JPS60226814A - 骨形成因子 - Google Patents
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- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
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- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
骨は高度に分化した結合組織であシ、その伸張性のマ）
ｌ）ツクス構造から誘導される独特の機械的性質を持
っている。タンパク質コラーゲンから構成された線惟性
の束の網状組織が骨の張力−抵抗性の振舞いを提供する
と推測されている。さらに、主として不完全に結晶した
ヒドロキシアパタイトから成る鉱物相に関連するプロテ
オグリカン、非コラーゲン性タンパク質、脂質および酸
性タンパク質などの他の物質は骨の伸張性マトリックス
構成中に存在している。骨組織は哺乳類の生涯を通して
連続的に再生されている。この生理的過程が若い組織の
性質の保持に役立っているのだろう。
ｌ）ツクス構造から誘導される独特の機械的性質を持
っている。タンパク質コラーゲンから構成された線惟性
の束の網状組織が骨の張力−抵抗性の振舞いを提供する
と推測されている。さらに、主として不完全に結晶した
ヒドロキシアパタイトから成る鉱物相に関連するプロテ
オグリカン、非コラーゲン性タンパク質、脂質および酸
性タンパク質などの他の物質は骨の伸張性マトリックス
構成中に存在している。骨組織は哺乳類の生涯を通して
連続的に再生されている。この生理的過程が若い組織の
性質の保持に役立っているのだろう。
骨形成および再生の過程は分化した細胞によシなされる
。形態発生および骨の生成に関する骨形成はたぷん゛′
骨芽細胞′（骨形成細胞）によシなされている。骨の造
り直しは明らかに、゛破骨細胞″と称される骨再吸収細
胞と骨形成骨芽細胞の活性の相互作用によりなされてい
る。骨質骨格はそれゆえ機械的機能の構成構造友けでな
く、生きている組織であシ、成長、形の形成、再形成お
よび修復ができる。これらの過程は分化した生きている
細胞により実行されるため、化学的（薬学的またはホル
モン的）、物理的および物理化学的変化は骨組織の質、
量および造形に影響できる。
。形態発生および骨の生成に関する骨形成はたぷん゛′
骨芽細胞′（骨形成細胞）によシなされている。骨の造
り直しは明らかに、゛破骨細胞″と称される骨再吸収細
胞と骨形成骨芽細胞の活性の相互作用によりなされてい
る。骨質骨格はそれゆえ機械的機能の構成構造友けでな
く、生きている組織であシ、成長、形の形成、再形成お
よび修復ができる。これらの過程は分化した生きている
細胞により実行されるため、化学的（薬学的またはホル
モン的）、物理的および物理化学的変化は骨組織の質、
量および造形に影響できる。
身体のストレス同機種々の病理学上の疾病では体の正常
の環境で支持できるより著しく高い速度で活性な骨組織
形成が必要とされる。それ故、前もって定められた楊所
での骨形成を誘導できる生理的に適当な化学薬品（ホル
モン／薬剤／成長因子）を同定する事は価値がある。そ
のような薬品は骨形成細胞の設置のための透過性マトリ
ックス構造を提供し、咬たは骨形成細胞の成長刺激を起
こし、または骨形成細胞の適当な原細胞の分化を誘導す
る。
の環境で支持できるより著しく高い速度で活性な骨組織
形成が必要とされる。それ故、前もって定められた楊所
での骨形成を誘導できる生理的に適当な化学薬品（ホル
モン／薬剤／成長因子）を同定する事は価値がある。そ
のような薬品は骨形成細胞の設置のための透過性マトリ
ックス構造を提供し、咬たは骨形成細胞の成長刺激を起
こし、または骨形成細胞の適当な原細胞の分化を誘導す
る。
従来の技術
骨芽細胞のタンパク質性およびプロスタグランジン様成
長刺激剤の存在は検討されている、Ｒａ１ｓｚ、Ｌ、
Ｇ、らのＴｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎ
ａ−１ｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ、 ３０９巻、１号、 ｐ
ｐ、 ２９−３５（１９８３）およびＲａ１ｓｚ、 Ｌ
、 Ｇ、らのＴｈｅ Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、 ３０９巻、２号、
ｐｐ８３−８９ （１９８３）を参照されたい。
長刺激剤の存在は検討されている、Ｒａ１ｓｚ、Ｌ、
Ｇ、らのＴｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎ
ａ−１ｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ、 ３０９巻、１号、 ｐ
ｐ、 ２９−３５（１９８３）およびＲａ１ｓｚ、 Ｌ
、 Ｇ、らのＴｈｅ Ｎｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、 ３０９巻、２号、
ｐｐ８３−８９ （１９８３）を参照されたい。
Ｕｒｉｓｔらは鉱物質除去骨粉末の解離的処理により骨
マトリックスー付随非コラーゲン性タンノξり質が単離
されたことおよびこの抽出物質の混合物はそれらから得
た部分分画物質同様に骨形態発生活性を含む事を証明で
きている。Ｕｒｉｓｔ、Ｍ、 ＲらＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７６巻、４号。
マトリックスー付随非コラーゲン性タンノξり質が単離
されたことおよびこの抽出物質の混合物はそれらから得
た部分分画物質同様に骨形態発生活性を含む事を証明で
きている。Ｕｒｉｓｔ、Ｍ、 ＲらＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７６巻、４号。
ｐｐ、１８２８−１８３２ （１９７９）； Ｕｒｉｓ
ｔ、Ｍ、Ｒ。
ｔ、Ｍ、Ｒ。
らＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ５ｏｃｉｅ
ｔｙ ｏｆ ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、 １６２巻、ｐｐ、４８
−５３（１９７９） ； Ｈａｎａｍｕｒａ、 Ｈ＋ら
Ｃ１１ｎｉｃａｌＯｒｔｂｏｐａｅｄｉｃｓ １４８巻
、ｐｐ、２８１−２９０（１９８０）；Ｕｒｉｓｔ、
Ｍ、 Ｒ，米国特許第４，２９４，７５３号（１９８１
）；Ｕｒｉｓｔ、 Ｍ、 Ｒ，米国特許第４，４５５，
２５６号（１９８４）；Ｕｒｉｓｔ、 Ｍ、 Ｒ，ら、
Ｃ１１ｎｉｃａｌ ０ｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ、１６２
巻、ｐｐ２１９−２３２ （１９８２）；およびＵｒｉ
ｓｔ。
ｔｙ ｏｆ ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、 １６２巻、ｐｐ、４８
−５３（１９７９） ； Ｈａｎａｍｕｒａ、 Ｈ＋ら
Ｃ１１ｎｉｃａｌＯｒｔｂｏｐａｅｄｉｃｓ １４８巻
、ｐｐ、２８１−２９０（１９８０）；Ｕｒｉｓｔ、
Ｍ、 Ｒ，米国特許第４，２９４，７５３号（１９８１
）；Ｕｒｉｓｔ、 Ｍ、 Ｒ，米国特許第４，４５５，
２５６号（１９８４）；Ｕｒｉｓｔ、 Ｍ、 Ｒ，ら、
Ｃ１１ｎｉｃａｌ ０ｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ、１６２
巻、ｐｐ２１９−２３２ （１９８２）；およびＵｒｉ
ｓｔ。
Ｍ、 Ｒ，ら５ｃｉｅｎｃｅ、 ２２０巻、ｐｐ ６８
０−６８６（１９８３） を参照されたい。
０−６８６（１９８３） を参照されたい。
Ｂａｙｌｉｎｋおよび彼の共同研究者は骨再吸収と新規
骨形成がたぶん対になった別の型の活性を同定できてい
る。Ｈｏｗａｒｄ、Ｇ、 Ａ、らＭｅｔａｂｏｌｉｃ
ＢｏｎｅＤｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｒｅ１ａｔｅｄ Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ、 ２巻、ｐｐ、１３１−１３５（１９
８０） ； Ｆａｒｌｅｙ、Ｊ、 Ｒ，らＢｉｏｃｈｅ
ｍｉｓ ｔｒｙ。
骨形成がたぶん対になった別の型の活性を同定できてい
る。Ｈｏｗａｒｄ、Ｇ、 Ａ、らＭｅｔａｂｏｌｉｃ
ＢｏｎｅＤｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｒｅ１ａｔｅｄ Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ、 ２巻、ｐｐ、１３１−１３５（１９
８０） ； Ｆａｒｌｅｙ、Ｊ、 Ｒ，らＢｉｏｃｈｅ
ｍｉｓ ｔｒｙ。
２１巻、ｐｐ、３５０２−３５０７（１９８２）および
Ｆ’ａｒｌｅｙ−Ｊ、 Ｒ１らＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ ２１巻、 ｐｐ、 ３５０８−３５１３（１９８２
）を参照されたい。Ｆａｒｌｅｙ らが骨マトリックス
から得た活性ゆ本発明またはＵｒｉｓｔ （前記文献）
のものとは異った抽出過程によシ得ておシ、それはよシ
大きな分子量を持ちパ骨格成長因子″または″骨格結合
因子″と称されている。
Ｆ’ａｒｌｅｙ−Ｊ、 Ｒ１らＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ ２１巻、 ｐｐ、 ３５０８−３５１３（１９８２
）を参照されたい。Ｆａｒｌｅｙ らが骨マトリックス
から得た活性ゆ本発明またはＵｒｉｓｔ （前記文献）
のものとは異った抽出過程によシ得ておシ、それはよシ
大きな分子量を持ちパ骨格成長因子″または″骨格結合
因子″と称されている。
この分野で知られている推定の骨形成活性を得るための
過程および技術はいくつかの欠点を持っている。単離過
程は長く、不明確および不完全である。それだけでは活
性と化学的に特徴付けられた高度に精製したタンパク質
調製との明確な関連は確立されていない。子牛前粉末か
ら得られた約１７．０００ダルトンのタンパク質は“骨
形態発生タンノξり質”と称されている、Ｕｒｉｓｔ、
Ｍ、 Ｒ，ら５ｃｉｅｎｃｅ ２２０巻、 ｐｐ、
６８０−６８６（１９８３）を参照されたい；それはあ
る種の他の骨誘導タンパク質と多分子集合体で存在する
時特に有効な骨形成を誘導し、１７，０００ダルトンタ
ンパク質が存在しない時は非骨形成的であると特許請求
されている。Ｕｒｉｓｔ＋らはＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ
ｏｆ ｔｈｅ ５ｏｃｉｅｔｙ ｏｆＥｘｐｅｒｉｍ
ｅｎ＋、ａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａ、ｎｄ Ｍｓｄｉｃ
ｉｎｅ、 １７３巻。
過程および技術はいくつかの欠点を持っている。単離過
程は長く、不明確および不完全である。それだけでは活
性と化学的に特徴付けられた高度に精製したタンパク質
調製との明確な関連は確立されていない。子牛前粉末か
ら得られた約１７．０００ダルトンのタンパク質は“骨
形態発生タンノξり質”と称されている、Ｕｒｉｓｔ、
Ｍ、 Ｒ，ら５ｃｉｅｎｃｅ ２２０巻、 ｐｐ、
６８０−６８６（１９８３）を参照されたい；それはあ
る種の他の骨誘導タンパク質と多分子集合体で存在する
時特に有効な骨形成を誘導し、１７，０００ダルトンタ
ンパク質が存在しない時は非骨形成的であると特許請求
されている。Ｕｒｉｓｔ＋らはＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ
ｏｆ ｔｈｅ ５ｏｃｉｅｔｙ ｏｆＥｘｐｅｒｉｍ
ｅｎ＋、ａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａ、ｎｄ Ｍｓｄｉｃ
ｉｎｅ、 １７３巻。
ｐｐ、 １９４−１９９（１９８３）において同様にヒ
ト骨からの１７，０００から１８，０００ダルトンタン
パク質を同定している；このタンノミク質は２４，００
０および１４，０００ダルトンヒト骨由来タンパク質と
一緒に投与された時有効な骨形成を特徴する特許請求さ
れている。２４，０００および１４，０００ダルトンタ
ンパク質は１７，０００から１８，０００ダルトンのタ
ンパク質なしで使用すると骨形成は不活性であるが、活
性１７，０００から１８，０００ダルドアヒト骨タンパ
ク質の担体として働いているのだろう。Ｕｒｉｓｔ、
Ｍ、 ＲｏらはＰｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ。
ト骨からの１７，０００から１８，０００ダルトンタン
パク質を同定している；このタンノミク質は２４，００
０および１４，０００ダルトンヒト骨由来タンパク質と
一緒に投与された時有効な骨形成を特徴する特許請求さ
れている。２４，０００および１４，０００ダルトンタ
ンパク質は１７，０００から１８，０００ダルトンのタ
ンパク質なしで使用すると骨形成は不活性であるが、活
性１７，０００から１８，０００ダルドアヒト骨タンパ
ク質の担体として働いているのだろう。Ｕｒｉｓｔ、
Ｍ、 ＲｏらはＰｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ、 ８１巻、ｐｐ、３７１−３７５（１
９８４年１月）においてウシの骨から単離された１ ８
，５００±５００ダルトンタンパク質を同定しておシ、
ウシ骨形態発生タンパク質と称している。１８，５００
ダルトンタンノξり質は単独でまたは他の骨由来タンパ
ク質と種々の組み合わせで移植すると骨形成を誘導スル
。１８，５００ダルトンタンパク質を含有している試料
のみが骨形成を誘導した。各々１４，０００ 。
９８４年１月）においてウシの骨から単離された１ ８
，５００±５００ダルトンタンパク質を同定しておシ、
ウシ骨形態発生タンパク質と称している。１８，５００
ダルトンタンノξり質は単独でまたは他の骨由来タンパ
ク質と種々の組み合わせで移植すると骨形成を誘導スル
。１８，５００ダルトンタンパク質を含有している試料
のみが骨形成を誘導した。各々１４，０００ 。
１７．０００，１７，５００，２２，０００または３４
，０００ダルトンの分子量を持つ他のウシ骨由来タンパ
ク質を単独または種々の組合わせで移植しても骨形成の
誘導が失敗した事がさらに示されている。ウシ骨由来２
４，０００ダルトンタンパク質についてもまた記載され
ているが、２４，０００ダルトンタンパク質が骨形成を
誘導する事については何も示されていない。
，０００ダルトンの分子量を持つ他のウシ骨由来タンパ
ク質を単独または種々の組合わせで移植しても骨形成の
誘導が失敗した事がさらに示されている。ウシ骨由来２
４，０００ダルトンタンパク質についてもまた記載され
ているが、２４，０００ダルトンタンパク質が骨形成を
誘導する事については何も示されていない。
１７．０００から２３，０００ダルトンの間の分子量の
タンパク質を含み骨形前発生活性を特徴する特許請求さ
れた純度の低い調製試料がマウス骨肉腫［Ｈａｎａｍｕ
ｒａ、 Ｈ，ら、Ｃ１１ｎｉｃａｌ ０ｒｔｈｏｐａｅ
ｄｉｃｓ。
タンパク質を含み骨形前発生活性を特徴する特許請求さ
れた純度の低い調製試料がマウス骨肉腫［Ｈａｎａｍｕ
ｒａ、 Ｈ，ら、Ｃ１１ｎｉｃａｌ ０ｒｔｈｏｐａｅ
ｄｉｃｓ。
１５３巻、 ｐｐ、 ２３２−２４０（１９８０）を参
照されたい〕およびウサギ歯質［Ｃｏｎｏｖｅｒ、 Ｍ
、 Ａ、およびＵｒｉｓｔ、 Ｍ、 Ｒ，、鉱物質化結
合組織の化学および生物学、 Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｎｏ
ｒｔｈ Ｈｏ１ｌａｎｄ Ｉｎｃ、、 ｐｐ、 ５９７
−６０６（１９８１）を参照されたい〕から単離されて
いる。
照されたい〕およびウサギ歯質［Ｃｏｎｏｖｅｒ、 Ｍ
、 Ａ、およびＵｒｉｓｔ、 Ｍ、 Ｒ，、鉱物質化結
合組織の化学および生物学、 Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｎｏ
ｒｔｈ Ｈｏ１ｌａｎｄ Ｉｎｃ、、 ｐｐ、 ５９７
−６０６（１９８１）を参照されたい〕から単離されて
いる。
現在捷で文献に記載されている骨形成活性測定実験のほ
とんどに使用されているタンパク質調製試料は不十分な
純度であシ、それ故観察された活性に対応する特定分子
の存在の同定に至っていない。さらに、現在まで報告さ
れている研究は種々の“骨形態発生タンパク質″調製試
料に存在する活性タンパク質種間のいかなる化学的（生
化学的）相関も明らかにしていない。
とんどに使用されているタンパク質調製試料は不十分な
純度であシ、それ故観察された活性に対応する特定分子
の存在の同定に至っていない。さらに、現在まで報告さ
れている研究は種々の“骨形態発生タンパク質″調製試
料に存在する活性タンパク質種間のいかなる化学的（生
化学的）相関も明らかにしていない。
例えば米国特許第４，２９４，７５３号、４，４５５，
２５６号および４，４３４，０９４号から鉱物質除去骨
マトリックスの解離的抽出によシ得られる粗タンパク質
混合物の分画に関係するすべての過程がわかる。
２５６号および４，４３４，０９４号から鉱物質除去骨
マトリックスの解離的抽出によシ得られる粗タンパク質
混合物の分画に関係するすべての過程がわかる。
米国特許第４，２９４，７５３号、４，４５５，２５６
号および４，４３４，０９４号から最高の収率での異っ
たタンパク質の混合物および本質的に均質でないタンパ
ク質種が骨形成活性を持っていると同定されている事が
知られる。
号および４，４３４，０９４号から最高の収率での異っ
たタンパク質の混合物および本質的に均質でないタンパ
ク質種が骨形成活性を持っていると同定されている事が
知られる。
発明が解決しようとする問題点
本発明は免疫学的に関連した第一骨形成因子（ここでは
”Ｐ３タンパク質″と称する）−族に関し、その各々は
実質的に純粋な状態で、単独または適した医薬として適
当な担体との混合物で応用した時、哺乳類において前も
って決まった場所に骨形成を誘導する。
”Ｐ３タンパク質″と称する）−族に関し、その各々は
実質的に純粋な状態で、単独または適した医薬として適
当な担体との混合物で応用した時、哺乳類において前も
って決まった場所に骨形成を誘導する。
本明細書に記載した方法を用いると、タンパク質（その
ようなタンパク質は本明細書にさらに記載されておシ、
解離的、還元的条件下のポリアクリルアミドゲルにおい
てのそれらの移動に基づいてＰｉ、Ｐ２．Ｐ３．ｐ４お
よびその類似名のごとき１町建名を与えである）を各々
の哺乳類種の骨から得る事ができる。そのようにして得
たタンパク質のうち、本明細書で６第−骨形成因子”（
ここではその同定名は“Ｐ３タンパク質”として称され
る）と称されるタンパク質があシ、それは単独または適
した医薬として適当な担体との混合物で投与した場合、
哺乳類において前もって決められた場所で骨形成を誘導
する。特定の第一骨形成因子は特定の晴乳類種の骨から
得る事が出来る。
ようなタンパク質は本明細書にさらに記載されておシ、
解離的、還元的条件下のポリアクリルアミドゲルにおい
てのそれらの移動に基づいてＰｉ、Ｐ２．Ｐ３．ｐ４お
よびその類似名のごとき１町建名を与えである）を各々
の哺乳類種の骨から得る事ができる。そのようにして得
たタンパク質のうち、本明細書で６第−骨形成因子”（
ここではその同定名は“Ｐ３タンパク質”として称され
る）と称されるタンパク質があシ、それは単独または適
した医薬として適当な担体との混合物で投与した場合、
哺乳類において前もって決められた場所で骨形成を誘導
する。特定の第一骨形成因子は特定の晴乳類種の骨から
得る事が出来る。
例えばウシ骨から得た第一骨形成因子はヒトの骨から得
た第一骨形成因子に相当し、免疫学的に関連する、また
他の哺乳類種の骨から単離できる各々の第一骨形成因子
に相当し免疫学的に関連する。
た第一骨形成因子に相当し、免疫学的に関連する、また
他の哺乳類種の骨から単離できる各々の第一骨形成因子
に相当し免疫学的に関連する。
本発明においては術語゛第一骨形成因子”または“Ｐ３
タンパク質”は特定の哺乳類種の骨に対して外来性の特
定のＰ３タン、Ｒり質のことを意味する。それ故、この
免疫学的に関連あるタンパク質の一族は各々の哺乳類の
骨から得たＰ３タンノξり質からなシ、各々のＰ３タン
パク質は一族の他の一員の分子種変種である。
タンパク質”は特定の哺乳類種の骨に対して外来性の特
定のＰ３タン、Ｒり質のことを意味する。それ故、この
免疫学的に関連あるタンパク質の一族は各々の哺乳類の
骨から得たＰ３タンノξり質からなシ、各々のＰ３タン
パク質は一族の他の一員の分子種変種である。
本発明の骨形成物質は下記の群から選択される骨形成因
子を包含する＝（ａ）免疫学的に関連したタンパク質の
Ｐ３族のタンパク質（即ちＰ３タンパク質） ｐ （ｂ
）前記Ｐ３タンパク質から誘導される骨形成の活性のあ
るポリ、Ｃブチｌ−” ； （ｃ）骨形成活性な物質に
変換されるまたはできるポリペプチドでＰ３タンパク質
の１つまた紘それ以上と免疫学的に関連するもの； （
ｄ）（ａ） ＃ （ｂ）および（Ｃ）から選択される骨
形成因子の混合物。
子を包含する＝（ａ）免疫学的に関連したタンパク質の
Ｐ３族のタンパク質（即ちＰ３タンパク質） ｐ （ｂ
）前記Ｐ３タンパク質から誘導される骨形成の活性のあ
るポリ、Ｃブチｌ−” ； （ｃ）骨形成活性な物質に
変換されるまたはできるポリペプチドでＰ３タンパク質
の１つまた紘それ以上と免疫学的に関連するもの； （
ｄ）（ａ） ＃ （ｂ）および（Ｃ）から選択される骨
形成因子の混合物。
本発明において、良好なＰ３タンパク質は：ウシ骨（子
ウシ骨のごとき）から得る事ができるＰ３タンパク質で
本明細書では゛ウシＰ３タンパク質′″または°゛子ウ
つＰ３タンノぞり質”と称し；ヒト骨から得る事ができ
るＰ３タンパク質で本明細書では°゛ヒトＰ３タンパク
質と称し；およびシタ骨から得る事ができるタンパク質
で本明細書では“ツタＰ３タンパク質”と称する。
ウシ骨のごとき）から得る事ができるＰ３タンパク質で
本明細書では゛ウシＰ３タンパク質′″または°゛子ウ
つＰ３タンノぞり質”と称し；ヒト骨から得る事ができ
るＰ３タンパク質で本明細書では°゛ヒトＰ３タンパク
質と称し；およびシタ骨から得る事ができるタンパク質
で本明細書では“ツタＰ３タンパク質”と称する。
本発明のＰ３タンパク質は哺乳類の目的の位置で骨形成
を促進または刺激する能力を示す。本発明の骨形成因子
を用いる方法においては特定の哺乳類種からの骨形成因
子はその補乳類種に投与するように使用するのが良好で
ある（例えば、ヒト骨から得たＰ３タンパク質はヒトに
投与するのが良好である）；シかしながら、取シ扱う哺
乳類種と異った哺乳類種の骨から得たＰ３タンノξり質
の使用も本発明の範囲である。
を促進または刺激する能力を示す。本発明の骨形成因子
を用いる方法においては特定の哺乳類種からの骨形成因
子はその補乳類種に投与するように使用するのが良好で
ある（例えば、ヒト骨から得たＰ３タンパク質はヒトに
投与するのが良好である）；シかしながら、取シ扱う哺
乳類種と異った哺乳類種の骨から得たＰ３タンノξり質
の使用も本発明の範囲である。
この分野でよく知られている方法を用い（例えば化学的
、酵素的または組換えＤＮＡ技術）、本明細書に記載さ
れている骨形成Ｐ３タンパク質から誘導され、骨形成を
促進または刺激する能力を示すポリペプチドを得る事が
可能である。Ｐ３タンパク質に免疫学的に関連した骨形
成活性種に変換されるまたは変換できるタン−ξり質ま
たはポリはブチｌまたはそれらのフラグメントもまた本
発明の範囲内であると考えられる。本明細書で゛活性ポ
リにブチｌまたは１骨形成活性ポリイプチドと称される
骨形成活性実体には、本発明の主題の骨形成活性を持つ
いかなるタンパク質部分またはポリ、９ブチｒおよび骨
形成活性を持つそれらの機能的誘導体が含まれ、また化
学合成、酵素修復または組換えＤＮＡ技術のごとき通常
の方法によシ産生できるいかなる骨形成活性物質も含ま
れる。そのような活性ポリペプチドには例えば化学的ま
たは酵素的修飾ポリペプチド；融合タンパク質；または
、ポリマーその他のごとき適した担体物質と結合したポ
リにブチｌも含まれる。本発明はまたＰ３タンパク質の
単離、精製および特徴付けの方法にも関連し、および１
つまたはそれ以上のＰ３タンパク質および／または骨形
成活性ポリ４プチドおよび／または免疫学的に関連した
（即ち１またはそれ以上のタンパク質に免疫学的に関連
した）骨形成活性実体を哺乳類における骨成長の刺激の
だめの医薬品として用いる方法に関連する。１つまたは
それ以上のＰ３タンノ２り質および／咬たは骨形成活性
ポリはブチドおよび／または免疫学的に関連した骨形成
活性物質と医薬として適当な担体からなる医薬として適
当な組成物もまた本明細書に記載されている。そのよう
な組成物は組成物の投与を助けまたは組成物の有効性を
増加させる他の生物活性のある物質または他の成分を随
意に含む事ができる。
、酵素的または組換えＤＮＡ技術）、本明細書に記載さ
れている骨形成Ｐ３タンパク質から誘導され、骨形成を
促進または刺激する能力を示すポリペプチドを得る事が
可能である。Ｐ３タンパク質に免疫学的に関連した骨形
成活性種に変換されるまたは変換できるタン−ξり質ま
たはポリはブチｌまたはそれらのフラグメントもまた本
発明の範囲内であると考えられる。本明細書で゛活性ポ
リにブチｌまたは１骨形成活性ポリイプチドと称される
骨形成活性実体には、本発明の主題の骨形成活性を持つ
いかなるタンパク質部分またはポリ、９ブチｒおよび骨
形成活性を持つそれらの機能的誘導体が含まれ、また化
学合成、酵素修復または組換えＤＮＡ技術のごとき通常
の方法によシ産生できるいかなる骨形成活性物質も含ま
れる。そのような活性ポリペプチドには例えば化学的ま
たは酵素的修飾ポリペプチド；融合タンパク質；または
、ポリマーその他のごとき適した担体物質と結合したポ
リにブチｌも含まれる。本発明はまたＰ３タンパク質の
単離、精製および特徴付けの方法にも関連し、および１
つまたはそれ以上のＰ３タンパク質および／または骨形
成活性ポリ４プチドおよび／または免疫学的に関連した
（即ち１またはそれ以上のタンパク質に免疫学的に関連
した）骨形成活性実体を哺乳類における骨成長の刺激の
だめの医薬品として用いる方法に関連する。１つまたは
それ以上のＰ３タンノ２り質および／咬たは骨形成活性
ポリはブチドおよび／または免疫学的に関連した骨形成
活性物質と医薬として適当な担体からなる医薬として適
当な組成物もまた本明細書に記載されている。そのよう
な組成物は組成物の投与を助けまたは組成物の有効性を
増加させる他の生物活性のある物質または他の成分を随
意に含む事ができる。
本明細書で用いた用語６免疫学的に関連した”とは、タ
ンパク質に対して高めまたは作られる抗体においての抗
原−結合部位への結合および／まだは認識を示すいかな
るポリペプチドを含む事を意味する。術語パ骨形成”は
骨形成活性調製試料を医薬として適当な方法での局所投
与（例えば移植）に対応して特定の部位で新しい骨の形
成または前から存在している骨の成長を意味する。用語
゛骨形成量”とは骨形成Ｐ３タンパク質および／まだは
骨形成活性ポリ投ブチドおよび／または免疫学的に関連
した骨形成活性物質が目的の効果を提供するのに十分な
量を意味する。用語″′骨形成活性”または６骨形成的
”とは調製試料が骨形成を促進または誘導する能力を持
っている事を意味する。
ンパク質に対して高めまたは作られる抗体においての抗
原−結合部位への結合および／まだは認識を示すいかな
るポリペプチドを含む事を意味する。術語パ骨形成”は
骨形成活性調製試料を医薬として適当な方法での局所投
与（例えば移植）に対応して特定の部位で新しい骨の形
成または前から存在している骨の成長を意味する。用語
゛骨形成量”とは骨形成Ｐ３タンパク質および／まだは
骨形成活性ポリ投ブチドおよび／または免疫学的に関連
した骨形成活性物質が目的の効果を提供するのに十分な
量を意味する。用語″′骨形成活性”または６骨形成的
”とは調製試料が骨形成を促進または誘導する能力を持
っている事を意味する。
第１図は鉱物質除去したウシ骨粉末を４ＭＧｕＨＣＡ
−０，０１Ｍ ）リス−Ｈ（Ｊ緩衝液（ｐＨ７，０）で
８時間抽出して得たタンパク質のセファロースＣＬ−６
Ｂカラムクロマトグラフィーによシ得られた溶出プロフ
ィールを表わしている。
−０，０１Ｍ ）リス−Ｈ（Ｊ緩衝液（ｐＨ７，０）で
８時間抽出して得たタンパク質のセファロースＣＬ−６
Ｂカラムクロマトグラフィーによシ得られた溶出プロフ
ィールを表わしている。
第２図はセファロース０Ｌ−６Ｂカラムクロマトグラフ
イーから得た活性分画に含まれているタンパク質の４
Ｍ ＧｕＨＣｌ−０，０１Ｍ ）すｙ、 ・ＨＣ／緩衝
液（ｐＨ７，０）中での七７アクリルＳ−２００カラム
クロマトグラフィーによシ得られた溶出プロフィールを
表わしている。
イーから得た活性分画に含まれているタンパク質の４
Ｍ ＧｕＨＣｌ−０，０１Ｍ ）すｙ、 ・ＨＣ／緩衝
液（ｐＨ７，０）中での七７アクリルＳ−２００カラム
クロマトグラフィーによシ得られた溶出プロフィールを
表わしている。
第３図は七フアクリルＳ−２００カラムクロマトグラフ
ィーの活性分画中に存在するタンパク質の、アセトニト
リルグラジェントをタンパク質の溶出に使用する逆相プ
ロデシル３００オクチルカラム上での溶出プロフィール
を示している。
ィーの活性分画中に存在するタンパク質の、アセトニト
リルグラジェントをタンパク質の溶出に使用する逆相プ
ロデシル３００オクチルカラム上での溶出プロフィール
を示している。
第４図は還元剤存在下非連続的ドセチル硫酸ナトリウム
−ポリアクリルアミドゲル上での精製骨マトリックスタ
ンパク質の電気泳動分析の結果を示している。
−ポリアクリルアミドゲル上での精製骨マトリックスタ
ンパク質の電気泳動分析の結果を示している。
第５Ａ図はズタＰ３タンパク質フラグメントの逆相Ｃ８
カラム上での高速液体クロマトグラフィーによシ得られ
た溶出プロフィールを示している；フラグメントはスタ
フィロコッカス アウレウス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ） Ｖ ８プロテアーゼを用い
てブタＰ３タンパク質を酵素的に消化して発生させた。
カラム上での高速液体クロマトグラフィーによシ得られ
た溶出プロフィールを示している；フラグメントはスタ
フィロコッカス アウレウス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ） Ｖ ８プロテアーゼを用い
てブタＰ３タンパク質を酵素的に消化して発生させた。
第５Ｂ図はウシＰ３タンパク質フラグメントの逆相Ｃ８
カラム上での高速液体クロマトグラフィーによシ得られ
た溶出プロフィールを示している；フラグメントはスタ
フィロコッカス アウレウス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ） Ｖ ８プロテアーゼを用い
てウシＰ３タンパク質を酵素的に消化して発生させた。
カラム上での高速液体クロマトグラフィーによシ得られ
た溶出プロフィールを示している；フラグメントはスタ
フィロコッカス アウレウス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ） Ｖ ８プロテアーゼを用い
てウシＰ３タンパク質を酵素的に消化して発生させた。
ｆｆ１６Ａ図はブタＰ３タンパク質フラダメントの逆相
Ｃ１８カラム上での高速液体クロマトグラフィーによシ
得られた溶出プロフィールを示していす る；フラグメントはスタフィロコッカス 嘩つレウス（
５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ） Ｖ
８プロテアーゼを用い還元、カルボキシメチル化ブタ
Ｐ３タンパク質の酵素的消化によ多発生させる。
Ｃ１８カラム上での高速液体クロマトグラフィーによシ
得られた溶出プロフィールを示していす る；フラグメントはスタフィロコッカス 嘩つレウス（
５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ） Ｖ
８プロテアーゼを用い還元、カルボキシメチル化ブタ
Ｐ３タンパク質の酵素的消化によ多発生させる。
第６Ｂ図はヒトＰ３タンパク質７ラグメントの逆相Ｃ１
８カラム上での高速液体クロマトグラフィーによシ得ら
れた溶出プロフィールを示していす る：フラグメントはスタフィロコッカス 葛つレウス（
ａｔ、祉欺害娶狸退Ｓ些堕朋）Ｖ８プｌ：Ｉテアーゼを
用い、還元、カルボキシメチル化ヒトＰ３タンパク質の
酵素的消化によ多発生させる。
８カラム上での高速液体クロマトグラフィーによシ得ら
れた溶出プロフィールを示していす る：フラグメントはスタフィロコッカス 葛つレウス（
ａｔ、祉欺害娶狸退Ｓ些堕朋）Ｖ８プｌ：Ｉテアーゼを
用い、還元、カルボキシメチル化ヒトＰ３タンパク質の
酵素的消化によ多発生させる。
第７図は放射性標識試験抗原が拮抗する非標識抗原調製
試料存在下、特定抗体分子へ結合する能力で測定した拮
抗ラジオイムノアッセイの結果を示している。
試料存在下、特定抗体分子へ結合する能力で測定した拮
抗ラジオイムノアッセイの結果を示している。
本明細書に記載した方法を用い、特定の咄乳類種の鉱物
質除去費粉末の粗抽出物から出発して、第一骨形成因子
および数種の他のタンパク質を本質的に均質な状態に精
製できる。例えば、特定の哺乳類種の骨から第一骨形成
因子不在下では骨形成を促進しない数種の他のタンパク
質の実質的に純粋な調製試別に加えて第一骨形成因子の
実質的に純粋な調製試料を得る事ができる。
質除去費粉末の粗抽出物から出発して、第一骨形成因子
および数種の他のタンパク質を本質的に均質な状態に精
製できる。例えば、特定の哺乳類種の骨から第一骨形成
因子不在下では骨形成を促進しない数種の他のタンパク
質の実質的に純粋な調製試別に加えて第一骨形成因子の
実質的に純粋な調製試料を得る事ができる。
解離的、還元条件下、本質的にＬａｅｍｍｌｉ 、 Ｖ
、 Ｋ。
、 Ｋ。
によｐ Ｎａｔｕｒｅ、 ２２７巻、ｐｐ、６８０−６
８５（１９７０）に記載された方法を用いポリアクリル
アミドゲル中でのこれらの実質的に純粋なタンパク質の
移動から判断して、見掛は分子量の減少の順に異ったタ
ンパク質種はＰＩ、、Ｐ２．Ｐ３．Ｐ４およびその類似
名のごとき名前で帰属される（表１参照）。
８５（１９７０）に記載された方法を用いポリアクリル
アミドゲル中でのこれらの実質的に純粋なタンパク質の
移動から判断して、見掛は分子量の減少の順に異ったタ
ンパク質種はＰＩ、、Ｐ２．Ｐ３．Ｐ４およびその類似
名のごとき名前で帰属される（表１参照）。
同等のタンパク質が異った哺乳類の骨から得られた。例
えば、本明細書でＰ３の帰属名を持つ第一骨形成因子に
相当する同等タンパク質が数種の哺乳類の骨から単離さ
れた。これらのタンパク質は免疫学的関連Ｐ３タンパク
質の一族の代表的−員である；本質的に本明細書に記載
した方法に従って子ウシ骨から得た本質的に均質な状態
に精製されたＰ３タンパク質は２２，０００から２４，
０００ダルトンの見掛は分子量を持ち、本明細書で後に
記載されるごときアミノ末端配列およびアミノ酸組成を
持つ。同様に、ヒト骨から単離されたＰ３タンパク質は
本質的に本明細書に記載されているごとき方法に従って
本質的に均質な状態まで精製され、子ウシＰ３タンノモ
ク質およびブタＰ３タンパク質と免疫学的に関連し、２
２，０００から２４．０００ダルトンの見掛けの分子量
を持ち、本明細書の後に記載されるごときアミノ酸組成
でちる。同様にして、ブタ骨から単離されたＰ３タンパ
ク質は本質的に本明細書に記載する方法に従って精製さ
れ、子ウシＰ３タンノξり質およびヒトＰ３タンパク質
と免疫学的に関連し、２２，０００から２４，０００ダ
ルトンの見掛けの分子量を持ち、本明細書で後に記載す
るごときアミノ酸組成を持つ。Ｐ３タンパク質の各々は
骨組織源とは無関係に骨形成活性を示す。
えば、本明細書でＰ３の帰属名を持つ第一骨形成因子に
相当する同等タンパク質が数種の哺乳類の骨から単離さ
れた。これらのタンパク質は免疫学的関連Ｐ３タンパク
質の一族の代表的−員である；本質的に本明細書に記載
した方法に従って子ウシ骨から得た本質的に均質な状態
に精製されたＰ３タンパク質は２２，０００から２４，
０００ダルトンの見掛は分子量を持ち、本明細書で後に
記載されるごときアミノ末端配列およびアミノ酸組成を
持つ。同様に、ヒト骨から単離されたＰ３タンパク質は
本質的に本明細書に記載されているごとき方法に従って
本質的に均質な状態まで精製され、子ウシＰ３タンノモ
ク質およびブタＰ３タンパク質と免疫学的に関連し、２
２，０００から２４．０００ダルトンの見掛けの分子量
を持ち、本明細書の後に記載されるごときアミノ酸組成
でちる。同様にして、ブタ骨から単離されたＰ３タンパ
ク質は本質的に本明細書に記載する方法に従って精製さ
れ、子ウシＰ３タンノξり質およびヒトＰ３タンパク質
と免疫学的に関連し、２２，０００から２４，０００ダ
ルトンの見掛けの分子量を持ち、本明細書で後に記載す
るごときアミノ酸組成を持つ。Ｐ３タンパク質の各々は
骨組織源とは無関係に骨形成活性を示す。
さらに、Ｐ３タンパク質とは無関係の本明細書でＰ２お
よびＰ４として指定された２つのタンバク質調製試料も
また数種の異った哨乳類種の各々の骨から単離された。
よびＰ４として指定された２つのタンバク質調製試料も
また数種の異った哨乳類種の各々の骨から単離された。
特定の哺乳類管理から単離されたＰ２タンパク質族の各
々の構成物は特徴付けられている。子ウシ骨から単離さ
れた典型的なＰ２タンパク質は３０，０００から３３，
０００ダルトンの見掛けの分子量を持ち、代表的なＰ３
タンパク質非存在下では骨形成を誘導できず、本明細書
で後で記載するごときアミノ末端配列を持っている。こ
のＰ２タンパク質族と免疫学的に関連するものがヒト骨
およびブタ骨から本質的に本明細書に記載した方法に従
って単離された。
々の構成物は特徴付けられている。子ウシ骨から単離さ
れた典型的なＰ２タンパク質は３０，０００から３３，
０００ダルトンの見掛けの分子量を持ち、代表的なＰ３
タンパク質非存在下では骨形成を誘導できず、本明細書
で後で記載するごときアミノ末端配列を持っている。こ
のＰ２タンパク質族と免疫学的に関連するものがヒト骨
およびブタ骨から本質的に本明細書に記載した方法に従
って単離された。
同様な方法で、本明細書に記載されている方法に従い、
Ｐ４タンパク質族が単離された。子ウシ骨からのＰ４タ
ンパク質の精製が達成された段階において、Ｐ４調製試
料は２つの主な成分からなっておシ、それらはＰ３タン
パク質非存在下では骨形成を誘導できず、両方とも約１
６，０００から１８．０００ダルトンの見掛けの分子量
を持ち、本明細書で後に記載されるととくアミノ末端ア
ミノ酸配列で特徴付けられる。またＰ３タンノ々り質非
存在下では骨形成を誘導できないとのＰ４タンパク質族
の免疫相関タンパク質が本質的に本明細書に記載されて
いる方法に従ってヒト骨およびブタ骨から単離された。
Ｐ４タンパク質族が単離された。子ウシ骨からのＰ４タ
ンパク質の精製が達成された段階において、Ｐ４調製試
料は２つの主な成分からなっておシ、それらはＰ３タン
パク質非存在下では骨形成を誘導できず、両方とも約１
６，０００から１８．０００ダルトンの見掛けの分子量
を持ち、本明細書で後に記載されるととくアミノ末端ア
ミノ酸配列で特徴付けられる。またＰ３タンノ々り質非
存在下では骨形成を誘導できないとのＰ４タンパク質族
の免疫相関タンパク質が本質的に本明細書に記載されて
いる方法に従ってヒト骨およびブタ骨から単離された。
本発明はまた本明細書に記載したどんなＰ３タンパク質
に対しても調製された抗体を使用して分子を検出するこ
とにも関している；Ｐ３タンパク質の分子量と実質的に
異なる分子量の他のタンパク質がＰ３タンパク質の抗体
によシ認識されるこれら他のタンパク質の能力で他の哺
乳類組織（即ち、骨板外の組織）から検出された。特に
、約４０．０００から約４５，０００ダルトンの見掛は
分子量を持つタンパク質が、ラット、ヒトまたはウシの
脳；子ウシまだはラット歯髄；ウシ、ヒトまたはブタ気
管または関節の軟骨；ラット骨腫瘍由来の培養細胞のご
とき組織からこの技術を用いて同定された。この分野で
よく知られているごとく、生物活性物質よシ見掛けの分
子量が実質的に高い免疫相関したタンパク質はしばしば
生合成の前駆体かまたは活性実体を共有結合的（グリコ
ジル化および／またはアシル化体、その他）に修飾した
型のものである。そのような前駆体は生物学的活性を示
さないが、標準的な化学または酵素的方法によシ処理し
てしばしば活性物質となる。本明細書に記載した方法に
よシ得られるまたは同定される４ ０．０００から４５
，０００ダルトンのタンパク質は骨形成活性または活性
になシ得る免疫相関タンパク質の異った一族からなって
いる。
に対しても調製された抗体を使用して分子を検出するこ
とにも関している；Ｐ３タンパク質の分子量と実質的に
異なる分子量の他のタンパク質がＰ３タンパク質の抗体
によシ認識されるこれら他のタンパク質の能力で他の哺
乳類組織（即ち、骨板外の組織）から検出された。特に
、約４０．０００から約４５，０００ダルトンの見掛は
分子量を持つタンパク質が、ラット、ヒトまたはウシの
脳；子ウシまだはラット歯髄；ウシ、ヒトまたはブタ気
管または関節の軟骨；ラット骨腫瘍由来の培養細胞のご
とき組織からこの技術を用いて同定された。この分野で
よく知られているごとく、生物活性物質よシ見掛けの分
子量が実質的に高い免疫相関したタンパク質はしばしば
生合成の前駆体かまたは活性実体を共有結合的（グリコ
ジル化および／またはアシル化体、その他）に修飾した
型のものである。そのような前駆体は生物学的活性を示
さないが、標準的な化学または酵素的方法によシ処理し
てしばしば活性物質となる。本明細書に記載した方法に
よシ得られるまたは同定される４ ０．０００から４５
，０００ダルトンのタンパク質は骨形成活性または活性
になシ得る免疫相関タンパク質の異った一族からなって
いる。
約１４，０００から約１６，０００ダルトンの見掛けの
分子量を持つ他のタンパク質がＰ３タンパク質に対して
発生した抗体に結合する能力によシいくつかの哺乳類組
織に検出された。これらのタンパク質はプロテアーゼに
よる特異的または非特異的切断によシＰ３タンパク質ま
たはその前駆体から誘導される。これらのタンパク質の
いくつかは骨形成活性を持っているであろう。
分子量を持つ他のタンパク質がＰ３タンパク質に対して
発生した抗体に結合する能力によシいくつかの哺乳類組
織に検出された。これらのタンパク質はプロテアーゼに
よる特異的または非特異的切断によシＰ３タンパク質ま
たはその前駆体から誘導される。これらのタンパク質の
いくつかは骨形成活性を持っているであろう。
Ｐ３タンパク質に対して発生させた特異的抗体によシ骨
以外の哺乳類組織および非骨組織由来の培養細胞中にも
また約２２，０００から２６，０００ダルトンの分子量
を持つタンパク質の存在を検出した；これらのタンパク
質は骨形成活性であるだろう。
以外の哺乳類組織および非骨組織由来の培養細胞中にも
また約２２，０００から２６，０００ダルトンの分子量
を持つタンパク質の存在を検出した；これらのタンパク
質は骨形成活性であるだろう。
本明細書で使用される用語゛本質的に均質″とはタンツ
ク質化学の分野に精通する者によシ通常使用される１つ
またはそれ以上の純度または均質度特性によシ均質とさ
れるタンパク質を表わすことを意味する。
ク質化学の分野に精通する者によシ通常使用される１つ
またはそれ以上の純度または均質度特性によシ均質とさ
れるタンパク質を表わすことを意味する。
例えば本質的に均質なタンパク質は以下のごときパラメ
ーターに対し標準実験偏差以内で一定および再現性のあ
る特性を示す二アミノ酸分析、アミノ−またはカルボキ
シル末端配列、通常のポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＰＡＧＥ） または他のクロマトグラフィー技術にお
いてのバントゞパターン、分子量、等電点、免疫的性質
および他のそのようなパラメーター。しかしながらこの
用語は他のタンパク質とタンパク質の人工または合成混
合物を排除しない。それ改番発すＪは２つまたはそれ以
上の本質的に均質なタンパク質の混合物を含有する、例
えばＰ３およびＰ４；Ｐ３およびＰ２：Ｐ２．Ｐ３およ
びＰ４．Ｐ３と中性マトリックスタンパク質（類）；Ｐ
３と他のまだ発見されていない骨形成タンノξり質；２
つまたはそれ以上の哺乳類源からのＰ３の混合物。この
用語はまた例えば不完全精製のため存在するが、タンパ
ク質の生物活性には干渉しない少量の不純物の存在は排
除しない。
ーターに対し標準実験偏差以内で一定および再現性のあ
る特性を示す二アミノ酸分析、アミノ−またはカルボキ
シル末端配列、通常のポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＰＡＧＥ） または他のクロマトグラフィー技術にお
いてのバントゞパターン、分子量、等電点、免疫的性質
および他のそのようなパラメーター。しかしながらこの
用語は他のタンパク質とタンパク質の人工または合成混
合物を排除しない。それ改番発すＪは２つまたはそれ以
上の本質的に均質なタンパク質の混合物を含有する、例
えばＰ３およびＰ４；Ｐ３およびＰ２：Ｐ２．Ｐ３およ
びＰ４．Ｐ３と中性マトリックスタンパク質（類）；Ｐ
３と他のまだ発見されていない骨形成タンノξり質；２
つまたはそれ以上の哺乳類源からのＰ３の混合物。この
用語はまた例えば不完全精製のため存在するが、タンパ
ク質の生物活性には干渉しない少量の不純物の存在は排
除しない。
作用
本発明の骨形成物質の応用は、１つまたはそれ以上の骨
形成Ｐ３タンパク質および／または１つまたはそれ以上
の骨形成活性ポリ投ゾチドおよび／または１つまたはそ
の以上の免疫相関した骨形成活性実体の凍結乾燥試料ま
たは懸濁液を移植のごとくして十分量投与することによ
シ便利に達成され、目的の部位で骨形成を促進する。さ
らに、本明細書に記載した１つまたはそれ以上の骨形成
Ｐ３タンパク質および／または１つまたはそれ以上の骨
形成活性ポリペプチドおよび／または１つ咬だはそれ以
上の免疫相関した骨形成活性物質およびコラーゲン性タ
ンパク質または骨粉末を強変性剤で抽出して誘導される
マトリックス物質または他の医薬として適当な担体のご
とき医薬として適当なマトリックスから成る医薬として
適当な組成物も使用できる。
形成Ｐ３タンパク質および／または１つまたはそれ以上
の骨形成活性ポリ投ゾチドおよび／または１つまたはそ
の以上の免疫相関した骨形成活性実体の凍結乾燥試料ま
たは懸濁液を移植のごとくして十分量投与することによ
シ便利に達成され、目的の部位で骨形成を促進する。さ
らに、本明細書に記載した１つまたはそれ以上の骨形成
Ｐ３タンパク質および／または１つまたはそれ以上の骨
形成活性ポリペプチドおよび／または１つ咬だはそれ以
上の免疫相関した骨形成活性物質およびコラーゲン性タ
ンパク質または骨粉末を強変性剤で抽出して誘導される
マトリックス物質または他の医薬として適当な担体のご
とき医薬として適当なマトリックスから成る医薬として
適当な組成物も使用できる。
以下の実施例で本質的に概説した方法は各々のＰ３タン
パク質の実質的に純粋な調製試料を得るのに使用できる
；得られる特定のＰ３タンパク質は単にどの哺乳魚種か
ら骨を得たかに依存している。本発明の更なる例示に実
施例を示すがその制限として解釈してはならない。
パク質の実質的に純粋な調製試料を得るのに使用できる
；得られる特定のＰ３タンパク質は単にどの哺乳魚種か
ら骨を得たかに依存している。本発明の更なる例示に実
施例を示すがその制限として解釈してはならない。
実施例
骨形成因子（類）の単離
骨処理
典型的な調製では、哺乳類からの長い骨（長い骨の末端
）（例えば、子ウシからのくるぶし、ヒトの骨の大腿骨
頭またはを柱、ラットからの全脛骨および腓骨）を処理
し、ＩＪｒｉｓｔ、 Ｍ、 Ｒ，によ）米国特許第４，
２９４，７５３（１９８１ンに記載されているよく知ら
れた常法によシ鉱物質除去する。これらおよび本明細書
に引用されているすべての引用文献は本明細書に参考文
献としてとシ入れられている。
）（例えば、子ウシからのくるぶし、ヒトの骨の大腿骨
頭またはを柱、ラットからの全脛骨および腓骨）を処理
し、ＩＪｒｉｓｔ、 Ｍ、 Ｒ，によ）米国特許第４，
２９４，７５３（１９８１ンに記載されているよく知ら
れた常法によシ鉱物質除去する。これらおよび本明細書
に引用されているすべての引用文献は本明細書に参考文
献としてとシ入れられている。
処理および骨鉱物質除去の常法は以下の如くである：
骨（良好なのは若い哺乳類から骨を得処理するまで凍結
乾燥して保つ）を囲む骨膜層を機械的手段で除去し、中
心腔からの沓髄を冷水で洗浄して除去する。骨を常法に
よシ（例えばＷｉｌｅｙ製粉機を使用して）微粒子〔一
般的に直径１がら２ミリメーター（龍）〕に粉末化する
。粒子を０．１５ＭＮａＣｌ−０，１Ｍ）リス−ＨＣＩ
緩衝液（ｐＨ７，０）のごとき緩衝化した塩溶液でよく
洗浄し、脂質および残存している血液のほとんどを除去
する。例えばポリトロンホモゲナイザー（Ｂｒｉｎｋｍ
ａｎ工ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ）を用いて粒子の大きさ
を更に小さくし、直径約５００ミクロン←）″またはそ
れ以下の粒子を得る。ホモゲナイズした粒子を上に記し
た緩衝化塩溶液および水、その後エタノールおよび最後
にエーテルで洗浄する。洗浄したホモゲナイズ粒子は真
空下または風乾する；この“骨粉末”は長期間−８０Ｃ
で保存できる。
乾燥して保つ）を囲む骨膜層を機械的手段で除去し、中
心腔からの沓髄を冷水で洗浄して除去する。骨を常法に
よシ（例えばＷｉｌｅｙ製粉機を使用して）微粒子〔一
般的に直径１がら２ミリメーター（龍）〕に粉末化する
。粒子を０．１５ＭＮａＣｌ−０，１Ｍ）リス−ＨＣＩ
緩衝液（ｐＨ７，０）のごとき緩衝化した塩溶液でよく
洗浄し、脂質および残存している血液のほとんどを除去
する。例えばポリトロンホモゲナイザー（Ｂｒｉｎｋｍ
ａｎ工ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ）を用いて粒子の大きさ
を更に小さくし、直径約５００ミクロン←）″またはそ
れ以下の粒子を得る。ホモゲナイズした粒子を上に記し
た緩衝化塩溶液および水、その後エタノールおよび最後
にエーテルで洗浄する。洗浄したホモゲナイズ粒子は真
空下または風乾する；この“骨粉末”は長期間−８０Ｃ
で保存できる。
効果的な鉱物質除去およびタンパク質抽出のため、骨粉
末をふるい分け、直径約７５から５００μの範囲の大き
さの粒子を得る。鉱物質除去（即ち骨マトリックスから
のリン酸カルシウム除去）ハ塩酸（ＨＣＪ ）溶液によ
る繰シ返し洗浄によシ達成される。例えば骨粉末を骨粉
未乾燥Ｎ景ゲラムレ）当シ約ｌＯから１５ミリリツトル
（ｍｌ）の０．５規定（１Ｊ）ＨＣＪと１時間攪拌し、
液体をデカントし、この操作を３から４回縁シ返す。そ
の後鉱物質除去した骨粉末をよく脱イオン蒸留水でｐＨ
が中性に近ツくマで洗浄する。エタノール続いてエーテ
ルで洗浄して鉱物質除去した骨粉末から水を除き、乾燥
する。鉱物質除去した骨粉末は低温（例えば−２０°か
ら一８０Ｃ）で保存できる。骨粉末の鉱物質除去は他の
ｒく知られた方法、例えば−チレンジアミン四酢酸のご
ときキレート剤を用いても達成できる。
末をふるい分け、直径約７５から５００μの範囲の大き
さの粒子を得る。鉱物質除去（即ち骨マトリックスから
のリン酸カルシウム除去）ハ塩酸（ＨＣＪ ）溶液によ
る繰シ返し洗浄によシ達成される。例えば骨粉末を骨粉
未乾燥Ｎ景ゲラムレ）当シ約ｌＯから１５ミリリツトル
（ｍｌ）の０．５規定（１Ｊ）ＨＣＪと１時間攪拌し、
液体をデカントし、この操作を３から４回縁シ返す。そ
の後鉱物質除去した骨粉末をよく脱イオン蒸留水でｐＨ
が中性に近ツくマで洗浄する。エタノール続いてエーテ
ルで洗浄して鉱物質除去した骨粉末から水を除き、乾燥
する。鉱物質除去した骨粉末は低温（例えば−２０°か
ら一８０Ｃ）で保存できる。骨粉末の鉱物質除去は他の
ｒく知られた方法、例えば−チレンジアミン四酢酸のご
ときキレート剤を用いても達成できる。
処理前粉末がＨＣノ処理後十分に鉱物質除去され骨−マ
トリックスタンバク質の抽出の準備ができたかどうか決
定するため、水で洗った粒末の鉱物質含量を試験する〔
（即ちカルシウム含量）、例えば、Ｖａｎ Ｋｏｓｓａ
の硝酸銀色付は法による、Ｊ。
トリックスタンバク質の抽出の準備ができたかどうか決
定するため、水で洗った粒末の鉱物質含量を試験する〔
（即ちカルシウム含量）、例えば、Ｖａｎ Ｋｏｓｓａ
の硝酸銀色付は法による、Ｊ。
ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ、 Ｚｉｅｇｌｅｒ’ ｓ Ｂｅ１
ｔｒ、 ２９． １．６３（１９０１）を参照されたい
〕。ＶＯｎ ＫＯ３５ａ色付けが陰性の場合、処理前粉
末はタンパク質抽出の準備の十分な鉱物質除去がなされ
ている。そのような鉱物質除去管粉末を試験動物に移植
すると移植部位で新しい骨の形成が誘導され、即ち推定
されているが未同定の骨形成因子を含んでいる。
ｔｒ、 ２９． １．６３（１９０１）を参照されたい
〕。ＶＯｎ ＫＯ３５ａ色付けが陰性の場合、処理前粉
末はタンパク質抽出の準備の十分な鉱物質除去がなされ
ている。そのような鉱物質除去管粉末を試験動物に移植
すると移植部位で新しい骨の形成が誘導され、即ち推定
されているが未同定の骨形成因子を含んでいる。
鉱物質除去管粉末からのタンパク質の抽出および分離前
に記載したごとく調製した鉱物質除去管粉末から約２か
ら８モル（Ｍ）グアニジニウム−塩酸水溶液（ＧｕＨＣ
／）でＴｒｉｚｍａ−塩酸（トリス・ＨＣＪ）のごとき
緩衝液中ｐ Ｈ７，０付近で目的のタンパク質を抽出す
るのに十分な時間一定速度の攪拌を行い抽出する。良好
なのは鉱物質除去した骨粉末をフェニルメチルスルホニ
ルフルオリドのごときタンパク質分解酵素阻害剤の存在
下、４Ｍ ＧｕＨＣＡ−０、ＯＩＭ）リス・ＨＣノ緩衝
液（ｐＨ７，０）と約４゜から２０Ｃの間で８から１２
時間攪拌し抽出を実施する。鉱物質除去管粉末を適当な
ＧｕＨＣＡ！−トリス・Ｈ（Ｊ緩衝液と目的のタンパク
質を実質的な量るため十分な時間接触させ抽出できる。
に記載したごとく調製した鉱物質除去管粉末から約２か
ら８モル（Ｍ）グアニジニウム−塩酸水溶液（ＧｕＨＣ
／）でＴｒｉｚｍａ−塩酸（トリス・ＨＣＪ）のごとき
緩衝液中ｐ Ｈ７，０付近で目的のタンパク質を抽出す
るのに十分な時間一定速度の攪拌を行い抽出する。良好
なのは鉱物質除去した骨粉末をフェニルメチルスルホニ
ルフルオリドのごときタンパク質分解酵素阻害剤の存在
下、４Ｍ ＧｕＨＣＡ−０、ＯＩＭ）リス・ＨＣノ緩衝
液（ｐＨ７，０）と約４゜から２０Ｃの間で８から１２
時間攪拌し抽出を実施する。鉱物質除去管粉末を適当な
ＧｕＨＣＡ！−トリス・Ｈ（Ｊ緩衝液と目的のタンパク
質を実質的な量るため十分な時間接触させ抽出できる。
典型的抽出では１００グラム（ｙ）の脱鉄物子ウシ前粉
末から約１５００ミリグラム（ｒｎ９）総タンパク質が
４Ｍ ＧｕＨ（Ｊ −０，０１Ｍ トリス−ＨＣ１Ｍ衝
液（ｐＨ７，０）で３日で抽出される。本発明の方法で
妹、４ Ｍ ＧｕＨＣＡ！−０，０１Ｍ ）リス−Ｈ（
Ｊ緩衝液（ｐＨ７，０）によシ、３日抽出によシ荀られ
る総タンパク質の８０パーセント（鉤以上が最初の８か
ら１２時間で抽出される。最初の８から１２時間の間の
抽出で３日抽出によシ得られる総低分子量タンパク質集
団の９５％以上が回収される。はとんどの骨形成活性は
これら低分子量タンパク質に付随している。鉱物質除去
骨粉未乾燥重量ダラム当シ約１５ｍＪの４Ｍ ＧｕＨＣ
ｌ−トリス・ＨＣ４緩衝液（ｐＨ７，０）を使用する。
末から約１５００ミリグラム（ｒｎ９）総タンパク質が
４Ｍ ＧｕＨ（Ｊ −０，０１Ｍ トリス−ＨＣ１Ｍ衝
液（ｐＨ７，０）で３日で抽出される。本発明の方法で
妹、４ Ｍ ＧｕＨＣＡ！−０，０１Ｍ ）リス−Ｈ（
Ｊ緩衝液（ｐＨ７，０）によシ、３日抽出によシ荀られ
る総タンパク質の８０パーセント（鉤以上が最初の８か
ら１２時間で抽出される。最初の８から１２時間の間の
抽出で３日抽出によシ得られる総低分子量タンパク質集
団の９５％以上が回収される。はとんどの骨形成活性は
これら低分子量タンパク質に付随している。鉱物質除去
骨粉未乾燥重量ダラム当シ約１５ｍＪの４Ｍ ＧｕＨＣ
ｌ−トリス・ＨＣ４緩衝液（ｐＨ７，０）を使用する。
抽出期間が完了したら、抽出液を沖過しく例えばＷｈａ
ｔｍａｎ ｆｐ紙で）、Ｆ液を常法によシ濃縮する；典
型的な実験では、濃縮工程に約５，０００ダルトンの分
子切シ離しサイズのメンブランフィルタ−または中空繊
維沖過カートリッジを付けたＡｍ１ｃｏｎ 限外沖過装
置（ＡｍｉｃｏｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、 Ｌｅｘｉ
ｎｇｔｏｎ、 Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ）を使用
する（即ち、メンプランまたは中空繊維カートリッジは
約５，０００ダルトイ以上の分子量を持つ分子を保持し
、例えば、ＹＭ−５のごとき適当なり１ａｆｌｏ＠限外
濾過膜またはＡｍ１ｃｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎカ
ラのＨＩＰ５−２０のごとき中空繊維カートリッジ八こ
こに記載されている例えば４ＭＧｕＨＣノー０．０１）
リス・ＨＣノ緩衝液のごとき種々の緩衝液および例えば
０１５ＮＨＣ１溶液社水性緩衝液または溶液で指示した
物質は水中に指示された濃度で存在する。濃縮タンパク
質溶液のタンパク質成分は以下のごとく高速液体クロマ
トクラフィーを含む種々の通常のクロマトグラフィーの
技術を用いて分画する： 最初のタンパク質分画はセファロース０Ｌ−６Ｂ（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、 Ｎｅｗ Ｊｅ
ｒｓｅｙ ）カラム上で都合よく達成される。典型的な
実験では、本明細書に記載されているタンパク質抽出液
を限外済過により約２５から４０４旬の濃度まで濃縮す
る。種々の抽出調製試料およびカラム分画のタンパク質
濃度は通常２８０ナノメーター（ｎｍ）における溶液の
吸光度を分光光度法的測定のごとき常法によシ推定する
。適当な量のタンパク質濃縮液（タンパク質にして約５
００〜の量）を４ＭＧｕＨＣＡ！−０，０１Ｍ ）リス
ーＭＣＩ緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化した５センチメ
ーター（ｃｍ）Ｘ９０ｃｍのセファロースＣＬ−ｓＢカ
ラムに応用する。カラムを約５０から１００ｃｍの静水
圧で４Ｍ ＧｕＨＣｌ−０，０１Ｍ）リス・ＨＣＩ Ｍ
衝液で溶出し、１５から２０ｄ容量の個々の分画を集め
る。上記条件下での典型的な溶出プロフィールを個々の
分画の２８０ｎｍに於ける吸光度を測定する事にょシ得
、第１図に示した。
ｔｍａｎ ｆｐ紙で）、Ｆ液を常法によシ濃縮する；典
型的な実験では、濃縮工程に約５，０００ダルトンの分
子切シ離しサイズのメンブランフィルタ−または中空繊
維沖過カートリッジを付けたＡｍ１ｃｏｎ 限外沖過装
置（ＡｍｉｃｏｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、 Ｌｅｘｉ
ｎｇｔｏｎ、 Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ）を使用
する（即ち、メンプランまたは中空繊維カートリッジは
約５，０００ダルトイ以上の分子量を持つ分子を保持し
、例えば、ＹＭ−５のごとき適当なり１ａｆｌｏ＠限外
濾過膜またはＡｍ１ｃｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎカ
ラのＨＩＰ５−２０のごとき中空繊維カートリッジ八こ
こに記載されている例えば４ＭＧｕＨＣノー０．０１）
リス・ＨＣノ緩衝液のごとき種々の緩衝液および例えば
０１５ＮＨＣ１溶液社水性緩衝液または溶液で指示した
物質は水中に指示された濃度で存在する。濃縮タンパク
質溶液のタンパク質成分は以下のごとく高速液体クロマ
トクラフィーを含む種々の通常のクロマトグラフィーの
技術を用いて分画する： 最初のタンパク質分画はセファロース０Ｌ−６Ｂ（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、 Ｎｅｗ Ｊｅ
ｒｓｅｙ ）カラム上で都合よく達成される。典型的な
実験では、本明細書に記載されているタンパク質抽出液
を限外済過により約２５から４０４旬の濃度まで濃縮す
る。種々の抽出調製試料およびカラム分画のタンパク質
濃度は通常２８０ナノメーター（ｎｍ）における溶液の
吸光度を分光光度法的測定のごとき常法によシ推定する
。適当な量のタンパク質濃縮液（タンパク質にして約５
００〜の量）を４ＭＧｕＨＣＡ！−０，０１Ｍ ）リス
ーＭＣＩ緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化した５センチメ
ーター（ｃｍ）Ｘ９０ｃｍのセファロースＣＬ−ｓＢカ
ラムに応用する。カラムを約５０から１００ｃｍの静水
圧で４Ｍ ＧｕＨＣｌ−０，０１Ｍ）リス・ＨＣＩ Ｍ
衝液で溶出し、１５から２０ｄ容量の個々の分画を集め
る。上記条件下での典型的な溶出プロフィールを個々の
分画の２８０ｎｍに於ける吸光度を測定する事にょシ得
、第１図に示した。
本明細書に記載した骨誘導検定糸を用いてセファロース
ＣＬ−６Ｂカラムからの種々の溶出分画の骨誘導活性を
測定し、その結果は第１図において′Ｃ″と同定された
分画のプールが骨形成活性に対応する因子を含んでいた
。プールされた分画■。
ＣＬ−６Ｂカラムからの種々の溶出分画の骨誘導活性を
測定し、その結果は第１図において′Ｃ″と同定された
分画のプールが骨形成活性に対応する因子を含んでいた
。プールされた分画■。
■および■からなるプールＣを常法を用いて濃縮する。
標準的抽出では、セファロースＣＬ−５Ｂカラム上の全
タンパク質の溶出から得られるプールＣは鉱物質除去子
ウシ骨粉末の４ Ｍ ＧｕＨ（Ｊ−０、ＯＩＭ）リス・
ＨＣ１緩衝液（ｐＨ７，０）による８から１２時間抽出
により得られる総タンパク質の約４０％を示し−Ｃいる
。更なる分画は七７アクリルＳ −２００（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、 ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ
）カラムによるクロマトグラフィーによシ達成された。
タンパク質の溶出から得られるプールＣは鉱物質除去子
ウシ骨粉末の４ Ｍ ＧｕＨ（Ｊ−０、ＯＩＭ）リス・
ＨＣ１緩衝液（ｐＨ７，０）による８から１２時間抽出
により得られる総タンパク質の約４０％を示し−Ｃいる
。更なる分画は七７アクリルＳ −２００（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、 ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ
）カラムによるクロマトグラフィーによシ達成された。
典型的な実験では、プールＣからの７５から１００■の
タンパク質を約２５峰価の濃度で、２．２ｃｍＸ １１
５ｃｍセファクリルＳ−２００カラムに応用し、約５０
から７５ｃｒ／ｌの間の静水圧にて４ Ｍ ＧｕＨＣ／
−０，０１Ｍ トリス−Ｉ（（Ｊ緩衝液（１）Ｈ７，
０）で溶出し、約４ｄ容量で個々の分画を集める。上記
条件下得られる典型的な溶出プロフィールを第２図に示
した。
タンパク質を約２５峰価の濃度で、２．２ｃｍＸ １１
５ｃｍセファクリルＳ−２００カラムに応用し、約５０
から７５ｃｒ／ｌの間の静水圧にて４ Ｍ ＧｕＨＣ／
−０，０１Ｍ トリス−Ｉ（（Ｊ緩衝液（１）Ｈ７，
０）で溶出し、約４ｄ容量で個々の分画を集める。上記
条件下得られる典型的な溶出プロフィールを第２図に示
した。
セファクリルＳ−２００カラムから有られる分画をプー
ルしく第２図参照）、得られるプールした物質は任意に
アルファ（α）、ベータ（ロ）、ガンマ■（γＩ）、ガ
ンマ■（γ■）およびデルタ（δ）として同定した。
ルしく第２図参照）、得られるプールした物質は任意に
アルファ（α）、ベータ（ロ）、ガンマ■（γＩ）、ガ
ンマ■（γ■）およびデルタ（δ）として同定した。
ドデシル硫酸ナトリウム存在下、通常の非連続ポリアク
リルアミ１ゲル電気泳動（ＬａｅＩ］ｌＩｎ１ｉ、 Ｕ
。
リルアミ１ゲル電気泳動（ＬａｅＩ］ｌＩｎ１ｉ、 Ｕ
。
Ｋ、、 Ｎａｔｕｒｅ、 ２２７巻、 ｐｐ、６８０−
６８５（１９７０））を用いて、アルファからデルタプ
ールのそれぞれに含まれるタンパク質の分析によりいく
っがのタンノぐり質が同定された。アルファプールは５
０．０００ダルト／以上の分子量の少ないタンパク質成
分を含み；ベータプールは３８，０００から４０．００
０ダルト／の主成分、より分子量が高い微量の夾雑物お
よび１４，０００から３０，０００ダルトンに移動する
少量の低分子量タンパク質種を含み；ガンマＩおよびガ
ンマ■ブールは３１，０００から３５．０００ダルトン
、２２，０００から２５，０００ダルトン、１６，００
０から１８，０００ダルトンおよび１２．０００から１
４，０００ダルトンに移動する４つの主な大きさの組の
種を含み；デルタプールはｔｌとんど１２，０００から
１４，０００ダルト／範囲のタンパク質を含むことが観
察された。
６８５（１９７０））を用いて、アルファからデルタプ
ールのそれぞれに含まれるタンパク質の分析によりいく
っがのタンノぐり質が同定された。アルファプールは５
０．０００ダルト／以上の分子量の少ないタンパク質成
分を含み；ベータプールは３８，０００から４０．００
０ダルト／の主成分、より分子量が高い微量の夾雑物お
よび１４，０００から３０，０００ダルトンに移動する
少量の低分子量タンパク質種を含み；ガンマＩおよびガ
ンマ■ブールは３１，０００から３５．０００ダルトン
、２２，０００から２５，０００ダルトン、１６，００
０から１８，０００ダルトンおよび１２．０００から１
４，０００ダルトンに移動する４つの主な大きさの組の
種を含み；デルタプールはｔｌとんど１２，０００から
１４，０００ダルト／範囲のタンパク質を含むことが観
察された。
本質的に本明細書に記載されているごとく、骨誘導検定
での活性測定はガンマ■およびガンマ■プールが骨形成
誘導因子を含有していることを示している。
での活性測定はガンマ■およびガンマ■プールが骨形成
誘導因子を含有していることを示している。
最終的タンパク質Ｎ製の議論を簡単にするため、ベータ
、ガンマおよびデルタプール中に観察されたタンパク質
のリストを表■に示した。前に指摘したごとく、それぞ
れの主タンパク質釉は各々表■に示したごとく同定名（
Ｐｉ、Ｐ２およびその類似名）で帰属しである。
、ガンマおよびデルタプール中に観察されたタンパク質
のリストを表■に示した。前に指摘したごとく、それぞ
れの主タンパク質釉は各々表■に示したごとく同定名（
Ｐｉ、Ｐ２およびその類似名）で帰属しである。
表１
Ｐｉ ３８−４０
Ｐ２ ３Ｏ−３３
ＰＡ ２８−３０
ＰＢ ２４
ＰＢ ２２−２４
ＰＣ１９
Ｐ４ １６−１８
Ｐ５ａ １３−１４
Ｐ５ｂ １４”
ＰＤ １２
タンノξり種のすべての一次の分子量帰属は、ドデシル
硫酸ナトリウムおよび還元剤存在下ゲルを溶解し、ｐＨ
８，８にて１３チアクリルアミドで非連続ポリアクリル
アミドゲル電気泳動による移動度に基づいている。少な
いタンパク種とはゲル上分析されたそれぞれの試料にお
ける全物質の１０から１５ノξ−セント以下である事を
示している。
硫酸ナトリウムおよび還元剤存在下ゲルを溶解し、ｐＨ
８，８にて１３チアクリルアミドで非連続ポリアクリル
アミドゲル電気泳動による移動度に基づいている。少な
いタンパク種とはゲル上分析されたそれぞれの試料にお
ける全物質の１０から１５ノξ−セント以下である事を
示している。
Ｐ５ｂは非還元条件下約１０，０００ダルトンに移動し
、それによ５ＰｓｂからＰ５ａを区別できる。
、それによ５ＰｓｂからＰ５ａを区別できる。
Ｐ３タンパク質の最終的精製
七７アクリルＳ−２００カラムクロマトグラフィーから
得られた部分精製タンパク質調製試料の逆相ＨＰＬＣ（
４２）型マイクロプロセッサ−ユニットの制御によるＢ
ｅｃｋｍａｎ Ａｌｔｅｘ ＨＰＬＣを用いて）によシ
最終的精製が達成された。２つの方法を用いた。
得られた部分精製タンパク質調製試料の逆相ＨＰＬＣ（
４２）型マイクロプロセッサ−ユニットの制御によるＢ
ｅｃｋｍａｎ Ａｌｔｅｘ ＨＰＬＣを用いて）によシ
最終的精製が達成された。２つの方法を用いた。
いくつかのタンパク質の特徴的な現象Ｃ特にここに記載
したＰ３タンパク質族）はＧ ｕ ＨＣＡ！のごとき強
い解離剤非存在下では溶解性がなくなる事である。さら
に、多数のタンパク質種が同時にゾール中に存在し、Ｇ
ｕＨＣＡ！を除去するとＰＢと一緒に他のタン、２り質
も共沈殿する。それ故、ただ１つまたは２つの主タンパ
ク質からなる狭いプールをセファクリルＳ−２００カラ
ムから得ＨＰＬＣによる更なる精製の出発物質とする方
法を発展させた。さらに、溶液中のタンパク質の保持を
最大にするため上に記載したごときプールを１０％から
１５％容量の間の濃度のアセトニトリル（ＡＣＮ）を供
給した０、１％トリフルオロ酢酸（ＴＦ’Ａ）を含む水
性溶液に対して直接透析した。分子量カットオノサイズ
が３，５００ダルトンまたはそれ以下の通常の透析膜チ
ューブをこの過程に使用する。
したＰ３タンパク質族）はＧ ｕ ＨＣＡ！のごとき強
い解離剤非存在下では溶解性がなくなる事である。さら
に、多数のタンパク質種が同時にゾール中に存在し、Ｇ
ｕＨＣＡ！を除去するとＰＢと一緒に他のタン、２り質
も共沈殿する。それ故、ただ１つまたは２つの主タンパ
ク質からなる狭いプールをセファクリルＳ−２００カラ
ムから得ＨＰＬＣによる更なる精製の出発物質とする方
法を発展させた。さらに、溶液中のタンパク質の保持を
最大にするため上に記載したごときプールを１０％から
１５％容量の間の濃度のアセトニトリル（ＡＣＮ）を供
給した０、１％トリフルオロ酢酸（ＴＦ’Ａ）を含む水
性溶液に対して直接透析した。分子量カットオノサイズ
が３，５００ダルトンまたはそれ以下の通常の透析膜チ
ューブをこの過程に使用する。
ＴＦＡ：ＡＣＮ溶媒に可溶なタンパク質が都合よく各々
透析したプールからの不溶性物の遠心分離による除去に
よシ得られる。この時点で可溶性タンパク質はここに記
載したＰｒｏｔｅｓｉｌ ３００オクチルカラムのごと
き逆相ＨＰＬＣ（カラム上でクロマトグラフィーを行え
る。典型的実験では、この方法によるピーク分画から得
たＴＦＡ：ＡＣＮ可溶性タンパク質を０．１チＴＦ’Ａ
： １０チＡＣＮで平衡化した１０ミクロンの粒子サイ
ズの０．４６ｃｍＸ ２５．０ｃｒｒＬＰｒｏｔｅｓｉ
ｌ ３００オクチルカラム（Ｗｈａｔｍａｎ ）に応用
する。これらの条件下、カラムに結合したタンパク質を
６０ ｍＪ／ｈｒの流速で、１０％から８０％ＡＣＮ直
線的グラジェントを４５分以上かけ溶出する。典型的実
験においては、第３Ａ図に示したごとく、Ｐ２およびＰ
１タンパク質がＡＣＮ濃度（点線で示した）濃度によシ
続いてガンマ■ピークから回収される。同様に、ベータ
ビークからＰ１タンパク質が得られ、一方デルタピーク
からＰ５ａおよびＰ５ｂを得る。Ｐ３タンパク質はセフ
ァクリルＳ−２００カラムではガンマ■およびガンマ■
領域の間に溶出する。Ｐ３タンパク質は適当な分画のＴ
Ｆ’Ａ ： ＡＣＨに対する透析によシ得られる可溶お
よび不溶物質の両方に観察される。Ｐ３タンパク質の溶
解性の欠除によシネ溶物質中に本質的に均質なＰ３タン
パク質として得る。ＴＦＡ：ＡＣＮ溶媒の溶液に保持さ
れているＰ３タンパク質は本質的に上に記載したごとく
逆相ＨＰＬＣによシ更に精製される。
透析したプールからの不溶性物の遠心分離による除去に
よシ得られる。この時点で可溶性タンパク質はここに記
載したＰｒｏｔｅｓｉｌ ３００オクチルカラムのごと
き逆相ＨＰＬＣ（カラム上でクロマトグラフィーを行え
る。典型的実験では、この方法によるピーク分画から得
たＴＦＡ：ＡＣＮ可溶性タンパク質を０．１チＴＦ’Ａ
： １０チＡＣＮで平衡化した１０ミクロンの粒子サイ
ズの０．４６ｃｍＸ ２５．０ｃｒｒＬＰｒｏｔｅｓｉ
ｌ ３００オクチルカラム（Ｗｈａｔｍａｎ ）に応用
する。これらの条件下、カラムに結合したタンパク質を
６０ ｍＪ／ｈｒの流速で、１０％から８０％ＡＣＮ直
線的グラジェントを４５分以上かけ溶出する。典型的実
験においては、第３Ａ図に示したごとく、Ｐ２およびＰ
１タンパク質がＡＣＮ濃度（点線で示した）濃度によシ
続いてガンマ■ピークから回収される。同様に、ベータ
ビークからＰ１タンパク質が得られ、一方デルタピーク
からＰ５ａおよびＰ５ｂを得る。Ｐ３タンパク質はセフ
ァクリルＳ−２００カラムではガンマ■およびガンマ■
領域の間に溶出する。Ｐ３タンパク質は適当な分画のＴ
Ｆ’Ａ ： ＡＣＨに対する透析によシ得られる可溶お
よび不溶物質の両方に観察される。Ｐ３タンパク質の溶
解性の欠除によシネ溶物質中に本質的に均質なＰ３タン
パク質として得る。ＴＦＡ：ＡＣＮ溶媒の溶液に保持さ
れているＰ３タンパク質は本質的に上に記載したごとく
逆相ＨＰＬＣによシ更に精製される。
精製したタンパク質を本質的に均質な状態にする第２の
方法は３５，０００から１４，０００ダルトン分子量範
囲のある種のタンパク質の高度な不溶性を利用して〔特
に高濃度で一緒に存在する時（例えば約１ＣＩ＋ν箕）
〕計画された。この方法においてはセファクリルＳ−２
００カラムクロマトグラフイーからガンマＩおよびガン
マ■プール中に溶出されるタンパク質（即ち、骨誘導活
性が観察されるプール）を約１０ｍｐ／ｍ／！に濃縮す
る。この物質を急速に〔例えば、２から３時間毎に各々
４リツトルを６回交換する（分子カットオフサイズ２，
０００ダルトンの透析チューブに入れる））１５ｔ：’
から２３Ｃの脱イオン蒸留水に対して透析する。沈殿し
たタンパク質を遠心分離によシ集め、洗浄水中１０４旬
以上のタンパク質濃度を保つようにして脱イオン蒸留水
で数回洗浄する。この沈殿物質の主たる構成物はＰ２．
Ｐ３．Ｐ４およびＰ５ａである事が観察された；いくつ
かの場合種々の量で少量のＰ１タンパク質が観察された
。最終的はレットを０．１％ＴＦ’Ａを含む１５％ＡＣ
Ｈに溶解し、可溶化物質をＰｒｏｔｅｓｉｌ ３００オ
クチルカラムに応用した。ＡＣＮ濃度の増加によυ典型
的溶出プロフィールである第３Ｂ図に示したごとく、ｐ
２．ｐ３゜Ｐ４およびＰ５ａタンパク質が溶出した。
方法は３５，０００から１４，０００ダルトン分子量範
囲のある種のタンパク質の高度な不溶性を利用して〔特
に高濃度で一緒に存在する時（例えば約１ＣＩ＋ν箕）
〕計画された。この方法においてはセファクリルＳ−２
００カラムクロマトグラフイーからガンマＩおよびガン
マ■プール中に溶出されるタンパク質（即ち、骨誘導活
性が観察されるプール）を約１０ｍｐ／ｍ／！に濃縮す
る。この物質を急速に〔例えば、２から３時間毎に各々
４リツトルを６回交換する（分子カットオフサイズ２，
０００ダルトンの透析チューブに入れる））１５ｔ：’
から２３Ｃの脱イオン蒸留水に対して透析する。沈殿し
たタンパク質を遠心分離によシ集め、洗浄水中１０４旬
以上のタンパク質濃度を保つようにして脱イオン蒸留水
で数回洗浄する。この沈殿物質の主たる構成物はＰ２．
Ｐ３．Ｐ４およびＰ５ａである事が観察された；いくつ
かの場合種々の量で少量のＰ１タンパク質が観察された
。最終的はレットを０．１％ＴＦ’Ａを含む１５％ＡＣ
Ｈに溶解し、可溶化物質をＰｒｏｔｅｓｉｌ ３００オ
クチルカラムに応用した。ＡＣＮ濃度の増加によυ典型
的溶出プロフィールである第３Ｂ図に示したごとく、ｐ
２．ｐ３゜Ｐ４およびＰ５ａタンパク質が溶出した。
表１に記載された主タンパク質の各々はＰｒｏｔｅｓｉ
ｌ得られた分画のプールを凍結乾燥して濃縮し、Ｑ、１
％ＴＦＡおよび特定の凍結乾燥物質に依存して約１０か
ら２０ ％ＡＣＮに再溶角イし、Ｐｒｏｔｅｓｉ１３０
０オクチルカラムへ再応用する。タンパク質を長時間か
けて（従って個々の分画数が多くなる）流出させる事を
除いてここで前に記載した条件下即ち直線的１０％から
８Ｏ−ＡＣＨのグラジェントを用い６０ ｍｌ／ｂｒの
流速でタンパク質を力２ムから溶出する。各々のタンパ
ク質分画の純度は通常の非連続ＰＡＧＥを用いて決定し
た。／ヒだ１つの主化学種を示す分画を更なる化学およ
び生物的特徴付けに用いた。典型的にはこれらの分画を
凍結乾燥し、凍結乾燥粉末として保存する。
ｌ得られた分画のプールを凍結乾燥して濃縮し、Ｑ、１
％ＴＦＡおよび特定の凍結乾燥物質に依存して約１０か
ら２０ ％ＡＣＮに再溶角イし、Ｐｒｏｔｅｓｉ１３０
０オクチルカラムへ再応用する。タンパク質を長時間か
けて（従って個々の分画数が多くなる）流出させる事を
除いてここで前に記載した条件下即ち直線的１０％から
８Ｏ−ＡＣＨのグラジェントを用い６０ ｍｌ／ｂｒの
流速でタンパク質を力２ムから溶出する。各々のタンパ
ク質分画の純度は通常の非連続ＰＡＧＥを用いて決定し
た。／ヒだ１つの主化学種を示す分画を更なる化学およ
び生物的特徴付けに用いた。典型的にはこれらの分画を
凍結乾燥し、凍結乾燥粉末として保存する。
第４図はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド
ゲル上で典型的非連続ゲル電気泳動分析の結果を表わし
ている。分析はドデシル硫酸ナトリウムおよび還元剤存
在下ｐＨ８，８にて１３％のアクリルアミドおよび０．
３５１のビス−アクリルアミド架橋剤でゲルを溶解し非
連続ポリアクリルアミドゲル系で実施する。ゲルは５０
ポルトで３０分分間−て１００ボルトで７時間通電する
。タンパク質バンドはクーマシーブリリアントブルーＲ
で色付けして見えるようにする。カラム１および８は以
下の標準分子量マーカーを加えたゲルを表わしている：
９５，０００（ホスホリラーゼＡ）、６８．０００ （
ウシ血清アルブミン）、４３，０００ （オバル／ミン
Ｌ ３１，０００（カーボニックアルヒドラーゼ）、２
１，０００ （大豆トリプシンインヒビター）および１
４，０００ （リボヌクレアーゼ）；カラム２．３．４
．５および６は各々鉱物質除去子ウシ骨粉末からのｐｉ
、Ｐ２．ｐ３．Ｐ４およびＰ・５タンパク質（ＣＰＩか
らＣＦ２）を示し；カラム７は鉱物質除を示している。
ゲル上で典型的非連続ゲル電気泳動分析の結果を表わし
ている。分析はドデシル硫酸ナトリウムおよび還元剤存
在下ｐＨ８，８にて１３％のアクリルアミドおよび０．
３５１のビス−アクリルアミド架橋剤でゲルを溶解し非
連続ポリアクリルアミドゲル系で実施する。ゲルは５０
ポルトで３０分分間−て１００ボルトで７時間通電する
。タンパク質バンドはクーマシーブリリアントブルーＲ
で色付けして見えるようにする。カラム１および８は以
下の標準分子量マーカーを加えたゲルを表わしている：
９５，０００（ホスホリラーゼＡ）、６８．０００ （
ウシ血清アルブミン）、４３，０００ （オバル／ミン
Ｌ ３１，０００（カーボニックアルヒドラーゼ）、２
１，０００ （大豆トリプシンインヒビター）および１
４，０００ （リボヌクレアーゼ）；カラム２．３．４
．５および６は各々鉱物質除去子ウシ骨粉末からのｐｉ
、Ｐ２．ｐ３．Ｐ４およびＰ・５タンパク質（ＣＰＩか
らＣＦ２）を示し；カラム７は鉱物質除を示している。
斜線でかげをつけた部分は低濃度のバンドである。
子ウシ骨から得たｐ２．ｐ３およびＰ４タンパク質のア
ミン末端配列を以下の方法を用いて調べたニ アミノ末端配列はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ Ｍｏｄｅ１４７０Ａ Ｇａｓ Ｐｈａｓｅ Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ ５ｅｑｕｅｎｃｅｒによシ決定した。再構成
試料を充填ディスクに適当な溶媒にタン・ξり質を溶解
して（典型的にはトリノルオロ酢酸）３０マイクロリツ
トル（μｌ）の容量で応用する。試料を加える前にデス
クにポリブレンを加え、反応容器は１２サイクル前もっ
て廻し、ポリプレン／ディスクキャリアの条件を整える
。
ミン末端配列を以下の方法を用いて調べたニ アミノ末端配列はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ Ｍｏｄｅ１４７０Ａ Ｇａｓ Ｐｈａｓｅ Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ ５ｅｑｕｅｎｃｅｒによシ決定した。再構成
試料を充填ディスクに適当な溶媒にタン・ξり質を溶解
して（典型的にはトリノルオロ酢酸）３０マイクロリツ
トル（μｌ）の容量で応用する。試料を加える前にデス
クにポリブレンを加え、反応容器は１２サイクル前もっ
て廻し、ポリプレン／ディスクキャリアの条件を整える
。
Ｅｄｍａｎ分解および次の変換は装置によシ自動的に実
行される。アミノ酸誘導体は以前に記載されている（
Ｔｈｏｍａｓ、 Ｋ、 Ａ、ら、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃ
ｈｅｍ、 ２５６巻、 ｐｐ、 １９４７−１９５５（
１９８１）を参照〕ごとく、アセトン／アセトニトリル
：メタノールのグラジェントを用いてＨｅｗｌ−ｅｔｔ
−Ｐａｃｋａｒｄ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａ−ｎｒ
ｏＴ、（ａｌｔ（ｄＣｈｒｎｍｌｌｌｔｐｃｒｙｎｙ）
ｈＭｎＡｏ］１ｎ只ａ’Ｒμｍ１１同定する。Ｂｅｃｋ
ｍａｍ Ｃ１８マイクロスクエア逆相カラムを用い、同
定する。用いたガスシークエンサーおよびＨＰＬＣプロ
グラムによシ各々の試料のすべての２０アミノ酸誘導体
の同定ができる。
行される。アミノ酸誘導体は以前に記載されている（
Ｔｈｏｍａｓ、 Ｋ、 Ａ、ら、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃ
ｈｅｍ、 ２５６巻、 ｐｐ、 １９４７−１９５５（
１９８１）を参照〕ごとく、アセトン／アセトニトリル
：メタノールのグラジェントを用いてＨｅｗｌ−ｅｔｔ
−Ｐａｃｋａｒｄ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａ−ｎｒ
ｏＴ、（ａｌｔ（ｄＣｈｒｎｍｌｌｌｔｐｃｒｙｎｙ）
ｈＭｎＡｏ］１ｎ只ａ’Ｒμｍ１１同定する。Ｂｅｃｋ
ｍａｍ Ｃ１８マイクロスクエア逆相カラムを用い、同
定する。用いたガスシークエンサーおよびＨＰＬＣプロ
グラムによシ各々の試料のすべての２０アミノ酸誘導体
の同定ができる。
子ウシＰ３タンパク質の部分アミノ末端配列（子ウシＰ
３タンパク質はここではまたパウシＰ３タンパク質″と
も称される）はＨ２Ｎ −Ｐ ｈ ｅ −Ｐｒｏ−Ｖａ
ｌ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ
−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａであると決
定された。
３タンパク質はここではまたパウシＰ３タンパク質″と
も称される）はＨ２Ｎ −Ｐ ｈ ｅ −Ｐｒｏ−Ｖａ
ｌ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ
−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａであると決
定された。
子ウシＰ２タンパク質の部分アミン末端配列はＨ２Ｎ−
Ｔｒｐ−？−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−？−Ｔｒｐであると決定
された。
Ｔｒｐ−？−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−？−Ｔｒｐであると決定
された。
子ウシＰ４タンパク質複合体の部分アミノ末端配列は以
下の配列の２つの主成分が存在する事を示しでいる： Ｈ２Ｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−？−？−Ｔｙｒ；Ｈ
２Ｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−？−７−Ｔｙｒ。
下の配列の２つの主成分が存在する事を示しでいる： Ｈ２Ｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−？−？−Ｔｙｒ；Ｈ
２Ｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−？−７−Ｔｙｒ。
慣例として受け入れられている省略彫金ここでは使用し
、以下のごとく各々のアミノ酸を表わす：Ａｌａ、アラ
ニｙ ； Ａｒ ｇ、アルギ＝ｙ；Ａ５ｎ、アスパラギ
ン；Ａｓｐ、アスパラギン酸ｓ ＣｙＱ（’／２）＋シ
スティン；Ｇｌｙ、ダリシン； Ｇｌｎ、／ルタミン；
Ｇ １ ｕ ＋グルタミン酸；Ｈ１ｓ、ヒスチジｙ；Ｉ
ｌｅ。
、以下のごとく各々のアミノ酸を表わす：Ａｌａ、アラ
ニｙ ； Ａｒ ｇ、アルギ＝ｙ；Ａ５ｎ、アスパラギ
ン；Ａｓｐ、アスパラギン酸ｓ ＣｙＱ（’／２）＋シ
スティン；Ｇｌｙ、ダリシン； Ｇｌｎ、／ルタミン；
Ｇ １ ｕ ＋グルタミン酸；Ｈ１ｓ、ヒスチジｙ；Ｉ
ｌｅ。
インロイシン； Ｌｅｕ、ロイシン；”ＹＳｓリジン；
Ｍｅｔ、メチオニン； Ｐｈｅ、フェニルアラニン；Ｐ
ｒｙ、ゾロリｙ；Ｓｅｒ、セリン；Ｔｈｒ、スレオニン
；Ｔｙｒ、チロシン：Ｔｒｐ、トリプトファン；Ｍａｌ
、バリン。アミノ酸配列中に使用した“？”は未同定の
アミノ酸を示す。
Ｍｅｔ、メチオニン； Ｐｈｅ、フェニルアラニン；Ｐ
ｒｙ、ゾロリｙ；Ｓｅｒ、セリン；Ｔｈｒ、スレオニン
；Ｔｙｒ、チロシン：Ｔｒｐ、トリプトファン；Ｍａｌ
、バリン。アミノ酸配列中に使用した“？”は未同定の
アミノ酸を示す。
本質的に本明細書に記載した抽出および精製方法をたど
ると、鉱物質除去したヒト骨粉末から約２３．０００ダ
ルトンの分子量を持ち、ヒ）Ｐ３タンパク質と呼ばれる
タンパク質を得る。ヒトＰ３タンパク質は本質的に均質
な状態に精製され、移植すると骨の形成を誘導する。ヒ
ト骨から得たヒトＰ３タンパク質は子ウシＰ３タンパク
質と相関している。本質的に本明細書に記載したごとき
抽出および精製方法をたどると、鉱物質除去したブタ骨
粒末から約２３，０００グルトンの分子量を持ち、ブタ
Ｐ３タンノξり質と呼ばれているタンパク質を得る。ブ
タ骨から得たブタＰ３タンパク質は子ウシＰ３およびヒ
トＰ３タンパク質は相関している。
ると、鉱物質除去したヒト骨粉末から約２３．０００ダ
ルトンの分子量を持ち、ヒ）Ｐ３タンパク質と呼ばれる
タンパク質を得る。ヒトＰ３タンパク質は本質的に均質
な状態に精製され、移植すると骨の形成を誘導する。ヒ
ト骨から得たヒトＰ３タンパク質は子ウシＰ３タンパク
質と相関している。本質的に本明細書に記載したごとき
抽出および精製方法をたどると、鉱物質除去したブタ骨
粒末から約２３，０００グルトンの分子量を持ち、ブタ
Ｐ３タンノξり質と呼ばれているタンパク質を得る。ブ
タ骨から得たブタＰ３タンパク質は子ウシＰ３およびヒ
トＰ３タンパク質は相関している。
子ウシ、ヒトおよびブタ各々のＰ３タンパク質は以下の
ごとき類似性を示す： （１）本明細書に記載した方法に従ってすべて抽出およ
び精製され、強解離剤非存在下では水にわずかしか溶解
しない； （２）アルカリホスファターゼ活性測定およびタンパク
質の移植の結果生長した体外移植組織の組織学的検査に
よシ判断された骨形成を誘導する能力が各々について示
され； （３）各々がほとんど同じ見掛けの分子量を持っている
事が非連続ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動系で示され；（４）子ウシ骨由来Ｐ３タ
ンパク質に対して調製された抗体がヒトおよびブタ骨由
来Ｐ３タンパク質に結合し；同様にブタＰ３タンパク質
またはヒトＰ３タンパク質に対して調製した抗体はすべ
てＭ Ｑ ／−１７７−１’Ｄ ”ｌ Ｊ２’／Ｆ Ａ
）ｆｒＷ’ｋｈム−＋ １７７’ｌ テとｈｅ−ｔ７
ｓタンパク質は免疫学的に関連している；（５）表２に
示したごとくアミノ酸分析は著しい類似性を示し；およ
び （６）各々のＰ３タンパク質から発生するはブチドのア
ミノ酸配列は広範囲の相同な領域を示す。
ごとき類似性を示す： （１）本明細書に記載した方法に従ってすべて抽出およ
び精製され、強解離剤非存在下では水にわずかしか溶解
しない； （２）アルカリホスファターゼ活性測定およびタンパク
質の移植の結果生長した体外移植組織の組織学的検査に
よシ判断された骨形成を誘導する能力が各々について示
され； （３）各々がほとんど同じ見掛けの分子量を持っている
事が非連続ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動系で示され；（４）子ウシ骨由来Ｐ３タ
ンパク質に対して調製された抗体がヒトおよびブタ骨由
来Ｐ３タンパク質に結合し；同様にブタＰ３タンパク質
またはヒトＰ３タンパク質に対して調製した抗体はすべ
てＭ Ｑ ／−１７７−１’Ｄ ”ｌ Ｊ２’／Ｆ Ａ
）ｆｒＷ’ｋｈム−＋ １７７’ｌ テとｈｅ−ｔ７
ｓタンパク質は免疫学的に関連している；（５）表２に
示したごとくアミノ酸分析は著しい類似性を示し；およ
び （６）各々のＰ３タンパク質から発生するはブチドのア
ミノ酸配列は広範囲の相同な領域を示す。
表４参照。
子ウシ、ブタおよびヒトＰ３タンパク質のアミノ酸組成
が再蒸留した６Ｎ塩酸（１１０ｔｌｌ’、２４時間）に
よシ調製′された酸加水分解物から決定された。酸素を
除くため封管に先だって管を真空にする。６Ｎ塩酸の蒸
発による除去およびクエン酸緩衝液中での再構成に続い
て、加水分解物をＢｅｃｌａｎａｎ ６３００型自動ア
ミノ酸分析機で分析する。
が再蒸留した６Ｎ塩酸（１１０ｔｌｌ’、２４時間）に
よシ調製′された酸加水分解物から決定された。酸素を
除くため封管に先だって管を真空にする。６Ｎ塩酸の蒸
発による除去およびクエン酸緩衝液中での再構成に続い
て、加水分解物をＢｅｃｌａｎａｎ ６３００型自動ア
ミノ酸分析機で分析する。
Ｂｅｎ５ｏｎ、 Ｊ、 Ｒｏらにヨｉ）″”−Ｆニー１
ｆ トＶ）７ ミ／酸分析”はブチド二分析９合成、生
物学（Ｅ、 ＧｒｏｓｓおよびＪ、 Ｍｅｉｅｎｈｏｆ
ｅｒ編集） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ。
ｆ トＶ）７ ミ／酸分析”はブチド二分析９合成、生
物学（Ｅ、 ＧｒｏｓｓおよびＪ、 Ｍｅｉｅｎｈｏｆ
ｅｒ編集） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ。
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 ４巻、ｐｐ、２１７−２６０（１
９８１）に記載されている標準的操作方法を使用した。
９８１）に記載されている標準的操作方法を使用した。
でてくる定量的なデータは普通のＰＡＧＥによシ推定さ
れた分子量に基づいてタンパク質モル当シの残基数に変
換された。
れた分子量に基づいてタンパク質モル当シの残基数に変
換された。
表２はヒトＰ３、ブタＰ３および子ウシＰ３タンパク質
で得られたアミノ酸組成のデータを表わしている。その
データはＢｅｃｋｍａｎ ６３００型アミノ酸分析機で
のタンパク質当シロ回の実験（各々２つの独立した精製
調製試料を３回分析した）から得られた平均値で表わし
である。以下の理由でアミノ酸組成の決定には誤差が導
入され易い事を注意すべきである：（１）異ったアミノ
酸残基の安定性および／または加水分解され易さの変動
のためある種のアミノ酸収率が変化するタンパク質加水
分解の程度、（１１）少ない不純物の抽出量が１つの調
製試料と他のもので異る （ｉｉｉ） 異ったアミノ酸
の位置に対応するピーク面積から誘導されるコンピユー
タ化されたデータ分析および（ＩＶ） ５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅまたはカラムクロマトグラフィーのごとき普通の技術
によるタンパク質の正確な分子量の推定に伴う誤差。
で得られたアミノ酸組成のデータを表わしている。その
データはＢｅｃｋｍａｎ ６３００型アミノ酸分析機で
のタンパク質当シロ回の実験（各々２つの独立した精製
調製試料を３回分析した）から得られた平均値で表わし
である。以下の理由でアミノ酸組成の決定には誤差が導
入され易い事を注意すべきである：（１）異ったアミノ
酸残基の安定性および／または加水分解され易さの変動
のためある種のアミノ酸収率が変化するタンパク質加水
分解の程度、（１１）少ない不純物の抽出量が１つの調
製試料と他のもので異る （ｉｉｉ） 異ったアミノ酸
の位置に対応するピーク面積から誘導されるコンピユー
タ化されたデータ分析および（ＩＶ） ５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅまたはカラムクロマトグラフィーのごとき普通の技術
によるタンパク質の正確な分子量の推定に伴う誤差。
数字は、分子量がポリアクリルアミドゲル電気泳動のご
とき通常用いられる独立した方法によシ推定された各々
のタン・ξり質のモル当シの指示されたアミノ酸の残基
の近似的ガ数字（最も近い整数）を表わしている。本発
明のＰ３タンパク質の数字はアミノ酸組成分析の分野に
固有の実験誤差内である。かっこ内の値は特定の波長の
吸収に基づいて決定した。
とき通常用いられる独立した方法によシ推定された各々
のタン・ξり質のモル当シの指示されたアミノ酸の残基
の近似的ガ数字（最も近い整数）を表わしている。本発
明のＰ３タンパク質の数字はアミノ酸組成分析の分野に
固有の実験誤差内である。かっこ内の値は特定の波長の
吸収に基づいて決定した。
アミノ酸組成データは各々のＰ３タンパク質の分子光シ
の各々のアミノ酸の残基の推定数を示している。この分
野に精通ずる者は理解しているごとく、アミノ酸組成デ
ータは試験した実験回数およびタンパク質の精製の程度
に依存する。アミノ酸組成データはヒト、ブタおよび子
ウシＰ３タンパク質の組成が互いに似ている事を示して
おシ、例えば、各々はチロシン残基のかなシの数回様に
高いアスパラギン酸（＋アスパラギン）およびグルタミ
ン酸（＋グルタミン）残基含量を持っている。
の各々のアミノ酸の残基の推定数を示している。この分
野に精通ずる者は理解しているごとく、アミノ酸組成デ
ータは試験した実験回数およびタンパク質の精製の程度
に依存する。アミノ酸組成データはヒト、ブタおよび子
ウシＰ３タンパク質の組成が互いに似ている事を示して
おシ、例えば、各々はチロシン残基のかなシの数回様に
高いアスパラギン酸（＋アスパラギン）およびグルタミ
ン酸（＋グルタミン）残基含量を持っている。
表３にはこの分野において以前に記載されている数種の
タンパク質のアミノ酸組成が含まれている。即ちＵｒｉ
ｓｔ、 Ｍ、Ｒｏらによｐ ５ｃｉｅｎｃｅ、 ２２０
巻、ｐｐ ６８０−６８６（１９８３）に記載された１
７，０００から１８，０００ダルトンの子ウシ骨からの
骨形態発生タンパク質、表３の゛子つシ１”参照； Ｕ
ｒｉｓｔ。
タンパク質のアミノ酸組成が含まれている。即ちＵｒｉ
ｓｔ、 Ｍ、Ｒｏらによｐ ５ｃｉｅｎｃｅ、 ２２０
巻、ｐｐ ６８０−６８６（１９８３）に記載された１
７，０００から１８，０００ダルトンの子ウシ骨からの
骨形態発生タンパク質、表３の゛子つシ１”参照； Ｕ
ｒｉｓｔ。
Ｍ、 Ｒ，らによりＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔ
ｈｅ ５ｏｃｉｅｔｙ ｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、 １７
３巻。
ｈｅ ５ｏｃｉｅｔｙ ｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、 １７
３巻。
ｐｐ １９４−１９９（１９８３） に記載されている
ヒト骨からの１７，０００から１８，０００ダルトンの
骨形態発生タンパク質、表３の ヒト 参照。
ヒト骨からの１７，０００から１８，０００ダルトンの
骨形態発生タンパク質、表３の ヒト 参照。
Ｃｏｎｏｖｅｒ、 Ｍ、 Ａ、およびＵｒｉｓｔ、 Ｍ
、 Ｒ７によシ″鉱物質化結合組織の化学および生物学
″’ＥｌｓｅｖｉｅｒＮｏｒｔｈ Ｈｏ１ｌａｎｄ、Ｉ
ｎｃ、 、ｐｐ ５９７−６０６ （１９８１）に記載
されているウサギ象牙質からの２３，０００ダルトン骨
形態発生タンパク質、表３の６ウサギ３”参照； Ｕｒ
ｉｓｔ、 Ｍ、 Ｒ，らによｌ） Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
ｌ、 Ａｃａｄ−８ｃｉ、 ＵＳＡ、 ８１巻、ｐｐ
３７１−３７５（１９８４年１月）に記載されている１
８，５００ダルトンの分子量を持ち骨形成活性を持つ
といわれているウシ骨由来タンパク質、表３の１ウシ骨
１８．５にタン・ぞり質４”参照；およびＵｒｉｓｔ、
Ｍ、 Ｒ，らにより５ｃｉｅｎｃｅ。
、 Ｒ７によシ″鉱物質化結合組織の化学および生物学
″’ＥｌｓｅｖｉｅｒＮｏｒｔｈ Ｈｏ１ｌａｎｄ、Ｉ
ｎｃ、 、ｐｐ ５９７−６０６ （１９８１）に記載
されているウサギ象牙質からの２３，０００ダルトン骨
形態発生タンパク質、表３の６ウサギ３”参照； Ｕｒ
ｉｓｔ、 Ｍ、 Ｒ，らによｌ） Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
ｌ、 Ａｃａｄ−８ｃｉ、 ＵＳＡ、 ８１巻、ｐｐ
３７１−３７５（１９８４年１月）に記載されている１
８，５００ダルトンの分子量を持ち骨形成活性を持つ
といわれているウシ骨由来タンパク質、表３の１ウシ骨
１８．５にタン・ぞり質４”参照；およびＵｒｉｓｔ、
Ｍ、 Ｒ，らにより５ｃｉｅｎｃｅ。
２２０巻、 ｐＩＯ６８０−６８６（１９８３）に記載
された２ ４．０００ダルトンの分子量を持ち骨形成を
誘導しない子ウシ骨由来タンパク質、表３０″子ウシ骨
２４にタンパク質 参照 Ｓｅｒ １９ １４ ２５ １７ ２０Ｐｒｏ １２
７ ９ １０ １３ Ｇｌｙ １５ ４３ １７ １６ ２０Ａｌａ １１１
２ ９ １１ １６ Ｍａｌ ９ ８ ４ ９ １０ Ｍｅｔ ３ ２ １ ２ ４ １１ｅ ８ ６ ４ ４ ８ Ｌｅｕ １２１２ ７ １１ １４ 表３（続き） Ｔｙｒ ７ ５ ５ ６ １２ Ｐｈｅ ８ ５ ５ ６ １１ Ｈｉｓ ３ ３ ３ ３ ８ Ｌｙｓ ７７１０ ６ ６ Ａｒｇ ８ １２ ８ １２ ６ Ｃｙｓ（１／２） ３ ４ １ ５ ０Ｔｒｐ Ｎ、Ｄ
、Ｎ、Ｄ、Ｎ、Ｄ、 Ｎ、Ｄ、 Ｎ、Ｄ。
された２ ４．０００ダルトンの分子量を持ち骨形成を
誘導しない子ウシ骨由来タンパク質、表３０″子ウシ骨
２４にタンパク質 参照 Ｓｅｒ １９ １４ ２５ １７ ２０Ｐｒｏ １２
７ ９ １０ １３ Ｇｌｙ １５ ４３ １７ １６ ２０Ａｌａ １１１
２ ９ １１ １６ Ｍａｌ ９ ８ ４ ９ １０ Ｍｅｔ ３ ２ １ ２ ４ １１ｅ ８ ６ ４ ４ ８ Ｌｅｕ １２１２ ７ １１ １４ 表３（続き） Ｔｙｒ ７ ５ ５ ６ １２ Ｐｈｅ ８ ５ ５ ６ １１ Ｈｉｓ ３ ３ ３ ３ ８ Ｌｙｓ ７７１０ ６ ６ Ａｒｇ ８ １２ ８ １２ ６ Ｃｙｓ（１／２） ３ ４ １ ５ ０Ｔｒｐ Ｎ、Ｄ
、Ｎ、Ｄ、Ｎ、Ｄ、 Ｎ、Ｄ、 Ｎ、Ｄ。
※表中の数字は分子量がポリアクリルアミドゲル電気泳
動のごとき通常用いられる独立した方法によシ推定され
た各々のタンパク質のモル当シの指示されたアミノ酸の
残基の近似的な数字（最も近い整数）を表わしている。
動のごとき通常用いられる独立した方法によシ推定され
た各々のタンパク質のモル当シの指示されたアミノ酸の
残基の近似的な数字（最も近い整数）を表わしている。
Ｎ、 Ｄ、は指示されたアミノ酸の決定が行われなかっ
た事を示す。
た事を示す。
１−子ウシ骨からの１７，０００から１８，０００ダル
トン骨形態発生タンパク質。
トン骨形態発生タンパク質。
２−ヒト骨からの１７，０００から１８，０００ダルト
ン骨形態発生タンパク質。
ン骨形態発生タンパク質。
３−ウサギ象牙質からの２３，０００ダルトン骨形態発
生タンパク質。
生タンパク質。
４−ウシ骨からの１８，５００ダルトン骨形態発生タン
パク質。
パク質。
５−子ウシ骨からの骨形成を誘導しない２４，０００ダ
ルトンタンパク質。
ルトンタンパク質。
本明細書に記載したアミノ酸組成物のデータは骨形成に
含まれていると特許請求され、従来この分野で記載され
た他の全ての生物学的に活性なタンパク質とＰ３族の骨
形成因子が異なることを示している。
含まれていると特許請求され、従来この分野で記載され
た他の全ての生物学的に活性なタンパク質とＰ３族の骨
形成因子が異なることを示している。
タンパク質分子をよシ小さなポリペプチド断片に消化す
る酵素であるプロテアーゼはイゾチド結合をある程度特
異的に開裂する。例えば、酵素トリプシンはアルギニン
およびリジン残基のうしろではゾチド結合を開裂するの
に対して、スタフイからのｖ８プロテアーゼはアスパラ
ギン酸およびグルタミン酸残基のうしろではブチド結合
を開裂する。従って、もし２つのタンノξり質がそのア
ミノ酸配列が類似している場合、それぞれのタンパク質
を同一のプロテアーゼで消化すると、一方のタンノ々り
質から生じた断片は他方のタンパク質中に相同の類似物
を有する。Ｐ３タンパク質のタンパク分解開裂様式をス
タフィロコッカス、アウレウス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ）からのｖ８プロテアーゼを
用いて研究した。
る酵素であるプロテアーゼはイゾチド結合をある程度特
異的に開裂する。例えば、酵素トリプシンはアルギニン
およびリジン残基のうしろではゾチド結合を開裂するの
に対して、スタフイからのｖ８プロテアーゼはアスパラ
ギン酸およびグルタミン酸残基のうしろではブチド結合
を開裂する。従って、もし２つのタンノξり質がそのア
ミノ酸配列が類似している場合、それぞれのタンパク質
を同一のプロテアーゼで消化すると、一方のタンノ々り
質から生じた断片は他方のタンパク質中に相同の類似物
を有する。Ｐ３タンパク質のタンパク分解開裂様式をス
タフィロコッカス、アウレウス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ）からのｖ８プロテアーゼを
用いて研究した。
第１の実験では、ブタＰ３および子ウシＰ３タンパク質
をスタフィロコッカス・アウＬ／ウス（Ｓｔ、ａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ） Ｖ ８プロテア
ーゼで同時に処理し、ジスルフィド結合で一緒に保持さ
れている断片を離すため、消化生成物に強力な還元処理
を行なった。生じたイブチド断片をシンクロパンク０８
カラムの逆相ＨＰＬＣにかけた。はブチド断片を０．１
％トリフルオロ酢酸水溶液中ア七トニトリルの容積で２
０％から７０％の直線状勾配を用い溶離した。イブチド
の溶１４Ｆ！、は２２９ ｎｍで溶出液の吸収を測定す
ることによシ検出した。
をスタフィロコッカス・アウＬ／ウス（Ｓｔ、ａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ） Ｖ ８プロテア
ーゼで同時に処理し、ジスルフィド結合で一緒に保持さ
れている断片を離すため、消化生成物に強力な還元処理
を行なった。生じたイブチド断片をシンクロパンク０８
カラムの逆相ＨＰＬＣにかけた。はブチド断片を０．１
％トリフルオロ酢酸水溶液中ア七トニトリルの容積で２
０％から７０％の直線状勾配を用い溶離した。イブチド
の溶１４Ｆ！、は２２９ ｎｍで溶出液の吸収を測定す
ることによシ検出した。
シンクロパンク０８カラムによるｖ８プロテアーゼ消化
および還元ブタＰ３タン／ξり質の逆相ＨＰＬＣ溶出プ
ロフィールを図５Ａに示す；そして同様に処理したウシ
Ｐ３タンノξり質の溶出プロフィールを第５Ｂ図に表す
。
および還元ブタＰ３タン／ξり質の逆相ＨＰＬＣ溶出プ
ロフィールを図５Ａに示す；そして同様に処理したウシ
Ｐ３タンノξり質の溶出プロフィールを第５Ｂ図に表す
。
第２の実験では、ブタＰ３およびヒトＰ３タンパク質を
まず還元剤で処理し、遊離のスルフヒト９リル基を技術
的に良く知られた技法を用いてＳ−カルボキシメチル化
によル化学的に誘導した。そのＳ−カルボキシメチル化
タンパク質調製物をそれぞれスタフィロコッカス・アウ
レウス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ
） Ｖ ８プロテアーゼで消化した。ｖ８プロテアー
ゼによる消化で生じたはプチビ断片をワットマンＣＩ８
カラムの逆相ＨＰＬＣにかけた。はブチドを０．１％Ｔ
ＦＡ水溶液中容積で２０チから７０％のア七ト二トリル
の直線状勾配を用いて溶離した。Ｒブチドの溶離は２２
９ ｎｍで溶出液の吸収を測定することによシ検出した
。ワットマンＣＩ８カラムによるＳ−カルボキシメチル
化およびｖ８プロテアーゼ消化ブタＰ３タン／ξり質の
逆相ＨＰＬＣ溶出プロフィールを第６Ａ図に示し、同様
に処理したヒ）Ｐ３タンパク質の溶出プロフィールを第
６Ｂ図に示す。
まず還元剤で処理し、遊離のスルフヒト９リル基を技術
的に良く知られた技法を用いてＳ−カルボキシメチル化
によル化学的に誘導した。そのＳ−カルボキシメチル化
タンパク質調製物をそれぞれスタフィロコッカス・アウ
レウス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ
） Ｖ ８プロテアーゼで消化した。ｖ８プロテアー
ゼによる消化で生じたはプチビ断片をワットマンＣＩ８
カラムの逆相ＨＰＬＣにかけた。はブチドを０．１％Ｔ
ＦＡ水溶液中容積で２０チから７０％のア七ト二トリル
の直線状勾配を用いて溶離した。Ｒブチドの溶離は２２
９ ｎｍで溶出液の吸収を測定することによシ検出した
。ワットマンＣＩ８カラムによるＳ−カルボキシメチル
化およびｖ８プロテアーゼ消化ブタＰ３タン／ξり質の
逆相ＨＰＬＣ溶出プロフィールを第６Ａ図に示し、同様
に処理したヒ）Ｐ３タンパク質の溶出プロフィールを第
６Ｂ図に示す。
追加のアミノ酸配列情報
２つまたはそれ以上のタンパク質の間の相関を確める試
験はタンパク質のアミノ酸配列を検査することによシ得
られる。子ウシ、ブタおよびヒト骨から得られたＰ３タ
ンパク質の種々の部位のアミノ酸配列を比較した。アミ
ノ酸配列資料はＰ３タンパク質そのまま、またはそれか
ら得られたはブチド断片に気相微量配列法のような従来
の手順を用いて得られた。ヒトおよびブタ骨からのその
ままのＰ３タンパク質がいかなるアミノ酸配列情報も得
られなかった。これは各タンパク質調製品のアミノ末端
アミノ酸残基がふさがれていることを示しているらしい
。しかし、子ウシＰ３タンパク質の７ミノ末端アミノ酸
配列を決定するために分析する場合にはアミノ酸配列情
報を得ることができた（本明細書に前述した子ウシＰ３
タンパク質のアミノ末端アミノ酸配列参照）。タンパク
質化学の技術で知られているように、アミン末端アミノ
酸残基をふさぐ修飾は生理学的すなわち組織中でタンパ
ク質の生合成の間に起こるかまたは時には精製過程の間
に起こシうる。更にアミノ酸配列情報を得るため、本明
細書で前述したそれぞれのＰ３タンパク質をスタフィロ
コッカス・アウレウス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ ）のＶ８プロテアーゼで消化して得ら
れた種々のイブチド断片を単離し、配列を決めた。単離
したイプチトゞに関するアミノ酸配列の資料を表４に集
約した。表４に表わした情報は子ウシ、ヒトおよびブタ
Ｐ３タンパク質からの相同のにブチド断片が実質的に同
一のアミノ酸配列を有することを示している。これは哺
乳動物の骨形成因子（種々の哺乳動物の骨から得られた
Ｐ３タンパク質）が関連のあるタンパク質であることを
示している。
験はタンパク質のアミノ酸配列を検査することによシ得
られる。子ウシ、ブタおよびヒト骨から得られたＰ３タ
ンパク質の種々の部位のアミノ酸配列を比較した。アミ
ノ酸配列資料はＰ３タンパク質そのまま、またはそれか
ら得られたはブチド断片に気相微量配列法のような従来
の手順を用いて得られた。ヒトおよびブタ骨からのその
ままのＰ３タンパク質がいかなるアミノ酸配列情報も得
られなかった。これは各タンパク質調製品のアミノ末端
アミノ酸残基がふさがれていることを示しているらしい
。しかし、子ウシＰ３タンパク質の７ミノ末端アミノ酸
配列を決定するために分析する場合にはアミノ酸配列情
報を得ることができた（本明細書に前述した子ウシＰ３
タンパク質のアミノ末端アミノ酸配列参照）。タンパク
質化学の技術で知られているように、アミン末端アミノ
酸残基をふさぐ修飾は生理学的すなわち組織中でタンパ
ク質の生合成の間に起こるかまたは時には精製過程の間
に起こシうる。更にアミノ酸配列情報を得るため、本明
細書で前述したそれぞれのＰ３タンパク質をスタフィロ
コッカス・アウレウス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ ）のＶ８プロテアーゼで消化して得ら
れた種々のイブチド断片を単離し、配列を決めた。単離
したイプチトゞに関するアミノ酸配列の資料を表４に集
約した。表４に表わした情報は子ウシ、ヒトおよびブタ
Ｐ３タンパク質からの相同のにブチド断片が実質的に同
一のアミノ酸配列を有することを示している。これは哺
乳動物の骨形成因子（種々の哺乳動物の骨から得られた
Ｐ３タンパク質）が関連のあるタンパク質であることを
示している。
Ｐ３タンパク質の免疫学的関連の証明
それぞれのＰ３タンパク質に結合できる単一特異抗体を
産生ずる目的で、沖々の哺乳動物種の骨から得られたＰ
３タンパク質でウサギのような実験動物を免疫する。
産生ずる目的で、沖々の哺乳動物種の骨から得られたＰ
３タンパク質でウサギのような実験動物を免疫する。
代表的な実験では、抗体を増加させるＰ３タンノぐり質
約１００７１１ｉｉｉ’をフロイントの完成補助薬と混
合し、ウサギの内靴の皮下に接種する。１０〜１４日後
、不完全７０インドの補助薬と混合した等量のタンパク
質を皮下に接種する。更に１０〜１４日後そのウサギに
水酸化アルミニウムの１０チ溶液に混合した５０〜１０
０ｐ＆のタンパク質を更に接種する。次いで４週間の間
隔で５０〜１００μｇのタンパク質でウサギを免疫する
。
約１００７１１ｉｉｉ’をフロイントの完成補助薬と混
合し、ウサギの内靴の皮下に接種する。１０〜１４日後
、不完全７０インドの補助薬と混合した等量のタンパク
質を皮下に接種する。更に１０〜１４日後そのウサギに
水酸化アルミニウムの１０チ溶液に混合した５０〜１０
０ｐ＆のタンパク質を更に接種する。次いで４週間の間
隔で５０〜１００μｇのタンパク質でウサギを免疫する
。
それぞれのＰ３タンパク質に対して発達した特異抗体の
力価を（ａ） 酵素結合免疫吸着剤による分析（ＥＬ工
ＳＡ）および（ｂ） 放射標識したＰ３３タンパク質子
を免疫沈降する抗体の能力によって測定する。代表的な
ＥＩ、ＩＳＡ分析では、試験する抗原（すなわち試験す
る特定のＰ３クン・ξり質）１０〜２０ ｎｇを微小力
価用皿（ファルコン製またはベルコ製）の穴の中にタン
パク質溶液を入れ風乾することによシブラスチック表面
に結合させる。試験抗血清の連続希釈物を穴の中で培養
し、非結合抗体を洗浄して除去し、次いで結合した抗体
を試験抗血清を生成した種の免疫グロブリンに対する第
２抗体調製品と結合した酵素と培養する。
力価を（ａ） 酵素結合免疫吸着剤による分析（ＥＬ工
ＳＡ）および（ｂ） 放射標識したＰ３３タンパク質子
を免疫沈降する抗体の能力によって測定する。代表的な
ＥＩ、ＩＳＡ分析では、試験する抗原（すなわち試験す
る特定のＰ３クン・ξり質）１０〜２０ ｎｇを微小力
価用皿（ファルコン製またはベルコ製）の穴の中にタン
パク質溶液を入れ風乾することによシブラスチック表面
に結合させる。試験抗血清の連続希釈物を穴の中で培養
し、非結合抗体を洗浄して除去し、次いで結合した抗体
を試験抗血清を生成した種の免疫グロブリンに対する第
２抗体調製品と結合した酵素と培養する。
次いで各穴に結合した酵素の量を適当な比色分析で定量
する。この試験において、試験抗原に対して高い力価の
抗体の血清は数千倍に希釈でき、それでも相当の発色を
示す。
する。この試験において、試験抗原に対して高い力価の
抗体の血清は数千倍に希釈でき、それでも相当の発色を
示す。
他の分析法、すなわち放射性免疫沈降分析法（ＲＩＰ）
、では、試験抗原を１２５■のような放射性同位元素
で標識する。次いで一定量の放射標識した抗原を試験抗
血清の連続希釈物と培養する。
、では、試験抗原を１２５■のような放射性同位元素
で標識する。次いで一定量の放射標識した抗原を試験抗
血清の連続希釈物と培養する。
試験漉清を生成した種の免疫グロブリンに対する第２抗
体または一定のスタフィロコッカス・アウレウス（５ｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ）細菌懸濁
液またはビーズ上に固定したスタフィロコッカス・アウ
レウス（５ｔａｌ）１１ｙ］、０ＣＯＣＣｕＳ ａｕｒ
ｅｕｓ ’）タン、ｏり質Ａを用いて免疫複合抗原を沈
降させる。前述したＥＬＩＳＡ操作と同様に高力価の特
異抗体の血清は数千倍に希釈でき、それでも相当量の放
射標識した抗原を沈降させる。
体または一定のスタフィロコッカス・アウレウス（５ｔ
ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ）細菌懸濁
液またはビーズ上に固定したスタフィロコッカス・アウ
レウス（５ｔａｌ）１１ｙ］、０ＣＯＣＣｕＳ ａｕｒ
ｅｕｓ ’）タン、ｏり質Ａを用いて免疫複合抗原を沈
降させる。前述したＥＬＩＳＡ操作と同様に高力価の特
異抗体の血清は数千倍に希釈でき、それでも相当量の放
射標識した抗原を沈降させる。
いずれの定量法でも、試験血清試料中の抗体の特異的な
力価は免疫になっていない動物または試験タンパク質と
関連のないタンパク質で免疫になった動物からの血清で
得られた値（呈色または沈降した放射活性）を差引くこ
とによシ決定する。
力価は免疫になっていない動物または試験タンパク質と
関連のないタンパク質で免疫になった動物からの血清で
得られた値（呈色または沈降した放射活性）を差引くこ
とによシ決定する。
種々のタンパク質の免疫学的関係と同様に抗血清の特異
性は抗原の結合の程度への血清希釈の相対的効果を調べ
ることによシ、いずれかの分析法で判断することができ
る。
性は抗原の結合の程度への血清希釈の相対的効果を調べ
ることによシ、いずれかの分析法で判断することができ
る。
子ウシ、ブタおよびヒトの骨から得たＰ３タンパク質の
間の免疫学的関連を上述した分析法を用いて試験した。
間の免疫学的関連を上述した分析法を用いて試験した。
その結果を表５に表わす。
表５に示した結果はあるＰ３タンツク質に対する抗体が
他種のＰ３タンパク質と結合しうることを明らかに示し
ている。このことは、それぞれの哺乳類のＰ３骨形成因
子が他種のものと免疫学的に関連していることを示して
いる。３種の哺乳類から得たＰ３タンパク質（すなわち
、子ウシの骨から得たＰ３タンパク質、ヒトの骨から得
たＰ３タンパク質およびブタの骨から得たＰ３タンパク
質）の間の相関を更に拮抗ラジオイムノアッセイで試験
した。拮抗ラジオイムノアッセイは試験抗原に対して上
昇した特異抗体分子への放射標識した試験抗原の結合と
拮抗する非標識抗原分子の能力に基づく。タンパク質と
試験抗原の間の免疫学的相関の程度は非標識拮抗タンパ
ク質の量を増して培養混合物に添加した時抗体に結合す
る放射標識した試験抗原の置換の傾斜により決定する。
他種のＰ３タンパク質と結合しうることを明らかに示し
ている。このことは、それぞれの哺乳類のＰ３骨形成因
子が他種のものと免疫学的に関連していることを示して
いる。３種の哺乳類から得たＰ３タンパク質（すなわち
、子ウシの骨から得たＰ３タンパク質、ヒトの骨から得
たＰ３タンパク質およびブタの骨から得たＰ３タンパク
質）の間の相関を更に拮抗ラジオイムノアッセイで試験
した。拮抗ラジオイムノアッセイは試験抗原に対して上
昇した特異抗体分子への放射標識した試験抗原の結合と
拮抗する非標識抗原分子の能力に基づく。タンパク質と
試験抗原の間の免疫学的相関の程度は非標識拮抗タンパ
ク質の量を増して培養混合物に添加した時抗体に結合す
る放射標識した試験抗原の置換の傾斜により決定する。
拮抗ラジオイムノアッセイでは、子ウシＰ３タンパク質
に対して上昇した抗体との一結合からの放射標識した子
ウシＰ３タンパク質の置換において、ヒ）Ｐ３タンパク
質は子ウシＰ３タンパク質ｔなど、充分には拮抗しない
（第７Ａ図）。同様の分析で、ヒ）Ｐ３およびブタＰ３
タンパク質の両者はブタＰ３タンパク質に対して上昇し
た抗体への放射標識したブタＰ３タンパク質の結合と充
分に拮抗したが、子ウシＰ３タンパク質はよシ低い効率
で拮抗した（第７Ｂ図）。第３の分析では、ヒ）Ｐ３タ
ンパク質に対して上昇した抗体への結合からの放射標識
したヒ）Ｐ３タンパク質の置換にオイテブタＰ３タンパ
ク質は子ウシＰ３タンパク質よシ有効であった（第７Ｃ
図）。ツタＰ３タンパク質への抗体はヨウ素化したヒ）
Ｐ３タンパク質を免疫沈降させるので、そのＰ３タンパ
ク質を広い交差種分析における拮抗への能力で比較した
（第７Ｄ図）。子ウシＰ３タンパク質はこの分析で再び
最低の拮抗効率を示した。それぞれのＰ３タンパク質が
特定のＰ３タンパク質に対して上昇した特異抗体の結合
において相互に拮抗するという事実はそれぞれのＰ３タ
ンパク質が免疫学的に関連していることを示している。
に対して上昇した抗体との一結合からの放射標識した子
ウシＰ３タンパク質の置換において、ヒ）Ｐ３タンパク
質は子ウシＰ３タンパク質ｔなど、充分には拮抗しない
（第７Ａ図）。同様の分析で、ヒ）Ｐ３およびブタＰ３
タンパク質の両者はブタＰ３タンパク質に対して上昇し
た抗体への放射標識したブタＰ３タンパク質の結合と充
分に拮抗したが、子ウシＰ３タンパク質はよシ低い効率
で拮抗した（第７Ｂ図）。第３の分析では、ヒ）Ｐ３タ
ンパク質に対して上昇した抗体への結合からの放射標識
したヒ）Ｐ３タンパク質の置換にオイテブタＰ３タンパ
ク質は子ウシＰ３タンパク質よシ有効であった（第７Ｃ
図）。ツタＰ３タンパク質への抗体はヨウ素化したヒ）
Ｐ３タンパク質を免疫沈降させるので、そのＰ３タンパ
ク質を広い交差種分析における拮抗への能力で比較した
（第７Ｄ図）。子ウシＰ３タンパク質はこの分析で再び
最低の拮抗効率を示した。それぞれのＰ３タンパク質が
特定のＰ３タンパク質に対して上昇した特異抗体の結合
において相互に拮抗するという事実はそれぞれのＰ３タ
ンパク質が免疫学的に関連していることを示している。
種々の哺乳類の骨から得た非Ｐ３タンツク質を含んだ非
関連抗原が特定のＰ３クン・ξり質に対して上昇した特
異抗体との結合においてＰ３タンパク質と拮抗しないと
いう他の拮抗ラジオイムノアッセイの結果もこの結論を
支持している。第７Ａ、２Ｂ、７Ｃおよび７Ｄ図で、「
ウシ」はウシＰ３タンパク質に関する曲線と一致し、「
ヒト」はヒ）Ｐ３タンパク質に関する曲線と一致し、「
ブタ」はブタＰ３タンパク質に関する曲線と一致する。
関連抗原が特定のＰ３クン・ξり質に対して上昇した特
異抗体との結合においてＰ３タンパク質と拮抗しないと
いう他の拮抗ラジオイムノアッセイの結果もこの結論を
支持している。第７Ａ、２Ｂ、７Ｃおよび７Ｄ図で、「
ウシ」はウシＰ３タンパク質に関する曲線と一致し、「
ヒト」はヒ）Ｐ３タンパク質に関する曲線と一致し、「
ブタ」はブタＰ３タンパク質に関する曲線と一致する。
Ｐ３３タンパク質の免疫学的相関をイムノブロッティン
グ法を用いて他種のＰ３タンパク質の１変性」または「
変性および還元」型と結合するだめの特定のＰ３タンパ
ク質に対する抗体の能力でも試験した。イムノブロッテ
ィングの操作では、タンパク質を還元剤の存在または不
在下ドデシル硫酸ナトリウム中で加熱して変性させる。
グ法を用いて他種のＰ３タンパク質の１変性」または「
変性および還元」型と結合するだめの特定のＰ３タンパ
ク質に対する抗体の能力でも試験した。イムノブロッテ
ィングの操作では、タンパク質を還元剤の存在または不
在下ドデシル硫酸ナトリウム中で加熱して変性させる。
次いで変性まだは変性還元タンパク質をドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）存在下、変性ポリアクリ
ルアミピゲル電気泳動にかける。次いでタンパク質分子
をニトロセルロースメンブランフィルタ−に移す。電気
泳動で分離したタン・ξり質のバンドのレプリカをそれ
ぞれのタンパク質に対する抗体と培養する。タンパク質
の、＜ンドへの抗体の結合は放射標識または酵素結合の
スタフィロコッカス７’７レウス（Ｓｔ鼾披」堅狸退Ｂ
蝦乃朋）からのタンパク質Ａがニトロセルロースメンプ
ラン上のタンパク質に付着した抗体と結合する能力で測
定する。次いで抗体により認識されたタンパク質のバン
ト９の位置をオートラジオグラフィーによシ視覚化する
。この技法によシ特異抗体調製によシ認められた分子種
を同定する。
トリウム（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）存在下、変性ポリアクリ
ルアミピゲル電気泳動にかける。次いでタンパク質分子
をニトロセルロースメンブランフィルタ−に移す。電気
泳動で分離したタン・ξり質のバンドのレプリカをそれ
ぞれのタンパク質に対する抗体と培養する。タンパク質
の、＜ンドへの抗体の結合は放射標識または酵素結合の
スタフィロコッカス７’７レウス（Ｓｔ鼾披」堅狸退Ｂ
蝦乃朋）からのタンパク質Ａがニトロセルロースメンプ
ラン上のタンパク質に付着した抗体と結合する能力で測
定する。次いで抗体により認識されたタンパク質のバン
ト９の位置をオートラジオグラフィーによシ視覚化する
。この技法によシ特異抗体調製によシ認められた分子種
を同定する。
子ウシＰ３タンパク質を多数の非関連タンパク質と混合
し、ト５デシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲ
ルで電気泳動し、次いで子ウシＰ３タンパク質に対して
上昇したウサギの抗体を用いたイムノブロッティングで
分析すると、唯一のノ；ンド（ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの移
動で決定されたように約２３，０００ダルトンの分子量
を示す位置に移動する）がオートラジオグラフィーで見
えるようになった。
し、ト５デシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲ
ルで電気泳動し、次いで子ウシＰ３タンパク質に対して
上昇したウサギの抗体を用いたイムノブロッティングで
分析すると、唯一のノ；ンド（ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの移
動で決定されたように約２３，０００ダルトンの分子量
を示す位置に移動する）がオートラジオグラフィーで見
えるようになった。
子ウシ、ブタおよびヒトＰ３タンノξり質問の免疫学的
相関をイムノブロッティング法でも調べた。
相関をイムノブロッティング法でも調べた。
子ウシ、ブタおよびヒトの骨から得たＰ３タンノξり質
に結合した子ウシＰ３タンパク質またはブタＰ３タンパ
ク質に対して抗体が上昇した。更に、ある種のＰ３タン
パク質の多数の断片（タンパク分解消化によシ生成）が
他種のＰ３タンパク質に対して上昇した抗体によシ認め
られた。これらの結果はそれぞれのＰ３タンパク質の間
に免疫学的に検出しうる領域が維持されていることを示
しておシ、このことはアミノ酸配列データによっても支
持されている。
に結合した子ウシＰ３タンパク質またはブタＰ３タンパ
ク質に対して抗体が上昇した。更に、ある種のＰ３タン
パク質の多数の断片（タンパク分解消化によシ生成）が
他種のＰ３タンパク質に対して上昇した抗体によシ認め
られた。これらの結果はそれぞれのＰ３タンパク質の間
に免疫学的に検出しうる領域が維持されていることを示
しておシ、このことはアミノ酸配列データによっても支
持されている。
Ｐ３タンパク質に関連した他のプロテアーゼ様物質の同
定哺乳類の組織の成長／再生を誘発するタンパク質因子
は標的位置以外の位置でもしばしば生合成される。加え
て、これらの因子の生合成は試験管内または試験管外で
生物学的活性種に変わシうる、より大きいまたは修飾さ
れた型を通過しうる。哺乳動物では、生物活性はブチド
の産生け、しばしば多数の中間体を通過する、たとえば
、プレプロ−クンバク質またはブロータンパク質は種々
の程度の生物活性または生物不活性を有する。
定哺乳類の組織の成長／再生を誘発するタンパク質因子
は標的位置以外の位置でもしばしば生合成される。加え
て、これらの因子の生合成は試験管内または試験管外で
生物学的活性種に変わシうる、より大きいまたは修飾さ
れた型を通過しうる。哺乳動物では、生物活性はブチド
の産生け、しばしば多数の中間体を通過する、たとえば
、プレプロ−クンバク質またはブロータンパク質は種々
の程度の生物活性または生物不活性を有する。
哺乳動物骨形成因子のＰ３タンパク質族の同定はこの分
野に精通する者が（典型的には免疫学的手段によシ）培
養細胞および他の組織中の他の関連分子の存在を検出す
ることを可能にする。
野に精通する者が（典型的には免疫学的手段によシ）培
養細胞および他の組織中の他の関連分子の存在を検出す
ることを可能にする。
骨形成活性を有しうる他のプロテアーゼ様物質を同定す
るだめの便利な方法は本明細書で前述したイムノブロッ
ティング法を使用する；しかしラジオイムノアッセイ分
析の使用のような他の技法も利用できる。代表的な実験
では、候補の組織または培養細胞を還元剤の存在または
不在下、クアニジン塩酸塩、グアニジンインチオシアナ
ートまたはト９デシル硫酸ナトリウムのような強力な解
離剤で抽出する。次いで全抽出物または部分的に分別し
た抽出物を５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、その電気泳動で分
離したタンパク種をニトロセルロースメンブランフィル
タ−上に移す。Ｐ３タンパク質骨形成因子に関連ある分
子種の存在はＰ３タンパク質に対する抗体と結合する能
力によシ検出する。
るだめの便利な方法は本明細書で前述したイムノブロッ
ティング法を使用する；しかしラジオイムノアッセイ分
析の使用のような他の技法も利用できる。代表的な実験
では、候補の組織または培養細胞を還元剤の存在または
不在下、クアニジン塩酸塩、グアニジンインチオシアナ
ートまたはト９デシル硫酸ナトリウムのような強力な解
離剤で抽出する。次いで全抽出物または部分的に分別し
た抽出物を５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、その電気泳動で分
離したタンパク種をニトロセルロースメンブランフィル
タ−上に移す。Ｐ３タンパク質骨形成因子に関連ある分
子種の存在はＰ３タンパク質に対する抗体と結合する能
力によシ検出する。
ウシの脳の部分的に分別した抽出物を用いた実験では、
分子量が約４０，０００〜４５，０００ダルトンの免疫
学的技法連した物質がよシ分子量の大きい物質を含んだ
分画中の子ウシＰ３タンパク質に対して上昇した抗体を
用いて検出゛された。ウシの脳から抽出したよシ分子量
の小さいタン−ξり質を含んだ分画では、約１４，００
０〜２５，０００ダルトンの分子量を有する子ウシＰ３
タンパク質に免疫学的に関連のあるよシ分子量の小さい
物質の混合物が見い出された。
分子量が約４０，０００〜４５，０００ダルトンの免疫
学的技法連した物質がよシ分子量の大きい物質を含んだ
分画中の子ウシＰ３タンパク質に対して上昇した抗体を
用いて検出゛された。ウシの脳から抽出したよシ分子量
の小さいタン−ξり質を含んだ分画では、約１４，００
０〜２５，０００ダルトンの分子量を有する子ウシＰ３
タンパク質に免疫学的に関連のあるよシ分子量の小さい
物質の混合物が見い出された。
子ウシ歯髄組織で行なった同様の分析は子ウシＰ３タン
パク質に対して上昇した抗体と結合した分子量が２３，
０００〜２５，０００ダルトンの物質、１４．０００〜
１６，０００ダルトンのよシ小さな物質および４０，０
００〜４５，０００ダルトンの物質の存在を示した。同
様のタンパク質の存在が子ウシの気管、鼻および関節の
軟骨中や、ラットの骨腫瘍の組織および培養細胞中およ
び鉱物質除去した骨マトリックスの移殖による骨の発育
に誘発されるラット組織中でも検出されている。本明細
書に述べられた免疫学的技法によシ検出された骨形成活
性または活性になシうるタンパク質またはポリイブチド
および哺乳類骨組織からのＰ３タン・ぞり買置形成因子
に対して上昇した抗体によシ検出された他の哺乳類の組
織中に存在する他の骨形成活性または活性になシうるタ
ンノξり質またはイブチドが本発明の範囲内にあると考
えられる。
パク質に対して上昇した抗体と結合した分子量が２３，
０００〜２５，０００ダルトンの物質、１４．０００〜
１６，０００ダルトンのよシ小さな物質および４０，０
００〜４５，０００ダルトンの物質の存在を示した。同
様のタンパク質の存在が子ウシの気管、鼻および関節の
軟骨中や、ラットの骨腫瘍の組織および培養細胞中およ
び鉱物質除去した骨マトリックスの移殖による骨の発育
に誘発されるラット組織中でも検出されている。本明細
書に述べられた免疫学的技法によシ検出された骨形成活
性または活性になシうるタンパク質またはポリイブチド
および哺乳類骨組織からのＰ３タン・ぞり買置形成因子
に対して上昇した抗体によシ検出された他の哺乳類の組
織中に存在する他の骨形成活性または活性になシうるタ
ンノξり質またはイブチドが本発明の範囲内にあると考
えられる。
本質的に均質の状態で子ウシＰ３、ブタＰ３およびヒ）
Ｐ３タンパク質を本明細書で述べたバイオアッセイを使
った試験で示したようにしてラットに移殖すると、約３
週間で移植位置に骨の形成が誘発される。異なった哺乳
動物から精製されたＰ３タンパク質の仲間は一般的に呻
乳ｉ物に骨形成活性を有するらしい。仁のようにＰ３タ
ンパク質は主要な骨形成因子であると考えられる免疫学
的に関連のあるタンパク質の一族を表わす。
Ｐ３タンパク質を本明細書で述べたバイオアッセイを使
った試験で示したようにしてラットに移殖すると、約３
週間で移植位置に骨の形成が誘発される。異なった哺乳
動物から精製されたＰ３タンパク質の仲間は一般的に呻
乳ｉ物に骨形成活性を有するらしい。仁のようにＰ３タ
ンパク質は主要な骨形成因子であると考えられる免疫学
的に関連のあるタンパク質の一族を表わす。
骨銹発分析方法
試験タンパク質分画またはタンパク質の骨形成活性を決
定するため、次のような操作を利用できる。骨マトリッ
クス粉末（７５〜５００ミクロン大）は本明細書に記載
されたようにして鉱物質除去し、次いで鉱物質除去した
骨粉床１７ｇ当シ１５〜２０−の４ＭＧｕＨＣ６で３回
続けて抽出する。抽出したマトリックスを水、次いでエ
タノールとエーテルで洗浄し、次いで粉末を乾燥する。
定するため、次のような操作を利用できる。骨マトリッ
クス粉末（７５〜５００ミクロン大）は本明細書に記載
されたようにして鉱物質除去し、次いで鉱物質除去した
骨粉床１７ｇ当シ１５〜２０−の４ＭＧｕＨＣ６で３回
続けて抽出する。抽出したマトリックスを水、次いでエ
タノールとエーテルで洗浄し、次いで粉末を乾燥する。
ラットのような試験動物に移殖しても、この粉末は骨形
成を誘発しないので、不活性骨マトリックス（ＩＢＭ）
と呼ばれる。タンパク質調製試料の活性を測定するため
、ＩＢＭ粉末をタンパク質の水溶液または懸濁液と混合
し、水を凍結乾燥によシ除去する。
成を誘発しないので、不活性骨マトリックス（ＩＢＭ）
と呼ばれる。タンパク質調製試料の活性を測定するため
、ＩＢＭ粉末をタンパク質の水溶液または懸濁液と混合
し、水を凍結乾燥によシ除去する。
次いで再構成したマトリックスをゼラチンカプセルに詰
め込み、若令ラット（１〜２ケ月令）の大腿筋の近くに
皮下移殖する。種々のタンパク質調製品の効力を決定す
るため、タンパク質調製品の量を変えて一定量のＩＢＭ
と一緒にカプセルに用いる。移殖によシ誘発された骨形
成活性を次の２つの方法を用いて削シ取った移殖片（外
道片としても本明細書中で参照する）の検査によシ評価
する。２つの方法とは（ａ） 骨形成活性を決定するた
めに調製試料を移殖してから１７〜２０日後に削り取っ
た移殖部位に発達した組織中のアルカリ性ホスファター
ゼのレベルの測定および（ｂ）移殖部位に発達した組織
の５〜７ミクロンの厚さの切片を組織学的に検索し次い
でこの組織のパラフィン固定切片をトルイジンブルー（
軟骨マトリックスを染色）、ヘマトキシリン−エオシン
（線維質や軟骨および骨組織を分析）およびバンコッサ
（ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ ）銀染色（骨組織の石灰化した
マトリックス用）Ｋよ）染色するものである。
め込み、若令ラット（１〜２ケ月令）の大腿筋の近くに
皮下移殖する。種々のタンパク質調製品の効力を決定す
るため、タンパク質調製品の量を変えて一定量のＩＢＭ
と一緒にカプセルに用いる。移殖によシ誘発された骨形
成活性を次の２つの方法を用いて削シ取った移殖片（外
道片としても本明細書中で参照する）の検査によシ評価
する。２つの方法とは（ａ） 骨形成活性を決定するた
めに調製試料を移殖してから１７〜２０日後に削り取っ
た移殖部位に発達した組織中のアルカリ性ホスファター
ゼのレベルの測定および（ｂ）移殖部位に発達した組織
の５〜７ミクロンの厚さの切片を組織学的に検索し次い
でこの組織のパラフィン固定切片をトルイジンブルー（
軟骨マトリックスを染色）、ヘマトキシリン−エオシン
（線維質や軟骨および骨組織を分析）およびバンコッサ
（ｖｏｎ Ｋｏｓｓａ ）銀染色（骨組織の石灰化した
マトリックス用）Ｋよ）染色するものである。
活性骨形成がこの酵素の太きなうねシによって特異的に
進行し、骨の継続的な形成が移殖片のまわシの非骨線維
組織中に見い出されるものよシもアルカリ性ホス７アタ
ー゛ゼ活性のレベルが安定して高いのでアルカリ性ホス
ファターゼのしばルを測定する。タンパク質調製試料中
の骨訪発活性のレベルの近似的定量は外題組織の単位重
量当シのアルカリ性ホスファターゼのレベルを定量する
ことによシ得られる。実際問題としては、外題組織をト
リス−食塩水のような適切な緩衝液中で均質にし、非イ
オン性洗浄剤で解離させ、組織から切）離された可溶化
した酵素を遠心分離を用いて破片を除去することにより
得る。アルカリ性ホスファターゼは試験抽出物の希釈に
よシ触媒されるパラニトロフェニル７オス７アートのパ
ラニトロフェノールへの変化の測定および既知の酵素の
標準曲線からの計算によシ定量される。
進行し、骨の継続的な形成が移殖片のまわシの非骨線維
組織中に見い出されるものよシもアルカリ性ホス７アタ
ー゛ゼ活性のレベルが安定して高いのでアルカリ性ホス
ファターゼのしばルを測定する。タンパク質調製試料中
の骨訪発活性のレベルの近似的定量は外題組織の単位重
量当シのアルカリ性ホスファターゼのレベルを定量する
ことによシ得られる。実際問題としては、外題組織をト
リス−食塩水のような適切な緩衝液中で均質にし、非イ
オン性洗浄剤で解離させ、組織から切）離された可溶化
した酵素を遠心分離を用いて破片を除去することにより
得る。アルカリ性ホスファターゼは試験抽出物の希釈に
よシ触媒されるパラニトロフェニル７オス７アートのパ
ラニトロフェノールへの変化の測定および既知の酵素の
標準曲線からの計算によシ定量される。
生物学的分析の研究のため、部分的に精製されたタンパ
ク質プール（すなわち、本明細書で前記したアルファ、
ベータ、ガンマ■、ガンマ■およびテルタ）が本明細書
で前記したように子ウシ骨抽出物の七フアクリルＳ−２
００カラムクロマトグラフィーから得られた。これらの
それぞれのタンパク質プールをＩＢＭと再構成し、ラッ
ト大腿に皮下に移殖した。アルカリ性ホスファターゼ活
性の測定および移殖後１７〜２０日に取去った外殖片の
切片の組織学的検索はＰｌおよびＰ５ａ−Ｐ５ｂタンパ
ク質が骨誘発活性を有しないことを示した。
ク質プール（すなわち、本明細書で前記したアルファ、
ベータ、ガンマ■、ガンマ■およびテルタ）が本明細書
で前記したように子ウシ骨抽出物の七フアクリルＳ−２
００カラムクロマトグラフィーから得られた。これらの
それぞれのタンパク質プールをＩＢＭと再構成し、ラッ
ト大腿に皮下に移殖した。アルカリ性ホスファターゼ活
性の測定および移殖後１７〜２０日に取去った外殖片の
切片の組織学的検索はＰｌおよびＰ５ａ−Ｐ５ｂタンパ
ク質が骨誘発活性を有しないことを示した。
生物学的分析の研究はタンパク質プールのガンマＩおよ
びガンマ■に最大の骨形成の存在を示した。
びガンマ■に最大の骨形成の存在を示した。
ガンマ分画の３つの主要成分、すなわちＰ２．Ｐ３およ
びＰ４タンパク質を本明細書で前記された逆相ＨＰＬＣ
を用いて本質的に均質の状態に精製された。単一まだは
完全な混合物の精製タン・ξり質を不活性骨マトリック
スと再構成し、骨誘発分析を行なった。結果を表６に示
す。
びＰ４タンパク質を本明細書で前記された逆相ＨＰＬＣ
を用いて本質的に均質の状態に精製された。単一まだは
完全な混合物の精製タン・ξり質を不活性骨マトリック
スと再構成し、骨誘発分析を行なった。結果を表６に示
す。
表６
アルカリ性ホスファターゼ
（単位／ｇ） 組織学
ＩＢＭ”のみ 〈５ 線維組織
ＩＢＭ＋７５０μ、？Ｐ２タンパク質 〈５ 線維組織
ＩＢＭ＋７５０μ、９Ｐ３タンパク質 ７８ 新生骨Ｉ
ＢＭ＋１０００μ、９Ｐ４タンパク質 〈５ 線維組織
（微螢の軟骨） ＩＢＭ÷それぞれ２５０／４のＰ２． ６３ 新生骨Ｐ
３およびＰ４タンパク質 ※ ”ＩＢＭ”は不活性骨マトリックスを意味する。
ＩＢＭ＋７５０μ、９Ｐ３タンパク質 ７８ 新生骨Ｉ
ＢＭ＋１０００μ、９Ｐ４タンパク質 〈５ 線維組織
（微螢の軟骨） ＩＢＭ÷それぞれ２５０／４のＰ２． ６３ 新生骨Ｐ
３およびＰ４タンパク質 ※ ”ＩＢＭ”は不活性骨マトリックスを意味する。
”〈”は以下を意味する。
表６の資料は子ウシＰ３タンパク質が骨形成を誘発する
ととを示す。子ウシＰ３調製品を含む移殖片は高レベル
のアルカリ性ホスファターゼ９２活性を含んだ組織中で
発達した。対照的に、Ｐ２またはＰ４調製品の再構成で
調製された移殖片は検出できるような骨を造らなかった
。全ての３つのタンノξり質を一緒に用いた時に、かな
シの骨形成が観察され、高レベルのアルカリ性ホスファ
ターゼ酵素がＰ３タンノξり質の１／３量（Ｐ３タンパ
ク質移殖と比較して）得られた。低濃度のＰ３タンパク
質では、Ｐ２およびまたはＰ４タンパク質の存在はＰ３
タンパク質によシ誘発される骨形成の増進をもたらすら
しい。
ととを示す。子ウシＰ３調製品を含む移殖片は高レベル
のアルカリ性ホスファターゼ９２活性を含んだ組織中で
発達した。対照的に、Ｐ２またはＰ４調製品の再構成で
調製された移殖片は検出できるような骨を造らなかった
。全ての３つのタンノξり質を一緒に用いた時に、かな
シの骨形成が観察され、高レベルのアルカリ性ホスファ
ターゼ酵素がＰ３タンノξり質の１／３量（Ｐ３タンパ
ク質移殖と比較して）得られた。低濃度のＰ３タンパク
質では、Ｐ２およびまたはＰ４タンパク質の存在はＰ３
タンパク質によシ誘発される骨形成の増進をもたらすら
しい。
同様の試験で、ヒト骨またはブタ骨から得られた精製Ｐ
３タンパク質をＩＢＭと再構成し、移殖した。約３週後
、移動部位のすわシ組織の外殖片についてアルカリ性ホ
スファターゼ活性および組織学的特性を調べた。各場合
、７５０μｇのＰ３タンパク角が骨形成を誘発した。
３タンパク質をＩＢＭと再構成し、移殖した。約３週後
、移動部位のすわシ組織の外殖片についてアルカリ性ホ
スファターゼ活性および組織学的特性を調べた。各場合
、７５０μｇのＰ３タンパク角が骨形成を誘発した。
本明細書で前記した活性調製品を用いて、骨形成量の１
つ井たけそれ以上のＰ３タンパク質およびまたは骨形成
活性ポリ投プチト９およびまたは免疫学的に関連のある
骨形成活性物質を医薬とじて適当な担体と伴にまたは無
しで、哺乳動物において骨誘発が望ましい部位にまたは
近接に投与する。
つ井たけそれ以上のＰ３タンパク質およびまたは骨形成
活性ポリ投プチト９およびまたは免疫学的に関連のある
骨形成活性物質を医薬とじて適当な担体と伴にまたは無
しで、哺乳動物において骨誘発が望ましい部位にまたは
近接に投与する。
投与は処理される対象の年令、状態、性およびその他の
特性に依存する。好適な投与は移殖、局部注射またはマ
イクロカプセルまたは他の装置を用いた時間調整供与に
よるものである。投与量は例えば骨折部位のような治療
する範囲の位置と形態に依存する。例えば５立方ミリメ
ートルの骨片は約１００■のＩＢＭ中に移殖片として約
１００〜２００μＩのＰ３タンパク質を投与または移殖
することによシ得ることができる。
特性に依存する。好適な投与は移殖、局部注射またはマ
イクロカプセルまたは他の装置を用いた時間調整供与に
よるものである。投与量は例えば骨折部位のような治療
する範囲の位置と形態に依存する。例えば５立方ミリメ
ートルの骨片は約１００■のＩＢＭ中に移殖片として約
１００〜２００μＩのＰ３タンパク質を投与または移殖
することによシ得ることができる。
活性な調製品は成長ｉ子、細胞付着因子、化学走性剤、
ステロイド、抗生物質、抗炎症剤などを含みうる。
ステロイド、抗生物質、抗炎症剤などを含みうる。
第１図は鉱物質除去したウシ骨粉末を４ＭＧｕＨＣＡ’
−０，０１Ｍ ）すｘ−ＨＣＩＩ緩衝液（ｐＨ７，０）
で８時間抽出して得たタンパク質のセファロースＣＬ−
６Ｂカラムクロマトグラフィーにニジ得られた溶出プロ
フィールを表わしている。 第２図はセファロースＣＬ−６Ｂカラムクロマトダラフ
イーから得た活性分画に含まれているタンパク質の４
Ｍ ＧｕＨＣＡ！−０，０１Ｍ ）すｘ−ＨＣＪ緩衝液
（ｐＨ７，０）中でのセファクリルＳ−２００カラムク
ロマトグラフイーによシ得られた溶出プロフィールを表
わしている。 第３図はセファクリルＳ−２００カラムクロマトグラフ
イーの活性分画中に存在するタンパク質のアセトニトリ
ルグラジェントをタンパク質の溶出に使用する逆相プロ
デシル３００オクチルカラム上での溶出プロフィールを
示している。 第４図は還元剤存在下非連続的ドセチル硫酸ナトリウム
−ポリアクリルアミドゲル上での精製骨マトリックスタ
ンパク質の電気泳動分析の結果を示している。 第５Ａ図はツタＰ３タンパク質フラグメントの逆相Ｃ８
カラム上での高速液体クロマトグラフィーによシ得られ
た溶出プロフィールを示している；フラグメントはスタ
フィロコッカス・アウレウス用いてブタＰ３タンパク質
を酵素的に消化して発生させた。 第５Ｂ図はウシＰ３タンパク質フラグメントの逆相カラ
ム上での高速液体クロマトグラフィーによシ得られた溶
出プロフィールを示している；フラグメントはスタフィ
ロコッカス・アウレウス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ ａｕｒｅｕｓ ） Ｖ ８プロテアーゼを用いてウ
シＰ３タンパク質を酵素的に消化して発生させた。 第６Ａ図はブタＰ３タンパク質フラグメントの逆相Ｃ１
８カラム上での高速液体クロマトグラフィーにより得ら
れた溶出プロフィールを示している；フラグメントはス
タフィロコッカス・アウレウス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ） Ｖ ８プロテアーゼを用
い還元、カルボキシメチル化ブタＰ３タンパク質の酵素
的消化によ多発生させる。 第６Ｂ図はヒトＰ３タンパク質フラダメントの逆相Ｃ１
８カラム上での高速液体クロマトグラフィーにより得ら
れた溶出プロフィールを示している；フラグメントはス
タフィロコッカス・アウレウス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ） Ｖ ８プロテアーゼを用
い還元、カルボキシメチル化ヒ）Ｐ３タンノξり質の酵
素的消化によ多発生させる。 第７図は放射性標識試験抗原が拮抗する非標識抗ＩＪＡ
ｐｙｒａ製試料存在下、特定抗体分子へ結合する能力で
測定した拮抗ラジオイムノアッセイの結果を示している
。 特許出願人 ザ・ダウ・ケミカル・カンパニーｊｌ百Ｏ
ｉ’、１ｍ（１’Ｊ１．’７４＝大ＩＴｊｉ： ′”。 ２ｍ ｎｍ ＋てδ−１７う吸ノヒソ艷μアむト：トリ
ルｊｊｊｌ！ｔ（手だ・）−一セント）分′３１−童ｑ
グ３ 一口［［Ｉ口［ロト ｊりｌ−５Ｆ １０ ２５ ５０ １００ ２Ｓ０ ５００手続補正書 昭和メ０年Ｓ月７２日 特許庁長官志 賀 字数 「１） １、事件の表示 昭和ｂｏ年特許願第 ７ｇ 号 ２、発明の名称 看第４／ぺ１困Ｊ ６、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 俗％’）（？λリサ゛・り′ヤ・ケミカｔｌｆ７ンｌぐ
ニー４、代理人 別紙の通り 哨ｒ １”’］ Ｓｔつ−ｚｔｆｌｉ汀り
手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 イし 一 昭和６０年 特許 願第 ７８ 号 ６、補正をする者 事件との関係 出 願 人 住所 名 称 （７２３）ザ・ダウ・ケミカル・カンパニー４
代理人 ５補正命令の日付 昭和６０年４月６０日（発送日）Ｉ
ｌｌ 滴ＴすｒｆｊＷ而ＡＪ面４ｉＱけ昭珀Ａｎなス日
１つ口り一姐申袷喘十（２）明細書５頁１３−１７行の
［Ｒａ１ＳＺ・・・・（１９８３）Ｊを下記のように訂
正する。 「レイズ、エル・シーらのザ・ニュー・イングランド・
ジャーナル・オブ・メグ４９２，３０９巻、１号２９−
３５頁（１９８３）（ＲａｉｓｚｌＬ、 Ｇ、。 ｅｔ ａｌ、＋ ＴＩ＋ｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ 、Ｖｏｌ、
３０９＋Ｎｏ、１ ＋ ｐｐ、 ２９−３５（１９８３
））およびレイズ、エル・シーらのザ・二ニー・イング
ランド・ジャーナル・オブ・メディシン、３０９巻、２
号、８３−８９頁（１９８３） （Ｒａｉｓｚ＋ Ｌ、
Ｇ、、 ｅｔ ａｌ、＋ Ｔｈｅ ＮｅｗＥｎｇｌａｎ
ｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｎｉｎｅ、 Ｖｏ
ｌ。 ３０９、Ｎｏ、２．ｐｐ、８３ ８９（１９８３））Ｊ
（３）明細書６頁２〜７行の「ＵｒｉｓＬ、 Ｍ、 Ｒ
。 ・・・・（１９７９）Ｊを下記のように訂正する。 「ウリスト・エム・アールら、プロシーディング・ナチ
ュラル・アカデミツク・サイエンス・ニー・ニス・エイ
、７６巻第４号１８２８〜１８３２頁（１９７９）（Ｕ
ｒｉｓＬ＋Ｍ、 Ｒ，＋ ｃｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、’ ＵＳＡ、Ｖｏｌ
、７６＋Ｎｏ。 ４、ｐｐ、、１８２８−１８３２（１９７９））；ウリ
スト・エム・アールら、プロシーディング・オプ俸ザ・
ソサイエティ・オブ・工、クスベリメンタル・バイオロ
ノー・エンド・メディシン １６２巻、４Ｂ−５３頁（
１９７９）（Ｕｒｉｓｔ、 Ｍ、 Ｒ，ｙ ｅｔａｌ、
＋ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｔｈｅ ５ｏｃｉ
ｅｔｙ ｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ ａｎｃｌ ＭｅｄｉｃｉｎｅｇＶｏｌ、１６２．ｐ
ｐ、４Ｂ−５３（１９７９））Ｊ（４）明細ＩＦ６頁７
〜８行のｒＨａｎａｍｕｒａ、Ｈ・・・・（１９８０）
Ｊを下記のように訂正する。 「ハナムラ、エッチら、クリニカル・オルトペデイック
ス、１４８巻２８１−２９０頁（１９８０）（Ｈａｎａ
ｍｕｒａ＋Ｈ，＋ ｅｔ ａｌ、ｔ Ｃｌ１ｎｉｃａｌ
Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｅｓ＋ Ｖｏｌ、 １４ Ｂ ＋
ｐｐ、 ２８１−２９０（１９ｓ ｏ））Ｊ （５）明細書６頁９および１０行の［Ｕｒｉｓｔ、 Ｍ
。 Ｒ，Ｊを「ウリスト−ｘム・アール（Ｕｒｉｓｔ、Ｍ。 Ｒｏ）」と訂正する。 （６）明細書６頁１１−１４行のＪＵｒｉｓｔ、 Ｍ。 Ｒ・・・・（１９８３）Ｊを下記のように訂正する。 「ウリスト・エム・アールら、クリニカル・オルトベデ
ィックス、第１６２巻、２１９−２３２頁（１９８２）
（Ｕｒｉｓｔ、 Ｍ、Ｒ，ｅｔ ａｌ、＋ Ｃ１１ｎｉ
ｃａｌＯｒｔｌ＋ｏｐａｅｄｉｃｓ、Ｖｏｌ、１６２＋
ｐｐ、２１９−２３２（１９８２））およびウリスト
・エム・アールら、サイエンス、第２２０巻、６８０−
６８６頁（１９８３） （Ｕｒｉｓｔ、 Ｍ、Ｒ，＋
ｅｔ ａｌ、。 ５ｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ、２２０＋ ｐｐ、６８０ ６
８６（１９８３））」 （７）明細書６真下から４行目ないし７頁２行目に［Ｈ
ｏＩＩＩａｒｄ・・・・・（１９８２）」とあるのを以
下のように訂正する。 「ハワード、シー、エイ、ら、メタポリツク・ボーン・
ディシーズ・エンド・リレイテッド・リサーチ、ｆｊ’
、２＠、１３１−１３５頁＜１９８０）（Ｈｏｗａｒｄ
Ｇ、Ａ、、ｅｔ ａｌ、、ＭｅｔａｂｏｌｉｃＢｏｎ
ｅ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｒｅ１ａｔｅｄ Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ＋Ｖｏ１．２．ｐｐ、１３１−１３５（１９
８０））ニア１−レイ、ジェイ、アー、ら、バイオケミ
ストリイ、第２１巻、３５０２−３５０７頁（１９８２
）（Ｆａｒｌｅｙ＋Ｊ、Ｒ，、ｅｔ ａｌ、Ｉ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋Ｖｏ１．２１＝ ｐｐ、３５０２
−３５０７（１９８２）およびファーレイ、ジェイ、ア
ールら、バイオケミス１リイ、第２１巻３５０８−３５
１３頁（１９８２）（Ｆａｒｌｅｙｔ Ｊ、 Ｒｏｅｔ
ａｌ、＋Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 Ｖｏｌ、２１
ｔ ｐｐ、３５０８−３５１３（１９８２））Ｊ （８）明細書６頁下から６行［ＢａｙｌｉｎｋＪを「ベ
イリンク（Ｂａｙｌｉｎｋ）Ｊ と訂正する。 （９）明細書７頁２行の［ＦａｒｌｅｙＪを「ファーレ
イ（Ｆａｒｌｅｙ）Ｊと訂正する。 （１０）明細書７真下から６〜下から５行１” Ｕ ｒ
ｉｓｔ・・・・（１９８３）Ｊを下記のように訂正する
。 「ウリスト・エム・アールら、サイエンス、２２０巻６
８０−６８６頁（１９８３）（Ｕｒｉｓｔ、 Ｍ。 Ｒ，ｅｔ ａｌ、＋ ５ｃｉｅｎｃｅｙ Ｖｏｌ、２２
０． ｐｐ。 ６８０〜６８６（１９８３））Ｊ （１１）明細書８頁１〜３行の「Ｕｒｉｓｔ・・・・（
１９８３）Ｉを下記のように訂正する−［ウリストら、
プロシーディング・オプ・ザ・ソサイエティ・オブ・エ
クスペリメンタル・バイオロジー◆エンド・メディシン
、１７３６．１９４−１９９頁（１９８３） （Ｕｒｉ
ｓｔ ｅｔ ａｌ、。 Ｐ ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｔ ｈｅ Ｓ ｏｃ
ｉｅｔｙ ｏｆＥｘｐｅｒｉｌＩｌｅｎｔａｌ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ＋Ｖｏ１．１７３
＝ ρｐ、１９４−１９９（１９８３））ｊ（１２）明
細書８頁１３−１４行の［Ｕｒｉｓｔ・・・・・・（１
９８４年１月）」を下記のように訂正する。 ［ウリスト・エム・アールら、プロン−ディング・ナチ
ュラル・アカデミツク・サイエンス・ニー・ニス・エイ
、 ８１巻、３７１−３７５頁（１９８４年１月）（Ｕ
ｒｉｓｔ、 Ｍ、 Ｒ，ｅｔ ａｌ、、Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、Ｖｏｌ、８１
゜ｐｐ、 ３７１−３７５（Ｊａｎｕａｒｙ、１９８４
））Ｊ（１３）明細書９頁１３−１４の「ＨａｎａＩＩ
ｌｕｒａ・・・・（１９８０）Ｊを下記のように訂正す
る。 ［ハナムラ、エッチら、クリニカル・オルトペディノク
ス、第１５３巻、２３２−２４０頁（１９８０）（１−
１ａｎａｍｕｒａ＋Ｈ，，ｅｔ ａｌ ＋＋ Ｃｌ１ｎ
ｉｃａｌＯｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ＋ Ｖｏｌ、１５３
、ｐｐ、２３２−２４０（１９８０））Ｊ （１４） 明細書９頁１５−１８行の［Ｃｏｎｏｖｅｒ
・・・・（１９８１）Ｊを下記のように訂正する。 ［コノバー・エム・エイおよびウリスト・エム・アール
げ鉱物質化結合組織の化学および生物学”、エルスピア
−・ノース・ホランド・インク、５９７−６０６頁（１
９８１） （Ｃｏｎｏｖｅｒ、 Ｍ、 Ａ、。 ａｎｄ Ｕｒｉｓｔ、 Ｍ、 Ｒ，Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ａｎｄＢｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｎｅｒａ
ｌｉｚｅｄ ＣｏｎｎｅｃｔｉｖｅＴｉｓｓｕｅｓ＋
Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｎｏｒｔｈ Ｈｏ１ｌａｎｄ、Ｉｎ
ｃ、＋ｐｐ、５９７−６０６（１９８１））Ｊ以上
−０，０１Ｍ ）すｘ−ＨＣＩＩ緩衝液（ｐＨ７，０）
で８時間抽出して得たタンパク質のセファロースＣＬ−
６Ｂカラムクロマトグラフィーにニジ得られた溶出プロ
フィールを表わしている。 第２図はセファロースＣＬ−６Ｂカラムクロマトダラフ
イーから得た活性分画に含まれているタンパク質の４
Ｍ ＧｕＨＣＡ！−０，０１Ｍ ）すｘ−ＨＣＪ緩衝液
（ｐＨ７，０）中でのセファクリルＳ−２００カラムク
ロマトグラフイーによシ得られた溶出プロフィールを表
わしている。 第３図はセファクリルＳ−２００カラムクロマトグラフ
イーの活性分画中に存在するタンパク質のアセトニトリ
ルグラジェントをタンパク質の溶出に使用する逆相プロ
デシル３００オクチルカラム上での溶出プロフィールを
示している。 第４図は還元剤存在下非連続的ドセチル硫酸ナトリウム
−ポリアクリルアミドゲル上での精製骨マトリックスタ
ンパク質の電気泳動分析の結果を示している。 第５Ａ図はツタＰ３タンパク質フラグメントの逆相Ｃ８
カラム上での高速液体クロマトグラフィーによシ得られ
た溶出プロフィールを示している；フラグメントはスタ
フィロコッカス・アウレウス用いてブタＰ３タンパク質
を酵素的に消化して発生させた。 第５Ｂ図はウシＰ３タンパク質フラグメントの逆相カラ
ム上での高速液体クロマトグラフィーによシ得られた溶
出プロフィールを示している；フラグメントはスタフィ
ロコッカス・アウレウス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ ａｕｒｅｕｓ ） Ｖ ８プロテアーゼを用いてウ
シＰ３タンパク質を酵素的に消化して発生させた。 第６Ａ図はブタＰ３タンパク質フラグメントの逆相Ｃ１
８カラム上での高速液体クロマトグラフィーにより得ら
れた溶出プロフィールを示している；フラグメントはス
タフィロコッカス・アウレウス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ） Ｖ ８プロテアーゼを用
い還元、カルボキシメチル化ブタＰ３タンパク質の酵素
的消化によ多発生させる。 第６Ｂ図はヒトＰ３タンパク質フラダメントの逆相Ｃ１
８カラム上での高速液体クロマトグラフィーにより得ら
れた溶出プロフィールを示している；フラグメントはス
タフィロコッカス・アウレウス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ） Ｖ ８プロテアーゼを用
い還元、カルボキシメチル化ヒ）Ｐ３タンノξり質の酵
素的消化によ多発生させる。 第７図は放射性標識試験抗原が拮抗する非標識抗ＩＪＡ
ｐｙｒａ製試料存在下、特定抗体分子へ結合する能力で
測定した拮抗ラジオイムノアッセイの結果を示している
。 特許出願人 ザ・ダウ・ケミカル・カンパニーｊｌ百Ｏ
ｉ’、１ｍ（１’Ｊ１．’７４＝大ＩＴｊｉ： ′”。 ２ｍ ｎｍ ＋てδ−１７う吸ノヒソ艷μアむト：トリ
ルｊｊｊｌ！ｔ（手だ・）−一セント）分′３１−童ｑ
グ３ 一口［［Ｉ口［ロト ｊりｌ−５Ｆ １０ ２５ ５０ １００ ２Ｓ０ ５００手続補正書 昭和メ０年Ｓ月７２日 特許庁長官志 賀 字数 「１） １、事件の表示 昭和ｂｏ年特許願第 ７ｇ 号 ２、発明の名称 看第４／ぺ１困Ｊ ６、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 俗％’）（？λリサ゛・り′ヤ・ケミカｔｌｆ７ンｌぐ
ニー４、代理人 別紙の通り 哨ｒ １”’］ Ｓｔつ−ｚｔｆｌｉ汀り
手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 イし 一 昭和６０年 特許 願第 ７８ 号 ６、補正をする者 事件との関係 出 願 人 住所 名 称 （７２３）ザ・ダウ・ケミカル・カンパニー４
代理人 ５補正命令の日付 昭和６０年４月６０日（発送日）Ｉ
ｌｌ 滴ＴすｒｆｊＷ而ＡＪ面４ｉＱけ昭珀Ａｎなス日
１つ口り一姐申袷喘十（２）明細書５頁１３−１７行の
［Ｒａ１ＳＺ・・・・（１９８３）Ｊを下記のように訂
正する。 「レイズ、エル・シーらのザ・ニュー・イングランド・
ジャーナル・オブ・メグ４９２，３０９巻、１号２９−
３５頁（１９８３）（ＲａｉｓｚｌＬ、 Ｇ、。 ｅｔ ａｌ、＋ ＴＩ＋ｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ 、Ｖｏｌ、
３０９＋Ｎｏ、１ ＋ ｐｐ、 ２９−３５（１９８３
））およびレイズ、エル・シーらのザ・二ニー・イング
ランド・ジャーナル・オブ・メディシン、３０９巻、２
号、８３−８９頁（１９８３） （Ｒａｉｓｚ＋ Ｌ、
Ｇ、、 ｅｔ ａｌ、＋ Ｔｈｅ ＮｅｗＥｎｇｌａｎ
ｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｎｉｎｅ、 Ｖｏ
ｌ。 ３０９、Ｎｏ、２．ｐｐ、８３ ８９（１９８３））Ｊ
（３）明細書６頁２〜７行の「ＵｒｉｓＬ、 Ｍ、 Ｒ
。 ・・・・（１９７９）Ｊを下記のように訂正する。 「ウリスト・エム・アールら、プロシーディング・ナチ
ュラル・アカデミツク・サイエンス・ニー・ニス・エイ
、７６巻第４号１８２８〜１８３２頁（１９７９）（Ｕ
ｒｉｓＬ＋Ｍ、 Ｒ，＋ ｃｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、’ ＵＳＡ、Ｖｏｌ
、７６＋Ｎｏ。 ４、ｐｐ、、１８２８−１８３２（１９７９））；ウリ
スト・エム・アールら、プロシーディング・オプ俸ザ・
ソサイエティ・オブ・工、クスベリメンタル・バイオロ
ノー・エンド・メディシン １６２巻、４Ｂ−５３頁（
１９７９）（Ｕｒｉｓｔ、 Ｍ、 Ｒ，ｙ ｅｔａｌ、
＋ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｔｈｅ ５ｏｃｉ
ｅｔｙ ｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ ａｎｃｌ ＭｅｄｉｃｉｎｅｇＶｏｌ、１６２．ｐ
ｐ、４Ｂ−５３（１９７９））Ｊ（４）明細ＩＦ６頁７
〜８行のｒＨａｎａｍｕｒａ、Ｈ・・・・（１９８０）
Ｊを下記のように訂正する。 「ハナムラ、エッチら、クリニカル・オルトペデイック
ス、１４８巻２８１−２９０頁（１９８０）（Ｈａｎａ
ｍｕｒａ＋Ｈ，＋ ｅｔ ａｌ、ｔ Ｃｌ１ｎｉｃａｌ
Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｅｓ＋ Ｖｏｌ、 １４ Ｂ ＋
ｐｐ、 ２８１−２９０（１９ｓ ｏ））Ｊ （５）明細書６頁９および１０行の［Ｕｒｉｓｔ、 Ｍ
。 Ｒ，Ｊを「ウリスト−ｘム・アール（Ｕｒｉｓｔ、Ｍ。 Ｒｏ）」と訂正する。 （６）明細書６頁１１−１４行のＪＵｒｉｓｔ、 Ｍ。 Ｒ・・・・（１９８３）Ｊを下記のように訂正する。 「ウリスト・エム・アールら、クリニカル・オルトベデ
ィックス、第１６２巻、２１９−２３２頁（１９８２）
（Ｕｒｉｓｔ、 Ｍ、Ｒ，ｅｔ ａｌ、＋ Ｃ１１ｎｉ
ｃａｌＯｒｔｌ＋ｏｐａｅｄｉｃｓ、Ｖｏｌ、１６２＋
ｐｐ、２１９−２３２（１９８２））およびウリスト
・エム・アールら、サイエンス、第２２０巻、６８０−
６８６頁（１９８３） （Ｕｒｉｓｔ、 Ｍ、Ｒ，＋
ｅｔ ａｌ、。 ５ｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ、２２０＋ ｐｐ、６８０ ６
８６（１９８３））」 （７）明細書６真下から４行目ないし７頁２行目に［Ｈ
ｏＩＩＩａｒｄ・・・・・（１９８２）」とあるのを以
下のように訂正する。 「ハワード、シー、エイ、ら、メタポリツク・ボーン・
ディシーズ・エンド・リレイテッド・リサーチ、ｆｊ’
、２＠、１３１−１３５頁＜１９８０）（Ｈｏｗａｒｄ
Ｇ、Ａ、、ｅｔ ａｌ、、ＭｅｔａｂｏｌｉｃＢｏｎ
ｅ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｒｅ１ａｔｅｄ Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ＋Ｖｏ１．２．ｐｐ、１３１−１３５（１９
８０））ニア１−レイ、ジェイ、アー、ら、バイオケミ
ストリイ、第２１巻、３５０２−３５０７頁（１９８２
）（Ｆａｒｌｅｙ＋Ｊ、Ｒ，、ｅｔ ａｌ、Ｉ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋Ｖｏ１．２１＝ ｐｐ、３５０２
−３５０７（１９８２）およびファーレイ、ジェイ、ア
ールら、バイオケミス１リイ、第２１巻３５０８−３５
１３頁（１９８２）（Ｆａｒｌｅｙｔ Ｊ、 Ｒｏｅｔ
ａｌ、＋Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 Ｖｏｌ、２１
ｔ ｐｐ、３５０８−３５１３（１９８２））Ｊ （８）明細書６頁下から６行［ＢａｙｌｉｎｋＪを「ベ
イリンク（Ｂａｙｌｉｎｋ）Ｊ と訂正する。 （９）明細書７頁２行の［ＦａｒｌｅｙＪを「ファーレ
イ（Ｆａｒｌｅｙ）Ｊと訂正する。 （１０）明細書７真下から６〜下から５行１” Ｕ ｒ
ｉｓｔ・・・・（１９８３）Ｊを下記のように訂正する
。 「ウリスト・エム・アールら、サイエンス、２２０巻６
８０−６８６頁（１９８３）（Ｕｒｉｓｔ、 Ｍ。 Ｒ，ｅｔ ａｌ、＋ ５ｃｉｅｎｃｅｙ Ｖｏｌ、２２
０． ｐｐ。 ６８０〜６８６（１９８３））Ｊ （１１）明細書８頁１〜３行の「Ｕｒｉｓｔ・・・・（
１９８３）Ｉを下記のように訂正する−［ウリストら、
プロシーディング・オプ・ザ・ソサイエティ・オブ・エ
クスペリメンタル・バイオロジー◆エンド・メディシン
、１７３６．１９４−１９９頁（１９８３） （Ｕｒｉ
ｓｔ ｅｔ ａｌ、。 Ｐ ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｔ ｈｅ Ｓ ｏｃ
ｉｅｔｙ ｏｆＥｘｐｅｒｉｌＩｌｅｎｔａｌ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ＋Ｖｏ１．１７３
＝ ρｐ、１９４−１９９（１９８３））ｊ（１２）明
細書８頁１３−１４行の［Ｕｒｉｓｔ・・・・・・（１
９８４年１月）」を下記のように訂正する。 ［ウリスト・エム・アールら、プロン−ディング・ナチ
ュラル・アカデミツク・サイエンス・ニー・ニス・エイ
、 ８１巻、３７１−３７５頁（１９８４年１月）（Ｕ
ｒｉｓｔ、 Ｍ、 Ｒ，ｅｔ ａｌ、、Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、Ｖｏｌ、８１
゜ｐｐ、 ３７１−３７５（Ｊａｎｕａｒｙ、１９８４
））Ｊ（１３）明細書９頁１３−１４の「ＨａｎａＩＩ
ｌｕｒａ・・・・（１９８０）Ｊを下記のように訂正す
る。 ［ハナムラ、エッチら、クリニカル・オルトペディノク
ス、第１５３巻、２３２−２４０頁（１９８０）（１−
１ａｎａｍｕｒａ＋Ｈ，，ｅｔ ａｌ ＋＋ Ｃｌ１ｎ
ｉｃａｌＯｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ＋ Ｖｏｌ、１５３
、ｐｐ、２３２−２４０（１９８０））Ｊ （１４） 明細書９頁１５−１８行の［Ｃｏｎｏｖｅｒ
・・・・（１９８１）Ｊを下記のように訂正する。 ［コノバー・エム・エイおよびウリスト・エム・アール
げ鉱物質化結合組織の化学および生物学”、エルスピア
−・ノース・ホランド・インク、５９７−６０６頁（１
９８１） （Ｃｏｎｏｖｅｒ、 Ｍ、 Ａ、。 ａｎｄ Ｕｒｉｓｔ、 Ｍ、 Ｒ，Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ａｎｄＢｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｉｎｅｒａ
ｌｉｚｅｄ ＣｏｎｎｅｃｔｉｖｅＴｉｓｓｕｅｓ＋
Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｎｏｒｔｈ Ｈｏ１ｌａｎｄ、Ｉｎ
ｃ、＋ｐｐ、５９７−６０６（１９８１））Ｊ以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、（α）本質的に均質の状態において、哺乳動物にお
ける骨形成を促進する能力を有することによシ特徴づけ
られた免疫学的に関連したタンパク質のＰ３族のタンノ
ξり質； （ｂ） 前記タン・ξり質よシ誘導された骨形成活性ポ
リペプチド； （Ｃ）前記タンパク質と免疫学的に関連した骨形成に活
性を有する物質に変換するまたは変換しうるポリペプチ
ド；または （ｄ）（α） 、 （ｆｉ）および（Ｃ）より選択され
た骨形成因子の混合物 よシ成る群より選択された１つのものである本質的に均
質な骨形成因子。 ２、 ウシの骨よシ単離されたＰ３タンパク質である特
許請求の範囲第１項の骨形成因子。 ３、 ヒトの骨よシ単離されたＰ３タンノξり質である
特許請求の範囲第１項の骨形成因子。 ４、 ブタの骨よシ単離されたＰ３タンパク質である特
許請求の範囲第１項の骨形成因子。 ５、アミノ酸末端配列Ｈ２Ｎ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ
−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−
Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａを有する特許
請求の範囲第１項のタンパク質。 ６、（α）少くとも１つの特許請求の範囲第１項の骨形
成因子および （ｈ）（１） 免疫学的に関連したタンパク質のＰ４族
および （２）免疫学的に関連したタンパク質のＰ２族 から本質的になる群よシ選択される少くとも１つのもの
からなる組成物。 ７、（α）特定の哺乳動物種よシ誘導された特許請求の
範囲第１項の骨形成因子；および （ｂ） 異なった哺乳動物種よシ誘導された特許請求の
範囲第１項の１つまたはそれ以上の骨形成因子からなる
組成物。 ８、（（Ｚ） ％許請求の範囲第１項の骨形成因子の少
なくとも１つ；および （ｂ）（α）に記載されたもの以外の少なくとも１つの
生物活性物質からなる組成物。 ９、医薬として適当な担体および骨形成有効量の特許請
求の範囲第１項の少なくとも１つの骨形成因子からなる
骨形成組成物。 １０、医薬として適当な担体がコラーゲンまだは強力な
変性剤で抽出された骨粉よシ誘導されたマトリックス物
質である特許請求の範囲第９項の組成物。 １１、少なくとも１つの非骨形成生物活性成分もまた含
有する特許請求の範囲第９項の組成物。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US56816784A | 1984-01-04 | 1984-01-04 | |
| US568167 | 1984-01-04 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60226814A true JPS60226814A (ja) | 1985-11-12 |
Family
ID=24270176
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60000078A Pending JPS60226814A (ja) | 1984-01-04 | 1985-01-04 | 骨形成因子 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0148155B1 (ja) |
| JP (1) | JPS60226814A (ja) |
| AT (1) | ATE42309T1 (ja) |
| AU (1) | AU580975B2 (ja) |
| CA (1) | CA1241641A (ja) |
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| DK (1) | DK161524C (ja) |
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| IE (1) | IE57966B1 (ja) |
| NZ (1) | NZ210699A (ja) |
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