DK161524B - Fremgangsmaade til isolering af et praeparat af et osteogent protein samt et praeparat i stand til at fremme osteogenese fremstillet ved fremgangsmaaden - Google Patents

Description

DK 161524B

i

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til isolering af et præparat af et osteogent protein, som er et medlem af P3-familien af immunologisk beslægtede proteiner, hvilket præparat overvejende er homogent med hensyn til en molekylvægt 5 på fra 22.000 daltons til 24.000 daltons, ud fra deminerali seret benvæv samt et præparat i stand til at fremme osteoge-nese fremstillet ved fremgangsmåden.

Benvæv er et højt specialiseret bindevæv med unikke mekaniske 10 egenskaber som følge af dets udstrakte matriksstruktur. Et netværk af fibrøse bundter bestående af proteinet collagen formodes at bidrage til benvævs spændings-resistente opførsel.

I tilgift er andre materialer, omfattende proteoglycaner, ikke-collagene proteiner, lipider og sure proteiner, der er 15 forundet med en mineral fase bestående primært af svagt kry stalliseret hydroxyapatit, aflejret i benets udstrakte matriks-arkitektur. Benvæv gendannes i pattedyr kontinuert igennem hele livet. Denne fysiologiske proces kan formodentlig tjene til at bevare egenskaberne som i ungt væv.

20

Benvævs dannelses- og fornyelsesprocesser udføres af specialiserede celler. Osteogenese vis-a-vis morphogenese og vækst af benvæv formodes udført af osteoblasterne (benvæv-dannende celler). Gendannelse af benvæv udføres tilsyneladende ved 25 et samspil imellem aktiviteterne i de benvæv-resorberende celler, kaldet "osteoclaster", og de benvæv-dannende osteo-blaster. Benskelette-1i er således ikke blot en arkitektonisk struktur med en mekanisk funktion, men er også et levende væv, der er i stand til at vokse, formes, omformes og repa-3P reres. Eftersom disse processer udføres af specialiserede levende celler, kan kemiske (farmaceutisk/hormonale), fysiologiske og fysiokemiske ændringer påvirke kvaliteten, kvantiteten og formgivningen af benvæv.

35 En række forskellige pathologiske forstyrrelser såvel som fysiologisk stress (f.eks. brud) nødvendiggør aktiv dannelse

2 DK 161524 B

af benvæv med hastigheder, der er signifikant højere end den, som udvises ved kroppens normale miljø. Det er således af værdi at identificere fysiologisk acceptable kemiske virkemidler (hormoner/farmaceutika/vækstfaktorer), som kan indu-5 cere dannelsen af benvæv på et forudbestemt sted. Sådanne virkemidler kunne enten tilvejebringe en tilladelig matriks-struktur for aflejring af benvævdannende celler eller bevirke. j vækststimulering af benvævdannende celler eller inducere differentiering af egnede stamceller for benvævsdannende celler.

10

Tilstedeværelsen af proteinholdige og prostaglandinlignende vækststimulatorer for osteoblaster er blevet undersøgt, se

Raisz, L.G. et al., The New England Journal of Medicine, bind 309, nr. 1, side 29-35 (1983) og L.G. Raisz et al., The New

England Journal of Medicine, bind 309, nr. 2, side 83-89 (1983).

15

Urist et al. har været i stand til at fremlægge bevis for, at benmatriks-associerede ikke-collagene proteiner kan isoleres ved opløsende behandling af demineraliseret benpulver, og at denne blanding af ekstraherede materialer såvel som delvis fraktionerede materialer opnået herfra indeholder benmorphogenetisk aktivitet, se M.R. Urist et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, bind 76, nr. 4, side 1828-1832 (1979); M.R.

Urist, et al., Proceedings of The Society of Experimental

Biology and Medicine, bind 162, side 48-53 (1979); H. Hanamura, 25 et al., Clinical Orthopaedics, bind 148, side 281-290 (1980); M.R. Urist, US-patentskrift nr. 4.294.753 {1981); M.R. Urist, US-patenskrift nr. 4.455.256 (1984); M.R. Urist, et al.,

Clinical Orthopaedics, bind 162, side 219-232 (1982), og M.R.

Urist, et al., Science, bind 220, side 680-686 (1983).

30

Baylink og hans medarbejdere har været i stand til at identificere en særskilt type aktivitet, som tilsyneladende sammenkobler benvæv-resorption med dannelsen af nyt benvæv, se G.A. Howard, et al., Metabolic Bone Disease and Related Re-35 search, bind 2, side 131-135 (1980), J.R. Farley, et al., Biochemistry, bind 21, side 3502-3507 (1982) og J.R. Farley, et al., Biochemistry, bind 21, side 3508-3513 (1982). Den aktivitet, som Farley et al. opnåede fra benmatriks, invol- 3

DK 161524 B

verer en ekstraktionsprocedure, der er forskellig fra den i den foreliggende opfindelse eller den beskrevet af Urist ovenfor, og har en større molekylvægt og blev kaldt "skelet-5 vækstfaktor" eller "skeletkoblingsfaktor".

De kendte procedurer og teknikker til opnåelse af formodede osteogene aktiviteter lider af adskillige mangler. Isoleringsprocedurerne er for lange, dårligt definerede og ufuldstændige.

10

Der er således ikke tilvejebragt en definitiv sammenhæng imellem aktiviteten og et kemisk karakteriseret, højt oprenset proteinpræparat. Et protein på omkring 17.000 daltons, frembragt fra kalvebenpulver, er blevet benævnt "benmorphogent protein", se M.R. Urist et al., Science, bind 220, side 680-686 (1983). Det hævdes at inducere effektiv dannelse af benvæv, specielt når det er til stede i en multimolekylær sammenføjning med visse andre proteiner afledt fra ben, som ved fravær af 17.000 dalton proteinet er ikke-osteogene. Urist 20 et al., Proceedings of The Society of Experimental Biology and Medicine, bind 173, side 194-199 (1983), identificerede også et 17.000 til 18.000 dalton protein fra humant benvæv.

Dette protein hævdes at inducere effektiv dannelse af benvæv, når det indgives sammen med 24.000 og 14.000 dalton proteiner 25 afledt fra humant benvæv. 24.000 og 14.000 dalton proteinerne er osteogent inaktive, når de anvendes uden 17.000 til 18.000 dalton proteinet, men kan eventuelt tjene som bærere for det aktive 17.000 til 18.000 dalton humanbenprotein. M.R. Urist et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,bind 81, side 371-375 (januar 1984) identificerer et 18.500 + 500 dalton protein, isoleret

O U

fra bovinben fra kvæg og benævnt bovinbenmorphogenetisk protein. 18.500 dalton proteinet inducerede dannelse af benvæv, når det blev indgivet alene eller sammen med forskellige kombinationer af andre benvævsafledede proteiner. Kun prøver indeholdende 18.500 dalton proteinet inducerede dannelsen v b af benvæv. Det blev desuden indikeret, at andre proteiner afledt fra bovinbenvæv med molekylvægte på henholdsvis 14.000, 17.000, 17.500, 22.000 og 34.000 daltons, ikke inducerede 4

DK 161524 B

dannelsen af benvæv, når de blev indgivet alene eller i forskellige kombinationer. Et protein afledt fra bovint benvæv på 24.000 daltons blev også nævnt, og der var ikke nogen indi-5 kation af, at 24.000 dalton proteinet inducerede dannelsen af benvæv.

Mindre rene præparater indeholdende proteiner med molekylvægte mellem 17.000 og 23.000 daltons, som hævdes at have 10 benmorphogenetiske aktiviteter, er blevet isoleret fra kilder som f.eks. museosteosarcoma, se H. Hanamura et al., Clinical

Orhopaedics, bind 153, side 232-240 (1980), og kanindentin, se M.A. Conover og M.R. Urist, The Chemistry and Biology of

Mineralized Connective Tissues, Elsevier North Holland, Inc., 15 side 597-606 (1981).

Proteinpræparater, der har været anvendt i de fleste af eksperimenterne med måling af osteogen aktivitet og beskrevet i litteraturen til dato, har været af utilstrækkelig renheds- 20 grad og har således ikke· ført til identifikationen af de sp-cifikke molekylære enkeltdele, der er ansvarlige for de observerede aktiviteter. Ydermere har de studier, der er rapporteret til dato, ikke været i stand til at afsløre nogen kemisk (biokemisk) sammenhæng imellem de aktive proteinenheder, der er til stede i de forskellige "benmorphogent protein"-præparater.

For eksempel omhandler beskrivelserne i US-patentskrifterne nr. 4.294.753, 4.455.256 og 4.434.094 alle processer til frak-30 . .

tionering af råproteinblandinger, opnået ved opløsningsekstraktioner af demineraliseret benmatriks. Beskrivelserne i US-patentskrift nr. 4.294.753, 4.455.256 og 4.434.094 giver i bedste fald en blanding af forskellige proteiner og ikke en overvejende homogen proteinenhed, der er identificeret som 35 havende osteogen aktivitet.

5

DK 161524 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til isolering af et præparat af et osteogent protein, som er et medlem af P3-familien af immunologisk beslægtede proteiner, hvilket præparat overvejende er homogent med hensyn til en molekylvægt 5 på fra 22.000 daltons til 24.000 daltons, ud fra demineraliseret benvæv, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at den omfatter, at man (a) behandler det demineraliserede benvæv under vandige betingelser med et sol ubi 1 iser ingsmiddel for det osteogene protein og derved ekstraherer det osteogene protein i opløsning med solubiliseringsmidlet; ^ (b) underkaster opløsningen for en første størrelsesfraktione ring til udvinding af protei nfrakt i oner, identificerer fraktionerne indeholdende det osteogene protein ved at måle deres ben inducerende aktivitet, kombinerer fraktionerne indeholdende det osteogene protein til en første proteinpool og koncentre-2Q rer denne første pool; (c) underkaster den koncentrerede første pool for en anden stør.relsesfraktionering til udvinding af proteinfraktioner med en molekylvægt på mellem 12.000 daltons og 40.000 daltons, atter identificerer fraktionerne indeholdende det osteogene 2 5 protein ved at måle deres beninducerende aktivitet, kombinerer fraktionerne indeholdende det osteogene protein til en anden pool og koncentrerer denne anden pool; 30 (d) underkaster den koncentrerede anden pool for et dialyse- trin, som omfatter enten (i) dialyse af den koncentrerede pool over for en vandigt opløsningsmiddel indeholdende trifluored-dikesyre og acetonitril og fjernelse af det uopløselige materiale til opnåelse af en opløselig fraktion eller {i i) dialyse 35 over for deioniseret vand til dannelse af en uopløselig pellet og solubi!isering af denne pellet med et vandigt opløsnings- !

DK 161524B

6 middel omfattende tri fluoreddikesyre og acetonitril til opnåelse af en opløselig fraktion,· 5 (e) underkaster den opløselige fraktion fra trin (d) for om vendt fase HPLC; og (f) udvinder et præparat af et osteogent protein.

Opfindelsen angår også et præparat af et osteogent protein, som er et medlem af P3-familien af immunolog.isk beslægtede proteiner, som overvejende er homogent med hensyn til en molekylvægt på fra 22.000 daltons til 24.000 daltons og i en sådan overvejende homogen tilstand er i stand til at -fremme osteo-15 genese i et pattedyr, fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede præparat omfatter et protein, som er medlem' af en familie af immu- 20 nologisk beslægtede primære osteogene faktorer (også her kaldet "P3-proteiner"), som hver for sig i overvejende ren tilstand inducerer dannelsen af benvæv på et forudbestemt sted i et pattedyr, når det indgives alene eller i en blanding med en anvendelig, farmaceutisk acceptabel bærer.

25

Under anvendelse af procedurerne beskrevet heri, kan proteiner (sådanne proteiner beskrives yderligere heri og er blevet givet identifikationsnavne som f.eks. Pi, P2, P3, P4 og lignende baseret på deres bevægelighed i polyacrylamidgeler under op-30 løsende, reducerende betingelser) frembringes fra benvæv af enhver pattedyreart. Blandt de proteiner, som er frembragt 35 7

DK 161524 B

således, er der et protein, i det følgende referet til som "den primære osteogene faktor" (også i det følgende referet til ved dets identifikationsnavn "P3 protein"), som inducerer dannelse af benvæv på et forudbestemt sted i et pattedyr, 5 når det indgives alene eller iblandet en anvendelig, farmaceutisk acceptabel bærer. En bestemt primær osteogen faktor kan frembringes fra benvævet af den pågældende pattedyreart.

F.eks. svarer den primære osteogene faktor, der er frembragt fra bovint benvæv til - og er immunologisk beslægtet med den primære osteogene faktor, der er frembragt fra humant benvæv og svarer til - og er immunologisk beslægtet med de respektive primære osteogene faktorer, som kan isoleres fra benvævet fra andre pattedyrearter. I den foreliggende opfindelse referer benævnelsen "primær osteogen faktor" eller "P3-pro-tein" til et bestemt P3-protein, som findes i benvævet fra den pågældende pattedyreart. Denne familie af immunologisk beslægtede proteiner omfatter således P3-proteinerne, frembragt af benvævet fra de pågældende pattedyrearter, hvor hvert P3-protein er en molekylær variant af de andre medlemmer af familien.

De osteogene stoffer inkluderer de osteogene faktorer, valgt fra gruppen bestående af: (a) proteinerne af P3-fami 1ien af immunologisk beslægtede proteiner (dvs. P3-proteiner); (b) de 25 osteogent aktive polypeptider, der er eller kan omdannes til osteogenisk aktive enheder, som er immunologisk beslægtede med en eller flere af P3-proteinerne; og (d) blandinger af osteogene faktorer, udvalgt fra (a), (b) og (c).

30 I den foreliggende opfindelse er de foretrukne P3-proteiner: P3-proteinet, som kan frembringes fra bovint benvæv (som f.eks. kalvebenvæv), og i det følgende referere til enten som "bovin-P3-protein" eller "kalve-P3-protein"; P3-proteinet, som kan frembringes af humant benvæv, i det følgende refereret til 35 8

DK 161524 B

som "human-P3-protein"; og P3-proteinet,· · som kan frembringes fra porcint benvaev, i det følgende refereret til ved "por- cin-P3-protein” δ P3-proteinerne udviser evnen til at fremme eller stimulere osteogenese på udvalgte steder i pattedyr. Ved indgivelse af præparaterne fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen foretrækkes det at anvende et præparat omfattende en osteogen faktor, der er frembragt fra en bestemt pattedyreart, til ind-gift i den givne pattedyreart (f.eks. foretrækkes det, at P3-proteinet frembragt fra humant benvæv indgives til mennesker); dog ligger anvendelsen af P3-proteiner, frembragt fra benvæv af pattedyrearter, som er forskellige fra den pattedyreart, der behandles, inden for rækkevidden af den forelig-*δ gende opfindelse.

Under anvendelse af velkendte procedurer, f.eks. kemiske, enzymatiske eller rekombinant DNA-teknikker, kan det være muligt at frembringe polypeptider, afledt fra de osteogene 20 P3-proteiner, beskrevet i det følgende, som udviser evnen til at fremme eller stimulere osteogenese. Proteiner eller polypeptider, som er eller kan omdannes til osteogent aktive enheder, der er immunologisk beslægtede med P3-proteinerne eller fragmenter deraf, betragtes også som værende inden for 25 rækkevidden af den foreliggende opfindelse. Osteogent aktive enheder, i det følgende refereret til som "aktive polypeptider" eller "osteogent aktive polypeptider", inkluderer enhver del af proteinerne eller polypeptiderne, som er genstand for den foreliggende opfindelse ved at have osteogen aktivitet og 30 funktionelle derivater deraf, som har osteogen aktivitet, og inkluderer enhver osteogent aktiv enhed, som kan produceres ved hjælp af konventionelle procedurer, som f.eks. kemisk syntese, enzymatisk modifikation eller rekombinant DNA-teknikker. Derivater af sådanne aktive polypeptider kan f.eks.

35 omfatte kemisk eller enzymatisk modificerede polypeptider; fusionsproteiner; eller polypeptider, bundet til et hensigtsmæssigt bæremateriale, som f.eks. en polymer, osv..

9 DK 161524 B

Præparaterne fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen finder anvendelse som f.eks. farmaceutiske virkemidler til stimulation af vækst af benvæv i pattedyr. Farmaceutisk acceptable præparater, der omfatter en eller flere af P3-proteiner-5 ne og/eller osteogent aktive polypeptider og/eller immunolo gisk beslægtede osteogent aktive enheder i kombination med en farmaceutisk acceptabel bærer er også beskrevet i det følgende. Sådanne midler kan efter frit valg indeholde andre bioaktive materialer eller andre bestandedele, som kan hjælpe ved indgiften af midlet eller bidrage til effektiviteten af midlet.

Med begrebet "immunologisk beslægtet" menes der, som det er anvendt i det følgende, ethvert polypeptid, som viser binding 15 til og/eller genkendelse af antigen-bindende regioner i an tistoffer, der er dannet eller frembragt imod proteinet. Betegnelsen "osteogenese" betyder dannelse af nyt benvæv eller induktion af vækst af forud eksisterende benvæv på bestemte steder som svar på lokal indgift (f.eks. implantering) af 20 et osteogent aktivt præparat på en farmaceutisk acceptabel måde. Betegnelsen "osteogen mængde" refererer til en mængde af det osteogene P3-protein og/eller osteogent aktive polypeptid og/eller immunologisk beslægtet osteogen aktiv enhed, som er tilstrækkelig til at frembringe den ønskede effekt.

25 Betegnelsen "osteogent aktiv" eller "osteogen" betyder, at præparatet er i stand til at fremme eller inducere osteogenese.

Kort beskrivelse af tegningerne.

30 Fig. 1 viser den elueringsprofil, der opnåedes ved Sepharose CL-6B søjlekromatografi af proteinerne, frembragt ved en otte timers ekstraktion af demineraliseret kalvebenpulver med 4M GuHCl-Ο,ΟΐΜ Tris.HCl-puffer (pH 7,0).

35 Fig. 2 viser den elueringsprofil, der opnåedes ved Sephacryl S-200 søjlekromatografi i 4M GuHCl-Ο,ΟΐΜ Tris.HCl-puffer (pH 7,0) af de proteiner, der var indeholdt i den aktive fraktion, frembragt fra Sepharose CL-6B søjlekromatografi.

10

DK 161524 B

o

Fig. 3 viser elueringsprofilen af de proteiner, der er til stede i den aktive fraktion fra Sephacryl S-200 søjlekromatografi på en omvendt fase Protesil 300 octylkolonne ved anvendelse af en acetonitrilgradient til elueringen af proteiner. 5

Fig. 4 viser resultaterne af elektroforetisk analyse af op-rensede benmatriksproteiner på diskontinuert natriumdodecyl-sulfat-polyacrylamidgeler i nærværelse af et reducerende middel .

10

Fig. 5A viser den elueringsprofil, der opnåedes ved væskekromatografi med stor ydeevne (HPLC) på en omvendt fase C8-kolonne af fragmenter af porcin-P3-protein, hvor fragmenterne blev dannet ved den enzymatiske digestion af p0rcin-P3-15 protein under anvendelse af Staphylococcus aureus V8 protease.

Fig. 5B viser den elueringsprofil, der opnåedes ved væskekromatografi med stor ydeevne (HPLC) på en omvendt fase €8-kolonne af fragmenter fra bovin-P3-protein, hvor fragmenterne 20 blev dannet ved. den enzymatiske digestion af bovin-P-3-protein under anvendelse af Staphylococcus aureus V8 protease.

Fig. 6A viser den elueringsprofil, der opnåedes ved væskekromatografi med- stor ydeevne (HPLC) på en omvendt fase C18r 25 kolonne af fragmenter af porcin-P3-protein, hvor fragmenterne blev dannet ved den enzymatiske digestion af reduceret, car-boxymethyleret porcin-P3-protein under anvendelse af Staphylococcus aureus V8 protease.

30 Fig. 6B viser den elueringsprofil, der opnåedes ved væskekromatografi med stor ydeevne (HPLC) på en omvendt fase Cl 8-kolonne af fragmenter af human-P3-protein, hvor fragmenterne blev dannet ved den enzymatiske digestion af reduceret, carb-oxymethyleret human-P3-protein under anvendelse af Staphy-35 lococcus aureus V8 protease.

Fig. 7 viser resultaterne af kompetitive radioimmunoassays, der måler radioaktivt mærket testantigens evne til at binde 11

DK 161524 B

o til specifikke antistofmolekyler i nærværelse af konkurrerende, umærkede antigenpræparater.

Under anvendelse af fremgangsmåderne beskrevet i det følgende, 5 kan den primære osteogene faktor og adskillige andre proteiner hver for sig oprenses til en overvejende homogen tilstand med udgangspunkt i råekstraktet af det demineralise-rede benpulver fra en given pattedyreart. F.eks. kan der fra benvævet fra en given pattedyreart opnås et overvejende rent 10 præparat af den primære osteogene faktor i tilgift til overvejende rene præparater af adskillige andre proteiner, som ikke fremmer benvævsdannelsen i fravær af den primære osteogene faktor.

15 Bedømt ud fra bevægeligheden af disse overvejende rene proteiner i polyacrylamidgeler under opløsende, reducerende betingelser, og under anvendelse af proceduren, i alt væsentligt som beskrevet af Laemmli, U.K., Nature, bind 227, side 680-685 (1970), er de forskellige proteiner blevet vedhæftet 20 navne som Pi, P2, P3, P4 osv. efter faldende tilsyneladende molekylvægt (se tabel I). Ækvivalente proteiner er blevet fremstillet af benvæv fra forskellige pattedyr. F.eks. er ækvivalente proteiner, svarende til den primære osteogene faktor med det tildelte navn P3 heri, blevet isoleret fra 25 benvæv fra forskellige pattedyr. Disse proteiner er repræsentative medlemmer af familien af immunologisk beslægtede P3-proteiner, hvor P3-proteinet, oprenset til en overvejende homogen tilstand, og fremstillet fra kalvebenvæv i overensstemmelse med fremgangsmåderne overvejende som beskrevet i 30 det følgende, har en tilsyneladende molekylvægt på 22.000 til 24.000 daltons, og har en aminoterminalsekvens og en amino-syresammensætning som beskrevet senere heri. P3-proteinet, isoleret fra humant benvæv og oprenset til en i det væsentlige homogen tilstand ifølge fremgangsmåden overvejende som beskrevet 35 heri, er ligeledes immunologisk beslægtet med kalve-P3-pro-teinet og porcin-P3-proteinet, og har en tilsyneladende molekylvægt på 22.000 til 24.000 daltons og en aminosyresammen-sætning som beskrevet senere heri. Ligeledes er P3-proteinet,

D'K 161524 B

0 12 der er isoleret fra porcint benvæv og oprenset til en overvejende homogen tilstand i overensstemmelse med fremgangsmåderne, overvejende som beskrevet heri, immunologisk beslægtede . med kalve-P3-proteinet og human-P3-proteinet og har en til- ' 5 syneladende molekylvægt på 22.000 til 24.000 daltons og en aminosyresammensætning som beskrevet senere heri. Ethvert af P3-proteinerne udviser osteogen aktivitet uanset benvævskilden. Desuden er to proteinpræparater, heri betegnet som P2 og P4, som ikke er beslægtede med P3-proteinet, også blevet 10 isoleret fra ben fra hver af adskillige forskellige pattedyre-arter. En familie af P2-proteiner, hvor hvert medlem er isoleret fra en given pattedyrebenkilde, er blevet karakteriseret.

Et typisk P2-protein, isoleret fra kalveben, har en tilsyneladende molekylvægt på 30.000 til 33.000 daltons, er ude 15 af stand til at inducere osteogenese i fravær af et repræsentativt P3-protein, og har en aminoterminalsekvens som beskrevet senere heri. Immunologisk beslægtede medlemmer af denne P2-proteinfamilie er blevet isoleret fra humanben og porcinben i overensstemmelse med fremgangsmåden overvejende som beskrevet 20 heri.

På lignende måde er en familie af P4-proteiner blevet isoleret i overensstemmelse med fremgangsmåderne beskrevet heri.

På det oprensningstrin, der opnåedes for P4-proteinet fra 25 kalveben, består P4-præparatet af to hovedkomponenter, som er ude af stand til at inducere osteogenese i fravær af P3-protein, og som har en tilsyneladende molekylvægt på omkring 16.000 til 18.000 daltons og er karakteriseret ved aminoter- minale aminosyresekvenser som beskrevet senere heri. Immuno-30 logisk beslægtede medlemmer af denne P4-protemfamilie, som*.........

ligeledes er ude af stand til at inducere osteogenese i fravær af P3-protein, er blevet isoleret fra humant benvæv og porcint benvæv i overensstemmelse med fremgangsmåden, overvejende som beskrevet heri.

Opfindelsen omhandler også molekylære elementer, der er blevet påvist ved anvendelse af antistoffer, dannet imod en hvilken som helst af de her beskrevne P3-proteiner. Andre proteiner 35

O

13

DK 161524 B

med molekylvægte, som er overvejende forskellige fra molekylvægtene af P3-proteinerne, er blevet påvist i andre pattedyre-væv (dvs. i andet end benvæv) ved disse andre proteiners evne til at blive genkendt af antistofferne imod P3-proteiner.

5 Specielt er proteiner med en tilsyneladende molekylvægt på omkring 40.000 til omkring 45.000 daltons blevet identificeret ved denne teknik i væv fra f.eks. rotte-, humane eller bovin-hjerner; kalve- eller rottetandpulp; bovint , humant eller porcint bruskvæv i luftrør eller led; og cellekulturer afledt 10 fra rottebenvævstumorer. Som bekendt repræsenterer immunologisk beslægtede proteiner med tilsyneladende molekylvægte, der er væsentligt højere end et biologisk aktivt elements ofte biosyntetiske forløbere eller kovalent modificerede former (som f.eks. glycosylerede og/eller acylerede former, osv.) 15 af det aktive element. Sådanne forløbere kan eventuelt udvise biologisk aktivitet, men kan ofte omdannes ved hjælp af standardkemiske eller -enzymatiske metoder til det aktive element. 40.000 til 45.000 dalton proteinerne, der kan opnås og identificeres ved de her beskrevne metoder, kan udgøre 20 en særlig familie af immunologisk beslægtede proteiner, som kan være osteogent aktive eller aktiverbare.

Andre proteiner med tilsyneladende molekylvægte på omkring 14.000 til omkring 16.000 daltons er blevet påvist i adskillige 25 pattedyrevæv ved deres evne til at binde til antistoffer, der er dannet imod et P3-protein. Disse proteiner kan være afledt fra P3-proteinerne eller deres forløbere ved specifik eller ikke-specifik proteasespaltning. Nogle af disse proteiner kan have osteogen aktivitet.

30

De specifikke antistoffer, dannet imod et P3-protein, har også påvist tilstedeværelsen af proteiner med molekylvægte fra omkring 22.000 til 26.000 daltons i pattedyrevæv, som ikke er benvæv, og i cellekulturer, afledt fra ikke-benvæv.

35

Disse proteiner kan være osteogent aktive.

Under betegnelsen "overvejende homogent" er det her hensigten at beskrive et protein, som er homogent ifølge en eller flere

O

14

DK 161524 B

renheds- eller homogenitetskriterier, som normalt anvendes af fagfolk inden for proteinkemi. F.eks. vil et overvejende homogent protein udvise konstante og reproducerbare karaktertræk inden for eksperimentelle standardafvigelser for para-5 metre, som f.eks. følgende: Aminosyreanalyse, amino- eller carboxyl-terminalsekvens, båndmønstre på konventionel poly-acrylamidgelelektroforese (PAGE) eller andre kromatografiske teknikker, molekylvægt, isoelektrisk punkt, immunologiske egenskaber og andre lignende parametre. Med betegnelsen er i 10 det imidletid ikke hensigten at udelukke kunstige eller syntetiske blandinger af proteinet med andre proteiner. Den foreliggende opfindelse inkluderer således blandinger af to eller flere overvejende homogene proteiner, f.eks. blandinger af P3 og P4; af P3 og P2; af P2, P3 og P4; af P3 med neutralt 15 matriksprotein(er); af P3 med andre osteogene proteiner, der endnu resterer at blive opdaget; af P3'er fra to eller flere pattedyskilder, og lignende. Det er heller ikke hensigten med betegnelserne at udelukke tilstedeværelse af mindre urenheder, som ikke påvirker proteinets biologiske aktivitet, 20 og som kan være til stede, f.eks. på grund af ufuldstændig oprensning.

Anvendelsen af præparaterne fremstillet ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan hensigtsmæssigt opnås ved administration, som 25 f.eks. ved implantering, af et lyofiliseret præparat eller suspension af en eller flere af de osteogene P3-proteiner og/eller et eller flere osteogent aktive polypeptider og/eller et eller flere immunologisk beslægtede osteogent aktive elementer i tilstrækkelig mængde til at fremme osteogenese på 30 det ønskede sted. Alternativt kan der anvendes farmaceutisk * acceptable materialer, som omfatter en eller flere af de osteogene P3-proteiner og/eller.et eller flere af de osteogent aktive polypeptider og/eller et eller flere af de heri beskrevne, immunologisk beslægtede osteogent aktive elementer og 35 en farmaceutisk acceptabel matriks, som f.eks. collagen-proteiner eller matriksmateriale afledt fra pulveriserede ben, og ekstraheret med stærke denaturerende virkemidler, eller andre farmaceutisk acceptable bærematerialer.

O

15

DK 161524 B

Fremgangsmåden, som der i alt væsentligt redegøres for i følgende eksempel, kan anvendes til opnåelse af overvejende rene præparater af de respektive P3-proteiner, hvor arten af det P3-protein, som opnås, simpelthen afhænger af, hvilken patte-5 dyreart benvævet stammer fra. Eksemplet er medtaget for yderligere at illustrere opfindelsen, men skal ikke opfattes som en begrænsning heraf.

Eksempel.

10

Isolering af de osteogene faktorer.

Behandling af ben.

I et typisk præparat behandles og demineraliseres lange ben 15 (ender af lange ben) fra et pattedyr, f.eks. ankler fra kalve, lårhoveder eller hvirvelsøjler fra humane ben, hele skinneben og lægben fra rotter under anvendelse af velkendte, konventionelle procedurer, som f.eks. dem, der er beskrevet i M.R.

Urist, US-patentskrift nr. 4.294.753 (1981). Disse og alle 20 andre heri citerede referencer inkorporeres heri ved henvisning dertil.

En hensigtsmæssig metode til behandling og demineralisering af ben er som følger: 25

Benhindelaget, der omgiver benet (benet fremskaffes fortrinsvis fra et ungt pattedyr og bevares nedkølet indtil behandling), fjernes mekanisk, og dernæst fjernes marven fra hulrummet i midten af benet ved skylning med koldt vand. Benet pulveri-seres til små partikler [generelt 1 til 2 mm i diameter] på konventionel vis, f.eks. ved anvendelse af en Wiley-mølle. Partiklerne vaskes dernæst grundigt med en pufret saltvandsopløsning, f.eks. 0,15M NaCl-Ο,ΙΜ Tris.HCl-puffer (pH 7,0) for at fjerne det meste af lipiderne og tilbageværende blod.

35

Partiklerne reduceres yderligere i størrelse ved at blive klippet i stykker, f.eks. ved anvendelse af en polytron homo-genisator (Brinkman Instruments), således at der opnås partikler på omkring 500 μ ^ller mindre i diameter. De homogenise-

O

16

DK 161524 B

rede partikler vaskes med pufret saltvand, f.eks. den, der er nævnt ovenover, og vand, dernæst med ethanol og til slut med ether. De vaskede, homogeniserede partikler vakuum- eller lufttørres dernæst og dette "benpulver" kan opbevares ved 5 -80°C i lang tid.

For at opnå effektiv demineralisering og proteinekstraktion bliver benpulveret siet for at opnå partikler med en størrelsesorden på omkring 75 til 500 μ i diameter. Demineralisering 10 (dvs. fjernelse af calciumphosphat fra benmatri'ksen) sker ved gentagne skylninger med en saltsyre (HC1)-opløsning, f.eks. ved at omrøre benpulver i 1 time med ca. 10 - 15 ml 0,5N HCl/g tørvægt af benpulveret, dekantering af væsken og gentagelse af denne proces tre eller fire gange. Det demineraliserede 15 benpulver vaskes dernæst grundigt med deioniseret, destilleret vand, indtil pH nærmer sig neutralitet. Vandet fjernes fra det demineraliserede benpulver ved vask med ethanol, dernæst ether og derpå tørring. Det demineraliserede benpulver kan opbevares ved lave temperaturer (f.eks. -20 til -80°C). De-20 mineralisering af benpulveret kan også opnås ved anvendelse af andre velkendte procedurer, f.eks. ved anvendelse af en chelator som f.eks. ethylendiamintetraeddikesyre.

For at bedømme, om det behandlede benpulver er tilstrækkeligt 25 demineraliseret efter HC1-behandling til at være klar til ekstraktionen af benmatriksproteinerne, testes det vandskyllede pulver for indhold af mineral [(dvs. calciumindhold), f.eks. ved hjælp af sølvnitratfarvningsmetoden af von Kossa, se J. von Kossa, Zieglers Beitr. 29, 163 (1901)]. Hvis von Kossa-30 farvningen er negativ, er det behandlede pulver tilstrækkeligt demineraliseret til at være klar til ekstraktion af proteiner. Sådant demineraliseret benpulver inducerer, når det implanteres i testdyr, dannelsen af nyt benvæv på stedet for implantation, dvs. at det indeholder formodede, men uidentificerede osteo-35 gene faktorer.

Ekstraktion af separation af proteiner fra demineraliseret benpulver.

O

17

DK 161524 B

Demineraliseret benpulver, fremstillet som beskrevet ovenfor, ekstraheres ved konstant omrøring med en vandig opløsning af omkring 2 til 8 molær (M) guanidinium-saltsyre (GuHCl) i en puffer som f.eks. Trizma-saltsyre (Tris.HCl) ved eller nær pH 7,0 i et tidsrum, der er tilstrækkeligt for at eks-5 trahere de ønskede proteiner. Fortrinsvis udføres ekstraktionen ved omrøring af det demineraliserede benpulver med 4M GuHCl-0,01M Tris.HCl puffer (pH 7,0) i nærværelse af en proteolytisk enzyminhibitor, såsom phenylmethylsulfonylfluo-1Q rid i 8-12 timer mellem ca. 4 og 20°C. Proteinerne fra demineraliseret benpulver kan ekstraheres ved at bringe det demineraliserede benpulver i kontakt med en hensigtsmæssig GuHCl-Tris.HCl-puffer i et tidsrum, som er tilstrækkeligt til at opnå væsentlige mængder af de ønskede proteiner. I en typisk 15 ekstraktion af 100 g demineraliseret kalvebenpulver ekstraheres ca. 1500 mg totalproteiner i et tre dages ekstraktionstidsrum med 4M GuHCl-Ο,ΟΙΜ Tris.HCl-puffer (pH 7,0). Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse har man fundet, at mere end 80% af den mængde totalprotein, der opnåedes i 20 en tre dages ekstraktion, kan ekstraheres i de første 8 til 12 timer med en 4M GuHCl-Ο,ΟΙΜ Tris.HCl-puffer (pH 7,0). I de første 8-12 timers ekstraktion udvindes typisk mere end 95% af den totale mængde lavmolekylære proteiner, som kan opnås i en tre dages ekstraktion. Den største osteogene akti-25 vitet er forbundet med disse lavmolekylære proteiner. Ca.

15 ml 4M GuHCl-Ο,ΟΙΜ Tris.HCl puffer (pH 7,0)-opløsning anvendes pr. gram tørvægt af demineraliseret benpulver. Efter endt ekstraktion filtreres ekstrakten, f.eks. over Whatman-papir, og filtratet koncentreres ved hjælp af konventionelle 30 metoder. I typiske eksperimenter anvendes et Amicon ultrafiltreringsapparat (Amicon Corporation, Lexington, Massachusetts) med et membranfilter eller en hul fiberfilterpatron med en grænsemolekylstørrelse på omkring 5.000 daltons til koncentreringstrinnet (dvs. membranen eller den hule fiberpa-35 tron tilbageholder molekyler, der har en molekylvægt, der

R

er større end omkring 5.000 daltons, f.eks. en egnet Diaflo ultrafiltreringsmembran som f.eks. YM-5 eller en hul fiber-

DK 161524B

18 O - patron som f.eks. H1P5-20 fra Amicon Corporation).

De forskellige her beskrevne puffere, f.eks. 4M GuHCl-0,0lM Tris.HCl-pufferen og opløsninger, f.eks. 0,5N HCl-opløsningen, 5 er vandige puffere eller opløsninger, i hvilke de angivne materialer er til stede i vand i de angivne koncentrationer. Proteinkomponenterne i den koncentrerede proteinopløsning blev fraktioneret ved anvendelse af forskellige konventionelle kromatografiske teknikker, omfattende high performance liquid 10 chromatography (HPLC) som følger:

Den initiale proteinfraktionering blev hensigtsmæssigt opnået ved kromatografi på en Sepharose CL-6B-(Pharmacia Chemicals,

New Jersey) kolonne. I et typisk eksperiment koncentreres 15 proteinerne, ekstraheret som det er beskrevet, ved ultrafiltrering til en koncentration på omkring 25 til 40 mg/ml. Kon- i centrationen af proteiner i forskellige ekstraktpræparationer og kolonnefraktioner blev sædvanligvis bedømt på konventionel vis, som f.eks. spektrofotometrisk måling af absorbansen i 20 opløsningerne ved 280 nm. En hensigtsmæssig mængde af proteinkoncentratet (en mængde, der tilvejebringer ca. 500 mg protein) blev tilført en 5 cm x 90 cm Sepharose CL-6B-kolonne, ækvi-libreret med 4M GuHCl-0,0lM Tris. HCl-puffer (pH 7,0). Kolonnen elueres med 4M GuHCl-Ο,ΟΙΜ Tris.HCl-puffer (pH 7,0) ved en 25 hydrostatisk trykhøjde på omkring 50 til 100 cm, og individuelle fraktioner på 15 til 20 ml volumen blev opsamlet. En typisk elueringsprofil under de nævnte betingelser opnåedes ved måling af abosrbansen af individuelle fraktioner ved 280 nm og er vist i fig. 1.

30

Den benvævsinducerende aktivitet af forskellige fraktioner, elueret fra Sepharose CL-6B-kolonnen, blev målt ved anvendelse af benvævsinduktionsanalysesystemet, som er beskrevet heri, og indikerede, at forrådet af fraktioner, identificeret som "C" 35 i fig. 1, indeholdt de faktorer, der er ansvarlige for den osteogene aktivitet. Forråd C, scan bestod af opsamlede fraktioner V, VI og VII, blev koncentreret under anvendelse af konventionelle procedurer. I en standardekstraktion repræsenterer forråd C, opnået

O

19

DK 161524 B

fraelueringen af totalproteiner pa Sepharose CL-6B-kolonnen, omkring 40% af de totale proteiner, opnået i en 8-12 timers ekstraktion af demineraliseret kalvebenpulver med 4M GuHCl- 0,01M Tris.HCl-puffer (pH 7,0). Yderligere fraktionering blev dernæst opnået ved kromatografi på en Sephacryl S-200-(Phar-5 macia Chemicals, New Jersey) kolonne. I et typisk eksperiment tilsættes 75 til 100 mg protein fra forråd C med en koncentration på omkring 25 mg/ml til en 2,2 cm x 115 cm Sephacryk S-200-kolonne, og kolonnen elueres med 4M GuHCl-Ο,ΟΙΜ Tris.HCl-puffer (pH 7,0) under en hydrostatisk trykhøjde på omkring 50 til 75 cm, og individuelle fraktioner på omkring 4 ml volumen opsamles. En typisk elueringsprofil, som blev opnået under de nævnte betingelser, er vist i fig. 2.

15 Fraktioner fra Sephcryl S 200-kolonnen blev opsamlet (se fig.

2), og de resulterende opsamlede materialer blev arbitrært betegnet som a, j3, γΐ, γΙΙ og 5.

Analyse ved anvendelse af konventionel diskontinert polyacryl-2q amidgelelektroforese i nærværelse af natriumdodecylsulfat [Laemmli U.K., Nature, bind 227, side 680-685 (1970)] af de proteiner, der er indeholdt i de respektive α til 6-forråd, tillod identifikation af adskillige proteiner. Det blev fundet, at a-forrådet indeholdt mindre mængder proteinkomponenter 25 med molekylvægte højere end 50.000 daltons. jS-forrådet indeholdt en hovedkomponent på 38.000 til 40.000 daltons, mindre mængder højmolekylære kontaminanter og små mængder lavmolekylære proteinarter med en vandringsevne på 14.000 og 30.000 daltons, γΐ- og γΙΙ-forrådene indeholdt fire hovedstørrelsesklasser 30 med vandringsevner på 31.000 til 35.000 daltons, 22.000 til 25.000 daltons, 16.000 til 18.000 daltons og 12.000 til 14.000 daltons. 6-forrådene indeholdt hovedsagelig proteiner i størrelsesordenen 12.000 til 14.000 daltons.

35 Måling af aktivitet i benvævsinduktionsanalysen, i alt væsentligt som beskrevet heri, indikerede, at γΐ- og γΙΙ-forrådene indeholdt faktorer, der inducerede dannelse af benvæv.

O

20

DK 161524 B

For at forenkle diskussionen angående den endelige oprensning af proteinerne, er der i tabel I angivet en liste over i proteiner, fundet i /3-, γ- og δ-forrådene. Som tidligere angivet blev hver af de respektive hovedkomponentproteiner givet et identifikationsnavn (Pi, P2 og lignende) som angivet i j tabel I. ! TABEL I.

Hovedkomponenter Bikomponenter 10 Beregnet Beregnet molekylvægt molekylvagt navn_X 10_- navn_X 1-0 PI 38-40 P2 30-33 PA 28-30 15 PB 24 0 P3 22-24 PC 19 P4 16-18 P5a 13-14 P5b 14* PD 12 20

Alle primære molekylvægtsangivelser af proteiner er baseret på bevægeligheder i diskontinuert polyacrylamidgelelektro- forese med 13% acrylamid ved pH 8,8 i den opløsende gel i 25 nærværelse af natriumdodecylsulfat og et reducerende middel.

Bikomponentproteinerne udgjorde mindre end 10 til 15% af det totale ma£eriale i de respektive prøver, der blev analyseret på geler. *P5b vandrede ved omkring 10.000 daltons under ikke- reducerende betingelser, hvilket tjener til at skelne P5a fra P5b.

30

Endelig oprensning af P3-proteinet.

Den endelige oprensning blev opnået ved omvendt fase HPLC af de delvis oprensede proteinpræparationer, der opnåedes fra 35 Sephacryl S-200 kolonnekromatografi, under anvendelse af en

Beckman Altex HPLC, reguleret af en Model 421 mikroprocessorenhed. To gennemløb er foretaget.

O

21

DK 161524 B

Et karakteristisk kendetegn ved nogle af proteinerne, specielt den heri beskrevne P3-proteinfamilie, er deres mangel på opløselighed i fravær af et stærkt opløsningsmiddel, såsom GuHCl. Desuden resulterede fjernelse af GuHCl, når mange proteiner var til stede samtidigt i et forråd, i en samtidig 5 fældning af andre proteiner samme med P3. En metode blev derfor udviklet, hvori snævre forråd kun bestående af en eller to hovedkomponentproteiner, blev indsamlet fra Sephacryl S-200-kolonnen og anvendt som udgangsmateriale for yderligere op-10 rensning med HPLC. Desuden blev forråd som dem beskrevet ovenfor for at maksimere tilbageholdelsen af proteiner i opløsning dialyseret direkte imod et vandigt opløsningsmiddel indeholdende 0,1% trifluoreddikesyre (TFA) tilsat acetonitril (ACN) i koncentrationer på mellem 10 og 15 volumen%. En kon-15 ventionel dialysemembranslange med en molekylvægttilbageholdelse på 3.500 daltons eller mindre kan hensigtsmæssigt anvendes i denne procedure. Proteiner, der er opløselige i TFAsACN-opløsningsmidlet, kunne derpå hensigtsmæssigt frembringes ved fjernelse af det uopløselige materiale fra hvert dialyseret 2o forråd ved centrifugering. De opløselige proteiner på dette trin kunne kromatograferes på en omvendt fase HPLC-kolonne, såsom.den her beskrevne Protesil 300 octylkolonne. I et typisk eksperiment blev de TFA:ACN~opløselige proteiner, opnået i topfraktionerne, tilført til en 0,46 cm x 25,0 cm Protesil 25 300 octylkolonne (Whatman) med en 10 mikron partikelstørrel se, ækvilibreret med 0,1% TFA:10% ACN. Proteiner, bundet til kolonnen under disse betingelser, elueredes ved en strømningshastighed på 60 ml/time under anvendelse af en lineær 10% til 80% ACN-gradient, opbygget over 45 minutter. I et typisk 30 eksperiment blev som angivet i fig. 3A, P2- og Pl-proteiner efter hinanden udvundet med stigende ACN-koncentrationer (afbildet ved den stiplede linie) fra γΐ-toppen. Pl-protein kan på lignende måde opnås fra β-toppen, mens P5a og P5b kan opnås fra 6-toppen. P3-proteinet elueres imellem γΐ- og γΙΙ-35 regionerne fra Sephacryl S-200-kolonnen. P3-proteinet findes i både de opløselige og de uopløselige materialer, der opnås ved dialyse af hensigtsmæssige fraktioner imod TFA-ACN. Manglen på opløselighed af P3-proteinet giver således overvejende

O

22

DK 161524 B

homogent P3-protein i det uopløselige materiale. P3-proteinet, der er bevaret i opløsning i TFA:ACN-opløsningsmidiet, kan yderligere .oprenses ved omvendt fase HPLC, overvejende som beskrevet ovenfor.

5

Den andén fremgangsmåde til oprensning af proteiner til en overvejende homogen tilstand blev konstrueret for at udnytte den høje uopløselighedsgrad af bestemte proteiner i 35.000 til 14.000 daltons molekylvægtstørrelsesordenen, specielt 1Q når de er til stede sammen i høje koncentrationer (f.eks.

omkring 10 mg/ml). Ved denne fremgangsmåde blev proteiner, der eluerer i γΐ- og γΐΐ-forrådene fra Sephacryl S-200 kolonnekromatografien (dvs. de forråd, hvor den benvævinducerende aktivitet findes) koncentreret til ca. 10 mg/ml. Materialet 15 blev hurtigt dialyseret [f.eks. seks skift, hver med 4 liter hver 2. og 3. time (under anvendelse af dialyseslanger med en molekylær tilbageholdelsesstørrelse på 2.000 daltons)] imod deioniseret, destilleret vand ved 15 til 23°C. Bundfældede proteiner blev opsamlet ved centrifugering og vasket adskillige 20 gange med deioniseret, destilleret vand, idet koncentrationen af protein blev holdt højere end 10 mg/ml skyllevand. Hoved-bestanddelene i dette bundfældede materiale viste sig at være P2, P3, P4 og P5a, idet små mængder Pl-protein i nogle tilfælde blev fundet i varierende mængder. Det endelige bundfald blev 25 . opløst i 0,1% TFA med 15% ACN, og det opløste materiale blev tilført til en Protesil 300 octylkolonne. Stigende ACN-koncen-trationer- eluerede P2-, P3-, P4- og P5a-proteiner som vist i fig. 3B, der er en typisk elueringsprofil.

30 Hver af hovedkomponentproteinerne, beskrevet i tabel I, blev yderligere oprenset ved rekromatografering på Protesil 300 octylkolonne. Forråd af fraktioner, opnået som angivet i fig.

3, blev koncentreret ved lyofilisering og genopløst i 0,1% TFA og ca. 10 til 20% ACN, afhængig af det specielle lyofili-35 serede materiale og igen tilsat til Protesil 300 octylkolon-nen. Proteinerne blev elueret fra kolonnen under anvendelse af en lineær 10-80% ACN-gradient ved en strømningshastighed på 60 ml/time under de tidligere heri angivne betingelser,med

O

23

DK 161524 B

undtagelse af, at proteinerne blev elueret over en længere periode og derved resulterede i et stort antal individuelle fraktioner. Renhedsgraden af hver af proteinfraktionerne blev bestemt ved anvendelse af konventionel, diskontinuert PAGE.

5 De fraktioner, som kun viste én hovedkomponent, blev anvendt til yderligere kemiske og biologiske karakteriseringer. Som regel blev disse fraktioner lyofiliseret og lagret som lyo-filiserede pulvere.

10 Fig. 4 afbilder resultaterne af en typisk diskontinuert gel-elektroforeseanalyse på natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-geler. Analysen blev udført på et diskontinuert polyacylamid-gelsystem i nærværelse af natriumdodecylsulfat og et reducerende middel, hvor den opløsende gel var 13% acrylamid og 0,35% T5 bisacrylamidtværbinder ved en pH på 8,8. Gelen blev kørt ved 50 volt i 30 minutter efterfulgt af 7 timer ved 100 volt. Proteinbånd blev synliggjort ved farvning med coomassie brilliant blue R. Kolonne 1 og 8 afbilder geler med følgende stand-ardmolekylvægtmarkører: 95.000 (phosphorylase A), 68.000 (bo-20 vinserumalbumin), 43.000 (ovalbumin), 31.000 ("kulsyre an-hydrase"), 21.000 (sojabønnetrypsinhæmmer) og 14.000 (ribo-nuclease). Kolonne 2, 3, 4, 5 og 6 viser respektivt Pi-, P2-, P3-, P4- og P5-proteinerne (CPl til CP5) fra demineraliseret kalvebenpulver, og kolonne 7 viser P3-proteinet (HP3) fra 25 demineraliseret, humant benpulver. Skraverede områder angiver bånd med lave koncentrationer.

Aminoterminalsekvenserne af P2-, P3- og P4-proteinerne, frembragt fra kalveben, blev undersøgt under anvendelse af følgen-30 de fremgangsmåde:

Aminoterminale sekvenser blev bestemt på en Applied Biosystems Model 470A Gas Phase Protein Sequencer. Rekonststituerede prøver blev tilført til fødepladen i et volumen på 30 microliter qc (μ1) i et opløsningsmiddel, der er egnet til at opløse proteinet (typisk trifluoreddikesyre).Polybren blev tilsat til pladen forud for tilsætningen af prøven, og reaktionsbeholderen blev forud gennemstrømmet 12 gange for at standardisere polybren/ pladebærematerialerne.

O

24

DK 161524 B

Edman-nedbrydningen af de resulterende omdannelser blev udført automatisk af instrumentet. Aminosyrederivaterne blev identificeret på en Hewlett-Packard High Performance Liquid j

Chromatograph Model 1084B under anvendelse af en acetat/ace-5 tonitril:methanolgradient som tidligere beskrevet, se Thomas, j K.A., et al., J. Biol. Chem., bind 256, side 1947-1955 (1981). j

En Beckman Cl8 mikrosphere omvendt fase kolonne blev anvendt ! til identifikationen. Den anvendte gassekvensbestemmer og HPLC-program tillod identifikation af alle 20 aminosyrederiva-10 ter i hver prøve.

Den delvis aminoterminale sekvens af kalve-P3-proteinet (kal-ve-P3-protein betegnes her også som "bovin-P3-protein") blev bestemt til at være ^N-Phe-Pro-Val-Tyr-Asp-Tyr-Ser-Pro-Ala-Arg-15 Leu-Lys-Glu-Ala.

Den delvis aminoterminale sekvens af kalve-P2-proteinet blev bestemt til at være ^N-Trp-^ -Pro-Tyr-2-Trp.

20 Den delvise aminoterminale sekvens af kalve-P4-proteinkomplek-set viste, at to hovedkomponenter var til stede med følgende sekvenser: ^N-Ala-Glu-Pro-Z -zf’.-Tyr; 25 H2N-Pro-Glu-Pro-<? -<?-Tyr.

Konventionelt accepterede forkortelser er her anvendt til angivelse af de respektive aminosyrer som følger: Ala, ala- nin; Arg, arginin; Asn, asparagin; Asp, asparaginsyre; Cys(l/2), 30 cystein; Gly, glycin; Gin, glutamiri; Glu, glutaminsyre; His histidin; Ile, isoleucin; Leu, leucin; Lys, lycin; Met, methio- nin; Phe, phenylalanin; Pro, prolin; Ser, serin; Thr, threo- nin; Tyr, tyrosin; Trp, tryptophan; Val, valin. "2" indikerer, når det anvendes i aminosyresekvensen, en aminosyre, som fort-35 sat er uidenfificeret.

Idet ekstraktions- og oprensningsprocedurerne blev fulgt overvejende som beskrevet heri,opnåedes at protein fra demineralise-

O

25

DK 161524 B

ret, humant benpulver med en molekylvægt på omkring 23.000 daltons og betegnes som human-P3-protein. Human-P3-protein, oprenset til en i alt væsentlig homogen tilstand, inducerede dannelsen af benvæv, når det blev implanteret. Human-P3-proteinet, 5 opnået fra humant ben, er beslægtet med kalve-P3-proteinet.

Idet ekstraktions- og oprensningsprocedurerne blev fulgt i alt væsentligt som beskrevet heri, opnåedes et protein fra demineraliseret porcint benpulver med en molekylvægt på omkring 23.000 daltons og betegnet som porcin-P3-protein. Porcin-P3- 10 protein, opnået fra porcint benvæv, er beslægtet med kalve-P3- og human-P3-proteinerne. De respektive kalve-, human-og porcin-P3-proteiner udviser følgende lighedstræk: (1) alle er ekstraherede og oprensede ifølge de heri 15 beskrevne fremgangsmåder og alle er kun lidt opløselige i vand i fravær af et stærkt opløsningsmiddel; (2) hvert af dem har den demonstrerede evne til at inducere benvævsdannelse, at dømme efter målinger af alkalisk phosphatase aktivitet og ved histologisk 20 undersøgelse af eksplanteret væv, der udvikledes som følge af implanteringen af proteinet; .(3) hvert af dem har omtrent samme tilsyneladende molekylvægt i det diskontinuerte natriumdodecylsulfat-poly-acrylamidgelelektroforesesystem; 25 (4) proteinerne er immunologisk beslægtede, idet anti stoffer frembragt imod det fra kalveben frembragte P3-protein binder til P3-proteiner; og antistoffer, frembragt imod porcin-P3-proteinet eller human-P3-proteinet, binder ligeledes alle tre P3-proteiner; 3Π (5) aminosyreanalyser viser signifikante lighedstræk, som beskrevet i tabel II, og (6) aminosyresekvenserne af peptider, dannet fra de respektive P3-proteiner, indikerer regioner med udstrakt homologi, se tabel IV.

Aminosyresammensætninger fra kalve-, porcin- og human-P3-pro- 35

O

26

DK 161524 B

teiner blev bestemt ud fra syrehydrolysater, frembragt med redestilleret 6N saltsyre (110°C, 24 timer). Rørene blev suget lufttomme forud for forsegling for at fjerne oxygen. Efter fjernelse af 6N saltsyren ved fordampning af rekonstituering _ i citratpuffer, blev hydrolysaterne analyseret på en Beckman

Model 6300 automatisk aminosyreanalysater.· Standardoperationsprocedurer blev anvendt som beskrevet af J.R. Benson, et al., "Amino Acid Analysis of Peptides" i Peptides: Analysis, Synthesis, Biology (E. Gross og J. Meienhofer, red.) Academic Press, 10 New York, bind 4, side 217-260 (1981). De fremkomne kvantitative data blev omregnet til led/mol protein, baseret på molekylvægtene, bedømt ved hjælp af konventionel PAGE.

Tabel II angiver de opnåede data for aminosyresammensætningen 15 af human P3-, porcin P3- og kalve P3-proteinerne. Dataene angiver middelværdierne af seks analyser pr. protein (tredobbelte analyser på hvert af to uafhængigt oprensede præparater) på en Beckman Model 6300 aminosyreanalysater. Det bør noteres, at bestemmelser af aminosyresammensætninger er gen-20 stand for fejl, der kan skyldes (i) graden af proteinhydrolyse, hvor udbyttet af visse aminosyrer kan variere på grund af variationer i stabilitet og/eller hydrolysabilitet af forskellige aminosyreled, (ii) mindre mængder urenheder, hvor de eksakte mængder kan variere fra et præparat til et andet, 25 (iii) computerudført analyse af data-, der stammer fra arealerne under toppene, svarende til positionerne af forskellige aminosyrer, og (iv) fejl, indbyggede i beregningen af den nøjagtige molekylvægt af proteiner ved hjælp af konventionelle teknikker, såsom SDS-PAGE eller kolonnekromatografi.

30 35

DK 161524B

O

27 TABEL II.

Aminosyresammensætning af P3-proteinerne; opnået fra ben af forskellige pattedyrearter 5 \

Antal led i

Human-P3- Porcin-P3- Kalve-P3-protein protein protein

Asparaginsyre & asparagin 21 24 23 10 Threonin 9 9 8

Serin 11 14 12

Glutaminsyre & glutamin 30 30 28

Prolin 10 13 8

Glycin 18 18 20 15 Alanin 97 8

Valin 9 10 8

Methionin 59 4

Isoleucin 65 5

Leucin 86 8 20 Tyrosin 20 24 16

Phenylalanin 78 8

Histidin 23 4

Lysin 55 5

Arginin 10 9 19 25 Tryptophan (10) (7) (4)

Cystein (6) (7) (6)

Tallene angiver det omtrentlige antal led (til nærmeste hele antal) af de angivne aminosyrer pr. mol af de respektive pro-30 teiner, hvis molekylvægte blev bestemt ved uafhængige, almindeligt anvendte metoder, såsom polyacrylamidgelelektroforese. Tallene for P3-proteinerne ifølge den foreliggende opfindelse ligger inden for eksperimentelle usikkerheder, der er indbygget i analysemetoden til bestemmelse af aminosyresammen-35 sætninger. Værdier i parenteser blev bestemt,baseret på ab-sorbans ved specifikke bølgelængder.

O

28

DK 161524 B

Dataene for aminosyresammensætningen viser det beregnede antal | led af hver aminosyre pr. molekyle af de respektive P3-pro- ! teiner. Som det vil være fagfolk bekendt, afhænger nøjagtigheden af aminosyresammensætningskdata af antallet af udførte analyser 5 og graden af proteinoprensning. Dataene for aminosyresammen- sætningerne indikerer, at sammensætningerne af human-, porcin-og kalve-P3-proteinerne ligner hinanden, f.eks. har de alle høje indhold af asparaginsyre (+ asparagin) og glutaminsyre (+ glutamin), og ligeledes et stort antal tyrosinled.

10

Tabel III indeholder aminosyresammensætnngerne af adskillige proteiner, som tidligere er blevet beskrevet, nemlig et 17.000 til 18.000 dalton benmorfogent protein fra kalveben, beskrevet af M.R. Urist, et al., Science, bind 220, side 680-686 (1983), 15 se "kalv^" i tabel III; et 17.000 til 18.000 dalton benmorfogent protein fra humant benvæv, M.R. Urist, et al., Proceedings of The Society of Experimental Biology and Medicine, bind 173, side 194-199 (1983), se "Human2''i tabel III; et 23.000 dalton benmorfogent protein fra kanindentin, M.A. Conover 20 og M.R. Urist, The Chemistry and Biology of Mineralized Connective Tissues, Elsevier North Holland, Inc., side 597-606 3 (1981), se "kanin " i tabel III; et fra bovint benvæv udledt protein, som angiveligt har osteogen aktivitet og med en molekylvægt på 18.500 daltons, M.R. Urist, et al., Proc. Natl.

25 Acad. Sci. USA, bind 81, side 371-375 (januar 1984), se ::"bovint 4 benVæv 18,5K protein " i tabel III, og et fra kalvebenvæv udledt protein,som ikke inducerer osteogenese og har en molekylvægt på 24.000 daltons, M.R. Urist, et al., Science, bind 220, side 680-686 (1983), se "kalvebenvæv 24K protein'’" i 30 , „ tabel III.

\ 35 29

DK 161524 B

i—!

H C

M <D

co Λ <0(0 fej p å c -H «H I -H · d) > d) m ^ ij >Γ]+ο onooono'»DO'^t,oO'^t(<Ni—i oo cd co o

(1)¾ P20fOrHO]PPC'iPP rH i—I ιΗ H

tn Φ <0 S P

c rH tø$ SJ

•Η Ό

Cd P

-P „ Φ fB p' c CO <1) -H ^ C C <D C m* H iaj o £; « H d) ooi'~r-ir)Ovop<3''<NJ'tfpcocofOvo(NLn

H S+J p-rlStn-PrH P CN P P P rH rH H

H (0 O fl > C “ O

ω p O d) oo p ci d) a οι cq^Hft HP Τ3 ffl >i d) d)

< co Ό P

Eh O 0) dJ

C P -P co * •H (D P C h g^j o -η ^ootoco^r^cTi'ifiH'^t^-LnLnfoocOi—i ·

(fl p Q. CrOCNOOrH Ή H

o a <0 CP Q) <0 tø <0 a p <0 tn P d)

C P

•H <U <U CN pj & m -H § ^ir)«^ær-coiNcocNcocs]inincor--cN'^

H &i H g P P ^ P rH PH

rH -H Ti P

C rH Ή id (1) Ό Eh S Ή

g -P

<0 rH rn CO o) > w (ji ,—i r-r^<y>cocMLDHcnnæcNr^cofor'C3oro ·

£j -H Γβ p P P P P P rH H

H rH tø

C C

CO H ^ C 0 ^ I + +

O W w P

rj QJ "Wr -Hp appdo>n'<tjp-pa>dpa>cocotnco&

g > COjCOJPPPPCddJPfljrH'dPiHp^lP

<j cn| <IEHCOØpHØr<I>SHHEHp9lxlPl<IOEH

O

DK 161524B

30 *Tallene i tabellen angiver omtrentlige antal led (til det nærmeste hele antal) af de angivne aminosyrer pr. mol af de respektive proteiner, hvis molekylvægte blev bestemt med uafhængige, almindeligt anvendte metoder, såsom polyacrylamid- 5 gelelektroforese. I.B. betyder, at der ingen bestemmelse er foretaget af den angivne aminosyre.

^ - A 17.000 til 18.000 dalton benmorfogent protein fra kalveben væv .

2 10 - A 17.000 til 18.000 dalton benmorfogent protein fra humart benvæv 3 - A 23.000 dalton benmorfogent protein fra kanindentin.

4 - A 18.500 dalton benmorfogent protein fra bovint benvæv 5 - A 24.000 dalton protein f ra kalvebenvæv, som ikke inducerer 15 osteogenese.

De her angivne data for aminosyresammensætningen viser, at P3-familien af. osteogene faktorer adskiller sig. fra alle andre biologisk aktive proteiner, som hævdes at være invol-20 veret i osteogenese, og som tidligere er beskrevet.

P3-proteiner,dannet fra ben af forskellige pattedyrearter, -udviser store kemiske lighedstræk.

25 Proteoly tiske spaltningsmønstre.

Proteaser, enzymer, som digesterer proteinmolekyler til mindre polypeptidfragmenter, spalter peptidbindinger med en vis grad af specificitet. F.eks. spalter enzymet trypsin peptidbin-30 dinger efter arginin og lysin, og V8-proteasen fra Staphylo- coccus aureus spalter peptidbindinger efter asparaginsyre og glutaminsyreled. Således vil, hvis to proteiner er ens i deres aminosyresekvenser, fragmenterne dannet fra et protein have homologe modparter i det andet protein, når hvert protein 35 digesteres med den samme protease. De proteolytiske spaltningsmønstre af P3-proteinerne blev studeret under anvendelse af V8-proteasen fra Staphylococcus aureus.

O

31

DK 161524 B

I et eksperiment blev porcin-P3- og kalve-P3-proteinerne behandlet samtidig med Staphylococcus aureus V8-protease, og digestionsproduktet blev udsat for en stærkt reducerende behandling for at frigive fragmenter, som måtte blive holdt 5 sammen af disulfidbindinger. Efter den reducerende behandling blev de således dannede peptidfragmenter udsat for omvendt fase HPLC på en Synchropak C8-kolonne. Peptidfragmenterne blev elueret ved anvendelse af en liniær gradient, fra 20 til 70 volumen% acetonitril i 0,1% trifluoreddikesyre i vand.

10 Elueringen af peptiderne blev fulgt ved måling af absorbansen af eluatet ved 229 nm. Omvendt fase HPLC elueringsprofilen af det V8-protease digesterede og reducerede porcin- P3-protein på Synchropak C8-kolonnen er vist i fig. 5A; og elueringsprofilen for det på samme måde behandede bovin-P3-protein er vist i 15 fig. 5B.

I et andet eksperiment blev porcin-P3- og human-P3-proteiner begge først behandlet med et reducerende middel, og de frie sulfhydrylgrupper blev kemisk derivatiseret ved S-carboxymethy-20 lering under anvendelse af velkendte teknikker. De S-carboxy-methylerede proteinpræparater blev hver især digesteret med Staphylococcus aureus V8-protease. Peptidfragmenterne, som resulterede fra V8-protease-digestionen, blev udsat for omvendt fase HPLC på en Whatman C18-kolonne. Peptiderne blev elueret 25 under anvendelse af en lineær acetonitrilgradient fra 20 til 70 volumen% i 0,1% TFA i vand. Elueringen af peptiderne blev fulgt ved måling af absorbasen af eluatet ved 229 nm. Omvendt fase elueringsprofilen af det S-carboxymethylerede og V8-protease-digesterede porcin-P3-protein på Whatman C-18-kolon-30 nen er vist i fig. 6A, og elueringsprofilen for det på samme måde behandlede human-P3-protein er vist i fig. 6B.

Yderligere aminosyresekvensinformation.

35 En overbevisende test for graden af slægtsskab imellem to eller flere proteiner opnås ved undersøgelse af proteinernes aminosyresekvens. Aminosyresekvenserne af forskellige dele af P3-proteinerne, udvundet fra kalve-porcint og humant benvæv er blevet sammenlignet. Aminosyresekvensdataene blev opnået

O

32

DK 161524 B

under anvendelse af konventionelle procedurer, såsom gasfase-mikrosekventering, på de intakte P3-proteiner eller peptid- j fragmenter fra disse. De intakte P3-proteiner fra humant og porcint benvæv gav ikke nogen aminosyresekvensinformation, 5 hvilket sandsynligvis indikerer, at det aminoterminale amino- s^xeled i hvert af dis-se proteinpræparater var blokeret; derimod var det muligt at opnå aminosyresekvensinformation, når kalve-P3-proteinet blev analyseret for at bestemme dets aminoterminale aminosyresekvens (se den tidligere angivne aminoterminale 10 aminosyresekvens for kalve-P3-protein). Som det er kendt inden for proteinkemien, kan modifikationer, som blokerer det aminoterminale aminosyreled, være fysiologisk, dvs. finde sted under biosyntesen af proteinerne i vævet, eller de kan somme tider finde sted under oprensningsprocessen. For at opnå yder-15 ligere aminosyresekvensinformation, blev forskellige peptidfragmenter, opnået ved Staphylococcus aureus V8-proteasedigestion af de respektive P3-proteiner som tidligere beskrevet, isoleret og sekventeret. Aminosyresekvensdataene for de isolerede peptider er angivet i tabel IV. D.en information, som er angivet 20 i tabel IV, viser, at homologe peptidfragmenter fra kalve-, human- og porcin-P3-proteiner i realiteten har identiske aminosyresekvenser, hvilket indikerer, at pattedyrs osteogene faktorer, (dvs. P3-proteiner, frembragt fra forskellige pattedyrs benkilder) er beslægtede proteiner.

25 30 \ 35

O

33

DK 161524 B

TABEL IV.*

Aminosyresekvenser fra forskellige homologe domæner af P3-proteiner, isoleret fra forskellige pattedyrs benvævs-5 kilder.

Kalv: -Met-Asp-Met-Ile-Arg-Tyr- ? -Tyr-Asp-

Porcin: -Met-Asp-Met-Ile-Arg-Tyr- ? -Tyγ ιο

Kalv: -Tyr-Tyr-Met-Arg-Gly-Ala-Thr-Thr-Thr-Phe-

Porcin: -Tyr-Tyr-Met-Arg-Gly-Ala-Thr-Thr-Thr-Phe-

Ser-Ala-Val-Human: -Tyr-Tyr-Met- 15

Porcin: -Ile-Asn-Arg-Ala-Gly-Met-Gln-Trp-Tyr-Gln-Thr- ?-?-Asn-Asn-Gly-Leu-Val-Ala-Gly-phe-Lys-Tyr-Human: -Ile-Asn-Arg-Ala-Gly-Met-Gln- ? -Tyr-Gln- 2o Porcin: -Gly-Tyr-Asp-Ala-Gln-Trp-Asn-Tyr-Ala-Ser-Met-Pro-His-Pro-

Gln- ? -Leu-

Human: -Gly- ? -Asp-Arg-Gln-Trp-Asn-Tyr-Ala- ? -Met-Pro- ? -Pro-Gln- ? -Leu-Gly-?-Thr- 25 * Identiteten af de respektive aminosyreled er angivet ved konventionelt accepterede forkortelser; "P" angiver led, som for nuværende ikke er identificerede.

30 35 34 · ;

DK 161524 B

O ; i Påvisning af immunologisk slæqtsskab imellem P3-proteiner.

P3-proteiner, udvundet fra ben fra forskellige pattedyrearter, er blevet anvendt til at immunisere laboratoriedyr, såsom 5 kaniner, for at danne monospecifikke antistoffer, som er i stand til at binde til de respektive P3-proteiner. I et typisk eksperiment blandes ca. 100 mikrogram af det pågældende P3-protein, mod hvilket der skal dannes antistoffer, med Freund's komplette hjælpestof og inokuleres i trædepuderne og subkutant 10 i kaniner; 10 til 14 dage senere inokuleres subkutant en lignende mængde protein, blandet med ukomplet Freund's hjælpestof.

Efter yderligere 10 til 14 dage inokuleres dyret med yderligere 50 til 100 μg protein, blandet i en 10% opløsning af aluminiumhydroxid. Dyret immuniseres derefter med fire ugers intervaller j 15 med 50 til 100 pg protein. | i

De specifikke antistoftitere, udviklet imod de respektive P3-proteiner, er blevet målt ved (a) en enzymkoblet immuno-sorbentanalyse (ELISA) og ved (b) antistoffets evne til at 20 immunopræcipitere radioaktivt mærkede P3-proteinmolekyler. ! I en typisk ELISA-analyse bindes 10 til 20 nanogram af testantigenet (dvs. det pågældende P3-protein, som testes) til en plastoverflade ved lufttørring af en proteinopløsning i brøndene på mikrotiterplader (Falcon Products eller Bellco 25 products). Fortyndinger i serier af testantisera inkuberes i brøndene, ubundne antistoffer fjernes ved skylning, og de bundne antistoffer inkuberes dernæst med et andet enzymkonjugeret antistofpræparat, rettet imod immunoglobulinerne af den art, i hvilket testantiserummet blev dannet. Mængden af enzym, 30 bundet i hver brønd, kvantetiseres dernæst ved hjælp af en hensigtsmæssig farveanalyse. I sådanne tests kan sera med høje titere af antistof imod testantigenet fortyndes adskillige tusinde gange og stadig udvise en signifikant farveudvik- ling.

35 I en anden analyse, dvs. radioimmunopræcipiteringsanalysen (RIP), mærkes testantigenet med en radioaktiv isotop, såsom 125 I. En fikseret mængde af det radioaktivt mærkede antigen inkuberes dernæst med fortyndingsserier af testantiseraeneo

O

35

DK 161524 B

Det immunkomplekse antigen bundfældes, enten ved anvendelse af et andet antistof, rettet imod immunoglobulinerne fra den art, i hvilken testserummet blev dannet, eller ved anvendelse af en fikseret Staphylococcus aureus bakteriesuspension, eller 5 ved anvendelse af Staphylococcus aureus protein A, immobiliseret på små kugler. Som i den tidligere angivne ELISA-procedure kan serum med høje titere af specifikt antistof fortyndes adskellige tusinde gange og stadig bundfælde signifikante mængder af det radioaktivt mærkede antigen.

10 I begge analyser bestemmes de specifikke titere af antistofferne i testserumprøverne ved at fratrække værdierne (farve eller bundfældet radioaktivitet), der er opnået med serum fra ikke-immuniserede dyr eller fra dyr, der er immuniseret med et 15 protein, som er ubeslægtet med testproteinet. Specificiteten af antiseraene, såvel som det immunologiske slægtsskab af forskellige proteiner kan bedømmes i begge analyser ved at undersøge de relative effekter af serumfortyndinger på graden af binding af antigenet.

20

Det immunologiske slægtsskab imellem P3-proteinerne, udvundet fra kalve-, porcint- og humant benvæv, blev testet under anvendelse af de ovenfor beskrevne analyser. Resultaterne af testningen er angivet i tabel V.

25 30 35

DK 161524B

36 Ρ Ή φ ·Η Ρ Μ 4-> Φ ' Φ Ό ϋ Ό 13 ·

(D ΦΠ 3 g HOC

C g Α Ό Φ $ ·η ·γΙ Φ Ο Ρ 4-4 in φ

t7> 43 β O O k 0ΐ ™ Ό 4J 4J

ο g φ « ο m ο ο a ο Μ c > ο ε 3 Ρ g 4"> Η CM Η C«!)"3 3 ·Η ^ ο ρ φ 3 ........ ρ φ ω * 33+)¾ X! Φ Φ S3 Η Η Η Η φ β Η Φ Μ ω·π ό ω “ ρ φ ε φ β ΟΓ5'ΠΦ0Φ Ό 4-1 3 Η *>hCH Ό ·Η Ρ β « ε ft Ε ® 3 Ό 0 ρω ε s · > 2 * φ ο Φ -Γ-> CM-HC Ρ Φ g g Ρ Ρ βφ Μ -Η ΟΟ Φ 0 3 ^ 3 Μ •Η > Ρ Φ a u Ο Ο Ο Ο φ _^Μ Ρ Ό ·Η φ Ρ >1 43 φ Ρ ΙΛ CM Η Η ΠΐμΐΌΗ φ φ ε 4-> Φ Ό η β 0 ........ -Ρ Φ Φ W ε θ!> 4J ·Η £4 Η Η Η Η C ^ *ηι ·Η · Ρ 0 φ » β , Φ φ , g 4-> 4-> Ρ

A CP Α Φ Φ -3 κ β Φ A

1 13 ·Η ΗΛίΓΟ 4-4 Η ω φ Λ! πΦηΡηΑ Φ φ ^ Ρ 43 A g Η Φ Ο φ Λ .. W I 3 , Φ Ρ C Ο øl C ^ Φ g β φ-p^ ΙΗ Η VO Ο Ο Ο β Φ > 2 ·Η ' • >Φω > Η Ν ΟΙ Η Η > Ό Ρ 01 43 g > ·η ρ ρ ·ο ........ -α β 3 W β φ -ΡΦ0 CQ Η Η Η Η β Φ , , ·Η>.

J Λ! W 4-1 >t mm 13 Φ Ρ

Η Φ -Η 43 τΐ ω 2 β Η A

«&βφ Ρ φ , Η >, XI

< W 3 Ρ Ο > ft ^ 43 Εη Φ g 4-4 ιρφβρΜ Ρ Β Ρ Ό Η Ο Φ , Ηβ C Φ ^ W > 4 φ φ φ Φ ·* > Φ όρχ! η φ >ι φ φ egg* Φ Α Η > Η Φ Ο ” 13 Φ 13 . Ο g Φ Ρ JQ 13 Φ 'ft

ΟΡΡ φβΟΟ ΟβΦ S

ε φ 4-4 ε ε φ ο . ο ο φ φ a - ε - ό Η 13 3 g ΟΙ (S Η Η I φ Q — >1 -ρ ρ -Ρ ........ .+»<·> φ ε * Ρ - Φ φ φ Μ Η μ Η Η φ Μ φ- 8 Φ5 Φ Ρ 13 ΦΡ >ΗβΡ 4J (4 4-4 φ β φ Ή J 8 Α Φ θ' 2 44 β 3 4-1 φ O' W Ρ g > ο c 0 ·Η > Φ ·Η Η β J3 3 ·Η β 4J β φ β α φ "Η +j ρ σιΦνο ΦΦ3Η3 ΦφββΟ •Η ,¾ ρ g ·β ΡβφΦΦΗ.

-Ρ Ρ φ g Ή Ο Ο ΦΦ-Ρ Ο s

βφφ -Ρ Η U Ο · Ο Ο 04 β Ρ Ιίΐ · 4J

ΦΡβ -Η Ρ 04 a ΙΟ Η Η β Ρ 3 φ w (0 Η 4-4 Η -Ρ Ρ 0....... φ Η φ g Ο φ 4-1 Φ / φ Α Η Η Η Η X! β > ε Η -Ρ 43 φ ε -ρ < c φ>λ·ηφφ.φ 3 ο ω ·η -ρ ρ ι ja c "β φ 2 Ρ Ρ Η β φ ·Η φ Φ φ Α £) ft Φ Α >4 Φ CO Φ4-ΙΛ!-Ρσ4 43 Φ I Η 34 Λ β ε -Ρ Λ4 -Η -Ρ φ •Η Η Ο β 3 Φ Ή Φ 43 φ 3*- Β Η Α φ βΟΓΟΟ ΦεΡ β β 43 Λ4 Ρ Η Ο · Ο Ο Ό ·Η φ β β φ ·Η ·Η 4-1 > (Ο ffl ΟΙ Η ΦΦΦ φ I > = 0 ·* · ·· ·· ·γΙ ^ ·γ4 Ό 43 Η £Q Η Η Η Η Φ Η 4-1 3 -Ρ Ϊ4 β g ·Η Φ -Η Ο, Μ φ ' Φ Χ2 u β Φ 13 Ρ 4-4 Ο Ρ ft β Η >| φ φ ε φ 2 φ μ -ρ β Η 43 ε σ> ZJ Ρ 4-1 Η φ φ Η £4 ΓΟ Η ·ι-4φ·Η β,φ Φ4-Ι.Ω 44 0 ft A Α 43>ν·Η343 -Η Φ ·Η β I Η β 13 ί“ Η dP Ο s Φ 44 β “Η β β <φφβ^430φ Ε-ιβ-ΡΟφ-Η Φ > Ρ ε > η ·Η 44 10 ft Φ· 0030 J 43 43 Ρ φ 4—I · Η η ft s η Μφβο»ΦΡίΦβ = Η Ό Φ 4-4 β CM Ο φ Γ0

DK 161524 B

O

37

Resultaterne angivet i tabel V viser tydeligt, at antistoffer rettet imod ét P3-protein kan binde P3-proteiner fra andre arter, hvilket indikerer, at de respektive P3-osteogene faktorer fra pattedyr er immunologisk beslægtede med hinanden. Graden 5 af slægtsskab imellem P3-proteinerne, udvundet fra ben fra tre forskellige pattedyrearter (dvs. P3-proteinet udvunde#: fra kalvebenvæv, P3-proteinet udvundet fra humant benvæv, og P3-proteinet udvundet fra porcint benvæv) blev yderligere testet ved konkurrerende radioimmunoanalyser. Konkurrerende 10 radioimmunoanalyser er baseret på umærkede antigenmolekylers evne til at konkurrere med bindingen af det radioaktivt mærkede testantigen til de specifikke antistofmolekyler, dannet imod testantigenet. Graden af immunologisk slægtsskab imellem et protein og testantigenet bestemmes ved øgningen af fortræng-15 ningen af det radioaktivt mærkede testantigen, der er bundet til antistoffet, når stigende mængder af det umærkede, konkurrerende protein tilsættes til inkubationsblandingen. I konkurrerende radioimmunoanalyser konkurrerer human-P3-proteinet ikke så effektivt som kalve-P3-proteinet i fortrængning af 20 radioaktivt mærket kalve-P3-protein fra binding til antistof fer, dannet imod kalve-P3-proteinet (fig. 7A). I en lignende analyse konkurrerer både human-P3 og porcin-P3-proteinerne effektivt med bindingen af radioaktivt mærket porcin-P3-protein til antistoffer, dannet imod pcrcin-P3-protein. Kalve-P3-prote-25 inet konkurrerede med en meget lavere effektivitet (fig. 7B).

I en tredje analyse var porcin-P3-protein mere effektivt end kalve-P3-protein til fortrængning af radioaktivt mærket hdfcan-P3-protein fra binding til antistoffer, dannet imod human-P3- protein (fig. 7C). Eftersom antistoffer imod porcin-P3-proteinet 30 immunofældede det jodmærkede hu.man-P3-protein, blev P3-pro- teinerne sammenlignet for deres evne til at konkurrere i en bred krydsart-analyse (fig. 7D). Kalve-P3-proteinet viste igen den mindst effektive konkurrence i denne analyse. Den kendsgerning, at de respektive P3-proteiner konkurrerer med 35 hinanden om bindingen af specifikke antistoffer, dannet imod et givet P3-protein, viser, at de respektive P3-proteiner er immunologisk beslægtede. Denne konklusion underbygges yderligere af resultaterne af andre konkurrerende

O

38

DK 161524 B

radioimmuno-analyser, hvori ubeslægtede antigener^ inkluderende ikke-P3-proteiner, udvundet fra forskellige pattedyreben, ikke var i stand til at konkurrere med P3-proteiner om bindingen af specifikke antistoffer, dannet imod et givet P3-protein.

5 I fig. 7A, 7B, 7C og 7D identificerer ordet "bovin" kurver, der angår bovin-P3-protein* "human" identificerer kurver, der angår human-P3-protein; og "porcin" identificerer kurver, der angår porcin-P3-protein.

10 Graden af immunologisk slægtsskab imellem P3-proteinerne blev også testet ved den evne,som antistoffer rettet imod et givet P3-protein har til at binde til "denaturerede" eller "denaturerede og reducerede" former for P3-proteiner af andre arter ved anvendelse af immunoaftrykteknikken. I proceduren for 15 immunoaftryk denatureres proteiner ved opvarmning .i natrium- dodecylsulfat i tilstedeværelse eller fravær af et reducerende middel. De denaturerede eller denaturerede og reducerede proteiner udsættes dernæst for denaturerende polyacrylamidgelelek-troforese i tilstedeværelse af natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE).

20 Proteinmolekylerne overføres dernæst til et nitrocellulose- membranfilter. Dette aftryk af de elektroforetisk adskilte proteinbånd inkuberes dernæst med antistoffer rettet imod de respektive proteiner. Bindingen af antistof til et proteinbånd måles ved evnen af radioaktivt mærket eller enzymkonjugeret 25 protein A fra Staphylococcus aureus til at binde til antistof ferne, der er vedhæftet proteinerne på nitrocellulosemembranen. Placeringen af de egnede proteinbånd, genkendt af antistoffet, visualiseres dernæst ved autoradiografi. Denne teknik tillader at identificere den molekylære komponent, som er genkendt 30 af et specifikt antistofpræparat.

\ 35 39

DK 161524 B

o Når kalve-P3-protein blev blandet med et antal ubeslægtede proteiner, elektroforetiseret igennem natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgeler og dernæst analyseret ved hjælp af immu-noaftryk under anvendelse af kanin-antistoffer, dannet imod 5 kalve-P3-prbteinet, blev^kun et bånd (som havde bevæget sig til en position, der angav en tilsyneladende molekylvægt på ca. 23.000 daltons, bestemt ved dets vandring i SDS-PAGE) visualiseret ved autoradiografi.

10 Graden af immunologisk slægtsskab imellem kalve-, porcin- og human-P3-proteiner blev også undersøgt ved hjælp af immu-noaftrykteknikken. Antistoffer dannet imod enten kalve-p3-pro-teinet eller porcin-P3-proteinet, bundet til P3-proteiner udvundet fra kalve-, porcint og humant benvæv. Yderligere 15 blev mange fragmenter (dannet ved proteolytisk digestion) af et P3-protein genkendt af antistoffer, dannet imod P3-proteinet fra en anden art. Disse resultater indikerer, at der imellem de respektive P3-proteiner er bevaret områder, som kan påvises immunologisk. Dette understøttes også af amino- 20 syresekvensdata.

Identifikation af andre proteinholdige materialer, der er beslægtet med P3-proteinerne.

25 Proteinfaktorer, der inducerer vækst/regenerering af patte-

dyrevæv, biosyntetiseres ofte på andre steder end det tilsigtede. Yderligere kan biosyntesen af disse faktorer foregå igennem en større eller modificeret form, som kan omdannes til en biologisk aktiv komponent in vivo eller in vitro. I

oo pattedyr foregår produktionen af biologisk aktive peptider ofte igennem et antal mellemprodukter, f.eks. præpro-proteiner eller pro-proteiner med forskellige grader af biologisk aktivitet eller ingen biologisk aktivitet.

35

Identifikationen af P3-proteinfamilien af pattedyrs ostegene faktorer tillader fagfolk at påvise, som regel ved hjælp af immunologiske metoder, andre beslægtede molekylære komponenter i cellekulturer og andre væv.

O

40 '

DK 161524 B

En hensigtsmæssig metode til at identificere andre protein-holdige materialer, som kan indeholde osteogen aktivitet, gør brug af den tidligere beskrevne immunoaftryksteknologi; dog kan andre teknologier, såsom anvendelse af radioimmunoassays 5 også anvendes. I et typisk eksperiment ekstraheres et muligt væv eller cellekulturmasse med stærke opløsningsmidler, såsom guanidinsaltsyre eller guanidinisothiocyanat eller natriumdo-decylsulfat, i nærværelse eller fravær af et reducerende middel. Den totale ekstrakt eller de delvist fraktionerede ekstrakter 10 udsættes dernæst for SDS-PAGE, og de elektroforet!sk adskilte proteinkomponenter overføres til nitrocellulosemembranfiltre. Tilstedeværelsen af molekylære komponenter, beslægtet med de P3-protein-osteogene faktorer påvises ved deres evne til at binde antistoffer rettet imod P3-proteinerne.

15 I eksperimenter, hvor der anvendtes delvis fraktionerede ekstrakter af kvæghjerne, blev et immunologisk beslægtet element med en tilsyneladende molekylvægt på omkring 40.000 til 45.000 daltons påvist ved anvendelse af antistoffer, dannet imod 20 kalve-P3-protein, i visse fraktioner indeholdende jftøjmoleky- lære komponenter; i fraktioner, der indeholdt lavmolekylære proteiner, ekstraheret fra kvæghjerne, blev der fundet en blanding af lave molekylære komponenter, der var immunologisk beslægtet med kalve-P3-protein og med molekylvægte i størrel- ΛΓ sesordenen på omkring 14.000 til 25.000 daltons.

Lignende analyser udført på kalve-tandpulpvæv viste tilstedeværelse af en komponent med molekylvægten 23.000 til 25.000 dalton, og mindre mængder af en 14.000 til 16.000 dalton-30 komponent og en 40.000 til 45.000 dalton-komponent, som hver \ især bandt antistoffer, dannet imod kalve-P3-protein. Tilstedeværelsen af lignende proteiner er blevet påvist i luftrør-, næse- og ledbruskvæv fra kalve, i væv og cellekulturer af en rottebentumor, og i visse rottevæv induceret til at udvikle 35 ben ved implantering af demmeraiseret benmatriks. Osteogent aktive eller aktiverbare proteiner eller polypeptider, der er påvist ved de her beskrevne immunologiske teknikker, og

O

41

DK 161524 B

andre osteogent aktive eller aktiverbare proteiner eller polypeptider, der er til stede i andre pattedyrevæv, og påvist ved hjælp af antistofffer, der er dannet imod en P3-protein v ' :, i ' osteogen faktor frå et 'patttédyrébenvæv, betragtes som 'værende 5 inden for rækkevidden af^denne opfindelse.

Kalve-P3-, porcin-P3- og human-P3-proteinerne i en overvejende homogen tilstand inducerer alle, når de implanteres i rotter, som demonstreret i afprøvning under anvendelse af 10 det her beskrevne bioassaysystem, dannelsen af benvæv i løbet af ca. 3 uger på stedet for implantation. Det fremgår, at medlemmer af P3-protein-familien, oprenset fra forskellige pattedyr, vil have osteogen aktivitet i pattedyr generelt. P3-proteinerne repræsenterer således en familie af immunologisk 15 beslægtede proteiner, der kan betragtes som værende primære osteogene faktorer.

Benvævsinduktionsanalysesystem.

20 Til at bestemme den osteogene aktivitet af testproteinfrak- tioner eller -proteiner, kan en fremgangsmåde som den følgende anvendes. Benmatrikspulver (i størrelsen 75 til 500 mikron) demineraliseres som det er blevet beskrevet og ekstraheres derefter tre gange efterfølgende, hver med 15 til 20 ml 4M 25 GuHCL pr. g demineraliseret benpulver. Den ekstraherede matriks vaskes grundigt med vand, efterfulgt af ethanol og ether og dernæst tørres pulveret. Dette pulver kan ikke inducere osteogenese, når det implanteres i forsøgsdyr, såsom en rotte, og kaldes inaktiv benmatriks (IBM). Med henblik på at måle 30 aktiviteten af et proteinpræparat, blandes IBM-pulveret med en vandig opløsning eller suspension af proteinet, og vandet fjernes ved lyofilisering. Den rekonstituerede matriks pakkes dernæst i gelatinekapsler og implanteres subkutant nær ved lårmusklerne af unge (en til to måneder gamle) rotter. Varie-35 rende mængder af proteinpræparaterne anvendes sammen med en konstant mængde IBM i hver kapsel for at bestemme effektiviteten af de forskellige proteinpræparater, osteogen aktivitet,

DK 161524B

O

42 der er induceret af et implantat, bestemmes ved undersøgelse af den fjernede implantering (også omtalt heri som eksplantat), på to måder, (a) måling af niveauet af enzymet alkalisk phosphatase i vævet, udviklet på stedet for implantering, hvor 5 sådant væv fjernes 17 til 20 dage efter implantering af et j præparat, i hvilket den osteogene aktivitet skal bestemmes, j og (b) udførelse af en histologisk undersøgelse af en 5 til i 7 mikron tyk sektion af vævet udviklet på stedet for implantering, efterfulgt af farvning af paraffinfikserede sektioner 10 af dette væv med toluidinblåt (farver bruskmatriks), hæmatoxy-lin-eosin (adskiller fibrøse-, bruskholdige- og benvæv) og von Kossa sølvfarvning (til kalcifieret matriks af benvæv).

Niveauet for alkalisk phosphatase måles, fordi en signifies kant forøgelse af dette enzym karakteristisk går forud for aktiv dannelse af benvæv, og fortsat dannelse af benvæv følges af et forhøjet stabilt niveau af alkalisk phosphataseaktivitet, sammenlignet med et niveau, fundet i ikke-benfibrøst væv, der omgiver implantaterne. En tilnærmet kvantetisering af 20 niveauet for benvævinducerende aktivitet i et proteinpræparat er blevet opnået ved kvantetisering af niveauet af alkalisk phosphatase pr. vægtenhed fjernet væv. I praksis homogeniseres det fjernede væv i en hensigtsmæssig puffer, såsom Trissaltvand, opløses med en ikke-ionisk detergent, og de opløste 25 enzymer, som er frigivet fra vævet, udvindes ved fjernelse af bundfaldet ved centrifugering. Niveauerne af alkalisk phosphatase kvantetiseres ved måling af omdannelsen af paranitro-phenylphosphat til paranitrophenol, katalyseret ved fortyndinger af testekstrakten og ved beregning ud fra en standard- 30 kurve for kendt enzymaktivitet.

\

Til bioanalysestudier blev den sammenblandefraktion af delvis oprenset protein (dvs. alfa, beta, gamma I, gamma II og delta som tidligere beskrevet) udvundet ved Sephacryl S-200 kolonne kromatografi af et kalvebenekstrakt, som tidligere beskrevet.

Disse respektive sammenblandefraktioner af proteinforråd blev rekonstitueret med IBM og implanteret - subkutant i rottelår. Måling af alkalisk phosphatase- 43

DK 161524 B

5 aktivitet og histologisk evaluering af sektioner af eksplantater, fjernet 17 til 20 dage efter implantering, viste, at Pi- og P5a-P5b-proteinerne ikke har nogen benveevsinducerende aktivitet. Bioanalysestudierne indikerede tilstedeværelsen af maksimal osteogen aktivitet i proteinerne i gamma I- og gamma Il-forråd.

\ 10 De tre hovedkomponenter i gammafraktionerne, dvs., P2-, P3-og P4-proteinerne, blev oprenset til en overvejende homogen tilstand ved anvendelse af omvendt fase HPLC, som beskrevet.

De oprensede proteiner blev enten hver for sig eller i en komplet blanding rekonstitueret med inaktiv benmatriks, og 15 en benvævsinduktionsanalyse blev udført. Resultaterne er vist i tabel VI.

TABEL VI.

Alkalisk 20 phosphatase (enheder/g) Histologi IBM alene <5 Fibrøse væv IBM + 750 μg P2-protein <5 Fibrøse væv IBM + 750 μg P3-protein 78 Nyt benvæv 25 IBM + 1000 μ9 P4-protein <5 Fibrøse væv (et svagt spor af brusk) IBM + 250 μ9 af hver af 63 Nyt benvæv P2-, P3- og P4-proteinerne "IBM" betyder inaktiv benmatriks.

"<" betyder mindre end.

Dataene i tabel VI indikerer, at kalve-P3-proteinet inducerede dannelsen af benvæv. Implantater indeholder kalve-P3-præparatet 35 udvikledes til væv, der indeholdt høje niveauer af alkalisk phosphataseenzymaktivitet. Derimod var implatater, fremstillet ved rekonstitution med enten P2- eller P4-præparat ikke i stand til at producere påviseligt benvæv. Når alle tre proteiner blev anvendt i kombination, blev der observeret signifikant 40 dannelse af benvæv, og høje niveauer af alkalisk phosphat- aseenzym blev opnået med en tredjedel af mængden af P3-protein

DK 161524 B

44

O

i ! (sammenlignet med P3-proteinimplantatet alene). Det fremgår således, at tilstedeværelse af P2- og/eller P4~proteinerne ved lave koncentrationer af P3-protein udgør en forbedring af den osteogenese, der induceres af P3-proteinet.

5 I lignende afprøvninger blev oprensede P3-proteine'r, der var udvundet fra Humant benvæv eller porcint benvæv, rekonstitueret med IBM og implanteret. Ca. tre uger senere blev eksplantatet af væv, som omgav implanteringsstedet, undersøgt for alkalisk 10 phosphataseaktivitet og histologiske karaktertræk. I hvert tilfælde inducerede 750 μg af hvert P3-protein dannelsen af benvæv.

Ved anvendelse af de her beskrevne aktive præparater indgives 15 en osteogen mængde af en eller flere af P3-proteinerne og/eller osteogent aktive polypeptider og/eller immunologisk beslægtede osteogent aktive komponenter, med eller uden en farmaceutisk acceptabel bærer, på eller i nærheden af det sted i pattedyret, hvor induktion af benvæv er ønsket. Administrationen vil afhænge 20 af alder, tilstand, køn og andre karakteristika hos den person, der skal behandles. Den foretrukne administration er implantering lokal injektion eller tidsreguleret frigivelse ved anvendelse af mikrokapsler eller andre former. Doser vil afhænge af stedet og konfigurationen af det område, der skal helbredes, såsom 3 25 f.eks. en frakturzone. F.eks. kan en 5 mm benflis opnås med omkring 100 til 200 pg P3-protein administreret eller implanteret lokalt i form af et implantat i ca. 100 mg IBM.

Aktive præparater kan omfatte andre egnede bioaktive materialer, 30 såsom vækstfaktorer, cellevedhæftningsfaktorer, kemotaktiske \ midler, steroider, antibiotika, antiinflammatoriske midler og lignende.

35

Claims (8)

1. Fremgangsmåde til isolering af et præparat af et osteogent 5 protein, som er et medlem af P3-familien af immunologisk beslægtede proteiner, hvilket præparat overvejende er homogent med hensyn til en molekylvægt på fra 22.000 daltons til 24.000 daltons ud fra demineraliseret benvæv, kendetegnet ved, at den omfatter, at man 10 (a) behandler det demineraliserede benvæv under vandige betingelser med et solubi 1 i ser ingsmiddel for det osteogene protein og derved ekstraherer det osteogene protein i opløsning med solubi liseringsmidlet; 15 (b) underkaster opløsningen for en første størrelsesfraktionering til udvinding af proteinfraktioner, identificerer fraktionerne indeholdende det osteogene protein ved at måle deres beninducerende aktivitet, kombinerer fraktionerne indeholdende 20 det osteogene protein til en første proteinpool og koncentrerer denne første pool; (c) underkaster den koncentrerede første pool for en anden størrelsesfraktionering til udvinding af proteinfraktioner med 25 en molekylvægt på mellem 12.000 og 40.000 daltons, atter identificerer fraktionerne indeholdende det osteogene protein ved at måle deres ben i nducerende aktivitet, kombinerer fraktionerne indeholdende det osteogene protein til en anden pool og koncentrerer denne anden pool; 30 (d) underkaster den koncentrerede anden pool for et dialysetrin, som omfatter enten (i) dialyse af den koncentrerede pool over for et vandigt opløsningsmiddel indeholdende trifluored- dikesyre og acetonitril og fjernelse af det uopløselige mate-35 Male til opnåelse af en opløselig fraktion eller (ii) dialyse over for deioniseret vand til dannelse af en uopløselig pellet og sol ubi 1 iser ing af denne pellet med et vandigt opløsnings DK 161524 B middel omfattende trif1uoreddikesyre og acetonitril til opnåelse af en opløselig fraktion; (e) underkaster den opløselige fraktion fra trin (d) for om- 5 vendt fase HPLC; og (f) udvinder et præparat af et osteogent protein.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, 10 at solubili seringsmidlet er guanidiniumhydrochlorid.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den koncentrerede anden proteinpool i trin (c) omfatter proteiner med molekylvægt på mellem 16.000 daltons og 25.000 I5 daltons.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at størrelsesf rakt ioner i ngerne i trin (b) og (c) gennemføres ved gelfi'ltrering. 20

5. Præparat af et osteogent protein, som er et medlem af P3-familien af immunologisk beslægtede proteiner, som overvejende er homogent med hensyn til en molekylvægt på fra 22.000 daltons til 24.000 daltons og i en sådan overvejende homogen 25 tilstand er i stand til at fremme osteogenese i et pattedyr, fremstillet ved fremgangsmåden ifølge krav 1.

6. Præparat ifølge krav 5, kendetegnet ved, at det er isoleret fra bovint benvæv. 30

7. Præparat ifølge krav 5, k. endetegnet ved, at det er isoleret fra humant benvæv.

8. Præparat ifølge krav 5, kendetegnet ved, at det 35 er isoleret fra porcint benvæv.