CN113660942A - 嵌合细胞因子受体 - Google Patents

Abstract

本文提供的方法和组合物的一些实施方式涉及嵌合细胞因子受体。在一些实施方式中，嵌合细胞因子受体可包括栓系至胞外IL‑7受体结构域的IL‑7和连接至胞外IL‑7受体结构域的胞内IL‑21受体结构域。在一些实施方式中，在不存在外源细胞因子的情况下，包含嵌合细胞因子受体的T细胞可以容易地被激活和/或扩增。

Description

嵌合细胞因子受体

优先权以及相关申请的交叉引用

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技术领域

本文提供的方法和组合物的一些实施方式涉及嵌合细胞因子受体。在一些实施方式中，嵌合细胞因子受体可包括栓系至胞外IL-7受体结构域的IL-7以及连接至所述胞外IL-7受体结构域的胞内IL-21受体结构域。在一些实施方式中，在不存在外源细胞因子的情况下，包含嵌合细胞因子受体的T细胞可容易地被激活和/或扩增。

背景技术

在基于细胞的过继免疫疗法中，从患者分离的T细胞可以被修饰以表达合成蛋白，所述合成蛋白使所述细胞在随后被转移回患者中后能够执行新的治疗功能。此类合成蛋白的实例是嵌合抗原受体(CAR)和经工程化的T细胞受体(TCR)。目前使用的CAR的实例是胞外识别结构域(例如，抗原结合结构域)、跨膜结构域、和一个或多个细胞内信号传导结构域的融合体。在抗原接合后，CAR的细胞内信号传导部分可以在免疫细胞中启动与激活相关的应答，例如释放溶细胞分子以诱导肿瘤细胞死亡。

在临床前模型中，可以通过补充γ链细胞因子(促进T细胞生长和存活的可溶性因子)来改善CAR T细胞疗法。然而，向患者系统性给予细胞因子并不是治疗上可行的解决方案，因为临床试验表明这种方法导致毒副作用。

发明内容

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括编码嵌合细胞因子受体多肽的多核苷酸，其中，所述嵌合细胞因子受体多肽包含：栓系至胞外IL-7受体结构域的IL-7；跨膜结构域；以及胞内IL-21受体结构域，其中，所述跨膜结构域将所述胞外IL-7受体结构域连接至所述细胞内IL-21受体结构域。

一些实施方式包括：编码IL-7的第一核酸；编码系链(tether)的第二核酸；编码胞外IL-7受体结构域的第三核酸，其中，所述IL-7通过所述系链连接至所述胞外IL-7受体结构域；编码跨膜结构域的第四核酸；以及，编码胞内IL-21受体结构域的第五核酸。

在一些实施方式中，所述系链具有从3个氨基酸到30个氨基酸的长度。

在一些实施方式中，所述跨膜结构域包含IL-7受体跨膜结构域。

在一些实施方式中，第一核酸包含与SEQ ID NO：02具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，第一核酸包含SEQ ID NO：02的核苷酸序列。

在一些实施方式中，第二核酸包含与SEQ ID NO：03具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，第二核酸包含SEQ ID NO：03的核苷酸序列。

在一些实施方式中，第三核酸包含与SEQ ID NO：04具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，第三核酸包含SEQ ID NO：04的核苷酸序列。

在一些实施方式中，第三核酸和第四核酸一起包含与SEQ ID NO：04具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，第三核酸和第四核酸一起包含SEQ ID NO：04的核苷酸序列。

在一些实施方式中，第五核酸包含与SEQ ID NO：05具有至少95％同一性的核苷酸序列。在一些实施方式中，第五核酸包含SEQ ID NO：05的核苷酸序列。

一些实施方式还包括可诱导型启动子。一些实施方式还包括可诱导型细胞毒性基因。在一些实施方式中，细胞毒性基因编码选自以下的蛋白质：胸苷激酶、融合至胸苷酸激酶的胸苷激酶、氧化还原酶、脱氧胞苷激酶、尿嘧啶磷酸核糖转移酶、胞嘧啶脱氨酶、或融合至尿嘧啶磷酸核糖转移酶的胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方式中，所述细胞毒性基因包括胸苷激酶。在一些实施方式中，胸苷激酶包括SR39TK。

一些实施方式还包括核糖体跳跃序列。在一些实施方式中，核糖体跳跃序列包括T2A跳跃序列。

在一些实施方式中，所述多核苷酸编码转导标志物。在一些实施方式中，所述标志物包括截短的CD19(CD19t)。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括包含前述多核苷酸中的任一种的载体。在一些实施方式中，所述载体包括病毒载体。在一些实施方式中，所述载体选自慢病毒载体、腺相关病毒载体或腺病毒载体。在一些实施方式中，所述载体包括慢病毒载体。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括由前述多核苷酸中的任一种编码的多肽。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括包含前述多核苷酸中的任一种或由前述多核苷酸中的任一种编码的蛋白质的细胞。

一些实施方式还包括编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸或CAR蛋白。

在一些实施方式中，所述细胞为T细胞。在一些实施方式中，所述细胞为CD8+T细胞或CD4+T细胞。在一些实施方式中，所述细胞衍生自CD8+T细胞或CD4+T细胞。在一些实施方式中，所述细胞为原代细胞。在一些实施方式中，所述细胞为哺乳动物细胞。在一些实施方式中，细胞为人细胞。在一些实施方式中，细胞是离体的。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括治疗或改善受试者中的癌症的方法，所述方法包括：向有需要的受试者给予前述细胞中的任一种。

在一些实施方式中，癌症的治疗或改善缺乏向受试者共同给予细胞因子。

一些实施方式还包括向受试者共同给予细胞因子，其中，与向已经给予了包含CAR但缺乏权利要求1-23中任一项所述的多核苷酸或由所述多核苷酸编码的蛋白质的细胞的受试者共同给予的所述细胞因子的剂量相比，所给予的所述细胞因子的剂量减少。

在一些实施方式中，所述细胞因子选自IL-7、IL-15或IL-21。在一些实施方式中，所述细胞因子包括IL-21。

在一些实施方式中，所述细胞对于所述受试者而言是自体的。

在一些实施方式中，所述癌症包括实体瘤或非实体瘤，所述实体瘤例如结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、肾癌、胰腺癌、脑癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、肉瘤、骨癌或肝癌，所述非实体瘤例如白血病或多发性骨髓瘤。在一些实施方式中，所述癌症包括脑癌。

在一些实施方式中，所述受试者为哺乳动物。在一些实施方式中，所述受试者为人。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括制备包含嵌合抗原受体(CAR)的细胞群的方法，所述方法包括：(a)用编码嵌合受体的多肽对T细胞进行转导，其中，所述多肽包括上述多核苷酸中的任一种；(b)用编码CAR的多核苷酸对所述T细胞进行转导；以及(c)在足以刺激所述T细胞激活和扩增的条件下，对经转导的T细胞进行培养，其中，与足以刺激缺乏编码嵌合受体的多核苷酸的T细胞的激活和扩增的量相比，培养基包含减少量的外源性细胞因子。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括制备包含嵌合抗原受体(CAR)的细胞群的方法，所述方法包括：(a)用前述多核苷酸中的任一种对T细胞进行转导；(b)用编码CAR的多核苷酸对所述T细胞进行转导；以及(c)在刺激所述T细胞激活和扩增的条件下，对经转导的T细胞进行培养，其中，培养基缺少外源性细胞因子。

在一些实施方式中，步骤(b)在步骤(a)之前进行。

在一些实施方式中，步骤(a)和步骤(b)同时进行。

在一些实施方式中，所述细胞因子选自IL-7、IL-15或IL-21。在一些实施方式中，所述细胞因子包括IL-21。

在一些实施方式中，所述细胞为CD8+T细胞或CD4+T细胞。在一些实施方式中，所述细胞衍生自CD8+T细胞或CD4+T细胞。在一些实施方式中，所述细胞为原代细胞。在一些实施方式中，所述细胞为哺乳动物细胞。在一些实施方式中，所述细胞为人细胞。在一些实施方式中，所述细胞是离体的。

附图说明

图1描绘了用于T细胞中IL-21信号传导的嵌合细胞因子受体(CCRIL21)的示意图。图1(左子图)描绘了CCRIL21的蛋白质设计，而图1(右子图)描绘了CCRIL21的示例性功能。

图2A描绘了编码CCRIL21的慢病毒构建体的示意图。

图2B描绘了对表达CCRIL21的CD8+T细胞的FACS分析，所述CD8+T细胞在转导后使用CD19特异性磁性分选进行纯化。

图3描绘了关于磷酸化STAT3(pSTAT3)或磷酸化STAT5(pSTAT5)的存在对CD8+T细胞的分析。

图4A描绘了示出与外源性IL-21接触的T细胞或含有嵌合细胞因子受体CCRIL21的T细胞进展通过细胞周期的细胞的百分比的图表，带有说明标准偏差的误差棒。

图4B描绘了示出当T细胞与外源性IL-21接触或含有嵌合细胞因子受体CCRIL21时经历凋亡的细胞的百分比的图表。

图5A描绘了示出由含有806CAR的T细胞、或含有806CAR和嵌合细胞因子受体CCRIL21的T细胞裂解的肿瘤细胞的百分比的图表。

图5B描绘了关于LAMP-1、GZMB或PRF的存在的FACS分析。

图6描绘了示出通过含有806CAR的T细胞、或含有806CAR和嵌合细胞因子受体CCRIL2的T细胞的中靶(on-target)和脱靶(off-terget)肿瘤细胞的百分比的图表。

图7描绘了关于BATF或T-bet的存在的分析。

图8A描绘了给予了含有806CAR的T细胞或含有806CAR和CCRIL21的T细胞的小鼠的肿瘤负荷(通过发光测量)随时间的图表。

图8B描绘了Kaplan Meier图表，该图表示出了给予了含有806CAR的细胞或含有806CAR和CCRIL21的T细胞的荷瘤小鼠的存活百分比随时间的变化。

图9A示出了证明将表达CCRIL21的B7H3CAR T细胞致敏(primed)从而增加对肿瘤细胞的细胞毒性的数据图表(实施例8)。

图9B示出了证明将表达CCRIL21的CAR T细胞致敏从而由于效应蛋白表达增加而增加细胞毒性的数据的条形图(实施例9)。

图10示出了证明CCRIL21通过关键转录因子调节效应物功能的数据的条形图(实施例10)。

具体实施方式

成功的过继性T细胞疗法需要所给予的T细胞的稳健扩增和持续留存，并且由T细胞接收的环境信号对这些行为有很大贡献。在临床前模型中，嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法可以通过补充使用γ链细胞因子的疗法来进行改善，所述γ链细胞因子是促进T细胞生长和存活的可溶性因子。然而，向患者系统性给予细胞因子并不是治疗上可行的解决方案，因为临床试验表明此类干预导致毒副作用(Jeught V.等，(2014)Oncotarget 6:1359-81)。为了在不引起系统性毒性的情况下赋予CAR T细胞疗法以细胞因子补充的好处，已工程化了提供T细胞内在组成型白介素信号传导的嵌合细胞因子受体的组。嵌合细胞因子受体重现了特定γ链细胞因子的信号传导事件。此外，含有某些嵌合细胞因子受体的CAR T细胞具有出乎意料的增强的活性。

表达嵌合细胞因子受体的CAR T细胞在体外经受连续的肿瘤攻击，并检查了T细胞组的存活、增殖和消除肿瘤细胞的能力。发现在不存在外源性细胞因子的情况下，表达嵌合细胞因子受体的CAR T细胞表现出增加的增殖和存活。此外，特定的嵌合细胞因子受体对T细胞有丝分裂和细胞毒性产生不同的影响，并且这些影响追溯到关键转录因子的细胞因子特异性调控。此外，将原位胶质母细胞瘤异种移植小鼠模型用于表明表达这些嵌合细胞因子受体的CAR T细胞在体内表现出显著改善的效力。

最佳T细胞激活和扩增需要三种信号：T细胞受体激活、共刺激和刺激性细胞因子。在CAR T细胞中，CAR可以提供前两种信号，但第三种信号仍然依赖于环境/外源性细胞因子，其在肿瘤微环境中可能很少。虽然细胞因子补充可以改善CAR T细胞疗法的疗效，但系统性细胞因子给予在临床试验中导致毒性。开发选择性地向CAR T细胞提供第三种信号而没有系统性毒性或系统性毒性减少的方法具有临床价值。

在本文提供的方法和组合物的一些实施方式中，CAR T细胞经工程化以包含白介素21的嵌合受体(CCRIL21)。CCRIL21为CAR T细胞提供刺激性细胞因子信号并改善CAR T细胞疗法的疗效。图1描绘了T细胞中的CCRIL21并示出了蛋白质设计(左子图)，其包含嵌合受体蛋白，所述嵌合受体蛋白包含IL-7受体的胞外结构域和跨膜结构域以及IL-21受体的细胞内结构域，通过柔性接头连接至栓系的IL-7细胞因子。图1(右子图)示出了CCRIL21的示例性功能，其中，栓系的IL-7与内源性γ链受体复合，并且受体二聚化通过IL-21受体结构域激活细胞内信号传导。

体外原代人T细胞数据证明了表达CCRIL21的CD8+T细胞：诱导IL-21信号传导下游的信号传导，促进细胞因子无关的增殖和存活，以及赋予增加的细胞毒性和效应物功能。来自小鼠的体内原位胶质母细胞瘤数据证明了，与不具有CCRIL21的CAR T细胞相比，CCRIL21CAR T细胞显著改善肿瘤清除并促进总体存活。

术语

当根据申请文件阅读时，应当对本文公开内容中的术语赋予其普通和常见的含义。基于整个申请文件，本领域技术人员能理解所使用的术语。

如本文所使用的，“一个/一种”(a和an)可意指一个或多于一个。

如本文所使用的，术语“约”表示包括用于确定值的方法的误差的固有变化、或实验之间存在的变化的值。

如本文所使用的，“嵌合受体”可包括设计合成的受体，所述受体包含抗体或其它蛋白序列的配体结合结构域，所述配体结合结构域结合与疾病或紊乱相关的分子，并优选通过间隔区结构域连接至T细胞或其它受体的一个或多个细胞内信号传导结构域(例如共刺激结构域)。嵌合受体也可称为人工T细胞受体、嵌合T细胞受体、嵌合免疫受体或嵌合抗原受体(CAR)。

如本文所使用的，“嵌合细胞因子受体”可包括设计合成的受体，所述受体包含栓系至细胞因子受体多肽的胞外结构域的细胞因子、跨膜结构域、以及通过所述跨膜结构域连接至细胞因子受体多肽的胞外结构域的胞内细胞因子受体结构域。在一些实施方式中，所述细胞因子可选自I型细胞因子受体，例如IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-13、IL-15或IL-21。在一些实施方式中，细胞因子受体多肽的胞外结构域可衍生自I型细胞因子受体，例如IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-13、IL-15或IL-21。在一些实施方式中，跨膜结构域可衍生自I型细胞因子受体，例如IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-13、IL-15或IL-21。在一些实施方式中，细胞因子受体多肽的胞内结构域可衍生自I型细胞因子受体，例如IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-13、IL-15或IL-21。

如本文所使用的，“嵌合抗原受体”(CAR)，也称为嵌合T细胞受体，可指作为经工程化的受体的人工T细胞受体，其将任意特异性移植到免疫效应细胞上。例如，这些受体可用于将单克隆抗体的特异性移植到T细胞上；通过逆转录病毒载体或任何其它合适的基因递送系统促进其编码序列的转移。CAR的结构可以包含衍生自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段融合至CD3-ζ跨膜和内结构域。此类分子引起响应于scFv对其靶标的识别的ζ信号的传输。一些替代方式利用具有自失活转座酶系统的基因递送载体。在一些替代方式中，基因递送载体进一步包含至少一种蛋白质的序列。在一些替代方式中，所述蛋白质为嵌合抗原受体。嵌合受体也可称为人工T细胞受体、嵌合T细胞受体、嵌合免疫受体和/或CAR。这些CAR是可将任意特异性移植到免疫受体细胞上的工程化的受体。CAR可以包括抗体或抗体片段、间隔区、信号传导结构域和/或跨膜区。然而，由于修饰CAR的不同组分或结构域(例如表位结合区(例如抗体片段、scFv或其部分)、间隔区、跨膜结构域和/或信号传导结构域)的惊人效果，CAR的组分在本文中的一些上下文中进行了描述，以将这些特征包括为独立的元件。例如，CAR不同元件的变化可以引起对特定表位的更强结合亲和力。

人工T细胞受体或CAR可用作使用称为过继细胞转移的技术的对于癌症或病毒感染的疗法。从受试者取出T细胞并进行修饰，以使它们表达对癌细胞或病毒或受病毒感染的细胞上展示的分子具有特异性的受体。经遗传工程化的T细胞被重新引入受试者，然后可以识别并杀伤癌细胞或受病毒感染的细胞或者促进病毒的清除。在一些替代方式中，基因递送载体可包含用于嵌合抗原受体的序列。在一些替代方式中，提供了生成用于过继性T细胞免疫疗法的经工程化的多重化T细胞(multiplexed T-cells)的方法。在最广泛的意义上，该方法可以包括：提供本文所述的任一种替代方式所述的基因递送载体，将所述基因递送载体引入T细胞，以及对包含所述基因递送载体的细胞进行选择，其中，选择包括在选择压力下分离表达表型的T细胞。

T细胞共刺激对于有效免疫应答的发展而言是期望的，并且该事件在淋巴细胞激活期间发生。共刺激信号是抗原非特异性的，并由T细胞和抗原携带细胞的膜上表达的共刺激分子之间的相互作用来提供。共刺激分子可包括但不限于CD28、CD80或CD86。在一些替代方式中，提供了生成用于过继性T细胞免疫疗法的经工程化的多重化T细胞的方法。在一些替代方式中，所述T细胞是携带嵌合抗原受体的T细胞。在一些替代方式中，所述携带嵌合抗原受体的T细胞被工程化以表达共刺激配体。在一些替代方式中，提供了用于治疗、抑制或改善受试者的癌症或病毒感染的方法。在最广泛的意义上，该方法可以包括向受试者给予本文所述的任一种替代方式所述的T细胞。在这些替代方式的一些中，所述受试者为动物，例如家畜或伴侣动物，而在其它替代方式中，所述受试者为人。在这些替代方式的一些中，携带嵌合抗原的T细胞被工程化以表达共刺激分子。在一些替代方式中，所述基因递送载体包含用于至少一种共刺激分子的序列。在一些替代方式中，所述基因递送载体为至少1kB至20kB。

如本文所述，“遗传修饰”和“经遗传修饰的”可包括修饰生物体或细胞(例如具有遗传物质(如核酸)的细菌、T细胞、细菌细胞、真核细胞、昆虫、植物或哺乳动物，将所述遗传物质使用遗传工程技术进行改变)的工艺。例如，可以通过如下将核酸(例如DNA)插入宿主基因组中：首先使用分子克隆方法分离并拷贝感兴趣的遗传物质、或者通过合成DNA，以生成DNA序列，然后将该构建体插入宿主生物体。也可使用核酸酶移除或“敲除”基因。基因靶向是使用同源重组来改变内源性基因的不同的技术，并可用于删除基因、移除外显子、添加基因或引入点突变。

本文描述了通过转导进行的遗传修饰。“转导”是指通过载体的方式将遗传物质(例如DNA或RNA)转移至例如细胞的方法。常用技术使用病毒载体、电穿孔和化学试剂来提高细胞通透性。可通过病毒或通过病毒载体转移DNA。本文描述了用于对免疫CD4+和/或CD8+T细胞进行修饰的方法。例如，为了实现治疗性基因的高表达和/或增加细胞表面上的嵌合抗原受体的量，用编码蛋白质或嵌合抗原受体的遗传物质转导T细胞。例如，可使用病毒对T细胞进行遗传修饰。例如，通常用于基因疗法的病毒为腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒或慢病毒。

已经开发了多种转导技术，其利用重组感染性病毒颗粒来递送编码嵌合抗原受体的核酸。这代表了目前优选的T淋巴细胞转导的方式。如本文所述，用于转导的病毒载体可包括衍生自猴病毒40、腺病毒、AAV、慢病毒载体或逆转录病毒的病毒载体。因此，基因转移和表达方法很多，但实质上发挥的作用是在哺乳动物细胞中引入和表达遗传物质。上述技术中的多种可用于转导造血细胞或淋巴样细胞，包括：磷酸钙转染，原生质体融合，电穿孔，或者用重组腺病毒、腺相关病毒、慢病毒或逆转录病毒载体进行的感染。通过电穿孔以及通过逆转录病毒或慢病毒感染已成功转导了原代T淋巴细胞。就此而言，逆转录病毒载体和慢病毒载体提供了将基因转移到真核细胞(例如T细胞)的高效方式。而且，逆转录病毒或慢病毒整合以受控的方式发生，并引起每个细胞稳定整合一个或数个新的遗传信息的拷贝。如本文所述，可原位转导细胞。

如本文所使用的，“载体”或“构建体”可包括用于将异源核酸引入细胞的核酸，其也可具有调控元件以提供异源核酸在细胞中的表达。载体包括但不限于质粒、微环(minicircles)、酵母和病毒基因组。在一些实施方式中，所述载体为质粒、微环、病毒载体、DNA或mRNA。在一些实施方式中，所述载体为慢病毒载体或逆转录病毒载体。在一些实施方式中，所述载体为慢病毒载体。如本文所使用的，“Vpx”可包括由HIV2型以及在一些猿猴免疫缺陷病毒株中编码的病毒体相关蛋白。Vpx可增强人中的HIV-2复制。当用于转染时，与Vpx蛋白一起包装的慢病毒载体可引起髓系细胞感染增加。在一些实施方式中，慢病毒载体与Vpx蛋白一起包装。如本文所使用的，“Vpr”蛋白可指病毒蛋白R，其为14kDa蛋白，在调控HIV-1前整合复合物的核输入中起重要作用并且是非分裂细胞中病毒复制所必需的。非分裂细胞可包括例如巨噬细胞。在一些实施方式中，慢病毒载体可与Vpr蛋白或其Vpr蛋白部分一起包装。在一些实施方式中，慢病毒载体与病毒辅助蛋白一起包装。在一些实施方式中，病毒辅助蛋白选自于由Vif、Vpx、Vpu、Nef和Vpr所组成的组。这些辅助蛋白(例如vif、Vpx、vpu或nef)例如与细胞配体相互作用以充当适配器分子，以出于病毒特异性目的而重定向宿主因子的正常功能。HIV辅助蛋白描述于Strebel等(“HIV Accessory Proteinsversus Host Restriction Factors,Curr Opin Virol.2013Dec；3(6):10.1016/j.coviro.2013.08.004；以引用的方式将其整体明确并入此处)。

如本文所使用的，“启动子”可包括指导结构基因转录的核苷酸序列。在一些实施方式中，启动子位于基因的5'非编码区，靠近结构基因的转录起始位点。在启动转录中起作用的启动子内的序列元件通常以共有核苷酸序列为特征。非限制性地，这些启动子元件可包括RNA聚合酶结合位点、TATA序列、CAAT序列或分化特异性元件(DSE；McGehee等，Mol.Endocrinol.7:551(1993)；以引用的方式将其整体明确并入此处)、环AMP应答元件(CRE)、血清应答元件(SRE；Treisman等，Seminers in Cancer Biol.1:47(1990)；以引用的方式将其整体明确并入此处)、糖皮质激素应答元件(GRE)，或其它转录因子的结合位点，所述转录因子例如CRE/ATF(O'Reilly等，J.Biol.Chem.267:19938(1992)；以引用的方式将其整体明确并入此处)、AP2(Ye等，J.Biol.Chem.269:25728(1994)；以引用的方式将其整体明确并入此处)、SP1、cAMP应答元件结合蛋白(CREB；Loeken等，Gene Expr.3:253(1993)；以引用的方式将其整体明确并入此处)或八聚体因子(octamer factors)(总体参见Watson等编著，Molecular Biology of the Gene，第4版(The Benjamin/Cummings PublishingCompany,Inc.1987；以引用的方式将其整体明确并入此处)，以及Lemaigre和Rousseau，Biochem.J.303:1(1994)；以引用的方式将其整体明确并入此处)。如本文所使用的，启动子可为组成型活性、阻遏型或可诱导型。如果启动子为可诱导型启动子，那么转录速率响应于诱导剂而增加。相反，如果启动子是组成型启动子，则转录速率不受诱导剂调控。阻遏型启动子也是已知的。

如本文所用，取决于上下文，“治疗”可指治疗性治疗和预防性或防止性治疗两者。

如本文所使用的，关于紊乱的“改善”可指减轻紊乱的症状、使得疾病稳定或防止紊乱的进展。对于例如癌症的紊乱，这可以包括减小肿瘤的大小、减少癌细胞的生长或增殖或癌细胞数量、完全或部分移除肿瘤(例如，完全或部分应答)、使得疾病稳定、防止癌症的进展(例如，无进展存活)、或医师认为是治疗性的对癌症的任何其它作用。

如本文所使用的，“给予”可以指将化合物或其药学上可接受的盐或经修饰的细胞组合物引入患者或受试者的方法，包括但不限于口服、静脉内、肌内、皮下或经皮。

如本文所使用的，“受试者”或“患者”可以指可以对其使用或给予本文所述的实施方式的任何生物体，例如出于实验、诊断、预防和/或治疗目的。受试者或患者包括例如动物。在一些实施方式中，受试者为小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物或人。在一些实施方式中，受试者为牛、羊、猪、马、狗、猫、灵长类动物或人。

如本文所使用的，“共同给予”可以指多于一种治疗剂与另一种的联合给予。每种试剂可以序贯给予或同时给予，使得各试剂可以同时存在于生物体的血流中。

某些多核苷酸

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括编码嵌合细胞因子受体多肽的多核苷酸。在一些实施方式中，所述嵌合细胞因子受体多肽可包含：栓系至I型细胞因子受体的胞外结构域和跨膜结构域(例如IL-7受体胞外结构域和跨膜结构域)的细胞因子(例如IL-7)；和I型细胞因子受体的胞内结构域(例如IL-21受体胞内结构域)。在一些此类实施方式中，所述跨膜结构域将所述胞外受体结构域连接至所述胞内受体结构域。在一些实施方式中，所述嵌合细胞因子受体多肽可包含：栓系至细胞外IL-7受体结构域的IL-7；跨膜结构域；和胞内IL-21受体结构域，其中，所述跨膜结构域将所述胞外IL-7受体结构域连接至所述胞内IL-21受体结构域。此类嵌合细胞因子受体的示例性实施方式描绘于图2A中。在一些实施方式中，所述IL-7受体结构域衍生自IL-7α链结构域。

在一些实施方式中，多核苷酸可包括编码IL-7的第一核酸。在一些实施方式中，多核苷酸可包括编码系链的第二核酸。在一些实施方式中，多核苷酸可包括编码胞外IL-7受体结构域的第三核酸，其中，IL-7通过所述系链连接至所述胞外IL-7受体结构域。在一些实施方式中，多核苷酸可包括编码IL-7受体跨膜结构域的第四核酸。在一些实施方式中，多核苷酸可包括编码胞内IL-21受体结构域的第五核酸。

在一些实施方式中，多核苷酸可包括编码IL-7的第一核酸。在一些实施方式中，所述IL-7是哺乳动物的，例如人的。在一些实施方式中，第一核酸包含与SEQ ID NO：02的核苷酸序列具有同一性百分比的核苷酸序列。在一些此类实施方式中，所述同一性百分比大于80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或为100％，或在由上述百分比中任意两个所限定的范围内。在一些此类实施方式中，所述同一性百分比大于约95％。在一些此类实施方式中，所述同一性百分比大于95％。

在一些实施方式中，多核苷酸可包括编码系链的第二核酸。在一些实施方式中，所述系链可具有如下长度：大于或等于2个氨基酸且小于或等于50个氨基酸、大于或等于5个氨基酸且小于或等于40个氨基酸、大于或等于10个氨基酸且小于或等于35个氨基酸、大于或等于10个氨基酸且小于或等于30个氨基酸、或者大于或等于15个氨基酸且小于或等于25个氨基酸。在一些实施方式中，第二核酸包含与SEQ ID NO：03的核苷酸序列具有同一性百分比的核苷酸序列。在一些此类实施方式中，所述同一性百分比大于80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或为100％，或在由上述百分比中任意两个所限定的范围内。在一些此类实施方式中，所述同一性百分比大于约95％。在一些此类实施方式中，所述同一性百分比大于95％。

在一些实施方式中，多核苷酸可包括编码胞外IL-7受体结构域的第三核酸，其中，IL-7通过所述系链连接至所述胞外IL-7受体结构域。在一些实施方式中，所述胞外IL-7受体结构域是哺乳动物的，例如人的。在一些实施方式中，第三核酸包含与SEQ ID NO：04的核苷酸序列具有同一性百分比的核苷酸序列。在一些此类实施方式中，所述同一性百分比大于80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或为100％，或在由上述百分比中任意两个所限定的范围内。在一些此类实施方式中，所述同一性百分比大于约95％。在一些此类实施方式中，所述同一性百分比大于95％。

在一些实施方式中，多核苷酸可包括编码跨膜结构域的第四核酸。在一些实施方式中，所述跨膜结构域包括IL-7受体跨膜结构域或IL-21受体跨膜结构域。在一些实施方式中，所述跨膜结构域包括IL-7受体跨膜结构域。在一些实施方式中，所述IL-7受体跨膜结构域是哺乳动物的，例如人的。在一些实施方式中，第三核酸和第四核酸一起编码所述胞外IL-7受体结构域和所述IL-7受体跨膜结构域，并且包含与SEQ ID NO：04的核苷酸序列具有同一性百分比的核苷酸序列。在一些此类实施方式中，所述同一性百分比大于80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或为100％，或在由上述百分比中任意两个所限定的范围内。在一些此类实施方式中，所述同一性百分比大于约95％。在一些此类实施方式中，所述同一性百分比大于95％。

在一些实施方式中，多核苷酸可包括编码胞内IL-21受体结构域的第五核酸。在一些实施方式中，所述胞内IL-21受体结构域是哺乳动物的，例如人的。在一些实施方式中，第五核酸包含与SEQ ID NO：05的核苷酸序列具有同一性百分比的核苷酸序列。在一些此类实施方式中，所述同一性百分比大于80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或为100％，或在由上述百分比中任意两个所限定的范围内。在一些此类实施方式中，所述同一性百分比大于约95％。在一些此类实施方式中，所述同一性百分比大于95％。

在一些实施方式中，多核苷酸还可以包含可诱导型启动子。在一些此类实施方式中，可在某些药物的存在下，诱导嵌合细胞因子受体的转录，所述药物与可诱导型启动子相互作用。

在一些实施方式中，多核苷酸还可编码可诱导型细胞毒性基因。在一些此类实施方式中，可以诱导细胞毒性基因的转录以诱导对含有所述多核苷酸的细胞的杀伤。细胞毒性基因的实例包括编码例如如下蛋白质的基因：胸苷激酶、融合至胸苷酸激酶的胸苷激酶、氧化还原酶、脱氧胞苷激酶、尿嘧啶磷酸核糖转移酶、胞嘧啶脱氨酶、或融合至尿嘧啶磷酸核糖转移酶的胞嘧啶脱氨酶。在一些实施方式中，优选胸苷激酶。在一些此类实施方式中，所述胸苷激酶包括SR39TK。包含SR39TK的核苷酸序列的实例包括SEQ ID NO：07的核苷酸序列。

在一些实施方式中，多核苷酸可包括多于一种的蛋白编码序列。在一些此类实施方式中，所述多核苷酸可包含核糖体跳跃序列。核糖体跳跃序列的实例包括T2A跳跃序列。包含T2A跳跃序列的核苷酸序列的实例包括SEQ ID NO：06的核苷酸序列。

在一些实施方式中，多核苷酸可包含编码转导标志物的核酸。此类标志物对于识别和获得已成功转导有多核苷酸并成功表达所编码的标志物的细胞有用。转导标志物的实例包括截短的CD19(CD19t)分子。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括由本文提供的多核苷酸编码的多肽。

载体

本文提供的方法和组合物的一些实施方式涉及包含本文所述的多核苷酸的载体。在一些实施方式中，所述载体适用于或被配置用于转导到细胞中。在一些实施方式中，所述载体包括病毒载体。病毒载体的实例包括慢病毒载体、腺相关病毒载体或腺病毒载体。在一些实施方式中，所述载体包括慢病毒载体。

在一些实施方式中，载体可包含编码嵌合细胞因子受体的本文提供的多核苷酸以及编码CAR的多核苷酸。

细胞

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括含有本文提供的多核苷酸或由本文提供的多核苷酸编码的多肽的细胞。在一些实施方式中，所述细胞还含有编码CAR的多核苷酸、或CAR蛋白。在一些实施方式中，所述细胞为T细胞。在一些实施方式中，所述细胞为CD8+T细胞或CD4+T细胞。在一些实施方式中，所述细胞衍生自CD8+T细胞或CD4+T细胞。在一些实施方式中，所述细胞为原代细胞。在一些实施方式中，所述细胞为哺乳动物细胞。在一些实施方式中，所述细胞为人细胞。

治疗方法

本文提供的方法和组合物的一些实施方式涉及治疗或改善受试者中的癌症的方法。一些此类方法包括向有需要的受试者给予本文提供的细胞。在一些实施方式中，所述细胞包含嵌合细胞因子受体或编码所述嵌合细胞因子受体的多核苷酸，以及CAR或编码CAR的多核苷酸。

在一些实施方式中，癌症可包括实体瘤或非实体瘤，所述实体瘤例如结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、肾癌、胰腺癌、脑癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、肉瘤、骨癌或肝癌，所述非实体瘤例如白血病或多发性骨髓瘤。在一些实施方式中，所述癌症包括脑癌。

本文提供的一些嵌合细胞因子受体可减少或消除通过共同给予细胞因子向受试者补充疗法的需要。例如，向受试者给予不含嵌合细胞因子受体的CAR T细胞可包括共同给予外源性细胞因子以进一步刺激或激活已给予至所述受试者的CAR T细胞。如本文所述，包含本文提供的嵌合细胞因子受体的T细胞可在不存在外源性细胞因子的情况下或与不包含本文提供的嵌合细胞因子受体的T细胞相比显著减少剂量的外源性细胞因子下以充分刺激和/或激活的状态提供。在一些实施方式中，所述癌症的治疗或改善缺乏向受试者共同给予细胞因子。一些实施方式还可包括向受试者共同给予细胞因子，其中，与向给予了包含CAR而缺乏本文提供的嵌合细胞因子受体的细胞的受试者所共同给予的细胞因子的剂量相比，细胞因子的剂量减少。在一些此类实施方式中，与向给予了包含CAR而缺乏嵌合细胞因子受体的细胞的受试者所共同给予的细胞因子的剂量相比，向给予了包含CAR和嵌合细胞因子受体的受试者所共同给予的细胞因子的剂量可减少多于或多于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，或由上述百分比中的任意两个所限定的范围内的量。

在一些实施方式中，与给予缺乏本文提供的嵌合细胞因子受体的CAR T细胞的受试者中的肿瘤移除相比，给予包含本文提供的嵌合细胞因子受体的CAR T细胞改善肿瘤从受试者的移除。

在一些此类实施方式中，与给予了缺乏本文提供的嵌合细胞因子受体的CAR T细胞的受试者中的肿瘤体积相比，给予包含本文提供的嵌合细胞因子受体的CAR T细胞使受试者中的肿瘤体积减少。在一些此类实施方式中，与给予了缺乏本文提供的嵌合细胞因子受体的CAR T细胞的受试者中的肿瘤体积相比，给予包含本文提供的嵌合细胞因子受体的CAR T细胞的受试者中的肿瘤体积可减少多于或多于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，或由上述百分比中的任意两个所限定的范围内的量。

在一些此类实施方式中，与给予了缺乏本文提供的嵌合细胞因子受体的CAR T细胞的受试者中的肿瘤体积减少相比，给予包含本文提供的嵌合细胞因子受体的CAR T细胞以更大的速率减少受试者中的肿瘤体积。

在一些实施方式中，与给予缺乏本文提供的嵌合细胞因子受体的CAR T细胞的受试者的总体存活相比，给予含有本文提供的嵌合细胞因子受体的CAR T细胞使受试者的总体存活增加。

在一些前述实施方式中，所述细胞因子选自IL-7、IL-15或IL-21。在一些实施方式中，所述细胞因子包括IL-21。在一些实施方式中，所述细胞对于受试者而言是自体的。在一些实施方式中，所述受试者为哺乳动物，例如人。

制备细胞群的方法

本文提供的方法和组合物的一些实施方式涉及制备包含CAR的细胞群的方法。一些此类方法包括：(a)用编码本文提供的嵌合细胞因子受体的多核苷酸对T细胞进行转导；(b)用编码CAR的多核苷酸对所述T细胞进行转导；以及，(c)在足以刺激所述T细胞的激活和扩增的条件下，对经转导的T细胞进行培养，其中，与足以刺激缺乏本文提供的嵌合细胞因子受体的T细胞的激活和扩增的量相比，培养基包含减少量的外源性细胞因子。在一些实施方式中，步骤(b)在步骤(a)之前进行。在一些实施方式中，步骤(a)和步骤(b)同时进行。

在一些实施方式中，与足以刺激包含CAR而缺乏本文提供的嵌合细胞因子受体的T细胞的激活和扩增的外源性细胞因子的量相比，足以刺激包含本文提供的嵌合细胞因子受体和CAR的T细胞的激活和扩增的外源性细胞因子的量减少多于或多于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，或由上述百分比中的任意两个所限定的范围内的量。在一些实施方式中，所述细胞因子选自IL-7、IL-15或IL-21。在一些实施方式中，所述细胞因子包括IL-21。在一些实施方式中，所述细胞为CD8+T细胞或CD4+T细胞。在一些实施方式中，所述细胞衍生自CD8+T细胞或CD4+T细胞。在一些实施方式中，所述细胞为原代细胞。在一些实施方式中，所述细胞为哺乳动物细胞，例如人细胞。

一些实施方式包括制备包含嵌合抗原受体(CAR)的细胞群的方法，所述方法包括：(a)用编码本文提供的嵌合细胞因子受体的多核苷酸对T细胞进行转导；(b)用编码CAR的多核苷酸对所述T细胞进行转导；以及，(c)在刺激所述T细胞的激活和扩增的条件下，对经转导的T细胞进行培养。在一些实施方式中，T细胞使用缺乏外源性细胞因子的培养基进行生长。在一些实施方式中，步骤(b)在步骤(a)之前进行。在一些实施方式中，步骤(a)和步骤(b)同时进行。在一些实施方式中，所述细胞因子选自IL-7、IL-15或IL-21。在一些实施方式中，所述细胞因子包括IL-21。在一些实施方式中，所述细胞为CD8+T细胞或CD4+T细胞。在一些实施方式中，所述细胞衍生自CD8+T细胞或CD4+T细胞。在一些实施方式中，所述细胞为原代细胞。在一些实施方式中，所述细胞为哺乳动物细胞，例如人细胞。

试剂盒和系统

本文提供的方法和组合物的一些实施方式涉及用于制备T细胞群的试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒可包含本文提供的多核苷酸或载体。

本文提供的方法和组合物的一些实施方式包括用于制备T细胞群的系统。在一些实施方式中，系统可包含本文提供的多核苷酸或载体。在一些实施方式中，系统还可以包括本文提供的细胞。

实施例

实施例1方法

用于IL21信号传导的嵌合细胞因子受体(CCRIL21)构建体设计。CCRIL21构建体包括编码CD19标志物蛋白的单个阅读框，随后为T2A核糖体跳跃序列和CCRIL21蛋白(图2A)。表达由人延伸因子1α(EF1α)启动子驱动。CCRIL21蛋白包括胞外结构域，所述胞外结构域包含内源性IL7R的细胞外结构域和跨膜结构域，其通过柔性接头序列与IL7细胞因子栓系。在IL7R跨膜结构域的胞内侧上的是内源性IL21R的胞内结构域。表1列出了用于IL21信号传导的嵌合细胞因子受体(CCRIL21)的核酸元件。表1中的每个序列按所列顺序连接以构成完整的CCRIL21序列。表2列出了与本文提供的某些实施方式一起有用的额外核酸元件。

T细胞的产生和培养。CD8+T细胞通过磁激活细胞分选从人外周血单核细胞(PBMC)中分离而来，并使用Dynabeads(Life Technologies)经受基于珠的CD3/CD28刺激。两天后，用慢病毒转导细胞以引入CCRIL21和/或CAR转基因。在刺激后第10天和第24天之间，将甲氨蝶呤(MTX)添加到CAR转导的T细胞培养物中以选择表达CAR的群体。刺激后24天，通过关于CD19表达的磁性分选来富集表达CCRIL21的细胞(图2B)。使分选的群体经受快速扩增方案(REP)。参见例如Wang,X.等，J.Immunother.35,689-701(2012)。在REP的第5天和第14天之间再次补充MTX。在REP后14天，流式细胞术证实了表达CCRIL21和/或CAR构建体的纯化T细胞群，并将T细胞冷冻用于以后的测定。将T细胞解冻并立即投入第二个REP中，并在14天后开始测定。

凋亡状态测定。将细胞用膜联蛋白(Annexin)V和7-AAD(BioLegend)染色以确定活力和凋亡状况。将细胞从培养物中移出并置于96孔圆底板中，用BioLegend膜联蛋白V染色缓冲液洗涤两次，用膜联蛋白V和7-AAD染色，再用膜联蛋白V缓冲液洗涤两次，并在12小时内通过流式细胞术进行分析。

细胞周期测定。将Millipore Muse细胞周期分析试剂盒用于量化T细胞有丝分裂活性。该试剂盒用于流式细胞术确定个体细胞的细胞周期阶段。通过碘化丙锭染色，基于DNA含量将细胞门控到细胞周期阶段中。

细胞毒性测定。靶标细胞用铬⁵¹加载，并与T细胞组以可变比例共培养4小时。通过测量释放到上清液中的铬⁵¹来量化靶标细胞的裂解(Cooper,L.J.N.等，Blood 101,1637-1644(2003))。

细胞内细胞因子染色。T细胞与表达EGFRvIII的K562细胞(K562-vIII)以2:1的效应物与靶标比共培养6小时。共培养开始后两小时，添加转运抑制剂混合物以防止T细胞释放分泌蛋白。在共培养结束时，对细胞关于表面标志物进行染色，使用CytoFix/CytoPerm试剂盒(BD)进行固定和透化，最后关于分泌蛋白进行细胞内染色。

磷流(Phospho-flow)。如Krutzik,P.O.等，Cytometry 55A,61-70(2003)中所述，通过流式细胞术评估信号传导蛋白的磷酸化状况。将浓缩的PFA直接添加到细胞培养孔中，然后用70％乙醇对细胞进行透化。使用抗phosphoSTAT抗体(BioLegend)进行染色。

具有混合靶标的基于流式的细胞毒性测定。CAR T细胞与表达CD19t的K562细胞(脱靶)和表达EGFRvIII的K562细胞(中靶)的混合物共孵育。共孵育后，通过流式细胞术对群体进行分选，并使用选择性标记死细胞的染料评估每个靶标群体的杀伤。

小鼠研究。根据IACUC批准的方案，使用原位胶质母细胞瘤模型评估表达CCR的CART细胞的体内抗肿瘤功效。向10-12周龄雄性NSG小鼠颅内注射200,000个表达GFP和萤火虫荧光素酶的人U87细胞。在皮下注射D-萤光素后，使用关于萤火虫荧光素酶发光的生物发光成像来评估肿瘤植入。随后将小鼠分选为实验组，每组4-5只小鼠。7天后，将1×10⁶个T细胞直接颅内注射到肿瘤注射位点。此后，通过生物发光成像监测小鼠的肿瘤进展，直到第90天。

实施例2CCRIL21重现IL-21信号传导事件

在CD8+T细胞中，外源性IL-21可以结合至与共同γ链复合的IL-21受体，并且异源二聚体受体复合物可诱导IL-21相关信号传导事件，包括STAT3和STAT5的磷酸化。

在通过流式细胞术分析phospho-STAT3和phospho-STAT5的存在之前，将原代CD8+人T细胞在没有细胞因子或具有IL-21(10ng/mL)的情况下培养14小时。如图3所示，含有CCRIL21且未与IL-21一起培养的细胞表现出与不含CCRIL21且与IL-21培养的对照细胞实质上相似水平的磷酸化STAT3和STAT5。因此，CCRIL21重现了原代CD8+人T细胞中的IL-21信号传导事件。

实施例3CCRIL21介导细胞因子无关的细胞周期进程和存活

为了在体外评估CCRIL21对T细胞增殖和存活的影响，在不存在外源性细胞因子的情况下对表达CCRIL21的T细胞和模拟T细胞进行培养。两天后检查细胞周期进程(图4A)，六天后检查细胞的凋亡状况(图4B)。作为对照，模拟T细胞也与10ng/mL IL-21一起培养。

如图4A所示，含有CCRIL21且未与IL-21一起培养的细胞与不含CCRIL21且与IL-21一起培养的对照细胞具有实质上相似比例的经历S期和G2/M期的细胞。此外，经历S期和G2/M期的含有CCRIL21且未与IL-21一起培养的细胞的总百分比显著大于经历S期和G2/M期的未与IL-21一起培养的对照细胞的总百分比。

如图4B所示，对于含有CCRIL21且未与IL-21一起培养的细胞以及不含CCRIL21且与IL-21一起培养的对照细胞而言，经历凋亡的细胞或死亡的细胞的总百分比实质上相似。

实施例4将表达CCRIL21的CAR T细胞致敏从而增加细胞毒性

在细胞毒性测定中，测定含有靶向EGFRvIII的CAR(806CAR)的T细胞或含有806CAR和CCRIL21的T细胞的活性。表达CCRIL21的CAR T细胞在针对人胶质母细胞瘤细胞系U87的4小时铬释放测定中显示出增强的细胞毒性(图5A)。

还测定了与细胞毒性相关的蛋白质水平，包括Lamp-1、颗粒酶B和穿孔素。在与K562-EGFRvIII细胞共孵育6小时后评估Lamp-1的表面存在，并通过流式细胞术评估细胞毒性蛋白颗粒酶B和穿孔素的基线表达(图5B)。表达CCRIL21的细胞显示出较高水平的脱颗粒蛋白Lamp-1(LAMP-1)；和细胞毒性蛋白，如颗粒酶B(GZMB)和穿孔素(PRF)。

实施例5 CCRIL21致敏的细胞毒性限于CAR靶向的细胞

含有806CAR的T细胞或含有806CAR和CCRIL21的T细胞的细胞毒活性用表达靶标(EGFRvIII)或非靶标对照CD19t的靶标细胞进行测定。将细胞与表达CD19t的K562细胞(脱靶)和表达EGFRvIII的K562细胞(中靶)的混合物共孵育。共孵育后，通过流式细胞术对群体进行分选，并使用流式细胞术技术评估每个靶标群体的杀伤。

如图6所示，CCRIL21不引起对脱靶肿瘤细胞的毒性增加，表明CCRIL21促进的细胞毒性增加限于CAR靶向的细胞。

实施例6 CCRIL21通过806CAR T细胞中的关键转录因子调控效应物功能。

将含有806CAR的T细胞或含有806CAR和CCRIL21的T细胞与表达EGFRvIII的K562细胞以1:1的比例培养24小时。将含有仅包含806CAR的T细胞的培养物与IL-21接触。

确定转录因子、BATF和T-bet的水平(图7)。BATF和T-bet与细胞毒性功能的获得和维持有关。CCRIL21通过上调包括BATF和T-bet在内的转录因子而重现了IL-21对CAR T细胞的作用。这表明将表达CCRIL21的CAR T细胞致敏从而增加细胞毒性。

实施例7 CCRIL21表达增加CAR T细胞在体内的肿瘤清除

向小鼠植入颅内人胶质母细胞瘤肿瘤。7天后，向小鼠颅内给予表达肿瘤特异性CAR(806CAR)的T细胞。如通过生物发光成像测量的，表达CCRIL21的806CAR T细胞引起较高的肿瘤移除(图8A)。此外，用表达CCRIL21的806CAR T细胞处理的小鼠比用仅表达CAR的T细胞处理的小鼠显著存活更久(图8B)。

表1

表2

实施例8将表达CCRIL21的B7H3CAR T细胞致敏从而增加对肿瘤细胞的细胞毒性

为了评估是否将表达CCRIL21的CAR T细胞致敏从而增加对肿瘤细胞的细胞毒性，将CD8+B7H3CAR T细胞与K562肿瘤细胞以2个肿瘤细胞对每个T细胞的比例共培养。使用Incucyte S3活细胞荧光成像仪在一周的过程内监测肿瘤细胞生长。

如图9A中的数据所示，B7H3CAR T细胞最终被肿瘤细胞超过，但表达CCRIL21的CART细胞能够在研究过程中抑制肿瘤生长。

这些数据证明了表达CCRIL21的CAR T细胞的持续细胞毒能力。此外，结果表明CCRIL21增强了B7H3CAR T细胞中以及806CAR T细胞中的细胞毒性。

实施例9将表达CCRIL21的B7H3CAR T细胞致敏从而由于效应蛋白的表达增加而增 加细胞毒性。

为了评估是否将表达CCRIL21的CAR T细胞致敏从而由于细胞毒性能力增加而增加细胞毒性，在效应蛋白表达的细胞内流式细胞术分析之前，将CD8+B7H3CAR T细胞与K562肿瘤细胞共培养。

图9B中的图表示出了三个生物学重复中的中位荧光强度(MFI)的平均值。误差棒反映标准偏差，并进行了单因素ANOVA统计学分析(n.s.＝不显著，*p<0.05，***p<0.005)。

如数据所示，与B7H3CAR T细胞相比，表达CCRIL21的CAR T细胞表现出更高水平的细胞毒性蛋白，颗粒酶B、干扰素γ和穿孔素。

这些发现证明，如在806CAR T细胞中所发现的，CCRIL21通过支持B7H3CAR T细胞中效应蛋白的较高表达水平来致敏细胞毒性能力。

实施例10 CCRIL21通过B7H3CAR T细胞中的关键转录因子调控效应物功能。

为了确定CCRIL21是否通过关键转录因子调控效应物功能，使用细胞内流式细胞术评估转录因子Tbet和BATF的表达。

图10中的图表显示了三个生物学重复中的中位荧光强度(MFI)的平均值。误差棒反映标准偏差，并进行了单因素ANOVA统计学分析(**p<0.01，****p<0.001)。表达CCRIL21的CAR T细胞表现出统计学上较高水平的Tbet和BATF。

数据表明，如在806CAR T细胞中那样，CCRIL21通过调控关键转录因子的表达来影响B7H3CAR T细胞中基因表达的整体变化。

本文所使用的术语“包含(comprising)”与“包括(including)”、“含有(containing)”或“特征在于”同义，并且是包括性或开放性的，不排除另外的未叙述的要素或方法步骤。

以上描述公开了本发明的若干种方法和材料。本发明允许对方法和材料进行修改，并且允许对制造方法和设备进行改变。通过考虑本公开或本文公开的发明的实践，这样的修改对于本领域技术人员将变得显而易见。因此，无意将本发明限于本文公开的特定实施方式，相反，本发明涵盖了落入本发明的真实范围和精神内的所有修改和替代方式。

本文引用的所有参考文献(包括但不限于已公开和未公开的申请、专利和文献参考文献)均以引用的方式整体并入本文，并因此成为本申请文件的一部分。在以引用的方式并入的出版物和专利或专利申请与本申请文件中包含的公开内容相抵触的范围内，本申请文件旨在取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。

序列表

<110> 西雅图儿童医院（DBA西雅图儿童研究所）

<120> 嵌合细胞因子受体

<130> SCRI.215WO

<150> 62/802847

<151> 2019-02-08

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的；GMCSF信号序列

<400> 1

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atccca 66

<210> 2

<211> 456

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的；人IL7细胞因子序列（移除起始密码子）

<400> 2

gattgtgata ttgaaggtaa agatggcaaa caatatgaga gtgttctaat ggtcagcatc 60

gatcaattat tggacagcat gaaagaaatt ggtagcaatt gcctgaataa tgaatttaac 120

ttttttaaaa gacatatctg tgatgctaat aaggaaggta tgtttttatt ccgtgctgct 180

cgcaagttga ggcaatttct taaaatgaat agcactggtg attttgatct ccacttatta 240

aaagtttcag aaggcacaac aatactgttg aactgcactg gccaggttaa aggaagaaaa 300

ccagctgccc tgggtgaagc ccaaccaaca aagagtttgg aagaaaataa atctttaaag 360

gaacagaaaa aactgaatga cttgtgtttc ctaaagagac tattacaaga gataaaaact 420

tgttggaata aaattttgat gggcactaaa gaacac 456

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的；柔性接头序列（甘氨酸4丝氨酸1）2

<400> 3

ggaggcggtg ggagcggagg cggtgggagc 30

<210> 4

<211> 792

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的；人IL7R胞外结构域和跨膜结构域

<400> 4

atgacaattc taggtacaac ttttggcatg gttttttctt tacttcaagt cgtttctgga 60

gaaagtggct atgctcaaaa tggagacttg gaagatgcag aactggatga ctactcattc 120

tcatgctata gccagttgga agtgaatgga tcgcagcact cactgacctg tgcttttgag 180

gacccagatg tcaacatcac caatctggaa tttgaaatat gtggggccct cgtggaggta 240

aagtgcctga atttcaggaa actacaagag atatatttca tcgagacaaa gaaattctta 300

ctgattggaa agagcaatat atgtgtgaag gttggagaaa agagtctaac ctgcaaaaaa 360

atagacctaa ccactatagt taaacctgag gctccttttg acctgagtgt catctatcgg 420

gaaggagcca atgactttgt ggtgacattt aatacatcac acttgcaaaa gaagtatgta 480

aaagttttaa tgcacgatgt agcttaccgc caggaaaagg atgaaaacaa atggacgcat 540

gtgaatttat ccagcacaaa gctgacactc ctgcagagaa agctccaacc ggcagcaatg 600

tatgagatta aagttcgatc catccctgat cactatttta aaggcttctg gagtgaatgg 660

agtccaagtt attacttcag aactccagag atcaataata gctcagggga gatggatcct 720

atcttactaa ccatcagcat tttgagtttt ttctctgtcg ctctgttggt catcttggcc 780

tgtgtgttat gg 792

<210> 5

<211> 855

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的；人IL21R胞内结构域

<400> 5

agcctgaaaa cacaccctct gtggcggctg tggaagaaaa tctgggccgt gccatctcct 60

gagcggttct tcatgcctct gtacaagggc tgcagcggcg acttcaagaa atgggtcgga 120

gcccctttta ccggcagctc tctggaactt ggaccttgga gccctgaggt gcccagcaca 180

ctggaagtgt acagctgtca ccctcctaga agccccgcca agagactgca gctgacagag 240

ctgcaagagc ctgccgagct ggtggaatct gatggcgtgc ccaagcctag cttctggccc 300

acagctcaga atagcggcgg ctctgcctac agcgaggaaa gagatagacc ctacggcctg 360

gtgtccatcg acaccgtgac agtgctggat gccgagggac cttgtacctg gccttgtagc 420

tgcgaggacg atggctaccc tgctctggat ctggacgctg gccttgagcc ttctccagga 480

ctggaagatc ctctgctgga cgccggaaca accgtgctgt cttgtggctg tgtgtctgcc 540

ggatctcctg gacttggagg ccctctggga agcctgctgg atagactgaa acctcctctg 600

gccgacggcg aagattgggc tggtggactt ccttggggcg gaagatctcc aggcggagtg 660

tctgagtctg aagccggttc tccactggcc ggcctggaca tggatacctt cgattctggc 720

ttcgtgggca gcgactgtag cagccctgtg gaatgcgact tcacaagccc tggcgacgag 780

ggcccaccta gaagctatct gagacagtgg gtcgtgatcc ctccacctct gtctagtcct 840

ggacctcagg cttct 855

<210> 6

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的；T2A

<400> 6

ggcggcggag agggcagagg aagtcttcta acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc 60

cct 63

<210> 7

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的；SR39TK基因

<400> 7

atgcccacgc tactgcgggt ttatatagac ggtccccacg ggatggggaa aaccaccacc 60

acgcaactgc tggtggccct gggttcgcgc gacgatatcg tctacgtacc cgagccgatg 120

acttactggc gggtgctggg ggcttccgag acaatcgcga acatctacac cacacaacac 180

cgcctcgacc agggtgagat atcggccggg gacgcggcgg tggtaatgac aagcgcccag 240

ataacaatgg gcatgcctta tgccgtgacc gacgccgttc tggctcctca tatcgggggg 300

gaggctggga gctcacatgc cccgcccccg gccctcacca tcttcctcga ccgccatccc 360

atcgccttca tgctgtgcta cccggccgcg cggtacctta tgggcagcat gaccccccag 420

gccgtgctgg cgttcgtggc cctcatcccg ccgaccttgc ccggcaccaa catcgtgctt 480

ggggcccttc cggaggacag acacatcgac cgcctggcca aacgccagcg ccccggcgag 540

cggctggacc tggctatgct ggctgcgatt cgccgcgttt acgggctact tgccaatacg 600

gtgcggtatc tgcagtgcgg cgggtcgtgg cgggaggact ggggacagct ttcggggacg 660

gccgtgccgc cccagggtgc cgagccccag agcaacgcgg gcccacgacc ccatatcggg 720

gacacgttat ttaccctgtt tcgggccccc gagttgctgg cccccaacgg cgacctgtat 780

aacgtgtttg cctgggcctt ggacgtcttg gccaaacgcc tccgttccat gcacgtcttt 840

atcctggatt acgaccaatc gcccgccggc tgccgggacg ccctgctgca acttacctcc 900

gggatggtcc agacccacgt caccaccccc ggctccatac cgacgatatg cgacctggcg 960

cgcacgtttg cccgggagat gggggaggct aac 993

Claims (59)

1.一种编码嵌合细胞因子受体多肽的多核苷酸，其中，所述嵌合细胞因子受体多肽包含：

栓系至胞外IL-7受体结构域的IL-7；

跨膜结构域；以及

胞内IL-21受体结构域，其中，所述跨膜结构域将所述胞外IL-7受体结构域连接至所述胞内IL-21受体结构域。

2.如权利要求1所述的多核苷酸，所述多核苷酸包含：

编码所述IL-7的第一核酸；

编码系链的第二核酸；

编码所述胞外IL-7受体结构域的第三核酸，其中，所述IL-7通过所述系链连接至所述胞外IL-7受体结构域；

编码所述跨膜结构域的第四核酸；以及

编码胞内IL-21受体结构域的第五核酸。

3.如权利要求1或2所述的多核苷酸，其中，所述系链具有3个氨基酸至30个氨基酸的长度。

4.如权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸，其中，所述跨膜结构域包括IL-7受体跨膜结构域。

5.如权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸，其中，所述第一核酸包含与SEQ ID NO：02具有至少95％同一性的核苷酸序列。

6.如权利要求1-5中任一项所述的多核苷酸，其中，所述第二核酸包含与SEQ ID NO：03具有至少95％同一性的核苷酸序列。

7.如权利要求1-6中任一项所述的多核苷酸，其中，所述第三核酸包含与SEQ ID NO：04具有至少95％同一性的核苷酸序列。

8.如权利要求1-7中任一项所述的多核苷酸，其中，所述第三核酸和第四核酸一起包含与SEQ ID NO：04具有至少95％同一性的核苷酸序列。

9.如权利要求1-8中任一项所述的多核苷酸，其中，所述第五核酸包含与SEQ ID NO：05具有至少95％同一性的核苷酸序列。

10.如权利要求1-9中任一项所述的多核苷酸，其中，所述第一核酸包含SEQ ID NO：02的核苷酸序列。

11.如权利要求1-10中任一项所述的多核苷酸，其中，所述第二核酸包含SEQ ID NO：03的核苷酸序列。

12.如权利要求1-11中任一项所述的多核苷酸，其中，所述第三核酸包含SEQ ID NO：04的核苷酸序列。

13.如权利要求1-12中任一项所述的多核苷酸，其中，所述第三核酸和第四核酸一起包含SEQ ID NO：04的核苷酸序列。

14.如权利要求1-13中任一项所述的多核苷酸，其中，所述第五核酸包含SEQ ID NO：05的核苷酸序列。

15.如权利要求1-14中任一项所述的多核苷酸，所述多核苷酸进一步包含可诱导型启动子。

16.如权利要求1-15中任一项所述的多核苷酸，所述多核苷酸进一步包含可诱导型细胞毒性基因。

17.如权利要求16所述的多核苷酸，其中，所述细胞毒性基因编码选自如下的蛋白质：胸苷激酶、融合至胸苷酸激酶的胸苷激酶、氧化还原酶、脱氧胞苷激酶、尿嘧啶磷酸核糖转移酶、胞嘧啶脱氨酶、或融合至尿嘧啶磷酸核糖转移酶的胞嘧啶脱氨酶。

18.如权利要求16或17所述的多核苷酸，其中，所述细胞毒性基因包括胸苷激酶。

19.如权利要求18所述的多核苷酸，其中，所述胸苷激酶包括SR39TK。

20.如权利要求1-19中任一项所述的多核苷酸，所述多核苷酸进一步包含核糖体跳跃序列。

21.如权利要求20所述的多核苷酸，其中，所述核糖体跳跃序列包括T2A跳跃序列。

22.如权利要求1-21中任一项所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码转导标志物。

23.如权利要求22所述的多核苷酸，其中，所述标志物包括截短的CD19(CD19t)。

24.一种载体，所述载体包含如权利要求1-23中任一项所述的多核苷酸。

25.如权利要求24所述的载体，其中，所述载体包括病毒载体。

26.如权利要求24或25所述的载体，其中，所述载体选自慢病毒载体、腺相关病毒载体或腺病毒载体。

27.如权利要求26所述的载体，其中，所述载体包括慢病毒载体。

28.由如权利要求1-23中任一项所述的多核苷酸编码的多肽。

29.一种细胞，所述细胞包含如权利要求1-23中任一项所述的多核苷酸或由所述多核苷酸编码的蛋白质。

30.如权利要求29所述的细胞，所述细胞进一步包含编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸、或CAR蛋白。

31.如权利要求29或30所述的细胞，其中，所述细胞为T细胞。

32.如权利要求29-31中任一项所述的细胞，其中，所述细胞为CD8+T细胞或CD4+T细胞。

33.如权利要求29-32中任一项所述的细胞，其中，所述细胞衍生自CD8+T细胞或CD4+T细胞。

34.如权利要求29-33中任一项所述的细胞，其中，所述细胞为原代细胞。

35.如权利要求29-34中任一项所述的细胞，其中，所述细胞为哺乳动物的。

36.如权利要求29-35中任一项所述的细胞，其中，所述细胞为人的。

37.如权利要求29-36中任一项所述的细胞，其中，所述细胞为离体的。

38.一种治疗或改善受试者中的癌症的方法，所述方法包括：

向有需要的所述受试者给予如权利要求29-37中任一项所述的细胞。

39.如权利要求38所述的方法，其中，所述癌症的治疗或改善缺乏向所述受试者共同给予细胞因子。

40.如权利要求38所述的方法，所述方法进一步包括向所述受试者共同给予细胞因子，其中，与向给予了包含CAR而缺乏如权利要求1-23中任一项所述的多核苷酸或由所述多核苷酸编码的蛋白质的细胞的受试者所共同给予的所述细胞因子的剂量相比，所给予的所述细胞因子的剂量减少。

41.如权利要求38-40中任一项所述的方法，其中，所述细胞因子选自IL-7、IL-15或IL-21。

42.如权利要求38-41中任一项所述的方法，其中，所述细胞因子包括IL-21。

43.如权利要求38-42中任一项所述的方法，其中，所述细胞对于所述受试者而言是自体的。

44.如权利要求38-43中任一项所述的方法，其中，所述癌症包括实体瘤或非实体瘤，所述实体瘤例如结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、肾癌、胰腺癌、脑癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、肉瘤、骨癌或肝癌，所述非实体瘤例如白血病或多发性骨髓瘤。

45.如权利要求38-44中任一项所述的方法，其中，所述癌症包括脑癌。

46.如权利要求38-45中任一项所述的方法，其中，所述受试者为哺乳动物。

47.如权利要求38-46中任一项所述的方法，其中，所述受试者为人。

48.一种制备包含嵌合抗原受体(CAR)的细胞群的方法，所述方法包括：

(a)用编码嵌合受体的多肽对T细胞进行转导，其中，所述多肽包括如权利要求1-23中任一项所述的多核苷酸；

(b)用编码CAR的多核苷酸对所述T细胞进行转导；以及

(c)在足以刺激所述T细胞的激活和扩增的条件下，对经转导的T细胞进行培养，其中，与足以刺激缺乏所述编码嵌合受体的多核苷酸的T细胞的激活和扩增的量相比，培养基包含量减少的外源性细胞因子。

49.一种制备包含嵌合抗原受体(CAR)的细胞群的方法，所述方法包括：

(a)用如权利要求1-23中任一项所述的多核苷酸对T细胞进行转导；

(b)用编码CAR的多核苷酸对所述T细胞进行转导；以及

(c)在刺激所述T细胞的激活和扩增的条件下，对经转导的T细胞进行培养，其中，培养基缺乏外源性细胞因子。

50.如权利要求48或49所述的方法，其中，步骤(b)在步骤(a)之前进行。

51.如权利要求48或49所述的方法，其中，步骤(a)和步骤(b)同时进行。

52.如权利要求48-51中任一项所述的方法，其中，所述细胞因子选自IL-7、IL-15或IL-21。

53.如权利要求48-52中任一项所述的方法，其中，所述细胞因子包括IL-21。

54.如权利要求48-53中任一项所述的方法，其中，所述细胞为CD8+T细胞或CD4+T细胞。

55.如权利要求48-54中任一项所述的方法，其中，所述细胞衍生自自CD8+T细胞或CD4+T细胞。

56.如权利要求48-55中任一项所述的方法，其中，所述细胞为原代细胞。

57.如权利要求48-56中任一项所述的方法，其中，所述细胞为哺乳动物的。

58.如权利要求48-57中任一项所述的方法，其中，所述细胞为人的。

59.如权利要求48-58中任一项所述的方法，其中，所述细胞为离体的。

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