JPS6344527A - 軟骨細胞および骨芽細胞を刺激する組成物、オセインヒドロキシアパタイトコンパウンド、その製法、および前記組成物を含む製剤生成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１１緒言 本発明は軟骨細胞および骨芽細胞を刺激するオセインヒ
ドロキシアパタイトコンパウンド（０）１ｃ）に関する
。さらに本発明はＯＨＣを製造する方法に関する。本発
明はさらに変形性関節症および骨粗鬆症の予防および治
療、並びに骨折、軟骨欠損および骨欠損の治癒をするた
めの、殊に経口投与用の製剤組成物に対するＯＨＣの使
用に関する。

（２）発明の背景 コルチコステロイド療法に基く骨粗鬆症の予防に対する
微結晶ヒドロキシアパタイト組成物（ＭＣＨＣ）が既に
知られている；ビネス（Ａ。

Ｐｉｎｅｓ）ほか、カーレント・メディカル・リサーチ
・アンド・オピニオン（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｍｅｄｉｃａ
ｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈａｎｄ　０ｐｉｎｉｏｎ　）　、
８巻、１０号、１９８４．７３４〜７４２頁参照。該組
成物はヒドロキシアパタイトとリン酸カルシウムとの複
合塩約５０重景％を含む。それはさらに約２６％のコラ
ーゲンおよび約９％の非コラーゲン性タンパク質／ペプ
チドを含有する。さらにそれは約０６０５％のナトリウ
ム並びに→グネシウムおよびカリウム、並びに微量元素
としてフッ素、亜鉛、ストロンチウム、ケイ素、鉄、ル
ビジウム、セシウムおよび白金を含有する。最後に該組
成物はグリコサミノグリカン類、クエン酸塩および水を
含有する。ＭＣＨＣの製法については何も知られていな
い。

（３）　　発明の概要 本発明の目的はオセインヒドロキシアパタイトコンパウ
ンド（ＯＨＣ）およびその製造方法を提供することであ
る。他の目的はＯＨＣを含有し、軟骨細胞および骨芽細
胞の刺激（増殖）に、従って変形性関節症および骨粗鬆
症の予防および治療、並びに骨折、軟骨欠損および骨欠
損の治癒に適する製剤組成物を提供することである。

ＯＨＣは、有機成分を非変質状態で、また無機成分を生
理的均衡割合で含有するので、骨および軟骨の代謝に対
し特異的効果を有することが認められた。ＯＨＣの投与
はヒトおよび動物生体に骨格系に必須の物質（非コラー
ゲン性の骨枠異的ペプチド、局所活性の骨および軟骨細
胞調整因子、カルシウムおよびリン酸塩）が供給される
ことを保証する。ＯＨＣはコラーゲン並びに必須の骨特
異的非コラーゲン性ペプチドおよびプロテオグリカンの
有機オセインマトリックスで骨代謝を支持し、骨再生を
促進し、オセインマトリックス中に包埋されるヒドロキ
シアパタイトの無機成分の骨中のとり込みを高める。さ
らに、ＯＨＣは身体軟骨修復機構を刺激し、軟骨組織を
変質から保護する。

ＯＨＣは、骨組織の生成に関与する細胞である骨芽細胞
に特有の生物学的作用を示す。ＯＨＣは骨芽細胞の増殖
および代謝を増強し、さらに非特異的間葉細胞の軟骨芽
細胞または骨芽細胞への分化を促進する。従って、ＯＨ
Ｃは異なる起源の骨疾患、例えば−次および二次骨粗鬆
症における、並びに骨折および骨欠損の治癒における、
並びにプロテーゼの最適化に対する新治療約である。そ
れは記載する細胞生物学特性から明らかであり、ＯＨＣ
が従来のカルシウム製剤および全骨粉より著しく優れて
いることは動物において生体内薬理学的におよびヒトに
おいて臨床的に確認された。

ＯＨＣは骨吸収を抑制するだけでなく何よりも骨成長を
促進するので、ＯＨＣは骨粗鬆症に対する治療製品内の
純骨吸収抑制剤例えばエストロゲンおよびカルシトニン
に対する真の代替物を提供する。ＯＨＣは、それが生ず
る副作用が著しく少なく例えば胃腸の副作用、関節の痛
みがない事実により同様に骨代謝を刺激する現存治療製
品例えばフッ化ナトリウムおよびジホスホナート類とは
区別される。ジホスホナート類は非常に狭い治療範囲を
有するがＤＨＣは事実上無毒性である。

さらに、ＯＨＣは軟骨組織の形成および吸収に関与する
軟骨細胞に対して生物学的作用を及ぼす。

その表現型の損失な（軟骨細胞はＯＨＣにより増殖およ
びその代謝の増加を刺激され、並びに医原　　４性病毒
例えばコルチコステロイドから保護される。

さらに、ＯＨＣは軟骨細胞に対する非特異的間葉細胞の
分化を促進し、従って、軟骨細胞の再生に主要役割を果
す過程である軟骨様化生を促進する。

従ってＯＨＣは、軟骨細胞の数およびそれらの代謝活性
の低下があり、また軟骨の再生が適切な軟骨様化生を要
求する変形性関節症の治療に顕著に有用である。ＯＨＣ
はさらに骨粗鬆症の治療、並びに骨折並びに骨および軟
骨の欠損の治癒の支持に適する。

ＯＨＣの生物学的活性は試験管内で、例えば次のように
確認することができる、 （ａｌ　　骨芽細胞、軟骨細胞および線維芽細胞のＩ）
ＮＡＡ合成刺激、 （′ｂ）軟骨細胞および線維芽細胞のタンパク賞合成の
刺激、 （Ｃ１全タンパク賞合成の刺激に比べて、軟骨細胞のコ
ラーゲン全合成の選択的刺激、 （ｄｉ　　軟骨細胞中のタンパク質ｘおよびｙの合成の
誘発、 （ｅ）非特異的間葉細胞の軟骨細胞または骨芽細胞への
分化の促進。

コラーゲン全合成の刺激において、コラーゲン型■およ
び■の割合は軟骨細胞培養中２４時間不変のままであり
、それにより軟骨細胞の表現型をこの時間にわたって保
持する。

ＤＮＡ合成に対する生物学的効果は普通に使用される方
法で、細胞系例えば３７３線維芽細胞による３Ｈ−チミ
ジンとり込みの刺激の測定により決定される；ジメネズ
・ド・フェア（Ｊｉｍｅｎｅｚ　ｄｅＡｓｕａ）ほか、
プロシーディング・オフ゛・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オフ・サイエンス（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、７２巻（
１９７５）、２７２４〜２７２８頁参照。これはマイト
ジェン物質の確認に普通に使用される生物学的方法であ
る。細胞系は培養が容易であるので細胞系をこの確認法
に用いることが有利である。

この試験法は細胞培養中の非形質転換線維芽細胞が２極
端成長状態を示すことの考察に暴く。静止状態において
細胞は００〜Ｇ３ｔＩＩにあり、従って分裂しない、さ
らに活性増殖の状態が存在する。

静止状態から増殖状態への転移は必須栄養、血清または
他の成長促進因子の濃度により調整することができる。

ＯＨＣはそのような成長促進因子を含有する。後者は中
性緩衝生理溶媒例えばリン酸塩緩衝食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ
）または生理食塩水に可溶性であり、それらは静止３７
３線維芽細胞による３Ｈ−チミジンの高刺激性用量関連
とり込みに影響を与える。

ガンマ線の照射による食品および製剤調製物の滅菌にし
ばしば使用される方法は、３７３線維芽細胞の３Ｈ−チ
ミジンとり込みに対する刺激効果により測定してＯＨＣ
の生物学的活性を低下しない。

この試験系はまた骨芽細胞Ｄ　Ｎ　Ａ合成の細胞特異的
刺激の測定に使用できる。ラット頭蓋冠から逐次酵素消
化により得られる骨芽細胞集団が使用される。骨芽細胞
集団は骨芽細胞の成熟における種々の段階を示し、集団
１〜■は前骨芽細胞型であると、集団■〜■は骨芽細胞
型と、また集団りは静止骨芽細胞型細胞または骨細胞と
みなされる。

中性可溶化ＯＨＣ成分は集団■および■の骨芽細胞に対
する用量依存性刺激効果を有する。平行して検定したラ
ット線維芽細胞の初代培養の増殖は刺激されない。これ
らの試験結果から推論すると中性可溶化ＯＨＣ成分は骨
細胞特異的活性を示すであろう。

タンパク質合成に対する生物学的効果は普通に使用され
る方法で、細胞例えば３７３線維芽細胞のような細胞系
、またはヒト包皮線維芽細胞のＬ−（５−”Ｈ）−プロ
リンとり込みの刺激を測定することにより決定される。

この方法は刺激された細胞のタンパク質合成が増加する
との考察に基く。Ｌ−（５−３Ｈ）−プロリンが細胞培
地中の刺激細胞に提供されると、細胞はそれを新合成タ
ンパク質中へとり込む。設定インキュベーション期間後
、刺激効果の尺度である放射能とり込み量を測定する。

ＯＨＣは３Ｔ３線維芽細胞およびヒト包皮線維芽細胞中
のタンパク合成に高刺激、用量依存性効果を与える中性
可溶化成分を含む。

アルカリ性ホスファターゼ検定はドイツ臨床化学会（Ｄ
ｅｕｔｓｃｈｅ　Ｇｅ５ｅｌｌｓｃｈａｆｔ　ｆυｒ　
Ｋ１１ｎｉｓｃｈｅＣｈｅａ＋ｉｅ）　、ツアイトシェ
リフト・フェア・クリニツエ・ヘミ−・ラント・クリニ
ッシェ・バイオヘミー（Ｚ、　Ｋ１１ｎ、　Ｃｈｅｍ、
　ａｎｄ　Ｋ１１ｎ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、８巻（１
９７０）　、６５８；９巻（１９７１）、４６４：およ
び１０巻（１９７２）、１８２により推奨された方法に
より行なわれる。ホスファターゼ活性は本発明の方法に
おいて各段階で品質制御のために検定される。

表Ｉには分析により測定されたＯＨＣの組成（約１５０
バツチから得た値）が総括される。

表　　Ｉ （４）　　発明の説明 本発明によれば次の工程がＯＨＣの製造に行なわれる： 初めに公認獣医により検査された胎児〜約１２刃金の哺
乳動物から骨をとり出す。とり出した後、清浄な骨を速
やかに冷凍し、必要になるまで約−２０〜−３０℃で保
存する：第１図、囲枠１参照。

その後処理する前に骨を検査し、それがなお新鮮である
ことを調べる、それはその臭および色により決定するこ
とができる。骨はまた検査してそれが清浄であり実際に
必要な骨であることを調べる。

必要であれば骨は大きさおよび形状について家畜の解剖
学マニュアルに対して検査する。残存する肉、鍵および
軟骨もまた除去する。

動物のアイデンティティについて疑いがあれば、種もま
た通常の免疫反応例えば沈降の助けにより決定すること
ができる。

次いで骨を粉砕機中で最大約ＩＣ１１の粒径に粉砕する
（第１図、囲枠２参照）、雪粒子は次いでその残留成分
が最大約１０％、または約１０〜２５％になるまで減圧
下に２０〜８０℃で乾燥する（第１図、囲枠３ａおよび
３ｂ参照）。得られた骨物質を次に酸例えば塩酸、リン
酸、酢酸、ギ酸またはクエン酸を用いて約５．０〜５．
５のｐＨにする。

次に骨物質を親水性かつ親油性溶媒を用いて約５％の最
大残留水分および残留脂肪含量に脱水、脱脂するか、ま
たは初めに親水性溶媒を用いて２０〜８０℃で約５％の
最大残留水分に脱水し次いで親油性溶媒を用いて２０〜
８０℃で最大約５％の残留脂肪含量に脱脂する（第１図
、囲枠４ａおよび４ｂ参照）。

生じた脱水、脱脂した骨物質を次にさらに減圧下に２０
〜８０℃で、例えば渦流で、約１％の最大溶媒含量に達
するまで乾燥する（第１図、囲枠５参照）。

意図する用途により得られた骨物質は次いで常法で粉砕
および篩別機中で約５０〜３００ミクロンの種々の粒径
の粉末に粉砕する（第１図、囲枠６参照）。

骨物質中の微生物の数が約１０，０００毎ダラムを越え
れば、骨物質を常法で、例えばそれをエチレンオキシド
で処理するかまたはガンマ線で照射することにより滅菌
する（第１図、囲枠１０〜１２参照）。製剤薬物の製造
に適するＯＨＣが得られる（第１図、囲枠１３参照）。

本発明の方法の他の様式において、上記哺乳動物の骨を
約ＩＣＩＩの最大粒径に、例えば粉砕機中で粉砕する（
第２図、囲枠２参照）。骨の粒子は次に酸でｐｕｓ、ｏ
〜５．５にする０次にそれを親水性かつ親油性溶媒を用
いて約５％の最大残留水分および脂肪含量に脱水、脱脂
するか、または初めに親水性溶媒で２０〜８０℃におい
て約５％の最大残留水分に脱水し次に親油性溶媒で２０
〜８０℃において約５％の最大残留脂肪含量に脱脂する
（第２図、囲枠３ａおよび３ｂ参照）。

次いで生じた脱水、脱脂した骨物質をさらに減圧下に一
２０〜８０℃で、例えば渦流で、約１％の最大溶媒含量
が達成されるまで乾燥する（第２図、囲枠４参照）。必
要であれば骨物質をさらに上記のように処理することが
できる（第２図、囲枠５〜１１参照）。製剤薬物の製造
に適するＯＨＣが得られる（第２図、囲枠１２）。

上記のように本発明の方法に使用する好ましい骨は長管
例えば上腕骨、大腿骨、脛骨、撓骨および尺骨、中手骨
または中足骨である。さらに仔牛（Ｂｏｓ　ｔａｕｒｕ
ｓ）からの骨は好ましく使用される。

生成物が変質するのを防ぐために、どの場合にも水分お
よび溶媒含量だ低下すると乾燥および脱脂温度を低下さ
せることが必要であることは明らかである。既に言及し
たように８０℃の最高温度が脱水および乾燥に使用され
る。水および溶媒含量が低下すると温度を低下させ、操
作を非常に速やかに行なう。

脱水および乾燥操作中、圧力は最大約４００ミリバール
である。

適当な親油性溶媒の典型的な例はアセトン、トリクロロ
エチレン、塩化メチレンおよび低沸点石油エーテルであ
る。適当な親水性溶媒の典型的な例はアセトン、エタノ
ールおよびイソプロパノ−□ルである。

生じたＯＨＣは常法で経口投与用製剤製品、例えば顆粒
、フィルムコーティング錠、カプセル、コーティング火
剤、粉末または懸濁液に調製することができる。−日量
は０．６〜１０ｇで２〜３回の個々の用量に分割される
。用量の単位は２００〜４０００■である。

顆粒の製造には、ＯＨＣは充填剤および矯味料を混合し
、水で濡らし、粒化し、乾燥する。

フィルムコーティング錠の製造には、ＯＨＣを湿り状態
で粒化し、乾燥し、次いでふるいにかける。流展剤（ｆ
ｌｏｗａｎｃｅ　ａｇｅｎｔ）　、滑沢剤および崩解剤
が配合される。成形準備のできた混合物を錠剤にし、次
に薄い有色ラッカーで被覆する。

コーティング火剤の製造には、ＯＨＣを湿り状態で粒化
し、乾燥し、ふるいにかける。次いで通常の錠剤化補助
剤を加え、火剤核を形成させる。

核を分離し、白色トップコートを与え、着色し、つや出
しする。

粉末の製造には、ＯＨＣを皮殻で覆われた粒子に加工し
芳香をつけ、ふるいにかける。

懸濁液の製造には、ＯＨＣを粘度を高める補助剤ととも
に糖蜜中に懸濁させる。懸濁液を着色し、芳香をつけ、
次いで保存する。

第１図は実施例１におけるようにＯＨＣを製造する図式
を示し、 第２図は実施例２におけるようにＯＨＣを製造する図式
を示し、 第３図はＯＨＣ抽出物による３７３線維芽細胞中の３Ｈ
−チミジンのとり込みの刺激を示す。横軸はＯＨＣ抽出
物の濃度をμｌ／ｍｌ−培地で示す。縦軸は３Ｈ−チミ
ジンのとり込みをｃｐｍ　Ｘ　ＩＱ’で示す。バーは９
個の測定値の平均値に対する標準偏差を示す。相関係数
は、０．９１７゜第４図はウシ胎児血清（−−−）およ
びＯＨＣ成分（−）による３７３線維芽細胞中のＬ−（
５−２Ｈ）−プロリンとり込みの刺激を示す。横軸は試
験した試料中の濃度をμｌ／ｍｌ！−培地で示し、縦軸
はＬ−（５−３Ｈ）−プロリンのとり込みをｃｐｍｘ１
０３で示す。

第５図はウシ軟骨細胞中の３Ｈ−チミジンとり込みの刺
激を０ＨＣ３４／４の用量の関数として示す。横軸は試
験した試料中の濃度をμｇ／ｍｌ−培地で、縦軸は３Ｈ
−チミジンとり込みをｃｐｍ×１０４で示す。

第６図は単層培養中の軟骨細胞のコラーゲン合成の刺激
および全タンパク質をＯＨＣｔＭ度の関数として示す。

横軸は用いた活性検定タンパク質の量、μｇ毎ｍｌ−培
地を示す。縦軸は各培養バッチに対するそれぞれ新合成
タンパク質Ｘ−Ｘおよびコラーゲン０−−−０の量、μ
ｇを示す。

第７図は全タンパク質中のコラーゲン含量の増加パーセ
ントをＯＨＣ用量の関数として示す。

第８図は照射および非照射ＯＨＣ抽出物による３Ｔ３線
維芽細胞中の３Ｈ−チミジンとり込みの刺激を示す。照
射ＯＨＣ抽出物は６９０μｇ／ｍｌｌのタンパク質含量
を示す（＝）。非照射ＯＨＣ抽出物は６７０μｇ／ｍ１
のタンパク質含量を示す（−−−）。横軸はＯＨＣ抽出
物の濃度をμｌ／２．５Ｉ１１−培地で示す、縦軸は３
Ｈ−チミジンのとり込みをｃｐｏＩで示す。

第９図はレンコル（Ｌｅｎｃｏｌｌ、　（登録商標）〕
、レンホス［Ｌｅｎｐｈｏｓ　　（登録商標）］、レン
ソル（Ｌｅｎｓｏｌ　（登録商標）〕、レンソル凝集体
（Ｌｅｎｓｏｌａｇｇｌｏｍｅｒａｔｅｄ）　、オス・
プルビット（Ｏｓｓ　Ｐｕ１ｖｉｔ）、ミツビシ・クツ
キー（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ　Ｃｏｏｋｉｅｓ）　、オ
ステオトロフインク・コンセントレート、カンゾカル（
Ｃａｎｚｏｃａｌ）　、Ｐ　Ｍ　ＣおよびＯＨＣによる
３Ｔ３線維芽細胞上の３Ｈ−チミジンとり込みの刺激を
示す。横軸は試験した試料中の濃度をμＩ！／ｍｌ−培
地で示し、縦軸は３Ｈ−チミジンとり込みをｃｐｍで示
す。

調べた細胞生物学系中、単にＯＨＣおよびＰ）ＩＣ並び
にレンコル（登録商標）のみが活性である。

調査した生成物各１ｇをＰＢＳｌｏｍｆで抽出し、遠心
分離上澄みの一部を試験した。

第１０図はビタミンＤ２、グルコン酸カルシウムによる
、およびＯＨＣによる処置１４月後の骨皮質厚さの変化
率を示す。ビタミンＤ２と比較するとＯＨＣを用いたと
きに１１．６％の増加がある。

第１１図は２年の期間にねたりＯＨＣで処置しか患者（
−）および対照（−−−）中の撓骨鉱物含量ＢＭＣの平
均変化をｇ　／　ｃｔｎで示す、標準偏差がバーにより
示されている。

第１２図は２年の期間ＯＨＣで処置した患者（−）およ
び対照（−−−）中の海綿質（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒｂ
ｏｎｅ）体積（ＴＢＶ）および腸骨稜の皮質厚さくＣＰ
Ｔ）の平均変化を示す。標準偏差がバーにより示されて
いる。

第１３図中縦軸は３Ｈ−チミジンとり込みをｃｐｍで示
し、横軸は調べた試料の濃度をμｇ／２００μｌ−培地
で示す。

本発明は実施例により一層詳細に例示される。

実施例１ ０８Ｃの製造（方法１〉 約３刃金の子牛（ｂｏａ　ｔａｕｒｕｓ）の長管（上腕
骨、大腿骨、脛骨、撓骨および尺骨、中手骨および中足
骨）を出発物質としてＯＨＣの製造に用いる。

動物は公認獣医により検査される。次いでそれを屠殺し
て骨をとり出す。骨をとり出しだ後清浄な骨を速やかに
冷凍し、後の処理まで−２０〜−３０℃で貯蔵する：第
１図、囲枠１参照。

それを後に処理する前に、骨と新鮮さくその臭および色
により識別できる）、清浄さについて検査し、それらが
真に必要な骨であることを確認すく。肉、股および軟骨
残留物を除去する。

方法の第１段階において凍結骨１６００ｋｇ（１バツチ
）を、２０ｍｍ綱目を有するステンレス鋼製粉砕機中で
粉砕する。粉砕した骨の粒子の大きさは約１ｃｍである
。骨の温度は粉末中０℃以下に維持される；第１図、囲
枠２参照。

次いで粉砕骨をステンレス鋼羽根付乾燥器中で０．９７
〜０．９８バールの圧力で脱水する。熱水は初め約９０
℃の温度であり、乾燥の過程中に約４０℃に低下される
。それ以上水が凝縮物捕集器中へ留去しなくなると（乾
燥開始後約１０時間）、加熱を中止し骨組酸物をさらに
減圧下に、残留水分が最大約１０％（第１図、囲枠３ａ
参照）または１０〜２５％（第１図、囲枠３ｂ）になる
まで乾燥する。この後者の乾燥操作における骨組酸物の
温度は４０℃を越えてはならない。

次いで乾燥管組成物をクエン酸でｐｕｓ、ｏ〜５．５に
する。次に乾燥管組成物を再度８０〜２０℃で脱水し、
脂質を除去する。このためアセトンを親水性かつ親油性
溶媒として用いるか、または乾燥管組成物を初めに２０
〜８０℃の温度においてアセトンで、次に第２操作で２
０〜８０℃においてトリクロロエチレンを用いて脱脂す
る。残留水分および残留脂肪含量が最大５％である骨組
酸物が得られる（第１図、囲枠４ａおよび４ｂ参照）。

次いで溶媒残留物を渦流で２０〜８０℃、９０ミリバー
ルで除去する。残留溶媒含量は約１％である（第１図、
囲枠５参照）。

生じた骨組酸物をハンマーミル中で２Ｘ２０ｎスロツト
付ふるい中で粉砕し、上部ふるいが２．４１層の網目大
きさを存し、下部ふるいが０．３４璽鳳の網目大きさを
有する篩別機でふるう。２．４ｎふるい上に保持される
物質は廃棄し、０．３４鶴ふるいを通ったものは後に使
用される。０．８ｕ目網を挿入した粉砕機中で再度粉砕
し、０．７４１１の網目大きさを有するふるいと０．３
４ｍの網目を有するふるいを有する篩別機でふるう。０
．７４　ａｘふるい上に保持される物質を廃棄する。０
．３４ｉｏａふるいを通った物質を捕集し、再度０．８
　ｚｍｍ綱網挿入した粉砕機中で粉砕する。次いで上記
のようにふるいにかける。最後に粉末を捕集し、０．２
５　ｘ重の網目大きさを有するふるいを用いて篩別け、
０．５　ｗ目線を挿入した粉砕機中で粉砕する。次いで
全粉末を０．２５ｆｌの網目大きさのふるいに通す（第
１図、囲枠６参照）。

表■は生じたＯＨＣ粉末の分析値の摘要を示す。

表　　■ 分析でＯＨＣ組成物が１０，０００微生物毎ダラム以上
を含有することが示されれば、組成物をエチレンオキシ
ドで処理することにより、またはガンマ線による照射に
より滅菌する（第１図、囲枠ｌＯ〜１２参照）。

製剤組成物の製造に適するＯＨＣが得られる（第１図、
囲枠１３参照）。

実施例２ ０ＨＣの製造（方法２） ｌｅａの最大粒径を有する粉砕管組成物を実施例１にお
けるように調製する。次いでこの骨組酸物をクエン酸で
ｐＨ５，０〜５．５になし、さらに実施例１におけるよ
うに処理する。

表■に示す分析値を有するＯＨＣ＆Ｉｌ成物が得られる
。

表　　■ 実施例３ ３Ｔ３線維芽細胞中の３Ｈ−チミジンとり込みのＯＨＣ
による刺激 スイスマウス３　Ｔ　３　綿維芽細胞〔フロー・ラボラ
トリーズ（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）製〕
をＤＭＥＭ〔ダルベツコの変性イーグル培地、ベーリン
ガー、マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈ
ｅｉｍ）製〕、中で培養する。培地は初めに濾過滅菌前
にＣＯ□でｐＨ６，６にした後ペニシリン１００単位／
ｌ１ｌｌｌ、ストレプトマイシン１００■／ｍ１　（と
もにベーリンガー、マンハイム製）およびＮａＨＣＯｚ
　　（メルク、ダルムシュタット（Ｍｅｒｃｋ、　Ｄａ
ｒｍｓｔａｄｔ）製）３．７ｇ／ｊ２を補足する。さら
に培地は細胞培養のために１０％ウシ胎児血清（ベーリ
ンガ、マンハイム製）を補足する。サブコンフルエント
（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）培養を５％ＣＯ□圧下に
３７℃で９０１ｍペトリ皿中に成長させ、細胞を４Ｘ１
０’細胞毎１０ｎｊ！培地毎ペトリ皿の初期接種で週２
回継代培養する。

下記研究のそれぞれにおいて３〜２０！！代の細胞を用
いる。

３Ｈ−チミジンとり込みに対する検定はエル・ジメネズ
・デ・アスア（Ｌ、　Ｊｉｍｅｎｅｚ　ｄｅ　Ａｓｕａ
）ほか〔プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ）　、７２巻（１９７
５）　、２７２４〜２７２８頁〕により記載されたよう
に行なう。上記保存培養からのスイスマウス３Ｔ３線維
芽細胞を、０．０５％トリプシン１０．０２％ＥＤＴＡ
の無菌溶液を用いてトリプシン処理する。細胞を再びＤ
ＭＥＭ／１０％ウシ胎児血清中に４Ｘ１０’細胞／ｍｌ
の濃度に懸濁させる。細胞懸濁液１　ｍｌを１．９（Ｊ
”マイクロタイタープレート上で培養する。細胞を培地
の変更なくさらに４日間インキュベートし、静止非増殖
細胞の集蜜的細胞単層を作る。次いで培地を吸出し、ウ
シ胎児血清のない新培地１　　ｍｌで置換し、試験する
試料もまた加える。

実施例１または２において製造したＯＨＣ１ｇをＭｇお
よびＣａのないリン酸塩緩衝食塩水（ＫＣｌＯ，２ｇＳ
Ｍａｃ１８　ｇＳＮａＨＰＯ＊”　１２８ｚ０２、７　
ｇ　−ＫＨｚＰＯａ　０．２　ｇ毎すットル）１０ｍｊ
？中に懸濁させる。室温で２時間ふりまぜた後、試料を
２０００　Ｘｇで１５分間遠心分離する。

遠心分離後に得られる中性可溶化ＯＨＣ成分を含む透明
上澄み２〜５００μｍ部分を次いで上に得られた３Ｔ３
線維芽細胞培養に加える。

ブランクの測定には、同一量の新培地のみを培養に加え
る。陽性対照としてウシ胎児血清２〜２００μｌを加え
る。検定する培養は、最後に５％Ｃｏｔ圧下に３７℃で
２０時間インキュベートし、次いで３Ｈ−チミジンでパ
ルスする。細胞は１μＣｉ　　（メチル−Ｈ）チミジン
〔アマジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、　ＩＪＫ）製〕およ
び０．９μｇメチルチミジン〔シグマ（Ｓｔｇｍａ、　
ＵＳＡ）製〕を含む無菌チミジン水溶液１０μｌ／ｒｔ
ｒｌ！培地毎ウエルを加えることにより放射性標識する
。３Ｈ−チミジンを加えた後上記条件下にさらに４時間
インキュベートする。

次いで試料をシンチレーション計数にかける。

培地を吸出し、細胞層を０．０２％Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　／
ＰＢＳ溶液０溶液０．５アｊ！する。細胞が十分離れる
まで上記のように細胞をトリプシン処理する。）ぢ濁し
た細胞をマイクロタイターダイナチク・マルチマツシュ
（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　ｍｕｌｔｔｍａｓｈ）装置中で処
理し、それらは自動的にガラス微小繊維フィルター〔ワ
ンドマン（Ｗｈａｔｍａｎ）　９３４−　Ａ　Ｈ）に移
される。

装置は次のようにプログラムされる： （ｉ）ＰＢＳ洗浄：（ｉｉ）５％トリクロロ酢酸（メル
ク、ダルムシスタット類）による沈殿：（ｉｉｉ　）エ
タノール固定、ガラス微小繊維フィルターを乾燥し、シ
ンチレーションバイアルに移す。

液体シンチレーションカクテル〔ｌ：３比のトリトンＸ
−１００／）ルエン１１中にパーマブレンド、パソカー
ド（Ｐｅｒｎ＋ａｂｌｅｎｄ　Ｐａｃｋａｒｄ）　　７
　ｇ　　（メルク、ダルムシュタット）製）を加え、試
料の放射能をＬＫＢ−ワラツク（Ｗａｌｌａｃ）　　１
２１７ラツクベータ（Ｒａｃｋｂｅｔａ）液体シンチレ
ーションカウンター中で壊変毎分として測定する。

ＯＨＣによる最大刺激は単にウシ胎児血清で達成され゛
た最大刺激の〃に達するだけである。しかし、ウシ胎児
血清がＯＨＣ抽出物より約６０倍も多い全タンパク質を
含むことを想起しなければならない。従って、３Ｈ−チ
ミジンのとり込みはウシ胎児血清を用いるときより有意
に高い程度に使用ＯＨＣ抽出物により刺激される。ＯＨ
Ｃを用いて得られた測定結果は第３図に要約される。

記載した検定系はまた実施例１または２により得たＯＨ
Ｃ組成物の質の測定に使用できる。ウシ胎児血清を陽性
対照として、一方細胞生物検定系における内部照合とし
て、および他方ＯＨＣ試料で得られた値に対する参照と
して用いるとき、ＯＨＣ組成物の生物学的活性の確認に
対する活性単位を規定し、示すことができる。これはＯ
ＨＣ組成物の生物学的活性の標定を可能にする。

実施例４ ３Ｔ３線維芽細胞およびヒト包皮線維芽細胞におけるＬ
−（５−’Ｈ）−プロリンとり込みのＯＨＣによる刺激 培養細胞のプロリンとり込みは、実施例３におけるよう
に、しかし既に記載した細胞培養系中の３Ｈ−チミジン
の代りにＬ−（５−”Ｈ）−プロリンを用いて測定する
ことができる。この検定は培養細胞によるタンパク質の
合成速度を測定し、細胞により吸収された放射能の測定
および定量化により０ＨＣ）Ｊｌ成物の生物学的活性を
決定することができる。第４図はＯＨＣによる３Ｔ３繊
維芽細胞中のＬ−（５−”Ｈ）−プロリンとり込みの刺
激を示す。

第４図はＯＨＣＭｉ成物が調査した細胞中のタイバク質
合成速度を実質的に増すことを示す。

実施例５ ウシ軟骨細胞培養に対するＯＨＣの中性可溶化成分の効
果 常法でウシ胎児の置端軟骨から軟骨細胞を分離する。各
場合に１０％ウシ胎児血清を補足したＦ１２培地１　ｍ
ｌで５０，０００細胞を４〜６日間にサブコンフルエン
トに成長させる。実施例３におけるように、生じた細胞
培養を実施例１または２により得られたＯＨＣ組成物３
４／４で処理する。

次いで細胞を実施例３におけるように３Ｈ−チミジンで
パルスし、とり込まれた放射能を測定する。

第５図は第１試験の結果の要約を与える。ウシ軟骨細胞
による３Ｈ−チミジンのとり込みは物質０ＨＣ３４／４
の用量に対する応答で示される。

調べた０ＨＣ３５／４が全タンパク質合成およびコラー
ゲン合成の速度を刺激することは第６図および第７図か
ら明らかである。

３４／４および３５／４はバッチ連続番号を示す。

実施例６ 試験管内の骨細胞集団に対するＯＨＣの中性可溶化成分
の効果 実質的にコーン（Ｃｏｈｎ）はか〔シモンズはか（Ｓｉ
ｍｍｏｎｓ　ａｎｄ　Ｋａｎｉｎ）Ｉ、骨格研究、試験
アプローチ（Ｓｋｅｌｅｔａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　
ａｎ　Ｅｘｐｅｒｉ＋ｎｅｎｔａｌＡｐｐｒｏａｃｈ）
　、アカデミツク・プレス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓ
ｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃ
ｏ、　Ｌｏｎｄｏｎ）　〜３〜２０頁〕により記載され
たように、種々の骨細胞集団を１日令ウィスター（Ｗｉ
ｓｔａｒ）ラット頭蓋上から逐次時間依存性酵素消化手
順により分離するが、しかしヒアルロニダーゼ０．０５
％を追加酵素として、コラゲナーゼおよびトリプシンと
ともに用いて骨組織から細胞を遊離させる。

２０分の消化中に遊離された種々の細胞集団は個々の細
胞画分が得られる順序に相応するローマ数字で表わされ
る。頭蓋冠から遊離される最初の細胞集団はＩと称され
、消化の１時間の過程で遊離される最後の細胞画分はＬ
と標識される。機能試験は集団Ｉ〜■がおそらく前原性
（ａｓｔｅｏｐｒｏｇｅｎ　１ｔｏｒ）細胞プール（全
骨芽細胞様）の細胞に相当することを示唆する。細胞集
団■〜■は骨芽細胞様特性を有する特徴を示し、細胞集
団■Ｌと称されるものは静止骨芽細胞様細胞またはおそ
らく骨細胞様細胞とみなすことができる。

１．５Ｘ１０５細胞／ｍ１７のウシ胎児血清補足Ｍ　Ｅ
　Ｍ培地〔アール塩（Ｅａｒｌｅ’　ｓ　５ａｌｔｓ）
）の懸濁液１０ｍ１を２５０ｄ組織培養フラスコ中で培
養する。５％Ｃ０２圧下に３７℃で９〜ｌＯ日間インキ
ニベートした後集蜜的細胞層が得られ、それを０．２％
トリプシンで懸濁液にする。細胞を４００Ｘｇで７分間
遠心分離することにより回収する。

生じた細胞ペレットを２０％０％ウシ胎清および１０％
ＤＭＳＯ補足Ｍ　Ｅ　Ｍ培地中に再懸濁させ、次いで懸
濁液を後に使用するまで液体窒素中で凍結する。

個々の凍結骨細胞集団を注意深く３７℃にあげ、２０％
０％ウシ胎清補足ＭＥＭ４０ｄ中に吸収させる。それを
４００Ｘｇで７分間遠心分離し、生じた細胞ベレットを
１０％０％ウシ胎清補足新培地中に再び懸濁させ、９６
ウエルマイクロタイタープレート中で７〜ｌ０ＸＩＯ３
細胞毎ウエルの密度で培養する。細胞は２日間培養する
。第３日に培地を１％または２％ウシ胎児血清を含む培
地により置換する。２４時間インキュベートした後、培
地を再び１％または２％ウシ胎児血清、０．５μＣ１３
Ｈ−チミジン／ｒｎｌおよび種々の濃度の中性可溶化Ｏ
ＨＣ成分を含む新培地で置換するＣＰＢＳ適量を対照溶
液に加える。

種々の骨細胞培養が実際にマイトジェンに応答すること
を確認するためにＥＤＧＦ　（上皮成長因子）を用いて
試験を行なう。骨細胞培養を、３Ｈ−チミジンを含む培
地で上記条件下に２４時間インキュベートする。次にと
り込まれた３Ｈ−チミジンの量を実施例３におけるよう
に測定する。

試験結果は表■に要約され、各値は５試験で得られた平
均を表わし、標準偏差とともに示される。

ＰＢＳ中に溶解したＯＨＣ成分は２００μｌの全培地体
積に対し５〜５０μｌの量で培地に添加する。

表　　　■ １％または２％ＦＣ３の存在下の中性可溶化ＯＨＣ成分
ＶおよびＸによる刺激に対する３Ｈ−チミジンとり込み
表　　■　（続き） ＊ＦＣ３＝ウシ胎児血清 表■から、中性可溶溶性ＯＨＣ成分がＰＢＳで処理した
対照培養に対照して骨細胞集団Ｖおよび■の増殖を刺激
することが明らかである。骨細胞集団Ｉおよび■は反応
を示さない。結果は第１３図にグラフで示される。

実施例７ 表Ｖに中性可溶化ＯＨＣ成分（ＯＨＣＸ）の作用をラッ
ト皮膚線維芽細胞で検定した試験の結果の要約が示され
る。

表　　　Ｖ 種々の濃度の０ＨＣＸに対する応答におけるラット皮膚
線維芽細胞の：ＩＨ−チミジンとり込みｎｏ　ＦＣＳ　
　　　　　　　　　　４５０　±２９＋１５μＩ　ＰＢ
Ｓ　　　　　　４８５±３８＋　　７．５　、ｌ　ＯＨ
ＣＸ　　　　３４３±１８＋　１５．０μｌ　ＯＨＣＸ
　　　　５８２±４２＋　３０．０μｌ　ＯＨＣＸ　　
　　６１８　±１６１χＦＣ５−９１７±８５ ＋１５μＩ　ＰＢＳ　　　　　　９２１　±３３＋７．
５μｍ　０ＨＣＸ　　　　６０６±３２＋　１５．０　
／７１０ＨＣＸ　　　　６４３±３３＋　３０．０　μ
ｌ　ＯＨＣＸ　　　　７８３　±７９２χＦＣ３−１０
５１±２３ ＋１５μＩ　ＰＢＳ　　　　　　１１２７　±５１＋　
　７．５　、ｌ　ＯＨＣＸ　　　　１０５９　±３８＋
　１５．０　、ｌ　ＯＨＣＸ　　　　９２０±３５＋　
３０．０μｌ　ＯＨＣＸ　　　　１１４０±５７表Ｖに
要約される結果から、ラット皮膚線維芽細胞を０ＨＣＸ
により刺激できないことを知見することができる。

表■に要約された試験結果と表Ｖに要約された試験結果
とを比較すると、０ＨＣＸの観察されたマイトジェン活
性が骨芽細胞に特異的であることが明らかになる。

実施例８ 照射ＯＨＣの生物学的活性の測定 実施例１または２におけるように製造したＯＨＣを２５
　ＫＧｙ　（２，５Ｍｒａｄ）で照射する。試験を実施
例３におけるように行なう、結果は第８図に示される。

第８図に照射および非照射ＯＨＣのＰＢＳ抽出物の種々
の量を用いた刺激る対する３Ｔ３線維芽細胞によりとり
込まれた３Ｈ−チミジンの結果が要約される。第８図か
ら照射がＯＨＣの生物学的活性に影響を与えないことを
知見できる。

実施例９ 同領域の指標に対するＯＨＣの効果と公知製剤の効果と
の比較 検定する物質各１ｇをねじふたバイアルに秤取し、ＰＢ
３１０ｍＡを加える。室温で２時間ふりまぜた後、ＭＳ
Ｅテーブル遠心分離機中で３６００ｒｐ＋ｗで１０分間
遠心分離する。透明上澄みをデカントし、沈殿を廃棄す
る。溶液のタンパク質含量をプラトフォード（Ｂｒａｄ
ｆｏｒｄ）　　（アナリティカル・バイオケミストリー
（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　、７２（１９７６
）　、２４８頁〕による記載のように測定する。３Ｔ３
線維芽細胞中の３Ｈ−チミジンのとり込みを実施例３に
おけるように刺激して評価する。

表■に比較した製剤およびその抽出性タンパク質含量が
要約される。

表　　　■ １１０２タンパク　　　　　Ｕ レンコル（Ｌｅｎｃｏｌｌ■）　　　　　　　　　　３
３０　　ｐｇレンホス（Ｌｅｎｐｈｏｓ■）　　　　　
　　　　１０５　μｇレンソル（Ｌｅｎｓｏｌ■）　　
　　　　　　　３８５０　　ｐｇ′α叩１氏８、。ｍｅ
ｒａ　Ｌｅｄ） ４２００　　　μ　ｇ オスプルビット（Ｏｓｓｐｕｌｖｉｔ■）　　　　　　
２４　μｇミツビシ・クツキー　　　　　　　　　　８
２　μｇ（旧ｔｓｕｂｉｓｈｉ　Ｃｏｏｋｉｅｓ■）Ｐ
ＭＣ■）　　　　　　　　　　　　　　４００８ｇオス
テオトロフィック・　　　　　　　　　２２　μｇコン
セントレート カンゾカル（Ｃａｎｚｏｃａｌ■’）　　　　　　　　
２　Ｂ、　５μｇＯＨＣ（本発明）　　　　　　　　　
　　６００　μｇ試験結果は第９図に要約される。不活
性物質はブランクと区別できず、従って示すことができ
ない。

第９図からＯＨＣがＤＮＡ合成の刺激において他の製品
より著しく優れていることを知見できる。

実施例１０ 動物試験における骨の治癒に及ぼすＯＨＣの効果骨の治
癒に及ぼすＯＨＣの効果は６０成ウサギは用いた研究で
確認される。精密工学を用いて両膝関節の遠位大腿骨端
中に大きさおよび位πの等しい軟骨／骨欠損を導入する
。

動物は無作為に各１５動物４群に分ける。非処置群が対
照の役目をする。第１群は毎日０ＨＣ８３０■（カルシ
ウム１７８．０■）を与え、第２群は毎日灰化０ＨＣ５
１０■（すなわち活性有機成分のない骨鉱物、カルシウ
ム１７８．９■）を与え、第３群は毎日炭酸カルシウム
６５０■（カルシウム１８９．７■）を与える。表■に
試験設計が詳記される。

１−一二！ 試験設計 欠損の導入後７日〜２３日に動物を一連の螢光標識で処
置する。５動物を５週、８週および１２週後にそれぞれ
解剖する０組織学切片を螢光顕微鏡で骨欠損の領域中の
切片平面の標準化位置および解像力で調べる。顕微鏡写
真を螢光強度、欠損充填の性質および程度、並びに新管
成長の構造に暴く指数点茶で評価する０表■に結果が示
される。

表−一−１ 異なる処置および試験持続期間による合計指数点の平均
および標準偏差 ０１１Ｃ２４，３±４．８　　３１．８±１．１　　３
４．３±２．４０ＩＣ２４，４±４．２　　２８．２±
４．１　　２５．０：１２．８（灰化） ３処置群は非処置対照群より有意に改良された無機質化
を示す。他の２活性処置とは対照的にＯＨＣによる療法
は骨欠損の治癒に著しい改良を生ずる。

ＯＨＣおよび灰化ＯＨＣで得られた試験結果を比較する
と、有機成分が破壊されるとＯＨＣの有利な効果が失な
われることが明らかになる。

実施例１１ 動物試験における関節軟骨細胞の超微細構造に及ぼすＯ
ＨＣの効果 コルチコイド損傷後、関節軟骨細胞超微細構造に及ぼす
ＯＨＣの効果をラットによる一連の生体内試験で調査し
た。定量的評価は新興現性形態測定の使用により行なう
ことができる；アンネフエルド（Ｍ、　Ａｎｎｅｆｅｌ
ｄ）、　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｔｉ５ｓ、　Ｒｅａｃ、、■
巻〔４〕、（１９５８）、２７３〜２８９頁参照。

試験は５おすウィスターラフト３群で行なわれる。第１
群は対照群であり、処置されない。第２群はデキサメサ
ゾンを筋肉内に投与し、第３群はデキサメサゾンを筋肉
内およびさらにＯＨＣを経口で与える。試験設計は表■
に要約される。

群　　　　　　　　用量毎動物　　所与薬物　　調査持
続　動物毎週　　　　用量全数　　期間　週　　数ｉ、
ｍ、　＝筋肉内、　　ｐ、ｏ、−経口５週間処置した後
動物を解剖する。両膝関節の大腿骨および脛骨から全軟
骨組織を切除し、組織を電子顕微鏡検査のために調製す
る。各動物から５０軟骨細胞を形態測定学的に分析する
。

対照に比べてデキサメサゾンで処置した動物はその関節
軟骨細胞の小胞体の長さおよびゴルジ装置の全表面の低
下を高軟骨細胞死亡率とともに示す。この電子顕微鏡所
見はコルチコステロイドによる関節軟骨細胞に対する損
傷の明らかな証拠である。

ＯＨＣで追加処置した動物はその関節軟骨細胞中の小胞
体およびゴルジ装置の表面の非常に小さい低下を示す。

ＯＨＣはデキサメサゾンで増加した軟骨細胞の致死率を
対照水準以下にまで低下し、同時にＯＨＣはまたミトコ
ンドリアの全表面および数を増加する。これらの所見は
経口投与後ＯＨＣが軟骨細胞の代謝を増加する事実を示
す。表Ｘは試験結果の要約を示す。

１−及 ５週継続試験後軟骨細胞超微細構造の 形態測定的測定 デキサメサゾンおよびＯＨＣの影響： １＝対照と試験群との間に統計的に有意な差異２＝デキ
サメサゾン処置群とデキサメサゾンおよび療法の両方を
与えた群との間に統計的に有意な差異 ｐ＝０．０１、　　ｎ＝２５０毎群 この試験から試験管内の０ｌ−ＩＣによる細胞生物学試
験で得られた結果（実施例３〜６参照）もまた生体内で
その有効性を保持することを知見することができる。さ
らに、結果はＯＨＣがコルチコステロイドの軟骨および
骨細胞に対する負効果を細胞代謝の調整により防ぐこと
を示す。

実施例１２ 骨治癒の支持に対するＯＨＣの使用 プラシーボに対する骨折治癒におけるＯＨＣの影響を二
重盲検法で臨床的に調べる。

無作為化した後脛骨幹骨折８５症例を２投薬法の１つで
６週間処置する。表ＸＩに患者の年令および処置の型の
概観が示される。

表−一旦 〉５５才　　　　１３１３ 〈５５才　　　　３６２３ 脛骨幹骨折の硬着は次のパラメーターにより決定される
： ａ）骨折部位における不動性状態 ｂ）　痛みの有無 Ｃ）骨折端の可動化 ｄ）骨折端の最大装填 ｅ）放射線所見 年長患者の場合には、ＯＨＣ処置による硬着は約１１週
後に、すなわちプラシーボを用いたとき（１４，２週、
ｐ＜０．０５）よりも著しく速やかに生ずる。若年患者
の場合には、差は統計的に有意でない（１２，５週対１
１．５週）。これらの試験結果から、プラシーボ群の場
合に外科を必要とする治癒中の合併症の数が３倍も高い
ことを想起すれば、ＯＨＣが指図骨折治癒を促進するこ
とが明らかである。

実施例１３ ０ＨＣによる骨粗〃症の治療 制御研究において、コルチコイド誘発骨粗鬆症に対する
ＯＨＣの影響を調査する。

リウマチ性関節炎の治療にコルチコステロイドを受けた
少くとも５０才の６４患者を治療のために統計的に等し
い群に無作為化する。群１中の患者はその通常の治療に
加えて毎日０ＨＣ４，９ｇを与える。群２の患者にはＯ
ＨＣを投与しない。

処置期間の終りに幹高さ減および撓骨骨密度の低下がＯ
ＨＣ処置群において対照群より著しく低い。他のパラメ
ーター例えば尺骨骨密度および背痛が同様にＯＨＣ処置
群において対照よりも非常に改良されるが、しかし統計
的有意に達しない。

結果は表Ｘｆｆに要約される。

ｎ、ｓ、　”有意差なし ＯＨＣによる治療はまたステロイドで治療されたリウマ
チ患者における骨減少症の進行の防止に十分である。こ
の研究からＯＨＣ治療が全身性コルチコステロイド治療
を開始するとすぐ骨減少症め発生を示す臨床症状を待た
ないで開始すべきであることが明らかである。

実施例１４ カルシウムと比較したＯＨＣによる骨粗髭症の治療 臨床研究において、ビタミンＤ、　、ＯＨＣおよびグル
コン酸カルシウム原発性肝硬変に対する療法の一部とし
ての効果を調べる、後者の状態は速やかな骨減量を生ず
る。

ビタミンＤ２は原発性肝硬変で骨粗鬆変化を有する６５
名の閉経期後婦人に非経口投与される。

この患者の集団を統計基準で３群に分ける。第１群は２
２患者を含み、ビタミンＤ２のみ（対照）を与える。第
２群を形成する２１患者はそのビタミンＤ２療法に加え
て毎日０ＨＣ６，６ｇを与える。

２２患者の第３群は第２群の患者に与えたＯＨＣに等し
い用量で、すなわちグルコン酸カルシウムの４沸騰錠剤
毎日でカルシウムを与える。

療法１４月後、ビタミンＤ２による非経口治療が単独で
、中手骨指数により測定して骨ｍｔの阻止に十分でない
こと、さらにビタミンＤ２とグルコン酸カルシウムとの
組合せが単にかろうじてその後の骨ｆＩｉ量の停止に十
分であること、およびビタミンＤ２とＯＨＣとの組合せ
のみが対照に比べて骨皮質に統計的に有意な１１．６％
の増加を生じたことが確認される。試験結果は第１０図
に要約される。これらの試験結果はＯＨＣが単なる純カ
ルシウム製剤でないことを示す。

実施例１５ ０ＨＣによる骨粗髭症の治療 慢性活性自己免疫肝炎に対して少くとも１年間のプレド
ニソロンおよびアザチオプリンによる治療下にあった３
６患者を統計的基準で２群に分ける。第１群中の１８患
者は毎日０ＨＣ６，６ｇを２年間与え、対照群中の１８
患者はＯＨＣを与えない。

試験結果は光デンシトメトリーおよび骨生検により得ら
れる。２年後、対照群は撓骨の鉱物含量ＢＭＣＣｒ単」
光デンシトメトリー）および腸骨稜の皮質厚さＣＰＴ　
（骨生検）に統計的に有意な低下を生じた（第１１図お
よび第１２図参照）。

骨生検で対照群中に海綿質体積（ＴＢＶ）の明らかな低
下があったことが認められる（第１２図参照）。一方、
ＯＨＣ療法の場合に撓骨の鉱物含量は一定に保持され（
第１１図参照）、海綿質体積が増加し、皮質厚さの低下
は対照群におけるより統計的に小さい（第１２図）。治
療２年間の間に、対照群の３患者が推骨変形を示し、Ｏ
ＨＣ群は１患者も示さない。５患者はムニエル（Ｍｅｕ
ｎｉｅｒ）により仮定された「推骨骨折域値」以下の１
１％±３％の海綿賞体積（ＴＢＶ）を示したが、しかし
ＯＨＣで治療した危険４患者のいずれも椎骨骨折を生じ
ない、しかし対照患者（ＴＢＶ＞１６％）中の３患者は
ＴＢＶ水準の１１％への低下を伴なって推骨変形を示す
。

実施例１６ 卵巣摘出後のＯＨＣの効果 遡及的に制御された研究において、普通の骨特異性パラ
メーター（アルカリ性ホスファターゼの骨特異的アイソ
エンザイムー骨芽細胞標識；尿中のヒドロキシプロリン
−破骨細胞標識；「酒石酸塩耐性」酸性ホスファターゼ
−破骨綿ζ胞標識）を用いると、一方で血清中の酵素水
準が卵巣摘出の直後に鋭敏に上昇しく高く強い骨交代の
徴候）、他方、９月間毎日０ＨＣ７，５ｇによる治療が
高い骨交代水準を規格化し、それにより危険を低下する
ことが示される。生物化学的所見に平行して骨増加がＯ
ＨＣを投与したときに認められ、これは中手骨指数によ
り測定することができる。治療前に測定された１年当り
１．１±０．６％の皮質骨減量がＯＨＣ療法の場合に１
年当り０．２±０．３％の統計的に存意な陽性増加に変
化する。

実施例１７ 明らかな骨粗鬆症におけるＯＨＣの効果のコンピュータ
ー断層撮影測定 骨粗鬆症患者１１名（男性２名、女性９名）を２年間毎
日０ＨＣ７，５ｇで治療し、定量コンピューター断層撮
影を用いて調べる〔ルグセガー（Ｐ。

Ｒｕｅｇｓｅｇｇｅｒ）ほか、ジャーナル・オブーコン
ピューター・アシステツド・トモグラフィー（Ｊ、　Ｃ
ｏｍｐｕｔ。

Ａｓ５ｉｓｔ、　Ｔｏｍｏｇｒ、）、５　　（１９８１
）　、３９４〜３９０頁参照〕。患者の年令構成に基き
、海綿質密度を平均すると毎年２．７％の減量が予想さ
れる。

しかし、ＯＨＣ療法の場合に、事実上すべての処置患者
が海綿状骨質量の小増加を示すことが認められる。その
ような増加は他にフッ化ナトリウム療法の場合にのみ認
められるが、しかし後者の場合に、効果はそれほど規則
的かつ連続的でなく、若干の患者（応答者）にのみ認め
られた。最近の結果〔ダンバッハ−（Ｍ、　Ａ、Ｄａｍ
ｂａｃｈｅｒ）ほか、ボーン（Ｂｏｎｅ）　？、１９９
〜２０５頁参照〕は骨粗鬆症の標準療法（フン化ナトリ
ウムまたはフン化ナトリウムとカルシウムの組合せ）が
疾患の進行を阻止できない（骨減量を完全に抑制できず
、椎骨圧迫骨折速度が増す）ことを示す。非処置患者に
おける自然海綿質増加は今まで決して認められなかった
。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１におけるＯＨＣを製造する図式を示し
、 第２図は実施例２におけるＯＨＣを製造する図式を示し
、 第３図はＯＨＣ抽出物による３Ｔ３線維芽細胞中の！Ｈ
−チミジンとり込みの刺激を示すグラフであり、 第４図はウシ胎児血清（−−−）およびＯＨＣ成分（＝
）による３７３線維芽細胞中のＬ−（５−３Ｈ）−プロ
リンのとり込みの刺激を示すグラフであり、 第５図はウシ軟骨細胞中の２Ｈ−チミジンとり込みの刺
激を０ＨＣ３４／４の用量の関数として示すグラフであ
り、 第６図は単層培養中の軟骨細胞のコラーゲン合成の刺激
および全タンパク質をＯＨＣ？Ｍ度の関数として示すグ
ラフであり、 第７図は全タンパク質中のコラーゲン含量の増加パーセ
ントをＯＨＣの関数として示すグラフであり、 第８図は照射および非照射ＯＨＣ抽出物による３Ｔ３線
維芽細胞中の３Ｈ−チミジンのとり込みの刺激を示すグ
ラフであり、 第９図はＯＨＣおよび公知製剤による３７３線維芽細胞
の３Ｈ−チミジンとり込みの刺激を示すグラフであり、 第１０図はビタミンＤ！、グリコン酸カルシウムおよび
ＯＨＣによる処置１４月後の骨皮質厚さの変化率を示す
グラフであり、 第１１図は２年゛間にわたりＯＨＣで処置した患者（−
）および対照（−−−）中の撓骨鉱物含量ＢＭＣの平均
変化を示すグラフであり、 第１２図は２年間ＯＨＣで処置した患者（−）および対
照（−−−）中の海綿質体積（ＴＢＶ）および腸骨稜の
皮質厚さくＣＰＴ）の平均変化を示すグラフであり、 第１３図は３Ｈ−チミジンのとり込みと試料の濃度との
関係を示すグラフである。 ３日−フ゛ロリン Ｆｉｇ、　　ｔ＋ Ｃヨー １　　　　　　％　　全タンパク賞中のコラーデン時開
（′４） Ｆｉｇ、１１ Ｆｉｇ、　１２ 骨和胞軍団

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）次の乾燥物質分析パラメーター： 官能検査：細粒〜多少粒状、ベージュ〜灰色粉末弱い自
   然臭 アイデンティティ：−カルシウムおよびホスファターゼ
   、確認−コラーゲン、確認 水分：＜７％ 全灰分：５１．３−６２．７％ カルシュウム：１９．２−２３．６％ リン：８．９−１０．９％ コラーゲン：２３．４−２８．６％ 非コラーゲン性タンパク質／ペプチド：７．２−１０．
   ８％微量元素：Ｆ、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｃｕ
   およびＮｉ、確認ホスファターゼ活性：０．５−１５ｍ
   Ｅ／ｍｇ異常毒性：不耐性の徴候なし 全微生物含量：＜１０＾４／ｇ 酵母／かび：＜１０＾２／ｇ 腸内細菌：＜１０＾２／ｇ 特異微生物種：存在せず に特徴があり、次の生物学的活性： （ａ）骨芽細胞、軟骨細胞および線維芽細胞のＤＮＡ合
   成の刺激、 （ｂ）軟骨細胞および線維芽細胞のタンパク質合成の刺
   激、 （ｃ）全タンパク質合成の刺激に比べて、軟骨細胞のコ
   ラーゲン全合成の選択的刺激、 （ｄ）軟骨細胞中のタンパク質ｘおよびｙの合成の誘発
   、 （ｅ）非特異的間葉細胞の軟骨細胞または骨芽細胞への
   分化の促進、 を特徴とするオセインヒドロキシアパタイトコンパウン
   ド（ＯＨＣ）。
2. （２）特許請求の範囲第（１）項記載のオセインヒドロ
   キシアパタイトコンパウンドを製造する方法であって、 （ａ）胎児〜約１２月令哺乳動物の骨を最大約１ｃｍの
   粒径に粉砕し、 （ｂ）骨粒子を減圧で約２０〜８０℃において最大約１
   ０％または約１０〜２５％の残留 水分まで乾燥し、 （ｃ）生じた骨物質を酸でｐＨ５．０〜５．５になし、
   （ｄ）次いで親水かつ親油性溶媒で最大約５％の残留水
   分および残留脂肪含量に脱水、脱 脂するか、または親水性溶媒で２０〜８０ ℃において最大約５％の残留水分に脱水し 次いで親油性溶媒で２０〜８０℃において 最大約５％の残留脂肪含量に脱脂し、 （ｅ）脱水、脱脂した骨物質を減圧で２０〜８０℃にお
   いて約１％の最大溶媒含量に乾燥し、（ｆ）骨物質を約
   ５０〜３００ミクロメートルの粒径に粉砕し、次いで滅
   菌する、 ことを含む方法。
3. （３）特許請求の範囲第（１）項記載のオセインヒドロ
   キシアパタイトコンパウンドを製造する方法であって、 （ａ）胎児〜約１２月令哺乳動物の骨を最大約１ａｍの
   粒径に粉砕し、 （ｂ）骨粒子を酸でｐＨ５．０〜５．５になし、（ｃ）
   次いで親水かつ親油性溶媒で最大約５％の残留水分およ
   び残留脂肪含量に脱水、脱 脂するか、または親水性溶媒で２０〜８０ ℃において最大約５％の残留水分に脱水し 次いで親油性溶媒で２０〜８０℃において 最大約５％の残留脂肪含量に脱脂し、 （ｄ）脱水、脱脂した骨物質を減圧で２０〜８０℃にお
   いて約１％の最大溶媒含量に乾燥し、（ｅ）骨物質を約
   ５０〜３００ミクロメートルの粒径に粉砕し、次いで滅
   菌する、 ことを含む方法。
4. （４）長骨を用いる、特許請求の範囲第（２）項または
   第（３）項記載の方法。
5. （５）肉用仔牛の長骨を用いる、特許請求の範囲第（２
   ）項または第（３）項記載の方法。
6. （６）特許請求の範囲第（１）項記載のオセインヒドロ
   キシアパタイトコンパウンドを用いて製剤組成物を製造
   する方法。
7. （７）特許請求の範囲第（１）項記載のオセインヒドロ
   キシアパタイトコンパウンドを変形性関節症および骨粗
   鬆症の予防および治療に、並びに骨折、軟骨欠損および
   骨欠損の治癒に用いる方法。
8. （８）特許請求の範囲第（１）項記載のオセインヒドロ
   キシアパタイトコンパウンドおよび場合により補助剤お
   よび添加剤を含む経口投与用製剤組成物。
9. （９）変形性関節症および骨粗鬆症の予防および治療、
   並びに骨折、軟骨欠損および骨欠損の治癒をする方法で
   あって、前記処置を必要とする患者に、特許請求の範囲
   第（１）項記載のオセインヒドロキシアパタイトコンパ
   ウンドの有効量を与えることを含む方法。