JPH0211599A - 骨芽細胞増殖因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、骨芽細胞の増殖を促進して骨形成を増長せし
める骨芽細胞増殖因子に関する。さらに詳しくは、骨粗
鰭症、難治性骨折などの治療ならびにそれらの病気の診
断測定用試薬および骨芽細胞増殖因子のための抗体を製
造するにおいて、または骨代謝研究において有用な骨芽
細胞増殖因子に関する。

［従来の技術および発明が解決しようとする課題］ を推動物は一生を通して骨形成と骨吸収をくり返し、そ
の両者のバランスが保たれて骨格が維持されている。こ
のバランスが崩れると種々の骨代謝性疾患が発症する。

なかでも骨粗髭症はその代表的なものとしてあげられ、
これは骨の吸収のあと、形成が伴なわないときに起こる
ものと考えられている。

そこで本発明者らはかかる実情に鑑み鋭意研究を重ねた
結果、その生理活性物により骨芽細胞の増殖を促進して
骨形成を増長せしめ、骨粗髭症、難治性骨折などの治療
ならびにそれらの病気の診断測定用試薬および骨芽細胞
増殖因子のための抗体を製造するにおいて、または骨代
謝研究において有用な骨芽細胞増殖因子を見出し、本発
明を完成した。

［課題を解決するための手段］ すなわち、本発明は、ヒトまたは哺乳動物の骨から精製
されたものであって、 （１）等電点がｐＨ４〜６であり、 （２合成ポリマーゲル濾過剤による濾過で相対平均分子
ｆｆｉ　１００００〜４０００ｄａｌの位置に溶出する
ものであり、 （３）天然ゲル濾過剤による濾過で相対平均分子量が２
５０００−１５０００ｄａｌの位置に溶出するものであ
り、 （４）　１ｏ　ｏ℃で５分間の熱処理に安定であり、か
つ（５）ジチオトレイトール（以下、ＤＴＴという）に
よる還元処理に安定である 活性成分を含有することを特徴とする骨芽細胞増殖因子
（Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ　Ｐｒｏｌｌｆｅｒａｔｉｏｎ
　Ｆａｃｔｏｒｓ以下ＯＰＦという）に関する。

上記活性成分はさらにＣＩ８ヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅ
ｏｓｉｌ）カラム（３００人（平均細孔直径）、７μｍ
　（粒子径）、０．４８　　（内径）Ｘ２５（カラム長
）　ｃｌｌｌ、ナーゲル（Ｍ、Ｎａｇｅｌ　）社製）を
用いて行なう逆層高速液体クロマトグラフィーでｃ１８
ヌクレオシルカラムに結合し、３５±２％（容量％、以
下同様）アセトニトリル−０，１％トリフルオロ酢酢酸
台溶液で溶出するもの、とくにそれに加えてＣＡＢバイ
ダック（ＶＹＤＡＣ）カラム（３００人（平均細孔直径
）、５μｍ　（粒子径）、０．４８　　（内径）Ｘ２５
（カラム長）　ｃｍ、バイダック（ＶＹＤＡＣ）社製）
を用いて行なう逆層高速液体クロマトグラフィーでＣＡ
６パイダツクカラムに結合し、２８．８±３％アセトニ
トリル−０．１％トリフルオロ酢酸混合溶液で溶出する
ものが骨芽細胞増殖活性がより高いので好ましい。

上記本発明の骨芽細胞増殖因子の活性成分は以下に示す
方法にしたがってえられた結果によって特定される。

（等電点） オー・ファーレル（０’Ｐａｒｒｅｌｌ　、ザ串ジャー
ナル・オブψバイオロジカル・ケミストリ（Ｊ。

Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｍ　、　２５０巻、４００７頁（１９
７５））の方法に順じて行なう。

チューブ（０，５（内径）ＸＩＧ（チューブ長）ｅｌｌ
）２本を用い、−本にはサンプル１０μｇを添加して、
他の一本は無添加で泳動させる。泳動後サンプル添加ゲ
ルとサンプル無添加ゲルをただちに０．５　ｃｍ間隔で
切断し、サンプル添加ゲルをたとえば０．０２５％シー
・エイチ・ニー・ピー・ニス（半井化学薬品■製、以下
ＣＩＡＰＳという）−１ｈＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＮ　（ｐ
Ｈ７，４）混合溶液０．５ｍｌで３時間抽出し、抽出液
をニワトリ骨芽細胞を培養した培地に最終添加濃度が２
０ｎｇ／ｍｌになるように添加し培地内の３Ｈ−チミジ
ンのニワトリ骨芽細胞への取り込み量を指標に各サンプ
ル添加ゲルの生理活性をアッセイする。また、各サンプ
ル無添加ゲルを水０．５ｍｌにつけ３時間抽出後１）Ｈ
を測定して対応するサンプル添加ゲルの等電点を決定す
る。

（合成ポリマーゲル濾過剤による濾過での相対平均分子
量） サンプル２２０ｍｇを５　ｍｌの４ＭＧｎｄ　　　ＨＣ
Ｎ　−２０１ｉＭＴｒｌｓ−ＨＣｆ　（ｐＨ７，５）混
合溶液に溶解し、１６時間、４℃で放置する。不溶性蛋
白質を遠心除去したのち、このサンプル液を前記４ＭＧ
ｎｄ　　　ＨＣｆ　−２０１Ｍ　Ｔｒｉｓ　　　ＨＣＩ
混合溶液で平衡化した合成ポリマーゲル濾過剤、たとえ
ばトーソー（Ｔｏｓｏ）　ＨＶ−５０Ｆカラム（２，８
（内径）Ｘ１００（カラム長）（至）、東ソー■製）に
添加し、４℃で流速１ｍ１Ｚ分で溶出分画（５ｍｌ　／
フラクション）する。溶出したサンプル画分を透析チュ
ーブ、たとえば透析チューブＶＴ３５１（平井化学薬品
■製）に入れ、それぞれＩＩＩの水に対して４℃で２日
間透析し、透析内液を凍結乾燥する。えられた蛋白質を
２ｍｌの蒸溜水で溶解したのち、ニワトリ骨芽細胞を培
養した培地に添加し、培地内の３Ｈ−チミジンのニワト
リ骨芽細胞への取り込み量を指標にサンプルの生理活性
をアッセイ（Ａｓ５ａｙ）　Ｌ、最大活性を示す両分を
サンプルの活性成分の溶出位置とする。この溶出位置か
ら、前記と同一の条件下で前記カラムに添加して、溶出
させた分子量既知のマーカー蛋白質、たとえばビーニス
ニー（ＢＳＡ、重量平均分子量６８ｋｄａｌ；　シグマ
（３１ｇｍａ）社製）、オブアルブミン（０ｖａｌｂｕ
Ｉｌｉｎ　ｓ重量平均分子量４３ｋｄａｌ　；シグマ社
製）、α−キモトリプシノーゲンＡ（α− ｃｈｙｍｏｔｒｙ１８ｉｎｏｇｅｎ　Ａ％重量平均分子
量２５ｋｄａｌ　；シグマ社製）、シトクロームＣ（ｃ
ｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｃｓ重量平均分子１１１２ｋｄａ
ｌ；　シグマ社製）およびブタインシュリン（ｐｏｒｃ
ｌｎｅ　Ｉｎ５ｕｌｉｎ　、重量平均分子量８ｋｄａｌ
　　；シグマ社製）の溶出位置に基づいてサンプルの活
性成分の相対平均分子量を算出する。

（天然ゲル濾過剤による濾過での相対平均分子量） サンプル２２０ｔｓｇを５　ｍｌの４ＭＧｎｄ　　　Ｈ
Ｃｆ　−２０ｍＭＴｒ１ｓ−ＨＣｆ　（ｐＨ７，５）混
合溶液に溶解し、同混合溶液で平衡化した天然ゲル濾過
剤、たとえばセファデックスＧ−７５スーパーフアイン
（５ｅｐｈａｄｅｘＧ−７５Ｓｕｐｅｒｆｌｎｅ）カラ
ム（２，８（内径）Ｘ１００（カラム長）ＣＩＯ，ファ
ルマシア（ｐｈａｒｉａｃｌａ）社製）に添加し、４℃
で流速０．２ｍｌ　／分で溶出分画（５ｍｌ　／フラク
ション）する。

溶出したサンプル画分を透析チューブ、たとえば透析チ
ューブＶＴ３５１に入れ、それぞれ１ｇの水に対して４
℃で２日間透析し、透析内液を凍結乾燥する。えられた
蛋白質を２　ｍｌの蒸溜水で溶解したのち、ニワトリ骨
芽細胞を培養した培地に添加し、培地内の３Ｈ−チミジ
ンのニワトリ骨芽細胞への取り込み量を指標にサンプル
の生理活性をアッセイ（Ａｓ５ａｙ）　Ｌ、最大活性を
示す両分をサンプルの活性成分の溶出位置とする。

この溶出位置から、前記と同一の条件下で、前記カラム
に添加して、溶出させた分子量既知のマーカー蛋白質、
たとえばビーニスニー（ＢＳＡ。

重量平均分子量８８ｋｄａｌ）　、オブアルブミン（Ｏ
ｖａｌｂｕｌｎ、重量平均分子ｊ１４３ｋｄａｌ）　、
ａ−キモトリプシノーゲンＡ　（ａ　−ｃｈｙｍｏｔｒ
ｙ１８ｉｎｏｇｅｎＡ１重量平均分子ｆ１２５ｋｄａｌ
）およびシトクロームＣ（ｃｙｔｏｃｈｒｏａ＋ｅ　Ｃ
、重量平均分子量１２ｋｄａｌ）の溶出位置に基づいて
サンプルの活性成分の相対平均分子量を算出する。

（０１８ヌクレオシルカラムを用いて行なう逆層高速液
体クロマトグラフィーでの溶出）凍結乾燥サンプル３０
μｇを６％アセトニトリル−ロ、１％トリフルオロ酢酸
（以下、ＴＦＡという）混合溶液２　ｍｌに溶解したの
ち、前記６％アセトニトリル−０，１％ＴＦＡ混合溶液
で平衡化したＣ＋ａ＋６ヌクレオシルカラム００Å、７
μｔｘ　ｓ　０−４６Ｘ　２５ｅ１１）に２０℃で添加
する。

逆層高速液体クロマトグラフィー（たとえば日立高速液
体クロマトグラフ８５５Ａ、■日立製作所型）の制御下
に１０分間同じ混合溶液を流したのち、０．１％ＴＦＡ
の存在下、２０℃で６０％アセトニトリルの濃度が直線
的勾配（Ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｌｅｎｔ）を示すよう
にして２時間にわたり溶出する。流速は１ｍｌ／分を用
いる。

（０１８パイダツクカラムを用いて行なう逆層高速液体
クロマトグラフィーでの溶出） 凍結乾燥サンプルを、前記Ｃ＋６ヌクレオシルカラムを
用いて行なう逆層高速液体クロマトグラフィーでの溶出
と同じ条件下でＣＡ６パイダッフカラム（３００Å、５
　ｕ　ｍ　、　０．４６×　２５ｃｍ）に２０℃で添加
し、逆層高速液体クロマトグラフィー（たとえば日立高
速液体クロマトグラフｅ５５Ａ）の制御下に１０分間同
じ混合溶液を流したのち、０．１％ＴＦＡの存在下、２
０℃で６０％アセトニトリルの濃度が直線的勾配（Ｌｌ
ｎｅａｒ　ｇｒａｄｌｅｎｔ）を示すようにして３時間
にわたり溶出する。流速は１ｍｌ／分を用いる。

（熱処理） サンプル１μｇを０．２ｍｌの生理食塩水に溶解し、そ
のＯ，１ｍｌを１００℃沸騰水浴上で５分間処理したの
ち、ただちに氷水中に入れ室温まで冷却する。ついで該
溶液と残りＯ，１ｍｌの溶、液とをそれぞれサンプルの
培地中の最終濃度が２０ｎｇ／ｍ１になるように０．１
％ＢＳＡ溶液で調製してニワトリ骨芽細胞を培養した培
地に添加し培地内の３Ｈ−チミジンのニワトリ骨芽細胞
への取り込み量を指標にサンプルの生理活性をアッセイ
する。

無処理のサンプルの生理活性を１００として、熱処理の
サンプルの生理活性が９０以上であれば安定と評価する
。

（ＤＴＴによる還元処理） サンプル２００ｎｇを０．２ｍｌの０．１Ｍ燐酸緩衝液
（ｐＨ７，５）−２０ｍＭ　ＤＴＴ混合溶液に溶解し４
℃で６時間静置して還元処理する。該溶液と同量のサン
プルの０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，５）とをそれぞれ
ニワトリ骨芽細胞を培養した培地に添加し培地内の３Ｈ
−チミジンのニワトリ骨芽細胞への取り込み量を指標に
サンプルの生理活性をアッセイする。

無処理のサンプルの生理活性を１００として、還元処理
のサンプルの生理活性が９０以上であれば安定と評価す
る。

［実施例］ 本発明のＯＰＦは、人大腿頭骨（股関節手術で不要にな
った骨）などの骨基質を分離源として精製された骨芽細
胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ＣｈｉｃｋＣａｌｖａｒｉａ
ｌ　Ｃｅ１ｌ）の増殖に活性を有する成分である酸性ポ
リペプチドを含有し、即知のものとは異った新規なもの
である。

本発明のＯＰＦの分離源としては、ヒトまたは哺乳動物
の骨があげられとくに人大腿頭骨で軟骨、骨髄および血
液成分をほとんど完全に除去された骨基質が好ましい。

また、牛、ブタ、その他補乳動物の骨（基質）は、入手
が容易である点で好ましい。

本発明のＯＦＦの調製は、たとえば以下のように行なわ
れる。

たとえばミルなどの粉砕機を用いて上記分離源よりえた
骨を破砕し、えられた粉骨に凍結乾燥、洗浄、脱脂、透
析、透析内液の遠心分離による巨大蛋白分子の除去など
の操作を施し、粗砥分子蛋白質をうる。

つぎに、えられた粗蛋白質を合成ポリマーゲル濾過剤に
よる濾過、ついで天然ゲル濾過剤にによる濾過に供して
　３ｎ−チミジンの取り込み量の増加を骨芽細胞増殖の
指標として、骨芽細胞増殖活性を有する両分を集め本発
明のＯＰＦをうる。上記濾過法としては通常当業者にお
いて用いられる方法を用いることができる。

合成ポリマーゲル濾過剤としては、たとえばトーソーＨ
Ｗ−５０Ｐカラム（２，６（内径）Ｘ１００（カラム長
）Ｃ１１）があげられる。合成ポリマーゲル濾過により
本発明のＯＰＦの活性成分は相対平均分子量１００００
〜４０００ｄａｌの位置に遅れて溶出する。遅れて溶出
するのは本発明のＯＰＰの活性成分のカラム内のゲル濾
過剤との特異的相互作用のためである。また、天然ゲル
濾過剤としては、たとえばセファデックス０７５スーパ
ーフアインカラム（２，８（内径）Ｘ１００（カラム長
）ａｍ）があげられる。天然ゲル濾過により本発明のＯ
ＰＦの活性成分は相対平均分子量２５０００〜１５００
０ｄａｌの位置に溶出する。天然ゲル濾過剤はデキスト
ランを架橋したものでありで、天然材のものであるので
親水性なために蛋白質の相互作用が少ない。

ついで、さらに高純度に活性成分を含有するＯＦＦをう
るために以下の工程を用いることができる。まず、上記
ゲル濾過によってえられた骨芽細胞増殖活性を有する画
分をイオン交換クロマトグラフィーにかける。この工程
においては、ｐｎは８．０〜９．０が蛋白質を塩基性イ
オン交換体に結合させるので好ましく用いられ、イオン
交換体としてはファルマシアモノＱ　（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａＭｏｎｏ　Ｑ）カラム（０，５（内径）×５（カラ
ム長）口、ファルマシア社製）　、ＤＥＡＲＴＳＫ−５
ＰＶカラム（０，５（内径）ＸＩＯ（カラム長）ｃｍ、
東ソー■製）などを用い、溶媒としてＮ）（４ＨＣ０３
などの塩をＣＨＡＰＳなどの界面活性剤とともに用いて
、ＮＨ４ＨＣＯ３濃度勾配を利用して溶出させる。溶媒
としてＮＨ４ＨＣＯ３、界面活性剤として０．０２５％
ＣＨＡＰＳおよびイオン交換体としてファルマシアモノ
Ｑカラム、（０，５（内径）×５（カラム長）ｃＳ）を
用いるばあいにはＮ）ｌ＋ＨｃＯｘの濃度勾配は５ｍＭ
から５００　ｄの範囲を用いうる。この工程における操
作は通常当業者に既知の方法にしたがって行うことがで
きる。

さらに、上記クロマトグラフィーによってえられた骨芽
細胞増殖活性を有する画分を逆層高速液体クロマトグラ
フィーにかけさらに精製し、高純度に活性成分を含有す
るＯＦＦをつる。

つぎに実施例をあげて本発明のＯＰＦおよびその調製法
をさらに詳し、く説明するが、本発明はかかる実施例の
みに限定されるものではない。

実施例１ （骨より蛋白質の抽出） 人大腿頭骨（股関節手術で不要になった骨）５００ｇを
液体窒素で凍結し、ミルで破砕し粉骨をえた。えられた
粉骨を２５ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７，２）で繰り返し洗
浄して血液成分および骨髄を除去した。ついでアセトン
つぎにエーテルで脱脂したのち、粉骨をｌＯ％ＥＤＴＡ
（ｐＨ７，２）　ｌｏｏＯｍｌに懸濁し、この懸濁液を
透析チューブＶＴ８０１（平井化学薬品■製）に入れ、
４℃で７日間前記ｌＯ％ＥＤＴＡ３０ｐ中に透析した。

透析内液を集め不溶性物質を遠心分Ｍ　（１００００ｇ
　ｘ３０分）により除去し上澄を集め、それにアセトン
を最終濃度５０％になるまで加えて、該液から遠心分離
（１００００ｇＸ３０分）により巨大蛋白分子を除去し
、さらにその上澄（アセトン５０％含有溶液）に、その
最終濃度が７５％になるまでアセトンを加えて低分子蛋
白質を沈殿させた。４℃の条件下１晩放置後低分子蛋白
質を遠沈（１００００ｇ　Ｘ　３０分）して粗蛋白質を
集めた。

（合成ポリマーゲル濾過剤による濾過）前記工程でえた
粗蛋白質２２０ｍｇを５１の４ＭＧｎｄ　・ＨＣｌ−２
０ｍＭ　ＴｒＩｓ　ＩＬＨＣＩ　（ｐＨ７，５）混合溶
液に溶解し、１８時間４℃で放置した。不溶性蛋白質を
遠心除去したのち、この蛋白質溶液を前記４Ｍ　Ｇｎｄ
　　　ＨＣｌ−２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ混合溶液で
平衡化した合成ポリマーゲル濾過剤（トーソーＨＷ−５
０Ｆカラム、２、Ｂ（内径）ｘｌｏｏ（カラム長）備に
添加し、４℃で、流速１ｍ１／分で溶出分画（５１／フ
ラクシヨン）した。２８０ｎｍにおける各画分の光学濃
度を分光光度法で読み取った。

また溶出した蛋白質各両分の生理活性を知るために、各
両分を透析チューブ（透析チューブＶＴ３５１）に入れ
、それぞれ１ｇの水に対して４℃で２日間透析し、透析
内液を凍結乾燥した。えられた蛋白質を２　ｍｌの蒸留
水で溶解したのち、ニワトリ骨芽細胞を培養した培地へ
添加し、培地内の３１１−チミジンのニワトリ骨芽細胞
への取り込み量を測定し、この取り込み量を生理食塩水
添加のコントロールにおける　３Ｈ−チミジンの取り込
み量と比較して、３１■−チミジンの取り込み量の増加
率を求めた（バイオケミストリー（Ｂｌｏｃｈｅｍｌｓ
ｔｒｙ）　２１巻、３５０２〜３５０７頁（１９８２）
参照）。

えられた結果を第１図に示す。第１図から明らかなよう
に最大活性成分を有する両分はフラクション番号４８〜
６２の両分であり、精製の対象とした。このピークの活
性成分の相対平均分子量はその溶出位置から、前記と同
一の条件下で前記カラムに添加し−で、溶出させた分子
量既知のマーカ蛋白質（ビー・ニス・ニー（ｆｆｉ量平
均分子量Ｈｋｄａｌ）　、オブアルブミン（重量平均分
子量４１ｋｄａｌ）　、α−キモトリプシノーゲンＡ（
重量平均分子量２５ｋｄａｌ）　、シトクロームＣ（ｆ
ｆｉｆｆｉ平均分子量１２ｋｄａｌ）およびブタインシ
ニリン（重量平均分子量６　ｋｄａｌ）の溶出位置に基
づいて１００００〜４０００ｄａｌと算出された。

（天然ゲル濾過剤による濾過） 前記工程でえられた活性成分を有する両分２５■（フラ
クション番号４８〜６２）を透析チューブ（透析チュー
ブＶＴ８０１　）　に入れ、ｌｏｇの水に対して４℃で
３日間透析し、透析内液を凍結乾燥したのち、５　ｍｌ
の４ＭＧｎｄ　　　ＨＣＺ−２０ｓ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−１
（Ｃｆ（ｐＨ７，５）混合溶液に溶解し、前記４ＭＧｎ
ｄ　　　ＨＣＺ−２０ｇＭ　Ｔｒｌｓ−ＨＣＺ（ｐＨ７
，５）混合溶液で平衡化した天然ゲル濾過剤（セファデ
ックスＧ−７５スーパーフアインカラム、（２，８（内
径）Ｘ１００（カラム長）備）に添加し、４℃で流速０
．２ｍｌ／分で溶出分画（５Ｉｌｌ／フラクシヨン）し
た。前記（合成ポリマーゲル濾過剤による濾過）の工程
と同様にして光学濃度を測定し、また生理活性の指標と
して骨芽細胞の３Ｈ−チミジンの取り込み量の増加率を
求めた。えられた結果を第２図に示す。第２図から明ら
かなように蛋白質はフラクション番号５７（相対平均分
子量８０００ｄａｌの位置）画分を最大ピークとして溶
出するが、生理活性を存する画分はフラクション番号３
０〜４２に溶出した。生理活性を有する画分（活性成分
）の相対平均分子量はその溶出位置から、前記と同一条
件下で前記カラムに添加して、溶出させた分子量既知の
マーカー蛋白質（ビーニスニー（重量平均分子量８８ｋ
ｄａｌ）　、オブアルブミン（重量平均分子ｆｆ１４３
ｋｄａｌ）　、α−キモトリプシノーゲンＡ（重量平均
分子量２５ｋｄａｌ）およびシトクロームＣ（重量平均
分子量１２ｋｄａｌの溶出位置に基づき２５０００〜１
５０００ｄａｌと算出された。

このようにＯＦＦの活性成分がトーソーＨＶ−５０Ｆカ
ラムでは相対平均分子量１ｏｏｏｏ〜４０００ｄａｌに
溶出し、セファデックスＧ７５スーパーフアインカラム
（２，８（内径）Ｘ１００（カラム長）　ｃｍ）では相
対平均分子量２５０００〜１５０００ｄａｌに溶出する
のは、ＯＰＰがトーソーＨＶ−５０Ｆカラムでは特異的
に相互作用し遅れて溶出するが、セファデックス０７５
スーパーフアインカラムではそのような相互作用をしな
いためである。したがって、ＯＦＦの活性成分はゲル濾
過法による相対平均分子量として２５０００〜１５００
０ｄａｌを有すると判断される。さらにこの２つのカラ
ムの組合せによる精製はＯＰＰの性質を利用した簡便で
収率のよいものである。

（ファルマシアモノＱカラムによるイオン交換クロマト
グラフィー） 前記工程でえられたＯＰＰ　３　ａ＋ｇ　（上記フラク
ション番号３０〜４２）を透析チューブＶＴ３５１に入
れ、１０ｇの水に対して４℃で３日間透析し、さらに凍
結乾燥したのち、５１Ｍ　ＮＨ４ＨＣＯ３−０，０２５
％ＣＨ八ＰＳ　（へｐｔ（１１，３）混合溶液２ｍｌに
溶解し、前記５１０Ｍ　ＮＨ４）＋ｃＯ３−０，０２５
％ＣＨＡＰＳ混合溶液で平衡化したファルマシアモノＱ
カラム（０，５（内径）×５（カラム長）　ｃｍ）に添
加１し高速液体クロマトグラフィ　（ファルマシア社製
液体クロマトグラフ装置）による制御下に１０分間同じ
混合溶液を流した。つぎに０．０２５％ＣＨＡＰＳ（ｐ
Ｈ８，３）の存在下で５００ｍＮ　ＮＨ４）Ｉ　ＣＯｓ
の濃度が直線的勾配（Ｌｌｎｅａｒｇｒａｄｉｅｎｔ）
を示すようにして１時間にわたり溶出し、ついで５００
ＩＩＩＭ　ＮＨａＨＣＯ３−０，０２５％ＣＨＡＰＳ混
合溶液を２０分間流し、前記（合成ポリマーゲル濾過剤
による濾過）の工程と同様にして光学濃度を測定し、ま
た生理活性の指標として骨芽細胞の３Ｈ−チミジンの取
り込み量の増加率を求めた。えられた結果を第３図に示
す。なお流速１ｍｌ／分で溶出分画（２ｍｌ／ｌ／クラ
ジン）した。

生理活性はフラクション番号１４〜２０に溶出した。

（０１８ヌクレオシルカラムによる逆層高速液体クロマ
トグラフィー） 前記工程でえられた活性成分を有する両分（フラクショ
ン番号１４〜２０）を凍結乾燥し、その３０ｇｇを６％
アセトニトリル−〇、１％ＴＦＡ混合溶液の２ｍｌに溶
解したのち、前記６％アセトニトリル−〇、１％ＴＦＡ
混合溶液で平衡化したＣＩ８ヌクレオシルカラム（３０
０Å、７μｍ、０．４６×２５ｃｍ）に２０℃で添加し
た。高速液体クロマトグラフィー（日立高速液体クロマ
トグラフ８５５Ａ）の制御下に１０分間同じ混合溶液を
流したのち、０．１％ＴＦＡの存在下２０℃で８０％ア
セトニトリルの濃度が直線的勾配（Ｌｉｎｅａｒ　ｇｒ
ａｄｉｅｎｔ　）を示すようにして２時間にわたり溶出
し、前記（合成ポリマーゲル濾過剤による濾過）の工程
と同様にして光学濃度を測定し、また生理活性の指標と
して骨芽細胞の３Ｈ−チミジンの取り込み量の増加率を
求めた。えられた結果を第４図に示す。なお流速は１　
ｍｌ／分で溶出分画（２ｍｌ　／フラクション）した。

第４図から明らかなように最大生理活性は保持時間７４
．４８分（アセトニトリル濃度：３５％）にみられた。

この活性ピークを含有するフラクション番号３８の画分
を次に等電点電気泳動およびさらなる精製に供した。

（等電点電気泳動） 前記工程でえられたＯＰＦを用いてオー・ファーレル（
０°Ｐａｒｒｅｌｌ　ｓザ・ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリＣＪ、Ｂ１ｏ１．Ｃｈｅｔａ　５
２５０巻、４００７頁（１９７５））の方法に順じて行
った。

チューブ（０，５（内径）ＸＩＧ（チューブ長）ｃｍ）
２本を用い、−本にはｏｐｐ　ｉｏμｇを添加して、他
の一本は無添加で泳動させた。泳動後ＯＦＦ添加ゲルと
ＯＦＦ無添加ゲルをただちに０．５叩間隔で切断し、各
ＯＰＦ添加ゲルを０．０２５％ＣＨＡＰＳ−１０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ　　ＨＣＩ　（ｐＨ７，４）混合溶液０．５ｍ
ｌで３時間抽出し前記（合成ポリマーゲル濾過剤による
濾過）の工程と同様にして、抽出液をニワトリ骨芽細胞
を培養した培地に最終添加濃度２０ｎｇ／ｍｌになるよ
うに添加し培地内の３Ｈ−チミジンのニワトリ骨芽細胞
への取り込み量を指標１：ＯＰＰの生理活性をアッセイ
し生理活性を測定した。また各ＯＰＦ無添加ゲルを水０
．５ｍｌにつけ３時間抽出後ｐＨを測定して等電点を決
定した。

生理活性は無添加チューブのｐＨ５，３±０．７に検出
された。

（０１８パイダツクカラムによる逆層高速液体クロマト
グラフィー） 前記工程（０１８ヌクレオシルカラムよる逆層高速液体
クロマトグラフィー）でえられたＯＦＦ　（保持時間：
　７４．４８分）を含有するフラクション番号３８の両
分を凍結乾燥したのち、前記工程と同じ条件下ＣＩ８パ
イダックカラム（３００Å、５ρ、０．４８ｘ　２５ｃ
ｏ＋）に２０℃で添加し、ＨＰＬＣ（日立高速液体クロ
マトグラフ８５５Ａ）の制御下に前記６％アセトニトリ
ル−０，１％ＴＦＡ混合溶液を流したのち０．１％ＴＦ
Ａの存在下２０℃で６０％アセトニトリルの濃度が直線
的勾配（Ｌｌｎｅａｒ　ｇｒａｄｌｅｎｔ）を示すよう
にして３時間にわたり溶出した。えられた結果を第５図
に示す。以下の条件はすべて前記工程（Ｃ＋ｓヌクレオ
シルカラムによる逆相高速液体クロマトグラフィーと同
じである。生理活性を前記（合成ポリマーゲル濾過剤に
よる濾過）の工程と同様にして測定したところ活性成分
のピークは保持時間１１２．７２分（アセトニトリル濃
度２８．８±３．０％）と一致した。さらに純度を高め
るために同一条件でこの工程と同様の操作をくり返し１
１２．０３分（アセトニトリル濃度２８，８±３．０％
、フラクション番号５７）のＯＰＰを完全精製し同様に
溶出した。その結果を第６図に示す。

ＳＤＳ電気泳動法（ファルマシア社製、ファーストシス
テム（Ｐａｓｔ　５ｙｓｔｅａ＋）グラジェントゲル８
〜２５％アクリルアミド）により、えられたフラクショ
ン番号５７の画分のＯＰＦの相対平均分子量を測定した
。

測定は、マーカー蛋白質およびＯＰＦを５０μｇ／　ｍ
ｌ蛋白質濃度の５％２−メルカプトエタノール、２％Ｓ
ＤＳおよび５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，４
）溶液とし、３７℃で２時間該溶液をインキエベートし
た。

ついで、該溶液の蛋白質５０ｎｇに対応する量をアクリ
ルアミドゲルＳＤＳ電気泳動に供した。マーカー蛋白質
としてはファルマシア社製マーカー蛋白質（ホスホリラ
ーゼｂ（９４ｋｄａｌ）　、アルブミン（６７ｋｄａｌ
）、オブアルブミン（４３ｋｄａｌ）、カーボニックア
ンヒドラーゼ（３０ｋｄａｌ）、トリプシンインヒビタ
ー（２０ｋｄａｌ）およびα−ラクトアルブミン（１４
ｋｄａｌ）を用いた。なお、染色には銀染色法を用いた
。えられた結果を、ＳＤＳ電気泳動パターンを示す第１
Ｏ図を用いて示す。なお、第１Ｏ図中、Ａはマーカー蛋
白質の添加点、ＢはＯＦＦの添加点を示し、また１、２
．３．４．５．６および７はそれぞれホスホリラーゼ、
アルブミン、オブアルブミン、カーボニックアンヒドラ
ーゼ、トリプシンインヒビター　α−ラクトアルブミン
およびＯＰＦのアクリルアミドゲル中の像を示す。第１
０図より本工程でえられたｏＰＦは本ＳＤＳ電気泳動法
により分子量１５．４ｋｄａｌの単一バンドを有するこ
とがわかる。

また、フラクション番号５７の両分を熱処理および還元
処理に供した結果を以下に示す。

（熱処理） ＯＦＦ　１μｇを０．２ｍｌの生理食塩水に溶解し、そ
の０．１ｍｌを１００℃沸騰水浴上で５分間処理したの
ち、ただちに氷水中に入れ室温まで冷却した。ついで該
溶液と残り０．１ｍｌの溶液とをそれぞれＯＰＦ培地中
の最終濃度が２０ｎｇ／ｍｌになるように０．１％ＢＳ
Ａ溶液で調製してニワトリ骨芽細胞を培養した培地に添
加し培地内の３Ｈ−チミジンのニワトリ骨芽細胞への取
り込み量を前記（合成ポリマーゲル濾過剤による濾過）
の工程と同様にしてＯＦＦの生理活性をアッセイした。

無処理のＯＰＦの生理活性を１００とすると、熱処理済
のＯＰＦの生理活性は９８であった。

（ＤＴＴによる還元処理） ＯＰＰ２００ｎｇを０．２ｍｌの０．１Ｍ燐酸緩衝液（
ｐＨ７，５）−２ＨＭ　ＤＴＴ混合溶液に溶解し４℃で
６時間静置して還元処理した。該溶液と同量のＯＰＦの
０．１Ｍ燐酸緩衝液（ｐｉ（７，５）溶液とをそれぞれ
ニワトリ骨芽細胞を培養した培地に添加し培地内の３ｏ
−チミジンのニワトリ骨芽細胞への取り込み量を前記（
合成ポリマーゲル濾過剤による濾過）の工程と同様にし
てＯＰＦの生理活性をアッセイした。無処理のＯＰＦの
生理活性を１００とすると、還元処理されたＯＦＦの生
理活性は９Ｂであった。

前記（Ｃ１８バイダックカラムによる逆層高速液体クロ
マトグラフィー）の工程によってえられたＯＰＰ　　（
フラクション番号５７の両分）を用いて以下の試験を行
なった。

試験例１ （ＯＦＦの生理作用） ＯＦＦの骨芽細胞の３Ｈ−チミジンの取り込みに対する
用量作用反応を実施した。受精１４日口のニワトリ胎児
の頭ガイ骨より骨芽細胞を採取しファーレイおよびペイ
リンク（Ｆａｒｌｅｙ　ａｎｄＢａｙｌｉｎｋ　）、（
バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、
２１巻、３５０２〜３５０７頁（１９８２）参照）、フ
ァルコン（Ｆａｌｃｏｎ）社製９Ｂ穴マルチプレートに
５．７Ｘ　ｔｏ’　ｃｅｌｌｓ／ｍｌの骨芽細胞液０．
２５ａ＋１を添加し、２４時間培養した。つぎに精製Ｏ
ＰＦを第７図に示す濃度での用量添加し、さらに１８時
間培養した。１６時間後に　３Ｈ−チミジン１μＣＩ／
ｖｅｉｌ添加しさらに２時間インキュベートして、骨芽
細胞内への３Ｈ−チミジンの取り込み量を液体シンチレ
ーションカウンターにて計測した（遠藤浩良および山根
績著；　「組織培養応用研究法」、ソフトサイエンス社
発行参照）。

えられた結果を第７図に示す。なお、第７図においては
３Ｈ−チミジンの取り込み量は生理食塩水添加のコント
ロールの３トチミジンの取り込み量を１００％として表
示する。第７図より明らかなように、ＯＰＦはｌＯｐｇ
／ｍｌ添加から１１００ｐ／ｍｌまで用量依存的（Ｄｏ
ｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）に３Ｈ−チミジンの取り込
みを促進した。最大反応を示す生理活性は１１００ｐ／
ｍｌでみられた。

つぎにＯＰＦのクローン化されたマウス骨芽細胞ＭＣ−
３Ｔ３１．＋　　（遠藤浩良および山根績著、「組織培
養応用研究法、ソフトサイエンス社発行参照）における
アルカリホスファターゼ活性促進作用およびコラーゲン
合成促進作用を測定した。

アルカリホスファターゼ活性の測定はキットアルカリ性
ホスファターゼ試薬Ｓ（ヤトロン社製）にて培養上清中
のアルカリホスファターゼ活性を測定した（クメガワ・
エム（Ｋｕｓｅｇａｖａ、Ｍ）著、Ｃａ１ｃｌｆ、Ｔｌ
５ｓｕｅ　Ｉｎｔ、、３ｏ巻、７２頁（１９８３）参照
）。

また、コラーゲン合成の測定は〔３Ｈ〕−ヒドロキシプ
ロリンの蛋白質内への取り込み量を液体シンチレーショ
ンカウンターで測定した（ヒバマツ・エム（Ｈ１ｖａｍ
ａｔｓｕ’Ｍ）著、ザ。ジャーナルΦオブ・バイオケミ
ストリー・（トーキヨウ）（Ｊ　、Ｂｌｏｃｈｅｓ、Ｔ
ｏｋｙｏ）、９５巻、１３５３頁（１９８３）参照）。

各結果をそれぞれ第８図および第９図に示す。第８図お
よび第９図より明らかなように用量作用曲線（Ｄｏｓｅ
−ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｃｕｒｖｅ）は３Ｈ−チミジンの
取り込みでみられたもの（第７図）とよく相関していた
。したがって本発明のＯＰＦはＭＣ３Ｔ３−Ｅ　、細胞
のＤＮＡ合成を促進するとともにコラーゲン合成、アル
カリホスファターゼ活性を促進させる作用を有すること
がわかる。

［発明の効果］ 本発明は、骨芽細胞の増殖を促進して骨形成を増長せし
め、骨粗髭症、難治性骨折などの治療ならびにそれらの
病気の診断測定用試薬および骨芽細胞増殖因子のための
抗体を製造するにおいて、または骨代謝研究において有
用な骨芽細胞増殖因子を提供しうる。

【図面の簡単な説明】

第１図は合成ポリマーゲル濾過剤による濾過からの溶離
液両分の光学濃度および生理活性を示すグラフであり、
第２図は天然ゲル濾過剤による濾過からの溶離液両分の
光学濃度および生理活性を示すグラフであり、第３図は
ファルマシアモノＱカラムによるイオン交換クロマトグ
ラフィーからの溶離液両分の光学濃度および生理活性を
示すグラフであり、第４図はＣ＋６ヌクレオシルカラム
による逆層高速液体クロマトグラフィーからの溶離液画
分の光学濃度および生理活性を示すグラフであり、第５
図および第６図はＣ＋６パイダツクカラムによる逆層高
速液体クロマトグラフィーからの溶離液両分の光学濃度
を示すグラフであり、第７図はＯＦＦ濃度とニワトリ骨
芽細胞の３Ｈ−チミジンの取り込み量との関係を示すグ
ラフであり、第８図はＯＰＦ濃度とＫｉｎｄ　Ａｒｍｓ
ｔｒｏｎｇ単位（ＭＣ−３Ｔ３Ｅ＋細胞のアルカリホス
ファターゼ活性）との関係を示すグラフであり、第９図
はＯＰＦ濃度と〔３Ｈ〕−ヒドロキシプロリンの取り込
み量（ＭＣ−３７３Ｂ＋細胞のコラーゲン合成）との関
係を示すグラフであり、第１０図はＯＰＦの分子量の測
定結果を示すＳＤＳ電気泳動パターンを示すものである
。 （図面の主要符号） （７）　；　０ＰＦ（骨芽細胞増殖因子）第１　図 第２図 一：光学濃度 一：増加率（生理活性） 一°光学濃度 一一二増加率（生理活性） フラクション番号 フラクション番号 才３園 時 間　（分ン 加 （イ） 光学濃度（Ａ２８ｏｎｍ） 光学濃度（Ａ　２８０ｎｍ　’） ３Ｈ−デミジンの取り込み量のｍｕ（％）光学濃度（Ａ
２８０ｎｍ） ０．０１ ０．１ ＦＦ 濃 度 （ｎｇ／ｍ＃） ′：）Ｖ８図 ０．００＋　　０．０１ ０ＰＦ濃 ０．１ 度 Ｃｒ＠／ｍ１　） ＯＰＦ＠ 度 （ｎｇ７ｍり

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　ヒトまたは哺乳動物の骨から精製されたものであっ
   て、 （１）等電点がｐＨ４〜６であり、 （２）合成ポリマーゲル濾過剤による濾過で相対平均分
   子量１００００〜４０００ｄａｌの位置に溶出するもの
   であり、 （３）天然ゲル濾過剤による濾過で相対平均分子量２５
   ０００〜１５０００ｄａｌの位置に溶出するものであり
   、 （４）１００℃で５分間の熱処理に安定であり、かつ （５）ジチオトレイトールによる還元処理に安定である 活性成分を含有することを特徴とする骨芽細胞増殖因子
   。 ２　Ｃ＿１＿８ヌクレオシルカラム（３００Å、７μｍ
   、０．４６×２５ｃｍ）を用いて行なう逆層高速液体ク
   ロマトグラフィーでＣ＿１＿８ヌクレオシルカラムに結
   合し、３５±２％アセトニトリル−０．１％トリフルオ
   ロ酢酸混合溶液で溶出するものである請求項１記載の骨
   芽細胞増殖因子。 ３　Ｃ＿１＿８バイダックカラム（３００Å、５μｍ、
   ０．４６×２５ｃｍ）を用いて行なう逆層高速液体クロ
   マトグラフィーでＣ＿１＿８バイダックカラムに結合し
   、２８．８±３％アセトニトリル−０．１％トリフルオ
   ロ酢酸混合溶液で溶出するものである請求項１または２
   記載の骨芽細胞増殖因子。