JP4748154B2 - 新規微細藻類及び炭化水素の生産方法 - Google Patents
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Description
本発明は、炭化水素生産能を有する新規微細藻類、及び微細藻類を用いる炭化水素の生産方法に関する。
これまで炭化水素生産能を有する細菌についていくつかの報告がある。例えば、炭素源を基質としてＣ１４〜Ｃ２２のｎ−アルカンを産生するビブリオ・フルニッシー（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｕｒｎｉｓｓｉｉ）Ｍ１（ＦＥＲＭ Ｐ−１８３８２）（Ｍ．−Ｏ．Ｐａｒｋ，Ｍ．Ｔａｎａｂｅ，Ｋ．Ｈｉｒａｔａ，Ｋ．Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈａｔ ｐｒｏｄｕｃｅｓ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｌｙ ｗｈｉｃｈ ａｒｅ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｔｏ ｌｉｇｈｔ ｏｉｌ，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５６（２００１），４４８−４５２；特開２００３−２２９号公報）、二酸化炭素を固定してｎ−テトラデカンやｎ−ヘキサデカン等を産生するシュードモナス・アナエロオレフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎａｅｒｏｏｌｅｏｐｈｉｌａ）ＨＤ−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１４０３５）などがある（特開平７−１９４３８６号公報）。しかしながら、これらの菌株は、炭化水素生産に有機物を必要としたり、増殖能力や生産能力が満足できるレベルではない。また、嫌気的条件下でアルカン類を分解又は二酸化炭素を固定してアルカン類を生産するクレブシエラ アナエロオレオフィラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｎａｅｒｏｏｌｅｏｐｈｉｌａ）ＴＫ−１２２（ＦＥＲＭＰ−１６９２０）も知られているが（特開２０００−１２５８４９号公報）、この菌株は、分解と生産を同時に行うので、炭化水素のネットの生産能力は低い。また、酸素のない条件でのみ炭化水素生産が認められているので、通常の空気条件下において炭化水素を生産させるためには、酸素を遮断するための特殊な培養装置、生産装置を必要とする。
一方、微細藻類は、ＣＯ２（無機炭素）と光エネルギーと水があれば光合成を行い、ＣＯ２から炭化水素を含む有機物を生産することができる。直鎖状炭化水素を油滴として細胞内外に蓄積する株としてはＢｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉが知られている（Ｍｅｔｚｇｅｒ ａｎｄ Ｌａｒｇｅａｕ，Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ： ａ ｒｉｃｈ ｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｅｔｈｅｒ ｌｉｐｉｄｓ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ６６（２００５））。Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓの特徴は、重油相当（炭素数３０以上）か、あるいはもっと長鎖の炭化水素を蓄積する点にある。しかし、これ以外の微細藻類で直鎖状炭化水素を顕著に蓄積する例は知られていない。
一方、微細藻類は、ＣＯ２（無機炭素）と光エネルギーと水があれば光合成を行い、ＣＯ２から炭化水素を含む有機物を生産することができる。直鎖状炭化水素を油滴として細胞内外に蓄積する株としてはＢｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉが知られている（Ｍｅｔｚｇｅｒ ａｎｄ Ｌａｒｇｅａｕ，Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ： ａ ｒｉｃｈ ｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｅｔｈｅｒ ｌｉｐｉｄｓ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ６６（２００５））。Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓの特徴は、重油相当（炭素数３０以上）か、あるいはもっと長鎖の炭化水素を蓄積する点にある。しかし、これ以外の微細藻類で直鎖状炭化水素を顕著に蓄積する例は知られていない。
そこで、本発明の目的は、ＣＯ２を原料として炭化水素、特には、ディーゼル燃料（軽油）の代替燃料として利用できる、炭素数１０〜２５の範囲の炭化水素を生産する新規な微細藻類を提供することにある。
発明者らは、上記課題を解決すべく、国内各地の淡水サンプルを収集し、スクリーニングを行った結果、炭化水素生産能を有する新規微細藻類を分離することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）炭化水素生産能を有する新規微細藻類シュードコリシスチス エリプソイディア（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）。
（２）炭化水素生産能を有する新規微細藻類シュードコリシスチス エリプソイディア セキグチ エト クラノ ジェン エト エスピー ノブ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ ｅｔ Ｋｕｒａｎｏ ｇｅｎ．ｅｔ ｓｐ．ｎｏｖ．）ＭＢＩＣ１１２０４株。
（３）炭化水素生産能を有する新規微細藻類シュードコリシスチス エリプソイディア セキグチ エト クラノ ジェン エト エスピー ノブ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ ｅｔ Ｋｕｒａｎｏ ｇｅｎ．ｅｔ ｓｐ．ｎｏｖ．）ＭＢＩＣ１１２２０株。
（４）炭化水素が、炭素数１０〜２５の飽和又は不飽和脂肪族炭化水素である、（１）から（３）のいずれかに記載の新規微細藻類。
（５）シュードコリシスチス（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ）属に属し、炭化水素生産能を有する微細藻類を培養し、培養物から炭化水素を採取することを特徴とする炭化水素の製造方法。
（６）微細藻類が、シュードコリシスチス エリプソイディア セキグチ エト クラノ ジェン エト エスピー ノブ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ ｅｔ Ｋｕｒａｎｏ ｇｅｎ．ｅｔ ｓｐ．ｎｏｖ．）ＭＢＩＣ１１２０４株である、（５）に記載の方法。
（７）微細藻類が、シュードコリシスチス エリプソイディア セキグチ エト クラノ ジェン エト エスピー ノブ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ ｅｔ Ｋｕｒａｎｏ ｇｅｎ．ｅｔ ｓｐ．ｎｏｖ．）ＭＢＩＣ１１２２０株である、（５）に記載の方法。
（８）コリシスチス（Ｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ）属に属し、炭化水素生産能を有する微細藻類を培養し、培養物から炭化水素を採取することを特徴とする炭化水素の製造方法。
（９）微細藻類が、コリシスチス マイナー（Ｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｍｉｎｏｒ）ＳＡＧ２５１−１株、又はコリシスチス マイナー（Ｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｍｉｎｏｒ）ＳＡＧ１７．９８株である、（８）に記載の方法。
（１０）炭化水素が、炭素数１０〜２５の飽和又は不飽和脂肪族炭化水素である、（５）から（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）培養を窒素欠乏条件下で行う、（５）から（１０）のいずれかに記載の方法。
本発明によれば、炭化水素生産能を有する新規微細藻類が提供される。本発明の微細藻類を用いることにより、既存の化石燃料の代替となるバイオ燃料（バイオディーゼル）、潤滑油、プラスチック・合成繊維・塗料などの工業原料として使用できる炭化水素の生産が可能となる。本発明の微細藻類を用いる炭化水素生産は光合成によって行われるため、地球温暖化の原因となっている二酸化炭素排出量を軽減でき、環境負荷がない。
発明者らは、上記課題を解決すべく、国内各地の淡水サンプルを収集し、スクリーニングを行った結果、炭化水素生産能を有する新規微細藻類を分離することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）炭化水素生産能を有する新規微細藻類シュードコリシスチス エリプソイディア（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）。
（２）炭化水素生産能を有する新規微細藻類シュードコリシスチス エリプソイディア セキグチ エト クラノ ジェン エト エスピー ノブ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ ｅｔ Ｋｕｒａｎｏ ｇｅｎ．ｅｔ ｓｐ．ｎｏｖ．）ＭＢＩＣ１１２０４株。
（３）炭化水素生産能を有する新規微細藻類シュードコリシスチス エリプソイディア セキグチ エト クラノ ジェン エト エスピー ノブ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ ｅｔ Ｋｕｒａｎｏ ｇｅｎ．ｅｔ ｓｐ．ｎｏｖ．）ＭＢＩＣ１１２２０株。
（４）炭化水素が、炭素数１０〜２５の飽和又は不飽和脂肪族炭化水素である、（１）から（３）のいずれかに記載の新規微細藻類。
（５）シュードコリシスチス（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ）属に属し、炭化水素生産能を有する微細藻類を培養し、培養物から炭化水素を採取することを特徴とする炭化水素の製造方法。
（６）微細藻類が、シュードコリシスチス エリプソイディア セキグチ エト クラノ ジェン エト エスピー ノブ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ ｅｔ Ｋｕｒａｎｏ ｇｅｎ．ｅｔ ｓｐ．ｎｏｖ．）ＭＢＩＣ１１２０４株である、（５）に記載の方法。
（７）微細藻類が、シュードコリシスチス エリプソイディア セキグチ エト クラノ ジェン エト エスピー ノブ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ ｅｔ Ｋｕｒａｎｏ ｇｅｎ．ｅｔ ｓｐ．ｎｏｖ．）ＭＢＩＣ１１２２０株である、（５）に記載の方法。
（８）コリシスチス（Ｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ）属に属し、炭化水素生産能を有する微細藻類を培養し、培養物から炭化水素を採取することを特徴とする炭化水素の製造方法。
（９）微細藻類が、コリシスチス マイナー（Ｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｍｉｎｏｒ）ＳＡＧ２５１−１株、又はコリシスチス マイナー（Ｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｍｉｎｏｒ）ＳＡＧ１７．９８株である、（８）に記載の方法。
（１０）炭化水素が、炭素数１０〜２５の飽和又は不飽和脂肪族炭化水素である、（５）から（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）培養を窒素欠乏条件下で行う、（５）から（１０）のいずれかに記載の方法。
本発明によれば、炭化水素生産能を有する新規微細藻類が提供される。本発明の微細藻類を用いることにより、既存の化石燃料の代替となるバイオ燃料（バイオディーゼル）、潤滑油、プラスチック・合成繊維・塗料などの工業原料として使用できる炭化水素の生産が可能となる。本発明の微細藻類を用いる炭化水素生産は光合成によって行われるため、地球温暖化の原因となっている二酸化炭素排出量を軽減でき、環境負荷がない。
図１は、ＭＢＩＣ１１２０４株の光学顕微鏡写真を示す（黒い線は１μｍを表す）。
図２は、ＭＢＩＣ１１２０４株の超薄切片写真を示す（黒い線は１μｍを表す。Ｃ：葉緑体、Ｖ：液胞）。
図３は、四分胞子により生殖するＭＢＩＣ１１２０４株の超薄切片写真を示す（黒い線は１μｍを表す）。
図４は、二分裂により増殖するＭＢＩＣ１１２０４株の光学顕微鏡写真を示す（黒い線は１μｍを表す）。
図５は、ＭＢＩＣ１１２０４株の蛍光顕微鏡写真を示す（上図：明視野、下図：蛍光視野。明るい蛍光発色：Ｎｉｌｅ Ｒｅｄによって発色した細胞内の油滴、薄暗い部分：葉緑体の自家蛍光）。
図６は、Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ染色したＭＢＩＣ１１２０４株の蛍光パターン（励起波長４８８ｎｍ）を示す。
図７は、緑色植物における分子系統樹（１８Ｓ ｒＤＮＡ部分配列、ＮＪ法）を示す。
図８は、緑色植物全体の分子系統樹（ｒｂｃＬ部分配列、ＮＪ法）を示す。外群として三株のシアノバクテリアを用いた。
図９は、ＭＢＩＣ１１２０４株の窒素十分条件（左）と窒素欠乏条件（右）の細胞の光学顕微鏡写真を示す。窒素欠乏条件で顕著な油分の蓄積が認められる。
図１０は、窒素欠乏条件移行後の油分増加曲線を示す。横軸は窒素欠乏条件移行後の経過時間、縦軸は単位細胞あたりのＮｉｌｅ ｒｅｄの蛍光強度を示す。Ｎｉｌｅ ｒｅｄ蛍光は油分含量の指標である。
図１１は、ＭＢＩＣ１１２０４株の乾燥重量を指標とした増殖曲線を示す。
図１２は、ＭＢＩＣ１１２０４株のｐＨに対する増殖特性を示す（白抜き：増殖、黒塗り：ｐＨ）。
図１３は、コリシスチス（Ｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ）に属する株（ＳＡＧ２５１−１株、ＳＡＧ１７．９８株）の蛍光顕微鏡写真を示す（赤色：葉緑体の自家蛍光、黄色の粒：Ｎｉｌｅ Ｒｅｄによって発色した油滴）。
図１４は、７２０ｎｍにおける吸光度を指標としたＭＢＩＣ１１２２０株とＭＢＩＣ１１２０４株の増殖曲線を示す（菱形：ＭＢＩＣ１１２２０株、四角：ＭＢＩＣ１１２０４株）。
図１５は、ＭＢＩＣ１１２２０株の光学顕微鏡写真を示す（黒い線は１０μｍを表す）。
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００５年４月１２日に出願された日本国特許出願２００５−１１４４０４号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
１．炭化水素生産能を有する新規微細藻類
本発明によれば、炭化水素生産能を有する新規微細藻類シュードコリシスチスエリプソイディア（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）が提供される。
このような微生物の例としては、本発明者らが淡水サンプルから分離したシュードコリシスチス エリプソイディア セキグチ エト クラノ ジェン エト エスピー ノブ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ ｅｔ Ｋｕｒａｎｏ ｇｅｎ．ｅｔ ｓｐ．ｎｏｖ．）ＭＢＩＣ１１２０４株、シュードコリシスチス エリプソイディア セキグチ エト クラノ ジェン エト エスピー ノブ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ ｅｔ Ｋｕｒａｎｏ ｇｅｎ．ｅｔ ｓｐ．ｎｏｖ．）ＭＢＩＣ１１２２０株を挙げることができる。
上記の微細藻類株は、日本国内の各地から温泉水を採取し、その３０ミリリットルに、下記表１に示す組成を有するＩＭＫ培地（日本製薬製）を添加し、蛍光灯の光照射下、約２０℃で静置培養したサンプルを顕微鏡下で観察することによって選出した。
ＭＢＩＣ１１２０４株の藻類学的性質は以下のとおりである。
Ａ．形態的性質
（１）栄養型細胞は、楕円形又はやや曲がった腎臓形で両端は丸い。短径１〜２μｍ、長径３〜４μｍである（図１）。鞭毛を持たず運動性を示さない。アルカリ性では細胞は凝集する。
（２）栄養型細胞は外囲を細胞壁に囲まれ、内部に核、葉緑体が一個存在し、その他、ミトコンドリア、ゴルジ体、液胞、油滴等が認められる。葉緑体内にピレノイドは認められない（図２）。
Ｂ．生殖様式
（１）内生胞子は栄養細胞内に四個形成され（図３）、細胞内に均等に分布する。内生胞子はその細胞内に核、葉緑体を一個有する。
（２）二分裂による増殖も行う（図４）。
Ｃ．生理学・生化学性状
（１）培養液：淡水を素にした培養液中で生育できる。
（２）光合成能：光合成による光独立栄養生育ができる。
（３）含有色素：クロロフィルａ、クロロフィルｂ、及び他のカロチノイド類。
（４）同化貯蔵物質：澱粉。
（５）生育温度域：１５℃〜３０℃（至適温度２５℃）。
（６）生育ｐＨ域：ｐＨ６．０〜１０．０（至適ｐＨは７．０）。
（７）細胞内に存在する油滴はＮｉｌｅ ｒｅｄによる蛍光染色でオレンジ色の蛍光を示す（図５）。図６はＮｉｌｅ ｒｅｄ染色しＭＢＩＣ１１２０４株の典型的な中性脂質の蛍光パターンを示す。
上記のとおり、ＭＢＩＣ１１２０４株は楕円形又はやや曲がった腎臓形の形状を有し、主要光合成色素として、クロロフィルａ、クロロフィルｂを含有している。また、遊走細胞のステージを持たず、二分裂又は四分胞子の形成によって生殖を行う。さらに、ピレノイドを欠く葉緑体を有する。
以上の点から、ＭＢＩＣ１１２０４株は形態学的には既知のトレボウクシア藻綱のＣｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ属によく一致し、Ｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ属に属すると推察された。ところが、１８Ｓ ｒ ＤＮＡ遺伝子を指標とした分子系統解析を行ったところ、既知のＣｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ属とは類縁関係を示さなかった。（図７）。一方、Ｒｕｂｉｓｃｏ ｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔ遺伝子（ｒｂｃＬ）の部分配列を指標とした分子系統解析では、ＭＢＩＣ１１２０４株は緑色植物全体の根元に位置することが明らかとなった（図８）。ＭＢＩＣ１１２０４株の１８Ｓ ｒ ＤＮＡ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に、また、Ｒｕｂｉｓｃｏ ｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔ遺伝子（ｒｂｃＬ）の塩基配列を配列表の配列番号２に示す。同じ解析においてＣｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ属はひとかたまりのクレードを作っており、そのクレードとはかけ離れた位置にＭＢＩＣ１１２０４株は存在する。また、トレボウクシア藻綱のタイプ株やＣｈｌｏｒｅｌｌａ属とも全くかけ離れている。
そこでＭＢＩＣ１１２０４株を、（ｉ）形態的にはＣｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ属に類似するが１８Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の系統解析ではＣｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ属に属さない、（ｉｉ）ｒｂｃＬ遺伝子による系統解析では緑色植物の根元に位置する、（ｉｉｉ）直鎖状炭化水素を含有する、ことを特徴とする、新属新種の微細藻類株と判断し、シュードコリシスチス エリプソイディア セキグチ エト クラノ ジェン エト エスピー ノブ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ ｅｔ Ｋｕｒａｎｏ ｇｅｎ．ｅｔ ｓｐ．ｎｏｖ．）ＭＢＩＣ１１２０４株と命名した。属名は、Ｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ属と形態的に類似するという意味で、種名は、細胞の形が回転楕円体であることに由来する。
一方、ＭＢＩＣ１１２２０株もまたＭＢＩＣ１１２０４株と同様の楕円形又はやや曲がった腎臓形の形状を有し（図１５）、その他の藻類学的性質も一致した。また、ＭＢＩＣ１１２２０株の１８Ｓ ｒ ＤＮＡ遺伝子の塩基配列（配列表の配列番号３）、Ｒｕｂｉｓｃｏ ｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔ遺伝子（ｒｂｃＬ）の塩基配列（配列表の配列番号４）を決定し、同様にして１８Ｓ ｒ ＤＮＡ遺伝子を指標とした分子系統解析、及びＲｕｂｉｓｃｏ ｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔ遺伝子（ｒｂｃＬ）の部分配列を指標とした分子系統解析を行った。それらの分子系統解析と直鎖状炭化水素の生産の点においても、ＭＢＩＣ１１２０４株の有する前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の特徴と一致した。そこで、ＭＢＩＣ１１２２０株もまた新属新種の微細藻類株と判断し、シュードコリシスチス エリプソイディア セキグチ エト クラノ ジェン エト エスピー ノブ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ ｅｔ Ｋｕｒａｎｏ ｇｅｎ．ｅｔ ｓｐ．ｎｏｖ．）ＭＢＩＣ１１２２０株と命名した。
ＭＢＩＣ１１２０４株は、２００５年２月１５日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０４０１として寄託され、２００６年１月１８日付でプタベスト条約の規定下で受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４８４として国際寄託に移管されている。
また、ＭＢＩＣ１１２２０株は、２００６年１月１８日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にプタベスト条約の規定下で受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４８５として国際寄託されている。
２．微細藻類を用いる炭化水素の製造方法
ＭＢＩＣ１１２０４株は、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）の結果、９種類の炭化水素を生産することが確認された。いずれも脂肪族炭化水素で、ｎ−ヘプタデセン（ｎ−ｈｅｐｔａｄｅｃｅｎｅ；Ｃ１７Ｈ３４）、ｎ−ヘプタデカン（ｎ−ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｅ；Ｃ１７Ｈ３６）、ｎ−オクタデセン（ｎ−ｏｃｔａｄｅｃｅｎｅ；Ｃ１８Ｈ３６）、ｎ−オクタデカン（ｎ−ｏｃｔａｄｅｃａｎｅ；Ｃ１８Ｈ３８）、ｎ−ノナデセン（ｎ−ｎｏｎａｄｅｃｅｎｅ；Ｃ１９Ｈ３８）、ｎ−ノナデカン（ｎ−ｎｏｎａｄｅｃａｎｅ；Ｃ１９Ｈ４０）の６種と、残り３種はｎ−エイコサジエン（ｎ−ｅｉｃｏｓａｄｉｅｎｅ；Ｃ２０Ｈ３８）で、二重結合が２ヶ所存在するが、いずれも二重結合の位置は特定できない（表６）。また、ＭＢＩＣ１１２２０株は、ｎ−ヘプタデセン（ｈ−ｈｅｐｔａｄｅｃｅｎｅ；Ｃ１７Ｈ３４）、ｎ−ヘプタデカン（ｎ−ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｅ；Ｃ１７Ｈ３６）、ｎ−ノナデセン（ｎ−ｎｏｎａｄｅｃｅｎｅ；Ｃ１９Ｈ３８）、ｎ−ノナデカン（ｎ−ｎｏｎａｄｅｃａｎｅ；Ｃ１９Ｈ４０）の４種類の炭化水素を生産することが確認された（表６）。
また、図９に示すようにＭＢＩＣ１１２０４株の炭化水素油滴の含有量は窒素欠乏条件で著しく増大する。さらに、細胞をＮｉｌｅ ｒｅｄで染色してその蛍光強度を測ると窒素欠乏条件移行後、単位細胞あたりの蛍光強度が増大していた（図１０）。このＮｉｌｅ ｒｅｄ蛍光は細胞の炭化水素含有量を反映しているので、ＭＢＩＣ１１２０４株による炭化水素生産の収量増大の手段として、窒素欠乏条件が有効であるといえる。
以上から、本発明によれば、シュードコリシスチス（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ）属に属し、炭化水素生産能を有する微細藻類を培養し、培養物から炭化水素を採取することを特徴とする炭化水素の製造方法が提供される。
また、同じく微細藻類コリシスチス（Ｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ）に属する株の培養細胞中にも、同様な炭化水素油滴が確認された（図１３）。この炭化水素油滴を分析したところ、コリシスチス マイナー（Ｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｍｉｎｏｒ）ＳＡＧ２５１−１株における炭化水素は、ｎ−ヘプタデカン（ｎ−ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｅ；Ｃ１７Ｈ３６）、ｎ−ノナデセン（ｎ−ｎｏｎａｄｅｃｅｎｅ；Ｃ１９Ｈ３８）、ｎ−ヘンエイコセン（ｎ−ｈｅｎｅｉｃｏｓｅｎｅ；Ｃ２１Ｈ４２）の３種、コリシスチス マイナー（Ｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｍｉｎｏｒ）ＳＡＧ１７．９８株における炭化水素は、ｎ−ヘプタデカン（ｎ−ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｅ；Ｃ１７Ｈ３６）、ｎ−ノナデセン（ｎ−ｎｏｎａｄｅｃｅｎｅ；Ｃ１９Ｈ３８）、ｎ−ヘンエイコセン（ｎ−ｈｅｎｅｉｃｏｓｅｎｅ；Ｃ２１Ｈ４２）、ｎ−トリコセン（ｎ−ｔｒｉｃｏｓｅｎｅ；Ｃ２３Ｈ４６）の４種であった（表６）。
従って、本発明によれば、コリシスチス（Ｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ）属に属し、炭化水素生産能を有する微細藻類を培養し、培養物から炭化水素を採取することを特徴とする炭化水素の製造方法もまた提供される。
上記方法にて製造される炭化水素には、いずれも炭素数１０〜２５の飽和又は不飽和脂肪族炭化水素の１種または２種以上の混合物が含まれる。すなわち、従来の微細藻類を用いる方法では、重油相当の炭素数の炭化水素しか得られなかったが、本願発明の微細藻類を用いる方法によれば、軽油相当の炭素数の炭化水素を製造することが可能となる。
上記微細藻類の培養するための培地としては、微細藻類の培養に通常使用されているものでよく、例えば、各種栄養塩、微量金属塩、ビタミン等を含む公知の淡水産微細藻類用の培地、海産微細藻類用の培地のいずれも使用可能である。栄養塩としては、例えば、ＮａＮＯ３、ＫＮＯ３、ＮＨ４Ｃｌ、尿素などの窒素源；Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、グリセロリン酸ナトリウムなどのリン源が挙げられる。また、微量金属としては、鉄、マグネシウム、マンガン、カルシウム、亜鉛等が挙げられ、ビタミンとしてはビタミンＢ１、ビタミンＢ１２等が挙げられる。培養方法は、通気条件で二酸化炭素の供給とともに攪拌を行えばよい。その際、蛍光灯で１２時間の光照射、１２時間の暗条件などの明暗サイクルをつけた光照射、又は、連続光照射して培養する。また培養条件も微細藻類の増殖に悪影響を与えない範囲内であれば特に制限はされないが、例えば培養液のｐＨは７〜９とすることが好ましく、培養温度は、２０〜３０℃にすることが好ましい。以上のような条件で培養すると、培養開始から６〜８日程度で、上記の炭化水素が採取できる。
より具体的には、ＭＢＩＣ１１２０４株の培養をする場合は、培養液には、前記市販のＩＭＫ培地（日本製薬製）を脱塩水に規定濃度溶解したものを蒸気滅菌し、各種の緩衝溶液を添加したものを用いることができる。この培養液に、ＭＢＩＣ１１２０４株を植菌し、２５℃、蛍光灯の光照射下（連続照明下又は明暗周期下）で静置又は振盪又は空気通気を行うことによって培養できる。また、空気中へ二酸化炭素を１〜５％程度付加すると、増殖が促進され、好ましい。また、既知の淡水産微細藻類用の培地も用いることが可能である。さらに、既知の淡水産微細藻類用の培地をベースに作成した寒天平板培地も利用可能である。
生産された炭化水素は培養藻体から採取できる。フレンチプレスやホモジナイザーなどの一般的な方法により細胞を破砕してからｎ−ヘキサンなどの有機溶媒によって抽出する方法や、細胞をガラス繊維等のフィルター上に回収し、乾燥させてから、有機溶媒などによって抽出する方法が可能である。また、細胞を遠心分離で回収し、凍結乾燥して粉末化し、その粉末から有機溶媒で抽出することも可能である。抽出後の溶媒を、減圧又は常圧下で、また加温又は常温で揮散させることにより目的の炭化水素が得られる。
図２は、ＭＢＩＣ１１２０４株の超薄切片写真を示す（黒い線は１μｍを表す。Ｃ：葉緑体、Ｖ：液胞）。
図３は、四分胞子により生殖するＭＢＩＣ１１２０４株の超薄切片写真を示す（黒い線は１μｍを表す）。
図４は、二分裂により増殖するＭＢＩＣ１１２０４株の光学顕微鏡写真を示す（黒い線は１μｍを表す）。
図５は、ＭＢＩＣ１１２０４株の蛍光顕微鏡写真を示す（上図：明視野、下図：蛍光視野。明るい蛍光発色：Ｎｉｌｅ Ｒｅｄによって発色した細胞内の油滴、薄暗い部分：葉緑体の自家蛍光）。
図６は、Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ染色したＭＢＩＣ１１２０４株の蛍光パターン（励起波長４８８ｎｍ）を示す。
図７は、緑色植物における分子系統樹（１８Ｓ ｒＤＮＡ部分配列、ＮＪ法）を示す。
図８は、緑色植物全体の分子系統樹（ｒｂｃＬ部分配列、ＮＪ法）を示す。外群として三株のシアノバクテリアを用いた。
図９は、ＭＢＩＣ１１２０４株の窒素十分条件（左）と窒素欠乏条件（右）の細胞の光学顕微鏡写真を示す。窒素欠乏条件で顕著な油分の蓄積が認められる。
図１０は、窒素欠乏条件移行後の油分増加曲線を示す。横軸は窒素欠乏条件移行後の経過時間、縦軸は単位細胞あたりのＮｉｌｅ ｒｅｄの蛍光強度を示す。Ｎｉｌｅ ｒｅｄ蛍光は油分含量の指標である。
図１１は、ＭＢＩＣ１１２０４株の乾燥重量を指標とした増殖曲線を示す。
図１２は、ＭＢＩＣ１１２０４株のｐＨに対する増殖特性を示す（白抜き：増殖、黒塗り：ｐＨ）。
図１３は、コリシスチス（Ｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ）に属する株（ＳＡＧ２５１−１株、ＳＡＧ１７．９８株）の蛍光顕微鏡写真を示す（赤色：葉緑体の自家蛍光、黄色の粒：Ｎｉｌｅ Ｒｅｄによって発色した油滴）。
図１４は、７２０ｎｍにおける吸光度を指標としたＭＢＩＣ１１２２０株とＭＢＩＣ１１２０４株の増殖曲線を示す（菱形：ＭＢＩＣ１１２２０株、四角：ＭＢＩＣ１１２０４株）。
図１５は、ＭＢＩＣ１１２２０株の光学顕微鏡写真を示す（黒い線は１０μｍを表す）。
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００５年４月１２日に出願された日本国特許出願２００５−１１４４０４号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
１．炭化水素生産能を有する新規微細藻類
本発明によれば、炭化水素生産能を有する新規微細藻類シュードコリシスチスエリプソイディア（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）が提供される。
このような微生物の例としては、本発明者らが淡水サンプルから分離したシュードコリシスチス エリプソイディア セキグチ エト クラノ ジェン エト エスピー ノブ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ ｅｔ Ｋｕｒａｎｏ ｇｅｎ．ｅｔ ｓｐ．ｎｏｖ．）ＭＢＩＣ１１２０４株、シュードコリシスチス エリプソイディア セキグチ エト クラノ ジェン エト エスピー ノブ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ ｅｔ Ｋｕｒａｎｏ ｇｅｎ．ｅｔ ｓｐ．ｎｏｖ．）ＭＢＩＣ１１２２０株を挙げることができる。
上記の微細藻類株は、日本国内の各地から温泉水を採取し、その３０ミリリットルに、下記表１に示す組成を有するＩＭＫ培地（日本製薬製）を添加し、蛍光灯の光照射下、約２０℃で静置培養したサンプルを顕微鏡下で観察することによって選出した。
Ａ．形態的性質
（１）栄養型細胞は、楕円形又はやや曲がった腎臓形で両端は丸い。短径１〜２μｍ、長径３〜４μｍである（図１）。鞭毛を持たず運動性を示さない。アルカリ性では細胞は凝集する。
（２）栄養型細胞は外囲を細胞壁に囲まれ、内部に核、葉緑体が一個存在し、その他、ミトコンドリア、ゴルジ体、液胞、油滴等が認められる。葉緑体内にピレノイドは認められない（図２）。
Ｂ．生殖様式
（１）内生胞子は栄養細胞内に四個形成され（図３）、細胞内に均等に分布する。内生胞子はその細胞内に核、葉緑体を一個有する。
（２）二分裂による増殖も行う（図４）。
Ｃ．生理学・生化学性状
（１）培養液：淡水を素にした培養液中で生育できる。
（２）光合成能：光合成による光独立栄養生育ができる。
（３）含有色素：クロロフィルａ、クロロフィルｂ、及び他のカロチノイド類。
（４）同化貯蔵物質：澱粉。
（５）生育温度域：１５℃〜３０℃（至適温度２５℃）。
（６）生育ｐＨ域：ｐＨ６．０〜１０．０（至適ｐＨは７．０）。
（７）細胞内に存在する油滴はＮｉｌｅ ｒｅｄによる蛍光染色でオレンジ色の蛍光を示す（図５）。図６はＮｉｌｅ ｒｅｄ染色しＭＢＩＣ１１２０４株の典型的な中性脂質の蛍光パターンを示す。
上記のとおり、ＭＢＩＣ１１２０４株は楕円形又はやや曲がった腎臓形の形状を有し、主要光合成色素として、クロロフィルａ、クロロフィルｂを含有している。また、遊走細胞のステージを持たず、二分裂又は四分胞子の形成によって生殖を行う。さらに、ピレノイドを欠く葉緑体を有する。
以上の点から、ＭＢＩＣ１１２０４株は形態学的には既知のトレボウクシア藻綱のＣｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ属によく一致し、Ｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ属に属すると推察された。ところが、１８Ｓ ｒ ＤＮＡ遺伝子を指標とした分子系統解析を行ったところ、既知のＣｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ属とは類縁関係を示さなかった。（図７）。一方、Ｒｕｂｉｓｃｏ ｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔ遺伝子（ｒｂｃＬ）の部分配列を指標とした分子系統解析では、ＭＢＩＣ１１２０４株は緑色植物全体の根元に位置することが明らかとなった（図８）。ＭＢＩＣ１１２０４株の１８Ｓ ｒ ＤＮＡ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に、また、Ｒｕｂｉｓｃｏ ｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔ遺伝子（ｒｂｃＬ）の塩基配列を配列表の配列番号２に示す。同じ解析においてＣｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ属はひとかたまりのクレードを作っており、そのクレードとはかけ離れた位置にＭＢＩＣ１１２０４株は存在する。また、トレボウクシア藻綱のタイプ株やＣｈｌｏｒｅｌｌａ属とも全くかけ離れている。
そこでＭＢＩＣ１１２０４株を、（ｉ）形態的にはＣｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ属に類似するが１８Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子の系統解析ではＣｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ属に属さない、（ｉｉ）ｒｂｃＬ遺伝子による系統解析では緑色植物の根元に位置する、（ｉｉｉ）直鎖状炭化水素を含有する、ことを特徴とする、新属新種の微細藻類株と判断し、シュードコリシスチス エリプソイディア セキグチ エト クラノ ジェン エト エスピー ノブ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ ｅｔ Ｋｕｒａｎｏ ｇｅｎ．ｅｔ ｓｐ．ｎｏｖ．）ＭＢＩＣ１１２０４株と命名した。属名は、Ｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ属と形態的に類似するという意味で、種名は、細胞の形が回転楕円体であることに由来する。
一方、ＭＢＩＣ１１２２０株もまたＭＢＩＣ１１２０４株と同様の楕円形又はやや曲がった腎臓形の形状を有し（図１５）、その他の藻類学的性質も一致した。また、ＭＢＩＣ１１２２０株の１８Ｓ ｒ ＤＮＡ遺伝子の塩基配列（配列表の配列番号３）、Ｒｕｂｉｓｃｏ ｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔ遺伝子（ｒｂｃＬ）の塩基配列（配列表の配列番号４）を決定し、同様にして１８Ｓ ｒ ＤＮＡ遺伝子を指標とした分子系統解析、及びＲｕｂｉｓｃｏ ｌａｒｇｅ ｓｕｂｕｎｉｔ遺伝子（ｒｂｃＬ）の部分配列を指標とした分子系統解析を行った。それらの分子系統解析と直鎖状炭化水素の生産の点においても、ＭＢＩＣ１１２０４株の有する前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の特徴と一致した。そこで、ＭＢＩＣ１１２２０株もまた新属新種の微細藻類株と判断し、シュードコリシスチス エリプソイディア セキグチ エト クラノ ジェン エト エスピー ノブ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ ｅｔ Ｋｕｒａｎｏ ｇｅｎ．ｅｔ ｓｐ．ｎｏｖ．）ＭＢＩＣ１１２２０株と命名した。
ＭＢＩＣ１１２０４株は、２００５年２月１５日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０４０１として寄託され、２００６年１月１８日付でプタベスト条約の規定下で受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４８４として国際寄託に移管されている。
また、ＭＢＩＣ１１２２０株は、２００６年１月１８日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にプタベスト条約の規定下で受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０４８５として国際寄託されている。
２．微細藻類を用いる炭化水素の製造方法
ＭＢＩＣ１１２０４株は、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）の結果、９種類の炭化水素を生産することが確認された。いずれも脂肪族炭化水素で、ｎ−ヘプタデセン（ｎ−ｈｅｐｔａｄｅｃｅｎｅ；Ｃ１７Ｈ３４）、ｎ−ヘプタデカン（ｎ−ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｅ；Ｃ１７Ｈ３６）、ｎ−オクタデセン（ｎ−ｏｃｔａｄｅｃｅｎｅ；Ｃ１８Ｈ３６）、ｎ−オクタデカン（ｎ−ｏｃｔａｄｅｃａｎｅ；Ｃ１８Ｈ３８）、ｎ−ノナデセン（ｎ−ｎｏｎａｄｅｃｅｎｅ；Ｃ１９Ｈ３８）、ｎ−ノナデカン（ｎ−ｎｏｎａｄｅｃａｎｅ；Ｃ１９Ｈ４０）の６種と、残り３種はｎ−エイコサジエン（ｎ−ｅｉｃｏｓａｄｉｅｎｅ；Ｃ２０Ｈ３８）で、二重結合が２ヶ所存在するが、いずれも二重結合の位置は特定できない（表６）。また、ＭＢＩＣ１１２２０株は、ｎ−ヘプタデセン（ｈ−ｈｅｐｔａｄｅｃｅｎｅ；Ｃ１７Ｈ３４）、ｎ−ヘプタデカン（ｎ−ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｅ；Ｃ１７Ｈ３６）、ｎ−ノナデセン（ｎ−ｎｏｎａｄｅｃｅｎｅ；Ｃ１９Ｈ３８）、ｎ−ノナデカン（ｎ−ｎｏｎａｄｅｃａｎｅ；Ｃ１９Ｈ４０）の４種類の炭化水素を生産することが確認された（表６）。
また、図９に示すようにＭＢＩＣ１１２０４株の炭化水素油滴の含有量は窒素欠乏条件で著しく増大する。さらに、細胞をＮｉｌｅ ｒｅｄで染色してその蛍光強度を測ると窒素欠乏条件移行後、単位細胞あたりの蛍光強度が増大していた（図１０）。このＮｉｌｅ ｒｅｄ蛍光は細胞の炭化水素含有量を反映しているので、ＭＢＩＣ１１２０４株による炭化水素生産の収量増大の手段として、窒素欠乏条件が有効であるといえる。
以上から、本発明によれば、シュードコリシスチス（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ）属に属し、炭化水素生産能を有する微細藻類を培養し、培養物から炭化水素を採取することを特徴とする炭化水素の製造方法が提供される。
また、同じく微細藻類コリシスチス（Ｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ）に属する株の培養細胞中にも、同様な炭化水素油滴が確認された（図１３）。この炭化水素油滴を分析したところ、コリシスチス マイナー（Ｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｍｉｎｏｒ）ＳＡＧ２５１−１株における炭化水素は、ｎ−ヘプタデカン（ｎ−ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｅ；Ｃ１７Ｈ３６）、ｎ−ノナデセン（ｎ−ｎｏｎａｄｅｃｅｎｅ；Ｃ１９Ｈ３８）、ｎ−ヘンエイコセン（ｎ−ｈｅｎｅｉｃｏｓｅｎｅ；Ｃ２１Ｈ４２）の３種、コリシスチス マイナー（Ｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｍｉｎｏｒ）ＳＡＧ１７．９８株における炭化水素は、ｎ−ヘプタデカン（ｎ−ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｅ；Ｃ１７Ｈ３６）、ｎ−ノナデセン（ｎ−ｎｏｎａｄｅｃｅｎｅ；Ｃ１９Ｈ３８）、ｎ−ヘンエイコセン（ｎ−ｈｅｎｅｉｃｏｓｅｎｅ；Ｃ２１Ｈ４２）、ｎ−トリコセン（ｎ−ｔｒｉｃｏｓｅｎｅ；Ｃ２３Ｈ４６）の４種であった（表６）。
従って、本発明によれば、コリシスチス（Ｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ）属に属し、炭化水素生産能を有する微細藻類を培養し、培養物から炭化水素を採取することを特徴とする炭化水素の製造方法もまた提供される。
上記方法にて製造される炭化水素には、いずれも炭素数１０〜２５の飽和又は不飽和脂肪族炭化水素の１種または２種以上の混合物が含まれる。すなわち、従来の微細藻類を用いる方法では、重油相当の炭素数の炭化水素しか得られなかったが、本願発明の微細藻類を用いる方法によれば、軽油相当の炭素数の炭化水素を製造することが可能となる。
上記微細藻類の培養するための培地としては、微細藻類の培養に通常使用されているものでよく、例えば、各種栄養塩、微量金属塩、ビタミン等を含む公知の淡水産微細藻類用の培地、海産微細藻類用の培地のいずれも使用可能である。栄養塩としては、例えば、ＮａＮＯ３、ＫＮＯ３、ＮＨ４Ｃｌ、尿素などの窒素源；Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、グリセロリン酸ナトリウムなどのリン源が挙げられる。また、微量金属としては、鉄、マグネシウム、マンガン、カルシウム、亜鉛等が挙げられ、ビタミンとしてはビタミンＢ１、ビタミンＢ１２等が挙げられる。培養方法は、通気条件で二酸化炭素の供給とともに攪拌を行えばよい。その際、蛍光灯で１２時間の光照射、１２時間の暗条件などの明暗サイクルをつけた光照射、又は、連続光照射して培養する。また培養条件も微細藻類の増殖に悪影響を与えない範囲内であれば特に制限はされないが、例えば培養液のｐＨは７〜９とすることが好ましく、培養温度は、２０〜３０℃にすることが好ましい。以上のような条件で培養すると、培養開始から６〜８日程度で、上記の炭化水素が採取できる。
より具体的には、ＭＢＩＣ１１２０４株の培養をする場合は、培養液には、前記市販のＩＭＫ培地（日本製薬製）を脱塩水に規定濃度溶解したものを蒸気滅菌し、各種の緩衝溶液を添加したものを用いることができる。この培養液に、ＭＢＩＣ１１２０４株を植菌し、２５℃、蛍光灯の光照射下（連続照明下又は明暗周期下）で静置又は振盪又は空気通気を行うことによって培養できる。また、空気中へ二酸化炭素を１〜５％程度付加すると、増殖が促進され、好ましい。また、既知の淡水産微細藻類用の培地も用いることが可能である。さらに、既知の淡水産微細藻類用の培地をベースに作成した寒天平板培地も利用可能である。
生産された炭化水素は培養藻体から採取できる。フレンチプレスやホモジナイザーなどの一般的な方法により細胞を破砕してからｎ−ヘキサンなどの有機溶媒によって抽出する方法や、細胞をガラス繊維等のフィルター上に回収し、乾燥させてから、有機溶媒などによって抽出する方法が可能である。また、細胞を遠心分離で回収し、凍結乾燥して粉末化し、その粉末から有機溶媒で抽出することも可能である。抽出後の溶媒を、減圧又は常圧下で、また加温又は常温で揮散させることにより目的の炭化水素が得られる。
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものでない。
脱塩水を用いて下記表２に示す組成のＡ５培地を作り、これを扁平なガラスフラスコ（稼働容量５００ｍｌ）に入れ加圧滅菌した。
上記Ａ５培地にシュードコリシスチス エリプソイディア セキグチ エト クラノ ジェン エト エスピー ノブ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ ｅｔ Ｋｕｒａｎｏ ｇｅｎ．ｅｔ ｓｐ．ｎｏｖ．）ＭＢＩＣ１１２０４株（以下、ＭＢＩＣ１１２０４株という）を植菌し、通気性のある栓をし、３％のＣＯ２を付加した空気を通気すると同時にフラスコ内の培養液を攪拌した。このときフラスコの周囲から白色蛍光ランプにより光を照射し、恒温水槽に浸けて温度を２８℃付近に調節した。細胞の乾燥重量をＭＢＩＣ１１２０４株の生育の指標として経時的に測定した。これらの結果を図１１に示す。対数増殖期の比増殖速度は０．０７９ｈ−１で、８．８時間に１回細胞分裂した。
得られた培養液４００ｍｌ中の細胞を遠心分離し（１５，０００ｒｐｍ、１０分間）、上記Ａ５培地からＮａＮＯ３を除いた窒素欠乏培地で２回洗浄し、さらに該窒素欠乏培地を用いて同じ条件で３日間培養した。このことにより著量の炭化水素の蓄積が光学顕微鏡ドで確認された（図９）。
得られた培養液４００ｍｌ中の細胞を遠心分離し（１５，０００ｒｐｍ、１０分間）、上記Ａ５培地からＮａＮＯ３を除いた窒素欠乏培地で２回洗浄し、さらに該窒素欠乏培地を用いて同じ条件で３日間培養した。このことにより著量の炭化水素の蓄積が光学顕微鏡ドで確認された（図９）。
実施例１で得られた、３００ｍｌで培養された藻体を遠心分離で回収した後、凍結乾燥した。藻体の乾燥重量は、窒素欠損条件で７２１．７ｍｇ、窒素含有条件で８８４．７ｍｇだった。次に、乾燥藻体２００ｍｇに対し、１０ｍｌのｎ−ヘキサンで脂溶性化合物を粗抽出した後、１０ｍｌの抽出液を窒素ガスで１ｍｌ以下に濃縮した。測定前に、１ｍｌにメスアップし、これをＧＣ−ＭＳ分析用の試料とした。
ＧＣ−ＭＳ分析用キャピラリーカラムはＤＢ−５（Ｊ＆Ｗ、３０ｍ Ｘ ０．２５ｍｍ）を使用した。測定機器は、ＧＣＭＳ−ＱＰ５０００（島津製作所）を用いた。イオン化法として、電子イオン化（ＥＩ）法と、化学イオン化（ＣＩ）法を用いた。成分の同定には、ＧＬサイエンスの直鎖状飽和炭化水素混合物（Ｃ１１，Ｃ１３，Ｃ１５，Ｃ１７，Ｃ１９，Ｃ２０，Ｃ２２，Ｃ２４，Ｃ２６，Ｃ２８，Ｃ３０）標準試料を用いた。
ＧＣ／ＭＳ条件は以下の通りである。
インジェクター温度：２８０℃
試料注入量：１μｌ
注入方法：スプリットレスモード
インターフェース温度：３００℃
サンプリング時間：０．５分
カラム入り口圧：１００ｋＰａ
ガス流量：５０．０ｍｌ／ｍｉｎ
キャリアーガス：ヘリウムガス
昇温条件：分析開始より５０℃で２分保持、６℃／ｍｉｎで３００℃まで昇温後、３００℃で１８分保持。
イオン化電圧（ＥＩ）：７０ｅＶ
反応ガス（ＣＩ）：メタン
スキャン範囲：ｍ／ｚ５０〜５００
ＧＣ−ＭＳ（ＥＩ）分析の結果、そのフラグメントパターンから、試料に含まれる成分は、ｎ−ヘプタデセン（ｎ−ｈｅｐｔａｄｅｃｅｎｅ；Ｃ１７Ｈ３４）、ｎ−ヘプタデカン（ｎ−ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｅ；Ｃ１７Ｈ３６）、ｎ−オクタデセン（ｎ−ｏｃｔａｄｅｃｅｎｅ；Ｃ１８Ｈ３６）、ｎ−オクタデカン（ｎ−ｏｃｔａｄｅｃａｎｅ；Ｃ１８Ｈ３８）、ｎ−ノナデセン（ｎ−ｎｏｎａｄｅｃｅｎｅ；Ｃ１９Ｈ３８）、ｎ−ノナデカン（ｎ−ｎｏｎａｄｅｃａｎｅ；Ｃ１９Ｈ４０）の６種と、残り３種はｎ−エイコサジエン（ｎ−ｅｉｃｏｓａｄｉｅｎｅ；Ｃ２０Ｈ３８）であると推定された。しかし、ｎ−エイコサジエンの二重結合の位置は特定できなかった（表６）。
また、ＭＢＩＣ１１２０４株をＭＣ培地（後記表４）で７日間培養後、ＭＣ培地からＫＮＯ３を除去した培地に移した。適当な時間間隔で培養液を採取し、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を終濃度２０％になるように添加して撹拌し、５分後にＮｉｌｅ ｒｅｄ溶液（終濃度５μｇ／ｍｌ）を加えて撹拌しさらに５分放置した後蛍光強度を測定した（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ４８８ｎｍ、ｅｍｉｓｓｉｏｎ ５８０ｎｍ）。単位細胞あたりの蛍光強度の増加パターンを図１０に示す。この蛍光強度はＮｉｌｅ ｒｅｄによって染色される物質の量、すなわち細胞内の炭化水素量を反映しているので、蛍光強度の増加は炭化水素量の増加を意味している。窒素欠乏条件へ以降後、速やかな炭化水素量の増加が示された。
ＧＣ−ＭＳ分析用キャピラリーカラムはＤＢ−５（Ｊ＆Ｗ、３０ｍ Ｘ ０．２５ｍｍ）を使用した。測定機器は、ＧＣＭＳ−ＱＰ５０００（島津製作所）を用いた。イオン化法として、電子イオン化（ＥＩ）法と、化学イオン化（ＣＩ）法を用いた。成分の同定には、ＧＬサイエンスの直鎖状飽和炭化水素混合物（Ｃ１１，Ｃ１３，Ｃ１５，Ｃ１７，Ｃ１９，Ｃ２０，Ｃ２２，Ｃ２４，Ｃ２６，Ｃ２８，Ｃ３０）標準試料を用いた。
ＧＣ／ＭＳ条件は以下の通りである。
インジェクター温度：２８０℃
試料注入量：１μｌ
注入方法：スプリットレスモード
インターフェース温度：３００℃
サンプリング時間：０．５分
カラム入り口圧：１００ｋＰａ
ガス流量：５０．０ｍｌ／ｍｉｎ
キャリアーガス：ヘリウムガス
昇温条件：分析開始より５０℃で２分保持、６℃／ｍｉｎで３００℃まで昇温後、３００℃で１８分保持。
イオン化電圧（ＥＩ）：７０ｅＶ
反応ガス（ＣＩ）：メタン
スキャン範囲：ｍ／ｚ５０〜５００
ＧＣ−ＭＳ（ＥＩ）分析の結果、そのフラグメントパターンから、試料に含まれる成分は、ｎ−ヘプタデセン（ｎ−ｈｅｐｔａｄｅｃｅｎｅ；Ｃ１７Ｈ３４）、ｎ−ヘプタデカン（ｎ−ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｅ；Ｃ１７Ｈ３６）、ｎ−オクタデセン（ｎ−ｏｃｔａｄｅｃｅｎｅ；Ｃ１８Ｈ３６）、ｎ−オクタデカン（ｎ−ｏｃｔａｄｅｃａｎｅ；Ｃ１８Ｈ３８）、ｎ−ノナデセン（ｎ−ｎｏｎａｄｅｃｅｎｅ；Ｃ１９Ｈ３８）、ｎ−ノナデカン（ｎ−ｎｏｎａｄｅｃａｎｅ；Ｃ１９Ｈ４０）の６種と、残り３種はｎ−エイコサジエン（ｎ−ｅｉｃｏｓａｄｉｅｎｅ；Ｃ２０Ｈ３８）であると推定された。しかし、ｎ−エイコサジエンの二重結合の位置は特定できなかった（表６）。
また、ＭＢＩＣ１１２０４株をＭＣ培地（後記表４）で７日間培養後、ＭＣ培地からＫＮＯ３を除去した培地に移した。適当な時間間隔で培養液を採取し、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を終濃度２０％になるように添加して撹拌し、５分後にＮｉｌｅ ｒｅｄ溶液（終濃度５μｇ／ｍｌ）を加えて撹拌しさらに５分放置した後蛍光強度を測定した（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ４８８ｎｍ、ｅｍｉｓｓｉｏｎ ５８０ｎｍ）。単位細胞あたりの蛍光強度の増加パターンを図１０に示す。この蛍光強度はＮｉｌｅ ｒｅｄによって染色される物質の量、すなわち細胞内の炭化水素量を反映しているので、蛍光強度の増加は炭化水素量の増加を意味している。窒素欠乏条件へ以降後、速やかな炭化水素量の増加が示された。
ＭＢＩＣ１１２０４株を、下記表３に示す組成を有するＣ培地に３種の緩衝溶液（５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）、５０ｍＭ ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、５０ｍＭ ＣＨＥＳ（ｐＨ９．０））をそれぞれ添加した培養液（加圧滅菌済み）に植菌し、実施例１と同様の培養を行い、培養液のｐＨが細胞の増殖に及ぼす影響を評価した。
図１２に示すようにｐＨ７．０における増殖がもっとも良好であった。緩衝液の濃度を５０ｍＭに設定したので、培養中のｐＨは安定であった。
図１２に示すようにｐＨ７．０における増殖がもっとも良好であった。緩衝液の濃度を５０ｍＭに設定したので、培養中のｐＨは安定であった。
下記表４に示す組成を有するＭＣ培地と、実施例３で用いたＣ培地のどちらがＭＢＩＣ１１２０４株の培養に適しているかを調べるための実験を行った。同時に、空気にＣＯ２を付加する効果についても確認を行った。
ＭＣ培地とＣ培地を入れた培養容器（加圧滅菌済み）を二本ずつ用意し、二本の内の一本には空気を、残る一本には空気に３％のＣＯ２を付加した混合ガスを通気して、実施例１と同様の条件で６日間培養した。
結果を表５に示す。もっとも増殖がよい条件は、ＭＣ培地を用いて３％ ＣＯ２を付加条件であった（クロロフィル濃度が３４．８倍）。ＭＣ培地の場合にはＣＯ２付加にはプラスの効果が認められたが、Ｃ培地の場合は空気のみでも同様の増殖であった。
ＭＣ培地とＣ培地を入れた培養容器（加圧滅菌済み）を二本ずつ用意し、二本の内の一本には空気を、残る一本には空気に３％のＣＯ２を付加した混合ガスを通気して、実施例１と同様の条件で６日間培養した。
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｇａｅ（ＳＡＧ）ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎに寄託された微細藻類について、直接細胞をＮｉｌｅ ｒｅｄにて染色して観察した結果、Ｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｍｉｎｏｒ ＳＡＧ２５１−１、Ｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｍｉｎｏｒ ＳＡＧ１７．９８はオレンジ色の蛍光を発し、顕著な油滴の存在が確認された（図１３）。
これらの油滴を実施例２と同様の条件にてＭＳ−ＧＳ分析したところ、そのフラグメントパターンから、コリシスチス マイナー（Ｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｍｉｎｏｒ）ＳＡＧ２５１−１株における油滴は、ｎ−ヘプタデカン（ｎ−ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｅ；Ｃ１７Ｈ３６）、ｎ−ノナデセン（ｎ−ｎｏｎａｄｅｃｅｎｅ；Ｃ１９Ｈ３８）、ｎ−ヘンエイコセン（ｎ−ｈｅｎｅｉｃｏｓｅｎｅ；Ｃ２１Ｈ４２）の３種、コリシスチス マイナー（Ｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｍｉｎｏｒ）ＳＡＧ１７．９８株における油滴は、ｎ−ヘプタデカン（ｎ−ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｅ；Ｃ１７Ｈ３６）、ｎ−ノナデセン（ｎ−ｎｏｎａｄｅｃｅｎｅ；Ｃ１９Ｈ３８）、ｎ−ヘンエイコセン（ｎ−ｈｅｎｅｉｃｏｓｅｎｅ；Ｃ２１Ｈ４２）、ｎ−トリコセン（ｎ−ｔｒｉｃｏｓｅｎｅ；Ｃ２３Ｈ４６）の４種であると推定された（表６）。
これらの油滴を実施例２と同様の条件にてＭＳ−ＧＳ分析したところ、そのフラグメントパターンから、コリシスチス マイナー（Ｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｍｉｎｏｒ）ＳＡＧ２５１−１株における油滴は、ｎ−ヘプタデカン（ｎ−ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｅ；Ｃ１７Ｈ３６）、ｎ−ノナデセン（ｎ−ｎｏｎａｄｅｃｅｎｅ；Ｃ１９Ｈ３８）、ｎ−ヘンエイコセン（ｎ−ｈｅｎｅｉｃｏｓｅｎｅ；Ｃ２１Ｈ４２）の３種、コリシスチス マイナー（Ｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｍｉｎｏｒ）ＳＡＧ１７．９８株における油滴は、ｎ−ヘプタデカン（ｎ−ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｅ；Ｃ１７Ｈ３６）、ｎ−ノナデセン（ｎ−ｎｏｎａｄｅｃｅｎｅ；Ｃ１９Ｈ３８）、ｎ−ヘンエイコセン（ｎ−ｈｅｎｅｉｃｏｓｅｎｅ；Ｃ２１Ｈ４２）、ｎ−トリコセン（ｎ−ｔｒｉｃｏｓｅｎｅ；Ｃ２３Ｈ４６）の４種であると推定された（表６）。
ＭＢＩＣ１１２２０株を、前記表２に示す組成を有するＡ５培地で実施例１と同じ培養条件で培養した結果を図１４に示す。７２０ｎｍにおける吸光度を細胞濃度の指標として経時的に測定し、増殖曲線を描いた。図１４には同じ条件で培養したＭＢＩＣ１１２０４株の増殖も表示した。両方の株はこの実験条件ではよく似た増殖を示した。
この培養によって得られたＭＢＩＣ１１２２０株の細胞から、実施例２と同じ方法で炭化水素を抽出し、分析したところ、ｎ−ヘプタデセン（ｎ−ｈｅｐｔａｄｅｃｅｎｅ；Ｃ１７Ｈ３４）、ｎ−ヘプタデカン（ｎ−ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｅ；Ｃ１７Ｈ３６）、ｎ−ノナデセン（ｎ−ｎｏｎａｄｅｃｅｎｅ；Ｃ１９Ｈ３８）、ｎ−ノナデカン（ｎ−ｎｏｎａｄｅｃａｎｅ；Ｃ１９Ｈ４０）の４種であると推定された。
上記の実施例で確認されたＭＢＩＣ１１２０４株、ＭＢＩＣ１１２２０株、ＳＡＧ２５１−１株、ＳＡＧ１７．９８株の培養により生産される炭化水素を下記表６にまとめる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。
この培養によって得られたＭＢＩＣ１１２２０株の細胞から、実施例２と同じ方法で炭化水素を抽出し、分析したところ、ｎ−ヘプタデセン（ｎ−ｈｅｐｔａｄｅｃｅｎｅ；Ｃ１７Ｈ３４）、ｎ−ヘプタデカン（ｎ−ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｅ；Ｃ１７Ｈ３６）、ｎ−ノナデセン（ｎ−ｎｏｎａｄｅｃｅｎｅ；Ｃ１９Ｈ３８）、ｎ−ノナデカン（ｎ−ｎｏｎａｄｅｃａｎｅ；Ｃ１９Ｈ４０）の４種であると推定された。
上記の実施例で確認されたＭＢＩＣ１１２０４株、ＭＢＩＣ１１２２０株、ＳＡＧ２５１−１株、ＳＡＧ１７．９８株の培養により生産される炭化水素を下記表６にまとめる。
本発明は、炭化水素生産能を有する新規微細藻類を提供するものであり、該微細藻類より生産される炭化水素はディーゼル燃料（軽油）の代替燃料として利用できる。従って、本発明は、二酸化炭素を排出せず、環境負荷のない炭化水素生産システムとして非常に有用である。
［配列表］
［配列表］
Claims (5)
- 炭化水素生産能を有する新規微細藻類シュードコリシスチス エリプソイディア セキグチ エト クラノ ジェン エト エスピー ノブ（Pseudochoricystis ellipsoidea Sekiguchi et Kurano gen. et sp. nov.）MBIC11204株。
- 炭化水素生産能を有する新規微細藻類シュードコリシスチス エリプソイディア セキグチ エト クラノ ジェン エト エスピー ノブ（Pseudochoricystis ellipsoidea Sekiguchi et Kurano gen. et sp. nov.）MBIC11220株。
- 炭化水素が、炭素数１７〜２０の飽和又は不飽和脂肪族炭化水素である、請求項１または２に記載の新規微細藻類。
- 請求項１または２に記載の新規微細藻類を培養し、培養物から炭素数１７〜２０の飽和又は不飽和脂肪族炭化水素を採取することを特徴とする炭化水素の製造方法。
- 培養を窒素欠乏条件下で行う、請求項４に記載の方法。
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