JP5597160B2 - 抗ウイルス剤及びその製法 - Google Patents
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Description
この乾燥したコッコミクサ藻体を揮発性の溶剤と一緒に超音波振とう遠心濃縮機により振とう及び遠心分離を行なうと共に、揮発性の溶剤で複数回の脱脂操作を行い、その後、所要時間に亘り熱湯抽出し、該熱湯抽出物を遠心分離により固液分離し、分離した液層を濃縮し凍結乾燥して第1の発明に係る中性の熱水抽出物を得る。
次に、実施例及び試験例により本発明を更に詳細に且つ具体的に説明する。
[コッコミクサの水溶性多糖体の抽出方法]
乾燥したコッコミクサ藻体2gに100mlのベンゼン:メタノール(2:1)からなる揮発性溶剤を入れ、超音波処理を10分行った後、50℃に加温した状態で3時間振とう及び遠心分離を行なった後に、同様の揮発性溶剤、即ち、ベンゼン:メタノール(2:1)を100ml入れて脱脂操作を少なくとも3回繰り返して行ない、遠心分離により溶剤を除去する。
この脱脂後のパウダー状になったものに100mlの水を加え、90℃に加熱して3時間撹拌抽出した。所要時間保冷後に遠心分離(3000rpm)を行って固液分離した。分離して回収した液層は濃縮し、該濃縮液を凍結乾燥して中性多糖体(推定)の乾燥粉末を得た。つまり、コッコミクサから0.26gの熱水抽出物(CmNE)を得た。
凍結乾燥物をPBSに溶解し、除タンパク及び脂質除去を行なった後透析チューブにて透析し、透析チューブ内試料を凍結乾燥した。
なお、複数回の脱脂処理を行うことによって有効成分中の大半の脂質が除去される。
前記水溶性多糖体の抽出工程で遠心分離後に得られた固層(含水率75%)に水1Lを加え、所要のアルカリ溶液、例えば、10%KOHにてpH9〜11に調整した。調整した液を60℃に加温して30分間撹拌抽出を行なった。所要時間保冷後に遠心分離(15000rpm)し液層を回収した。回収した液に所要の酸性溶液、例えば、10%HClを添加しpH4に調整し浮遊物を確認した後、沈殿物を得るために4℃で12時間静置した。沈殿物は遠心分離(15000rpm)し固形物として回収した。この固形物の回収操作、即ち、加水、撹拌洗浄、遠心分離を3回繰り返して得られた洗浄後の沈殿物を凍結乾燥し、酸性多糖体(推定)を得た。つまり、コッコミクサから0.1gのアルカリ抽出物(CmAE)を得た。
その後、凍結乾燥物をPBSに溶解し、除タンパク及び脂質除去を行なった後透析チューブにて透析し、透析チューブ内試料を凍結乾燥した。
乾燥物を、Tris-HClに懸濁し、クロロホルム:メタノールで脱脂処理を行った後、DEAEカラムにて分画処理した。
抽出物の有効成分は、ガラクトース、マンノース、グルコース、キシロース、N-アセチルグルコサミン、フコース等からなる脱脂された純度の高い多糖体である。
検体として、本発明で得たコッコミクサのアルカリ抽出物(CmAE)を用いて、抗インフルエンザウイルス活性を検証した。そのアルカリ抽出物をDPBS(-)で高濃度(10mg/ml)溶液を調整し、該溶液を段階的に希釈することで試験した。
試験のために入手したA型ヒトインフルエンザウイルス(IFV)については、第1グループとして、新型及び現在流行中の季節性インフルエンザウイルスと、第2グループとして過去に流行した季節性インフルエンザウイルスとに分けられる。
第1グループ:
1) A/California/07/2009(H1N1)pdm : H1N1亜型(2009年新型)
2) A/Narita/1/2009(H1N1)pdm : H1N1亜型(2009年新型)
3) A/Brisbane/59/2007(H1N1) : H1N1亜型(流行中の季節性)
4) A/Uruguai/716/2007(H3N2) : H3N2亜型(流行中の季節性)
第2グループ:
1)A/WSN/1933/H1N1 : H1N1亜型(古典的な季節性)
2)A/USSR/1977/H1N1 : H1N1亜型(古典的な季節性)
3)A/Adachi/1957/H2N2 : H2N2亜型(古典的な季節性)
4) A/Aichi/1968/H3N2 : H3N2亜型(古典的な季節性)
インフルエンザウイルス(IFV)の感染実験で繁用される成犬の腎臓から樹立された上皮様細胞株であるMDCK(Mardin-Darby canine kindney )細胞を使用した。細胞は10%FBSを含むDMEM液体培地で37℃、5%CO2で継代培養したものを使用した。
MDCK細胞を96well plate(ウェルプレート)へ播種し、12時間培養して細胞を吸着させた後、新鮮なMEM−10%FBSに培地交換した。その際、高濃度に調整したアルカリ抽出物の溶液を各終濃度になるように添加した。溶液添加後、37℃の5%CO2インキュベーターで48時間培養した時点で終濃度500ug/mlとなるようMTTを添加し、同条件のインキュベーター内で3時間培養し色素を取り込ませた。その後、色素を含む培地を取り除き、DMSO(100ul/well)を加え沈殿を溶解し570nmの吸光度を測定した。予め作成しておいて検量線を元に細胞のviabiltyを決定した。
48well plate(ウェルプレート) に培養したMDCK細胞を前記アルカリ抽出物の溶液(10−2000ug/ml)で2時間処理後、6PFU(プラーク形成単位)/細胞でインフルエンザウイルスを感染させ、感染48時間後に収穫した。ウイルス量は鶏赤血球凝集試験(HA test)にて測定し、赤血球濃度からウイルス粒子数を換算し、増殖阻止活性を評価した。
図1(1)に示したように、96ウェルを12列8行(A〜H)に整列して並べて、
1) 各ウェルに生理食塩水を50ulずつ添加する。
2) 前記第1と第2グループの8種類の各ウイルスサンプル液50ulを採って、第1列Aから順にH行まで添加する。第1列のウェルA〜Hだけが計100ulとなる。
3) 2倍段階希釈:第1列の各ウェルの溶液をピペッティングにより混和した後、50ulだけ吸い取り、これを次の第2列のウェルに加える。第2列のウェルが100ulになるが、第1列と同様にピペッティングで混和した後、50ulだけ吸い取りこれを次の第3列のウェルに加える。この操作を第3列以降のウェルについても順次行うことにより、2倍段階希釈列を作成する。
4) 1%鶏赤血球を50ulずつ第12列から第1列まで加える。AからH行全てについて行なう。
5) 血球凝集を起こしたサンプル希釈液の最大希釈倍数をもってそのサンプル原液のHA価(血球凝集価)とする。
1) HA価(血球凝集価):血球凝集を起こしたサンプル希釈液の最大希釈倍数をもってそのサンプル原液のHA価とする。
2) 即ち、上記のHA価は、28=256となる。
3) 1%cRBC=(1×107 cells/ml)を使用して上記結果を得た場合、サンプル原液のウイルス濃度は、28×(1×107)=256×107=2.6×109粒子/mlとなる。
I. MDCK細胞をCmAEでウイルス感染前に3時間処理した場合。
II. ウイルス感染中のみにCmAEが培地中に存在した場合。
III. ウイルス感染中から48時間後にCmAEが存在した場合。
IV. 感染処理後3時間以降にCmAEが培地中に存在した場合。
V. 感染処理後6時間以降にCmAEが倍地中に存在した場合。
なお、本願発明の抗ウイルス剤における抽出物(CmAEおよびCmNE)中の脂質除去による抗ウイルス効果について、IFVはエンベロープ(外套)という脂質をまとった構造物であり、該エンベロープという脂質と好んで相互作用するように、抽出物中の抗IFV活性物質における脂質をできるだけ多く除去しておくことで、両者間の相互作用がより有効に活性化するのであり、また、IFV以外の脂質にも作用するはずであるから、他のウイルスにも有効に作用すると考えられる。
Claims (4)
- A型ヒトインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性を有する抗ウイルス剤の製法であって、
微細藻類のコッコミクサと、ベンゼン:メタノール(2:1)からなる揮発性溶剤とを一緒にして超音波振とう及び遠心分離を行なう工程と、
揮発性溶剤で脱脂操作を複数回行なう工程と、
脱脂工程後に所要量の水を加え所要時間に亘って加熱し熱湯抽出する工程と、
熱湯抽出物を遠心分離により固液分離した液層を濃縮し乾燥する工程とからなること
を特徴とする抗ウイルス剤の製法。 - 前記請求項1で固液分離された固層に所要量の水と所要のアルカリ溶液とを加えてアルカリ性に調整し撹拌して抽出を行なう工程と、
抽出を行なった後に遠心分離にて固液を分離して液層を回収する工程と、
回収した液層に所要の酸性溶液を加えて酸性に調整し所要時間静置して沈殿物を生成させる工程と、
該沈殿物を遠心分離して固形物として回収すると共に、回収された固形物を複数回洗浄操作を行なう工程と、
洗浄後の沈殿物を凍結乾燥させる工程とからなること
を特徴とする抗ウイルス剤の製法。 - 前記請求項1乃至2のいずれかによって得られた微細藻類のコッコミクサより抽出された多糖体画分を有効成分とするものであって、
該有効成分中の大半の脂質が除去されたものであり、少なくとも新型(2009年新型)及び季節性のA型ヒトインフルエンザウイルスに対する抗ウイルス活性を有すること
を特徴とする抗ウイルス剤。 - 前記多糖体画分の有効成分が、ガラクトース、マンノース、グルコース、キシロース、N-アセチルグルコサミン、フコースを主成分とすること
を特徴とする請求項3に記載の抗ウイルス剤。
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