FI91877C - Menetelmä osseiini-hydroksiapatiittiyhdisteen valmistamiseksi - Google Patents

Menetelmä osseiini-hydroksiapatiittiyhdisteen valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI91877C
FI91877C FI871670A FI871670A FI91877C FI 91877 C FI91877 C FI 91877C FI 871670 A FI871670 A FI 871670A FI 871670 A FI871670 A FI 871670A FI 91877 C FI91877 C FI 91877C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
ohc
bone
chondrocytes
collagen
maximum
Prior art date
Application number
FI871670A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI871670A (fi
FI91877B (fi
FI871670A0 (fi
Inventor
Thea Rosenberg
Original Assignee
Robapharm Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Robapharm Ag filed Critical Robapharm Ag
Publication of FI871670A0 publication Critical patent/FI871670A0/fi
Publication of FI871670A publication Critical patent/FI871670A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI91877B publication Critical patent/FI91877B/fi
Publication of FI91877C publication Critical patent/FI91877C/fi

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/32Bones; Osteocytes; Osteoblasts; Tendons; Tenocytes; Teeth; Odontoblasts; Cartilage; Chondrocytes; Synovial membrane
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/827Proteins from mammals or birds
    • Y10S530/84Bones; tendons; teeth; cartilage

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Description

91S77
Menetelmå osseiini-hydroksiapatiittiyhdisteen valmistami-seksi
Keksinto koskee menetelmåå osseiini-hydroksiapa-5 tiittiyhdisteen (OHC) valmistamiseksi, joka soveltuu kon-drosyyttien ja osteoblastien stimulointiin. OHC:tå voidaan kåyttåå osteoartriitin ja osteoporoosin profylaksiaan ja hoitoon sekå luunmurtumien, rustovikojen ja luuvikojen parantamiseen soveltuvien farmaseuttisten koostumusten, 10 erityisesti suun kautta annettaviksi tarkoitettujen koos-tumusten, valmistamiseen.
Mikrokiteinen hydroksiapatiittikoosturnus (MCHC), joka soveltuu kortikosteroidihoidosta aiheutuvan osteoporoosin eståmiseen, tunnetaan jo; ks. A. Pines et al., Cur-15 rent Medical Research and Opinion 8 (1984); nro 10, 734-742. Koostumus sisåltåå noin 50 paino-% hydroksiapatiitin ja kalsimfosfaatin muodostamaa kompleksista suolaa. Sen lisåksi se sisåltåå noin 26 % kollageenia ja noin 9 % ei-kollageenisia proteiineja/peptidejå. Lisåksi se sisåltåå 20 noin 0,65 % natriumia samoin kuin magnesiumia ja kaliumia sekå hivenaineina fluoria, sinkkiå, strontiumia, piitå, rautaa, rubidiumia, cesiumia ja platinaa. Lisåksi koostumus sisåltåå vielå glykosaminoglykaaneja, sitraattia ja vettå. Siitå, miten MCHC:tå valmistetaan, ei tiedetå mi- 25 tåån.
Keksinnon pååmåårånå on tarjota osseiini-hydroksi-apatiittiyhdistettå (OHC) ja menetelmå sen tuottamiseksi. Lisåksi pååmåårånå on tarjota farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisåltåvåt OHC:tå ja soveltuvat kondrosyyttien ja 30 osteoblastien stimulointiin (proliferaation aikaansaan- tiin) ja siten osteoartriitin ja osteoporoosin profylaksiaan ja hoitoon sekå luunmurtumien, rustovikojen ja luuvikojen parantamiseen.
0HC:llå on todettu olevan spesifinen vaikutus lui-35 den ja ruston metaboliaan, sillå se sisåltåå denaturoitu- 2 91877 mattomassa tilassa olevia orgaanisia aineosia ja myos epa-orgaanisia aineosia fysiologisesti tasapainoisissa suh-teissa. OHCsn kåytto takaa sen, ettå ihmis- ja elåineli-misto saa luustolle vålttåmåttomiå aineita (ei-kollageeni-5 sia luuspesifisiå peptideja, paikallisesti aktiivisia luu-ja rustosoluja sååteleviå tekijoitå, kalsiumia ja fosfaat-tia). OHC edistaå luiden metaboliaa kollageenin seka vålt-tåmåttomien, luuspesifisten, ei-kollageenisten peptidien ja proteoglykaanien muodostaman orgaanisen osseiinimatrik-10 sin avulla ja edistaå luun uudiskasvua ja osseiinimatrik-sin sisåånså sulkeminen hydroksiapatiitin epåorgaanisten aineosien sisållyttåmistå luihin. Lisåksi OHC stimuloi kehon rustonkorjausmekanismeja ja suojaa rustokudosta rap-peutumiselta.
15 OHCsllå on karakteristinen biologinen vaikutus os- teoblasteihin, luukudoksen tuottamisesta vastaaviin solui-hin. OHC tehostaa osteoblastien proliferaatiota ja metabo-liaa ja edistaå lisåksi epåspesifisten mesenkyymisolujen erilaistumista kondroblasteiksi tai osteoblasteiksi. OHC 20 on siis uusi lååke synnyltåån erilaisiin luusairauksiin, esimerkiksi primaarisiin ja sekundaarisiin osteoporoosei-hin sekå luunmurtumien ja luuvikojen parantamiseen ja pro-teesien optimointiin. Mainittujen solubiologisten ominai-suuksien, jotka vahvistettiin in vivo farmakologisesti 25 elåimillå ja kliinisesti ihmisillå, perusteella on selvåå, ettå OHC on huomattavasti parempi kuin tavanomaiset kal-siumvalmisteet ja kaikki luujauhot. OHC muodostaa osteo-poroosin hoitoon soveltuvien terapeuttisten tuotteiden piirisså todellisen vaihtoehdon puhtaille luuresorptio-30 inhibiittoreille, kuten estogeeneille ja kalsitoniineille, koska OHC ei pelkåståån estå luuresorptiota vaan ennen kaikkea ediståå luun kasvua. OHC eroaa niistå olemassa olevista terapeuttisista tuotteista, jotka myos stimuloi-vat luiden metaboliaa, esimerkiksi natriumfluoridista ja 35 difosfonaateista, siinå suhteessa, sillå on huomattavasti il 91877 3 våhenunån sivuvaikutuksia esimerkiksi gastrointestinaalis-ten sivuvaikutusten ja nivelsårkysivuvaikutusten puuttues-sa silta. Difosfonaateilla on hyvin kapea terapeuttinen alue, kun sen sijaan OHC on kåytånnollisesti katsoen myr-5 kyton.
Lisåksi OHC vaikuttaa biologisesti kondrosyyttei-hin, jotka vastaavat rustokudoksen muodostuksesta ja re-sorptiosta. OHC stimuloi kondrosyyttien proliferaatiota ja metaboliaa niiden fenotyypin håviåmåttå ja suojaa kondro-10 syytteja iatrogeenisia vahingoittavia tekijoita, kuten kortikosteroideja, vastaan. Lisåksi OHC ediståå epåspesi-fisten mesenkyymisolujen erilaistumista kondrosyyteiksi ja siten kondroidista metaplasiaa, joilla prosessilla on tår-kea osa rustokudoksen uudiskasvussa.
15 Tastå syysta OHC on erittåin kåyttokelpoinen osteo- artriitin, jossa kondrosyyttien måarå ja metabolinen ak-tiivisuus alenee ja ruston uudiskasvu edellyttåisi jarjes-telmållista kondroidista metaplasiaa, hoidossa. Lisåksi OHC soveltuu osteoporoosin hoitoon ja luunmurtumien seka 20 luu- ja rustovikojen paranemisen ediståmiseen.
OHC:n biologinen aktiivisuus voidaan todeta in vitro esimerkiksi a) osteoblastien, kondrosyyttien ja fibroblastien DNA-synteesin kiihtymisena, 25 b) kondrosyyttien ja fibroblastien proteiinisyntee- sin kiihtymisena, c) kondrosyyttien kokonaiskollageenisynteesin se-lektiivisenå kiihtymisena suhteessa kokonaisproteiinisyn-teesin kiihtymiseen, ja 30 d) epåspesif isten mesenkyymisolu jen kondrosyyteiksi tai osteoblasteiksi erilaistumisen ediståmisenå.
Kokonaiskollageenisynteesin stimuloinnin yhteydesså kollageenityyppien I ja II suhde sailyy kondrosyyttivil-jelmisså muuttumattomana 24 tunnin jakson aikana, joten 35 kondrosyyttien fenotyyppi sailyy ennallaan tåmån jakson 4 91877 aikana.
Biologinen vaikutus DNA-synteesiin mååritetåån nor-maalisti kåytetyllå tavalla mittaamalla solulinjojen, esi-merkiksi 3T3-fibroblastien, 3H-tymidiinin vastaanoton (so-5 luihin oton) kiihtyminen; Jimenez de Asua et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2724-2728. Tama on yleisesti kåytetty biologinen menettelytapa mitogeenisten aineiden tunnistamiseksi. Tåsså tunnistusmenetelmassa on edullista kåyttåa solulinjoja, koska solulinjoja on helppo viljellå.
10 Tåmå testausmenetelmå perustuu siihen, ettå solu- viljelmån sisåltåmillå transformoitumattomilla fibroblas-teilla on kaksi kasvun aåritilaa. Lepotilassa solut ovat GQ-G^vaiheessa eivåtkå sen vuoksi jakaudu. Lisåksi on ole-massa aktiivinen proliferatiivinen tila. Siirtymista lepo-15 tilasta proliferatiiviseen tilaan voidaan såådella vålttå-måttomien ravintoaineiden, seerumin ja muiden kasvua edis-tåvien tekijoiden pitoisuuden avulla. OHC sisåltåå sellai-sia kasvua ediståviå tekijoita. Viimeksi mainitut liukene-vat neutraaleiksi puskuroituihin fysiologisiin liuotti-20 miin, kuten fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS) tai fysiologiseen suolaliuokseen, ja ne saavat lepotilassa olevat 3T3-fibroblastit kiihdyttåmåan voimakkaasti 3H-tymi-diinin ottoa soluihin, joka kiihtyminen on annoksesta riippuvaa.
25 Usein kaytetty menetelma elintarvikkeiden ja far- maseuttisten valmisteiden steriloimiseksi såteilyttåmålla niitå gammasåteillå ei vahennå OHC:n biologista aktiivi-suutta mitattaessa kyseistå aktiivisuutta silla stimuloi-valla vaikutuksella, joka kohdistuu 3T3-fibroblastien 3H-30 tymidiinin vastaanottoon.
Tata koejarjestelmaa voidaan kåyttåa myos osteo-blastien DNA-synteesin soluspesifisen kiihtymisen måårit-tåmiseen. Siinå kåytetåån rottien kalvaarioista entsymaat-tisella sarjahajotuksella saatavia osteoblastipopulaatioi-35 ta. Osteoblastipopulaatiot edustavat osteoblastien eri • · , 91877 kypsyysasteita; populaatioiden I-III katsotaan olevan pre-osteoblastityyppisiå, populaatioiden IV-VI osteoblasti-tyyppisiå ja populaation L lepotilassa olevia osteoblasti-tyyppisia soluja tai osteosyytteja.
5 Neutraaleissa olosuhteissa liukenevilla OHC:n ai- neosilla on annoksesta riippuva stimuloiva vaikutus popu-laatioihin V ja VI kuuluviin osteoblasteihin. Rinnakkai-sesti testattujen, rotan fibroblasteista muodostettujen primaariviljelmien proliferaatio ei kiihdy. Nåistå kokeel-10 lisista havainnoista seuraa, ettå neutraaleissa olosuhteissa liukenevilla 0HC:n aineosilla on luusoluspesifinen vaikutus.
Biologinen vaikutus proteiinisynteesiin måaritetåan normaalisti kåytetyllå tavalla mittaamalla solujen, esi-15 merkiksi sellaisten solulinjojen kuin 3T3-fibroblastit tai ihmisen esinahkafibroblastien, L-(5-3H)proliinin vastaan-oton kiihtyminen. Tama menetelmå perustuu siihen, ettå stimuloitujen solujen proteiinisynteesi lisååntyy. Jos stimuloiduille soluille tarjotaan solujen kasvualustalla 20 L-(5-3H)proliinia, ne sisållyttåvåt sen uusiin syntetisoi-taviin proteiineihin. Mååråtyn inkubointiajan jålkeen mi-tataan soluihin otetun radioaktiivisuuden måårå, joka on stimuloivan vaikutuksen mitta. OHC sisåltåå neutraaleissa olosuhteissa liukenevia aineosia, joilla on voimakas sti-25 muloiva vaikutus 3T3-fibroblastien ja ihmisen esinahkafib-roblastien proteiinisynteesiin, joka vaikutus on annoksesta riippuva.
Emåksinen fosfataasi -testi suoritetaan tavalla, jota on suositellut Deutsche Gesellschaft fiir klinische 30 Chemie; ks. Z. Klin. Chem. und Klin. Biochem. 8 (1970) 658, 9 (1971) 464 ja 10 (1972) 182. Fosfataasiaktiivisuus mååritetåån laaduntarkkailutarkoituksessa keksinnon mukai-sen menetelman jokaisessa vaiheessa.
Taulukossa I on esitetty yhteenveto analyysien 35 avulla mååritetystå 0HC:n koostumuksesta (arvot on saatu 6 91S77 noin 150 eråstå).
Taulukko I
Aistinvarainen testi Hienosta våhån rakeiseen vaihteleva, beigenharmaa 5 jauhe, jolla heikko luon- tainen haju
Identtisyys Todettiin kalsium ja fos- fataasi 10 Todettiin kollageeni
Vesipitoisuus <7 %
Tuhkan kokonaismååra 51,3 - 62,7 %
Kalsium 19,2 - 23,6 % 15 Fosfori 8,9 - 10,9 %
Kollageeni 23,4 - 28,6 %
Ei-kollageeniset prote-iinit/peptiidit 7,2 - 10,8 %
Hivenaineet Todettiin F, Na, K, Mg, 20 Fe, Zn, Cu ja Ni
Fosfataasipitoisuus 0,5 - 15 mE/mg
Epånormaali myrkyllisyys Ei merkkejå intoleranssis- ta 4
Kokonaismikrobisisålto <10_/g 25 Hiivat clO^/g
Enterobakteerit clO'/g
Erityiset mikrobilajit Ei lasna_
Keksinnon mukaiselle menetelmålle OHC:n tuottami-30 seksi on tunnusomaista se, mitå patenttivaatimuksessa esi-tetaån. Toteutetaan seuraavat vaiheet:
Ensin irrotetaan luut virallisten elåinlaåkårien tutkimista nisåkkåista, jotka ovat iåltaån sikioasteisesta 12 kuukauden ikåiseen. Irrottamisensa jålkeen luut pakas-35 tetaan nopeasti ja såilytetåån noin -20 - -30 °C:ssa, kun-nes niita tarvitaan (ks. kuvio 1, lokero 1). Ennen jatko-kåsittelyå luut tarkastetaan sen toteamiseksi, etta ne ovat yhå tuoreita, mikå voidaan måårittåa niiden hajun ja vårin perusteella. Luut tarkastetaan myos sen toteamisek-40 si, etta ne ovat puhtaita ja todella vaadittavia luita. Tarvittaessa luiden koko ja muoto tarkastetaan kotielåin-ten anatomian kasikirjaa apuna kåyttåen. Mahdolliset lihan, janteiden ja ruston jåånteet poistetaan myos.
, · 91877 7
Mikåli esiintyy jotain epåilystå siitå, mikå elåin on kysymyksesså, laji voidaan måårittåå myos normaalien immunologisten reaktioiden avulla, esimerkiksi saostuksel-la.
5 Sen jalkeen luut murskataan murskaimessa niin, ettå maksimihiukkaskooksi tulee noin 1 cm (ks. kuvio 1, lokero 2). Luuhiukkasia kuivataan sitten alennetussa paineessa noin 10 % tai noin 10-25 % (ks. kuvio 1, lokerot 3a ja 3b). Saatavan luuaineksen pH såådetåån sitten suunnilleen 10 arvoon 5,0 - 5,5 jotakin happoa, kuten suola-, fosfori-, etikka-, muurahais- tai sitruunahappoa, kåyttåen.
Sen jalkeen luuaineksesta poistetaan hydrofiilista ja lipofiilista liuotinta kåyttåen vettå ja rasvaa, kunnes jåljellå oleva vesi- ja jåljellå oleva rasvapitoisuus ovat 15 korkeintaan noin 5 %, tai siita poistetaan ensin 20-80 °C:ssa hydrofiilista liuotinta kåyttåen vettå, kunnes jåljellå oleva vesipitoisuus on korkeintaan noin 5 %, ja sen jålkeen 20-80 °C:ssa lipofiilista liuotinta kåyttåen rasvaa, kunnes jåljellå oleva rasvapitoisuus on korkeintaan 20 noin 5 % (ks. kuvio 1, lokerot 4a ja 4b).
Tuloksena olevaa luuainesta, josta on poistettu vettå ja rasvaa, kuivataan sitten edelleen alennetussa paineessa 20-80 °C:ssa, esimerkiksi pyorrevirtauksessa, kunnes saavutetaan korkeintaan noin 1 %:n liuotinpitoisuus 25 (ks. kuvio 1, lokero 5).
Suunnitellusta kåytostå riippuen saatava luuaines jauhetaan sitten normaalilla tavalla jauhanta- ja seulon-talaitteessa jauheiksi, joiden raekoko vaihtelee noin 50 μm:stå 300 μπι:ϋη (ks. kuvio 1, lokero 6).
30 Mikåli mikrobien måårå luuaineksessa on suurempi kuin noin 10 000/g, luuaines steriloidaan normaalilla tavalla, esimerkiksi kåsittelemållå se etyleenioksidilla tai såteilyttåmållå sitå gammasåteillå (ks. kuvio 1, lokerot 10-12). Saadaan OHC:tå, joka soveltuu lååkeaineiden val-35 mistukseen (ks. kuvio 1, lokero 13).
8 91877
Eraåsså keksinnon mukaisen menetelmån vaihtoehtoi-sessa versiossa edellå kuvatun kaltaiset nisåkkåiden luut murskataan esimerkiksi murskaimessa niin, ettå maksimi-hiukkaskooksi tulee noin 1 cm (ks. kuvio 2, lokero 2).
5 Luuhiukkasten pH såådetåån sitten hapolla arvoon 5,0 - 5,5. Sen jålkeen niistå poistetaan hydrofiilista ja lipo-fiilista liuotinta kåyttåen vettå ja rasvaa, kunnes jål-jellå oleva vesi- ja jaljella oleva rasvapitoisuus ovat korkeintaan noin 5 %, tai niistå poistetaan ensin 20-80 10 °C:ssa hydrofiilista liuotinta kayttåen vettå, kunnes jål-jellå oleva vesipitoisuus on korkeintaan noin 5 %, ja sen jålkeen 20-80 °C:ssa lipofiilista liuotinta kåyttåen rasvaa, kunnes jåljellå oleva rasvapitoisuus on korkeintaan noin 5 % (ks. kuvio 2, lokerot 3a ja 3b).
15 Tuloksena olevaa luuainesta, josta on poistettu vettå ja rasvaa, kuivataan sitten edelleen alennetussa paineessa 20-80 °C:n låmpotilassa, esimerkiksi pyorrevir-tauksessa, kunnes saavutetaan korkeintaan noin 1 %:n liuo-tinpitoisuus (ks. kuvio 2, lokero 4). Tarvittaessa luu-20 aines voidaan kåsitellå edelleen edellå kuvatulla tavalla (ks. kuvio 2, lokerot 5-11). Saadaan OHC:tå, joka soveltuu lååkeaineiden valmistukseen (kuvio 2, lokero 12).
Edullisia luita kåytettåviksi keksinnon mukaisessa menetelmåsså, jota on kuvattu yksityiskohtaisesti edellå, 25 ovat humerus, femur, tibia, radius, ulna, os metacarpale ja os metatarsale. Nåiden lisåksi kåytetåån edullisesti nautavasikoiden (Bos taurus) luita.
On selvåå, ettå tuotteen denaturoitumisen eståmi-seksi, kummassakin tapauksessa on vålttåmåtontå alentaa 30 kuivaus- ja rasvanpoistolåmpotilaa kosteus- ja liuotinpi-toisuuden laskiessa. Kuten jo on mainittu veden poistossa ja kuivauksessa kåytettåvå låmpotila on korkeintaan 80 °C. Vesi- ja liuotinpitoisuuden laskiessa låmpotilaa alenne-taan ja toimenpide toteutetaan hyvin nopeasti.
35 Paine on vedenpoisto- ja kuivausvaiheen aikana kor- li 9 91 8 77 keintaan noin 400 mbar.
Tyypillisia esimerkkejå sopivista lipofiilisista liuottimista ovat asetoni, trikloorietyleeni, metyleeni-kloridi ja matalassa låmpotilassa kiehuva petrolieetteri.
5 Tyypillisia esimerkkeja sopivista hydrofiilisista liuottimista ovat asetoni, etanoli ja isopropanoli.
Tuloksena olevasta OHCs stå voidaan valmistaa tavan-omaisella tavalla suun kautta annettaviksi soveltuvia far-maseuttisia tuotteita, kuten rakeita, kalvopaallysteisiå 10 tabletteja, kapseleita, påållystettyjå pillereitå, pulve-reita tai suspensioita. Vuorokausiannokset ovat 0,6 - 10 g kahteen tai kolmeen kerta-annokseen jaettuina. Annosyksik-kd on 200 - 4000 mg.
Rakeiden valmistamiseksi OHC:hen sekoitetaan tayte-15 aineita ja aromiaineita, ja seos kostutetaan vedellå, ra-keistetaan ja kuivataan.
Kalvopaallysteisten tablettien valmistamiseksi OHC rakeistetaan kosteana, kuivataan ja seulotaan sen jålkeen. Sekoitetaan mukaan juoksevuudensaatoaineita, liukastusai-20 neita ja hajoamista edistaviå aineita. Seos, joka on nyt valmis muovattavaksi, tabletoidaan ja paållystetåån sitten ohuella vårillisella lakalla.
Påållystettyjen pillereiden valmistamiseksi OHC rakeistetaan kosteana, kuivataan ja seulotaan. Sen jålkeen 25 lisåtåån tavanomaisia tabletointiapuaineita, ja muovataan pilleriytimet. Ytimet erotetaan, varustetaan valkealla påållysteellå, vårjåtåån ja kiillotetaan.
Pulvereiden valmistamiseksi OHC:sta valmistetaan kuorellisia rakeita, jotka aromatisoidaan ja seulotaan.
30 Suspensioiden valmistamiseksi OHC suspendoidaan yhdesså viskositeettia kohottavien apuaineiden kanssa me-lassiin. Suspensioon lisåtåån våriaineita ja aromiaineita ja sen jålkeen såilymistå parantavia aineita.
Kuvio 1 esittåå kaaviota OHCin valmistamiseksi esi-35 merkin 1 mukaisesti.
91877 10
Kuvio 2 esittåå kaaviota OHC:n valmistamiseksi esi-merkin 2 mukaisesti.
Kuvio 3 osoittaa OHC-uutteen stimuloivan vaikutuk-sen 3T3-fibroblastien 3H-tymidiinin vastaanottoon. Abskissa 5 osoittaa OHC-uutteen pitoisuuden yksikkonå μΐ/ml kasvu-alustaa. Ordinaatta osoittaa 3H-tymidiinin oton soluihin yksikkonå cpm x 104. Pylvååt osoittavat keskipoikkeamat yh-deksån mittauksen keskiarvoista; korjauskerroin 0,917.
Kuvio 4 osoittaa naudan sikion seerumin (---) ja 10 OHC:n aineosien (-) stimuloivan vaikutuksen 3T3-fibro- blastien L-(5-3H)proliinin vastaanottoon. Abskissa osoittaa pitoisuuden testinaytteesså yksikkonå μΐ/ml kasvualustaa, ja ordinaatta osoittaa L-(5-3H)proliinin oton soluihin yksikkonå cpm x 103.
15 Kuvio 5 osoittaa naudan kondrosyyttien 3H-tymidiinin vastaanoton stimulaation OHC 34/4:n annoksen funktiona. Abskissa osoittaa pitoisuuden testatuissa nåytteisså yksikkonå μ9/πι1 kasvualustaa, ja ordinaatta osoittaa 3H-ty-midiinin oton soluihin yksikkonå cpm x 104.
20 Kuvio 6 osoittaa kondrosyyttien kollageenisynteesin ja kokonaisproteiinisynteesin stimulaation yksisolukerros-viljelmisså OHC-pitoisuuden funktiona. Abskissa osoittaa kåytetyn aktiivisen testiproteiinin måårån μ9:χηβ ml:a kohden viljelmåå. Ordinaatta osoittaa vastasyntetisoidun 25 proteiinin (x—x) ja kollageenin (o---o) måårån μ9:ϊηη vastaavasti kunkin erån tapauksessa.
Kuvio 7 osoittaa, miten kollageenin prosentuaalinen osuus proteiinin kokonaismååråstå kohoaa OHC-annoksen funktiona.
30 Kuvio 8 osoittaa såteilytetyn ja såteilyttåmåttomån OHC-uutteen stimuloivan vaikutuksen 3T3-fibroblastien 3H-tymidiinin vastaanottoon. Såteilytetyn OHC-uutteen prote- iinipitoisuus on 690 μ9/πι1 (-). Såteilyttåmåttomån OHC- uutteen proteiinipitoisuus on 670 μ9/πι1 (---). Abskissa 35 osoittaa OHC-uutteen pitoisuuden yksikkonå μ1/2,5 ml kas- 11 91 877 vualustaa. Ordinaatta osoittaa 3H-tymidiinin oton soluihin yksikkonå cpm.
Kuvio 9 osoittaa valmisteiden Lencoll* Lenphos®, Lensol*, Lensol® agglomerated, Osspulvit®, Mitsubishi Coo-5 kies®, Osteotrophic Concentrate, Canzocal* ja PMC* seka OHCsn stimuloivan vaikutuksen 3T3-fibroblastien 3H-tymidii-nin vastaanottoon. Abskissa osoittaa pitoisuuden testi-nåytteesså yksikkonå μΐ/ml kasvualustaa, ja ordinaattaa osoittaa 3H-tymidiinin oton soluihin yksikkonå cpm.
10 Tutkimuksessa kåytetysså solubiologisessa systee- misså ainoastaan OHC, PMC® ja Lencoll® ovat aktiivisia.
1 g kutakin tutkituista tuotteista uutettiin 10 ml:11a PBS:åå, testeisså kåytettiin yhtå suuria eriå sent-rifugoimalla saaduista supernatanteista.
15 Kuvio 10 osoittaa luun kuoriosan paksuuden prosen- tuaalisen muutoksen 14 kuukautta keståneen D2-vitamiini-, kalsiumglukonaatti- ja OHC-kåsittelyn jålkeen. D2-vita-miiniin verrattuna lisåys on 11,6 % OHC:tå kåytettåesså.
Kuvio 11 esittåå radiuksen kivennåisainepitoisuuden 20 BMC (g/cm) keskimååråistå muutosta OHC:llå hoidetuilla po- tilailla (-) ja vertailupotilailla (---) kahden vuoden ai kana. Pylvååt osoittavat keskipoikkeamia.
Kuvio 12 osoittaa ansasluutilavuuden (TBV) ja suo-liluun harjan kuoriosan paksuuden (CPT) keskimååråisiå 25 muutoksia 0HC:llå hoidetuilla potilailla (-) ja vertailupotilailla (---) kahden vuoden aikana. Pylvååt osoitta vat keski poikkeamia.
Kuviossa 13 ordinaatta osoittaa 3H-tymidiinin oton soluihin yksikkonå cpm ja abskissa pitoisuuden tutkitussa 30 nåytteesså yksikkonå μg/200 μΐ viljelmåå.
Seuraavat esimerkit valaisevat tåtå keksintoå yksi-tyiskohtaisemmin.
12 91877
Esimerkki 1 OHCsn valmistus (menetelma 1) Låhtomateriaalina OHC:n tuottamiseksi kåytetåån noin 3 kuukauden ikaisistå nautavasikoista (Bos taurus) 5 peråisin olevia pitkiå luita (humerus, femur, tibia, radius, ulna, os metacarpale ja os metatarsale).
Elåimet tutkitutetaan virallisilla elåinlååkåreil-la. Sen jalkeen ne teurastetaan ja luut irrotetaan. Luiden irrotuksen jalkeen puhtaat luut pakastetaan nopeasti ja 10 såilytetåån -20 - -30 °C:ssa jatkokåsittelyyn saakka (ks. kuvio 1, lokero 1).
Ennen jatkokåsittelyå luut tarkastetaan niiden tuo-reuden (todettavissa niiden hajun ja vårin perusteella), puhtauden ja sen, ettå ne todella ovat vaadittavia luita, 15 toteamiseksi. Mahdolliset lihan, jånteiden ja ruston jaan-teet poistetaan.
Menetelman ensimmaisessa vaiheessa 1600 kg (yksi era) pakastettuja luita murskataan ruostumattomasta teråk-sestå valmistetussa murskaimessa, jossa on 20 mm:n seula-20 reiåt. Murskatun luun hiukkaskoko on noin 1 cm. Luiden lampotila pidetåan murskauksen aikana 0 °C:n alapuolella (ks. kuvio 1, lokero 2).
Sen jalkeen murskatuista luista poistetaan vettå ruostumattomasta teråksestå valmistetussa lapakuivurissa 25 0,97 - 0,98 bar:n paineessa. Kuuman veden lampotila on aluksi noin 90 °C ja alennetaan kuivauksen kuluessa noin 40 °C:seen. Heti kun veden tislautuminen kondensaatinke-råysastiaan lakkaa (noin 10 tunnin kuluttua kuivauksen aloittamisesta), kuumennus lopetetaan ja luukoostumuksen 30 kuivausta jatketaan alennetussa paineessa, kunnes sen jal-jellå oleva vesipitoisuus on joko korkeintaan noin 10 % (ks. kuvio 1, lokero 3a) tai 10-25 % (ks. kuvio 1 lokero 3b). Tåsså jålkimmåisesså kuivausvaiheessa luukoostumuksen lampotila ei saisi ylittåå 40 "Csta.
35 Kuivatun luukoostumuksen pH såådetaan sitten sit- n 91877 13 ruunahapolla arvoon 5,0 - 5,5. Sen jålkeen kuivatusta luu-koostumuksesta poistetaan viela kerran vettå 20-80 °C:ssa ja rasvat poistetaan. Tåhån tarkoitukseen kåytetåån joko sekå hydrofiilisena ettå lipofiilisena liuottimena aseto-5 nia tai kuivatusta luukoostumuksesta poistetaan ensin vettå asetonin avulla 20-80 °Csn låmpotilassa ja sen jalkeen toisessa vaiheessa rasvaa trikloorietyleenin avulla 20-80 °C:ssa. Saadaan luukoostumus, jossa jåljellå oleva vesi-ja jåljellå oleva rasvapitoisuus ovat korkeintaan 5 % (ks.
10 kuvio 1, lokerot 4a ja 4b). Liuotinjåånnokset poistetaan sen jålkeen pyorrevirtauksessa 20-80 °C:n låmpotilassa ja 90 mbar:n paineessa. Jåljelle jååvå liuotinpitoisuus on noin 1 % (ks. kuvio 1, lokero 5).
Tuloksena oleva luukoostumus jauhetaan vasaramyl-15 lysså, jossa suorakulmaisilla 2x20 mm:n rei'illå varustet-tu seula ja seulotaan sitten seulakoneessa, jossa ylemmån seulan reikåkoko on 2,4 cm ja alemman seulan reikåkoko on 0,34 mm. 2,4 mmsn seulalle jååvå aines heitetåån pois, ja 0,34 mm:n seulan låpåissyt aines kåytetåån edelleen. Se 20 jauhetaan vielå kerran jauhimessa, johon on sijoitettu 0,8 mm:n rei'illå varustettu seulaverkko, ja seulotaan seulakoneessa, jossa toisen seulan reikåkoko on 0,74 mm ja toisen reikåkoko on 0,34 mm. 0,74 mm:n seulalle jååvå aines heitetåån pois. 0,34 mm:n seulan låpåissyt aines keråtåån 25 talteen ja jauhetaan vielå kerran jauhimessa, johon on sijoitettu 0,8 mm:n rei'illå varustettu seulaverkko. Sen jålkeen se seulotaan edellå kuvatulla tavalla. Lopuksi jauhe keråtåån talteen ja seulotaan kåyttåen seulaa, jonka reikåkoko on 0,25 mm, ja jauhetaan jauhimessa, johon on 30 sijoitettu 0,5 mm:n rei'illå varustettu seulaverkko. Sen jålkeen kaikki lasketaan seulan, jonka reikåkoko on 0,25 mm, låpi (ks. kuvio 1, lokero 6).
Taulukossa II on esitetty yhteenveto tulokseksi saatavan OHC-jauheen analyysiarvoista.
91877 14
Taulukko II
Aistinvarainen Hienosta våhån rakei- testi seen vaihteleva, bei- 5 genharmaa jauhe, jol- la heikko luontainen Asianmukai- haju nen
Identtisyys Todettiin kalsium ja Asianmukai- fosfataasi nen 10 Todettiin kollageeni Asianmukai- nen
Vesipitoisuus <7 % 6,3 %
Tuhkan kokonais- måårå 51,3-62,7% 56,2% 15 Kalsium 19,2 - 23,6 % 21,57 %
Fosfori 8,9 - 10,9 % 9/71 %
Kollageeni 23,4 - 28,6 % 26,4 %
Ei-kollageeniset proteiinit/pep- 20 tidit 7,2 - 10,8 % 9,0 %
Hivenaineet Todettiin F, Na, K, Asianmukai-
Mg, Fe, Zn, Cu ja Ni set Fosfataasi 0,5 - 15 mE/mg 3,9 mE/mg
Epånormaali myr- Ei merkkejå intole- Asianmukai- 25 kyllisyys ranssista nen
Kokonaismikrobi- .
sisalto <10^/q Noin 300
Hiivat/homeet <10^/g Ei låsnå
Enterobakteerit <10 Vg Ei låsnå 30 Erityiset mikro- bilajit Ei låsnå Ei låsnå
Mikåli analyysi osoittaa OHC-koostumuksen sisåltå-35 vån yli 10 000 mikro-organismia/g, koostumus steriloidaan joko kåsittelemållå se etyleenioksidilla tai såteilyttå-mållå sitå gammasåteillå (ks. kuvio 1, lokerot 10-12).
Saadaan OHC:tå, joka soveltuu farmaseuttisten koos-tumusten valmistukseen (ks. kuvio 1, lokero 13).
. 40 Esimerkki 2 OHC:n valmistus (menetelmå 2)
Valmistetaan murskattu luukoostumus, jonka maksimi-hiukkaskoko on 1 cm, samalla tavalla kuin esimerkisså 1. Tåmån luukoostumuksen pH såådetåån sitten sitruunahapolla 45 arvoon 5,0 - 5,5,ja se jatkokåsitellåån samalla tavalla 91877 15 kuin esimerkisså 1.
Saadaan OHC-koostumus, jolla on taulukossa III yh-teenvetona esitetyt analyysiarvot
5 Taulukko III
Aistinvarainen Hienosta vahån rakei- testi seen vaihteleva, bei- genharmaa jauhe, jol- 10 la heikko luontainen Asianmukai- haju nen
Identtisyys Todettiin kalsium ja Asianmukai- fosfataasi nen
Todettiin kollageeni Asianmukai- 15 nen
Vesipitoisuus <7 % 6,6 %
Tuhkan kokonais- maara 51,3 - 62,7 % 56,07 %
Kalsium 19,2 - 23,6 % 21,33 % 20 Fosfori 8,9 - 10,9 % 9,95 %
Kollageeni 23,4 - 28,6 % 26,2 %
Ei-kollageeniset proteiinit/pep- tidit 7,2 - 10,8 % 8,8 % 25 Hivenaineet Todettiin F, Na, K, Asianmukai-
Mg, Fe, Zn, Cu ja Ni set
Fosfataasi 0,5 - 15 mE/mg 5,4 mE/mg
Epånormaali myr- Ei merkkeja intole- Asianmukai- kyllisyys ranssista nen 30 Kokonaismikrobi- .
sisålto <10^/9 Noin 300
Hiivat/homeet <10^/9 Ei lasnå
Enterobakteerit <10z/q Ei låsnå
Erityiset mikro- 35 bilajit Ei låsnå Ei låsnå
Esimerkki 3 0HC:n stimuloiva vaikutus 3T3-fibroblastien 3H-tymi-40 diinin vastaanottoon
Viljellåån sveitsilåisten hiirien 3T3-fibroblasteja (Flow Laboratories) DMEMisså (Dulbeccon muunnetussa Eaglen alustassa, Boehringer Mannheim). Sen jålkeen kun alustan pH on ensin såådetty C02:lla arvoon 6,6 ennen sterilointi-45 suodatusta, alustaan lisåtåån 100 yksikkoå penisilliiniå/ 16 91877 ml, 100 mg streptomysiiniå/ml (molempien toimittaja Boehringer Mannheim) ja 3,7 g NaHC03:ta/litra (Merck, Darmstadt). Lisåksi viljelmåån lisåtåån 10 % naudan sikion seerumia (Boehringer Mannheim) solujen viljelemistå var-5 ten. Vielå epåyhtenåisiå alaviljelmiå viljellåån 90 mm:n petrimaljoissa 37 °C:ssa C02:n osapaineen ollessa 5 %, ja soluista muodostetaan uusia alaviljelmiå kahdesti viikossa alkuinokulaation ollessa 4 x 104 solua/10 ml kasvualustaa petrimaljaa kohden. Kussakin jåljempånå yksityiskohtaises-10 ti kuvatuista tutkimuksista kåytetåån 3.-20. alaviljelmås-tå peråisin olevia soluja.
3H-tymidiinin ottoa soluihin koskeva testi suorite-taan tavalla, jonka ovat esittåneet L. Jimenez de Asua et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2724-2728. Edellå 15 esitetyt, varastoviljelmåstå peråisin olevat sveitsilåis-ten hiirien 3T3-fibroblastit kåsitellåån trypsiinillå kåyttåen steriiliå liuosta, joka sisåltåå 0,05 % trypsii-niå ja 0,02 % EDTA:a. Solut suspendoidaan uudelleen DMEM:-iin, joka sisåltåå 10 % naudan sikion seerumia, niin ettå 20 pitoisuudeksi tulee 4 x 104 solua/ml. 1 mlsn eråt solusus-pensiosta sijoitetaan 1,9 cm2:n mikromaljoille. Soluja in-kuboidaan 4 lisåvuorokautta alustaa muuttamatta, ja saa-daan aikaan kiinni toisiinsa kasvaneista, lepotilassa ole-vista ei-proliferatiivisista soluista koostuvia yksisolu-25 kerroksia. Elatusaine imetåån sitten pois ja korvataan 1 ml:11a tuoretta kasvualustaa, joka ei sisållå naudan sikion seerumia mutta johon lisåtåån myos testattavia nåyt-teitå.
1 g 0HC:tå, joka on valmistettu esimerkin 1 tai 2 30 mukaisesti, suspendoidaan 10 mlraan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (0,2 g KCl:å, 8 g NaClså, 2,7 g NaHP04 12HzO:ta ja 0,2 g KH2P04:å litraa kohden), joka ei sisållå magnesiumia eikå kalsiumia. Sen jålkeen kun nåytteitå on ravistettu 2 tuntia huoneen låmpotilassa, niitå sentrifu-35 goidaan 15 minuuttia nopeudella 2000 x g.
il « · 91877 17
Edella saatuihin 3T3-fibroblastiviljelmiin lisåtåån sitten 2-500 μ1:η eriå sentrifugoinnin jålkeen saatavia supernatantteja, jotka sisåltåvåt neutraaleissa olosuh-teissa liukenevia 0HC:n aineosia.
5 Sokeakoemittausten suorittamista vårten lisåtåån pelkåståån sama måårå tuoretta kasvualustaa viljelmiin. Positiiviseksi vertailuaineeksi lisåtåån 2-200 μΐ naudan sikion seerumia.
Testiviljelmiå inkuboidaan lopuksi 20 tuntia 37 10 °C:ssa C02:n osapaineen ollessa 5 %, ja sen jålkeen niistå tehdåån pulsseja antavia 3H-tymidiinillå. Solut leimataan radioaktiivisesti lisååmållå kuhunkin syvennykseen milli-litraa kohden kasvualustaa 10 μΐ steriiliå tymidiinin ve-siliuosta, joka sisåltåå 1 μΟϊ (metyyli-3H)tymidiiniå 15 (Amersham, Yhdistynyt Kuningaskunta) ja 0,9 pg metyylity-midiiniå (Sigma, Yhdysvallat). 3H-tymidiinin lisåyksen jålkeen seuraa vielå 4 tunnin inkubointijakso edella maini-tuissa olosuhteissa.
Nåytteet kåsitellåån sitten tuikelaskentaa silmållå 20 pitåen. Elatusaine imetåån pois, ja solukerros peståån 0,5 ml:11a PBS-liuosta, joka sisåltåå 0,2 % EDTA:a. Soluja kåsitellåån trypsiinillå edellå kuvatulla tavalla, kunnes niistå tulee tåysin irtonaisia. Suspensoituja soluja kåsitellåån Dynatech-mikromonikåsittelylaitteessa, jossa ne 25 siirretåån automaattisesti mikrolasikuitusuodattimiin (Whatman 934-AH). Laite ohjelmoidaan seuraavalla tavalla: 1) PBS-pesu; 2) saostus 5-%sisella trikloorietik-kahapolla (Merck, Darmstadt); 3) etanolifiksaatio. Mikro-lasikuitusuodattimet kuivataan ja siirretåån tuikelasken-30 tapulloihin. Lisåtåån 3 ml nestemåistå tuikeaineseosta (7 g Permablend Packardia 1 litrassa Triton X-100:n ja tolu-eenin seosta (1:3); Merck, Darmstadt), ja mitataan nåyt-teiden radioaktiivisuus hajoamisina/minuutti LKB-Wallac 1217 Rackbeta -nestetuikelaskurilla.
35 OHCsn suurin stimuloiva vaikutus kohoaa vain noin 18 91877 puoleen naudan sikion seerumilla saavutettavasta maksimis-timulaatiosta. Tulisi kuitenkin muistaa, ettå naudan sikion seerumin sisåltamå kokonaisproteiinimåårå on noin 60 kertaa niin suuri kuin OHC-uutteiden. Kåytetyt OHC-uutteet 5 stimuloivat siis 3H-tymidiinin ottoa soluihin huomattavasti suuremmassa måårin verrattaessa stimulointiastetta siihen, joka saavutetaan naudan sikion seerumia kaytettåesså. Yh-teenveto OHCrtå kayttåen saaduista mittaustuloksista on esitetty kuviossa 3.
10 Testausmenetelmåå voidaan kåyttåå myos esimerkkien 1 ja 2 mukaisesti saatavien OHC-koostumusten laadun måå-rittåmiseen. Kaytettåesså naudan sikion seerumia positii-visena vertailuaineena, toisaalta sisåisenå standardina solubiologisessa testaussysteemisså ja toisaalta OHC-nåyt-15 teillå saatavien arvojen referenssinå, on mahdollista måå-ritellå ja ilmaista aktiivisuusyksikko OHC-koostumusten biologisen aktiivisuuden karakterisoimiseksi. Tåmå mahdol-listaa OHC-koostumusten biologisen aktiivisuuden standar-doinnin.
20 Esimerkki 4 OHCsn stimuloiva vaikutus 3T3-fibroblastien ja ih-misen esinahkafibroblastien L-(5-3H)proliinin vastaanottoon
Viljeltyjen solujen porliinin vastaanotto voidaan måårittåå samalla tavalla kuin esimerkisså 3 mutta kåyttå-25 mållå jo kuvatussa soluviljelysysteemisså 3H-tymidiinin tilalla L-(5-3H)proliinia. Tållå testillå mååritetåån viljeltyjen solujen proteiinisynteesin nopeus, ja mittaamalla solujen absorboiman radioaktiivisuuden måårå voidaan måårittåå OHC-koostumusten biologinen aktiivisuus. Kuvio 4 30 osoittaa OHC:n stimuloivan# vaikutuksen 3T3-fibroblastien L-(5-3H)proliinin vastaanottoon.
Kuvio 4 paljastaa, ettå OHC-koostumus kohottaa huomattavasti proteiinisynteesin nopeutta tutkituissa soluis-sa.
• li 91877 19
Esimerkki 5
Neutraaleissa olosuhteissa liukenevien OHC in aine-osien vaikutus naudan kondrosyyteistå muodostettuihin vil-jelmiin 5 Kondrosyytit eristetåån nautavasikoiden epifyysi- rustoista normaalilla tavalla. 50 000 solua viljellåån epayhtenaisina viljelmina 4-6 vuorokautta kayttaen kussa-kin tapauksessa 1 ml F12-kasvualustaa, johon on lisåtty 10 % naudan sikion seerumia. Kuten esimerkissa 3 tuloksena 10 olevat soluviljelmåt kasitellaån OHC-koostumuksilla 34/4, jotka on saatu esimerkkien 1 ja 2 mukaisesti. Soluista tehdåån sitten pulsseja antavia 3H-tymidiinilla kuten esimerkissa 3, ja solujen radioaktiivisuus mitataan.
Kuviossa 5 on esitetty yhteenveto ensimmaisen tes-15 tin tuloksista. Naudan kondrosyyttien 3H-tymidiinin vas-taanotto esitetaan suhteessa OHC 34/4 -annokseen.
Kuvioista 6 ja 7 ilmenee, ettå tutkittu OHC 35/5 kiihdyttåå kokonaisproteiinisynteesia ja kollageenisyntee-sia.
20 34/4 ja 35/4 ilmaisevat erien sarjanumeron.
Esimerkki 6
Neutraaleissa olosuhteissa liukenevien OHC:n aine-osien vaikutus luusolupopulaatioihin in vitro
Suurin piirtein tavalla, jonka ovat esittaneet Cohn 25 et al. Skeletal Research, an Experimental Approach, toim. Simmons ja Kanin, Academic Press, New York - San Francisco - Lontoo, s. 3-20), eristetaan eri luusolupopulaatiot ai-kariippuvaisella entsymaattisella sar jaha jotusmenetelmalla vuorokauden ikaisten Wistar-rottien kalvaarioista, paitsi 30 ettå kollagenaasin ja trypsiinin ohella kåytetåån lisåent-syyminå hyaluronidaasia 0,05-%:isena solujen vapauttami-seksi luukudoksesta.
Erilaisia 20 minuutin hajotuksen aikana vapautunei-ta solupopulaatioita merkitaan roomalaisilla numeroilla, 35 jotka vastaavat sitå jårjestystå, jossa eri solufraktiot 20 91877 saadaan. Ensimmåistå kalvaarioista vapautettavaa solupo-pulaatiota merkitaån 1:11a, kun taas viimeistå 1 tunnin aikana vapautuneista solufraktiosta merkitaån Lsllå. Toi-mintatestit viittaavat siihen, ettå populaatiot I-III ovat 5 osteoprogenitorisoluryhmåån kuuluvia solu ja (preosteoblas-tityyppisiå). Solupopulaatioissa IV-VI on luonteeltaan osteoblastimaisia piirteitå, ja solupopulaatioita, joita merkitaån VIII:llå ja L:llå, voidaan pitåå lepotilassa olevina osteoblastityyppisinå soluina tai ehkå osteosyyt-10 tityyppisinå soluina.
10 ml suspensiota, joka sisåltåå 1,5 x 105 solua/ml MEM-alustaa (joka sisåltåå Earlen suoloja), johon on li-såtty 10 % naudan sikion seerumia, levitetåån 250 ml:n ku-dosviljelypulloihin. 9-10 vuorokautta keståneen, 37 °C:ssa 15 ja olosuhteissa, joissa C02:n osapaine on 5 %, suoritetun inkuboinnin jålkeen saadaan yhtenåisiå solukerroksia, joista muodostetaan suspensio 0,2-%:ista trypsiiniå kåyt-tåen. Solut keråtåån sentrifugoimalla suspensiota 7 mi-nuuttia nopeudella 400 x g. Tuloksena olevat solupelletit 20 suspendoidaan uudelleen MEM-alustaan, johon on lisåtty 20 % naudan sikion seerumia ja 10 % DMS0:ta, suspensiot pa-kastetaan sitten nestetypesså myohempåå kåyttoå vårten.
Yksittåiset jåådytetyt luusolupopulaatiot låmmite-tåån varovasti 37 °C:seen ja sekoitetaan 40 ml:aan MEM:å, 25 johon on lisåtty 20 % naudan sikion seerumia. Suspensioita sentrifugoidaan 7 minuuttia nopeudella 400 x g, ja tuloksena olevat solupelletit suspendoidaan uudelleen tuoree-seen alustaan, johon on lisåtty 10 % naudan sikion seerumia, ja levitetåån 96-syvennyksiselle mikromaljaile niin, 30 ettå kuhunkin syvennykseen tulee 7 - 10 x 103 solua. Soluja viljellåån 2 vuorokautta. Kolmantena påivånå kasvualusta korvataan alustalla, joka sisåltåå joko 1 % tai 2 % naudan sikion seerumia. 24 tunnin inkuboinnin jålkeen alusta korvataan taas tuoreella alustalla, joka sisåltåå 1 % tai 2 % 35 naudan sikion seerumia, 0,5 μΟϊ 3H-tymidiiniå/ml ja neut- • · 91877 21 raaleissa olosuhteissa liukenevia OHC:n aineosia erilaisi-na pitoisuuksina. Vertailuviljelmiin lisatåån sopivat måå-råt PBS så.
Sen vahvistamiseksi, ettå eri luusoluviljelmåt to-5 della vastaavat mitogeenia, tehdåån kokeita EDGF:å (epi-dermaalista kasvutekijåa).
Luusoluviljelmiå inkuboidaan 24 tuntia edellå mai-nituissa olosuhteissa 3H-tymidiiniå sisåltåvåå alustaa kåyttåen. Soluihin otettu 3H-tymidiinimåårå mitataan sitten 10 samalla tavalla kuin esimerkisså 3.
Yhteenveto koetuloksista on esitetty taulukossa IV, jossa kukin arvo on viidestå kokeesta saatu keskiarvo on esitetty keskipoikkeaman kera. PBSsåån liuenneita OHC:n aineosia lisataan kasvualustoihin 5-50 μΐ kasvualustan 15 kokonaistilavuuden ollessa 200 μΐ.
Taulukko IV
Luusolupopulaatiot 3H-tymidiinin otto soluihin neutraa- leissa olosuhteissa liukenevien OHC:n 20 aineosien V ja X aiheuttaman stimulaa- tion johdosta, kun mukana on 1 % FCS1 2 % FCS1 _(cpm/svvennvs + keskipoikkeama)
P-I
25 Vertailu (PBS) 19022 ± 1630(5) 27656 ± 841(5)
Op V 11070 ± 1160(5) 12394 ± 195(5)
Op X 11800 ± 508(5) 12678 ± 884(5)
P-II
Vertailu 19023 ± 552(5) 25103 ± 344(5) 30 Op V 15440 ± 491(5) 14910 ± 611(5)
Op X 13161 ± 491(5) 13425 ± 940(5)
P-III
Vertailu 12473 ± 582(5) 15159 ± 588(5)
Op V 8179 ± 433(5) 10105 ± 600(5) 35 Op X 6735 ± 455(5) 9676 ± 436(5) 22 9 1 8 7 7
Taulukko IV Matkoa)
P-IV
Vertailu 16482 ± 750(5) 21006 ± 711(5)
Op V 9445 ± 481(5) 11388 ± 649(5) 5 Op X 6945 ± 178(5) 10356 ± 539(5)
P-V
Vertailu 18298 ± 774(5) 22677 ± 176(5)
Op V 14380 ± 746(5) 16115 ± 261(5)
Op X 14866 ± 250(5) 18330 ± 296(5)
10 P-VI
Vertailu 25789 ± 966(5) 37205 ± 2553(5)
Op V 23424 ± 1026(5) 28168 ± 711(5)
Op X 23346 ± 1239(5) 32107 ± 422(5)
P-VII
15 Vertailu 19405 ± 827(5) 26369 ± 1236(5)
Op V 30189 ± 1327(5) 41293 ± 1769(5)
Op X 37498 ± 994(5) 44817 ± 728(5)
P-L
Vertailu 13378 ± 396(5) 18654 ± 491(5) 20 Op V 18677 ± 523(5) 26816 ± 1027(5)
Op X 28488 ± 1241(5) 33411 ± 1220(5) 1 li FCS = naudan sikion seerumi
Taulukosta IV ilmenee, ettå neutraaleissa olosuh-25 teissa liukenevat OHCsn aineosat stimuloivat luusolupopu-laatioiden V ja VI proliferaatiota suhteessa vertailuvil-jelmiin, joihin on lisåtty PBS:å. Luusolupopulaatiot I ja VII eivat osoita mitåån reaktiota. Tulokset on toistettu graafisessa muodossa kuviossa 13.
30 Esimerkki 7
Taulukossa V on esitetty yhteenveto kokeiden, jois-sa maaritettiin neutraaleissa olosuhteissa liukenevien OHCsn aineosien (OHC X) vaikutus rotan nahan fibroblastei-hin, tuloksista.
91877 23
Taulukko V
Rotan nahan fibroblastien 3H-tymidiinin vastaanotto OHC X-pitoisuuden funktiona 3H-tymidiinin otto soluihin 5 _imin'Vsvvennvs ± keskipoikkeamal ei FCSså 450 ± 29 + 15 μΐ PBS 485 ± 38 + 7,5 μΐ OHC X 343 ± 18 + 15,0 μΐ OHC X 582 ± 42 10 + 30,0 μΐ OHC X 618 ± 16 1 % FCS - 917 ± 85 + 15 μΐ PBS 921 ± 33 + 7,5 μΐ OHC X 606 ± 32 + 15,0 μΐ OHC X 643 ± 33 15 + 30,0 μΐ OHC X 783 ± 79 2 % FCS - 1051 ± 23 + 15 μΐ PBS 1127 ± 51 + 7,5 μΐ OHC X 1059 ± 38 + 15,0 μΐ OHC X 920 ± 35 20 + 30,0 μΐ OHC X 1140 ± 57
Tuloksista, jotka on esitetty yhteenvetona taulu-kossa V, voidaan havaita, etta OHC X ei kykene stimuloi-maan rotan nahan fibroblasteja.
25 Verrattaessa koetuloksia, jotka on esitetty yhteen vetona taulukossa IV, taulukossa V yhteenvetona esitettyi-hin koetuloksiin, kåy selvåksi, etta OHC Xsn mitogeeninen aktiivisuus on osteoblastispesifistå.
Esimerkki 8 30 Såteilytetyn OHC:n biologisen aktiivisuuden mååri- tys OHC:tå, joka on valmistettu esimerkin 1 tai 2 mu-kaisesti, såteilytetåån annoksen ollessa 25 kGy (2,5 Mrad). Koe suoritetaan samalla tavalla kuin esimerkisså 3.
35 Tulokset on esitetty kuviossa 8.
24 91877
Kuviossa 8 on esitetty yhteenveto tuloksista, jotka saatiin tutkittaessa 3T3-fibroblastien 3H-tymidiinin vas-taanoton stimulaatiota kåyttamållå erilaisia mååriå satei-lytetyn ja såteilyttåmåttomån OHC:n PBS-uutetta. Kuviosta 5 8 voidaan havaita, ettå såteilytys ei vaikuta OHC:n biolo- giseen aktiivisuuteen.
Esimerkki 9 OHC:n vaikutuksen vertailu samalle indikaatioalu-eelle tarkoitettujen tunnettujen valmisteiden vaikutukseen 10 Punnitaan kierrekorkilla varustettuihin pulloihin 1 g kutakin testattavaa ainetta, ja lisåtaån 10 ml PBS:a.
Sen jålkeen kun pulloja on ravistettu 2 tuntia huoneen låmpotilassa, seuraa 10 minuutin sentrifugointi MSE-poy-tåsentrifugissa nopeudella 3600 kierrosta/min. Kirkkaat 15 supernatantit erotetaan dekantoimalla ja sakat heitetåån pois. Liuosten proteiinipitoisuus mååritetåan Bradfordin esittåmallå tavalla, Anal. Biochem. 72 (1976) 248. 3T3- fibroblastien 3H-tymidiinin vastaanottoa stimuloidaan sa-malla tavalla kuin esimerkisså 3, ja se arvioidaan.
20 Yhteenveto valmisteista, joita verrattiin, ja nii- den uuttuvasta proteiinisisållostå on esitetty taulukossa VI.
Taulukko VI
Uutettavissa oleva prote- 25 iinimaara/ml liuosta
Lencoll® 330 μg
Lenphos® 105 μg
Lensol® 3850 μg
Lensol® 4200 μg 30 Osspulvit® 24 μg
Mitsubishi Cookies® 82 μg PMC® 400 μg
Osteotrophic Concentrate 22 μg
Canzocal® 28,5 μg 35 OHC (keksinto) 600 μg l! 91877 25
Yhteenveto koetuloksista on esitetty kuviossa 9. Inaktiivisia aineita ei voida erottaa sokeasta kokeesta, eikå niistå ole tasta syystå piirretty kuvaajaa.
Kuviosta 9 voidaan havaita, etta OHC on selvåsti 5 parempi kuin muut tuotteet DNA-synteesin stimuloinnissa.
Esimerkki 10 OHC:n vaikutus luun paranemiseen elainkokeissa OHC:n vaikutus luun paranemiseen selvitetåan tutkimuksel-la, jossa kaytetåan 60 tåysikasvuista kania. Kåytetåån 10 tarkkuustekniikkaa kooltaan ja sijainniltaan identtisten rustovikojen/luuvikojen aiheuttamiseksi kummankin pol-vinivelen distaaliseen femoraaliseen epifyysiin.
Elåimet jaetaan sattumanvaraisesti neljåan 15 elåi-men ryhmåån. Hoitamaton ryhmå toimii vertailuryhmånå. En-15 simmåinen ryhmå saa 830 mg OHC:tå (178,0 mg kalsiumia) vuorokaudessa, toinen 510 mg tuhkaksi poltettua OHC:tå (ts. luun kivennåisaineita ilman aktiivisia orgaanisia aineosia; 178,9 mg kalsiumia) vuorokaudessa ja kolmas ryhmå 650 mg kalsiumkarbonaattia (189,7 mg kalsiumia) vuoro-20 kaudessa. Yksityiskohtainen kuvaus koesuunnitelmasta on esitetty taulukossa VII.
91877 26
Taulukko VII Koesuunnitelma
Testiryh- Kokeen Koe- Vuorokausi- Lisåkalsiu- må post- elåin- annos min måårå opera- ten elåintå vuorokausi- tiivi- luku- kohden suun annoksessa nen måårå kautta an- mg:ina __kesto___nettuna__ 5 Vertailu- 35 5 ryhmå 56 5 __84__5___ OHC-ryhmå 35 51 tabletti 178,0 56 5 g 830 mg __84__5___ OHC (tuh- 35 51 tabletti 178,9 kaksi 56 5 @510 mg 10 poltettu__84__5___
CaCO-, 35 5 1 tabletti 189,7 (Os-Cal) 56 5 @ 650 mg _I 84 1 5 __ 7. påivåstå 23. påivåån vikojen aiheuttamisen jål-15 keen elåimiå kåsitellåån sarjalla fluoresoivia merkkiai-neita. 5, 8 ja 12 viikon kuluttua 5 elåintå (kullakin ker-ralla) tapetaan. Kudosleikkeet tutkitaan fluoresenssimik-roskoopilla kyseisen leikkaustason sijainnin ja mååritte-lyn ollessa vakioitu luuvika-alueella. Mikroskooppivaloku-20 vat tutkitaan indeksipistejårjestelmållå fluoresenssin intensiteetin, vikakohdan umpeutumisen luonteen ja asteen sekå uuden luun rakenteen perusteella. Tulokset on luetel-tu taulukossa VIII.
27 9 1 8 7 7
Taulukko VIII Koesuunnitelma
Yhteenlaskettujen indeksipisteiden keskiarvo ja keskipoik-keamat eri hoitojen ja kokeen keston mukaan 5 Ryhmåt 35 vuoro- 56 vuoro- 84 vuoro- __kautta__kautta__kautta_
Vertailu__17,8 ± 3,6 22,0 ± 8,5 16,2 ± 2,8 OHC__24,3 ± 4,8 31,8 ± 1,1 34,3 ± 2,4 OHC (tuhkak- 24,4 ± 4,2 28,2 ± 4,1 25,0 ± 12,8 si poltettu____ 10 CaC03 20,0 ± 7,1 27,2 ± 6,3 29,0 ± 6,1 (Os-Cal)
Kolmella hoidetulla ryhmålla kivennåistyminen on huomattavasti parempaa kuin hoitamattomalla vertailuryh-15 målla. Kahteen muuhun vaikuttavaan hoitoon verrattuna hoi-to OHCsllå johtaa luuvikojen paranemisen huomattavaan pa-ranemiseen.
Verrattaessa OHCtllå ja tuhkaksi poltetulla OHCtllå saatuja koetuloksia kåy selvåksi, ettå tuhottaessa orgaa-20 niset aineosat 0HC:n edullinen vaikutus håviåå.
Esimerkki 11 0HC:n vaikutus nivelkondrosyyttien hienorakentee-seen elåinkokeissa OHC:n vaikutusta nivelkondrosyyttien hienorakentee-25 seen kortikoidivaurion jålkeen tutkitaan sarjalla in vivo kokeita, joissa kåytetåån rottia. Kvantitatiivisen mååri-tyksen mahdollistaa uuden, toistettavissa olevan morfomet-risen menetelmån kåytto; ks. M. Annefeld, Int. J. Tiss. Reac. VII (1985), nro 4, 273-289.
30 Kokeet suoritetaan kolmella ryhmållå, joissa kus- sakin on 5 urospuolista Wistar-rottaa. Ensimmåinen on ver-tailuryhmå eikå saa hoitoa. Toiselle ryhmålle annetaan deksametasonia lihakseen ja kolmannelle ryhmålle deksame-tasonia lihakseen ja lisåksi suun kautta OHC:tå. Yhteen- 28 91877 veto koesuunnitelmasta on esitetty taulukossa IX.
Taulukko IX
Ryhma Annos- Annetta- Tutkimuk- Elåinten tus/ vien sen kesto lukumåarå elåin/ lååkean- viikkoina viikko nosten koko-naismaa- ___rå___ 5 Vertailu__-__-__5__5_
Deksame- 2x0,5 mg 10 5 5 tasoni__i.m.____
Deksame- 2x0,5 mg tasoni/ i.m. 10 5 5 10 OHC 5x50 mg p.o. 25 5 5 i.m. = lihakseen; p.o. = suun kautta.
Sen jålkeen kun elaimia on hoidettu 5 viikkoa, ne 15 tapetaan. Kaikki rustokudos kummankin polvinivelen femu-rista ja tibiasta leikataan pois, ja kudos preparoidaan elektronimikroskooppitutkimusta vårten. 50 kondrosyyttia kustakin elaimesta analysoidaan morfometrisesti.
Suhteessa vertailuryhmåån deksametasonilla hoide-20 tuilla elåimillå esiintyy endoplasmaverkon pituuden ja niiden nivelkondrosyyttien Golgin laitteiden kokonaispin-ta-alan pienenemistå kondrosyyttien suuremman kuolemisen ohella. Nåmå elektronimikroskooppihavainnot ovat selvå todiste kortikosteroidien nivelkondrosyyteille aiheutta-25 masta vahingosta.
Elåimillå, joita hoidettiin lisåksi OHCsllå, esiintyy paljon våhåisempåå endoplasmaverkon ja niiden nivelkondrosyyttien Golgin laitteiden pinta-alan pienenemista. OHC alentaa kondrosyyttien kuolemisasteen, jota deksame-30 tasoni oli kohottanut, vertailutason alapuolelle, ja sa-malla OHC myds lisåå mitokondrioiden kokonaispinta-alaa ja tl • * 91877 29 lukumååråå. Nåmå havainnot viittaavat siihen, ettå suun kautta annettuna OHC kiihdyttåå kondrosyyttien metaboliaa. Yhteenveto koetuloksista on esitetty taulukossa X.
5 Taulukko X
Kondrosyyttien hienorakenteen morfometrinen mååritys 5 viikkoa keståneiden testien jålkeen
Ver- Deksametasoni Deksametasoni tailu ____OHC_ endoplasma-10 verkko, koko- naispituus, μιη__28,2 1_21,6__23,6
Golgin laitteet, kokonaispinta- ala (μπτ )__2,58 1_2,12__2,71 2 15 Mitokondrioiden 13,1 1 16,1 1 20,4 2 lukumåårå, koko- naispinta-ala 1,28 - 1,35 1 1,96 2 (m )____
Solujen kuolemi- 20 nen, %_ 2,17 _4,00 1,25_
Deksametasonin ja OHC:n vaikutus 1 = tilastollisesti merkityksellinen ero vertailu- ja tes-tiryhmån vålillå . 25 2 = tilastollisesti merkittåvå ero deksametasonilla ja sekå deksametasonilla ettå 0HC:llå hoidetun ryhmån vålillå p = 0,01 n = 250/ryhmå Tåmån kokeen perusteella voidaan todeta, ettå 30 OHCillå in vitro suoritetuilla solubiologisilla kokeilla saadut tulokset (ks. esimerkit 3-6) pitåvåt paikkansa myos in vivo. Lisåksi tulokset osoittavat, ettå OHC ehkåisee kortikosteroidien tunnettuja negatiivisia vaikutuksia rusto- ja luusoluihin sååtelemållå solujen metaboliaa.
30 91877
Esimerkki 12 OHC:n kåytto luun paranemisen edistamiseen
Tutkitaan kliinisesti OHCsn vaikutusta luunmurtuman paranemiseen plaseboon verrattuna kaksoissokkokokeella.
5 Sattumanvaraisen ryhmiin jarjeståmisen jålkeen 85 saariluunvarsimurtumatapausta hoidetaan kuuden viikon ajan jommalla kummalla kahdesta lååkityksestå. Taulukossa XI on esitetty yhteenveto potilaiden iåsta ja hoitotyypistå.
10 Taulukko XI
Potilaiden lukumaårå 1 400 mg OHC/d 15 > 55 vuotta 13 13 < 55 vuotta 36 23 49 36 20
Saariluunvarsimurtumien paraneminen mååritetåån seuraavien parametrien perusteella: a) liikkumattomuus murtumakohdassa b) kivun puuttuminen 25 c) murtuneen raajan liikkuvuus d) murtuneen raajan maksimikuormitus e) radiologiset havainnot
Vanhempien potilaiden tapauksessa lujittuminen OHC-hoidon vaikutuksesta tapahtuu noin 11 viikon kuluttua, ts.
30 huomattavasti nopeammin kuin plaseboa kaytettåesså (14,2 viikkoa, p < 0,05). Nuorempien potilaiden tapauksessa erolla ei ole tilastollista merkitysta (12,5 viikkoa versus 11,5 viikkoa). Naistå koetuloksista ilmenee, kunhan muistetaan, etta plaseboryhman tapauksessa komplikaatioi- 35 den måara kirurgisia toimenpiteita vaativassa paranteuni-sessa on kolme kertaa suurempi, ettå OHC ediståå murtumien jårjestelmållistå paranemista.
• * 31 91877
Esimerkki 13
Osteoporoosin hoito OHCslla
Tutkitaan OHCsn vaikutusta kortikoidien aiheutta-maan osteoporoosiin vertailututkimuksella.
5 64 potilasta, joiden ikå on våhintåån 50 vuotta ja jotka ovat saaneet kortikosteroideja nivelreuman hoitoon, jaetaan tilastollisesti identtisiin ryhmiin hoitoa vårten. Ryhmån 1 potilaat saavat 4,9 g OHC:ta vuorokaudessa nor-maalin hoitonsa lisaksi. Ryhmån 2 potilaille ei anneta 10 OHC:tå.
Hoitojakson lopussa sååriluun varren lyheneminen ja vårttinåluun tiheyden pieneneminen on huomattavasti våhåi-sempåå OHCsllå hoidetussa ryhmåsså kuin vertailuryhmåsså. Myos muiden parametrien, kuten kyynårluun tiheyden ja sel-15 kåkipujen, osalta ilmenee myos paranemista OHCillå hoidetussa ryhmåsså vertailuryhmåån nåhden mutta ei tilastollisesti merkittåvåsså måårin. Yhteenveto tuloksista on esi-tetty taulukossa XII.
Taulukko XII
20 Luukato-oire-erot 1 vuoden tåydentåvån OHC-hoidon jålkeen
Vertailuryhmå OHC p-arvot Sååriluun pituuden 25 keskim. lyheneminen (cm ± keskipoik- keama) 1,16 = 0,71 0,87 = 0,58 0,01 < p < 0,05 Vårttinåluun tihey-30 den keskim. pienene minen BMC/W ± keski- poikkeama 0,056 = 0,035 0,043 = 0,029 p < 0,05
Kyynårluun tiheyden 35 keskim. pieneneminen BMC/W ± keskipoik- keama 0,033 = 0,031 0,030 = 0,026 n.s.
Nikamien uusien pirstale-40 murtumien måårå radiograf eissa 4 3 n.s.
n.s. = merkitykseton • * 91877 ___ -· 1— 32 OHC-hoito on tuloksellinen myos luukadon etenemisen ehkåisysså steroideilla hoidetussa reumassa. Tutkimuksen perusteella on ilmeistå, ettå OHC-hoito tulisi aloittaa mahdollisimman pian systeemisen kortikosteroidihoidon al-5 kaessa odottamatta luukadon kehittymistå ilmaisevia klii-nisia oireita.
Esimerkki 14
Osteoporoosin hoito OHC:lla kalsiumhoitoon verrat- tuna 10 Tutkitaan kliinisesti D2-vitamiinin, OHCsn ja kal- siumglukonaatin vaikutusta osana alkuvaiheessa olevan mak-sakirroosin hoitoa, joka tila on seurausta nopeasta luuka-dosta.
D2-vitamiinia annetaan parenteraalisesti 65:lie 15 vaihdevuodet ohittaneelle naiselle, joilla on osteoporoot-tisia muutoksia, alkuvaiheessa olevassa maksakirroosissa. Potilaat jaetaan tilastollisin perustein kolmeen ryhmåån. Ensimmåisesså ryhmassa on 22 potilasta, ja se saa ainoas-taan D2-vitamiinia (vertailuryhmå). Toisen ryhmån muodosta-20 vat 21 potilasta saavat 6,6 g 0HC:ta vuorokaudessa D2-vi-tamiinihoitonsa lisåksi. Kolmas ryhma, jossa on 22 potilasta, saa sellaisen annoksen kalsiumia, joka vastaa toi-sen ryhmån potilaille annettavaa OHC-annosta, ts. 4 kal-siumglukonaattiporetablettia vuorokaudessa.
25 14 kuukauden hoidon jålkeen kåy selvåksi, ettå pa- renteraalinen hoito OHCtllå ei riitå pysåyttåmåån luuka-toa, jota mitattiin kåmmenluuindeksin avulla, ja ettå D2-vitamiinin ja kalsiumglukonaatin yhdistelmå on vain juuri ja juuri pysåyttånyt luukadon etenemisen ja ettå vain D2-• 30 vitamiinin ja 0HC:n yhdistelmå saa aikaan tilastollisesti merkityksellisen luun kuoriosan 11,6 %:n lisååntymisen vertailuryhmåån nåhden. Yhteenveto koetuloksista on esi-tetty kuviossa 10.
Nåmå tulokset osoittavat, ettå OHC ei ole yksin-35 omaan pelkkå kalsiumvalmiste.
33 9 1 8 7 7
Esimerkki 15
Osteoporoosin hoito OHCslla 36 potilasta, joita on hoidettu prednisolonilla ja atsatiopriinilla våhintåån vuoden ajan jatkuvasti aktiivi-5 sen autoimmuunihepatiitin johdosta, jaetaan kahteen ryh-måån tilastollisin perustein. Ensimmaisen ryhrnan 18 poti-lasta saavat 6,6 g OHC:ta vuorokaudessa 2 vuoden ajan, kun taas vertailuryhmån 18 potilasta eivåt saa OHC:ta.
Koetulokset saadaan fotodensitometrian ja luubiop-10 sian avulla. Kahden vuoden kuluttua vertailuryhmå on koke-nut tilastollisesti merkityksellisen kyynarluun kivennais-ainepitoisuuden BMC alenemisen ("yksi ainoa" fotodensito-metrinen maåritys) ja suoliluun harjan kuoriosan paksuuden CPT alenemisen (luubiopsia) (ks. kuviot 11 ja 12). Luu-15 biopsiassa havaitaan, etta vertailuryhmåssa on tapahtunut selva ansasluutilavuuden (TBV) pieneneminen (ks. kuvio 12). Toisaalta OHC-hoidon tapauksessa kyynarluun kiven-nåisainepitoisuus såilyy muuttumattomana (ks. kuvio 11), ansasluutilavuus kasvaa ja kuoriosan paksuuden pienenemi-20 nen on tilastollisesti huomattavasti vahaisempåa kuin vertailuryhmåssa (kuvio 12). Kahden vuoden hoitojakson aikana kolmella vertailuryhmållå potilaalla esiintyy nikamadefor-maatioita mutta ei yhdellåkåån OHC-hoitoryhmån potilaalla. Viidellå potilaalla ansasluutilavuus (TBV) on Meunierin 25 olettaman "nikamamurtumakynnyksen" 11 % - 3 % alapuolella, mutta yhdellåkåån neljåstå riskipotilaasta, joita hoidet-tiin 0HC:llå, nikamamurtumaa ei kehity. Kolmella vertailuryhmån potilaalla (TBV > 16 %) esiintyy kuitenkin nikama-deformaatioita, joihin liittyy TBV-tason putoaminen alle 30 11 %:n.
Esimerkki 16 OHC:n vaikutus munasarjan poiston jålkeen
Retrospektiivisesti kontrolloidussa tutkimuksessa kåytetåån tavanomaisia luuspesifisiå parametreja (emåksi-35 sen fosfataasin luuspesifinen isoentsyymi - osteoblasti- merkkiaine; hydroksiproliini virtsassa - osteoplastimerk-kiaine; "tartraattiresistentti" hapan fosfataasi - osteo- 34 9 1 8 7 7 klastimerkkiaine) sen osoittamiseksi, etta toisaalta see-rumin entsyymitaso kohoaa jyrkåsti valittomasti munasarjan poiston jalkeen (merkki suuresta ja voimakkaasta luun muuttumisesta) ja etta toisaalta 9 kuukauden hoito 7,5 5 g:lla OHCsta vuorokaudessa normalisoi lisaantyneen luun muuttumisen ja alentaa siten riskia. Biokemiallisia ha-vaintoja vastaavasti havaitaan luun lisakasvua OHCsta an-nettaessa, ja tåmå voidaan mitata metakarpaalisen indeksin avulla. Kortikaalinen 1,1 - 0,6 %sn luukato vuodessa, joka 10 mitattiin ennen hoitoa, muuttuu OHC-hoidon tapauksessa ti-lastollisesti merkitykselliseksi luun todelliseksi lisåån-tymiseksi 0,2 - 0,3 % vuodessa.
Esimerkki 17 OHC:n vaikutusta selvåsti todetussa osteoporoosissa 15 koskeva tietokonetomografiamittaus 11 potilasta, joilla on osteoporoosi (2 miestå, 9 naista), hoidetaan kahden vuoden ajan 7,5 g:lla OHCsta vuorokaudessa tutkitaan kvantitatiivista tietokonetomogra-fiaa kayttåen; ks. P. Ruegsegger et al., J. Comput. As-20 sist. Tomogr. 5 (1981) 384-390. Potilaiden ikårakenteen perusteella olisi odotettavissa luuhohkatiheyden alenemi-nen keskimaarin 2,7 % vuodessa.
OHC-hoidon tapauksessa kuitenkin kåytånnollisesti katsoen kaikilla hoidetuilla potilailla havaitaan pientå 25 huokoisen luun massan kasvua. Sellaista kasvua on muuten havaittu ainoastaan natriumfluoridihoidon tapauksessa, mutta viimeksi mainitussa tapauksessa vaikutus ei ollut yhtå såånnollinen ja jatkuva ja se havaittiin ainoastaan eråisså potilaissa (vasteelliset). Viimeisimmat tulokset, 30 ks. M.A. Dambacher et al., Bone 7 (1986) 199 - 205, osoit-tavat, ettå tavanomainen hoito (natriumfluoridi tai natriumf luoridin ja kalsiumin yhdistelma) ei pysty eståmåån taudin etenemista (luukatoa ei voida eståå tåydellisesti; nikamien pirstalemurtumien måara kohoaa). Spontaania an-35 sasluun lisååntymistå ei ole tåhån mennesså koskaan havaittu hoitamattomilla potilailla.
Il

Claims (9)

  1. 91877 Patenttivaatimus Menetelmå osseiini-hydroksiapatiittiyhdisteen (OHC) valmistamiseksi, jonka kuiva-aineanalyysiparametrit ovat 5 seuraavat: Aistinvarainen testi Hienosta vShån rakeiseen vaihte- leva, beigenharmaa jauhe, jolla heikko luontainen haju Identtisyys Todettiin kalsium ja fosfataasi
  2. 10 Todettiin kollageeni Vesipitoisuus <7 % Tuhkan kokonaismaSrS 51,3 - 62,7 % Kalsium 19,2 - 23,6 % Fosfori 8,9 - 10,9 %
  3. 15 Kollageeni 23,4 - 28,6 % Ei-kollageenit proteiinit/ peptidit 7,2 - 10,8 % Hivenaineet Todettiin F, Na, K, Mg, Fe, Zn, Cu ja Ni
  4. 20 Fosfataasiaktiivisuus 0,5 - 15 mE/mg EpSnormaali myrkylli- syys Ei merkkeja intoleranssista KokonaismikrobisisSltO <104/g Hiivat <102/g
  5. 25 Enterobakteerit <102/g Erityiset mikrobilajit Ei lMsnd ja jolla on seuraavat biologiset aktiivisuudet: a) osteoblastien, kondrosyyttien ja fibroblastien DNA-synteesia stimuloiva vaikutus, 30 b) kondrosyyttien ja fibroblastien proteiinisyntee- sia stimuloiva vaikutus, c) selektiivisesti kondrosyyttien kokonaiskollagee-nisynteesia stimuloiva vaikutus suhteessa kokonaisproteii-nisynteesin stimulaatioon, ja 35 d) epaspesifisten mesenkyymisolujen erilaistumista 91877 kondrosyyteiksi tax osteoblasteiksi edistavS vaikutus, tunnettu siita, etta a) iåltaan sikioasteisesta noin 12 kuukauden ikai-seen olevasta naudasta peraisin olevat pitkat luut murska- 5 taan niin, etta maksimihiukkaskooksi tulee noin 1 cm, b) mahdollisesti luuhiukkasia kuivataan alennetussa paineessa 20 - 80 °C:ssa, kunnes niiden jaijellå oleva vesipitoisuus on korkeintaan 10 % tai 10 - 25 %, c) saadun luuaineksen pH saadetaan hapolla arvoon 10 5,0 - 5,5, d) sen jålkeen luuaineksesta poistetaan hydrofii-lista ja lipofiilista liuotinta kayttaen vetta ja rasvaa, kunnes jaijelia oleva vesi- ja jaijelia oleva rasvapitoi-suus ovat korkeintaan 5 %, tai siita poistetaan ensin 20 - 15 80 °C:ssa hydrofiilista liuotinta kåyttaen vetta, kunnes jaijellå oleva vesipitoisuus on korkeintaan 5%, ja sen jalkeen 20 - 80 °C:ssa lipofiilista liuotinta kayttaen rasvaa, kunnes jaijelia oleva rasvapitoisuus on korkeintaan 5 %, 20 e) luuainesta, josta on poistettu vetta ja rasvaa, kuivataan alennetussa paineessa 20 - 80 °C:ssa, kunnes saavutetaan korkeintaan 1 %:n liuotinpitoisuus, ja f) luuaines jauhetaan 50 - 300 pm:n hiukkaskokoon ja steriloidaan sen jalkeen. « 91877 Forfarande for produktion av en ossein-hydroxiapa-titforening (OHC) med foljande analysparametrar for torr-5 substansen: Organoleptiskt prov Fint till något granulårt, beige- grått pulver med svag naturlig doft Identitet Kalcium och fosfatas identifierat
  6. 10 Kollagen identifierat Vatteninnehåll <7 % Aska totalt 51,3 - 62,7 % Kalcium 19,2 - 23,6 % Fosfor 8,9 - 10,9 %
  7. 15 Kollagen 23,4 - 28,6 % Icke-kollagena proteiner/ peptider 7,2 - 10,8 % Spåråmnen F, Na, K, Mg, Fe, Zn, Cu och Ni identifierade
  8. 20 Fosfatasaktivitet 0,5 - 15 mE/mg Onormal giftighet inga tecken på intolerans Totalt mikrobinnehåll <10Vg Jåst <102/g Enterobakterier <102/g
  9. 25 Specie11a mikrobarter frånvarande och med foljande biologiska aktiviteter: a) stimulering av DNA-syntesen hos osteoblaster, chondrocyter och fibroblaster, b) stimulering av proteinsyntesen hos chondrocyter 30 och fibroblaster, c) selektiv stimulering av den totala kollagensyn-tesen hos chondrocyter i jåmforelse med stimuleringen av den totala proteinsyntesen, och d) befråmjande av differentieringen av icke-speci-35 fika mesenchymceller till chondrocyter eller osteoblaster, 91877 kånnetecknat dårav, att man a) krossar långa ben av notkreatur i en ålder mel-lan fosterstadiet och 12 månader, så att partikelstorle-ken maximalt biir ca 1 cm, 5 b) eventuellt torkar benpartiklarna vid reducerat tryck vid 20 - 80 °C tilis den kvarvarande vattenmångden Sr maximalt 10 % eller 10 - 25 %, c) reglerar pH vardet hos det erhållna benmaterialet till 5,0 - 5,5 med en syra, 10 d) dårefter avlågsnar vatten och fett ur benmate rialet med ett hydrofilt och lipofilt ldsningsmedel tilis den återstående vatten- och återstående fetthalten år maximalt 5 %, eller forst avlågsnar dårur vattnet med ett hydrofilt ldsningsmedel vid 20 - 80 °C tilis den återstå-15 ende vattenmångden år maximalt 5 % och sedan fettet med ett lipofilt ldsningsmedel vid 20 - 80 °C tilis den återstående fetthalten år maximalt 5 %, e) torkar benmaterialet ur vilket vatten och fett avlågsnats vid reducerat tryck vid 20 - 80 °C tilis den 20 maximala halten ldsningsmedel år 1 %, och f) pulveriserar benmaterialet till en partikelstor-lek på 50 - 300 pm och dårefter steriliserer.
FI871670A 1986-08-05 1987-04-15 Menetelmä osseiini-hydroksiapatiittiyhdisteen valmistamiseksi FI91877C (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3626414 1986-08-05
DE3626414A DE3626414C2 (de) 1986-08-05 1986-08-05 Präparat zur Stimulierung von Chondrocyten und Osteoblasten (Ossein-Hydroxyapatit-Komplex), Verfahren zu seiner Herstellung und dieses enthaltende Arzneimittel

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI871670A0 FI871670A0 (fi) 1987-04-15
FI871670A FI871670A (fi) 1988-02-06
FI91877B FI91877B (fi) 1994-05-13
FI91877C true FI91877C (fi) 1994-08-25

Family

ID=6306689

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI871670A FI91877C (fi) 1986-08-05 1987-04-15 Menetelmä osseiini-hydroksiapatiittiyhdisteen valmistamiseksi

Country Status (20)

Country Link
US (1) US4919931A (fi)
EP (1) EP0255565B1 (fi)
JP (1) JPS6344527A (fi)
KR (2) KR880002897A (fi)
CN (1) CN1028237C (fi)
AR (1) AR242589A1 (fi)
AT (1) ATE77239T1 (fi)
AU (1) AU604014B2 (fi)
CA (1) CA1289878C (fi)
DE (2) DE3626414C2 (fi)
DK (1) DK175488B1 (fi)
ES (1) ES2041647T3 (fi)
FI (1) FI91877C (fi)
GR (1) GR3005579T3 (fi)
HU (1) HU205373B (fi)
IE (1) IE59916B1 (fi)
IL (1) IL82213A (fi)
NO (1) NO173786C (fi)
PT (1) PT84693B (fi)
ZA (1) ZA872701B (fi)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4859467A (en) * 1986-09-25 1989-08-22 Colgate-Palmotive Company Sustained release fluoride composition
US4861590A (en) * 1986-09-25 1989-08-29 Colgate-Palmolive Company Sustained release fluoride and calcium composition
JPH02149618A (ja) * 1988-11-30 1990-06-08 Kobe Steel Ltd 加工性に優れた高強度熱延鋼板の製造方法
CN1045719C (zh) * 1993-04-10 1999-10-20 北京市西城区华新生化技术研究所 口服接骨和治骨质疏松液
ATE251640T1 (de) * 1993-07-23 2003-10-15 Kato Yukio Prof Neues chondrozytprotein
DE59510968D1 (de) * 1994-08-23 2004-12-23 Stoess & Co Gelatine Verwendung von geschmacksneutralem, hydrolysiertem kollagen und mittel enthaltend dasselbe
US5788941A (en) * 1996-01-31 1998-08-04 Steris Corporation Method of sterilization of bone tussue
JPH09238291A (ja) * 1996-02-29 1997-09-09 Sony Corp メニュー操作方法及び電子機器及びテレビジョン受像機
NL1020729C2 (nl) * 2002-05-31 2003-12-02 Gelatine Smits Beheer B V Calciumbevattende samenstelling, werkwijze voor het bereiden daarvan, en farmaceutisch preparaat op basis van de samenstelling.
CN1212126C (zh) * 2002-07-09 2005-07-27 中国科学院长春应用化学研究所 纳米羟基磷灰石补钙剂
JP4369969B2 (ja) * 2007-10-26 2009-11-25 株式会社アールビーエス 生体適合性材料並びにその製造方法
WO2012143324A1 (en) 2011-04-19 2012-10-26 Bioiberica, S.A. Cartilage product
RU2478394C1 (ru) * 2011-11-23 2013-04-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А. Илизарова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Биоматериал для возмещения дефектов костей и способ его получения
WO2015033211A1 (en) 2013-09-05 2015-03-12 Waitaki Biosciences High osteocalcin microcrystalline hydroxyapatite for calcium supplement

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE894895C (de) * 1950-03-06 1953-10-29 Albert Dr Reissner Verfahren zur Herstellung eines Praeparates zur Anregung der Zahnerhaltung
US3400199A (en) * 1965-02-26 1968-09-03 Leslie L. Balassa Wound-healing cartilage powder
BE650626A (fi) * 1962-02-28 1900-01-01
USRE28093E (en) * 1962-02-28 1974-07-30 Wound-healing cartilage powder
DE2425266A1 (de) * 1974-05-24 1975-11-27 Lothar Tischmann Zum einnehmen bestimmtes naehr- und heilmittel aus tierischer knochen-substanz und verfahren zu seiner herstellung
DE2840064C2 (de) * 1978-09-14 1989-09-21 Hans Dr.med. Dr.med.dent. 8000 München Scheicher Verfahren zur Herstellung von Knochenkontaktschichten
US4232425A (en) * 1980-01-15 1980-11-11 Darling & Company Method of producing stabilized bone
US4294753A (en) * 1980-08-04 1981-10-13 The Regents Of The University Of California Bone morphogenetic protein process
US4455256A (en) * 1981-05-05 1984-06-19 The Regents Of The University Of California Bone morphogenetic protein
AU542631B2 (en) * 1980-10-07 1985-02-28 Nordjyske Andelsslagteriers Fabrikker Andelsselskab Producing proteins from bones
US4444752A (en) * 1982-09-13 1984-04-24 Lescarden Ltd. Method for treating progressive systemic sclerosis
US4436720A (en) * 1983-03-04 1984-03-13 Pakhomov Gennady N Granulated treatment-and-prophylactic dental preparation possessing anticarious effect
NZ210699A (en) * 1984-01-04 1989-06-28 Int Genetic Eng Isolation of an osteogenic protein of the p3 immunologically related family
DE3409372A1 (de) * 1984-03-14 1985-09-19 Dr. Ruhland Nachf. GmbH, 8425 Neustadt Material zum vitalisieren von implantatoberflaechen
DE3422466C1 (de) * 1984-06-16 1986-03-20 Lothar 6750 Kaiserslautern Tischmann Verfahren zum Herstellen eines eßbaren, proteinhaltigen Knochenmehlpräparates aus frischen Tierknochen
US4620327A (en) * 1984-07-05 1986-11-04 Caplan Arnold I Process of adapting soluble bone protein for use in stimulating osteoinduction

Also Published As

Publication number Publication date
US4919931A (en) 1990-04-24
IL82213A0 (en) 1987-10-30
IE870983L (en) 1988-02-05
ZA872701B (en) 1987-11-25
DK196387A (da) 1988-02-06
PT84693A (en) 1987-05-01
HUT44047A (en) 1988-01-28
KR880002534A (ko) 1988-05-09
IL82213A (en) 1991-08-16
EP0255565A2 (en) 1988-02-10
DE3779829T2 (de) 1993-01-14
DE3626414C2 (de) 1994-11-10
CN87102744A (zh) 1988-02-17
GR3005579T3 (fi) 1993-06-07
EP0255565B1 (en) 1992-06-17
KR960009651B1 (en) 1996-07-23
NO871599L (no) 1988-02-08
AU604014B2 (en) 1990-12-06
JPS6344527A (ja) 1988-02-25
AR242589A1 (es) 1993-04-30
CN1028237C (zh) 1995-04-19
PT84693B (pt) 1990-06-29
ES2041647T3 (es) 1993-12-01
CA1289878C (en) 1991-10-01
NO871599D0 (no) 1987-04-15
FI871670A (fi) 1988-02-06
NO173786B (no) 1993-10-25
DK175488B1 (da) 2004-11-08
DE3626414A1 (de) 1988-02-11
DE3779829D1 (de) 1992-07-23
JPH0558606B2 (fi) 1993-08-27
FI91877B (fi) 1994-05-13
ATE77239T1 (de) 1992-07-15
AU7157787A (en) 1988-02-11
HU205373B (en) 1992-04-28
KR880002897A (ko) 1988-05-12
FI871670A0 (fi) 1987-04-15
DK196387D0 (da) 1987-04-15
IE59916B1 (en) 1994-04-20
EP0255565A3 (en) 1990-01-31
NO173786C (no) 1994-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI91877C (fi) Menetelmä osseiini-hydroksiapatiittiyhdisteen valmistamiseksi
Rüegsegger et al. Comparison of the treatment effects of ossein-hydroxyapatite compound and calcium carbonate in osteoporotic females
Harris et al. Stimulation of bone formation in vivo by phosphate supplementation
US6344217B1 (en) Putamen OVI
KR100399374B1 (ko) 오가피 추출물 및 이를 포함하는 성장기 뼈 형성 촉진 및 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2008004118A2 (en) Carthamus tinctoris plant extracts for treating osteoporosis and the extraction process thereof
Lang et al. Case report: fibrogenesis imperfecta ossium with early onset: Observations after 20 years of illness
KR100510426B1 (ko) 괴각 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 대사성 질환의예방 및 개선용 식품 조성물
KR101790031B1 (ko) 인삼 추출물, 작약 추출물, 감초 추출물 및 키토산을 유효성분으로 포함하는 폐경 또는 난소절제로 인한 여성 골다공증 예방 또는 치료용 약학적 조성물
Abdullah et al. Aloin Extract on Histopathological Features of Osteogenesis in Fractures of Rattus Norvegicus Wistar Strains
Follis Jr A survey of bone disease
JP2003502377A (ja) キマメ(CajanusCajan(L.)Millsp)の葉及びその抽出物、製剤とそれらの効用
WO2008084283A2 (en) Andrographis paniculata plant extracts for treating osteoporosis and the extraction process thereof
CN100509023C (zh) 一种细胞生长营养素、制备方法,及其成品的用途
WO2009007774A1 (en) Asparagus racemosa extracts for treating osteoporosis and the extraction process thereof
Vujasinović-Stupar et al. Supplementation with bio-calcium from shells Pinctada maxima in postmenopausal women with decreased mineral bone density: Pilot study
US20090280196A1 (en) Cissus quadrangularis plant extracts for treating osteoporosis and the extraction process thereof
WO2008004026A1 (en) Citrus reticulata plant extracts for treating osteoporosis and the extraction process thereof
AU2020200192B2 (en) High osteocalcin microcrystalline hydroxyapatite for calcium supplement
WO2008004119A2 (en) Eugenia jambolana plant extracts for treating osteoporosis and the extraction process thereof
WO2008004121A2 (en) Allium sativum plant extracts for treating osteoporosis and the extraction process thereof
CN100367952C (zh) 一种含有l-苏糖酸钙和大豆异黄酮的组合物
WO2008007214A2 (en) Glycyrrhiza glabra plant extracts for treating osteoporosis and the extraction process thereof
WO2008084282A2 (en) Punica granatum plant extracts for treating osteoporosis and the extraction process thereof
WO2008007216A2 (en) Psoralea corylifolia plant extracts for treating osteoporosis and the extraction process thereof

Legal Events

Date Code Title Description
BB Publication of examined application
FG Patent granted

Owner name: ROBAPHARM AG

MA Patent expired