CN114224851A - 一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂及制备方法 - Google Patents

一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体提供了一种人白细胞介素10‑Fc融合蛋白的冻干粉制剂及制备方法，冻干粉制剂包括：人白细胞介素10‑Fc融合蛋白、缓冲液、蛋白保护剂、冻干赋形剂、表面活性剂；制备方法包括将上述混合溶液经除菌过滤后在冻干机内进行预冻、一次升华干燥和二次解析干燥后得到冻干粉制剂。本发明提供的冻干粉制剂和方法能够保证人白细胞介素10‑Fc融合蛋白复溶后的产品质量属性和产品稳定性，本发明提供了很好的制剂辅料环境和储存条件，使产品在贮存、运输和使用过程中，有效降低制剂中蛋白的聚集、降解的生成速率，提高了药物的物理和化学稳定性，确保蛋白活性，降低了融合蛋白在长期存放中的安全性风险。

Description

一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂及制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂及制备方法。
背景技术
人白细胞介素10(IL-10)是一种多细胞源、多功能的细胞因子，调节细胞的生长与分化，参与炎性反应和免疫反应，是公认的炎症与免疫抑制因子。人的IL-10基因位于1号染色体上，是由178个氨基酸组成的约35KD大小的二聚体。其在肿瘤、感染及心血管系统的发病机理中发挥重要作用。但是，重组人IL-10在体内半衰期只有2个小时，很快会被清除，这严重影响了其在疾病治疗中的应用。为此，现有技术中，将重组人IL-10与免疫球蛋白Fc片段融合形成人白细胞介素10-Fc融合蛋白，以此来延长重组人IL-10的半衰期，成为了主要研究方向，例如专利申请号为201910947766.3，专利名称为一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白及其医药用途的公开技术。
众所周知，生物分子具有复杂的高级结构，在形成制剂或者存储过程中，会在各种影响因素下发生聚集，经历多种化学和物理变性或降解，人白细胞介素10-Fc融合蛋白和大多数的蛋白分子一样，同样会出现上述类似问题。人白细胞介素10-Fc融合蛋白的稳定性较差，在室温条件下放置很快即发生电荷异构体和聚集体的变化，使得蛋白在2-8℃的条件下其稳定性不足以支撑足够长的药品有效期；此外，IL-10分子量大，其与Fc片段组合成的融合蛋白相比于一般的Fc融合蛋白的稳定性天然更差，在制剂开发过程中我们发现其热稳定性较差，在室温条件下容易出现电荷异构体的偏移，其蛋白结构更容易发生变化，保持蛋白药物的高级结构是发挥它们生物学活性的最基本条件，这些因物理或化学变化产生的相关蛋白，不仅可能造成蛋白药物的活性减弱，可能还会对用药的安全性产生很大的影响，特别是一些蛋白聚集物会激发人体的免疫反应，轻者降低生物药物的疗效，重者产生严重的不良反应甚至会造成病人的死亡。为此，蛋白类药物不仅需要在制备过程中维持其稳定性，在生产结束时得到高纯度的产品，还要在运输、储存和临床使用过程中保持其结构稳定。所以，考虑到人白细胞介素10-Fc融合蛋白分子量较大，蛋白浓度较高，稳定性较差的特点，为了维持其在生产过程、储运和临床使用过程中质量一致，急需研发一种能够使人白细胞介素10-Fc融合蛋白稳定存储的冻干粉制剂。
发明内容
为了保证人白细胞介素10-Fc融合蛋白在存储、运输和临床使用过程中的长期稳定性，本发明提供了一种专门针对人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂及制备方法。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂，所述冻干粉制剂包括：
Figure BDA0003364685850000021
其中，所述冻干粉制剂的pH值为6.5-7.5。
本发明的目的是提供给了一种专门针对人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂，该冻干粉制剂中包括的不同含量的缓冲液、蛋白保护剂、冻干赋形剂和表面活性剂协同配合，有效保证了高浓度的人白细胞介素10-Fc融合蛋白的稳定性、可溶性、体液平衡(pH)以及血液等渗性，进而使其稳定性足以支撑足够长的药品有效期。
进一步的，所述人白细胞介素10-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
优选的，所述人白细胞介素10-Fc融合蛋白的含量为10-20mg/mL。
本发明中主要针对序列如SEQ ID NO.1所示的人白细胞介素10-Fc融合蛋白，该融合蛋白来源于专利申请号为201910947766.3，专利名称为一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白及其医药用途中提供的融合蛋白，本发明中冻干粉制剂中融合蛋白的高浓度比例及蛋白的结构稳定性是制剂研发的难点，经过大量的实验验证，人白细胞介素10-Fc融合蛋白的浓度含量为10-20mg/mL，能够满足冻干粉制剂的长期稳定性要求。
进一步的，所述冻干粉制剂的pH值为6.5-7.0。
进一步的，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、Tris-盐酸缓冲液或组氨酸缓冲液中的一种或多种组合。
优选的，所述缓冲液为10-20mM的磷酸盐缓冲液。
缓冲液能够为人白细胞介素10-Fc融合蛋白提供适宜存放环境，有效保证了蛋白稳定性。
进一步的，所述蛋白保护剂包括精氨酸、赖氨酸或甘氨酸中的一种或多种组合；
优选的，所述蛋白保护剂为赖氨酸。
进一步的，所述冻干赋形剂包括蔗糖、甘露醇或海藻糖的一种或多种组合；
优选的，所述冻干赋形剂为海藻糖，所述海藻糖为α-海藻糖。
进一步的，所述表面活性剂包括聚山梨酯20、聚山梨酯80或泊洛沙姆中的一种或多种组合；
优选的，所述表面活性剂为0.008-0.015％w/v的泊洛沙姆。
表面活性剂能够明显改善人白细胞介素10-Fc融合蛋白在临床使用过程中的亚可见微粒的控制，有利于减少可能的不良反应。
本发明还提供了一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1、将权利要求1中所述人白细胞介素10-Fc融合蛋白、所述缓冲液、所述蛋白保护剂、所述冻干赋形剂和所述表面活性剂充分混合均匀，然后调节所述pH值为6.5-7.5，加入注射用水后进行除菌过滤，即得到滤液；
S2、将所述滤液在冻干机内进行预冻、一次干燥、二次干燥后得到人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂。
进一步的，步骤S2包括以下方法：
S21、预冻：将所述滤液放置在冻干机内，将所述冻干机内的温度在1-3小时内降温到-40至-50℃，然后设置预冻时间为1-3小时；
S22、一次干燥：预冻结束后，设置温度在-25至-35℃，真空度为10-25Pa条件下干燥20-50小时；
S23、二次干燥：一次干燥结束后，设置温度在25至40℃条件下，二次干燥4-6小时，即得到人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂；
优选的，步骤S21中，将所述冻干机内的温度在1小时内快速降温到-50℃。
本发明根据人白细胞介素10-Fc融合蛋白的结构特性，筛选并优化适宜的冻干工艺条件，专门提供了针对人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂的制备方法，该方法已经通过了规模化生产的验证，通过该方法制备的冻干粉制剂有效提高了高浓度的蛋白稳定性和制剂属性，具备商业化生产的条件，除了在成药性和临床应用的创新性外，还显示出了极强的实用价值，此外，本发明中采用快冻的预冻方式，将冻干机板层温度在1小时内快速降温到-50℃，实现了快冻，缩短冻干时间，降低了成本。
本发明的有益效果如下：本发明提供的冻干粉制剂以冻干剂型特有的优势保证产品的稳定性，并以冻干处方中的缓冲盐液、蛋白保护剂、冻干赋形剂、表面活性剂相互作用的协同配合，保证了人白细胞介素10-Fc融合蛋白复溶后的产品质量属性(尤其是亚可见颗粒控制)和产品稳定性，提供了很好的制剂辅料环境和储存条件，使得产品在贮存、运输和使用过程中，能有效降低制剂中蛋白的聚集、降解的生成速率，提高抗体的物理和化学稳定性，确保蛋白活性的同时，降低了融合蛋白在长期存放中的安全性风险；此外，本发明还提供了人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂的制备方法，通过该方法制备的冻干粉制剂具有产品稳定性好、蛋白浓度高、工艺放大稳健等特点，提供了一种成熟可用的针对人白细胞介素10-Fc融合蛋白冻干粉制剂的制备方法。
附图说明
图1为本发明实验五中亚可见微粒的测定图一；
图2为本发明实验五中亚可见微粒的测定图二；
图3为本发明实验五中亚可见微粒的测定图三；
图4为本发明实验六中冻干显微镜对人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂的塌陷温度拍摄图；
图5为本发明实验六中1小时快速预冻的冻干曲线图；
图6为本发明实验六中3小时慢速预冻的冻干曲线图；
图7为本发明实验七中预冻方式实际过程中的冻干曲线图。
具体实施方式
下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1-4
本发明实施例1-4分别提供了一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂，冻干粉装至2mL西林瓶中，1mL/瓶，冻干粉制剂包括以下成分：
Figure BDA0003364685850000061
人白细胞介素10-Fc融合蛋白为专利申请号为201910947766.3，专利名称为一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白及其医药用途公开的人白细胞介素10-Fc融合蛋白，来源于该专利权人北京东方百泰生物科技股份有限公司，人白细胞介素10-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体序列如下：
SPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKAYACAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
上述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、Tris-盐酸缓冲液或组氨酸缓冲液中的一种或多种组合；上述蛋白保护剂包括精氨酸、赖氨酸或甘氨酸中的一种或多种组合；上述冻干赋形剂包括蔗糖、甘露醇或海藻糖的一种或多种组合；上述表面活性剂包括聚山梨酯20、聚山梨酯80或泊洛沙姆中的一种或多种组合。
冻干粉制剂的制备方法为：
S1、将上述人白细胞介素10-Fc融合蛋白、缓冲液、蛋白保护剂、冻干赋形剂和表面活性剂充分混合均匀，然后调节pH值为6.5，加入注射用水后进行除菌过滤，即得到滤液；
S2、将滤液在冻干机内进行预冻、一次干燥、二次干燥后得到人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂。
实施例5-9
本发明实施例5-9分别提供了一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂，冻干粉装至2mL西林瓶中，1mL/瓶，冻干粉制剂包括以下成分：
Figure BDA0003364685850000071
上述蛋白保护剂包括精氨酸、赖氨酸或甘氨酸中的一种或多种组合；上述冻干赋形剂包括蔗糖、甘露醇或海藻糖的一种或多种组合；上述表面活性剂包括聚山梨酯20、聚山梨酯80或泊洛沙姆中的一种或多种组合。
人白细胞介素10-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
冻干粉制剂的制备方法与实施例1-4相同。
实施例10-22
本发明实施例10-22分别提供了一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂，冻干粉装至2mL西林瓶中，1mL/瓶，冻干粉制剂包括以下成分：
Figure BDA0003364685850000072
上述蛋白保护剂包括精氨酸、赖氨酸或甘氨酸中的一种或多种组合；上述冻干赋形剂包括蔗糖、甘露醇或海藻糖的一种或多种组合；上述表面活性剂包括聚山梨酯20、聚山梨酯80或泊洛沙姆中的一种或多种组合。
人白细胞介素10-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
冻干粉制剂的制备方法与实施例1-4相同。
实施例23-31
本发明实施例23-31分别提供了一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂，冻干粉装至2mL西林瓶中，1mL/瓶，冻干粉制剂包括以下成分：
Figure BDA0003364685850000081
上述冻干赋形剂包括蔗糖、甘露醇或海藻糖的一种或多种组合；上述表面活性剂包括聚山梨酯20、聚山梨酯80或泊洛沙姆中的一种或多种组合。
人白细胞介素10-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
冻干粉制剂的制备方法与实施例1-4相同。
实施例32-36
本发明实施例23-31分别提供了一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂，冻干粉装至2mL西林瓶中，1mL/瓶，冻干粉制剂包括以下成分：
Figure BDA0003364685850000082
上述表面活性剂包括聚山梨酯20、聚山梨酯80或泊洛沙姆中的一种或多种组合。人白细胞介素10-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
冻干粉制剂的制备方法与实施例1-4相同。
实施例37-47
本发明实施例37-47分别提供了一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂，冻干粉装至2mL西林瓶中，1mL/瓶，冻干粉制剂包括以下成分：
Figure BDA0003364685850000091
人白细胞介素10-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
冻干粉制剂的制备方法与实施例1-4相同。
实施例48
本发明实施例48在上述实施例1-47的基础上进一步限定了人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂的制备方法中的步骤S2，具体方法如下：
S21、预冻：将滤液放置在冻干机内，将冻干机内的温度在3小时内降温到-50℃，然后设置预冻时间为1-3小时；S22、一次干燥：预冻结束后，设置温度在-25℃，真空度为25Pa条件下干燥20-50小时；S23、二次干燥：一次干燥结束后，设置温度在25-40℃条件下，二次干燥4-6小时，即得到人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂。
实施例49
本发明实施例49在实施例48的基础上进一步限定了步骤S21中，将所述冻干机内的温度在1小时内快速降温到-50℃，其余方法和实验参数与实施例48相同。
实施例50
本发明实施例50在实施例48的基础上进一步限定了步骤S22中，一次干燥：预冻结束后，设置温度在-30℃，真空度为20Pa条件下干燥20-50小时；其余方法和实验参数与实施例48相同。
实施例51
本发明实施例51在实施例48的基础上进一步限定了步骤S22中，一次干燥：预冻结束后，设置温度在-35℃，真空度为10Pa条件下干燥20-50小时；其余方法和实验参数与实施例48相同。
实验一、不同pH值范围对蛋白稳定性影响实验
1、按照实施例5-9公开的成分和含量通过实施例1中公开的制备方法制备人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂，制备的冻干粉制剂分装完毕后检测蛋白的热稳定性，然后将样品放置40±2℃培养箱，分别进行蛋白浓度和纯度的稳定性检测。
2、分析检测方法：
热稳定性，采用多功能蛋白质稳定性分析系统(UNcle)检测热变性温度(Tm)、变性起始温度(Tonset)、聚集温度(Tagg)；纯度检测，采用分子排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)检测；蛋白浓度，采用紫外分光光度法检测。
3、热稳定性检测结果如下：
通过多功能蛋白质稳定性分析系统(UNcle)考察蛋白构象(Tm和Tonset)和胶体稳定性(Tagg)，通过40±2℃加速试验考察蛋白纯度(SEC-HPLC)和蛋白浓度变化，筛选相对稳定的pH范围，检测结果如下：
Figure BDA0003364685850000101
40±2℃加速稳定性考察结果如下：
Figure BDA0003364685850000111
热稳定性检测结果显示，人白细胞介素10-Fc融合蛋白的Tm(热变性温度)较低(50℃左右或低于50℃)，显示蛋白的热稳定性较差；加速稳定性考察结果显示，蛋白样品在40±2℃加速放置1周后，纯度均明显下降，实施例5、实施例6下降最多(下降25％左右)，实施例7-8下降最少(下降12％左右)，蛋白浓度在放置过程中未发生明显变化，初步结果显示在pH6.5-7.5范围内，人白细胞介素10-Fc融合蛋白相对较为稳定，pH7.0时，人白细胞介素10-Fc融合蛋白最为稳定。
实验二、不同缓冲液对蛋白稳定性影响实验
1、选择pH值7.0的缓冲液内开展缓冲液体系，主要通过热稳定性(Tm、Tonset、Tagg)检测，考察蛋白构象稳定性和胶体稳定性，通过40±2℃加速稳定性试验，考察蛋白浓度和纯度变化，筛选合适的缓冲液体系。
2、按照实施例10-22公开的成分和含量通过实施例1中公开的制备方法制备人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂，制备的冻干粉制剂分装完毕后检测蛋白的热稳定性，然后将样品放置40±2℃培养箱，分别进行蛋白浓度和纯度的稳定性检测，检测方法与实验一相同。
3、热稳定性检测结果如下：
Figure BDA0003364685850000112
Figure BDA0003364685850000121
40±2℃加速稳定性考察结果：
Figure BDA0003364685850000122
热稳定性检测结果显示，通过实验例15-17得知，缓冲液为10-20mM的磷酸盐缓冲液时，蛋白的Tm和Tagg相对于其他的缓冲液均较高；加速稳定性的结果显示，40±2℃放置1周后，各处方样品蛋白浓度未发生明显变化，纯度均出现下降，其中实施例10和14下降最多(下降30％多)，实施例11-13与实施例10和14对比，说明本发明限定的缓冲液含量为10-40mM时，蛋白较为稳定，超过或低于这个含量范围时，SEC-HPLC纯度(％)和蛋白浓度均降低，实施例11-13与实施例15-22得知，实施例15-17下降相对较少，说明缓冲液为10-20mM的磷酸盐缓冲液时蛋白较为稳定，实施例17下降最少(下降9％左右)，所以可以得知，缓冲液为20mM的磷酸盐缓冲液对于人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂最为稳定。
实验三、不同蛋白保护剂对蛋白稳定性影响实验
1、选择pH值7.0的磷酸盐缓冲液内开展蛋白保护剂的筛选，主要通过热稳定性(Tm、Tonset、Tagg)检测，考察蛋白构象稳定性和胶体稳定性，通过40±2℃加速稳定性试验，考察蛋白浓度和纯度变化，筛选合适的蛋白保护剂。
2、按照实施例23-31公开的成分和含量，通过实施例1中公开的制备方法制备人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂，制备的冻干粉制剂分装完毕后放置40±2℃培养箱，分别进行蛋白浓度和纯度的稳定性检测，检测方法与实验一相同。
3、40±2℃加速稳定性考察结果如下：
Figure BDA0003364685850000131
稳定性结果显示，40±2℃加速放置10天后，虽然蛋白浓度在加速放置10天后各处方均无明显变化，但是，人白细胞介素10-Fc融合蛋白纯度的均不同程度下降，实施例27蛋白纯度下降最少(下降10％左右)，所以，本发明优选的蛋白保护剂为赖氨酸可以使蛋白稳定性更好；此外，本实验三与实验二相比，人白细胞介素10-Fc融合蛋白浓度从10mg/mL浓度提升到15mg/mL后纯度表现变化不大。
实验四、不同冻干赋形剂对蛋白稳定性影响实验
1、选择pH值7.0的磷酸盐缓冲液、蛋白保护剂为5mM的赖氨酸内开展冻干赋形剂的筛选，主要通过热稳定性(Tm、Tonset、Tagg)检测，考察蛋白构象稳定性和胶体稳定性，通过40±2℃加速稳定性试验，考察蛋白浓度和纯度变化，筛选合适的冻干赋形剂。
2、按照实施例32-36公开的成分和含量，通过实施例1中公开的制备方法制备人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂，制备的冻干粉制剂分装完毕后放置40±2℃培养箱，分别进行蛋白浓度和纯度的稳定性检测，检测方法与实验一相同。
3、40±2℃加速稳定性考察结果如下：
Figure BDA0003364685850000141
通过上述实施例可得知，本发明中限定的冻干赋形剂为α-海藻糖对人白细胞介素10-Fc融合蛋白稳定性相对其他冻干赋形剂较好。
实验五、不同表面活性剂对蛋白稳定性影响实验
1、选择pH值7.0的磷酸盐缓冲液、蛋白保护剂为5mM的赖氨酸及8％w/v的α-海藻糖内开展表面活性剂的筛选，主要通过热稳定性(Tm、Tonset、Tagg)检测，考察蛋白构象稳定性和胶体稳定性，通过25±2℃加速稳定性试验，考察蛋白浓度和纯度变化，筛选合适的表面活性剂。
2、按照实施例37-47公开的成分和含量，通过实施例1中公开的制备方法制备人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂，实施例45提供的融合蛋白的成分同时制备成注射液，制备的冻干粉制剂和注射液分装完毕后放置25±2℃培养箱，分别进行蛋白浓度和纯度的稳定性检测，检测方法与实验一相同。
3、25±2℃加速稳定性考察结果如下：
Figure BDA0003364685850000142
Figure BDA0003364685850000151
研究结果加速稳定性考察两周后，实施例43-47与其他实施例对比可以得出，本发明实施例提供的表面活性剂选择泊洛沙姆对抑制聚集体的产生有明显的作用，聚山梨酯80与聚山梨酯20对蛋白的稳定性有所帮助但影响较小，泊洛沙姆对蛋白稳定的帮助相对更大。
实施例44和45提供的人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂SEC-HPLC纯度明显高于实施例43和实施例46、实施例47，说明本发明优选的表面活性剂为0.008-0.015％w/v的泊洛沙姆，能够有效抑制蛋白聚集；同时，实施例45与同成分的注射液相比，结果显示冻干剂型在加速放置两周后纯度和电荷异构体均未发生明显变化，冻干样品的稳定性明显优于液体液。
4、设置对照空白组，不添加表面活性剂，其他成分与实施例41和实施例44相同，考察表面活性剂的添加与否及种类会影响样品的亚可见微粒的情况，亚可见微粒检测的考察结果如下：
(1)不添加表面活性剂的对照空白组样品亚可见微粒的测定结果如下，附图参考图1：
Figure BDA0003364685850000152
(2)添加聚山梨酯80的实施例41蛋白样品亚可见微粒的测定结果如下，附图参考图2：
Figure BDA0003364685850000161
(3)添加泊洛沙姆的实施例44蛋白样品亚可见微粒的测定结果如下，附图参考图3：
Figure BDA0003364685850000162
如图1-3，亚可见颗粒研究结果显示：添加表面活性剂泊洛沙姆的实施例44样品相比于添加聚山梨酯80的实施例41或不添加表面活性剂的空白对照组样品的亚可见微粒的数量更少，有利于蛋白药物给药过程中的颗粒的控制，所以本发明优先选择表面活性剂为泊洛沙姆。
综上，本发明通过上述实验例筛选出本发明针对人白细胞介素10-Fc融合蛋白最佳冻干粉制剂的成分如下：
Figure BDA0003364685850000163
其中，冻干粉制剂的pH值为6.5-7.0。
实验六、人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂制备工艺条件筛选
1、选择上述实验五中筛选出的最佳成分的人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂，筛选冻干制剂制备方法的工艺条件，冻干工艺开发之前，需要通过冻干显微镜对人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂的塌陷温度进行检测，通过冻干显微镜拍摄，结果如图4所示，发现人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂的塌陷温度为-29℃。
2、在获得人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂的关键温度(塌陷温度Tc)后，使用实验五中筛选出的最佳成分的人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂相同的处方和升华条件对预冻方式(慢冻和快冻)进行了对比、并对升华温度和速率与真空度的配合进行了优化。
3、选择实验五中筛选出的最佳成分的人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂，分别通过实施例48和实施例49中公开的制备方法制备不同的冻干制剂，制备的冻干制剂结束后压塞，轧盖。分装完毕后将样品放置25±2℃培养箱，分别按计划进行外观、复溶后外观、复溶时间、纯度和水分含量的稳定性考察。
4、分析检测方法：
外观：采用目测的方法
复溶后外观及复溶时间，使用1ml注射用水复溶冻干粉，记录溶解过程用时间和溶解后的颜色和外观；
纯度检测，采用分子排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)检测；
水分含量，采用卡尔费休法检测冻干粉的水分含量。
(1)实施例48和实施例49提供的预冻方式的比较
使用相同的制剂处方，在预冻步骤分别采用实施例49中冻干机内的温度在1小时内快速降温到-50℃和实施例48中冻干机内的温度在1小时内慢速降温的方式进行预冻，冻干曲线设定如下：
Figure BDA0003364685850000171
如图5和图6所示：冻干结束后，采用实施例49中采用1小时快冻的预冻方式得到的样品与实施例48中采用3小时慢冻的预冻方式得到的样品相比，样品外观和产品质量，并没有显著区别，所以本发明优选实施例49中1小时快冻的预冻方式进行预冻，大大减少了冻干制备过程的总体时间，节省了冻干成本。
(2)一次干燥中温度和真空度的协同调整
同样选择实验五中筛选出的最佳成分的人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂，分别通过实施例48、50和51中提供的制备方法制备冻干粉制剂，筛选一次干燥中所需的实验条件，具体如下：
一次干燥是冻干中水分大量升华的阶段，也是冻干过程中最耗时间的部分。影响该阶段升华效率的两个主要因素是板层温度和箱体真空度，具体筛选如下：
按照实施例48中提供的一次干燥中的条件设定，-25℃的板层温度，真空度25Pa，冻干工艺条件1设定如下：
Figure BDA0003364685850000181
按照实施例50中提供的一次干燥中的条件设定，-30℃的板层温度，真空度20Pa，冻干工艺条件2设定如下：
Figure BDA0003364685850000182
按照实施例51中提供的一次干燥中的条件设定，-35℃的板层温度，真空度10Pa，冻干工艺条件3设定如下：
Figure BDA0003364685850000183
一次升华温度和真空度协同调整的结果显示，-25℃到-35℃的一次升华温度均可作为主升华阶段的板层温度，当板层温度较低时，同时应设定较低的真空，保证产品能进行较好的对流传导，同样可以达到一次升华温度较高时的升华效率，所以本发明优选一次干燥中板层温度为-25-35℃，真空度为10-25Pa条件下干燥20-50小时。
综上，我们通过缓冲体系、不同pH、不同蛋白保护剂、不同赋形剂、不同表面活性剂和不同抗体浓度等方面的考察拟定了制剂处方，并在该处方条件下测定了IL-10Fc融合蛋白制剂的关键温度。以关键温度为依据，开展了冻干工艺的开发，对预冻方式(快冻或者慢冻)、一次干燥条件进行了优化，得到了较为优化的制备方法条件。
实验七、冻干工艺放大后稳定性检测
(1)根据上述实验六中筛选的制备方法的条件，选择实验五中筛选出的最佳成分的人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂分别放置在冻干机不同板层位置，并分别命名为产品01、产品02和产品03；进行放大生产时，在生产型冻干机上拟定了如下的工艺参数：
Figure BDA0003364685850000191
实验过程中执行的温度和真空度曲线如图7所示：其中产品01、产品02和产品03分别为不同板层位置的样品，结果显示不同位置的产品确实存在不同的升华曲线，冻干过程中充分考虑到所有板层的所有样品的升华全部结束后再结束干燥过程，同样获得了较好的冻干的外观和产品质量。
(2)选择实验五中筛选出的最佳成分的人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂，通过实施例48、实施例50和实施例51提供的方法及上述放大生产方法生产冻干粉制剂样品，并于25±2℃加速稳定性结果如下：
Figure BDA0003364685850000192
Figure BDA0003364685850000201
以上研究的结果显示，本发明通过上述冻干工艺的放大生产后(从0.1平方米的冻干面积扩大到5平方米的冻干面积，即四百只到两万只冻干产品的规模放大)，且产品质量及稳定性没有明显区别，所以可以说明，本发明提供的制备方法能够用于放大生产。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京东方百泰生物科技股份有限公司
<120> 一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂及制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 417
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1 5 10 15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20 25 30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85 90 95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100 105 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115 120 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130 135 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145 150 155 160
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys
180 185 190
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Glu Gly Gly Pro
195 200 205
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
210 215 220
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
225 230 235 240
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
245 250 255
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
260 265 270
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Ala
275 280 285
Tyr Ala Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
290 295 300
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
305 310 315 320
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
325 330 335
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
340 345 350
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
355 360 365
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
370 375 380
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
385 390 395 400
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
405 410 415
Lys

Claims (10)

1.一种人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂，其特征在于，所述冻干粉制剂包括：
Figure FDA0003364685840000011
其中，所述冻干粉制剂的pH值为6.5-7.5。
2.如权利要求1所述的冻干粉制剂，其特征在于，所述人白细胞介素10-Fc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
优选的，所述人白细胞介素10-Fc融合蛋白的含量为10-20mg/mL。
3.如权利要求1所述的冻干粉制剂，其特征在于，所述冻干粉制剂的pH值为6.5-7.0。
4.如权利要求1所述的冻干粉制剂，其特征在于，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、Tris-盐酸缓冲液或组氨酸缓冲液中的一种或多种组合。
5.如权利要求4所述的冻干粉制剂，其特征在于，所述缓冲液为10-20mM的磷酸盐缓冲液。
6.如权利要求1所述的冻干粉制剂，其特征在于，所述蛋白保护剂包括精氨酸、赖氨酸或甘氨酸中的一种或多种组合；
优选的，所述蛋白保护剂为赖氨酸。
7.如权利要求1所述的冻干粉制剂，其特征在于，所述冻干赋形剂包括蔗糖、甘露醇或海藻糖的一种或多种组合；
优选的，所述冻干赋形剂为海藻糖，所述海藻糖为α-海藻糖。
8.如权利要求1所述的冻干粉制剂，其特征在于，所述表面活性剂包括聚山梨酯20、聚山梨酯80或泊洛沙姆中的一种或多种组合；
优选的，所述表面活性剂为0.008-0.015％w/v的泊洛沙姆。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
S1、将权利要求1中所述人白细胞介素10-Fc融合蛋白、所述缓冲液、所述蛋白保护剂、所述冻干赋形剂和所述表面活性剂充分混合均匀，然后调节所述pH值为6.5-7.5，加入注射用水后进行除菌过滤，即得到滤液；
S2、将所述滤液在冻干机内进行预冻、一次干燥、二次干燥后得到人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤S2包括以下方法：
S21、预冻：将所述滤液放置在冻干机内，将所述冻干机内的温度在1-3小时内降温到-40至-50℃，然后设置预冻时间为1-3小时；
S22、一次干燥：预冻结束后，设置温度在-25至-35℃，真空度为10-25Pa条件下干燥20-50小时；
S23、二次干燥：一次干燥结束后，设置温度在25至40℃条件下，二次干燥4-6小时，即得到人白细胞介素10-Fc融合蛋白的冻干粉制剂；
优选的，步骤S21中，将所述冻干机内的温度在1小时内快速降温到-50℃。
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