ES2957890T3 - Métodos de tratamiento del cáncer y las enfermedades infecciosas mediante terapias celulares - Google Patents
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Abstract
Esta divulgación se refiere a composiciones y métodos para revertir la senescencia en células T interrumpiendo la señalización del péptido intestinal vasoactivo (VIP) y/o inhibiendo la señalización del inhibidor de fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3 quinasa) y usos en el tratamiento del cáncer y las infecciones virales crónicas. En ciertas realizaciones, la divulgación contempla métodos para revertir la senescencia de las células T mezclando células T in vitro con un agente que evita que VIP interactúe con receptores de VIP y/o un inhibidor de PI3 quinasa. En ciertas realizaciones, la divulgación contempla la expansión de células T senescentes mezclándolas con un inhibidor de la quinasa PI3, un agente que bloquea VIP y la señalización del receptor de VIP, una enzima que degrada VIP y combinaciones de los mismos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos de tratamiento del cáncer y las enfermedades infecciosas mediante terapias celulares
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos Número 62/319,957, presentada el 8 de abril de 2016.
Declaración sobre la investigación financiada con fondos federales
Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo las subvenciones RO1 HL116737-01A y RO1 CA188523 otorgadas por the National Institutes of Health El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.
Incorporación por referencia del material presentado como archivo de texto a través del sistema de archivo electrónico de la oficina (EFS-WEB)
El Listado de Secuencias asociado a esta solicitud se proporciona en formato de texto en lugar de una copia en papel, y por la presente se incorpora por referencia a la memoria descriptiva. El nombre del archivo de texto que contiene el listado de secuencias es 16094PCT_ST25.txt. El archivo de texto es de 11 κΒ, se creó el 5 de abril de 2017 y se presenta electrónicamente a través de EFS-Web.
Antecedentes
Las células T citotóxicas destruyen directamente las células y la respuesta es específica del antígeno. Para destruir los tumores, las células citotóxicas deben proliferar en número suficiente para alcanzar a las células cancerosas en división. Sin embargo, las células T se consideran senescentes si tienen un potencial proliferativo limitado en respuesta a la estimulación antigénica. Filaci et al. informan de que un subconjunto de células T efectoras, los linfocitos T reguladores CD8+ CD28-, inhiben las funciones proliferativas y citotóxicas de las células T en los cánceres humanos. J. Immunol., 2007(179): 4323-4334. Montes et al. indican que los tumores inducen células T senescentes como una forma potencial de evasión inmunitaria tumoral. Cancer Res 2008(68): 870-879. Las células T senescentes se caracterizan por la pérdida de expresión de CD27 y CD28, la falta de capacidad proliferativa y el aumento de la expresión de moléculas asociadas a la senescencia. Véase Ramello et al Cell Death and Disease, 2014. 5, e1507. De este modo, es necesario identificar procedimientos mejorados para tratar el cáncer invirtiendo la senescencia en las células T
Se han descrito microesferas magnéticas recubiertas con anti-CD3 y anti-CD28 (microesferas anti-CD3/CD28) para la expansión de células T que se ha usado experimentalmente para impulsar la inmunidad de células T en pacientes inmunodeprimidos con cáncer. Véase Porter et al. A phase 1 trial of donor lymphocyte infusions expanded and activated ex vivo via CD3/CD28 costimulation. Blood, 2006, 107:1325-1331.
Li et al informan de la modulación de injerto contra leucemia en trasplantes alogénicos antagonizando la señalización del péptido intestinal vasoactivo. Cancer Res, 2016, 76(23):6802-681. Véase también Li et al. PLoS One. 2013, 8(5):e63381; Li et al., Blood. 2013, 121(12):2347-51, Li et al., J Immunol. 2011, 187(2):1057-65; Patente de los Estados Unidos 9,458,217 y la Solicitud publicada en los Estados Unidos con el número 2013/0302351.
Teschner et al. informan de la estimulación y expansión in vitro de linfocitos T citotóxicos CD8+ reactivos a tumores humanos mediante microesferas magnéticas anti-CD3/CD28/CD137. Scandinavian Journal of Immunology, 2011, 74:155-164.
Las referencias citadas en el presente documento no constituyen una admisión de la técnica anterior.
Sumario
La presente divulgación se refiere a composiciones y procedimientos para revertir la senescencia en células T mediante la interrupción de la señalización del péptido intestinal vasoactivo (VIP)....
La materia para la que se solicita protección es la definida en las reivindicaciones.
La invención proporciona una composición de cultivo celular in vitro que comprende células T purificadas y un antagonista del receptor VIP y anticuerpos anti-CD3 y anticuerpos anti-CD28 opcionalmente inmovilizados en una microesfera o superficie sólida. Más del 15 % de las células T pueden ser negativas para CD28. El antagonista del receptor VIP puede comprender KPRRPYTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN) (SEQ ID NO: 1).
La invención también proporciona una composición de cultivo celular in vitro que comprende células T purificadas y una enzima degradadora de VIP y anticuerpos anti-CD3 y anticuerpos anti-CD28 inmovilizados opcionalmente en una microesfera o superficie sólida. Más del 15 % de las células T pueden ser negativas para CD28.
En otro aspecto, la invención proporciona procedimientos de proliferación de células T que son negativas para CD28 usando un cultivo celular in vitro como se divulga en la presente memoria que proporciona células T replicadas. Las células T replicadas pueden tener una mayor expresión de CD28 y/o CD27 en comparación con los niveles previos a la replicación.
Antes, durante o después de la proliferación de las células T, las células T pueden mezclarse con un vector que tiene una secuencia de ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico, en el que el receptor de antígeno quimérico comprende una secuencia diana de cáncer, un dominio transmembrana, un dominio de molécula coestimuladora de células T y un componente de transducción de señales de un dominio de receptor de antígeno de células T en condiciones tales que las células expresan un receptor de antígeno quimérico en la superficie de las células.
En ciertas realizaciones, las células T se purifican a partir de células de médula ósea o células sanguíneas.
En ciertas realizaciones, el cultivo comprende un antagonista del receptor VIP tal como VIPhyb que comprende (SEQ ID NO: 1) KPRRPYTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN con una amida C-terminal. En ciertas realizaciones, el cultivo comprende un antagonista del receptor VIP tal como VIPhyb en una concentración de al menos de agregado a 0,001, 0,01, 0,1, 0,5, 1,0, 2, o 3 micromolar. En ciertas realizaciones, el cultivo comprende un antagonista del receptor VIP tal como VIPhyb en una concentración de entre 0,5 y 10 micromolar o entre 1 y 8 micromolar.
En ciertas realizaciones, el cultivo comprende una enzima que hidroliza VIP. En ciertas realizaciones, el cultivo comprende una enzima degradadora de VIP, como una peptidasa, una serina peptidasa, una triptasa, una quimasa, una quimasa humana 1 (CMA1) o una serina proteinasa quimotírica. En ciertas realizaciones, el cultivo tiene al menos 0,001, 0,01, 0,1, o 1 microgramo por ml de la enzima degradadora de VIP tal como una quimasa de mastocitos.
En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-CD3 y anticuerpos anti-CD28 se inmovilizan en una microesfera, microesfera magnética o superficie sólida. En ciertas realizaciones, más del 5,0 % o del 10 % o del 15 % del total de células del cultivo expresan CD3 y/o CD4 y/o CD8. En ciertas realizaciones, más del 20 %, 25 % o 50 % del total de células expresan CD3 y/o CD4 y/o CD8. En ciertas realizaciones, más del 15 %, 20 % o 30 % de las células T del cultivo son negativas para CD28 y/o CD27. En ciertas realizaciones, más del 20 %, 25 % o 50 % de las células T son negativas para CD28 y/o CD27.
En ciertas realizaciones, las células T purificadas se obtienen centrifugando la sangre en condiciones tales que el plasma y los glóbulos rojos se separan proporcionando células T purificadas en una mezcla de glóbulos blancos entre el plasma y los glóbulos rojos. En ciertas realizaciones, las células T purificadas se obtienen mediante aspirados de médula ósea o una biopsia de médula ósea.
En ciertas realizaciones, las células T purificadas se obtienen mezclando las células con un marcador fluorescente que se une a CD3 y purificando las células mediante clasificación celular activada por fluorescencia. En ciertas realizaciones, las células T purificadas se obtienen mezclando las células con un marcador magnetizado que se une a CD3 y purificando las células mediante clasificación magnética. En ciertas realizaciones, las células T purificadas se obtienen mezclando células con un marcador fluorescente que se une a CD3 y/o CD4 y/o CD8 y purificando las células mediante clasificación celular activada por fluorescencia. En ciertas realizaciones, las células T purificadas se obtienen mezclando células con un marcador magnetizado que se une a CD3 y/o CD4 y/o CD8 y purificando las células mediante clasificación magnética.
La divulgación contempla un sustrato sólido, tal como microesferas, con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 y que tiene una enzima degradadora de VIP acoplada a la superficie. En ciertas realizaciones, se contempla que las microesferas estén dispuestas en el medio y que las células T se expandan sobre el medio de forma que las microesferas sean subcelulares.
En ciertas realizaciones, la enzima degradadora de VIP comprende CMA1 humana Número de acceso GenBank: AAI03975.1: MLLKLKEKASLTLAVGTLPFPSQFNFVPPGRMCRVAGWGRTGVLKPGSDTLQEVKLRL MDPQACSHFRDFDHNLQLCVGNPRKTKSAFKGDSGGPLLCAGVAQGIVSYGRSDAKPP AVFTRISHYRPWINQILQAN (SEQ ID NO: 2). En ciertas realizaciones, la enzima que degrada VIP es una encefalinasa recombinante humana (endopeptidasa neutra, EC 3.4.24.11) que tiene (SEQ ID NO: 3) DGICKS SDCIKS AARLIQNMD ATTEPCTDFFKYACGGWLKRNVIPETS SRYGNFDILRDE
LE VYLKD VLQEPKTEDIV AV QKAKAL YRS CINES AID SRGGEPLLKLLPDIY GWP V ATEN
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YAVNSIKTD VESPGNFRIIGTLQN S AEFSE AFHCRKN S YMNPEKKCRVW.
En ciertas realizaciones, los cultivos celulares y los procedimientos incluyen además IL-12. En ciertas realizaciones, se contempla que la IL-12 potencie el efecto del antagonista del receptor VIP sobre la proliferación de células T estimuladas in vitro con anticuerpos contra CD3 y CD28.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1A muestra datos que indican que el tratamiento con VIPhyb aumentó la proliferación in vitro de células T estimuladas por aloantígenos. La proliferación de células T esplénicas B6 con luciferasa cultivadas durante 3 días en MLR con esplenocitos FVB irradiados, con adición diaria de VIP y/o VIPhyb para alcanzar las concentraciones mostradas (0-10 mmol/L).
La figura 1B muestra datos para concentraciones variantes de VIPhyb.
La figura 2 muestra datos sobre el número relativo de células CD27+ y CD28+ producidas en un cultivo in vitro sobre una muestra en la que el paciente tiene células T senescentes. "Id" se refiere a idelalisib. "VA" se refiere a VIPhyb. "MC" se refiere a la quimasa de mastocitos humanos (CMA1).
La figura 3A muestra datos sobre la expresión de CD27 y CD28 en la población total de CD3+ el día 14 de la expansión. Las células T de pacientes con DLBCL se expandieron durante 14 días con microesferas CD3/CD28 en presencia de 30 U/ml de IL-2 con o sin los compuestos indicados.
La figura 3B muestra una curva de expansión de las células T del paciente en presencia o ausencia de los compuestos indicados. La preservación del compartimento CD27+CD28+ y el aumento del rendimiento global en la expansión de células T de un paciente con DLBCL con Idelalisib y VIPhyb.
La figura 4 muestra datos que indican que la expresión de Bcl-2 en células T de pacientes con linfoma se aumenta con la adición de VIPhyb, Idelalisib o una combinación de ambos. Los lisados de proteínas de los cultivos de expansión de células T de los pacientes se prepararon los días 7 y 14. Las muestras se pasaron por un gel SDS-PAGE antes de transferirlas a una membrana de nitrocelulosa. A continuación, se sondeó la membrana en busca de la proteína pro-supervivencia Bcl-2, se despojó se decapó y se volvió a sondear en busca de actina como control de carga.
La figura 5A muestra datos sobre los volúmenes tumorales el día 18 tras la inyección de células tumorales. A los ratones se les inyectaron por vía subcutánea 5 x105 células de E. G7-OVA, que se dejaron crecer durante 7 días hasta que se formó un tumor palpable. Durante este periodo, las células T OT-I, OT-II y B6 se expandieron con microesferas CD3/CD28 en presencia de IL-2 y los compuestos indicados durante 3 días. El día 7 de crecimiento del tumor, se inyectó a los ratones por vía intravenosa una combinación de células T OT-I, OT-II y B6 expandidas (2 x 106 OT-I, 1 x106 OT-II y 2 x106 células B6) o 2 x106 células T B6 como control. A continuación, se controló el crecimiento tumoral de los ratones, que se calculó como (LxW2)/2.
La figura 5B muestra la curva de crecimiento tumoral que muestra la tasa de crecimiento entre los grupos a lo largo del tiempo. La expansión de células T de ratón en presencia de Idelalisib, VIPhyb o una combinación de ambos mejora su eficacia terapéutica en un modelo de linfoma con expresión de OVA.
Descripción detallada
Antes de que la presente divulgación se describa con mayor detalle, debe entenderse que esta divulgación no se limita a las realizaciones particulares descritas, y como tal puede, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología usada en la presente memoria tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente divulgación estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece la divulgación. Aunque en la práctica o prueba de la presente divulgación, también se puede usar cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria, ahora se describen los métodos y materiales preferentes.
La cita de cualquier publicación es para su divulgación antes de la fecha de presentación y no debe interpretarse como una admisión de que la presente divulgación no tiene derecho a ser anterior a dicha publicación en virtud de una divulgación previa. Además, las fechas de publicación proporcionadas podrían ser diferentes de las fechas reales de publicación, que deben ser confirmadas de forma independiente.
Como será aparente para los expertos en la técnica tras leer esta divulgación, cada una de las realizaciones individuales descritas e ilustradas en la presente memoria tiene componentes y características discretas que pueden ser fácilmente separadas o combinadas con las características de cualquiera de las otras varias realizaciones sin apartarse del alcance de la presente divulgación. Cualquier procedimiento citado puede llevarse a cabo en el orden de los eventos recitados o en cualquier otro orden que sea lógicamente posible.
Las realizaciones de la presente divulgación emplearán, a menos que se indique lo contrario, técnicas de inmunología, medicina, química orgánica, bioquímica, biología molecular, farmacología, fisiología y similares, que están dentro del conocimiento de la técnica. Tales técnicas se explican totalmente en la bibliografía.
Como se describe en la presente memoria, el nivel de al menos un biomarcador de superficie basado en proteínas se mide en una muestra biológica de un individuo. El nivel o niveles de proteína pueden medirse usando cualquier tecnología de medición disponible que sea capaz de determinar específicamente el nivel del biomarcador en una muestra biológica. La medición puede ser ya sea cuantitativa o cualitativa, siempre que sea capaz de indicar si el nivel del biomarcador en la muestra biológica está por encima o por debajo del valor de referencia.
Aunque algunos formatos de ensayo permitirán el análisis de muestras biológicas sin procesamiento previo de la muestra, las muestras de fluidos biológicos de sangre periférica pueden procesarse antes del análisis. El procesamiento suele consistir en la eliminación de células (nucleadas y no nucleadas), tales como eritrocitos, leucocitos y plaquetas en las muestras de sangre, y también puede incluir la eliminación de determinadas proteínas, tales como ciertas proteínas de la cascada de coagulación de la sangre. En algunos ejemplos, la muestra de fluido biológico periférico se recoge en un recipiente que contiene EDTA.
El procedimiento de comparar un valor medido y un valor de referencia puede llevarse a cabo de cualquier manera conveniente apropiada al tipo de valor medido y valor de referencia para el biomarcador en cuestión. Como se ha discutido anteriormente, la medición puede realizarse mediante técnicas de medición cuantitativas o cualitativas, y el modo de comparar un valor medido y un valor de referencia puede variar en función de la tecnología de medición empleada. Por ejemplo, cuando se usa un ensayo colorimétrico cualitativo para medir los niveles de biomarcadores, los niveles pueden compararse comparando visualmente la intensidad del producto de reacción coloreado, o comparando datos de mediciones densitométricas o espectrométricas del producto de reacción coloreado (por ejemplo, comparando datos numéricos o datos gráficos, tales como diagramas de barras, derivados del dispositivo de medición). Sin embargo, se espera que los valores medidos usados en los procedimientos de la divulgación sean más comúnmente valores cuantitativos (por ejemplo, medidas cuantitativas de concentración, tales como nanogramos de biomarcador por mililitro de muestra, o cantidad absoluta). Al igual que con las mediciones cualitativas, la comparación puede realizarse inspeccionando los datos numéricos, inspeccionando representaciones de los datos (por ejemplo, inspeccionando representaciones gráficas tales como gráficos de barras o de líneas).
Cabe señalar que, tal como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno, una" y "el/la" incluyen referencias plurales salvo que el contexto indique claramente lo contrario. En esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones que siguen, se hará referencia a una serie de términos que se definirán con el siguiente significado, a menos que sea evidente una intención contraria.
Como se usa en la presente memoria, el término "idelalisib" se refiere al compuesto (S)-2-(1-(9H-purin-6-ilamino)propil)-5-fluoro-3-fenilquinazolin-4(3H)-ona o sales alternativas del mismo.
Como se usa en la presente memoria, "células T que son negativas para CD28 y/o CD27" se refiere a tener baja expresión o falta de expresión de concentraciones relativas de estos marcadores en comparación con células T normales que expresan marcadores de antígenos de superficie CD3 en un sujeto sano.
El término "clasificación celular activada por fluorescencia" o "FACS" se refiere a un procedimiento de clasificación de una mezcla de células en dos o más áreas, por lo general una célula a la vez, basado en las características fluorescentes de cada célula, una carga eléctrica aplicada respectivamente, y la separación por movimiento a través de un campo electrostático. Por lo general, un mecanismo vibratorio hace que un flujo de células se rompa en gotas individuales. Justo antes de la formación de gotas, las células en un fluido pasan por una zona para medir la fluorescencia de la célula. Un mecanismo de carga eléctrica está configurado en el punto donde el flujo se rompe en gotas. Basándose en la medición de la intensidad de fluorescencia, se impone una carga eléctrica respectiva a la gota cuando se desprende del flujo. A continuación, las gotas cargadas se mueven a través de un sistema de desviación electrostática que desvía las gotas hacia zonas en función de su carga relativa. En algunos sistemas, la carga se aplica directamente a la corriente, y la gota que se desprende retiene carga del mismo signo que el flujo. A continuación, el flujo vuelve a ser neutro después de que se desprenda la gota. En otros sistemas, se proporciona una carga en un conducto que induce una carga opuesta en la gota. Por lo general, las células se hacen fluorescentes mezclándolas con un anticuerpo que se une específicamente a un marcador que se hace fluorescente por conjugación con una molécula fluorescente. Sin embargo, se contemplan otros procedimientos para hacer que una célula sea fluorescente, tales como el uso de balizas moleculares.
Un "medio esencial mínimo" se refiere a un medio que contiene sales de calcio, magnesio, potasio, sodio, fosfato y bicarbonato, vitaminas y aminoácidos esenciales. Los 12 aminoácidos esenciales son: L-arginina; L-cistina; L-glutamina; L-histidina; L-isoleucina; L-leucina; L-metionina; L-fenilalanina; L-treonina; L-triptófano; L-tirosina; y L-valina. A menudo, el MEM se complementa con componentes tales como el bicarbonato o la glutamina. En ciertas realizaciones, la presente divulgación contempla un medio esencial mínimo complementado con aminoácidos no esenciales: L-ala; L-asn; L-asp; L-glu; L-gly; L-pro y L-ser. En ciertas realizaciones, la presente divulgación contempla un medio esencial mínimo complementado con nucleósidos (ribonucleósidos y/o desoxirribonucleósidos).
El término "recombinante" cuando se hace referencia a una molécula de ácido nucleico se refiere a una molécula de ácido nucleico que está compuesta por segmentos de ácido nucleico unidos mediante técnicas de biología molecular. El término "recombinante" cuando se hace referencia a una proteína o un polipéptido se refiere a una molécula de proteína que se expresa usando una molécula de ácido nucleico recombinante. El término ácido nucleico recombinante se distingue de los recombinantes naturales que resultan del cruce entre cromosomas homólogos. Los ácidos nucleicos recombinantes, como se usan en la presente memoria, son una unión no natural de ácidos nucleicos de fuentes no homólogas, normalmente de organismos diferentes.
Los términos "vector" o " vector de expresión" se refieren a un ácido nucleico recombinante que contiene una secuencia codificante deseada y secuencias de ácido nucleico adecuadas necesarias para la expresión de la secuencia codificante enlazada operablemente en un organismo hospedador o sistema de expresión particular, por ejemplo, celular o libre de células. Las secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión en procariotas normalmente incluyen un promotor, un operador (opcional) y un sitio de unión al ribosoma, a menudo junto con otras secuencias. Se sabe que las células eucariotas usan promotores, potenciadores y señales de terminación y poliadenilación.
Los términos "péptido intestinal vasoactivo" y "VIP" se refieren a (SEQ ID NO: 12) HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN excepto cuando el contexto indique lo contrario. VIP es un polipéptido endógeno multifuncional que modula tanto la inmunidad innata como la adaptativa a múltiples niveles de diferenciación y activación de las células inmunitarias.
VIP es secretado por lo general por una variedad de células tales como las neuronas (tanto en el sistema nervioso central como en el periférico), células B, células T y células accesorias. VIP y el neuropéptido estrechamente relacionado, polipéptido activador de la adenilil ciclasa de la pituitaria (PACAP) se unen a tres receptores conocidos: VPAC1, VPAC2 y PAC1. Se cree que las células T y las células dendríticas (CD) expresan VPAC1 y VPAC2, pero no PAC1. PAC1 se expresa principalmente en las células neuronales y endocrinas del cerebro y las glándulas pituitaria y suprarrenal, y en la mayoría de sus formas se une selectivamente al PACAP.
El término "antagonista VIP" o "antagonista del receptor VIP" se refiere a cualquier molécula que inhiba o reste importancia a la capacidad de VIP para alterar las respuestas inmunitarias. Se conocen antagonistas del receptor VIP que incluyen análogos VIP, fragmentos VIP, análogos del factor liberador de la hormona del crecimiento y péptidos híbridos. Un número de antagonistas de los receptores VIP se divulgan en las Patentes de los Estados Unidos números 5,565,424; 7,094,755; 6,828,304. Algunos ejemplos de antagonistas del receptor VIP incluyen [Ac-Tyr1,D-Phe2]GRF 1-29, amida, es decir, (SEQ ID NO: 4) YFDAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSR (Modificaciones: Tyr-1 = Ac N-terminal, Phe-2 = D-Phe, Arg-29 = amida C-terminal); VIP (6-28), es decir, (SEQ ID NO:5) FTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN (Modificaciones: Asn-23 = amida C-terminal); [D-p-Cl-Phe6, Leu17]-VIP, es decir, (SEQ ID NO: 6) HSDA VFTDNYTRLRKQLA VKKYLNSILN (Modificaciones: Phe-6 = p-Cl-D-Phe, Asn = amida C-terminal); VIP-hyb también conocido como VIPhíbrido (SEQ ID NO: 1) KPRRPYTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN, es decir, un péptido híbrido de neurotensina y VIP consistente en un KPRRPY N-terminal (SEQ ID NO: 7) , también designado neurotensina (6-11)] seguido de los 22 aminoácidos C-terminales de VIP, es decir, (SEQ ID NO: 8) TDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN, también designado VIP (7-28); estearil N-terminal , norleucina 17 VIPhyb, es decir, (SEQ ID NO: 9) KPRRPYTDNYTRLRKQXAVKKYLNSILN, en la que X es norleucina; Ac His1 [D-Phe(2), Lys(15), Arg(16), Leu(27)]-VIP(l-7)/GRF(8-27), es decir, (SEQ ID NO: 10) HFDAVFTNSYRKVLKRLSARKLLQDIL, amida C-terminal; y polipéptido activador de la adenilato ciclasa de la pituitaria, PACAP (6-38) amida C-terminal, es decir, (SEQ ID NO: 11) TDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK. Se contempla la posibilidad de modificar cualquiera de estas moléculas con grupos hidrocarburo o polietilenglicol para mejorar propiedades tales como la solubilidad, la biodisponibilidad y/o la degradación biológica.
Como se usan en la presente memoria, los términos "tratar" y "tratamiento" no se limitan al caso en el que el sujeto (por ejemplo, el paciente) se cure y la enfermedad se erradique. Más bien, la presente divulgación también contempla el tratamiento que simplemente reduce los síntomas, y/o retrasa la progresión de la enfermedad.
Inmunofenotipo de los pacientes con linfoma recidivante
Durante el envejecimiento fisiológico y en individuos expuestos a repetidas rondas de quimioterapia o condiciones inflamatorias crónicas, las células T desarrollan una condición de senescencia en la que son anérgicas o tienen un potencial proliferativo limitado en respuesta a la estimulación antigénica. El fenotipo de las células T de senescencia se ha descrito como aquellas células T que carecen de los receptores coestimuladores CD27 y CD28 o que presentan niveles elevados del marcador CD57. Además, la expresión de PD1, un receptor de ligando de muerte programada, se ha asociado con el estado anérgico. La presencia de células T anérgicas es un cofactor crítico en la capacidad de los pacientes para responder a las vacunas o para organizar respuestas inmunitarias protectoras y duraderas frente a infecciones víricas crónicas o el cáncer. Se necesitan enfoques novedosos para revertir la senescencia y la anergia de las células T a fin de ofrecer a los pacientes con infecciones crónicas y cáncer la perspectiva de una inmunoterapia celular eficaz.
El inmunofenotipo de los pacientes con linfoma recidivante se caracteriza por tener una representación excesiva de células T con fenotipo anérgico: CD3 positivo, CD27 negativo, CD28 negativo. Se comprobó si la señalización a través del receptor del polipéptido intestinal vasoactivo contribuía a la senescencia de las células T y a la energía específica del antígeno. La adición de un péptido antagonista del receptor VIP denominado VIPhyb aumentó la proliferación de células T in vitro y mitigó el efecto inhibidor del péptido VIP nativo sobre la proliferación de células T.
Se probó si la adición del antagonista VIPhyb podía revertir los déficits proliferativos de las células T anérgicas de pacientes con cáncer recidivante de larga duración. Se evaluó el inmunofenotipo de las células T en un paciente con linfoma recidivante. Había una relativa sobrerrepresentación de células que carecían de los receptores coestimuladores CD27 y CD28. Además, las células T de esta estación tienen altos niveles de expresión de CD57, PD1 y Tim-3.
Usando la clasificación celular de alta velocidad se aislaron subconjuntos de células T definidos por sus niveles de expresión de CD27 y CD28 del paciente con linfoma recidivante y de un control sano. Las células T CD3 positivas con cada uno de los cuatro fenotipos definidos por la expresión de CD27 y CD28 se seleccionaron y cultivaron in vitro en presencia de microesferas anti-CD3/anti-CD28. Mientras que las células T totales de donantes sanos presentaban una expresión del 100% del marcador de proliferación Ki67 tras cuatro días de cultivo, la correspondiente población de células T totales del paciente con células T anérgicas tras el tratamiento del linfoma sólo presentaba un 90 % de células T que expresaban el marcador Ki67.
Después de la adición diaria de 3 uM de VIPhyb a estos cultivos, la proporción de células T Ki67 positivas del paciente con linfoma anérgico aumentó al 100%. Los subconjuntos de células T clasificados en función de la expresión de CD27 y CD28 de este paciente mostraron que la población CD27 positiva y CD28 positiva (doble positiva) proliferaba normalmente en respuesta a las microesferas anti-CD3/CD28. Por el contrario, los subconjuntos de células T que carecían de expresión de los marcadores CD27 o CD28, o de ambos, tenían una respuesta proliferante deteriorada cuando se incubaban con las microesferas anti-CD3/CD28.
La adición del antagonista VlPhyb aumentó la proliferación de células T en los subconjuntos que carecían ya sea de CD27 o CD28. La adición de IL 12 a estos cultivos tuvo un impacto significativo en el aumento de la fracción de proliferación de las células T CD28 negativas, pero no de las CD27 negativas. El análisis por citometría de flujo de las células T cultivadas con microesferas anti-CD3/anti-CD28 mostró que la adición de 3 uM de VIPhyb provocó una disminución de los niveles de expresión de PD-1 en comparación con los cultivos de control a los que no se agregó ningún antagonista de VIP Estos datos indican que VIP se induce durante la activación específica de antígenos de las células T y que la estrategia para bloquear la señalización de VIP podría aumentar la proliferación de células T y revertir la anergia entre las células T senescentes de individuos con afecciones inflamatorias crónicas o que han estado expuestos a múltiples ciclos de quimioterapia.
Dado que el péptido VIP tiene una semivida muy corta in vivo de menos de dos minutos y es escindido por endopeptidasas, se cree que la sobreexpresión de peptidasas específicas de VIP en la vecindad de células T activadas a través de su receptor de células T resulta en un aumento de la activación y proliferación de células T y podría revertir la senescencia inmune.
En ciertas realizaciones, la divulgación se refiere a la expansión de células T que son positivas para CD3 y negativas para CD4 y CD8, tales como las células T gamma delta (células T y8). Células T gamma delta que tienen un receptor de células T (TCR) distintivo en su superficie. La mayoría de las células T son células T ap (alfa beta) con un TCR compuesto por dos cadenas de glicoproteínas denominadas cadenas a (alfa) y p (beta) del TCR. Por el contrario, las células T gamma delta (y8) tienen un TCR que está formado por una cadena y (gamma) y una cadena 8 (delta).
En ciertas realizaciones, la divulgación contempla una célula T modificada genéticamente para expresar en su superficie una enzima que degrada VIP En ciertas realizaciones, la enzima que degrada VIP es la quimasa de mastocitos CMA1 humana recombinante. En ciertas realizaciones, las células T modificadas genéticamente también expresan un receptor de antígeno quimérico que las dirige a las células cancerosas.
Ejemplos
La señalización VIP regula la proliferación de células T inducida por aloantígenos
Para explorar el papel de la señalización VIP en las respuestas aloinmunes, se realizaron reacciones de linfocitos mixtos unidireccionales (MI,R) que contenían VIP y/o el péptido antagonista VIPhyb. La adición de VIP disminuyó la proliferación de células T Luciferasa de forma dependiente de la dosis, mientras que la adición de VIPhyb aumentó la proliferación de células T. VIPhyb invirtió el efecto supresor de VIP en MLR, restaurando la proliferación de células T a niveles superiores a los cultivos de control.
El bloqueo farmacológico durante la expansiónex vivode células T para la fabricación de T CAR aumenta el rendimiento y preserva los compartimentos naive y de memoria central
El linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) es una neoplasia maligna agresiva de células B que afecta principalmente a poblaciones de pacientes de edad avanzada. A pesar de los sólidos regímenes de tratamiento disponibles, existe un subgrupo de pacientes con DLBCL con linfoma que es altamente resistente al tratamiento. Debido al hecho de que la enfermedad de estos pacientes es refractaria a prácticamente todos los regímenes de tratamiento actuales, la terapia T CAR es muy prometedora como opción de rescate eficaz; sin embargo, muchos pacientes no han recibido tratamiento en ensayos clínicos debido a un fallo en la expansión de células T ex vivo. Este fracaso se debe en gran parte al daño causado por numerosas rondas de terapias, así como a la edad de los pacientes. Adicionalmente, los datos indican que los pacientes con NHL tienen una proporción sesgada de células T de memoria frente a naive, lo que da lugar a una inmunoterapia celular deficiente.
Dos de las proteínas de superficie que son indicativas del potencial de un paciente para una expansión exitosa de células T son CD27 y CD28. Las células T que expresan tanto CD27 como CD28 tienen el mayor potencial proliferativo, mientras que las células T que carecen de la expresión de ambos a menudo no se expanden y mueren durante la activación y expansión anti-CD3/CD28. Los individuos sanos tienen una abundancia de linfocitos T CD27+CD28+ (doble positivo), mientras que los pacientes con DLBCL tienen una sobreabundancia de linfocitos T CD27-CD28-(doble negativo). Esta sobrerrepresentación de la población doble negativa en pacientes con linfoma ayuda a explicar aún más el fracaso de las células T para expandirse adecuadamente durante la fabricación de T CAR. Además de la falta de expresión de CD27 y CD28, las células T de los pacientes con DLBCL también exhiben signos de agotamiento y senescencia que conducen a deficiencias funcionales y a la incapacidad de expandirse.
Para abordar los problemas con la expansión de células T de pacientes con DLBCL durante la fabricación de células T CAR, se usaron una variedad de tecnologías para potenciar la expansión de poblaciones específicas de células T deseadas. La inclusión del inhibidor de PI3K 8 idelalisib solo o en combinación con un mastocito quimasa o antagonista del péptido intestinal vasoactivo (VlPhyb) durante la activación de células T aumenta el número de células T viables obtenidas e incrementa la proporción de células naive y de memoria central. Las células naive y de memoria central son el subconjunto más eficaz para la inmunoterapia celular adoptiva. Adicionalmente, la inclusión de idelalisib o VIPhyb aumenta la frecuencia de células CD27+CD28+ mientras que disminuye la frecuencia de células CD27-CD28-. Estudios adicionales realizados con células T murinas y humanas han indicado que, mientras que el bloqueo de PI3K 8 tiene un efecto inhibidor sobre la proliferación, la prevención de la diferenciación terminal y la preservación del compartimento naive mejoran la supervivencia y el rendimiento de las células T Estos datos indican que las condiciones de cultivo usadas no sólo aumentan el número total de células T del paciente, sino que también preservan los compartimentos más eficaces en la inmunoterapia adoptiva con células T. Como tal, el uso de nuestros procedimientos durante la fabricación de T CAR tiene el potencial de permitir el desarrollo del tratamiento de último recurso que muchos pacientes con DLBCL no han podido recibir previamente.
Expansión de células T senescentes con inhibidores de la cinasa P13 y bloqueo de la señalización VIP
Idelalisib es un inhibidor de la PI3 cinasa. La PI3 cinasa es una vía de señalización importante para la activación y diferenciación de los linfocitos, y regula la actividad de AKT y mTORI. Idelalisib está aprobado por la FDA para el tratamiento de pacientes con leucemia linfocítica crónica y neoplasia maligna indolente de células B. Se ha observado que los pacientes tratados con idelalisib presentan respuestas anticancerosas continuadas tras la interrupción del tratamiento farmacológico y desarrollan signos y síntomas de tipo autoinmunitario, como colitis y erupciones cutáneas, lo que lleva a plantear la hipótesis de que idelalisib modula el sistema inmunitario y activa o preserva las células T polarizadas Th1.
El tratamiento con idelalisib produce un aumento de la activación de las células T en pacientes con CLL. La exposición ex vivo de células T activadas a idelalisib potencia su activación y expansión in vitro. Mediante la adición de una gama de concentraciones de idelalisib a células T cultivadas in vitro con microesferas anti-CD3/CD28, se midió la expansión y diferenciación de las células T.
Una muestra de células T que se usó de un paciente con linfoma que tenía células T senescentes que no lograron expandirse in vitro cuando se intentó la fabricación de células T CAR. Se eliminaron los monocitos de la muestra de células T, ya que se sabe que los monocitos inhiben la expansión de las células T en cultivos que contienen microesferas anti-CD3/CD28. Se comparó el efecto de una gama de concentraciones de idelalisib solo y en combinación con 3 uM de antagonista del péptido VIP (VIPhyb) o 1 ug/ml de quimasa de mastocitos, una enzima que degrada el VIP endógeno, sobre la activación, diferenciación y proliferación de las células T. Se midió el número de células T viables durante un cultivo in vitro de 10 días, así como los perfiles de diferenciación y activación de células T, centrándose en el número relativo de células T con un fenotipo senescente en el que los receptores coestimuladores CD27 y CD28 están ausentes (CD27-CD28-), a un fenotipo activado, en el que o bien CD27, CD28, o ambos receptores coestimuladores están presentes (CD27+CD28+).
Se descongelaron rápidamente alícuotas de productos de aféresis de pacientes congelados o PBMC de sangre total ficolizada y se dejaron reposar durante la noche en RPMI 1640 completo complementado con 10 % de suero bovino fetal, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina y 50 μM de 2-mercaptoetanol (medio completo). Al día siguiente, se extrajeron los glóbulos rojos de los productos de aféresis mediante gradiente de ficoll. A continuación, los leucocitos se enriquecieron para células T usando un kit EasySep de enriquecimiento de células T humanas según las instrucciones del fabricante. Las células se sembraron en 200 μl de medio completo en cada pocillo de una placa de fondo plano de 96 pocillos. Los compuestos se agregaron a las concentraciones indicadas, y la concentración de DMSO se normalizó al 0,1 % para todos los pocillos. Se agregaron microesferas Anti-CD3/CD28 en una proporción de 1:1 microesfera/célula. El día 7 después de la estimulación, las células de cada tratamiento se transfirieron a un medio nuevo. A continuación, se agregaron nuevos compuestos y microesferas, y las células se cultivaron durante 3 días más. El día 10 después de la estimulación inicial, se retiraron las microesferas y se tiñeron las células para realizar un análisis de citometría de flujo.
Las células se lavaron dos veces en PBS. También se tiñeron las células con un colorante de viabilidad fijable. A continuación, se tiñeron los marcadores de superficie agregando anticuerpos conjugados con fluorocromo contra CD3, CD4, CD8, CD27, CD28, CD45RA, CD45RO, PD-1 y CCR7. Para evaluar la proliferación, se evaluó la expresión de Ki67 en la mitad de las células. La tinción Ki67 se realizó usando un kit de tinción intracelular FoxP3. Justo antes de analizar las muestras, se agregaron microesferas de recuento Accucheck a cada tubo. Las muestras se adquirieron en un BD FACS Aria, y el análisis se realizó usando el software FlowJo. En el análisis se usaron células viables. El número absoluto de células se calculó para cada población siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante de las microesferas de recuento Accucheck.
La adición de idelalisib a los cultivos de células T a concentraciones de 1 uM o 100 nM, aumentó significativamente la proporción de células T que coexpresaban CD27 y CD28 en comparación con los cultivos de control sin fármaco agregado. Cabe destacar que la fracción de células T senescentes que carecían de receptores coestimuladores CD27 y CD28 se redujo del 55,2 % en los cultivos de control sin fármaco agregado, al 16,1 % en los cultivos con 10 nM de idelalisib, al 35,7 % en los cultivos con 3 uM de VlPhyb, y al 37,4 % en los cultivos con 1 |jg por ml de quimasa de mastocitos.
Idelalisib a una concentración de 100 nM fue sinérgico al potenciar de la proporción de células T que expresan receptores coestimuladores cuando se combinó con VlPhyb o quimasa, con una fracción de células CD27+CD28+ del 21,5 % con la combinación de 100 nM de idelalisib y VlPhyb y del 14,2 % en la combinación de 100 nM de idelalisib y quimasa frente al 3,5 % en los cultivos de control sin fármaco agregado.
Los números de células T efectoras de memoria (Tern) en los cultivos de 10 días también aumentaron con la exposición a idelalisib, VlPhyb y las combinaciones de idelalisib con quimasa y VlPhyb. El número total de células T viables en los cultivos aumentó significativamente con las combinaciones de idelalisib y quimasa o idelalisib y VlPhyb en comparación con los cultivos de control sin fármaco agregado. Cabe destacar que los números totales del subconjunto de células T CD27+ CD28+ se enriquecieron más de 10 veces en los cultivos que contenían 100 nM de idelalisib, 1 uM de idelalisib más 1 ug/ml de quimasa, o 100 nM de idelalisib más 3 uM de VlPhyb en comparación con los cultivos que no contenían fármacos agregados, mientras que los números totales de CD3+ Tern en los cultivos de 10 días aumentaron 10 veces en los cultivos que contenían 1 uM de idelalisib más quimasa en comparación con los cultivos de control sin fármacos agregados. Las células T de memoria central CD3+ (Tcm) aumentaron entre 5-10 veces en los cultivos que contenían idelalisib solo, VlPhyb solo, quimasa sola o combinaciones de idelalisib con VlPhyb o quimasa en comparación con los cultivos de control sin fármacos agregados.
Estos datos indican que las células T senescentes que no pueden expandirse en cultivo con microesferas anti CD3/CD28 y que no produjeron suficientes células T CAR fabricadas para uso clínico pueden expandirse significativamente in vitro con la adición de idelalisib, VlPhyb o quimasa de mastocitos como agentes únicos o en combinación. Estos resultados apoyan la adición de estos agentes durante la fabricación de T CAR y apoyan su uso in vitro para expandir las células T senescentes para potenciar la inmunoterapia del cáncer y la inmunidad antiviral.
Claims (10)
1. Una composición de cultivo celular in vitro que comprende células T purificadas y un antagonista del receptor VIP y anticuerpos anti-CD3 y anticuerpos anti-CD28 opcionalmente inmovilizados en una microesfera o superficie sólida.
2. La composición de la reivindicación 1, en la que más del 15 % de las células T son negativas para CD28.
3. La composición de la reivindicación 1, en la que el antagonista del receptor VIP comprende KPRRPYTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN) (SEQ ID NO: 1).
4. Una composición de cultivo celular in vitro que comprende células T purificadas y una enzima degradadora de VIP y anticuerpos anti-CD3 y anticuerpos anti-CD28 opcionalmente inmovilizados en una microesfera o superficie sólida.
5. La composición de la reivindicación 4, en la que más del 15 % de las células T son negativas para CD28.
6. La composición de la reivindicación 4, en la que la enzima degradadora de VIP comprende mllklkekasltlavgtlpfpsqfnfvppgrmcrvagwgrtgvlkpgsdtlqevklrlmdpqacshfrdfdhnlqlcvgnprktksafk gdsggμllcagvaqgivsygrsdakppavftrishyrpwinqilqan (SEQ ID NO: 2).
7. La composición de la reivindicación 4, en la que la enzima degradadora de VIP comprende (SEQ ID NO: 3).
DGICKS SDCIKS AARLIQNMD ATTEPCTDFFKYACGGWLKRNVIPETS SRYGNFDILRDE LEVYLKD VLQEPKTEDIV AV QKAKAL YRS CINES AID SRGGEPLLKLLPDIY GWP V ATEN WEQKY GAS WT AEKAIAQLN SKY GKKVLINLFV GTDDKN S VTS1HVIHIDQPRLGLPSRD Y YECTGIYKEACTAYVDFMISVARLIRQEERLPIDENQLALEMNKVMELEKEIANATAKPE DRNDPMLLYNKMTLAQIQNNFSLEINGKPFSWLNFTNEIMSTVNISITNEEDVWYAPEY LTKLKPILTKYSARDLQNLMSWRFIMDLVSSLSRTYKESRNAFRKALYGTTSETATWRR CANYVNGNMENAVGRLYVEAAFAGESKHVVEDLIAQIREVFIQTLDDLTWMDAETKK RAEEKAL AIKERIGYPDDIV SNDNKLNNE YLELN YKEDE YFENIIQNLKF S Q SKQLKKLR EKVDKDEWIS GAAVVNAF Y S S GRN QIVFP AGILQPPFF S AQQ SN SLN Y GGIGMVIGHEIT
HGFDDNGRNFNKDGDLVDWWTQQSASNFKEQSQCMVYQYGNFSWDLAGGQHLNGIN TLGENIADNGGLGQAYRAYQNYIKKNGEEKLLPGLDLNHKQLFFLNFAQYWCGTYRPE YAVNSIKTD VESPGNFRIIGTLQNS AEFSEAFHCRKNS YMNPEKKCRVW.
8. Un procedimiento de proliferación de células T que son negativas para CD28 usando un cultivo celular in vitro como el proporcionado en las reivindicaciones 1-7 que proporciona células T replicadas.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que las células T replicadas tienen una mayor expresión de CD28 en comparación con los niveles previos a la replicación.
10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que antes, durante o después de la proliferación de las células T, las células T se mezclan con un vector que tiene un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico, en el que el receptor de antígeno quimérico comprende una secuencia diana de cáncer, un dominio transmembrana, un dominio de molécula coestimuladora de células T y un componente de transducción de señales de un dominio de receptor de antígeno de células T, en condiciones tales que las células expresan el receptor de antígeno quimérico en la superficie de las células.
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