PT84693B

PT84693B - Processo de producao de uma composicao para estimular condrocitos e osteoblastos (composto de hidroxiapatite de osseina), e de produtos farmaceuticos contendo a referida composicao

Info

Publication number: PT84693B
Application number: PT84693A
Authority: PT
Inventors: Thea Rosenberg
Original assignee: Robapharm Ag
Priority date: 1986-08-05
Filing date: 1987-04-15
Publication date: 1990-06-29
Also published as: EP0255565B1; DE3779829D1; NO871599L; KR880002534A; AR242589A1; DE3779829T2; IE870983L; KR960009651B1; DK196387A; IL82213A0; DK196387D0; GR3005579T3; HUT44047A; JPH0558606B2; KR880002897A; AU604014B2; HU205373B; FI871670L; ATE77239T1; NO173786C

Description

- Introdução

A invenção diz respeito a um composto de hidroxiapatite de osseína (CHO), para a estimulação de condrócitos e osteoblastos. A invenção diz ainda respeito aos métodos de produção do CHO e à sua utilização no fabrico de composições farmacêuticas, especialmente para administração oral, para a profilaxia e o tratamento de osteoartritres e osteoporoses, fracturas dos ossos e de defeitos quer nos ossos quer nas cartilagens.

- Antecedentes da invenção já é conhecida uma composição de hidroxiapatite microcristalina (GHMC) para a prevenção de osteoporoses, baseada na terapêutica por corticosteroides; ver A. -Pines e outros, Current Medicai Research and Opinion”, vol. 8, n² 10, 1984, p. 734-742. A composição q formada por cerca de 50$, em peso, de um sal complexo de hidroxiapatite e fosfato de cálcio. Contem ainda cerca de 26% de colagénio e cerca de 9$ de proteínas/peptidos. Contem também cerca de 0,65$ de sódio, magnésio e potássio e dos seguintes elementos vestigiais: flúor, zinco, estroncio, » A A silicio, ferro, rubidio, cesio e platina. Finalmente a composição contém ainda glicosaminoglicanos, citratos e água. Não se sabe como é fabricada a CHMC.

- Sumário da invenção objectivo da presente invenção é proporcionar um composto de hidroxiapatite de osseína (CHO) e um método para a sua produção. Um segundo objectivo consiste em proporcionar composições farmacêuticas que contenham CHO e que são apropriadas para estimular (proliferar) condrócitos e osteoblastos e que por isso servem para a profilaxia β o tratamento de osteoartrites , osteoporoses, fracturas ósseas e defeitos das cartilagens e dos ossos.

CHO tem um efeito específico no metabolismo dos ossos e

922

Ref: W 157PT

-3cartilagens, devido ao seu conteúdo, em proporções fisiológicamente equilibradas, de componentes orgânicos num estado nãoA w

-desnaturado e de componentes inorgânicos. A aplicaçao de CHO assegura ao organismo humano ou animal um fornecimento de substancias essenciais ao seu sistema osseo (peptidos não-colagenicos específicos dos ossos, factores reguladores das células cartilagíneas e osseos activos localmente, cálcio e fosfato). 0 CHO sustenta o metabolismo ósseo com uma matriz de osseína organica de colagénios e peptidos e proteoglicanos essenciais, não colagenicos, e específicos dos ossos, promove a regeneração dos ossos e aumenta a incorporação, naqueles, de componentes inorgânicos de hidroxiapatite, que estão embebidos na matriz de osseína. Além disso, o CHO estimula os mecanismos de regeneração da cartilagem do corpo e protege o tecido cartilagíneo da degeneração.

CHO exibe uma acção biológica característica nos osteoblastos, células responsáveis pela formação do tecido ósseo. 0 CHO intensifica a proliferação e metabolismo dos osteoblastos e promove a diferenciação das células não específicas do mssenquima em condroblastos e osteoblastos. Assim, o CHO é um novo fármaco para as doenças ósseas de diferentes origens, por exemplo osteoporoses primárias e secundárias, para a cura de fracturas ósseas e defeitos ósseos e para a optimização das próteses. Em virtude das propriedades citobiológicas mencionadas e confirmadas farmacologicamente, in vivo, nos animais e clinicamente em pessoas, torna-se evidente que o CHO é manifestamente superior às preparações de cálcio convencionais e a todas as ósseas. 0 CHO oferece uma alternativa real aos inibidores de ressorção óssea puros, dentro dos produtos terapêuticos da osteoporose, tais como estrogénios e calcitoninas, visto que o CHO não só inibe a ressorção óssea, mas, acima de tudo, promove o crescimento ósseo. 0 CHO distingue-se de todos os outros produtos terapêuticos existentes que são estimulantes do metabolismo ósseo, como por exemplo fluoreto de sódio e difosfonatos, pelo facto de produzir menos efeitos secundários, não produzindo por exemplo efeitos gastroin-

922

Ref: W 157PT

-4testinais secundários nem dores articulares. Os difosfonatos tem uma gama terapêutica muito limitada, enquanto o CHO é virtualmente não tóxica.

Alem disso, o CHO exerce uma acção biológica sobre os condrócitos que são responsáveis pela formação e ressorção do tecido cartilagíneo. Os condrócitos são estimulados pelo CHO, a proliferar e a aumentar o seu metabolismo, sem perda do seu fenótipo, ficando também protegidos contra os efeitos iatrogénicos nocivos como os dos corticosteroides. Por outro lado, o CHO promove a diferenciação das células do mesenquima inespecíficas em condrócitos e assim promove a metaplasia condroide, processo que desempenha o papel mais importante na regeneraçêb do tecido cartilagíneo.

CHO é altamente útil no tratamento da osteoartrite, em que há uma diminuição do número de condrócitos e da sua actlvidade metabólica e em que a regeneração da cartilagem exigirá uma metaplasia condroide regulada. 0 CHO é, para além disso, apropriado para o tratamento de osteoporoses e para auxiliar a cura de fracturas ósseas e de defeitos ósseos e cartilagíneos.

A actividade biológica do CHO pode identificar-se in vitro, por exemplo, da seguinte forma:

a) estimulação da síntese de ADN dos osteoblastos, condrócitos e fibroblastos,

b) estimulação da síntese proteica dos condrócitos e fibroblastos,

c) estimulação selectiva da síntese total do colagénio dos condrócitos, em comparação com a estimulação da síntese proteica total,

d) indução da síntese das. proteínas X e Y nos condrócitos e

e) promoção das células do mesenquima inespecíficas em condrócitos ou osteoblastos.

Na estimulação da síntese total de colagénio a taxa de colagénio do tipo I e II permanece inalterada nas culturas de condrócitos durante 24 horas, preservando assim o fenótipo dos con65 922

Ref: W 157PT

-5drócitos, durante este período.

efeito biológico sobre a síntese do ADN é determinado, da forma habitual, medindo a estimulação da ^H-timidina fixada pelas linhas celulares , por exemplo fibroblastos 3T3; ver Jimenez de Asua e outros, Proc. Nat. Acad. Sei., EUA, vol. 72 (1975), p. 2724 - 2728. Trata-se dúma técnica biológica vulgarmente utilizada para identificar substancias mitogénicas. É vantajoso usar linhas celulares neste método de identificação, visto que são fáceis de cultivar.

Este método de teste baseia-se no facto de os fibroblastos não transformados na cultura de células exibirem dois estados de crescimento extremos. No estado de quiescente as células estão na fase G_q - G₁ e por isso não se dividem. Para além disso há o estado de proliferação activa. A transição do estado quiescente para o estado de proliferação pode ser regulada pela concentração de nutrientes essenciais, soro ou outros factores promotores do crescimento. 0 GHO contém esses factores promotores do crescimento. Eles são solúveis em solventes fisiológicos tampanados de modo neutro, como por exemplo uma solução salina tamponada com fosfato de sódio ou solução salina fisiológica, que exercem um efeito altamente estimulante dependente da dose na fixação de ^H-timidina por parte dos fibroblastos 3T3 quiescentes.

método de esterilização de alimentos e preparações farmacêuticas por irradiação com raios gama, que é usado frequentemente, não diminui a actividade biológica do GHO, medida pelo efeito estimulador da fixação de ¾-timidina dos fibroblastos 3T3.

Este sistema experimental pode também ser usado para determinar a estimulação específica das células na síntese do ADN osteoblástico. Usam-se as populações osteoblásticas obtidas por digestão enzimática sequencial a partir da ratazana calvar ria. As populações de osteoblastos apresentam vários estádios na maturidade dos osteoblastos; as populações I a III são do tipo pré-osteoblasto, as populações IV a VII são do tipo osteoblasto e a população L· é de células do tipo osteoblasto quies-

922

Ref: W 157PT

-6centes ou osteócitos. Os componentes do CHO solubilizados de

A modo neutro tem efeito estimulador dependente da dose, nos osteoblastos das populações V e VI. A proliferação de culturas primárias dos fibroblastos de ratazana analisada em paralelo não foi estimulada. Destas experiências conclui-se que os componentes de GHO solubilizados e neutralisados exibem uma actividade específica das células ósseas.

efeito biológico na síntese das proteínas é determinado duma forma comum, medindo a estimulação das células marcadas •z com L-(5- H)-prolina, por exemplo linhas celulares como os fi3T3 ou . # broplastos/do prepucio humano. Este método baseia-se no facto da síntese das proteínas das células estimuladas aumentar. Se se fornece L-(5- H)-prolina ãs células estimuladas no meio de cultura das células, elas incorporam-na nas novas proteínas sintetizadas. Depois de um determinado período de incubação, mede-se a quantidade de radioactividade fixada, que é uma medida do efeito estimulador. 0 GHO contém componentes solúveis neutros que exercem uma elevada estimulação, dependendo da dose o efeito na síntese de proteínas nos fibroblastos 3T3 e nos fibroblastos do prepucio.

A análise da fosfatase alcalina faz-se de acordo com a recomendação do Deutsche Gesellschaft fur Klinische Chemie, Z. Klin. Chem. and Klin. Biochem., Vol. 8 (1970), p.658; Vol. 9 (1971), p.464; e vol. 10 (1972), p.182. A actividade da fosfatase analisa-se, para o controle de qualidade, em cada estádio, no método da presente invenção.

quadro I resume a composição do CHO (valores obtidos de 150 amostras) determinada por análise.

‘ 65 922

Ref: W 157PT

-7Quadro I

Teste organoletico	PÓ creme-acinzentado, fino a ligeiramente a granular com um cheiro natural fraco
Identificação	- Cálcio e fosfatase iden-
	tificados
	- Colagénio identificado
Teor de água	<7 %
Cinza total	51,3 - 62,7 %
cálcio	19,2 - 23,6 %
Fósforo	8,9 - 10,9 %
Colagénio	23,4 - 28,6 %
Proteinas/Peptideos
não colagénicos	7,2 - 10_;8 %
Elementos vestigiais	F, Na, K, Mg, Fe, Zn, Cu
	e Ni identificados
Actividade da fosfatase	0,5 - 15 mE/mg
Toxicidade anómala	Sem sinais de intolerância
Teor microbiano total	<10⁴ /g
Leveduras	Λ0² /g
Enterobacteriaceas	<io² /g
Espécies de micróbios
específicos	Ausência

- Descrição da Invenção

De acordo com a presente invenção, para produzir CHO, são necessários os seguintes passos:

Primeiro retiram-se os ossos de mamíferos desde o estado fetal ate com cerca de 12 meses de idade que foram examinados por

922

Ref: W 157PT

-8veterinários oficiais. Depois de serem retirados e limpos congelam-se rapidamente os ossos e conservam-se a -20 ou -30°C ate serem necessários; ver figura 1, bloco 1. Antes de serem tratados, os ossos são inspeccionados para ver se ainda estão fresΛ * w cos, o que pode ser determinado pelo cheiro e cor. Também sao inspeccionados para ver se estão limpos e se podem ser usados. Se for necessário verifica-se as dimensões e forma dos ossos, comparando com um manual de anatomia de animais domésticos. Removem-se também restos de carne, tendões e cartilagens.

Se existirem dúvidas sobre a identidade dó animal, pode-se determinar a espécie com a ajuda de reacções imunológicas, por exemplo precipitação.

Trituram-se os ossos num moinho de modo a obterem-se partículas de 1 cm no máximo (ver figura 1, bloco 2). Secam-se as partículas a pressão reduzida, a uma temperatura entre 20 e 80° G, até que o teor de água residual seja' no máximo de 10$ ou entre 10 e 25$ (ver figura 1, blocos 3a e 3b). Leva-se a matéria óssea obtida a um pH de 5,0 a 5,5, usando um ácido, como ácido clorídrico, fosfórico, acético, fórmico ou cítrico. Desidrata-se o material ósseo e desengordura-se usando um solvente hidrofílico e lipofílico, até que o teor máximo de água residual e o conteúdo de gordura residual sejam de cerca de 5$, ou superior desidratando-se primeiro até a um teor de água residual máximo de cerca de 5$, usando um solvente hidrofílico a 20-80°C e desengordura-se então, ate a um teor de gordura residual máximo de cerca de 5$, usando um solvente lipofílico a 20-80°C (ver figura 1, blocos 4a e 4b).

material osseo resultante, desidratado e desengordurado é então seco novamente, a pressão reduzida e a 20-80°C, por exemplo num vortex, até que o teor de solvente máximo seja da ordem de 1$ (ver figura 1, bloco 5).

Conforme a aplicação pretendida, o material ósseo obtido é pulverizado da forma habitual em máquinas de triturar e crivos, obtendo-se pós de várias dimensões de grão que vão de 50 a 300 microns (ver figura 1, bloco 6).

Se o número de micróbios no material ósseo excede 10.000

922

Ref: W 157PT

-9por grama, esteriliza-se da forma habitual, por exemplo tratando com óxido de etileno ou irradiando com raios gama (ver figura 1, blocos 10 a 12). Obtem-se CHO apropriado para produzir medicamentos (ver figura 1, bloco 13). Numa versão alternativa do método da presente invenção, trituram-se num moinho os ossos dos mamíferos até a uma dimensão máxima das partículas de 1 cm (ver figura 2, bloco 2) . Acidificam-se as partículas até a um pH de 5,0 a 5,5. Em seguida são desidratadas e desengorduram-se até que o teor de água e de gordura máximo seja de 5$, usando um solvente hidrofílico e lipofílico, ou desidrata-se primeiro com um solvente hidrofílico á temperatura de 20 a 80°C, até se obter um teor de água residual máximo de 5$ e desengordura-se em seguida, a 20 a 80°C, com um solvente lipofílico, até se obter um teor de gordura residual máximo d· cerca de 5$ (ver figura 2, blocos 3a e 3b).

Seca-se o material ósseo obtido, a pressão reduzida e a uma temperatura entre 20 e 80°C, por exemplo numa corrente em turbilhão, até que o teor de solvente máximo seja de 1$ (ver figura 2, bloco 4). Se fôr necessário, o material ósseo pode ainda ser tratado tal como se descreveu antes (ver figura 2, blocos 5 a 11). Obtém-se CHO apropriado para a produção de medicamentos (figura 2, bloco 12). Os ossos preferíveis para utilizar no método da presente invenção, tal como foi descrito antes, são ossos compridos, tal como o úmero, fémur, tíbia, rádio e cúbito, metacarpo e metatarso. São preferíveis os ossos dos bezerros (Bos taurus).

Para evitar que haja uma desnaturação dos ossos, é necesssário, em cada caso, reduzir a temperatura de desidratação e *

desengorduramento, a medida que diminui a humidade β o teor de solvente. Como já se mencionou, usa-se uma temperatura máxima de 80°C para a desidratação e a secagem. A medida que o teor de água e de solvente diminui, reduz-se a temperatura e a operação desenrola-se muito rapidamente.

Durante as operações de desidratação e de secagem, a pressão máxima e de aproximadamente 0,4 x 105 Pa,

São os exemplos típicos de solventes lipofílicos apropria-

922

Bef: W 157PT

-10dos a acetona, tricloroetileno, cloreto de metlleno e éter de petróleo de baixo ponto de ebulição. São exemplos típicos de solventes hidrofílicos apropriados a acetona, o etanol e o isopropanol.

GHO obtido pode ser transformado, da forma habitual, em produtos farmacêuticos para administração oral, tal como granulados, comprimidos revestidos com um filme, cápsulas, drageias revestidas, pós ou suspensões. As doses diárias são de 0,6 a 10 g, divididas em duas ou três doses individuais. A dose unitária é de 200 a 400 mg. Para produzir grânulos, mistura-se o CHO com agentes de enchimento e aromatizantes, molham-se com /

agua, granula-se e seca-se.

Para produzir comprimidos revestidos por um filme, granula-se o CHO húmido, seca-se e passa-se por um crivo. Mistura-se agentes fluidificantes, lubrificantes e agentes de desintegração. A mistura agora pronta para a moldagem e comprimida e depois revestida com uma laca fina e colorida.

Para produzir drageias revestidas granula-se o CHO húmido, seca-se e passa-se por um crivo. Juntam-se os auxiliares habituais para a preparação de comprimidos e moldam-se os núcleos das drageias, separam-se, dá-se-lhes um revestimento superficial branco coram-se e polem-se.

Para produzir CHO em pó, transforma-se o CHO em grânulos crustáceos, aromatiza-ae e passa-se por um crivo.

Para produzir suspensões, faz-se uma suspensão de CHO com auxiliares que aumentam a viscosidade para melaços. Cora-se e aromatiza-se a suspensão e conserva-se.

A figura 1 mostra o esquema de preparação do CHO, tal como no exemplo 1.

A figura 2 mostra o esquema de preparação do CHO, segundo o exemplo 2.

A figura 3 mostra a estimulação da fixação de H-timidina nos fibroplastos 3T3, provocada por um extracto de CHO. As abcissas mostram a concentração do extracto de CHO em jUl/ ml do meio de cultura. As ordenadas mostram a fixação de H-timidina em cpm x 10 . As barras dao os desvios padrao dos valores me-

922

Ref: W 157PT

-11dios de 9 medidas; coeficiente de correlação 0,917.

A figura 4 mostra a estimulação da fixação de prolina L3

-(5- H) em fibroplastos 3T3 causada pelo soro do bezerro fetal (---) e pelos componentes do CHO (---). As abcissas dão a concentração na amostra analisada em pl/ml do meio de cultura; as ordenadas indicam a fixação de prolina L-(5- H) em cpm x 10 .

- - 3

A figura 5 mostra a estimulação da fixaçao de H-timldina em condrócitos bovinos, em função da dose de CHO 34/4. As abcissas dão a concentração nas amostras analisadas em jug/ml do meio de cultura e as ordenadas dão a fixação de H-timidina em cpm x 10 .

A figura 6 mostra a estimulação da síntese do colagenio e as proteínas totais de condrócitos em culturas de mono camada, em função da concentração de CHO. As abcissas dão a quantidade (jug) de proteína activa ensaiada, usada por ml de cultura. As ordenadas indicam a quantidade (pg) de proteína nova sintetizada x---x e colagenio o---o respectivamente em cada cultura.

A figura 7 mostra a percentagem de aumento do teor de colagónio na proteína total, em função da dose de CHO.

A figura 8 mostra a estimulação da fixação de H-timidina nos fibroblastos 3T3 com extracto de CHO irradiado ou não irradiado. 0 extracto de CHO irradiado exibe um teor de proteína de 690 jug/ml (----) . 0 extracto de CHO não-irradiado exibe um teor de proteína de 670 jug/ml (---). As abcissas dão a concentração do extracto de CHO em pl/2,5 ml do meio de cultura. As ordenadas mostram a fixação de H-timidina em cpm.

A figura 9 mostra a estimulação da fixação de H-timidina nos fibroplastos 3T3, induzida por Lencoll®, Lenphos®, Lensol®, Lensol aglomerado, OSS Pulvit, Mitsubishi Cookies, concentrado osteotrófico, Canzocal, PMC e CHO. As abcissas dão a concentração, na amostra analisada, em jul/ml. do meio de cultura; as or- 3 denadas mostram a fixaçao de H-timidina em cpm.

No sistema citobiológico investigado só o CHO, PMC e Lencoli foram activos.

Extraiu-se 1 g de cada um dos produtos investigados com 10 ml de PBS; analisaram-se as amostras dos produtos centrifu-

922

Bef: W 157PT

-12gados sobrenadantes.

A figura 10 mostra a percentagem de alterações na espessura do córtex dos ossos após 14 meses de tratamento com vitamina D_g, gluconato de cálcio e com CHO. Em comparação com a vitamina Dg, ha um ganho de 11,6$ quando se usa o CHO.

A figura 11 mostra a variação media do BMC o teor mineral do rádio em g/cm em doentes tratados com CHO (---) e com controlos ( ), durante um período de dois anos. Os desvios padrão estão indicados em barras.

A figura 12 mostra as alterações no volume das trabéculas ósseas (VTO) e na espessura do córtex da cristã ilíaca (CPT) em doentes tratados com CHO (-—) e controlos (---), num período de dois anos. Os desvios padrão estão indicados por barras.

Na figura 13, as ordenadas mostram a fixação de H-timidina em cpm, e as abcissas a concentração na amostra investigada em jug/200 yxl de cultura.

A presente invenção ilustra-se, com mais detalhe, pelos exemplos.

Exemplo 1

Preparação de CHO (Método 1)

TJsa-se como material de partida para a produção de CHO, ossos compridos (úmero, fémur, tíbia, rádio, cúblto, metacarpos e metatarsos) de vitelas (bos taurus) com. cerca de 3 meses.

Os animais são examinados por veterinários oficiais. São então abatidos e os ossos são removidos. Os ossos depois de limpos são congelados e armazenados a -20° a -30°C ate um posterior tratamento; ver figura 1, bloco 1).

Antes de qualquer tratamento os ossos são inspeccionados para verificar se são frescos (reconhecíveis pelo cheiro e cor), se estão limpos e para assegurar que são os ossos adequados. Remove-se qualquer carne, tendão ou cartilagem que esteja presente .

No primeiro passo do método, tritura-se, 1600 Kg (1 lote)

922

Ref: W 157PT

-13de ossos congelados, num moinho de aço Inoxidável e com aberturas de 20 mm. A dimensão das partículas de osso esmagadas á d· aproximadamente 1 cm. Mantém-se a temperatura dos ossos abaixo de 0°G durante a trituração; ver figura 1, bloco 2.

Em seguida desidratam-se os ossos triturados num secador de laminas de aço inoxidável, á pressão de 0,97 x 105 Pa a 0,98 x 105 Pa. A água quente está inicialmente a uma temperatura de 90°C e baixa para cerca de 40°C durante a secagem. Quando não destila mais água no colector de condensados (cerca de 10 horas após começar a secagem), desliga-se o aquecimento e seca-se a composição óssea, a pressão reduzida, ate que o teor de água residual seja, no máximo de 10$ (ver figura 1, bloco 3a) ou esteja entre 10 e 25$ (figura 1, bloco 3b). Nesta última operar ção de secagem a temperatura da composição óssea não deve exceder 40°C.

Acidifica-se então a composição óssea ate um pH de 5,0 a 5,5, com ácido cítrico. Desidrata-se novamente a composição óssea seca, a 80 a 20°C e removem-se os lípidos. Para isto pode-se usar acetona ou solvente hidrofílico e lipofílico. A composição óssea pode ser primeiro desidratada com acetona a temperaturas entre 20 e 80°0 e depois desengordurada* usando-se tricloroetileno entre 20 e 80°C. 0btem-se uma composição óssea na qual o teor máximo de água e de gordura é de 5$ (ver figura 1, blocos 4a e 4b). Os resíduos de solvente são removidos por uma corrente turbilhonar a 20 - 80°C e a 0,09 x 105 Pa. 0 teor de solvente residual é de cerca de 1$ (ver figura 1, bloco 5).

A composição óssea resultante e esmagada com um moinho de r.artelo num peneiro de 2 x 20 mm e é crivada num crivo em que o peneiro superior tem uma dimensão de malha de 2,4 mm e cujo peneiro inferior tem uma malha de 0,34mm. Deita-se fora o mar terial que fica retido no peneiro de 0,74 mm. Recolhe-se o material peneirado através do peneiro de 0,34 mm e volta a triturar-se num triturador com um peneiro de 0,8 mm. Finalmente recolhe-se o pó e peneira-se usando um peneiro com uma malha de 0,25 mm e é triturado novamente num triturador com um crivo com orifícios de 0,5 mm. Passa-se então todo o pó por um crivo com

922

Ref: W 157PT

-14uma dimensão de malha de 0,25 mm (ver figura 6, bloco 6) .

quadro II resume os valores analíticos do pó de CHO resultante

Quadro II

Teste organolético	/ Po creme-acinzentado fina a ligeiramente granular com um odor natural fraco	Em ordem
Identificação	- Cálcio e .fosfatase iden-
	tificados	Em ordem
	- Colagénio identificado	Em ordem
Teor de água		6,3$
Cinza total	51,3 - 62,7 %	56,2$
Cálcio	19,2 - 23,6 %	21^57 $
Fósforo	8,9 - 10,9 %	9,71 $
Colagénio	23,4 - 28,6 %	26_;4 $
Proteínas/Peptídeos
não colagénicos	7,2 - 10,8 $	9,0 $
Elementos vestigiais ·	F, Na, K, Mg, Fe, Zn, Cu
	e Ni identificados	Em ordem
Actividade de fos-
fatase	0.5 - 15 mE/mg	3,9 mE/mg
Toxicidade anómala	Sem sinais de intolerân-
	cia	Em ordem
Teor microbiano to-
tal	<10⁴ /g	Aprox. 300
Leveduras boloras	< 10² /g	Ausente
Enterobacteriaceas	<io² /g	Ausente
Espécies específicas	Ausente	Ausente
de micróbios

922

Ref: W 157PT

-15Se a análise mostra que a composição de CHO contem mais do que 10.000 microorganismos por grama, a composição e ainda esterilizada, tratando-a com óxido de etlleno ou por irradiação com raios gama (ver figura 1, blocos 10-12.)

Obtém-se CHO apropriado para a produção de composições farmacêuticas (ver figura 1, bloco 13).

Exemplo 2

Preparação de CHO (método 2) ) Prepara-se uma composição óssea moída, com uma dimensão de partículas máxima de 1 cm, tal como se fez no exemplo 1. Acidifica-se a composição com ácido cítrico ate que o pH esteja entre 5,0 e 5,5. Trata-se tal como no exemplo 1.

Obtém-se uma composição de CHO cujos valores analíticos se indicam no quadro III,

922

Ref: W 157PT

-16Quadrp III

Ensaio organolético	PÓ creme-acinzentadp fino a ligeiramente granulado, com um odor natural fraco	Em ordem
Identificação	- Galcio e fosfatase
	identificados	Em ordem
	- Colagénio identificado	Em ordem
Teor de água	<7 $	6,6^
Ginza total	51,3 - 62,7 <$>	56,07$
Cálcio	19,2 - 23,6 $	21,33 $
Fosforo ..	8,9 - 10,9 $	9,95$
Colagénio	23^4 - 28,6	26,2 $
Proteínas/Peptídeos
não colagénicos	- 10,8 %	8,8 %
Elementos vestiglais	F, Na, K, Mg, Fe, Zn,
	Cu e Ni identificados	Em ordem
Actividade da fosfa-
tase	0,5 - 15 mE/mg	5,4mE/mg
Toxicidade anómala	Sem sinais de intole-
	rancia	Em ordem
Teor microbiano to-
tal	<10⁴ /g	Aprox. 10
Leveduras bolores	<10² /g	Ausente
Enterobacteriáceas	<10² /g	Ausente
Espécies de micro-
bios específicos	Ausente	Ausente

922

Ref: W 157PT

-17Exemplo 3

Estimulação da fixação de H-timidina nos flbroblastos 3T3, induzida pelo CHO

Fez-se uma cultura de flbroblastos 3T3 de ratos suiços (Laboratórios Flow) num meio de Eagle modificado por Dulbecco (ME MD) (Boehringer Manriheim). Acidificou-se o meio para um pH de

6,6 com COg, fez-se uma filtração estéril e juntou-se ao meio 100 unidades/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina (ambas da Boehringer Mannheim) e 3,7 g de NaHC0₃/litro (Merck, Darmstadt). Adicionou-se ainda â cultura 10$ de soro fetal de vitela para a cultura das células. As culturas sub-confluentes crescem em placas de Petri de 90 mm, a 37°C, a uma pressão de 5$ COg. Faz-se uma sub-cultura das células duas vezes por semana, com uma sementeira inicial de 4 x 10^ células por 10 ml de meio de cultura por cada placa de Petri. Em cada uma das investigações descritas a seguir, usaram-se células com 3 a 20 passagens.

ensaio da fixação de H-timidina faz-se tal como foi descrito por L. Jimenez de Asua e outros (Proc. Natl. Acad. Sei., EUA, vol. 72 (1975), p. 2724-2728). Tratam-se com tripsina os flbroblastos 3T3 dos ratos suiços de culturas do caldo descrito antes, usando uma solução estéril de 0,05$ de tripsina/0,02$ de EDTA. Faz-se uma nova suspensão das células em MEMD/10$ de soro fetal de vitela, numa concentração de 4 x 10^ células/ml. Colocam-se amostras de 1 ml da suspensão de células em placas , microtituladoras de 1,9 cm . As células sao incubadas durante 4 dias sem mudança de meio e estabelecem-se camadas confluentes de células não-proliferantes, em repouso. Extrai-se o meio e substitui-se por 1 ml do meio de cultura fresco sem soro fetal de vitela, juntando-se também amostras para serem ensaiadas.

Faz-se uma suspensão de 1 g de CHO, preparado como se indicou nos exemplos 1 ou 2, em 10 ml de uma solução salina tamponada com fosfato sem Mg e Ca (0,2 g KC1, 8 g NaCl, 2,7 g NaHPO^. 12HgO, 0,2 g KHgPO^ por litro.) Agitam-se as amostras

922

Ref: W 157PT

-18durante 2 horas à temperatura ambiente e centrifugam-se durante 15 minutos a 2000 x g.

Adiciona-se, às culturas de fibroblastos 3T3 obtidos antes, aliquotas de 2-500 jul, dos sobrenadantes limpos obtidos apos centrifugação e que contem componentes de CHO solubilizados de uma forma neutra.

Para fazer uma medição de controlo, junta-se as culturas uma quantidade idêntica de cultura fresca. Para um controlo positivo junta-se 2-200 jul de soro fetal de vitela.

Faz-se uma incubação das culturas para análise durante 20 horas a 37°G e sob uma pressão de 5$ de COg. Agita-se com °H-timidina. Marcam-se as células radioactivamente, juntando 10 jul/ml de um meio de cultura, por recipiente, duma solução aquosa de timidina contendo 1 juCi de (metil- H)-timidina (Amersham, RU) e 0,9 jug de metil-timidina (Sigma,EUA).

Depois de se juntar a timidina há um período de incubação de 4 horas, nas condições indicadas antes.

Tratam-se então as amostras contam-se por cintilação. Agita-se o meio de cultura e lava-se a camada das células com uma solução de 0,5 ml de EDTA/PBS a 0,02$. Tratam-se as células com tripsina, tal como se descreveu antes, ate que as células se destaquem completamente. Tratam-se as células em suspensão num aparelho microtitulador da Dynatech donde são automaticamente transferidas para filtros em microfibras de vidro (Whatman 934-AH). Programa-se o aparelho da seguinte forma:

1) lavagem com PBS; 2) precipitação com ácido tricloroacético a 5$ (Merck, Darmstadt); 3) fixação com etanol. Secam-se os filtros de microfibras de vidro e transferem-se para frascos de cintilação. Junta-se 3 ml duma mistura de cintilação (7 g de Permablend Packard num litro de Triton X 100/tolueno numa proporção de 1:3; Merck, Darmstadt), e mede-se a radioactividade das amostras em termos de desintegrações por minuto, num contador de cintilação de liquidos de LKB-Wallac 1217 Rackbeta.

A estimulação máxima provocada pelo CHO atinge apenas metade da estimulação máxima atingida com soro fetal de vitela.

922

Ref: W 157PT

-19Contudq, recorde-se que o soro fetal de vitela contem cerca de 60 vezes mais proteína total do que os extractos de CHO. Assim, 3 * a fixação de H-timidina e estimulada pelos extractos de CHO num grau significativamente superior que quando se usa soro fetal de vitela. Os resultados das medições obtidas quando se usou CHO estão resumidos na figura 3.

sistema de ensaio descrito pode também ser usado para medir a qualidade das composições de CHO obtidas, de acordo com os exemplos 1 ou 2. guando se usa o soro fetal de vitela, como controlo positivo, por um lado como utn controlo interno do sistema de análise citobiológico e, por outro lado, como referencia para os valores obtidos com as amostras de CHO, e possível definir e exprimir uma unidade de actividade que caracterize a actividade biológica das composições de CHO. Isto permite uma normalização da actividade biológica das composições de CHO.

Estimulação da fixação de prolina L-(5- H) nos fibroblastos 3T3 e nos fibroblastos do prepúcio humano induzida pelo CHO

A fixação de prolina pelas células da cultura pode medir-se como no exemplo 3, mas usando prolina L-(5- H) em vez de ^H-timidina, no sistema de cultura de células já descrito. Esta análise determina a taxa de síntese proteica pelas células cultivadas e, através da medição e quantificação da radioactividade absorvida pelas células, permite determinar a actividade biológica dos componentes de CHO. A figura 4 mostra a estimu- lação da fixação de prolina L-(5- H) em fibroblastos 3T3 induzida pelo CHO.

A figura 4 revela que a composição CHO aumenta substancialmente a taxa de síntese proteica nas células investigadas.

922

Ref: W 157PT

-20Exemplo 5

Efeito dos componentes solubilizados e neutralizados de CHO nas culturas de condróoitos de bovinos

Isolam-se os condróoitos das cartilagens das epífises de fetos de vacas, pela forma habitual 50.000 células . Crescem confluentemente durante 4-6 dias, em cada caso com 1 ml do meio F 12 a que se junta 10$ de soro fetal de vitela. Tal como no exemplo 3, tratam-se as culturas de células resultantes com composições de CHO 34/4 obtidas de acordo com os exemplos 1 ou * õ

2. Agitam-se as células com H-timidina, tal como no exemplo

3, e mede-se a radioactividade incorporada.

A figura 5 fornece um resumo dos resultados do primeiro ensaio. Mostra-se a fixação de H-timidina pelos condróoitos de bovino, em resposta â dose de substancias de CHO 34/4.

Torna-se evidente, pelas figuras 6 e 7 que o CHO 35/4 investigado estimula a sintese de proteína total e a taxa de sintese de colagénio.

34/4 e 35/4 significam os numeros de série dos lotes.

Exemplo 6

Efeito dos componentes solubilizados neutros do CHO sobre popu-lações de células ósseas, in vitro

Isolaram-se, essencialmente como descrito por Cohn e col. (Simmons and Kanin (ed.), Skeletal Research, an Experimental Approach, Academic Press, New York, São Francisco, Londres, pp. 3 - 20), várias populações de células ósseas pelo processo de digestão enzir^ática sequencial dependente do tempo de ratazanas Wistar calvaria com um dia de idade com a excepção de que se usou hialurodinase a 0,05 $ como uma enzima adicional a colagenase e tripsina para libertação das células do tecido osseo.

As várias populações de células libertadas durante os 20 minutos de digestão são designadas por números romanos correspondentes á ordem pela qual as fracções de células individuais

922

Ref: W 157Ρ1

-21sao obtidas. A primeira população de células a ser libertada do calvaria é designada por I, e a última fracção de células, libertada durante 1 hora de digestão é designada por L. Os testes funcionais sugeriram que as populações I a II representam, provavelmente, células das células osteoprogenitoras (semelhantes a pré-osteoblastos). As populações IV a VI exibem caracteristicas com caracter semelhante a osteoblastos e as fracções designadas de VII a L podem ser consideradas como células, semelhantes aos osteoblastos quiescentes ou talvez como células semelhantes aos osteocitos,

Colocam-se, em frascos de cultura de tecidos de 250 ml, 10 ml duma suspensão do meio de Eagle modificado (MEM) com 1,5 x 10$ células/ml (com sais de Earle), a que se adiciona soro fetal de vitela a 10$. Depois de uma incubação durante 9-10 dias a 37°C e a uma pressão de COg de 5$, obtem-se camadas de células confluentes, de que se faz uma suspensão com tripsina a 0,2 $. Recolhem-se as células por centrifugação a 400 x g durante 7 minutos. Faz-se uma nova suspensão das pastilhas de células resultantes num meio de MEM a que se adiciona soro fetal de vitela a 20$ e DMSO a 10$ e congelam-se as suspensões em azoto líquido até posterior utilização.

Aquece-se, cuidadosamente, até 37°G, as populações individuais de células ósseas congeladas, e colocam-se em 40 ml de MEM a que se adiciona soro fetal de vitela a 20$. Centrifugam-se durante 7 minutos a 400 x g e faz-se uma nova suspensão, das pastilhas de células resultantes, num meio fresco a que se adiciona soro fetal de vitelas a 10$ e colocam-se em 96 reservató3 * rios placas microtituladoras a uma densidade de 7-10 x 10 células por reservatório. Faz-se uma cultura das células durante 2 dias. Ao terceiro dia subatitui-se o meio de cultura por um meio contendo soro fetal de vitela a 1 ou 2$. Depois de uma incubação durante 24 horas substitui-se novamente o meio por um meio fresco contendo soro fetal de vitela a 1 ou 2$, 0,5 pCi de H-timidina/ml e componentes de CHO solubilizado e neutralizado, em diferentes concentrações. Juntam-se quantidades apropriadas de PBS ás culturas de controlo.

Para verificar se as várias culturas de células respondem

922

Ref: W 157PT

-22às substancias mitogenicas, fizeram-se experiencias usando Factor de Crescimento Epidérmico.

Incubaram-se as culturas de células ósseas durante 24 horas nas condições anteriormente mencionadas, com um meio contendo

3

H-timidina. Mede-se a quantidade de H-timidina incorporada, tal como no exemplo 3.

Os resultados experimentais estão resumidos no Quadro IV, em que cada valor representa a média obtida em 5 passagens e em que se indica também o desvio padrão. Juntam-se os componentes de CHO dissolvidos em PBS ao meio de cultura em quantidades de 5 - õO^qlitros para um volume total de meio de cultura de 200 JUlitros.

922

Ref: W 157PT

-23Populações de células ósseas

Quadro IV

Incorporação de H-timidina para estimulação com componentes V e X de CHO solubilizado e neutralizado, na presença de 1$ SFB* 2 $ SFB* (cpm/reservatórlo + desvio padrão)

P - I

Controlo (PBS)	19022	4·	1630(5)	27656	Ί'	841(5)
Op V	11070		1160(5)	12394		195(5)
Op X	11800	+	508(5)	12678	+	884(5)
P - II
Controlo	19023	+	552(5)	25103	+	344(5)
Op V	15440	+	491(5)	14910	+	611(5)
Op X	13161	+	491(5)	13425	+	940(5)

Controlo	12473	+	582(5)	15159	+	588(5)
Op V	8179	+	433(5)	10105		600(5)
Op X	6735	+	455(5)	9676	+	436(5)
P - IV
Controlo	16482		750(5)	21006	+	711(5)
Op V	9445	+	481(5)	11388	w»	649(5)
Op X	6945	+	178(5)	10356	+	539(5)
P - V
Controlo	18298	+	774(5)	22677		176(5)
Op V	14380		746(5)	16115	+	261(5)
Op X	14866	+	250(5)	18330	+	296(5)
P - VI
Controlo	25789	+	966(5)	37205	+	2553(5)
Op V	23424		1026(5)	28168	+	711(5)
Op x	23346		1239(5)	32107	+	422 (5)
P - VII
Controlo	19405		827(5)	26369	+	1236(5)
Op V	30189	+1327 (5)	41293	+	1769(5)
Op X	37498		994(5)	44817	+	728(5)

922

Ref: W 157pT

-24Quadro IV (cont_.)

P - L

Controlo	13378
Op V	18677
Op X	28488

- 396(5) 18654 - 491(5)

- 523(5) 26816 - 1027(5) ±1241(5) 33411 ± 1220(5) x SFB = Soro fetal de vitela

É evidente, do quadro IV, que os componentes de CHO, soluI bilizado e neutralizado, estimulam a proliferação das populações de células ósseas V e VI, comparadas com as culturas de controlo tratadas com PBS. As populações de células ósseas I e VII não mostram qualquer reacção. Os resultados estão reproduzidos, em forma de gráfico, na figura 13.

Exemplo 7 quadro V resume os resultados das experiencias em que a acção dos componentes de CHO solubilizado e neutralizado (CHO X) foi ensaiado nos fibroblastos de pele do rato.

I

922

Eef: W 157PT

-25Quadro V

Incorporação de H-timidina nos fibroblastos da pele do rato, em resposta a várias concentrações de CHO X

Incorporação de H-timidina (cpm/ /reservatório - desvio padrão)

Sem SFB + 15 jul PPS + 7,5 piCHO λ + 15,0 pi CHO X + 50,0 plCHO X % SFB a 1% + 15 Ml pbs + 7^5 julCHO X + 15,0 JJ1CH0 X + 30,0 mIGHO X % SFB a 2% + 15 yul PBS + 7,5 julCHO X + 15,0 mICHD X + 50 j0 /41 CHO X

450 - 29

485 Í 58

543 t 18

582 - 42

618 - 16

917 - 85

921 - 33

606 - 32

643 t 33

783 t 79

1051 - 23

1127 - 51

1059 - 38

920 - 35

1140 - 57

Dos resultados resumidos no quadro V vê-se que os fibroblastos da pele do rato não podem ser estimulados pelo CHO X.

Se se comparar os resultados apontados nos quadros IV e V, torna-se evidente que a actividade mitogenica do CHO X observada, é específica para os osteoblastos.

Exemplo 8

Medição da actividade biológica do CHO irradiado

Irradia-se o CHO, preparado como nos exemplos 1 ou 2, com kGy (2,5 Mrad). Realiza-se a experiencia como no exemplo 3. Mostram-se os resultados na figura 8.

_ 3

A figura 8 resume os resultados da incorporação de H-timi

922

Ref: W 157PT

-26dina pelos fibroblastos 3T3 por estimulação usando várias quantidades de um extracto de PBS ou CHO irradiado ou não. Da figura 8 verifica-se que a irradiação não afecta a actividade biológica do CHO.

Exemplo 9

Comparação do efeito do CHO com o efeito de preparações conhecidas utilizadas para o mesmo fim

Pesa-se 1 g de cada uma das substancias a ensaiar e coloca-se num frasco de rosca e junta-se 10 ml de PBS. Depois de 2 horas de agitação a temperatura ambiente, centrifuga-se durante 10 minutos a 3600 rpm numa mesa MSE. Decantam-se os sobrenadantes limpos e separam-se os precipitados. Mede-se o teor de proteína das soluções, tal como foi descrito por Bradford (Anal. Biochem. 72 (1976), p.248). A fixação de ³H-timidina nos fibroblastos 3T3 é estimulada, tal como no exemplo 3, e avaliada.

quadro VI indica as preparações que foram comparadas e o seu teor de proteína extraível.

Quadro VI

Quantidade de proteína extraível/ml de solução

Lencoll^	330	Pg
Lenphos®	105	με
r n® Lensol A.	3850	με
Lensol® aglomerado	4200	με
Osspulvit	24	με
Mitsubishi Cookies®	82	pg
PMC®	400	με
Concentrado Osteotrofico	22	pg
Canzocal®	28,5	Mg
CHO (Invenção)	600	pg

922

Ref: W 157PT

-27Os resultados experimentais estão representados na figura

9. As substâncias inactivas não se distinguem do controlo e

A não podem, por isso, ser despistadas. Da figura 9 ve-se que o CHO é marcadamente superior a outros produtos no que se refere a estimulação da síntese de ADN.

Exemplo 10

Efeito do CHO na cicatrização de ossos em experiencias com animais efeito do CHO na cicatrização de ossos foi verificado num estudo em que se usaram 60 coelhos adultos. Utiliza-se um mecanismo de engenharia de precisão para introduzir defeitos nas cartilagens ou ossos, idênticos, no tamanho e cuja localização se situa na epifise femural distai nas articulações dos dois joelhos.

Distribuêm-se os animais ao acaso em 4 grupos de 15 animais cada. Um grupo que não foi tratado actua como controlo. Um l²grupo recebe 830 mg de CHO (178,0 mg de cálcio) diariamente, o 2² grupo recebe 510 mg de cinzas de CHO (isto e, mineral osseo sem ingredientes orgânicos activos; 178,9 mg de cálcio) diariamente e um 3² grupo recebe diariamente 650 mg de carbonato de cálcio (189,7 mg de cálcio). 0 quadro VII pormenoriza o deserrcr lar da experiência.

922

Ref: W 157PT

Quadro VII

Desenrolar da experiencia

Grupo de	Duração post-	N² de	Dose diária	Quantidade adi
ensaio	-operatória da	animais	administrada	cional de Ca n
	experiência	ensaia-	oralmente a	dose diária
		dos	cada animal	(em mg)
Grupo	35	5	-	-
de	56	5
controlo	84	5
Grupo	35	5	1 comprimido
CHO	56	5	0 830 mg	178.0
	84	5
CHO	35	5	1 comprimido
(em cinzas)	56	5	0 510 mg	178.9
	84	5
CaC0₃	35	5	1 comprimido
(Os-Cal)	56	5	& 650 mg	189.7
	84	5
Depois	de 7 a 23 dias	após	a introdução	dos defeitos
tratam-se os animais com uma serie	de marcadores	fluorescentes,
Sacrificam-	se os animais 5	após 5,	8 e 12 semanas respectiva-

mente. Examinam-se os cortes histologicos com um microscópio de fluorescência com uma localização normalizada e uma,definição do plano seccional na região do defeito do osso. Avaliam-se as microfotografias num sistema de pontos indexados baseado na intensidade de fluorescência, natureza e grau do interior do defeito e estrutura do crescimento do novo osso. 0 quadro VIII lista os resultados.

922

Ref: W 157PT

-29Quadro VIII

Medias e desvios padrão do total de pontos indexados de acordo com os diferentes tratamentos e duração do ensaio
Grupos	35 dias	56 dias	84 dias
Controlo	17,8 + 3,6	22,0 + 8,5	16_f2 + 2,8
CHO	24^3 + 4,8	31,8 + 1,1	34,3 + 2,4
CHO (em cinzas)	24,4 + 4,2	28j2 + 4,1	25,0 + 12_f8
CaCOg (Os-Cal)	20_;0 + 7,1	27,2 + 6,3	29,0 + 6,1
A Os tres cativamente foi tratado.	grupos tratados mostram uma mineralização signifiaumentada em relação ao grupo de controlo que não Em contraste com dois outros tratamentos activos

os resultados da terapia com GHO na cura de defeitos dos ossos registou melhorias significativas.

A comparação dos resultados dos ensaios com CHO e com CHO em cinzas, mostra claramente que, se os componentes orgânicos são destruídos, se perde o efeito vantajoso do CHO.

Exemplo 11

Efeito do CHO na pltra-estrutura do condrocito articular em experiências em anirais

Investiga-se, numa serie de testes in vivo com ratos, o efeito do CHO na ultra-estrutura do condrocito articular, após uma lesão causada por corticoides. Foi possível uma avaliação quantitativa pela utilização de um novo método reprodutível morfometricamente; ver M. Annefeld, Int. J. Tiss. Reac., vol. VII /”4.7, (1958) p. 273-289.

As experiências foram feitas com 3 grupos de 5 ratos wistaf.

922

Ref: W 157PT

-30machos. 0 l^s. grupo é um grupo de controlo e não é tratado.

Ao 22. grupo administra-se intramuscularmente dexametasona e ao

32. grupo dá-se, intramuscularmente, dexametasona e ainda CHO por via oral. 0 esquema da experiencia está resumido no quadro IX.

Quadro IX

Grupo	Dose por animal e por semana	total de doses de droga administrada	Duração da experiência em semanas	Numero de animais
Controlo	-	-	5	5
Dexametasona	2x0;5mg im.	10	5	5
Dexametasona/	2xQ\|5mg im.	10	5	5
CHO	5x50mg po.	25	5	5

i.m. = administração intramuscular

p.o. = administração oral

Depois de terem sido tratados durante 5 semanas, sacrifi-: cam-se os animais. Faz-se uma excisão de todo o tecido oartilagínio do fémur e tíbia e das articulações dos joelhos. Prepara-se então o tecido para a microscopia electrónica. Analisam-se, morfometricamente, 50 condrocitos de cada animal.

Comparados com os controles, os animais tratados com dexametasona mostram uma redução no comprimento do retículo endoplásmico e em toda a superfície do aparelho do Golgi dos condrócitos articulares, ao mesmo tempo que se verifica um aumento da mortalidade dos condrócitos. Estas verificações ao microscópio electrónico são uma prova clara das lesões que os corticosteroides podem provocar nos condrócitos articulares.

Os animais que também foram tratados com CHO revelam uma

922

Ref: W 157PT

-31redução muito menor do reticulo endoplasmico e da superfície do aparelho de Golgi dos seus condrócitos articulares. 0 CHO baixa a taxa de mortalidade dos condrócitos, que a dexametasona tinha aumentado, mesmo abaixo do nível do controlo e, ao mesmo tempo, o CHO também aumenta a superfície total e o número de mitocondrias. Estas verificações apontam para o facto de que, após a administração oral, o CHO aumenta o metabolismo dos condrócitos. 0 Quadro X dá um resumo dos resultados dos ensaios.

Quadro X

Determinação morfométrica da ultra-estrutura dos condrócitos depois de 5 semanas de ensaios

Controlo Dexametasona Dexametasona CHO

Comprimento total do retículo endoplásmicQ

jxm		28,2	1	21,6	—	23,6	-
Superfície	total do
aparelho de	Golgi (um^{1 2})	2,58	1	2,12	—	2,71	2
NÚmero de Mitocondrias	13,1	1	16,1	1	20,4	2
superfície	total (jim )	1,28	-	1,35	1	1,96	2
Mortalidade (Λ	das células	2,17		4j00		1^25

Influência da dexametasona e da GHO:

= diferenças estatísticas acentuadas entre os grupos ensaiados e os de controlo

- diferenças estatísticas significativas entre os grupos trar tados com dexametasona e os que foram sujeitos a uma terapia com dexametasona e CHO

922

Rei; W 15721'

-32p = 0,01, n - 250 por grupo

Deste teste pode-se ver que os resultados obtidos nos ensaios citobiológicos com CHO, in vitro (ver exemplos 3 a 6) mantém também a sua validade in vivo. Além disso, os resultados mostram que o CHO evita os efeitos negativos conhecidos dos corticosteroides nas células dos ossos e das cartilagens, por regular o metabolismo das células.

Exemplo 12

Utilização do CHO na_ cicatrização dos ossos

Investigou-se clinicamente num estudo duplamente cego, a influencia do CHO na cicatrização das fracturas ósseas versus o uso dum placebo.

Fez-se um tratamento randomizado de 85 casos de fracturas da diáfise da tíbia, durante seis semanas, com um de dois medicamentos .

quadro XI dá uma panorâmica da idade dos doentes e do tipo de tratamento.

Quadro XI

	Numero de doentes
Placebo	1 400 mg CHO/d
> 55 anos	13	13
<55 anos	36	23
	49	36

A consolidação das fracturas da diáfise da tíbia determiA na-se de acordo com os seguintes parâmetros:

a) imobilidade no local da fractura

A

b) ausência de dor

922

Ref; W 157PT

c) mobilidade da extremidade partida.

d) carga máxima da extremidade partida

e) verificações radiológicas

No caso de doentes idosos a consolidação, por tratamento com CHO ocorre após aproximadamente 11 semanas, isto e, marcadamente mais rápido do que quando se usa um placebo (14,2 semanas, p<0,05) No caso de doentes mais novos, a diferença não tem significado estatístico (12,5 semanas versus 11,5 semanas). Torna-se evidente, a partir destes resultados que o CHO promove a cura das fracturas, se se recordar que, no caso do grupo dos placebos, o número de complicações na cura requer cirurgia num grau 3 vezes mais elevado.

Exemplo 13

Tratamento da osteoporose com CHO

Num estudo controlado, investigou-se a influencia do CHO na osteoporose induzida por corticoides.

Distribui-se, ao acaso, 64 doentes, com pelo menos 50 anos, por grupos estatisticamente idênticos, para serem tratados. Estes doentes tinham tomado corticosteroides para o tratamento de artrite reumática. Os doentes do grupo 1 tomaram diariamente, para além do seu tratamento habitual, 4,9 g de CHO. Aos doentes do grupo 2 não se administrou CHO.

No fim do período de tratamento, a perda na altura do eixo e a redução da densidade do rádio foi marcadamente inferior no grupo tratado com CHO do que no grupo de controlo. Outros parâmetros, tal como a densidade, do cúbito e as dores nas costas melhoram francamente no grupo tratado com CHO, em comparação com o grupo de controlo, mas não atingem significado estatístico. Os resultados estão sistematizados no Quadro XII.

922

Ref: W 157PT

-34 Quadro XII

Diferenças nos índices de osteopenia após ano de tratamento suplementar com CHO

Controlos

CHO Valores de p

Perda média de altura
do eixo + D.P.	1,16 = 0j71	0,87 =	0,58	0,01 < p < 0,05
Perda média da densi-
dade ossea do radio BMC/P + D.P. Perda média da den-	0,056=0,035	0,043=	0,029	p<0,05
sidade óssea do cubito BMC/P i D.P. N⁸ de novas fracturas	0,033=0,031	0,030=	0,026	s.s.
por esmagamento das	4	3		s ,s.

vértebras nas radiografias

s.s. = sem significado tratamento com CHO também tem tido sucesso na prevenção da progressão da osteopenia em reumáticos tratados com esteróides. É evidente do estudo que o tratamento com CHO deve começar tão cedo quanto o tratamento sistemático com corticosteroides, sem esperar que sintomas clínicos evidenciem o desenvolvimento da osteopenia.

922

Ref: W 157PT

-35Exemplo 14

Tratamento da osteoporose com CHO versus cálcio

Num estudo clínico investigou-se o efeito da vitamina Dg, do GHO e do gluconato de cálcio, como parte da terapêutica duma cirrose primária do fígado, condição que resulta numa perda do osso rápida.

Administra-se, parentericamente, vitamina Dg a 65 mulheres post-menopáusicas com alterações osteoporóticas devidas a cirrose hepática primária. Divide-se este conjunto de doentes em 5 grupos, numa base estatística. 0 1® grupo compreende 22 doentes que recebem só vitaminas Dg (controlo). Os 22 doentes, que formam o 2^a grupo, recebem 6,6 g diários de GHO, para alem da sua terapêutica com vitamina D_o. 03® grupo de 22 doentes recebem cálcio numa dose equivalente a dose de CHO dada aos doentes do segundo grupo, isto e, 4 pastilhas efervescentes de gluconato de cálcio por dia.

Após 14 meses de terapêutica, verifica-se que a terapêutica parentérica com vitamina Dg não e, por si só, suficiente para parar a perda de osso, que é medida por meio de um índice metacárpico. Verifica-se ainda que a combinação de vitamina Dg e gluconato de cálcio só muito tenuemente faz parar a perda de osso e que só a combinação de vitamina Dg com CHO produz um ganho de 11,6% no córtex do osso significativo, sob o ponto de vista estatístico, quando comparado com o controlo. Os resultados da experiência estão resumidos na figura 10.

Estes ensaios mostram que o CHO não é simplesmente uma preparação de cálcio.

Exemplo 15

Tratamento da osteoporose com CHO

Dividiram-se 36 doentes em 2 grupos, numa base estatística. Estes doentes tinham estado a ser tratados com prednisolona e azatioprina durante pelo menos um ano, em virtude de uma hepatite autoimune cronicamente activa. Os 18 doentes do 1® grupo recebem, durante 2 anos, uma dose diária de 6,6 g de CHO, enquan65 922

Ref: W 157PT

-36to os 18 doentes do grupo de controlo não recebem CHO.

Obtêm-se os resultados dos ensaios por fotodensimetria e com a ajuda de biópsias dos ossos. Após dois anos o grupo de controlo sofreu uma redução significativa, sob o ponto de vista estatístico, no teor de minerais do BMC do rádio (fotodensimetria simples) e na espessura do córtex do CPT da cristã ilíaca (biópsia do osso) (ver figuras 11 e 12). Verifica-se, na biópsia do osso, que no grupo de controlo houve uma redução nítida do volume das trabéculas ósseas (VTO) (ver figura 12). No caso de terapêutica com CHO, por outro lado, o teor de minerais do rádio permanece constante (ver figura 11), o volume das trabéculas do osso aumenta e a redução da espessura do córtex e . significativamente menor, sob o ponto de visto estatístico, do que no grupo de controlo (figura 12). Durante o período de 2 anos de tratamento, 3 doentes do grupo de controlo exibiam deformações vertebrais, mas isso não acontecia a um único doente do grupo do CHO. 5 doentes exibiam um volume das trabéculas do osso (VTD) 11$ + 3$ abaixo do ”limiar da fractura vertebral” postulado por Meunier e nenhum dos 4 doentes em risco, que foram tratados com CHO, desenvolveram fracturas vertebrais. Contudo, 3 doentes do controlo (VTO 16$) exibiam deformações vertebais, acompanhadas por descidas dos niveis de VTO abaixo de ( 11A

Exemplo 16 efeito do CHO após ooforectomía

A

Num estudo controlado retrospectivamente usou-se os parâmetros convencionais específicos dos ossos (a isoenzima de fosfar tase alcalina especifica do osso - marcador dos osteoblastos; hídroxiprolina na urina - marcador dos osteoclastos; fosfatase ácida ”resistente ao tartarato” - marcador dos osteoclastos), para mostrar que, por um lado, os niveis de enzimas no soro sobem rapidamente, imediatamente após ooforectomía (um sinal de elevada e intensiva destruição dos ossos) e, por outro lado, a terapêutica diária de 7,5 g de CHO durante 9 meses, normaliza

922

Ref: W 157PT

-37os niveis aumentados de destruição do osso, diminuindo assim o risco. Paralelamente âs verificações bioquímicas, verifica-se que há um ganho de osso quando se administra CHO, o que pode ser medido por meio de um índice metacárpico. A perda óssea cortical de 1,1 + 0,6% por ano que se mediu antes da terapêutica, altera-se, no caso da terapêutica com CHO, para um ganho de osso positivo de 0,2 + 0,3% por ano, significativo sob o ponto de vista estatístico.

Exemplo 17

Medição por tomografia computorizada do efeito do CHO na osteoporose manifesta

Tratou-se 11 doentes osteoporóticos (2 homens e 9 mulheres), durante 2 anos, com uma dose diária de 7,5 g de CHO e examinou-se os doentes usando tomografia computorizada quantitativa; ver P. Ruegsegger e outros, J. Comput. Assist. Tomogr., 5 (1981) p. 384 - 390. Com base na idade dos doentes, seria de esperar uma perda média da densidade esponjosa da ordem de 2,7% por ano.

Contudo, no caso da terapêutica com CHO, virtualmente todos os doentes tratados exibiam um pequeno aumento da massa esponjosa do osso. Tal aumento só tinha sido observado no caso de terapêuticas com fluoreto de sódio, mas, mesmo neste caso, o efeito não era tão regular e contínuo e só foi observado nalguns doentes. Os últimos resultados (ver M.A. Dambacher e outros, Bone, 7, p. 199-205 (1986)) mostram que a terapêutica convencional na osteoporose (fluoreto de sódio ou combinação de fluoreto de sódio e cálcio) não podem parar a progressão da doença (a perda de osso não pode ser inibida completamente; a taxa de fracturas por esmagamento de vértebras aumenta). 0 ganho espontâneo das trabéculas do osso em pacientes sem tratamento nunca foi observado.

Claims

- Processo de produção de um composto de hidroxiapa

19.

tite de osseína (CHO) com as ticas da substância seca:

Teste organolético

Identificação

Teor de água

Cinza total

Cálcio

Fósforo

Colagenio

Proteínas/peptidos não colagenio os

Elementos vestlglais

Actividade de fosfatase Toxicidade anómala Teor microbiano total Leveduras

Enterobacteriáceaa Espécie de micróbios específicos seguintes características analí

Po creme-acinzentado fino a ligeiramente granular, odor natural fraco

- Cálcio e fosfatase identi ficados

- Colagenio identificado Z7 $

51.3 - 62,7 $

19,2 - 23,6 %

8,9 - 10,9 %

23.4 - 28,6 $

7,2 - 10,8 $

F, Na, K, Mg, Fe, Zn,

Cu e Ni identificados

0,5 - 15 mE/mg

Sem sinais de intolerância < 10¼ i 10?/g <102/8

Ausente e apresentando actividade biológica sobre:

a) estimulação da síntese de ADN dos osteoblastos, con drócitos e f ibroblastos,

b) estimulação da síntese de proteínas dos condrócitos e fibroblastos,

c) estimulação selectiva da síntese de colagenio total

65 922

Ref: W 157 PT

-39dos condrócitos em comparação com a estimulação da síntese de proteína total,

d) Indução da síntese de proteínas x e y nos condrócitos, e

e) promoção da diferenciação de células inespecíficas do mesenquima para condrocitos ou osteoblastos, caracterizado pelo facto de compreender:

a) triturarem-se ossos de mamíferos desde a idade fetal até cerca de 12 meses de idade, para se obterem partículas com a dimensão máxima de 1 cm,

b) secarem-se as partículas de osso a pressão reduzida e a temperaturas entre 20 e 80^0, até que o teor de água residual máximo seja de 10$ ou entre 10 e 25$,

c) acidificar-se o material ósseo resultante para um pH entre 5 >0 ® 5 »5 »

d) desidratar-se e desengordurar-se com um solvente hidrofílico e llpofílico até que o teor de água residual e de gordura residual seja no máximo de 5$ ou desidratar-se com um solvente hidrofílico entre 20 e 802C até que o teor de água residual seja no máximo de 5% ® desengordurar-se então com um solvente lipofílico entre 20 e 80^0 ate que o teor máximo de gordura residual seja de 5$,

e) secar-se 0 material ósseo desidratado e desengordura do, a pressão reduzida e a uma temperatura de 20 a 80^fi0 até que 0 teor máximo de solvente seja da ordem de 1%, e

f) pulverizar-se o material ósseo até a uma dimensão de partículas de 50 a 500 micrómetros e depois esterilizar-se;
2*. - Processo de produção de um composto de hidroxiapatite de osseína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de

a) triturarem-se ossos de mamíferos desde a idade fetal até cerca de 12 meses de idade, produzindo partículas com a

-40dimensão máximo de 1 cm»

b) acidificarem-se as partículas para um pH entre 5,0 e 5,5,

c) desidratarem-se e desengordurarem-se com um solvente hidrofílico e lipofílico ate que o teor residual máximo de água e de gordura seja da ordem de 5$, ou desidratar-se com um solvente hidrofílico a 20-80*C até que o teor residual máximo de água seja de 5$ e depois desengordurar-se com um solvente lipofílico a 20-8020 ate que o teor residual máximo de gordura seja 5$,

d) secar-se o material ósseo desidratado e desengordurado, a pressão reduzida e a uma temperatura entre 20 e 8020, até que o teor máximo de solvente seja de cerca de 1$ e

e) pulverizar-se o material ósseo para se obterem parti, culaa com uma dimensão de 50 ^a 300 miçrómetros e depois esterillzar-se.

5⁵· - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por se usarem ossos compridos.
4*. - Processo de acordo com qualquer daa reivindicações 1 ou 2, caracterizado por se usarem ossos longos de vitelos.
5^?. - Processo de preparação de uma composição farmacêutica, para administração oral, caracterizado por se associar um composto de hidroxiapatite de osseína, preparado de acordo com a reivindicação 1 com, eventualmente, auxiliares e aditivos .