KR20210056379A - 살바이러스 나노입자 및 인플루엔자 바이러스에 대한 이의 용도 - Google Patents

살바이러스 나노입자 및 인플루엔자 바이러스에 대한 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 트리사카라이드 모이어티를 포함하는 살바이러스 나노입자 및 인플루엔자 바이러스에 대한 이의 용도에 관한 것이다.

Description

살바이러스 나노입자 및 인플루엔자 바이러스에 대한 이의 용도
본 발명은 트리사카라이드 모이어티를 포함하는 살바이러스 나노입자 및 인플루엔자 바이러스에 대한 이의 용도에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스는 가장 전염성이 강한 바이러스 중 하나이다. 매년 다양한 인플루엔자 균주가 동물 개체군 및 인간 인구의 많은 부분을 감염시켜, 인플루엔자-관련 합병증으로 인한 입원 및 사망 위험이 있는 영아, 노인 및 면역력이 약화된 사람들을 위험에 빠뜨린다. 그 결과, 계절성 인플루엔자는 사회-경제에 큰 영향을 미친다. 실제로, 호흡기 질환은 선진국과 주요 개발도상국에서 총 보건의료비의 상당 부분을 차지할 수 있다. 인플루엔자는 매우 빠르게 변이되기 때문에, 백신의 개발은 여전히 중요한 도전이다. 매년 발생하는 것이 아니라 간간이 발생하는 유행병에 초점을 맞출 때 백신 개발은 더 큰 도전을 제기할 것이다. 이러한 경우, 평균 6개월인, 새로운 백신의 개발 시간은 심각한 위험에 해당한다. 또한, 백신이 존재하더라도, 합리적인 예방접종 적용범위에 도달하는 것은 필연적인 결론과 거리가 멀다. 따라서, 스페인 독감과 같은, 새로운 유행병의 위험은 여전히 존재하며 세계 보건에 대한 가장 큰 위협 중 하나로서 인식되고 있다.
자연히, 백신에 이은 두 번째 방어선은 항바이러스성 약물이다. 많은 항-인플루엔자 약물이 현재 승인되어 있다: 뉴라미니다아제 억제제 예컨대 자나미비르 및 오셀타미비르, 이온 채널 억제제 예컨대 아만타딘, 융합 억제제 예컨대 우미페노비르(러시아 및 중국에서만) 및 폴리머라아제 억제제 예컨대 최근 미국 및 일본에서 승인된 발록사비르 마르복실. 그러나, 현재 약물의 효능은 이상과 거리가 멀다는 것이 인식되어 있다. 이들 약물에 대한 우려는 심각한 부작용부터 단기간 사용 후 약물-내성 바이러스의 출현까지 다양하다. 이 문제의 중요성을 감안할 때, 많은 다른 약물이 임상 시험 중에 있다. 이들 약물의 대부분은 바이러스가 숙주 세포로 융합하는 것을 억제하는 단일클론성 항체이다. 이들은 유망하지만, 이들의 제조 공정으로 인해 많은 비용이 발생할 가능성이 있다.
바이러스의 보존된 부분을 표적으로 하는 분자의 개발에 대한 연구 라인이 꽤 많이 있다. 추가로, 제한된 독성을 갖는 살바이러스(즉, 비가역적) 약물을 찾는 것은 매우 어렵다. 최근, 개구리 피부에서 단리된 펩타이드가 이러한 특성을 갖는 것으로 발견되었으나, 이들의 EC50은 마이크로몰에 불과하고 이들의 독성은 논쟁의 여지가 있다.
숙주 세포에서 바이러스의 혈구응집소(HA) 및 시알산(SA)-함유 당단백질 사이의 상호작용은 인플루엔자 감염의 주요 단계이다. SA 및 HA 사이의 결합 친화도는 낮고 다가 결합에 의해 보상된다. 이 자연 현상에 영감을 받아, 중합체, 덴드리머 및 나노입자와 같은 SA 코팅된 다가 물질을 사용하여 인플루엔자 바이러스를 억제하려는 여러 시도가 있었다.
Reuter 등은 선형 중합체, 콤(comb)-분지형 중합체 및 덴드론과 같은 다양한 구조의 시알산 장식된 중합성 물질을 합성하였고; 인플루엔자 A 바이러스의 상이한 균주에 대해 이들을 시험하였다. 고분자량(>100 kDa) 분지형 구조만이 마이크로몰 농도의 시알산에서, 인플루엔자 바이러스 중 하나의 균주, X-31을 억제하는 것으로 밝혀졌다. Papp 등은 인플루엔자 바이러스 X-31 균주에 대한 시알산 기능화된 금 나노입자(NP)의 억제 활성을 시험하였으며 14㎚ 코어 직경의 NP가 2㎚ NP보다 더 우수한 억제 활성을 가짐을 보고하였다. 그러나, 이 연구에서 그들은 바이러스를 억제하는 NP 농도를 언급하지는 않았다. 동일 군은 또한 상이한 크기의 시알산 장식된 글리코구조를 합성하였고 밀리몰 농도로 X-31 균주를 억제하였다.
인간 인플루엔자 바이러스는 당단백질 상의 α2,6-연결된 SA에 우선적으로 결합하는 것으로 알려져 있다. 더욱 최근에는, α2,6-시알릴락토오스를 함유한 다가 물질이 낮은 마이크로몰 농도로 인플루엔자 바이러스를 억제하는 것이 입증되었다. Tang 등은 마이크로몰 농도의 시알산 단위로 인플루엔자 A PR8 균주를 억제한 α2,6-시알릴락토오스를 함유한 브러시 중합체를 합성하였다. Kwon 등은 α2,6-시알릴락토오스로 PAMAM 덴드리머를 장식하였고 인플루엔자 A PR8, CAL 09 및 NWS 33과 같은 몇몇 인플루엔자 균주를 억제하였다.
시험관내 인플루엔자 바이러스를 억제하는 마이크로몰 물질 농도는 여전히 너무 높고 생체내 농도는 훨씬 더 높을 것이다. 또한, 대부분의 진입 억제제는 바이러스 억제성이고; 바이러스는 시험관내에서 바이러스-물질 복합체를 희석하면 다시 전염성이 된다.
광범위의 효과적인 백신이 없는 상황에서, 인플루엔자에 대한 약물에 대해 충족되지 않은 필요성이 존재한다. 이상적인 항-인플루엔자 약물은 스펙트럼이 폭넓고, 바이러스의 고도로 보존된 부분을 표적으로 하며, 비가역적 효과를 갖는 것, 즉 (체액의 희석으로 인한 효능의 손실을 방지하기 위해) 낮은 농도에서 살바이러스(virucidal)여야 하고, 분명히 무독성이어야 한다.
이 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 HA와 강하게 상호작용하고, 낮은 농도로 인플루엔자 바이러스의 감염성을 비가역적으로 억제하고, 매우 낮은 독성을 나타내는 나노입자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예는 코어 및 상기 코어에 공유적으로 연결된 다수의 리간드를 포함하는 살바이러스 나노입자를 제공하고, 여기서 상기 리간드의 적어도 일부는 트리사카라이드 모이어티를 포함하고 여기서:
- 상기 코어는 시클로덱스트린이고,
- 상기 리간드는 동일하거나 상이하고 선택적으로 치환된 알킬계 리간드이고, 및
- 각각의 트리사카라이드 모이어티는 3-시알릴-N-아세틸락토오스아민(3'SLN) 및 6-시알릴-N-아세틸락토오스아민(6'SLN)으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 구현예는 식 (I)로 표시되는 살바이러스 나노입자를 제공한다:
Figure pct00001
여기서
m은 2~8이고, 및
n은 2~28 또는 4~13이다.
본 발명의 또 다른 구현예는 식 (II)로 표시되는 살바이러스 나노입자 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
Figure pct00002
여기서:
각각의 R은, 독립적으로, 선택적으로 치환된 알킬계 리간드이고, 여기서 상기 리간드 중 적어도 2개는 3-시알릴-N-아세틸락토오스아민(3'SLN) 및 6-시알릴-N-아세틸락토오스아민(6'SLN)을 포함하는 군으로부터 선택되는 트리사카라이드 모이어티를 가지거나, 또는 상기 리간드 중 적어도 하나는 3'SLN을 가지고 다른 하나는 6'SLN을 가지고;
각각의 R'은, 독립적으로, H, -(CH2)y-COOH, -(CH2)y-SO3 -, 중합체 또는 수용화 모이어티이고;
x는 6, 7 또는 8이고; 및
y는 4~20의 정수이다.
본 발명의 추가의 구현예는 유효량의 하나 이상의 본 발명의 살바이러스 나노입자 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 추가의 구현예는 인플루엔자 바이러스 감염 및/또는 인플루엔자 바이러스와 관련된 질환을 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 본 발명의 살바이러스 나노입자를 제공한다.
본 발명의 추가의 구현예는 유효량의 하나 이상의 본 발명의 살바이러스 나노입자 및 선택적으로 적어도 하나의 적합한 에어로졸 담체를 포함하는 살바이러스 조성물을 제공한다.
본 발명의 추가의 구현예는 본 발명의 살바이러스 조성물, 또는 본 발명의 살바이러스 나노입자를 사용하는 것을 포함하는 소독 및/또는 살균 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 구현예는 본 발명의 살바이러스 조성물, 또는 하나 이상의 본 발명의 살바이러스 나노입자 및 상기 살바이러스 조성물 또는 살바이러스 나노입자를 적용(applying) 또는 분배(dispensing)하기 위한 수단을 포함하는 장치를 제공한다.
본 발명의 추가의 구현예는 살균을 위한 및/또는 소독을 위한 본 발명의 살바이러스 나노입자 또는 본 발명의 살바이러스 조성물의 용도를 제공한다.
도 1은 리간드 조성이 상이한 NP의 화학 구조를 보여준다. 평균 NP 직경: 2.9±0.9 ㎚.
도 2는 H3N2 바이러스 Vic/11 균주의 TEM 이미지를 보여준다: NP 없음 (A), LD 6'SLN NP (B) 및 PEG(5) NP (C)와 함께 1시간 인큐베이션한 후의 바이러스.
도 3은 C15-6'SLN 변형된 β-CD의 화학 구조 (a), 상이한 인플루엔자 균주에 대한 변형된 CD의 EC50 농도 (b), Neth/09 균주에 대한 살바이러스 활성 (c), 머실에어(MucilAir)에서의 생체외 실험 (d), HA 구형 헤드와 상호작용하는 변형된 CD의 도해 (e)를 보여준다.
도 4는 예시적인 변형된 시클로덱스트린을 보여준다. β-CD 당 6'SLN 또는 3'SLN의 수는 1H NMR에 의해 계산된 평균의 수이다. 변형된 시클로덱스트린의 대표적인 화학 구조는 NMR 결과를 기초로 구축되었다. EC50은 A/Netherlands/2009 (H1N1)에 대한 24 hpi에서의 MDCK 세포의 절반-억제 농도를 나타낸다(도 7). N/A: 평가할 수 없음. 이들 3D 구조에서 참조가 용이하도록, 후방의 시클로덱스트린 당, 리간드 및 트리사카라이드 중 일부는 도시되지 않는다.
도 5는 도 4에 도시된 변형된 시클로덱스트린을 특징짓기 위해 1H NMR 연구를 수행한 것을 보여준다. β-시클로덱스트린 당 6'SLN 또는 3'SLN의 평균의 수는 트리사카라이드의 고유한 피크(◆)를 β-시클로덱스트린의 고유한 피크(●)와 비교함으로써 계산되었다. 두 피크 모두 단일 수소에 해당한다.
도 6은 A/Netherlands/2009 H1N1에 대한 C6-6' (A), C14-6' (B), C11-3' (C) 및 C1-6' (D)의 항바이러스성 활성을 입증하는 용량-반응 곡선을 보여준다. 상기 결과는 중복으로 수행된 2개의 독립적인 실험의 평균이다.
도 7은 B/Wisconsin/2010 (A), A/Clinical/2018 H1N1 (B), A/Singapore/2004 H3N2 (C) 및 B/Clinical/2018 (D)에 대한 C11-6'의 항바이러스성 활성을 입증하는 용량-반응 곡선을 보여준다. 상기 결과는 중복으로 수행된 2개의 독립적인 실험의 평균이다.
도 8은 (C11-6' 대조군과 함께) 조류 균주 A/turkey/Turkey/2005 H5N1에 대한 C11-3'의 항바이러스성 활성을 입증하는 용량-반응 곡선 (A) 및 조류 균주 A/Turkey/Italy/977/1999 H7N1에 대한 C11-3'의 항바이러스성 활성을 입증하는 용량-반응 곡선 (B)을 보여준다. 그래프 A의 경우, FACS 및 ICC 방법으로 감염을 정량화하였다. 상기 결과는 중복으로 수행된 2개의 독립적인 실험의 평균이다.
도 9는 시험관내 C11-6' 및 P8-6'의 항바이러스성 활성 비교를 보여준다. 패널 (a) 및 (b)는 왼쪽 그래프에서, 세포 생존율 분석의 결과와 겹쳐서, A/NL/09에 대한 각 화합물의 억제 활성을 보여준다. 모든 화합물은 매우 유사한 거동을 나타낸다. 이들 패널의 오른쪽 그래프에는 살바이러스(즉, 희석) 시험의 결과가 나타나있다. 도면의 축에서 ffu는 초점 형성 단위를 나타내고 NT는 미처리를 나타냄에 유의한다. (c)에서 C11-6'은 다음의 바이러스 균주에 대해 시험되었다: A/Singapore/2004 (H3N2), B/Wisconsin/2010, 및 A/Clinical/2018 (H1N1). 상기 결과는 중복으로 수행된 2개의 독립적인 실험의 평균 및 SEM이다.
도 10은 A/Netherhands/2009 (H1N1)에 대한 C14-6' (A), C6-6' (B) 및 C11-3' (C)의 살바이러스 활성을 보여준다. 실험은 100 ㎍/㎖의 화합물 농도로 수행되었다. 상기 결과는 2개의 독립적인 실험의 평균 및 SEM이다.
도 11은 C11-6' 및 P8-6'의 생체외 억제 활성 비교를 보여준다. C11-6'은 공동-처리 조건에서 임상적 유행성 H1N1 09 균주에 대한 완전한 보호를 제공한 반면, P8-6'은 감염의 초기에 약간의 보호만 제공하였다 (a). 도 11(b)에서 감염-후 7일의 면역형광(공동-처리 조건)은 C11-6'에 의해 제공되는 보호를 확인한다. 빨간색: 단일클론성 항체 인플루엔자 A, 파란색: DAPI, 녹색: β-IV-튜불린 (섬모 세포의 마커). 각 조직의 두께는 해당 이미지의 하단에 나타냈다 (b). C11-6'은 후-처리 조건에서도 높은 효능을 나타냈다 (c). (a) 및 (c)의 결과는 중복으로 수행된 2개 내지 4개의 독립적인 실험의 평균 및 SEM이다. (b)의 이미지는 각 조건에 대해 촬영한 10개의 이미지 중 대표이다.
도 12는 감염된 조직에서의 LDH 방출을 보여준다. 감염시 C11-6'(50 ㎍) 또는 P8-6'으로 조직을 감염 및 처리하였다. 96 및 24 hpi에서 수행된 정점 세척(apical wash)에 대해 LDH 측정을 수행하였다. 상기 결과는 H1N1 및 H1N1 C11-6'에 대한 2개의 독립적인 실험 및 P8-6'에 대해 중복으로 수행된 단일 실험의 평균 및 SEM이다.
도 13은 장기간의 공동-처리 실험을 보여준다. 감염시 C11-6'(50 ㎍)으로 조직을 감염 및 처리하였다. 매일의 바이러스 생성량을 평가하기 위해 전날 세척하고, 처음 5일 동안, 및 이후 9일, 17일 및 23일에, 매일의 정점 세척을 수집하였다. 상기 결과는 중복으로 수행된 단일 실험의 평균이다.
도 14는 생체외 독성을 보여준다. 조직은 상이한 용량의 C11-6' 또는 동일한 부피의 배지 또는 트리톤 5%를 매일 첨가하여 처리되었다. 처리 후 96시간에 조직에 대해 A) MTT 분석, B) 조직의 생존율을 평가한 LDH 분석, C) 트랜스 상피 저항성 평가 및 D) 전-염증성 사이토카인의 방출을 평가하기 위한 ELISA 분석을 수행하였다. LDH 및 ELISA는 수집된 기초 배지에서 수행하였다. 실험은 2개의 독립적인 실험의 평균 및 SEM이다.
도 15는 C11-6'의 생체내 항바이러스성 활성을 보여준다. (a 내지 c) A/NL/09로 감염과 동시에 또는 48시간 후에 PBS 또는 C11-6'로 마우스를 비강 내 처리하였다. 바이러스 양(viral load)은 감염-후 48시간 및 96시간 (a)에 정량화되었고 감염된 마우스의 이환율 (온도 (b) 및 체중 (c)의 손실)을 매일 모니터링하였다. (d 내지 f) 마우스를 감염-후 6시간에 PBS 또는 C11-6'로 3일 동안 매일 (14 ㎍/마우스) 비강 내 처리하였다. 감염된 마우스의 이환율(d-e) 및 생존율(f)을 매일 모니터링하였다. 상기 결과는 평균±SEM으로 표현된다. 화살표는 처리 시간을 나타낸다.
도 16은 β-시클로덱스트린, 6'SLN-β-에틸아민 및 C11-6'의 1H NMR 스펙트럼을 쌓은 것을 보여준다.
도 17은 C11-6'의 DOSY 스펙트럼을 보여주고 이는 생성된 화합물에는 비결합 트리사카라이드가 없음을 입증한다.
도 18은 FACS에 대해 수행된 게이팅 전략을 보여준다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 그 전체로서 참고로서 포함된다. 본 명세서에서 논의된 간행물 및 출원은 본 출원의 출원일 이전의 이들의 개시를 위해서만 제공된다. 본 명세서의 어떠한 것도 본 발명이 선행 발명으로 인해 이러한 간행물보다 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 또한, 재료, 방법, 및 실시예는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도는 아니다.
상충되는 경우, 정의를 포함하는, 본 명세서가 제어할 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 명세서의 주제가 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해 다음의 정의가 제공된다.
용어 "포함하다"는 일반적으로 포함의 의미로, 즉 하나 이상의 특징 또는 구성요소의 존재를 허용하는 의미로 사용된다. 또한, 명세서 및 청구범위에서 사용 된 바와 같이, "포함하는"이라는 언어는 "구성되는" 및/또는 "필수적으로 구성되는"의 측면에서 설명되는 유사한 실시양태를 포함할 수 있다.
명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같이, 본 명세서에서 "A 및/또는 B"와 같은 구절에서 사용된 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A", 및 "B"를 포함하는 것으로 의도된다.
명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나(a)", "하나의(an)" 및 "상기(the)"는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수형의 참조를 포함한다.
명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같이, "적어도 하나의 C 원자"와 같은 구절에서 사용된 용어 "적어도 하나"는 "하나의 C 원자" 또는 "2개의 C 원자" 또는 그 이상의 C 원자를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "바이러스 억제성(virustatic)"은 항바이러스성 조성물과의 상호작용 후 바이러스의 감염성의 가역적 억제를 입증하는 시험관내 시험에 의해 측정된 항바이러스성 효능의 특징을 지칭한다. 상호작용은, 예를 들어, 바이러스에 결합하거나 그렇지 않으면 바이러스의 표면 리간드를 방해함으로써, 감염성을 억제한다. 그러나, 일단 상호작용이 (예를 들어, 희석에 의해) 종결될 때 바이러스의 재구성을 촉진하는 임의의 첨가된 물질 또는 조건의 부재 하에, 바이러스가 감염성을 재개할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "살바이러스"는 항바이러스성 화합물 또는 조성물과의 상호작용 후 바이러스의 감염성의 비가역적 억제를 입증하는 시험관내 시험에 의해 측정된 항바이러스성 효능의 특징을 지칭한다. 상호작용은, 예를 들어, 바이러스에 결합하거나 그렇지 않으면 바이러스의 표면 리간드를 방해함으로써, 감염성을 억제한다. 그러나, 상호작용이 (예를 들어, 희석에 의해) 종료된 후에도 바이러스 재구성을 촉진하는 임의의 첨가된 물질 또는 조건의 부재 하에, 바이러스가 감염성을 재개하는 것은 본질적으로 불가능하다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "생체적합성"은 살아있는 세포, 조직, 기관, 또는 시스템과의 호환성, 및 면역계에 의한 상해, 독성, 또는 거부의 큰 위험이 없는 것을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "나노입자"에서 사용된 바와 같은, "나노"는 나노미터 크기를 갖는 입자와 같은, 나노미터 크기를 지칭하며, 임의의 특정 형상 제한을 전달하려는 의도는 아니다. 특히, "나노입자"는 나노구, 나노튜브, 나노박스, 나노클러스터, 나노로드 등을 포함한다. 특정 실시 양태에서 본 명세서에서 고려되는 나노입자 및/또는 나노입자 코어는 일반적으로 다면체 또는 구체의 기하학을 갖는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "인플루엔자"는 시알산-추구, 공기 중 전파되는 (인간 또는 동물) RNA 바이러스, 예컨대 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 C 바이러스 및 인플루엔자 D 바이러스를 지칭한다. 인플루엔자 A 바이러스는 다음의 혈청형을 포함한다: H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3, H10N7, H7N9, 및 H6N1.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "알킬"은 1~50개의 탄소 원자, 바람직하게 4~30개의 탄소 원자를 함유하는 직쇄 탄화수소 사슬을 지칭한다. 알킬의 대표적인 예는 비제한적으로 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "카르복시알킬"은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 알킬기를 통해 모 분자 모이어티에 부가된 카르복시기를 지칭한다.
α2,6-연결된 시알산이 인간 인플루엔자 바이러스와 상호작용하는 것으로 알려져 있지만, 높은 친화도 결합을 제공하는 정확한 글리칸 서열은 문헌에서 불분명하게 남아있었다. 본 발명자들은 대부분의 인간 인플루엔자 바이러스가 2개 이상, 바람직하게 3개 또는 4개의 트리사카라이드 모이어티, 특히 6-시알릴-N-아세틸락토오스아민(6'SLN) 또는 3-시알릴-N-아세틸락토오스아민(3'SLN)으로 종결되는 글리칸에 높은 친화도로 결합함을 입증하였다.
본 발명의 일 구현예는 코어 및 상기 코어에 공유적으로 연결된 다수의 리간드를 포함하는 살바이러스 나노입자를 제공하고, 여기서 상기 리간드의 적어도 일부는 트리사카라이드 모이어티를 포함하고 여기서
- 코어는 금속 나노입자 또는 유기 물질이고, 여기서 바람직하게 상기 금속 나노입자는 금 나노입자, 산화철 나노입자, 은 나노입자, 백금 나노입자, 코발트 나노입자, 아연 나노입자, 실리카 나노입자, 카드뮴 셀레나이드 나노입자, 금-은 합금 나노입자, 산화 알루미늄 나노입자, 산화 구리 나노입자, 산화 마그네슘 나노입자, 산화 니켈 나노입자, 이산화티탄 나노입자, 산화 아연 나노입자를 포함하는 군으로부터 선택되고, 더 바람직하게는 상기 금속 나노입자는 금 나노입자이고, 여기서 유기 물질은 시클로덱스트린, 중합체, 덴드리머, 및 덴드론을 포함하는 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 상기 유기 물질은 시클로덱스트린이고,
- 리간드는 동일하거나 상이하고 선택적으로 치환된 알킬계 리간드 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)계 리간드이다. 바람직하게는 선택적으로 치환된 알킬계 리간드는 선택적으로 치환된 C4-C30 알킬계 리간드이고, 더 바람직하게는 선택적으로 치환된 알킬계 리간드는 선택적으로 치환된 C4-C30 카르복시 알킬이고; 바람직하게는 PEG계 리간드는 PEG3, PEG4, PEG5, PEG6, PEG7, PEG8을 포함하는 군으로부터 선택되고; 더 바람직하게는 리간드는 폴리에틸렌 글리콜 5(PEG5), 16-머캅토헥사데콘산(C15), 및 11-머캅토운데칸산을 포함하는 군으로부터 유래되고,
- 트리사카라이드 모이어티는 3-시알릴-N-아세틸락토오스아민(3'SLN) 및/또는 6-시알릴-N-아세틸락토오스아민(6'SLN)이다.
본 발명의 맥락에서, 트리사카라이드 모이어티는 임의의 다른 리간드가 트리사카라이드 모이어티와 인플루엔자 바이러스 사이의 상호작용을 방해하지 않게 하는 방식으로 나노입자(NP)의 외부 표면에 공유 결합된 리간드 상에 노출된다.
코어의 평균 직경은 약 1.0 ㎚ 내지 약 200 ㎚, 바람직하게는 1 ㎚ 내지 5 ㎚, 가장 바람직하게는 1.5 ㎚ 내지 3 ㎚의 범위이다. 전체 나노입자 크기는 3 ㎚ 내지 250 ㎚, 또는 3 ㎚ 내지 200 ㎚, 바람직하게는 3 ㎚ 내지 10 ㎚, 더 바람직하게는 4.5 ㎚ 내지 6 ㎚의 평균 입자 직경을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 살바이러스 나노입자 내 코어는 유기 물질, 바람직하게는 중합체이고, 여기서 중합체는 폴리아크릴산(PAA), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜라이드(PGA), 폴리디옥사논(PDO), 및 폴리(락트-코-글리콜산)을 포함하는 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 살바이러스 나노입자 내 코어는 유기 물질, 바람직하게는 폴리(아미도아민)(PAMAM) 및 비스-MPA를 포함하는 군으로부터 선택되는 덴드리머이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 살바이러스 나노입자 내 코어는 유기 물질, 바람직하게는 폴리(아미도아민)(PAMAM) 및 비스-MPA를 포함하는 군으로부터 선택되는 덴드론이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 살바이러스 나노입자 내 코어는 시클로덱스트린인 유기 물질이다.
시클로덱스트린(CD)은 알파(14)-연결된 글루코피라노사이드 단위로 이루어진 자연 발생적 고리형 글루코오스 유도체이다. 이들의 고리형 구조는 글루코오스 단위의 제1 히드록실이 좁은 면 상에 있고 제2 히드록실이 넓은 면 상에 있는 잘린 원뿔 형상을 생성한다. 각 면은 쉽게 독립적으로 기능화될 수 있다. 가장 일반적으로 사용되는 천연의 CD는 6, 7, 및 8개의 글루코피라노사이드 단위를 가지며, 각각 알파, 베타 및 감마 시클로덱스트린이라고 지칭된다. 바람직한 시클로덱스트린은 베타이다. CD의 고리형 구조로 인해, 게스트 분자와 초분자 포함 복합체를 형성할 수 있는 공동(cavity)을 갖는다. CD는 자연적으로 발생하고, 쉽게 기능화되며, 게스트 포함을 위한 공동을 가지고 생체적합성이기 때문에, 약물 전달, 공기 청정제 등을 포함하는 많은 상업적 적용물에서 이들의 용도가 발견되었다. 광범위한 변형된 시클로덱스트린의 합성을 위해 CD의 각 면의 상이한 반응성이 사용되었다. CD의 제1 면은 치환의 정도 및 위치에 대한 제어가 가능하므로, 더 쉽게 변형된다. 할로겐화 CD와 같이, 우수한 이탈기를 함유한 CD 유도체는 CD 기능화에서 중요한 중간체이다. CD의 모든 제1 히드록실 단위를 요오도 단위로 대체함으로써 제1 면의 완전한 기능화가 가능한 중간체를 제공하는 한편, 제2 히드록실 및 경질의(rigid) 잘린 원뿔 형상은 그대로 남아 있다. 일 실시양태에서, 헵타키스-6-요오도-6-디옥시-베타-시클로덱스트린을 합성한 다음 머캅토운데카오설포네이트(MUS)와 반응시켜 제1 면 상에 운데카나오설포네이트기를 갖는 기능화된 CD를 생산하였다. 이후 시클로덱스트린의 제2 면을 독립적으로 변형하여 추가의 가용화 기, 염료 분자, 중합체 등을 도입할 수 있다. 또한, β-CD의 크기(d~1.5 ㎚)는 본 발명의 코어에 대한 바람직한 나노 크기 내에 포함되고 HA 구형 헤드(~5 ㎚)와 잘 일치한다. 베타-시클로덱스트린은 살바이러스 활성에 기여하는 것으로 여겨지는 경질의 화학 구조를 가지고 있고, 좁은 면에 따라서 최대 7개의 트리사카라이드-함유 리간드, 바람직하게는 3~4개의 트리사카라이드-함유 리간드를 가질 수 있으며, 3개는 인플루엔자 바이러스 HA 구형 헤드에서 시알산 결합 점의 수이다.
본 발명의 살바이러스 나노입자는 또한 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 또한 의도된 정제된 단일 분자 또는 화합물일 수 있다.
본 발명의 일 실시양태는 코어 및 상기 코어에 공유적으로 연결된 다수의 리간드를 포함하는 살바이러스 나노입자를 제공하고, 여기서 상기 리간드의 적어도 일부는 트리사카라이드 모이어티를 포함하고 여기서
- 상기 코어는, 바람직하게는 알파-시클로덱스트린, 베타-시클로덱스트린, 감마-시클로덱스트린 또는 이의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는, 시클로덱스트린이고,
- 상기 리간드는 동일하거나 상이하고 선택적으로 치환된 알킬계 리간드, 바람직하게는 선택적으로 치환된 C4-C30 알킬계 리간드, 더 바람직하게는 선택적으로 치환된 C6-C15 알킬계 리간드이고,
- 각각의 트리사카라이드 모이어티는 3-시알릴-N-아세틸락토오스아민(3'SLN) 및 6-시알릴-N-아세틸락토오스아민(6'SLN)으로부터 선택된다.
본 발명의 살바이러스 나노입자의 일부 실시양태에서, 상기 리간드의 일부 또는 전부는 3'SLN을 포함하고, 상기 리간드의 일부 또는 전부는 6'SLN을 포함하며, 상기 리간드의 전부가 아닌 일부는 트리사카라이드 모이어티를 포함하지 않는다.
본 발명의 살바이러스 나노입자(여기서 코어는 시클로덱스트린이다)는 식 (I)로 표시될 수 있다:
Figure pct00003
여기서
m은 2~8이고, 바람직하게는 m은 2~7 또는 2~6이고, 더 바람직하게는 m은 3 또는 4이고,
n은 2~28 또는 4~13 또는 4~30 또는 6~15, 바람직하게는 2~28 또는 4~13이고, 일부 실시양태에서 n은 2 또는 4 또는 6 내지 13 또는 28 또는 30이고, 및
바람직하게는 시클로덱스트린은 알파-시클로덱스트린, 베타-시클로덱스트린, 감마-시클로덱스트린 또는 이의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 구현예는 식 (II)로 표시되는 살바이러스 나노입자 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
Figure pct00004
여기서
각각의 R은, 독립적으로, 선택적으로 치환된 알킬계 리간드이고, 여기서 상기 리간드 중 적어도 2개는 3-시알릴-N-아세틸락토오스아민(3'SLN) 및 6-시알릴-N-아세틸락토오스아민(6'SLN)을 포함하는 군으로부터 선택되는 트리사카라이드 모이어티를 가지거나, 또는 상기 리간드 중 적어도 하나는 3'SLN을 가지고 다른 하나는 6'SLN을 가지고; 바람직하게는 선택적으로 치환된 알킬계 리간드는 선택적으로 치환된 C4-C30 알킬계 리간드, 더 바람직하게는 선택적으로 치환된 C6-C15 알킬계 리간드 또는 6'SLN을 포함하는 선택적으로 치환된 C6-C15 알킬계 리간드이고;
각각의 R'은, 독립적으로, H, -(CH2)y-COOH, -(CH2)y-SO3 -, 중합체 또는 수용화 모이어티이고; 바람직하게는 R'은 H이고; 바람직하게는 R'은, 독립적으로, H, -(CH2)y-COOH, -(CH2)y-SO3 -, 또는 중합체이고; 바람직하게는 R'은, 독립적으로, -(CH2)y-COOH, -(CH2)y-SO3 -, 또는 중합체이고; 바람직하게는 R'은, 독립적으로, H, -(CH2)y-COOH, 또는 -(CH2)y-SO3 -이고; 바람직하게는 R'은, 독립적으로, -(CH2)y-COOH, 또는 -(CH2)y-SO3 -이고;
x는 6, 7 또는 8이고; 및
y는 적어도 4 내지 약 20의 정수이고, 바람직하게는 y는 적어도 4이고, 바람직하게는 y는 4 내지 20이고, 바람직하게는 y는 7 내지 11이고, 가장 바람직하게는 y는 10이다. 다른 실시양태에서, y는 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11이다. 다른 실시양태에서, y는 최대 100, 최대 70, 최대 50, 최대 25, 최대 20, 최대 15이다.
본 발명의 살바이러스 나노입자 내 중합체는 합성 및 천연 중합체 모두에서 선택될 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서, 합성 중합체는 비제한적으로 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리(아크릴아미드)(PAAm), 폴리(n-부틸 아크릴레이트), 폴리-(α-에스테르), (PEG-b-PPO-b-PEG), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(pNIPAAM), 폴리락트글리콜산(PLGA) 및/또는 이의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 천연 중합체는 덱스트란, 덱스트린, 글루코오스, 셀룰로오스 및/또는 이의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 살바이러스 나노입자의 일부 실시양태에서, 트리사카라이드 모이어티는 바람직하게는 인간 인플루엔자 균주에 특이적인, 6'SLN이다. 본 발명의 살바이러스 나노입자의 다른 실시양태에서, 트리사카라이드 모이어티는 바람직하게는 조류 인플루엔자 균주에 특이적인, 3'SLN이다.
본 발명의 살바이러스 나노입자의 리간드 (또는 리간드 화합물)는 전형적으로 충분히 길고(적어도 2개, 또는 적어도 4개 또는 적어도 6개의 탄소 원자) 소수성이다.
전형적으로, 본 발명의 맥락에서, 선택적으로 치환된 알킬계 리간드는 헥산-, 펜탄-, 옥탄-, 운데칸-, 헥사데칸-계 리간드를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 살바이러스 나노입자의 치환된 알킬계 리간드, 치환된 C4-C30 알킬계 리간드, 및 치환된 C4-C30 카르복시알킬은 알케닐, 알케닐티오, 알케닐옥시, 알콕시, 알콕시알콕시, 알콕시알콕시알콕시, 알콕시알콕시알킬, 알콕시알킬, 알콕시카르보닐, 알콕시카르보닐알콕시, 알콕시카르보닐알킬, 알콕시술포닐, 알킬, 알킬아미도알킬, 알킬카르보닐, 알킬카르보닐알콕시, 알킬카르보닐알킬, 알킬카르보닐알킬티오, 알킬카르보닐옥시, 알킬카르보닐티오, 알킬설피닐, 알킬설피닐알킬, 알킬 설포닐, 알킬설포닐알킬, 알킬티오, 알킬티오 알킬, 알킬티오알콕시, 알카이닐, 알카이닐옥시, 알카이닐티오, 아릴, 아릴카르보닐, 아릴옥시, 아릴설포닐, 카르복시, 카르복시알콕시, 카르복시알킬, 시아노, 시아노알콕시, 시아노알킬, 시아노알킬티오, 1,3-디옥소라닐, 디옥사닐, 디티아닐, 에틸렌디옥시, 포르밀, 포르밀알콕시, 포르밀알킬 , 할로알케닐, 할로 알케닐옥시, 할로알콕시, 할로알킬, 할로알카이닐, 할로 알카이닐옥시, 할로겐, 헤테로사이클, 헤테로시클로카르보닐, 헤테로시클로옥시, 헤테로시클로설포닐, 히드록시, 히드록시알콕시, 히드록시알킬, 머캅토, 머캅토 알콕시, 머캅토 알킬, 메틸렌디옥시, 및 니트로를 포함하는 군으로부터 독립적으로 선택되는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 치환기로 치환된다. 바람직하게는 치환된 알킬계 리간드, 치환된 C4-C30 알킬계 리간드, 및 치환된 C4-C30 카르복시알킬은 (비변형된 시클로덱스트린의 해당 산소를 대체하여) 하나의 머캅토기로 치환된다. 바람직한 치환된 알킬계 리간드는 C4-C30 또는 C2 내지 C28 또는 C4 내지 C13 알킬계 리간드로 치환된 알킬아미도알킬이다.
리간드 및 트리사카라이드 모이어티를 포함하는 리간드 사이의 백분율 비율은 75%:25% 내지 95%:5%; 바람직하게는 88%:12%이다.
본 개시의 맥락에서, "다수의 리간드"는 본 발명의 다수의 리간드에 의해, 부분적으로 또는 완전히, 코팅된 살바이러스 나노입자 코어를 지칭하며, 여기서 상기 리간드의 적어도 일부는 본 발명의 트리사카라이드 모이어티를 포함한다. 상기 코팅은 균질하거나, 비구조화되거나 또는 구조화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 살바이러스 나노입자는 본 발명의 트리사카라이드 모이어티를 포함하는 리간드를 매우 고밀도(HD)로, 예를 들어 총 리간드의 25%로 포함한다. 일부 실시양태에서, 살바이러스 나노입자는 ㎚2 당 약 2개 내지 약 5개의 본 발명의 리간드를 포함하며, 여기서 상기 리간드의 적어도 일부는 트리사카라이드 모이어티를 포함한다. 다른 실시양태에서, 살바이러스 나노입자는 ㎚2 당 4개의 본 발명의 리간드를 포함하고, 여기서 이러한 리간드의 적어도 일부는 트리사카라이드 모이어티를 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 본 발명의 다수의 리간드는 폴리에틸렌 글리콜 5(PEG(5)) 및 16-머캅토헥사데콘산(C15)과 같은, 적어도 2개의 구조적으로 상이한 리간드의 혼합물을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "적어도 2개의 구조적으로 상이한 리간드의 혼합물"은 상기 정의된 바와 같은 본 발명의 2개 이상의 리간드의 조합을 지칭하고, 여기서 상기 리간드는 적어도 하나의 위치에서 이들의 화학적 조성이 서로 상이하다. 상기 혼합물은 유리하게는 트리사카라이드 모이어티를 함유하지 않은 리간드가 트리사카라이드 모이어티를 함유하는 리간드를 위해 최적의 간격을 제공하고 트리사카라이드 모이어티와 인플루엔자 바이러스 HA 사이의 상호작용을 방해하지 않도록 조직화될 수 있다. 따라서, 트리사카라이드 모이어티를 함유하지 않는 리간드 대 트리사카라이드 모이어티를 함유하는 리간드 사이에, 약 75:25 내지 약 95:5 범위의, 바람직하게는 약 88:12의, 백분율 비율이 존재할 것이다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, PEG(5) 및 16-머캅토헥사데콘산(C15) 혼합된 리간드 금 나노입자(NP)가 합성되었다. PEG(5)는 NP의 수용성을 향상시키는 반면 C15는 트리사카라이드를 그래프팅하기 위한 리간드이다. 리간드 선택은 두 가지 이유에 근거하였다: 1) C15는 HA 상에서, ~4 ㎚ 떨어져 있는, 3개의 시알산 결합 점을 표적으로 하기에 충분히 길고, 2) 탄소계 경질 리간드는 살바이러스의 활성을 향상시킨다.
리간드는 일반적으로 인플루엔자 혈구응집소(hemagglutinin)에 대한 트리사카라이드 모이어티의 결합을 최적화하는 양으로 코어의 표면 상에 존재한다. 코어는 전형적으로 ㎚2 당 4개의 리간드를 갖는다. 일부 실시양태에서, 코어는 ㎚2 당 약 2개 내지 약 5개의 리간드를 갖는다.
본 발명의 살바이러스 나노입자의 중요한 이점은 상세한 독성 분석 결과 조직 구조의 임의의 변경 또는 전-염증성 사이토카인의 방출을 나타내지 않았다는 것이다. 생체내 시험은 본 발명의 살바이러스 나노입자를 사용한 치료가 감염 전 또는 후의 약물의 첨가와 관계없이, 감염된 마우스의 건강 상태를 상당히 개선하고 폐의 바이러스 양을 상당히 감소시켰음을 보여주었다.
본 발명의 또 다른 구현예는 유효량의 하나 이상의 본 발명의 살바이러스 나노입자 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물을 개시한다.
적절한 부형제, 담체 및 희석제에 관해서는, 이들을 설명하는 표준 문헌, 예를 들어 "Comprehensive Medicinal Chemistry", Pergamon Press 1990의 Vol. 5의 chapter 25.2 및 H.P. Fiedler에 의한 "Lexikon der Hilfsstoffe f
Figure pct00005
r Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete", Editio Cantor, 2002를 참조할 수 있다. 용어 "약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및/또는 희석제"는 일반적으로 안전하고, 허용가능한 독성을 보유한 약학적 조성물을 제조하는 데 유용한 담체, 부형제 또는 희석제를 의미한다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 수의학적 용도 뿐만 아니라 인간 약학적 용도로 허용될 수 있는 것을 포함한다. 명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같은 "약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및/또는 희석제"는 이러한 담체, 부형제 및/또는 희석제 하나 이상을 둘 다 포함한다.
선택적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 하나 이상의 추가의 활성제, 바람직하게는 항-바이러스제를 추가로 포함한다.
본 발명의 방법에서 사용되는 본 발명의 살바이러스 나노입자는 치료적 투여를 위한 다양한 제형 및 약제에 혼입될 수 있다. 더 구체적으로, 본 명세서에서 제공된 바와 같은 살바이러스 나노입자는 적절한, 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및/또는 희석제와 조합하여, 약학적 조성물로 제형화될 수 있고, 고체, 반-고체, 액체 또는 기체 형태, 예컨대 정제, 캡슐, 환, 분말, 과립, 드라제, 젤, 슬러리, 연고, 용액, 좌제, 주사제, 흡입제 및 에어로졸의 제조물(preparation)로 제형화될 수 있다. 이와 같이, 살바이러스 나노입자의 투여는 구강, 협측, 흡입(폐, 코), 직장, 비경구, 복강내, 피내, 경피, 두개내 및/또는 기관내 투여를 포함하는, 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 또한, 살바이러스 나노입자는 데포(depot) 또는 지속적 방출 제형으로, 전신적 방식보다 국소적 방식으로 투여될 수 있다. 살바이러스 나노입자는 일반적인 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 제형화될 수 있고, 정제로 압축되거나, 또는 편리한 구강 투여를 위해 엘릭서 또는 용액으로 제형화될 수 있거나, 또는 근육내 또는 정맥내 경로로 투여될 수 있다. 살바이러스 나노입자는 경피로 투여될 수 있고, 지속적 방출 투여 형태 등으로 제형화될 수 있다. 살바이러스 나노입자는 단독으로, 서로 조합하여 투여될 수 있거나, 또는 이들은 다른 공지된 화합물과 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용하기 적합한 제형은 Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company (1985) Philadelphia, PA, 17th ed.)에서 발견되며, 이는 본 명세서에 참조로서 포함된다. 또한, 약물 전달 방법에 대한 간략한 검토는 Langer, Science (1990) 249:1527-1533을 참조하며, 이는 본 명세서에 참조로서 포함된다.
지속적-방출 제조물이 제조될 수 있다. 지속적-방출 제조물의 적합한 예는 본 발명의 살바이러스 나노입자를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 상기 매트릭스는 성형 물품의 형태, 예를 들어 필름, 또는 마이크로 캡슐로 존재한다. 지속적-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락타이드(미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산 및 [감마] 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 예컨대 LUPRON DEPOT(TM)(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사가능한 미소구체), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.
본 발명의 살바이러스 나노입자는 또한, 예를 들어, 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 계면중합에 의해, 제조되는 마이크로캡슐에, 예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메트아실레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에 또는 매크로에멀젼에, 포획될 수 있다. 이러한 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 개시되어 있다.
본 명세서에서 서술된 약학적 조성물은 본 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방식으로, 즉, 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 드라제-제조, 분말화, 유화, 캡슐화, 포획 또는 동결건조 방법에 의해, 제조될 수 있다. 다음의 방법 및 부형제는 단지 예시일 뿐이며 제한하는 것은 결코 아니다. 주사를 위해, 수성 또는 비수성 용매, 예컨대 식물성 또는 다른 유사한 오일, 합성 지방족산 글리세라이드, 고급 지방족산의 에스테르 또는 프로필렌 글리콜에; 및 원한다면, 가용화제, 등장제, 현탁제, 유화제, 안정화제 및 보존제와 같은 통상적인 첨가제와 함께, 살바이러스 나노입자 (및 선택적으로 또 다른 활성제)를 용해, 현탁 또는 유화함으로써 이들은 제조물로 제형화될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 살바이러스 나노입자는 수용액, 바람직하게는 행크스 용액, 링거 용액, 또는 생리식염수 완충액과 같은 생리학적으로 호환가능한 완충액으로 제형화될 수 있다. 점막경유의 투여의 경우, 침투할 장벽에 적합한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 본 기술분야에 일반적으로 공지되어 있다.
바람직하게는, 비경구 투여를 위한 약학적 제형은 수용성 형태의 살바이러스 나노입자의 수용액을 포함한다. 추가적으로, 살바이러스 나노입자의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 참기름과 같은 지방유, 또는 에틸 올리에이트 또는 트리글리세리드와 같은, 합성 지방산 에스테르, 또는 리포솜을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨, 또는 덱스트란과 같이, 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한 고농축 용액의 제조를 가능하게 하기 위해 살바이러스 나노입자의 용해도를 증가시키는 적합한 안정화제 또는 작용제를 함유할 수 있다.
담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태를 생성할 수 있는 본 발명의 살바이러스 나노입자의 양은 치료되는 바이러스성 질환, 포유류 종, 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 또한, 임의의 특정 환자에 대한 특정 용량 수준은 사용되는 특정 화합물의 활성; 치료받는 개인의 연령, 체중, 일반적인 건강상태, 성별 및 식이요법; 투여 시간 및 경로; 배설 속도; 이전에 투여된 다른 약물; 및 치료법을 받고 있는 특정 바이러스성 질환의 심각도;를 포함하는 다양한 요인에 따라 달라질 것임이 이해될 것이며, 이는 해당 분야의 통상의 기술자에게 잘 이해되는 바와 같다.
본 발명의 추가의 구현예는 치료적으로 유효량의 하나 이상의 본 발명의 살바이러스 나노입자를, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 바이러스 감염 및/또는 인플루엔자 바이러스와 관련된 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예는 인플루엔자 바이러스 감염 및/또는 인플루엔자 바이러스와 관련된 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 살바이러스 나노입자를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "대상체" 또는 "환자"는 본 기술분야에서 잘-인식되어 있으며, 개, 고양이, 랫트, 마우스, 원숭이, 소, 말, 염소, 양, 돼지, 낙타, 및 가장 바람직하게는, 인간을 포함하는, 포유류를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 닭과 같은 다른 동물도 이들 용어에 포함된다. 바람직한 실시양태에서, 용어 "대상체" 또는 "환자"는 개, 고양이, 랫트, 마우스, 원숭이, 소, 말, 염소, 양, 돼지, 낙타, 닭과 같은, 인간 및 동물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 치료가 필요한 대상체 또는 인플루엔자 바이러스에 의해 감염된 대상체이다. 다른 실시양태에서, 대상체는 닭과 같은, 조류 인플루엔자에 의해 감염된 동물일 수 있다. 그러나, 다른 실시양태에서, 대상체는 건강한 대상체 또는 이미 치료를 받은 대상체일 수 있다. 상기 용어는 특정 연령 또는 성별을 나타내지 않는다. 따라서, 남성이든지 또는 여성이든지, 성인, 아이 및 신생아 대상체를 아우르는 것으로 의도된다.
"치료"는 치료적 치료 및 예방적 또는 방지적 조치 둘 다를 지칭한다. 치료를 필요로 하는 대상체는 이미 인플루엔자 바이러스에 의해 감염된 대상체, 뿐만 아니라 인플루엔자 바이러스성 감염이 예방되어야 하는 대상체도 포함한다. 따라서, 본 명세서에서 치료될 포유류, 바람직하게는 인간은 인플루엔자 바이러스에 의해 감염된 것으로서 진단되었을 수 있거나, 또는 인플루엔자 바이러스에 감염되기 쉬울 수 있거나 민감할 수 있다. 치료는 인플루엔자 바이러스성 감염으로 인한 질환 또는 상태의 적어도 하나의 증상을 호전시키거나, 이러한 질환 또는 상태를 치유하거나 및/또는 이러한 질환 또는 상태의 발생을 예방하는 것을 포함한다. 예방은 예를 들면, 진입-후 바이러스의 사건에 영향을 미침으로써, 감염 또는 질환을 야기하는 인플루엔자 바이러스의 능력을 약화시키거나 감소시키는 것을 의미한다.
치료를 목적으로 하는 "포유류"는 인간, 가축 및 농장 동물 또는 애완 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소, 원숭이 등을 포함하는 포유류로서 분류된 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 포유류는 인간이다.
용어 "치료적으로 유효량"은 수용자 대상체에서 인플루엔자 바이러스를 변경하고, 이를 불활성 상태로 만들거나, 및/또는 그의 존재가 수용자 대상체에서 생리학적으로 검출 가능한 변화를 초래하는 경우, 예를 들어, 바이러스성 감염과 관련된 적어도 하나의 증상을 호전시키거나, 예방하거나 또는 적어도 하나의 바이러스성 물질의 전파 속도를 감소시키기에 효과적인 본 발명의 살바이러스 나노입자의 양을 지칭한다.
본 발명의 또 다른 구현예는 유효량의 하나 이상의 본 발명의 살바이러스 나노입자 및 선택적으로 적어도 하나의 적합한 담체 또는 에어로졸 담체를 포함하는 살바이러스 조성물을 제공한다. "유효량"은 인플루엔자 바이러스를 비가역적으로 억제하기에 충분한 양, 즉 살바이러스 효과를 수득하기에 충분한 양을 지칭한다. 일 실시양태에서, 적합한 담체는 안정화제, 방향제, 착색제, 유화제, 증점제, 습윤화제, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 살바이러스 조성물은 액체, 겔, 폼(foam), 분무제 또는 에멀전의 형태로 존재할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 살바이러스 조성물은 공기 청정제, 멸균 용액 또는 소독 용액일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예는 본 발명의 살바이러스 조성물 또는 하나 이상의 본 발명의 살바이러스 나노입자 및 본 발명의 살바이러스 나노입자를 적용 및/또는 분배하기 위한 수단을 포함하는 장치 (또는 제품)를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 수단은 분배기, 분무제 도포기 또는 본 발명의 살바이러스 나노입자로 적셔진 고체 지지체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 지지체는 직물 또는 부직물, 섬유(textile), 종이 수건, 탈지면, 및 흡착 중합체 시트, 또는 스폰지이다.
본 발명의 또 다른 구현예는 본 발명의 살바이러스 나노입자 또는 본 발명의 살바이러스 조성물 또는 본 발명의 약학적 조성물을 사용하여 소독 및/또는 멸균하는 방법을 제공한다.
바람직한 실시양태에서, 소독 및/또는 멸균 방법은 (i) 적어도 하나의 본 발명의 살바이러스 나노입자 또는 본 발명의 살바이러스 조성물, 또는 본 발명의 약학적 조성물을 제공하는 단계, (ii) 인플루엔자 바이러스-오염된 표면 또는 인플루엔자 바이러스에 의해 오염된 것으로 의심되는 표면을 살바이러스 효과를 수득하기에 충분한 시간 동안 적어도 하나의 본 발명의 살바이러스 나노입자 또는 본 발명의 살바이러스 조성물 또는 본 발명의 약학적 조성물과 접촉시키는 단계;를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인플루엔자 바이러스-오염된 표면은 인간 또는 동물 피부이다. 다른 실시양태에서, 인플루엔자 바이러스-오염된 표면은 비-생체 표면, 예컨대 의료 장비, 의류, 마스크, 가구, 방 등이다.
본 발명의 또 다른 구현예는 멸균 및/또는 소독을 위한 본 발명의 살바이러스 나노입자 또는 본 발명의 살바이러스 조성물 또는 본 발명의 약학적 조성물의 용도를 제공한다. 일부 실시양태에서, 멸균 및 소독은 인플루엔자 바이러스-오염된 표면 또는 인플루엔자 바이러스에 의해 오염된 것으로 의심되는 표면이다. 일부 바람직한 실시양태에서, 표면은 인간 또는 동물 피부이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 표면은 비-생체 표면, 예컨대 의료 장비, 의류, 마스크, 가구, 방 등이다. 일 실시양태에서, 본 발명의 살바이러스 조성물 또는 본 발명의 약학적 조성물은 빈번한 사용을 위해 살바이러스 손 소독제로서 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 살바이러스 조성물 또는 본 발명의 약학적 조성물은 분무에 의해 적용된다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 살바이러스 조성물 또는 본 발명의 약학적 조성물은 보호 마스크 상에 적용된다.
본 기술분야의 기술자는 본 명세서에 서술된 발명이 구체적으로 서술된 것 이외의 변경 및 변형을 받아들이기 쉽다는 것을 인식할 것이다. 본 발명이 그의 사상 또는 필수적인 특징을 벗어나지 않으면서 모든 이러한 변경 및 변형을 포함한다는 것을 이해할 것이다. 본 발명은 본 명세서에서 개별적으로 또는 총체적으로 지칭되거나 지시된 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물, 및 상기 단계 또는 특징 중 임의의 2개 이상의 단계 또는 특징 또는 임의의 모든 조합도 포함한다. 따라서, 본 개시는 모든 구현예에서 제한하기 위한 것이 아니라 예시하기 위한 것으로 여겨질 것이고, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해 지시되며, 동등한 의미 및 범위 내에 있는 모든 변화들이 그 안에 포함되는 것으로 의도된다.
하기 설명은 하기 실시예를 참조함으로써 더 충분히 이해될 것이다. 그러나, 이러한 실시예는 본 발명을 실시하는 방법을 예시하기 위한 것이고 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.
실시예
실험 데이터
밀도 분석
최적의 6'SLN 밀도를 입증하기 위해 3개의 상이한 6-시알릴-N-아세틸락토오스아민(6'SLN) 밀도의 NP를 합성하였다(도 1). PEG(5) 및 3-시알릴-N-아세틸락토오스아민(3'SLN)-코팅된 금 NP를 사용한 대조군 실험도 수행하였다.
2개의 인플루엔자 A 균주 H1N1(Neth/09) 및 H3N2(Sing/04) 및 하나의 B 균주, Yamagata에 대해 용량-반응 비교 연구를 수행하였다. LD-6'SLN NP는 시험된 모든 바이러스에 대해 가장 낮은 절반 억제 농도(EC50)를 갖는다. 일반적으로, NP는 B 하위유형보다 인플루엔자 A 하위유형을 더 잘 억제하였다.
H1N1 Neth/09 균주에 대한 상이한 NP의 시험관내 절반 억제(EC50) 및 세포독성 농도(CC50). 몰농도는 NP 및 트리사카라이드/NP를 기준으로 별도로 계산되었다.
인플루엔자 균주 EC 50
(㎍/㎖) 		EC 50 NPs
(nM) 		EC 50 6'SLN
(nM) 		CC 50
(㎍/㎖)
LD 6'SLN NPs
(18 6'SLN/NP)		 H1N1 Neth/09 0.13 0.64 11.5 >500
HD 6'SLN NPs
(38 6'SLN/NP)		 H1N1 Neth/09 0.45 2.2 83 > 500
LD(-) 6'SLN NPs
(8 6'SLN/NP)		 H1N1 Neth/09 1.1 5.4 43 > 500
LD 3'SLN NPs
(18 3'SLN/NP)		 H1N1 Neth/09 5.3 27.2 489 >500
PEG5 NPs H1N1Neth/09 N/A N/A N/A > 500
H3N2 Sing/04 균주에 대한 상이한 NP의 EC50 및 CC50.
인플루엔자 균주 EC 50
(㎍/㎖) 		EC 50 NPs
(nM) 		EC 50 6'SLN
(nM) 		CC 50
(㎍/㎖)
LD 6'SLN NPs
(18 6'SLN/NP)		 H3N2 SING/04 0.58 2.8 50.4 >500
HD 6'SLN NPs
(38 6'SLN/NP)		 H3N2 SING/04 1.12 5.9 224.4 > 500
LD(-) 6'SLN NPs
(8 6'SLN/NP)		 H3N2 SING/04 1.9 9.4 75.2 > 500
LD 3'SLN NPs
(18 3'SLN/NP)		 H3N2 SING/04 4.5 22 396 >500
PEG5 NPs H3N2 SING/04 N/A N/A N/A > 500
인플루엔자 B/Yamagata에 대한 상이한 NP의 EC50 및 CC50.
인플루엔자 균주 EC 50
(㎍/㎖) 		EC 50 NPs
(nM) 		EC 50 6'SLN
(nM) 		CC 50
(㎍/㎖)
LD 6'SLN NPs
(18 6'SLN/NP)		 B/Yamagata 13.7 67 1206 >500
HD 6'SLN NPs
(38 6'SLN/NP)		 B/Yamagata 17.25 85 3230 > 500
LD(-) 6'SLN NPs
(8 6'SLN/NP)		 B/Yamagata 53.3 260 2080 > 500
LD 3'SLN NPs
(18 3'SLN/NP)		 B/Yamagata >100 >100 >1000 >500
PEG5 NPs B/Yamagata N/A N/A N/A > 500
이후 억제 메커니즘이 비가역적인지 여부를 결정하기 위해, 살바이러스 분석을 수행하였다. 살바이러스 분석에서, 일정한 시간 동안 해당 IC99 농도에서 바이러스와 함께 NP를 인큐베이션하였다. 이후 접종물의 연속 희석을 수행하고 바이러스의 잔류 감염성을 측정하였다. Neth/09 및 Sing/04 균주에 대한 LD 6'SLN NP의 살바이러스 활성은 용량-반응 실험에 비해 바이러스 농도를 10배 증가시켜 시험하였다. Neth/09 균주의 역가는 2 로그(log) 감소한 반면 Sing/04는 1.5 로그 감소하였다. 바이러스 역가의 1-2 로그 감소는 바이러스가 비가역적으로 억제됨을 나타낸다.
바이러스-NP 상호작용을 입증하기 위한 TEM 연구
바이러스-NP 상호작용은 전자 현미경(TEM)으로도 입증되었다. H3N2 Vic/11 바이러스를 LD 6'SLN NP와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. TEM 그리드를 제조한 후, 메틸 텅스텐 염색을 수행하였다. 대부분의 바이러스는 LD 6'SLN NP로 완전히 덮였다(도 2b). 대조군 실험은 PEG(5) NP로 수행하였고, NP가 모두 주변에 있었지만 바이러스 외피에 부착되지는 않았다(도 2c).
조류 인플루엔자 바이러스를 억제하는 NP의 잠재력
인플루엔자 유행병은 일반적으로 동물 인플루엔자 균주가 인간 인플루엔자 균주와 혼합될 때 나타난다. 따라서, 다음 목표는 본 발명의 NP로 조류 독감 균주를 비가역적으로 억제하는 것이다. 알-적응 바이러스 균주, CAL/09로 예비 연구를 수행하였다. Neth/09 및 CAL/09는 2개의 매우 유사한 인간 H1N1 균주이다. LD-6'SLN NP는 Neth/09 균주에 대해 강한 활성을 가지고 있다. 그러나, 계란을 사용하여 복제한, CAL/09 균주는 LD 3'SLN NP에 더 높은 친화도로 결합한다(표 4). 이 결과는 LD-3'SLN NP가 조류 인플루엔자 균주를 억제함을 나타낸다.
알 적응된 바이러스 균주는 -2,3 연결을 선호하는 반면, 마우스 적응된 균주는 -2,6 연결을 선호한다.
Neth/09 마우스 적응된
EC 50 (㎍/㎖) 		CAL/09 알 적응된
EC 50 (㎍/㎖)
LD-6'SLN 0.13 34.9
LD-3'SLN 5.13 1.18
금 코어에서 시클로덱스트린 코어까지
인간 인플루엔자 바이러스는 C15-6'SLN 그래프팅된 금 NP로 비가역적으로 억제되었다. 그러나, 약학적 적용물에서는 금 코어를 유기 물질로 변경하는 것이 중요하다. 중합체, 덴드리머 및 덴드론과 같은 상이한 유기 물질 중에서, 시클로덱스트린(CD)은 HA를 표적으로 하기 위해 6'SLN을 함유하는 리간드를 그래프팅하기에 바람직한 코어이다.
CD의 크기(d~1.5 ㎚)는 본 발명의 금(금속) NP(~3 ㎚)와 비슷하고 HA 구형 헤드(~5 ㎚)와 잘 일치한다. 금(금속) NP와 유사하게, 시클로덱스트린은 리간드와 함께 살바이러스 활성에 기여하는, 경질의 화학 구조를 갖는다. 또한, 베타-시클로덱스트린은 최대 7개의 트리사카라이드 (더 바람직하게는 3개 또는 4개의 트리사카라이드)를 가질 수 있고, 3개는 HA 구형 헤드 내 시알산 결합 점의 정확한 수이다(도 3a). 따라서, β-CD는 금 나노입자와 매우 유사한 방식으로 C15-6'SLN으로 변형되었다.
시알산을 함유하는 이전의 유기 물질과 비교하여, 상이한 인간 인플루엔자 바이러스에 대해 상당히 더 낮은 EC50 값이 수득되었다(도 3b). 바이러스의 역가가 수개의 로그만큼 감소된 생체내 및 생체외 실험 모두에서 변형된 시클로덱스트린의 살바이러스 활성이 증명되었다(도 3c 및 d). 생체외에서의 성공적인 결과는 변형된 시클로덱스트린이 생체내에서 바이러스를 비가역적으로 억제할 것임을 나타낸다.
트리사카라이드 뿐만 아니라 리간드의 선택은 나노-물질로 인간 인플루엔자 바이러스를 비가역적으로 억제하는 데 매우 중요함을 본 명세서에서 보여준다. 금 나노입자 및 시클로덱스트린이라는 2개의 상이한 코어 상에 있는 C15-6'SLN 리간드는 매우 낮은 나노-물질 농도로 인간 인플루엔자 바이러스의 여러 균주를 억제하였다. 트리사카라이드 단위에 비해, 낮은 nM 범위(1~100 nM)에서 EC50 농도가 달성된 반면, 문헌 EC50 값은 유사한 물질에 대해 50~500배 더 높았다.
변형된 시클로덱스트린의 시험관내 항바이러스성 활성
화학 구조 및 항바이러스성 활성 사이의 관계를 조사하기 위해, 트리사카라이드와 함께 또는 없이, β-시클로덱스트린(β-CD)을 상이한 리간드로 변형시켰다. 예시적인 변형된 시클로덱스트린을 도 4에 나타낸다. 이들은 1H 핵자기 공명 분광법(NMR)으로 측정된, 비슷한 수의 트리사카라이드를 함유한다(도 5 및 표 5 참조). 인플루엔자 A/Netherlands/2009 (H1N1) 균주 (A/NL/09)에 대한 용량-반응 분석을 수행하여 이들 NP의 억제 활성을 비교하였다(도 6). 감염은 감염-후 24시간(hpi)에 면역세포화학적 분석으로 정량화되었다. 충분히 긴, 소수성 리간드 및 6'SLN 말단-기(C6-6'SLN, C11-6'SLN 및 C14-6'SLN)를 함유하는 β-CD는 인플루엔자 A/NL/09에 의한 세포 감염에 대해 강한 억제 활성을 나타냈고, 나노몰 범위의 EC50 값을 갖는다. 반면, 더 짧은 리간드, C1-6'SLN를 갖는 β-CD는 감염을 잘 억제하지 못했다. 충분히 긴 리간드를 도입하면 말단-기 유연성이 분명히 향상되었고; 따라서 억제 농도가 감소하였다. EC50은 소수성 리간드가 친수성 PEG8 리간드(PEG8-6'SLN)로 대체되었을 때 비슷했다(그러나 약간 더 높음).
1H NMR에 의해 결정된 ß-시클로덱스트린 당 6'SLN 또는 3'SLN의 평균의 수 및 해당 분자량.
스페이서의 수/CD 6'SLN의 수/CD 분자량 (kDa)
P8-6' 4 3.5 5.7
C14-6' 3.1 3 4.1
C11-6' 3.6 3.1 4.1
C6-6' 2.8 2.7 3.4
C11-3' 3 2.7 3.9
C1-6' - 3 3.5
A/NL/09에 대해 최고의 억제 활성을 보여준 나노입자인, C11-6'SLN은 A 및 B 유형 모두에서 인간 인플루엔자 균주에 대해 강한 항바이러스성 활성을 나타냈다(표 6 및 도 7). 중요하게는, 이는 제네바의 대학 병원의 환자로부터 단리되어 세포에서 단 한 번만 계대된, (2017/2018 인플루엔자 시즌으로부터의) 매우 최근의 A(H1N1) 및 B 임상적 균주를 억제하였다. C11-6'SLN은 HSPG 결합 바이러스인, HSV-2에 대해 어떠한 항바이러스성 활성도 나타내지 않았고, 이는 시알산 의존성 바이러스에 대한 화합물의 특이성을 나타낸다.
6'SLN은 인간 인플루엔자 균주에 특이적인 것으로 알려져 있는 반면 3'SLN은 조류 인플루엔자 균주에 대해 1차 부착 점으로서 바람직하다. 특히 종 장벽을 교차할 수 있는 것으로 알려진 인플루엔자 균주에 대해, 이 접근법의 일반성을 증명하기 위해, C11-3'SLN을 합성하고 조류 인플루엔자 균주에 대해 시험하였다(도 4). C11-3'SLN은 2개의 조류 균주, H5N1 및 H7N1을, 각각 4.1 및 8.8 ㎍/㎖ 농도에서 성공적으로 억제하였다(표 6 참조). 사실상, 이들 결과는 인간 균주에 대해 채택된 전략을 확인해준다. 중요하게는, 이들 조류 균주 중 하나인, H5N1은, 다음 인플루엔자 유행병을 일으킬 상당한 가능성을 가지고 있다. C11-3'SLN이 인간 균주, A/NL/09를 억제할 수 있는지 여부 및 C11-6'SLN이 조류 균주, H5N1에 대해서도 활성이 있는지 여부를 추가로 시험하였다. C11-3'SLN은 A/NL/09에 대해 우수한 억제 활성을 나타낸(도 4 및 표 6) 반면 C11-6'SLN은 H5N1에 대해 어떠한 활성도 나타내지 않았다(표 6 및 도 8). 이들 결과는 상이한 유형의 시알산에 대해 조류 및 인간 균주의 결합 친화도를 비교하는 이전 문헌과 유사하다. 조류 인플루엔자 균주 (특히 H5N1 균주)는 얇고 곧은 트랜스 형태를 갖는, 알파 -2,3 연결된 시알산에 우선적으로 결합한다. 다른 한편, 인간 균주의 더 넓은 시알산 결합 부위는 알파 -2,6 연결된 시알산의 벌키 시스 형태 및 더 좁은 -2,3 연결된 시알산을 모두 수용할 수 있다.
상이한 인플루엔자 균주에 대한 C11-6'SLN 및 C11-3'SLN의 억제 활성.
화합물 CC 50 (㎍/㎖) EC 50 (㎍/㎖) EC 50 † (nM)
A/Netherlands/2009
(H1N1) 		C11-6' >100 0.18 (0.14 - 0.24) 42
C11-3' >100 6.5 (4.1-10.1) >1000
A/Clinical/2018
(H1N1) 		C11-6' >100 0.5 (0.4 - 0.67) 125
Singapore/2004
(H3N2) 		C11-6' >100 0.23 (0.16 - 0.34) 56.5
B/Wisconsin/2010* C11-6' >100 2.2 (1.49 - 3.42) 500
B/Clinical/2018 C11-6' >100 20 (10.5 - 28.7) >1000
A/turkey/Turkey/2005
(H5N1) 		C11-3' >100 4.1 (2.55-6.7) 931
C11-6' >100 N/A N/A
A/turkey/Italy/1999
(H7N1) 		C11-3' >100 8.8 (3.2-26) >1000
HSV-2 (대조군) C11-6' >100 N/A N/A
* B Yamagata 하위유형
† 몰 농도는 시클로덱스트린 코어의 수를 기준으로 결정되었다.
CC50: 절반 최대 세포독성 농도.
다음으로, 억제의 메커니즘, 즉 살바이러스(비가역적) 또는 바이러스 억제성(가역적)을 결정하기 위해 살바이러스 분석을 수행하였다. β-시클로덱스트린 코어 및 6'SLN 모이어티를 공유하지만 리간드가 상이한 유사한 나노입자의 합성은 살바이러스 작용을 부여하는 구조적 특징을 강조한다(도 9 및 10). 비가역적 바이러스 억제의 핵심 요소 중 하나는 결합 모이어티(여기서는 6'SLN)가 소수성 리간드에 의해 함유되는 것이라는 가설이 세워졌다. 이 가설을 검증하기 위해, C11-6'SLN 및 P8-6'SLN을 비교하였다. 간단히 말해서, 완전한 보호를 제공하는 화합물의 양(10 ㎍의 C11-6' 및 50 ㎍의 P8-6')을 A/NL/09와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 접종물의 연속 희석을 수행한 후 감염성을 평가하였다. C11-6'의 경우 (a)의 그래프는 희석시 완전한 보호가 유지되었음을 보여주고 (c)의 그래프는 이 특성이 여러 상이한 균주에 대해 발견되었음을 보여준다. 이를 비가역적(즉, 희석에 대한 내성) 억제 활성 살바이러스 메커니즘이라고 한다. P8-6'의 경우, (b)의 그래프는 초기 농도에서 완전한 보호가 존재한 반면, 희석시 대조군 샘플(바이러스 단독)의 감염성과 차이가 손실되었음을, 즉, 억제 효과는 가역적(바이러스 억제성)인 것으로 발견되었음을 보여준다. 이들 두 나노입자는 리간드의 소수성만 다르고 비슷한 억제 활성을 나타낸다. 살바이러스 분석에서, C11-6'SLN은 바이러스 역가를 1000배 감소시킨(도 9b) 반면, P8-6'SLN의 경우 감염이 완전히 회복되었다(도 9a). 따라서 C11-6'SLN은 바이러스에 대해 비가역적 억제 효과를 갖는 반면 P8-6'SLN의 효과는 가역적이다. 두 나노입자 모두 세포에 대해 무독성이라는 점을 언급할 가치가 있다(도 9a 및 9b). 다른 인플루엔자 균주에 대한 C11-6'SLN의 살바이러스 활성을 추가로 조사하였고 이로써 균주와 무관한 그의 비가역적 활성을 확인하였다(도 9c).
변형된 시클로덱스트린의 생체외 활성
인간 기도 재구성 상피의 3D 모델, 머실에어®에서 생체외 실험을 수행하였다. 이들 공기-액체 계면 배양은 인간에서 인플루엔자 바이러스 복제의 주요 부위인, 인간 상부 호흡기 상피의 거짓중층 구조(기저, 섬모 및 배상 세포) 및 장벽 방어 메커니즘(즉, 점막섬모 제거 및 상피 세포 면역)을 완벽히 모방한다. 생체외 실험은 임의의 적응 편향을 배제하기 위해 세포에서 계대되지 않은 임상적 H1N1 유행성 09 균주로 수행하였다. C11-6'SLN 또는 P8-6'SLN(50 ㎍/조직) 및 바이러스(104 RNA 사본/조직)를, 사전 인큐베이션 없이, 먼저 조직의 정점 표면에 동시에 첨가하였다. 4시간 후, 접종물을 제거하고, 조직을 세척하고 감염의 진행을 나노입자의 임의의 재첨가 없이, 조직의 정점 세척으로부터의 qPCR로 일일 단위로 모니터링하였다. C11-6'SLN은 실험의 전체 과정에서 바이러스 복제를 완전히 예방한 반면, P8-6'SLN은 감염-후 처음 2일(dpi) 동안 바이러스 복제를 약간 감소시켰지만 그 이후에는 그렇지 않았다(도 11a).
또한, C11-6'SLN으로 처리된 조직에서, 바이러스 복제의 억제는 감염된 세포의 부재 및 처리된 조직의 원상태의 형태학에서도 반영되었는데, 이는 미처리 조직 또는 P8-6'SLN-처리된 조직과 현저히 달랐다(도 11b). 면역형광 이미지 및 정점 세척에서 락테이트 디히드로게나아제(LDH) 방출의 부족은 섬모 세포 층뿐만 아니라 생리학적 섬모 움직임 및 조직 무결성이 보존되었음을 입증하였다(도 11b 및 12). 완전히 대조적으로, 미처리 조직 또는 P8-6'SLN-처리된 대조군은, 섬모 세포 층의 변경으로 인한 두께의 감소, 및 감염된 세포의 존재를 나타냈다(도 11b). 처리된 조직에서 qPCR에 의해 검출된 잔류 바이러스의 수준이 감염성인 것을 배제하기 위해, 조직을 23일 동안 배양물에서 유지했지만 시간 경과에 따라 바이러스의 역가의 증가는 관찰되지 않은 반면, 미처리 조직은 지속적으로 바이러스를 배출하고 있었다(도 13). 중요하게는, 치료적 투여를 모방하기 위해 1 dpi에서 시작하여, C11-6'SLN (30 ㎍/조직)을 24시간 마다 4일 동안 투여한 더욱 엄격한 후-처리 조건에서도 생체외 실험을 수행하였다. 또한, 이들 조건에서, 나노입자는 현저한 억제 활성을 나타내어, 치료제로서의 잠재력을 증명하였다(도 11c). 동일한 생체외 모델에서, 매일 투여되는, 높은 용량의 C11-6'SLN의 생체적합성을 평가하였다. C11-6'SLN은 상술한 조건에서 어떠한 세포독성 또는 전-염증성 활성도 나타내지 않았다(도 14).
변형된 시클로덱스트린의 생체내 활성
생체내 실험은 BALB/c 마우스로 공동-처리 및 후-처리 조건 모두에서 수행되었다. 공동-처리 실험에서, 마우스에게 C11-6'SLN (25 ㎍/마우스) 및 A/NL/09 (100 감염성 입자/마우스)를 비강 내 경로를 통해 동시에 투여하였다. C11-6'SLN 투여가 감염된 동물의 생리학적 상태에 미치는 영향을 추정하기 위해 일일 단위로 마우스의 체온 및 체중을 측정하였다. 2 dpi에서, 마우스의 절반을 무작위로 안락사시키고 나머지 마우스를 C11-6'SLN으로 재처리하였다. 두 번째 군의 마우스는 4 dpi에 안락사시켰다. 바이러스의 역가는 기관지폐포 세척요법(BAL)으로 정량화되었다(도 15a). 처리된 마우스에서 감염-후 2일 및 4일에 바이러스의 역가의 상당한 감소가 관찰되었다(도 15a). C11-6'SLN의 항바이러스성 활성은 또한 미처리 마우스에 비해 체중 및 체온 모두의 상당한 보존과 함께 이환율을 상당히 감소시켰다(도 15b 및 15c). 종합적으로, 이들 결과는 C11-6'SLN 나노입자가 생체내 감염 및 폐에서 바이러스 확산을 방지하는 능력을 입증한다.
C11-6'SLN의 생체내 치료적 가능성은 후-처리 조건을 통해 평가되었다. 마우스를 A/NL/09 (100개의 감염성 입자/마우스)로 감염시킨 다음 3일 동안 매일 C11-6'SLN 6 hpi (14 ㎍/마우스)로 동일한 용량의 나노입자로 처리하였다(도 15d~f). 마우스의 체중 및 체온은 매일 측정하였다. C11-6'SLN은 후-처리 조건에서 덜 강력했지만, 여전히 감염의 진행을 지연시켰다. 처리된 마우스는 이환 징후의 감소(도 15d 및 15e) 및 더 나은 임상적 점수를 나타냈다. 감염된 동물의 생리학적 상태의 이러한 개선은 장기간의 생존과 연관성이 있다(도 15f).
방법
변형된 시클로덱스트린의 합성
화학물질: Neu5Acα(2,6)-Galβ(1-4)-GlcNAc-β-에틸아민 및 Neu5Acα(2,3)-Galβ(1-4)-GlcNAc-β-에틸아민은 TCI 화학에서 구입하였다. 헵타키스-(6-디옥시-6-머캅토)-베타-시클로덱스트린 및 카르복시메틸-베타-시클로덱스트린 나트륨 염은 시클로덱스트린-샵에서 구입하였다. 11-도데센산은 abcr GmbH에서 구입하였다. 14-펜타데센산은 라로단 AB에서 구입하였다. 말레이미드-PEG8-CH2CH2COOH는 퓨어PEG에서 구입하였다. 다른 모든 화학물질 및 용매는 시그마-알드리치에서 구입하였다.
방법: 인플루엔자 바이러스를 표적으로 하는 시클로덱스트린 유도체를 3 단계로 합성하였다. 첫 번째 단계는 리간드를 시클로덱스트린에 접합하는 것이었다. 두 번째 단계는 리간드의 -COOH 말단 기의 N-히드록시숙신이미드(NHS) 활성화였다. 세 번째 단계는 리간드에 SLN을 그래프팅하는 것이었다.
단계 1: 리간드로 β-시클로덱스트린의 변형
0.04 mmol 헵타키스-(6-디옥시-6-머캅토)-베타-시클로덱스트린을 5㎖의 DMSO 중의 알릴 및 카르복실산 말단-기를 함유하는 이-기능성 분자(리간드)(예컨대 6-헵텐산, 11-도데센산 또는 14-펜타데센산) 0.28 mmol과 함께, UV 램프(250W)의 존재 하에, 밤새 교반하였다. 생성된 헵타키스-(6-디옥시-6-알칸산티온)-베타-시클로덱스트린 유도체를 원심분리에 의해 DCM-디에틸 에테르 혼합물로부터 침전시키고 진공 하에 건조시켰다.
PEG8 스페이서로 β-시클로덱스트린을 변형하기 위해, 0.04 mmol 헵타키스-(6-디옥시-6-머캅토)-베타-시클로덱스트린을 5 ㎖의 인산염 완충액(pH: 6.8) 중의 0.28 mmol의 말레이미드-PEG8-CH2CH2COOH와 함께, 밤새 교반하였다. 변형된 β-시클로덱스트린은 투석으로 정제하고 동결건조로 건조시켰다.
단계 2: NHS 활성화 반응
단계 1에서 수득된 시클로덱스트린 유도체 0.04 mmol을, 각각, 5 ㎖의 DMSO 중의 1.12 mmol N-히드록시숙신이미드(NHS), 0.56 mmol 에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC-hcl) 및 0.02 mmol 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)과 함께, 밤새 교반하였다. 생성된 NHS-활성화된 시클로덱스트린 유도체는 먼저 빙냉수에서 침전시킨 후, 아세토니트릴 및 디에틸 에테르로 세척하였다. 생성물을 진공 하에 건조시켰다.
C1-6'을 수득하기 위해, 단계 1을 생략하고 NHS 활성화 반응을 바로 수행하였다. 카르복시메틸-베타-시클로덱스트린 나트륨 염(0.04 mmol)을 1.12 mmol NHS 0.56 mmol EDC-hcl로 바로 활성화하고 0.02 mmol DMAP를 첨가하였다. 활성화 반응을 밤새 수행하였다. 생성된 시클로덱스트린 유도체는 먼저 DCM-디에틸 에테르 혼합물로부터 침전시키고 추가로 3회 세척하였다. 생성물을 진공 하에 건조시켰다. 6'SLN 그래프팅은 단계 3과 동일한 방식으로 수행하였다.
단계 3: 트리사카라이드 그래프팅
5.6 μmol Neu5Acα(2,6)-Galβ(1-4)-GlcNAc-β-에틸아민 (C11-3'의 경우 Neu5Acα(2,3)-Galβ(1-4)-GlcNAc-β-에틸아민)을 단계 2에서 수득된 1.6 μmol의 시클로덱스트린 유도체와 혼합하였다. 15 μmol 트리에틸아민(TEA)을 첨가하고 1 ㎖ DMSO 중에서 반응을 밤새 수행하였다. 반응 생성물을 0.01 M 인산염 완충액(pH: 7.5)으로 희석하고 아미콘 필터(MWCO: 3k)를 사용하여 농축시켰다. 생성된 헵타키스-(6-디옥시-6-SLN-에틸카르복사미도-알킬티오)-베타-시클로덱스트린 유도체를 증류수로 추가로 세척하고 동결건조로 건조시켰다. 리간드-변형된 시클로덱스트린 상에 트리사카라이드의 그래프팅은 1H 및 DOSY NMR 연구로 확인되었다(도 16 및 17).
C15-6'SLN 변형된 시클로덱스트린의 합성
β-CD의 C15 변형: 5㎖의 DMSO 중의 55 ㎎의 티올 변형된 β-CD 및 70 ㎎의 14-펜타데센산을 UV 광 하에서 밤새 교반하였다.
C15-β-CD의 NHS 활성화: 생성된 물질을 DMF 중의 100 ㎎ NHS, 75 ㎎의 EDC 및 2.5 ㎎의 DMAP를 사용하여 밤새 활성화하였다. NHS-활성화된 C15-β-CD는 빙냉수에서 침전시키고 추가로 3회 세척하였다. 마지막 침전은 아세토니트릴에서 수행되었다.
C15-β-CD 상에 6'SLN 그래프팅: 5 ㎎ C15-β-CD 및 5 ㎎ 아민 기능화된 6'SLN 및 3 ㎎ TEA를 DMSO 중에서 밤새 교반하였다. 생성된 물질은 아미콘 필터를 사용하여 깨끗이 하였다.
PEG 나노입자의 합성
PEG(5) NP의 합성: 15 ㎖의 EtOH 중의 88.6 ㎎의 테트라클로로아우르(3)산 트리히드레이트(HAuCl4*3H2O)를 5 ㎖의 EtOH 중의 56 ㎎의 HS-PEG(5)와 10분 동안 혼합하였다. 37.5 ㎖의 EtOH 중의 94.6 ㎎의 나트륨 보로히드레이트(NaBH4)를 혼합물에 적가하였다. 완전한 NP 형성을 위해, 밤새 반응을 수행하였다. 생성된 NP는 EtOH-H2O 용매 혼합물을 사용하여 아미콘 필터로 깨끗이 하였다.
PEG(5)-C15 혼합된 리간드 NP: DMF 중의, 1.5 ㎎의 16-머캅토헥사카노산(16-mercaptohexacanoic acid)(HS-C15-COOH) 및 20 ㎎의 PEG(5) NP를 사용하여 리간드 교환 반응을 밤새 수행하였다. NP는 DMF-디에틸 에테르 혼합물로부터 침전시키고 추가로 3회 세척하였다.
NP의 NHS 활성화: 15 ㎎의 NP를, DMF 중의 10 ㎎ N-히드록시숙신이미드 에스테르(NHS), 2 ㎎의 에틸카르보디이미드 히드로클로라이드(EDC) 및 0.1 ㎎의 4-(디메틸아미노)-피리딘(DMAP)을 사용하여 밤새 활성화하였다. 생성된 NP는 DMF-디에틸 에테르 혼합물로부터 침전시키고 추가로 3회 세척하였다.
NP 상에 6'SLN 그래프팅: 1 ㎖의 DMSO 중의 5 ㎎의 NHS-활성화 NP를 3 ㎖의 0.1 M 인산염 완충액(pH: 7.5) 중의 1.7 ㎎의 아민 기능화된 6'SLN과 혼합하였다. 5시간 반응 후, 6'SLN 그래프팅된 NP를 아미콘 필터로 깨끗이 하였다.
생물학적 분석
물질: DMEM-글루타맥스 배지는 써모 피셔 싸이언티픽(Thermo Fischer Scientific)에서 구입하였다. 세척 완충액으로서 트윈 20® 및 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 정제는 시그마 알드리치에서 구입하였다. 1차 항체(인플루엔자 A 단일클론성 항체)는 라이트 디아그노스틱스(Light Diagnostics)에서 구입하였다. 2차 항체(항-마우스 IgG, HRP-연결된 항체)는 셀 시그널링 테크놀로지®에서 구입하였다. 전자 커플링 시약 (페나진 에토설페이트; PES) 및 테트라졸륨 화합물 [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨, 내염; MTS]을 함유하는 셀타이터 96® AQueous 원 솔루션 세포 증식 분석은 프로메가(Promega)에서 구입하였다.
세포 배양:
MDCK(마딘-다비 개 신장 세포) 세포주는 ATCC(아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션, 록빌, MD)에서 구입하였다. 세포는 10% 소태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 글루코오스 보충제(DMEM+GlutaMAX™)가 있는 둘베코의 변형된 이글(Eagle) 배지에서 배양하였다. MDCK 세포주는 37℃에서 CO2(5%)와 함께 습윤 분위기에서 성장시켰다.
바이러스 균주:
HSV-2의 임상적 단리물은 원래 M. Pistello 교수(이탈리아 피사 대학교)에 의해 제공받았고 베로(Vero) 세포에 대한 플라크 분석에 의해 번식 및 적정되었다. H1N1 Neth09 및 B Yamagata는 M. Schmolke 교수(제네바 대학)의 친절한 선물이었다. 조류 균주 NIBRG-23 (A/turkey/Turkey/1/2005 H5N1 표면 단백질 및 A/PR/8/34 (H1N1) 백본을 사용하여 역 유전학에 의해 제조됨)은 생물 표준 및 통제 국립 연구소(National Institute for Biological Standards and Controls), 포터스 바, 영국으로부터 수득하였고 생후 10일령의 발육 계란에서 추가로 성장시킨 후 바이러스 정제 및 특성화를 수행하였다. 제네바 대학 병원에서 익명화된 환자로부터 임상적 샘플을 제공받았다. 모든 인플루엔자 균주는 TPCK-처리된 트립신(0.2 ㎎/㎖)의 존재 하에 MDCK 세포에 대한 ICC에 의해 번식 및 적정되었다.
세포 생존율 분석
세포 생존율은 MTS [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨] 분석에 의해 측정하였다. 96-웰 플레이트에 분주된 포화된(confluent) 세포 배양물을 항바이러스성 분석에 대해 설명된 동일한 실험 조건 하에서 상이한 농도의 나노입자 또는 리간드와 함께 삼중으로 인큐베이션하였다. 제조업체의 지침에 따라 셀타이터 96 증식 분석 키트 (프로메가, 매디슨, WI, 미국)에 의해 세포 생존율을 결정하였다. 흡광도는 490 ㎚에서 마이크로플레이트 리더(모델 680, BIORAD)를 사용하여 측정하였다. 상이한 농도의 나노입자 또는 시클로덱스트린이 세포 생존율에 미치는 효과는, 처리된 세포의 흡광도를 배양 배지만으로 인큐베이션된 세포의 흡광도와 비교하여, 백분율로 표시하였다. 50% 세포독성 농도(CC50) 및 95% 신뢰 구간(CI)은 프리즘 소프트웨어(그래프-패드 소프트웨어, 샌디에고, CA)를 사용하여 결정되었다.
억제 분석
MDCK 세포를 96-웰 플레이트에 24시간 전에 미리-배치하였다. 증가하는 농도의 물질을 인플루엔자 바이러스(MOI: H5N1의 경우 0.02 또는 0.01이고 다른 바이러스의 경우 0.1)와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 혼합물을 세포에 첨가하였다. 바이러스 흡착(37℃에서 1시간) 후, 바이러스 접종물을 제거하고, 세포를 세척하고 새로운 배지를 첨가하였다. 37℃에서 24시간 인큐베이션한 후, 면역세포화학(ICC) 분석으로 감염을 분석하였다. 세포를 고정하고 메탄올로 투과하였다. 이후 1차 항체(1:100 희석)를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척 완충액(DPBS+트윈 0.05%)으로 3회 세척하고; 이후 2차 항체(1:750 희석)를 첨가하였다. 1시간 후 세포를 세척하고 DAB 용액을 첨가하였다. 감염된 세포를 계수하고 감염된 세포의 수를 처리 및 미처리 조건에서 비교하여 감염의 백분율을 계산하였다.
H5N1의 경우, 유동 세포분석-기반 억제 분석을 추가로 수행하였다. MDCK 세포를 24-웰 플레이트(75,000 세포/웰)에 24시간 전에 미리-배치하였다. 증가하는 농도의 물질을 인플루엔자 바이러스(MOI: 0.04)와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 혼합물을 세포에 첨가하였다. 바이러스 흡착(37℃에서 1시간) 후, 바이러스 접종물을 제거하고, 세포를 세척하고 새로운 배지를 첨가하였다. 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션한 후, 유동 세포분석으로 감염을 분석하였다. 간단히 말해서, 세포를 트립신화하고 실온에서 15분 동안 IC 고정 완충액(써모 피셔 싸이언티픽, 네덜란드)을 사용하여 고정한 후 4℃에서 15분 동안 1X IC 투과 완충액(써모 피셔 싸이언티픽, 네덜란드)을 사용하여 투과시켰다. 세포를 4℃에서 30분 동안 항-인플루엔자 A 바이러스 핵단백질 마우스 단일클론성 항체 [D67J] (FITC) (압캠 ab210526, 네덜란드)로 염색하였다. 항체 희석은 투과 완충액에서 1:80이었고 튜브 당 50㎕를 첨가하였다. FACS 분석은 FACS 칼리버 3 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 감염된 세포의 수를 50% 감소시키는 농도(유효 농도 (EC50))는 프리즘 소프트웨어를 사용하여 결정되었다. FACS에 대한 게이팅 전략은 도 18에 나타낸 바와 같이 수행되었다. FSC/SSC를 기반으로 첫 번째 게이팅을 수행한 후 FITC에 대한 네거티브 게이트를 만들었다. 이 게이팅을 나머지 샘플에 적용하였다.
H7N1 감염성은 루시퍼라아제 활성을 통해 평가하였다. MDCK 세포를 96-웰 플레이트에 5×104로 분주하였다. 24시간 후, 배지를 무-혈청 배지로 교체하였다. 증가하는 농도의 C11-3'을 나노루시퍼라아제를 암호화하는 100 pfu의 H7N1 A/Turkey/Italy/977/1999와 함께 인큐베이션하였다. 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 세포에 첨가하여 37℃에서 1시간 더 인큐베이션하였다(웰당 100㎕). 세포를 세척하고 배지를 1 ㎍/㎖ TPCK-트립신이 있는 무-혈청 배지로 교체하였다. 감염 후 24시간에, 세포를 세척한 후 PBS 중의 1/2 희석된 나노 글로® 루시퍼라아제 분석 완충액(프로메가)의 웰당 40㎕로 용해시켰다. 루시퍼라아제 활성은 테칸 인피니트 M200PRO 플레이트 리더를 사용하여 세포 용해물에서 측정하였다: PBS 중의 1/5000 희석된 나노 글로® 루시퍼라아제 분석 기질(프로메가) 15㎕를 각 웰에 대해 15㎕의 용해물에 첨가하였다.
살바이러스 분석
바이러스 (초점 형성 단위(ffu): 105/㎖) 및 시험 물질(EC99 농도, 표 7)을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 미처리 대조군과 함께 바이러스-물질 복합체의 연속 희석을 수행하고 세포로 옮겼다. 1시간 후, 혼합물을 제거하고 새로운 배지를 첨가하였다. 다음날, ICC 분석으로 바이러스의 역가를 평가하였다. ICC 분석의 경우, 전술한 바와 동일한 절차를 따랐다.
시험관내 바이러스 분석이 수행된 물질 농도.
물질 농도 (㎍/㎖)
A/Netherlands/2009 H1N1 C6-6' 100
C11-6' 100
C14-6' 100
P8-6' 500
C11-3' 500
NPs C15-6'SLN 100
NPs PEG4-6'SLN 500
A/Singapore/2004 H3N2 C11-6' 100
B/Wisconsin/2010 C11-6' 200
데이터 분석
모든 결과는 중복으로 수행된 3개의 독립적인 실험의 평균 값으로 제시된다. 억제 곡선에 대한 EC50 값은 그래프패드 프리즘 버전 5.0(그래프패드 소프트웨어, 샌디에고, 캘리포니아, 미국) 프로그램을 사용하여 회귀 분석에 의해 계산하여 가변 기울기-시그모이드 용량-반응 곡선을 적합하였다.
생체외
공동-처리 1번: H1N1 Neth/09 균주 (pfu: 104~105) 및 CD-C15-6'SLN (400㎍/㎖)을 동시에 머실에어 (인간 기도 상피의 재현)에 첨가하였다. 4시간 후, 상청액을 제거하고 새로운 배지를 첨가하였다. 상청액의 바이러스의 역가를 qPCR로 24시간마다 추적하였다.
공동-처리 2번: 시험관내에 재현된 인간 기도 상피인, 머실에어 조직 (에피텔릭스
Figure pct00006
, 제네바, 스위스)을 건강한 기증자로부터 유래한 비강 폴립 상피 세포의 혼합물로부터 공기-액체 계면에서 배양하였다. 인플루엔자 H1N1 pdm 2009 임상적 균주 (1e4 rna 사본/조직) 및 C11-6'(50 ㎍/조직)을, 미처리 대조군과 함께, 사전-인큐베이션 없이 조직으로 옮겼다. 4시간의 인큐베이션 시간 후, 조직을 2회 세척하였다. 일일 단위로, 기초 배지를 변경하였다. 매일 qPCR 측정을 수행하기 위해, 200 ㎕의 배지를 조직에 첨가하고 20분 후에 수집하였다. EZNA 바이러스 추출 키트(오메가 바이오텍)로 추출된 RNA는 스텝원 ABI 써모사이클러에서 퀀티테크 키트(#204443; 퀴아젠, 힐덴, 독일)로 qPCR을 사용하여 정량화하였다.
후-처리: 머실에어 조직을 H1N1 pdm 2009 (1e4 사본/조직)로 감염시켰다. 4시간 후 접종물을 제거하고 조직을 세척하였다. 20시간 후 20' 동안 정점 세척을 수행한 다음 C11-6'(30㎍/조직), 또는 미처리 조직 내 동일 부피의 배지를, 정점에 첨가하였다. 20' 정점 세척 후 매일 C11-6'의 새로운 첨가를 수행하였다. 이후 RNA를 추출하고 전술한 바와 같이 qPCR을 수행하였다. 독성 연구를 위해 바이러스의 부재 하에 유사한 절차를 수행하였다.
면역형광
인플루엔자 감염된 세포는 인플루엔자 A 항체 (라이트 디아그노스틱)로 직접 검출하였고 베타 튜불린 1차 토끼 항체(압캠)를 섬모 세포의 마커로서 사용하였다. 알렉사(Alexa) 488-염소 항-토끼 Ab 및 알렉사 594-염소 항-마우스 Ab (라이프 테크놀로지)를 2차 Ab로서 사용하고 핵을 DAPI로 염색하였다. 자이스 LSM 700 메타 공초점 현미경으로 이미지를 획득하고 이마리스(Imaris)로 처리하였다.
락테이트 디히드로게나아제 분석(LDH)
기초 배지에서의 LDH 방출은 세포독성 검출 키트(로쉐 04744926001)로 측정하였다.
MTT 분석
MTT 용액을 머실에어 배지(1㎎/㎖)로 희석하고 300㎕를 24 웰 플레이트에 기본으로 첨가하였다. 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션한 후 조직을 새로운 플레이트로 옮기고 1㎖의 DMSO로 용해시켰다. 상청액을 570 ㎚에서 판독하였다. 처리된 조직 및 미처리 조직을 비교하여 생존율의 백분율을 계산하였다.
ELISA
인터류킨-6(IL-6), CXC 모티프 케모카인 10(CXCL10 또는 IP-10), CC 모티프 케모카인5(CCL5 또는 RANTES), 인터류킨-8(IL-8 또는 CXCL-8) 및 인터페론 람다(IL-29/IL-28B)는 다양한 농도의 CD로 매일 처리한 후 ELISA (R&D DY206-05, DY266-05, DY278-05, DY208-05 및 DY1598B-05)에 의해 기초 배지에서 측정하였다.
생체내
전-처리: 5 마리 BALB/c 마우스의 4개 군을 0일에 50㎕의 PBS 또는 C11-6'(50㎕ 중의 25㎍)로 처리하고 즉시 A/NL/09(102 ffu)로 접종하였다. 일일 단위로, 마우스의 체온 및 체중을 측정하였다. 감염 2일 후, 마우스 2개 군을 희생시켰다(한 군은 pbs로 다른 군은 C11-6'로 처리됨). 폐 균질물 및 코 점막 및 기관지폐포 세척을 수집하여 qPCR 측정을 통해 바이러스의 역가를 정량화하였다. C11-6' 처리 군은 동일한 양의 나노입자로 재처리하였다. 2일 후, 나머지 모든 마우스를 희생시키고, 폐 균질물 및 코 점막을 수집하였다. 조직 파괴 후, 트리졸로 RNA를 추출하고 qPCR을 사용하여 정량화하고 BAL은 플라크 분석을 수행하였다. 2개의 독립적인 실험을 수행하였다.
후-처리: 10 마리 BALB/c 마우스의 2개 군을 A/NL/09(102 ffu)로 감염시키고 감염-후 6시간에 처리하고 이어서 7일 동안 매일 처리하였다. 마우스의 체온 및 체중을 매일 측정하였다. 생존 연구 동안 인간 종점(Humane endpoint)이 사용되었다: 체중이 시작 체중의 75%로 감소했을 때 자궁 탈구로 마우스를 안락사시켰다. 또한, 빈사 상태(반응이 없고 자극을 인식하지 못함)에 도달한 동물도 안락사시켰다.
용량-반응 분석
고정 바이러스 농도(ffu: 103)를 다양한 용량의 나노입자와 함께, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 혼합물을 세포로 옮겼다. 1시간 후, 혼합물을 제거하고 세포를 세척하였다. 다음 날, 면역세포화학(ICC) 분석으로 감염을 분석하였다.
참조문헌
1. Mammen, M., Choi, S.-K. & Whitesides, G. M. Polyvalent Interactions in Biological Systems: Implications for Design and Use of Multivalent Ligands and Inhibitors. Angew. Chem. Int. Ed. 37, 2754-2794 (1998).
2. Reuter, J. D. et al. Inhibition of Viral Adhesion and Infection by Sialic-Acid-Conjugated Dendritic Polymers. Bioconjug. Chem. 10, 271-278 (1999).
3. Papp, I. et al. Inhibition of Influenza Virus Infection by Multivalent Sialic-Acid-Functionalized Gold Nanoparticles. Small 6, (2010).
4. Papp, I. et al. Inhibition of Influenza Virus Activity by Multivalent Glycoarchitectures with Matched Sizes. ChemBioChem 12, 887-895 (2011).
5. Tang, S. et al. Antiviral Agents from Multivalent Presentation of Sialyl Oligosaccharides on Brush Polymers. ACS Macro Lett. 5, 413-418 (2016).
6. Kwon, S.-J. et al. Nanostructured glycan architecture is important in the inhibition of influenza A virus infection. Nat. Nanotechnol. 12, 48-54 (2017).

Claims (18)

  1. 코어 및 상기 코어에 공유적으로 연결된 다수의 리간드를 포함하는 살바이러스 나노입자로서,
    상기 리간드의 적어도 일부는 트리사카라이드 모이어티를 포함하고, 여기서:
    - 상기 코어는 시클로덱스트린이고,
    - 상기 리간드는 동일하거나 상이하고 선택적으로 치환된 알킬계 리간드이고, 및
    - 각각의 트리사카라이드 모이어티는 3-시알릴-N-아세틸락토오스아민(3'SLN) 및 6-시알릴-N-아세틸락토오스아민(6'SLN)으로부터 선택되는 살바이러스 나노입자.
  2. 청구항 1에 있어서,
    시클로덱스트린은 알파-시클로덱스트린, 베타-시클로덱스트린, 감마-시클로덱스트린, 또는 이의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 살바이러스 나노입자.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    상기 리간드는 선택적으로 치환된 C4-C30 알킬계 리간드인 살바이러스 나노입자.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 리간드는 선택적으로 치환된 C6-C15 알킬계 리간드 화합물인 살바이러스 나노입자.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 리간드의 일부 또는 전부는 3'SLN을 포함하고, 상기 리간드의 일부 또는 전부는 6'SLN을 포함하고, 상기 리간드의 전부가 아닌 일부는 트리사카라이드 모이어티를 포함하지 않는 살바이러스 나노입자.
  6. 식 (I)로 표시되는 살바이러스 나노입자:
    Figure pct00007

    여기서
    m은 2~8이고, 및
    n은 2~28 또는 4~13이다.
  7. 청구항 6에 있어서,
    시클로덱스트린은 알파-시클로덱스트린, 베타-시클로덱스트린, 및 감마-시클로덱스트린을 포함하는 군으로부터 선택되는 살바이러스 나노입자.
  8. 청구항 6 또는 7에 있어서,
    m은 3 또는 4인 살바이러스 나노입자.
  9. 식 (II)로 표시되는 살바이러스 나노입자 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    Figure pct00008

    여기서:
    각각의 R은, 독립적으로, 선택적으로 치환된 알킬계 리간드이고, 여기서 상기 리간드 중 적어도 2개는 3-시알릴-N-아세틸락토오스아민(3'SLN) 및 6-시알릴-N-아세틸락토오스아민(6'SLN)을 포함하는 군으로부터 선택되는 트리사카라이드 모이어티를 가지거나, 또는 상기 리간드 중 적어도 하나는 3'SLN을 가지고 다른 하나는 6'SLN을 가지고;
    각각의 R'은, 독립적으로, H, -(CH2)y-COOH, -(CH2)y-SO3 -, 중합체 또는 수용화 모이어티이고;
    x는 6, 7 또는 8이고; 및
    y는 4~20의 정수이다.
  10. 청구항 9에 있어서,
    R'은 H인 살바이러스 나노입자.
  11. 청구항 9 또는 10에 있어서,
    상기 알킬계 리간드는 선택적으로 치환된 C4-C30 알킬계 리간드인 살바이러스 나노입자.
  12. 청구항 9 내지 11 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 알킬계 리간드는 6'SLN을 포함하는 선택적으로 치환된 C6-C15 알킬계 리간드인 살바이러스 나노입자.
  13. 유효량의 하나 이상의 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항의 살바이러스 나노입자 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
  14. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서,
    인플루엔자 바이러스 감염 및/또는 인플루엔자 바이러스와 관련된 질환을 치료 및/또는 예방하는 데 사용하기 위한 살바이러스 나노입자.
  15. 유효량의 하나 이상의 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항의 살바이러스 나노입자 및 선택적으로 적어도 하나의 적합한 에어로졸 담체를 포함하는 살바이러스 조성물.
  16. 청구항 13 또는 15 중 어느 한 항의 살바이러스 조성물, 또는 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항의 살바이러스 나노입자를 사용하는 것을 포함하는 소독 및/또는 멸균 방법.
  17. 청구항 13 또는 15 중 어느 한 항의 살바이러스 조성물, 또는 하나 이상의 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항의 살바이러스 나노입자 및 상기 살바이러스 조성물 또는 살바이러스 나노입자를 적용 또는 분배하기 위한 수단을 포함하는 장치.
  18. 멸균 및/또는 소독을 위한 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항의 살바이러스 나노입자 또는 청구항 13 또는 15의 살바이러스 조성물의 용도.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220159997A (ko) 2020-03-30 2022-12-05 에꼴 뽈리떼끄닉 뻬데랄 드 로잔느 (으뻬에프엘) 살바이러스 조성물 및 이의 용도
CN113984747B (zh) * 2021-10-21 2024-04-05 南京理工大学 一种金纳米阵列表面修饰唾液酸的方法
WO2024086510A1 (en) * 2022-10-17 2024-04-25 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Virucidal compounds and use thereof

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
EP2230249A3 (en) * 2003-02-06 2010-12-22 ChronTech Pharma AB Antigen/antibody or ligand/receptor glycosylated specificity exchangers
CN101511385A (zh) * 2006-09-11 2009-08-19 诺华有限公司 不使用蛋制备流感病毒疫苗
US8450441B2 (en) * 2007-06-28 2013-05-28 National University Corporation Shizuoka University Synthetic N-linked sialo-glycan-containing polymer and method for producing the same
JP2009001805A (ja) * 2008-07-04 2009-01-08 Okura Ind Co Ltd ポリアミド系電子写真用部材
AU2008362921B2 (en) * 2008-10-13 2012-07-26 Semiotik Llc Multiligand constructs
FR2967677B1 (fr) * 2010-11-18 2014-05-16 Centre Nat Rech Scient Derives de polysaccharides comprenant un motif alcene et reaction de couplage par chimie thio-clic
IL255944B (en) * 2015-05-27 2022-07-01 Univ Northwestern Carbohydrate-modified particles and particle compositions for immune response modulation
CA3031413A1 (en) * 2016-07-22 2018-01-25 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) Virucidal compounds and uses thereof
CN110312529A (zh) * 2016-08-18 2019-10-08 纳诺医药有限公司 包含核心和结合至核心表面的唾液酸、唾液酸乳糖或其衍生物的缀合物及其用途
US20200166506A1 (en) * 2017-04-28 2020-05-28 National University Corporation Tokyo Medical And Dental University Modified nanoparticle, dispersion containing modified nanoparticle, set for resistive pulse sensing, set and reagent for detecting virus or bacterium, and method for detecting virus or bacterium

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