FI91877B - Menetelmä osseiini-hydroksiapatiittiyhdisteen valmistamiseksi - Google Patents

Description

91877

Menetelmä osseiini-hydroksiapatiittiyhdisteen valmistami-seksl

Keksintö koskee menetelmää osseiini-hydroksiapa-5 tiittiyhdisteen (OHC) valmistamiseksi, joka soveltuu kon-drosyyttien ja osteoblastien stimulointiin. OHC:tä voidaan käyttää osteoartriitin ja osteoporoosin profylaksiaan ja hoitoon sekä luunmurtumien, rustovikojen ja luuvikojen parantamiseen soveltuvien farmaseuttisten koostumusten, 10 erityisesti suun kautta annettaviksi tarkoitettujen koostumusten, valmistamiseen.

Mikrokiteinen hydroksiapatiittikoostumus (MCHC), joka soveltuu kortikosteroidihoidosta aiheutuvan osteoporoosin estämiseen, tunnetaan jo; ks. A. Pines et ai., Cur-15 rent Medical Research and Opinion 8 (1984); nro 10, 734-742. Koostumus sisältää noin 50 paino-% hydroksiapatiitin ja kalsimfosfaatin muodostamaa kompleksista suolaa. Sen lisäksi se sisältää noin 26 % kollageenia ja noin 9 % ei-kollageenisia proteiineja/peptidejä. Lisäksi se sisältää 20 noin 0,65 % natriumia samoin kuin magnesiumia ja kaliumia sekä hivenaineina fluoria, sinkkiä, strontiumia, piitä, rautaa, rubidiumia, cesiumia ja platinaa. Lisäksi koostumus sisältää vielä glykosaminoglykaaneja, sitraattia ja vettä. Siitä, miten MCHC:tä valmistetaan, ei tiedetä mi- 25 tään.

Keksinnön päämääränä on tarjota osseiini-hydroksi-apatiittiyhdistettä (OHC) ja menetelmä sen tuottamiseksi. Lisäksi päämääränä on tarjota farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät OHC:tä ja soveltuvat kondrosyyttien ja 30 osteoblastien stimulointiin (proliferaation aikaansaan tiin) ja siten osteoartriitin ja osteoporoosin profylaksiaan ja hoitoon sekä luunmurtumien, rustovikojen ja luuvikojen parantamiseen.

0HC:llä on todettu olevan spesifinen vaikutus lui-35 den ja ruston metaboliaan, sillä se sisältää denaturoitu- 2 91877 mattomassa tilassa olevia orgaanisia aineosia ja myös epäorgaanisia aineosia fysiologisesti tasapainoisissa suhteissa. OHCsn käyttö takaa sen, että ihmis- ja eläineli-mistö saa luustolle välttämättömiä aineita (ei-kollageeni-5 siä luuspesifisiä peptidejä, paikallisesti aktiivisia luu-ja rustosoluja sääteleviä tekijöitä, kalsiumia ja fosfaattia) . OHC edistää luiden metaboliaa kollageenin sekä välttämättömien, luuspesifisten, ei-kollageenisten peptidien ja proteoglykaanien muodostaman orgaanisen osseiinimatrik-10 sin avulla ja edistää luun uudiskasvua ja osseiinimatrik-sin sisäänsä sulkeminen hydroksiapatiitin epäorgaanisten aineosien sisällyttämistä luihin. Lisäksi OHC stimuloi kehon rustonkorjausmekanismeja ja suojaa rustokudosta rappeutumiselta.

15 OHCsllä on karakteristinen biologinen vaikutus os- teoblasteihin, luukudoksen tuottamisesta vastaaviin soluihin. OHC tehostaa osteoblastien proliferaatiota ja metaboliaa ja edistää lisäksi epäspesifisten mesenkyymisolujen erilaistumista kondroblasteiksi tai osteoblasteiksi. OHC 20 on siis uusi lääke synnyltään erilaisiin luusairauksiin, esimerkiksi primaarisiin ja sekundaarisiin osteoporoosei-hin sekä luunmurtumien ja luuvikojen parantamiseen ja proteesien optimointiin. Mainittujen solubiologisten ominaisuuksien, jotka vahvistettiin in vivo farmakologisesti 25 eläimillä ja kliinisesti ihmisillä, perusteella on selvää, että OHC on huomattavasti parempi kuin tavanomaiset kalsiumvalmisteet ja kaikki luujauhot. OHC muodostaa osteoporoosin hoitoon soveltuvien terapeuttisten tuotteiden piirissä todellisen vaihtoehdon puhtaille luuresorptio-30 inhibiittoreille, kuten estogeeneille ja kalsitoniineille, koska OHC ei pelkästään estä luuresorptiota vaan ennen kaikkea edistää luun kasvua. OHC eroaa niistä olemassa olevista terapeuttisista tuotteista, jotka myös stimuloivat luiden metaboliaa, esimerkiksi natriumfluoridista ja 35 difosfonaateista, siinä suhteessa, sillä on huomattavasti il 91877 3 vähemmän sivuvaikutuksia esimerkiksi gastrointestinaalis-ten sivuvaikutusten ja nivelsärkysivuvaikutusten puuttuessa siltä. Difosfonaateilla on hyvin kapea terapeuttinen alue, kun sen sijaan OHC on käytännöllisesti katsoen myr-5 kytön.

Lisäksi OHC vaikuttaa biologisesti kondrosyyttei-hin, jotka vastaavat rustokudoksen muodostuksesta ja re-sorptiosta. OHC stimuloi kondrosyyttien proliferaatiota ja metaboliaa niiden fenotyypin häviämättä ja suojaa kondro-10 syyttejä iatrogeenisia vahingoittavia tekijöitä, kuten kortikosteroideja, vastaan. Lisäksi OHC edistää epäspesifisten mesenkyymisolujen erilaistumista kondrosyyteiksi ja siten kondroidista metaplasiaa, joilla prosessilla on tärkeä osa rustokudoksen uudiskasvussa.

15 Tästä syystä OHC on erittäin käyttökelpoinen osteo- artriitin, jossa kondrosyyttien määrä ja metabolinen aktiivisuus alenee ja ruston uudiskasvu edellyttäisi järjestelmällistä kondroidista metaplasiaa, hoidossa. Lisäksi OHC soveltuu osteoporoosin hoitoon ja luunmurtumien sekä 20 luu- ja rustovikojen paranemisen edistämiseen.

OHC:n biologinen aktiivisuus voidaan todeta in vitro esimerkiksi a) osteoblastien, kondrosyyttien ja fibroblastien DNA-synteesin kiihtymisenä, 25 b) kondrosyyttien ja fibroblastien proteiinisyntee sin kiihtymisenä, c) kondrosyyttien kokonaiskollageenisynteesin selektiivisenä kiihtymisenä suhteessa kokonaisproteiinisyn-teesin kiihtymiseen, ja 30 d) epäspesifisten mesenkyymisolu jen kondrosyyteiksi tai osteoblasteiksi erilaistumisen edistämisenä.

Kokonaiskollageenisynteesin stimuloinnin yhteydessä kollageenityyppien I ja II suhde säilyy kondrosyyttivil-jelmissä muuttumattomana 24 tunnin jakson aikana, joten 35 kondrosyyttien fenotyyppi säilyy ennallaan tämän jakson 4 91877 aikana.

Biologinen vaikutus DNA-synteesiin määritetään normaalisti käytetyllä tavalla mittaamalla solulinjojen, esimerkiksi 3T3-fibroblastien, 3H-tymidiinin vastaanoton (so-5 luihin oton) kiihtyminen; Jimenez de Asua et ai., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 72 (1975) 2724-2728. Tämä on yleisesti käytetty biologinen menettelytapa mitogeenisten aineiden tunnistamiseksi. Tässä tunnistusmenetelmässä on edullista käyttää solulinjoja, koska solulinjoja on helppo viljellä.

10 Tämä testausmenetelmä perustuu siihen, että solu viljelmän sisältämillä transformoitumattornilla fibroblas-teilla on kaksi kasvun ääritilaa. Lepotilassa solut ovat Go-G^vaiheessa eivätkä sen vuoksi jakaudu. Lisäksi on olemassa aktiivinen proliferatiivinen tila. Siirtymistä lepo-15 tilasta proliferatiiviseen tilaan voidaan säädellä välttämättömien ravintoaineiden, seerumin ja muiden kasvua edistävien tekijöiden pitoisuuden avulla. OHC sisältää sellaisia kasvua edistäviä tekijöitä. Viimeksi mainitut liukenevat neutraaleiksi puskuroituihin fysiologisiin liuotti-20 miin, kuten fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS) tai fysiologiseen suolaliuokseen, ja ne saavat lepotilassa olevat 3T3-fibroblastit kiihdyttämään voimakkaasti 3H-tymi-diinin ottoa soluihin, joka kiihtyminen on annoksesta riippuvaa.

25 Usein käytetty menetelmä elintarvikkeiden ja far maseuttisten valmisteiden steriloimiseksi säteilyttämällä niitä gammasäteillä ei vähennä OHC:n biologista aktiivisuutta mitattaessa kyseistä aktiivisuutta sillä stimuloivalla vaikutuksella, joka kohdistuu 3T3-fibroblastien 3H-30 tymidiinin vastaanottoon.

Tätä koejärjestelmää voidaan käyttää myös osteo-blastien DNA-synteesin soluspesifisen kiihtymisen määrittämiseen. Siinä käytetään rottien kalvaarioista entsymaat-tisella sarjahajotuksella saatavia osteoblastipopulaatioi-35 ta. Osteoblastipopulaatiot edustavat osteoblastien eri • · , 91877 kypsyysasteita; populaatioiden I-III katsotaan olevan pre-osteoblastityyppisiä, populaatioiden IV-VI osteoblasti-tyyppisiä ja populaation L lepotilassa olevia osteoblasti-tyyppisiä soluja tai osteosyyttejä.

5 Neutraaleissa olosuhteissa liukenevilla OHC:n ai neosilla on annoksesta riippuva stimuloiva vaikutus populaatioihin V ja VI kuuluviin osteoblasteihin. Rinnakkaisesta testattujen, rotan fibroblasteista muodostettujen primaariviljeImien proliferaatio ei kiihdy. Näistä kokeel-10 lisistä havainnoista seuraa, että neutraaleissa olosuhteissa liukenevilla OHC:n aineosilla on luusoluspesifinen vaikutus.

Biologinen vaikutus proteiinisynteesiin määritetään normaalisti käytetyllä tavalla mittaamalla solujen, esi-15 merkiksi sellaisten solulinjojen kuin 3T3-fibroblastit tai ihmisen esinahkafibroblastien, L-(5-3H)proliinin vastaanoton kiihtyminen. Tämä menetelmä perustuu siihen, että stimuloitujen solujen proteiinisynteesi lisääntyy. Jos stimuloiduille soluille tarjotaan solujen kasvualustalla 20 L-(5-3H)proliinia, ne sisällyttävät sen uusiin syntetisoitaviin proteiineihin. Määrätyn inkubointiajän jälkeen mitataan soluihin otetun radioaktiivisuuden määrä, joka on stimuloivan vaikutuksen mitta. OHC sisältää neutraaleissa olosuhteissa liukenevia aineosia, joilla on voimakas sti-25 muloiva vaikutus 3T3-fibroblastien ja ihmisen esinahkafibroblastien proteiinisynteesiin, joka vaikutus on annoksesta riippuva.

Emäksinen fosfataasi -testi suoritetaan tavalla, jota on suositellut Deutsche Gesellschaft fiir klinische 30 Chemie; ks. Z. Klin. Chem. und Klin. Biochem. 8 (1970) 658, 9 (1971) 464 ja 10 (1972) 182. Fosfataasiaktiivisuus määritetään laaduntarkkailutarkoituksessa keksinnön mukaisen menetelmän jokaisessa vaiheessa.

Taulukossa I on esitetty yhteenveto analyysien 35 avulla määritetystä OHC:n koostumuksesta (arvot on saatu 6 91877 noin 150 erästä).

Taulukko I

Aistinvarainen testi Hienosta vähän rakeiseen vaihteleva, beigenharmaa 5 jauhe, jolla heikko luon tainen haju

Identtisyys Todettiin kalsium ja fos- fataasi 10 Todettiin kollageeni

Vesipitoisuus <7 %

Tuhkan kokonaismäärä 51,3 - 62,7 %

Kalsium 19,2 - 23,6 % 15 Fosfori 8,9 - 10,9 %

Kollageeni 23,4 - 28,6 %

Ei-kollageeniset prote-iinit/peptiidit 7,2 - 10,8 %

Hivenaineet Todettiin F, Na, K, Mg, 20 Fe, Zn, Cu ja Ni

Fosfataasipitoisuus 0,5 - 15 mE/mg

Epänormaali myrkyllisyys Ei merkkejä intoleranssis ta 4

Kokonaismikrobisisältö <10_/g 25 Hiivat clO^/g

Enterobakteerit clO'/g

Erityiset mikrobilajit Ei läsnä_

Keksinnön mukaiselle menetelmälle OHC:n tuottami-30 seksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa esitetään. Toteutetaan seuraavat vaiheet:

Ensin irrotetaan luut virallisten eläinlääkärien tutkimista nisäkkäistä, jotka ovat iältään sikiöasteisesta 12 kuukauden ikäiseen. Irrottamisensa jälkeen luut pakas-35 tetaan nopeasti ja säilytetään noin -20 - -30 °C:ssa, kunnes niitä tarvitaan (ks. kuvio 1, lokero 1). Ennen jatkokäsittelyä luut tarkastetaan sen toteamiseksi, että ne ovat yhä tuoreita, mikä voidaan määrittää niiden hajun ja värin perusteella. Luut tarkastetaan myös sen toteamisek-40 si, että ne ovat puhtaita ja todella vaadittavia luita. Tarvittaessa luiden koko ja muoto tarkastetaan kotieläinten anatomian käsikirjaa apuna käyttäen. Mahdolliset lihan, jänteiden ja ruston jäänteet poistetaan myös.

, · 91877 7

Mikäli esiintyy jotain epäilystä siitä, mikä eläin on kysymyksessä, laji voidaan määrittää myös normaalien immunologisten reaktioiden avulla, esimerkiksi saostuksella.

5 Sen jälkeen luut murskataan murskaimessa niin, että maksimihiukkaskooksi tulee noin 1 cm (ks. kuvio 1, lokero 2). Luuhiukkasia kuivataan sitten alennetussa paineessa noin 10 % tai noin 10-25 % (ks. kuvio 1, lokerot 3a ja 3b). Saatavan luuaineksen pH säädetään sitten suunnilleen 10 arvoon 5,0 - 5,5 jotakin happoa, kuten suola-, fosfori-, etikka-, muurahais- tai sitruunahappoa, käyttäen.

Sen jälkeen luuaineksesta poistetaan hydrofiilista ja lipofiilista liuotinta käyttäen vettä ja rasvaa, kunnes jäljellä oleva vesi- ja jäljellä oleva rasvapitoisuus ovat 15 korkeintaan noin 5 %, tai siitä poistetaan ensin 20-80 °C:ssa hydrofiilista liuotinta käyttäen vettä, kunnes jäljellä oleva vesipitoisuus on korkeintaan noin 5 %, ja sen jälkeen 20-80 °C:ssa lipofiilista liuotinta käyttäen rasvaa, kunnes jäljellä oleva rasvapitoisuus on korkeintaan 20 noin 5 % (ks. kuvio 1, lokerot 4a ja 4b).

Tuloksena olevaa luuainesta, josta on poistettu vettä ja rasvaa, kuivataan sitten edelleen alennetussa paineessa 20-80 °C:ssa, esimerkiksi pyörrevirtauksessa, kunnes saavutetaan korkeintaan noin 1 %:n liuotinpitoisuus 25 (ks. kuvio 1, lokero 5).

Suunnitellusta käytöstä riippuen saatava luuaines jauhetaan sitten normaalilla tavalla jauhanta- ja seulon-talaitteessa jauheiksi, joiden raekoko vaihtelee noin 50 μm:stä 300 μπι:ϋη (ks. kuvio 1, lokero 6).

30 Mikäli mikrobien määrä luuaineksessa on suurempi kuin noin 10 000/g, luuaines steriloidaan normaalilla tavalla, esimerkiksi käsittelemällä se etyleenioksidilla tai säteilyttämällä sitä gammasäteillä (ks. kuvio 1, lokerot 10-12). Saadaan OHC:tä, joka soveltuu lääkeaineiden val-35 mistukseen (ks. kuvio 1, lokero 13).

8 91877

Eräässä keksinnön mukaisen menetelmän vaihtoehtoisessa versiossa edellä kuvatun kaltaiset nisäkkäiden luut murskataan esimerkiksi murskaimessa niin, että maksimi-hiukkaskooksi tulee noin 1 cm (ks. kuvio 2, lokero 2).

5 Luuhiukkasten pH säädetään sitten hapolla arvoon 5,0 - 5,5. Sen jälkeen niistä poistetaan hydrofiilista ja lipo-fiilista liuotinta käyttäen vettä ja rasvaa, kunnes jäljellä oleva vesi- ja jäljellä oleva rasvapitoisuus ovat korkeintaan noin 5 %, tai niistä poistetaan ensin 20-80 10 °C:ssa hydrofiilista liuotinta käyttäen vettä, kunnes jäljellä oleva vesipitoisuus on korkeintaan noin 5 %, ja sen jälkeen 20-80 °C:ssa lipofiilista liuotinta käyttäen rasvaa, kunnes jäljellä oleva rasvapitoisuus on korkeintaan noin 5 % (ks. kuvio 2, lokerot 3a ja 3b).

15 Tuloksena olevaa luuainesta, josta on poistettu vettä ja rasvaa, kuivataan sitten edelleen alennetussa paineessa 20-80 °C:n lämpötilassa, esimerkiksi pyörrevir-tauksessa, kunnes saavutetaan korkeintaan noin 1 %:n liuo-tinpitoisuus (ks. kuvio 2, lokero 4). Tarvittaessa luu-20 aines voidaan käsitellä edelleen edellä kuvatulla tavalla (ks. kuvio 2, lokerot 5-11). Saadaan OHC:tä, joka soveltuu lääkeaineiden valmistukseen (kuvio 2, lokero 12).

Edullisia luita käytettäviksi keksinnön mukaisessa menetelmässä, jota on kuvattu yksityiskohtaisesti edellä, 25 ovat humerus, femur, tibia, radius, ulna, os metacarpale ja os metatarsale. Näiden lisäksi käytetään edullisesti nautavasikoiden (Bos taurus) luita.

On selvää, että tuotteen denaturoitumisen estämiseksi, kummassakin tapauksessa on välttämätöntä alentaa 30 kuivaus- ja rasvanpoistolämpötilaa kosteus- ja liuotinpi-toisuuden laskiessa. Kuten jo on mainittu veden poistossa ja kuivauksessa käytettävä lämpötila on korkeintaan 80 °C. Vesi- ja liuotinpitoisuuden laskiessa lämpötilaa alennetaan ja toimenpide toteutetaan hyvin nopeasti.

35 Paine on vedenpoisto- ja kuivausvaiheen aikana kor- li 9 91577 keintaan noin 400 mbar.

Tyypillisiä esimerkkejä sopivista lipofiilisista liuottimista ovat asetoni, trikloorietyleeni, metyleeni-kloridi ja matalassa lämpötilassa kiehuva petrolieetteri.

5 Tyypillisiä esimerkkejä sopivista hydrofiilisista liuottimista ovat asetoni, etanoli ja isopropanoli.

Tuloksena olevasta OHCsstä voidaan valmistaa tavanomaisella tavalla suun kautta annettaviksi soveltuvia farmaseuttisia tuotteita, kuten rakeita, kalvopäällysteisiä 10 tabletteja, kapseleita, päällystettyjä pillereitä, pulvereita tai suspensioita. Vuorokausiannokset ovat 0,6 - 10 g kahteen tai kolmeen kerta-annokseen jaettuina. Annosyksik-kö on 200 - 4000 mg.

Rakeiden valmistamiseksi OHC:hen sekoitetaan täyte-15 aineita ja aromiaineita, ja seos kostutetaan vedellä, rakeistetaan ja kuivataan.

Kalvopäällysteisten tablettien valmistamiseksi OHC rakeistetaan kosteana, kuivataan ja seulotaan sen jälkeen. Sekoitetaan mukaan juoksevuudensäätöaineita, liukastusai-20 neita ja hajoamista edistäviä aineita. Seos, joka on nyt valmis muovattavaksi, tabletoidaan ja päällystetään sitten ohuella värillisellä lakalla.

Päällystettyjen pillereiden valmistamiseksi OHC rakeistetaan kosteana, kuivataan ja seulotaan. Sen jälkeen 25 lisätään tavanomaisia tabletointiapuaineita, ja muovataan pilleriytimet. Ytimet erotetaan, varustetaan valkealla päällysteellä, värjätään ja kiillotetaan.

Pulvereiden valmistamiseksi OHC:sta valmistetaan kuorellisia rakeita, jotka aromatisoidaan ja seulotaan.

30 Suspensioiden valmistamiseksi OHC suspendoidaan yhdessä viskositeettia kohottavien apuaineiden kanssa me-lassiin. Suspensioon lisätään väriaineita ja aromiaineita ja sen jälkeen säilymistä parantavia aineita.

Kuvio 1 esittää kaaviota OHC:n valmistamiseksi esi-35 merkin 1 mukaisesti.

91877 10

Kuvio 2 esittää kaaviota OHC:n valmistamiseksi esimerkin 2 mukaisesti.

Kuvio 3 osoittaa OHC-uutteen stimuloivan vaikutuksen 3T3-fibroblastien 3H-tymidiinin vastaanottoon. Abskissa 5 osoittaa OHC-uutteen pitoisuuden yksikkönä μΐ/ml kasvualustaa. Ordinaatta osoittaa 3H-tymidiinin oton soluihin yksikkönä cpm x 104. Pylväät osoittavat keskipoikkeamat yhdeksän mittauksen keskiarvoista; korjauskerroin 0,917.

Kuvio 4 osoittaa naudan sikiön seerumin (---) ja 10 OHC:n aineosien (-) stimuloivan vaikutuksen 3T3-fibro- blastien L-(5-3H)proliinin vastaanottoon. Abskissa osoittaa pitoisuuden testinäytteessä yksikkönä μΐ/ml kasvualustaa, ja ordinaatta osoittaa L-(5-3H)proliinin oton soluihin yksikkönä cpm x 103.

15 Kuvio 5 osoittaa naudan kondrosyyttien 3H-tymidiinin vastaanoton stimulaation OHC 34/4:n annoksen funktiona. Abskissa osoittaa pitoisuuden testatuissa näytteissä yksikkönä μ9/πι1 kasvualustaa, ja ordinaatta osoittaa 3H-ty-midiinin oton soluihin yksikkönä cpm x 104.

20 Kuvio 6 osoittaa kondrosyyttien kollageenisynteesin ja kokonaisproteiinisynteesin stimulaation yksisolukerros-viljelmissä OHC-pitoisuuden funktiona. Abskissa osoittaa käytetyn aktiivisen testiproteiinin määrän μ9:χηβ ml:a kohden viljelmää. Ordinaatta osoittaa vastasyntetisoidun 25 proteiinin (x—x) ja kollageenin (o---o) määrän μ9:ϊη3 vastaavasti kunkin erän tapauksessa.

Kuvio 7 osoittaa, miten kollageenin prosentuaalinen osuus proteiinin kokonaismäärästä kohoaa OHC-annoksen funktiona.

30 Kuvio 8 osoittaa säteilytetyn ja säteilyttämättömän OHC-uutteen stimuloivan vaikutuksen 3T3-fibroblastien 3H-tymidiinin vastaanottoon. Säteilytetyn OHC-uutteen proteiinipitoisuus on 690 μ9/πι1 (-). Säteilyttämättömän OHC- uutteen proteiinipitoisuus on 670 μ9/πι1 (---). Abskissa 35 osoittaa OHC-uutteen pitoisuuden yksikkönä μ1/2,5 ml kas- 91877 11 vualustaa. Ordinaatta osoittaa 3H-tymidiinin oton soluihin yksikkönä cpm.

Kuvio 9 osoittaa valmisteiden Lencoll* Lenphos®, Lensol*, Lensol® agglomerated, Osspulvit®, Mitsubishi Coo-5 kies®, Osteotrophic Concentrate, Canzocal* ja PMC* sekä OHCsn stimuloivan vaikutuksen 3T3-fibroblastien 3H-tymidii-nin vastaanottoon. Abskissa osoittaa pitoisuuden testi-näytteessä yksikkönä μΐ/ml kasvualustaa, ja ordinaattaa osoittaa 3H-tymidiinin oton soluihin yksikkönä cpm.

10 Tutkimuksessa käytetyssä solubiologisessa systee missä ainoastaan OHC, PMC® ja Lencoll® ovat aktiivisia.

1 g kutakin tutkituista tuotteista uutettiin 10 ml :11a PBS:ää, testeissä käytettiin yhtä suuria eriä sent-rifugoimalla saaduista supernatanteista.

15 Kuvio 10 osoittaa luun kuoriosan paksuuden prosen tuaalisen muutoksen 14 kuukautta kestäneen D2-vitamiini-, kalsiumglukonaatti- ja OHC-käsittelyn jälkeen. D2-vitamiiniin verrattuna lisäys on 11,6 % OHC:tä käytettäessä.

Kuvio 11 esittää radiuksen kivennäisainepitoisuuden 20 BMC (g/cm) keskimääräistä muutosta OHC:llä hoidetuilla potilailla (-) ja vertailupotilailla (---) kahden vuoden ai kana. Pylväät osoittavat keskipoikkeamia.

Kuvio 12 osoittaa ansasluutilavuuden (TBV) ja suo-liluun harjan kuoriosan paksuuden (CPT) keskimääräisiä 25 muutoksia 0HC:llä hoidetuilla potilailla (-) ja vertailupotilailla (---) kahden vuoden aikana. Pylväät osoitta vat keski poikkeamia.

Kuviossa 13 ordinaatta osoittaa 3H-tymidiinin oton soluihin yksikkönä cpm ja abskissa pitoisuuden tutkitussa 30 näytteessä yksikkönä μg/200 μΐ viljelmää.

Seuraavat esimerkit valaisevat tätä keksintöä yksityiskohtaisemmin.

12 91877

Esimerkki 1 OHCsn valmistus (menetelmä 1) Lähtömateriaalina OHC:n tuottamiseksi käytetään noin 3 kuukauden ikäisistä nautavasikoista (Bos taurus) 5 peräisin olevia pitkiä luita (humerus, femur, tibia, radius, ulna, os metacarpale ja os metatarsale).

Eläimet tutkitutetaan virallisilla eläinlääkäreillä. Sen jälkeen ne teurastetaan ja luut irrotetaan. Luiden irrotuksen jälkeen puhtaat luut pakastetaan nopeasti ja 10 säilytetään -20 - -30 °C:ssa jatkokäsittelyyn saakka (ks. kuvio 1, lokero 1).

Ennen jatkokäsittelyä luut tarkastetaan niiden tuoreuden (todettavissa niiden hajun ja värin perusteella), puhtauden ja sen, että ne todella ovat vaadittavia luita, 15 toteamiseksi. Mahdolliset lihan, jänteiden ja ruston jäänteet poistetaan.

Menetelmän ensimmäisessä vaiheessa 1600 kg (yksi erä) pakastettuja luita murskataan ruostumattomasta teräksestä valmistetussa murskaimessa, jossa on 20 mm:n seula-20 reiät. Murskatun luun hiukkaskoko on noin 1 cm. Luiden lämpötila pidetään murskauksen aikana 0 °C:n alapuolella (ks. kuvio 1, lokero 2).

Sen jälkeen murskatuista luista poistetaan vettä ruostumattomasta teräksestä valmistetussa lapakuivurissa 25 0,97 - 0,98 bar:n paineessa. Kuuman veden lämpötila on aluksi noin 90 °C ja alennetaan kuivauksen kuluessa noin 40 °C:seen. Heti kun veden tislautuminen kondensaatinke-räysastiaan lakkaa (noin 10 tunnin kuluttua kuivauksen aloittamisesta), kuumennus lopetetaan ja luukoostumuksen 30 kuivausta jatketaan alennetussa paineessa, kunnes sen jäljellä oleva vesipitoisuus on joko korkeintaan noin 10 % (ks. kuvio 1, lokero 3a) tai 10-25 % (ks. kuvio 1 lokero 3b). Tässä jälkimmäisessä kuivausvaiheessa luukoostumuksen lämpötila ei saisi ylittää 40 °C:ta.

35 Kuivatun luukoostumuksen pH säädetään sitten sit- n 91877 13 ruunahapolla arvoon 5,0 - 5,5. Sen jälkeen kuivatusta luu-koostumuksesta poistetaan vielä kerran vettä 20-80 °C:ssa ja rasvat poistetaan. Tähän tarkoitukseen käytetään joko sekä hydrofiilisena että lipofiilisena liuottimena aseto-5 nia tai kuivatusta luukoostumuksesta poistetaan ensin vettä asetonin avulla 20-80 °C:n lämpötilassa ja sen jälkeen toisessa vaiheessa rasvaa trikloorietyleenin avulla 20-80 °C:ssa. Saadaan luukoostumus, jossa jäljellä oleva vesi-ja jäljellä oleva rasvapitoisuus ovat korkeintaan 5 % (ks.

10 kuvio 1, lokerot 4a ja 4b). Liuotinjäännökset poistetaan sen jälkeen pyörrevirtauksessa 20-80 °C:n lämpötilassa ja 90 mbar:n paineessa. Jäljelle jäävä liuotinpitoisuus on noin 1 % (ks. kuvio 1, lokero 5).

Tuloksena oleva luukoostumus jauhetaan vasaramyl-15 lyssä, jossa suorakulmaisilla 2x20 mm:n rei'illä varustettu seula ja seulotaan sitten seulakoneessa, jossa ylemmän seulan reikäkoko on 2,4 cm ja alemman seulan reikäkoko on 0,34 mm. 2,4 mmsn seulalle jäävä aines heitetään pois, ja 0,34 mm:n seulan läpäissyt aines käytetään edelleen. Se 20 jauhetaan vielä kerran jauhimessa, johon on sijoitettu 0,8 mm:n rei'illä varustettu seulaverkko, ja seulotaan seula-koneessa, jossa toisen seulan reikäkoko on 0,74 mm ja toisen reikäkoko on 0,34 mm. 0,74 mm:n seulalle jäävä aines heitetään pois. 0,34 mm:n seulan läpäissyt aines kerätään 25 talteen ja jauhetaan vielä kerran jauhimessa, johon on sijoitettu 0,8 mm:n rei'illä varustettu seulaverkko. Sen jälkeen se seulotaan edellä kuvatulla tavalla. Lopuksi jauhe kerätään talteen ja seulotaan käyttäen seulaa, jonka reikäkoko on 0,25 mm, ja jauhetaan jauhimessa, johon on 30 sijoitettu 0,5 mm:n rei'illä varustettu seulaverkko. Sen jälkeen kaikki lasketaan seulan, jonka reikäkoko on 0,25 mm, läpi (ks. kuvio 1, lokero 6).

Taulukossa II on esitetty yhteenveto tulokseksi saatavan OHC-jauheen analyysiarvoista.

91877 14

Taulukko II

Aistinvarainen Hienosta vähän rakei- testi seen vaihteleva, bei- 5 genharmaa jauhe, jolla heikko luontainen Asianmukai- haju nen

Identtisyys Todettiin kalsium ja Asianmukai- fosfataasi nen 10 Todettiin kollageeni Asianmukai nen

Vesipitoisuus <7 % 6,3 %

Tuhkan kokonaismäärä 51,3-62,7% 56,2% 15 Kalsium 19,2 - 23,6 % 21,57 %

Fosfori 8,9 - 10,9 % 9/71 %

Kollageeni 23,4 - 28,6 % 26,4 %

Ei-kollageeniset proteiinit/pep- 20 tidit 7,2 - 10,8 % 9,0 %

Hivenaineet Todettiin F, Na, K, Asianmukai-

Mg, Fe, Zn, Cu ja Ni set Fosfataasi 0,5 - 15 mE/mg 3,9 mE/mg

Epänormaali myr- Ei merkkejä intole- Asianmukai- 25 kyllisyys ranssista nen

Kokonaismikrobi- .

sisältö «clO^/g Noin 300

Hiivat/homeet clO^/g Ei läsnä

Enterobakteerit <10 Vg Ei läsnä 30 Erityiset mikrobilajit Ei läsnä Ei läsnä

Mikäli analyysi osoittaa OHC-koostumuksen sisältä-35 vän yli 10 000 mikro-organismia/g, koostumus steriloidaan joko käsittelemällä se etyleenioksidilla tai säteilyttä-mällä sitä gammasäteillä (ks. kuvio 1, lokerot 10-12).

Saadaan OHC:tä, joka soveltuu farmaseuttisten koostumusten valmistukseen (ks. kuvio 1, lokero 13).

. 40 Esimerkki 2 OHC:n valmistus (menetelmä 2)

Valmistetaan murskattu luukoostumus, jonka maksimi-hiukkaskoko on 1 cm, samalla tavalla kuin esimerkissä 1. Tämän luukoostumuksen pH säädetään sitten sitruunahapolla 45 arvoon 5,0 - 5,5,ja se jatkokäsitellään samalla tavalla 91877 15 kuin esimerkissä 1.

Saadaan OHC-koostumus, jolla on taulukossa III yhteenvetona esitetyt analyysiarvot

5 Taulukko III

Aistinvarainen Hienosta vähän rakei- testi seen vaihteleva, bei- genharmaa jauhe, jol- 10 la heikko luontainen Asianmukai- haju nen

Identtisyys Todettiin kalsium ja Asianmukai- fosfataasi nen

Todettiin kollageeni Asianmukai- 15 nen

Vesipitoisuus <7 % 6,6 %

Tuhkan kokonaismäärä 51,3 - 62,7 % 56,07 %

Kalsium 19,2 - 23,6 % 21,33 % 20 Fosfori 8,9 - 10,9 % 9,95 %

Kollageeni 23,4 - 28,6 % 26,2 %

Ei-kollageeniset proteiinit/peptidit 7,2 - 10,8 % 8,8 % 25 Hivenaineet Todettiin F, Na, K, Asianmukai-

Mg, Fe, Zn, Cu ja Ni set

Fosfataasi 0,5 - 15 mE/mg 5,4 mE/mg

Epänormaali myr- Ei merkkejä intole- Asianmukai- kyllisyys ranssista nen 30 Kokonaismikrobi- .

sisältö clO^/g Noin 300

Hiivat/homeet clOj/g Ei läsnä

Enterobakteerit <10^/g Ei läsnä

Erityiset mikro- 35 bilajit Ei läsnä Ei läsnä

Esimerkki 3 0HC:n stimuloiva vaikutus 3T3-fibroblastien 3H-tymi-40 diinin vastaanottoon

Viljellään sveitsiläisten hiirien 3T3-fibroblasteja (Flow Laboratories) DMEMissä (Dulbeccon muunnetussa Eaglen alustassa, Boehringer Mannheim). Sen jälkeen kun alustan pH on ensin säädetty C02:lla arvoon 6,6 ennen sterilointi-45 suodatusta, alustaan lisätään 100 yksikköä penisilliiniä/ 16 91 877 ml, 100 mg streptomysiiniä/ml (molempien toimittaja Boeh-ringer Mannheim) ja 3,7 g NaHC03:ta/litra (Merck, Darmstadt). Lisäksi viljelmään lisätään 10 % naudan sikiön seerumia (Boehringer Mannheim) solujen viljelemistä var-5 ten. Vielä epäyhtenäisiä alaviljelmiä viljellään 90 mm:n petrimaljoissa 37 °C:ssa C02:n osapaineen ollessa 5 %, ja soluista muodostetaan uusia alaviljelmiä kahdesti viikossa alkuinokulaation ollessa 4 x 104 solua/10 ml kasvualustaa petrimaljaa kohden. Kussakin jäljempänä yksityiskohtaises-10 ti kuvatuista tutkimuksista käytetään 3.-20. alaviljelmäs-tä peräisin olevia soluja.

3H-tymidiinin ottoa soluihin koskeva testi suoritetaan tavalla, jonka ovat esittäneet L. Jimenez de Asua et ai, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 72 (1975) 2724-2728. Edellä 15 esitetyt, varastoviljelmästä peräisin olevat sveitsiläisten hiirien 3T3-fibroblastit käsitellään trypsiinillä käyttäen steriiliä liuosta, joka sisältää 0,05 % trypsii-niä ja 0,02 % EDTA:a. Solut suspendoidaan uudelleen DMEM:-iin, joka sisältää 10 % naudan sikiön seerumia, niin että 20 pitoisuudeksi tulee 4 x 104 solua/ml. 1 ml:n erät solusus-pensiosta sijoitetaan 1,9 cm2:n mikromaljoille. Soluja in-kuboidaan 4 lisävuorokautta alustaa muuttamatta, ja saadaan aikaan kiinni toisiinsa kasvaneista, lepotilassa olevista ei-proliferatiivisista soluista koostuvia yksisolu-25 kerroksia. Elatusaine imetään sitten pois ja korvataan 1 ml:11a tuoretta kasvualustaa, joka ei sisällä naudan sikiön seerumia mutta johon lisätään myös testattavia näytteitä.

1 g 0HC:tä, joka on valmistettu esimerkin 1 tai 2 30 mukaisesti, suspendoidaan 10 ml:aan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (0,2 g KCl:ä, 8 g NaCl:ä, 2,7 g NaHP04 12HzO:ta ja 0,2 g KH2P04:ä litraa kohden), joka ei sisällä magnesiumia eikä kalsiumia. Sen jälkeen kun näytteitä on ravistettu 2 tuntia huoneen lämpötilassa, niitä sentrifu-35 goidaan 15 minuuttia nopeudella 2000 x g.

il « · 91877 17

Edellä saatuihin 3T3-fibroblastiviljelmiin lisätään sitten 2-500 μ1:η eriä sentrifugoinnin jälkeen saatavia supernatantteja, jotka sisältävät neutraaleissa olosuhteissa liukenevia 0HC:n aineosia.

5 Sokeakoemittausten suorittamista varten lisätään pelkästään sama määrä tuoretta kasvualustaa viljelmiin. Positiiviseksi vertailuaineeksi lisätään 2-200 μΐ naudan sikiön seerumia.

Testiviljelmiä inkuboidaan lopuksi 20 tuntia 37 10 °C:ssa C02:n osapaineen ollessa 5 %, ja sen jälkeen niistä tehdään pulsseja antavia 3H-tymidiinillä. Solut leimataan radioaktiivisesta lisäämällä kuhunkin syvennykseen milli-litraa kohden kasvualustaa 10 μΐ steriiliä tymidiinin vesiliuosta, joka sisältää 1 μΟϊ (metyyli-3H)tymidiiniä 15 (Amersham, Yhdistynyt Kuningaskunta) ja 0,9 pg metyylity-midiiniä (Sigma, Yhdysvallat). 3H-tymidiinin lisäyksen jälkeen seuraa vielä 4 tunnin inkubointijakso edellä mainituissa olosuhteissa.

Näytteet käsitellään sitten tuikelaskentaa silmällä 20 pitäen. Elatusaine imetään pois, ja solukerros pestään 0,5 ml:11a PBS-liuosta, joka sisältää 0,2 % EDTA:a. Soluja käsitellään trypsiinillä edellä kuvatulla tavalla, kunnes niistä tulee täysin irtonaisia. Suspensoituja soluja käsitellään Dynatech-mikromonikäsittelylaitteessa, jossa ne 25 siirretään automaattisesti mikrolasikuitusuodattimiin (Whatman 934-AH). Laite ohjelmoidaan seuraavalla tavalla: 1) PBS-pesu; 2) saostus 5-%:isella trikloorietik-kahapolla (Merck, Darmstadt); 3) etanolifiksaatio. Mikro-lasikuitusuodattimet kuivataan ja siirretään tuikelasken-30 tapulloihin. Lisätään 3 ml nestemäistä tuikeaineseosta (7 g Permablend Packardia 1 litrassa Triton X-100:n ja tolu-eenin seosta (1:3); Merck, Darmstadt), ja mitataan näytteiden radioaktiivisuus hajoamisina/minuutti LKB-Wallac 1217 Rackbeta -nestetuikelaskurilla.

35 OHC:n suurin stimuloiva vaikutus kohoaa vain noin 18 91877 puoleen naudan sikiön seerumilla saavutettavasta maksimis-timulaatiosta. Tulisi kuitenkin muistaa, että naudan sikiön seerumin sisältämä kokonaisproteiinimäärä on noin 60 kertaa niin suuri kuin OHC-uutteiden. Käytetyt OHC-uutteet 5 stimuloivat siis 3H-tymidiinin ottoa soluihin huomattavasti suuremmassa määrin verrattaessa stimulointiastetta siihen, joka saavutetaan naudan sikiön seerumia käytettäessä. Yhteenveto OHCrtä käyttäen saaduista mittaustuloksista on esitetty kuviossa 3.

10 Testausmenetelmää voidaan käyttää myös esimerkkien 1 ja 2 mukaisesti saatavien OHC-koostumusten laadun määrittämiseen. Käytettäessä naudan sikiön seerumia positiivisena vertailuaineena, toisaalta sisäisenä standardina solubiologisessa testaussysteemissä ja toisaalta OHC-näyt-15 teillä saatavien arvojen referenssinä, on mahdollista määritellä ja ilmaista aktiivisuusyksikkö OHC-koostumusten biologisen aktiivisuuden karakterisoimiseksi. Tämä mahdollistaa OHC-koostumusten biologisen aktiivisuuden standardoinnin.

20 Esimerkki 4 OHCsn stimuloiva vaikutus 3T3-fibroblastien ja ihmisen esinahkafibroblastien L-(5-3H)proliinin vastaanottoon

Viljeltyjen solujen porliinin vastaanotto voidaan määrittää samalla tavalla kuin esimerkissä 3 mutta käyttä-25 mällä jo kuvatussa soluviljelysysteemissä 3H-tymidiinin tilalla L-(5-3H)proliinia. Tällä testillä määritetään viljeltyjen solujen proteiinisynteesin nopeus, ja mittaamalla solujen absorboiman radioaktiivisuuden määrä voidaan määrittää OHC-koostumusten biologinen aktiivisuus. Kuvio 4 30 osoittaa OHC:n stimuloivan# vaikutuksen 3T3-fibroblastien L-(5-3H)proliinin vastaanottoon.

Kuvio 4 paljastaa, että OHC-koostumus kohottaa huomattavasti proteiinisynteesin nopeutta tutkituissa soluissa.

• li 91877 19

Esimerkki 5

Neutraaleissa olosuhteissa liukenevien OHC: n aineosien vaikutus naudan kondrosyyteistä muodostettuihin viljelmiin 5 Kondrosyytit eristetään nautavasikoiden epifyysi- rustoista normaalilla tavalla. 50 000 solua viljellään epäyhtenäisinä viljelminä 4-6 vuorokautta käyttäen kussakin tapauksessa 1 ml F12-kasvualustaa, johon on lisätty 10 % naudan sikiön seerumia. Kuten esimerkissä 3 tuloksena 10 olevat soluviljelmät käsitellään OHC-koostumuksilla 34/4, jotka on saatu esimerkkien 1 ja 2 mukaisesti. Soluista tehdään sitten pulsseja antavia 3H-tymidiinillä kuten esimerkissä 3, ja solujen radioaktiivisuus mitataan.

Kuviossa 5 on esitetty yhteenveto ensimmäisen tes-15 tin tuloksista. Naudan kondrosyyttien 3H-tymidiinin vastaanotto esitetään suhteessa OHC 34/4 -annokseen.

Kuvioista 6 ja 7 ilmenee, että tutkittu OHC 35/5 kiihdyttää kokonaisproteiinisynteesiä ja kollageenisyntee-siä.

20 34/4 ja 35/4 ilmaisevat erien sarjanumeron.

Esimerkki 6

Neutraaleissa olosuhteissa liukenevien OHC:n aineosien vaikutus luusolupopulaatioihin in vitro

Suurin piirtein tavalla, jonka ovat esittäneet Cohn 25 et ai. Skeletal Research, an Experimental Approach, toim. Simmons ja Kanin, Academic Press, New York - San Francisco - Lontoo, s. 3-20), eristetään eri luusolupopulaatiot aikariippuvaisella entsymaattisella sar jahajotusmenetelmällä vuorokauden ikäisten Wistar-rottien kalvaarioista, paitsi 30 että kollagenaasin ja trypsiinin ohella käytetään lisäent-syyminä hyaluronidaasia 0,05-%:isena solujen vapauttamiseksi luukudoksesta.

Erilaisia 20 minuutin hajotuksen aikana vapautuneita solupopulaatioita merkitään roomalaisilla numeroilla, 35 jotka vastaavat sitä järjestystä, jossa eri solufraktiot 20 91877 saadaan. Ensimmäistä kalvaarioista vapautettavaa solupopulaatiota merkitään Iillä, kun taas viimeistä 1 tunnin aikana vapautuneista soluiraktiosta merkitään Lsllä. Toi-mintatestit viittaavat siihen, että populaatiot I-III ovat 5 osteoprogenitorisoluryhmään kuuluvia soluja (preosteoblas-tityyppisiä). Solupopulaatioissa IV-VI on luonteeltaan osteoblastimaisia piirteitä, ja solupopulaatioita, joita merkitään Villillä ja Lilla, voidaan pitää lepotilassa olevina osteoblastityyppisinä soluina tai ehkä osteosyyt-10 tityyppisinä soluina.

10 ml suspensiota, joka sisältää 1,5 x 105 solua/ml MEM-alustaa (joka sisältää Earlen suoloja), johon on lisätty 10 % naudan sikiön seerumia, levitetään 250 ml in ku-dosviljelypulloihin. 9-10 vuorokautta kestäneen, 37 °Cissa 15 ja olosuhteissa, joissa C02in osapaine on 5 %, suoritetun inkuboinnin jälkeen saadaan yhtenäisiä solukerroksia, joista muodostetaan suspensio 0,2-%lista trypsiiniä käyttäen. Solut kerätään sentrifugoimalla suspensiota 7 minuuttia nopeudella 400 x g. Tuloksena olevat solupelletit 20 suspendoidaan uudelleen MEM-alustaan, johon on lisätty 20 % naudan sikiön seerumia ja 10 % DMSOita, suspensiot pakastetaan sitten nestetypessä myöhempää käyttöä varten.

Yksittäiset jäädytetyt luusolupopulaatiot lämmitetään varovasti 37 °Ciseen ja sekoitetaan 40 mliaan MEMtä, 25 johon on lisätty 20 % naudan sikiön seerumia. Suspensioita sentrifugoidaan 7 minuuttia nopeudella 400 x g, ja tuloksena olevat solupelletit suspendoidaan uudelleen tuoreeseen alustaan, johon on lisätty 10 % naudan sikiön seerumia, ja levitetään 96-syvennyksiselle mikromaljalle niin, 30 että kuhunkin syvennykseen tulee 7 - 10 x 103 solua. Soluja viljellään 2 vuorokautta. Kolmantena päivänä kasvualusta korvataan alustalla, joka sisältää joko 1 % tai 2 % naudan sikiön seerumia. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen alusta korvataan taas tuoreella alustalla, joka sisältää 1 % tai 2 % 35 naudan sikiön seerumia, 0,5 μΟϊ 3H-tymidiiniä/ml ja neut- • · 91877 21 raaleissa olosuhteissa liukenevia OHC:n aineosia erilaisina pitoisuuksina. Vertailuviljelmiin lisätään sopivat määrät PBS:ä.

Sen vahvistcuniseksi, että eri luusoluviljelmät to-5 della vastaavat mitogeenia, tehdään kokeita EDGF:ä (epi-dermaalista kasvutekijää).

Luusoluviljelmiä inkuboidaan 24 tuntia edellä mainituissa olosuhteissa 3H-tymidiiniä sisältävää alustaa käyttäen. Soluihin otettu 3H-tymidiinimäärä mitataan sitten 10 samalla tavalla kuin esimerkissä 3.

Yhteenveto koetuloksista on esitetty taulukossa IV, jossa kukin arvo on viidestä kokeesta saatu keskiarvo on esitetty keskipoikkeaman kera. PBSiään liuenneita OHC:n aineosia lisätään kasvualustoihin 5-50 μΐ kasvualustan 15 kokonaistilavuuden ollessa 200 μΐ.

Taulukko IV

Luusolupopulaatiot 3H-tymidiinin otto soluihin neutraaleissa olosuhteissa liukenevien OHC:n 20 aineosien V ja X aiheuttaman stimulaa tion johdosta, kun mukana on 1 % FCS1 2 % FCS1 _(cpm/syvennys + keskipoikkeama)

P-I

25 Vertailu (PBS) 19022 ± 1630(5) 27656 ± 841(5)

Op V 11070 ± 1160(5) 12394 ± 195(5)

Op X 11800 ± 508(5) 12678 ± 884(5)

P-II

Vertailu 19023 ± 552(5) 25103 ± 344(5) 30 Op V 15440 ± 491(5) 14910 ± 611(5)

Op X 13161 ± 491(5) 13425 ± 940(5)

P-III

Vertailu 12473 ± 582(5) 15159 ± 588(5)

Op V 8179 ± 433(5) 10105 ± 600(5) 35 Op X 6735 ± 455(5) 9676 ± 436(5) 22 9 1 8 7 7

Taulukko IV (jatkoa)

P-IV

Vertailu 16482 ± 750(5) 21006 ± 711(5)

Op V 9445 ± 481(5) 11388 ± 649(5) 5 Op X 6945 ± 178(5) 10356 ± 539(5)

P-V

Vertailu 18298 ± 774(5) 22677 ± 176(5)

Op V 14380 ± 746(5) 16115 ± 261(5)

Op X 14866 ± 250(5) 18330 ± 296(5)

10 P-VI

Vertailu 25789 ± 966(5) 37205 ± 2553(5)

Op V 23424 ± 1026(5) 28168 ± 711(5)

Op X 23346 ± 1239(5) 32107 ± 422(5)

P-VII

15 Vertailu 19405 ± 827(5) 26369 ± 1236(5)

Op V 30189 ± 1327(5) 41293 ± 1769(5)

Op X 37498 ± 994(5) 44817 ± 728(5)

P-L

Vertailu 13378 ± 396(5) 18654 ± 491(5) 20 Op V 18677 ± 523(5) 26816 ± 1027(5)

Op X 28488 ± 1241(5) 33411 ± 1220(5) 1 li FCS = naudan sikiön seerumi

Taulukosta IV ilmenee, että neutraaleissa olosuh-25 teissä liukenevat OHCsn aineosat stimuloivat luusolupopu-laatioiden V ja VI proliferaatiota suhteessa vertailuvil-jelmiin, joihin on lisätty PBS:ä. Luusolupopulaatiot I ja VII eivät osoita mitään reaktiota. Tulokset on toistettu graafisessa muodossa kuviossa 13.

30 Esimerkki 7

Taulukossa V on esitetty yhteenveto kokeiden, joissa määritettiin neutraaleissa olosuhteissa liukenevien OHCsn aineosien (OHC X) vaikutus rotan nahan fibroblastei-hin, tuloksista.

91877 23

Taulukko V

Rotan nahan fibroblastien 3H-tymidiinin vastaanotto OHC X-pitoisuuden funktiona 3H-tymidiinin otto soluihin 5 _(min'1/syvennys ± keskipoikkeamat ei FCSsä 450 ± 29 + 15 μΐ PBS 485 ± 38 + 7,5 μΐ OHC X 343 ± 18 + 15,0 μΐ OHC X 582 ± 42 10 + 30,0 μΐ OHC X 618 ± 16 1 % FCS - 917 ± 85 + 15 μΐ PBS 921 ± 33 + 7,5 μΐ OHC X 606 ± 32 + 15,0 μΐ OHC X 643 ± 33 15 + 30,0 μΐ OHC X 783 ± 79 2 % FCS - 1051 ± 23 + 15 μΐ PBS 1127 ± 51 + 7,5 μΐ OHC X 1059 ± 38 + 15,0 μΐ OHC X 920 ± 35 20 + 30,0 μΐ OHC X 1140 ± 57

Tuloksista, jotka on esitetty yhteenvetona taulukossa V, voidaan havaita, että OHC X ei kykene stimuloimaan rotan nahan fibroblasteja.

25 Verrattaessa koetuloksia, jotka on esitetty yhteen vetona taulukossa IV, taulukossa V yhteenvetona esitettyihin koetuloksiin, käy selväksi, että OHC Xsn mitogeeninen aktiivisuus on osteoblastispesifistä.

Esimerkki 8 30 Säteilytetyn OHC:n biologisen aktiivisuuden määri tys 0HC:tä, joka on valmistettu esimerkin 1 tai 2 mukaisesti, säteilytetään annoksen ollessa 25 kGy (2,5 Mrad). Koe suoritetaan samalla tavalla kuin esimerkissä 3.

35 Tulokset on esitetty kuviossa 8.

24 91 δ 77

Kuviossa 8 on esitetty yhteenveto tuloksista, jotka saatiin tutkittaessa 3T3-fibroblastien 3H-tymidiinin vastaanoton stimulaatiota käyttämällä erilaisia määriä sätei-lytetyn ja säteilyttämättömän OHC:n PBS-uutetta. Kuviosta 5 8 voidaan havaita, että säteilytys ei vaikuta OHC:n biolo giseen aktiivisuuteen.

Esimerkki 9 OHC:n vaikutuksen vertailu samalle indikaatioalueelle tarkoitettujen tunnettujen valmisteiden vaikutukseen 10 Punnitaan kierrekorkilla varustettuihin pulloihin 1 g kutakin testattavaa ainetta, ja lisätään 10 ml PBS:ä.

Sen jälkeen kun pulloja on ravistettu 2 tuntia huoneen lämpötilassa, seuraa 10 minuutin sentrifugointi MSE-pöy-täsentrifugissa nopeudella 3600 kierrosta/min. Kirkkaat 15 supernatantit erotetaan dekantoimalla ja sakat heitetään pois. Liuosten proteiinipitoisuus määritetään Bradfordin esittämällä tavalla, Anal. Biochem. 72 (1976) 248. 3T3- fibroblastien 3H-tymidiinin vastaanottoa stimuloidaan samalla tavalla kuin esimerkissä 3, ja se arvioidaan.

20 Yhteenveto valmisteista, joita verrattiin, ja nii den uuttuvasta proteiinisisällöstä on esitetty taulukossa VI.

Taulukko VI

Uutettavissa oleva prote- 25 iinimäärä/ml liuosta

Lencoll® 330 μg

Lenphos® 105 μg

Lensol® 3850 μg

Lensol® 4200 μg 30 Osspulvit® 24 μg

Mitsubishi Cookies® 82 μg PMC® 400 μg

Osteotrophic Concentrate 22 μg

Canzocal® 28,5 μg 35 OHC (keksintö) 600 μg l! 91877 25

Yhteenveto koetuloksista on esitetty kuviossa 9. Inaktiivisia aineita ei voida erottaa sokeasta kokeesta, eikä niistä ole tästä syystä piirretty kuvaajaa.

Kuviosta 9 voidaan havaita, että OHC on selvästi 5 parempi kuin muut tuotteet DNA-synteesin stimuloinnissa.

Esimerkki 10 OHC:n vaikutus luun paranemiseen eläinkokeissa OHC:n vaikutus luun paranemiseen selvitetään tutkimuksella, jossa käytetään 60 täysikasvuista kania. Käytetään 10 tarkkuustekniikkaa kooltaan ja sijainniltaan identtisten rustovikojen/luuvikojen aiheuttamiseksi kummankin polvinivelen distaaliseen femoraaliseen epifyysiin.

Eläimet jaetaan sattumanvaraisesti neljään 15 eläimen ryhmään. Hoitamaton ryhmä toimii vertailuryhmänä. En-15 simmäinen ryhmä saa 830 mg OHC:tä (178,0 mg kalsiumia) vuorokaudessa, toinen 510 mg tuhkaksi poltettua OHC:tä (ts. luun kivennäisaineita ilman aktiivisia orgaanisia aineosia; 178,9 mg kalsiumia) vuorokaudessa ja kolmas ryhmä 650 mg kalsiumkarbonaattia (189,7 mg kalsiumia) vuoro-20 kaudessa. Yksityiskohtainen kuvaus koesuunnitelmasta on esitetty taulukossa VII.

91877 26

Taulukko VII Koesuunnitelma

Testiryh- Kokeen Koe- Vuorokausi- Lisäkalsiu- mä post- eläin- annos min määrä opera- ten eläintä vuorokausi- tiivi- luku- kohden suun annoksessa nen määrä kautta an- mg:ina __kesto___nettuna__ 5 Vertailu- 35 5 ryhmä 56 5 __84__5___ OHC-ryhmä 35 51 tabletti 178,0 56 5 g 830 mg __84__5___ OHC (tuh- 35 5 1 tabletti 178,9 kaksi 56 5 @510 mg 10 poltettu__84__5___

CaCO-, 35 5 1 tabletti 189,7 (Os-Cal) 56 5 @ 650 mg _| 84 1 5 __ 7. päivästä 23. päivään vikojen aiheuttamisen jäl-15 keen eläimiä käsitellään sarjalla fluoresoivia merkkiaineita. 5, 8 ja 12 viikon kuluttua 5 eläintä (kullakin kerralla) tapetaan. Kudosleikkeet tutkitaan fluoresenssimik-roskoopilla kyseisen leikkaustason sijainnin ja määrittelyn ollessa vakioitu luuvika-alueella. Mikroskooppivaloku-20 vat tutkitaan indeksipistejärjestelmällä fluoresenssin intensiteetin, vikakohdan umpeutumisen luonteen ja asteen sekä uuden luun rakenteen perusteella. Tulokset on lueteltu taulukossa VIII.

27 9 1 8 7 7

Taulukko VIII Koesuunnitelma

Yhteenlaskettujen indeksipisteiden keskiarvo ja keskipoikkeamat eri hoitojen ja kokeen keston mukaan 5 Ryhmät 35 vuoro- 56 vuoro- 84 vuoro- __kautta__kautta__kautta_

Vertailu__17,8 ± 3,6 22,0 ± 8,5 16,2 ± 2,8 OHC__24,3 ± 4,8 31,8 ± 1,1 34,3 ± 2,4 OHC (tuhkak- 24,4 ± 4,2 28,2 ± 4,1 25,0 ± 12,8 si poltettu____ 10 CaC03 20,0 ± 7,1 27,2 ± 6,3 29,0 ± 6,1 (Os-Cal)

Kolmella hoidetulla ryhmällä kivennäistyminen on huomattavasti parempaa kuin hoitamattomalla vertailuryh-15 mällä. Kahteen muuhun vaikuttavaan hoitoon verrattuna hoito OHCsllä johtaa luuvikojen paranemisen huomattavaan paranemiseen.

Verrattaessa OHCtllä ja tuhkaksi poltetulla OHCtllä saatuja koetuloksia käy selväksi, että tuhottaessa orgaa-20 niset aineosat OHC:n edullinen vaikutus häviää.

Esimerkki 11 OHC:n vaikutus nivelkondrosyyttien hienorakenteeseen eläinkokeissa OHC:n vaikutusta nivelkondrosyyttien hienorakentee-25 seen kortikoidivaurion jälkeen tutkitaan sarjalla in vivo kokeita, joissa käytetään rottia. Kvantitatiivisen määrityksen mahdollistaa uuden, toistettavissa olevan morfomet-risen menetelmän käyttö; ks. M. Annefeld, Int. J. Tiss. Reac. VII (1985), nro 4, 273-289.

30 Kokeet suoritetaan kolmella ryhmällä, joissa kus sakin on 5 urospuolista Wistar-rottaa. Ensimmäinen on vertailuryhmä eikä saa hoitoa. Toiselle ryhmälle annetaan deksametasonia lihakseen ja kolmannelle ryhmälle deksame-tasonia lihakseen ja lisäksi suun kautta OHC:tä. Yhteen- 28 91877 veto koesuunnitelmasta on esitetty taulukossa IX.

Taulukko IX

Ryhmä Annos- Annetta- Tutkimuk- Eläinten tus/ vien sen kesto lukumäärä eläin/ lääkean- viikkoina viikko nosten koko-naismää- ___rä___ 5 Vertailu__-__-__5__5_

Deksame- 2x0,5 mg 10 5 5 tasoni__i.m.____

Deksame- 2x0,5 mg tasoni/ i.m. 10 5 5 10 OHC 5x50 mg p.o. 25 5 5 i.m. = lihakseen; p.o. = suun kautta.

Sen jälkeen kun eläimiä on hoidettu 5 viikkoa, ne 15 tapetaan. Kaikki rustokudos kummankin polvinivelen femu-rista ja tibiasta leikataan pois, ja kudos preparoidaan elektronimikroskooppitutkimusta varten. 50 kondrosyyttiä kustakin eläimestä analysoidaan morfometrisesti.

Suhteessa vertailuryhmään deksametasonilla hoide-20 tuilla eläimillä esiintyy endoplasmaverkon pituuden ja niiden nivelkondrosyyttien Golgin laitteiden kokonaispinta-alan pienenemistä kondrosyyttien suuremman kuolemisen ohella. Nämä elektronimikroskooppihavainnot ovat selvä todiste kortikosteroidien nivelkondrosyyteille aiheutta-25 masta vahingosta.

Eläimillä, joita hoidettiin lisäksi OHCsllä, esiintyy paljon vähäisempää endoplasmaverkon ja niiden nivelkondrosyyttien Golgin laitteiden pinta-alan pienenemistä. OHC alentaa kondrosyyttien kuolemisasteen, jota deksame-30 tasoni oli kohottanut, vertailutason alapuolelle, ja samalla OHC myös lisää mitokondrioiden kokonaispinta-alaa ja • * tl 91877 29 lukumäärää. Nämä havainnot viittaavat siihen, että suun kautta annettuna OHC kiihdyttää kondrosyyttien metaboliaa. Yhteenveto koetuloksista on esitetty taulukossa X.

5 Taulukko X

Kondrosyyttien hienorakenteen morfometrinen määritys 5 viikkoa kestäneiden testien jälkeen

Ver- Deksametasoni Deksametasoni tailu ____OHC_ endoplasma-10 verkko, koko- naispituus, μιη__28,2 1_21,6__23,6

Golgin laitteet, kokonaispinta- ala (μπτ )__2,58 1_2,12__2,71 2 15 Mitokondrioiden 13,1 1 16,1 1 20,4 2 lukumäärä, kokonaispinta-ala 1,28 - 1,35 1 1,96 2 (m )____

Solujen kuolemi- 20 nen, %_ 2,17 _4,00 1,25_

Deksametasonin ja OHC:n vaikutus 1 = tilastollisesti merkityksellinen ero vertailu- ja testiryhmän välillä . 25 2 = tilastollisesti merkittävä ero deksametasonilla ja sekä deksametasonilla että 0HC:llä hoidetun ryhmän välillä p = 0,01 n = 250/ryhmä Tämän kokeen perusteella voidaan todeta, että 30 OHCillä in vitro suoritetuilla solubiologisilla kokeilla saadut tulokset (ks. esimerkit 3-6) pitävät paikkansa myös in vivo. Lisäksi tulokset osoittavat, että OHC ehkäisee kortikosteroidien tunnettuja negatiivisia vaikutuksia rusto- ja luusoluihin säätelemällä solujen metaboliaa.

30 91S 77

Esimerkki 12 OHC:n käyttö luun paranemisen edistämiseen

Tutkitaan kliinisesti OHCsn vaikutusta luunmurtuman paranemiseen plaseboon verrattuna kaksoissokkokokeella.

5 Sattumanvaraisen ryhmiin järjestämisen jälkeen 85 sääriluunvarsimurtumatapausta hoidetaan kuuden viikon ajan jommalla kummalla kahdesta lääkityksestä. Taulukossa XI on esitetty yhteenveto potilaiden iästä ja hoitotyypistä.

10 Taulukko XI

Potilaiden lukumäärä 1 400 mg OHC/d 15 > 55 vuotta 13 13 < 55 vuotta 36 23 49 36 20 Sääriluunvarsimurtumien paraneminen määritetään seuraavien parametrien perusteella: a) liikkumattomuus murtumakohdassa b) kivun puuttuminen 25 c) murtuneen raajan liikkuvuus d) murtuneen raajan maksimikuormitus e) radiologiset havainnot

Vanhempien potilaiden tapauksessa lujittuminen OHC-hoidon vaikutuksesta tapahtuu noin 11 viikon kuluttua, ts.

30 huomattavasti nopeammin kuin plaseboa käytettäessä (14,2 viikkoa, p < 0,05). Nuorempien potilaiden tapauksessa erolla ei ole tilastollista merkitystä (12,5 viikkoa versus 11,5 viikkoa). Näistä koetuloksista ilmenee, kunhan muistetaan, että plaseboryhmän tapauksessa komplikaatioi- 35 den määrä kirurgisia toimenpiteitä vaativassa parantamisessa on kolme kertaa suurempi, että OHC edistää murtumien järjestelmällistä paranemista.

• * 31 91877

Esimerkki 13

Osteoporoosin hoito OHCsllä

Tutkitaan OHCsn vaikutusta kortikoidien aiheuttamaan osteoporoosiin vertailututkimuksella.

5 64 potilasta, joiden ikä on vähintään 50 vuotta ja jotka ovat saaneet kortikosteroideja nivelreuman hoitoon, jaetaan tilastollisesti identtisiin ryhmiin hoitoa varten. Ryhmän 1 potilaat saavat 4,9 g OHC:tä vuorokaudessa normaalin hoitonsa lisäksi. Ryhmän 2 potilaille ei anneta 10 OHC:tä.

Hoitojakson lopussa sääriluun varren lyheneminen ja värttinäluun tiheyden pieneneminen on huomattavasti vähäisempää OHCsllä hoidetussa ryhmässä kuin vertailuryhmässä. Myös muiden parametrien, kuten kyynärluun tiheyden ja sel-15 käkipujen, osalta ilmenee myös paranemista OHCsllä hoidetussa ryhmässä vertailuryhmään nähden mutta ei tilastollisesti merkittävässä määrin. Yhteenveto tuloksista on esitetty taulukossa XII.

Taulukko XII

20 Luukato-oire-erot 1 vuoden täydentävän OHC-hoidon jälkeen

Vertailuryhmä OHC p-arvot Sääriluun pituuden 25 keskim. lyheneminen (cm ± keskipoikkeama) 1,16 = 0,71 0,87 = 0,58 0,01 < p < 0,05 Värttinäluun tihey-30 den keskim. pienene minen BMC/W ± keskipoikkeama 0,056 = 0,035 0,043 = 0,029 p < 0,05

Kyynärluun tiheyden 35 keskim. pieneneminen BMC/W ± keskipoikkeama 0,033 = 0,031 0,030 = 0,026 n.s.

Nikamien uusien pirstale-40 murtumien määrä radio- grafeissa 4 3 n.s.

n.s. = merkityksetön • * 91877 32 OHC-hoito on tuloksellinen myös luukadon etenemisen ehkäisyssä steroideilla hoidetussa reumassa. Tutkimuksen perusteella on ilmeistä, että OHC-hoito tulisi aloittaa mahdollisimman pian systeemisen kortikosteroidihoidon al-5 käessä odottamatta luukadon kehittymistä ilmaisevia kliinisiä oireita.

Esimerkki 14

Osteoporoosin hoito OHC:llä kalsiumhoitoon verrattuna 10 Tutkitaan kliinisesti D2-vitamiinin, OHCsn ja kal- siumglukonaatin vaikutusta osana alkuvaiheessa olevan maksakirroosin hoitoa, joka tila on seurausta nopeasta luukadosta.

D2-vitamiinia annetaan parenteraalisesti 65:lie 15 vaihdevuodet ohittaneelle naiselle, joilla on osteoporoot-tisia muutoksia, alkuvaiheessa olevassa maksakirroosissa. Potilaat jaetaan tilastollisin perustein kolmeen ryhmään. Ensimmäisessä ryhmässä on 22 potilasta, ja se saa ainoastaan D2-vitamiinia (vertailuryhmä). Toisen ryhmän muodosta-20 vat 21 potilasta saavat 6,6 g 0HC:tä vuorokaudessa D2-vi-tamiinihoitonsa lisäksi. Kolmas ryhmä, jossa on 22 potilasta, saa sellaisen annoksen kalsiumia, joka vastaa toisen ryhmän potilaille annettavaa OHC-annosta, ts. 4 kal-siumglukonaattiporetablettia vuorokaudessa.

25 14 kuukauden hoidon jälkeen käy selväksi, että pa- renteraalinen hoito OHCtllä ei riitä pysäyttämään luukatoa, jota mitattiin kämmenluuindeksin avulla, ja että D2-vitamiinin ja kalsiumglukonaatin yhdistelmä on vain juuri ja juuri pysäyttänyt luukadon etenemisen ja että vain D2-• 30 vitamiinin ja 0HC:n yhdistelmä saa aikaan tilastollisesti merkityksellisen luun kuoriosan 11,6 %:n lisääntymisen vertailuryhmään nähden. Yhteenveto koetuloksista on esitetty kuviossa 10.

Nämä tulokset osoittavat, että OHC ei ole yksin-35 omaan pelkkä kalsiumvalmiste.

33 91 S 77

Esimerkki 15

Osteoporoosin hoito OHCsllä 36 potilasta, joita on hoidettu prednisolonilla ja atsatiopriinilla vähintään vuoden ajan jatkuvasti aktiivi-5 sen autoimmuunihepatiitin johdosta, jaetaan kahteen ryhmään tilastollisin perustein. Ensimmäisen ryhmän 18 potilasta saavat 6,6 g OHC:tä vuorokaudessa 2 vuoden ajan, kun taas vertailuryhmän 18 potilasta eivät saa OHC:tä.

Koetulokset saadaan fotodensitometrian ja luubiop-10 sian avulla. Kahden vuoden kuluttua vertailuryhmä on kokenut tilastollisesti merkityksellisen kyynärluun kivennäisainepitoisuuden BMC alenemisen ("yksi ainoa" fotodensito-metrinen määritys) ja suoliluun harjan kuoriosan paksuuden CPT alenemisen (luubiopsia) (ks. kuviot 11 ja 12). Luu-15 biopsiassa havaitaan, että vertailuryhmässä on tapahtunut selvä ansasluutilavuuden (TBV) pieneneminen (ks. kuvio 12). Toisaalta OHC-hoidon tapauksessa kyynärluun kivennäisainepitoisuus säilyy muuttumattomana (ks. kuvio 11), ansasluutilavuus kasvaa ja kuoriosan paksuuden pienenemi-20 nen on tilastollisesti huomattavasti vähäisempää kuin vertailuryhmässä (kuvio 12). Kahden vuoden hoitojakson aikana kolmella vertailuryhmällä potilaalla esiintyy nikamadefor-maatioita mutta ei yhdelläkään OHC-hoitoryhmän potilaalla. Viidellä potilaalla ansasluutilavuus (TBV) on Meunierin 25 olettaman "nikamamurtumakynnyksen" 11 % - 3 % alapuolella, mutta yhdelläkään neljästä riskipotilaasta, joita hoidettiin 0HC:llä, nikamamurtumaa ei kehity. Kolmella vertailuryhmän potilaalla (TBV > 16 %) esiintyy kuitenkin nikama-deformaatioita, joihin liittyy TBV-tason putoaminen alle 30 11 %:n.

Esimerkki 16 OHC:n vaikutus munasarjan poiston jälkeen

Retrospektiivisesti kontrolloidussa tutkimuksessa käytetään tavanomaisia luuspesifisiä parametreja (emäksi-35 sen fosfataasin luuspesifinen isoentsyymi - osteoblasti- merkkiaine; hydroksiproliini virtsassa - osteoplastimerk-kiaine; "tartraattiresistentti" hapan fosfataasi - osteo- 34 9 1 8 7 7 klastimerkkiaine) sen osoittamiseksi, että toisaalta seerumin entsyymitaso kohoaa jyrkästi välittömästi munasarjan poiston jälkeen (merkki suuresta ja voimakkaasta luun muuttumisesta) ja että toisaalta 9 kuukauden hoito 7,5 5 g:11a OHCstä vuorokaudessa normalisoi lisääntyneen luun muuttumisen ja alentaa siten riskiä. Biokemiallisia havaintoja vastaavasti havaitaan luun lisäkasvua OHCrtä annettaessa, ja tämä voidaan mitata metakarpaalisen indeksin avulla. Kortikaalinen 1,1 - 0,6 %:n luukato vuodessa, joka 10 mitattiin ennen hoitoa, muuttuu OHC-hoidon tapauksessa tilastollisesti merkitykselliseksi luun todelliseksi lisääntymiseksi 0,2 - 0,3 % vuodessa.

Esimerkki 17 OHC:n vaikutusta selvästi todetussa osteoporoosissa 15 koskeva tietokonetomografiamittaus 11 potilasta, joilla on osteoporoosi (2 miestä, 9 naista), hoidetaan kahden vuoden ajan 7,5 g:11a OHC:tä vuorokaudessa tutkitaan kvantitatiivista tietokonetomografiaa käyttäen; ks. P. Ruegsegger et ai., J. Comput. As-20 sist. Tomogr. 5 (1981) 384-390. Potilaiden ikärakenteen perusteella olisi odotettavissa luuhohkatiheyden aleneminen keskimäärin 2,7 % vuodessa.

OHC-hoidon tapauksessa kuitenkin käytännöllisesti katsoen kaikilla hoidetuilla potilailla havaitaan pientä 25 huokoisen luun massan kasvua. Sellaista kasvua on muuten havaittu ainoastaan natriumfluoridihoidon tapauksessa, mutta viimeksi mainitussa tapauksessa vaikutus ei ollut yhtä säännöllinen ja jatkuva ja se havaittiin ainoastaan eräissä potilaissa (vasteelliset). Viimeisimmät tulokset, 30 ks. M.A. Dambacher et ai., Bone 7 (1986) 199 - 205, osoittavat, että tavanomainen hoito (natriumfluoridi tai natriumf luoridin ja kalsiumin yhdistelmä) ei pysty estämään taudin etenemistä (luukatoa ei voida estää täydellisesti; nikamien pirstalemurtumien määrä kohoaa). Spontaania an-35 sasluun lisääntymistä ei ole tähän mennessä koskaan havaittu hoitamattomilla potilailla.

Il

Claims (9)

1. 91877 Patenttivaatimus Menetelmä osseiini-hydroksiapatiittiyhdisteen (OHC) valmistamiseksi, jonka kuiva-aineanalyysiparametrit ovat 5 seuraavat: Aistinvarainen testi Hienosta vähän rakeiseen vaihte- leva, beigenharmaa jauhe, jolla heikko luontainen haju Identtisyys Todettiin kalsium ja fosfataasi
2. 10 Todettiin kollageeni Vesipitoisuus <7 % Tuhkan kokonaismäärä 51,3 - 62,7 % Kalsium 19,2 - 23,6 % Fosfori 8,9 - 10,9 %
3. 15 Kollageeni 23,4 - 28,6 % Ei-kollageenit proteiinit/ peptidit 7,2 - 10,8 % Hivenaineet Todettiin F, Na, K, Mg, Fe, Zn, Cu ja Ni
4. 20 Fosfataasiaktiivisuus 0,5 - 15 mE/mg Epänormaali myrkyllisyys Ei merkkejä intoleranssista Kokonaismikrobisisältö <104/g Hiivat <102/g
5. 25 Enterobakteerit <102/g Erityiset mikrobilajit Ei läsnä ja jolla on seuraavat biologiset aktiivisuudet: a) osteoblastien, kondrosyyttien ja fibroblastien DNA-synteesiä stimuloiva vaikutus, 30 b) kondrosyyttien ja fibroblastien proteiinisyntee siä stimuloiva vaikutus, c) selektiivisesti kondrosyyttien kokonaiskollagee-nisynteesiä stimuloiva vaikutus suhteessa kokonaisproteii-nisynteesin stimulaatioon, ja 35 d) epäspesifisten mesenkyymisolujen erilaistumista 91877 kondrosyyteiksi tai osteoblasteiksi edistävä vaikutus, tunnettu siitä, että a) iältään sikiöasteisesta noin 12 kuukauden ikäiseen olevasta naudasta peräisin olevat pitkät luut murska- 5 taan niin, että maksimihiukkaskooksi tulee noin 1 cm, b) mahdollisesti luuhiukkasia kuivataan alennetussa paineessa 20 - 80 °C:ssa, kunnes niiden jäljellä oleva vesipitoisuus on korkeintaan 10 % tai 10 - 25 %, c) saadun luuaineksen pH säädetään hapolla arvoon 10 5,0 - 5,5, d) sen jälkeen luuaineksesta poistetaan hydrofii-lista ja lipofiilista liuotinta käyttäen vettä ja rasvaa, kunnes jäljellä oleva vesi- ja jäljellä oleva rasvapitoisuus ovat korkeintaan 5 %, tai siitä poistetaan ensin 20 - 15 80 °C:ssa hydrofiilista liuotinta käyttäen vettä, kunnes jäljellä oleva vesipitoisuus on korkeintaan 5%, ja sen jälkeen 20 - 80 °C:ssa lipofiilista liuotinta käyttäen rasvaa, kunnes jäljellä oleva rasvapitoisuus on korkeintaan 5 %, 20 e) luuainesta, josta on poistettu vettä ja rasvaa, kuivataan alennetussa paineessa 20 - 80 °C:ssa, kunnes saavutetaan korkeintaan 1 %:n liuotinpitoisuus, ja f) luuaines jauhetaan 50 - 300 pm:n hiukkaskokoon ja steriloidaan sen jälkeen. « 91877 Förfarande för produktion av en ossein-hydroxiapa-titförening (OHC) med följande analysparametrar för torr-5 substansen: Organoleptiskt prov Fint tili nägot granulärt, beige- grätt pulver med svag naturlig doft Identitet Kalcium och fosfatas identifierat
6. 10 Kollagen identifierat Vatteninnehäll <7 % Aska totalt 51,3 - 62,7 % Kalcium 19,2 - 23,6 % Fosfor 8,9 - 10,9 %
7. 15 Kollagen 23,4 - 28,6 % Icke-kollagena proteiner/ peptider 7,2 - 10,8 % Spärämnen F, Na, K, Mg, Fe, Zn, Cu och Ni identifierade
8. 20 Fosfatasaktivitet 0,5 - 15 mE/mg Onormal giftighet inga tecken pä intolerans Totalt mikrobinnehäll <10Vg Jäst <102/g Enterobakterier <102/g
9. 25 Speciella mikrobarter fränvarande och med följande biologiska aktiviteters a) stimulering av DNA-syntesen hos osteoblaster, chondrocyter och fibroblaster, b) stimulering av proteinsyntesen hos chondrocyter 30 och fibroblaster, c) selektiv stimulering av den totala kollagensyn-tesen hos chondrocyter i jämförelse med stimuleringen av den totala proteinsyntesen, och d) befrämjande av differentieringen av icke-speci-35 fika mesenchymceller tili chondrocyter eller osteoblaster, 91877 kännetecknat därav, att man a) krossar länga ben av nötkreatur i en älder mel-lan fosterstadiet och 12 mänader, sä att partikelstorle-ken maximalt blir ca 1 cm, 5 b) eventuellt torkar benpartiklarna vid reducerat tryck vid 20 - 80 °C tills den kvarvarande vattenmängden är maximalt 10 % eller 10 - 25 %, c) reglerar pH värdet hos det erh&llna benmateri-alet tili 5,0 - 5,5 med en syra, 10 d) därefter avlägsnar vatten och fett ur benmate- rialet med ett hydrofilt och lipofilt lösningsmedel tills den äterstäende vatten- och äterstäende fetthalten är maximalt 5 %, eller först avlägsnar därur vattnet med ett hydrofilt lösningsmedel vid 20 - 80 °C tills den äterstä-15 ende vattenmängden är maximalt 5 % och sedan f ettet med ett lipofilt lösningsmedel vid 20 - 80 °C tills den äter-stäende fetthalten är maximalt 5 %, e) torkar benmaterialet ur vilket vatten och fett avlägsnats vid reducerat tryck vid 20 - 80 °C tills den 20 maximala haiten lösningsmedel är 1 %, och f) pulveriserar benmaterialet tili en partikelstor-lek pä 50 - 300 pm och därefter steriliserar.