NO173786B - Fremgangsmaate for fremstilling av en osseinhydroksyapatittforbindelse (ohc) - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av en osseinhydroksyapatittforblndelse (OHC). Forbindelsen stimulerer kondrocytter og osteoblaster og kan anvendes for profylakse og behandling av osteoartritt og osteoporose og for heling av benbrudd, bruskdefekter og bendefekter.

En mikrokrystallinsk hydroksyapatittsammensetning (MCHC) for forebyggelse av osteoporose basert på en kortlkosteroid terapi er allerede kjent; se A. Pines et al., Current Medical Research and Opinion, bind 8, nr. 10, 1984, side 734-742. Sammensetningen innbefatter i et omfang på ca. 50 vekt-% et komplekssalt av hydroksyapatitt og kalsiumfosfat. Den inneholder videre ca. 26% kollagen og ca. 9% ikke-kollageniske proteiner/peptider. I tillegg inneholder den ca. 0,65% natrium så vel som magnesium og kalium og som sporele-menter fluor, sink, strontium, silisium, jern, rubidium, cesium og platina. Endelig inneholder sammensetningen glukosaminglykaner, citrat og vann. Det er ikke kjent hvordan MCHC fremstilles.

Formålet med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av en osseinhydroksyapatittforbindelse (OHC).

OHC er funnet å ha en spesifikk virkning på metabolismen av ben og brusk, for den inneholder organiske komponenter i ikke-denaturert tilstand og også uorganiske komponenter i fysiologisk avbalanserte andeler. Anvendelse av OHC sikrer at menneske- og dyreorganismer tilføres stoffer som er essensielle for skjelettsystemet (ikke-kollageniske ben-spesifikke peptider, lokalt aktive ben- og bruskcelleregulerende faktorer, kalsium og fosfat). OHC understøtter benmetabolismen med en organisk osseinmatriks av kollagener og essensielle, ben-spesifikke, ikke-kollageniske peptider og proteoglykaner, fremmer benregenerering og forøker inkor-poreringen i benene av de uorganiske komponentene av hydroksyapatitt som er innstøpt i osseinmatriksen. Videre stimulerer OHC kroppens bruskreparasjonsmekanismer og beskytter bruskvev mot nedbrytning.

OHC viser en karakteristisk biologisk virkning på osteoblaster, cellene som er ansvarlige for regenerering av benvev. OHC intensiverer formeringen og metabolismen av osteoblaster og fremmer videre differensieringen av ikke-spesifikke mesenkymceller for kondroblaster og osteoblaster. Følgelig er OHC et nytt helbredelsesmiddel for bensykdommer av forskjel-lig genese, f.eks. primære og sekundære osteoporoser og ved heling av benbrudd og bendefekter og for optimalisering av proteseinnsetning. Det fremgår fra de nevnte cytobiologiske egenskapene, som ble bekreftet in vivo farmakologisk i dyr og klinisk i mennesker, at OHC er klart overlegen konvensjonelle kalsiumpreparater og alle benmel. OHC utgjør et reelt alternativ til de rene benresorpsjonsinhibitorene i terapeutiske preparater for osteoporose, så som østrogener og kalsitoniner, idet OHC ikke bare inhiberer benresorpsjon, men fremfor alt fremmer benvekst. OHC adskiller seg fra de eksisterende terapeutiske produktene som på tilsvarende måte stimulerer benmetabolismen, f.eks. natriumfluorid og difosfonater, ved det faktum at den gir færre bivirkninger, den gir f.eks. ikke de gastrointenstinale bivirkningene og de verkende leddene. Difosfonater har et meget trangt terapeu-tisk område, mens OHC er tilnærmet fullstendig ikke-toksisk.

I tillegg utøver OHC en biologisk virkning på kondrocytter, som er ansvarlige for dannelsen og resorpsjonen av bruskvevet. Uten tap av deres fenotype stimuleres kondrocytter av OHC til formering og metabolismen økes, så vel som de beskyttes mot iatrogene skadelige faktorer så som korti-kosteroider. Videre fremmer OHC differensieringen av uspesifikke . mesenkymceller for kondrocytter og fremmer følgelig kondroidmetaplasia, en prosess som spiller en hovedrolle ved regenereringen av bruskvev.

OHC er derfor ytterst nyttig ved behandlingen av osteoartritt, hvor det forekommer en reduksjon i antallet kondrocytter og deres metaboliske aktivitet og hvor regenerering av brusken ville kreve ordnet kondroidmetaplasia. OHC er videre egnet ved behandling av osteoporose og ved understøttelse av helingen av benbrudd og av ben og bruskdefekter.

Den biologiske aktivitet av OHC kan identifiseres in vitro som f.eks.,

a) stimulering av DNA syntesen av osteoblaster, kondrocytter og fibroblaster, b) stimulering av proteinsyntesen av kondrocytter og fibroblaster, c) selektiv stimulering av den kollageniske totalsyntesen av kondrocytter sammenlignet med stimulering av den samlede

proteinsyntesen, og

d) fremmelse av differensieringen av ikke-spesifikke mesenkymceller til kondrocytter eller osteoblaster.

Ved stimuleringen av kollagenisk totalsyntese forblir forholdet mellom kollagentype I og II uendret i kondrocytt-kulturer i løpet av 24 timer, derved bevares fenotypen for, kondrocyttene over dette tidsrommet.

Den biologiske virkningen av DNA syntese bestemmes på en vanlig benyttet måte ved å måle stimuleringen av <3>H-tymidin-opptaket av cellelinjer, f.eks. 3T3 fibroblaster; se Jimenez de Asua et al., Proe. Nat. Sei. USA, bind 72 (1975), 2724-2728. Dette er en vanlig benyttet biologisk teknikk for identifisering av mitogene stoffer. Det er fordelaktig å benytte cellelinjer ved denne identifikasjonsfremgangsmåten idet cellelinjer er enkle å dyrke.

Denne forsøksfremgangsmåten er basert på det forhold at utransformerte fibroblaster i cellekulturen viser to ekstreme veksttilstander. I hvilke tilstanden er cellene i Gq-G^ fasen og deler seg derfor ikke. I tillegg finnes tilstanden av aktiv formering. Overgang fra hviletilstand til formerings-tilstand kan reguleres ved konsentrasjonen av essensielle næringsmidler, serum eller andre vekstfremmende faktorer. OHC inneholder slike vekstfremmende faktorer. Sistnevnte er oppløselig i nøytralt bufrede fysiologiske oppløsningsmidler så som fosfatbufret saltvannsoppløsning (PBS) eller fysiologisk saltvann, og det bevirker et meget stimulerende, dose-relatert opptak av <3>H-tymidin av hvilende 3T3 fibroblaster.

Den ofte benyttede fremgangsmåten for sterilisering av matvarer og farmasøytiske preparater ved bestråling med gammastråler nedsetter ikke den biologiske aktiviteten av OHC målt ved stimuleringsvirkningen av <3>H-tymidinopptaket for 3T3 fibroblaster.

Dette forsøkssystemet kan også benyttes for å bestemme den cellespesifikke stimuleringen av osteoblast DNA syntesen. Osteoblastpopulasjoner ble benyttet. Osteoblastpopulasjonene representerer forskjellige modenhetstrinn for osteoblastene; populasjoner I til III betraktes som tilhørende preosteo-blasttypen, populasjoner IV til VII som tilhørende osteo-blasttypen og populasjonen L som hvilende osteoblasttypecel-ler eller osteocytter.

Nøytralt oppløseliggjorte OHC komponenter har en doseavhengig stimulerende virkning på osteoblastene av populasjoner V og VI. Formering av primære kulturer av rottefibroblaster analysert parallelt stimuleres ikke. Det følger fra disse eksperimentelle funnene at de nøytralt oppløseliggjorte OHC komponentene viser bencelle-spesifikk aktivitet.

Den biologiske virkningen på proteinsyntesen bestemmes ved en vanlig benyttet fremgangsmåte ved å måle stimuleringen av L-(5-<3>H)-prolinopptaket for celler, f.eks. cellelinjer så som 3T3 fibroblaster, eller fibroblaster fra human forhud. Denne fremgangsmåten er basert på det faktum at proteinsyntesen for stimulerte celler øker. Dersom L-(5-<3>H)-prolin stilles til rådighet for de stimulerte cellene i cellekulturmediet inkorporerer de dette i det nysyntetiserte proteinene. Etter en fastsatt inkuberingsperiode måles omfanget av radioak-tiv! tetsopptak , dette er et mål for stimuleringsvirkningen. OHC inneholder nøytralt oppløseliggjorte komponenter som utøver en meget stimulerende, doseavhengig virkning på proteinsyntesen i 3T3 fibroblaster og fibroblaster fra human forhud.

Den alkaliske fosfataseanalysen gjennomføres ved fremgangsmåten anbefalt av Deutsche Gesellschaft flir klinische Chemie, Z. Klin. Chem. og Klin. Biochem., bind 8 (1970), 658; bind 9 (1971), 464; og bind 10 (1972), 182. Fosfatase-aktiviteten analyseres for kvalitetskontrollformål ved ethvert trinn i fremgangsmåten Ifølge oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av en osseinhydroksyapatittforbindelse (OHC) med de følgende analytiske parametere for tørrstoffet:

Spesifikke mikrobespesies Fraværende

og ved følgende biologiske aktiviteter:

a) stimulering av DNA syntesen av osteoblaster, kondrocytter og fibroblaster, b) stimulering av proteinsyntesen av kondrocytter og fibroblaster, c) selektiv stimulering av den kollageniske totalsyntesen av kondrocytter sammenlignet med stimulering av samlet

proteinsyntese, og

d) fremmelse av differensieringen av ikke-spesifikke mesenkymceller til kondrocytter eller osteoblaster.

Fremgangsmåten er kjennetegnet ved at

a) ben fra pattedyr fra fosterstadiet til ca. 12 måneder gamle nedknuses til partikkelstørrelse på maksimalt 1 cm, b) benpartiklene tørkes ved redusert trykk ved 20 til 80° C til et restvanninnhold på maksimalt ca. 10 % eller 10 til 25 56, c) det resulterende benmaterlalet bringes til pH 5,0 til 5,5 méd en syre, d) deretter dehydratiseres og avfettes med et hydrofilt og llpofilt oppløsningsmiddel opp til et restvann- og restfettinnhold på 5 % maksimal, eller det dehydratiseres med et hydrofilt oppløsningsmiddel ved 20 til 80° C til et restvanninnhold på 5 % maksimalt, og deretter avfettes med et lipofilt oppløsningsmiddel ved 20 til 80° C opp til

et restfettinnhold på 5 % maksimalt,

e) det dehydratiserte og avfettede benmaterlalet tørkes ved redusert trykk ved 20 til 80° C til et maksimalt opp-løsningsmiddelinnhold på 1 Sé, og f) benmaterlalet pulveriseres til en partikkelstørrelse på 50 til 300 jjm og steriliseres deretter.

Ifølge oppfinnelsen gjennomføres følgende trinn for å fremstille OHC: Først fjernes benene fra pattedyr fra fosterstadiet til ca. 12 måneder gamle, etter at dyrene er undersøkt av godkjente veterinærer. Etter at de er fjernet, dypfryses de rene benene raskt og holdes ved -20 til -30°C inntil de skal benyttes; se fig. 1, boks 1. Før de bearbeides videre, undersøkes benene for å fastslå at de fremdeles er friske, hvilken kan bestemmes ved fargen og lukten. Benene undersøkes også for å fastslå at de er rene og virkelig er de benene som kreves. Om nødvendig undersøkes benene vedrørende størrelse og form ved hjelp av en manual som viser husdyrenes anatomi. Eventuelle gjenværende rester av kjøtt, sener og brusk fjernes også.

Hvis det foreligger noen tvil om dyrets identitet kan spesies også bestemmes ved hjelp av vanlige immunologiske reaksjoner, f.eks. utfelling.

Benene knuses deretter i en mølle til en partikkelstørrelse på 1 cm maksimalt (se fig. 1, boks 2). Benpartiklene tørkes deretter under redusert trykk ved 20-80°C inntil restvanninnholdet er rundt 10% maksimalt, eller mellom 10 og 25% (se fig. 1, boks 3a og 3b). Benmaterlalet som derved oppnås bringes deretter til en pH på 5,0 til 5,5 ved anvendelse av en syre som f.eks. saltsyre, fosforsyre, eddiksyre, maursyre eller sitronsyre. Deretter dehydratiseres benmaterlalet og avfettes ved anvendelse av et hydrofilt og lipofilt opp-løsningsmiddel til et maksimalt gjenværende vanninnhold og gjenværende fettinnhold på ca. 5%, eller dehydratiseres først til et maksimalt gjenværende vanninnhold på 5% ved anvendelse av et hydrofilt oppløsningsmiddel ved 20 til 80% og avfettes deretter til et gjenværende fettinnhold på 5% maksimalt ved anvendelse av et lipofilt oppløsningsmiddel ved 20 til 80"C, (se fig. 1, boks 4a og 4b).

Det resulterende dehydratiserte og avfettede benmaterlalet tørkes deretter videre under redusert trykk ved 20 til 80°C, f.eks. i en virveltørker, inntil et maksimalt oppløsnings-middel innhold på 1% er nådd (se fig. 1, boks 5).

Avhengig av den planlagte anvendelsen pulveriseres det oppnådde benmaterlalet deretter på normal måte i male- og siktemaskiner til pulver av varierende kornstørrelse fra 50 til 300 pm (se fig. 1, boks 6).

Dersom antallet mikrober i benmaterlalet overskrider ca.

10 000 pr. g, steriliseres benmaterlalet på vanlig måte, f.eks. ved å behandle det med etylenoksyd eller ved bestråling med gammastråler (se fig. 1, boks 10 til 12). OHC som er egnet for fremstilling av legemidler oppnås (se fig. 1, boks 13).

I en alternativ utgave av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, nedknuses pattedyrben som beskrevet ovenfor til en maksimal partikkelstørrelse på 1 cm, f.eks. i en mølle (se fig. 2, boks 2). Benpartiklene bringes deretter til en pH på 5,0 til 5,5 med en syre. Deretter dehydreres de og avfettes til et maksimalt gjenværende vann- og fettinnhold på 5% ved anvendelse av et hydrofilt og lipofilt oppløsningsmiddel, eller det dehydratiseres først med et hydrofilt oppløsnings-middel ved 20 til 80°C til et maksimalt gjenværende vanninnhold på 5% og det avfettes deretter med et lipofilt opp-løsningsmiddel ved 20 til 80"C til et maksimalt gjenværende fettinnhold på 5% (se fig. 2, boks 3a og 3b).

Det resulterende dehydratiserte og avfettede benmaterlalet tørkes deretter videre under redusert trykk ved 20 til 80"C, f.eks. i en virvelstrøm, inntil et maksimalt oppløsningsmid-del innhold på 1% er nådd (se fig. 2, boks 4). Om nødvendig, kan benmaterlalet bearbeides ytterligere som beskrevet ovenfor (se fig. 2, bokser 5 til og med 11). Det oppnås OHC som er egnet for fremstilling av legemidler (fig. 2, boks 12).

Foretrukne ben for anvendelse ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen som angitt ovenfor er lange ben så som humurus, femur, tibia, radius og ulna, os metacarpale eller os metatarsale. Videre anvendes fortrinnsvis ben fra oksekalver (Bos taurus ).

Det er åpenbart at for å forhindre at produktet blir denaturert er det nødvendig i hvert tilfelle å redusere tørke- og avfettingstemperaturen ettersom fuktigheten og oppløsningsmiddelinnholdet avtar. Som allerede nevnt, anvendes en maksimal temperatur på 80° C for dehydratisering og tørking. Ettersom vann- og oppløsningsmiddelinnholdet avtar, reduseres temperaturen og operasjonen utføres meget raskt.

Under dehydratiserings- og tørkeoperasjonen er trykket maksimalt 400 mbar.

Typiske eksempler på egnede lipofile oppløsningsmidler er aceton, trikloretylen, metylenklorid og lavtkokende petro-leumseter. Typiske eksempler på egnede hydrofile oppløsnings-midler er aceton, etanol og isopropanol.

Den resulterende OHC kan bearbeides på konvensjonell måte til farmasøytiske produkter for oral administrering, så som granulater, filmbelagte tabletter, kapsler, belagte piller, pulvere eller suspensjoner. De daglige dosene er 0,6 til 10 g, oppdelt i to eller tre individuelle doser. Enhetsdosen er 200 til 4 000 mg.

For å fremstille korn blandes OHC med fyllstoffer og smaksstoffer, fuktes med vann, granuleres og tørkes.

For å fremstille filmbelagte tabletter granuleres OHC i fuktig tilstand, tørkes og siktes deretter. Flytmidler, smøremidler og sprengmidler tilsettes. Blandingen som nå er klar for formgivning tabletteres, og belegges deretter med en tynn farget lakk.

For å fremstille belagte piller granuleres OHC i fuktig tilstand, tørkes og siktes. Deretter tilsettes vanlige

tabletteringshjelpemidler og pillekjernene formes. Kjernene separeres, gis et hvitt toppbelegg, farges og poleres.

For å fremstille pulvere bearbeides OHC til skorpeaktige korn og smakssettes og siktes deretter.

For å fremstille suspensjoner suspenderes OHC sammen med hjelpestoffer som forøker viskositeten i melasser. Suspensjo-nen farges og smakssettes og konserveres deretter. Fig. 1 viser fremgangsmåte for fremstilling av OHC ifølge eksempel 1. Fig. 2 viser fremgangsmåten for fremstilling av OHC ifølge eksempel 2. Fig. 3 viser stimulering av <3>H-tymidinopptak i 3T3 fibroblaster ved hjelp av et OHC ekstrakt. Abscissen viser konsentrasjonen av OHC ekstrakt i pl/ml kulturmedium. Ordinaten viser opptaket av <3>H-tymidin i cpm x IO<4>. Søylene angir standardav-vikene for middelverdiene fra ni målinger; korrelasjonsko-effisient 0,917. Fig. 4 viser stimulering av L-(5-<3>H)-prolinopptaket i 3T3 fibroblaster ved hjelp av fetalt kalveserum ( ) og ved hjelp av OHC komponenter ( ). Abscissen angir konsentrasjonen i prøven undersøkt i pm/ml kulturmedium; ordinaten angir opptaket av L-(5-<3>H)-prolin i cpm x IO<3>. Fig. 5 viser stimuleringen av <3>H-tymidinopptaket i bovine kondrocytter som en funksjon av dosen av OHC 34/4. Abscissen angir konsentrasjoner i de undersøkte prøvene i pg/ml kulturmedium, ordinaten angir <3>H-tymidinopptaket i cpm x 10<*>. Fig. 6 viser stimuleringen av kollagensyntesen og samlede proteiner av kondrocytter i monolagskulturer som en funksjon av OHC konsentrasjonen. Abscissen angir pg mengden av aktivt analyseprotein benyttet pr. ml kultur. Ordinaten angir pg mengden av nysyntetisert protein x x og kollagen o o for hver kulturporsjon. Fig. 7 viser den prosentvise økningen I kollageninnhold i det samlede proteinet som en funksjon av OHC dosen. Fig. 8 viser stimulering av 3H-tymidinopp taket i 3T3 fibroblaster med bestrålt og ubestrålt OHC ekstrakt. Det bestrålte OHC ekstraktet viser et proteininnhold på 690 pg/ml ( ). Det ubestrålte OHC ekstraktet viser et proteininnhold på 670 ug/ml ( ). Abscissen angir konsentrasjonen av OHC ekstrakt i pl/2,5 ml kulturmedium. Ordinaten viser opptaket av <3>H-tymidin i cpm. Fig. 9 viser stimuleringen av <3>H-tymidinopptaket i 3T3 fibroblaster ved hjelp av "Lencoll", "Lenphos", "Lensol", "Lensol agglomerat", "Oss Pulvit", "Mitsubishi Cookies",

osteotropisk konsentrat, "Canzocal", PMC og OHC. Abscissen angir konsentrasjonen i den undersøkte prøven i pl/ml kulturmedium; ordinaten viser -tymldlnopptaket i cpm.

I det undersøkte cytobiologiske systemet er bare OHC og PMC og "Lencoll" aktive. 1 g av hvert av de undersøkte produktene ble ekstrahert med 10 ml PBS; porsjoner av sentrifugerte supernatanter ble undersøkt. Fig. 10 viser den prosentvise endringen i benkortekstykkelse etter 14 måneders behandling med vitamin D2, kalsiumglykonat og med OHC. Ved sammenligning med vitamin D2 er det en 11,6% økning når OHC anvendes. Fig. 11 viser den midlere endringen i radiusmineralinnhold BMC i g/cm i pasienter behandlet med OHC ( ) og kontrollpasienter ( ) over en toårsperiode. Standardavvik er angitt ved søylene. Fig. 12 viser midlere endringer i trabekulært benvolum (TBV) og kortekstykkelse for hoftekammen (CPT) i pasienter behandlet med OHC ( ) og kontrollpasienter ( ) i løpet av et tidsrom på to år. Standardavvik er angitt ved søylene.

I fig. 13 viser ordinaten opptaket av <3>H-tymidin i cpm, og abscissen viser konsentrasjonen i den undersøkte prøven i jjg/200 ml kultur.

Oppfinnelsen skal idet følgende illustreres nærmere ved hjelp av eksempler.

EKSEMPEL 1

Fremstilling av OHC ( fremgangsmåte 1)

Lange ben (numerus, femur, tibia, radius og ulna, os metacarpale og os metatarsale) fra ca. 3 måneders gamle oksekalver (bos taurus) benyttes som utgangsmateriale for fremstilling av OHC.

Dyrene undersøkes av godkjente veterinærer. Deretter slaktes de og benene fjernes. Etter fjernelse dypfryses de rensede benene raskt og lagres ved -20 til -30°C inntil ytterligere behandling; (se fig. 1, boks 1).

Før de bearbeides videre, undersøkes benene vedrørende friskhet (på bakgrunn av deres lukt og farge), renhet og for å sikre at de virkelig er de benene som kreves. Eventuelle rester av kjøtt, sener og brusk fjernes.

I det første trinnet av fremgangsmåten knuses 1 600 kg (1 porsjon) frosne ben i en nedbrytningsmølle fremstilt av rustfritt stål med siktperforeringer på 20 mm. Størrelsen av partiklene av nedknust ben er ca. 1 cm. Temperaturen for benene holdes under 0°C under nedknusingen; (se fig. 1, boks 2).

Deretter dehydratiseres de nedknuste benene i en bladtørker av rustfritt stål ved et trykk på 0,97 til 0,98 bar. Det varme vannet har innledningsvis en temperatur på ca. 90"C og reduseres til ca. 40"C under forløpet av tørkingen. Når ikke mer vann destilleres over inne i kondensatsamleren (ca. 10 timer etter at tørkingen startet), avsluttes oppvarmingen og bensammensetningen tørkes videre under redusert trykk, inntil restvanninriholdet enten har en maksimalverdi på ca. 10% (se fig. 1, boks 3a) eller 10 til 25% (fig. 1, boks 3b). I denne sistnevnte tørkeoperasjonen bør temperaturen av bensammensetningen ikke overskride 40°C.

Den tørkede bensammensetningen bringes deretter til pH 5,0 til 5,5 med sitronsyre. Den tørkede bensammensetningen er nå dehydratisert nok en gang ved 80 til 20" C og lipidene fjernet. For dette formålet anvendes enten aceton som de hydrofile og lipofile oppløsningsmidlet eller ellers dehydratiseres den tørkede bensammensetningen først med aceton ved temperaturer fra 20 til 80°C og avfettes deretter ved anvendelse av trikloretylen ved 20 til 80°C i en andre operasjon. En bensammensetning oppnås hvori restvanninnholdet og restfettinnholdet er maksimalt 5% (se fig. 1, boks 4a og 4b). Oppløsningsmiddelrester fjernes deretter i en vir-velstrøm ved 20 til 80° C og 90 mbar. Restinnholdet av oppløsningsmiddel er ca. 1% (se fig. 1, boks 5).

Den resulterende bensammensetningen nedmales i en hammermølle i en 2 x 20 mm spalteformet sikt og siktes på en siktemaskin hvori den øvre sikten har en maskevidde på 2,4 mm og den nedre sikten har en maskevidde på 0,34 mm. Materialet som blir igjen på sikten med maskevidde 2,4 mm kastes, og det som siktes gjennom sikten med maskevidde 0,34 mm benyttes videre. Det nedmales igjen i en målemaskin med en 0,8 mm perforert sikt og siktes på en siktemaskin som har en sikt med en maskevidde på 0,74 mm og en annen med en maskevidde på 0,34 mm. Materialet som blir igjen på sikten med maskevidde 0,74 mm kastes. Materialet som siktes igjennom sikten med maskevidde 0,34 mm samlet og nedmales igjen i en målemaskin med et perforert siktinnskudd med maskevidde 0,8 mm. Det siktes deretter som beskrevet ovenfor. Endelig samles filtratet og siktes ved anvendelse av en sikt med maskevidde 0,25 mm og nedmales i en målemaskin med en perforert skjerm med åpninger 0,5 mm. Alt pulveret føres deretter gjennom en sikt med en maskevidde på 0,25 mm (se fig. 1, boks 6).

Tabell I gir en sammenfatning av de analytiske verdiene for det resulterende OHC pulveret.

Dersom analysen viser at OHC sammensetningen inneholder mer enn 10 000 mikroorganismer pr. g blir sammensetningen sterilisert, enten ved behandling med etylenoksyd eller ved bestråling med gammastråler (se fig. 1, bokser 10-12).

Det oppnås OHC som er egnet for fremstilling av farmasøytiske preparater (se fig. 1, boks 13).

EKSEMPEL 2

Fremstilling av OHC ( fremgangsmåte 2 )

En nedknust bensammensetning med en maksimal partikkelstørr-else på 1 cm fremstilles som i eksempel 1. Denne bensammensetningen bringes deretter til pH 5,0 til 5,5 med sitronsyre og behandles videre som i eksempel 1.

Det oppnås en OHC sammensetning som har de analytiske verdiene angitt i tabell III.

EKSEMPEL 3

Stimulering av <3>H-tymidinopptak i 3T3 fibroblaster ved hjelp av OHC

3T3 fibroblaster fra sveitsiske mus (Flow Laboratories) dyrkes i DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium, Boehringer Mannheim). Mediet suppleres med 100 enheter/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin (begge fra Boehringer Mannheim) og 3,7 g NaHC03/liter (Merck, Darmstadt), etter at den første er bragt til pH 6,6 med C02 før sterilf iltrering. I tillegg suppleres kulturen med 10% fetalt kalveserum (Boehringer Mannheim) for celledyrking. De subsammenflytende kulturene dyrkes i 90 mm petriskåler ved 37"C under 5% CO2 trykk, og cellene subkultiveres to ganger i uken med et innledende kim på 4 x IO<4> celler pr. 10 ml kulturmedium pr. petriskål. I hvert av forsøkene angitt nedenfor ble det benyttet celler fra passasje 3 t.o.m. 20.

Analysen for <3>H-tymidinopptak utføres ved fremgangsmåten beskrevet av L. Jimenez de Asua et al. (Proe. Nati. Acad. Sei. TJSA, bind 72 (1975), side 2724-2728). 3T3 fibroblaster fra sveitsiske mus fra forrådskulturene beskrevet ovenfor trypsinbehandles ved anvendelse av en steril oppløsning av 0,05% trypsin/0,02% EDTA. Cellene resuspenderes i DMEM/10% fetalt kalveserum ved en konsentrasjon på 4 x IO<4> celler/ml. 1 ml porsjoner av cellesuspensjonen belegges på 1,9 cm<2 >mikrotiterplater. Cellene inkuberes i ytterligere 4 dager uten endring av medium, og sammenflytende monolag av hvilende, ikke-formerende celler etableres. Mediet suges deretter av og erstattes med 1 ml friskt kulturmedium uten fetalt kalveserum, prøver som skal undersøkes tilsettes også. 1 g OHC fremstilt som i eksempel 1 eller 2, suspenderes i 10 ml fosfatbufret saltvannsoppløsning uten Mg og Ca (0,2 g KC1, 8 g NaCl, 2,7 g NaHP04, 12H20, 0,2 g KH2P04 pr. liter). Etter 2 timers risting ved romtemperatur sentrifugeres prøvene i 15 minutter ved 2 000 x g.

Porsjoner på 2-500 pl av de klare supernatantene oppnådd etter sentrifugering inneholdende de nøytralt oppløsliggjorte OHC komponentene tilsettes deretter til 3T3 fibroblastkul-turene oppnådd ovenfor. For måling av blindprøver, tilsettes en identisk mengde nytt kulturmedium til kulturene. Som en positiv kontroll tilsettes 2-200 pl fetalt kalveserum. Kulturene som skal analyseres Inkuberes endelig I 20 timer ved 37°C under 5% CO2 trykk og pulsbehandles deretter med <3>H-tymidin. Cellene merkes deretter radioaktivt ved tilsats av 10 pl/ml kulturmedium pr. brønn av en steril vandig tymidin-oppløsning inneholdende 1 p Ci (metyl-<3>H)tymidin (Amersham, UK) og 0,9 pg metyltymidin (Sigma, USA).

Etter at 3H -tymidinet er tilsatt, er det en ytterligere inkuberingsperiode på 4 timer under betingelsene angitt ovenfor.

Prøvene bearbeides deretter for scintillasjonstelling. Kulturmediet suges av og cellelaget vaskes med 0,5 ml 0,02% EDTA/PBS oppløsning. Cellene trypsinbehandles som beskrevet ovenfor inntil de er fullstendig løsrevet. De suspenderte cellene bearbeides i en mikrotiter "Dynatech multimash" apparatur hvor de automatisk overføres til glassmikrofiber-filtere ("Whatman 934-AH").

Apparaturen er programmert på følgende måte:

1) PBS vasking; 2) utfelling med 5% trikloreddiksyre (Merck, Darmstadt); 3) etanolfiksering. Glassmikroflberfliterne tørkes og overføres til scintillasjonsflasker. 3 ml flytende scintillasjonsvæske tilsettes (7 g "Permablend Packard" i 1 liter "Triton X-100"/toluen i et 1:3 forhold; Merck, Darmstadt), og radioaktiviteten for prøvene måles som disintegreringer pr. minutt i en "LKB-Wallac 1217 Rackbeta" væskescintillasjonsteller.

Maksimal stimulering med OHC når bare halvparten av den maksimale stimuleringen som oppnås med fetalt kalveserum. Det bør imidlertid understrekes at det fetale kalveserumet inneholder ca. 60 ganger så mye samlet protein som OHC ekstraktene. Følgelig stimuleres opptaket av <3>H-tymidin av OHC ekstraktene som er benyttet i en betydelig høyere grad enn når fetalt kalveserum benyttes. Måleresultatene som oppnås ved anvendelse av OHC er sammenfattet i fig. 3.

Det angitte analysesysternet kan også anvendes for å måle kvaliteten av OHC sammensetningene oppnådd ifølge eksempel 1 eller 2.

Når fetalt kalveserum benyttes som en positiv kontroll, på den ene side som en indre kontroll av det cytobiologiske analysesystemet og på den andre siden som en referanse for verdiene som oppnås med OHC prøvene, er det mulig å definere og uttrykke en aktivitetsenhet for karakteriseringen av den biologiske aktiviteten av OHC sammensetningene. Dette tillater standardisering av den biologiske aktiviteten av OHC sammensetningene.

EKSEMPEL 4

Stimulering av L-(5-<3>H)prolinopptaket i 3T3 fibroblaster og fibroblaster fra human forhud ved h. lelp av OHC Prolinopptaket for de dyrkede cellene kan måles som i eksempel 3, men ved å anvende L-(5-<3>H)prolin i steden for <3>H-tymidin i cellekultursystemet som allerede er beskrevet. Denne analysen bestemmer hastigheten for proteinsystemet ved de dyrkede cellene, og ved måling og kvantifisering av radioaktiviteten absorbert av cellene kan den biologiske aktiviteten av OHC sammensetningene bestemmes. Fig. 4 viser stimuleringen av L-(5-<3>H)-prolinopptaket i 3T3 fibroblaster av OHC.

Fig. 4 viser at OHC sammensetningene i vesentlig grad øker proteinsyntesehastigheten i de undersøkte cellene.

EKSEMPEL 5

Virkningen av nøytralt oppløsllggjorte komponenter av OHC på bovine kondrocvttkulturer

Kondrocytter isoleres fra epifysisbrusket fra kalvefostere på vanlig måte. 50 000 celler dyrkes subsammenflytende i 4-6 dager, i hvert tilfelle med 1 ml F12 medium supplert med 10% fetalt kalveserum. Som i eksempel 3 behandles de resulterende cellekulturene med OHC sammensetningene 34/4 oppnådd ifølge eksempel 1 eller 2. Cellene pulsbehandles deretter med <3>H-tymidin som i eksempel 3 og den inkorporerte radioaktiviteten måles.

Fig. 5 viser en sammenfatning av de resultatene fra det første forsøket. Opptaket av 3H -tymidin av de bovine kondrocyttene er vist i respons på dosen av stoffer OHC 34/4.

Det fremgår fra fig. 6 og 7 at den undersøkte OHC 35/4 stimulerer samlet proteinsyntese og hastigheten for kollagen-syntese.

34/4 og 35/4 angir porsjonsserienummeret.

EKSEMPEL 6

Virkningen av nøytralt oppløseliggjorte komponenter av OHC på bencellepopulas. loner in vitro

Idet vesentlige som beskrevet av Cohn et al. (Simmons og Kanin (red.), "Skeletal Research, an Experimental Approach", Academic Press, New York, San Francisco, London, side 3-20), blir forskjellige bencellepopulasjoner isolert ved en trinnvis, tidsavhengig enzymatisk nedbrytningsfremgangsmåte fra hjerneskaller av en dag gamle Wlstar rotter, med det unntak at hyaluronidase 0,05% anvendes som et ekstra enzym sammen med kollagenase og trypsin for å frigjøre cellene fra benvevet.

De forskjellige cellepopulasjonene frigjort 1 løpet av 20 minutters nedbrytning betegnes med romertall svarende til den rekkefølgen hvori de individuelle cellefraksjonene oppnås. Den første cellepopulasjonen som frigjøres fra hjerneskallen kalles I, mens den siste cellefraksjonen, frigjort i løpet av 1 times nedbrytning, merkes L. Funksjonelle forsøk tyder på at populasjoner I t.o.m. III sannsynligvis representerer celler av osteoprogenitorcellesamlingen (preosteoblastlig-nende). Cellepopulasjoner IV t.o.m. VI viser trekk med osteoblastlignende karakter, og de betegnes VII og L kan betraktes som hvilende osteoblast-lignende celler, eller muligens osteocyttlignende celler. 10 m av en suspensjon på 1,5 x IO<5> celler/ml MEM medium (med Earle's salter) supplert med 10% fetalt kalveserum belegges i 250 ml vevskulturflasker. Etter inkuberlng i 9-10 dager ved 37°C under 5% CO2 trykk oppnås sammenflytende cellelag, som bringes i suspensjon med trypsin 0,2%. Den resulterende cellepelleten resuspenderes i MEM medium supplert med 20% fetalt kalveserum og 10% DMSO, og suspensjonene fryses deretter bort i flytende nitrogen inntil videre anvendelse.

De individuelle, frosne bencellepopulasjonene bringes forsiktig til 37° C og opptas i 40 ml MEM supplert med 20% fetalt kalveserum. De sentrifugeres i 7 minutter ved 400 x g, og de resulterende cellepelletene resuspenderes i nytt medium supplert med 10% fetalt kalveserum og belegges i 96 brønns mikrotiterplater ved en tetthet på 7-10 x IO<3> celler pr. brønn. Cellene dyrkes i 2 dager. På den tredje dagen erstattes kulturmédiet med et medium inneholdende enten 1% eller 2% fetalt kalveserum. Etter inkuberlng i 24 timer erstattes mediet igjen med friskt medium inneholdende 1% eller 2% fetalt kalveserum, 0,5 pCi <3>H-tymidin/ml og nøytralt oppløseliggjorte OHC komponenter i forskjellige konsentrasjoner. Egnede mengder PBS tilsettes til kontrollkulturene. For å fastslå at de forskjellige bencellekulturene virkelig viser respons på en mitogen, utføres forsøk ved anvendelse av EDGF (epidermisk vekstfaktor).

Bencellekulturene inkuberes i 24 timer under betingelsene angitt ovenfor med mediet inneholdende <3>H-tymidin. Mengden av inkorporert <3>H-tymidin måles deretter som i eksempel 3.

De eksperimentelle resultatene er sammenfattet i tabell IV, hvor hver verdi representerer gjennomsnittet oppnådd fra fem forsøk og er angitt sammen med standardavviket. OHC komponentene oppløst i PBS tilsettes til kulturmediet i mengder på 5-50 pl i et samlet volum av kulturmediet på 200 pl.

Det fremgår fra tabell IV at de nøytralt oppløseliggjorte OHC komponentene stimulerer formeringen av bencellepopulasjoner V og VI, sammenlignet med kontrollkulturer behandlet med PBS. Bencellepopulasjoner I og VII viser ikke noen reaksjon. Resultatene er reprodusert 1 grafisk form i fig. 13.

EKSEMPEL 7

Tabell V angir en sammenfatning av resultatene av forsøk, hvori virkningen av nøytralt oppløseliggjorte OHC komponenter (OHC X) ble analysert på fibroblaster fra rotteskinn.

Det fremgår fra resultatene sammenfattet i tabell V at fibroblaster fra rotteskinn ikke kan stimuleres ved hjelp av

OHC X.

Dersom forsøksresultatene sammenfattet i tabell IV sammenlig-nes med forsøksresultatene sammenfattet i tabell V fremgår det at den observerte mitogene aktiviteten for OHC X er spesifikk for osteoblaster.

EKSEMPEL 8

Måling av den biologiske aktiviteten av bestrålt OHC

OHC fremstilt som i eksempel 1 eller 2 bestråles med 25 kGy

(2,5 Mrad). Forsøket utføres som i eksempel 3. Resultatene er gjengitt i fig. 8.

Fig. 8 sammenfatter resultatene fra <3>H-tymidininkorporering ved 3T3 fibroblaster for stimulering ved anvendelse av forskjellige mengder av et PBS ekstrakt av bestrålt eller ubestrålt OHC. Det fremgår fra fig. 8 at bestråling ikke påvirker den biologiske aktiviteten av OHC.

EKSEMPEL 9

Sammenligning av virkningen av OHC med virkningen av kjente preparater for det samme indikas. lonsområdet 1 g av hvert av stoffene som analyseres veies ut i en flaske med skrukork og 10 ml PBS tilsettes. Etter 2 timers risting ved romtemperatur, følges sentrifugering i 10 minutter ved 3 600 opm i en MSE bordsentrifuge. De klare supernatantene dekanteres og bunnfallet kastes. Proteininnholdet for oppløsningene måles som beskrevet av Bradford (Anal. Biochem. 72 (1976), s. 248). Opptaket av <3>H-tymidin i 3T3 fibroblaster stimuleres som i eksempel 3 og vurderes.

Tabell VI sammenfatter preparatene som ble sammenlignet og deres ekstraherbare proteininnhold.

Forsøksresultatene er sammenfattet i fig. 9. Inaktive stoffer kan ikke skilles fra blindprøvene og kan følgelig ikke avfettes.

Det fremgår fra fig. 9 at OHC er klart overlegen de andre produktene ved stimulering av DMA syntesen.

BIOLOGISK FORSØK 1

Virkningen av OHC på benhellng 1 dyreforsøk

Virkningen av OHC på benhellng fastslås i en undersøkelse ved anvendelse av 60 voksne kaniner. Presisjonsteknikk benyttes for å introdusere brusk/bendefekter identiske i størrelse og plassering i distal femoral epifysis i begge kneledd.

Dyrene fordeles tilfeldig i fire grupper med 15 dyr i hver. En ubehandlet gruppe virker som kontrollgruppe. En første gruppe får 830 mg OHC (178,0 mg kalsium) daglig, den andre gruppen får 510 mg aske-OHC (dvs. benmineral uten aktive, organiske bestanddeler; 178,9 mg kalsium) daglig og en tredje gruppe får 650 mg kalsiumkarbonat daglig (189,7 mg kalsium). Tabell VII angir forsøksutførelsen i detalj.

Fra dag 7 til dag 23 etter introduksjon av defektene behandles dyrene med en serie fluorescensmarkører. 5 dyr avlives etter hhv. 5, 8 og 12 uker. Histologiske seksjoner undersøkes med et fluorescensmikroskop med standardisert lokalisering og definisjon av snittplanet i området for bendefekten. Mikrobildene vurderes ifølge et indekspoengsys-tem basert på fluorescensintensitet, natur og grad av defektfylling, og strukturen av den nye benveksten. Tabell VIII angir resultatene.

De behandlede gruppene viser betydelig forbedret mineralise-ring sammenlignet med den ubehandlede kontrollgruppen. I motsetning til de to andre aktive behandlingene ga behandling med OHC markerte forbedringer i helingen av bendefektene.

Sammenligning av forsøksresultatene oppnådd med OHC og med aske-OHC gjør det klart at dersom de organiske komponentene ødelegges, tapes den fordelaktige virkningen av OHC.

BIOLOGISK FORSØK 2

Virkningen av OHC på ultrastrukturen av den artlkulære kondrocytten 1 dyreforsøk

Virkningen av OHC på den artlkulære kondrocyttultrastrukturen etter kortikoidskade undersøkes ved en serie in vivo forsøk med rotter. En kvantitativ fastsettelse muliggjøres ved anvendelse av en ny, reproduserbar morfometrisk fremgangsmåte; se M. Annefeld, Int. J. Tlss.Reac., bind VII (4),

(1958), s. 273-289.

Forsøkene utføres med tre grupper på 5 Wlstar hannrotter. Den første gruppen er en kontrollgruppe og behandles Ikke. Deksametason administreres til den andre gruppen intramus-kulært, og den tredje gruppen gis deksametason muskulært og i tillegg OHC oralt. Forsøksutførelsen er sammenfattet i tabell

IX.

Etter at de var behandlet i 5 uker ble dyrene avlivet. Alt bruskvevet fra femur og tibia i begge kneledd ble utskåret og vevet ble preparert for elektronmikroskopi. 50 kondrocytter fra hvert dyr ble analysert morfometrisk.

Sammenlignet med kontrolldyrene viser dyrene behandlet med deksametason en reduksjon i lengden av det endoplasmiske retikulum og i den samlede overflaten av Golgi-systemene i deres artlkulære kondrocytter, sammen med forøket kondrocytt-mortalitet. Disse elektronmikroskopfunnene er klare bevis for skade på de artlkulære kondrocyttene forårsaket av korticosteroider.

Dyrene som i tillegg ble behandlet med OHC viste en mindre reduksjon av det endoplasmiske retikulum og av overflaten av Golgi-systemene i deres artlkulære kondrocytter. OHC reduserer mortalitetsraten for kondrocyttene, som deksametason hadde øket, til under kontrollnivået, og samtidig øker OHC også den samlede overflaten og antallet mitokon-drier. Disse funnene peker mot det faktum at etter oral administrering øker OHC metabolismen av kondrocyttene. Tabell X gir en oppsummering av forsøksresultatene.

Det fremgår fra dette forsøket at resultatene oppnådd 1 cytoblologlske forsøk med OHC ln vltro (se eksempel 3 t.o.m. 6) også beholder sin gyldighet in vivo. Videre viser resultatene at OHC forhindrer de kjente negative virkningene av korticosteroider på brusk og benceller ved regulering av cellernetabolismen.

BIOLOGISK FORSØK 3

Anvendelse av OHC for å understøtte benhellng

Innvirkningen av OHC ved heling av benbrudd sammenlignet med en placebo undersøkes klinisk i et dobbelt blindforsøk.

Etter randomisering behandles 85 tilfeller av tibia knokkel-skaftbrudd i 6 uker med et av de to medikamentene.

Tabell XI gir en oversikt over alderen av pasientene og behandlingstypen.

Konsolideringen av tibia knokkelbruddet bestemmes ved hjelp av følgende parametere:

a) immobilitet av bruddstedet

b) smertefrlhet

c) mobilitet av den brukne ekstremiteten

d) maksimal belastning for den brukne ekstremiteten

e) radiologiske funn

I tilfellet eldre pasienter finner konsolidering ved

behandling med OHC sted etter ca. 11 uker, dvs. markert raskere enn når placebo benyttes (14,2 uker, p < 0,05). I tilfellet yngre pasienter er forskjellen uten statistisk signifikans (12,5 uker mot 11,5 uker). Det fremgår fra disse resultatene, tatt i betraktning at i tilfellet placebogruppen er antallet komplikasjoner ved heling som krever kirurgi tre ganger høyere, at OHC fremmer riktig bruddheling.

BIOLOGISK FORSØK 4

Behandling av osteoporose med OHC

I et kontrollert forsøk ble innvirkningen av OHC på korti-coidindusert osteoporose undersøkt. 64 pasienter på minst 50 år som hadde fått korticosteroider for behandling av reumatisk artritt ble randomisert i statistisk identiske grupper for behandling. Pasientene i gruppe 1 fikk 4,9 g OHC daglig i tillegg til den vanlige behandlingen. Ingen OHC ble administrert til pasientene i gruppe 2.

Ved avslutningen av behandlingsperioden var tapet I benhøyde og reduksjonen i radius bentetthet markert nedsatt i gruppen behandlet med OHC sammenlignet med kontrollgruppen. Andre parametere, så som bentetthet i ulna og ryggsmerter, ble også meget forbedret i gruppen behandlet med OHC sammenlignet med kontrollgruppen, men disse parametrene har ikke statistisk signifikans. Resultatene er sammenfattet i tabell XII. Behandling med OHC er også vellykket ved forebyggelse av utvikling av osteopenia hos reumatikere behandlet med steroider. Det fremgår fra undersøkelsen at OHC behandlingen bør starte så snart den systemiske korticosteroidbehandlingen begynner, uten å vente på kliniske symptomer som bekrefter utviklingen av osteopenia.

BIOLOGISK FORSØK 5

Behandling av osteoporose med OHC sammenlignet med kalsium

I en klinisk undersøkelse ble virkningen av vitamin D2, av OHC og av kalsiumglykonat som del av behandlingen av primær levercirrhose undersøkt, denne tilstanden resulterer i raskt bentap.

Vitamin D2 administreres parenteralt til 65 kvinner etter klimakteriet med osteoporotiske endringer i primær levercirrhose. Denne samlingen av pasienter oppdeles i tre grupper på statistisk basis. Den første gruppen innbefatter 22 pasienter og får bare vitamin D2 (kontroll). De 21 pasientene som utgjør den andre gruppen får 6,6 g OHC daglig i tillegg til vitamin D2 behandlingen. Den tredje gruppen på 22 pasienter får kalsium i en dose svarende til dosen av OHC gitt til pasientene i den andre gruppen, dvs. 4 brusetabletter av kalslumglukonat pr. dag.

Etter 14 måneders behandling fastslås det at parenteral behandling med vitamin D2 alene ikke er tilstrekkelig til å stoppe bentapet som ble målt ved hjelp av metacarpalindeksen, at videre kombinasjonen av vitamin D2 og kalslumglukonat bare såvidt har greid å stoppe ytterligere bentap, og at bare kombinasjonen av vitamin D2 og OHC ga en statistisk signifikant økning på 11,6% i benkorteksen sammenlignet med kontrollgruppen. Forsøksresultatene er sammenfattet i fig. 10.

Disse forsøksresultatene viser at OHC ikke bare er et rent kalsiumpreparat.

BIOLOGISK FORSØK 6

Behandling av osteoporose med OHC

36 pasienter som har stått under behandling med prednisolon og azatioprin i minst 1 år for kronisk aktiv autoimmun-hepatitt inndeles i to grupper på statistisk basis. De 18 pasientene i den første gruppen får 6,6 g OHC daglig i 2 år, mens de 18 pasientene i kontrollgruppen Ikke får noe OHC.

Forsøksresultatene oppnås ved fotodensiometri og ved hjelp av benbiopsier. Etter 2 år har kontrollgruppen lidd en statistisk signifikant reduksjon i mineral innholdet av radius BMC ("enkelt" fotodensiometri) og i kortekstykkelsen av hoftekam CPT (benbiopsi) (se fig. 11 og 12). Det finnes ved benbiopsi at i kontrollgruppen har det forekommet en klar reduksjon i trabekulært benvolum (TBV) (se fig. 12). I tilfellet OHC behandling, på den annen side, forblir mineral innholdet 1 radius konstant (se fig. 11), trabekulært benvolum øker og reduksjonen i kortekstykkelse er statistisk signifikant mindre enn i kontrollgruppen (fig. 12). Under behandlingsperioden på 2 år viste tre pasienter fra kontrollgruppen vertebrale deformasjoner, men ikke en eneste pasient fra OHC gruppen. 5 pasienter viste et trabekulært benvolum (TBV) under "vertebral fracture threshold" postulert av Meunier på 11% ± 3%, likevel utviklet ingen av de 4 risikopasientene som ble behandlet med OHC vertebral fraktur. Imidlertid viste 3 av kontrollpasientene (TBV > 16%) vertebrale deformasjoner, med ledsagende fall i TBV nivåer til under 11%.

BIOLOGISK FORSØK 7

Virkningen av OHC etter operativ f. lernelse av eggstokken

I en retrospektivt kontrollert undersøkelse ble konvensjonelle benspesifikke parametere (det benspesifikke isoenzymet av alkalisk fosfatase - osteoblastmarkør; hydroksyprolin i urinen - osteoblastmarkør; "tartratreslstent" sur fosfatase-osteoblastmarkør) benyttet til å vise at på den ene siden stiger enzymnivåene i serumet skarpt straks etter operativ fjernelse av eggstokken (et tegn på høy og intens benomset-ning), og på den andre siden normaliserer behandling med 7,5 g OHC daglig i 9 månder den forøkede benreduksjonen og nedsetter derved risikoen. Parallelt med de biokjemiske funnene finnes benvekst når OHC administreres, og dette kan måles ved hjelp av metakarpalindeksen. Det kortiske bentapet på 1,1 ± 0,6% pr. år så ble målt før behandling endres i tilfellet OHC behandling til en statistisk signifikant benvekst på 0,2 ± 0,3% pr. år.

BIOLOGISK FORSØK 8

Datamaskintomograflske målinger av virkningene av OHC ved manifest osteoporose 11 osteoporosepasienter (2 menn, 9 kvinner) ble behandlet i 2 år med 7,5 g OHC daglig og undersøkt ved anvendelse av kvantitativ datamaskintomografi; se P.. Ruegsegger et al., J. Comput. Assist. Tomogr. 5 (1981), s. 384-390. Basert på pasientenes aldersstruktur ville man vente et gjennomsnitlig spongiosatetthetstap på 2,7% pr. år.

I tilfellet OHC behandling finnes imidlertid Idet vesentlige alle pasientene å vise en liten økning i den svampaktige benmassen. En slik økning har ellers bare vært observert i tilfellet natriumfluoridbehandling, men 1 dette tilfellet var virkningen ikke så regelmessig og kontinuerlig og det ble funnet bare hos visse pasienter. De seneste resultater, se M.A. Dambacher et al. Bone 7, 199-205 (1986), viser at standardbehandlingen ved osteoporose (natriumfluorld eller kombinasjoner av natriumfluorld og kalsium) ikke kan stoppe utviklingen av sykdommen (bentap kan ikke fullstendig forhindres; vertebral "crush fracture" omfanget øker). Spontan trabekulær benvekst hos ubehandlede pasienter har hittil aldri vært observert.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en osseinhydroksyapatittforbindelse (OHC) med de følgende analytiske parametere for tørrstoffet: og ved følgende biologiske aktiviteter: a) stimulering av DNA syntesen av osteoblaster, kondrocytter og fibroblaster, b) stimulering av proteinsyntesen av kondrocytter og fibroblaster, c) selektiv stimulering av den kollageniske totalsyntesen av kondrocytter sammenlignet med stimulering av samlet proteinsyntese, og d) fremmelse av differensieringen av ikke-spesifikke mesenkymceller til kondrocytter eller osteoblaster, karakterisert ved at a) ben fra pattedyr fra fosterstadiet til ca. 12 måneder gamle nedknuses til partikkelstørrelse på maksimalt 1 cm, b) benpartiklene tørkes ved redusert trykk ved 20 til 80°C til et restvanninnhold på maksimalt ca. 10 % eller 10 til 25 *, c) det resulterende benmaterlalet bringes til pH 5,0 til 5,5 med en syre, d) deretter dehydratiseres og avfettes med et hydrofilt og lipofilt oppløsningsmiddel opp til et restvann- og restfettinnhold på 5 % maksimal, eller det dehydratiseres med et hydrofilt oppløsningsmiddel ved 20 til 80°C til et restvanninnhold på 5 % maksimalt, og deretter avfettes med et lipofilt oppløsningsmiddel ved 20 til 80°C opp til et restfettinnhold på 5 % maksimalt, e) det dehydratiserte og avfettede benmaterlalet tørkes ved redusert trykk ved 20 til 80° C til et maksimalt opp-løsningsmiddellnnhold på 1 Sf, og f) benmaterlalet pulveriseres til en partikkelstørrelse på 50 til 300 pm og steriliseres deretter.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at a) ben fra pattedyr fra fosterstadiet til ca. 12 måneder gamle nedknuses til en partikkelstørrelse på maksimalt 1 cm, b) benpartiklene bringes til pH 5,0 til 5,5 med en syre, c) deretter dehydratiseres og avfettes med et hydrofilt og lipofilt oppløsningsmiddel til et restvann- og restfettinnhold på 5 % maksimalt, eller det dehydratiseres med et hydrofilt oppløsningsmiddel ved 20 til 80° C til et restvanninnhold på 5 % maksimalt, og deretter avfettes med et lipofilt oppløsningsmiddel ved 20 til 80° C til et restfettlnnhold på 5 % maksimalt, d) det dehydratiserte og avfettede materialet tørkes ved redusert trykk ved 20 til 80" C til et maksimalt opp-løsningsmiddel innhold på 1 %, og e) benmaterlalet pulveriseres til en partikkelstørrelse på 50 til 300 pm og steriliseres deretter.