CN102775501A - 用于肿瘤治疗的白细胞介素21(il-21)药物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及肿瘤治疗领域。本发明涉及使用白细胞介素21与抗Her2/neu的单链抗体的融合蛋白治疗乳腺癌。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤治疗领域。具体地，本发明涉及将白细胞介素-21用于治疗肿瘤。更具体地，本发明涉及使用白细胞介素21与抗Her2/neu的单链抗体的融合蛋白治疗乳腺癌。
背景技术
机体免疫在肿瘤发生和发展过程中起着重要作用，近几年研究发现机体的抗肿瘤免疫反应对常规的肿瘤放疗、化疗的治疗效应也起着重要作用。肿瘤放疗和化疗导致肿瘤细胞大量死亡，释放肿瘤抗原和系列“危险信号”，激活机体先天免疫信号通路，促进抗原递呈细胞对抗原的摄取、加工和递呈，诱发和增强机体抗肿瘤免疫反应。诱发的机体内在抗肿瘤免疫反应对清除残存的肿瘤细胞和肿瘤灶、抑制残存的肿瘤细胞和肿瘤灶的生长、防止肿瘤复发起着决定性作用[1，2，3]。
肿瘤抗体靶向治疗，以其高特异性、低毒性作用以及和化疗之间很好的协同作用而成为快速发展的肿瘤治疗方法。抗HER2/neu抗体是其中的一个典型代表，传统认为其肿瘤治疗机制[4，5]是通过阻断或抑制HER2/neu受体的胞内信号，以及抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)来杀伤肿瘤细胞，或抑制肿瘤细胞生长。本发明的申请人最新研究发现抗HER2/neu抗体的肿瘤治疗效应还依赖于机体的先天和获得性免疫反应[6]。抗HER2/neu抗体在临床上主要与化疗药联合应用，对HER2/neu+肿瘤患者具有良好治疗效果，存在的主要问题是抗性肿瘤细胞的产生和高复发率。本发明的申请人在小鼠移植乳腺癌模型中对抗HER2/neu抗体和化疗的不同联合应用方案进行研究，发现虽然两者联合应用能够显著促进原位肿瘤的消退，但与单独抗体治疗或先用化疗后用抗体的联合治疗方案相比，先用抗体后用化疗的联合治疗方案明显降低机体产生的记忆性抗肿瘤免疫反应，能够抑制治愈小鼠对肿瘤再攻击的免疫保护作用，可能促进肿瘤复发。
由于机体免疫系统在肿瘤发生和发展中的重要作用，肿瘤免疫治疗一直是肿瘤研究的一个热点，产生了各种旨在增强抗肿瘤免疫反应(主要是T细胞免疫反应)的肿瘤免疫治疗策略和方法。绝大多数免疫治疗对小的动物移植肿瘤具有良好的治疗效果，但对移植肿瘤晚期或者原发肿瘤治疗效果却不理想，临床试验的肿瘤治疗效果更不如人意[7]。虽然肿瘤常规治疗诱发的机体内源性抗肿瘤免疫反应对清除残存的肿瘤细胞和肿瘤灶、抑制残存的肿瘤细胞和肿瘤灶的生长具有重要作用，但对大多数肿瘤病人来讲，并不能完全彻底清除肿瘤细胞，不能防止肿瘤最终的复发。大量研究显示，肿瘤细胞在发生和发展过程中，逐步建立起肿瘤微环境，以利于、或者促进肿瘤生长，同时抑制机体的抗肿瘤反应。造成这一局面的主要的原因是肿瘤免疫抑制微环境对抗肿瘤免疫反应的抑制作用[8]。肿瘤免疫抑制微环境是肿瘤细胞为了生存和发展，在逃逸肿瘤免疫监视的基础上，为了对抗机体抗肿瘤免疫反应，充分利用机体免疫系统自身的负调控机制，在肿瘤微环境中建立的全方位免疫抑制网络。它是一个在抗肿瘤免疫选择压力作用下的动态免疫抑制网络，是随抗肿瘤免疫反应的变化而变化。无论是肿瘤疫苗免疫、抗体治疗、还是肿瘤反应性淋巴细胞过继治疗等，仅单方面的诱发和增强抗肿瘤免疫反应，肿瘤细胞会在抗肿瘤免疫压力作用下发生变化和调整，发生免疫逃逸，并增强相应的免疫抑制信号，最终在另一层面建立起足以抑制抗肿瘤免疫、使肿瘤细胞不被杀伤的免疫抑制微环境。因此，只增强抗肿瘤免疫，而不改善或解除肿瘤免疫抑制，就难以取得良好的治疗效果。大量研究证据显示，无论是肿瘤快速生长期，还是肿瘤发展晚期，荷瘤机体内均有抗肿瘤免疫反应的存在，但是被肿瘤免疫抑制微环境不同程度地控制。越来越多靶向肿瘤免疫抑制机制的研究结果，说明了肿瘤免疫抑制微环境对促进肿瘤发展和抵抗肿瘤治疗效应的关键作用。
巨噬细胞是肿瘤免疫抑制微环境的重要组成成分，已有大量研究显示，肿瘤组织巨噬细胞的浸润与肿瘤病人不良预后相关，不仅肿瘤组织中浸润巨噬细胞(又称为肿瘤相关巨噬细胞(TAM))的数量，而且TAM的表型和功能对肿瘤的发生、发展、以及化疗的敏感性具有重要调节作用[9，10，11]。根据表型和功能，巨噬细胞传统上被分为M1和M2型。在静止不发展的肿瘤、或者回缩肿瘤组织中，TAM表现为M1型，具有促炎、抗原递呈和肿瘤杀伤活性，起着抗肿瘤作用；而在进展的恶性肿瘤组织中，TAM主要表现为M2型，具有促进肿瘤血管生成、肿瘤细胞的侵袭和生长，以及抑制抗肿瘤免疫反应，起着促进肿瘤生长、转移的作用[11]。TAM在表型和功能上表现为不同的亚群，可以随着肿瘤组织环境的改变而发生变化，也可以通过免疫调控将TAM向不同亚群分化。本发明的申请人在小鼠乳腺癌移植模型中研究发现，随着肿瘤生长，肿瘤组织中浸润的巨噬细胞数量和比例急剧增加，功能和表型表现为典型的M2型，而其它免疫和炎症细胞的数量和比例变化不大。由于TAM在肿瘤发生发展中起着非常重要的作用，TAM一直是肿瘤治疗研究的靶点，诱导TAM由M2向M1型分化(即TAM的极化)一直是肿瘤治疗研究的一个重要方向[12，13，14]。
白细胞介素21(IL-21)是一种主要由CD4+T细胞产生的I类细胞因子，它的受体是由IL-21受体(IL-21R)和共同的γ链组成的异源二聚体。IL-21通过与靶细胞上受体的结合，激活胞内信号，在先天和获得性免疫反应中发挥多种生物学效应。已知IL-21可以促进B细胞、CD8+T细胞和NK细胞的分化，增强抗体反应、以及CD8+T细胞和NK细胞的反应和效应功能。已有研究发现全身系统性给予IL-21可以增强CD8+T细胞和NK细胞的反应和效应功能发挥抗肿瘤作用[15，16，17]，但肿瘤治疗效应不很理想。本发明发现通过肿瘤特异性单链抗体将IL-21靶向肿瘤组织，可以将促进肿瘤生长的M2型肿瘤相关巨噬细胞分化成具有抗肿瘤作用的M1型巨噬细胞，改善肿瘤组织微环境，从而显著增强机体抗肿瘤免疫反应，极大提高目前肿瘤常规治疗的疗效，防止肿瘤复发。
发明内容
本发明公开了IL-21新的生物学功能，IL-21可以诱导肿瘤组织中肿瘤相关巨噬细胞(TAM)由M2向M1型分化。靶向肿瘤组织的IL-21能减少肿瘤组织巨噬细胞的数量，同时能将TAM由M2极化为M1，消除TAM对T细胞反应的抑制作用，减少巨噬细胞促血管生成因子(VEGF)、免疫抑制因子(TGF-β、IL-10等)的产生，显著改善肿瘤免疫抑制微环境，发挥极强的抗肿瘤作用。
基于IL-21新的生物学功能，通过本说明书中公开的方法把IL-21靶向到肿瘤组织，改善肿瘤组织免疫抑制微环境，显著增强目前肿瘤常规治疗的疗效。
本发明通过基因工程方法将IL-21与抗HER2/neu的单链抗体构建成融合蛋白IL-21/scFv(neu)，与抗HER2/neu抗体联合应用，显著增强抗HER2/neu抗体的肿瘤治疗效果，防止肿瘤复发。
本发明除了通过基因工程方法把IL-21与抗肿瘤组织细胞的单链抗体或抗体构建成融合蛋白，还包括其它将IL-21靶向肿瘤组织，作用于肿瘤浸润巨噬细胞的方法，包括：把IL-21重组到融瘤病毒载体；通过转染建立表达IL-21的肿瘤特异性T细胞；通过纳米技术制备IL-21纳米颗粒。
更具体地，本发明提供以下各项：
1.一种融合蛋白，其包含白细胞介素21与抗肿瘤组织细胞的单链抗体的氨基酸序列。
2.第1项所述的融合蛋白，其中所述抗肿瘤组织细胞的单链抗体是抗Her2/neu的单链抗体。
3.第2项所述的融合蛋白，其中所述白细胞介素21的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述抗Her2/neu的单链抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。
4.第3项所述的融合蛋白，其中所述白细胞介素21与所述抗Her2/neu的单链抗体之间通过连接体相连。
5.第4项所述的融合蛋白，其中所述连接体的氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示。
6.第5项所述的融合蛋白，所述融合蛋白在所述抗Her2/neu的单链抗体的C端还含有氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的Ig Fc。
7.第6项所述的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：7所示。
8.编码第1-7项中任一项所述的融合蛋白的核苷酸序列。
9.第1-7项中任一项所述的融合蛋白在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
10.第9项所述的用途，其中所述肿瘤为乳腺癌。
11.第10项所述的用途，其中所述药物与抗Her2/neu抗体一起施用。
12.一种用于治疗乳腺癌的试剂盒，所述试剂盒包含第1-7项中任一项所述的融合蛋白和抗Her2/neu抗体。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
附图说明
图1.局部IL-21治疗增强抗HER2/neu抗体的治疗效果：(A)Balb/c小鼠皮下接种8x105Tubo肿瘤细胞，分为4组，每组5只小鼠，抗HER2/neu抗体+IL-21组：在第16天腹腔注射100μg抗HER2/neu抗体，在第16天和第19天，瘤内注射5μg IL-21蛋白；抗HER2/neu抗体组：在第16天腹腔注射100μg抗HER2/neu抗体，在第16天和第19天，瘤内注射等体积PBS；IL-21组：在第16天和第19天，瘤内注射5μgIL-21蛋白；PBS组：在第16天腹腔注射等体积PBS做为对照，定期用游标卡尺测量肿瘤的两个垂直直径，按0.5×[长(cm)×宽(cm)×宽(cm)]计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。(B)给(HER2/neu x Balb/c)F1小鼠皮下接种1x106Tubo肿瘤细胞，小鼠分为两组，每组5只小鼠，在肿瘤接种后的第18天，两组小鼠腹腔注射100μg抗HER2/neu抗体，在第18天和第20天，一组小鼠瘤内注射5μgIL-21蛋白，另一组小鼠瘤内注射等体积PBS，定期用游标卡尺测量肿瘤的两个垂直直径，按0.5×[长(cm)×宽(cm)×宽(cm)]计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线；
图2.局部IL-21治疗诱导M2型肿瘤相关巨噬细胞向M1型转化：(A-B)给Balb/c小鼠皮下接种8x105Tubo肿瘤细胞，在接种后的第15天，瘤内注射10μg IL-21蛋白，5天后，取肿瘤组织，进行流式染色，分析各种淋巴细胞亚群占CD45+细胞的比例。(C)用流式细胞仪分选出肿瘤浸润的巨噬细胞(Ly6c-GR-1-F4/80+CD11c+)，实时定量PCR检测各种M1型(下排)和M2(上排)型细胞因子的表达，内参为β肌动蛋白(β-actin)。(D)流式细胞仪分选出肿瘤浸润的巨噬细胞，在体外与CFSE标记的淋巴细胞以1∶3的比例共孵育72小时，同时用CD3和CD28激活抗体刺激。三天后，用流式检测淋巴细胞的增殖情况，图上分别标出增殖细胞群与未增殖细胞群。左图为代表性的流式结果，右图为增殖细胞的统计结果；
图3.IL-21直接作用于巨噬细胞向M1型极化(A)给Balb/c小鼠腹腔注射5μg无LPS的IL21蛋白或生理盐水，18小时后，取腹腔巨噬细胞，实时定量PCR检测巨噬细胞分泌M2型细胞因子的水平。(B-C)取Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞，加入培养皿中贴壁过夜后，去掉悬浮的细胞，加100ng/ml的IL-21培养过夜(B)，或加100ng/ml的IL-21培养4小时后，移走上清，加入低剂量50ng/ml LPS短时间刺激4小时(C)，实时定量PCR检测巨噬细胞分泌M2型细胞因子的水平。(D)给Balb/c小鼠皮下接种Tubo肿瘤细胞，接种后第20天取肿瘤组织，流式分选肿瘤浸润巨噬细胞(CD11b+F4/80+CD11c+)，在100ng/ml IL-21的条件下培养过夜，实时定量PCR检测细胞因子的表达。以上内参为β-actin；
图4.融合蛋白IL-21/scFv(neu)可以增强HER2/neu抗体的治疗效果，防止肿瘤复发(A)IL-21/scFv(neu)融合蛋白的构建图谱：由IL-21、G10S3连接体(linker)、抗HER2/neu单链抗体(scFv)和IgG的Fc段组成；(B)融合蛋白IL-21/scFv(neu)可以结合到HER2/neu阳性的Tubo细胞表面，红色为不加融合蛋白只加二抗的对照。(C)低剂量融合蛋白可以增强HER2/neu抗体的治疗效果；(D)融合蛋白IL-21/scFv(neu)与抗HER2/neu抗体对免疫耐受肿瘤的联合治疗，(*p＜0.05)。
具体实施方式
实施例中所用的实验材料
(1)实验动物
Balb/c小鼠：SPF级Balb/c雌性小鼠，6到8周，购于维通利华实验动物技术有限公司。
HER2/Neu转基因小鼠：为FVB遗传背景，购自美国Jackson Lab。因为所用的乳腺癌细胞Tubo来自Balb/c遗传背景小鼠，我们将HER2/Neu转基因小鼠与Balb/c小鼠交配，得到的(HER2/Neu x Balb/c)F1代小鼠用于Tubo肿瘤细胞的移植试验。正常小鼠接种外来肿瘤细胞建立的小鼠肿瘤模型，并不能很好反映临床病人自发的肿瘤，因为这种小鼠对肿瘤抗原没有免疫耐受，容易产生良好的抗肿瘤免疫反应；而肿瘤病人的肿瘤来自自身，对其肿瘤抗原往往产生一定程度的免疫耐受，不容易产生抗肿瘤免疫反应。HER2/Neu转基因小鼠自身表达高水平HER2/neu抗原，对HER2/Neu抗原免疫耐受，接种HER2/Neu+的乳腺癌细胞，更能模拟乳腺癌病人的免疫状况。
(2)细胞
Tubo细胞来自于Balb/c背景的HER2/neu转基因小鼠，将该小鼠自发的乳腺癌细胞建成稳定的细胞系[18]。该细胞系高表达大鼠原癌基因HER2/neu，且突变的HER2/neu分子可持续性的激活下游信号，促进细胞的增殖和癌变。
3T3KB细胞株稳定表达MHCI和共刺激分子B7.1，通过用表达MHCI和B7.1的质粒共转染3T3细胞(购自ATCC，CCL-92TM)建立而成[6]。3T3NKB则稳定表达HER2/neu，同时也表达MHCI和共刺激分子B7.1，其通过用表达MHCI、B7.1和HER2/neu的质粒共转染3T3细胞建立而成[6]。
(3)抗体
抗HER2/neu抗体(克隆号：7.16.4)：与Tubo细胞上的HER2/neu分子结合，抑制肿瘤的生长[19]，该抗体利用杂交瘤细胞制备(所用杂交瘤及所用方法参见[20])。
流式染色抗体：Anti-CD45-PacificBlue、Anti-CD11b-FITC、Anti-CD11c-PE、Anti-F4/80-PEcy7、Anti-Gr1-Percp cy5.5、Anti-Ly6c-APCcy7、anti-FcR均购于Biolegend公司(美国)。CD4、CD8、CD49b(DX5)抗体购于BD Pharmingen公司(美国)。
活化细胞的功能性抗体：Anti-CD3、Anti-CD28抗体购于BDPharmingen公司(美国)。
(4)PCR所用引物：
实验方法：
①肿瘤组织单细胞悬液制备：将肿瘤组织置于含2％胎牛血清(FBS)(Hyclone)的DMEM培养基(GIBCO)中剪碎，加入0.1％胶原酶IV(Sigma)37℃消化20分钟，用磨砂玻璃片轻轻研磨，用不含FBS的DMEM培养基洗两遍，重悬于含2％FBS的DMEM培养基，过40μm筛网，制成单细胞悬液，计数。
②流式细胞分析：每个样本取1x106细胞，重悬于100μl FACS缓冲液(PBS溶液中加入0.1％NaN3、2％FBS)中，加入5μl anti-FcR抗体与细胞共孵育10min封闭FcR，然后加入相应抗体，于4℃染色30min，用FACS缓冲液洗两遍，300ul 1％多聚甲醛溶液重悬标记后的细胞，48小时内FACS Calibu流式仪(BD Bioscience)检测，流式数据用Cellquest或Flowjo 5.7软件分析。
③定量RT-PCR检测巨噬细胞中细胞因子表达：将流式分选的细胞以1500rpm离心5分钟，充分移除上清，使用RNeasy Micro Kit(cat74004，QIAGEN)抽提细胞总RNA，使用
M-MuLV First Strand cDNASynthesis Kit(E6300，NEB)逆转录合成cDNA，并调整至合适的浓度；使用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪，检测细胞因子的表达；选用β-actin和18s做为内参，用Δ-ΔCt方法处理数据。
qPCR扩增体系(20μl)：
上下游引物(10μM)各0.5μl；
2×TransStartTM Eco Green qPCR SuperMix(TransGen Biotech)10μl；
cDNA 2μl；ddH2O 7μl
qPCR反应条件：
95℃30秒
95℃5秒
55℃退火5秒
72℃延伸5秒，
共35个循环
④肿瘤巨噬细胞对T细胞增殖的抑制：取6-8周龄Balb/c小鼠颈椎脱臼致死，取小鼠腹股沟，腋下，肠系膜等处淋巴结，用玻片轻轻研磨分散细胞，过筛网，离心后收集细胞。以终浓度5μMCFSE(C1157，Invitrogen)标记细胞，37℃水浴5-10分钟，以预冷PBS洗一遍，用10％FBS 1640完全培养基(GIBCO)重悬细胞，计数。将细胞以1×105/孔铺圆底96孔板，加入终浓度为1-2μg/ml Anti-CD3抗体和0.5μg/ml Anti-CD28抗体刺激。将上述实验方法①制备的肿瘤组织单细胞悬液用抗CD45、CD11b、F4/80、CD11c、Gr1、Ly6C的荧光抗体标记，流式分选CD45+CD11b+Gr1-Ly6C-F4/80+CD11c+肿瘤巨噬细胞。将分选所得的肿瘤巨噬细胞以1∶3或1∶5(巨噬细胞/T细胞)比例加入到上述96孔细胞培养板中，在37℃CO2培养箱共孵育3天，收集细胞，用抗CD8mAb染色，流式细胞术检测CD8细胞CFSE，以确定细胞增殖情况。
实施例1.肿瘤内注射IL-21显著增强抗HER2/neu抗体的肿瘤治疗效果：
给正常野生型Balb/c小鼠(图1A)或HER2/neu抗原免疫耐受的(HER2/neu x Balb/c)F1小鼠(图1B)接种肿瘤，待肿瘤长到一定大小给予抗HER2/neu抗体治疗，同时给予肿瘤注射重组IL-21蛋白(Pepro Tech)进行联合治疗，可以显著增强抗HER2/neu抗体的肿瘤治疗效果。
具体实验方法：
(1)给正常Balb/c小鼠皮下接种8×105Tubo肿瘤细胞，分为4组，每组5只小鼠，抗HER2/neu抗体+IL-21组：在第16天腹腔注射100μg抗HER2/neu抗体，在第16天和第19天，瘤内注射5μg IL-21蛋白(Pepro Tech)；抗HER2/neu抗体组：在第16天腹腔注射100μg抗HER2/neu抗体，在第16天和第19天，瘤内注射等体积PBS；IL-21组：在第16天和第19天，瘤内注射5μg IL-21蛋白；PBS组：在第16天腹腔注射等体积PBS作为对照，定期用游标卡尺测量肿瘤的两个垂直直径，按0.5×[长(cm)×宽(cm)×宽(cm)]计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，结果见图1A。
(2)给(HER2/neu x Balb/c)F1小鼠皮下接种1x106Tubo肿瘤细胞，小鼠分为两组，每组5只小鼠，在肿瘤接种后的第18天，两组小鼠腹腔注射100μg抗HER2/neu抗体，在第18天和第20天，一组小鼠瘤内注射5μg IL-21蛋白，另一组小鼠瘤内注射等体积PBS，定期用游标卡尺测量肿瘤的两个垂直直径，按0.52×[长(cm)×宽(cm)]计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线，结果见图1B。
实施例2.瘤内注射IL-21诱导肿瘤相关巨噬细胞向M1型极化，显著改善肿瘤免疫抑制微环境：
给荷瘤小鼠瘤内注射IL-21，显著减少肿瘤组织中巨噬细胞比例(图2A)，增加抗肿瘤效应细胞(NK、CD8+T细胞)的比例(图2B)；诱导肿瘤浸润巨噬细胞低表达M2型巨噬细胞因子CCL17、IL-10、TGF-β、VEGF等，高表达M1型巨噬细胞因子CXCL9、Nos2等(图2C)；消除TAM对T细胞增殖的抑制作用(图2D)。
具体实验方法：
(1)肿瘤组织中细胞亚群的分析：给Balb/c小鼠皮下接种8×105Tubo肿瘤细胞，在接种后的第15天，瘤内注射10μg IL-21蛋白(PeproTech)，5天后，取肿瘤组织，按照实验方法①制备肿瘤组织单细胞悬液，按照实验方法②，分别利用以下荧光标记抗体进行染色和流式细胞分析：Anti-CD45-PacificBlue(抗CD45)、Anti-CD11b-FITC(抗CD11b)、Anti-CD11c-PE(抗CD11c)、Anti-F4/80-PEcy7(抗F4/80)、Anti-Gr1-Percp cy5.5(抗Gr1)、Anti-Ly6c-APCcy7(抗Ly6c)、抗CD4抗体、抗CD8抗体、抗CD49b(DX5)抗体。肿瘤浸润的细胞亚群按下列表面标记分析：
巨噬细胞：CD45+CD11b+Gr1-Ly6C-F4/80+CD11c+
粒细胞性MDSC：CD45+CD11b+Gr1hiLy6ClowF4/80-CD11c-
单核细胞性MDSC：CD45+CD11b+Gr1lowLy6ChiF4/80-CD11c-/+
CD8+T细胞：CD45+CD3+CD8+
CD4+T细胞：CD45+CD3+CD4+
NK细胞：CD45+CD3-DX5+
(2)定量RT-PCR检测巨噬细胞中细胞因子表达：将上述制备的肿瘤组织单细胞悬液荧光抗体标记后，流式分选表型为CD11b+F4/80+CD11c+的肿瘤侵润巨噬细胞，按照实验方法③进行定量PCR，检测细胞中VEGF、IL-10、TGF-β、CCL2、CCL-17、CXCL-9、Nos2因子的表达。
(3)肿瘤巨噬细胞对T细胞增殖的抑制：取6-8周龄Balb/c小鼠颈椎脱臼致死，取小鼠腹股沟，腋下，肠系膜等处淋巴结，用玻片轻轻研磨分散细胞，过筛网，离心后收集细胞。以终浓度5μMCFSE(C1157，Invitrogen)标记细胞，37℃水浴5-10分钟，以预冷PBS洗一遍，用10％FBS 1640完全培养基(GIBCO)重悬细胞，计数。将细胞以1×105/孔加到圆底96孔板，加入终浓度为1-2μg/ml抗CD3抗体和0.5μg/ml抗体CD28抗体刺激。将上述(2)流式分选的CD11b+F4/80+CD11c+肿瘤巨噬细胞以1∶3或1∶5(巨噬细胞/T细胞)比例加入到上述96孔细胞培养板中，在37℃CO2培养箱共孵育3天，收集细胞，用抗CD8抗体染色，流式细胞术检测CD8细胞CFSE，以确定细胞增殖情况。
实施例3.IL-21直接诱导巨噬细胞向M1型分化：
为了证明瘤内注射IL-21诱导肿瘤相关巨噬细胞向M1型极化是IL-21对巨噬细胞直接作用的结果，我们首先证明小鼠腹腔注射IL-21，也能显著抑制腹腔巨噬细胞表达M2型巨噬细胞因子CCL17、IL-10、TGF-β、Mrc-1(图3A)；在此基础上，我分离小鼠腹腔巨噬细胞在体外和IL-21共培养，培养过夜即可显著抑制腹腔巨噬细胞M2型巨噬细胞因子VEGF、TGF-β的表达(图3B)；此外，IL-21也能显著增加LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞体外分泌炎症细胞因子TNF-β和IL-6的分泌(图3C)；IL-21直接作用于M2型肿瘤浸润巨噬细胞，可以快速诱导其向M1型分化(图3D)。这些结果说明：IL-21可以直接作用于巨噬细胞，诱导巨噬细胞由M2型向M1型分化。
具体实验方法：
(1)IL-21诱导小鼠腹腔巨噬细胞向M1型分化：给Balb/c小鼠腹腔注射重组IL21蛋白(Pepro Tech)或生理盐水，18小时后，用含20％蔗糖的PBS冲洗腹腔，收集腹腔细胞，按照实验方法③进行定量PCR，检测腹腔细胞中IL-10、TGF-β、CCL-17、Mrc-1因子的表达。
(2)用含20％蔗糖的PBS冲洗腹腔，收集腹腔细胞，加入细胞培养皿中贴壁过夜后，去掉悬浮的细胞，加100ng/ml的IL-21培养过夜，然后收集细胞，按照实验方法③进行定量PCR，检测腹腔细胞中IL-10、TGF-β、VEGF、Mrc-1因子的表达。
(3)用含20％蔗糖的PBS冲洗腹腔，收集腹腔细胞，在体外贴壁过夜后，去掉悬浮的细胞，加100μg/ml的IL-21培养4小时后，移走上清，加入低剂量50ng/ml LPS(sigma)短时间刺激4小时，按照实验方法③进行定量PCR，检测腹腔细胞中IL-6、TNF-β因子的表达。
(4)给Balb/c小鼠皮下接种Tubo肿瘤细胞，接种后第20天取肿瘤组织，按照实施例2流式分选肿瘤浸润巨噬细胞(CD11b+F4/80+CD11c+)，在100ng/ml IL-21的条件下培养过夜，按照实验方法③进行定量PCR，检测肿瘤巨噬细胞中IL-10、TGF-β、VEGF、Mrc-1、CCL2、CCL17因子的表达。
实施例4.融合蛋白IL-21/scFv(neu)肿瘤靶向治疗增强抗HER2/neu抗体的肿瘤治疗效果，防止肿瘤复发
为了将IL-21靶向肿瘤局部，我们构建并表达了一种新型蛋白：IL-21/scFv(neu)，由细胞因子IL-21(氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示)与抗HER2/neu的单链抗体(抗HER2/neu ScFv，氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示)融合而成，两者之间有连接体G10S3(氨基酸序列如SEQID NO：3所示)，在抗HER2/neu ScFv的C端还连接有IgG的Fc段(氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示)用于蛋白纯化，同时可增强IL-21/scFv(neu)融合蛋白的生物学功能(图4A)。IL-21/scFv(neu)蛋白可以有效的结合在HER2/neu+的肿瘤细胞系Tubo上(图4B)。首先，我们检测IL-21/scFv(neu)是否能提高抗HER2/neu抗体的治疗效果，抑制肿瘤的生长和复发。给BALB/c小鼠皮下接种Tubo肿瘤细胞，待肿瘤长到超过150mm3，给小鼠腹腔注射低剂量(25μg)的融合蛋白IL-21/scFv(neu)或PBS，两天后，腹腔注射抗HER2/neu抗体100μg，监测肿瘤的生长。结果发现，低剂量融合蛋白确实可以显著的改善机体对抗HER2/neu抗体的反应，增强其治疗效果，抑制肿瘤的复发(图4C)。
为了进一步鉴定融合蛋白IL-21/scFv(neu)的临床肿瘤治疗价值，我们采用了HER2/neu转基因小鼠的肿瘤移植模型。给(HER2/neu xBalb/c)F1小鼠皮下接种8x105肿瘤细胞Tubo，等肿瘤长200mm3左右，分别在第19天和第22天腹腔注射100μg抗HER2/neu抗体。在第32天和第42天，分为腹腔注射100μg的抗HER2/neu抗体、IL-21/scFv(neu)融合蛋白或PBS作为对照，监测肿瘤生长。结果发现，融合蛋白IL-21/scFv(neu)显著提高抗HER2/neu抗体对免疫耐受肿瘤的治疗效果，防止肿瘤的复发(图4D)。综上所述，融合蛋白IL-21/scFv(neu)联合HER2/neu抗体显著地抑制了肿瘤的生长和复发，在临床上有很好的应用前景。
具体实验方法：
(1)克隆IL-21基因：取野生型Balb/c小鼠脾脏置于DMEM培养基中，用玻片磨砂端轻轻研磨，使细胞分散，过筛网，400xg离心5分钟，弃上清，加入1ml ACK红细胞裂解液(0.16M NH4Cl，0.17M Tris，HCI调pH至7.21)裂解2分钟，加入含10％FBS培养基终止反应，离心后重悬细胞，计数。体外用5μg/ml抗CD3抗体刺激三天，收集细胞，参照实验方法③进行RNA提取和cDNA合成，PCR扩增IL-21基因片段。扩增IL-21基因的引物为：上游引物：5’GGAG ACTCAGTT3’；下游引物：5’GGGAATCTTCTCGGATCCTC3’，所扩增的IL-21编码基因序列如SEQ IDNO：5所示。
(2)利用通用简并引物，通过RT-PCR从抗HER2/neu抗体(克隆号：7.16.4)的杂交瘤细胞[20]克隆抗HER2/neu单链抗体(scFv)的基因片段，用Hind III(NEB公司)和EcoR I酶(NEB公司)消化，连接到质粒pSecTag2A(Invitrogen，货号V900-20)的Hind III和EcoR I酶之间，构建成表达质粒pSecTag2A ScFv。用上游引物为5’TCAGGTGGATCCGGTTCTGGAGGTGGAGATATCACGCAGTCTC3’下游引物为5’AATTGCTAGCCTAGACAGATGGGGGTGTT3’，从质粒pSecTag2A ScFv上，用PCR扩增抗HER2/neu ScFv基因片段，所扩增的抗HER2/neu scFv基因片段序列如SEQ ID NO：6所示。
(3)融合蛋白IL-21/scFv(neu)载体构建和表达：通过重叠PCR将上述IL-21与抗HER2/neu ScFv基因片段通过G10S3(Linker)融合成IL-21/scFv(neu)，重叠PCR所用的四条引物分别为：IL-21上游5’AGTAGAATTCATGGAGAGGACCCTTGTCTGTCT3’下游5’CCGGATCCACCTGATCCACCTCCAGGAGAGATGCTGATGA3’；scFv 上 游5’TCAGGTGGATCCGGTTCTGGAGGTGGAGATATCACGCAGTCTC3’和下游5’AATTGCTAGCCTAGACAGATGGGGGTGTT3’，最后将IL-21/scFv(neu)融合片段用EcoRI(NEB公司)和NheI(NEB公司)限制性内切酶处理，与经过同样内切酶处理的pIgFc载体连接，使IL-21/scFv(neu)片段与小鼠IgG的Fc段融合[21]。用转染试剂Fugene6转染试剂(Boehringer-Mannheim，Mannheim，Germany)参照试剂说明书，将构建的表达载体转染293T细胞，收集培养上清，用protienG-Sepharose柱(Pharmacia，Uppsala，瑞典)纯化IL-21/scFv(neu)融合蛋白。所构建的IL-21/scFv(neu)融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
(4)融合蛋白IL-21/scFv(neu)的鉴定：将5μg融合蛋白IL-21/scFv(neu)与Tubo细胞4℃孵育30分钟，洗去不结合的蛋白后加入二抗抗大鼠IgG-FITC(BD Pharmingen)孵育30分钟后，洗去未结合抗体，用流式细胞仪检测IL-21/scFv(neu)融合蛋白与HER2/neu+肿瘤细胞Tubo的结合。
(5)低剂量融合蛋白IL-21/scFv(neu)与HER2/neu抗体联合肿瘤治疗：给Balb/c小鼠接种8x105肿瘤细胞Tubo，分为3组，每组5只小鼠，IL-21/scFv+anti-neu组：在第12天和第20天，腹腔注射低剂量的IL-21/scFv(neu)融合蛋白25μg，在第15天和第22天腹腔注射100μg抗HER2/neu抗体；anti-neu组：在第12天和第20天，腹腔注射等体积PBS，在第15天和第22天腹腔注射100μg抗HER2/neu抗体；PBS组：在第15天和第22天腹腔注射等体积PBS，定期用游标卡尺测量肿瘤的两个垂直直径，按0.52×[长(cm)×宽(cm)]计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。
(6)融合蛋白IL-21/scFv(neu)与抗HER2/neu抗体对免疫耐受肿瘤的联合治疗：给HER2/neu抗原免疫耐受的(HER2/neu x Balb/c)F1小鼠接种8x105肿瘤细胞Tubo，分别在第19天和第22天腹腔注射100μg抗HER2/neu抗体，在第32天和第42天，3组小鼠分别腹腔注射100μg抗HER2/neu抗体、IL-21/scFv(neu)融合蛋白或PBS，定期用游标卡尺测量肿瘤的两个垂直直径，按0.5×[长(cm)×宽(cm)×宽(cm)]计算肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。
除了本发明公开的通过基因工程方法把IL-21与抗肿瘤组织细胞的单链抗体或抗体构建成融合蛋白的方法，本领域普通技术人员还可以容易地想到将IL-21靶向肿瘤组织从而作用于肿瘤浸润巨噬细胞的其他方法，所述方法包括但不限于：把IL-21重组到融瘤病毒载体；通过转染建立表达IL-21的肿瘤特异性T细胞；通过纳米技术制备IL-21纳米颗粒。
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Claims (12)
1.一种融合蛋白，其包含白细胞介素21与抗肿瘤组织细胞的单链抗体的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的融合蛋白，其中所述抗肿瘤组织细胞的单链抗体是抗Her2/neu的单链抗体。
3.权利要求2所述的融合蛋白，其中所述白细胞介素21的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述抗Her2/neu的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
4.权利要求3所述的融合蛋白，其中所述白细胞介素21与所述抗Her2/neu的单链抗体之间通过连接体相连。
5.权利要求4所述的融合蛋白，其中所述连接体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
6.权利要求5所述的融合蛋白，所述融合蛋白在所述抗Her2/neu的单链抗体的C端还含有氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示的Ig Fc。
7.权利要求6所述的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：7所示。
8.编码权利要求1-7中任一项所述的融合蛋白的核苷酸序列。
9.权利要求1-7中任一项所述的融合蛋白在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。
10.权利要求9所述的用途，其中所述肿瘤为乳腺癌。
11.权利要求10所述的用途，其中所述药物与抗Her2/neu抗体一起施用。
12.一种用于治疗乳腺癌的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1-7中任一项所述的融合蛋白和抗Her2/neu抗体。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20210513 Address after: 101407 room 201-15, 2nd floor, building 13, yard 53, Yanqi street, Yanqi Economic Development Zone, Huairou District, Beijing Patentee after: HAIKE MOLECULE (BEIJING) TECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: 100101 Beijing city Chaoyang District Datun Road No. 15 Patentee before: Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20220331 Address after: Room 201-01, North building, Xinchuang 8 industrial building, No. 689 Binhe Road, high tech Zone, Suzhou, Jiangsu 215000 Patentee after: Chengdian (Suzhou) biomedical Co.,Ltd. Address before: 101407 room 201-15, 2nd floor, building 13, yard 53, Yanqi street, Yanqi Economic Development Zone, Huairou District, Beijing Patentee before: HAIKE MOLECULE (BEIJING) TECHNOLOGY Co.,Ltd. |
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| TR01 | Transfer of patent right |