TW201043699A - Process for producing cytotoxic lymphocyte - Google Patents

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Hiroaki Sagawa
Mitsuko Ideno
Ikunoshin Kato
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Takara Bio Inc
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Description

201043699 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於取得在醫療領域方面有用之細胞傷害性淋 巴球之方法。 【先前技術】 身體主要藉由免疫回應對抗異物’免疫系統藉由各式各 樣細胞及彼等產生之可溶性因子而成立。其中扮演中心角 色者為白血球’尤其是淋巴球。該淋巴球主要分為B淋巴球 (以下稱為B細胞）及T淋巴球（以下稱為T細胞）二種主要類 型，任一者皆能特異性地識別抗原並對其作用，以防紫身 體。 T細胞被亞分類為具有CD(Cluster Designation)4標記且主 要幫助抗體產生及誘導各種免疫回應之輔助者T細胞（以下 s己載為TH) ’以及具有CD8標記且主要顯示細胞傷害活性之 細胞傷害性T細胞[Tc ;亦被稱為細胞傷害性T淋巴球 (cytotoxic T lymphocyte)及殺手T細胞。以下記載為CTL]。 在識別、破壞及除去腫瘤細胞及病毒感染細胞上松演最重 要角色之CTL，不像B細胞那樣產生特異的反應性抗體來對 付抗原’而是直接識別及作用於與存在於標的細胞膜表面 上之第I類主要組織適合複合體[MHC :在人類中亦被稱為 人類白血球抗原（HLA)]結合之來自標的細胞之抗原（抗原 胜肽）。此時’ CTL膜表面之T細胞受體（以下稱為TCR)能識 別上述之抗原胜肽及第I類MHC分子，並判斷抗原胜肽為來 自本身或不是來自本身。而且被判斷為非來自本身之標的 150446.doc 201043699 細胞被CTL特異性地破壞及除去。 近年，重新評價如藥劑治療法及放射線治療法等對於患 者有/儿重肉體負擔之冶療法，並提高對於減輕患者之肉體 負擔之免疫治療法之關心。尤其是將來自免疫機能正常人 類之淋巴球巾對於目的！Λ原能特異性反應之CTW體外誘 導後，或未騎料下，㈣淋巴球擴大培養，然後移入 患者之間接免疫療法之有效性正受到注目。例如f暗示在 動物模31中之間接免疫療法為對於病毒感染及腫瘤有效之 治療法[Greenberg R D.著，场⑽⑽ ^ Immun〇i〇gy ’ Μ% 年發仃，ReusserP·，etaI_，Bl00d，第78卷，第5號，第 1373〜 138〇頁（1"1)]。在該治療法中，維持或增強。几之抗原特 異性傷害活性狀態以及維持或增加其之細胞數頗為重要。 在如上述之間接免疫療法中，為了得到治療效果必須投 與一疋ϊ以上之細胞數之細胞傷害性淋巴球。亦即，在試 官内於短時間得到此等細胞數成為最大的問題。 為了維持及增強CTL之抗原特異性傷害活性’在誘導CTL 對於抗原之特異性回應之時，通常係採用以目的抗原反覆 刺激之方法。但是，用該方法最終得到的CTL數減少，無 法得到充分的細胞數。 調製在疾病之治療上有效之T細胞之方法，已知例如使用 以面濃度IL-2誘導腫瘤浸潤淋巴球（TIL)之間接免疫療法[N. Engl· J. Med.，第 316卷，第 1310〜1321 頁（1986); Rosenberg S-A. etal.，KEngl_J.Med_,第 319卷，第 25號，第 1676-1680 頁（1988); Ho M.,etal.，Blood，第 81 卷，第 8號，第 2093- 150446.doc 201043699 2101 頁（1993)]。 繼而，關於抗原特異性CTL之調製，曾報告使用自體CMV 感染纖維母細胞及白血球間素-2(IL-2) [Riddell S. A.，et al.， J. Immunol·，第 146卷，第 8號，第 2795〜2804 頁（1991)]，或 者抗 CD3 單株抗體（抗 CD3mAb)及 IL-2 [Riddell S. A.，et al.， J. Immunol. Methods，第 128 卷，第 2 號，第 1 89〜201 頁 (1990)]分別單離及大量培養CMV特異性CTL純系之方法。 再者，在國際公開第96/06929號公報中揭示REM法（快速 擴大法）。該REM法為使包含抗原特異性CTL及TH之T細胞之 初期集團在短時間内增殖之方法。總之，其特徵為可使各 個T細胞純系增殖以及提供大量的T細胞，以及使用會因抗 CD3抗體，IL-2及放射線照射而喪失增殖性之PBMC(末梢血 單核細胞）及伊斯坦普-巴病毒（以下簡稱為EBV)感染細 胞，來使抗原特異性CTL數增加。 又，在國際公開第97/32970號公報中揭示修改之REM 法，該方法為使用可與PBMC區別，會表現T細胞刺激成分 且不會分裂之哺乳動物細胞株做為餵養細胞，以減低PBMC 之使用量之方法。 淋巴球激素-活性化殺手細胞（LAK細胞）為藉由在包含淋 巴球之末梢血液（末梢血白血球）及臍帶血以及組織液等中 加入IL-2，並在試管内培養數日而得到之具有細胞傷害活 性之機能性細胞集團。此時，藉由添加抗CD3抗體及培養， 可更進一步加速LAK細胞之增殖。如此得到之LAK細胞對 於非特異性之各式各樣癌細胞及其他標靶具有傷害活性。 LAK細胞，與上述CTL一樣，可被用於上述間接免疫療法。 150446.doc 201043699 如上述，在得到細胞傷害性淋巴球如CTL、LAK細胞及 等之步鱗中，不可欠缺IL-2之利用。IL-2藉由結合在細 胞表面之白如球間素-2受體（IL-2R) ’可以進一步活性化細 α. ^ θ知IL-2R可做為淋巴球之活性化標記。在此等方 面，使細胞表面之1L_2R之表現上升頗為重要°又，在CTL 之誘導上，使CTL前驅細胞被抗原刺激而誘導成為CTL之效 率提高，办即使誘導後之細胞群中CD8陽性細胞之比率上 升頗為重要° 已知纖維連結蛋白（fibronectin)為存在於動物之血液、培 養細胞表面及組織之細胞外基質中之分子量為25萬之巨大 糖蛋白質，以及具有各式各樣之機能。已知其之結構域 (d〇main)構造有7個（以下參照圖1)，又，其之胺基酸序列中 包含3種類似序列，藉由重複此等序列而構成全體。該3種 類似之序列被稱為I型、Π型及III型，其中III型由71〜96個胺 基酸殘基構成。此等胺基酸殘基之一致率為17〜4〇% °在纖 維連結蛋白中雖存在14個III型序列，其中第8，第9及第10 個（以下被分別稱為III-8、III-9及III-10)被包含在細胞結合 結構域中，又，第12、第13及第14個（以下被分別稱為III-12、 111-13及111-14)被包含在肝素結合結構域中。又，111_10包含 VLA(極遲活化抗原）_5結合領域’其之核心序列為RGDS。 又，在肝素結合結構域之C終端側存在被稱為IIICS之領 域，在IIICS中存在被稱為CS-i之領域’其由25個胺基酸組 成且對 VLA-4 具有結合活性。（Deane F_ Momer，FIBRONECTIN ACADEMIC PRESS INC·, P.1-8 (1988) ; Kimizuka F. et al.，J. 150446.doc 201043699
Bi〇chem. Π〇 p.284-291 (1991) ； Hanenberg H. et al., Human Gene Therapy 8 p.2193-2206 (1997)) 〇 f發明内容】 本發明之目的係提供一種取得適合供醫療使用且保持高 程度細胞傷害活性之細胞傷害性淋巴球之方法。 亦即，本發明係關於： ⑴一種細胞傷害性琳巴球之製造方法，其特徵為包含於纖
維連結蛋白、其之片段或彼等之混合物存在下，進行細胞 傷害性淋巴球之誘導、維持及擴大培養中之至少 驟； 歹 上述[1]記载 …一〜吸右，丨王孙巳琢，與於敏 維連結蛋白、其之片段或被裳 心皮4之混合物不存在下進行細胞 傷害性淋巴球之誘導、維持及擴大培養令之至少一者而^ 性淋巴球相比，能高度表現白血球間素_2受體: w 1 »己載之方法，其中該細胞傷害性淋巴球，盘於纖 =結蛋白、其之片段或彼等之混合物不存在下進行細胞 傷害性淋巴球之誘導、维 、隹待及擴大培養中之至少一者而得 之細胞傷害性淋巴球相比， Γ4Ί , ,.M1 3有冋比车之CD8陽性細胞； [4] 上述[1]〜[3]中任—項印 p ,, ^ ^ ^ ± 。载之方法，其中該細胞傷害性淋 巴球’與於纖維連結蛋白、 ^ ,. 其之片段或彼等之混合物不存 在下進仃細胞傷害性淋 Μ. Φ - ifhr ^ ,誘v、維持及擴大培養中之 害活性； 傷害性淋巴球相比’能維持高細胞傷 [5] 上述[1]〜[4]中任— °栽之方法’其中該纖維連結蛋 150446.doc 201043699 白、其之片段或彼等之混合物為固定於固相者； [6] 上述[5]記載之方法，其中該固相為細胞培養用器材或細 胞培養用載體； ~ [7] 上述[6]§己载之方法，其中該細胞培養用器材為有蓋坡螭 器皿、燒瓶或袋子；培養用載體為珠體'膜或玻片； [8] 上述[1]〜[4]中任一項記载之方法，纟中該細胞傷害性淋 巴球之誘導、維持及擴大培養之任一者在包含纖維連結蛋 白、其之片段或彼等之混合物之培養基中進行； [9] 上述[1]〜[8]中任_項記載之方法，《中該纖維連結蛋白 之片段A包含序列表之序列編號卜7之胺&酸序列中之至 少-個之纽，或者具有在上❹肽之胺基酸序射有⑽ 、上之胺基酉文取代、刪♦、插入或附力口之胺基酸序列之多 肽，以及與上述多肽具有相同機能之多肽； ⑽上述m記載之方法’其中該纖維連結蛋白之片段為具 有細胞接著活性及/或肝素結合活性者； [η]上述[9]記載之方法，其中該纖維連結蛋白之片段為從 匕3序列表之序列編號8〜丨9表示之胺基酸序列之任一者之 多肽中選出者； Π2]上述[1] §己載之方法，其中該細胞傷害性淋巴球之誘 導.准持及擴大培養之任一者，係在纖維連結蛋白、其之 ^段或彼等之混合物存在下1包含培養基之細胞培養用 益材中進行，以及滿足下列條件中之任一者： ⑷培養開料’細胞數與細胞培制器材巾培養面積之比 率為1〜5 X 1〇5細胞/cm2，以及 150446.doc 201043699 培養基中之細胞濃度為1〜5 ν 1λ5 χ 1 ϋ細胞 [13]上述[12]記載之方法，其未包含稀釋步驟 養用器材之步驟； [14]一種細胞傷害性淋巴球，其藉由上述[1]〜[13]中之任 者記载之方法得到； 壬 ❹ (b)培養開始時 /ml ； 或交換細胞培 [^一種醫藥’其含有上述ΠΗ13]中之任—者記載之方法 付到之細胞傷害性淋巴球以做為有效成分； [16]—種細胞之白企球間素_2受體表現增強劑，其特徵為含 有纖維連結蛋白、其之片段或彼等之混合物以做為有效^ [17] 上述[16]記載之白血球間素_2受體表現增強劑，其中該 纖維連結蛋白之片段為包含序列表之序列編號卜乂胺^ 酸序列中之至少-個之多肽，或者具有在上述多肽之絲 酸序列中有1個以上之胺基酸取代、騎、插入或附加之胺 基酸序列之多肽，以及與上述多肽具有相同機能之多肤； [18] 上述[17]記載之白血球間素_2受體表現增強劑，其中該 纖維連結蛋白之片段為具有細胞接著活性及/或肝素結合 活性者； Π9]上述[17]記載之白金球間素_2受體表現增強劑，其中該 纖維連結蛋白之片段為從包含序列表之序列編號8〜19之胺 基酸序列之任一者之多肽_選出者； [2〇卜種淋巴球中之CD8陽性細胞之比率提高，其特徵為 含有纖維連結蛋白、其之片段或彼等之混合物以做為有效 150446.doc 201043699 成分； [21 ]上述[20]記載之CD8陽性細胞之比率提高劑，其中該纖 維連結蛋白之片段為包含序列表之序列編號卜7之胺基酸 序列中之至少一個之多肽，或者具有在上述多肽之胺基酸 序列中有1個以上之胺基酸取代、刪除、插入或附加之胺基 酸序列之多肽，以及與上述多肽具有相同機能之多肤； [22]上述[21] §己載之CD8陽性細胞之比率提高劑，其中該纖
維連結蛋白之片段為具有細胞接著活性及/或肝素結合活 性者； [23] 上述[21]記載之CD8陽性細胞之比率提高劑其中該纖 維連結蛋白之片段為從包含序列表之序列編號8〜19之胺基 酸序列之任一者之多肽中選出之多肽； [24] -種細胞傷害性淋巴球之細胞傷害活性之提高劑或維 持劑’其特徵為含有纖維連結蛋白、其之片段或彼等之混 合物以做為有效成分； [25] 上述[24]記載之細胞傷宜活性夕担 > 杰丨上 W D，在注之棱尚劑或維持劑，其
該纖維連結蛋白之片段為句合皮 f又馬包3序列表之序列編號1〜7之 基酸序列中之至少一者之吝胳 有之夕肽，或者具有在上述多肽之 基酸序列中有1個以上之胺其舻 上之基鲛取代、刪除、插入或附加 胺基酸序列之多肽，以及盥上诚 上迩夕肽具有相同機能之多月 [26] 上述[25]記載之細胞傷宝活 两》浓注之挺兩劑或維持劑，1 該纖維蛋白之結合月段蛊目女 八 合活性者；^為具有細胞接著活性及/或肝素 或維持劑，其中 [27]上述[25]記載之細 胞傷害活性之提高劑 150446.doc 10 201043699 該纖維連結蛋白之月段為從包含序列表之序列編號8〜i9之 胺基酸序列之任一者之多肽中選出者； [28] —種使細胞傷害性淋巴球中之白血球間素_2受體之表 現增大之方法，其包含於纖維連結蛋白、其之片段或彼等 之混合物存在下，進行細胞傷害性淋巴球之誘導、維持及 擴大培養中之至少一者之步驟； [29] —種提升細胞傷害性淋巴球中CD8陽性細胞比率之方 &，其包含於纖維連結蛋白、其之片段或彼等之混合物存 S下’進行細胞傷害性淋巴球之誘導、維持及擴大培養中 之至少一者之步驟； [3〇卜種提升或維持細胞傷害性淋巴球之細胞傷害活性之 方法’其包含於纖維連結蛋白、其之片段或彼等之混合物 存在下，進行細胞傷害性淋巴球之料、維持及擴大培養 中之至少一者之步驟； 〇 叫上述Π]〜间中卜項記載之方法，其尚包含在細胞傷 害性淋巴球中導入外來基因之步驟； [32]上述_記載之方法，其中使用反轉錄病毒、腺病毒、 腺病毒相關病毒或猿猴病毒以導入外來基因。 【實施方式】 實施發明之最佳形態
本發明發現在纖維連結蛋白及/或其之片段存在下所調 製之細胞傷害性淋巴球中，維持高細胞傷害活性，且IL_2R 之表現量有意義地上升以及CD8陽性細胞之比率提升，本 發明至此於焉完成。 I50446.doc 201043699 又在本5兑明書中，所謂「細胞傷害性淋巴球之製造」 係指包含該細胞之誘導（活性化）、維持及擴大培養之各步 驟，或者將此等組合之步驟。又，本發明之細胞傷害性淋 巴球之製造亦被稱為細胞傷害性淋巴球之培養。 以下具體地說明本發明。 (1)本說明書所使用之纖維連結蛋白及其之片段 本說明書記載之纖維連結蛋白及其之片段可為從天然得 到者或人為合成者。纖維連結蛋白及其之片段，例如可以 依據Ruoslahti E” et al·，j. Bi〇1 Chem，第 256卷第 14號, 第7277〜7281頁（1981)之揭示，從天然起源之物質以實質上 純之形態製造。在本說明書中記載之實質上純之纖維連結 蛋白或纖維連結蛋白片段，意指實質上不含在天然情況下 與纖維連結蛋白-起存在之蛋白f ^上述之纖維連結蛋白 及其之片段，可以分別單獨使用或將複數種混合使用。 與本發明所使用之纖維連結蛋白片段以及該片段之調製 相關之有用資訊可以從下列文獻得到_· F , ^ 几
Biochem·，第 110 卷，第 284 〜2911(1991);K〇rnbdhttA R， et al.，EMBO J.，第4卷，第 7號，ι755〜1759 (1985);以及 Selaguchi K” et al.，Biochemistry，第 25 卷第 17 號， 4936〜4941 (1986)。 在本發明中，做為纖維連結蛋白片段者，例如為至少包 含構成下列任一領域之胺基酸序列之多肽：Ιπ_8(序列表之 序列編號1之胺基酸序列）、ΠΙ_9(序列表之序列編號2之胺基 酸序列）、111-10(序列表之序列編號3之胺基酸序列）、 150446.doc 12· 201043699 III-12(序列表之序列編號4之胺基酸序列）、m_丨3(序列表之 序列編號5之胺基酸序列）、ΙΠ_14(序列表之序列編號6之胺 基酸序列）及CS-1 (序列表之序列編號7之胺基酸序列）（參照 圖1)。 又，做為該片段者，適合使用具有細胞接著活性及/或肝 素結合活性者。細胞接著活性，藉由使用公知之方法測定 以調查本發明所使用之片段（其之細胞結合構造域）與細胞 之結合。例如，此等方法包含Williams D. A. et al.，[Nature, 〇 第352卷，第438〜441頁（1991)]之方法。該方法為測定固定 於培養平m之片段與細胞結合之方法。又，肝素結合活性， 可以藉由使用公知之方法測定以調查本發明所使用之片段 (其之肝素結合構造域）與肝素之結合。例如，在上述之 Williams D. A.等人之方法中，藉由使用肝素（例如標識肝素） 代替細胞’可以同樣方法進行片段與肝素之結合之評價。 再者’做為纖維連結蛋白之片段者，例如為從C-274(序 列表之序列編號8之胺基酸序列）、H-271 (序列表之序列編號 〇 9之胺基酸序列）、H-296(序列表之序列編號1〇之胺基酸序 列）、CH-271(序列表之序列編號11之胺基酸序列）、 CH-296(序列表之序列編號12之胺基酸序列）或C-CS1(序列 表之序列編號13之胺基酸序列）中選出之多肽。 上述CH-271、CH-296、C-274及C-CS1之各片段為包括具 有VLA-5結合活性之細胞結合結構域之多肽。又，C-CS1、 H-296及CH-296為包括具有VLA-4結合活性之細胞結合結 構域之多肽。再者，H-271、H-296、CH-271及CH-296為具 150446.doc -13- 201043699 有肝素結合結構域之多肤。 在本發明中，亦可以使用上述各結構域被改變之片段。 纖維連結蛋白之肝素結合結構域由3個III型序列（iii_ 12、 III-13及III-14)構成。包含欠缺上述ΠΙ型序列中之1或2個之 肝素結合結構域之片段亦可用於本發明。例如，纖维連结 蛋白之細胞結合部位（VLA-5結合領域及Pr〇1239〜 Serl515) 與1個III型序列結合之片段’諸如CHV-89 (序列表之序列編 號14之胺基酸序列）、CHV-90(序列表之序列編號丨5之胺基 酸序列）及CHV-92(序列表之序列編號16之胺基酸序列）；或 者與二個III型序列結合之片段，諸如CHV-179(序列表之序 列編號17之胺基酸序列）及CHV-181 (序列表之序列編號1 8 之胺基酸序列）。CHV-89、CHV-90及CHV-92為分別包含 III-13、ΙΠ-14 及 III-12 者；CHV-179 包含 III-13 及 III-14，以及 CHV-181 包含 III-12 及 III-13。 又，將另外的胺基酸附加於上述各片段而得之片段亦可 用於本發明。該片段，例如可以藉由依照下述製造例記載 之H-275-Cys之製造方法’將期望之胺基酸附加於上述各片 段而製造。例如，H-275-Cys(序列表之序列編號19之胺基酸 序列）為具有纖維連結蛋白之肝素結合結構域及在C端具有 半胱胺酸殘基之片段。 又，本發明所使用之片段，只要可以得到本發明期望之 效果’亦可以為與包括上文例示之天然纖維連結蛋白之胺 基酸序列之至少一部分之片段同等之機能，且具有在構成 該片段之多肽之胺基酸序列中有1個以上之胺基酸取代、刪 150446.doc -14· 201043699 除、插入或附加之胺基酸序列之多肽組成之片段。 胺基酸之取代等，以在可以維持原來多肽之機能之範圍 内，得到變化該多肽之物理化學性狀等之程度為較佳。例 如，胺基酸之取代等在未實質改變原本多肽具有之性質(例 如疏水性、親水性、電荷及阼等)之範圍内。例如，胺基酸 之取代為在下列各群中之取代：⑴甘胺酸及丙胺酸；（稿 草胺西夂及異白月女酸，（3)天冬胺酸、穀胺酸、天冬酿胺及毅 胺醯胺；（4)絲胺酸及羥丁胺酸；（5)離胺酸及精胺酸；（6) 苯丙胺酸及酪胺酸；胺基酸之刪除、附加及插入，係具有 與多肽中此等對象部位周邊性質類似之性質之胺基酸，在 未實質改變對象部位週邊之性質之範圍中之刪除、附加及 插入。 又，所謂「具有同等之機能」意指具有纖維連結蛋白片 1又所具有之下列機能中之任一者之機能：⑴維持細胞傷害 性淋巴球之細胞傷害活性之機能，（Η)增強IL_2R之表現量之 ◎ 機能或（lli)提升CD8陽性細胞之比率。關於包含具有胺基酸 取代等之多肽之片段是否具有此等機能，可以依照下述實 施例記載之方法適當地確認。又，包含具有胺基酸取代等 之多月大之片段以具有細胞接著活性及/或肝素結合活性者 為較佳。細胞接著活性及肝素結合活性可以依照上述活性 測定方法評價。 包含具有胺基酸取代等之多肽之片段，例如在2個不同結 構域間插入1個以上胺基酸以做為連結子之片段亦可被用 於本發明。 150446.doc -15- 201043699 又’對於纖維連結蛋白本身，同樣地，若在其之多肚之 胺基酸序列中有1個以上之胺基酸取代、刪除、插入或附 加’且具有上述（i)〜(in)之任一者之機能之多肽，亦可用於 本發明。
本說明書中記載之纖維連結蛋白片段，例如可以藉由依 照美國專利第5，198,423號說明書之記載而得到之基因重组 體製造。例如上述之H-271(序列編號9)、H-296(序列編號 10)、CH-271(序列編號U)及CH:296(序列編號12)之各片段 以及取得彼等之方法被詳細地記載在該說明書中。又，上 述之C-274(序列編號8)片段可藉由美國專㈣5,iQ2,988號 說明書記載之方法得到。再者，c_⑶（序列編號13)片段可 以藉由日本專利第3104178號說明書記載之方法得到。上述 CHV-89(序列編號14) ’⑽，(序列編號i5)、chv_i79(序
列編號17)之各片段可以藉由日本專利第：⑵川號說明書 記載之方法得到。又，CHV_181(序列編號·段可以依照 國際公開第97/183 ! 8號公報記載之方法得到。chv_92(序列 編號16)片&，可以參照日本專利第η”川號說明書及國際 公開第97/18318號公報，並以此等文獻記載之質體為基礎構 条定型之質體’然後藉由使用該質體以遺傳工程之方法取 得。 於纖維連結蛋白為巨大的糖蛋白[要調製及使用天 =源之蛋白質在產業上及醫藥品製造上未必容易。再 做：維連結蛋白在身體中’以多量存在於也裝中，使用 為血液製劑之血聚中得到之纖維連結蛋白之情況，恐 150446.doc -16- 201043699 有纖維連結蛋白以外之成分污染 Ρ气0自。ν山j 文王方面亦被認為有 問碭。又由於纖維連結蛋白為多 机、'只，ir Κ 機b蛋白產，視其之使用 狀况，亦可能有與顯示本發明效 族夕π ή c & 之7頁域不同之領域所引 么之不良反應。基於此等原因， 月忠本士工如 赞明中，從容易取得 文全方面觀之，以使用纖維連結蛋白片段為較佳，以使 用如上述得到之重組纖维連結蛋白片段為更佳。再者= 顯不能提升下述淋巴球之擴大 1L t 货千徒升被擴大培養之 Ο
淋巴球中IL-2R之表現量以及提 _ , V被擴大培養之淋巴球隼 團中⑽陽性細胞之比率之效果之纖維連結蛋白片段為特 佳。又，關於本發明所使用之纖維連結蛋白片段之分子量，
雖無特殊限定，但以1〜2〇〇 盔h A kD為較佳，以5〜190 kD為更佳， 以10〜180 kD為特佳。 (2)本發明之細胞傷害性淋巴球之製造方法 以下’具體地說明本發明之細胞傷#性淋巴球之製造方 法。本發明之方法為在纖維連結蛋白、其之片段或彼等之 混合物存在下’進行細胞傷害性淋巴球之誘導、維持及擴 大坧養中之至少—者之細胞傷害性淋巴球之製造方法。 在本說明書中所謂細胞傷害性淋巴球意指含有細胞傷害 性淋巴球之細胞群。又，狭義而言，只表示上述細胞群所 含之細胞傷害性淋巴球。又，在本發明中所謂細胞傷害性 淋巴球之製造為包含下列者中之任—種：將可得到本發明 之細胞Θ害性淋巴球之前驅細胞料成為具有細胞傷害活 f之淋巴球’維持細胞傷害性淋巴球丨使用細胞傷害性淋 巴球及/或前驅細胞之細胞傷害性淋巴球之擴大培養。 150446.doc -17- 201043699 做為本發明之細胞傷害性淋巴球者，無特殊限定，例如 為具有抗原特異性細胞傷害活性之細胞傷害性丁細胞 (CTL)、淋巴球激素活性化之殺手細胞（lak細胞）、腫瘤浸 潤淋巴球（TIL)及NK細胞等。
在本發明中，做為可以得到細胞傷害性淋巴球（亦即具琴 分化成淋巴球之能力）之前驅細胞者，例如為pBMc、NK勤 胞、自然細胞（naive，、記憶細胞、造也幹細胞及腾帶立 單核球等。又，若為血料細胞，可在本發明中做為前權 細胞使用。此等細胞’可將從身體採取者以原樣或束結待 存者使用。又，在本發明之細胞傷#性淋巴球之製造方法 中’含有上述細胞之材料例如可以使用末梢血液、腾帶血 等血液、從血液除去紅血球及血㈣成分者以及㈣液等。 本發明之細胞傷害性淋巴球之製造方法，盆之一大特徵 為於從纖維連結蛋白、其之片段或彼等之混合物中選出二 有效成分存在下，製造細胞傷害性淋巴球。 在本發明之方法中，細胞傷害性琳巴球之誘導、維持及/
或擴大培養通常於本發明之上述有效成分存在下，在包入 所定成分之培養基中進行。 3 舉例言之，在本發明之方法中’於意圖誘導或擴大抖養 細胞傷害性淋巴球之情況，本發明所使用之培養開始時之 細胞數（細胞傷害性淋巴球及/或前驅細胞數），雖無特殊限 定，但以例如1〜1x108細胞/毫升為較佳。X，培養 特殊限疋’可錢㈣常細胞培養較狀條件 37t及獸〇2等條件下培養。又，可 °在 田的時間間隔將 150446.doc •18- 201043699 培養基交換成新鮮者。
在本發明之細胞傷害性淋巴球之製造方法中所使用之培 養基無特殊限定，可以使用將細胞傷害性淋巴球及其之前 驅細胞之維持及繁殖所必需之成分混合而製作之公知培養 基，例如可以為市售之培養基。此等培養基，除了含有原 來之構成成分之外，亦可含有適當之蛋白質、細胞激素類 以及其他成分。以含有IL_2之培養基用於本發明為較佳。 IL-2在培養基中之濃度，雖沒有特殊限定但例如以o.oiy X l〇5U/ml為較佳，以〇n x 1〇4u/mi為更佳。 又，可以在含有抗CD3抗體之培養基中共培養可以得到 細胞傷害性淋巴球之前驅細胞。抗CD3抗體在培養基中之 濃度，雖無限定，但例如以〇〇1〜1〇〇 μ§/ιη1為較佳。抗CD3 抗體係為了活性化淋巴球上之受體而添加。又，另外可以 添加外源凝集素（lectin)等淋巴球刺激因子。關於該成分在 培養基中之濃度，若可以得到期望之效果，將沒有特殊限 定。 再者，除了將此等成分溶解及共存於培養基中之外，亦 可以將其固定於適當的固相，例如有蓋玻璃器皿、燒瓶及 袋子等細胞培養用器材（包含開放系及閉鎖系中^任一 者）’又可以固定料體、膜及玻片#細胞培養用載體而使 用二此等固相之材質’若為可用於細胞培養者，將無特殊 限定。在將該成分例如岐於上述器材之情況，當將培養 基裝入該器材中之時，被固^化之各成分之量相對於裝入 器材之培養基量之比率，雖然較佳以與各成分溶於培養基 150446.doc -19· 201043699 中使用時所期望之濃度相同，但此等成分之固定化量，只 要能得到期望之效果，將無特殊限定。上述載體，可於細 胞培養時以浸潰於細胞培養用器材中之培養液内之方式使 用。在將上述成分固定於上述載體之情況，當將載體加至 培養基中時，被固定化之各成分之量相對於裝入器材之培 養基量之比率，雖然較佳以與各成分溶於培養基中使用時 所期望之濃度相同，但此等成分之固定化量，只要能得到 期望之效果，將無特殊限定。 在任一情況上述成分之固定化，可以依照公知之方法， 例如下述纖維連結蛋白片段之固定化方法進行。 再者，可將國際公開第02/14481號公報中記載之在誘導 具有抗原特異性細胞傷害活性之細胞傷害性T細胞上有效 之酸性多糖、酸性寡糖、酸性單糖及彼等之鹽組成之群中 選出之化合物，以及下述從（A)〜(D)中選出之物質與上述成 分共用： (A) 具有CD44結合活性之物質， (B) 能夠控制由CD44配位子與CD44結合所發出之信號之 物質， (C) 能夠抑制生長因子結合於生長因子受體之物質， (D) 能夠控制生長因子與生長因子受體結合所發出之信 號之物質。 上述具有CD44結合活性之物質，例如為CD44配位子及/ 或抗CD44抗體。能夠控制CD44配位子與CD44結合所發出 之信號之物質，例如為各種墙酸化酵素之抑制劑。能夠抑 150446.doc • 20· 201043699 制生長因子結合於生長因子受體之物質，例如為具有結合 於生長因子之活性，且藉由與生長因子形成複合體而扣 生長因子與生長因子受體結合之物質，或者具有結合於生 長因子受體之活性而可抑制生長因子與生長因子受體結人 之物質。再者，能夠控制生長因子與生長因子受體結合所 發出之信號之物質，例如為各種磷酸化酵素之抑制劑。此 等成分在培養基中之湲度，乡可以得到期望之效果將無特 殊之限定。又，此等成分除了溶解及共存於培養基中之外， 亦可以固定化在如上述之適當固相上使用。 又上述物質可以單獨或2種以上混合使用。 在本發明中，所謂「上述有效成分之存在」，只要在進行 細胞傷害性淋巴球之誘導、維持或擴大培養之時，上述有 效成分以可發揮機能之狀態存在，其之存在狀態將無特殊 限定。舉例言之，將有效成分溶於所用培養基之情況，在 進行共培養之培養基中，本發明之有效成分之含量若可以 Q 彳牙到期望之效果，將無特殊限定，例如以0.01〜10000 gg/ml 為較佳’以仏卜…⑼吨^丨為更佳’以^⑼盹觔丨為特佳。 又，有效成分，除了溶解及共存於培養基中之外，亦可以 將其固定於適當的固相，例如有蓋玻璃器孤、燒瓶及袋子 等細胞培養用器材（包含開放系及閉鎖系中之任一者），又可 以固定於珠體、膜及玻片等細胞培養用載體而使用。從將 被培養之細胞傷害性淋巴球投與身體之觀點言之，雖無特 殊限疋，但期望將上述有效成分固定化使用。 右將上述各種成分及本發明之有效成分固定於固相則 150446.doc -21· 201043699 藉由本發明方法得 埼σ性淋巴球之後，只要將該淋 巴球與固相分離，蔣可·交 ^ ^ f 了奋易地將有效成分等與該淋巴球分 離’並可以防止有效成分等混入該淋巴球中。 :將本發明之有效成分固定於上述器材之情況，將培養 =、入為材中時，被固定化之各成分之量相對於裝入器 材之培養基量之比傘，雜姊、私a 比羊雖然較佳以與各成分溶於培養基中 使用時所期望之遺磨相n y ,^ /辰度相冋，但此等成分之固定化量，只要 能得到期望之效果，將盔胜社a 1 /、 、 將無特殊限疋。在將有效成分固定於 上述載體之情況，去腺兮_却μ t 田將3亥载體加至培養基中時，被固定化 之各成分之量相對於裝人器材之培養基量之比率，雖然較 佳二與各成分溶於培養基中使用時所期望之濃度相同但 此專成为之固定化量，〇 φ 2； » u〇 ^ 里/、要此侍到期望之效果，將無特殊 限定。 舉例言之’纖維連結蛋白之片段之固定化可以藉由國際 公開第97/183 1 8號公報以及國際公開㈣/()9 i68號公報記 載之方法實施。 11 /於藉由本發明之製造方法得到之細胞傷害性淋巴球， 若測定IL-2R之表現量，將可見到與於纖料結蛋白、其之 片段或彼等之混合物不存在下進行誘導、維持及擴大培養 中之至少一者而得之細胞傷害性淋巴球相比，江_2汉之表現 量有意義地增加。其中，IL_2R之表現量可以藉由公知之方 法（例如使用抗IL-2R抗體）測定。 如上述，藉由本發明之方法得到之細胞傷害性淋巴球， IL-2R之表現量增加。IL_2R為在活性化τ細胞表面表現之活 150446.doc -22- 201043699 性化標記，伴隨著該分子之表現，細胞激素之產生、細胞 傷害活性及增殖活性等被活性化。因此藉由本發明法得到 之細胞傷害性淋巴球為具有高機能之細胞群。 又，藉由本發明之方法得到之細胞傷害性淋巴球，由於 IL-2R之表現量增加，對於被添加在培養基中之il_2，或者 細胞傷吾性淋巴球之前驅細胞、淋巴球本身或共存之其他 細胞所產生之IL-2造成之刺激之感受性提高。因此，縱使 在IL-2少之環境下（例如在體内），亦可以自行活性化。 0 #者’在藉由本發明之方法得到之細胞傷害性淋巴球 中，與於纖維連結蛋白、其之片段或彼等之混合物不存在 下，進行誘導、維持及擴大培養中之至少一者而得之細胞 傷害性淋巴球相比，具有CD8標記（CD8陽性）之細胞之存在 比率較高。此具有下列有利點：①⑽陽性細胞能產生白血 球間素r等細胞激素，引起免疫賦活以及使辅助者了細胞平 衡移向TM ;②CD8陽性細胞為細胞性免疫擔當細胞，可以 〇 #效率地排除病毒及腫瘤細胞等異物；③得到CD8陽性細胞 之情況，雖然先前用磁性珠粒或流式細胞光度計純化⑽ 陽性細胞，但在本發明之方法中，可以一面培養，一面富 化CD8陽性細胞；④由於⑽陽性細胞比高，誘導咖時: 以做為前驅細胞使用以及⑤縱使從CD8陽性細胞比低之集 團，亦可以一面提高CD8陽性細胞比率，一面培養。因此 本發明方法在細胞傷害性淋巴球之調製上極為有用。 又，在藉由本發明之方法得収細胞傷害性淋巴球中， CD8陽性細胞之比率雖無特殊限定，但可以使用例如抗⑽ 150446.doc -23- 201043699 抗體測定。 本發明之方法胡制 是CTL，具有所 =之細胞傷害性淋巴球，尤其 胞，亦不會有如先維持或者增殖培養後之細 之優異性質。到之細胞傷害活性顯著降低」 白、其之片段或彼等之混合物不=球’與於纖維連結蛋 擴大培養中之至少—者而得+ I進订誘導、维持及 性。因此，蕤ά 寸目比，能維持高細胞傷害活 呈有二:;選殖被培養之細胞傷害性淋巴球，可以維 寺有二之細胞傷害活性之淋巴球。又，— 可4由料抗原、各種細胞激素及抗⑽抗體刺激 而使之增殖及擴大培養。在該細胞傷害性淋巴球之=及 擴大培養上，雖無特殊限^，但可以㈣公知之方法。 所謂上述之細胞傷害性淋巴球之維持意指將細胞傷害性 淋巴球維持在具有細胞傷害活性。此時之培養條件雖無特 殊限定’但可以適用通常細胞培養所使用之條件。例如， 可以在37t及5%C〇2之條件下培養。又，可以在適當的時 間間隔將培養基交換成新鮮者。所使用之培養基及同時使 用之其他成分等與上述相同。 在本發明之方法中細胞傷害性淋巴球之維持及擴大培養 之一大特徵為於本發明之有效成分（亦即纖維連結蛋白，其 之片ί又或彼等之混合物）存在下，在培養基中分別繼續培養 及擴大培養細胞傷害性淋巴球。藉由擴大培養，可以使在 維持細胞傷害性淋巴球所具有之細胞傷害活性狀態之細胞 150446.doc -24- 201043699 恶樣為提供細胞傷害性淋 數增加。亦即，本發明方法之一 巴球之擴大培養方法。 在本發明之細胞傷害性淋巴球之擴大培養方法中，其之 =養條件無特殊㈣，可以採用通常細胞培養所使用之條 ，例如可以在3rc及5%c〇2等條件下培養。X，在適當 的時間間隔將培養基用新鮮者交換。所使用之培養基以及 同時使用之其他成分等與上述者相同。 Ο
依照本發明之擴大培養方法，例如在擴大培養CTL之情 =藉由14日之擴大培養，可以得到細胞數增加至_—〇〇〇 七之CTL。又，在LAK細胞之擴大培養之一例中，7日培養 可以得到增加至約200倍之LAK細胞，而9日培養可以制 增加至約咖倍之LAK細胞。再者，如此得到之細胞傷害 性淋巴球，尤其是CTL，與以先前之細胞傷害性淋巴球之 擴大培養方法（例如REM法或修改之REM法）所得到者相 比，可以保持較高之細胞傷害活性。本發明之此等效果， 可以藉由在下述實施例中記載之方法測定用本發明方法擴 大培養之CTL等所具有之細胞傷害活性而確認。 再者’本發明之細胞傷害性淋巴球之製造方法之特徵為 可從低細胞數開始培養。為了進行間接免疫療法需要大量 的淋巴球’但疋要從患者取得大量之淋巴球頗為困難。又， 在通常之細胞傷害性淋巴球之擴大培養中，必須視使用細胞 數選擇有it當培養面積之細胞培養用器#，以及用適當的 培養基量培養。亦即，在通常之細胞培養用器材中，必 須在高密度，即細胞量（數V培養面積[即與培養基接觸之器 150446.doc -25- 201043699 材表面部分之面積（cm2)]為1 χ 1〇6個細胞/cm2以上且細胞濃 度為1 X 106個細胞/m丨以上之條件下開始培養；若在低於此 細胞量之條件下，擴大培養率[擴大培養後之細胞數與擴大 培養前之細胞數之比（即擴大培養後之細胞數/擴大培養前 之細胞數）]將非常低’至得到大量的細胞傷害性淋巴球需長 時間的培養。因此，一般而言，目前係於使用小的細胞培 養用器材開始培養後，藉由階段性地使用大型之細胞培養 用器材或増加細胞培養用器材之數目，或者反覆稀釋操作 等方法來製造大量的淋巴球。因此，在通常之細胞傷害性 淋4巴球之擴大培養中，必須有複數個培養系統。 糟由本發明之方法，即使在從少量細胞開始之情況，不 論細胞培養用11材之大小，皆可以高擴大培養率進行培 養。因此’無需如先前般麻煩地交換細胞培養用器材及進 ::釋操作。亦即，依照本發明之方法，藉由使用“ =用器材進行培養操作（即藉由Η固培養系），即可以進行 :的細胞傷害性淋巴球之擴大培養。因&，本發明之方 害性驮w ““ …。蚕用益材步驟之細胞傷 大UZ 。更特定而言’用本發明之方法擴 加可、占，田胞之情況’在大容量之細胞培養用器材中添 即可以進行心細胞之擴=養基，之後只要添…
Γ 的LAK細胞之觀點言之，本發明非常有用。I 連結蛋白片段做為太旅 觀-占3之，以使用纖維 發明之有效成分為較佳。如此，藉由 150446.doc * 26 · 201043699 本發明之方法，將可以在短時間内得到必要量之細胞傷害 性淋巴球。 舉例言之’在本發明之有效成分存在下，於包含培養基 之細胞培養用器材中，從低細胞數開始進行細胞傷害性淋 巴球之誘導、维持及擴大培養之至少—者之情況，於培養 開始時’可使用滿足選自下述⑷及（b)之條件之細胞量來進 行。 (a)細胞量與所用細胞培養用器材中之培養面積之比，以 1〜5 X 1〇5個細胞/em2為較佳，以1{)〜} X…個細胞化^為更 it以1 X 1 〇〜5 X 1 〇4個細胞/ cm2為特佳； 03)培養基中細胞之濃度，以個細胞Mi為較佳， 以10〜1 X 105個細胞/ml為更佳，以i χ 1〇2〜5 x 1〇4個細胞/mi 為特佳。 又，其中所謂細胞量為細胞傷害性淋巴球及/或前驅細胞 之個數。 再者，在本發明之方法中，於不包含細胞培養用器材之 交換及稀釋操作等步驟下，以_培養系進行細胞傷害性淋 巴球之誘導、維持及擴大培養中之至少一者（任一者）之方法 被例示。 以下說明藉由本發明之製造方法製造CTL2例子。 CTL之誘導，藉由於上述有效成分存在下，將具有分化 成CTL能力之前驅細胞與適當的抗原呈現細胞（可賦與匸丁[ 識別期望抗原之能力）一起在例如任意之培養基十培養而 貫施。前驅細胞，若為處於變成CTL之前階段且賦有分化 150446.doc •27- 201043699 成CTL之使命之細胞，將無特殊限定，例如為末梢血單核 球（PBMC)、自然細胞（naifve cell)、記憶細胞、臍帶血單核 球及造血幹細胞等。抗原呈現細胞，若為能識別T細胞且有 呈現抗原之能力之細胞，將無特殊限定。舉例言之，單球、 B細胞、T細胞、巨嗤細胞、樹狀細胞、纖維母細胞等能夠 呈現期望之抗原，而可用於本發明。 在本發明中，例如製造CTL時之前驅細胞之培養條件， 可以依照一般的公知條件[例如參照Carter J., et al., Immunology,第 57卷，第 1 號，第 123〜129 頁（1986)]。 又，可以與適當的餵養細胞一起培養。在CTL與餵養細 胞一起培養之情況，宜使用對於CTL及餵養細胞之維持及 繁殖皆適當之培養基。可以使用市售之培養基做為該培養 基。 在本發明方法中所使用之餵養細胞，若為能與抗CD3抗 體協同刺激CTL，並能將T細胞受體活性化者，將無特殊限 定。在本發明中，例如，可以使用PBMC及被伊斯坦普-巴 病毒轉形之B細胞（EBV-B細胞）。通常，餵養細胞，於用放 射線照射手段奪去增殖能力後才被使用。又餵養細胞在培 養基中之含量依照公知之方法決定，例如以1 X 1 〇5〜7細胞 /ml為宜。 在特佳之態樣中，做為餵養細胞者，可以使用非病毒感 染細胞，例如EBV-B細胞以外者。藉此，可以排除在被擴 大培養之CTL中混入EBV-B細胞之可能性，而可以提高諸如 間接免疫療法等利用CTL之醫療方法之安全性。 150446.doc -28- 201043699 抗原呈現細胞’可以藉由將抗原胜肽附加於有抗原呈現 能力之細胞’以將抗原胜肽呈現在其之表面而調製[例如參 照 Bendnarek Μ. A·，et al·，J· Immunol，第 147卷，第 12號 第4〇47〜4〇53頁（1991)]。又，在具有抗原呈現能力之細胞有 處理抗原能力之情況’使該細胞負荷抗原，該抗原被攝入 細胞及接受處理，然後將被片段化之抗原胜肽呈現在細胞 表面。又，在將抗原胜肽附加於有抗原呈現能力之細胞之 障況，且採用與所用之抗原呈現細胞及待誘導之Ctl之 MHC拘束性相合之抗原胜肽。 又，在本發明中所使用之抗原，無特殊限定，例如可以 使用細菌及病毒等外來性抗原，或腫瘤相關抗原（癌抗原） 等内在性抗原。 在本發明中，抗原呈現細胞以非增殖性者為較佳。為了 使細胞成為非增殖性’例如可以進行χ光等放射線照射或用 絲裂黴素（mitomycin)等藥劑處理。 在本發明中，於選自纖維連結蛋白、其之片段或彼等之 混合物之有效成分存在下，將有分化成CTL能力之前驅細 胞與抗原呈現細胞一起培養（共培養）以誘導CTL之條件，可 以依公知之條件[例如參照Bendnarek M_ A., et al j ImmUn〇1.，第 147卷，第 12號，第 4047〜4053 頁（i99l)]。對 於共培養條件’無特殊限定，可以使用通常之細胞培養所 使用之條件，例如在371及5%C〇2等條件下培養。該共培 養通常雖實施約2〜15日，但在此期間可將抗原呈現細胞以新調 製者取代，以進行再度刺激。又，可在適當的時間間隔將 150446.doc •29- 201043699 培養基換成新鮮者。 藉由本發明方法得到之CTL，具有特異性識別期望之抗 原之能力，例如藉由其之細胞傷害性活性可以特異性破壞 具有該抗原之細胞。該CTL之細胞傷害活性藉由公知之方 法評價。例如’ CTL對於用放射性物質及螢光物質等標識 之標的細胞之細胞傷害活性，可以藉由測定來自被Ctl破 壞之標的細胞之放射能力或螢光強度而評價。又，可以藉 由測定被抗原特異性地從CTL或標的細胞游離出之 GM-CSF及IFN- τ等細胞激素之量而檢測出.此外，藉由使 用被螢光色素標識之抗原胜肽-MHC複合體，可以直接確 認。在該情況，使CTL與和CTL特異性抗體偶合之第1螢光 標記接觸後，與和第2螢光標記偶合之抗原胜肽_MHC複合 體接觸，然後藉由FACS(螢光-活化之細胞檢選）分析二重標 識細胞之存在，而評價CTL之細胞傷害活性。 又’在本發明之CTL之擴大培養方法中，上述有效成分， 若存在於該方法所使用之培養系中，將無特殊限定，在上 述以外之先前CTL擴大培養方法中，使上述有效成分存在 於該培養系中，亦即，於本發明之有效成分存在下進行前 驅細胞等之培養之態樣（例如將上述有效成分添加於培養 所使用之培養基中）亦被包含於本發明中。 繼而’詳細說明LAK細胞之培養方法。 LAK細胞之培養，藉由於上述有效成分存在下’將可以 得到LAK細胞之細胞與IL-2—起培養而實施。可以轉變為 LAK細胞之細胞，無特殊限定，例如為末梢血單核球 150446.doc •30· 201043699 (PBMC)、NK細胞、臍帶血單核球、造血幹細胞及含有此等 細胞之血液成分。 又，供培養LAK細胞之一般條件，可以依照公知之條件 [例如參照細胞工學，Vol. 14, No. 2, ρ·223〜227 (1995);細胞 培養，17，（6)，p.192〜195 (1991) ； THE LANCET, Vol. 356, P.802 〜807 (2000) ； Current Protocols in Immunology, supplement 17, UNIT 7.7]。對於共培養之條件無特殊限定， 可以使用通常之細胞培養所使用之條件，例如在37°C及 5°/〇C〇2等條件下培養。該共培養通常實施約2〜15日。又， 可以適當的時間間隔將培養基用新鮮者交換。 與上述之CTL及LAK細胞之誘導、維持及擴大培養同樣 地，藉由於纖維連結蛋白、其之片段或彼等之混合物存在 下培養，對於TIL亦可調製具有高細胞傷害活性之細胞群。 在本發明中，對於此等細胞之活性化操作，除了必須有纖 維連結蛋白、其之片段或彼等之混合物共存之外，餘則無 特殊限定。可以使用適於上述細胞之培養及活性化之培養 基而實施。關於纖維連結蛋白、其之片段或彼等之混合物 之用量及添加方法等，可以依照上述方法選擇適當者。 藉由以上之本發明之細胞傷害性淋巴球之製造方法，可 以得到維持高細胞傷害性活性、IL-2R之表現量有意義地上 升、CD8陽性細胞之比率提高且適於用於醫療之細胞傷害 性淋巴球。因此本發明之方法，在其之一態樣中，提供一 種使細胞傷害性淋巴球中之白血球間素-2受體之表現增加 之方法，其包含在本發明之有效成分存在下，進行細胞傷 150446.doc -31 - 201043699 口 巴球之誘導、維持及擴大培養之至少一者之步驟； 日夂種提问細胞傷害性淋巴球中之CD8陽性細胞比率 之方法，其包含在本發明之有效成分存在下，進行細胞傷 ° '淋巴球之誘導、維持及擴大培養之至少一者之步驟； 提供冑提兩或維持細胞傷害性淋巴球之細胞傷害活性 之方法，其包含在本發明之有效成分存在下進行細胞傷 «卜淋巴球之誘導、維持及擴大培養之至少—者之步驟。 在本發明之另-態樣中，提供一種在細胞表面上之 表現之增強劑，其含有纖維連結蛋白、其之片段或彼等之 混合物以做為有效成分。該增強劑’除了有效成分本身之 外，尚可包含其他任意成分，例如適於待活性化細胞之培 養基、蛋白質、細胞激素類（以IL_2為宜），以及期望之其他 成分。又，含有上述增強劑之培養基，可以被用做在細胞 傷害性淋巴球中增強IL__現用之培養基。上述培養基為 包含細胞培養用之任意基本成分者。又，上述之增強劑及 IL-2R表現增強用培#基，心藉由使用本發明之有效成 分’依照公知之方法製造。上述增強劑或il_2r表現增強用 培養基中，本發明之有效成分等之含量，若可以得到 明期望之效果，將無特殊限定’例如可以本發明方法所； 用之上述培養基中有效成分等之含量為基準，並依據期 望，適當地決定。又，上述增強劑，藉由直接投與至身體，
可以使身體内細胞上之IL-2R之表現增強。 A 又，在本發明之另一態樣中，提供一種被培養之 集圓⑽8陽性細胞之比率提升劑，其特徵為以從鐵维連 150446.doc -32- 201043699 結蛋白、其之月段或彼等之混合物中選出者做為有效成 分。該比率提升劑，除了有效成分本身之外，尚可包含其 他任意成分，例如適用於待活性化細胞之培養基、蛋白質、 細胞激素類（以IL-2為宜），以及期望之其他成分。又，含有 上述比率提升劑之培養基，可以被用做細胞傷害性淋巴球 中CD8陽性細胞之比率提升劑用之培養基。上述培養基為 包含細胞培養用之任意基本成分者。又，上述之比率^升 劑及比率提升用培養基，可以藉由使用本發明之有效成 分’依照公知之方法製造。上述比率提升劑及⑽陽性細
胞之比率提升用培養基中，本發明之有效成分等之含量， 與亡述IL-2R表現增強劑等之情況—樣，可依據期望適當地 决疋。又，上述比率提升劑，藉由直接投與至身體可以 使身體内細胞傷害性淋巴球之比率提高。 再者’在本發明之另—態樣中，提供—種細胞傷害性淋 巴球之細胞傷害活性之提升劑或維持劑，其特徵為以從細 胞纖維連結蛋白，其之片段或彼等之混合物中選出者做為 有效成分。該提升劑或維持劑除了有效成分本身之外，尚 可包含其他任意成分’例如適用於待活性化細胞之培養 1蛋白質 '細胞激素類（以IL_2為宜）以及期望之其他成 3有上述提升劑或維持劑之培養基，可以被用做 ，升或維持細胞傷害性淋巴球之細胞傷害活性用之培養 ^上返培養基為包含細胞培養用之任意基本成分者。又， 1劑、維持劑、提升用培養基及維持用培養基，可以藉 <用本發明之有效成分，依照公知之方法製造。上述提 150446.doc 33· 201043699 升劑、維持劑、提升用培養基 之有效成分等之含量，若可以"二。養基中’本發明 無特殊限定，例二=發明期望之效果，將 有效成分等二:準發:方法所使用之上述爾^ ,. tI x為基準’並依據期望，適當地決定。又， 唯㈣^持劑，藉由直接投與至㈣，可以提升或 維持身體巾細料害性淋㈣之活性。 之：二上述之表現增強劑、比率提升劑、細胞傷害活性 =持劑」其之活性成分可呈被固定在有蓋玻璃 系統中子等細胞培養用器材(包含開放系統及閉鎖 开: ）或者珠體、膜或玻片等細胞培養用载體之 办態。 巴細胞傷害性淋巴球之製造方法所得到之含淋 p t 通常亦混有辅助者·τ細胞等細胞傷害性淋 巴球以外之細胞。因此為了使在藉由本發明得到之含淋巴 :培養物中包含多量保持細胞傷害活性之淋巴球藉離心 從該培養物中回收該培養物之細胞，藉本發明方法得到之 細胞傷害性淋巴球可以原樣使用。若將上述有效成分等固 定於細胞培養用器料，將不賴^該等成分混人所得之 細胞傷害性淋巴球中。 又’藉由公知之方法從該培養物中分離出含有大量細胞 傷害性淋巴球之細胞集團(或培養物)，可做為藉由本發明方 法得到之細胞傷害性淋巴球使用。亦即，本發明之細胞傷 害性淋巴球之製造方法’可以包含從藉由該方法得到之培 養物中選出含有高量細胞傷害性淋巴球之細胞集團之步 150446.doc •34- 201043699 關於該含有咼量細胞傷害性淋巴球之細胞集團之選擇方 法，沒有特殊限定，例如使用與對抗期望之細胞表面上表 現之細胞表面抗原之抗體（例如抗CD8抗體）結合之細胞培 養用器材或载體選擇性回收目的細胞之方法，或者使用流 式細胞光度計之方法。例如使用磁性珠體或管柱做為上述 載體。又，藉由從培養物吸著除去期望細胞以外之細胞，
Ο 可以得到含有高量目的細胞之細胞集團。舉例言之，使用 對抗在輔助者τ細胞表面上表現之細胞表面抗原之抗體（例 如抗CD4抗體），可以從該淋巴球培#物除去辅助者τ細胞。 在§亥製程中可以使用流式細胞光度計。含有高量如此得到 之細胞傷害性淋巴球之細胞集團’與從培養物非選擇性地 回收細胞集團相較，具有較強之細胞傷害活性，尤其適合 用在醫療領域。 再者’本發明提供-種用上述本發明之細胞傷害性淋巴 球之製造方法得到之細胞傷害性淋巴球。該淋巴球，尤盆 是CTL’財所謂「有高細胞傷害活性，縱使長時間進行 繼績培養或擴大培養’細胞傷害活性之降低亦很少」之性 :二又’本發明提供一種含有該淋巴球以做為有效成分之 '樂（治療劑）。含有該淋巴球之上述治療劑尤其適合供間接 :疫：去：用。在間接免疫療法中’適合用於治療患者之具 細：：告活性之淋巴球，例如藉由投與至靜脈而投給患 ^治療劑，以依照治療領域中公知之方法（例如本發 方法）調製之淋巴球做為有效成分，並藉由例如與公知 150446.doc -35- 201043699 之適於非經口投與之有機或無機載體、賦形劑及安定劑等 混a而調製。又，在治療劑中本發明之淋巴球之含量，治 療劑之投與量以及與該治療劑有關之諸條件適於依照公知 之間接免疫療法決定。 在本發明之細胞傷害性淋巴球之製造方法中，另外尚可 包含將外來基因導入該淋巴球中之步驟。亦即，本發明提 供-種細胞傷害性淋巴球之製造方法，其尚包含將外來基 因導入細胞傷害性淋巴球中之步驟。又，所謂「外來」音 指對於為基因導入對象之淋巴球而言為外來。 | 藉由本發明之細胞傷害性淋巴球之製造方法尤其是進 行細胞傷害性琳巴球之擴大培養之方法，可以增強被培養 之淋巴球之DNA複製能力。因此’在本發明之細胞傷害性 淋巴球之製造方法中，藉由包含基因之導入步驟，可以期 待基因之導入效率上升。 在外來基因之手段上無特殊限定，可以藉由公知之基因 導入方法選擇適當者使用。基因導入之步驟，可以在製造 細胞傷害性淋巴球時，於任意時點實施。舉例言之，從作〇 業效率之觀點言之’以在與上述淋巴球之誘導、維持及/或 擴大培養之任-步驟之同時或該步驟之後實施為較佳。 士關於上述基因導入方法’使用病毒載體之方法及未使用 忒載體之方法之任一者皆可被用於本發明。此等方法之 細說明被發表於多個文獻中。 對於上述病毒載體，無特殊限定，通常可以使用 入方法所使用之公知病毒載體’例如反轉錄病毒載體、慢 150446.doc -36- 201043699 病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關病毒m |取體版猴病毒、 疫苗病毒載體或仙台病毒（Sendai virus)載體等。特別適合 做為病毒載體者，可以使用反轉錄病毒、腺病毒、腺病: 相關病毒或猿猴病毒。做為上述病毒載體者，以a缺、7 能力以致在感染細胞中無法自行複製者為較佳。 反轉錄病毒載體，可以將插入該栽體之外來基因安定地 組入導入該載體之細胞之染色體DNA中，及用於基因 f目的。由於該載體對於分裂及增殖中之細胞之感染：率 高，所以適合在本發明之細胞傷害性淋巴球之製造步驟， 例如在擴大培養之步驟中，進行基因導入。 關於未使用病毒載體之基因導入方法，例如有下述方法 (但非用來限定本發明）：使用核糖體及配體_聚離胺酸等載 體之方法、磷酸鈣法、電穿孔法及粒子槍法等。在該等情 況’導入被插入質體DNA及直鏈狀DNA中之外來基因。 在本發明中，對於被導入細胞傷害性淋巴球中之外來基 Q 因無特殊限定，可以選擇期望被導入上述細胞之任意基 因此專基因’除了編碼蛋白質（例如酵素、細胞激素類及 受體類等）者之外，可以使用編碼反義核酸及核糖核酸酶 者。又’可以同時導入可選擇已導入基因之細胞之標記基 因。 將上述之外來基因，例如以在適當啟動子控制下可表現 之方式插入載體或質體中使用。又，為了達成效率良好之 I因轉錄’在載體内可以存在與啟動子及轉錄開始部位協 同作用之其他調節單元，例如加強子序列及終止序列。又， 150446.doc •37· 201043699 為了藉由將外來基因進行相同重組以插入導入對象之淋巴 球之染色體中，例如可以將外來基因配置在與該染色體中 於該基因之期望標的插入部位之兩側所具有之驗基序列相 同之各驗基序列所組成之兩側序列之間。被導入之外來基 因可為天然者，亦可為以人工方法製作者，或者為來源不 同之NA刀子藉由連接（hgati叫等公知手段連接結合而成 者。再者，視其之目的，亦可為具有將突變導入天然序列 而得之序列者。 依舨本發明之方法，例如’可以將編碼對於癌症等患者 之治療所使用之藥劑產生耐性之相關酵素之基因導入細胞 傷害性淋巴球中，以賦與該淋巴球藥劑耐性。若使用此等 細胞傷害性淋巴球’可以將間接免疫療法與藥劑療法加以 組合’因而可以得到更高之、、Λ、底 更回之/〇療效果。關於藥劑耐性基因， 例如有多藥劑耐性基因。 =方面’與上述態樣相反’可以將能賦與對特定藥劑 ❹ 基因導入細胞傷害性淋巴球中’而賦與對於該藥 W之感受性。在該情況，可以藉 错由才又與忒藥劑除去移植至 身體後之淋巴球。關於賦與對於藥劑之感受性之基因 如為胸芬激酶基因。 實施例 以下列舉實施例’以更具體地說明本發 不受此等記載任何的限定。 ° 製造例1纖維連結蛋白片段之調製 (1)纖維連結蛋白片段之調製 150446.doc -38- 201043699 來自人類纖維連結蛋白之η in_ , 震w &片段Η-271，參照美國專利第 5，198,423號說明書中記載之方法調製。 又，來自人類纖維連結蛋白之片段h_296、ch_27i及 CH-296分別參照上述說明書記載之方法調製。 來自人類纖維連結蛋白之y 死。京曰之片段c_274，參照美國專利第 5，1〇2,988號說明書中記載之方法調製。 來自人類纖維連結蛋白之片段c-cS1，參照曰本專利第 3 104178號說明書中記載之方法調製。 0 來自人類纖維連結蛋白之片段哪-89及CmM79，分別 參照日本專利第2729712號說明書中記載之方法調製。 又，來自人類纖維連結蛋白之片段CHV_9〇，參照曰本專 利第2729712號說明書中記載之方法調製。亦即，藉由在該 說明書中記載之操作構築質體pCH後，培養保有該質體 之轉形體’並從該培養物調製CHV-90。 來自人類纖維連結蛋白之片段CHV_181，用國際公開第 ❹ 97/1 83 18號公報中s己載之方法構築含有編碼CHV-181之 DNA之質體（pCHV181)後，培養導入該質體之大腸菌 (HB101/pCHV181) ’然後以與上述調製chv-179同樣之方法 從該培養物調製。 (2) CHV-92之調製 構築在供表現上述多肽CHV-181之質體pCHV181中，欠缺 編碼CHV-181之領域中編碼ΠΙ-13之領域之質體CHV92。刪 除操作依照日本專利2729712號說明書中記載之從質體 PCHV179刪除編碼III-14之領域之操作而進行。 150446.doc -39- 201043699 培養用上述質體pCHV92轉形之大腸菌HB101 (Escheric 1^〇〇1丨1^101/卩匚11\^92)，然後依照日本專利2729712號說明 書中記載之CHV-89多肽之純化方法從該培養物進行純化操 作，得到純化之CHV-92標準品。 (3) H-275-Cys 之調製 供表現多肽H-275-Cys之質體依照以下所示之操作構 築。調製編碼上述CH-296之質體pCHl〇2。以該質體作為模 板，並使用具有序列表之序列編號20之鹼基序列之引子12S 及具有序列表之序列編號21之鹼基序列之引子14A進行 PCR，得到編碼纖維連結蛋白之肝素結合結構域之約0.8 kb 之DNA片段。將得到之DNA片段用Ncol及BamHI(皆為 TAKARA BIO公司製）消化後，藉由與用Ncol及BamHI消化 之pTV118N(TAKARA BIO公司製）連接，構築質體PRH1。 將質體載體pINIII-ompAJGhrayeb J·，et al·，EMBO J_，第 3 卷，第 10 號，第 2437〜2442 頁（1984)]用 BamHI 及 HincII (TAKARA BIO公司製）消化，回收包含糖蛋白終止領域之約 0.9 kb之DNA片段。將其與用BamHI及HincII消化之上述質 體pRHl混合，以進行連接，得到依次包含1ac啟動子，編碼 肝素結合結構域之DNA片段及糖蛋白終止子之質體 pRHl-T。 以該質體pRHl -T做為模板，並使用具有序列表之序列編 號22所示之鹼基序列之引子Cys-A及具有序列表之序列編 號23所示之鹼基序列之引子Cys-S進行PCR後，將回收之擴 增DNA片段用Notl (TAKARA BIO公司製）消化，然後將該 150446.doc •40· 201043699 DNA片段自行連接。將如此得到之環狀DNA用Spel及Seal (TAKARABIO公司製）消化得到之2.3kb之DNA片段，與將 質體pRHl-T用Spel及ScaI(TAKARA BIO公司製）消化得到之 2,5 kb之DNA片段混合進行連接，得到質體pRH-Cys。該質 體編碼在上述H-271之N終端側附加Met-Ala-Ala-Ser4個胺 基酸，然後在C終端附加Cys之多肽H-275-Cys。 多肽H-275-Cys藉由下述方法調製。將用上述質體 pRH-Cys轉形之大腸菌 HB101 (Escherichia coli HB101/pRH-Cys)在120 ml之LB培養基中，於37°C培養一夜。將從培養 液回收之菌體懸浮於40 ml之破碎用緩衝液（50 mM Tris-HC卜 1 mM EDTA、150 mM NaC卜 ImM DTT、1 mM PMSF、 pH7.5)，然後進行超音波處理並破碎菌體。將進行離心得 到之上清液加至以純化用緩衝液（50 mM Tris-HCl，pH7.5) 平衡化之高度捕集肝素管柱（Pharmacia公司製）中。用缓衝 液洗淨管柱内之非吸著部分後，用具有〇~1 M NaCl濃度梯 度之純化用緩衝液進行溶出。將溶出液用SDS-聚丙烯醯胺 凝膠電泳分析，收集相當於H-275-Cys之分子量之部分，得 到純化H-275-Cys標準品。 實施例1在CTL中之CD8陽性細胞比率 (1) PBMC之分離及保存 從保有進入治療階段之HLA-A2.1之健康人捐贈者實施成 分採血後，將採血液用PBS(-)稀釋2倍，然後重疊在Ficoll-paque(Pharmacia公司製）上並於500 X g離心20分鐘。用吸量 管回收中間層之末梢血單核細胞（PBMC)，然後洗淨。將採 150446.doc -41 - 201043699 取之PBMC懸浮於包含90%FBS (Bi〇 Whittaker公司製）/ 10%DMSO(SIGMA公司製）之保存液中，並用液體氮保存。 在CTL誘導時，將此等保存PBMC於37。(：水浴中急速融解， 用包含 lOpg/ml DNase (Calbiochem公司製）之RPMI1640培養 基（Bio Whittaker公司製）洗淨後，用錐蟲藍染色法計算出活 細胞數目並供各實驗使用。 (2)抗流行性感冒病毒之記憶CTL之誘導 抗流行性感冒病毒之記憶CTL之誘導，係改變Bednarek 等人之方法[J_ Immunology,第147卷，第12號，第4047〜4053 頁（1991)]之一部份而實施。亦即，將在實施例2-( 1)中調製 之PBMC懸浮於包含5%人類AB型企清、〇. 1 mM非必需胺基 酸、ImM丙酮酸鈉、2 mM L-榖胺醢胺（全部均為Bio Whittaker公司製）、10 mM HEPES(半井藥品化學公司製）及 1°/〇鏈黴素-青黴素（Gibco BRL公司製）之RPMI 1640培養基 (Bio Whittaker公司製）（以下簡稱為5HRPMI)中，並使其濃度 成為1〜4 xlO6細胞/ml後’接種在24穴細胞培養平皿（Falcon 公司製）中’每穴1 ml，繼而在5%C02濕式培育器中，於37 °C培育1.5小時’然後分離出塑膠接著性之單球。之後，將 非接著性之細胞用RPMI1640培養基回收，並保存在冰上以 做為回應細胞（responder cell)。在分離之單球中，添加做為 抗原胜肽之5 pg/ml來自流行性感冒病毒蛋白質之抗原決定 部位胜肽（來自序列表之序列編號24中記載之基質蛋白質 之Α2· 1結合性胜肽）以及包含1 pg/mi之0 2顯微球蛋白 (Scrips公司製）之5HRPMI各0.5爪卜並於室溫培育2小時後， 150446.doc -42· 201043699 用X光照射（5500R)以做為抗原呈現細胞。從各穴吸引除去 胜肽液及用RPMI1640培養基洗淨穴後，將保存在冰上之回 應細胞懸浮於5HRPMI並使其濃度成為0.5〜2 X 106細胞 /ml ’然後添加在抗原呈現細胞上，每穴1 mi。此時，添加 製造例1記載之各纖維連結蛋白片段（以下稱為FNfr)並使其 濃度成為10 pg/ml。設定未添加FNfr之群以做為對照群。將 平皿在5%C02中’於37°C培養。於培養開始後第2日，在各 穴中添加包含60U/ml之IL-2(鹽野義製藥公司製）及1〇 pg/ml 之FNfr之1 ml 5HRPMI (對照群只含IL-2);又在第5日，將培 養上清液除去半份後，添加同樣之含有IL-2及FNfr之培養基 (對照群只含有IL-2)1 ml。在第7曰，與上述同樣地調製抗 原呈現細胞後，將培養1星期之回應細胞懸浮於5HRPMI中 並使其濃度成為0.5〜2 X 106細胞/m卜然後添加在調製之抗 原呈現細胞上’每穴1 mL·以再度刺激。此時添加FNfr並使 其終濃度成為1 〇 pg/ml(對照群未添加）。再刺激後第2曰， 在各穴中添加包含60U/ml之IL-2及10 pg/ml之FNfr(對照群 只含有IL-2)之1 ml 5HRPMI。又，在第5曰將培養上清液除 去半份後，添加與除去前同樣之内容之培養基，每穴1 ml， 然後繼續培養2曰，以誘導CTL。 (3) CTL細胞傷害活性之測定 在實施例1-(2)中調製之於誘導開始後第14日之CTL之細 胞傷害活性，以使用鈣黃綠素（Calcein)-AM之細胞傷害活性 測定法[LichtenfeIs R_，et al.，J. Immunol. Methods,第 172卷， 第2號，第227〜239頁（1994)]評價。將與抗原決定部位胜肽共 150446.doc -43- 201043699 培養一仪或者在抗原決定部位胜肽不存在下培養之保持 HLA-A2.1之EBV轉形B細胞（細胞名221A2.1)懸浮於包含5% FBS(Bio Whittaker公司製）之RP]y[Ii64〇培養基中並使其濃 度成為1 X 106細胞/ml後，添加鈣黃綠素_AM(多泰特公司製） 並使其終濃度成為25 v Μ，然後於37°c培養i小時。將細胞 用不含鈣黃綠素-AM之培養基洗淨後，與2〇倍量之K562細 胞（ATCC CCL-243)混合，以做為鈣黃綠素標識之標的細 胞。又，K562細胞，係為了排除混入回應細胞iNK細胞所 造成之非特異性傷害活性而使用。 將在實施例1-(2)中調製之記憶CTL做為作用細胞並用 5HRPMI階段稀釋使濃度成為1χ1〇5〜9χ1〇6細胞/mi後，分 注於96穴細胞培養平皿之各穴中，每穴1〇〇μ1。於其中添加 調製為1 X 105細胞/ml之鈣黃素標識之標的細胞，每穴添加 100 μ卜將已加入上述細胞懸浮液之平皿於4〇〇 χ g離心^分 鐘後，在37。(：之濕式C〇2培育器内培育4小時。4小時後，從 各穴採取培養上清液100 μ1，藉由螢光平皿讀數器（々Μ nm/538nm)敎放出至料上清液巾之科綠素量（勞光強 度）。CTL之細胞傷害活性用以下之式j計算出。 式1 :細胞傷害活性 [(各穴之測定值-最小放出量）/(最大放出量-最小放出量小 100 上式中之最J放出里’為只含標的細胞及細胞之穴 之鈣η、4素放出里’其顯示來自標的細胞之鈣黃綠素自然 放出里又最大放出里，顯示在標的細胞中添加％為 150446.doc -44 - 201043699 界面活性劑之Triton X-100 (半井藥品化學公司製）以完全破 壞細胞時之鈣黃綠素放出量。結果剛誘導後，細胞傷害活 性雖被誘導，但誘導時是否添加FNfr大體未造成細胞傷害 活性之差異。 (4)在CTL細胞集團中CD8陽性細胞含有率之測定 將在實施例1-(2)中調製之2 X 105細胞之CTL用包含1%三 聚甲醛（半井藥品化學公司製）之PBS(尼斯公司製）固定後， 用PBS洗淨。將固定細胞懸浮於包含1%BSA(SIGMA公司製） 之100 plPBS中，添加FITC標識之小鼠IgGl或FITC標識之小 鼠抗人類CD8抗體（同時為DAKO公司製）後，在冰上培育30 分鐘。培育後，將細胞用PBS洗淨，然後再次懸浮於包含1% 三聚曱醛之PBS中。將該細胞供應至使用FACS Vantage (Becton Dickinson)公司製之流式細胞光度計，並測定CD8 陽性細胞之含有率。將結果示於表1中。 表1 纖維連結蛋白片段 CD8陽性細胞含有率（％) 對照（未添加FNfr) 60.2 CH-296 88.8 CH-271 65.7 H-271 81.4 C-274 86.2 H-275-Cys 79.0 CHV-89 70.2 CHV-90 77.0 150446.doc -45- 201043699 CHV-181 73_1 對照（未添加FNfr) 33.0 H-296 40.1 C-CS1 41.6 CHV-92 44.0 CHV-179 37.8 如表1所不，CTL誘導時，添加各種纖維連結蛋白片段之 群，與未添加此等片段之對照群相較，在CTL誘導開始後 第14日之C D 8陽性細胞之比率較高，亦即藉由與纖維連結蛋 白共存，顯然一方面可使CD8陽性細胞有意義地增殖，一 方面可以誘導CTL。 實施例2白血球間素_2受體表現之誘導 (1) 抗流行性感冒病毒之記憶CTL之誘導 用在κ鈀例1 -(1)中記載之方法分離及保存之pBMC，並用 與實施例H2)同樣之方法進行抗流行性感冒病毒之記憶 CTL之誘導。冑將誘導開始後第14日之ctl之細胞傷害活性 用在實施例1_(3)中記載之方法評價時，肖導時是否添加 FNfr大體未造成細胞傷害活性之差異。 (2) 在CTL中白灰球間素·2受體表現率之測定 在用實施例2-(1)調製之於誘導開始後第14日之ctl中白 血球間素-2受體（IL-2R)表現率之測定，係依照實施例卜⑷ ^記載之方法進行。又’在該操作中，將FITC標識之小鼠 ^類CD8抗體變更為FITC標識之小鼠抗人類IL-2R(CD25) 150446.doc -46- 201043699 抗體（DAKO公司製）。將結果示於表2中。
表2 纖維連結蛋白片段 IL-2R表現陽性細胞含有率（％) 對照（未添加FNfr) 29.8 CH-296 65.9 H-296 59.4 H-271 54.6 C-274 61.5 H-275-Cys 78.2 CHV-89 82.3 CHV-90 48.3 CHV-92 55.6 CHV-179 50.3 CHV-181 44.8 對照（未添加FNfr) 46.9 CH-271 60.9 C-CS1 72.3 如表2所示，在添加各種纖維連結蛋白片段而誘導之CTL 中，可見到任一細胞集團中之IL-2R表現率均上升。亦即藉 由在纖維連結蛋白片段共存下進行誘導，顯然一面可以使 IL-2R表現量增加，一面可以誘導CTL。 實施例3 CTL之擴大培養 (1)抗流行性感冒病毒之記憶CTL之誘導 150446.doc -47- 201043699 使用以實施例1-(1)中記載之方法分離及保存之PBMC，並 用與實施例1 -(2)同樣之方法進行抗流行性感冒病毒之記憶 CTL之誘導。當將誘導開始後第14日之CTL之細胞傷害活性 用在實施例1-(3)中記載之方法評價時，誘導時是否添加 FNfr大體未造成細胞傷害活性之差異。 (2) CTL之擴大培養 將在實施例3-(1)中調製之CTL用5HRPMI洗淨後，調製成 3 X 104細胞/m卜另一方面，將藉由與實施例1-(1)同樣之方 法採取之未保持HLA-A2.1之同種異體PBMC用X光照射 (3300R)，用培養基洗淨後調製成2〜5 X 106細胞/m卜將此等 CTL (3 X 104細胞）及同種異體PBMC(4〜10 X 106細胞/mi)懸 浮於 10 ml之 5HRPMI 或包含 10%HycloneFB.S、0.1 mM非必需 胺基酸、1 mM丙酮酸鈉、2 mM L-榖胺醯胺（全部為Bi〇 Whittaker公司製）、10 mM HEPES (半井藥品化學公司製）及 1%鏈黴素-青黴素（Gibco BRL公司製）之RPMI164〇培養基 (Bio Whittaker公司製）（以下略稱為lOHycloneRPMI)中，繼 而加入終濃度為50 ng/ml之抗CD3抗體（強生協和公司製）並 裝入12.5 cm2之燒瓶（Falcon公司製）中，然後在37°C之濕式 C02培育器中培養14曰。此時，添加與在CTL誘導時添加者 相同終濃度（10 pg/ml)之FNfr。又，在未添加FNfr下進行誘 導之對照群中未添加FNfr。其間完全未附加胜肽引起之刺 激，於培養第1曰添加終濃度為120 U/ml之IL-2，然後於培 養開始後第4日之後，每2〜3日除去半分培養上清液後，並 在各燒瓶中添加包含60U/ml IL-2之5HRPMI或10 Hyclone 150446.doc -48· 201043699 RPMI 5 ml。此時，在FNfr添加群之培養基中，添加同濃度 之FNfr。擴大培養開始後，於第14日用與實施例1-(3)同樣 之方法測定CTL之細胞傷害活性，然後算出與擴大培養前 者相較細胞傷害活性維持至何種程度，並以「細胞傷害活 性維持（％)」表示。 「細胞傷害活性維持（％)」用下式2算出。 式2 :細胞傷害活性維持（％) = [擴大培養後之細胞傷害活性（％)/擴大培養前之細胞傷害活 ❹性(％)] X 100 將測定結果示於表3中。表中之E/T比率表示作用細胞與 標的細胞之比。 表3 培養基 纖維連結蛋白片段 細胞傷害活性維 持（％) E/T比率=3 5HRPMI 對照（未添加FNfr) 17.3 CH-271 53.5 H-296 49.3 C-CS1 49.3 CHV-92 66.2 1 OHycloneRPMI 對照（未添加FNfr) 48.1 CH-271 250.8 H-296 162.3 H-271 72.2 C-CS1 100.2 CHV-92 157.8 150446.doc -49- 201043699 培養基 纖維連結蛋白片段 細胞傷害活性維 持（％)E/T比率=3 1 OHycloneRPMI 對照（未添加FNfr) 46.3 CHV-89 69.0 CHV-90 75.6 培養基 纖維連結蛋白片段 細胞傷害活性維 持（％)E/T比率=3 1 OHycloneRPMI 對照（未添加FNfr) 70.4 CH-296 113.5 lOHycloneRPMI 對照（未添加FNfr) 79.3 CHV-179 190.0 CHV-181 94.5 如表3所示，在誘導時及擴大培養時添加各種纖維連結蛋 白片段之群之CTL，與未添加纖維連結蛋白片段之對照群 相比，在14日之擴大培養後亦保持特異的高細胞傷害活 性。總之，藉由在纖維連結蛋白片段共存下進行誘導及擴 大培養，長期保持高細胞傷害活性狀態之CTL之擴大培養 顯然可能。 實施例4在CTL擴大培養後之細胞集團中IL-2R之表現 (1)抗流行性感冒病毒之記憶CTL之誘導 使用以實施例1-(1)中記載之方法分離及保存之PBMC，並 用與實施例1-(2)同樣之方法進行抗流行性感冒病毒之記憶 CTL·之誘導。當將誘導開始後第14日之CTL·之細胞傷害活性 用在實施例1-(3)中記載之方法評價時，誘導時是否添加 FNfr大體未造成細胞傷害活性之差異。 150446.doc -50- 201043699 (2)在被擴大培養之CTL中白血球間素-2受體表現率之測 定 將用實施例4-(1)調製之CTL用與實施例3-(2)同樣之方法 擴大培養。對於如此得到之擴大培養後之CTL，用實施例 2-(2)記載之方法測定IL-2R表現陽性細胞之比率。將結果示 於表4中。 表4 纖維連結蛋白片段 IL-2表現陽性細胞含有率（％) 對照（未添加FNfr) 19.5 CH-271 45.3 H-296 47.7 H-271 48.3 C-274 53.5 C-CS 39.7 CHV-891 28.6 CHV-90 60.0 CHV-179 53.7 CHV-181 50.3 對照（未添加FNfr) 26.8 CH-296 36.1 對照（未添加FNfr) 18.4 H-275-Cys 56.5 CHV-92 59.9 150446.doc -51 - 201043699 如表4所示，在誘導時及 白培養時添加各種纖维連結蛋 n 妹冑大培養後之細胞錢上，均見到 iL_2R表現細胞之比率之上升。
總之’藉由在纖维連結I 蛋白片段存在下誘導及擴大培養 CTL，顯然一面可使il_2 衣現里增加，一面可擴大培養 CTL。 實施例5於纖料結蛋自存在下之咖料及擴大培養 (1)抗流行性感冒病毒之記憶CTL之誘導 使用以實施例Wl)中記载之方法分離及保存之PBMC，並 用與實施例W2)同樣之方法進行抗流行性感f病毒之記憶 CTL之誘導。糾添加纖維連結蛋白（a —公司製）並 使其終濃度為10 _ml(對照群未添加）以代替職。當將誘 導開始後第14日之CTL之細胞傷害活性用在實施例i⑺中 記載之方法評價時，誘導時是否添加纖維連結蛋白大體未 造成細胞傷害活性之差異。 (2)在CTL中白血球間素·2受體表現率之測定 對於實施例5-(1)調製之CTL，用實施例Μ)記載之方法 測定IL-2R表現陽性細胞之比率。將結果示於表5中。 ^5_____ 塵維—-— IL-2R表現陽中(%) 對照（未添加纖維連結蛋白） 34 〇 纖維連結蛋白 _ 64 6 如表5所示，在於纖維連結蛋白存在下被誘導之CTL中， 見到在細胞集團上IL-2R之表現量上升。 150446.doc •52· 201043699 總之，藉由在纖維連結蛋白存在下進行ctl之誘導，顯 ,、、：面可使IL 2R_之表現量增加，—面可誘導。 (1) CTL之擴大培養 將在只此例5-(1)中調製之CTL用與實施例3_⑺同樣之方 法擴大培養。此時’在誘導時添加纖維連結蛋白者中添加 纖維連結蛋白（Calbi〇chem)公司製並使終濃度為1〇 gg/ml(對照群未添加）。將得到之ctl之細胞傷害活性用與
〇 實施例W3)同樣之方法敎，然、後算出與擴大培養前者相 較細胞傷害活性維持至何種程度，並以「細胞傷害活性維 持（％)」表示。 將測定結果示於表6中。 表6 纖維連結蛋白 細胞傷害活性維持（〇/0) E/T比率=3 對照（未添加纖維連結蛋白） 48.1 纖維連結蛋白 _ 148.9 如表6所示，在於纖維連結蛋白存在下進行CTL之誘導及 擴大培養之群中，高細胞傷害活性被保持。另一方面，在 CTL讀導及擴大培養之任—者時，未添加纖維連結蛋白之 對照群之細胞傷害活性明顯低下。總之’ #由在ctl誘導 時及擴大培養時添加纖維連結蛋白，長期保持特異性高細 胞傷害活性狀態之CTL之擴大培養顯然可能。 實施例6於固定化纖維連結蛋白（FN)片段存在下之^丁^擴 大培養 150446.doc -53- 201043699 (1) FN片段固定化 將纖維連結蛋白片段固定在下述實驗使用之培養用器材 (容器）上。亦即在24穴細胞培養平皿及12.5 cm2燒瓶中添加 包含各種纖維連結蛋白片段（終濃度10 pg/ml)之PBS，每穴 1〜2 m卜並於室溫培育5小時後，保存4°C直至使用時為止。 又，上述之平皿及燒瓶在使用前用PBS洗淨2次。 (2) 抗流行性感冒病毒之記憶CTL之誘導 使用以實施例1-(1)中記載之方法分離及保存之PBMC，並 依照實施例1-(2)之方法進行抗流行性感冒病毒之記憶CTL 之誘導。此時，使用固定有FNfr之平皿做為培養器材（在對 照組中使用未進行固定化處理之平皿）。當誘導後之CTL之 細胞傷害活性用在實施例1-(3)中記載之方法評價時，誘導 時使用之平皿是否固定有FNfr大體未造成細胞傷害活性之 差異。 (3) CTL之擴大培養 將在實施例6-(2)中調製之CTL依照實施例3-(2)之方法擴 大培養。此時，使用固定有各種FNfr之燒瓶做為培養器材 (在對照組中使用未進行固定化處理之燒瓶）。又，培養基係 使用 10 HycloneRPMI。 評價如此被擴大培養之CTL之細胞傷害活性，與擴大培 養前者相較維持至何種程度，並以「細胞傷害活性維持（％)」 表示。 將測定結果示於表7中。 150446.doc -54- 201043699
表7 纖維連結蛋白片段 細胞傷害活性維持（％) E/T比率=3 對照（未固定FNfr) 48.1 CH-271 95.4 H-296 95.0 H-271 133.9 C-CS1 73.8 H-275-Cys 137.7 CHV-92 92.7 對照（未固定FNfr) 18.7 CH296 67.4 C-CS1 78.5 CHV-89 90.8 CHV-90 73.0 CHV-179 112.5 CHV-181 25.6 如表7所不，在CTL誘導時及擴大培養時使用固定有纖維 連、、°蛋白片段之培養器材（平皿及燒瓶）之群之CTL在擴大 培養後亦保持特異的高細胞傷 時及擴大培養時之任—情況使 段之器材之對照群中，細胞傷 由使用被固定化之纖維連結蛋 基中之片段同樣地，擴大培養 害活性。另一方面，在誘導 用未固定有纖維連結蛋白片 告活性明顯降低。總之，藉 白片段’可與使用溶於培養 出長期保持高細胞傷害活性 150446.doc •55- 201043699 之 CTL。 實施例7在CTL擴大培養後 口食便之細胞集團中CD8陽性細胞含 有比率 (1) 抗流行性感冒病毒之記憶Ctl之誘導 使用以實施例Wl)中記載之方法分離及保存之PBMC，並 用與實施例W2)同樣之方法進行抗流行性感冒病毒之記憶 CTL之誘導。當將誘導開始後第14日之CTL之細胞傷害活性 用在實施例1-(3)中記載之方法評價時，誘導時是否添加 FNfr大體未造成細胞傷害活性之差異。 (2) 在被擴大培養之CTL中CD8陽性細胞含有比率之測定 將在實施例7-(1)中調製之CTL用與實施例3_(2)同樣之方 法擴大培養。對於如此得到之擴大培養後之CTl，用實施 利1 - (4) a己載之方法測定c D 8陽性細胞含有比率。將结果干 於表8中。 表8 纖維連結蛋白片段 ------- CD8陽性細胞含有率 對照（未添加FNfr) '----- 40.9 CH-296 85.1 CH-271 72.1 H-271 83.9 對照（未添加FNfr) — 75.4 H-296 87.2 C-CS1 86.5 對照（未添加FNfr) ---— 33.4 150446.doc -56- 201043699 CHV-90 72.9 CHV-92 51.6 CHV-179 57 CHV-181 __63.5 、如表8所示，在於CTL料時及擴大培養時添加各種纖維 連結蛋白片段之群中，在任一情、、兄撼+ 4 rt /兄擴大培養後之細胞集團 中均見到CD8陽性細胞含有比率上升。 總之’藉由在纖維連結蛋白片段存在下誘導及擴大培養 CTL’顯然可以一面使CD8陽性細胞有意義地增殖，一面擴 大培養CTL。 實施例8在於被固定之纖維連結蛋白片段存在下被誘導之 CTL中白血球間素_2受體表現之誘導 (1) FN片段固定化 用與實施例6-(1)同樣之方法，將纖維連結蛋白片段固定 在培養器材（容器）中。 (2) 抗流行性感冒病毒之記憶CTL之誘導 使用以實施例1-(1)中記載之方法分離及保存之pBMc，並 依照實施例1-(2)之方法進行抗流行性感冒病毒之記憶€1^ 之誘導。此時，使用固定有在實施例8_(1)中做成2FNfr2 平皿做為培養器材（在對照組中使用未進行固定化處理之 平皿）。當誘導後之C T L之細胞傷害活性用在實施例！ _ (3)中 "己載之方法§平價時，誘導時使用之平皿是否固定有FNfr大 體未造成細胞傷害活性之差異。 (3) CTL之擴大培養 150446.doc -57- 201043699 將在實施例8-(2)中調製之CTL依照實施例3-(2)之方法擴 大培養。此時，使用固定有在實施例8-(1)中做成之FNfr之 燒瓶做為培養器材（在對照組中使用未進行固定化處理之 燒瓶）。又，培養基係使用1 〇 HycloneRPMI。 對於如此得到之擴大培養前後之CTL，用實施例2-(2)中 記載之方法測定IL-2R表現陽性細胞比率。 將測定結果示於表9中。 表9 纖維結合 蛋白片段 擴大培養前IL-2R表現 陽性細胞含有率(％) 擴大培養後IL-2R表現 陽性細胞含有率(％) 對照(未固定FNfr) 14.4 6.8 CH-296 68.1 34.0 CH-271 28.3 14.7 H-296 21.3 22.9 C-274 30.3 20.5 C-CS1 56.8 34.1 H-275-Cys 43.6 17.2 CHV-89 34.6 36.8 CHV-90 47.3 29.1 CHV-92 37.2 13.0 CHV-179 52.3 16.3 CHV-181 37.4 18.3 如表9所示，在於CTL誘導時及擴大培養時使用固定有纖 維連結蛋白片段之培養器材（平皿及燒瓶）之群之CTL，在擴 150446.doc -58- 201043699 大培養前後，均見到與對照群相較IL-2R之表現率上升。總 之，藉由使用被固定之纖維連結蛋白片段，與溶解於培養 基中之片段一樣，可以一面維持高IL-2R表現量，一面擴大 培養CTL。 實施例9 CD8細胞表面上白血球間.素-2受體表現之誘導 (1) 抗流行性感冒病毒之記憶CTL之誘導 使用以實施例1-(1)中記載之方法分離及保存之PBMC，並 用與實施例1-(2)同樣之方法進行抗流行性感冒病毒之記憶 CTL之誘導。當將誘導開始後第14日之CTL之細胞傷害活性 用在實施例1-(3)中記載之方法評價時，誘導時是否添加 FNfr大體未造成細胞傷害活性之差異。 (2) 在CTL中白血球間素-2受體表現率之測定 在實施例9-(1)中調製之誘導開始後第14曰之CTL(尤其是 CD8細胞表面上）中白血球間素-2-受體（IL-2R)表現率之測 定，依照實施例1-(4)中記載之方法進行。又，在此次操作 中，使用FITC標識之小鼠抗人類CD8抗體做為1次抗體，以 及使用PE標識之小鼠抗人類IL-2R(CD25)抗體（DAKO公司 製）做為2次抗體。將結果示於表10中。 表10 纖維連結蛋白片段 CD8/IL-2R雙重陽性細胞 集團含有率(％) 對照(未添加FNfr) 30.7 CH-296 56.8 如表10所示，在添加各種纖維連結蛋白片段而誘導之 150446.doc -59- 201043699 CTL中，於CD8陽性細胞集團中可見到IL-2R表現率之上 升。亦即，藉由在纖維連結蛋白片段存下進行誘導，一方 面可以使CD8細胞表面上之IL-2R表現量增加，一方面可以 誘導CTL。 實施例10在CTL擴大培養前後之細胞集團中之CD8陽性細 胞含有率（纖維連結蛋白與纖維連結蛋白片段之比較） (1) 抗流行性感冒病毒之記憶CTL之誘導 使用以實施例1-(1)中記載之方法分離及保存之PBMC，並 用與實施例1 -(2)同樣之方法進行抗流行性感冒病毒之記憶 CTL之誘導。當將誘導開始後第14日之CTL之細胞傷害活性 用在實施例1-(3)中記載之方法評價時，誘導時是否添加纖 維連結蛋白及FNfr大體未造成細胞傷害活性之差異。 (2) 在被擴大培養之CTL中CD8陽性細胞含有比率之測定 將在實施例10-(1)中調製之CTL用與實施例3-(2)同樣之 方法擴大培養。對於如此得到之擴大培養前後之CTL，用 實施例1-(4)記載之方法測定CD8陽性細胞含有比率。將結 果示於表11中。 表11 擴大培養前CD8陽性擴大培養後CD8陽性細 細胞含有率(％) 胞含有率(％) 對照(未添加FNfr) 50.5 31.2 纖維連結蛋白 67.3 22.5 H-271 75.1 51.3 CHV-90 71.3 43.5 150446.doc -60- 201043699 如表u所示，在CTL誘導時及擴大培養時添加纖維連結蛋 白片段之群中，相對於任—者 者之對照群，擴大培養前及擴 大培養後之細胞集團中之⑽陽性細胞含有比率均被見到 上升。 …與纖維連結蛋白本身相比，於纖維連結蛋白片段 存在下進行誘導及擴大培養，顯然在擴大培#前後之任一 情況’-方面可使CD8陽性細胞有意義地增殖，—方面適 合擴大培養CTL。
實施例11在CTL擴大培養前後之細胞集團中il_2r表現之 誘導（纖維連結蛋白與纖維連結蛋白片段之比較） (1) 抗流行性感冒病毒之記憶CTL之誘導 使用以實施例1-(1)中記載之方法分離及保存之PBMC，並 用與實施例1-(2)同樣之方法進行抗流行性感w病毒之記憶 CTL之誘導。當將誘導開始後第M曰之CTLi細胞傷害活性 用在實施例1-(3)中記載之方法評價時，誘導時是否添加纖 維連結蛋白及FNfr大體未造成細胞傷害活性之差異。 (2) 在被擴大培養之CTL中IL-2R表現陽性細胞含有比率之 測定 將在實施例11-(1)中調製之CTL用與實施例3_(2)同樣之 方法擴大培養。對於如此得到之擴大培養前後之CTL，用 實施例2-(2)記載之方法測定IL_2R表現陽性細胞含有比 率。將結果示於表12中。 150446.doc -61 - 201043699 表12 擴大培養前IL-2R表現 擴大培養後IL-2R表現 陽性細胞含有率(％) 陽性細胞含有率(°/〇) 對照(未添加FNfr) 34.0 15.3 纖維連結蛋白 64.6 50.6 H-271 76.6 76.8 如表12所示，在CTL誘導時及擴大培養時添加纖維連結 蛋白片段之群中，相對於任一者之對照群，擴大培養前及 擴大培養後之細胞集團中之IL-2R表現陽性細胞含有比率 均被見到上升。該上升率與添加纖維連結蛋白之群相較有 意義地提高。 總之，與纖維連結蛋白本身相比，於纖維連結蛋白片段 存在下誘導及擴大培養CTL，顯然在擴大培養前及擴大培 養後之任一情況，一方面可使IL-2R表現陽性細胞有意義地 增殖，一方面適合擴大培養CTL。 實施例12 CTL之擴大培養（纖維連結蛋白與纖維連結蛋白 片段之比較） (1) 抗流行性感冒病毒之記憶CTL之誘導 使用以實施例1-(1)中記載之方法分離及保存之PBMC，並 用與實施例1-(2)同樣之方法進行抗流行性感冒病毒之記憶 CTL·之誘導。當將誘導開始後第14日之CTL·之細胞傷害活性 用在實施例1 -(3)中記載之方法評價時，誘導時是否添加纖 維連結蛋白及FNfr大體未造成細胞傷害活性之差異。 (2) CTL之擴大培養 150446.doc -62- 201043699 將在實施例12-(1)中調 方法擴大培養。又，培養 之 製之CTL·用與實施例3-(2)同樣 基係使用 10 HycloneRPMI。 貝如此被擴大培養之CTL之細胞傷害活性，與擴大培 養”者相k 4持至何種程度，並以「細胞傷害活性維持（％)」 表示。 將測定結果示於表13中。 表13 ----— 細胞傷害活性維持(％)E/T比率=3 對照(未添加FNfr) 48.1 纖維連結蛋白 148.9 CH-271 — 250.8 如表13所不’在CTL誘導時及擴大培養時添加纖維連結 蛋白片之群中之CTL，與未添加纖維連結蛋白片段之對 ’’、、群相比14日擴大培養後保持特異的高細胞傷害活性。 〇 又’其之活性與添加纖維連結蛋白之群相比有意義地提高。
總之’與纖維連結蛋白本身相Λ，於纖維連結蛋白片段 ^存在下進行料及擴大培養者，顯然適合用於長期保持 高細胞傷害活性狀態之CTL之擴大培養。 實施例13在L A Κ細胞（淋巴激素_活化之殺手細胞）培養系 中擴大培養率之測定 (1)抗人類CD3抗體及FN或FN片段之固定化 將抗人類CD3抗體及纖維連結蛋白（FN)*FN片段固定在 以下實驗使用之培養器材(容器)上。亦即將包含抗人類CD3 抗體（強生協和公司製）(終濃度5 μ§/ιη1)之pBS 1如(24穴平 150446.doc -63 - 201043699 孤之情況）或2 ml(12.5 cm2燒瓶之情況）添加至24穴細胞培 養平皿或12.5 cm2之細胞培養燒瓶（Faicon公司製）中。此 時，在纖維連結蛋白或FN片段添加群中，添加纖維連結蛋 白或製造例1中記載之各纖維連結蛋白片段（FNfr)並使終濃 度成為1〇48/瓜1(24穴平皿之情況）或25 4§/1111(12.5(；1112燒瓶 之情況）。設定未添加纖維連結蛋白及FNfr之群做為對照。 將此等培養器材於室溫培育5小時後，保存4°C直至使用 時為止。在剛使用前，將來自此等培養器材之包含抗體. FNfr之PBS吸引除去後，將各穴用PBS洗淨2次，用包含5% 人類AB型血清（Bio Whittaker公司製）及1%鏈徽素-青黴素 (Gibco BRL公司製）之 XVIVO20培養基（Bio whittaker公司製） (以下簡稱為5HXVIVO20)洗淨1次，然後供應至各實驗。 (2) LAK細胞之誘導及培養 將在實施例1-(1)中調製之PBMC懸浮於5HXVIV〇2〇中並 使其濃度成為0.5〜1 X 106細胞/ml後，接種在固定有實施例 13-(1)中調製之抗人類CD3抗體之平皿，或固定有抗人類 CD3抗體及纖維連結蛋白或FNfr之平皿中，每穴1 ml，然後 添加IL-2(鹽野義製藥公司製）並使終濃度成為1000 U/ml。 將此等平皿在5%C02及37°C下培養（於培養第〇日）。於培養 開始後第2曰及第3曰，添加包含1000 U/ml IL-2之 5HXVIVO20，每穴1 ml。於培養開始後第4曰，將用適當 5HXVIVO20稀釋之培養液移至未固定任何之新燒瓶中，然 後添加IL-2以使終濃度成為500 U/m卜繼續培養，每2〜3曰， 添加與培養開始第5曰一樣用適當5HXVIVO20稀釋之IL-2 150446.doc -64- 201043699 並使終濃度成為300〜500 U/ml。於培養開始後第7〜15日用錐 蟲藍染色法計測出活細胞數目，並算出與培養開始時之細 胞數相較之擴大培養率。將結果示於表14中。 表14 培養曰數 FN/FN片段 擴大培養率(倍率） 7曰 對照(未固定化FN/FNfr) xl03 纖維連結蛋白 x233 CH-296 x218 H-296 x247 9曰 對照(未固定化FN/FNfr) x250 纖維連結蛋白 xll90 CH-296 xl286 H-296 xl075 11日 對照(未固定化FN/FNfr) x576 纖維連結蛋白 x2304 CH-296 xl728 H-296 x2088 對照(未固定化FN/FNfr) x660 C-CS1 xll70 15日 對照(未固定化FN/FNfr) xl980 纖維連結蛋白 x3348 CH-296 x5364 對照(未固定化FN/FNfr) x2906 C-CS1 x5117 150446.doc -65- 201043699 如表14所示，在LAK細胞誘導初期使用固定有纖維連結 蛋白之培養器材之群，與對照群相較，LAK細胞之擴大培 養率高。又，各纖維連結蛋白片段固定化群之擴大培養率， 比於培養開始後第15日使用固定有纖維連結蛋白之培養器 材之群高。因而，在長時間擴大培養之情況，於LAK細胞 誘導初期和纖維連結蛋白片段共存者，與和纖維連結蛋白 共存者相比，顯然以更高之擴大培養率誘導•培養LAK細 胞。 實施例14在LAK細胞培養系中增殖率之測定 (1) LAK細胞之誘導及培養 用與實施例13-(2)同樣之方法誘導•培養LAK細胞。此時 計算出從培養開始後第4日至第7日之細胞增殖率。將結果 示於表15中。 表15 培養開始細胞數 纖維連結蛋白片段 從第4日至第7日之增 殖率(倍率） 5 X 105 細胞/ml 對照(未固定化FNfr) 2.7倍 CH-296 16.9 倍 對照(未固定化FNfr) 33.5 倍 H-296 49.5 倍 1 X 106 細胞/ml 對照(未固定化FNfr) 6.2倍 CH-296 20.4 倍 對照(未固定化FNfr) 23.5 倍 H-296 43.5 倍 150446.doc -66 - 201043699 如表15所示，在LAK細胞誘導初期使用固定有纖維連結 蛋白片段之培養器材之群，與對照群相較，培養開始第4曰 至第7日之LAK細胞之擴增率較高。亦即藉由在LAK細胞誘 導初期與纖維連結蛋白片段共存，顯然可以較早之增殖速 度誘導及培養LAK細胞。 實施例15在LAK細胞培養系中擴大培養率之測定（從低細 胞數誘導•培養L AK細胞） (1) LAK細胞之誘導及培養 用與實施例13-(2)同樣之方法誘導•培養LAK細胞。此 時，使培養開始時之細胞濃度成為2 X 105〜1 X 106細胞/ml (1 X 105〜5 X 105細胞/cm2)。培養開始後第15日用錐蟲藍染色法 計測活細胞數，並算出與培養開始時之細胞數相較下之擴 大培養率。.將結果示於表16中。 表16 培養開始細胞數 纖維連結蛋白片段 擴大培養率(倍率） 2 X 105 細胞/ml 對照(未固定化FNfr) x48.6 (lxlO5 細胞/ cm2) CH-296 X1004 5 x 105細胞/ml 對照(未固定化FNfr) x438 (2.5x105 細胞/ cm2) CH-296 xl094 1 x 106 細胞/ml 對照(未固定化FNfr) X 1020 (5x105 細胞/ cm2) CH-296 xl476 如表16所示，在LAK細胞誘導時使用固定有各纖維連結 蛋白片段之培養器材之群，不論培養開始時之細胞數，於 培養開始後第15日皆可以得到高擴大培養率。相對於此， 150446.doc -67- 201043699
之情況’於培養開始
15日之擴大培養柔柄 > B 奮丰低°亦即從低細胞數誘導LAK細胞
胞數誘導•培養LAK細胞/在無稀釋操作下之培養） (1) LAK細胞之誘導及培養 將在實施例ι-(ι)中調製之PBMC懸浮於5HXVIV〇2〇中並 使其濃度成為1 X 104細胞/ml後，接種在固定有以與實施例 13-(1)同樣之方法s周製之抗人類CD3抗體之平皿，或固定有 抗人類CD3抗體及纖維連結蛋白或FNfr之6穴平皿中，每穴 添加1 ml，然後添加5HXVIVO20 4 ml(l X 103細胞/cm2)以及 添加IL-2(鹽野義製藥公司製）並使終濃度成為5〇〇 u/m卜將 此等平皿在5%C02及37°C下培養（於培養第〇曰）。於培養開 始後第2日、第3曰及第4日’添加il-2並使終濃度成為5〇〇 U/ml。繼續培養，從培養開始後第7曰每2〜3曰添加IL-2以 使終濃度成為500 U/ml。在此期間完全未進行培養液之稀釋 操作。 於培養開始後第1 5日用錐蟲藍染色法計測活細胞數，並 算出與培養開始時之細胞數相較下之擴大培養率。將結果 示於表17中。 150446.doc •68- 201043699 表17 培養曰數 FN/FN片段 擴大培養率(倍率） 15曰 對照(未固定化FN/FNfr) xl5 纖維連結蛋白 x628 CH-296 x773 H-296 x960 如表17所示，從低細胞數誘導LAK細胞時，使用固定有 各纖維連結蛋白片段之培養器材之群，於在誘導途中無需 進行稀釋操作下，可於培養後第1 5日得到高擴大培養率。 又，其之擴大培養率，比使用固定有纖維連結蛋白之培養 器材之群所得之擴大培養率高。相對於此，在對照群中， 縱使至培養開始後第15日亦幾乎沒有增殖。亦即從低細胞 數誘導LAK細胞時，藉由與纖維連結蛋白或纖維連結蛋白 片段（以纖維連結蛋白片段為較佳）共存，顯然完全不需稀釋 操作，即可以高擴大培養率誘導•培養LAK細胞。 實施例17在LAK細胞中IL-2R表現之誘導 (1) LAK細胞之誘導及培養 用與實施例13-(2)同樣之方法誘導•培養LAK細胞。 (2) 在LAK細胞中IL-2R表現率之測定 在實施例17-(1)中誘導•培養之LAK細胞中IL-2R表現率 之測定依照實施例2-(2)記載之方法進行。將結果示於表18 中。在該表中IL_2R表現陽性細胞含有率（％)以IL-2R表現率 (%)表示。 150446.doc -69- 201043699 表18 培養曰數 FN/FN片段 IL-2R表現率(％) 4曰 對照(未固定化FN/FNfr) 86.5 纖維連結蛋白 97.2 CH-296 97.6 H-296 97.7 C-CS1 94.9 7曰 對照(未固定化FN/FNfr) 59.3 纖維連結蛋白 77.6 CH-296 90.4 H-296 89.1 C-CS1 65.8 如表1 8所示，在LAK細胞誘導初期使用固定有各纖維連 結蛋白之培養器材之群，可以在培養中之LAK細胞表面上 誘導高IL-2R表現率。又，其之IL-2R表現率比使用固定有 各纖維連結蛋白之培養器材之群之IL-2R表現率高。亦即， 誘導LAK細胞之時藉由與纖維連結蛋白片段共存，顯然比 與纖維連結蛋白共存更能提高IL-2R表現率，以及誘導•培 養LAK細胞。 實施例18在LAK細胞中IL-2R表現之誘導 (1) LAK細胞之誘導及培養 用與實施例13-(2)同樣之方法誘導•培養LAK細胞。 (2) 在LAK細胞中IL-2R表現率之測定 依照在實施例9-(2)中記載之方法，測定在實施例18-(1) 150446.doc -70- 201043699 中誘導•培養之第7日之LAK細胞中，於ce>4細胞及CD8細胞 表面上之IL-2R表現率。又，在此操作中，使用FITC標識之 小鼠抗人類CD4抗體或FITC標識之小鼠抗人類CD8抗體做 為1次抗體’以及使用PE標識之小鼠抗人類IL_2R(CD25)抗 體做為2次抗體。將結果示於表19中。 表19 纖維連結蛋白片段 CD4/IL-2R雙重陽性細 胞含有率(％) CD8/IL-2R雙重陽性細 胞含有率(°/〇) 對照(未固定FNfi*) 20.5 49.4 CH-296 41.2 61.6 C-CS1 24.4 54.6 如表19所示，在LAK細胞誘導初期使用固定有各纖維連 結蛋白之培養器材之群，可以在培養中之LAK細胞（CD4及 CD8陽性之兩細胞）表面上誘導高IL_2R表現率。亦即，誘導 LAK細胞之時藉由與纖維連結蛋白片段共存，顯然一方面 可以提尚CD4陽性細胞及CD8陽性細胞二者表面上之il_2R 表現率’以及另一方面可以誘導•培養lak細胞。 實施例19在LAK細胞集團中之CD8陽性細胞含有比率 (1) LAK細胞之誘導及培養 用與實施例13-(2)同樣之方法誘導•培養LAK細胞。 (2) 在LAK細胞中CD8陽性細胞集團含有比率之測定 在實施例19-(1)中誘導•培養之第15曰之LAK細胞中，CD8 陽性細胞含有比率之測定係依照實施例1_(4)記載之方法進 行。將結果示於表20中。 150446.doc -71 - 201043699 表20 纖維連結蛋白片段 CD8/陽性細胞含有率(％) 對照(未固定化FNfr) 42.9 CH-296 72.1 H-296 76.0 如表20所示，在LAK細胞誘導初期使用固定有各纖維連 結蛋白片段之培養器材之群，可以在培養中之LAK細胞中 誘導高CD8陽性細胞含有率。亦即，誘導LAK細胞之時藉由 與纖維連結蛋白片段共存，顯然一方面可以提高LAK細胞 中之CD8陽性細胞含有率，以及另一方面可以誘導•培養 LAK細胞。 實施例20 LAK細胞培養系中擴大培養率之測定 (1) LAK細胞之誘導及培養 將在實施例1-(1)中調製之PBMC懸浮於5HXVIVO20中並 使其濃度成為0.5〜1 X 106細胞/ml後，接種在固定有抗人類 CD3抗體之平皿，或固定有抗人類CD3抗體及FNfr之平皿 中，每穴添加1 ml，然後添加IL-2(鹽野義製藥公司製）並使 終濃度成為1〇〇〇 U/ml。將此等平皿在5%C02及37°C下培養 (於培養第〇日）。於培養開始後第2日及第3日，添加包含1000 U/ml IL-2之5HXVIVO20，每穴1 ml。於培養開始後第4曰， 將用適當5HXVIVO20稀釋之培養液移至未固定任何物之新 燒瓶中，然後添加IL-2並使終濃度成為500 U/ml。於培養開 始第8或9日，在固定有以與實施例13-(1)同樣之方法調製之 抗人類CD3抗體之燒瓶或者固定有抗人類CD3抗體及FNfr 150446.doc -72- 201043699 之燒瓶中（但用於固定化之抗人類CD3抗體之濃度為0.5 pg/ml)，移入用適當的5HXVIV〇20稀釋之培養液，然後添 加IL-2並使其終濃度為5〇〇 U/ml。於培養開始第11日或第12 日，再次將用適當的5HXVIVO20稀釋之培養液移至未固定 任何物之新燒瓶中，然後添加IL-2並使其終濃度為500 U/ml。於培養開始第15日用錐蟲藍染色法計測活細胞之數 目，並計算出與培養開始時之細胞數相較下之擴大培養 率。將結果示於表21及表22中。在該表中donor表示PBMC 供給者之記號。 表21 donor 纖維結合 培養開始 培養開始 擴大培養率 蛋白片段 第0日刺激 第8曰刺激 (倍率） A 對照(未固定化FNfr) 抗CD3 無 x80 抗CD3 抗CD3 x38 CH-296 抗 CD3+CH-296 無 xl452 抗 CD3+CH-296 抗CD3 xl620 抗CD3+CH-296 抗CD3+CH-296 x2700 B 對照(未固定化FNfr) 抗CD3 無 x710 抗CD3 抗CD3 x2363 CH-296 抗 CD3+CH-296 無 x504 抗 CD3+CH-296 抗CD3 x5468 抗CD3+CH-296 抗CD3+CH-296 xl4243 C 對照(未固定化FNfr) 抗CD3 無 xl805 抗CD3 抗CD3 x4200 150446.doc -73· 201043699 CH-296 抗CD3+CH-296 抗CD3+CH-296 X35700 H-296 抗 CD3+H-296 抗 CD3+H-296 X16950 表22 donor 纖維結合 培養開始 培養開始 擴大培養率 蛋白片段 第0曰刺激 第9日刺激 (倍率） B 對照(未固定FNfr) 抗CD3 無 X2074 抗CD3 抗CD3 X2880 CH-296 抗 CD3+CH-296 抗 CD3+CH-296 X38400 CH271 抗 CD3+CH-271 抗 CD3+CH-271 X12672 H-296 抗 CD3+H_296 抗 CD3+H-296 X67584 H-271 抗 CD3+H-271 抗 CD3+H-271 X 8755 C-274 抗 CD3+C-274 抗 CD3+C-274 X 8525 C-CS1 抗 CD3+C-CS1 抗 CD3+C-CS1 X9677 CHV-90 抗 CD3+CHV-90 抗 CD3+CHV-90 X10138 CHV-179 抗CD3+CHV-179 抗CD3+CHV-179 X8294 CHV-181 抗CD3+CHV-181 抗CD3+CHV-181 X5760 如表21及表22所示’在LAK細胞誘導初期及中期反覆使 用固定有各纖維連結蛋白片段及抗CD3抗體之培養器材之 群’與對照群相較，LAK細胞之擴大培養率較高。此等擴 大培養率’比在LAK細胞誘導初期及中期反復使用只固定 抗CD3抗體之培養器材之群之擴大培養率高。亦即藉由在 LAK細胞誘導初期及中期反覆使用纖維連結蛋白片段及抗 CD3抗體刺激’顯然可以更高擴大培養率誘導•培養lak細 胞。 150446.doc •74· 201043699 實施例21 LAK細胞培養系中增殖率之測定 (1) LAK細胞之誘導及培養 用與實施例20-(1)同樣之方法誘導•培養lak細胞。此時 計算出從培養開始後第4日至第8日之細胞增殖率及培養開 始後第11曰至第15曰之細胞增殖率。將結果示於表23及表 24中。
Ο 表23 donor 纖維結合 培養開始 培養開始 11~15日之增 蛋白片段 第0日刺激 第8日刺激 殖率(倍率） A 對照(未固定化 抗CD3 無 6.7倍 FNfr) 抗CD3 抗CD3 8.3倍 CH-296 抗 CD3+CH-296 無 2.6倍 抗 CD3+CH-296 抗CD3 5.5倍 抗 CD3+CH-296 抗 CD3+CH-296 11.1 倍 B 對照(未固定化 抗CD3 無 7.4倍 FNfr) 抗CD3 抗CD3 17.5 倍 CH-296 抗 CD3+CH-296 無 0. 9倍 抗 CD3+CH-296 抗CD3 19.8 倍 抗 CD3+CH-296 抗 CD3+CH-296 60.3 倍 C 對照(未固定化 抗CD3 無 5.2倍 FNfr) 抗CD3 抗CD3 22.2 倍 CH-296 抗CD3+CH-296 抗CD3+CH-2% 94.0 倍 H-296 抗 CD3+H-296 抗 CD3+H-296 35.0 倍 150446.doc -75- 201043699 表24 donor 纖維結合 蛋白片段 培養開始 _第0日刺激 培養開始 第9日刺激 11〜15日之增 殖率(倍率） B 對照(未固定化 抗CD3 無 5.7倍 FNfr) 抗CD3 抗CD3 15.6 倍 CH-296 抗 CD3+CH-296 抗 CD3+CH-296 55.6 倍 CH-271 抗 CD3+CH-271 抗 CD3+CH-271 25.0 倍 H-296 抗 CD3+H-296 抗 CD3+H-296 88.9 倍 H-271 抗 CD3+H-271 抗 CDs+m 23.8 倍 C-274 抗 CD3+C-274 抗 CD3+C-274 61.7 倍 C-CS1 抗 CD3+C-CS1 抗 CD3+C-CS1 28.0 倍 CHV-90 抗 CD3+CHV-90 抗 CD3+CHV-90 44.0 倍 CHV-179 抗 CD3+CHV-179 抗 CD3+CHV-179 32_7 倍 CHV-181 抗 CD3+CHV-181 抗 CD3+CHV-181 41.7 倍 如表23及表24所示，在LAK細胞誘導初期及中期反覆使 用固定有各纖維連結蛋白片段及抗CD3抗體之培養器材之 群’與對照群相較，在誘導後期LAK細胞之增殖率較高。 此等增殖率，比在LAK細胞誘導初期及中期反覆使用只固 定抗CD3抗體之培養器材之群之誘導後期LAK細胞之增殖 率高。亦即藉由在LAK細胞誘導初期及中期使用纖維連結 蛋白片段及抗CD3抗體刺激，顯然可以更高增殖率誘導•培 養LAK細胞。 實施例22在LAK細胞中IL_2R表現之誘導 (1) LAK細胞之誘導及培養 150446.doc -76- 201043699 用與實施例20-(1)同樣之方法誘導•培養lak細胞。 (2)在LAK細胞中IL-2R表現率之測定 在實施例22-(1)中於誘導•培養第15日之lak細胞中 IL-2R表現率之測定係依照實施例2-(2)記載之方法進行。將 其之結果示於表25及表26中。在該表中IL-2R表現陽性細胞 含有率（％)以IL-2R表現率（％)表示。
表25 纖維結合 培養開始 培養開始 IL-2R表現率 蛋白片段 第0日刺激 第9日刺激 (%) 對照(未固定化FNfr) 抗CD3 無 4.8 抗CD3 抗CD3 32.6 CH-296 抗 CD3+CH-296 無 2.5 抗 CD3+CH-296 抗CD3 72.3 抗 CD3+CH-296 抗 CD3+CH-296 94.7 H-296 抗 CD3+H-296 無 1.4 抗 CD3+H-296 抗CD3 50.2 抗 CD3+H-2% 抗 CD3+H-296 89.6 ❹ 表26 纖維結合 蛋白片段 培養開始 第0曰刺激 培養開始 第9日刺激 IL-2R表現 率(％) 對照(未固定化 抗CD3 無 4.8 FNfr) 抗CD3 抗CD3 18.0 CH-296 抗 CD3+CH-296 抗 CD3+CH-296 84.0 CH-271 抗 CD3+CH-271 抗 CD3+CH-271 67.1 150446.doc -77- 201043699 H-296 抗 CD3+H-296 抗 CD3+H-296 79.9 H-271 抗 CD3+H-271 抗 CD3+H-271 51.6 C-274 抗 CD3+C-274 抗 CD3+C-274 66.4 C-CS1 抗 CD3+C-CS1 抗 CD3+C-CS1 72.5 CHV-90 抗 CD3+CHV-90 抗 CD3+CHV-90 52.6 CHV-179 抗CD3+CHV-179 抗CD3+CHV-179 63.4 CHV-181 抗 CD3+CHV-181 抗 CD3+CHV-181 68.3 150446.doc -78- 201043699 表27 纖維結合 培養開始 培養開始 CD8陽性細胞 蛋白片段 第0日刺激 第8曰刺激 含有率(％) 對照(未固定化 抗CD3 益 * »»、 42.9 FNfr) 抗CD3 抗CD3 55.2 CH-296 抗 CD3+CH-296 無 72.1 抗 CD3+CH-296 抗CD3 85.2 抗 CD3+CH-296 抗 CD3+CH-296 75.9 H-296 抗 CD3+H-296 無 76.0 抗 CD3+H-296 抗CD3 82.0 抗 CD3+H-296 抗 CD3+H-296 77.1 如表27所示，在LAK細胞誘導初期及中期反覆使用固定 有各纖維連結蛋白片段及抗CD3抗體之培養器材之群，與 對照群相較，在培養開始第15日之LAK細胞集團中之CD8 陽性細胞含有比率較高。此等CD8陽性細胞含有比率，比 在LAK細胞誘導初期及中期反覆使用只固定抗CD3抗體之 培養器材之群之CD8陽性細胞含有比率高。亦即藉由在LAK 細胞誘導初期及中期使用纖維連結蛋白片段刺激，顯然可 以更高之CD8陽性細胞含有比率誘導•培養LAK細胞。 序列一覽表 序列編號：1 ;被命名為III-8之纖維連結蛋白之部分區域。 序列編號：2 ;被命名為III-9之纖維連結蛋白之部分區域。 序列編號：3 ;被命名為III-10之纖維連結蛋白之部分區域。 序列編號：4 ;被命名為III-12之纖維連結蛋白之部分區域。 150446.doc -79- 201043699 序列編號 序列編號 序列編號 序列編號 序列編號 序列編號 序列編成 序列編號 序列編號 序列編號 序列編號 序列編號 序列編號 序列編號 序列編號 序列編號 序列編號 序列編號 序列編號 5 ;被命名為III-13之纖維連結蛋 t部分區域。 6 ;被命名為III-14之纖維連結蛋 曰之部分區域。 被命名為CS-1之纖維連社| & 、°戈白之部分區域。 被命名為C-274之纖維連結蛋 ㈡月段。 被命名為Η-271之纖維連結蛋白片俨 被命名為Η-296之纖維連結蛋白片段。 被命名為CH-271之纖維連結蛋白片段。 被命名為CH-296之纖維連結 X曰月段。 被命名為C-CS1之纖維連結蛋白片段。 被命名為CHV-89之纖維連結蛋白片X段。 被命名為CHV-90之纖維連結蛋白片段。 被命名為CHV-92之纖維連結蛋白片段。 被命名為CHV-179之纖維連結蛋白片段。 被命名為CHV-181之纖維連結蛋白片段。 被命名為H-275-Cys之纖維連結蛋白片段。 引子12S。 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 引子14A。 引子Cys-A。 引子Cys-S。 序列編號：24 ;依據衍生自流行性感冒病毒之基質蛋白質 設計之胜肽。 產業上利用之可能性 依照本發明之細胞傷害性淋巴球之製造方法，可以得到 維持高細胞傷害活性，IL_2R之表現量有意義地上升且cd8 150446.doc -80 - 201043699 陽性細胞之比率提高之細胞 適厶帛# n ° 淋巴球。該淋巴球例如 適口用在間接免疫療法。因此， 醫療領域將有巨大貢獻。 蝴發明之方法在
【圖式簡單說明J 圖1為顯示纖維連結蛋白 圖 白之構造域（domain)之構造之模气
〇 150446.doc -81 · 201043699 序列表 <110>TAKARA BIO INC. <120>細胞傷害性淋巴球之製造方法
<130>03-021-TW <140>092106632 <141>2003-03-25 <150>JP 2002-84414 <151>2002-03-25 <160>24 〇 <210>1 <211>87 <212>PRT <213>人造序列 <220> <223>被命名為III-8之纖維連結蛋白之部分區域 <400>1 lie Gly Pro Asp Thr Met Arg 10 15 lie Asp Leu Thr Asn Phe Leu 〇
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn 1 5
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser 150446.doc 201043699 20 25 30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu 35 40 45
Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Yal Ser Ser Val Tyr Glu Gin 65 70 75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr 80 85 <210〉 2 〈211〉 90 <212> PRT 〈213〉人造序列 <220〉 〈223>被命名為III-9之纖維連結蛋白之部分區域 <400〉 2
Gly Leu Asp Ser Pro Thr Gly lie Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala 15 10 15
Asn Ser Phe Thr Val His Trp lie Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr 20 25 30
Gly Tyr Arg lie Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro 35 40 45
Arg Glu Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser He Thr Leu Thr 150446.doc -2- 201043699 50 55 60
Asn Leu Thr Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser lie Yal Ala Leu 65 70 75
Asn Gly Arg Giu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr 80 85 90 〈210〉 3 〈211〉 94 〈212〉 PRT 〈2丨3>人造序列 <220> 〈223>被命名為III-10之纖維連結蛋白.之部分區域 <400〉 3
Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro 15 10 15
Thr Ser Leu Leu lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg 20 25 30 〇 Tyr Tyr Arg lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val 35 40 45
Gin Glu Phe Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser 50 55 60
Gly Leu Lys Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val 65 70 75
Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro lie Ser lie 150446.doc 201043699 80 85 90
Asn Tyr Arg Thr <210〉 4 <211〉 92 <212〉 PRT <213〉人造序列 <220> <223〉被命名為πΐ-12之纖維連結蛋白之部分區域 <400> 4
Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr.Gin Val Thr Pro 1 5 10 15
Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp Thr Pro Pro Asn Val Gin Leu Thr 20 25 30
Gly Tyr Aig Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met 35 40 45
Lys Glu He Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Yal Val Yal Ser 50 55 60
Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu 65 70 75
Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gin Gly Yal Val Thr Thr 80 85 90
Leu Glu 150446.doc 201043699 <210> 5 <211> 89 〈212〉 PRT <213〉人造序列 <220> <223〉被命名為III· 13之纖維連結蛋白之部分區域 <400〉 5 ❹ Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu 15 10 15
Thr Thr lie Thr lie Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr lie Thr 20 25 30
Gly Phe Gin Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gin Thr Pro lie 35 40 45
Gin Arg Thr He Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr lie Thr Gly 50 55 60
Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys lie Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn 65 70 75 ® Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val lie Asp Ala Ser Thr 80 85
<210> 6 <211> 90 <212〉 PRT 150446.doc 201043699 <213〉人造序列 <220> <223〉被命名為ΠΙ-14之纖維連結蛋白之部分區域 <400> 6
Ala lie Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro 15 10 15
Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin Pro Pro Arg Ala Arg lie Thr 20 25 30
Gly Tyr He lie Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu 35 40 45
Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu.Ala Thr lie Thr . 50 55 60
Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr lie Tyr Val lie Ala Leu 65 70 75
Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro Leu lie Gly Arg Lys Lys Thr 80 85 90
<210> 7 <211> 25 <212> PRT <2丨3>人造序列 ： <220> <223〉被命名為CS-1之纖維連結蛋白之部分區域 150446.doc 201043699 <400> 7
Asp Glu Leu Pro Gin Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His 15 10 15
Gly Pro Glu lie Leu Asp Val Pro Ser Thr 20 25
<210〉 8 <211> 274 〇 <212> PRT <2丨3>人造序列 <220〉 〇23>被命名為C-274之纖維連結蛋白片段 <400〉 8
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie Gly Pro Asp Thr Met Arg 1 5 10 15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser He Asp Leu Thr Asn Phe Leu
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu 35 40 45
Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Yal Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin 150446.doc 201043699 65 70 75
His Glu 5er Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp 80 85 90
Ser Pro Thr Gly lie Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asn Ser Phe 95 100 105
Thr Val His Trp lie Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Gly Tyr Arg 110 115 120 lie Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser lie Thr Leu Thr Asn Leu Thr 140 145 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser lie Val Ala Leu Asn Gly Arg 155 160 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp 170 Π5 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 185 190 195
Leu lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210 lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe 215 220 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys 230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Yal Tyr Ala Val Thr Gly Arg 245 250 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg 150446.doc 201043699 260 265 270
Thr Gill lie Asp <210> 9 〈211〉 271 <212> PRT <213〉人造序列
O <220〉 <223〉被命名為H-271之纖維連結蛋白片段 <400> 9
Ala He Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gin Val Thr Pro 15 10 15
Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp Thr Pro Pro Asn Val Gin Leu Thr 20 25 30
Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met 35 40 45
Lys Glu lie Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser 50 55 60
Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu 65 70 75
Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gin Gly Val Yal Thr Thr 80 85 90
Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Yal Thr Asp Ala 150446.doc -9· 201043699 95 100 105
Thr Glu Thr Thr lie Thr lie Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr 110 115 120 lie Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gin Thr 125 130 135
Pro lie Gin Arg Thr lie Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr lie 140 145 150
Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys lie Tyr Leu Tyr Thr 155 160 165
Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val lie Asp Ala Ser 170 175 180
Thr Ala lie Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr 185 190 195
Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin Pro Pro Arg Ala Arg lie 200 205 210
Thr Gly Tyr lie lie Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg 215 220 225
Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr lie 230 235 240
Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr lie Tyr Val lie Ala 245 250 255
Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro Leu lie Gly Arg Lys Lys 260 265 270
Thr 150446.doc -10- 201043699 <210> 10 <211〉 296 <212> PRT <213〉人造序列 <220> <223>被命名為H-296之纖維連結蛋白片段 <400> 10 Ο
Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gin Val Thr Pro 15 10 15
Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp Thr Pro Pro Asn Val Gin Leu Thr 20 25 30
Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met 35 40 45
Lys Glu lie Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser 50 55 60
Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu 65 70 75
Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gin Gly Val Val Thr Thr 80 85 90
Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala ’95 100 105
Thr Glu Thr Thr lie Thr lie Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr 110 115 120 lie Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gin Thr 150446.doc -11 - 201043699 125 130 135
Pro lie Gin Arg Thr lie Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr lie 140 145 150
Thr Gly Leu Cln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys lie Tyr Leu Tyr Thr 155 160 165
Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val lie Asp Ala Ser 170 175 180
Thr Ala lie Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr 185 190 195
Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin Pro Pro Arg Ala Arg lie 200 205 210
Thr Gly Tyr lie lie Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg 215 220 225
Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr.Glu Ala Thr lie 230 235 240
Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr lie Tyr Val lie Ala 245 250 255
Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro Leu lie Gly Arg Lys Lys 260 265 270
Thr Asp Glu Leu Pro Gin Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu 275 280 285
His Gly Pro Glu lie Leu Asp Val Pro Ser Thr 290 295 <210> 11 150446.doc -12- 201043699 <211> 549 <212> PRT <213〉人造序列 <220> <223〉袜命名為CH-271之纖維連結蛋白片段 <400> 11
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie Gly Pro Asp Thr Met Arg
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp Leu Thr Asn Phe Leu 20 25 30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp .Val Ala Glu Leu 35 40 45
Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin 65 70 75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp 〇 80 85 90
Ser Pro Thr Gly lie Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asn Ser Phe 95 100 105
Thr Val His Trp lie Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Gly Tyr Arg Π0 115 120 lie Arg Iiis His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135 150446.doc -13- 201043699
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser lie Thr Leu Thr Asn Leu Thr 140 145 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser lie Val Ala Leu Asn Gly Arg 155 160 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp 170 175 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 185 190 195
Leu lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210 lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe 215 220 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys 230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg 245 250 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg 260 265 270
Thr Glu He Asp Lys Pro Ser Met Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp 275 280 285
Leu Lys Phe Thr Gin Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp 290 295 300
Thr Pro Pro Asn Val Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr 305 310 315
Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu lie Asn Leu Ala Pro 320 325 330 150446.doc -14· 201043699
Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys 335 340 345
Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg 350 355 360
Pro Ala Gin Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro 365 370 375
Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr lie Thr lie 380 385 390
Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr lie Thr Gly Phe Gin Val Asp Ο 395 400 405
Ala Val Pro Ala Asn Gly Gin Thr Pro lie Gin Arg Thr lie Lys 410 415 420
Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr lie Thr Gly Leu.Gin Pro Gly Thr 425 430 435
Asp Tyr Lys lie Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser 440 445 450
Ser Pro Val Val lie Asp Ala Ser Thr Ala lie Asp Ala Pro Ser 455 460 465
Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser 470 475 480
Trp Gin Pro Pro Arg Ala Arg lie Thr Gly Tyr lie lie Lys Tyr 485 490 495
Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg 500 505 510
Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr lie Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr 515 520 525 150446.doc -15- 201043699
Glu Tyr Thr lie Tyr Val lie Ala Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser 530 535 540
Glu Pro Leu lie Gly Arg Lys Lys Thr 545 〈210〉 12 〈211〉 574 〈212〉 PRT 〈213>人造序列 <220> 〈223>被命名為CH-296之纖維連結蛋白片段 <400> 12
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie Gly Pro Asp Thr Met Arg 15 10 15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp Leu Thr Asn Phe Leu 20 25 30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu 35 40 45
Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin 65 70 75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp 150446.doc -16- 201043699 80 85 90
Ser Pro Thr Gly lie Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asn Ser Phe 95 100 105
Thr Val His Trp lie Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Gly Tyr Arg 110 115 120 lie Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser lie Thr Leu Thr Asn Leu Thr 140 145 150 Ο
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser lie Val Ala Leu Asn Gly Arg 155 160 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp 170 175 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr,Pro Thr Ser Leu 185 190 195
Leu lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210 lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe 215 220 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys 230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg 245 250 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg 260 265 270
Thr Glu lie Asp Lys Pro Ser Met Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp 150446.doc -17- 201043699 275 280 285
Leu Lys Phe Thr Gin Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp 290 295 300
Thr Pro Pro Asn Val Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr 305 310 315
Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu lie Asn Leu Ala Pro 320 325 330
Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys 335 340 345
Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg 350 355 360
Pro Ala Gin Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro 365 370 375
Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr lie Thr lie 380 385 390
Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr lie Thr Gly Phe Gin Val Asp 395 400 405
Ala Val Pro Ala Asn Gly Gin Thr Pro lie Gin Arg Thr lie Lys 410 415 420
Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr lie Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr 425 430 435
Asp Tyr Lys lie Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser 440 445 450
Ser Pro Val Val lie Asp Ala Ser Thr Ala lie Asp Ala Pro Ser 455 460 465
Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser 150446.doc -18 - 201043699 470 475 480
Trp Gin Pro Pro Arg Ala Arg lie Thr Gly Tyr lie lie Lys Tyr 485 490 495
Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg 500 505 510
Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr lie Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr 515 520 525
Glu Tyr Thr lie Tyr Val He Ala Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser 530 535 540
Gin Pro Leu lie Gly Arg Lys Lys Thr Asp Glu Leu Pro Gin Leu 545 550 555
Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu lie Leu Asp 560 565 570
Val Pro Ser Thr
<210〉 13 <211> 302 <212> PRT O <213〉人造序列 <220> <223〉被命名為C-CS1之纖維連結蛋白片段 <400〉 13
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie Gly Pro Asp Thr Met Arg 150446.doc -19- 201043699 15 10 15
Yal Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp Leu Thr Asn Phe Leu 20 25 30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu 35 40 45
Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin 65 70 75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp 80 85 90
Ser Pro Thr Gly lie Asp Phe Ser Asp He Thr Ala Asn Ser Phe 95 100 105
Thr Val His Trp lie Ala Pro Arg Ala Thr Ile-Thr Gly Tyr Arg 110 115 120 lie Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser lie Thr Leu Thr Asn Leu Thr 140 145 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser lie Val Ala Leu Asn Gly Arg 155 160 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp 170 175 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 185 190 195
Leu lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 150446.doc -20- 201043699 200 205 210 lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe 215 220 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys 230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr He Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg 245 250 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg 260 265 270
Thr Glu lie Asp Lys Pro Ser Asp Glu Leu Pro Gin Leu Val Thr 275 280 285
Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu He Leu Asp Val Pro 290 295 300
Ser Thr
<210> 14 <211〉 367 <212〉 PRT 〇 <213〉人造序列 <220> <223〉被命名為CUV-89之纖維連結蛋白片段 <400> 14
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie Gly Pro Asp Thr Met Arg 150446.doc •21 - 201043699 15 10 15
Va! Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp Leu Thr Asn Phe Leu 20 25 30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu GIu Asp Val Ala Glu Leu 35 40 45
Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin 65 70 75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp 80 85 90
Ser Pro Thr Gly lie Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asn Ser Phe 95 100 105
Thr Val His Trp lie Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Gly Tyr Arg 110 115 120 lie Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser He Thr Leu Thr Asn Leu Thr 140 145 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser lie Val Ala Leu Asn Gly Arg 155 160 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp 170 175 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 185 1^0 195
Leu lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 150446.doc -22- 201043699 200 205 210 lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe 215 220 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys 230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg 245 250 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro lie Ser He Asn Tyr Arg 260 265 270 ❹
Thr Glu lie Asp Lys Pro Ser Met Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg 275 280 285
Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr He Thr lie Ser Trp 290 295 300
Arg Thr Lys Thr Glu Thr lie Thr Gly Phe Gin.Val Asp Ala Val 305 310 315
Pro Ala Asn Gly Gin Thr Pro lie Gin Arg Thr lie Lys Pro Asp 320 325 330
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Val Val He Asp Ala Ser Thr 365 <210> 15 150446.doc -23- 201043699 <211> 368 <212> PRT <213〉人造序列 <220〉 <223〉被命名為CHV-90之纖維連結蛋白片段 <400> 15
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie Gly Pro Asp Thr Met Arg 15 10 15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp Leu Thr Asn Phe Leu 20 25 30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu GIu Asp .Val Ala Glu Leu 35 40 45
Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin 65 70 75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp 80 85 90
Ser Pro Thr Gly lie Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asn Ser Phe 95 100 105
Thr Val His Trp lie Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Gly Tyr Arg 110 115 120 lie Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135 150446.doc -24- 201043699
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser lie Thr Leu Thr Asn Leu Thr 140 145 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser lie Val Ala Leu Asn Gly Arg 155 160 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp 170 175 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 185 190 195
Leu lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg Ο 200 205 210
He Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe 215 220 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie .Ser Gly Leu Lys 230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg 245 250 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg 260 265 270
Thr Glu lie Asp Lys Pro Ser Met Ala lie Asp Ala Pro Ser Asn 275 280 285
Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp 290 295 300
Gin Pro Pro Arg Ala Arg lie Thr Gly Tyr lie lie Lys Tyr Glu 305 310 315
Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro 320 325 330 150446.doc -25- 201043699
Gly Val Thr Glu Ala Thr lie Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu 335 340 345
Tyr Thr lie Tyr Val lie Ala Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu 350 355 360
Pro Leu lie Gly Arg Lys Lys Thr 365 <210> 16 <211> 370 <212> PRT <213〉人造序列 <220〉 〈223>被命名為CHV-92之纖維連結蛋白片段 <4〇0> 16
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie Gly Pro Asp Thr Met Arg 15 10 15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp Leu Thr Asn Phe Leu 20 25 30
Yal Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu 35 40 45
Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin 150446.doc -26- 201043699 65 70 75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp 80 85 90
Ser Pro Thr Gly lie Asp Phe Ser Asp lie Thr Ala Asn Ser Phe 95 100 105
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Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser lie Thr Leu Thr Asn Leu Thr 140 145 150
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Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser,Thr Val Ser Asp 170 175 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 185 190 195
Leu lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210 lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe 215 220 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr He Ser Gly Leu Lys 230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr He Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg 245 250 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg 150446.doc -27- 201043699 260 265 270
Thr Gla ile Asp Lys Pro Ser Met Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp 275 280 285
Leu Lys Phe Thr Gin Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp 290 295 300
Thr Pro Pro Asn Val Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr 305 310 315
Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro 320 325 330
Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys 335 340 345
Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg 350 355 360
Pro Ala Gin Gly Val Val Thr Thr Leu Glu 365 370 <210> 17 <211> 457 <212〉 PRT <213〉人造序列 <220> <223〉被命名為CHV-179之纖維連結蛋白片段 <400〉 17 150446.doc 28· 201043699
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie Gly Pro Asp Thr Met Arg 15 10 15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp Leu Thr Asn Phe Leu 20 25 30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala GIu Leu 35 40 45
Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin 0 65 70 75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp 80 85 90
Ser Pro Thr Gly lie Asp Phe Ser Asp lie Thr.Ala Asn Ser Phe 95 100 105
Thr Val His Trp lie Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Gly Tyr Arg 110 115 120 lie Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135
Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser lie Thr Leu Thr Asn Leu Thr 140 145 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser lie Val Ala Leu Asn Gly Arg 155 160 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp 170 175 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 185 190 195 150446.doc -29- 201043699
Leu lie 3cr Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210
He Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe 215 220 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys 230 235 240
Pro Giy Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg 245 250 255
Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg 260 265 270
Thr Glu lie Asp Lys Pro Ser Met Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg 275 280 285
Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr lie.Thr lie Ser Trp 290 295 300
Arg Thr Lys Thr Glu Thr lie Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala Val 305 310 315
Pro Ala Asn Gly Gin Thr Pro lie Gin Arg Thr He Lys Pro Asp 320 325 330
Val Arg Ser Tyr Thr He Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr 335 340 345
Lys lie Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro 350 355 360
Val Val lie Asp Ala Ser Thr Ala lie Asp Ala Pro Ser Asn Leu 365 370 375
Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin 380 385 390 150446.doc -30- 201043699
Pro Pro Arg Ala Arg lie Thr Gly Tyr lie lie Lys Tyr Glu Lys 395 400 405
Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly 410 415 420
Val Thr Glu Ala Thr lie Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr 425 430 435
Hir lie Tyr Vd lie Ala Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro 440 445 450
Leu lie Gly Arg Lys Lys Thr 〇 455 <210> 18 <211〉 459 <212> PRT <213〉人造序列 <220> <223〉被命名為CHV-1 81之纖維連結蛋白片段 ❹ <400> 18
Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn lie Gly Pro Asp Thr Met Arg 15 10 15
Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser lie Asp Leu Thr Asn Phe Leu 20 25 30
Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu 150446.doc -31 - 201043699 35 40 45
Ser lie Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Lea Thr Asn Leu Leu 50 55 60
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gin 65 70 75
His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gin Lys Thr Gly Leu Asp 80 85 90
Ser Pro Thr Gly lie Asp Phe Ser Asp He Thr Ala Asn Ser Phe 95 100 105
Thr Val His Trp He Ala Pro Arg Ala Thr lie Thr Gly Tyr Arg 110 115 120 lie Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135
Arg Val Pro Ilis Ser Arg Asn Ser lie Thr Leu .Thr Asn Leu Thr 140 145 150
Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser lie Val Ala Leu Asn Gly Arg 155 160 165
Glu Glu Ser Pro Leu Leu lie Gly Gin Gin Ser Thr Val Ser Asp 170 175 180
Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 185 190 195
Leu lie Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210 lie Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gin Glu Phe 215 220 225
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr lie Ser Gly Leu Lys 150446.doc -32- 201043699 230 235 240
Pro Gly Val Asp Tyr Thr lie Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg 245 250 255
Giy Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro lie Ser lie Asn Tyr Arg 260 265 270
Thr Glu lie Asp Lys Pro Ser Met Ala He Pro Ala Pro Thr Asp 275 280 285
Leu Lys Phe Thr Gin Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp 290 295 300 ❹
Thr Pro Pro Asn Val Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr 305 310 315
Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu lie Asn Leu Ala Pro 320 325 330
Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser Gly Leu Met,Val Ala Thr Lys 335 340 345
Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg 350 355 360
Pro Ala Gin Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro 365 370 375
Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr lie Thr lie 380 385 390
Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr lie Thr Gly Phe Gin Val Asp 395 400 405
Ala Val Pro Ala Asn Gly Gin Thr Pro lie Gin Arg Thr lie Lys 410 415 420
Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr lie Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr 150446.doc -33- 201043699 425 430 435
Asp Tyr Lys He Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser 440 445 450
Ser Pro Val Val lie Asp Ala Ser Thr 455 <210> 19 <211> 276 <212〉 PRT <213〉人造序列 <220〉 <223〉被命名為H-275-Cys之纖維連結蛋白片段 <400> 19
Met Ala Ala Ser Ala lie Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr 15 10 15
Gin Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gin Trp Thr Pro Pro Asn 20 25 30
Val Gin Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys 35 40 45
Thr Gly Pro Met Lys Glu lie Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser 50 55 60
Val Yal Val Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser 65 70 75 150446.doc -34- 201043699
Val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gin Gly 80 85 90
Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg 95 100 105
Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr lie Thr lie Ser Trp Arg Thr 110 115 120
Lys Thr Glu Thr lie Thr Gly Phe Gin Val Asp Ala Val Pro Ala 125 130 135
Asn Gly Gin Thr Pro lie Gin Arg Thr lie Lys Pro Asp Val Arg Ο 140 145 150
Ser Tyr Thr He Thr Gly Leu Gin Pro Gly Thr Asp Tyr Lys lie 155 160 165
Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser .Ser Pro Val Val 170 175 180 lie Asp Ala Ser Thr Ala lie Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe 185 190 195
Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gin Pro Pro 200 205 210
Arg Ala Arg lie Thr Gly Tyr lie lie Lys Tyr Glu Lys Pro Gly 215 220 225
Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr 230 235 240
Glu Ala Thr lie Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr lie 245 250 255
Tyr Val lie Ala Leu Lys Asn Asn Gin Lys Ser Glu Pro Leu lie 260 265 270 150446.doc -35- 201043699
Gly Arg Lys Lys Thr Cys 275 <210> 20 <211〉 38 <212〉 DNA <213〉人造序列 <220〉 <223〉引子 12S <400〉 20 aaaccatggc agctagcgct attcctgcac caactgac <210> 21 <211〉 36 <212〉 DNA <213〉人造序列 <220〉 <223〉引子 14A <400> 21 aaaggatccc taactagtct ttttccttcc aatcag 36- 150446.doc 201043699 <210> 22 <211> 40 <212> DNA <213〉人造序列 <220>
<223〉引子 Cys-A
O <400〉 22 aaaagcggcc gctagcgcaa gccatggtct gt t tcctgtg 40 <210> 23 <211> 41 <212> DNA <213〉人造序列 Ο <220〉
<223〉引子 Cys-S <400> 23 aaaagcggcc gcactagtgc atagggatcc ggctgagcaa c 41 150446.doc 37· 201043699 <210> 24 <211> 9 <212〉 PRT <213〉人造序列 <220> <223〉依據衍生自流行性感冒病毒之基質蛋白質設計之胜肽。 <400> 24
Gly lie Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu 1 5 150446.doc -38-

Claims (1)

  1. 201043699 七、申請專利範圍： 1. 一種細胞傷害性淋巴球之製造方法，其特徵為於重組纖 維連結蛋白片段或彼等之混合物存在下，培養末梢血單 核細胞、NK細胞、臍帶血單核球、造血幹細胞、或選自 含有該等細胞之血液中之具有分化成細胞傷害性淋巴球 之能力之前驅細胞’進行細胞傷害性淋巴球之擴大培 養，該重組纖維連結蛋白片段為具有細胞接著活性及/或 ❸ 肝素接著活性、且包含序列表之序列編號1〜7所示之胺基 S欠序列中之至少一個者，或者具有在上述多肽之胺基酸 序列中有1個以上之胺基酸取代、刪除、插入或附加之胺 基酸序列者，或與上述多肽具有相同機能之多肽者。 2. 如申請專利範圍第丨項之方法，其中該細胞傷害性淋巴 球，與於纖維連結|自、其之片&或彼等之混合物不存 在下之藉由細胞傷害性淋巴球之製造方法所得之者相 比’能高度表現白血球間素_2受體。 f法’其中該細胞傷害性淋巴 其之片段或彼等之混合物不存 巴球之製造方法所得者相比， Q 3.如申請專利範圍第1項之方法 球，與於纖維連結蛋白、其之 在下之藉由細胞傷害性淋巴球 含有高比率之CD8陽性細胞。 4_如申請專利範圍第1至3項中任 一項之方法，其中該細胞
    付考相比，能維持高細胞傷害活性。 如申請專利範圍第1項之方法，立 得者相比，能 其中與於纖維連結蛋白、 150446.doc 201043699 其之片段或彼等之混合物不存在下之藉由細胞傷害性淋 巴球之製造方法相比，為高擴大培養率之方法。 6. 7. 8. 9. 10 11. 12. 如申租專利範圍第1至3項中任一項之方法，纟中該重組 纖維連結蛋白片段或彼等之混合物為固定於固相者。 =申請專利範圍第6項之方法，纟中該固相為細胞培養用 器材或細胞培養用載體。 如申請專利範圍第7項之方法，其中該細胞培養用器材為 有蓋玻璃器皿、燒瓶或袋子；培養用載體為珠體、膜 玻片。 如申請專利範圍第丨至3項中任—項之方法，其係於該重 組纖維連結蛋白片段或彼等之混合物溶解於培養基下進 如申請專利範圍第1項之方 ，，—土、、瓜取啤1¾、?否蛋 段為從包含序料之㈣編號8〜丨9之胺基酸序列之 一者之多肽中選出者。 如申請專利範圍第1項之方法，i 乃忠具中該細胞傷害性淋巴3 之擴大培養係在重組纖維連結蛋白片段或彼等之混合4 存在下，於包含培養基之細胞培養用器材中進行，並 足下列條件中之任一者： '' ⑷培養開始時，細胞數與細胞培養用器材中培養面禾 之比率為1細胞/cm2〜5 χ 1〇5細胞/cm2，以及 (b)培養開始時，培春其由队、曲—上 。養基中之細胞濃度為1細胞/cm、5 : 1 〇5細胞/ml。 如申請專利範圍第U項之 万法其未包含稀釋步驟或交 150446.doc 201043699 13. Ο !4. 15. ❹ 16. 17. 換細胞培養用器材之步驟。 一種細胞之白血球間素_ 2受體表現增強劑，其特徵為含有 重組纖維連結蛋白片段或彼等之混合物以做為有效成 分，該重組纖維連結蛋白片段為具有細胞接著活性及/或 肝素接著活性、且包含序列表之序列編號卜7所示之胺基 酸序列中之至少一個者，或者具有在上述多肽之胺基酸 序列中有1個以上之胺基酸取代、刪除、插入或附加之胺 基酸序列者，或與上述多肽具有相同機能之多肤者。 如申凊專利範圍第13項之白血球間素_2受體表現增強 劑，其中該重組纖維連結蛋白片段為從由序列表之序列 編號8〜19之胺基酸序列之任一者所組成之多肽中選出 者。 一種淋巴球中之CD8陽性細胞之比率提高劑，其特徵為含 有重組纖維連結蛋白片段或彼等之混合物做為有效成 刀°亥重組纖維連結蛋白片段為具有細胞接著活性及/或 肝素接著活性、且包含序列表之序列編號丨〜7所示之胺基 酸序列中之至少一個者，或者具有在上述多肽之胺基酸 序列t有1個以上之胺基酸取代、刪除、插入或附加之胺 基酸序列者，或與上述多肽具有相同機能之多肤者。 女申咐專利範圍第1 5項之CD8陽性細胞之比率提高劑，其 中該重組，纖維連結蛋白片段為從由序列表之序列編號 8〜1 9之胺基酸序列之任一者所組成之多肽中選出者。 一種細胞冑害性淋巴球之細胞傷害活性之提高劑或維持 劑，其特徵為含有重組纖维逹結蛋白片段或彼等之混合 150446.doc 201043699 物做為有效成分，該重組纖維連結蛋白片段為具有細胞 接著活性及/或肝素接著活性、且命A皮⑴主 且已3序列表之序列編號 1〜7所示之胺基酸序列中之至少一 v 個者，或者具有在上述 多肽之胺基酸序列中有1個以上少 M上之胺基酸取代、刪除、插 入或附加之胺基酸序列者，式偽l ^或與上述多肽具有相同機能 之多肽者。 18. 如申請專利範圍第17項之細胞傷害活性之提高劑或維持 劑，其中該重組纖維連結蛋白片段為從由序列表之序列 編號8〜19之胺基酸序列所組成之任一者之多肽中選出 者。 19. 一種使細胞傷害性淋巴球中之白血球間素_2受體之表現 增加之方法，其包含於重組纖維連結蛋白片段或彼等之 混5物存在下，培養末梢血單核細胞、NK細胞、臍帶血 單核球、造血幹細胞、或選自含有該等細胞之血液中之 具有分化成細胞傷害性淋巴球之能力之前驅細胞，進行 細胞傷害性淋巴球之擴大培養之步驟，該重組纖維連結 蛋白片段為具有細胞接著活性及/或肝素接著活性、且包 含序列表之序列編號所示之胺基酸序列中之至少— 個者’或者具有在上述多肽之胺基酸序列中有1個以上之 胺基酸取代、刪除、插入或附加之胺基酸序列者，或與 上述多肽具有相同機能之多肽者。 2〇·如申請專利範圍第19項之方法，其中重組纖維連結蛋白 片段為包含序列表之序列編號8〜19所示之胺基酸序列中 之任意者。 150446.doc 201043699 21· —種提升細胞傷害性淋巴球中之CD8陽性細胞比率之方 法，其包含於重組纖維連結蛋白片段或彼等之混合物存 在下，培養末梢血單核細胞、Νκ細胞、臍帶血單核球、 造血幹細胞、或選自含有該等細胞之血液中之具有分化 成細胞傷害性淋巴球之能力之前驅細胞，進行細胞傷害 性淋巴球之擴大培養之步驟，該重組纖維連結蛋白片^ 為具有細胞接著活性及/或肝素接著活性、且包含序列表 ^ 之序列編號1〜7所示之胺基酸序列中之至少—個者，或者 具有在上述多肽之胺基酸序列中有丨個以上之胺基酸取 代、刪除、插入或附加之胺基酸序列者，或與上述多肽 具有相同機能之多肽者。 22.如申請專利範圍第21項之方法，其中重組纖維連結蛋白 片段為包含序列表之序列編號8〜19所示之胺基酸序列中 之任意者。 23· —種提升或維持細胞傷害性淋巴球之細胞傷害活性之方 〇 法’其包含於重組纖維連結蛋白片段或彼等之混合物存 在下，培養末梢血單核細胞、Νκ細胞、臍帶血單核球、 造血幹細胞、或選自含有該等細胞之血液中之具有分化 成細胞傷害性淋巴球之能力之前驅細胞，進行細胞傷害 性淋巴球之擴大培養之步驟，該重組纖維連結蛋白片段 為具有細胞接著活性及/或肝素接著活性、且包含序列表 之序列編號1〜7所示之胺基酸序列中之至少一個者，或者 具有在上述多肽之胺基酸序列中有丨個以上之胺基酸取 代、刪除、插入或附加之胺基酸序列者，或與上述多肽 150446.doc 201043699 具有相同機能之多肽者。 24 25. 26. 如申請專利範圍第23項之方法，其4組纖維連結蛋白 片段為包含序列表之序列編號8〜19心之胺基酸 之任意者。 宁 如申請專利㈣第⑴項中任—項之方法，其尚包 細胞傷害性淋巴球中導入外來基因之步驟。 如申請專利範圍第25項之方法，其中使用反轉錄病毒、 腺病毒、腺病毒相關病毒或猿猴病毒以導入外來基：。 150446.doc
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