JP2024026086A - 細胞ベースの治療法を用いて癌および感染性疾患を処置する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）シグナル伝達を中断し、かつ／またはホスファチジルイノシトール－３－キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）阻害剤のシグナル伝達を阻害することにより、Ｔ細胞の老化を反転させる組成物および方法、ならびに癌および慢性ウイルス感染の管理における使用を提供する。【解決手段】インビトロ細胞培養物組成物において、精製されたＴ細胞およびＶＩＰ受容体アンタゴニストならびにビーズまたは固体表面上に任意選択により固定化された抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を含むことを特徴とするインビトロ細胞培養物組成物とする。【選択図】図２

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年４月８日に出願された米国仮特許出願第６２／３１９，９５７号明細書の利益を主張する。この出願の全体は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

連邦政府が資金提供する研究についての声明
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＲＯ１ ＨＬ１１６７３７－０１ＡおよびＲＯ１ ＣＡ１８８５２３の下、政府の支援を得てなされたものである。政府は、本発明に対する一定の権利を有する。

特許庁電子出願システム（ＥＦＳ－ＷＥＢ）によってテキストファイルとして提出した資料の参照による組み込み
本出願に関する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書中に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、１６０９４ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは、１１ＫＢであり、２０１７年４月５日に作成され、かつＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で電子的に提出されている。

細胞毒性Ｔ細胞は細胞を直接殺傷し、応答は抗原特異的である。腫瘍を破壊するために、細胞毒性細胞は、分裂する癌細胞を追い越すために十分な数で増殖しなければならない。しかしながら、Ｔ細胞は、抗原刺激に応答した増殖能が制限される場合、老化したものとみなされる。Ｆｉｌａｃｉ ｅｔ ａｌ．は、エフェクターＴ細胞のサブセットであるＣＤ８＋ＣＤ２８－Ｔ制御リンパ球がヒト癌におけるＴ細胞の増殖能および細胞毒性機能を阻害することを報告している。Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７，１７９：４３２３－４３３４。Ｍｏｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．は、腫瘍が老化Ｔ細胞を腫瘍免疫回避の潜在的な形態として誘導することを示している。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２００８，６８：８７０－８７９。老化Ｔ細胞は、ＣＤ２７およびＣＤ２８の発現の喪失、増殖能の欠如ならびに老化関連分子の発現増加を特徴とする。Ｒａｍｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，２０１４．５，ｅ１５０７を参照されたい。したがって、Ｔ細胞の老化を反転させることによって癌を治療する改善された方法を同定する必要がある。

Ｔ細胞の増殖について、免疫抑制された癌患者のＴ細胞免疫を増強するために実験的に用いられてきた、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で被覆された磁気ビーズ（抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ）が報告されている。Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．を参照されたい。ドナーリンパ球注入の第１相試験は、ＣＤ３／ＣＤ２８共刺激によってエクスビボで増殖および活性化される。Ｂｌｏｏｄ，２００６，１０７：１３２５－１３３１。

Ｌｉ ｅｔ ａｌは、血管作動性腸管ペプチドシグナル伝達と拮抗することによる同種移植における移植片対白血病の調節を報告している。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１６，７６（２３）：６８０２－６８１。Ｌｉ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３，８（５）：ｅ６３３８１；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１３，１２１（１２）：２３４７－５１，Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１，１８７（２）：１０５７－６５；米国特許第９，４５８，２１７号明細書；および米国出願公開第２０１３／０３０２３５１号明細書も参照されたい。

本明細書に引用される参考文献は、従来技術の承認ではない。

本開示は、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）シグナル伝達を中断し、かつ／またはホスファチジルイノシトール－３－キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）阻害剤のシグナル伝達を阻害することにより、Ｔ細胞の老化を反転させる組成物および方法、ならびに癌および慢性ウイルス感染の管理における使用に関する。特定の実施形態において、本開示は、ＶＩＰがＶＩＰ受容体と相互作用することを防止する薬剤とインビトロでＴ細胞を混合することにより、および／またはＰＩ３キナーゼ阻害剤の添加により、Ｔ細胞の老化を反転させる方法を企図する。特定の実施形態において、本開示は、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＶＩＰおよびＶＩＰ受容体シグナル伝達を遮断する薬剤、ＶＩＰ分解酵素、ならびにそれらの組み合わせと混合することによる老化Ｔ細胞の増殖を企図する。

特定の実施形態において、本開示は、ＣＤ３および／またはＣＤ２８を結合する抗体と、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、イデラリシブ、ＶＩＰのＶＩＰ受容体との相互作用を防止する薬剤（例えば、ＶＩＰ受容体を通じたシグナル伝達を防止する）、ＶＩＰ分解酵素、およびそれらの組み合わせとを組み合わせてＴ細胞をインビトロで曝露することにより、単離されたＴ細胞を刺激するかまたは老化Ｔ細胞を増殖させる方法を企図する。特定の実施形態において、本開示は、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体、または結合剤（磁気ビーズなどの固体基材に任意選択により連結されたもの）の使用を企図する。

特定の実施形態において、本開示は、、本明細書に開示されるインビトロ細胞培養を用いて、ＣＤ２８および／またはＣＤ２７に対して陰性であるＴ細胞を増殖させ、複製前のレベルと比較してＣＤ２８および／またはＣＤ２７の増加した発現を有する複製Ｔ細胞を提供する方法を企図する。

特定の実施形態において、本開示は、Ｔ細胞を増殖させる方法であって、Ｔ細胞を増殖させる前、その間、またはその後、Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列を有するベクターと混合され、キメラ抗原受容体は、細胞が細胞表面上にキメラ抗原受容体を発現する条件下において、癌標的配列、膜貫通ドメイン、Ｔ細胞共刺激分子ドメイン、およびＴ細胞抗原受容体ドメインのシグナル伝達成分を含む、方法を企図する。

特定の実施形態において、本開示は、インビトロ細胞培養物組成物であって、最小必須培地およびＴ細胞ならびにＶＩＰ受容体アンタゴニスト、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＶＩＰ分解酵素、およびそれらの組み合わせを含み、ビーズなどの固体基材上に任意選択により固定化された抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を任意選択によりさらに含むインビトロ細胞培養物組成物に関する。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、骨髄細胞または血液細胞から精製される。

特定の実施形態において、ホスファチジルイノシトール－３－キナーゼ阻害剤は、イデラリシブ、ウォルトマンニン、デメトキシビリジン、ペリホシン、ブパルリシブ、デュベリシブ、コパンリシブ、およびアルペリシブから選択される。特定の実施形態において、ホスファチジルイノシトール－３－キナーゼ阻害剤は、培養物中において、０．００１、０．１、１、１０、１００ｎＭを超えるか、または１０ｎＭ～１０μＭ、または１０ｎＭ～５００ｎＭ、または１０ｎＭ～１μＭの濃度のイデラリシブから選択される。

特定の実施形態において、培養物は、Ｃ末端アミドを有する（配列番号１）ＫＰＲＲＰＹＴＤＮＹＴＲＬＲＫＱＭＡＶＫＫＹＬＮＳＩＬＮを含むＶＩＰｈｙｂなどのＶＩＰ受容体アンタゴニストを含む。特定の実施形態において、培養物は、少なくとも０．００１、０．０１、０．１、０．５、１．０、２または３μＭの濃度で添加されたＶＩＰｈｙｂなどのＶＩＰ受容体アンタゴニストを含む。特定の実施形態において、培養物は、０．５～１０μＭまたは１～８μＭの濃度のＶＩＰｈｙｂなどのＶＩＰ受容体アンタゴニストを含む。

特定の実施形態において、培養物は、ＶＩＰを加水分解する酵素を含む。特定の実施形態において、培養物は、ペプチダーゼ、セリンペプチダーゼ、トリプターゼ、キマーゼ、ヒトキマーゼ１（ＣＭＡ１）、またはキモトリプシンセリンプロテアーゼなどのＶＩＰ分解酵素を含む。特定の実施形態において、培養物は、１ｍＬ当たり少なくとも少なくとも０．００１、０．０１、０．１または１μｇのマスト細胞キマーゼなどのＶＩＰ分解酵素を有する。特定の実施形態において、本開示は、最小必須培地と、ＣＤ３、および／またはＣＤ４、および／またはＣＤ８を発現し、かつＣＤ２７および／またはＣＤ２８に対して陰性である単離された細胞と、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＶＩＰおよびＶＩＰ受容体シグナル伝達を遮断する薬剤、ならびにそれらの組み合わせとを含むＴ細胞培養物を企図する。細胞は、ビーズ、磁気ビーズ、または蛍光結合剤の粒子などの固体支持体に付着した結合剤を使用して陰性または陽性選択によって単離され得る。

特定の実施形態において、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体は、ビーズ、磁気ビーズ、または固体表面上に固定化される。特定の実施形態において、培養物中の全細胞の５．０％超、または１０％超、または１５％超は、ＣＤ３、および／またはＣＤ４、および／またはＣＤ８を発現する。特定の実施形態において、全細胞の２０％超、２５％超または５０％超は、ＣＤ３、および／またはＣＤ４、および／またはＣＤ８を発現する。特定の実施形態において、培養物中のＴ細胞の１５％超、または２０％超、または３０％超は、ＣＤ２８および／またはＣＤ２７に対して陰性である。特定の実施形態において、Ｔ細胞の２０％超、２５％超または５０％超は、ＣＤ２８および／またはＣＤ２７に対して陰性である。

特定の実施形態において、精製されたＴ細胞は、血漿および赤血球が分離し、血漿および赤血球間の白血球の混合物中に精製されたＴ細胞を提供するような条件下において、血液を遠心分離することによって得られる。特定の実施形態において、精製されたＴ細胞は、骨髄吸引または骨髄生検によって得られる。

特定の実施形態において、精製されたＴ細胞は、ＣＤ３と結合する蛍光マーカーを細胞と混合し、かつ蛍光活性化細胞選別によって細胞を精製することによって得られる。特定の実施形態において、精製されたＴ細胞は、ＣＤ３と結合する磁化マーカーを細胞と混合し、かつ磁気選別によって細胞を精製することによって得られる。特定の実施形態において、精製されたＴ細胞は、ＣＤ３、および／またはＣＤ４、および／またはＣＤ８と結合する蛍光マーカーを細胞と混合し、かつ蛍光活性化細胞選別によって細胞を精製することによって得られる。特定の実施形態において、精製されたＴ細胞は、ＣＤ３、および／またはＣＤ４、および／またはＣＤ８と結合する磁化マーカーを細胞と混合し、かつ磁気選別によって細胞を精製することによって得られる。

特定の実施形態において、本開示は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を有し、かつ表面にカップリングされたＶＩＰ分解酵素を有するビーズなどの固体基材を企図する。特定の実施形態において、ビーズが培地中に配置され、およびビーズが細胞レベル下であるようにＴ細胞が培地の上で増殖されることが企図される。

特定の実施形態において、ＶＩＰ分解酵素は、ヒトＣＭＡ１受託番号ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＩ０３９７５．１：

を含む。特定の実施形態において、ＶＩＰ分解酵素は、（配列番号３）

を有するヒト組換えエンケファリナーゼ（中性エンドペプチダーゼ、ＥＣ３．４．２４．１１）である。

特定の実施形態において、本明細書に記載の細胞培養物および方法は、ＩＬ－１２をさらに含む。特定の実施形態において、ＩＬ－１２は、ＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体によってインビトロで刺激されたＴ細胞増殖に対するＶＩＰ受容体アンタゴニストの効果を増強することが意図される。

特定の実施形態において、本開示は、対象の腫瘍における浸潤が見出され得る癌に対する天然の反応性を有する、Ｔ細胞の増殖またはＴ細胞における老化の拡大もしくは反転に関する。腫瘍は収集され得、これらの腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）は、本明細書に開示する方法を用いて増殖され得る。

図１Ａは、同種抗原によって刺激されたインビトロＴ細胞増殖を増大させたＶＩＰｈｙｂ処置を示すデータを示す。示された濃度（０～１０ｍｍｏｌ／Ｌ）を達成するためにＶＩＰおよび／またはＶＩＰｈｙｂを毎日添加した、ＭＬＲで照射ＦＶＢ脾細胞と３日間培養したルシフェラーゼＢ６脾臓Ｔ細胞の増殖である。図１Ｂは、ＶＩＰｈｙｂの変異体濃度に関するデータを示す。 図２は、患者が老化Ｔ細胞を有する試料においてインビトロ培養物中で産生されたＣＤ２７＋およびＣＤ２８＋細胞の相対数に関するデータを示す。「Ｉｄ」は、イデラリシブを指す。「ＶＡ」は、ＶＩＰｈｙｂを指す。「ＭＣ」は、ヒトマスト細胞キマーゼ（ＣＭＡ１）を指す。 図３Ａは、増殖１４日目の全ＣＤ３＋集団におけるＣＤ２７およびＣＤ２８の発現に関するデータを示す。ＤＬＢＣＬ患者のＴ細胞を、示された化合物と共にまたは示された化合物なしで、３０Ｕ／ｍＬのＩＬ－２の存在下においてＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと共に１４日間増殖させた。 図３Ｂは、示された化合物の存在下または非存在下における患者のＴ細胞の増殖曲線を示す。ＣＤ２７＋ＣＤ２８＋コンパートメントの保存ならびにＤＬＢＣＬ患者におけるイデラリシブおよびＶＩＰｈｙｂを用いたＴ細胞増殖における全収量の増加である。 図４は、リンパ腫患者のＴ細胞におけるＢｃｌ－２の発現が、ＶＩＰｈｙｂ、イデラリシブ、またはその両方の組み合わせの添加によって増加したことを示すデータを示す。患者のＴ細胞増殖培養物由来のタンパク質溶解物を７日目および１４日目に調製した。試料は、ニトロセルロース膜に転写する前にＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上に流した。次いで、膜を生存促進性Ｂｃｌ－２タンパク質についてプローブし、剥離し、次いでローディング対照としてアクチンを再プローブした。 図５Ａは、腫瘍細胞注射後１８日目の腫瘍体積に関するデータを示す。マウスに５×１０^５のＥ．Ｇ７－ＯＶＡ細胞を皮下注射し、触知可能な腫瘍が形成されるまで７日間増殖させた。この期間中、ＩＬ－２および示された化合物の存在下において、ＯＴ－１、ＯＴ－ＩＩ、およびＢ６Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと共に３日間増殖させた。腫瘍増殖の７日目に、増殖したＯＴ－Ｉ、ＯＴ－ＩＩ、およびＢ６Ｔ細胞（２×１０^６ＯＴ－１、１×１０^６ＯＴ－ＩＩおよび２×１０^６Ｂ６細胞）の組み合わせまたは対照として２×１０^６Ｂ６Ｔ細胞をマウスに静脈内注射した。次いで、（ＬｘＷ２）／２で計算された腫瘍増殖についてマウスをモニターした。図５Ｂは、時間に対するグループ間の増殖速度を示す腫瘍成長曲線を示す。イデラリシブ、ＶＩＰｈｙｂまたはその両方の組み合わせの存在下でのマウスのＴ細胞の増殖は、ＯＶＡ発現リンパ腫モデルにおいてその治療効果を高める。

本開示をより詳細に説明する前に、本開示は、記載される特定の実施形態に限定されず、当然のことながら変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定することを意図するものではないことも理解されたい。

他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載された方法および材料と類似のまたは均等な任意の方法および材料も本開示の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料がここで説明される。

本明細書に引用される全ての刊行物および特許は、それぞれの個々の刊行物または特許が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれ、引用される刊行物に関する方法および／または材料を開示および説明するように参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前の開示のものであり、本開示が、先の開示のためにそのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供された刊行物の公開日は、実際の公開日と異なる可能性があり、独立して確認する必要があることが考えられる。

本開示を読むと当業者に明らかなように、本明細書に記載され図示された個々の実施形態は、本開示の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態の何れかの特徴と容易に分離されるかまたは組み合わせ得る個別の構成要件および特徴をそれぞれ有する。任意の記載された方法は、記載された事象の順序または論理的に可能な任意の他の順序で実施することができる。

本開示の実施形態は、特に明記しない限り、免疫学、医学、有機化学、生化学、分子生物学、薬理学、生理学などの技術を用い、これは、当業者の技術の範囲内である。このような技術は文献に十分に説明されている。

本明細書に記載される場合、少なくとも１つのタンパク質に基づく表面バイオマーカーのレベルは、個体由来の生物学的試料中で測定される。タンパク質レベルは、生物学的試料中のバイオマーカーのレベルを特異的に決定することができる任意の利用可能な測定技術を用いて測定することができる。測定は、生物学的試料中のバイオマーカーのレベルが基準値を上回るまたは下回るかを示すことができる限り、定量的または定性的であり得る。

いくつかのアッセイ形式は、試料の前処理なしで生物学的試料の試験を可能にするが、試験前に末梢血液生物学的液体試料が処理され得る。処理は、一般に、血液試料中の赤血球、白血球、および血小板などの細胞（有核および非核）の排除の形態をとり、血液由来の特定の凝固カスケードタンパク質などの特定のタンパク質の排除も含み得る。いくつかの例において、末梢生物学的液体試料は、ＥＤＴＡを含む容器に収集される。

測定値と基準値とを比較するプロセスは、対象のバイオマーカーの測定値および基準値のタイプに適した任意の簡便な方法で行うことができる。上述のように、測定は、定量的または定性的測定技術を使用して実施することができ、測定値と基準値とを比較する方法は、使用される測定技術によって異なり得る。例えば、定量的比色アッセイを用いてバイオマーカーレベルを測定する場合、着色反応生成物の強度を視覚的に比較することにより、または着色反応生成物の濃度測定もしくは分光測定からのデータ（例えば、測定装置から得られる数値データもしくは棒グラフなどのグラフデータ）を比較することにより、レベルが比較され得る。しかしながら、本開示の方法で使用される測定値は、最も一般的には定量値（例えば、１ミリリットルの試料当たりのバイオマーカーのナノグラムなどの濃度の定量的測定値または絶対量）であることが想定される。定性的測定と同様に、データ表示を検査することにより（例えば、棒グラフまたは折れ線グラフなどのグラフ表示を検査することにより）、数値データを検査することによって比較を行うことができる。

本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意する必要がある。本明細書および以下の特許請求の範囲では、反対の意図が明らかでない限り、以下の意味を有すると定義されるいくつかの用語が参照される。

本明細書で使用される場合、用語「イデラリシブ」は、化合物（Ｓ）－２－（１－（９Ｈ－プリン－６－イルアミノ）プロピル）－５－フルオロ－３－フェニルキナゾリン－４（３Ｈ）－オンまたはその代替塩を指す。

本明細書で使用される場合、「ＣＤ２８および／またはＣＤ２７に対して陰性であるＴ細胞」とは、健常な対象においてＣＤ３表面抗原マーカーを発現する正常なＴ細胞と比較した場合、これらのマーカーの相対濃度の発現が低いかまたは発現を欠いているものを指す。

「蛍光活性化細胞選別」または「ＦＡＣＳ」という用語は、各細胞の蛍光特性、それぞれ印加された電荷、および静電場を通る移動による分離に基づき、典型的には一度に１つの細胞を選別する、細胞の混合物を２つ以上の領域に選別する方法を指す。典型的には、振動機構は、細胞の流れを個々の液滴に分裂させる。液滴形成の直前に、流体中の細胞は、細胞の蛍光を測定するための領域を通過する。帯電機構は、流れが液滴に分裂する点に構成される。蛍光強度測定に基づき、液滴が流れから分裂するのに従い液滴にそれぞれの電荷が課される。次いで、帯電した液滴は、液滴をそれらの相対電荷に基づいて領域に分ける静電偏向システムを通って移動する。いくつかのシステムでは、電荷が流れに直接印加され、分離する液滴は、流れと同じ符号の電荷を保持する。次いで、液滴が分裂した後、流れが中性に戻る。他のシステムでは、導管に電荷が供給され、液滴に反対電荷を誘導する。細胞は、典型的には、細胞を、蛍光分子との結合によって蛍光を発するマーカーに特異的に結合する抗体と混合することによって蛍光を発する。しかしながら、分子ビーコンの使用などにより、細胞蛍光を作製する他の方法も企図される。

「最小必須培地」は、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、リン酸塩、ならびに重炭酸塩、ビタミン、および必須アミノ酸の塩を含有する培地を指す。１２の必須アミノ酸は、Ｌ－アルギニン；Ｌ－シスチン；Ｌ－グルタミン；Ｌ－ヒスチジン；Ｌ－イソロイシン；Ｌ－ロイシン；Ｌ－メチオニン；Ｌ－フェニルアラニン；Ｌ－スレオニン；Ｌ－トリプトファン；Ｌ－チロシン；Ｌ－バリンである。最小必須培地には、多くの場合に重炭酸塩またはグルタミンなどの成分が追加される。特定の実施形態において、本開示は、非必須アミノ酸：Ｌ－ａｌａ；Ｌ－ａｓｎ；Ｌ－ａｓｐ；Ｌ－ｇｌｕ；Ｌ－ｇｌｙ；Ｌ－ｐｒｏおよびＬ－ｓｅｒが追加された最小必須培地を企図する。特定の実施形態において、本開示は、ヌクレオシド（リボヌクレオシドおよび／またはデオキシリボヌクレオシド）が追加された最小必須培地を意図する。

「組換え」という用語は、核酸分子に関して用いられる場合、分子生物学的技術によって一緒に連結された核酸のセグメントを含む核酸分子を指す。「組換え」という用語は、タンパク質またはポリペプチドに関して用いられる場合、組換え核酸分子を用いて発現されるタンパク質分子を指す。組換え核酸という用語は、相同染色体間の交配から生じる天然の組換え体とは区別される。本明細書で使用される組換え核酸は、通常、異なる生物由来である、非相同源由来の核酸の非天然の組である。

「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、所望のコード配列、および特定の宿主生物または発現系（例えば、細胞系もしくは無細胞系）において作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な適切な核酸配列を含む組換え核酸を指す。原核生物における発現に必要な核酸配列は、通常、プロモーター、オペレーター（任意選択による）、およびリボソーム結合部位を多くの場合に他の配列と一緒に含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、ならびに終止およびポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。

文脈で他に示唆されない限り、「血管作動性腸管ペプチド」および「ＶＩＰ」という用語は、（配列番号１２）ＨＳＤＡＶＦＴＤＮＹＴＲＬＲＫＱＭＡＶＫＫＹＬＮＳＩＬＮを指す。ＶＩＰは、免疫細胞の分化および活性化の複数のレベルで自然免疫および適応免疫の両方を調節する多機能性内在性ポリペプチドである。

ＶＩＰは、ニューロン（中枢神経系および末梢神経系の両方における）、Ｂ細胞、Ｔ細胞およびアクセサリー細胞などの種々の細胞によって典型的に分泌される。ＶＩＰおよび密接に関連するニューロペプチドの下垂体アデニリルシクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）は、３つの既知の受容体、ＶＰＡＣ１、ＶＰＡＣ２およびＰＡＣ１に結合する。Ｔ細胞および樹状細胞（ＤＣ）は、ＶＰＡＣ１およびＶＰＡＣ２を発現するが、ＰＡＣ１を発現しないと考えられている。ＰＡＣ１は、脳および下垂体および副腎のニューロンおよび内分泌細胞上で主に発現され、ほとんどの形態でＰＡＣＡＰに選択的に結合する。

「ＶＩＰアンタゴニスト」または「ＶＩＰ受容体アンタゴニスト」という用語は、ＶＩＰが免疫応答を変化させる能力を阻害または低下させる任意の分子を指す。ＶＩＰ類似体、ＶＩＰ断片、成長ホルモン放出因子類似体およびハイブリッドペプチドを含むＶＩＰ受容体アンタゴニストが知られている。多数のＶＩＰ受容体アンタゴニストが米国特許第５，５６５，４２４号明細書；米国特許第７，０９４，７５５号明細書；米国特許第６，８２８，３０４号明細書に開示されており、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。ＶＩＰ受容体アンタゴニストのいくつかの例には、［Ａｃ－Ｔｙｒ１，Ｄ－Ｐｈｅ２］ＧＲＦ１－２９、アミド、すなわち（配列番号４）ＹＦＤＡＩＦＴＮＳＹＲＫＶＬＧＱＬＳＡＲＫＬＬＱＤＩＭＳＲ（改変：Ｔｙｒ－１＝Ｎ末端Ａｃ、Ｐｈｅ－２＝Ｄ－Ｐｈｅ、Ａｒｇ－２９＝Ｃ－末端アミド）；ＶＩＰ（６－２８）、すなわち（配列番号５）ＦＴＤＮＹＴＲＬＲＫＱＭＡＶＫＫＹＬＮＳＩＬＮ（改変：Ａｓｎ－２３＝Ｃ末端アミド）；［Ｄ－ｐ－Ｃｌ－Ｐｈｅ６，Ｌｅｕ１７］－ＶＩＰ、すなわち（配列番号６）ＨＳＤＡＶＦＴＤＮＹＴＲＬＲＫＱＬＡＶＫＫＹＬＮＳＩＬＮ（改変：Ｐｈｅ－６＝ｐ－Ｃｌ－Ｄ－Ｐｈｅ、Ａｓｎ＝Ｃ末端アミド）；ＶＩＰｈｙｂｒｉｄ（配列番号１）ＫＰＲＲＰＹＴＤＮＹＴＲＬＲＫＱＭＡＶＫＫＹＬＮＳＩＬＮとしても知られているＶＩＰ－ｈｙｂ、すなわちニューロテンシン（６－１１）］とも呼ばれるＮ末端（配列番号７）ＫＰＲＲＰＹ、これに続くＶＩＰのＣ末端２２アミノ酸、すなわちＶＩＰ（７－２８）とも呼ばれる（配列番号８）ＴＤＮＹＴＲＬＲＫＱＭＡＶＫＫＹＬＮＳＩＬＮからなるＶＩＰおよびニューロテンシンのハイブリッドペプチド；Ｎ末端ステアリル、ノルロイシン１７ＶＩＰｈｙｂ、すなわち（配列番号９）ＫＰＲＲＰＹＴＤＮＹＴＲＬＲＫＱＸＡＶＫＫＹＬＮＳＩＬＮ（式中、Ｘは、ノルロイシンである）；ＡｃＨｉｓ１［Ｄ－Ｐｈｅ（２），Ｌｙｓ（１５），Ａｒｇ（１６），Ｌｅｕ（２７）］－ＶＩＰ（ｌ－７）／ＧＲＦ（８－２７）、すなわち（配列番号１０）ＨＦＤＡＶＦＴＮＳＹＲＫＶＬＫＲＬＳＡＲＫＬＬＱＤＩＬ、Ｃ末端アミド；および下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド、ＰＡＣＡＰ（６－３８）Ｃ末端アミド、すなわち（配列番号１１）ＴＤＳＹＳＲＹＲＫＱＭＡＶＫＫＹＬＡＡＶＬＧＫＲＹＫＱＲＶＫＮＫが含まれる。可溶性、バイオアベイラビリティ、および／または生物学的分解などの改善された特性を提供するために、これらの分子の何れかを炭化水素またはポリエチレングリコール基で修飾し得ることが企図される。

本明細書で使用される場合、「処置する」および「処置」という用語は、対象（例えば、患者）が治癒し、疾患が根絶される場合に限定されるものではない。むしろ、本開示の実施形態は、単に症状を軽減し、かつ／または疾患の進行を遅延させる処置も企図する。

再発性リンパ腫を有する患者の免疫表現型
生理学的老化中および化学療法のラウンドの繰り返しまたは慢性炎症状態に曝された個体において、Ｔ細胞は、それらがアネルギー性であるかまたは抗原刺激に応答して増殖能が制限される老化の状態を生じる。老化Ｔ細胞の表現型は、共刺激受容体ＣＤ２７およびＣＤ２８を欠くか、または高レベルのＣＤ５７マーカーを有するＴ細胞として記載されてきた。さらに、プログラム死リガンドの受容体であるＰＤ１の発現は、アネルギー状態と関連づけられてきた。アネルギー性Ｔ細胞の存在は、患者がワクチンに応答する能力、または慢性ウイルス感染もしくは癌に対する防御的で耐久性のある免疫応答を賦与する能力において重要な補因子である。慢性感染症および癌を有する患者に有効な細胞ベースの免疫療法の可能性を提供するには、Ｔ細胞老化およびアネルギーを反転させる新規アプローチが必要である。

再発性リンパ腫を有する患者の免疫表現型は、アネルギー表現型：ＣＤ３陽性、ＣＤ２７陰性、ＣＤ２８陰性を有するＴ細胞の過剰発現を有することを特徴とする。血管作動性腸管ポリペプチド受容体を介したシグナル伝達がＴ細胞老化および抗原特異的エネルギーに寄与したかどうかを調べた。ＶＩＰｈｙｂと呼ばれるＶＩＰ受容体に対するペプチドアンタゴニストの添加により、インビトロでＴ細胞増殖が増大し、Ｔ細胞増殖に対する天然ＶＩＰペプチドの阻害効果が軽減した。

ＶＩＰｈｙｂアンタゴニストの添加により、長期にわたる再発性の癌を有する患者からのアネルギー性Ｔ細胞の増殖性欠損を反転できるかどうかが試験された。再発性リンパ腫を有する患者におけるＴ細胞の免疫表現型を評価した。共刺激受容体ＣＤ２７およびＣＤ２８を欠く細胞の相対的な過剰発現があった。さらに、この観測点からのＴ細胞は、高レベルのＣＤ５７発現、ＰＤ１およびＴｉｍ－３を有する。

高速細胞選別を使用して、Ｔ細胞のサブセットが、再発性リンパ腫を有する患者および健常対照からのＣＤ２７およびＣＤ２８発現のレベルによって定義され、単離された。ＣＤ２７およびＣＤ２８発現によって定義される４つの表現型のそれぞれを有するＣＤ３陽性Ｔ細胞を選別し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズの存在下においてインビトロで培養した。健常ドナーからの全Ｔ細胞は、培養４日後にＫｉ６７増殖マーカーを１００％発現したが、リンパ腫の処置後のアネルギー性Ｔ細胞を有する患者からの対応する全Ｔ細胞集団は、Ｔ細胞のわずか９０％がＫｉ６７マーカーを発現した。

これらの培養物に３μＭのＶＩＰｈｙｂを毎日添加した後、アネルギー性リンパ腫患者由来のＫｉ６７陽性Ｔ細胞の割合は１００％に増加した。この患者からのＣＤ２７およびＣＤ２８発現に基づいて選別したＴ細胞のサブセットは、ＣＤ２７陽性、ＣＤ２８陽性（二重陽性）集団が抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに応答して正常に増殖することを示した。対照的に、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと共にインキュベートした場合、ＣＤ２７またはＣＤ２８または両方のマーカーの発現を欠くＴ細胞サブセットは、増殖応答を損なった。

アンタゴニストＶＩＰｈｙｂの添加により、ＣＤ２７またはＣＤ２８の何れかを欠くサブセットにおけるＴ細胞増殖が増大した。これらの培養物へのＩＬ１２の添加は、ＣＤ２８陰性であるがＣＤ２７陰性でないＴ細胞の増殖分画を増加させることに有意な影響を有した。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで培養したＴ細胞のフローサイトメトリー分析は、３μＭのＶＩＰｈｙｂを添加すると、ＶＩＰアンタゴニストが添加されていない対照培養物と比較してＰＤ－１発現のレベルが低下することを示した。このデータは、ＶＩＰがＴ細胞の抗原特異的活性化中に誘発され、ＶＩＰシグナル伝達を遮断する戦略が、慢性炎症状態を有する個体または複数の化学療法のサイクルに曝露された個体からの老化Ｔ細胞間でＴ細胞増殖を増大させ、アネルギーを反転させ得ることを示す。

ＶＩＰペプチドは、２分未満の非常に短い半減期を有し、エンドペプチダーゼによって切断されるため、Ｔ細胞受容体を介して活性化されたＴ細胞近傍のＶＩＰ特異的ペプチダーゼの過剰発現は、Ｔ細胞の活性化および増殖を増大させると考えられており、免疫老化を反転させる可能性がある。

治療的使用の方法
特定の実施形態において、本開示は、抗ＣＤ３抗体および抗腫瘍抗体ならびに組換えマスト細胞キマーゼの有効量を注入、移植または投与することによってＴ細胞老化を反転させるインビボでの方法を企図する。特定の実施形態において、組換えマスト細胞キマーゼは、抗ＣＤ３抗体および腫瘍関連抗原に対する抗体を投与されている対象／患者に投与または静脈内注入される。

特定の実施形態において、本開示は、癌または慢性感染症を処置する方法であって、単離されたＴ細胞を提供する対象からＴ細胞を精製することと、単離されたＴ細胞を、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＶＩＰ受容体アンタゴニスト、ＶＩＰ分解酵素、またはそれらの組み合わせと組み合わせて、ビーズまたは固体表面上に任意選択により固定化された抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と混合することと、Ｔ細胞が複製するような条件下において、複製前のレベルと比較してＣＤ２８の増加した発現を有する複製Ｔ細胞を提供することと、複製Ｔ細胞の有効量を、それを必要とする対象に投与することとを含む方法を企図する。

特定の実施形態において、本開示は、癌を処置する方法であって、単離されたＴ細胞を提供する対象からＴ細胞を精製することと、単離されたＴ細胞を、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＶＩＰ受容体アンタゴニスト、ＶＩＰ分解酵素、またはそれらの組み合わせと組み合わせて、ビーズまたは固体表面上に任意選択により固定化された抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と混合することと、Ｔ細胞が複製するような条件下において、複製前のレベルと比較してＣＤ２８の増加した発現を有する複製Ｔ細胞を提供することと、複製Ｔ細胞の有効量を、それを必要とする対象に投与することとを含む方法を企図する。特定の実施形態において、複製Ｔ細胞は、細胞の表面上にキメラ抗原受容体を発現する。特定の実施形態において、本方法は、複製Ｔ細胞の投与前、投与中、または投与後にＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＶＩＰ受容体アンタゴニスト、ＶＩＰ分解酵素、またはそれらの組み合わせを投与することをさらに含む。

特定の実施形態において、本開示は、癌を処置する方法であって、単離されたＴ細胞を提供する対象からＴ細胞を精製することと、ＣＤ３および／またはＣＤ２８を結合する抗体と、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、イデラリシブ、ＶＩＰのＶＩＰ受容体との相互作用を防止する薬剤（例えば、ＶＩＰ受容体を通じたシグナル伝達を防止する）、ＶＩＰ分解酵素、およびそれらの組み合わせとを組み合わせてＴ細胞をインビトロで曝露することにより、単離されたＴ細胞を培養し、ＣＤ２８の増加した発現を有する増殖Ｔ細胞を提供することと、増殖Ｔ細胞の有効量を対象に投与することを含む方法を企図する。

特定の実施形態において、本開示は、ＶＩＰ受容体アンタゴニストおよび／またはホスファチジルイノシトール－３－キナーゼ阻害剤と組み合わせた有効量の二重特異性抗体を、それを必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法であって、二重特異性抗体は、癌標的結合配列およびＣＤ３結合配列を含む、方法を企図する。特定の実施形態において、二重特異性抗体は、カツマキソマブまたはブリナツモマブである。

特定の実施形態において、本開示は、二重特異性抗体または抗癌抗体または腫瘍関連抗原に対する抗体の組み合わせ、およびＶＩＰｈｙｂなどのＶＩＰ受容体アンタゴニストの投与または非経口投与によって癌を処置する方法を企図する。特定の実施形態において、抗腫瘍特異的抗体は、ＣＤ１９に指向される。特定の実施形態において、抗癌抗体は、ＣＤ１２３に指向される。特定の実施形態において、抗癌抗体は、ＨＥＲ２／ｎｅｕに指向される。特定の実施形態において、抗癌抗体は、骨髄腫関連抗原であるＢＭＣＡに指向される。特定の実施形態において、抗癌抗体は、ＥＧＦＲに指向される。特定の実施形態において、抗癌抗体は、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ１に指向される。

特定の実施形態において、本開示は、ＶＩＰ受容体アンタゴニストまたはホスファチジルイノシトール－３－キナーゼ阻害剤と組み合わせたキメラ抗原受容体を有する有効量の細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法であって、キメラ抗原受容体は、癌標的配列、膜貫通ドメイン、Ｔ細胞共刺激分子ドメイン、およびＴ細胞抗原受容体ドメインのシグナル伝達成分を含む、方法を企図する。

特定の実施形態において、本開示は、Ｔ細胞の老化を反転させるインビボでの方法であって、遺伝子的にＴ細胞を改変してその表面にＶＩＰ分解酵素を発現させることを含む方法を企図する。特定の実施形態において、ＶＩＰ分解酵素は、組換えヒトＣＭＡ１マスト細胞キマーゼである。特定の実施形態において、遺伝子改変Ｔ細胞は、癌細胞に標的化するキメラ抗原受容体も発現する。特定の実施形態において、遺伝子改変Ｔ細胞は、癌を有する対象に投与または注入される。

特定の実施形態において、本開示は、癌を処置する方法であって、Ｔ細胞がＣＤ３ならびに任意選択によりＣＤ４および／またはＣＤ８を発現する、Ｔ細胞受容体を発現する対象からのＴ細胞を精製し、単離されたＴ細胞を提供することと、単離されたＴ細胞を、細胞が増殖するような条件下において、本明細書に開示される細胞培養物と混合することと、有効量の増殖した細胞を対象に移植または投与することとを含む方法に関する。

特定の実施形態において、本開示は、癌を処置する方法であって、キメラ抗原受容体を発現するように構成されたベクターを含むＴ細胞、例えば、キメラ抗原受容体をコードする核酸を有する組換えウイルスに感染させた細胞を、ＶＩＰｈｙｂ、ＶＩＰ分解酵素、ＰＩ３阻害剤、またはそれらの組み合わせなどのＶＩＰ受容体アンタゴニストの投与と組み合わせて投与することを含む方法を企図する。

特定の実施形態において、本開示は、癌を処置する方法であって、ＣＤ３、および／またはＣＤ４、および／またはＣＤ８を発現する対象由来の細胞を精製し、単離されたＴ細胞を提供することと、単離されたＴ細胞上のＣＤ２７および／またはＣＤ２８の発現を測定してＣＤ２７および／またはＣＤ２８の測定値を提供することと、ＣＤ２７および／またはＣＤ２８の測定値を参照レベルと比較し、測定されたＣＤ２７レベルが正常値より低い場合および／またはＣＤ２８の測定レベルが正常値より低い場合、次いで有効量のＶＩＰ受容体アンタゴニスト、ＶＩＰ分解酵素、ＰＩ３阻害剤、またはそれらの組み合わせを対象に投与することとを含む方法を企図する。

特定の実施形態において、本開示は、、癌を処置する方法であって、ＣＤ３、および／またはＣＤ４、および／またはＣＤ８を発現する対象由来の細胞を精製し、単離されたＴ細胞を提供することと、単離されたＴ細胞上のＣＤ２７および／またはＣＤ２８の発現を測定してＣＤ２７および／またはＣＤ２８の測定値を提供することと、ＣＤ２７の測定値が、複製Ｔ細胞を提供する正常値より低い場合および／またはＣＤ２８の測定値が、複製Ｔ細胞を提供する正常値より低い場合、次いで単離されたＴ細胞を、ＶＩＰ受容体アンタゴニスト、ＶＩＰ分解酵素、ＰＩ３阻害剤、またはそれらの組み合わせと、単離されたＴ細胞が複製するような条件下で混合することと、有効量の複製Ｔ細胞を、任意選択によりＶＩＰ受容体アンタゴニスト、ＶＩＰ分解酵素、ＰＩ３阻害剤、またはそれらの組み合わせの対象への投与と組み合わせて対象に移植または投与することとを含む方法を企図する。

特定の実施形態において、本開示は、ＣＤ３陽性であり、かつＣＤ４およびＣＤ８陰性である、ガンマデルタＴ細胞（γδＴ細胞）などのＴ細胞の増殖に関する。その表面に特有のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するガンマデルタＴ細胞である。ほとんどのＴ細胞は、α（アルファ）およびβ（ベータ）ＴＣＲ鎖と呼ばれる２つの糖タンパク質鎖から構成されるＴＣＲを有するαβ（アルファベータ）Ｔ細胞である。対照的に、ガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞は、１つのγ（ガンマ）鎖および１つのδ（デルタ）鎖から構成されるＴＣＲを有する。

特定の実施形態において、本開示は、その表面にＶＩＰ分解酵素を発現するように遺伝子改変されたＴ細胞を企図する。特定の実施形態において、ＶＩＰ分解酵素は、組換えヒトＣＭＡ１マスト細胞キマーゼである。特定の実施形態において、遺伝子改変Ｔ細胞は、癌細胞に標的化するキメラ抗原受容体も発現する。特定の実施形態において、遺伝子改変Ｔ細胞は、癌を有するヒト対象に投与または注入される。

特定の実施形態において、本開示は、癌を処置する方法であって、ＶＩＰ受容体アンタゴニスト、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＶＩＰ分解酵素、およびそれらの組み合わせと組み合わせて、有効量の二重特異性抗体を投与することを含む方法に関する。特定の実施形態において、二重特異性抗体は、カツマキソマブである。特定の実施形態において、対象は、悪性腹水症と診断される。特定の実施形態において、二重特異性抗体は、ブリナツモマブである。特定の実施形態において、癌は、白血病である。

特定の実施形態において、本開示は、癌を処置する方法であって、本明細書で提供される方法を用いてＴ細胞を精製しかつ増殖させ、単離されたＴ細胞を提供することと、二重特異性抗体がＣＤ３－Ｔ細胞受容体複合体に結合するような条件下において、単離されたＴ細胞を二重特異性抗体と混合することと、ＶＩＰ受容体アンタゴニスト、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＶＩＰ分解酵素、およびそれらの組み合わせを、それを必要とする対象に投与することと組み合わせて、有効量の二重特異性抗体結合Ｔ細胞を対象に投与することとを含む方法を企図する。

二重特異性抗体は２つの標的配列を含み、Ｔ細胞が癌細胞に結合し得るように、第１の配列は腫瘍関連抗原を標的とし、および第２の配列はＣＤ３Ｔ細胞受容体複合体を標的とする。二重特異性抗体は、Ｔ細胞を癌細胞に連結する。Ｚｈｕｋｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ＣＡＲｓ：ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１６，４０：２４－３５を参照されたい。特定の実施形態において、本開示は、二重特異性抗体が腫瘍関連抗原、ＣＤ１９エピトープ、ＣＤ１２３、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、または骨髄腫関連抗原であるＢＭＣＡに指向されることを企図する。

免疫細胞が癌細胞を殺傷する能力を向上させるために、Ｔ細胞を患者の血液から単離し、癌細胞の表面上に発現されたタンパク質を特異的に標的とするキメラ抗原受容体を発現し、免疫応答を刺激するように遺伝的に改変することができる。患者に戻すと、細胞は癌細胞を攻撃する。特定の実施形態において、本開示は、ＣＤ２２および／またはＣＤ１９抗原を標的とするＣＡＲＴ細胞の使用を企図する。ＣＤ１９は、癌性Ｂ細胞上に発現されるタンパク質である。Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ ｅｔ ａｌ．は、ＣＤ１９に結合するように改変されたＴ細胞が、化学療法耐性急性リンパ芽球性白血病を有する成人において癌の寛解を誘導し得ることを報告している。Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ，２０１３，５（１７７）：１７７ｒａ３８。

典型的な手順では、Ｔ細胞を精製し、血液または骨髄から単離する。例えば、Ｔ細胞は、身体から血液を回収し、１つ以上の血液成分（血漿、血小板または他の白血球など）を除去するプロセスであるアフェレーシスによって収集される。次いで、残りの血液は、体内に戻される。細胞は、ＣＡＲタンパク質が細胞膜に存在するように産生されるような方法で細胞に感染する、レンチウイルスベクターなどの組換えベクターに曝露される。Ｔ細胞は、その表面上にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を産生するように遺伝子操作する実験室または製薬施設に送られ得る。単離された細胞を組換えベクターで感染させる前および／または後に、本明細書に開示される方法を用いて細胞の複製を誘導することができる。遺伝子改変Ｔ細胞は、十分な数になるまで実験室で細胞を増殖させることによって増殖させることができる。任意選択により、これらのＣＡＲＴ細胞は凍結される。改変された細胞は、次いで患者に投与されて戻される。特定の実施形態において、本開示は、対象がＣＡＲＴ細胞の注入を受ける前に、対象にＶＩＰ受容体アンタゴニスト、ＶＩＰ分解酵素、および／またはＩＰ３キナーゼ阻害剤を任意選択により１つ以上の化学療法薬と組み合わせて投与することを企図する。

特定の実施形態において、本開示は、標的配列、膜貫通ドメイン、Ｔ細胞共刺激分子ドメイン、およびＴ細胞抗原受容体ドメインのシグナル伝達要素を含むキメラポリペプチドをコードする核酸を含む組換えベクターを含有する、本明細書に開示されるプロセスによって作製される細胞に関する。

特定の実施形態において、キメラ抗原受容体における標的配列は、標的細胞（例えば、癌細胞）上の表面タンパク質に選択的に結合することができる任意の様々なポリペプチド配列を指す。他の標的配列は、抗体、一本鎖抗体、および抗体模倣物の可変結合領域であり得る。特定の実施形態において、標的化は、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を介して達成される。標的配列は、典型的には、一般にＣＤ８またはＩｇＧ４に由来するヒンジ／膜貫通領域によって細胞内ドメインに連結される。細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータの細胞質シグナル伝達ドメインに連結された４－１ＢＢゼータおよび／またはＣＤ２８ゼータなどの共刺激ドメインを含有し得る。

ＶＩＰシグナル伝達は、同種抗原によって誘導されるＴ細胞増殖を調節する
同種免疫応答におけるＶＩＰシグナル伝達の役割を調べるために、ＶＩＰおよび／またはアンタゴニストＶＩＰｈｙｂペプチドを含有する一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を行った。ＶＩＰの添加は、ルシフェラーゼＴ細胞の増殖を用量依存的に減少させる一方、ＶＩＰｈｙｂの添加は、Ｔ細胞の増殖を増加させた。ＶＩＰｈｙｂは、ＭＬＲにおけるＶＩＰの抑制効果を反転させ、Ｔ細胞増殖を対照培養物よりも高いレベルに回復させた。

ＣＡＲＴ製造のためのエクスビボＴ細胞増殖中の薬理学的遮断は、収率を増加させ、ナイーブおよびセントラルメモリーコンパートメントを保存する
びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）は、主に高齢患者集団に影響を及ぼす高悪性度のＢ細胞悪性腫瘍である。強い処置レジメンが利用可能であるにもかかわらず、ＤＬＢＣＬ患者のサブセットには治療抵抗性が高いリンパ腫が存在する。これらの患者の疾患は、現在の処置レジメンの実質的に全てに対して抵抗性であるという事実から、ＣＡＲＴ療法は、効果的な救援の選択肢として非常に有望であるが、多くの患者は、エクスビボでのＴ細胞増殖の失敗のために臨床試験で処置を受けることができなかった。この失敗は、患者の年齢に加え、多数のラウンドの治療によって与えられるダメージに大きく起因する。さらに、データは、ＮＨＬを有する患者がナイーブＴ細胞に対するメモリー細胞の偏った比率を有し、細胞免疫療法が損なわれていることを示す。

患者のＴ細胞増殖に成功する可能性を示す表面タンパク質の２つは、ＣＤ２７およびＣＤ２８である。ＣＤ２７およびＣＤ２８の両方を発現するＴ細胞は、最も増殖能が高いのに対し、両方の発現を欠くＴ細胞は、多くの場合に増殖せず、抗ＣＤ３／ＣＤ２８の活性化および増殖中に死滅する。健常な個体は、豊富なＣＤ２７＋ＣＤ２８＋（二重陽性）Ｔ細胞を有し、ＤＬＢＣＬを有する患者は、過剰なＣＤ２７－ＣＤ２８－（二重陰性）Ｔ細胞を有する。リンパ腫患者における二重陰性集団のこの過剰表現は、ＣＡＲＴ製造中にＴ細胞が適切に増殖しないことをさらに説明するのに役立つ。ＣＤ２７およびＣＤ２８の発現の欠如に加え、ＤＬＢＣＬ患者のＴ細胞は、疲労および老化の徴候も示し、これらは、両方とも機能障害および増殖不能をもたらす。

ＣＡＲＴ細胞製造中のＤＬＢＣＬ患者のＴ細胞増殖の問題に対処するため、特定の所望のＴ細胞集団の増殖を促進するために様々な技術を利用した。Ｔ細胞活性化中、ＰＩ３Ｋδ阻害剤イデラリシブを単独で、またはマスト細胞キマーゼもしくは血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰｈｙｂ）のアンタゴニストと組み合わせて含むことにより、得られる生存Ｔ細胞の数が増加し、ナイーブ細胞およびセントラルメモリー細胞の割合が増加する。ナイーブ細胞およびセントラルメモリー細胞は、養子細胞免疫療法について最も効果的なサブセットである。さらに、イデラリシブまたはＶＩＰｈｙｂの何れかを含めると、ＣＤ２７＋ＣＤ２８＋細胞の発生頻度が増加し、ＣＤ２７－ＣＤ２８－細胞の発生頻度は減少する。マウスおよびヒトＴ細胞を用いたさらなる研究は、ＰＩ３Ｋδの遮断が増殖に対する阻害効果を有するが、最終分化の防止およびナイーブコンパートメントの保存はＴ細胞生存および収量を増強することを示した。このデータは、使用される培養条件が全患者のＴ細胞の数を増加させるだけでなく、養子Ｔ細胞免疫療法において最も有効なコンパートメントを保存することを示す。このように、ＣＡＲＴ製造中に本発明者らの方法を利用することにより、多くのＤＬＢＣＬ患者が以前に受けられなかった最後の治療法の開発が可能になる可能性がある。

Ｐ１３キナーゼ阻害剤およびＶＩＰシグナル伝達遮断による老化Ｔ細胞の増殖
イデラリシブは、ＰＩ３キナーゼの阻害剤である。ＰＩ３キナーゼは、リンパ球活性化および分化の重要なシグナル伝達経路であり、ＡＫＴおよびｍＴＯＲ１活性を調節する。イデラリシブは、慢性リンパ球性白血病および低悪性度Ｂ細胞悪性腫瘍を有する患者の治療についてＦＤＡの承認を受けている。イデラリシブで治療された患者は、薬物治療が停止した後に抗癌応答を継続し、結腸炎および発疹を含む自己免疫様の徴候および症状を発症することが認められており、これは、イデラリシブが免疫系を調節し、Ｔｈ１分極したＴ細胞を活性化または保存するという仮説を導く。

イデラリシブ処置は、ＣＬＬを有する患者におけるＴ細胞活性化の増加をもたらす。活性化Ｔ細胞のイデラリシブへのエクスビボでの曝露は、その活性化およびインビトロでの増殖を増強する。インビトロで抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと共に培養したＴ細胞に一定範囲の濃度のイデラリシブを添加することにより、Ｔ細胞の増殖および分化を測定した。

ＣＡＲＴ細胞の製造を試みたときにインビトロで増殖しなかった老化Ｔ細胞を有するリンパ腫患者からのＴ細胞試料が使用された。単球は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを含む培養物中のＴ細胞増殖を阻害することが知られているため、Ｔ細胞試料から単球を枯渇させた。一定範囲のイデラリシブ濃度の効果を単独で、および３μＭのＶＩＰペプチドアンタゴニスト（ＶＩＰｈｙｂ）または１μｇ／ｍｌのマスト細胞キマーゼ（Ｔ細胞活性化、分化および増殖における内因性ＶＩＰを分解する酵素）と組み合わせて比較した。生存Ｔ細胞の数ならびにＴ細胞分化および活性化プロファイルは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、または両方の共刺激受容体（ＣＤ２７＋ＣＤ２８＋）の何れかが存在する活性化された表現型に対する、共刺激受容体ＣＤ２７およびＣＤ２８の両方が存在しない（ＣＤ２７－ＣＤ２８－）老化表現型を有するＴ細胞の相対数に焦点を当てて、１０日間のインビトロでの培養中に測定された。

１０％のウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および５０μＭの２－メルカプトエタノールを添加した完全ＲＰＭＩ１６４０（完全培地）中において、凍結した患者アフェレーシス生成物またはフィコ―ル化した全血由来ＰＢＭＣのアリコートを迅速に解凍し、一晩放置した。翌日、赤血球をフィコール勾配によってアフェレーシス生成物から除去した。次に、製造者の説明書に従って、ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞濃縮キットを用いてＴ細胞について白血球を濃縮した。９６ウェル平底プレートの各ウェル中の２００μＬの完全培地に細胞を播種した。示された濃度で化合物を添加し、ＤＭＳＯ濃度を全ウェルについて０．１％に標準化した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを１：１ビーズ：細胞比で添加した。刺激後７日目に各処置からの細胞を新しい培地に移した。次いで、新鮮な化合物およびビーズを添加し、細胞をさらに３日間培養した。初期刺激後１０日目にビーズを除去し、細胞をフローサイトメトリー分析のために染色した。

細胞をＰＢＳで２回洗浄した。細胞はまた、固定可能な生存能染料を用いて染色された。次に、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＰＤ－１、およびＣＣＲ７に蛍光色素結合抗体を添加することにより、表面マーカーを染色した。増殖を評価するために、細胞の半分をＫｉ６７の発現について評価した。ＦｏｘＰ３細胞内染色キットを用いてＫｉ６７染色を行った。試料を流す直前にＡｃｃｕｃｈｅｃｋ計数ビーズを各チューブに加えた。試料をＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａで取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析を行った。生存細胞を分析に使用した。細胞の絶対数は、Ａｃｃｕｃｈｅｃｋ計数ビーズの製造者によって提供された説明書に従って各集団について計算された。

１μＭまたは１００ｎＭの濃度でのＴ細胞培養物へのイデラリシブの添加は、薬物を添加しない対照培養物と比較して、ＣＤ２７およびＣＤ２８を共発現するＴ細胞の割合を有意に増加させた。注目すべきことに、ＣＤ２７およびＣＤ２８共刺激受容体の両方を欠く老化Ｔ細胞の分画は、薬物を添加しない対照培養物での５５．２％から、１０ｎＭのイデラリシブでの培養物で１６．１％、３μＭのＶＩＰｈｙｂでの培養物で３５．７％、および１μｇ／ｍｌのマスト細胞キマーゼでの培養物で３７．４％に低下した。

１００ｎＭ濃度でのイデラリシブは、ＶＩＰｈｙｂまたはキマーゼと組み合わせた場合に共刺激受容体を発現するＴ細胞の割合を増強させることにおいて相乗的であり、薬物を添加しない対照培養物での３．５％に対し、１００ｎＭのイデレラジブとＶＩＰｈｙｂとの組み合わせで２１．５％のＣＤ２７＋ＣＤ２８＋細胞の分画を有し、１００ｎＭのイデレリシブとキマーゼとの組み合わせで１４．２％であった。

イデラリシブ、ＶＩＰｈｙｂ、およびイデラリシブとキマーゼおよびＶＩＰｈｙｂとの組み合わせに曝露することにより、１０日間の培養におけるエフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ）の数も増加した。培養物中の生存Ｔ細胞の総数は、薬物を添加しない対照培養物と比較して、イデラリシブおよびキマーゼまたはイデラリシブおよびＶＩＰｈｙｂの組み合わせで有意に増加した。注目すべきことに、ＣＤ２７＋ＣＤ２８＋Ｔ細胞サブセットの総数は、１００ｎＭのイデレリシブ、１μＭのイデラリシブ＋１μｇ／ｍｌのキマーゼ、または１００ｎＭのイデラリシブ＋３μＭのＶＩＰｈｙｂを含む培養物において、薬物を含有しない対照培養物と比較して１０倍超濃縮されており、１０日間の培養物中のＣＤ３＋Ｔｅｍの総数は、１μＭのイデレリシブ＋キマーゼを含む培養物において、薬物を添加しない対照培養物と比較して１０倍増加されていた。イデラリシブ単独、ＶＩＰｈｙｂ単独、キマーゼ単独、またはイデラリシブとＶＩＰｈｙｂまたはキマーゼとの組み合わせを含有する培養物では、薬物を添加しない対照培養物と比較して、ＣＤ３＋セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）が５～１０倍増加した。

このデータは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いた培養では増殖できず、臨床使用のために十分に製造されたＣＡＲＴ細胞を産生しなかった老化Ｔ細胞が、イデラリシブ、ＶＩＰｈｙｂまたはマスト細胞キマーゼを単独薬剤としてまたは組み合わせて添加することで、インビトロで有意に増殖し得ることを示し、これらの結果は、ＣＡＲＴの製造中にこれらの薬剤を添加することを支持し、癌免疫療法および抗ウイルス免疫を増強するために老化Ｔ細胞を増殖させるためのインビトロでのその使用を支持する。

Claims (19)

1. インビトロ細胞培養物組成物において、精製されたＴ細胞およびＶＩＰ受容体アンタゴニストならびにビーズまたは固体表面上に任意選択により固定化された抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を含むことを特徴とするインビトロ細胞培養物組成物。
2. 請求項１に記載の組成物において、前記Ｔ細胞の１５％超は、ＣＤ２８に対して陰性であることを特徴とする組成物。
3. 請求項１に記載の組成物において、前記ＶＩＰ受容体アンタゴニストは、ＫＰＲＲＰＹＴＤＮＹＴＲＬＲＫＱＭＡＶＫＫＹＬＮＳＩＬＮ）（配列番号１）を含むことを特徴とする組成物。
4. インビトロ細胞培養物組成物において、精製されたＴ細胞およびＶＩＰ分解酵素ならびにビーズまたは固体表面上に任意選択により固定化された抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を含むことを特徴とするインビトロ細胞培養物組成物。
5. 請求項４に記載の組成物において、前記Ｔ細胞の１５％超は、ＣＤ２８に対して陰性であることを特徴とする組成物。
6. 請求項４に記載の組成物において、前記ＶＩＰ分解酵素は、ｍｌｌｋｌｋｅｋａｓｌｔｌａｖｇｔｌｐｆｐｓｑｆｎｆｖｐｐｇｒｍｃｒｖａｇｗｇｒｔｇｖｌｋｐｇｓｄｔｌｑｅｖｋｌｒｌｍｄｐｑａｃｓｈｆｒｄｆｄｈｎｌｑｌｃｖｇｎｐｒｋｔｋｓａｆｋｇｄｓｇｇｐｌｌｃａｇｖａｑｇｉｖｓｙｇｒｓｄａｋｐｐａｖｆｔｒｉｓｈｙｒｐｗｉｎｑｉｌｑａｎ（配列番号２）を含むことを特徴とする組成物。
7. 請求項４に記載の組成物において、前記ＶＩＰ分解酵素は、（配列番号３）
   

   

   を含むことを特徴とする組成物。
8. インビトロ細胞培養物組成物において、精製されたＴ細胞およびホスファチジルイノシトール－３－キナーゼ阻害剤ならびにビーズまたは固体表面上に任意選択により固定化された抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を含むことを特徴とするインビトロ細胞培養物組成物。
9. 請求項８に記載の組成物において、前記Ｔ細胞の１５％超は、ＣＤ２８に対して陰性であることを特徴とする組成物。
10. 請求項９に記載の組成物において、前記ホスファチジルイノシトール－３－キナーゼ阻害剤は、イデラリシブから選択されることを特徴とする組成物。
11. 方法において、請求項１乃至１０の何れか１項に記載のインビトロ細胞培養物を用いて、ＣＤ２８に対して陰性であるＴ細胞を増殖させ、複製Ｔ細胞を提供することを特徴とする方法。
12. 請求項１１に記載の方法において、前記複製Ｔ細胞は、複製前のレベルと比較してＣＤ２８の増加した発現を有することを特徴とする方法。
13. 請求項１２に記載の方法において、前記Ｔ細胞を増殖させる前、その間、またはその後、前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体をコードする核酸を有するベクターと混合され、前記キメラ抗原受容体は、前記細胞が前記細胞の表面上に前記キメラ抗原受容体を発現する条件下において、癌標的配列、膜貫通ドメイン、Ｔ細胞共刺激分子ドメイン、およびＴ細胞抗原受容体ドメインのシグナル伝達成分を含むことを特徴とする方法。
14. 癌または慢性感染症を処置する方法において、単離されたＴ細胞を提供する対象からＴ細胞を精製することと、前記単離されたＴ細胞を、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＶＩＰ受容体アンタゴニスト、ＶＩＰ分解酵素、またはそれらの組み合わせと組み合わせて、ビーズまたは固体表面上に任意選択により固定化された抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と混合することと、前記Ｔ細胞が複製するような条件下において、複製前のレベルと比較してＣＤ２８の増加した発現を有する複製Ｔ細胞を提供することと、前記複製Ｔ細胞の有効量を、それを必要とする対象に投与することとを含むことを特徴とする方法。
15. 請求項１４に記載の方法において、前記複製Ｔ細胞は、前記細胞の表面上にキメラ抗原受容体を発現することを特徴とする方法。
16. 請求項１４に記載の方法において、前記複製Ｔ細胞の投与前、投与中、または投与後にＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＶＩＰ受容体アンタゴニスト、ＶＩＰ分解酵素、またはそれらの組み合わせを投与することをさらに含むことを特徴とする方法。
17. ＶＩＰ受容体アンタゴニストまたはホスファチジルイノシトール－３－キナーゼ阻害剤と組み合わせた有効量の二重特異性抗体を、それを必要とする対象に投与することを含む、癌を処置する方法において、前記二重特異性抗体は、癌標的結合配列およびＣＤ３結合配列を含むことを特徴とする方法。
18. 請求項１７に記載の方法において、前記二重特異性抗体は、カツマキソマブまたはブリナツモマブであることを特徴とする方法。
19. 請求項１７に記載の方法において、複製Ｔ細胞の投与前、投与中、または投与後にＰＩ３キナーゼ阻害剤、ＶＩＰ受容体アンタゴニスト、ＶＩＰ分解酵素、またはそれらの組み合わせを投与することをさらに含むことを特徴とする方法。
    

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