JPH08507205A

JPH08507205A - 軟骨礎質の形成を促進する方法

Info

Publication number: JPH08507205A
Application number: JP6516236A
Authority: JP
Inventors: エフ．ゲーティンク，ポール; トンドラビ，エム．メールダド; ビネット，フランソワ
Original assignee: ザジェネラルホスピタルコーポレイション
Priority date: 1993-01-06
Filing date: 1994-01-04
Publication date: 1996-08-06
Also published as: AU6228494A; CA2153241A1; US5986052A; EP0679089A1; US5872094A; EP0679089A4; WO1994015627A1

Abstract

(57)【要約】プロテオグリカンとヒアルロン酸との複合体とコラーゲンとの結合を促進できるポリペプチドを投与することによって、罹患または損傷した軟骨性および非軟骨性組織の修復を促進する方法：表面への組織の付着を促進する方法：ならびに軟骨礎質蛋白質（ＣＭＰ）およびリンク蛋白質（ＬＰ）のフラグメントを含む本発明の方法に役立つポリペプチドが記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】軟骨礎質の形成を促進する方法［連邦に支援された研究に関する陳述］ここに記載された研究の部分的な資金供給は、米国衛生研究所（National Ins titute of Health）が提供した助成金第HD-22016号および第HD-22050号によって与えられ、米国政府は本発明に一定の権利を有する。［発明の背景］本発明は、軟骨の細胞外礎質に関し、より明確には、軟骨礎質蛋白質（ＣＭＰ）およびリンク蛋白質（ＬＰ）に関する。一般に、結合組織は、特化した細胞によって合成かつ維持される豊富な細胞外礎質を有する。これらの細胞間の相互作用、独自に結合された細胞外礎質成分、ならびに各タイプの結合組織の細胞外液中の水、電解質および蛋白質が、組織の機能的特徴性を決定する。軟骨では、細胞外礎質の主な一成分はコラーゲン原繊維である。主たる伸張性要素として、コラーゲン原繊維は、軟骨性組織の構造的安定化に重要な役割を果たしている。原繊維は、II型コラーゲンに囲まれたXI型コラーゲンのコアからなり、周辺には、II型コラーゲンに共有結合で付着したIX型コラーゲンが存在する［Mendlerら、J．Cell Biol．、第108巻191〜197ページ（1989年）］。コラーゲン原繊維と作用し合う、デコリン「Vogel ら、Coll．Rel．Res．、第７巻104〜114ページ（1987年）］、軟骨礎質蛋白質（ＣＭＰ）［Paulssonら、Biochem．J．、第197巻367〜375ページ（1981年）；Win terbottomら、Dev．Dynamics、第193巻266〜276ページ（1992年）］、フィブロモジュリン［Hedbomら、J．Biol．Chem.、第264巻6,898〜6,905ページ（1989年）］およびコラーゲン結合蛋白質［Chandrasekharら、Proc．Natl．Acad．Sci． USA、第83巻5,126〜5,130ページ（1986年）］を包含する数種類の非コラーゲン蛋白質も記載されている。原繊維の組織化の際のこれらの蛋白質の役割は明瞭ではないものの、ＣＭＰはII型コラーゲンに結合することが最近報告されている［ Winterbottomら、前掲］。ＣＭＰは、ジスルフィド結合で結合されたサブユニットの単独三量体であり、表皮増殖因子との顕著な相同性を有するドメイン、および二つの相同な反復配列（ＣＭＰ−１およびＣＭＰ−２）を含むが、後者は、フォンビルブラント因子、補体因子Ｂ、補体因子Ｃ２、VI型コラーゲン、ならびにインテグリンであるMac- 1、p150，95およびＬＦＡ−１のα鎖内の領域との相同性を有する［Kissら、J． Biol．Chem.、第264巻8,126ページ（1989年）；Argravesら、Proc．Natl．Acad ．Sci．USA、第84巻464ページ（1987年）］。これらの反復配列は、コラーゲンとの結合を担当する領域を含むことが報告されている［Winterbottomら、前掲］。コラーゲン原繊維間の細胞外空間の大部分は、軟骨の細胞外礎質の第二の主要成分である、巨大な軟骨プロテオグリカン、アグレカン、リンク蛋白質（ＬＰ）およびヒアルロン酸（ＨＡ）という単量体からなる三重複合体によって占められる。各アグレカン単量体のポリアニオン性グリコサミノグリカンの側鎖は、コア蛋白質の共有結合修飾であって、大量の水およびイオンを礎質内に拘束し、こうして衝撃を吸収する軟骨組織の特性を与える［Hascall、J．Supramol．Struc.、第７巻101〜120ページ（1970年）］。100個という多数のアグレカン単量体が、アミノ末端の球形のドメインに含まれるアミノ酸残基によってただ１個のＨＡ重合体と結合している。これらの相互作用は、アグレカンとＨＡの双方とのただ１個のＬＰ分子の、独立した結合によって安定化される［Hascall、Biology of Ca rbohydrates、第１巻1〜49ページ、C．Ginsberg編、米国ニューヨーク、Wiley社（1981年）］。ＬＰのアミノ酸配列から、この蛋白質は、免疫グロブリン様蛋白質との相同性を有するＮＨ₂末端ドメインから［Bonnetら、Biochem．Biophys．Acta、第873巻 152ページ（1986年）］、およびアグレカンのＨＡとの結合領域との相同性を有する２個の縦並びに反復される配列から［Deakら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 、第83巻3,766ページ（1986年）：Doegeら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、第83 巻3,761ページ（1986年）； Neameら、J．Biol．Chem.、第261巻3,519ページ（1986年）］なることが明らかにされた。この配列相同性に基づき、これらの縦並びに反復される配列は、ＨＡとの相互作用のための部位を含むことが示唆されている［Deakら、前掲；Neame ら、J．Biol．Chem.、第260巻12,402ページ（1985年）；Goetinckら、J．Cell B iol.、第105巻2,403ページ（1987年）］。軟骨に大量に存在することに加えて、ＬＰは、大動脈、背側皮膚、腎臓および目を包含する多数の胚組織はもとより、消化管全体に沿った結合組織にも見いだされている［Gardellら、ＢＢＲＣ、第9 5巻1,823ページ（1980年）；Stirpeら、Dev．Biol.、第137巻419ページ（1990年）；Pooleら、J．Cell Biol.、第93巻910ページ（1982年）；Ripel1inoら、J．C ell Biol．、第108巻1,899ページ（1989年）；Binetteら、Mol．Biol．Cell、第３巻224ページ（1992年）］。非常に多様な組織におけるＬＰの存在は、この蛋白質も、非軟骨性組織の細胞外礎質の安定化に役割を果たし得ることを示していると提唱されている［Binnetteら、前掲］。現在のところ、軟骨や非軟骨性組織の細胞外礎質の主要成分間の高分子相互作用の性質は不明であるが、この相互作用は、これらの組織の増殖および維持に決定的に重要であることが認識されている。［発明の要約］リンク蛋白質は、軟骨礎質蛋白質に結合し、こうして、細胞外軟骨礎質の主要な２成分間の直接的相互作用の第一の証拠を与えることを本発明者らは発見した。その結果、第一の側面では、本発明は、プロテオグリカン（例えばアグレカン）とヒアルロン酸との複合体とコラーゲンとの結合を促進できるポリペプチドを投与することによって、例えば人間の患者のような哺乳類における罹患または損傷した軟骨性組織の修復を促進する方法を特徴とする。本発明のこの面の好適実施態様では、投与されるポリペプチドは、軟骨礎質蛋白質のフラグメント、およびリンク蛋白質のフラグメントを有する融合ポリペプチドである。好ましくは、ＬＰのフラグメントは、プロテオグリカン−ＨＡ複合体に結合でき（またこのようにして、縦に並ぶ反復配列の一方または双方を含み −そのような配列の少なくとも一方は結合に必要である）、ＣＭＰのフラグメントはコラーゲンに結合できる。最も好ましくは、融合フラグメントは、実質的に（少なくとも９０％）完全な長さのＬＰポリペプチドに付着したＣＭＰ−１またはＣＭＰ−２を含有する。このポリペプチドは、例えば、製薬上許容され得る担体での注射によるか、または該ポリペプチドを発現できる組換えＤＮＡを含有する細胞を送達することによって、組織に直接投与してよい。好ましくは、投与される細胞は軟骨細胞であり、最も好ましくは、該軟骨細胞は、受容者である患者から採取され、投与の前に組換えＤＮＡが移入される。第二の側面では、本発明は、表面への軟骨性組織の付着を促進する方法であって、（ａ）軟骨礎質蛋白質；（ｂ）軟骨礎質蛋白質の、コラーゲンおよびリンク蛋白質に結合できるフラグメント；（ｃ）リンク蛋白質；（ｄ）リンク蛋白質の、プロテオグリカンとヒアルロン酸との複合体および軟骨礎質蛋白質に結合できるフラグメント；（ｅ）軟骨礎質蛋白質の、コラーゲンに結合できるフラグメント、およびリンク蛋白質の、ヒアルロン酸とプロテオグリカンとの複合体に結合できるフラグメントを含む融合ポリペプチド；または（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のポリペプチドの２種類またはそれ以上の組合せ；のいずれかを表面に固定し、次いで、付着が生じるのを可能にするのに充分な時間、組織を表面に接触させる段階を含む方法を特徴とする。本発明の第二の側面の一実施態様では、該方法は、リンク蛋白質の、軟骨礎質蛋白質に結合できるポリペプチドフラグメントを表面に固定し、次いで、付着を生起するのに充分な時間、軟骨礎質蛋白質を表面に接触させることによって、表面への軟骨礎質蛋白質の付着を促進するのに用いられる。好ましくは、リンク蛋白質のフラグメントは、縦に並ぶアミノ酸反復配列の一方または双方を含有する。本発明の第二の側面の関連するもう一つの実施態様では、該方法は、軟骨礎質蛋白質の、リンク蛋白質に結合できるポリペプチドフラグメントを表面に固定し、次いで、リンク蛋白質が該表面に付着するのを可能にするのに充分な時間、リンク蛋白質を表面に接触させることによって、表面へのリンク蛋白質の付着を促進するのに用いられる。本発明の第二の側面の好適実施態様では、ポリペプチドと表面、例えば補綴装置、移植物または組織移植片とのイオン性もしくは疎水性の相互作用によるか、または慣用の方法を用いたポリペプチドと表面との架橋結合によって、ポリペプチドを該表面に固定させてよい。もう一つの代替的方法では、ポリペプチドを生体適合性組成物、例えばゲルに混合または包埋し、次いで、これを用いて表面を被覆してよい。更にもう一つの代替的方法では、ポリペプチドを発現できる組換え分子を含有する細胞、例えば軟骨細胞または繊維芽細胞を用いて、所望の表面を被覆するか、またはそれに浸透させる。もう一つの側面では、本発明は、プロテオグリカン、ヒアルロン酸およびリンク蛋白質の複合体とコラーゲンとの結合を促進できるポリペプチドを組織に投与することによって、非軟骨性組織、例えば皮膚におけるプロテオグリカン−ＨＡ −ＬＰ複合体とコラーゲンとの相互作用を促進する方法を特徴とする。好ましくは、ポリペプチドは、軟骨礎質蛋白質、または軟骨礎質蛋白質の、コラーゲンおよびリンク蛋白質に結合できるフラグメントである。ＣＭＰのポリペプチドまたはフラグメントは、上記の方法のいずれによって組織に送達してもよい。ＣＭＰを移入された細胞の送達によって送達を仲介する場合、細胞の好ましい細胞型は繊維芽細胞、例えば皮膚の繊維芽細胞である。本発明は、軟骨礎質蛋白質のフラグメントおよびリンク蛋白質のフラグメントを含有する融合ポリペプチドも特徴とする。好ましくは、ＬＰフラグメントは、ヒアルロン酸とプロテオグリカンとの複合体に結合でき；より好ましくは、該フラグメントは、ＬＰの縦に並ぶ反復配列の一方または双方を含み；最も好ましくは、該フラグメントは、ＬＰのアミノ酸配列の実質的に全部を含む。やはり好ましくは、ＣＭＰフラグメントはコラーゲンに結合でき；最も好ましくは、ＣＭＰフラグメントは、ＣＭＰ−１もしくはＣＭＰ−２、またはＣＭＰ−１およびＣＭＰ−２の双方を含む。もう一つの関連する側面では、本発明は、リンク蛋白質の、軟骨礎質蛋白質に結合できるフラグメントを含むポリペプチドを特徴とする。特に好適な一実施態様では、このポリペプチドは、リンク蛋白質の縦に並ぶ反復配列の一方または双方を含む。ここで用いられる限りで、「フラグメント」という用語は、少なくとも10個の隣接するアミノ酸、好ましくは、少なくとも20個の隣接するアミノ酸を意味し、ＣＭＰまたはＬＰのいずれかの全アミノ酸配列を含んでよい。本発明による好ましいフラグメントは、生物学的活性、すなわち、下記の検定によって決定されるような未変性蛋白質の結合特性を示すそれらである。ＣＭＰおよびＬＰフラグメントは、当業者に公知である方法を用いて生成することができるか、または正常な蛋白質プロセシング（例えば、生物学的活性には必要とされない未成熟ポリペプチドからのアミノ酸の除去、または代替的なｍＲＮＡスプライシングもしくは代替的な蛋白質プロセシングの事象によるアミノ酸の除去）の結果として得てもよい。ニワトリのＣＭＰのヌクレオチド配列は、X12346〜X12354という受託番号でGe nBank（登録商標）／ＥＭＢＬというデータバンクから入手できる。ヒトのＣＭＰのヌクレオチド配列は、J05666およびJ05667という受託番号でGenBank／ＥＭＢＬデータバンクから入手できる。ＣＭＰ−１（ＣＭＰ−１ドメイン）は、ニワトリＣＭＰの第30〜220アミノ酸に対応する配列であり；ＣＭＰ−２（ＣＭＰ− ２ドメイン）は、ＣＭＰの第262〜450アミノ酸に対応する配列である（番号付けは前掲のKissらによる）。ＣＭＰ−１はヒトＣＭＰの第23〜222アミノ酸にも対応し、ＣＭＰ−２はヒトＣＭＰの第264〜453アミノ酸にも対応する（番号付けは前掲のJenkinsらによる）。ＣＭＰ−１という用語は、フォンビルブラント因子、補体因子Ｂ、補体因子Ｃ２、VI型コラーゲン、ならびにインテグリンであるMa c-1、p150,95およびＬＦＡ−１のα鎖のような蛋白質の、ヒトまたはニワトリのＣＭＰ−１ドメインと相同であるドメインに対応するポリペプチドも包含する。ＣＭＰ−２という用語は、フォンビルブラント因子、補体因子Ｂ、補体因子Ｃ２、VI型コラーゲン、ならびにインテグリンであるMac- 1、p150,95およびＬＦＡ−１のα鎖のような蛋白質の、ヒトまたはニワトリのＣＭＰ−２ドメインと相同であるドメインに対応するポリペプチドも包含する。そのような相同ドメインは、標準的手法を用いて同定されている（総説については、前掲のKissらを参照されたい）。そのようなドメインは、ヒトＣＭＰ−１ドメインまたはヒトＣＭＰ−２ドメインに対して70％、好ましくは80％、より好ましくは90％相同である。好ましくは、ＣＭＰフラグメントは、天然に産する完全な長さのＣＭＰポリペプチドのそれの少なくとも10％、より好ましくは30％、最も好ましくは70％の結合活性で、コラーゲン、ＬＰ、またはコラーゲンおよびＬＰの双方に結合できる。ヒトリンク蛋白質の完全なアミノ酸配列は、X17405という受託番号でGenBank ／ＥＭＢＬデータバンクから入手できる。ラット軟骨肉腫およびニワトリＬＰの完全なアミノ酸配列も入手できる［Neameら、前掲；Deakら、前掲］。縦に並ぶ反復配列は、ニワトリＬＰの第207〜226および第306〜325アミノ酸に対応する（番号付けは前掲のDeakらによる）。好ましくは、ＬＰフラグメントは、天然に産する完全な長さのＬＰポリペプチドのそれの少なくとも10％、より好ましくは30 ％、最も好ましくは70％の結合活性で、ヒアルロン酸、ＣＭＰ、またはヒアルロン酸およびＣＭＰの双方に結合できる。別途定義されない限り、ここで用いられる技術用語および学術用語はすべて、本発明が属する技術の通常の技量を有する者に共通して理解されるのと同じ意味を有する。本発明の実施または試験には、ここに記載のそれと類似または相当するいかなる方法および材料を用いることもできるが、ここでは、好適な方法および材料を記載する。以下で言及するすべての出版物は、引用によって本発明に組み込まれる。別途言及されない限り、本発明に用いられるか、または企図される手法は、当業者には周知の標準的方法体系である。材料、方法および実施例は、例示であるにすぎず、限定するものではない。本発明の方法は、軟骨の退行変性を伴う疾病、例えば骨関節炎の治療に；何らかのタイプの外傷、すなわち損傷または外科手術のために引き裂かれた軟骨の修復のために；そして補綴装置の接着および生体適合性の促進のために役立つ。本発明のその他の特徴および利点は、その好適実施態様に関する下記の説明、および請求範囲から明らかにされるであろう。［詳細な説明］最初に、図面を簡単に説明する。図面図１は、固定化された抗ＣＭＰ抗体に捕捉されたＣＭＰとのビオチニル化ＬＰの結合を示すグラフである。 405nmでの光学密度（ｘ1,000）の毎分の変化を、ビオチニル化ＬＰの濃度（ng/m l）の関数としてプロットしてある。図２は、固定化された抗ＬＰ抗体に捕捉されたＬＰとのビオチニル化ＣＭＰの結合を示すグラフである。405nmでの光学密度（ｘ1,000）の毎分の変化を、ビオチニル化ＣＭＰの濃度（μg／ml）の関数としてプロットしてある。図３は、ウサギの抗ＬＰ（第306〜325番）ペプチド抗体による、固定化ＣＭＰとのＬＰの結合の阻害を示すグラフである。阻害の百分率を、抗体希釈の関数としてプロットしてある。図４は、ヒトＣＭＰのアミノ酸配列を示す。残基は、最初のメチオニン残基から連続的に番号付けてある。成熟したポリペプチドは、第23位のセリン（^*）から始まると考えられる。第76〜78位のＮ−グリコシル化の可能な部位に下線を施してある。図５は、ヒトＬＰのアミノ酸配列を示す。シグナルペプチドは矢印の間に印付けられ、２個のプロテオグリカンの縦に並ぶ反復は括弧で括られている。免疫グロブリンの可変域の折りたたみとの構造的相同性を示すドメインに下線を施してある。ＣＭＰおよびＬＰ下記に述べるのは、ＣＭＰおよびＬＰを製造し、ＣＭＰおよびＬＰのフラグメントを生成し、ＬＰおよびコラーゲンに結合するＣＭＰフラグメントを決定し、ＣＭＰに結合するＬＰフラグメントを決定し、ＬＰとＣＭＰとの融合蛋白質を生成する方法はもとより、これらの分子の治療上の用途である。ＣＭＰの精製ニワトリの胸骨の軟骨を、Pelfreeze社（米国アラスカ州Rogers）から購入し、残留するいかなる筋および軟骨膜も切除することによって浄化した。次いで、標準的なコーヒーミル中で、ドライアイスを用いて−70℃で組織を摩砕し、４モルのグアニジン−ＨＣｌ、50ミルモルのトリス−ＨＣｌ（pH7.5）を用い、４℃ で約２時間撹拌することによって抽出した。抽出物を、20,000ｘｇで20分間の遠心分離に付して、不溶性の材料を除去し、可溶性の材料を、抽出緩衝液で予め平衡させておいたオクチル−ファロースカラム（110mlの層体積、米国ニュージャージー州Picaway、Pharmacia社）に掛けた。カラムを抽出緩衝液で、280nmの吸光度の体積を通過する流れにそれ以上蛋白質を検出できなくなるまで（一般的には、最低カラム10本分の体積）洗浄した。0.5％の３−［（３−コラミンドプロピル）ジメチル−アンモニオ］−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）を含有する抽出緩衝液で結合蛋白質を溶離した。溶出液を、ＹＭ１０という膜（米国マサチューセッツ州Beverly、Amincon社）上の限外濾過室での限外濾過によって濃縮し、次いで、sephacryl Ｓ２００（Pharmacia社）のカラム（直径2.5cm、長さ69cm）に掛け、ＣＨＡＰＳを含まない抽出緩衝液中を毎分１mlで通過させた。空隙体積を捕集し、上記のとおり、限外瀘過によって濃縮した。得られた材料は、クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上のただ１条のみの蛋白質バンドの存在によって、95％を越えて純粋なＣＭＰであると判定される。結合検定に向けて、精製されたＣＭＰを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）または0.05％Tween-20含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で透析し、使用まで−20 ℃で貯蔵した。ＣＭＰのアリコート（0.25μg）を、基本的には製造者の指示に従って、Ｎ− ヒドロキシスクシンイミドビオチン（ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン：米国イリノイ州 Rockford、Pierce社）でビオチニル化した。略述すると、ＣＭＰをpH8.5の50ミリモル炭酸ナトリウム中に透析し、次いで、ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン100μgと混合して250μｌの全反応体積とした。反応を室温で30分間進行させ、反応混合物をBioSpinというゲル濾過カラム（米国カリフォルニア州Richmond、BioRad社）に掛け、製造者の指示に従って、空隙体積を捕集することによって、取り込まれていないビオチンからビオチニル化ＣＭＰを分離した。リンク蛋白質の精製上記のとおり、ニワトリ胸骨の軟骨を、４モルのグアニジン−ＨＣｌ、50ミルモルの酢酸ナトリウム、10ミリモルのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、10 0ミリモルの６−アミノカプロン酸、10ミリモルのベンズアミジン−ＨＣｌ（pH5.8）を用いて、４℃で24時間抽出した。抽出物を20,000ｘｇで20分間の遠心分離に付して、不溶性材料を除去し、次いで、グアニジン−ＨＣｌを欠く抽出緩衝液９容に対して透析した。透析は、グアニジンの濃度を４モルから0.4モルへと効果的に低下させた。会合条件と称されるこれらの条件下では、リンク蛋白質、アグレカンおよびヒアルロン酸の三重複合体が形成される。次いで、塩化セシウムを加えて、溶液の最終密度を1.64ｇ／mlとし、ベックマン50Tiローター中で４℃で36 ,000rpmの遠心分離に少なくとも36時間付して、密度平衡に到達させた。これらの条件下では、三重複合体は底層分画に堆積し、次いで、これを捕集した。この分画は、他の軟骨蛋白質を基本的に含まず、Ａ１分画（会合ＣｓＣｌ勾配第１分画）と称される。多数の勾配のＡ１分画を貯留し、全体積を決定し、８モルのグアニジン−ＨＣｌを含有する抽出緩衝液で希釈して、グアニジン−ＨＣｌの最終濃度を４モルとした。解離条件と称されるこれらの条件下では、三重複合体の成分は、もはや相互に結合することはない。次いで、塩化セシウムを加えて、溶液の最終密度を1.52ｇ／mlとし、試料を、ベックマン50Tiローター中で４℃で36,0 00rpmの遠心分離に少なくとも36時間付して、密度平衡に到達させた。これらの条件下では、アグレカンその他のプロテオグリカンは底層分画に堆積し、ヒアルロン酸は中層を占め、リンク蛋白質は表層に浮遊する。各遠沈管からの表層を捕集し、８モルの尿素、50 ミリモルのトリス−ＨＣｌ（pH6.8）に対して透析し、次いで、透析緩衝液で予め平衡させたＤＥＡＥ−セルロース（ＤＥ５２：英国Maidstone、Whatman社）のカラムに掛けた。これらの条件下では、リンク蛋白質がカラム内を流通する間に、汚染性プロテオグリカンはすべてＤＥＡＥ−セルロースに結合する。クーマシーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによる精製リンク蛋白質の分析は、ただ１条のバンドの存在を示す。上記の限外濾過によって、精製リンク蛋白質を濃縮し、結合検定のため、または−20℃で貯蔵するためにＰＢＳもしくはＰＢＳ−Ｔ中に透析した。ビオチニル化ＬＰを、上記の方法に従って製造した。ペプチド製造者が提供する化学的性状を備えた自動化されたペプチド合成装置（モデル第430A号：米国ニューヨーク州Hauppague、Applied Biosystems社）を用いて、ＬＰの特異的アミノ酸配列に対応するペプチドを合成した。フッ化水素による開裂が樹脂を形成した後、冷エチルエーテルでペプチドを洗浄し、水に再溶解し、凍結乾燥した。ペプチドの純度は、Ｃ−１８カラム（内径3.9mmｘ300mm；米国マサチューセッツ州Milford、Millipore社Waters Chromatography部門；microBond apark）によるＨＰＬＣによって試験した。すべての場合に、クロマトグラムは、90％またはそれ以上の推定純度を示す単一の主ピークを与えた。ペプチドの同定に用いた番号付け体系は、Deakら［Proc． Natl．Acad．Sci．USA第83巻3,766〜3,770ページ（1986年）］に基づくが、この体系では、15アミノ酸のシグナルペプチドの開始メチオニンが最初の残基と考えられる。抗体ニワトリ胚の胸骨軟骨の８モル尿素抽出物を用いたマウスの感作によって、モノクローナル抗体１Ｈｌ（抗ＣＭＰ）、４Ｂ６（抗ＬＰ）および３Ｈ８（抗ＬＰ）を調製した。尿素で抽出された蛋白質を、ＰＢＳ中に透析し、フロインド完全アジュバントと混合し、標準的方法に従ってマウスを感作するのに用いた。３回のブースター感作の後、マウスを殺し、脾臓を取り出した。標準的方法に従って、脾臓細胞を骨髄腫の細胞系と融合させ、こうして形成されたハイブリドーマを、標準的ＥＬＩＳＡ検定法を用いて、ＣＭＰおよびＬＰに対する抗体の存在を求めてふるい分けした。略述すると、微量滴定プレートをＣＭＰまたはＬＰのいずれかで被覆し、ハイブリドーマの培養液、次いで、酵素と結合させたヤギの抗マウス二次抗体（BioRad社）と反応させた。陽性のハイブリドーマをサブクローン化して、クローン的に派生させた純粋な細胞系を得た。次いで、ウエスターンブロット分析、免疫蛍光法および免疫沈降法を用いて、１Ｈ１ならびに４Ｂ６および３Ｈ８を試験し、それぞれＣＭＰならびにＬＰと反応することが判明した。ペプチドの合成の際にAsp³⁰⁶のアミノ基で導入したシステイン残基に対して、Ｎ−スクシンイミジル−３−（ピリジルチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）を用いて、キーホールカサガイ（keyhole limpet）のヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合させたＬＰペプチドのAsp³⁰⁶〜Arg³²⁵に対するポリクローン抗血清をウサギで生成した。条件は、Pierschbacherら［Proc．Natl．Acad．Sci．USA、第80巻1,224 〜1,227ページ（1983年）］によって記載されたそれに基づいた。それぞれの感作について、ペプチド３mgを、ＰＢＳ1.5mlに溶かした0.5mgのＳＰＤＰを用いてＫＬＨ１mgに結合させた。最初の感作のためには、混合物を等積のフロインド完全アジュバントと組合せた。抗ＬＰモノクローナル抗体である８Ａ４［Catersonら、J．Biol．Chem.、第26 0巻11,348〜11,356ページ（1985年）］は、National Institute of Child Healt h and Human Development（ＮＩＣＨＤ：米国メリーランド州Bethesda）からの契約番号第HD-6-2915号によって維持されるDevelopmental Studies Hybridoma B ankからの培養上清として入手した。ヤギ抗ウサギおよびヤギ抗マウスのＩｇＧアルカリホスファターゼ結合体は、 BioRad Laboratories社（米国カリフォルニア州Richmond）から入手した。結合検定一般的には、固定化しようとする材料、ＣＭＰ、ＬＰおよび抗体を、0.05モルの炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.6）中で透析した。次いで、材料60μlを微量滴定プレート（ＥＩＡ、Linbro：米国バージニア州McL ear、Flow Laboratories社）の各ウエルに加え、室温で１時間温置した。プレートをＰＢＳで洗浄し、次いで、ＰＢＳに溶かした１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１時間遮断した。次いで、プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。次いで、ＰＢＳ−Ｔに溶解した、材料の次の層を室温で１時間ウエルに加え、その後、ＰＢＳ−Ｔで５回洗浄した。それに続く層を同様にして加えた。二次抗体またはストレプトアビジンに結合したアルカリホスファターゼの活性を、基質であるニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）およびリン酸５−ブロモ−４−クロロ− ３−インドイル（ＢＣＩＰ）を製造者（米国メリーランド州Bethesda、ＢＲＬ社）が推奨する濃度で含有する100ミリモルのトリス−ＨＣｌ、50ミリモルのＭｇＣｌ₂、100ミリモルのＮａＣｌ（pH9.5）60μｌを加えることによって測定した。405nmでの吸光度を５分間の間隔で測定し、微量滴定プレート読取り装置（Tit ertek Multiskan Plus：米国バージニア州McLean、Flow Labs社）を用いて記録した。データは、ΔSoftというソフトウエア（米国ニュージャージー州Princeto n、Biometallics社）を用いて収集した。結果ＣＭＰとのＬＰの結合：ＣＭＰは、微量滴定プレートに直接固定化するか、または固定化抗ＣＭＰ抗体によって捕捉し、ＬＰを加える。次いで、結合したＬＰを、特異的な抗ＬＰ抗体、次いで、酵素と結合した二次抗体、または、ＬＰがビオチニル化されているときは、酵素と結合したストレプトアビジンを用いて検出する。例えば、一検定法では、抗ＣＭＰモノクローナル抗体である１Ｈ１を、微量滴定プレートの各ウエルに２０μg／mlの濃度で固定化し、固定化された抗体にＣＭＰ（0.5μg／ml）を捕捉した。次いで、増大する濃度のビオチニル化ＬＰを各ウエルに加え、温置し、次いで、上記のとおり洗浄した。次いで、アルカリホスファターゼを結合させたストレプトアビジンを用いて、ビオチニル化ＬＰを検出した。この検定の結果は、図１に示されているが、ＬＰはＣＭＰに用量依存的な様式で結合することを証明している。ＬＰとのＣＭＰの結合：ＬＰを、微量滴定プレートに直接固定化するか、または固定化された抗ＬＰ抗体によって捕捉し、ＣＭＰを加える。次いで、結合したＣＭＰを、特異的な抗ＣＭＰ抗体、次いで、酵素と結合した二次抗体、または、ＣＭＰがビオチニル化されているときは、酵素と結合したストレプトアビジンを用いて検出する。例えば、一検定では、微量滴定プレートを抗ＬＰモノクローナル抗体である３Ｈ８（20μg／ml）で被覆し、固定化された抗体にＬＰ（0.5μg／ml）を捕捉した。増大する濃度のビオチニル化ＣＭＰを各ウエルに加え、温置し、次いで、上記のとおり洗浄した。次いで、アルカリホスファターゼを結合させたストレプトアビジンを用いて、ビオチニル化ＣＭＰを検出した。この検定の結果は、図２に示されているが、ＣＭＰがＬＰに用量依存的な様式で結合することを証明している。ＬＰとＣＭＰとの相互作用の阻害：モノクローナル抗体の４Ｂ６またはビオチンのいずれかでＬＰを標識付けし、次いで、ＬＰ分子の特異的エピトープに仕向けた増加する量の抗ＬＰ抗体とともに温置する。次いで、微量滴定プレートに固定化したＣＭＰとともに混合物を温置し、洗浄し、次いで、酵素と結合した二次抗体、または、ＬＰがビオチニル化されているときは、酵素と結合したストレプトアビジンのいずれかを用いて検出する。ＬＰ（３μg／ml）をモノクローナル抗体の４Ｂ６で標識付けし、増加する量のウサギ抗ＬＰ（第306〜第325）とともに温置してから、固定化ＣＭＰと温置した一検定の結果を図３に示す。これらの結果は、ＬＰとＣＭＰとの相互作用は、抗ＬＰ（第306〜第325）抗体によって、用量依存的な様式で阻害されることを立証した。ＬＰのエピトープであるAsn²⁰⁷〜Pro²²⁶およびAsp³⁰⁶〜Arg³²⁵を認識するモノクローナル抗体、すなわち８Ａ４も、ＬＰとＣＭＰとの相互作用を阻害する。ＬＰに対して仕向けられた他のモノクローナル抗体、例えば３Ｈ８は、この相互作用を阻害することができなかった。これらの結果は、ＣＭＰとの相互作用に関与するＬＰの結合部位は、ニワトリのＬＰの縦に並ぶ反復配列（第207〜226または第306〜325アミノ酸残基）の一方または双方に非常に近接して存在することを示す。これらの結果は、軟骨の細胞外礎質の主要成分、すなわち三重複合体およびコラーゲン原繊維の相互作用は、少なくとも部分的には、ＬＰとのＣＭＰの結合に仲介されることを示す。したがって、完全な長さのＣＭＰおよびＬＰのポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、およびＣＭＰとＬＰの様々なドメインを含む融合ポリペプチドの大規模な調製は、この相互作用の正確な性質、および軟骨礎質の形成を促進する際にそれが果たす役割を決定するのに役立つであろう。融合蛋白質ＣＭＰ、ＬＰまたはその双方のフラグメントを含む融合蛋白質は、該ペプチドの公然と入手できる配列を用いて、標準的技術によって構成してよい（例えば前掲のAusebelらを参照のこと）。例えば、有用な一方法は、大腸菌でのマルトース結合発現ベクター系（米国マサチューセッツ州Beverly、New England Biolabs社）を利用する。この方法では、ベクター中で、問題のｃＤＮＡを大腸菌のマルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）に対して３’からクローン化する。ＩＰＴＧで細胞を誘発するとき、ＭＢＰ−融合蛋白質が、細胞によって合成される支配的な蛋白質であり、アミロース含有樹脂（New Eng1and Biolabs社）によるアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。この発現系は、ＣＭＰｃＤＮＡの様々なフラグメントを発現するのに用いられており、ＬＰの様々なフラグメントはもとより、ＣＭＰおよびＬＰの双方のフラグメントを含む融合ポリペプチドを発現するのに用いてもよい。これは大量のポリペプチドの精製を可能にし、次いで、それらを、ここに記載の検定を用いて様々な分子（例えばコラーゲン、ヒアルロン酸、アグレカン、ＣＭＰ、ＬＰ）との能力について試験してよい。その他の大腸菌ベクター、例えばｐＧＥＸ（Pharmacia社）またはｐＥＴ１１（米国ウィスコンシン州Madison、Novagen社）も、大量のＣＭＰおよびＬＰ由来ポリペプチドを発現するための有用なベクターである。コラーゲンおよびプロテオグリカン−ＨＡ複合体の双方に結合するＣＭＰ−ＬＰ融合蛋白質を構成してもよい。そのような融合は、ＬＰのコード化領域全体に結合されたＣＭＰのコード化領域全体からなっていてよい。これに代えて、ＣＭＰ−１もしくはＣＭＰ−２ドメインの一方または双方、またはＣＭＰの、ここに記載のコラーゲン結合検定によって決定されるようなコラーゲン結合特性を依然として保持する、より小さいフラグメントを含む融合蛋白質を構成してもよい。ＬＰの、ここに記載の検定によって決定されるようなプロテオグリカン−ＨＡ複合体に結合する能力を保持する、より小さいフラグメント、例えば、縦に並ぶ反復配列に対応するそれを用いてもよい。慣用の手段、例えば合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって、ＣＭＰおよびＬＰからの望みの配列をコード化しているｃＤＮＡを生成し、次いで、３分節系結合反応で適切な発現ベクターへ内へと結合させることができる。望みの融合蛋白質を正しい方向付けでコード化している結合されたＤＮＡを含むクローンを、期待された結合部位にまたがる20〜30ヌクレオチドのオリゴマーとハイブリッド形成する（慣用のオリゴマーの標識付けおよびハイブリッド形成の条件を用いて）ことによって、ふるい分けすることができる。ＣＭＰ− ＬＰ融合構成体は、大腸菌中で、上記のいかなる原核性発現ベクターで発現させてもよい。真核性の系での発現のためには、適切な何らかの酵母または哺乳発現ベクターに挿入された、ＣＭＰ−ＬＰ融合体の５’末端で挿入されたＬＰのシグナルペプチドをコード化しているＤＮＡを含む融合蛋白質を構成してよい。加えて、ＣＭＰ−ＬＰ融合体は、バクロウイルス−昆虫発現系で、例えば、ＳＦ−９の細胞（ＡＴＣＣ第CRL1711号）でBlueBac IIというベクター（米国カリフォルニア州San Diego、Invitrogen社）を用いて、発現してもよい。ポリペプチドの合成および単離無傷のＬＰおよびＣＭＰポリペプチドの精製は、上記のとおり実施してよい。これに代えて、組換えＤＮＡの方法を用いて、無傷のポリペプチド、フラグメントまたは融合ポリペプチドの大規模精製を実施してもよい。一般的には、ＣＭＰもしくはＬＰのアミノ酸配列の全部または一部を含むポリペプチドを、適切な発現媒体中でのＣＭＰ−もしくはＬＰ−コード化ｃＤＮＡの断片の全部または一部による適切な宿主細胞の形質転換によって生成してよい。分子生物学の分野の習熟者は、非常に多様な発現系のいずれを用いて、上記の組換え蛋白質のいずれを与えてもよいことを理解するであろう。用いられる厳密な宿主細胞は、本発明に対して決定的に重要ではない。原核性宿主（例えば大腸菌）中で、または真核性宿主（例えば、サッカロミセス・セレビジアエまたは哺乳類細胞、例えばＣＨＯおよびＣＯＳ）中でポリペプチドを製造してよい。そのような細胞は、広範囲の供給源（例えば、米国メリーランド州Rockland、アメリカ模式菌培養収集−ＡＴＣＣ；例えば前掲のAusebelら）から入手できる。形質転換および移入の方法、ならびに発現媒体の選択は、選ばれる宿主系に依存するであろう。形質転換および移入の方法は、例えば前掲のAusebelらに記載されており、発現媒体は、例えば、Cloning Vectors：ALaboratory Manual［P.H．Pouw elsら、（1985年）、追補（1987年）］中に提供されたものから選んでよい。例えば、一つの好適な発現系では、ＣＭＰ、ＬＰまたはそのフラグメントをコード化しているｃＤＮＡを、発現を可能にするよう設定された方向付けでｐＣＤＮＡ１（米国カリフォルニア州San Diego、Invitrogen社）に挿入する。このベクターは、組換えポリペプチド、選択できるＤＨＦＲ遺伝子、ならびにＳＶ４０のスプライシングおよびポリアデニル化シグナルの発現を駆動するシトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＬＴＲプロモーターを与える。該ベクターは、培地中のメトトレキセートの濃度を漸進的に増加させることによって増幅してよく、ＣＨＯおよびＣＯＳ７の細胞中で高レベルのＣＭＰｃＤＮＡを発現させるのに用いられている。組換えポリペプチドは、上記のとおりに単離されるはずである。これに代えて、安定的に移入された哺乳類の細胞系統を用いて、ＬＰおよびＣＭＰのポリペプチドならびに融合体を製造してもよい。哺乳類細胞の安定的な移入に適した多数のベクターが、公衆には入手でき（例えば前掲のPouwelsを参照のこと）、そのような細胞系統を構成する方法も、例えば前掲のAusebelらで公然と入手できる。一実施例では、ＬＰまたはＣＭＰポリペプチドをコード化しているｃＤＮＡを、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の遺伝子を有する発現ベクター中でクローン化する。宿主細胞の染色体へのこのプラスミド、したがってまた遺伝子の組込みは、（前掲のAusebelらに記載のとおり）細胞培養の培地に0.0 1〜300マイクロモルのメトトレキセートを含有させることによって選択される。この支配的選択は、ほとんどの細胞型で達成できる。組換え蛋白質の発現は、移入された遺伝子の、ＤＨＦＲに仲介される増幅によって増大させることができる。遺伝子増幅を担当する細胞系統を選ぶ方法は、前掲のAusebelらに記載されており、そのような方法は、一般に、次第に上昇するレベルのメトトレキセートを含有する培地中での延長された培養を必要とする。この目的に一般的に用いられるＤＨＦＲ含有発現ベクターとしては、ｐＣＶＳＥIIおよびｐＡｄＤ２６ＳＶ（Ａ）がある（前掲のAuse belらに記載）。宿主細胞のうちでも、上記の宿主細胞はいすれでも、または、好ましくは、ＤＨＦＲ欠乏ＣＨＯ細胞系統（例えばＣＨＯＤＨＦＲ^-細胞、ＡＴＣＣ受託番号第CRL9096号）が、安定的に移入された細胞系統のＤＨＦＲ選択に、またはＤＨＦＲに仲介される遺伝子増幅に好適である。加えて、治療しようとする患者を含む多様な供給源から慣用の手段を用いて［例えば、Methods in D evelopmental Biology、Wiltら編、米国ニューヨーク、Thomas Y．Cromwell社、 493〜530ページ（1967年）のCahnらを参照のこと］、軟骨細胞を得てもよい。組換えポリペプチドを発現させたならば、例えばアフィニティークロマトグラフィーを用いて、これを単離してよい。一実施例では、抗ＣＭＰ抗体をカラムに付着させ、ＣＭＰポリペプチドを単離するのに用いてよい。アフィニティークロマトグラフィーに先立って、ＣＭＰまたはＬＰを宿す細胞の溶解および分別を、標準的手法を用いて実施してもよい（例えば前掲のAusebel らを参照のこと）。これに代えて、融合蛋白質、例えばＣＭＰ−マルトース結合蛋白質、ＣＭＰ−β−ガラクトシダーゼまたはＣＭＰ−ｔｒｐＥ融合蛋白質を構成し、ＣＭＰまたはＬＰポリペブチドの単離に用いてもよい（例えば前掲のAuse belら；米国マサチューセッツ州Beverly、New England Biolabs社）。単離したならば、望みの場合、例えば高性能液体クロマトグラフィーによって、組換え蛋白質を更に精製することができる［例えば、Fisher、Laboratory Tec hniques in Biochemistry and Molecular Biology、WorkおよびBurdon編、Elsev ier社（1980年）を参照のこと］。本発明のポリペプチド、特にＣＭＰまたはＬＰの短いフラグメントは、化学合成［例えば、Solid PhasePeptide Synthesis、第２版、1,084ページ、米国イリノイ州Rockford、The Pierce Chemical社］を用いても製造できる。コラーゲンおよびプロテオグリカン−ＨＡ複合体とのポリペプチドの結合プロテオグリカン−ＨＡ複合体およびコラーゲンとの様々なＣＭＰおよびＬＰポリペプチドの結合特性は、上記の検定はもとより、下記の検定を用いて分析してもよい。コラーゲン結合検定：この検定は、特異的なＣＭＰポリペプチドまたは融合ポリペプチドがコラーゲンと結合できるか否かを決定するのに用いられる。この検定では、２mg／mlのII型コラーゲン（大阪、新田ゼラチン社）のＰＢＳ−Ｔでの１：75希釈物で微量滴定プレートを被覆し、37℃で約18時間乾燥する。次いで、上記のとおり精製したＣＭＰポリペプチドまたは融合蛋白質を、コラーゲンで被覆したプレートに塗布し、37℃で１時間温置する。次いで、ポリペプチドまたは融合蛋白質を、（上記の）抗ＬＰ抗血清または抗ＣＭＰ抗体、および基本的には上記のとおりの二次抗体で検出する。原繊維形成の検定：この検定は、融合ポリペプチドの特定のＣＭＰフラグメントが、コラーゲンと結合できるか、および原繊維形成を促進できるか否かを決定するのに用いられる。検定は、基本的にはHedbomら［J．Biol．Chem.、第264巻6 ,898ページ（1989年）］によって記載されたとおりに実施する。略述すると、ＣＭＰ、ＣＰＭポリペプチドもしくは融合ポリペプチドの存在または不在下で、原繊維形成緩衝液（60ミリモルのＮａＣｌ、30ミリモルのＮａＰＯ₄［pH7.3］）へのII型コラーゲンの37℃での添加によって、原繊維形成を開始させる。II型コラーゲンの最終濃度は200μg／mlであり、ポリペプチドの最終濃度は20μg／mlである。原繊維形成は、数時間の経過にわたって混合物の400nmでの光学密度を定期的に測定することによって監視する。ＣＭＰ−ＬＰ融合蛋白質とコラーゲンおよびプロテオグリカン−ＨＡ凝集体との相互作用を試験するためのＥＬＩＳＡ：この検定では、微量滴定プレートを、上記のとおりII型コラーゲンで被覆する。次いで、ＣＭＰ−ＬＰ融合蛋白質をプレートに塗布し、37℃で１時間温置し、続いて、プロテオグリカン−ＨＡ複合体とともに温置する。次いで、プロテオグリカンまたはＨＡのいずれかに対する抗体、および酵素結合二次抗体を用いて、基本的には上記のとおりに、プロテオグリカン−ＨＡ複合体の量を定量する。可溶性のＬＰまたはＣＭＰとの競合阻害を用いて、結合の特異性も試験できる。これに代わる検定では、プロテオグリカン−ＨＡ複合体を微量滴定プレートに固定化し、その後、ＣＭＰ−ＬＰ融合蛋白質およびコラーゲンとともに逐次温置する。結合したコラーゲンの量は、抗コラーゲン抗体（例えば１Ｂ４：Winterbo ttemら、前掲）および酵素結合二次抗体を用いて決定する。可溶性のＬＰまたはＣＭＰとの競合阻害を用いて、反応の特異性を試験することもできる。用途軟骨性組織の細胞外礎質の形成の際のＣＭＰとＬＰとの相互作用は、本発明の融合ポリペプチドが、関節炎性疾患の際の軟骨の退行変性の進行を停止または遅延させ、損傷組織、例えば関節での軟骨の急速な増殖を促進するための治療法として役立つことを示す。融合ポリペプチドは、製薬上許容され得る担体物質、例えば食塩水と混合し、直接的な注射によって組織のその部位に投与して、三重複合体とのコラーゲン原繊維の結合を促進し、こうして、軟骨礎質形成を促進してもよい。これに代えて、ポリペプチドをコード化している組換えＤＮＡを移入した細胞の、生物分解できる生体適合性重合体を用いた徐放性配合物としての注射によって、またはミセルもしくはゲルを用いた部位指向性送達系によって、融合ポリペプチドを送達してもよい。ポリペプチドの投与量は、選ばれた個々の送達様式、および患者の状態のような要因に応じて変化するであろう。本発明のＣＭＰおよびＬＰのポリペプチドならびにフラグメントはもとより、融合ポリペプチドも、コラーゲンおよびプロテオグリカン複合体を含有する組織の外科的修復に用いられる補綴装置（例えば人工関節、皮膚）または組織移植片（例えば軟骨、皮膚）の接着および生体適合性を促進するのにも役立つ。この蛋白質は、当業者に周知の方法に従って、共有結合性またはイオン性相互作用によって補綴物の表面に結合させてよい。加えて、１種類またはそれ以上のポリペプチドを発現する細胞を用いて、送達の前に補綴装置を被覆するか、またはそれに浸透させてもよい。そのような補綴装置の外科的送達の厳密な方法は、当業者には周知である。ＣＭＰポリペプチドは、例えば美容を目的として、組織の水和を増大させるために非軟骨性組織に送達してよい。美容を目的として設定された他の化合物も、本発明の方法に用いられるＣＭＰ、ＬＰまたは融合ポリペプチドに共有結合で付着させることによって、非軟骨性組織、例えば皮膚に送達してもよい。送達を実施するには、一般的には、化合物、例えば蛋白質を、ＣＭＰおよび／またはＬＰを含むポリペプチドに共有結合で付着させる。ポリペプチドを共有結合で付着させるための多数の手法が、当業者に公知である。例えば、スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−ａ−（２−ピリジルジチオ）トルエンおよび３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（米国イリノイ州Rockford、Pierce社）は、単独重合体の形成その他の望ましくない副反応を避けつつ、段階的な方式で蛋白質を結合するのに用いることができる異種二官能架橋結合剤である。これに代えて、遺伝子工学的に加工した融合蛋白質を生成して、ＣＭＰまたはＬＰと、軟骨性またはコラーゲン性組織に送達しようとする蛋白質とを結合することもできる。加えて、本発明のＣＭＰおよびＬＰポリペプチドならびに融合蛋白質は、生体外での軟骨礎質形成を促進し、こうして関節での軟骨の復旧外科のための材料、または軟骨を含む組織（例えば鼻、口蓋）の美容外科における材料を提供するのに用いてよい。その他の実施態様その他の実施態様は、下記の請求の範囲内にある。例えば、天然に産するいかなるＬＰまたはＣＭＰの類似物質も、本発明の方法に用いてよい。類似物質は、アミノ酸配列の相違によって、翻訳後の修飾によって、またはその双方によって天然に産するポリペプチドと異なることがある。本発明の類似物質は、一般的には、少なくとも70％、より好ましくは80％、更に好ましくは90％、最も好ましくは95％、または99％もの相同性を天然に産するＬＰもしくはＣＭＰの配列に対して示すであろう。比較配列の長さは、少なくとも８アミノ酸残基、好ましくは少なくとも24アミノ酸残基、より好ましくは35を超えるアミノ酸残基であろう。修飾としては、ポリペプチドの生体内および生体外の化学的誘導体形成、例えばアセチル化、カルボキシル化、リン酸化またはグリコシル化があるが、そのような修飾は、ポリペプチドの合成もしくはプロセシング、または単離された修飾酵素を用いたその後の処理の際に生じてよい。類似物質は、一次配列の変化によって、天然に産するＬＰまたはＣＭＰポリペプチドと異なることもある。これらは、自然の、または誘発された（例えば、照射、もしくはエタンメチル硫酸塩との接触によるか、または部位特異的な突然変異誘発［例えば、Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第２版、CHS Prss社（1989年）、または前掲のAusebelらを参照のこと］による無作為突然変異誘発の結果として生じる）遺伝的変異体を包含する。やはり包含されるのは、環化されたペプチド分子、およびＬ−アミノ酸以外の、例えばＤ−アミノ酸、または非天然産もしくは合成アミノ酸、例えばβまたはγアミノ酸を含む類似物質である。配列表配列番号：１１．配列の特徴長さ：496アミノ酸型：アミノ酸トポロジー：直鎖状２．分子の型：ペブチド 11．配列の記載：配列番号１配列番号：２１．配列の特徴長さ：1,400塩基対型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状 11．配列の記載：配列番号２

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 14/78 8318−4Ｈ 19/00 8318−4ＨＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9452−4Ｂ (72)発明者ビネット，フランソワアメリカ合衆国 08536 ニュージャージー，プレインズボロ，ソロードライブ 85

Claims

【特許請求の範囲】１．罹患または損傷した軟骨性組織の修復を促進する方法であって、プロテオグリカンとヒアルロン酸との複合体とコラーゲンとの結合を促進できるポリペプチドを該組織に投与することを含む方法。２．ポリペプチドが、軟骨礎質蛋白質のフラグメント、およびリンク蛋白質のフラグメントを含む融合ポリペプチドである請求項１記載の方法。３．ポリペプチドが、ＬＰの、複合体と結合できるポリペプチドフラグメント、およびＣＭＰの、コラーゲンと結合できるポリペブチドフラグメントを含む請求項２記載の方法。４．融合ポリペプチドが、基本的に無傷のＬＰポリペプチドに付着したＣＭＰ− １またはＣＭＰ−２を含む請求項２記載の方法。５．ポリペプチドが、該ポリペプチドを発現できる組換え核酸を含む細胞として組織に投与される請求項１記載の方法。６．細胞が軟骨細胞である請求項５記載の方法。７．ポリペプチドが組織内に直接注射される請求項１記載の方法。８．組織が関節の軟骨である請求項１記載の方法。９．哺乳類が人間の患者である請求項１記載の方法。 10．罹患した組織が関節炎状態の結果である請求項１記載の方法。 11．関節炎状態が骨関節炎である請求項10記載の方法。 12．表面への軟骨性組織の付着を促進する方法であって、下記のポリペプチド：（ａ）軟骨礎質蛋白質、（ｂ）軟骨礎質蛋白質の、コラーゲンおよびリンク蛋白質に結合できるフラグメント、（ｃ）リンク蛋白質、（ｄ）リンク蛋白質の、プロテオグリカンとヒアルロン酸との複合体および軟骨礎質蛋白質に結合できるフラグメント、ならびに（ｅ）軟骨礎質蛋白質の、コラーゲンに結合できるフラグメント、およびリンク蛋白質の、ヒアルロン酸とプロテオグリカンとの複合体に結合できるフラグメント、のうち１種類またはそれ以上を該表面に固定することと、該組織を該表面に、該付着が生じるのを可能にするのに充分な時間接触させることとを含む方法。 13．固定する段階が、ポリペプチドを発現できる組換え分子を含む細胞を表面に付着させることを含む請求項12記載の方法。 14．細胞が軟骨細胞である請求項13記載の方法。 15．表面への軟骨礎質蛋白質の付着を促進する方法であって、リンク蛋白質のフラグメントを含む、軟骨礎質蛋白質に結合できるポリペプチドを該表面に固定することと、該表面を該軟骨礎質蛋白質に、該付着が生じるのを可能にするのに充分な時間接触させることとを含む方法。 16．ポリペプチドが、リンク蛋白質の縦に並ぶ反復配列を含むペプチドである請求項15記載の方法。 17．表面へのリンク蛋白質の付着を促進する方法であって、軟骨礎質蛋白質のフラグメントを含む、該リンク蛋白質に結合できるポリペプチドを該表面に固定することと、該表面を該リンク蛋白質に、該付着が生じるのを可能にするのに充分な時間接触させることとを含む方法。 18．軟骨礎質蛋白質のフラグメント、およびリンク蛋白質のフラグメントを含む融合ポリペプチド。 19．ポリペプチドが、ＬＰの、ヒアルロン酸とプロテオグリカンとの複合体に結合できるフラグメント、およびＣＭＰの、コラーゲンに結合できるフラグメントを含む請求項18記載の融合ポリペプチド。 20．ポリペプチドが、基本的に無傷のＬＰポリペプチドに付着したＣＭＰ−１またはＣＭＰ−２を含む請求項18記載の融合ポリペプチド。 21．リンク蛋白質のフラグメントを含む、軟骨礎質蛋白質に結合できるポリペプチド。 22．ポリペプチドが、リンク蛋白質の縦に並ぶ反復配列を含む請求項21記載のポリペプチド。 23．非軟骨性組織における、コラーゲンと、プロテオグリカン、ヒアルロン酸およびリンク蛋白質の複合体との相互作用を促進する方法であって、該複合体と該コラーゲンとの結合を促進できるポリペプチドを該組織に投与することを含む方法。 24．ポリペプチドが軟骨礎質蛋白質である請求項23記載の方法。 25．ポリペプチドが、軟骨礎質蛋白質のフラグメントを含み、コラーゲンおよびリンク蛋白質に結合できる請求項23記載の方法。 26．ポリペプチドが、軟骨礎質蛋白質のフラグメント、およびリンク蛋白質のフラグメントを含む融合ポリペプチドである請求項23記載の方法。 27．非軟骨性組織が皮膚である請求項23記載の方法。 28．ポリペプチドが、該ポリペプチドを発現できる組換えＤＮＡ分子を含む細胞として組織に投与される請求項22記載の方法。 29．細胞が、皮膚の繊維芽細胞である請求項28記載の方法。