CN117222732A - 新颖方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及扩增γδT细胞的方法，所述方法包括制备富含γδT细胞的组合物和在饲养细胞存在下培养所述组合物。还提供一种工程化γδT细胞的方法，所述方法包括制备富含γδT细胞的组合物，转导所述组合物以表达对肿瘤相关抗原具有特异性的嵌合抗原受体(CAR)和培养所述转导的组合物以扩增所述工程化的γδT细胞。还提供根据所述方法产生的扩增的和工程化的γδT细胞，所述细胞可用于过继性T细胞疗法、嵌合受体疗法等。

Description

新颖方法
技术领域
本发明涉及扩增γδT细胞的方法，所述方法包括制备富含γδT细胞的组合物和在饲养细胞存在下培养所述组合物的步骤。还提供了一种工程化γδT细胞的方法，所述方法包括以下步骤：制备富含γδT细胞的组合物，转导所述组合物以表达对肿瘤相关抗原具有特异性的嵌合抗原受体(CAR)，并培养转导的组合物以扩增工程化的γδT细胞。这类γδT细胞包括非Vδ2细胞，例如Vδ1、Vδ3和Vδ5细胞。根据本文所述方法所产生的扩增的和工程化的γδT细胞被发现可用于过继性T细胞疗法、嵌合受体疗法等。本发明还涉及通过本文所述方法产生的单一细胞和细胞群。
背景技术
对于癌症T细胞免疫疗法日益增长的兴趣集中在CD8+和CD4+αβT细胞亚群识别癌细胞、以及介导宿主保护功能潜力的明显能力上，特别是通过由PD-1、CTLA-4和其它受体作用的抑制路径的临床介导拮抗的去压抑。然而，αβT细胞是MHC限制的，这可导致同种异体环境中的移植物抗宿主疾病。
采用过继性细胞疗法治疗癌症大部分仅限于基于循环的、患者来源的、工程化的自体αβT细胞的平台。尽管在某些血液科恶性疾病中取得了成功，但这种方法带来了挑战，包括相关的毒性、高生产成本以及在同种异体环境中使用时需要基因编辑细胞以避免移植物抗宿主疾病。虽然工程化的αβT细胞在血液科恶性疾病中显示出治疗活性，但在实体瘤中的临床活性一直受到挑战。
伽马德尔塔T细胞(gamma delta T细胞，γδT细胞)是代表T细胞的一个子集，它们在其表面表达独特的、定义的γδT细胞受体(TCR)。此TCR由一条伽马(γ)和一条德尔塔(δ)链组成。人γδTCR链选自三个主要的δ链(Vδ1、Vδ2和Vδ3)以及六个γ链。人γδT细胞可根据它们的TCR链进行广泛分类，因为某些γ和δ类型在一种或多种细胞类型上更常发现(虽然并非仅限于此)。例如，大部分血液驻留γδT细胞(blood-residentγδT cell)表达Vδ2TCR(例如Vγ9Vδ2)，而这在组织驻留γδT细胞(tissue-residentγδT cell)中不太常见，其更频繁地在皮肤中使用Vδ1，在肠道中使用Vγ4。
因此，与αβT细胞相比，Vδ1γδT细胞是由与Vδ1链配对的γ链组成的T细胞受体的表达所定义的先天T细胞子集。在小鼠中，Vδ1γδT细胞主要存在于组织中，通过模式和天然细胞毒性受体识别的介导性抗肿瘤反应，它们对广泛的癌症具有高度保护作用。类似地，在人类中，Vδ1γδT细胞主要存在于上皮组织内，介导非MHC限制的且非同种异体HLA反应的靶细胞识别。因此，γδT细胞过继性细胞疗法不需要患者的HLA匹配。先天的Vδ1γδT细胞生物学能够识别抗原非依赖性肿瘤、不需要HLA匹配、以及内在遗传的迁移且驻留在人体组织中，使Vδ1γδT细胞成为吸引人的细胞治疗平台。
因此，需要有效扩增γδT细胞的方法，以使其适合作为疗法(例如作为过继性T细胞疗法)，以及有可能提供同种异体“现成”嵌合抗原受体表达的γδT细胞疗法的方法，例如治疗实体瘤。
WO2017072367和WO2018202808涉及通过将获自非造血组织的淋巴细胞培养在至少有白介素-2(IL-2)和/或白介素-5(IL-5)的存在下进行体外扩增非造血组织驻留γδT细胞的方法。WO2015189356描述了一种组合物，所述组合物用于扩增通过血球分离术获得的样品的淋巴细胞，包括至少两种选自IL-2、IL-15和IL-21的细胞因子。
因此，尽管这些公开内容在某种程度上解决了上述问题，但仍需要扩增和工程化γδT细胞(例如来自皮肤)的方法，以提供在疗法中使用这类γδT细胞的能力。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了一种扩增γδT细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)制备富含γδT细胞的组合物；和
(ii)在饲养细胞存在下培养所述组合物，其中所述饲养细胞以至少4:1(饲养细胞:γδT细胞)的比例存在。
根据本发明的另一方面，提供了一种扩增γδT细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)制备富含γδT细胞的组合物；和
(ii)在饲养细胞和包含IL 15和IL-21的培养基存在下培养所述组合物，其中所述饲养细胞以至少3:2(饲养细胞:γδT细胞)的比例存在。
根据本发明的另一方面，提供了一种扩增γδT细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)通过αβT细胞的耗尽制备富含γδT细胞的组合物；和
(ii)在饲养细胞存在下培养所述组合物，其中所述饲养细胞以至少3:2(饲养细胞:γδT细胞)的比例存在。
根据本发明的另一方面，提供了一种工程化γδT细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)制备富含γδT细胞的组合物；
(ii)在没有TCR刺激的情况下转导所述组合物以表达识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)；和
(iii)培养转导的组合物以扩增工程化的γδT细胞，
其中步骤(ii)和(iii)可以按顺序或同时进行。
根据本发明的一方面，提供一种扩增的γδT细胞群，其是可获得的，例如通过本文所述的方法获得。根据另一方面，提供一种工程化的γδT细胞群，其是可获得的，例如通过本文所述的方法获得。
根据本发明另一方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如本文所述的扩增的γδT细胞群或工程化的γδT细胞群。
根据本发明的又一方面，提供了如本文所述的扩增的γδT细胞群、工程化的γδT细胞群或药物组合物，用作药物。在另一方面，提供如本文所述的扩增的γδT细胞群、工程化的γδT细胞群或药物组合物，用于治疗癌症，例如用于治疗实体瘤。
还提供一种扩增γδT细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)制备富含γδT细胞的组合物；和
(ii)在饲养细胞存在下培养所述组合物，其中所述饲养细胞以至少1:2(饲养细胞:γδT细胞)的比例存在，尤其是至少1:1(饲养细胞:γδT细胞)，特别是至少2:1(饲养细胞:γδT细胞)，例如至少3:1(饲养细胞:γδT细胞)。
还提供一种扩增γδT细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)制备富含γδT细胞的组合物；和
(ii)在饲养细胞和包含IL-15和IL-21的培养基存在下培养所述组合物，其中所述饲养细胞以至少1:2(饲养细胞:γδT细胞)的比例存在，例如至少1:1(饲养细胞:γδT细胞)。
还提供一种扩增γδT细胞的方法，其中所述方法包括步骤：
(i)通过αβT细胞的耗尽制备富含γδT细胞的组合物；和
(ii)在饲养细胞存在下培养所述组合物，其中所述饲养细胞以至少1:2(饲养细胞:γδT细胞)的比例存在，例如至少1:1(饲养细胞:γδT细胞)。
附图说明
图1：用于γδT细胞扩增的各种饲养细胞来源的比较。从皮肤中分离出γδT细胞，耗尽αβT细胞，并与以下辐照细胞共培养7天：同种异体外周血淋巴细胞(PBL)、同种异体外周血单核细胞(PBMC)、抗CD3 CD28活化的同种异体PBMC(Act PBMC)、或同种异体皮肤分离培养物(皮肤αβ/皮肤异细胞)，与对照组(4CK)相比。A)使用Ki67标记显示增殖，并且总Vδ1细胞数显示在B中。
图2：当γδT细胞从初始群中被阳性选择出来并以不同比例添加回剩余的饲养细胞群时的γδ细胞扩增。A)在对γδT细胞进行阳性选择后，在饲养细胞(在D0时，1％、5％、10％、20％或40％γδT细胞富集的、非αβ细胞含量，剩余的培养物是由自体饲养细胞组成的)存在的培养物中培养指定天数后测定γδT细胞的增殖倍数。B)是A在没有饲养细胞的情况下。
图3：当αβ细胞从初始群中耗尽并以不同比例作为饲养细胞添加回来时的γδ细胞扩增。A)在饲养细胞(在D0时，1％、5％、10％、20％或40％γδT细胞富集的、非αβ细胞含量，剩余的培养物是由自体饲养细胞组成的)存在的培养物中培养指定天数后测定γδT细胞的扩增倍数。B)是A在没有饲养细胞的情况下。
图4：CD19 CAR+γδT细胞对NALM6靶细胞表达出细胞毒性活性。用CD19 CAR转导包含αβ饲养细胞的γδT细胞组合物，然后通过耗尽αβT细胞从扩增的γδT细胞中去除饲养细胞。然后将转导的γδT细胞与以指定比例与表达CD19的NALM6靶细胞一起培养，并测量杀死的量。
图5：冷冻保存的转导γδT细胞是存活的，CAR表达稳定，解冻后仍保留细胞毒活性。A)在冷冻前，第14天扩增的CAR表达含量。B)至于A，在解冻后第7天测量CD19 CAR+细胞的比例，即使在冷冻和恢复后也显示出良好的表达量。
图6：解冻后CD19 CAR转导的γδT细胞，其中饲养细胞通过消耗αβT细胞被去除，以指定比例与表达CD19的NALM6靶细胞一起培养，并测量杀死的量。
图7：Meso-CAR转导的γδT细胞，其中起始γδT群被αβ耗尽，然后按照所描述转导和培养，产生超过40％间皮素CAR+的γδT细胞群。
图8：用meso-CAR转导的γδT细胞对间皮素阳性癌细胞系表达出细胞毒性。A)解冻后模拟细胞和转导细胞组的存活率。B)相对于Hela细胞的细胞毒性。C)相对于SCOV-3细胞的细胞毒性。
图9：将阴性选择的γδT细胞与皮肤驻留的CD4αβT细胞(“CD4饲养细胞”)、皮肤驻留的CD8αβT细胞(“CD8饲养细胞”)、或CD4和CD8αβT细胞两者(“αβ饲养细胞”)一起培养，或者在不添加额外饲养细胞的情况下进行培养(“仅γδ”)。然后扩增培养物14天(左图)或21天(右图)，然后收集培养物并且计算γδ扩增率。
具体实施方式
先前已报告，γδT细胞群可使用辐照人工抗原呈现细胞(aAPC)作为饲养细胞来扩大到临床规模(Deniger等人,Clin.Cancer Res.,2014；20(22):5708–5719)。这类aAPC是源自K562肿瘤细胞并表达CD137L(在存在IL-2和IL-21的情况下)，导致多克隆γδT细胞群的活化和增殖。然而，这类方法需要对K562肿瘤细胞进行基因修饰，以使其发挥aAPC的功能并支持γδT细胞扩增和活化，并且通过照射来阻止这些肿瘤衍生的aAPC的生长。
因此，根据本发明的第一方面，提供了一种扩增γδT细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)制备富含γδT细胞的组合物；和
(ii)在饲养细胞存在下培养所述组合物，其中所述饲养细胞以至少4:1(饲养细胞:γδT细胞)的比例存在。
本文所述的方法在人体或动物体外进行，即它们在体外和/或离体进行。因此，在一个实施方案中，本文所述的方法是体外方法。在另一实施方案中，本文所述的方法是离体方法。
如本文所用，提及“扩增的”、“扩增的群体”或“扩增的γδT细胞”包括比未扩增的群体更大或包含更多细胞数量的细胞群。这样的群体可以是数量多、数量少或混和的群体，在群体中扩增一部分或特定的细胞类型。应当理解的是，术语“扩增步骤”是指产生扩增或扩增群体的过程。因此，与未进行扩增步骤或在任何扩增步骤之前的群体相比，扩增或扩增的群体在数量上可能更多或包含更多数量的细胞。还应理解的是，本文中指示的任何指示扩增(例如倍数增加或倍数扩增)的数字是说明细胞群的数量或大小的增加或是细胞数的增加，并且是扩增数量的指标。
应当理解，对γδT细胞组合物的培养是持续一段时间以有效产生扩增的γδT细胞群。在一个实施方案中，有效产生扩增的γδT细胞群的持续时间为至少7天。因此，在一个实施方案中，将γδT细胞的组合物培养至少7天。在另一实施方案中，将组合物培养7至21天，例如9至15天。在另一实施方案中，将组合物培养约10、11、12、13或14天。
在另一实施方案中，将组合物培养至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天或至少21天，例如约14天或约21天以产生扩增的γδT细胞群。在一个实施方案中，将组合物培养约10、11、12、13或14天以产生扩增的γδT细胞群。
合适地扩增γδT细胞群提供至少5倍、尤其是至少10倍、尤其是至少20倍、例如至少50倍、例如至少100倍数量的γδT细胞。
在一个实施方案中，所述方法包括冷冻扩增的γδT细胞。这类冷冻扩增的γδT细胞接着可解冻以用于下游加工或用途，例如治疗用途。冷冻使扩增的γδT细胞易于运输和长期储存，并且在本领域中是众所周知的。因此，提供一种使细胞在冷冻和解冻后显示出良好存活率和活性的方法是有利的，并且并非所有扩增方法都产生这样的细胞(数据未显示)。
至少4:1的饲养细胞:γδT细胞比例等于培养物中至少80％的饲养细胞与20％或更少的γδT细胞比例。与在没有饲养细胞的情况下培养的γδT细胞群相比，这种饲养细胞:γδT细胞的比例大幅增加了培养物中的γδT细胞群的扩增(图2至3)。此外，即使在最高程度的饲养细胞添加下，这些培养物中的CD45+群中γδT细胞的纯度也会增加(数据未显示)。在培养的所有时间点都可以看到这些有利的效果，特别是在培养的第14天和第21天。
因此，在一个实施方案中，培养物包含至少80％的饲养细胞。在一些实施方案中，饲养细胞以约10:1至约99:1(饲养细胞:γδT细胞)的比例存在。在一个实施方案中，饲养细胞以至少10:1(饲养细胞:γδT细胞)的比例存在。因此，在另一实施方案中，培养物包含至少90％的饲养细胞。在另一实施方案中，饲养细胞以至少20:1(饲养细胞:γδT细胞)的比例存在。因此，根据一个实施方案，培养物包含至少95％的饲养细胞。在另一实施方案中，饲养细胞以至少50:1(饲养细胞:γδT细胞)的比例存在。因此，在一个实施方案中，培养物包含至少98％的饲养细胞。在另一实施方案中，饲养细胞以至少99:1(饲养细胞:γδT细胞)的比例存在。因此，在另一实施方案中，培养物包含至少99％的饲养细胞。与在没有饲养细胞的情况下培养的γδT细胞群相比，本文所测试的所有比例都大幅增强了培养中的γδT细胞群的扩增(图1)，当饲养细胞以约10:1的比例存在时(即，培养物中包括大约90％的饲养细胞)，γδT细胞的产量和纯度特别优良。
根据本发明的饲养细胞可以是未修饰的自体或同种异体非γδT细胞，即它们是源自与富含γδT细胞的组合物相同或不同的供体的细胞。此类饲养细胞包括αβT细胞和任选的自然杀手细胞(NK细胞)，其衍生自与富含γδT细胞的组合物相同的组织或相同的组织类型(独立于衍自相同/单一或不同供体)。例如，其中，从非造血组织(例如皮肤)分离γδT细胞，饲养细胞可以是也从所述非造血组织(例如皮肤)分离的非γδT细胞。此类饲养细胞，包含αβT细胞也可最初从造血组织中分离出来，但随后通过细胞培养或基因操作进行修饰，以类似于通常不会大量存在于造血组织中的组织驻留或记忆αβT的表型和生物学。因此，在一个实施方案中，饲养细胞和富含γδT细胞的组合物源自单个供体。在另一实施方案中，饲养细胞和富含γδT细胞的组合物来自不同的供体。
在一个实施方案中，γδT细胞的组合物源自单个供体。在替代实施方案中，所述组合物源自多个供体，即所述组合物是‘汇集的(pooled)’组合物。在另一实施方案中，饲养细胞源自单个供体。在另一实施方案中，饲养细胞源自多个供体，即饲养细胞是‘汇集的’。因此，在一个实施方案中，饲养细胞获自多个供体，并且富含γδT细胞的组合物获自单个供体。在另一实施方案中，饲养细胞获自单个供体，并且富含γδT细胞的组合物获自多个供体。
在一个实施方案中，单个或多个供体可包括要用本发明的细胞群或组合物治疗的主体。或者，单个或多个供体不包括要用本发明的细胞群或组合物治疗的主体。
在一些实施方案中，饲养细胞包括富含αβ的T细胞群。在另一实施方案中，饲养细胞包括αβT细胞。在一个实施方案中，αβT细胞包括CD4 T细胞和/或CD8 T细胞。应当理解的是，提及“CD4 T细胞”或“CD4+T细胞”是指一种表达CD4表面蛋白的T细胞。同样地，提及“CD8T细胞”或“CD8+T细胞”是指一种表达CD8表面蛋白的T细胞。在具体实施方案中，饲养细胞包括CD4 T细胞。在另一实施方案中，饲养细胞由CD4 T细胞组成。
在另一实施方案中，饲养细胞包括αβT细胞和自然杀手(NK)细胞的混合群。因此，在一个实施方案中，饲养细胞另外包括自然杀手(NK)细胞。
应当理解的是，本文所述的饲养细胞提供天然抗原呈现和共刺激能力，未经遗传修饰以起到抗原呈现细胞的作用，且因此不是aAPC。此外，不需通过辐照或丝裂霉素-C处理来阻止饲养细胞的生长，因为它们并非源自肿瘤细胞。然而，在另一实施方案中，饲养细胞是生长停滞的。生长停滞的方法是本领域已知的并且包括但不限于辐照(例如γ-辐照)和丝裂霉素-C处理，产生不能复制但保持代谢活性的饲养细胞，从而为γδT细胞提供足够的生长支持。阻止饲养细胞的生长能使γδT细胞长期培养，而不会在相对于γδT细胞以大量/高比例存在的情况下使这些细胞过度生长。因此，在另一实施方案中，饲养细胞被辐照。在替代实施方案中，饲养细胞经丝裂霉素-C处理。
在一个实施方案中，饲养细胞获自非造血组织。在另一实施方案中，饲养细胞获自皮肤。这类非造血组织和其制备方法的实例可在WO2020095058和WO2020095059中找到，其公开内容整体并入本文。
在其它实施方案中，富含γδT细胞的组合物包含NK细胞。因此，在一个实施方案中，步骤(i)包括αβT细胞的耗尽，即通过αβT细胞的耗尽来制备富含γδT细胞的组合物。在另一实施方案中，根据步骤(i)制备富含γδT细胞的组合物，包括获自起始样品(例如上文所述的非血液组织)的混合细胞群中αβT细胞的耗尽。组合物中NK细胞的存在是有利的，因为这些细胞也是有效的细胞毒性细胞。因此，与单独的γδT细胞组合物相比，额外包括NK细胞的γδT细胞组合物可能具有增强的细胞毒性特性。
NK细胞(也称为大颗粒淋巴细胞(LGL))是先天免疫系统的细胞毒性淋巴细胞。它们提供快速反应，例如对于病毒感染的细胞和肿瘤细胞独立于靶细胞表面的MHC表达。因此，与γδT细胞类似，NK细胞对靶细胞的识别不受MHC限制，也没有同种异体HLA反应性，这意味着基于NK细胞的疗法不需要患者的HLA匹配。
因此，根据本发明的另一方面，提供了一种扩增γδT细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)通过αβT细胞的耗尽制备富含γδT细胞的组合物；和
(ii)在饲养细胞存在下培养组合物，其中饲养细胞以至少3:2(饲养细胞γδT细胞)的比例存在。
因此，在某些实施方案中，培养物包括至少60％的饲养细胞。在其它实施方案中，培养物包含至少66％的饲养细胞，例如至少70％的饲养细胞。
在另一实施方案中，步骤(i)包括从获自起始样品的混和细胞群中阳性选择γδT细胞。
在某些实施方案中，起始样品是人类组织。在另一实施方案中，起始样品是非造血组织，例如上文所述。在一个具体实施方案中，起始样品是皮肤。
在某些实施方案中，所述方法包括通过αβT细胞的耗尽从扩增的γδT细胞中去除饲养细胞。这种通过αβT细胞的耗尽的去除导致了扩增的γδT细胞群，所述扩增的γδT细胞群是通过本文所述的方法产生并且进一步包括NK细胞。如前文所述，NK细胞是良好的效应细胞，其与γδT细胞相似，既不是MHC限制性的，也不是同种异体-HLA反应性的。因此，在一个具体实施方案中，扩增的γδT细胞群包含NK细胞。在替代实施方案中，所述方法包括通过γδT细胞的阳性选择从扩增的γδT细胞中去除饲养细胞。这种γδT细胞的阳性选择会导致高度纯化的γδT细胞群，与包含其它/额外细胞类型的群体相比，其可能更适合下游加工或用于治疗。
在一个实施方案中，组合物在包含IL-15的培养基中培养。在另一实施方案中，组合物在包含IL-21的培养基中培养。因此，在一些实施方案中，培养基包含IL-15和IL-21。在另一实施方案中，培养基另外包含IL-2。在另一实施方案中，培养基另外包含IL-4。因此，在一些实施方案中，培养基另外包含IL-2和IL-4。在另一实施方案中，培养基包含IL-15、IL-21、IL-2和IL-4。
在一个具体实施方案中，在步骤(ii)中在含有IL-15和IL-21的培养基中培养富含γδT细胞的组合物。在另一实施方案中，步骤(ii)包括WO2017072367和WO2018202808中公开的用于扩增γδT细胞的条件和/或方法，其内容整体并入本文。
因此，根据本发明另一方面，提供了一种扩增γδT细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)制备富含γδT细胞的组合物；和
(ii)在饲养细胞的存在下在含有IL-15和IL-21的培养基中培养所述组合物，其中饲养细胞以至少3:2(饲养细胞:γδT细胞)的比例存在。
如本文所用，“IL-15”是指天然或重组的IL-15或其变体，其作为一种或多种IL-15受体(IL-15R)亚基(例如其突变体、突变蛋白、类似物、亚基、受体复合物、片段、同种型和肽模拟物)。和IL-2一样，IL-15是一种已知的T细胞生长因子，可支持IL-2依赖性细胞系CTLL-2的增殖。IL-15作为114个氨基酸的成熟蛋白最早是由Grabstein等人报告(Grabstein等人Science 1994.264.5161:965-969)。本文所用的术语“IL-15”是指天然或重组的IL-15和其突变蛋白、类似物、亚基或其复合物(例如受体复合物，例如寿司肽(sushi peptide)，如WO2007/046006中所述)，并且其各自可刺激CTLL-2细胞的增殖。在CTLL-2增殖试验中，用重组表达的前体和IL-15成熟形式的同义融合物转染的细胞的上清液可诱导CTLL-2细胞增殖。
人IL-15可以根据Grabstein等人描述的过程获得，或是通过常规过程，例如聚合酶链式反应(PCR)。在1993年2月19日将人IL-15cDNA保存在并且登录号为69245。
人IL-15(基因标识3600)的氨基酸序列可在Genbank中的登录定位符NP000576.1GI：10835153(同种型1)和NP_751915.1GI：26787986(同种型2)发现。鼠(小家鼠(Mus musculus))IL-15氨基酸序列(基因标识16168)可在Genbank中以登录号NP_001241676.1GI：363000984发现。
IL-15还可以指涉源自多种哺乳动物物种的IL-15，包括例如人、猿猴、牛、猪、马和鼠。如本文所指，IL-15“突变蛋白”或“变体”是与天然哺乳动物IL-15的序列基本上同源的多肽，但是因为氨基酸缺失、插入或取代具有与天然哺乳动物IL-15多肽不同的氨基酸序列。变体可包含保守取代的序列，这意味着给定的氨基酸残基被具有相似物理化学特征的残基取代。保守取代的例子包括一个脂肪族残基取代另一个，例如Ile、Val、Leu或Ala，或一个极性残基取代另一个，例如在Lys与Arg之间；Glu与Asp之间；或Gln与Asn之间。其它这类的保守取代，例如具有相似疏水性特征的整个区域的取代，是众所周知的。本发明还包括天然存在的IL-15变体。这种变体的实例是由交替的mRNA剪接事件或由IL-15蛋白的蛋白水解切割产生的蛋白质，其中保留了IL-15结合特性。mRNA的交替剪接可产生截短但具有生物活性的IL-15蛋白。可归因于蛋白水解的变化包括例如在不同类型的宿主细胞中表达时N端或C端的差异，这是由于从IL-15蛋白中蛋白水解去除一个或多个末端氨基酸(通常是从1-10氨基酸)。在一些实施方案中，可以修饰蛋白质的末端以改变其物理特性，例如用化学基团如聚乙二醇(Yang等人Cancer 1995.76：687-694)。在一些实施方案中，蛋白质的末端或内部可以用额外的氨基酸修饰(Clark-Lewis等人PNAS1993.90:3574-3577)。
在一些实施方案中，本文定义的方法包括IL-15，其浓度通常为至少0.1ng/mL，例如至少10ng/mL(例如0.1ng/mL至10,000ng/mL、1.0ng/mL至1,000ng/mL、5ng/mL至800ng/mL、10ng/mL至750ng/mL、20ng/mL至500ng/mL、50ng/mL至400ng/mL、或100ng/mL至250ng/mL，例如0.1ng/mL至1.0ng/mL、1.0ng/mL至5.0ng/mL、5.0ng/mL至10ng/mL、10ng/mL至20ng/mL、20ng/mL至100ng/mL、20ng/mL至50ng/mL、40ng/mL至70ng/mL、50ng/mL至100ng/mL、50ng/mL至60ng/mL、100ng/mL至200ng/mL、200ng/mL至500ng/mL、或500ng/mL至1,000ng/mL)。在另一实施方案中，本文定义的方法包含浓度通常低于500ng/mL(例如低于100ng/mL)的IL-15。在一些实施方案中，IL-15的浓度约为50ng/mL。在另一实施方案中，IL-15的浓度约为55ng/mL。
如本文所用，“IL-21”是指天然或重组IL-21或其变体，其作为一种或多种IL-21受体(IL-21R)亚基(例如其突变体、突变蛋白、类似物、亚基、受体复合物、片段、同种型和肽模拟物)。这类试剂可支持自然杀手(NK)和细胞毒性(CD8+)T细胞的增殖。成熟的人IL-21以133个氨基酸序列的形式出现(减去信号肽，由另外的22个N端氨基酸组成)。IL-21突变蛋白是一种多肽，其中对白介素-21蛋白进行了特异性取代，同时保留了结合IL-21Rα的能力，例如美国专利第9,388,241号中所描述的那些。IL-21突变蛋白的特征在于在天然IL-21多肽链中或其它残基处的一个或多个位点处的氨基酸插入、缺失、取代和修饰。根据本公开，任何此类插入、缺失、取代和修饰都会产生保留IL-21R结合活性的IL-21突变蛋白。示例性突变蛋白可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸的取代。
编码人IL-21的核酸可以通过常规方法例如聚合酶链式反应(PCR)获得。人IL-21的氨基酸序列(基因ID 59067)可在Genbank中的登录号NC_000004.12发现。鼠(小家鼠)IL21氨基酸序列(基因标识60505)可在Genbank中以登录号NC_000069.6发现。
IL-21还可指涉源自多种哺乳动物物种的IL-21，包括例如人、猿猴、牛、猪、马和鼠。变体可包含保守取代的序列，这意味着给定的氨基酸残基被具有相似物理化学特征的残基取代。保守取代的实例包括一个脂肪族残基取代另一个，例如Ile、Val、Leu或Ala，或一个极性残基取代另一个，例如在Lys与Arg之间；在Glu与Asp之间；或在Gln与Asn之间。其它这类的保守取代，例如具有相似疏水性特征的整个区域的取代，是众所周知的。本发明还包括天然存在的IL-21变体。这种变体的实例是由交替的mRNA剪接事件或由IL-21蛋白的蛋白水解切割产生的蛋白质，其中保留了IL-21结合特性。mRNA的交替剪接可产生截短但具有生物活性的IL-21蛋白。可归因于蛋白水解的变化包括例如在不同类型的宿主细胞中表达时N端或C端的差异，这是由于从IL-21蛋白中蛋白水解去除一个或多个末端氨基酸(通常是从1-10氨基酸)。在一些实施方案中，可修饰蛋白质的末端以改变其物理特性，例如用化学基团如聚乙二醇(Yang等人Cancer 1995.76:687-694)。在一些实施方案中，蛋白质的末端或内部可以用额外的氨基酸修饰(Clark-Lewis等人PNAS1993.90:3574-3577)。
在另一实施方案中，本文定义的方法包括IL-21，其浓度通常为至少0.1ng/mL，例如至少1.0ng/mL(例如0.1ng/mL至1,000ng/mL、1.0ng/mL至100ng/mL、1.0ng/mL至50ng/mL、2ng/mL至50ng/mL、3ng/mL至10ng/mL、4ng/mL至8ng/mL、5ng/mL至10ng/mL、6ng/mL至8ng/mL，例如0.1ng/mL至10ng/mL、1.0ng/mL至5ng/mL、1.0ng/mL至10ng/mL、1.0ng/mL至20ng/mL)。在另一实施方案中，本文定义的方法包括浓度通常低于100ng/mL，例如低于50ng/mL的IL 21。在一些实施方案中，IL-21的浓度约为6ng/mL，例如约6.25ng/mL。
如本文所用，“IL-2”是指天然或重组IL-2或其变体，其作为一种或多种IL-2受体(IL-2R)亚基(例如其突变体、突变蛋白、类似物、亚基、受体复合物、片段、同种型和肽模拟物)。此类试剂可以支持IL-2依赖性细胞系CTLL-2(33；美国典型培养物保藏中心TIB 214)的增殖。如Fujita等人Cell 1986.46.3:401-407所述，成熟的人IL-2以133个氨基酸序列的形式出现(减去信号肽，由另外20个N端氨基酸组成)。IL-2突变蛋白是一种多肽，其中对白介素-2蛋白进行了特异性取代，同时保留了结合IL-2Rβ的能力，例如US2014/0046026所述的那些。IL-2突变蛋白的特征在于在天然IL-2多肽链中或其它残基处的一个或多个位点处的氨基酸插入、缺失、取代和修饰。根据本公开，任何此类插入、缺失、取代和修饰都会产生保留IL-2Rβ结合活性的IL-2突变蛋白。示例性突变蛋白可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸的取代。
编码人IL-2的核酸可以通过常规方法例如聚合酶链式反应(PCR)获得。人IL-2的氨基酸序列(基因标识3558)可在Genbank的登录号NP_000577.2GI：28178861发现。鼠(小家鼠)IL-2氨基酸序列(基因标识16183)可在Genbank登录号NP_032392.1GI：7110653发现。
IL-2还可指涉源自多种哺乳动物物种的IL-2，包括例如人、猿、牛、猪、马和鼠。变体可包含保守取代的序列，这意味着给定的氨基酸残基被具有相似物理化学特征的残基取代。保守取代的实例包括一个脂肪族残基取代另一个，例如Ile、Val、Leu或Ala，或一个极性残基取代另一个，例如在Lys与Arg之间；Glu与Asp之间；或Gln与Asn之间。其它这类的保守取代，例如具有相似疏水性特征的整个区域的取代，是众所周知的。本发明还包括天然存在的IL-2变体。这种变体的实例是由交替的mRNA剪接事件或由IL-2蛋白的蛋白水解切割产生的蛋白质，其中保留了IL-2结合特性。mRNA的交替剪接可产生截短但具有生物活性的IL-2蛋白。可归因于蛋白水解的变化包括例如在不同类型的宿主细胞中表达时N端或C端的差异，这是由于从IL-2蛋白中蛋白水解去除一个或多个末端氨基酸(通常是1-10个氨基酸)。在一些实施方案中，可修饰蛋白质的末端或内部以改变其物理特性，例如用化学基团如聚乙二醇(Yang等人Cancer 1995.76：687-694)。在一些实施方案中，蛋白质的末端或内部可以用额外的氨基酸修饰(Clark-Lewis等人PNAS1993.90:3574-3577)。
在某些实施方案中，本文定义的方法包含IL-2，其浓度通常为至少10IU/mL，例如至少100IU/mL(例如10IU/mL至1,000IU/mL、20IU/mL至800IU/mL、25IU/mL至750IU/mL、30IU/mL至700IU/mL、40IU/mL至600IU/mL、50IU/mL至500IU/mL、75IU/mL至250IU/mL、或100IU/mL至200IU/mL，例如10IU/mL至20IU/mL、20IU/mL至30IU/mL、30IU/mL至40IU/mL、40IU/mL至50IU/mL、50IU/mL至75IU/mL、75IU/mL至100IU/mL、100IU/mL至150IU/mL、150IU/mL至200IU/mL、200IU/mL至500IU/mL、或500IU/mL至1,000IU/mL)。在一些实施方案中，本文定义的方法包括浓度通常低于1,000IU/mL(例如低于500IU/mL)的IL-2。在一些实施方案中，IL-2的浓度约为100IU/mL。
如本文所用，“IL-4”是指天然或重组IL-4或其变体，其作为一种或多种IL-4受体(IL-4R)亚基(例如其突变体、突变蛋白、类似物、亚基、受体复合物、片段、同种型和肽模拟物)。此类试剂可以支持初始辅助T细胞(Th0细胞)向Th2细胞的分化。成熟的人IL-4以129个氨基酸序列的形式出现(减去信号肽，由另外的24个N端氨基酸组成)。IL-4突变蛋白是一种多肽，其中已经对白介素4蛋白进行了特异性取代，同时保留了结合IL-4Rα的能力，例如美国专利第6,313,272号中描述的那些。IL-4突变蛋白的特征在于在天然IL-4多肽链中或其它残基处的一个或多个位点处的氨基酸插入、缺失、取代和修饰。根据本公开，任何此类插入、缺失、取代和修饰都会产生保留IL-2Rα结合活性的IL-4突变蛋白。示例性突变蛋白可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸的取代。
编码人IL-4的核酸可以通过常规方法例如聚合酶炼式反应(PCR)获得。人IL-4的氨基酸序列(基因标识3565)可在Genbank的登录号NG_023252发现。鼠(小家鼠)IL-4氨基酸序列(基因标识16189)可在Genbank的登录号NC_000077.6发现。
IL-4还可指涉源自多种哺乳动物物种的IL-4，包括例如人、猿、牛、猪、马和鼠。变体可包含保守取代的序列，这意味着给定的氨基酸残基被具有相似物理化学特征的残基取代。保守取代的实例包括一个脂肪族残基取代另一个，例如Ile、Val、Leu或Ala，或一个极性残基取代另一个，例如在Lys与Arg之间；Glu与Asp之间；或Gln与Asn之间。其它这类的保守取代，例如具有相似疏水性特征的整个区域的取代，是众所周知的。本发明还包括天然存在的IL-4变体。这种变体的例子是由交替的mRNA剪接事件或由IL-4蛋白的蛋白水解切割产生的蛋白质，其中保留了IL-4结合特性。mRNA的交替剪接可产生截短但具有生物活性的IL-4蛋白。可归因于蛋白水解的变化包括例如在不同类型的宿主细胞中表达时N端或C端的差异，这是由于从IL-4蛋白中蛋白水解去除一个或多个末端氨基酸(通常是1-10个氨基酸)。在一些实施方案中，可修饰蛋白质的末端以改变其物理特性，例如用化学基团如聚乙二醇((Yang等人Cancer 1995.76:687-694)。在一些实施方案中，蛋白质的末端或内部可以用额外的氨基酸修饰(Clark-Lewis等人PNAS1993.90:3574-3577)。
在另外的实施方案中，本文定义的方法包括浓度典型地为至少0.1ng/mL，例如至少10ng/mL(例如0.1ng/mL至1,000ng/mL、1.0ng/mL至100ng/mL、1.0ng/mL至50ng/mL、2ng/mL至50ng/mL、3ng/mL至40ng/mL、4ng/mL至30ng/mL、5ng/mL至20ng/mL、10ng/mL至20ng/mL，例如0.1ng/mL至50ng/mL、1.0ng/mL至25ng/mL、5ng/mL至25ng/mL)的IL-4。在另外的实施方案中，本文定义的方法包括浓度典型地低于100ng/mL(例如低于50ng/mL，特别是低于20ng/mL)的IL-4。在一些实施方案中，IL-4的浓度约为15ng/mL。
本文所述的γδT细胞也可以进行基因工程以增强治疗特性，例如用于CAR-T疗法。这涉及工程化细胞受体的产生，例如嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)，以重新编程具有新特异性的T细胞，例如单克隆抗体的特异性。工程化CAR或TCR可以使T细胞对恶性细胞具有特异性，因此可用于癌症免疫疗法。例如，T细胞可以识别表达肿瘤抗原的癌细胞，例如来自受试者组织中的正常体细胞不表达的肿瘤特异性抗原、与健康体细胞相比优先在癌细胞上过度表达的肿瘤相关的抗原、或在应激事件(例如氧化应激、DNA损伤、紫外线辐射、EGF受体刺激)的环境中所表达的抗原；或用于识别癌细胞与非癌细胞的其它方法。因此，CAR-修饰的T细胞可用于例如癌症患者的过继性T细胞疗法。
因此，在一个实施方案中，本文所述的方法包括转导γδT细胞的组合物以表达感兴趣的表面受体，例如识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)。任何这类的CAR均可用于本发明，包括靶向CD19或其它已知肿瘤相关抗原的CAR。
已经描述了使用血液驻留γδT细胞进行CAR-T疗法。然而，通过本发明的方法获得的非造血γδT细胞可能是CAR-T方法的特别好的载体，因为它们可以用嵌合抗原特异性受体转导，同时保留其识别转化细胞的先天样能力并且可能比血液驻留的γδT细胞或传统的全身性αβT细胞具有更好的肿瘤穿透和滞留能力。此外，它们的MHC依赖性抗原呈现的缺乏降低了移植物抗宿主疾病的可能性，并允许它们锁定表达低量MHC的肿瘤。同样地，它们不依赖于常规的共刺激，例如通过CD28的参与增强了对表达低量共刺激受体的配体之肿瘤的靶向性。
根据本发明的另一方面，提供了一种工程化γδT细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)制备富含γδT细胞的组合物；
(ii)转导所述组合物以表达识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)；和
(iii)培养转导的组合物以扩增工程化的γδT细胞，
其中步骤(ii)和(iii)可以按顺序或同时进行。
在一个实施方案中，步骤(ii)在步骤(iii)之前进行。因此，根据此实施方案，组合物的转导是在不存在任何可能存在于培养物中的饲养细胞的情况下进行的。因此，由于仅转导γδT细胞，用于转导的材料量可能会减少。在一个替代实施方案中，步骤(ii)与步骤(iii)同时进行。根据此实施方案，组合物的转导在培养物中存在任何饲养细胞的情况下进行。因此，虽然与在步骤(iii)之前执行步骤(ii)相比，可能需要增加转导材料的量，但可以理解的是，可以减少操作，从而导致更简单的总体方法和减少损失，这可能是与所述的操作有关。
因此，在一些实施方案中，步骤(iii)包括在饲养细胞存在下培养转导的组合物。在另一实施方案中，根据此方面的方法包括前文所述的任何步骤。
令人惊讶地发现，不像先前已知的T细胞转导方法(所述已知方法包含需要TCR刺激的γδT细胞转导，其通过例如抗CD3抗体(例如OKT-3)或抗γδTCR抗体(例如抗-Vδ1抗体))，富含γδT细胞(特别是源自非造血组织的γδT细胞)的组合物并不需要TCR(T细胞受体)刺激。因此，本文所述的方法包括在不存在TCR刺激的情况下转导γδT细胞的组合物。
在某些实施方案中，使用病毒载体转导组合物。这类病毒载体在本领域中是已知的，并且技术人员将能够根据要转导的细胞识别要使用的合适病毒载体。在一个实施方案中，病毒载体是慢病毒载体或逆转录病毒载体，例如γ逆转录病毒载体。在另一实施方案中，病毒载体是γ逆转录病毒载体，例如鼠干细胞病毒(MSCV)或莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)。在另一实施方案中，病毒载体被假型化为除了水泡性口炎病毒-G(VSV-G)之外的包膜，例如β-逆转录病毒包膜，例如狒狒内源性病毒(BaEV)或RD114。
在一些实施方案中，步骤(ii)使用1×106至1×108TU/ml之间的病毒载体，例如约1×106、约5×106、约1×107、约5×107或约1×108TU/ml的病毒载体进行。在具体实施方案中，步骤(ii)使用1×107TU/ml的病毒载体进行。在其它实施方案中，步骤(ii)使用MOI在0.5与50之间的病毒载体进行，例如MOI为约0.5、约1、约1.5、约2.5、约5、约10、约25、约40或约50。在一个实施方案中，步骤(ii)使用MOI为2.5的病毒载体进行。在另一实施方案中，步骤(ii)使用MOI为5的病毒载体进行。在另一实施方案中，步骤(ii)使用MOI为10的病毒载体进行。
在一个实施方案中，肿瘤相关抗原是与实体瘤相关的抗原。因此，在一些实施方案中，肿瘤和/或癌症是实体瘤。肿瘤坏死家族成员CD70的组成性表达已在血癌和实体癌中得到描述，其中它通过受体CD27发出信号，从而增加肿瘤微环境中肿瘤细胞和调节T细胞的存活率。因此，在另一实施方案中，实体瘤是CD70+肿瘤。应当理解的是，CD70可用于将工程化的γδT细胞靶向所述肿瘤。因此，在另一实施方案中，肿瘤相关抗原是CD70。
在另一实施方案中，肿瘤相关抗原是间皮素。间皮素是一种40kDa的蛋白质，在间皮细胞中表达，并在几种肿瘤中过度表达，包括间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、肺腺癌和胆管癌。因此，它被提议作为一种肿瘤标记物或肿瘤相关抗原，可在免疫治疗中被锁定(Hassan等人Clin.Cancer Res.,2004,10(12):3937-3942)。这些肿瘤中间皮素的表达可能通过细胞粘附促进肿瘤的植入和腹膜扩散(Rump等人,Biological Chemistry,2004,279(10):9190-9198)。
根据本发明的一方面，提供了通过本文所述的方法获得的扩增的γδT细胞群。根据另一方面，提供了通过本文描述的方法获得的工程化的γδT细胞群。
在一些实施方案中，扩增的/工程化的γδT细胞群包含大于50％的γδT细胞，例如大于75％的γδT细胞，特别是大于85％的γδT细胞。在一个实施方案中，扩增的/工程化的群体包含Vδ1细胞，其中少于50％(例如少于25％)的Vδ1细胞表达TIGIT。在一个实施方案中，扩增的/工程化的群体包含Vδ1细胞，其中超过50％(例如超过60％)的Vδ1细胞表达CD27。
通过本文所述的方法获得的扩增的/工程化的γδT细胞群可用作药物，例如用于过继性T细胞疗法。这涉及将获自这些方法的扩增的/工程化的群体转移至患者体内。治疗可以是自体的，即γδT细胞可以被转移回取得它们的同一个患者体内；或治疗可为同种异体的，即来自一个人的γδT细胞可转移至不同的患者体内。在涉及同种异体转移的情况下，扩增的/工程化的群体可能基本上不含αβT细胞。例如，αβT细胞可能会从扩增的/工程化的群体中耗尽，例如在工程化之后，使用本领域已知的任何合适的方法(例如通过阴性选择，例如使用磁珠)。一种治疗方法可包括：提供从供体个体获得的非造血组织样品；扩增和/或工程化如本文所述的γδT细胞以产生扩增的/工程化的群体；并将扩增的/工程化的γδT细胞群施用于受体个体。
待治疗的患者或主体优选是人类癌症患者(例如，正在治疗实体瘤的人类癌症患者)或病毒感染患者(例如CMV感染或HIV感染患者)。在某些情况下，患者患有实体瘤和/或正在接受实体瘤治疗。因为它们通常驻留在非造血组织中，组织驻留Vδ1T细胞也比其全身血液驻留对应物更可能归巢并保留在肿瘤块内，并且这些细胞的过继转移在针对实体瘤和潜在的其它非造血组织相关免疫病理学更有效。
由于γδT细胞是非MHC限制的，其不能将被转移到的宿主识别为外来的，这意味着它们不太可能引起移植物抗宿主疾病。这意味着它们可以“现成”使用并转移到任何受体，例如用于同种异体过继性T细胞治疗。
通过本文所述方法获得的γδT细胞表达NKG2D，并对与恶性肿瘤密切相关的NKG2D配体(例如MICA)作出反应。它们还在没有任何活化的情况下表达细胞毒性特征，因此可能有效杀死肿瘤细胞。例如，如本文所述获得的扩增的/工程化的γδT细胞在没有任何活化的情况下表达IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、CCL4、IL-13、粒溶素(Granulysin)、粒酶A和B以及穿孔素中的一种或多种，优选为全部。IL-17A可能不表达。
因此，本文报告的发现提供了令人信服的证据，证明了将通过本文所述的方法获得的扩增/工程化的γδT细胞作为“现成的”免疫治疗试剂的临床应用的实用性和适用性。与其它T细胞相比，这些细胞具有先天样杀伤能力，没有MHC限制，并且显示出更好的归巢和/或保留在肿瘤内。
在一些实施方案中，治疗在非造血组织中具有实体瘤的个体的方法可包括：扩增/工程化来自如本文所述的个体样品中的γδT细胞以产生扩增的/工程化的群体；并向个体施用扩增的/工程化的γδT细胞群。在替代实施方案中，治疗方法包括扩增/工程化来自如本文所述的不同个体的样品中的γδT细胞以产生扩增的/工程化的群体；并将扩增的/工程化的γδT细胞群施用于患有实体瘤的个体。在一个实施方案中，施用于个体的扩增的/工程化的γδT细胞的量是治疗有效量。
在另一实施方案中，治疗方法和/或治疗有效量包括WO2020095058所公开的内容，其内容整体并入本文。
药物组合物可包括如本文所述的扩增的和/或工程化的γδT细胞以及一种或多种医药学或生理学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。这类组合物可包括缓冲剂，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。可用于本发明药物组合物的冷冻保存溶液包括例如DMSO。可以配制组合物，例如用于静脉内施用。
因此，根据本发明另一方面，提供了包含如本文所述的扩增的γδT细胞群或工程化的γδT细胞群的药物组合物。
在一个实施方案中，药物组合物基本上不含(例如没有)可检测量的污染物，例如内毒素或霉浆菌。
根据本发明的另一方面，提供了用作为药物的如本文所述的扩增的γδT细胞群、工程化的γδT细胞群或药物组合物。在另一方面，提供了用于治疗癌症的如本文所述的扩增的γδT细胞群、工程化的γδT细胞群或药物组合物。
应当理解的是，这里描述的所有实施方案都可以应用于本发明的所有方面。
如本文所用，术语“约”包括比指定的值高至且包含10％以及低至且包含10％，适当地比指定的值高至且包含5％以及低至且包含5％。术语“之间”包括所指定边界的数值。
现在将通过以下实施例并参考前述附图来说明本发明的某些方面和实施方案。
实施例
实施例1：使用饲养细胞扩增皮肤来源的γδ细胞
如先前在WO2020095058和WO2020095059中所述分离皮肤驻留细胞。皮肤驻留淋巴细胞被解冻并立即处理以去除αβT细胞饲养细胞，从而产生富含γδT细胞的培养物。然后在辐照饲养细胞群的存在下扩增αβ耗尽的培养物。在这个实验中试验了来自不同背景的辐照饲养细胞；同种异体外周血淋巴细胞(PBL)、同种异体外周血单核细胞(PBMC)、抗CD3 CD28活化的同种异体PBMC(Act PBMC)或同种异体皮肤分离培养物。然后将共培养物培养7天再收集，并且进行流式分析谱系标记和Ki67核表达。测量γδT细胞的核内Ki67的表达量以及每孔Vδ1γδT细胞的总数。在用辐照皮肤分离细胞作为饲养细胞刺激的培养物中，γδT胞内Ki67表达和Vδ1γδT的细胞总数均为最高，表示γδT细胞增殖。这些结果显示，皮肤驻留淋巴细胞作为饲养细胞成分在驱动皮肤来源的γδT细胞增殖方面优于基于血液的白血球。(图1A-B)
在单独的实验中，皮肤驻留的淋巴细胞被解冻并立刻通过2种不同的选择策略进行处理，以产生富含γδT细胞、αβT细胞耗尽的培养物。通过γδT细胞的阳性选择(图2A-B)或通过通过阳性选择αβT细胞部分的γδT细胞阴性选择富集来进行γδT细胞富集(图3A-B)。然后在不存在αβT细胞作为饲养细胞，或者作为一组起始群体，以非αβT细胞群体相对于自体αβT细胞饲养细胞的百分比表示(在D0时1％、5％、10％、20％或40％非αβ细胞含量，剩余的培养物由自体饲养细胞组成)。对于阳性选择的γδT细胞，主要含有皮肤αβT细胞的阴性部分用作饲养细胞层。在这些实验中，饲养细胞层没有受到辐照。对于阴性选择的γδT细胞，阳性选择的αβT细胞作为饲养细胞层。随后在生长细胞因子IL-15和IL-21的存在下将培养物扩增14天。在D14收集后，记录了CD45淋巴细胞部分的γδT细胞百分比，以及从D0到D14的γδT细胞生长的总增加倍数。结果清楚显示，当培养物中存在饲养细胞时，γδT细胞生长倍数在扩增期间增加。在所有情况下，就整体γδT细胞生长倍数而言，21天的扩增优于14天的扩增。在D0的阴性和阳性γδT细胞富集策略均使饲养细胞和无饲养细胞培养物成功扩增。
实施例2：使用CD19 CAR转导皮肤来源的γδ细胞
在存在IL-15和IL-21的情况下，将皮肤驻留淋巴细胞解冻并培养7天。在第7天，收集所有细胞并用载体转导，所述载体是编码CD19特异性CAR构建体。然后在收集和冷冻保存之前，在有IL-15和IL-21的情况下将细胞再扩增7天。转导干预不影响皮肤驻留γδT细胞的扩增(数据未显示)。对于功能测定，将冷冻保存的细胞解冻并通过阳性选择MACS处理分选αβT细胞，产生阳性选择的皮肤驻留αβT细胞和阴性选择的皮肤驻留γδT细胞。将γδT细胞或αβT细胞群与血液肿瘤细胞系NALM6以各种效应-靶标比例一起共培养。然后将共培养物培养18小时，并通过流式细胞术通过SYTOXTM(Thermofisher)染色来检测靶细胞裂解。CAR转导的皮肤驻留γδT细胞表达出对NALM6细胞系的高功能。这种功能水平与供体匹配的CAR转导皮肤αβT细胞的功能水平相当。(图4)
在单独的实验中，解冻皮肤驻留淋巴细胞并立刻处理，通过MACS对αβT细胞的阳性选择来消耗αβT细胞。在基因工程进行之前，在IL-15和IL-21存在的情况下，将这些αβT细胞耗尽、γδT细胞富集的群体培养2天。2天后，收集培养物并用载体转导，所述载体是编码CD19-特异性CAR构建体的。对于4个供体中的2个，建立了模拟转导培养物，其中细胞经历了相同的转导过程，但没有载体的存在。在转导后，接着将细胞再扩增12天，然后收集它们，通过流式细胞术对谱系和CD19特异性CAR表达进行表型分析，然后冷冻保存。结果指出，转导的γδT细胞表达对CD19特异的CAR构建体，而模拟转导的对照组(在适用的情况下)则不表达(图5A)。此外，一旦将冷冻保存的细胞解冻并在IL-15和IL-21中再培养7天，CAR+γδT细胞的百分比是稳定的(图5B)。冷冻保存的细胞也用于功能测定。将细胞解冻并与血液肿瘤细胞系NALM6一起在不同效应:靶标比例下培养18小时。结果指出，在测试的2个供体中，与匹配的未转导对照组相比，CAR转导的γδT细胞对NAML6的细胞毒性性能有所提高(图6)。
实施例3：使用间皮素-CAR对皮肤来源的γδ细胞进行转导和扩增
将皮肤驻留淋巴细胞解冻并立刻处理以通过使用MACS的αβT细胞的阳性选择来消耗αβT细胞。在基因工程之前，在IL-15和IL-21存在的情况下，将这些αβT细胞耗尽、γδT细胞富集的群体培养2天。在第2天，从培养物中收集细胞并使用编码间皮素特异性CAR构建体的RD-114假型化γ-逆转录病毒载体转导。作为对照，建立了模拟转导培养物，其中细胞经历了相同的转导过程，但没有载体的存在。随后将细胞再扩增12天，然后收集它们，通过流式细胞仪对谱系和CAR表达进行表型分析，然后冷冻保存。转导的细胞表达CAR构建体，而模拟转导对照组则不表达(图7)。解冻后，模拟和CAR转导的细胞组均表达出高存活率(通过NC250活细胞计数测量)(图8A)。
然后将转导的和模拟转导的细胞解冻并且立刻测试对于间皮素表达的实体瘤(腺癌细胞)细胞系(Hela和SCOV-3)的细胞毒性。除了转导的γδT细胞，还测试了用相同接合子(binder)转导并在IL-2中扩增的非供体匹配的PBMC衍生的αβT细胞对相同实体瘤靶细胞系的细胞毒性。以5:1、2.5:1、1.25:1、0.625:1、0.312:1和0.156:1的效应:靶标比例培养细胞。在终点分析之前将细胞毒性共培养物培养18小时。使用CellTitre(Promega)测定系统通过存活目标的计数来确定实体瘤靶细胞的毒性。与模拟转导的对照组相比，CAR转导的γδT细胞展现出提高对HeLa和SCOV-3细胞系的杀伤能力(图8B-C)。由于未转导的γδT细胞对肿瘤细胞系具有一定的活性，因此它们对肿瘤细胞系的细胞毒性与CAR转导的αβT细胞相似。然而，与未转导的γδT细胞和CAR转导的αβT细胞相比，CAR转导的γδT细胞显示出增加的细胞毒性。
实施例4：如实施例1所述将皮肤驻留细胞分离和冷冻。解冻后，通过磁性细胞分选技术(MACS)通过阴性选择来富集γδT细胞，随后与多种不同的自体阳性选择的αβT细胞群共培养，且在培养的第14和21天测量与αβT细胞的共培养对于γδT细胞扩增率的影响。首先，通过MACS通过αβT细胞的耗尽来富集冷冻分离的细胞中的γδT细胞。这产生了未接触的(即未用任何磁性标记的抗体标记)γδ和TCR阴性细胞的群体。然后将这些富含γδT细胞的群体与自体CD4αβT细胞(“CD4饲养细胞”)、CD8αβT细胞(“CD8饲养细胞”)或CD4和CD8αβT细胞两者(“αβ饲养细胞”)共培养。通过阳性标记MACS选择从皮肤驻留细胞中纯化所有饲养细胞层。在所有共培养物中，细胞是以比例为10％γδT细胞富集的群体设置以及其余90％的培养物是由自体饲养细胞层组成，培养物在加有5％异体血浆和80ng/ml IL-15以及11.25ng/ml IL-21的TexMACS培养基中运行。然后将培养物扩增14或21天，并在每个时间点记录每个培养物设置中γδT细胞的扩增。对培养物进行48小时的供料方案为去除50％的培养基并补充加有足以使培养物恢复到初始细胞因子浓度的细胞因子的50％培养基。在D0设置后，并没有再将饲养细胞添加到培养物中。建立了在未添加任何αβ饲养细胞的情况下扩增γδT细胞富集的培养物的对照群体(“仅γδ”)。
当与任何测试的αβT细胞饲养细胞培养物共培养时，γδT细胞扩增倍数得到增强。在培养14天和21天时，利用富集的CD4αβT细胞引起最大增加程度的γδ扩增倍数。结果指出，αβT细胞是作为促进γδT细胞扩增的有效饲养细胞层，CD4αβT细胞在驱动扩增方面优于CD8αβT细胞(图9)。

Claims (54)

1.一种扩增γδT细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)制备富含γδT细胞的组合物；和
(ii)在饲养细胞存在下培养所述组合物，其中所述饲养细胞以至少4:1(饲养细胞:γδT细胞)的比例存在。
2.一种扩增γδT细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)制备富含γδT细胞的组合物；和
(ii)在饲养细胞和包含IL-15和IL-21的培养基存在下培养所述组合物，其中所述饲养细胞以至少3:2(饲养细胞:γδT细胞)的比例存在。
3.一种扩增γδT细胞的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(i)通过αβT细胞的耗尽制备富含γδT细胞的组合物；和
(ii)在饲养细胞存在下培养所述组合物，其中所述饲养细胞以至少3:2(饲养细胞:γδT细胞)的比例存在。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述饲养细胞以至少4:1(饲养细胞:γδT细胞)的比例存在。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述饲养细胞以至少10:1(饲养细胞:γδT细胞)的比例存在。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述饲养细胞以约10:1至约99:1(饲养细胞:γδT细胞)的比例存在。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述饲养细胞包括αβT细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述αβT细胞包括CD4 T细胞。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述饲养细胞另外包括自然杀手(NK)细胞。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述饲养细胞被照射。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述饲养细胞源自非造血组织。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述饲养细胞源自皮肤。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述饲养细胞源自单个供体。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述饲养细胞源自多个供体。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述γδT细胞源自单个供体。
16.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述γδT细胞源自多个供体。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述饲养细胞和所述γδT细胞源自相同的供体。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述饲养细胞和所述γδT细胞源自不同的供体。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述方法包括通过αβT细胞的耗尽从所述扩增的γδT细胞中去除所述饲养细胞。
20.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述方法包括通过阳性选择γδT细胞从所述扩增的γδT细胞中去除所述饲养细胞。
21.一种工程化γδT细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)制备富含γδT细胞的组合物；
(ii)在没有TCR刺激的情况下转导所述组合物以表达识别肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)；和
(iii)培养所述转导的组合物以扩增所述工程化的γδT细胞，
其中步骤(ii)和(iii)可以按顺序或同时进行。
22.根据权利要求21所述的方法，其中步骤(ii)在步骤(iii)之前进行。
23.根据权利要求21所述的方法，其中步骤(ii)与步骤(iii)同时进行。
24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中所述组合物使用病毒载体，例如反转录病毒载体，例如γ反转录病毒载体或慢病毒载体转导。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述病毒载体是γ反转录病毒载体，例如鼠干细胞病毒(MSCV)或莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述病毒载体被假型化为具有除水泡性口炎病毒-G(VSV-G)之外的包膜，例如狒狒内源病毒(BaEV)或RD114的β-逆转录病毒包膜。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的方法，其中步骤(ii)使用1×107TU/ml的病毒载体进行。
28.根据权利要求21至27中任一项所述的方法，其中所述肿瘤抗原是来自受试者组织的正常体细胞不表达的肿瘤特异性抗原。
29.根据权利要求21至27中任一项所述的方法，其中所述肿瘤抗原是与健康体细胞相比优先在癌细胞上过度表达的肿瘤相关抗原。
30.根据权利要求21至27中任一项所述的方法，其中所述肿瘤抗原是在如氧化应激、DNA损伤、UV辐射、EGF受体刺激的应激事件的情况下表达的抗原。
31.根据权利要求21至30中任一项所述的方法，其中所述肿瘤抗原是与实体瘤相关的抗原。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述实体瘤是间皮素+肿瘤。
33.根据权利要求21至32中任一项所述的方法，其中所述肿瘤相关抗原是间皮素。
34.根据权利要求21至33中任一项所述的方法，其中步骤(iii)包括在不存在饲养细胞的情况下培养所述转导的组合物。
35.根据权利要求21至33中任一项所述的方法，其中步骤(iii)包括在存在饲养细胞的情况下培养所述转导的组合物。
36.根据权利要求32所述的方法，所述方法包括根据权利要求1至20中任一项所述的方法的步骤。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中步骤(i)包括从获自起始样品的混合细胞群中耗尽αβT细胞。
38.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中步骤(i)包括从获自起始样品的混合细胞群中阳性选择γδT细胞。
39.根据权利要求37或38所述的方法，其中所述起始样品是人体组织。
40.根据权利要求37至39中任一项所述的方法，其中所述起始样品是非造血组织。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述起始样品是皮肤。
42.根据权利要求1或3至41中任一项所述的方法，其中所述组合物在包括IL-15或IL-21的培养基中培养。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述培养基包括IL-15和IL-21。
44.根据权利要求42或43中任一项所述的方法，其中所述培养基另外包括IL-2和/或IL-4。
45.根据权利要求1至44中任一项所述的方法，其中所述方法包括培养所述组合物7至21天。
46.根据权利要求1至45中任一项所述的方法，其中所述方法包括培养所述组合物约10、11、12、13或14天。
47.根据权利要求1至42中任一项所述的方法，其中扩增所述γδT细胞群提供至少5倍，特别是至少10倍，特别是至少20倍，例如至少50倍，例如至少100倍数量的γδT细胞。
48.根据权利要求1至47中任一项所述的方法，其中所述方法包括冷冻所述扩增的γδT细胞。
49.一种扩增的γδT细胞群，所述细胞群是可获得的，例如通过权利要求1至20或36至48中任一项所述的方法获得。
50.一种工程化的γδT细胞群，所述细胞群是可获得的，例如通过权利要求21至48中任一项所述的方法获得。
51.一种药物组合物，所述药物组合物包括根据权利要求48所述的扩增的γδT细胞群或根据权利要求50所述的工程化的γδT细胞群。
52.根据权利要求49所述的扩增的γδT细胞群、根据权利要求50所述的工程化的γδT细胞群或根据权利要求51所述的药物组合物，其用作为药物。
53.根据权利要求49所述的扩增的γδT细胞群、根据权利要求50所述的工程化的γδT细胞群或根据权利要求51所述的药物组合物，其用于治疗癌症。
54.根据权利要求53所述使用的扩增的γδT细胞群、工程化的γδT细胞群或药物组合物，其中所述癌症是实体瘤。
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