JP4472764B2 - 抗原特異的細胞傷害性ｔ細胞拡大培養方法 - Google Patents

Description

本発明は、医療分野において有用な、抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を維持ならびに拡大培養する方法に関する。

生体は主として免疫応答により異物から守られており、免疫システムはさまざまな細胞とそれが作り出す可溶性の因子によって成り立っている。なかでも中心的な役割を果たしているのが白血球、特にリンパ球である。このリンパ球はＢリンパ球（以下、Ｂ細胞と記載することがある）とＴリンパ球（以下、Ｔ細胞と記載することがある）という２種類の主要なタイプに分けられ、いずれも抗原を特異的に認識し、これに作用して生体を防御する。

Ｔ細胞は、ＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）４マーカーを有し、主に抗体産生の補助や種々の免疫応答の誘導に関与するヘルパーＴ細胞（以下、Ｔ_Ｈ）、ＣＤ８マーカーを有し、主に細胞傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞〔Ｔ_Ｃ；細胞傷害性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）、キラーＴ細胞とも呼ばれる。以下、ＣＴＬと記載することがある〕に亜分類される。腫瘍細胞やウイルス感染細胞等を認識して破壊、除去するのに最も重要な役割を果たしているＣＴＬは、Ｂ細胞のように抗原に対して特異的に反応する抗体を産生するのではなく、標的細胞膜表面上に存在する主要組織適合複合体（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ，ＭＨＣ：ヒトにおいてはヒト白血球抗原（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ，ＨＬＡ）と称することもある。）クラスＩ分子に会合した標的細胞由来の抗原（抗原性ペプチド）を直接認識して作用する。この時、ＣＴＬ膜表面のＴ細胞レセプター（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，以下、ＴＣＲと称す）が前述した抗原性ペプチド及びＭＨＣクラスＩ分子を特異的に認識して、抗原性ペプチドが自己由来のものなのか、或は、非自己由来のものなのかを判断する。そして、非自己由来と判断された標的細胞はＣＴＬによって特異的に破壊、除去される。

近年、薬剤治療法や放射線治療法のように患者に重い肉体的負担がある治療法が見直され、患者の肉体的負担が軽い免疫治療法への関心が高まっている。特に免疫機能が正常なヒト由来のＣＴＬ又はＴ細胞から目的とする抗原に対して特異的に反応するＣＴＬを生体外（イン・ビトロ）で誘導した後、患者へ移入する養子免疫治療法の有効性が注目されている。例えば、動物モデルを用いた養子免疫療法がウイルス感染及び腫瘍に対して有効な治療法であることが示唆されており（非特許文献１参照）、さらに、免疫不全患者にＣＴＬを投与することにより、毒性を示すことなく、急速かつ持続的にサイトメガロウイルスが排除される特異的ＣＴＬ応答の再構築が行われた（非特許文献２参照）ことなどから、先天性、後天性及び医原性によるＴ細胞免疫不全症患者への使用も注目されている。この治療法ではＣＴＬの抗原特異的傷害活性を維持もしくは増強させた状態でその細胞数を維持あるいは増加させることが重要である。

またＣＴＬの細胞数の維持及び増加については、動物モデルでの研究からヒトの養子免疫療法において有効な細胞数を推測すると、１０^９〜１０^１０個の抗原特異的Ｔ細胞が必要とされている（非特許文献１参照）。すなわち、養子免疫療法においては、イン・ビトロでこれらの細胞数を短時間に得ることが最大の問題であるといえる。

ＣＴＬの抗原特異的傷害活性の維持及び増強については、ＣＴＬの抗原に特異的な応答を誘導する際に、目的とする抗原を用いた刺激を繰り返す方法が一般的である。しかし、この方法は、一時的には細胞数が増える場合もあるが、最終的には、細胞数が減ってしまい、必要とする細胞数が得られない。この対応策としては、抗原による刺激を繰り返す初期の段階において細胞を凍結保存するか、クローニングを行って得られた抗原特異的ＣＴＬクローンの、一部を凍結保存した後、長期培養により細胞数や抗原特異的傷害活性が低下した時に、凍結した細胞を融解して再度抗原刺激を繰り返すしかないのが、現状である。

マウスＴ細胞を用いて長期培養でＴ細胞を樹立する方法（非特許文献３参照）が報告されているが、これはＴ細胞を単離・株化する方法であり、この方法でＴ細胞を１０^９〜１０^１０個の細胞まで増殖することは不可能である。次に、特許文献１には、インターロイキン２（ＩＬ−２）を高濃度で大量に使用してリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞を誘導し、３〜４日間で細胞数を１００倍まで増やす方法が開示されている。これは、通常、１個の細胞が分裂して２個に増殖するのに約２４時間かかることを考えれば、飛躍的な細胞数である。また、同様に高濃度のＩＬ−２を用いて腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を誘導して養子免疫療法を試みている（非特許文献４、５、６参照）。しかし、前者は抗原に対して非特異的なＴ細胞の取得法であり、後者は活性化しているポリクローナルなリンパ球集団を用いるために特異性があったとしても僅かである。更に、上記の方法ではともに細胞増殖を促進する為に高濃度のＩＬ−２を用いており、高濃度のＩＬ−２で処理されたＴ細胞がＩＬ−２非存在下で特異的抗原刺激を受けた場合にアポトーシス（細胞死）を起こす可能性があるとの報告（非特許文献７、８参照）から、上記方法で得られたＬＡＫ細胞やＴＩＬの有効性には問題がある。

また、Ｔ細胞をＴ細胞増殖因子とＩＬ−２存在下で低密度（５×１０^３〜１×１０^４個／ｍｌ）で培養すると７日間にわたって急速に増殖し、最終的には細胞数が３〜５×１０^５個／ｍｌという飽和密度まで増殖する。しかしながら、ひとたびこの飽和密度に達すると、細胞が常に死んでしまうという報告もある（非特許文献９参照）。従って、ＬＡＫ細胞、ＴＩＬ及び低密度によるＴ細胞培養方法は、実用面においても、有用面においても問題を有している。

次に、抗原特異的なＣＴＬに関しては、同系異種由来のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）特異的ＣＴＬをイン・ビトロにて５〜１２週間培養してＣＴＬを増殖させた後、免疫不全の患者に静脈内投与する養子免疫療法（非特許文献１０参照）、自己ＣＭＶ感染線維芽細胞とＩＬ−２（非特許文献１１参照）及び抗ＣＤ３モノクローナル抗体（抗ＣＤ３ｍＡｂ）とＩＬ−２（非特許文献１２参照）を用いてＣＭＶ特異的ＣＴＬクローンを単離ならびに大量培養する方法が報告されている。しかし、これらの方法には大きな問題点が存在する。すわなち、１×１０^９個／ｍｌの抗原特異的ＣＴＬを得るのに約３ヶ月を要してしまい、その間に患者の症状が進行してしまう為、状況に応じた対応をとることが難しい。

このような問題点を解決する方法として、特許文献２にはＲＥＭ法（ｒａｐｉｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）が開示されている。このＲＥＭ法は、抗原特異的ＣＴＬ及びＴ_Ｈを含むＴ細胞の初期集団を短期間で増殖（Ｅｘｐａｎｄ）させる方法である。つまり、個々のＴ細胞クローンを増殖させて大量のＴ細胞を提供できる点が特徴であるが、次のような問題点が存在する。ＲＥＭ法においては、抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、並びに放射線照射により増殖性をなくしたＰＢＭＣ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ，末梢血単核細胞）とエプスタイン−バールウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ，以下ＥＢＶと略す）感染細胞とを用いて抗原特異的ＣＴＬ数を増殖させているが、Ｔ細胞へのＥＢＶトランスフォームＢ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）の混入の危険性が否定されない点（安全性の問題）、フィーダ細胞として大量のＰＢＭＣ（必要とする抗原特異的ＣＴＬ数の少なくとも約４０倍のＰＢＭＣ）が必要である点、増殖したＣＴＬの抗原特異的細胞傷害活性が充分満足しうるものではない点、Ｔ細胞クローン以外のＴ細胞集団を用いて増殖させた場合、Ｔ細胞が有する抗原特異的な細胞傷害活性は細胞の増殖と共に低下する点、等の問題を有している。

すなわち、従来の抗原特異的ＣＴＬ調製法では、治療への使用に有効な抗原特異的な細胞傷害活性を有するＣＴＬを、短期間で、かつ充分な量を調製するという、養子免疫療法において必要不可欠な問題が未だ解決されていないのが現状である。
グリーンバーグ（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｐ．Ｄ．）著、アドバンセズ・イン・イムノロジー（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、１９９２年 ロイゼル Ｐ．ら（Ｒｅｕｓｓｅｒ Ｐ．，ｅｔ ａｌ．）、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、第７８巻、第５号、第１３７３〜１３８０頁（１９９１） ポール Ｗ．Ｅ．ら（Ｐａｕｌ Ｗ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第２９４巻、第５８４３号、第６９７〜６９９頁（１９８１） ローゼンバーグ Ｓ．Ａ．ら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．）、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．）、第３１３巻、第２３号、第１４８５〜１４９２（１９８５） ローゼンバーグ Ｓ．Ａ．ら（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．）、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、第３１９巻、第２５号、第１６７６〜１６８０頁（１９８８） ホ Ｍ．ら（Ｈｏ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．）、Ｂｌｏｏｄ、第８１巻、第８号、第２０９３〜２１０１頁（１９９３） レナード Ｍ．Ｊ．ら（Ｌｅｎａｒｄｏ Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ、第３５３巻、第６３４７号、第８５８〜８６１頁（１９９１） ボーメ Ｓ．Ａ．ら（Ｂｏｅｈｍｅ Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．）、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第２３巻、第７号、第１５５２〜１５６０頁（１９９３） ギリス Ｓ．ら（Ｇｉｌｌｉｓ Ｓ．ｅｔ ａｌ）、イムノロジカル・レビューズ（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．）、第５４巻、第８１〜１０９頁（１９８１〕 リデル Ｓ．Ａ．ら（Ｒｉｄｄｅｌｌ Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５７巻、第５０６７号、第２３８〜２４０頁（１９９２） リデル Ｓ．Ａ．ら（Ｒｉｄｄｅｌｌ Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．）、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、第１４６巻、第８号、第２７９５〜２８０４頁（１９９１） リデル Ｓ．Ａ．ら（Ｒｉｄｄｅｌｌ Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．）、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ）、第１２８巻、第２号、第１８９〜２０１頁（１９９０） 米国特許第５，０５７，４２３号 国際公開第９６／０６９２９号パンフレット

本発明の目的は、養子免疫療法への使用に適した、抗原特異的な細胞傷害活性を高いレベルで保持したＣＴＬを拡大培養ならびに維持する方法を提供することにある。

本発明は、下記（Ａ）〜（Ｅ）からなる群より選択される少なくとも１種の物質（本発明においては、当該物質を有効成分として使用する）により、ＣＴＬの拡大培養及び継続培養において、意外にもＣＴＬの抗原特異的な細胞傷害活性の維持または増強能（以下、作用という場合がある）が発揮されることを見出し、完成するに至ったものである。
（Ａ）ＣＤ４４に結合活性を有する物質、
（Ｂ）ＣＤ４４リガンドがＣＤ４４に結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質、
（Ｃ）成長因子の成長因子レセプターへの結合を阻害し得る物質、
（Ｄ）成長因子が成長因子レセプターに結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質、並びに
（Ｅ）フィブロネクチン、そのフラグメント又はそれらの混合物。

即ち、本発明は、
〔１〕 抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を拡大培養する方法であって、
（ａ）ＶＬＡ−４結合ドメイン、
（ｂ）ＶＬＡ−５結合ドメイン、および
（ｃ）ヘパリン結合ドメイン、
からなる群より選択される少なくとも１種のドメインを有するフィブロネクチンのフラグメント又はその混合物の存在下に、細胞傷害性Ｔ細胞への分化能を有する前駆細胞を抗原提示細胞と共にインキュベートして抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する工程（工程１）、ならびに
前記フィブロネクチンのフラグメント又はその混合物の存在下に、前記工程１で誘導された細胞傷害性Ｔ細胞をインキュベートする工程（工程２）、
を含むことを特徴とする方法、
〔２〕 工程２において、さらに抗ＣＤ３抗体の存在下に細胞傷害性Ｔ細胞をインキュベートする前記〔１〕記載の方法、
〔３〕 工程２において、細胞傷害性Ｔ細胞をフィーダ細胞と共にインキュベートする前記〔１〕又は〔２〕記載の方法、
〔４〕 フィーダ細胞が非ウイルス感染細胞である前記〔３〕記載の方法、
〔５〕 フィブロネクチンのフラグメントが、配列表の配列番号１〜１３に記載のアミノ酸配列のいずれか１つからなるフラグメントである前記〔１〕記載の方法、
〔６〕 抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を維持するための方法であって、（ａ）ＶＬＡ−４結合ドメイン、
（ｂ）ＶＬＡ−５結合ドメイン、および
（ｃ）ヘパリン結合ドメイン、
からなる群より選択される少なくとも１種のドメインを有するフィブロネクチンのフラグメント又はその混合物の存在下に、細胞傷害性Ｔ細胞への分化能を有する前駆細胞を抗原提示細胞と共にインキュベートして抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する工程、ならびに
前記フィブロネクチンのフラグメント又はその混合物の存在下に、前記工程で誘導された細胞傷害性Ｔ細胞を継続培養する工程、
を含むことを特徴とする方法、
〔７〕 フィブロネクチンのフラグメントが、配列表の配列番号１〜１３に記載のアミノ酸配列のいずれか１つからなるフラグメントである前記〔６〕記載の方法、
〔８〕 前記〔１〕〜〔７〕いずれかに記載の方法によって得られた細胞傷害性Ｔ細胞含有培養物から、抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を高含有する細胞集団を選択する工程を含む細胞傷害性Ｔ細胞の回収方法、
に関する。

本発明により、養子免疫療法への使用に適した、抗原特異的な細胞傷害活性を高いレベルで保持したＣＴＬを拡大培養ならびに維持する方法が提供される。

以下、本発明を具体的に説明する。
（１）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法
通常、抗原提示細胞により誘導されたＣＴＬは、維持、増殖させる間にその抗原特異的な細胞傷害活性を低下させていくことが知られている。本発明により、誘導後の細胞を長期間にわたって維持、あるいはこれを増殖させても、従来観察されたような抗原特異的な細胞傷害活性の著しい低下が生じない抗原特異的なＣＴＬの誘導方法が提供される。
本発明のＣＴＬの誘導方法は前記有効成分の存在下にＣＴＬを誘導することを１つの大きな特徴とする。ＣＴＬの誘導は、当該有効成分の存在下、得られるＣＴＬに所望の抗原に対する認識能力を付与するために、適切な抗原提示細胞とともにＣＴＬへの分化能を有する前駆細胞をインキュベートすることにより実施される。前駆細胞はＣＴＬになる前段階で、しかもＣＴＬに分化するように運命付けられている細胞であれば特に限定されるものではなく、例えば末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ナイーブ細胞、メモリー細胞等が挙げられる。抗原提示細胞は、Ｔ細胞に対して認識すべき抗原を提示する能力を有する細胞であれば特に限定はない。例えば、単球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、線維芽細胞等に所望の抗原を提示させ、本発明に使用することができる。

抗原提示細胞は、抗原提示能を有する細胞に抗原ペプチドを付加し、その表面に抗原ペプチドを提示させることにより調製することができる〔例えば、ベドナレク Ｍ．Ａ．ら（Ｂｅｄｎａｒｅｋ Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１４７巻、第１２号、第４０４７〜４０５３頁（１９９１）を参照〕。また、抗原提示能を有する細胞が抗原を処理（ｐｒｏｃｅｓｓ）する能力を有している場合には、当該細胞に抗原を付加することにより、抗原が細胞内に取り込まれてプロセッシングを受け、断片化された抗原ペプチドが細胞表面に提示される。なお、抗原ペプチドを、抗原提示能を有する細胞に付加する場合、使用される抗原提示細胞、誘導しようとするＣＴＬのＨＬＡ拘束性に合致する抗原ペプチドが使用される。

なお、本発明において使用される抗原は特に限定されるものではなく、例えば、細菌、ウィルスなどの外来性抗原や腫瘍関連抗原（癌抗原）などの内在性抗原等が挙げられる。

本発明においては、抗原提示細胞は非増殖性とすることが好ましい。細胞を非増殖性とするためには、例えばＸ線等の放射線照射又はマイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）等の薬剤による処理を行えばよい。

本発明のＣＴＬの誘導方法において使用される培地には特に限定はなく、ＣＴＬ、その前駆細胞、ならびに抗原提示細胞の維持、生育に必要な成分を混合して作製された公知の培地を使用することができ、たとえば市販の培地であってもよい。これらの培地はその本来の構成成分以外に適当なタンパク質、サイトカイン類、その他の成分を含んでいてもよい。好適には、インターロイキン−２（ＩＬ−２）を含有する培地が本発明に使用される。また、これらのタンパク質、サイトカイン類、その他の成分は、本発明の方法に使用する培養器材やマイクロビーズ等の基体に固定化して使用してもよい。それらの成分は、所望の効果が得られるような量にて後述するような公知の固定化方法により培養器材等に固定化すればよい。

ＣＤ４４は造血系細胞、線維芽細胞、マクロファージなどに広く存在している細胞表面レセプターであり、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、オステオポンチン、コラーゲンタイプ１、コラーゲンタイプ４、フィブロネクチン、セルグリシンなどがそのリガンドとして報告されている。その機能としては、細胞−細胞間、および細胞−細胞外基質間の接着を介する細胞内への情報伝達により、他の接着分子の活性化、サイトカイン産生等の機能を発揮することが知られている。ＣＤ４４はＣＴＬにも存在しており、ＣＤ４４にヒアルロン酸や抗ＣＤ４４抗体が結合すると、ＣＤ４４の細胞内領域に存在するチロシンキナーゼドメインの活性化、これによる細胞内基質タンパク質のチロシンのリン酸化がおこり、細胞内情報伝達が行われることが知られている。すなわち、ＣＤ４４にそのリガンドや抗ＣＤ４４抗体が結合することによりシグナルが発せられ、種々の機能へとつながることが知られている。

本発明において、ＣＤ４４に結合活性を有する物質としては、ＣＴＬの特異的な細胞傷害活性の維持あるいは増強能を示す限り、特に限定はないが、例えばＣＤ４４リガンド及び／又は抗ＣＤ４４抗体が例示される。ＣＤ４４リガンドとしては、ＣＴＬの特異的な細胞傷害活性の維持あるいは増強能を示す限り、特に限定はないが、例えばヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、オステオポンチン、コラーゲンタイプ１、コラーゲンタイプ４、フィブロネクチン、セルグリシン等が挙げられ、特に好適にはヒアルロン酸が例示される。また、抗ＣＤ４４抗体としては、ＣＴＬの特異的な細胞傷害活性の維持あるいは増強能を示す限り、特に限定はないが、例えば市販の抗ＣＤ４４抗体が使用でき、誘導体、例えば蛍光標識化誘導体等も、ＣＴＬの特異的な細胞傷害活性の維持あるいは増強能を示す限り、特に限定なく使用することができる。

また、本発明においては、ＣＤ４４とＣＤ４４に結合活性を有する物質との結合の有無にかかわらず、ＣＤ４４リガンドがＣＤ４４に結合することにより発せられるシグナルを制御することによっても、所望の効果を得ることができる。すなわち、本発明は、ＣＤ４４に結合活性を有する物質の代わりに、ＣＤ４４リガンドがＣＤ４４に結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質を有効成分として用いても実施することができる。ここでＣＤ４４リガンドがＣＤ４４に結合することにより発せられるシグナルとしては、当該シグナルを受け取った生体分子から発せられるシグナルをも包含する。すなわち当該シグナルとしては、例えばＣＤ４４の細胞内領域に存在するチロシンキナーゼドメインの活性化、活性化された前記チロシンキナーゼによる細胞内基質タンパク質のチロシンのリン酸化等が挙げられ、これらのシグナルを制御する物質としては、例えば各種リン酸化酵素等が挙げられる。なお、本明細書において制御とは、シグナル伝達経路において活性化された情報を下流域へ伝達すること、又は活性化された情報の下流域への伝達を阻害することをいう。

成長因子は各種細胞の分裂や発達を促すポリペプチドの総称であり、細胞膜上の特異的レセプターを介して標的細胞に作用し、そのレセプターの多くは細胞内領域に存在するチロシンキナーゼドメインを活性化して標的細胞への情報伝達が行われることが知られている。

本発明において、成長因子としては、成長因子の成長因子レセプターへの結合が阻害される、もしくは成長因子の成長因子レセプターへの結合により発せられるシグナルが制御されることにより、ＣＴＬの特異的な細胞傷害活性の維持あるいは増強能が示されるものである限り、特に限定はないが、例えば、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インシュリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、インシュリン様増殖因子−２（ＩＧＦ−２）、神経成長因子（ＮＧＦ）、神経栄養性因子、上皮成長因子、ミルク由来成長因子、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、脳由来線維芽細胞成長因子、酸性線維芽細胞増殖因子、ケラチノサイト増殖因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血小板塩基性タンパク質、血小板第４因子、結合組織活性化ペプチド、コロニー形成刺激因子、エリスロポエチン、スロンボポエチン、Ｔ細胞成長因子、Ｂ細胞成長因子、軟骨由来因子、軟骨由来成長因子、骨由来成長因子、骨格成長因子、内皮細胞成長因子、内皮細胞由来成長因子、眼由来成長因子、精巣由来成長因子、セルトリ細胞由来成長因子、乳腺刺激因子、脊髄由来成長因子、マクロファージ由来成長因子、リサイクル間葉成長因子、形質転換増殖因子−α、形質転換増殖因子−β、ヘパリン結合性ＥＧＦ様増殖因子、アンフィレグリン、平滑筋細胞由来成長因子（ＳＤＧＦ）、ベータ−セルリン、エピレグリン、ニューレグリン−１、−２及び−３、血管内皮増殖因子、ニューロトロフィン、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン（ＮＴ）−３、−４、−５、−６及び−７、グリア細胞株由来神経栄養性因子、幹細胞因子、ミッドカイン、プレイオトロフィン、Ｅｐｈｒｉｎ、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ、アクチビン、腫瘍壊死因子等が例示される。本発明によれば、成長因子としては好適には肝細胞増殖因子、インシュリン様増殖因子−１、インシュリン様増殖因子−２が例示される。

ＨＧＦは肝細胞増殖作用、タンパク質合成促進作用、胆汁うっ滞改善作用、さらには薬剤による腎障害の予防作用などを示す成長因子である。ＨＧＦのレセプターとしてはｃ−Ｍｅｔが知られており、ＨＧＦの示す多様な生理作用はすべてｃ−Ｍｅｔを介して行われている。ｃ−Ｍｅｔはその細胞内ドメインにチロシンキナーゼドメインを有している。

インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ）はインシュリン抗体で中和できないインシュリン様の活性物質である。ＩＧＦにはＩＧＦ−１とＩＧＦ−２の２種が存在することが知られている。ＩＧＦの結合するレセプターにはインシュリンレセプター、ＩＧＦ−１レセプター、ＩＧＦ−２レセプターがあり、特にインシュリンレセプターおよびＩＧＦ−１レセプターにはその細胞内ドメインにチロシンキナーゼドメインを有している。

本発明において、成長因子の成長因子レセプターへの結合を阻害し得る物質としては、ＣＴＬの特異的な細胞傷害活性の維持あるいは増強能を示す限り、特に限定はないが、成長因子に結合活性を有し、成長因子と複合体を形成することにより成長因子が成長因子レセプターに結合するのを阻害する物質、もしくは成長因子レセプターに結合活性を有し、成長因子が成長因子レセプターに結合するのを阻害する物質が挙げられる。前者としては、例えば抗成長因子抗体、好適には抗ＨＧＦ抗体、抗ＩＧＦ−１抗体、抗ＩＧＦ−２抗体が例示される。また後者としては、例えば、抗成長因子レセプター抗体、好適には抗ｃ−Ｍｅｔ抗体、抗インシュリンレセプター抗体、抗ＩＧＦ−１レセプター抗体、抗ＩＧＦ−２レセプター抗体が例示される。

また、本発明においては、成長因子と成長因子レセプターとの結合の有無にかかわらず、成長因子が成長因子レセプターに結合することにより発せられるシグナルを制御することによっても、所望の効果を得ることができる。すなわち、本発明は、成長因子の成長因子レセプターへの結合を阻害し得る物質の代わりに、成長因子が成長因子レセプターに結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質を有効成分として用いても実施することができる。ここで成長因子が成長因子に結合することにより発せられるシグナルとしては、当該シグナルを受け取った生体分子から発せられるシグナルをも包含する。当該シグナルとしては、例えば成長因子の細胞内領域に存在するチロシンキナーゼドメインの活性化、これによる細胞内基質タンパク質のチロシンのリン酸化等が挙げられ、これらのシグナルを制御する物質としては例えば、キナーゼインヒビター等が挙げられる。

本明細書中に記載のフィブロネクチンおよびそのフラグメントは、天然から得られたもの、または慣用の遺伝子組換え技術等を用いて人為的に合成されたもののいずれでもよい。フィブロネクチンおよびそのフラグメントは、例えば、ルオスラーティ Ｅ．ら〔Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ Ｅ．，ｅｔ ａｌ、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第２５６巻、第１４号、第７２７７〜７２８１頁（１９８１）〕の開示に基づき、天然起源の物質から実質的に純粋な形態で製造することができる。ここで、本明細書に記載された実質的に純粋なフィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントとは、これらが天然においてフィブロネクチンと一緒に存在する、その供給源に由来する他のタンパク質等を本質的に含有していないことを意味する。上記のフィブロネクチン、およびそのフラグメントは、それぞれ単独で、もしくは複数の種類のものを混合して本発明に使用することができる。

本発明に使用できるフィブロネクチンフラグメント、ならびに該フラグメントの調製に関する有用な情報は、キミヅカ Ｆ．ら〔Ｋｉｍｉｚｕｋａ Ｆ．，ｅｔ ａｌ．、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１１０巻、第２号、第２８４〜２９１頁（１９９１）〕、コーンブリット Ａ．Ｒ．ら〔Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔ Ａ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ．）、第４巻、第７号、１７５５〜１７５９（１９８５）〕、およびセキグチ Ｋ．ら〔Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ Ｋ．，ｅｔ ａｌ、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２５巻、第１７号、第４９３６〜４９４１頁（１９８６）〕等より得ることができる。

フィブロネクチンは分子量２２０〜２５０ｋＤの巨大な糖タンパク質であり、コラーゲン、ヘパリン、フィブリン、インテグリンファミリーのＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５、細胞、細菌など多くの生体高分子と結合する。また、フィブロネクチン分子はその機能的領域として、いくつかのドメイン構造に分けられている（代謝、Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．１１（１９８６））。ドメイン１は分子量約３０，０００で、ヘパリン、フィブリン、黄色ブドウ球菌などに結合する。ドメイン２は分子量約４０，０００でコラーゲンに結合する。ドメイン３は分子量約２０，０００でフィブリンに弱く結合すると考えられている。ドメイン４は分子量約７５，０００で、細胞結合ドメインである。ドメイン５（ヘパリン結合ドメイン）は分子量約３５，０００でヘパリンに強く結合する。ドメイン６は分子量約３０，０００でフィブリンに結合する。ドメイン７はカルボキシル末端の分子量約３，０００のドメインである。さらに、ドメイン４にはＶＬＡ−５結合ドメインを含み、ドメイン５と６の間にはＶＬＡ−４結合ドメインを含んでいる。また、フィブロネクチンは、ＥＤ−Ａ、ＥＤ−Ｂ、ＩＩＩＣＳといったの３つのモジュールを有しており、選択的スプライシングが行われることが知られている。さらにＩＩＩＣＳには細胞接着活性を有するＣＳ−１、およびＣＳ−５を有している（ＦＩＢＲＯＮＥＣＴＩＮ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｄｅａｎｅ Ｆ．Ｍｏｓｈｅｒ，ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＲＥＳＳ，ＩＮＣ，（１９８９））。

本発明においては、特に限定するものではないが、フィブロネクチンフラグメントとしては、好適にはこれらのドメイン１〜７、ＶＬＡ−４結合ドメイン、ＶＬＡ−５結合ドメイン、ＥＤ−Ａ、ＥＤ−Ｂ、ＩＩＩＣＳ、ＣＳ−１およびＣＳ−５から選択される領域を有するフラグメントが例示される。また、本発明に使用されるフィブロネクチンフラグメントの分子量としては、特に限定はないが、好適には１〜２００ｋＤ、より好適には５〜１９０ｋＤ、さらに好適には１０〜１８０ｋＤのフラグメントが好適に使用される。

本発明においては、特に好適なフィブロネクチンフラグメントとしては、（ａ）フィブロネクチン由来の細胞結合ドメインであるインテグリンα５β１（ＶＬＡ−５）結合ドメイン、（ｂ）インテグリンα４β１（ＶＬＡ−４）結合ドメインおよび（ｃ）ヘパリン結合ドメインからなる群より選択される少なくとも１つのドメインを有するフラグメントが好適に使用される。ＶＬＡ−５結合ドメインを含むフラグメントとしては配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有するフラグメントが、ＶＬＡ−４結合ドメインを有するフラグメントとしては配列番号：２に記載のアミノ酸配列を有するフラグメントが、さらにヘパリン結合ドメインを含むフラグメントとしては配列番号：３に記載のアミノ酸配列を有するフラグメントがそれぞれ例示される。

なお、本発明において好適に使用されるフラグメントとしては、上記の結合活性を有している範囲において、フィブロネクチン由来のアミノ酸配列に１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加を有していてもよい。例えば、２つの異なるドメイン間にリンカーとして１以上のアミノ酸が挿入されたフラグメントも本発明に使用することができる。

本明細書中に記載の実質的に純粋なフィブロネクチンフラグメントは、例えば、米国特許第５，１９８，４２３号の記載に基づいて遺伝子組換え体より製造することもできる。特に、下記実施例でＨ−２７１（配列番号：３）、Ｈ−２９６（配列番号：４）、ＣＨ−２７１（配列番号：５）およびＣＨ−２９６（配列番号：６）として記載されている組換えフラグメントならびにこれらを取得する方法は、この特許に詳細に記載されている。また、下記実施例で使用したＣ−２７４フラグメント（配列番号：１）は、米国特許第５，１０２，９８８号に記載された方法により得ることができる。さらに、Ｃ−ＣＳ１フラグメント（配列番号：７）は、日本特許第３１０４１７８号に記載された方法により得ることができる。

上記の、ＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６、Ｃ−２７４、Ｃ−ＣＳ１の各フラグメントはＶＬＡ−５に結合する活性を有する細胞結合ドメインを有するポリペプチドである。また、Ｃ−ＣＳ１、Ｈ−２９６、ＣＨ−２９６はＶＬＡ−４に結合する活性を有する細胞結合ドメインを有するポリペプチドである。さらに、Ｈ−２７１、Ｈ−２９６、ＣＨ−２７１およびＣＨ−２９６はヘパリン結合ドメインを有するポリペプチドである。

上記の各ドメインが改変されたフラグメントも本発明に使用することができる。フィブロネクチンのヘパリン結合部位は３つのＩＩＩ型類似配列（ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４）によって構成されている。前記ＩＩＩ型類似配列のうちの１つもしくは２つを欠失したヘパリン結合部位を含むフラグメントも本発明に使用することが可能である。例えば、フィブロネクチンの細胞結合部位（ＶＬＡ−５結合ドメイン、Ｐｒｏ１２３９〜Ｓｅｒ１５１５）と１つのＩＩＩ型類似配列とが結合したフラグメントであるＣＨＶ−８９（配列番号：８）、ＣＨＶ−９０（配列番号：９）、ＣＨＶ−９２（配列番号：１０）、あるいは２つのＩＩＩ型類似配列とが結合したフラグメントであるＣＨＶ−１７９（配列番号：１１）、ＣＨＶ−１８１（配列番号：１２）が例示される。ＣＨＶ−８９、ＣＨＶ−９０、ＣＨＶ−９２はそれぞれＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４、ＩＩＩ−１２を含むものであり、ＣＨＶ−１７９はＩＩＩ−１３とＩＩＩ−１４を、ＣＨＶ−１８１はＩＩＩ−１２とＩＩＩ−１３を、それぞれ含んでいる。ＣＨＶ−８９、ＣＨＶ−９０、ＣＨＶ−１７９は、日本特許第２７２９７１２号に記載された方法により得ることができる。また、ＣＨＶ−１８１は国際公開第９７／１８３１８号パンフレットに記載された方法により得ることができる。さらに、ＣＨＶ−９２は上記文献に記載されたプラスミドに基づいて定型的にプラスミドを構築し、該プラスミドを用いて遺伝子工学的に取得することができる。

また、下記実施例に使用されたＨ−２７５−Ｃｙｓ（配列番号：１３）は、フィブロネクチンのヘパリン結合ドメインを有し、かつＣ末端にシステイン残基を有するフラグメントである。当該フラグメントも本発明に使用することができる。

これらのフラグメントまたはこれらのフラグメントから定型的に誘導できるフラグメントは、〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物寄託センター（旧通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所）に、下記受託番号のもとで寄託された微生物を用いて製造する、あるいは各微生物の保持するプラスミドを公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発等）により改変することにより製造することができる；
ＦＥＲＭ ＢＰ−２７９９（Ｈ−２７１をコードするプラスミドを保有する大腸菌）、
国際寄託日：１９８９年５月１２日
ＦＥＲＭ ＢＰ−２８００（ＣＨ−２９６をコードするプラスミドを保有する大腸菌）、
国際寄託日：１９８９年５月１２日
ＦＥＲＭ ＢＰ−５７２３（Ｃ−ＣＳ１をコードするプラスミドを保有する大腸菌）、
原寄託日：１９９０年３月５日
国際寄託への移管請求日：１９９６年１０月２３日
ＦＥＲＭ Ｐ−１０７２１（Ｈ−２９６をコードするプラスミドを保有する大腸菌）、
日本国内寄託日：１９８９年５月１２日
ＦＥＲＭ Ｐ−１２１８２（ＣＨＶ−８９をコードするプラスミドを保有する大腸菌）、
日本国内寄託日：１９９１年４月８日
ＦＥＲＭ Ｐ−１２１８３（ＣＨＶ−１７９をコードするプラスミドを保有する大腸菌）
日本国内寄託日：１９９１年４月８日

本発明で使用されるフラグメントの細胞結合ドメインと細胞との結合は、慣用の方法を使用してアッセイすることができる。例えば、このような方法には、ウイリアムズ Ｄ．Ａ．らの方法〔Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、第３５２巻、第６３３４号、第４３８〜４４１頁（１９９１）〕が含まれる。当該方法は、培養プレートに固定化したフラグメントに対する細胞の結合を測定する方法である。

また、上記方法において、細胞に換えてヘパリン、例えば標識ヘパリンを使用することにより、同様の方法でフラグメントのヘパリン結合ドメインの評価を行うことができる。

上記に述べたように、フィブロネクチンは巨大分子であることから、その利便性の点では、本発明において使用されるには、フィブロネクチンフラグメントが好適に使用される。また、本発明に使用されるフィブロネクチンまたはそのフラグメントは、動物由来の血漿や臓器から得られるものを使用した場合、動物に由来するウィルス（ＨＣＶ、ＨＩＶ等）のコンタミネーション、純度、均一性について注意を払う必要があることから、特に好適には上記のように遺伝子工学的に得られたフィブロネクチンまたはそのフラグメントを使用することが好ましい。

本発明において使用する有効成分は、単独でもしくは２種以上混合して用いることができる。

本発明においては、ＣＴＬへの分化能を有する前駆細胞を抗原提示細胞とともにインキュベート（共培養）してＣＴＬを誘導するための一般的な条件は公知の条件〔例えば、ベドナレク Ｍ．Ａ．（Ｂｅｄｎａｒｅｋ Ｍ．Ａ．）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１４７巻、第１２号、第４０４７〜４０５３頁（１９９１）を参照〕に従えばよい。共培養条件には特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができ、例えば、３７℃、５％ＣＯ_２等の条件で培養することができる。この共培養は通常、２〜１５日程度実施されるが、その間に抗原提示細胞を新たに調製したものに取り替えて再刺激を行ってもよい。また、適当な時間間隔で培地を新鮮なものに交換することができる。

共培養を行う培地中における、本発明の有効成分の含有量は所望の効果が得られれば特に限定するものではないが、例えば、好ましくは０．００１〜１０００μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０１〜１００μｇ／ｍｌである。なお、本明細書において、有効成分等の成分を培地中に含有するとは、細胞培養時に培地を入れて使用する培養器材や、培地に入れて使用するマイクロビーズ等の基体に当該成分を固定化しておき、それらの基体と培地とを接触させ、当該成分（培地との接触後、基体に固定化されているか否かを問わず）を培地に含めるという態様も包含する。なお、有効成分は培地中に溶解もしくは培養器材やマイクロビーズ等の基体に固定化して存在させるのが望ましい。また、前記有効成分としては、ヒアルロン酸、抗ＣＤ４４抗体、抗ＨＧＦ抗体、抗ＩＧＦ−１抗体、抗ＩＧＦ−２抗体、及びフィブロネクチンフラグメントからなる群から選択される少なくとも１種が好適である。

こうして誘導されたＣＴＬは所望の抗原を特異的に認識する能力を有しており、例えば該抗原を有する細胞を、その細胞傷害活性により特異的に破壊する。このＣＴＬの細胞傷害活性は公知の方法により評価できる。例えば、抗原提示細胞により提示されたペプチドと放射性物質、蛍光物質等で標識した標的細胞に対する傷害性、放射能の取り込みよって測定できるＣＴＬ増殖の抗原特異的な増加若しくはＣＴＬや標的細胞より抗原特異的に遊離されるＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ等のサイトカイン量を測定することにより評価することができる（後述の実施例１−１−（３）参照）。その他蛍光色素等によって標識された抗原ペプチドや複合体の使用によって直接確認することもできる。この場合、例えばＣＴＬをＣＴＬ特異性抗体とカップリングさせた第１蛍光マーカーと接触させてから第２蛍光マーカーとカップリングさせた抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体を接触させ、そして二重標識細胞の存在をＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）分析することにより評価することができる。

本発明の方法により誘導されたＣＴＬは誘導後の細胞を長期間にわたって維持、あるいはこれを急速に増殖させても、従来観察されたような抗原特異的な細胞傷害活性の著しい低下がないという優れた性質を有している。従って、誘導されたＣＴＬをクローン化することにより、安定した細胞傷害活性を有するリンパ球として維持することもできる。例えば、誘導されたＣＴＬに抗原、各種サイトカイン、抗ＣＤ３抗体刺激を与えることにより増殖させ、拡大培養することができる。このＣＴＬの維持、拡大培養には、特に限定はなく、公知の方法を用いることができ、例えば、後述する本発明の細胞傷害性Ｔ細胞の維持方法、拡大培養方法の使用が好適である。

（２）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞の維持方法
本発明の細胞傷害性Ｔ細胞の維持方法は、ＣＴＬを抗原特異的な細胞傷害活性を保ったままで維持する方法である。該方法は本発明の有効成分を含有する培地中でＣＴＬを継続培養することを１つの大きな特徴としており、該細胞の有する抗原特異的な細胞傷害活性を継続的に維持させることができる。

上記方法を適用可能なＣＴＬには限定はなく、公知の方法で得られたＣＴＬをその抗原特異的な細胞傷害活性を維持させたまま、本発明の方法で維持することができる。また、上記（１）に記載の本発明の細胞傷害性Ｔ細胞の誘導方法によって得られたＣＴＬの維持にも好適に使用される。

本発明においては、ＣＴＬの継続培養の一般的な条件は公知の条件〔例えば、カーター Ｊ．ら（Ｃａｒｔｅｒ Ｊ．ｅｔ ａｌ．）、イムノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第５７巻、第１号、第１２３〜１２９頁（１９８６）を参照〕に従えばよい。本発明の細胞傷害性Ｔ細胞の維持方法に使用される培地にも特に限定はなく、たとえば上記のＣＴＬの誘導方法に使用される培地を使用することができる。

本発明の方法は前記有効成分を含有する培地により実施される。培養を行う培地中における、本発明の有効成分の含有量は所望の効果が得られれば特に限定されるものではないが、好ましくは０．００１〜１０００μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０１〜１００μｇ／ｍｌである。なお、有効成分は培地中に溶解もしくは培養器材やマイクロビーズ等の基体に固定化して存在させるのが好ましい。また、前記有効成分としては、ヒアルロン酸、抗ＣＤ４４抗体、抗ＨＧＦ抗体、抗ＩＧＦ−１抗体、抗ＩＧＦ−２抗体およびフィブロネクチンフラグメントからなる群から選択される少なくとも１種が好適である。さらに、培地にはサイトカインやその他の公知の成分を添加することができる。本発明には好適にはＩＬ−２を含有する培地が使用される。また、前記同様に、これらのサイトカインやその他の公知の成分は培養器材やマイクロビーズ等の基体に固定化して使用してもよい。培養条件には特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができ、例えば、３７℃ ５％ＣＯ_２等の条件で培養することができる。また、適当な時間間隔で培地を新鮮なものに交換することができる。

上記のように、本発明の有効成分を含有する培地中にてＣＴＬを継続的に培養することにより、その特異的な細胞傷害活性の低下を抑制してＣＴＬを維持することができる。このような本発明の効果は、本発明の方法で維持されたＣＴＬの有する細胞傷害活性を、実施例１−１−（３）に記載された方法により測定し、確認することができる。また、該方法で維持されたＣＴＬは公知の拡大培養法により増殖させることができ、こうして増殖されたＣＴＬも特異的な細胞傷害活性を保持している。なお、ＣＴＬの拡大培養方法としては、後述する本発明のＣＴＬの拡大培養方法を好適に使用することができる。

（３）本発明の細胞傷害性Ｔ細胞の拡大培養方法
細胞傷害性Ｔ細胞は適切な条件下で培養を行うことにより、細胞数を増加させることができる（拡大培養）。従来、いくつかのＣＴＬの拡大培養方法が開発されているが、短期間で効率よくＣＴＬを増殖させることが可能なものとしてリデル（Ｒｉｄｄｅｌｌ）らの開発した前出のＲＥＭ法が知られている。該方法はＸ線照射により非増殖性としたＰＢＭＣ（フィーダ細胞として使用）とＥＢＶで形質転換されたＢ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）とを使用し、ＩＬ−２、抗ＣＤ３モノクローナル抗体の存在下にＣＴＬを培養する方法である。しかしながら、該方法ではＴ細胞へのＥＢＶ−Ｂ細胞の混入の危険性が否定されない点が問題とされていた。

本発明の細胞傷害性Ｔ細胞の拡大培養方法は、抗原特異的な細胞傷害活性を保ったままで当該細胞数を増加させることが可能な方法である。該方法は本発明の前記有効成分の存在下に細胞をインキュベート（培養）することを特徴とする。

本発明の方法において、適用可能なＣＴＬには限定はなく、生体から得られた細胞障害活性を有するＣＴＬ、公知の方法で誘導されたＣＴＬ、上記（１）に記載の本発明のＣＴＬの誘導方法によって得られたＣＴＬ、上記（２）に記載の本発明のＣＴＬの維持方法により維持されたＣＴＬを、本発明のＣＴＬの拡大培養に好適に使用することができる。なお、本発明においては、ＣＴＬの拡大培養の一般的な条件は公知の条件〔例えば、ウバーティ Ｊ．Ｐ．ら（Ｕｂｅｒｔｉ Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．）、クリニカル イムノロジー アンド イムノパソーロジー（Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．）、第７０巻、第３号、第２３４〜２４０頁（１９９４）を参照〕に従えばよい。

本発明の細胞傷害性Ｔ細胞の拡大培養方法においては、前記有効成分に加え、抗ＣＤ３抗体、好ましくは抗ＣＤ３モノクローナル抗体をさらに含有する培地中でＣＴＬを共培養するのが望ましい。また、さらに好適には、ＣＴＬは適切なフィーダ細胞と共培養される。

上記方法に使用される培地には特に限定はなく、ＣＴＬの培養、生育に必要な成分を混合して作製された公知の培地を使用することができ、たとえば市販の培地であってもよい。なお、ＣＴＬをフィーダ細胞と共培養する場合には、ＣＴＬ、フィーダ細胞の両者の維持、生育に適した培地であることが望ましい。これらの培地は、その本来の構成成分以外に適当なタンパク質、サイトカイン類、その他の公知の成分を含んでいてもよく、例えば、ＩＬ−２を含有する培地が本発明に好適に使用される。抗ＣＤ３抗体、特に抗ＣＤ３モノクローナル抗体はＣＴＬ上のＴ細胞レセプターを活性化する目的で添加することができる。なお、抗ＣＤ３抗体の培地中における含有量は公知の条件に従って決定すればよく、例えば０．０１〜４００μｇ／ｍｌが好適である。なお、これらのタンパク質、サイトカイン類、その他の公知の成分については、培地中に溶解して含有させてもよく、また、培養器材やマイクロビーズ等の基体に固定化して含有させてもよい。

本発明のＣＴＬの拡大培養方法は、前記有効成分を培地に含有させて実施される。なお、前記有効成分としては、ヒアルロン酸、抗ＣＤ４４抗体、抗ＨＧＦ抗体、抗ＩＧＦ−１抗体、抗ＩＧＦ−２抗体およびフィブロフラグメントからなる群から選択される少なくとも１種が好適である。また、培養を行う培地中における、本発明の有効成分の含有量は所望の効果が得られれば特に限定されるものではないが、好ましくは０．００１〜１０００μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０１〜１００μｇ／ｍｌである。なお、有効成分は培地中に溶解もしくは培養器材やマイクロビーズ等の基体に固定化して存在させるのが好ましい。

本発明の方法に使用されるフィーダ細胞は、抗ＣＤ３抗体、特に抗ＣＤ３モノクローナル抗体と協同してＣＴＬを刺激し、Ｔ細胞レセプター又は副刺激受容体（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を活性化するものであれば特に限定はない。本発明には、例えば、ＰＢＭＣやＥＢＶ−Ｂ細胞が使用される。通常、フィーダ細胞は放射線照射のような手段で増殖能を奪ったうえで使用される。なお、フィーダ細胞の培地中における含有量は公知の方法に従って決定すればよく、例えば、１×１０^５〜１×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌが好適である。

本発明の特に好ましい態様においては、フィーダ細胞として、非ウィルス感染細胞、例えば、ＥＢＶ−Ｂ細胞以外のもの、具体的には、自己もしくは非自己由来のＰＢＭＣ等が使用される。これにより、拡大培養されたＣＴＬ中にＥＢＶ−Ｂ細胞が混在する可能性を排除することができ、養子免疫療法のようなＣＴＬを利用した医療の安全性を高めることが可能となる。

本発明のＣＴＬの拡大培養方法において、その培養条件には特に限定はなく、通常の細胞培養に使用される条件を使用することができ、例えば、３７℃ ５％ＣＯ_２等の条件で培養することができる。また、適当な時間間隔で培地を新鮮なものに交換することができる。

なお、本発明のＣＴＬの拡大培養方法については、前記有効成分を使用されている培地に含有させていれば特に限定は無く、上記以外の従来のＣＴＬ拡大培養法において、本発明の有効成分を培地に含有させる態様も本発明に包含される。

本発明の拡大培養方法によれば、例えば１４日間の拡大培養によって１０^２〜１０^３倍に細胞数の増加したＣＴＬを得ることができる。さらに、こうして得られたＣＴＬは従来のＣＴＬ拡大培養法、例えばＲＥＭ法で得られたものに比べてより高い抗原特異的な細胞傷害活性を保持している。

このような本発明の効果は、本発明の方法で拡大培養されたＣＴＬの有する細胞傷害活性を、実施例１−１−（３）に記載された方法により測定し、確認することができる。

また、本発明に使用される有効成分は、ＣＴＬの抗原特異的な細胞傷害活性の維持または増強に働く、ＣＴＬ誘導剤、ＣＴＬ維持剤あるいはＣＴＬ拡大培養剤（以下、これらをＣＴＬ培養剤という）として使用することができる。当該ＣＴＬ培養剤は、有効成分そのもの、またはさらにその他の任意の成分、たとえば、ＣＴＬの誘導方法において使用される培地、ＣＴＬの維持方法において使用される培地またはＣＴＬの拡大培養方法において使用される培地に含まれる、ＣＴＬやフィーダ細胞等の培養、生育に必要な成分、ならびに適当なタンパク質、サイトカイン類（好適にはＩＬ−２）、所望のその他の成分とからなる。また、これらのＣＴＬ培養剤を含有する培地はＣＴＬ誘導用、維持用、あるいは拡大培養用培地（ＣＴＬ用培地）として使用することができる。また、これらのＣＴＬ培養剤は培地に混合（溶解を含む）させておいてもよく、培養器材やマイクロビーズ等の基体に固定化しておいてもよい。これらの培地は細胞培養のための基本的な成分を任意に含むものである。なお、前記ＣＴＬ培養剤およびＣＴＬ用培地は所望の成分を公知の方法により適宜混合することにより製造することができる。

さらに本発明によれば、例えば、培養プレート、シャーレ、フラスコ、バッグ等の任意の培養器材（容器）、もしくはビーズ、メンブレン等の支持担体等の基体（詳しくは、細胞培養時に培地が接触する基体の部分）に前記有効成分を固定化してなるＣＴＬ誘導用、維持用又は拡大培養用の、それらの基体を提供することもできる。基体への有効成分の固定化量としては、本発明の所望の効果が得られれば特に限定されるものではないが、当該基体を使用してＣＴＬを誘導等する場合に、有効成分が、本発明のＣＴＬ誘導方法、維持方法又は拡大培養方法の説明において記載した有効成分の好ましい培地含有量範囲で、基体において使用する任意の培地中に含まれうることとなる量であるのが好ましい。また、前記有効成分に加え、任意に、前記タンパク質、サイトカイン類、その他の成分を固定化してもよい。固定化方法としては、特に限定はないが、例えば、タンパク質吸着、ビオチンとアビジンもしくはストレプトアビジンとの結合、化学的固定化等の公知の固定化方法を使用できる。当該器材は本発明のＣＴＬ誘導方法、維持方法又は拡大培養方法において好適に使用される。

上記のＣＴＬの誘導方法、維持方法ならびに拡大培養方法を用いることにより得られたＣＴＬ含有培養物中には、通常、ヘルパーＴ細胞等のＣＴＬ以外の細胞も混在している。本発明においては、該培養物から遠心分離等により該培養物中の細胞を回収し、本発明の方法により得られたＣＴＬとしてそのまま使用することができる。

また、さらに該培養物から公知の方法により、抗原特異的な細胞傷害活性を有するＣＴＬを高含有する細胞集団（あるいは培養物）を分離し、本発明の方法により得られたＣＴＬとして使用することもできる。すなわち、本発明においては、前記ＣＴＬ含有培養物中のＣＴＬ以外の細胞（例えば、ヘルパーＴ細胞等）とＣＴＬとの分離操作を施すことにより抗原特異的な細胞傷害活性に関して濃縮された細胞集団を調製して使用することができる。このような前記細胞集団を分離することによる抗原特異的な細胞傷害活性の濃縮は従来のＲＥＭ法ではなしえなかったことである。よって、本発明の一態様として、本発明のＣＴＬの誘導方法、維持方法ならびに拡大培養方法のいずれかにより得られたＣＴＬ含有培養物から抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を高含有する細胞集団を選択する工程を含む細胞傷害性細胞の回収方法が提供される。なお、本発明のＣＴＬの回収方法は、１つには高い抗原特異的な細胞傷害活性を有するＣＴＬの細胞集団を選択的に得る方法をいうが、広義には、当該ＣＴＬの細胞集団を生産または獲得する方法をいう。該細胞集団の選択方法については特に限定はないが、例えば上記のＣＴＬの誘導方法、維持方法ならびに拡大培養方法を用いて得られたＣＴＬ含有培養物からＣＴＬ細胞表面上に発現している細胞表面抗原に対する抗体、例えば抗ＣＤ８抗体を結合させた磁気ビーズまたはカラムを用いてＣＴＬのみを選択的に回収し、ＣＴＬを高含有する細胞集団を得ることができる。また、フローサイトメーターを用いてＣＴＬを選択的に分離することもできる。また、本発明のＣＴＬの誘導方法、維持方法ならびに拡大培養方法により得られたＣＴＬ含有培養物中から、ＣＴＬ以外の細胞を除去することにより、ＣＴＬを高含有する細胞集団を得ることができる。例えば、当該培養物からヘルパーＴ細胞を除去するためにヘルパーＴ細胞表面上に発現している細胞表面抗原に対する抗体、例えば抗ＣＤ４抗体を結合させた磁気ビーズまたはカラムを用いてヘルパーＴ細胞を選択的に除去し、ＣＴＬを高含有する細胞集団を得ることができる。また、ヘルパーＴ細胞の除去にはフローサイトメーターを用いることもできる。このようにして得られたＣＴＬを高含有する細胞集団は、ＣＴＬ含有培養物から非選択的に回収された細胞集団と比較してより強い細胞傷害活性を有しており、本発明の方法により得られたＣＴＬとしてより好適に使用できる。また、本発明においてはＣＴＬを高含有する細胞集団として、ＣＴＬのみの細胞集団も包含する。

また、本発明のＣＴＬの維持方法ならびに拡大培養方法により得られたＣＴＬを用いて、さらに本発明のＣＴＬの維持方法ならびに拡大培養方法を行うことによりＣＴＬの維持または拡大培養を行うこともできる。例えば、本発明の拡大培養方法により得られたＣＴＬから上記の方法によりＣＴＬを高含有する画分を得、該画分を用いて、再度、本発明の拡大培養方法を行うことにより、さらに細胞傷害活性の高いＣＴＬを得ることもできる。また、本発明の拡大培養方法により得られたＣＴＬを本発明の維持方法を用いてその細胞傷害活性を維持させておくこともできる。

さらに本発明は、上記の本発明のＣＴＬの誘導方法、維持方法ならびに拡大培養方法で得られたＣＴＬ（これらの方法で得られたＣＴＬ含有培養物から前記回収方法により回収されたＣＴＬを含む）を提供する。かかるＣＴＬは、いずれも抗原特異的な細胞傷害活性を有しており、長期間にわたる継続培養や拡大培養を行っても細胞傷害活性の低下が少ないという性質を有する。また、本発明は、当該ＣＴＬを有効成分として含有する治療剤を提供する。当該治療剤は、特に養子免疫療法への使用に適している。養子免疫療法においては、患者の治療に適した抗原特異的な細胞傷害活性を有するＣＴＬが、例えば静脈への投与によって患者に投与される。当該治療剤は製薬分野で公知の方法に従い、例えば、本発明の方法により調製されたＣＴＬを有効成分として、たとえば、公知の非経口投与に適した有機または無機の担体、賦形剤、安定剤等と混合することにより調製できる。当該ＣＴＬとしては特に、本発明のＣＴＬ拡大培養方法によってＥＢＶ感染細胞を使用することなく調製されたＣＴＬがこの目的に好適である。なお、治療剤におけるＣＴＬの含有量、治療剤の投与量、当該治療剤に関する諸条件は公知の養子免疫療法に従って適宜、決定できる。

以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定されるものではない。

実施例１ ヒアルロン酸を用いた特異的細胞傷害活性保持ＣＴＬの拡大培養
実施例１−１
（１） ＰＢＭＣの分離および保存
ＨＬＡ−Ａ２．１保有ヒト健常人ドナーより成分採血を実施後、採血液をＰＢＳ（−）で２倍希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−ｐａｑｕｅ〔ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製〕上に重層後、５００ｇ×２０分間遠心した。遠心後、中間層の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をピペットで回収、洗浄した。採取したＰＢＭＣは９０％ＦＢＳ〔バイオ ウイタカー（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）社製〕／１０％ＤＭＳＯ〔シグマ（ＳＩＧＭＡ）社製〕からなる保存液に懸濁し、液体窒素中にて保存した。ＣＴＬ誘導時にはこれら保存ＰＢＭＣを３７℃水浴中にて急速融解し、１０μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ〔カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）社製〕を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）で洗浄後、トリパンブルー染色法にて生細胞数を算出して各実験に供した。

（２） 抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導
抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導は、ベドナレク（Ｂｅｄｎａｒｅｋ）らの方法〔Ｂｅｄｎａｒｅｋ Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．、第１４７巻、第４０４７〜４０５３頁（１９９１）〕を一部改変して実施した。すなわち、５％ヒトＡＢ型血清、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（全てＢｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ナカライテスク社製）、１％ストレプトマイシン−ペニシリン〔ギブコ ビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）社製〕を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）（以下５ＨＲＰＭＩと略す）に１〜４×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように実施例１−１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、２４穴細胞培養プレート〔ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）社製〕に１ｍｌ／ウェルずつまき、５％ＣＯ_２湿式インキュベーター内にて、３７℃で１．５時間インキュベートし、プラスチック接着性の単球を分離した。その後、非接着性の細胞をＲＰＭＩ１６４０培地を用いて回収し、レスポンダー細胞として氷上保存した。分離した単球には、抗原ペプチドとして５μｇ／ｍｌのインフルエンザウイルスタンパク質由来エピトープペプチド（配列表の配列番号：１８に記載のマトリックスプロテイン由来−ＨＬＡ−Ａ２．１結合性ペプチド）および１μｇ／ｍｌのβ２マイクログロブリン〔スクリプス（Ｓｃｒｉｐｓ）社製〕を含む５ＨＲＰＭＩを０．５ｍｌづつ添加し、２時間室温にてインキュベート後、Ｘ線照射（５５００Ｒ）して抗原提示細胞とした。各ウェルからペプチド液を吸引除去し、ウェルをＲＰＭＩ１６４０培地を用いて洗浄後、氷上保存しておいたレスポンダー細胞を０．５〜２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう５ＨＲＰＭＩに懸濁し、１ｍｌ／ウェルづつ抗原提示細胞上に添加した。このとき、ヒアルロン酸（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した。コントロールとして、サンプルを添加しない群も設定した。プレートを５％ＣＯ_２中、３７℃で培養した。培養開始後２日目に、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（塩野義製薬社製）と１０μｇ／ｍｌのヒアルロン酸を含む５ＨＲＰＭＩ １ｍｌ（コントロールは、ＩＬ−２のみ含有）を各ウェルに添加、また５日目には培養上清を半分除去後、同様のＩＬ−２およびヒアルロン酸含有培地（コントロールはＩＬ−２のみ含有）を１ｍｌずつ添加した。７日目に上記と同様にして抗原提示細胞を調製したあと、１週間培養したレスポンダー細胞を０．５〜２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように５ＨＲＰＭＩに懸濁し、調製した抗原提示細胞上に１ｍｌ／ウェルずつ添加し、再刺激した。このとき、ヒアルロン酸を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した（コントロールは、無添加）。再刺激後２日目に、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２および１０μｇ／ｍｌのヒアルロン酸を含む（コントロールは、ＩＬ−２のみ含有）５ＨＲＰＭＩ １ｍｌを各ウェルに添加、また５日目には培養上清を半分除去後、除去前と同じ内容の培地を１ｍｌづつ添加し、さらに培養を２日続け、ＣＴＬを誘導した。

（３） ＣＴＬ細胞傷害活性の測定
実施例１−１−（２）で調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭを用いた細胞傷害活性測定法〔リヒテンフェルズ Ｒ．ら（Ｌｉｃｈｔｅｎｆｅｌｓ Ｒ．ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、第１７２巻、第２号、第２２７〜２３９頁（１９９４）〕にて評価した。一晩エピトープペプチドと共培養、もしくはエピトープペプチド非存在下で培養したＨＬＡ−Ａ２．１保持ＥＢＶトランスフォームＢ細胞（細胞名 ２２１Ａ２．１）を１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう５％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，ウシ胎児血清、Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁後、終濃度２５μＭとなるようにＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭ〔ドータイト（Ｄｏｔｉｔｅ）社製〕を添加し、３７℃で１時間培養した。細胞をＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを含まない培地にて洗浄後、２０倍量のＫ５６２細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４３）と混合し、Ｃａｌｃｅｉｎ標識標的細胞とした。なお、Ｋ５６２細胞はレスポンダー細胞中に混入するＮＫ細胞による非特異的傷害活性を排除するために用いた。

実施例１−１−（２）で調製したメモリーＣＴＬをエフェクター細胞として１×１０^５〜９×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように５ＨＲＰＭＩで段階希釈後、９６穴細胞培養プレートの各ウェルに１００μｌ／ウェルずつ分注しておき、これらに１×１０^５／ｍｌに調製したＣａｌｃｅｉｎ標識標的細胞を１００μｌ／ウェルずつ添加した。上記細胞懸濁液の入ったプレートを４００ｇで１分間遠心後、３７℃の湿式ＣＯ_２インキュベーター内で４時間インキュベートした。４時間後、各ウェルから培養上清１００μｌを採取し、蛍光プレートリーダー（４８５ｎｍ／５３８ｎｍ）によって培養上清中に放出されたＣａｌｃｅｉｎ量を測定した。「特異的細胞傷害活性（％）」は以下の式１にしたがって算出した。
式１：特異的細胞傷害活性（％）＝
｛（各ウェルの測定値−最小放出量）／（最大放出量−最小放出量）｝×１００
上式において最小放出量は標的細胞およびＫ５６２細胞のみ含有するウェルのＣａｌｃｅｉｎ放出量であり、標的細胞からのＣａｌｃｅｉｎ自然放出量を示す。また、最大放出量は標的細胞に０．１％界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ナカライテスク社製）を加えて細胞を完全破壊した際のＣａｌｃｅｉｎ放出量を示している。この結果、誘導直後において、特異的細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時のヒアルロン酸添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんど無かった。

（４） ＣＴＬの拡大培養
実施例１−１−（２）で調製したＣＴＬを５ＨＲＰＭＩで洗浄後、３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。一方、実施例１−１−（１）と同様の方法により採取したＨＬＡ−Ａ２．１非保持ａｌｌｏｇｅｎｉｃ ＰＢＭＣをＸ線照射（３３００Ｒ）し、培地で洗浄後、２〜５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。これら３×１０^４ｃｅｌｌｓのＣＴＬおよび４〜１０×１０^６ｃｅｌｌｓのａｌｌｏｇｅｎｉｃ ＰＢＭＣを１０ｍｌの５ＨＲＰＭＩに懸濁し、さらに終濃度５０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体〔ヤンセン協和（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｋｙｏｗａ）社製〕を加えて１２．５ｃｍ^２のフラスコ（Ｆａｌｃｏｎ社製）に入れ、３７℃ 湿式ＣＯ_２インキュベーター中で１４日間培養した。この際、実施例１−１−（２）のＣＴＬ誘導の際に添加したヒアルロン酸を添加する群（終濃度１０μｇ／ｍｌ）と添加しない群を設定した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ ５ｍｌを各フラスコに添加した。この際、ヒアルロン酸添加群の培地には同濃度のサンプルを添加した。拡大培養開始後、１４日目に実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表１に示す。なお、表中においてＥ／Ｔ比は標的細胞数（Ｔ）に対するエフェクター細胞数（Ｅ）の比を、ペプチド付加は標的細胞に対するペプチド付加の有無を意味する。また、拡大増殖率は拡大培養開始時の細胞数に対する拡大培養終了時点の細胞数の比を増殖率として求めた。

その結果、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にヒアルロン酸を添加した群においては、ＣＴＬは１４日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにもサンプルを添加しなかった群では、その活性は、明らかに低下していた。つまり、ヒアルロン酸をＣＴＬ誘導時および拡大培養時に添加することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬの拡大培養が可能になることが明らかになった。

実施例１−２
（１） 抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、ヒアルロン酸を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した。さらに、サンプルを添加しない群も設定した。

こうして調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。この結果、誘導直後において、特異的細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時の抗体添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんど無かった。

（２） ＣＴＬの拡大培養
実施例１−２−（１）で調製したＣＴＬを用い、実施例１−１−（４）と同様の方法で、ＣＴＬの拡大培養を行った。この際、実施例１−２−（１）でのＣＴＬ誘導の際に添加したヒアルロン酸はまったく添加しなかった。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ ５ｍｌを各フラスコに添加した。拡大培養開始後、１４日目に実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表２に示す。

その結果、ＣＴＬ誘導時のみにヒアルロン酸を添加した群においては、拡大培養時にこれらのサンプルを添加しなくても、１４日間の拡大培養後において特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにもこれらのサンプルを添加しなかった群では、その活性は、明らかに低下していた。つまり、ヒアルロン酸の添加がＣＴＬ誘導時のみであっても、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬの拡大培養が可能になることが明らかになった。

実施例１−３
（１） 抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、ヒアルロン酸（表３中ではＨＡと称す）を添加する群（終濃度１０μｇ／ｍｌ）と全くサンプルを添加しない群を設定した。ヒアルロン酸添加群に関しては、同時に終濃度０．２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４４抗体（ヒアルロン酸結合Ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗体；表中ではＨＡ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗ＣＤ４４抗体と称す）もしくは抗ＣＤ４４抗体（ヒアルロン酸結合Ｎｏｎ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗体；表中ではＨＡ Ｎｏｎ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗ＣＤ４４抗体と称す）（それぞれアンセル（Ａｎｃｅｌｌ）社製、モノクローナル抗体）を共添加する群も設定し抗体による阻害効果を検討した。

こうして調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。この結果、誘導直後において、特異的細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時の抗体添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんど無かった。

（２） ＣＴＬの拡大培養
実施例１−３−（１）で調製したＣＴＬを用い、実施例１−１−（４）と同様の方法で、ＣＴＬの拡大培養を行った。この際、実施例１−３−（１）でのＣＴＬ誘導の際に添加したヒアルロン酸を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加する群と誘導時からヒアルロン酸を全く添加しない群を設定した。また誘導時にヒアルロン酸と抗ＣＤ４４抗体を共添加した群に関しては、拡大培養の際も同様のサンプルおよび抗体を添加した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ ５ｍｌを各フラスコに添加した。拡大培養開始後、１４日目に実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表３に示す。

その結果、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にヒアルロン酸を添加した群においては、ＣＴＬは１４日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにもサンプルを添加しなかった群では、その活性は、明らかに低下していた。また、ヒアルロン酸と抗ＣＤ４４抗体（ヒアルロン酸結合Ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗体）を共添加した群では、ヒアルロン酸によるＣＴＬ活性維持効果は完全に阻害された。一方、ヒアルロン酸と抗ＣＤ４４抗体（ヒアルロン酸結合Ｎｏｎ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗体）を共添加した群では、ヒアルロン酸によるＣＴＬ活性維持効果は阻害されなかった。つまり、ヒアルロン酸による細胞傷害活性維持の効果は細胞表面上のＣＤ４４抗原にヒアルロン酸が結合することによって発揮されることが明らかとなった。

実施例２ 抗ヒトＣＤ４４抗体を用いた特異的細胞傷害活性保持ＣＴＬの拡大培養
（１） 抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、精製マウスＩｇＧ１〔ジェンザイム／テクネ（Ｇｅｎｚｙｍｅ／Ｔｅｃｈｎｅ）社製〕もしくは実施例１−３−（１）で使用した２種類の抗ヒトＣＤ４４抗体を終濃度０．２μｇ／ｍｌとなるように添加した。さらに、抗体を添加しない群も設定した。

こうして調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。この結果、誘導直後において、特異的細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時の抗体添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんど無かった。

（２） ＣＴＬの拡大培養
実施例２−（１）で調製したＣＴＬを用い、実施例１−１−（４）と同様の方法で、ＣＴＬの拡大培養を行った。この際、実施例２−（１）でのＣＴＬ誘導の際に添加したマウスＩｇＧ１もしくは上記の２種類の抗ヒトＣＤ４４抗体をそれぞれ終濃度０．２μｇ／ｍｌとなるように添加する群と誘導時から抗体を全く添加しない群を設定した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加し、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２および０．２μｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ１もしくは上記の２種類の抗ヒトＣＤ４４抗体を含む５ＨＲＰＭＩ ５ｍｌを各フラスコに添加した。ただし、抗体を添加していない群においては、培地交換の際にも、抗体の添加は行わなかった。拡大培養開始後、１４日目に実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表４に示す。

その結果、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時に抗ヒトＣＤ４４抗体（ヒアルロン酸結合Ｎｏｎ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗体）を添加した群においては、ＣＴＬは１４日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにもこれらの抗体を添加しなかった群および抗ヒトＣＤ４４抗体（ヒアルロン酸結合Ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗体）添加群では、その活性は、明らかに低下していた。つまり、抗ヒトＣＤ４４抗体の中でもヒアルロン酸の結合を阻害しない抗体をＣＴＬ誘導時および拡大培養時に添加することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬの拡大培養が可能になることが明らかになった。

実施例３ ヒアルロン酸および抗ヒトＣＤ４４抗体と可溶性もしくは細胞表面上ＣＤ４４抗原の結合性
ＣＤ４４には、培養上清中に可溶性状態で存在するもの（以下、可溶性ＣＤ４４と称す）、細胞の膜表面上に存在するもの（以下、細胞表面上ＣＤ４４と称す）の２種類の存在様式がある。ＣＤ４４はヒアルロン酸のレセプターであり、ヒアルロン酸はＣＴＬの拡大培養の際に添加することにより細胞傷害活性維持効果があることから、この活性維持効果がどちらのＣＤ４４抗原に依存するものなのかを検討した。

実施例３−１
（１） 可溶性ＣＤ４４とヒアルロン酸の結合性評価
可溶性ＣＤ４４とヒアルロン酸の結合性は以下の方法で評価した。すなわち５μｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ４４抗体（可溶性ＣＤ４４認識抗体、Ａｎｃｅｌｌ社製）を含むＰＢＳ（ニッスイ社製）１００μｌ／ウェルを入れ、室温で１晩プレインキュベートしたＮｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏプレート〔ヌンク（Ｎｕｎｃ）社製〕を０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製）／ＰＢＳで３回洗浄後、ブロックエース（大日本製薬社製）を３００μｌ／ウェル添加し、室温で１時間以上インキュベートした。一方、可溶性ＣＤ４４（１５ｎｇ／ｍｌ）含有ＲＰＭＩ培地中にヒアルロン酸を終濃度０、０．２５、０．５、１μｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で１時間プレインキュベートした。ブロッキング後のプレートの各ウェルを再度０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄後、プレインキュベートしておいたヒアルロン酸含有もしくはヒアルロン酸を含まない可溶性ＣＤ４４含有（１５ｎｇ／ｍｌ）ＲＰＭＩ培地を１００μｌ／ウェルずつ添加した。さらに各ウェルにＨＲＰ標識Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ〔ベンダーメッド（ＢｅｎｄｅｒＭｅｄ）社製 可溶性ＣＤ４４測定用ＥＬＩＳＡシステム付属試薬〕を５０μｌ／ウェルずつ添加し室温で３時間インキュベートした。インキュベート後、各ウェルを０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄し、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）溶液（ＳＩＧＭＡ社製）を１００μｌ／ウェルづつ添加、室温で１５分間インキュベート後、２Ｎ 硫酸を５０μｌ／ウェルずつ添加し、反応を停止した。各々の吸光度はプレートリーダー（４５０ｎｍ）を用いて測定した。測定結果を第１図に示す。

その結果、可溶性ＣＤ４４含有培地中にヒアルロン酸を添加しても可溶性ＣＤ４４認識抗体による認識を全く阻害しなかった。つまり、ヒアルロン酸は培地中に存在する可溶性ＣＤ４４とは全く結合しなかった。このことにより、ヒアルロン酸によるＣＴＬ特異的細胞傷害活性維持効果に培地中の可溶性ＣＤ４４は全く関与しないことが明らかとなった。

（２） 抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導を行った。

こうして調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。この結果、誘導直後において、特異的細胞傷害活性は誘導されていた。

（３） ＣＴＬの拡大培養
実施例３−１−（２）で調製したＣＴＬを用い、実施例１−１−（４）と同様の方法で、ＣＴＬの拡大培養を行った。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加し、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ ５ｍｌを各フラスコに添加した。拡大培養開始後、１４日目に実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定し、これらのＣＴＬが特異的細胞傷害活性を有することを確認した。

（４） ヒアルロン酸と細胞表面上ＣＤ４４の結合性評価
実施例３−１−（３）で調製した２×１０^５ｃｅｌｌｓのＣＴＬを１％パラホルムアルデヒド（ナカライ社製）を含むＰＢＳ（ニッスイ社製）を用いて固定後、ＰＢＳで洗浄した。固定細胞を１０μｇ／ｍｌのＦＬ標識ヒアルロン酸〔モレキュラー プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）社製〕を含むＰＢＳ中に懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。ネガティブコントロールとしてＦＬ標識ヒアルロン酸（ＦＬ−ＨＡ）を含まないＰＢＳ中でインキュベートする群も設定した。インキュベート後、ＰＢＳで洗浄し、再度１％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中に懸濁した。調製したＣＴＬをＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ〔ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）社製〕にかけ、ＣＴＬ細胞表面上の蛍光強度を測定した。結果を第２図に示す。

この結果、ＦＬ標識ヒアルロン酸はＣＴＬの細胞表面上に結合していた。つまりヒアルロン酸によるＣＴＬ特異的細胞傷害活性維持効果は、ＣＴＬの細胞表面上に存在するＣＤ４４にヒアルロン酸が結合することによって発揮されることが明らかとなった。

実施例３−２
（１） 抗ヒトＣＤ４４抗体（ＨＡ Ｎｏｎ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ 抗ＣＤ４４抗体）と可溶性ＣＤ４４の結合性評価
ＨＡ Ｎｏｎ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗ＣＤ４４抗体と可溶性ＣＤ４４の結合性は以下の方法で評価した。すなわち１次抗体として、５μｇ／ｍｌのＨＡ Ｎｏｎ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗ＣＤ４４抗体もしくは抗ヒトＣＤ４４抗体（可溶性ＣＤ４４認識抗体）（Ａｎｃｅｌｌ社製）を含むＰＢＳ（ニッスイ社製）１００μｌ／ウェルを入れ、室温で１晩インキュベートしたＮｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏプレート（Ｎｕｎｃ社製）を０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＳＩＧＭＡ社製）／ＰＢＳで３回洗浄後、ブロックエース（大日本製薬社製）を３００μｌ／ウェル添加し、室温で１時間以上インキュベートした。ブロッキング後のプレートの各ウェルを再度０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄後、可溶性ＣＤ４４（１５ｎｇ／ｍｌ）含有ＲＰＭＩ培地を１００μｌ／ウェルずつ添加した。さらに各ウェルにＨＲＰ標識Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ベンダーメッド社製 可溶性ＣＤ４４測定用ＥＬＩＳＡシステム付属試薬）を５０μｌ／ウェルずつ添加し室温で３時間インキュベートした。インキュベート後、各ウェルを０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄し、ＴＭＢ溶液（ＳＩＧＭＡ社製）を１００μｌ／ウェルづつ添加、室温で１５分インキュベート後、２Ｎ 硫酸を５０μｌ／ウェルずつ添加し反応を停止した。各々の吸光度はプレートリーダー（４５０ｎｍ）を用いて測定した。実験は２連で行い、その平均値を採用した。その結果を第３図、第４図に示す。その結果、１次抗体として用いた可溶性ＣＤ４４認識抗体は培地中の可溶性ＣＤ４４を抗体濃度依存的に認識した。一方、ＨＡ Ｎｏｎ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗ＣＤ４４抗体は培地中の可溶性ＣＤ４４を全く認識しなかった。つまり、ＨＡ Ｎｏｎ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗ＣＤ４４抗体は培地中に存在する可溶性ＣＤ４４とは結合しなかった。このことにより、ＨＡ Ｎｏｎ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗ＣＤ４４抗体によるＣＴＬ特異的細胞傷害活性維持効果に培地中の可溶性ＣＤ４４は全く関与しないことが明らかとなった。

（２） 抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導を行った。

こうして調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。この結果、誘導直後において、特異的細胞傷害活性は誘導されていた。

（３） ＣＴＬの拡大培養
実施例３−２−（２）で調製したＣＴＬを用い、実施例１−１−（４）と同様の方法で、ＣＴＬの拡大培養を行った。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ ５ｍｌを各フラスコに添加した。拡大培養開始後、１４日目に実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定し、これらのＣＴＬが特異的細胞傷害活性を有することを確認した。

（４） 抗ヒトＣＤ４４抗体（ＨＡ Ｎｏｎ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗ＣＤ４４抗体）と細胞表面上ＣＤ４４の結合性評価
実施例３−２−（３）で調製した２×１０^５ｃｅｌｌｓのＣＴＬを、１％パラホルムアルデヒド（ナカライ社製）を含むＰＢＳ（ニッスイ社製）を用いて固定後、ＰＢＳで洗浄した。固定細胞を１μｇ／ｍｌの抗−ＣＤ４４／ＦＩＴＣ（ＦＩＴＣ標識ＨＡ Ｎｏｎ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗ＣＤ４４抗体（ＣＤ４４−ＦＩＴＣ）、Ａｎｃｅｌｌ社製）を含む１％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社製）ＰＢＳ中に懸濁し、氷上３０分インキュベートした。コントロールとして１μｇ／ｍｌマウスＩｇＧ１／ＦＩＴＣ（ＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ抗体（ＩｇＧ１−ＦＩＴＣ）、ダコ（ＤＡＫＯ）社製）を含むＰＢＳ中でインキュベートする群も設定した。インキュベート後、ＰＢＳで洗浄し再度１％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中に懸濁した。調製したＣＴＬをＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅにかけ、ＣＴＬ細胞表面上の蛍光強度を測定した。結果を第５図に示す。

その結果、ＦＩＴＣ標識ＨＡ Ｎｏｎ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗ＣＤ４４抗体はＣＴＬの細胞表面上に結合していた。つまり、抗ヒトＨＡ Ｎｏｎ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗ＣＤ４４抗体によるＣＴＬ特異的細胞傷害活性維持効果は、ＣＴＬの細胞表面上に存在するＣＤ４４にヒアルロン酸が結合することによって発揮される可能性が示唆された。

実施例３−３
（１） 抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、ＨＡ Ｎｏｎ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗ＣＤ４４抗体を終濃度０．２μｇ／ｍｌとなるように添加した。さらに、抗体を添加しない群も設定した。

こうして調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。この結果、誘導直後において、特異的細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時の抗体添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんど無かった。

（２） ＣＴＬの拡大培養
実施例３−３−（１）で調製したＣＴＬを用い、実施例１−１−（４）と同様の方法で、ＣＴＬの拡大培養を行った。この際、実施例３−３−（１）でのＣＴＬ誘導の際に添加したＨＡ Ｎｏｎ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗ＣＤ４４抗体をそれぞれ終濃度０．２μｇ／ｍｌとなるように添加した。また誘導時に抗体を添加していない群についてはここでも抗体は添加しなかった。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２および０．２μｇ／ｍｌのＨＡ Ｎｏｎ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗ＣＤ４４抗体を含む５ＨＲＰＭＩ ５ｍｌを各フラスコに添加した。ただし、抗体を添加していない群においては、培地交換の際にも、抗体の添加は行わなかった。拡大培養開始後、１４日目に実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。その結果、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にＨＡ Ｎｏｎ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗ＣＤ４４抗体を添加した群においては、ＣＴＬは１４日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を維持していることを確認した。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにもこれらの抗体を添加しなかった群では、その活性は、明らかに低下していることを確認した。

（３） ＨＡ Ｎｏｎ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗ＣＤ４４抗体添加拡大培養後ＣＴＬの細胞表面上における抗体結合性評価
実施例３−３−（１）で調製した２×１０^５ｃｅｌｌｓのＣＴＬ（ＨＡ Ｎｏｎ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗ＣＤ４４抗体添加条件で培養したＣＴＬ）を１％パラホルムアルデヒド（ナカライ社製）を含むＰＢＳ（ニッスイ社製）を用いて固定後、ＰＢＳで洗浄した。固定細胞を１μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧまたはＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体を含む１％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社製）ＰＢＳ中に懸濁し、氷上で３０分インキュベートした。インキュベート後、ＰＢＳで洗浄し、再度１％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中に懸濁した。調製したＣＴＬをＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅにかけ、ＣＴＬ細胞表面上の蛍光強度を測定した。結果を第６図に示す。

この結果、ＨＡ Ｎｏｎ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗ＣＤ４４抗体添加条件下で拡大培養したＣＴＬの細胞表面上において、この抗体の結合が確認された。つまりＨＡ Ｎｏｎ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ抗ＣＤ４４抗体によるＣＴＬ特異的細胞傷害活性維持効果は、ＣＴＬの細胞表面上に存在するＣＤ４４にこの抗体が結合することによって発揮されることが明らかとなった。

実施例４ 抗ヒトＨＧＦ抗体を用いた特異的細胞傷害活性保持ＣＴＬの拡大培養実施例４−１
（１） 抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、精製マウスＩｇＧ１（Ｇｅｎｚｙｍｅ／Ｔｅｃｈｎｅ社製）もしくは抗ヒトＨＧＦ抗体（マウスモノクローナル抗体；Ｇｅｎｚｙｍｅ／Ｔｅｃｈｎｅ社製）を終濃度２μｇ／ｍｌとなるように添加した。さらに、抗体を添加しない群も設定した。

こうして調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。この結果、誘導直後において、特異的細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時の抗体添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんど無かった。

（２） ＣＴＬの拡大培養
実施例４−１−（１）で調製したＣＴＬを用い、実施例１−１−（４）と同様の方法で、ＣＴＬの拡大培養を行った。この際、実施例４−１−（１）でのＣＴＬ誘導の際に添加したマウスＩｇＧ１もしくは抗ヒトＨＧＦ抗体と同じ抗体をそれぞれ終濃度２μｇ／ｍｌとなるように添加する群と誘導時から抗体を全く添加しない群を設定した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２および２μｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ１もしくは抗ヒトＨＧＦ抗体を含む５ＨＲＰＭＩ ５ｍｌを各フラスコに添加した。ただし、抗体を添加していない群においては、培地交換の際にも、抗体の添加は行わなかった。拡大培養開始後、１４日目に実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表５に示す。

その結果、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時に抗ヒトＨＧＦ抗体を添加した群においては、ＣＴＬは１４日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにもこれらの抗体を添加しなかった群では、その活性は、明らかに低下していた。つまり、抗ヒトＨＧＦ抗体をＣＴＬ誘導時および拡大培養時に添加することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬの拡大培養が可能になることが明らかになった。

実施例４−２
（１） 抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、抗ヒトＨＧＦ抗体（マウスモノクローナル抗体；Ｇｅｎｚｙｍｅ／Ｔｅｃｈｎｅ社製）を終濃度２μｇ／ｍｌとなるように添加した。さらに、抗体を添加しない群も設定した。

こうして調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。この結果、誘導直後において、特異的細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時の抗体添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんど無かった。

（２） ＣＴＬの拡大培養
実施例４−２−（１）で調製したＣＴＬを用い、実施例１−１−（４）と同様の方法で、ＣＴＬの拡大培養を行った。この際、実施例４−２−（１）でのＣＴＬ誘導の際に添加した抗ヒトＨＧＦ抗体はまったく添加しなかった。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ ５ｍｌを各フラスコに添加した。拡大培養開始後、１４日目に実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表６に示す。

その結果、ＣＴＬ誘導時のみに抗ヒトＨＧＦ抗体を添加した群においては、拡大培養時にこれらの抗体を添加しなくても、１４日間の拡大培養後において特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにもこれらの抗体を添加しなかった群では、その活性は、明らかに低下していた。つまり、抗ヒトＨＧＦ抗体の添加がＣＴＬ誘導時のみであっても、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬの拡大培養が可能になることが明らかになった。

実施例５ 抗ヒトＩＧＦ−１抗体を用いた特異的細胞傷害活性保持ＣＴＬの拡大培養
実施例５−１
（１） 抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、精製ヤギＩｇＧ〔ケミコン インターナショナル（ＣＨＥＭＩＣＯＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）社製〕もしくは抗ヒトＩＧＦ−１抗体（ヤギポリクローナル抗体；Ｇｅｎｚｙｍｅ／Ｔｅｃｈｎｅ社製）を終濃度２μｇ／ｍｌとなるように添加した。さらに、抗体を添加しない群も設定した。

こうして調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。この結果、誘導直後において、特異的細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時の抗体添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんど無かった。

（２） ＣＴＬの拡大培養
実施例５−１−（１）で調製したＣＴＬを用い、実施例１−１−（４）と同様の方法で、ＣＴＬの拡大培養を行った。この際、実施例５−１−（１）でのＣＴＬ誘導の際に添加したヤギＩｇＧもしくは抗ヒトＩＧＦ−１抗体をそれぞれ終濃度２μｇ／ｍｌとなるように添加する群と誘導時から抗体を全く添加しない群を設定した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２および２μｇ／ｍｌのヤギＩｇＧもしくは抗ヒトＩＧＦ−１抗体を含む５ＨＲＰＭＩ ５ｍｌを各フラスコに添加した。ただし、抗体を添加していない群においては、培地交換の際にも、抗体の添加は行わなかった。拡大培養開始後、１４日目に実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表７に示す。

その結果、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時に抗ヒトＩＧＦ−１抗体を添加した群においては、ＣＴＬは１４日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにもこれらの抗体を添加しなかった群では、その活性は、明らかに低下していた。つまり、抗ヒトＩＧＦ−１抗体をＣＴＬ誘導時および拡大培養時に添加することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬの拡大培養が可能になることが明らかになった。

実施例５−２
（１） 抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、抗ヒトＩＧＦ−１抗体（ヤギポリクローナル抗体；Ｇｅｎｚｙｍｅ／Ｔｅｃｈｎｅ社製）を終濃度２μｇ／ｍｌとなるように添加した。さらに、抗体を添加しない群も設定した。

こうして調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。この結果、誘導直後において、特異的細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時の抗体添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんど無かった。

（２） ＣＴＬの拡大培養
実施例５−２−（１）で調製したＣＴＬを用い、実施例１−１−（４）と同様の方法で、ＣＴＬの拡大培養を行った。この際、実施例５−２−（１）でのＣＴＬ誘導の際に添加した抗ヒトＩＧＦ−１抗体はまったく添加しなかった。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ ５ｍｌを各フラスコに添加した。拡大培養開始後、１４日目に実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表８に示す。

その結果、ＣＴＬ誘導時に抗ヒトＩＧＦ−１抗体を添加した群においては、拡大培養時に抗体を添加しなくても、１４日間の拡大培養後において特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにもこれらの抗体を添加しなかった群では、その活性は、明らかに低下していた。つまり、抗ヒトＩＧＦ−１抗体の添加がＣＴＬ誘導時のみであっても、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬの拡大培養が可能になることが明らかになった。

実施例６ 抗ヒトＩＧＦ−２抗体を用いた特異的細胞傷害活性保持ＣＴＬの拡大培養
（１） 抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、精製マウスＩｇＧ１（Ｇｅｎｚｙｍｅ／Ｔｅｃｈｎｅ社製）もしくは抗ヒトＩＧＦ−２抗体（マウスモノクローナル抗体；Ｇｅｎｚｙｍｅ／Ｔｅｃｈｎｅ社製）を終濃度２μｇ／ｍｌとなるように添加した。さらに、抗体を添加しない群も設定した。

こうして調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。この結果、誘導直後において、特異的細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時の抗体添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんど無かった。

（２） ＣＴＬの拡大培養
実施例６−（１）で調製したＣＴＬを用い、実施例１−１−（４）と同様の方法で、ＣＴＬの拡大培養を行った。この際、実施例６−（１）でのＣＴＬ誘導の際に添加したマウスＩｇＧ１もしくは抗ヒトＩＧＦ−２抗体と同じ抗体をそれぞれ終濃度２μｇ／ｍｌとなるように添加する群と誘導時から抗体を全く添加しない群を設定した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２および２μｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ１もしくは抗ヒトＩＧＦ−２抗体を含む５ＨＲＰＭＩ ５ｍｌを各フラスコに添加した。ただし、抗体を添加していない群においては、培地交換の際にも、抗体の添加は行わなかった。拡大培養開始後、１４日目に実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表９に示す。

その結果、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時に抗ヒトＩＧＦ−２抗体を添加した群においては、ＣＴＬは１４日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにもこれらの抗体を添加しなかった群では、その活性は、明らかに低下していた。つまり、抗ヒトＩＧＦ−２抗体をの添加がＣＴＬ誘導時にのみであっても、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬの拡大培養が可能になることが明らかになった。

実施例７ 腫瘍関連抗原特異的細胞傷害活性を保持するＣＴＬの拡大培養
実施例７−１
（１） 抗腫瘍関連抗原（ＭＡＧＥ３）特異的ＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、抗腫瘍関連抗原（ｍｅｌａｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ３，ＭＡＧＥ３）特異的ＣＴＬの誘導を行った。抗腫瘍関連抗原（ＭＡＧＥ３）特異的ＣＴＬの誘導はプレバンスキー Ｍ．らの方法〔Ｐｌｅｂａｎｓｋｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第２５巻、第６号、第１７８３〜１７８７頁（１９９５）〕を一部改変して実施した。すなわち、５ＨＲＰＭＩに、２〜４×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように実施例１−１−（１）で調製したＰＢＭＣを懸濁後、半量に分けた。半量はレスポンダー細胞として氷上保存とし、もう半量は抗原提示細胞として用い、抗原ペプチドとして８０μｇ／ｍｌのメラノーマ抗原ＭＡＧＥ３由来エピトープペプチド（配列表の配列番号：１９に記載のメラノーマ抗原ＭＡＧＥ３由来−ＨＬＡ−Ａ２．１結合性ペプチド）および６μｇ／ｍｌのβ２マイクログロブリン（Ｓｃｒｉｐｓ社製）を含む５ＨＲＰＭＩを等量添加し、５％ＣＯ_２湿式インキュベーター内にて、３７℃で２時間インキュベートした。その後、５ＨＲＰＭＩを用いて洗浄し、氷上保存していたレスポンダー細胞と混合後、２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。ＩＬ−７およびＫＬＨをそれぞれ終濃度２５ｎｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌとなるように添加し、２４穴細胞培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に２ｍｌ／ウェルずつ入れた。このとき、ヒアルロン酸（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した。またコントロールとして、サンプルを添加しない群も設定した。プレートを５％ＣＯ_２中、３７℃で培養した。培養開始後４日目に培養上清を半分除去後、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２と１０μｇ／ｍｌのヒアルロン酸を含む５ＨＲＰＭＩ １ｍｌ（コントロールは、ＩＬ−２のみ含有）を各ウェルに添加した。７日目に上記と同様にして抗原提示細胞を調製した後、Ｘ線照射（５５００Ｒ）し、４×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように調製した。１週間培養したレスポンダー細胞を２×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように５ＨＲＰＭＩに懸濁、調製した抗原提示細胞と等量混合し、１ｍｌ／ウェルづつ２４穴細胞培養プレートに添加し、さらに終濃度２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７を加えて再刺激した。このとき、ヒアルロン酸を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した（コントロールは、無添加）。再刺激後１日目に、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２および１０μｇ／ｍｌのヒアルロン酸を含む（コントロールは、ＩＬ−２のみ含有）５ＨＲＰＭＩ １ｍｌを各ウェルに添加、また３日目には培養上清を半分除去後、除去前と同じ内容の培地を１ｍｌづつ添加した。同様の再刺激を１週間に１度、計４回実施し、ＣＴＬを誘導した。

（２） ＣＴＬ細胞傷害活性の測定
実施例７−１−（１）で調製した誘導開始後３５日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法で評価した。ただしこの際、標的細胞として一晩エピトープペプチドと共培養、もしくはエピトープペプチド非存在下で培養したＨＬＡ−Ａ２．１保持ＥＢＶトランスフォームＢ細胞（細胞名 ２２１Ａ２．１）を用いた。この結果、誘導直後において、特異的細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時のヒアルロン酸添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんど無かった。

（３） ＣＴＬの拡大培養
実施例７−１−（１）で調製したＣＴＬを用い、実施例１−１−（４）と同様の方法で、ＣＴＬの拡大培養を行った。この際、実施例７−１−（１）でのＣＴＬ誘導の際に添加したヒアルロン酸を１０μｇ／ｍｌとなるように添加する群と誘導時からサンプルを全く添加しない群を設定した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２および１０μｇ／ｍｌのヒアルロン酸を含む５ＨＲＰＭＩ ５ｍｌを各フラスコに添加した。ただし、サンプルを添加していない群においては、培地交換の際にも、サンプルの添加は行わなかった。拡大培養開始後、１４日目に実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表１０に示す。

その結果、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にヒアルロン酸を添加した群においては、ＣＴＬは１４日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにもこれらのサンプルを添加しなかった群では、その活性は、明らかに低下していた。つまり、抗腫瘍関連抗原（ＭＡＧＥ３）ＣＴＬの拡大培養時においても、ヒアルロン酸をＣＴＬ誘導時および拡大培養時に添加することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬの拡大培養が可能になることが明らかになった。

実施例７−２
（１） 抗腫瘍関連抗原（ＭＡＲＴ１）特異的ＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例７−１−（１）と同様の方法で抗腫瘍関連抗原（Ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌ，ＭＡＲＴ１）特異的ＣＴＬの誘導を行った。抗原ペプチドとしてメラノーマ抗原ＭＡＲＴ１由来エピトープペプチド（配列表の配列番号：２０に記載のメラノーマ抗原ＭＡＲＴ１由来−ＨＬＡ−Ａ２．１結合性ペプチド）を用いた。このとき、ヒアルロン酸（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した。またコントロールとして、サンプルを添加しない群も設定した。

こうして調製した誘導開始後３５日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。ただしこの際、標的細胞として一晩エピトープペプチドと共培養、もしくはエピトープペプチド非存在下で培養したＨＬＡ−Ａ２．１保持ＥＢＶトランスフォームＢ細胞（細胞名 ２２１Ａ２．１）、１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γ存在化で二晩培養したＨＬＡ−Ａ２．１保持ガン細胞株（細胞名 ６２４ｍｅｌ；ＨＬＡ−Ａ２．１保持ＭＡＲＴ１発現細胞）もしくはＨＬＡ−Ａ２．１非保持ガン細胞株（細胞名 ８８８ｍｅｌ；ＨＬＡ−Ａ２．１非保持ＭＡＲＴ１発現細胞）を用いた。

この結果、誘導直後において、特異的細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時のサンプル添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんど無かった。

（２） ＣＴＬの拡大培養
実施例７−２−（１）で調製したＣＴＬを用い、実施例１−１−（４）と同様の方法で、ＣＴＬの拡大培養を行った。この際、実施例７−２−（１）でのＣＴＬ誘導の際に添加したヒアルロン酸を１０μｇ／ｍｌとなるように添加する群と誘導時からサンプルを全く添加しない群を設定した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２および１０μｇ／ｍｌのヒアルロン酸を含む５ＨＲＰＭＩ ５ｍｌを各フラスコに添加した。ただし、サンプルを添加していない群においては、培地交換の際にも、サンプルの添加は行わなかった。拡大培養開始後、１４日目に実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表１１に示す。

その結果、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にヒアルロン酸を添加した群においては、ＣＴＬは１４日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにもこれらのサンプルを添加しなかった群では、その活性は、明らかに低下していた。また腫瘍細胞株に対する特異的細胞傷害活性についてもＣＴＬ誘導時および拡大培養時にヒアルロン酸を添加した群においては、ＣＴＬは１４日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。つまり、抗腫瘍関連抗原（ＭＡＲＴ１）ＣＴＬの拡大培養時においても、ヒアルロン酸をＣＴＬ誘導時および拡大培養時に添加することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬの拡大培養が可能になることが明らかになった。

実施例８ ＲＥＭ法との比較及びＲＥＭ法との組み合わせ
（１） 抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、サンプルとしてヒアルロン酸を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した。さらに、サンプルを添加しない群も設定した。

こうして調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。抗原ペプチドとして、５μｇ／ｍｌの実施例１−（２）に記載のインフルエンザウイルスタンパク由来エピトープペプチドを用いた。

（２） 特異的活性保持ＣＴＬの抗ＣＤ３抗体による拡大培養
実施例８−（１）で調製したＣＴＬを５ＨＲＰＭＩで洗浄後、５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。一方、実施例１−１−（１）と同様に採取したＨＬＡ−Ａ２４およびＡ２．１非保持ａｌｌｏｇｅｎｉｃ ＰＢＭＣをＸ線照射（３３００Ｒ）し、培地で洗浄後、５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。これら３．０×１０^４ｃｅｌｌｓのＣＴＬおよび４〜１０×１０^６ｃｅｌｌｓのａｌｌｏｇｅｎｉｃ ＰＢＭＣを１０ｍｌの５ＨＲＰＭＩに懸濁し、さらに終濃度５０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（ヤンセン協和社製）を加えて１２．５ｃｍ^２のフラスコ（Ｆａｌｃｏｎ社製）に入れ、３７℃の湿式ＣＯ_２インキュベーター中で１４日間培養した。この際、サンプルとしてヒアルロン酸を添加する群（終濃度１０μｇ／ｍｌ）と添加しない群を設定した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ ５ｍｌを各フラスコに添加した。この際、サンプル添加群の培地には終濃度１０μｇ／ｍｌとなるようにヒアルロン酸を添加した。拡大培養開始後、１４日目に、実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表１２に示す。

一方、ＲＥＭ法による拡大培養は以下のように実施した。ＨＬＡ−Ａ２４およびＡ２．１非保持ａｌｌｏｇｅｎｉｃ ＰＢＭＣをＸ線照射（３３００Ｒ）し、培地で洗浄後５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。また、ＥＢＶ−Ｂ細胞をＸ線照射（８０００Ｒ）し、培地で洗浄後１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。実施例８−１−（１）で調製した３．０×１０^４ｃｅｌｌｓのＣＴＬ、４〜１０×１０^６ｃｅｌｌｓのａｌｌｏｇｅｎｉｃ ＰＢＭＣ、および２．５×１０^６ｃｅｌｌｓのＥＢＶ−Ｂ細胞を１０ｍｌの５ＨＲＰＭＩに懸濁し、さらに終濃度５０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（ヤンセン協和社製）を加えて１２．５ｃｍ^２のフラスコ（Ｆａｌｃｏｎ社製）に入れ、３７℃の湿式ＣＯ_２インキュベーター中で１４日間培養した。この際、サンプルとして終濃度１０μｇ／ｍｌとなるようにヒアルロン酸を添加する群と添加しない群を設定した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩ ５ｍｌを各フラスコに添加した。この際、サンプル添加群の培地には終濃度１０μｇ／ｍｌとなるようにヒアルロン酸を添加した。拡大培養開始後、１４日目に、実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。その結果を表１２に示す。

その結果、ヒアルロン酸を添加せずに誘導したＣＴＬ（ＣＴＬ活性維持物質無添加）は、ＲＥＭ法で拡大培養した場合には高い細胞傷害活性を維持していた。しかし、ＥＢＶ−Ｂ細胞を使用しない方法で拡大培養を行った場合には細胞傷害活性は著しく低下した。
一方、ヒアルロン酸をＣＴＬ誘導時と拡大培養時の両方に添加しておくとＥＢＶ−Ｂ細胞を添加しなくても１４日間の大量培養後におけるＣＴＬ細胞傷害活性を十分高く維持させておくことができた。さらに、本発明による拡大培養後の抗原特異的細胞傷害活性は、ＲＥＭ法と比較しても高いものであった。

また、ＲＥＭ法で拡大培養する場合、拡大培養に先立ち、ＣＴＬ誘導時から、本発明の方法のＣＴＬ活性維持効果を持つ物質の１つであるヒアルロン酸を添加しておくと、従来技術で誘導したＣＴＬ細胞を単にＲＥＭ法で拡大培養するより、細胞傷害活性を高く維持することができた。

つまり、本発明のＣＴＬの拡大培養方法においては、ＲＥＭ法では必須であるＥＢＶ−Ｂ細胞を必要とせず、ＥＢＶ−Ｂ細胞を用いる危険性を回避することができる。さらに、ＲＥＭ法より高いＣＴＬ活性が維持できる。これらのことより、本発明のＣＴＬ細胞の拡大培養方法は、ＲＥＭ法より、安全で優れた方法である。

さらに、ヒアルロン酸をＲＥＭ法に導入するとさらに高い活性を保持することができたことから、ヒアルロン酸はあらゆるＣＴＬ細胞の拡大培養方法への適応が可能である。すなわち、本発明で使用される物質を様々なＣＴＬ拡大培養方法に利用することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬの拡大培養が可能になる。

実施例９ フィブロネクチンフラグメントの調製
（１） フィブロネクチンフラグメントの調製
ヒトフィブロネクチン由来のフラグメント、Ｈ−２７１は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐＨＤ１０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２６４）より、米国特許第５，１９８，４２３号公報に記載の方法により調製した。

また、ヒトフィブロネクチン由来のフラグメント、Ｈ−２９６、ＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６はそれぞれ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐＨＤ１０２（ＦＥＲＭ Ｐ−１０７２１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐＣＨ１０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７９９）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐＣＨ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８００）を用い、これを上記の公報に記載の方法で培養し、該培養物より調製した。

ヒトフィブロネクチン由来のフラグメント、Ｃ−２７４は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＦ７２２１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１９１５）を用い、これを米国特許第５，１０２，９８８号公報に記載の方法で培養し、該培養物より調製した。

ヒトフィブロネクチン由来のフラグメント、Ｃ−ＣＳ１は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐＣＳ２５（ＦＥＲＭ ＢＰ−５７２３）を用い、日本特許３１０４１７８号公報に記載の方法で培養し、該培養物より調製した。

ヒトフィブロネクチン由来のフラグメント、ＣＨＶ−８９、ＣＨＶ−１７９は、それぞれ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐＣＨＶ８９（ＦＥＲＭ Ｐ−１２１８２）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐＣＨＶ１７９（ＦＥＲＭ Ｐ−１２１８３）を用い、日本特許２７２９７１２号公報に記載の方法で培養し、該培養物より調製した。

また、ヒトフィブロネクチン由来のフラグメント、ＣＨＶ−９０は上記の公報に記載の方法で調製した。すなわち、当該公報に記載の操作によってプラスミドｐＣＨＶ９０を構築したうえ、該プラスミドを保有する形質転換体を培養し、該培養物よりＣＨＶ−９０を調製した。

ヒトフィブロネクチン由来のフラグメント、ＣＨＶ−１８１は、国際公開第９７／１８３１８号パンフレットに記載の方法でＣＨＶ−１８１をコードするＤＮＡを含有するプラスミド（ｐＣＨＶ１８１）を構築した後、該プラスミドを導入された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐＣＨＶ１８１）を培養し、該培養物より、上記のＣＨＶ−１７９と同様の方法で調製した。

（２） ＣＨＶ−９２の調製
上記のポリペプチドＣＨＶ−１８１を発現させるためのプラスミド、ｐＣＨＶ１８１について、ＣＨＶ−１８１をコードする領域中のＩＩＩ−１３領域をコードする領域を欠失したプラスミドＣＨＶ９２を構築した。欠失操作は日本特許２７２９７１２号公報に記載されている、プラスミドｐＣＨＶ１７９からのＩＩＩ−１４コード領域の欠失操作に準じて行った。

上記のプラスミドｐＣＨＶ９２で形質転換された大腸菌ＨＢ１０１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐＣＨＶ９２）を培養し、該培養物より日本特許第２７２９７１２号に記載のＣＨＶ−８９ポリペプチドの精製方法に準じて精製操作を行い、精製ＣＨＶ−９２標品を得た。

（３） Ｈ−２７５−Ｃｙｓの調製
ポリペプチドＨ−２７５−Ｃｙｓを発現させるためのプラスミドは以下に示す操作に従って構築した。すなわち、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐＣＨ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８００）よりプラスミドｐＣＨ１０２を調製した。このプラスミドを鋳型とし、配列表の配列番号：１４に塩基配列を示すプライマー１２Ｓと配列表の配列番号：１５に塩基配列を示すプライマー１４Ａとを用いたＰＣＲを行い、フィブロネクチンのヘパリン結合ポリペプチドをコードする約０．８ｋｂのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片をＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩ（ともに宝酒造社製）で消化した後、ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで消化したｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）とライゲーションすることにより、プラスミドｐＲＨ１を構築した。

プラスミドベクターｐＩＮＩＩＩ−ｏｍｐＡ_１〔グーライェプＪ．ら（Ｇｈｒａｙｅｂ Ｊ．ｅｔ ａｌ．）、ＥＭＢＯ Ｊ．、第３巻、第１０号、第２４３７〜２４４２頁（１９８４）〕をＢａｍＨＩとＨｉｎｃＩＩ（宝酒造社製）とで消化し、リポプロテインターミネーター領域を含む約０．９ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。これをＢａｍＨＩとＨｉｎｃＩＩで消化した上記のプラスミドｐＲＨ１と混合してライゲーションを行い、ｌａｃプロモーター、ヘパリン結合ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片およびリポプロテインターミネーターをこの順に含むプラスミドｐＲＨ１−Ｔを得た。

このプラスミドｐＲＨ１−Ｔを鋳型とし、配列表の配列番号：１６に塩基配列を示すプライマーＣｙｓ−Ａと配列表の配列番号：１７に塩基配列を示すプライマーＣｙｓ−Ｓとを用いたＰＣＲ反応の後、回収した増幅ＤＮＡ断片をＮｏｔＩ（宝酒造社製）で消化し、さらに該ＤＮＡ断片をセルフライゲーションさせた。こうして得られた環状ＤＮＡをＳｐｅＩとＳｃａＩ（宝酒造社製）とで消化して得られる２．３ｋｂのＤＮＡ断片と、プラスミドｐＲＨ１−ＴをＳｐｅＩとＳｃａＩ（宝酒造社製）とで消化して得られる２．５ｋｂのＤＮＡ断片とを混合してライゲーションを行い、プラスミドｐＲＨ−Ｃｙｓを得た。該プラスミドには、前記のＨ−２７１のＮ末端側にＭｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｓｅｒの４アミノ酸が付加され、さらにＣ末端にＣｙｓが付加されたポリペプチド（Ｈ−２７５−Ｃｙｓ）がコードされている。

ポリペプチドＨ−２７５−Ｃｙｓは、以下の方法により調製した。上記のプラスミドｐＲＨ−Ｃｙｓで形質転換された大腸菌ＨＢ１０１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐＲＨ−Ｃｙｓ）を１２０ｍｌのＬＢ培地中、３７℃で１晩培養した。培養液より回収した菌体を４０ｍｌの破砕用緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、ｐＨ７．５）に懸濁、超音波処理を行って菌体を破砕した。遠心分離を行って得られた上清を精製用緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で平衡化されたハイトラップ−ヘパリンカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）にかけた。同緩衝液でカラム内の非吸着画分を洗浄した後、０〜１Ｍ ＮａＣｌ濃度勾配を持つ精製用緩衝液で溶出を行った。溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、Ｈ−２７５−Ｃｙｓの分子量に相当する画分を集めて精製Ｈ−２７５−Ｃｙｓ標品を得た。

実施例１０ フィブロネクチンフラグメント（ＦＮｆｒ）を用いた特異的細胞障害活性保持ＣＴＬの拡大培養
（１） 抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離保存したＰＭＢＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導を行った。その際、実施例９に記載の各フィブロネクチンフラグメント（以下、ＦＮｆｒと記載する）を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した。コントロールとして、ＦＮｆｒを添加しない群も設定した。

こうして調製した誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。この結果、誘導直後において、特異的細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時のＦＮｆｒ添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんど無かった。

（２） ＣＴＬの拡大培養
実施例１０−（１）で調製したＣＴＬを用い、実施例１−１−（４）と同様の方法でＣＴＬの拡大培養を行った。この際、ＣＴＬ誘導の際に添加したものと同じＦＮｆｒを終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した。また、ＦＮｆｒを添加せずに誘導を行ったコントロール群にはＦＮｆｒは添加しなかった。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む５ＨＲＰＭＩもしくは１０％Ｈｙｃｌｏｎｅ ＦＢＳ、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（全てＢｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ナカライテスク社製）、１％ストレプトマイシン−ペニシリン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）（以下、１０ＨｙｃｌｏｎｅＲＰＭＩと略す）を５ｍｌ各フラスコに添加した。この際、ＦＮｆｒ添加群の培地には同濃度のＦＮｆｒを添加した。拡大培養開始後、１４日目に実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。拡大培養前の特異的細胞傷害活性をどれだけ維持しているかを「特異的細胞傷害活性維持（％）」として算出した。「特異的細胞傷害活性維持（％）」は以下の式２にしたがって算出した。
式２：特異的細胞傷害活性維持（％）＝｛拡大培養後の特異的細胞傷害活性（％）／拡大培養前の特異的細胞傷害活性（％）｝×１００
測定結果を表１３に示す。

表１３に示されるように、誘導時ならびに拡大培養時に各種のフィブロネクチンフラグメントを添加した群のＣＴＬは、フィブロネクチンフラグメントを添加しなかったコントロールに比べて、１４日間の拡大培養の後も特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。つまり、フィブロネクチンフラグメントの共存下に誘導、拡大培養を行うことにより、高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態でのＣＴＬの拡大培養が可能であることが明らかになった。

実施例１１ フィブロネクチン存在下でのＣＴＬ誘導、拡大培養
（１） 抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導を行った。このとき、ＦＮｆｒにかえてフィブロネクチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した（コントロールは無添加）。誘導開始後１４日目のＣＴＬの細胞傷害活性を、実施例１−１−（３）に記載の方法で評価したところ、誘導時のＦＮｆｒ添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんどなかった。

（２） ＣＴＬの拡大培養
実施例１１−（１）で調製したＣＴＬを実施例１０−（２）と同様の方法で拡大培養した。このとき、誘導時にフィブロネクチンが添加されていたものにはフィブロネクチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を終濃度１０μｇ／ｍｌとなるように添加した（コントロールは無添加）。得られたＣＴＬの細胞傷害活性を実施例１−１−（３）と同様の方法にて測定し、拡大培養前の特異的細胞傷害活性をどれだけ維持しているかを「特異的細胞傷害活性維持（％）」として算出した。「特異的細胞傷害活性維持（％）」は上記の式２にしたがって算出した。測定結果を表１４に示す。

表１４に示されるように、フィブロネクチンの存在下にＣＴＬ誘導および拡大培養を行った群においては高い細胞傷害活性が保持されていた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにもフィブロネクチンを添加しなかったコントロールの細胞傷害活性は明らかに低下していた。つまり、フィブロネクチンをＣＴＬ誘導時および拡大培養時に添加することにより、特異的で細胞傷害活性を長期的に保持した状態でのＣＴＬの拡大培養が可能であることが明らかになった。

実施例１２ 固定化されたフィブロネクチン（ＦＮ）フラグメント存在下でのＣＴＬ拡大培養
（１） ＦＮフラグメント固定化
以下の実験で使用する培養用器材（容器）にフィブロネクチンフラグメントを固定化した。すなわち、２４穴細胞培養プレート、１２．５ｃｍ^２フラスコに各種フィブロネクチンフラグメント（終濃度１０μｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳを１〜２ｍｌずつ添加し、室温で２時間インキュベートした後、使用時まで４℃で保存した。また上記のプレート、フラスコは使用前にＰＢＳで２回洗浄した。

（２） 抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例１−１−（２）と同様の方法で、抗インフルエンザウイルス メモリーＣＴＬの誘導を行った。このとき、培養器材としてＦＮｆｒを固定化したプレートを使用した（コントロールには固定化処理を行っていないプレートを使用）。誘導後のＣＴＬの細胞傷害活性を、実施例１−１−（３）に記載の方法で評価したところ、誘導時に使用したプレートのＦＮｆｒ固定化の有無による細胞傷害活性の差はほとんどなかった。

（３） ＣＴＬの拡大培養
実施例１２−（２）で調製したＣＴＬを実施例１０−（２）と同様の方法で拡大培養した。この際、培養器材として各種ＦＮｆｒを固定化したフラスコを使用した（コントロールには固定化処理を行っていないフラスコを使用）。また、培地には１０Ｈｙｃｌｏｎｅ／ＲＰＭＩを用いた。

こうして拡大培養されたＣＴＬの細胞傷害活性が拡大培養前に比較してどれだけ維持されているかを「特異的細胞傷害活性維持（％）」として評価した。「特異的細胞傷害活性維持（％）」は上記の式２にしたがって算出した。測定結果を表１５に示す。

表１５に示されるように、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時にフィブロネクチンフラグメントを固定化した培養器材（プレート、フラスコ）を使用した群のＣＴＬは拡大培養後にも特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにもフィブロネクチンフラグメントを固定化しない器材を使用したコントロールでは、細胞傷害活性は明らかに低下していた。つまり、固定化されたフィブロネクチンフラグメントを使用することにより、培地中に溶解しているフラグメントと同様に高い細胞傷害活性を長期的に保持したＣＴＬを拡大培養することがが可能であることが明らかになった。

実施例１３ 腫瘍関連抗原特異的細胞傷害活性を保持するＣＴＬの拡大培養
（１） 抗腫瘍関連抗原（ＭＡＲＴ１）特異的ＣＴＬの誘導
実施例１−１−（１）に記載の方法で分離、保存したＰＢＭＣを用い、実施例７−２−（１）と同様の方法で抗腫瘍関連抗原（Ｍｅｌａｎｏｍａ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌ，ＭＡＲＴ１）特異的ＣＴＬの誘導を行った。このとき、抗ＨＧＦ抗体を終濃度２μｇ／ｍｌとなるように添加した。またコントロールとして、サンプルを添加しない群も設定した。

こうして調製した誘導開始後３５日目のＣＴＬの細胞傷害活性は、実施例１−１−（３）と同様の方法にて評価した。ただしこの際、標的細胞として一晩エピトープペプチドと共培養、もしくはエピトープペプチド非存在下で培養したＨＬＡ−Ａ２．１保持ＥＢＶトランスフォームＢ細胞（細胞名 ２２１Ａ２．１）、１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γ存在化で二晩培養したＨＬＡ−Ａ２．１保持ガン細胞株（細胞名 ６２４ｍｅｌ；ＨＬＡ−Ａ２．１保持ＭＡＲＴ１発現細胞）もしくはＨＬＡ−Ａ２．１非保持ガン細胞株（細胞名 ９３８ｍｅｌ；ＨＬＡ−Ａ２．１非保持ＭＡＲＴ１発現細胞）を用いた。

この結果、誘導直後において、特異的細胞傷害活性は誘導されていたが、誘導時のサンプル添加の有無による細胞傷害活性の差はほとんど無かった。

（２） ＣＴＬの拡大培養
実施例１３−（１）で調製したＣＴＬを用い、実施例１−１−（４）と同様の方法で、ＣＴＬの拡大培養を行った。この際、実施例１３−（１）でのＣＴＬ誘導の際に添加した抗ＨＧＦ抗体を２μｇ／ｍｌとなるように添加する群と誘導時からサンプルを全く添加しない群を設定した。この間ペプチドによる刺激はまったく付加せず、培養開始１日目に終濃度１２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を添加、さらに培養開始後４日目以降は２〜３日ごとに培養上清を半分除去後、６０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２および２μｇ／ｍｌの抗ＨＧＦ抗体を含む５ＨＲＰＭＩ ５ｍｌを各フラスコに添加した。ただし、サンプルを添加していない群においては、培地交換の際にも、サンプルの添加は行わなかった。拡大培養開始後、１４日目に実施例１−１−（３）と同様の方法にてＣＴＬの特異的細胞傷害活性を測定した。測定結果を表１６に示す。

その結果、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時に抗ＨＧＦ抗体を添加した群においては、ＣＴＬは１４日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。一方、ＣＴＬ誘導時および拡大培養時のどちらにもこれらのサンプルを添加しなかった群では、その活性は、明らかに低下していた。また腫瘍細胞株に対する特異的細胞傷害活性についてもＣＴＬ誘導時および拡大培養時に抗ＨＧＦ抗体を添加した群においては、ＣＴＬは１４日間の拡大培養後においても特異的で高い細胞傷害活性を保持していた。つまり、抗腫瘍関連抗原（ＭＡＲＴ１）ＣＴＬの拡大培養時においても、抗ＨＧＦ抗体をＣＴＬ誘導時および拡大培養時に添加することにより、特異的で高い細胞傷害活性を長期的に保持した状態で、ＣＴＬの拡大培養が可能になることが明らかになった。

なお、本発明の態様として、以下のものが挙げられる。
（１） 抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するための方法であって、
（Ａ）ＣＤ４４に結合活性を有する物質、
（Ｂ）ＣＤ４４リガンドがＣＤ４４に結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質、
（Ｃ）成長因子の成長因子レセプターへの結合を阻害し得る物質、
（Ｄ）成長因子が成長因子レセプターに結合することにより発せられるシグナルを制御し得る物質、並びに
（Ｅ）フィブロネクチン、そのフラグメント又はそれらの混合物、
からなる群より選択される少なくとも１種の物質の存在下に細胞傷害性Ｔ細胞への分化能を有する前駆細胞を抗原提示細胞と共にインキュベートする工程を含むことを特徴とする方法、
（２） ＣＤ４４に結合活性を有する物質がＣＤ４４リガンド及び／又は抗ＣＤ４４抗体である前記（１）記載の方法、
（３） ＣＤ４４リガンドがヒアルロン酸である前記（２）記載の方法、
（４） 成長因子の成長因子レセプターへの結合を阻害し得る物質が成長因子に結合活性を有する物質である前記（１）記載の方法、
（５） 成長因子に結合活性を有する物質が抗成長因子抗体である前記（４）記載の方法、
（６） 成長因子が肝細胞増殖因子、インシュリン様増殖因子−１及びインシュリン様増殖因子−２からなる群より選択される少なくとも１種の成長因子である前記（１）、（４）及び（５）いずれか１項に記載の方法、
（７） フィブロネクチンのフラグメントが、
（ａ）ＶＬＡ−４結合ドメイン、
（ｂ）ＶＬＡ−５結合ドメイン、および
（ｃ）ヘパリン結合ドメイン、
からなる群より選択される少なくとも１種のドメインを有するフラグメントである前記（１）記載の方法、
（８） 抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を維持するための方法であって、前記（１）に記載の（Ａ）〜（Ｅ）からなる群より選択される少なくとも１種の物質の存在下に細胞傷害性Ｔ細胞を継続培養する工程を含むことを特徴とする方法、
（９） ＣＤ４４に結合活性を有する物質がＣＤ４４リガンド及び／又は抗ＣＤ４４抗体である前記（８）記載の方法、
（１０） ＣＤ４４リガンドがヒアルロン酸である前記（９）記載の方法、
（１１） 成長因子の成長因子レセプターへの結合を阻害し得る物質が成長因子に結合活性を有する物質である前記（８）記載の方法、
（１２） 成長因子に結合活性を有する物質が抗成長因子抗体である前記（１１）記載の方法、
（１３） 成長因子が肝細胞増殖因子、インシュリン様増殖因子−１及びインシュリン様増殖因子−２からなる群より選択される少なくとも１種の成長因子である前記（８）、（１１）及び（１２）いずれか１項に記載の方法、
（１４） フィブロネクチンのフラグメントが、
（ａ）ＶＬＡ−４結合ドメイン、
（ｂ）ＶＬＡ−５結合ドメイン、および
（ｃ）ヘパリン結合ドメイン、
からなる群より選択される少なくとも１種のドメインを有するフラグメントである前記（８）記載の方法、
（１５） 抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を拡大培養する方法であって、前記（１）に記載の（Ａ）〜（Ｅ）からなる群より選択される少なくとも１種の物質の存在下に細胞傷害性Ｔ細胞をインキュベートする工程を含むことを特徴とする方法、
（１６） 前記工程において、さらに抗ＣＤ３抗体の存在下に細胞傷害性Ｔ細胞をインキュベートする前記（１５）記載の方法、
（１７） 前記工程において、細胞傷害性Ｔ細胞をフィーダ細胞と共にインキュベートする前記（１５）又は（１６）記載の方法、
（１８） フィーダ細胞が非ウイルス感染細胞である前記（１７）記載の方法、
（１９） ＣＤ４４に結合活性を有する物質がＣＤ４４リガンド及び／又は抗ＣＤ４４抗体である前記（１５）〜（１８）いずれか１項に記載の方法、
（２０） ＣＤ４４リガンドがヒアルロン酸である前記（１９）記載の方法、
（２１） 成長因子の成長因子レセプターへの結合を阻害し得る物質が成長因子に結合活性を有する物質である前記（１５）〜（１８）いずれか１項に記載の方法、
（２２） 成長因子に結合活性を有する物質が抗成長因子抗体である前記（２１）記載の方法、
（２３） 成長因子が肝細胞増殖因子、インシュリン様増殖因子−１及びインシュリン様増殖因子−２からなる群より選択される少なくとも１種の成長因子である前記（１５）〜（１８）、（２１）及び（２２）いずれか１項に記載の方法、
（２４） フィブロネクチンのフラグメントが、
（ａ）ＶＬＡ−４結合ドメイン、
（ｂ）ＶＬＡ−５結合ドメイン、および
（ｃ）ヘパリン結合ドメイン、
からなる群より選択される少なくとも１種のドメインを有するフラグメントである前記（１５）記載の方法、
（２５） 前記（１）〜（２４）いずれかに記載の方法によって得られた細胞傷害性Ｔ細胞含有培養物から、抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を高含有する細胞集団を選択する工程を含む細胞傷害性Ｔ細胞の回収方法、
（２６） 前記（１）〜（２５）いずれかに記載の方法で調製された抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞、ならびに
（２７） 前記（２６）に記載の細胞傷害性Ｔ細胞を有効成分として含有することを特徴とする治療剤、
に関する。

本発明により抗原特異的な細胞傷害活性を高活性で保持したまま維持及び／又は拡大培養することのできるCTLの誘導方法、維持方法および拡大培養方法が提供される。
当該方法は大量のCTLを必要とする養子免疫療法等の細胞医療の分野で極めて有用である。また当該方法により調製されるCTLは安全な方法で調製されることから、極めて安全性の高い細胞医薬となる。

第１図は、ヒアルロン酸による可溶性CD44と可溶性CD44認識抗体の結合阻害活性を示す図である。 第２図は、ＦＬ標識ヒアルロン酸とCTL細胞表面上CD44の結合活性を示す図である。 第３図は、可溶性CD44認識抗体と培地中の可溶性CD44の結合活性を示す図である。 第４図は、HA Non-Blocking抗CD44抗体と培地中の可溶性CD44の結合活性を示す図である。 第５図は、HA Non-Blocking抗CD44抗体とCTL細胞表面上CD44の結合活性を示す図である。 第６図は、HA Non-Blocking抗CD44抗体添加拡大培養後CTLの細胞表面上における本抗体の結合を示す図である。

配列番号：１は、Ｃ−２７４と名付けられたヒトフィブロネクチン由来のペプチドフラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号：３は、Ｈ−２７１と名付けられたヒトフィブロネクチン由来のペプチドフラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号：４は、Ｈ−２９６と名付けられたヒトフィブロネクチン由来のペプチドフラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号：５は、ＣＨ−２７１と名付けられたヒトフィブロネクチン由来のペプチドフラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号：６は、ＣＨ−２９６と名付けられたヒトフィブロネクチン由来のペプチドフラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号：７は、Ｃ−ＣＳ１と名付けられたヒトフィブロネクチン由来のペプチドフラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号：８は、ＣＨＶ−８９と名付けられたヒトフィブロネクチン由来のペプチドフラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号：９は、ＣＨＶ−９０と名付けられたヒトフィブロネクチン由来のペプチドフラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号：１０は、ＣＨＶ−９２と名付けられたヒトフィブロネクチン由来のペプチドフラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号：１１は、ＣＨＶ−１７９と名付けられたヒトフィブロネクチン由来のペプチドフラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号：１２は、ＣＨＶ−１８１と名付けられたヒトフィブロネクチン由来のペプチドフラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号：１３は、Ｈ−２７５−Ｃｙｓと名付けられたヒトフィブロネクチン由来のペプチドフラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号：１４は、プライマー１２Ｓの塩基配列である。
配列番号：１５は、プライマー１４Ａの塩基配列である。
配列番号：１６は、プライマーＣｙｓ−Ａの塩基配列である。
配列番号：１７は、プライマーＣｙｓ−Ｓの塩基配列である。
配列番号：１８は、インフルエンザウイルスのマトリックスプロテイン由来ＨＬＡ−Ａ２．１結合性ペプチドに基づいてデザインされたペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号：１９は、メラノーマ抗原ＭＡＧＥ３由来ＨＬＡ−Ａ２．１結合性ペプチドに基づいてデザインされたペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号：２０は、メラノーマ抗原ＭＡＲＴ１由来ＨＬＡ−Ａ２．１結合性ペプチドに基づいてデザインされたペプチドのアミノ酸配列である。

Claims (8)

1. 抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を拡大培養する方法であって、
   （ａ）ＶＬＡ−４結合ドメイン、
   （ｂ）ＶＬＡ−５結合ドメイン、および
   （ｃ）ヘパリン結合ドメイン、
   からなる群より選択される少なくとも１種のドメインを有するフィブロネクチンのフラグメント又はその混合物の存在下に、細胞傷害性Ｔ細胞への分化能を有する前駆細胞を抗原提示細胞と共にインキュベートして抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する工程（工程１）、ならびに
   前記フィブロネクチンのフラグメント又はその混合物の存在下に、前記工程１で誘導された細胞傷害性Ｔ細胞をインキュベートする工程（工程２）、
   を含むことを特徴とする方法。
2. 工程２において、さらに抗ＣＤ３抗体の存在下に細胞傷害性Ｔ細胞をインキュベートする請求項１記載の方法。
3. 工程２において、細胞傷害性Ｔ細胞をフィーダ細胞と共にインキュベートする請求項１又は２記載の方法。
4. フィーダ細胞が非ウイルス感染細胞である請求項３記載の方法。
5. フィブロネクチンのフラグメントが、配列表の配列番号１〜１３に記載のアミノ酸配列のいずれか１つからなるフラグメントである請求項１記載の方法。
6. 抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を維持するための方法であって、（ａ）ＶＬＡ−４結合ドメイン、
   （ｂ）ＶＬＡ−５結合ドメイン、および
   （ｃ）ヘパリン結合ドメイン、
   からなる群より選択される少なくとも１種のドメインを有するフィブロネクチンのフラグメント又はその混合物の存在下に、細胞傷害性Ｔ細胞への分化能を有する前駆細胞を抗原提示細胞と共にインキュベートして抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する工程、ならびに
   前記フィブロネクチンのフラグメント又はその混合物の存在下に、前記工程で誘導された細胞傷害性Ｔ細胞を継続培養する工程、
   を含むことを特徴とする方法。
7. フィブロネクチンのフラグメントが、配列表の配列番号１〜１３に記載のアミノ酸配列のいずれか１つからなるフラグメントである請求項６記載の方法。
8. 請求項１〜７いずれかに記載の方法によって得られた細胞傷害性Ｔ細胞含有培養物から、抗原特異的な細胞傷害活性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を高含有する細胞集団を選択する工程を含む細胞傷害性Ｔ細胞の回収方法。

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