JP2023540761A - Ｉｌ－２変異体およびその用途 - Google Patents

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Abstract

本開示は、ＩＬ－２変異体およびその使用を開示する。より具体的には、本開示は、ＩＬ－２変異体および対応する融合タンパク質、抱合体、核酸断片、ベクター、宿主細胞、変異体又は融合タンパク質を調製する方法、当該方法によって調製されたＩＬ－２変異体又は融合タンパク質、医薬組成物、製薬学的使用、疾患を治療する方法、ならびに制御性Ｔ細胞を優先的に刺激する方法を提供する。本開示のＩＬ－２変異体は、野生型ＩＬ－２と比較して、Ｔｍ値が高く、安定性が向上している。あるいは、本開示のＩＬ－２変異体は、野生型ＩＬ－２と比較して、収量が増加し、ＩＬ－２Ｒβγ複合体に対する結合活性が変化している。

Description

本開示は、生物医学の分野に関し、特にＩＬ－２変異体およびその使用に関する。
インターロイキン２（ＩＬ－２）は、当初、Ｔ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）として同定されたが、その後の研究において、受容体に結合し、Ｔ細胞やＮＫ細胞などの免疫細胞の増殖および活性化を促進することが見出されている。
ＩＬ－２受容体としては、ＩＬ－２Ｒαサブユニット（ＣＤ２５）、ＩＬ－２Ｒβサブユニット（ＣＤ１２２）、およびＩＬ－２Ｒγサブユニット（ＣＤ１３２）が挙げられる。異なるサブユニットによって、高親和性受容体ＩＬ－２Ｒαβγ、中親和性受容体ＩＬ－２Ｒβγ、および低親和性受容体ＩＬ－２Ｒα又はＩＬ－２Ｒαβなどの親和性の異なる受容体複合体を形成することができる。異なる細胞は、異なる種類のＩＬ－２Ｒサブユニットを発現する。例えば、休止状態にある従来型のＴ細胞（ＣＤ４＋ＴおよびＣＤ８＋Ｔ）は、通常、細胞表面にＩＬ－２受容体β（ＩＬ－２Ｒβ、ＣＤ１２２）およびＩＬ－２受容体γ（ＩＬ－２Ｒγ、ＣＤ１３２）を発現するが、ＩＬ－２α受容体（ＩＬ－２Ｒα、ＣＤ２５）はほとんど発現しない。しかしながら、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）においては、ＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２Ｒγに加えて、ＩＬ－２Ｒαが構造的に高度に発現される。
現在、研究者は、ＩＬ－２又はその変異体を用いて免疫細胞又は免疫細胞のサブセットを活性化して、腫瘍又は自己免疫疾患を治療することを試みている。例えば、悪性黒色腫又は転移腎細胞癌の治療用に、高用量のＩＬ－２が承認されており、また、自己免疫疾患の臨床試験に、ＰＥＧ－ＩＬ－２抱合体であるＮＫＴＲ－３５８が承認されている。
したがって、ＩＬ－２の安定性および収量を向上させ、かつ／又は特定の受容体複合体への結合能を変化させることは、ＩＬ－２薬の開発にとって非常に重要である。この点を鑑みて、本開示を提案するものである。
本開示は、ＩＬ－２変異体、融合タンパク質、抱合体、核酸断片、ベクター、宿主細胞、変異体又は融合タンパク質を調製する方法、当該方法によって調製されたＩＬ－２変異体又は融合タンパク質、医薬組成物、製薬学的使用、治療方法、および制御性Ｔ細胞を優先的に刺激する方法を提供する。
第１の態様において、本開示は、野生型ＩＬ－２と比較して、Ｑ１３、Ｌ１８、Ｇ２７、Ｙ３１、Ａ７３、Ｈ７９、Ｐ８２、Ｉ８９、Ｎ９０、Ｖ９１、Ｖ９３、Ｆ１１７、又はＲ１２０において１つ以上の変異を含むＩＬ－２変異体を提供する。
いくつかの特定の実施形態において、変異は、欠失、挿入、又は置換であり、好ましくは置換である。
いくつかの特定の実施形態において、ＩＬ－２変異体は、Ｑ１３Ｌ、Ｌ１８Ｉ、Ｇ２７Ｗ、Ｙ３１Ｖ、Ａ７３Ｌ、Ｈ７９Ｑ、Ｐ８２Ｌ、Ｉ８９Ｌ、Ｎ９０Ｙ、Ｖ９１Ａ、Ｖ９３Ｉ、Ｆ１１７Ｗ、又はＲ１２０Ｆのうちの１つ以上の変異を含む。
いくつかの特定の実施形態において、ＩＬ－２変異体は、（ａ）群から（ｈ）群のうちの少なくとも１つの群の変異を含む：
（ａ）．Ｙ３１／Ａ７３／Ｈ７９における変異；好ましくはＹ３１Ｖ／Ａ７３Ｌ／Ｈ７９Ｑにおける変異；
（ｂ）．Ｑ１３における変異；好ましくはＱ１３Ｌにおける変異；
（ｃ）．Ｒ１２０における変異；好ましくはＲ１２０Ｆにおける変異；
（ｄ）．Ｌ１８／Ｖ９１／Ｆ１１７における変異；好ましくはＬ１８Ｉ／Ｖ９１Ａ／Ｆ１１７Ｗにおける変異；
（ｅ）．Ｌ１８／Ｉ８９／Ｖ９３における変異；好ましくはＬ１８Ｉ／Ｉ８９Ｌ／Ｖ９３Ｉにおける変異；
（ｆ）．Ｇ２７／Ｒ１２０における変異；好ましくはＧ２７Ｗ／Ｒ１２０Ｆにおける変異；
（ｇ）．Ｐ８２／Ｒ１２０における変異；好ましくはＰ８２Ｌ／Ｒ１２０Ｆにおける変異；
（ｈ）．Ｎ９０／Ｒ１２０における変異；好ましくはＮ９０Ｙ／Ｒ１２０Ｆにおける変異。
いくつかの特定の実施形態において、ＩＬ－２変異体は、配列番号２から配列番号９のいずれか１つに示すアミノ酸配列を有する。
いくつかの特定の実施形態において、ＩＬ－２変異体のＴｍ値は、野生型ＩＬ－２のＴｍ値よりも高い。
いくつかの特定の実施形態において、野生型ＩＬ－２は、配列番号６０又は配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。
いくつかの特定の実施形態において、ＩＬ－２変異体は、Ｈ１６、Ｄ２０、Ｎ８８、Ｖ９１、又はＱ１２６における変異、例えば、Ｈ１６Ｅ、Ｄ２０Ａ、Ｄ２０Ｈ、Ｄ２０Ｙ、Ｎ８８Ａ、Ｎ８８Ｉ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｄ、Ｖ９１Ｒ、Ｖ９１Ｋ、Ｑ１２６Ｌ、又はＱ１２６Ｆからなる群から選択される１つ以上の変異をさらに含む。
好ましくは、ＩＬ－２変異体は、（ｉ）群から（ｉｖ）群のうちから選択される少なくとも１つの群の変異をさらに含む：
（ｉ）．Ｈ１６における変異；好ましくはＨ１６Ｅにおける変異；
（ｉｉ）．Ｄ２０における変異；好ましくはＤ２０Ａにおける変異；
（ｉｉｉ）．Ｖ９１における変異；好ましくはＶ９１Ｒにおける変異；
（ｉｖ）．Ｈ１６／Ｖ９１における変異；好ましくはＨ１６Ｅ／Ｖ９１Ｒにおける変異。
いくつかの特定の実施形態において、ＩＬ－２変異体は、（ａ）群から（ｎ）群のうちの少なくとも１つの群の変異を含む：
（ａ）．Ｈ１６／Ｙ３１／Ａ７３／Ｈ７９における変異；好ましくはＨ１６Ｅ／Ｙ３１Ｖ／Ａ７３Ｌ／Ｈ７９Ｑにおける変異；
（ｂ）．Ｈ１６／Ｒ１２０における変異；好ましくはＨ１６Ｅ／Ｒ１２０Ｆにおける変異；
（ｃ）．Ｈ１６／Ｌ１８／Ｖ９１／Ｆ１１７における変異；好ましくはＨ１６Ｅ／Ｌ１８Ｉ／Ｖ９１Ａ／Ｆ１１７Ｗにおける変異；
（ｄ）．Ｈ１６／Ｌ１８／Ｉ８９／Ｖ９３における変異；好ましくはＨ１６Ｅ／Ｌ１８Ｉ／Ｉ８９Ｌ／Ｖ９３Ｉにおける変異；
（ｅ）．Ｈ１６／Ｇ２７／Ｒ１２０における変異；好ましくはＨ１６Ｅ／Ｇ２７Ｗ／Ｒ１２０Ｆにおける変異；
（ｆ）．Ｈ１６／Ｐ８２／Ｒ１２０における変異；好ましくはＨ１６Ｅ／Ｐ８２Ｌ／Ｒ１２０Ｆにおける変異；
（ｇ）．Ｄ２０／Ｙ３１／Ａ７３／Ｈ７９における変異；好ましくはＤ２０Ａ／Ｙ３１Ｖ／Ａ７３Ｌ／Ｈ７９Ｑにおける変異；
（ｈ）．Ｄ２０／Ｒ１２０における変異；好ましくはＤ２０Ａ／Ｒ１２０Ｆにおける変異；
（ｉ）．Ｖ９１／Ｙ３１／Ａ７３／Ｈ７９における変異；好ましくはＶ９１Ｒ／Ｙ３１Ｖ／Ａ７３Ｌ／Ｈ７９Ｑにおける変異；
（ｊ）．Ｖ９１／Ｑ１３における変異；好ましくはＶ９１Ｒ／Ｑ１３Ｌにおける変異；
（ｋ）．Ｖ９１／Ｒ１２０における変異；好ましくはＶ９１Ｒ／Ｒ１２０Ｆにおける変異；
（ｌ）．Ｖ９１／Ｌ１８／Ｉ８９／Ｖ９３における変異；好ましくはＶ９１Ｒ／Ｌ１８Ｉ／Ｉ８９Ｌ／Ｖ９３Ｉにおける変異；
（ｍ）．Ｈ１６／Ｖ９１／Ｙ３１／Ａ７３／Ｈ７９における変異；好ましくはＨ１６Ｅ／Ｖ９１Ｒ／Ｙ３１Ｖ／Ａ７３Ｌ／Ｈ７９Ｑにおける変異；
（ｎ）．Ｈ１６／Ｖ９１／Ｌ１８／Ｉ８９／Ｖ９３における変異；好ましくはＨ１６Ｅ／Ｖ９１Ｒ／Ｌ１８Ｉ／Ｉ８９Ｌ／Ｖ９３Ｉにおける変異。
いくつかの特定の実施形態において、ＩＬ－２変異体は、配列番号２２から配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２から配列番号３５、配列番号３７又は配列番号３８のいずれか１つに示すアミノ酸配列を有する。
いくつかの特定の実施形態において、ＩＬ－２変異体はＮ２６、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｎ７１、Ｑ１１、Ｌ１３２、Ｌ７０、Ｐ８２、Ｇ２７、又はＦ２８における変異からなる群から選択される１つ以上の変異をさらに含む。
好ましくは、ＩＬ－２変異体はＮ２６Ｑ、Ｎ２９Ｓ、Ｎ３０Ｓ、Ｎ７１Ｑ、Ｑ１１Ｃ、Ｌ１３２Ｃ、Ｌ７０Ｃ、Ｐ８２Ｃ、Ｇ２７Ｃ、又はＦ７８Ｃからなる群から選択される１つ以上の変異をさらに含む。
より好ましくは、ＩＬ－２変異体は、（ａ）群から（ｇ）群における少なくとも１つの群の変異をさらに含む：
（ａ）．Ｎ２６Ｑ；
（ｂ）．Ｎ２９Ｓ；
（ｃ）．Ｎ３０Ｓ；
（ｄ）．Ｎ７１Ｑ；
（ｅ）．Ｑ１１Ｃ／Ｌ１３２Ｃ；
（ｆ）．Ｌ７０Ｃ／Ｐ８２Ｃ；
（ｇ）．Ｇ２７Ｃ／Ｆ７８Ｃ。
いくつかの特定の実施形態において、ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２、Ｙ４５、又はＬ７２における変異、好ましくはＦ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、又はＬ７２Ｇからなる群から選択される１つ以上の変異をさらに含む。
いくつかの特定の実施形態において、ＩＬ－２変異体は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２Ｒβγサブユニット複合体に対する結合能が低下しており；好ましくは、結合能ＩＬ－２Ｒβγサブユニット複合体／結合能ＩＬ－２αβγサブユニット複合体が低下している。
いくつかの特定の実施形態において、変異体は、野生型ＩＬ－２と比較して、非制御性Ｔ細胞又はＮＫ（ナチュラルキラー）細胞に対する刺激能が低下しており；当該刺激としては、細胞内ＳＴＡＴ５リン酸化又は細胞増殖から選択することができる。
いくつかの特定の実施形態において、変異体は、非制御性Ｔ細胞又はＮＫ（ナチュラルキラー）細胞よりも末梢血内の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）又はＴ細胞集団を優先的に刺激し；当該優先的刺激としては、制御性Ｔ細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化を優先的に刺激すること、制御性Ｔ細胞の増殖を優先的に刺激すること、非制御性Ｔ細胞に対する制御性Ｔ細胞の比率を上昇させること、又はＮＫ細胞に対する制御性Ｔ細胞の比率を上昇させることから選択することができる。
第２の態様において、本開示は、野生型ＩＬ－２と比較して、Ｈ１６、Ｄ２０、又はＶ９１において１つ以上の変異を含むＩＬ－２変異体を提供し；好ましくは、ＩＬ－２変異体は、（ｉ）群から（ｉｖ）群のうちから選択される少なくとも１つの群の変異を含む：
（ｉ）．Ｈ１６における変異；好ましくはＨ１６Ｅにおける変異；
（ｉｉ）．Ｄ２０における変異；好ましくはＤ２０Ａにおける変異；
（ｉｉｉ）Ｖ９１における変異；好ましくはＶ９１Ｒにおける変異；
（ｉｖ）．Ｈ１６／Ｖ９１における変異；好ましくはＨ１６Ｅ／Ｖ９１Ｒにおける変異。
いくつかの特定の実施形態において、ＩＬ－２変異体は、配列番号２１、配列番号２８、配列番号３１、又は配列番号３６に示すアミノ酸配列を有する。
いくつかの特定の実施形態において、ＩＬ－２変異体は、Ｎ２６、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｎ７１、Ｑ１１、Ｌ１３２、Ｌ７０、Ｐ８２、Ｇ２７、又はＦ２８における変異からなる群から選択される１つ以上の変異をさらに含む。
好ましくは、ＩＬ－２変異体は、Ｎ２６Ｑ、Ｎ２９Ｓ、Ｎ３０Ｓ、Ｎ７１Ｑ、Ｑ１１Ｃ、Ｌ１３２Ｃ、Ｌ７０Ｃ、Ｐ８２Ｃ、Ｇ２７Ｃ、又はＦ７８Ｃからなる群から選択される１つ以上の変異をさらに含む。
より好ましくは、ＩＬ－２変異体は、（ａ）群から（ｇ）群における少なくとも１つの群の変異をさらに含む：
（ａ）．Ｎ２６Ｑ；
（ｂ）．Ｎ２９Ｓ；
（ｃ）．Ｎ３０Ｓ；
（ｄ）．Ｎ７１Ｑ；
（ｅ）．Ｑ１１Ｃ／Ｌ１３２Ｃ；
（ｆ）．Ｌ７０Ｃ／Ｐ８２Ｃ；
（ｇ）．Ｇ２７Ｃ／Ｆ７８Ｃ。
いくつかの特定の実施形態において、ＩＬ－２変異体は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２Ｒβγサブユニット複合体に対する結合能が低下しており；好ましくは、結合能ＩＬ－２Ｒβγサブユニット複合体／結合能ＩＬ－２αβγサブユニット複合体が低下している。
いくつかの特定の実施形態において、変異体は、野生型ＩＬ－２と比較して、非制御性Ｔ細胞又はＮＫ（ナチュラルキラー）細胞に対する刺激能が低下しており、当該刺激としては、細胞内ＳＴＡＴ５リン酸化又は細胞増殖から選択することができる。
いくつかの特定の実施形態において、変異体は、非制御性Ｔ細胞又はＮＫ細胞よりも末梢血内の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）又はＴ細胞集団を優先的に刺激し；当該優先的刺激としては、制御性Ｔ細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化を優先的に刺激すること、制御性Ｔ細胞の増殖を優先的に刺激すること、非制御性Ｔ細胞に対する制御性Ｔ細胞の比率を上昇させること、又はＮＫ細胞に対する制御性Ｔ細胞の比率を上昇させることから選択することができる。
いくつかの特定の実施形態において、変異は、欠失、挿入、又は置換を含み、好ましくは置換を含む。
いくつかの特定の実施形態において、野生型ＩＬ－２は、配列番号６０又は配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。
第３の態様において、本開示は、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質であって、第１のポリペプチドは、上述したＩＬ－２変異体であり、第２のポリペプチドは、非ＩＬ－２ポリペプチドである、融合タンパク質を提供する。
いくつかの特定の実施形態において、第２のポリペプチドは、Ｆｃ、腫瘍抗原結合分子、又はＩＬ－２受容体サブユニットであり；
Ｆｃは、任意に、ヒトＩｇＧのＦｃ、例えばヒトＩｇＧ１のＦｃであり；
好ましくは、ヒトＩｇＧ１のＦｃは、（ａ）群から（ｉ）群のうちから選択される少なくとも１つの群の変異を含み：
（ａ）．Ｃ２２０Ｓ；
（ｂ）．Ｎ２９７Ｇ；
（ｃ）．Ｃ２２０ＳおよびＮ２９７Ｇ；
（ｄ）．Ａ３２７Ｑ；
（ｅ）．Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ；
（ｆ）．Ａ２８７ＣおよびＬ３０６Ｃ；
（ｇ）．Ａ２５９ＣおよびＬ３０６Ｃ；
（ｈ）．Ｒ２９２ＣおよびＶ３０２Ｃ；
（ｉ）．Ｖ３２３ＣおよびＩ３３２Ｃ；
より好ましくは、ヒトＩｇＧ１のＦｃは、配列番号１１に示すアミノ酸配列を有し；
腫瘍抗原は、ＥＤＢ－ＦＮ（フィブロネクチンのエクストラドメイン）、Ｍｕｃ１、ｐ５３、ＦＡＰ、ＧＤ２、ＥｐＣＡＭ、テネイシン－Ｃ、ＣＤ２０、ＣＥＡ、ＭＡｄＣＡＭ－１、又はＷＴ１（ウィルムス腫瘍タンパク質１）を任意に含み；腫瘍抗原結合分子は、任意に、ｓｃＦｖ、ｓｄＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖなどの抗体であり；
ＩＬ－２受容体サブユニットは、任意に、ＩＬ－２受容体αサブユニットである。
いくつかの特定の実施形態において、第１のポリペプチドのＣ末端は、リンカーを介して、又はリンカーを介さずに、第２のポリペプチドのＮ末端に連結され；あるいは、第１のポリペプチドのＮ末端は、リンカーを介して、又はリンカーを介さずに、第２のポリペプチドのＣ末端に連結され；
好ましくは、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＧＧＮＧＴ）ｎ、又は（ＹＧＮＧＴ）ｎから選択され、ｎは、１、２、３、４、又は５から選択され；
より好ましくは、第１のポリペプチドのＣ末端は、リンカー（Ｇ４Ｓ）３によって第２のポリペプチドのＮ末端に連結されている。
いくつかの特定の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号１３から配列番号２０又は配列番号３９から配列番号５６のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含む。
第４の態様において、本開示は、上述した変異体又は融合タンパク質を含み、変異体又は融合タンパク質に結合した安定剤、薬物、又はトレーサー分子をさらに含む、抱合体を提供し；安定剤としては、モノメトキシポリエチレングリコールなどのポリエチレングリコール類から選択することができる。
第５の態様において、本開示は、上述した変異体又は融合タンパク質をコードする単離核酸断片を提供する。
第６の態様において、本開示は、上述した核酸断片を含むベクターを提供する。
第７の態様において、本開示は、上述したベクターを含む宿主細胞を提供する。
いくつかの特定の実施形態において、宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であり；原核細胞又は真核細胞としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、又は哺乳類細胞から選択することができ、哺乳類細胞としては、ＣＨＯ細胞系又はＨＥＫ２９３細胞系から選択することができる。
第８の態様において、本開示は、上述した変異体又は融合タンパク質を調製する方法を提供し、当該方法は、上記宿主細胞を培養することと、宿主細胞によって発現されたＩＬ－２変異体又は融合タンパク質を単離することと、を含む。
第９の態様において、本開示は、上記方法によって調製されたＩＬ－２変異体又は融合タンパク質を提供する。
第１０の態様において、本開示は、上記変異体、融合タンパク質、抱合体、核酸断片、ベクター、又は宿主細胞と；薬学的に許容される担体、希釈剤、又はアジュバントと、を含む医薬組成物を提供し；
好ましくは、医薬組成物は、例えば静脈注射又は皮下注射などの注射用の医薬組成物であり；より好ましくは、投与１回あたりの医薬組成物は、対象に投与される融合タンパク質を有効量含み；最も好ましくは、有効量は、０．００１ｍｐｋから１０ｍｐｋ、例えば、０．００１ｍｐｋ、０．００２ｍｐｋ、０．００３ｍｐｋ、０．００４ｍｐｋ、０．００５ｍｐｋ、０．００６ｍｐｋ、０．００７ｍｐｋ、０．００８ｍｐｋ、０．００９ｍｐｋ、０．０１ｍｐｋ、０．０２ｍｐｋ、０．０３ｍｐｋ、０．０４ｍｐｋ、０．０５ｍｐｋ、０．０６ｍｐｋ、０．０７ｍｐｋ、０．０８ｍｐｋ、０．０９ｍｐｋ、０．１ｍｐｋ、０．２ｍｐｋ、０．３ｍｐｋ、０．４ｍｐｋ、０．５ｍｐｋ、０．６ｍｐｋ、０．７ｍｐｋ、０．８ｍｐｋ、０．９ｍｐｋ、１ｍｐｋ、２ｍｐｋ、３ｍｐｋ、４ｍｐｋ、５ｍｐｋ、６ｍｐｋ、７ｍｐｋ、８ｍｐｋ、９ｍｐｋ、又は１０ｍｐｋである。
第１１の態様において、本開示は、疾患治療用の薬剤の製造における上記変異体、融合タンパク質、抱合体、核酸断片、ベクター、又は宿主細胞の使用を提供し；
好ましくは、薬剤は、例えば静脈注射又は皮下注射などの注射用の薬剤であり；
好ましくは、投与１回あたりの薬剤は、対象に投与される融合タンパク質を有効量含み；最も好ましくは、有効量は、０．００１ｍｐｋから１０ｍｐｋ、例えば、０．００１ｍｐｋ、０．００２ｍｐｋ、０．００３ｍｐｋ、０．００４ｍｐｋ、０．００５ｍｐｋ、０．００６ｍｐｋ、０．００７ｍｐｋ、０．００８ｍｐｋ、０．００９ｍｐｋ、０．０１ｍｐｋ、０．０２ｍｐｋ、０．０３ｍｐｋ、０．０４ｍｐｋ、０．０５ｍｐｋ、０．０６ｍｐｋ、０．０７ｍｐｋ、０．０８ｍｐｋ、０．０９ｍｐｋ、０．１ｍｐｋ、０．２ｍｐｋ、０．３ｍｐｋ、０．４ｍｐｋ、０．５ｍｐｋ、０．６ｍｐｋ、０．７ｍｐｋ、０．８ｍｐｋ、０．９ｍｐｋ、１ｍｐｋ、２ｍｐｋ、３ｍｐｋ、４ｍｐｋ、５ｍｐｋ、６ｍｐｋ、７ｍｐｋ、８ｍｐｋ、９ｍｐｋ、又は１０ｍｐｋであり；
好ましくは、薬剤は、自己免疫疾患、増殖性疾患、又はウイルス感染を治療するために用いられ；
より好ましくは、自己免疫疾患は、関節リウマチ、強直性脊椎炎、全身性エリテマトーデス、皮膚エリテマトーデス、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、乾癬、尋常性乾癬、円形脱毛症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、移植片対宿主疾患、臓器移植拒絶反応、自己免疫性肝炎、Ｉ型糖尿病、自己免疫性血管炎、湿疹、又は喘息を含み；
より好ましくは、増殖性疾患は、新生物、固形腫瘍、血液系腫瘍、悪性腹水、又は悪性胸水を含み；固形腫瘍は、良性であっても悪性であっても、原発性であっても転移性であってもよく、悪性固形腫瘍は、がん又は肉腫、例えば、上皮細胞癌、内皮細胞癌、扁平上皮細胞癌、奇形腫、肺腫瘍、パピローマウイルス誘発性がん、腺癌、癌腫、黒色腫、血管肉腫、神経芽細胞腫、転移性肺がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、乳がん、メルケル細胞がん、卵巣がん、腎細胞がん、転移性腎がん、頭頸部がん、膀胱がん、筋層非浸潤性膀胱がんなどであってもよく；血液系腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞大顆粒リンパ球白血病などの白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫であってもよく；
より好ましくは、ウイルス感染は、ＨＩＶ感染、新型コロナウイルス感染、又はＨＰＶウイルス感染から選択される。
第１２の態様において、本開示は、自己免疫疾患、増殖性疾患、又はウイルス感染を治療する方法を提供し、当該方法は、上記ＩＬ－２変異体、融合タンパク質、抱合体、核酸断片、ベクター、宿主細胞、又は医薬組成物を、対象に有効量投与するステップを含み；
好ましくは、投与するステップは、例えば静脈注射又は皮下注射などの注射を介して行われ；
好ましくは、有効量は、０．００１ｍｐｋから１０ｍｐｋ、例えば、０．００１ｍｐｋ、０．００２ｍｐｋ、０．００３ｍｐｋ、０．００４ｍｐｋ、０．００５ｍｐｋ、０．００６ｍｐｋ、０．００７ｍｐｋ、０．００８ｍｐｋ、０．００９ｍｐｋ、０．０１ｍｐｋ、０．０２ｍｐｋ、０．０３ｍｐｋ、０．０４ｍｐｋ、０．０５ｍｐｋ、０．０６ｍｐｋ、０．０７ｍｐｋ、０．０８ｍｐｋ、０．０９ｍｐｋ、０．１ｍｐｋ、０．２ｍｐｋ、０．３ｍｐｋ、０．４ｍｐｋ、０．５ｍｐｋ、０．６ｍｐｋ、０．７ｍｐｋ、０．８ｍｐｋ、０．９ｍｐｋ、１ｍｐｋ、２ｍｐｋ、３ｍｐｋ、４ｍｐｋ、５ｍｐｋ、６ｍｐｋ、７ｍｐｋ、８ｍｐｋ、９ｍｐｋ、又は１０ｍｐｋであり；
好ましくは、自己免疫疾患は、関節リウマチ、強直性脊椎炎、全身性エリテマトーデス、皮膚エリテマトーデス、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、乾癬、尋常性乾癬、円形脱毛症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、移植片対宿主疾患、臓器移植拒絶反応、自己免疫性肝炎、Ｉ型糖尿病、自己免疫性血管炎、湿疹、又は喘息を含み；
好ましくは、増殖性疾患は、新生物、固形腫瘍、血液系腫瘍、悪性腹水、又は悪性胸水を含み；固形腫瘍は、良性又は悪性のもの、原発性又は転移性のものから任意に選択され、悪性固形腫瘍は、がん又は肉腫、例えば、上皮細胞癌、内皮細胞癌、扁平上皮細胞癌、奇形腫、肺腫瘍、パピローマウイルス誘発性がん、腺癌、癌腫、黒色腫、血管肉腫、神経芽細胞腫、転移性肺がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、乳がん、メルケル細胞がん、卵巣がん、腎細胞がん、転移性腎がん、頭頸部がん、膀胱がん、筋層非浸潤性膀胱がんから任意に選択され；血液系腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞大顆粒リンパ球白血病などの白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫から任意に選択され；
より好ましくは、ウイルス感染は、ＨＩＶ感染、新型コロナウイルス感染、又はＨＰＶウイルス感染から選択される。
第１３の態様において、本開示は、Ｔ細胞集団又は末梢血内の制御性Ｔ細胞を優先的に刺激する方法を提供し、当該方法は、Ｔ細胞集団又は末梢血を、上記ＩＬ－２変異体、融合タンパク質、抱合体、核酸断片、ベクター、宿主細胞、又は医薬組成物に接触させるステップを含み；
好ましくは、当該優先的に刺激することは：
（ａ）非制御性Ｔ細胞又はＮＫ細胞よりも制御性Ｔ細胞のＳＴＡＴ５リン酸化を優先的に刺激すること；
（ｂ）非制御性Ｔ細胞又はＮＫ細胞よりも制御性Ｔ細胞の増殖を優先的に刺激すること；および／又は
（ｃ）非制御性Ｔ細胞に対する制御性Ｔ細胞の比率を上昇させること、又はＮＫ細胞に対する制御性Ｔ細胞の比率を上昇させること、を含む。
［用語および定義］
本開示において別途定義されない限り、本開示に関する科学用語および専門用語は、当業者が通常理解する意味を有するものとする。
本明細書において、「ＩＬ２」又は「ＩＬ－２」なる語は、特に断りがない限り、霊長類（例えば、ヒト）および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）ならびに飼い慣らされた哺乳類又は家畜化された哺乳類などの哺乳類を含むあらゆる脊椎動物に由来する、あらゆる天然ＩＬ－２又は組み換えＩＬ－２のことをいう。本開示における「ＩＬ２」又は「ＩＬ－２」は、未処理のＩＬ－２（例えば、Ｎ末端にシグナルペプチドを含むＩＬ－２）から細胞内の成熟ＩＬ－２に及ぶあらゆる形態を含む。本開示における「ＩＬ２」又は「ＩＬ－２」は、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体などの、ＩＬ－２の自然変異体および断片も含む。本明細書における「ＩＬ２」又は「ＩＬ－２」は、遺伝子工学によって人工的に改変されたＩＬ－２変異体などの、非自然発生変異体も含む。
「野生型ＩＬ－２」なる語は、ＩＬ－２変異体の変異位置における各アミノ酸が野生型アミノ酸のまま維持されていること以外は、ＩＬ－２変異体と同様である。例えば、ＩＬ－２変異体が未処理のＩＬ－２である場合、変異体の野生型形態は、未処理のＩＬ－２であり；ＩＬ－２変異体が成熟ＩＬ－２である場合、変異体の野生型形態は、成熟ＩＬ－２であり；ＩＬ－２変異体がＩＬ－２の切断型である場合、変異体の野生型形態は、野生型配列を有するＩＬ－２の対応する切断型である。一例として、本開示における「野生型ＩＬ－２」は、以下のようなアミノ酸配列を有していてもよい：
ＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＸＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号６０）；配列中、１２５番目のアミノ酸残基である「Ｘ」は、Ｃ、Ｓ、Ａ、又はＶを表す。
本明細書において、「変異」なる語は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、又はこれらの任意の組み合わせを含む。本開示における「変異」は、当該技術分野において公知の遺伝学的方法又は化学的方法によって生成されてもよく、これらの方法としては、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成等が挙げられるが、これらに限定されない。
ＩＬ－２変異体の「変異部位」の付番は、配列番号６０に示す「野生型ＩＬ－２」の１番目のアミノ酸残基（Ａ）から開始される。一例として、「Ｑ１３変異」とは、配列番号６０に示す野生型ＩＬ－２の１３位におけるアミノ酸残基（Ｇｌｎ、Ｑ）の変異のことをいう。例えば、「Ｑ１３Ｌ変異」とは、配列番号６０に示す野生型ＩＬ－２の１３位におけるアミノ酸Ｑ（Ｇｌｎ）がＬ（Ｌｅｕ）に変異されたＩＬ－２変異体のことをいう。
本明細書において、変異部位間に用いられる句読点「／」は、「および」を意味し、これは、「／」の前後の変異が、同じＩＬ－２変異体に同時に共存していることを示す。例えば、「Ｙ３１／Ａ７３／Ｈ７９」は、同じＩＬ－２変異体のＹ３１、Ａ７３、およびＨ７９において、変異が同時に生じていることを意味し、「Ｙ３１Ｖ／Ａ７３Ｌ／Ｈ７９Ｑ」は、Ｙ３１Ｖ、Ａ７３Ｌ、およびＨ７９Ｑが、同じＩＬ－２変異体において同時に共存していることを意味する。
本明細書において、「Ｔｍ」（融解温度）なる語は、タンパク質の５０％が変性する温度をいう。本開示における「Ｔｍ」は、当該技術分野においてよく知られている任意の方法によって決定されてもよい。例えば、タンパク質のＴｍ値は、本開示の実施例３又は実施例６に示される方法によって決定することができる。
本開示における「融合タンパク質」なる語は、遺伝的組み換え法、化学的方法、又はその他の適切な方法によって、２つ以上の遺伝子のコード領域を接続し、遺伝的組み換え法によって得たタンパク質産物を同じ制御配列の制御下において発現させることで得たタンパク質産物のことをいう。本開示の融合タンパク質において、２つ以上の遺伝子のコード領域は、（１つ又は複数の）リンカーをコードする配列によって、１箇所又は数箇所で融合させることができる。（１つ又は複数の）リンカーを用いて、本開示の融合タンパク質を構築することができる。
本明細書において、「リンカー」なる語は、ＩＬ－２を別のタンパク質分子又はタンパク質断片に連結して、タンパク質の正しい折り畳みおよび安定性を確保するのに用いられるペプチドのことをいう。当該別の分子としてはＦｃが挙げられるが、これに限定されない。好ましくは、本開示における「リンカー」は、（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、式中、ｎは、０でもよいし、１でもよいし、２でもよいし、３でもよいし、４でもよいし、５でもよい。リンカー配列が短すぎる場合、２つのタンパク質の高次構造の折り畳みに影響する場合があり、このため、２つのタンパク質が互いに干渉し合う。リンカー配列が長すぎる場合、免疫原性を伴うことがあるが、これは、リンカー配列自体が新規の抗原となるためである。
本明細書において、「第２のポリペプチド」なる語は、ｓｃＦｖ抗体などの単鎖ポリペプチドのことであってもよい。「第２のポリペプチド」は、多連鎖ポリペプチドも含み、この場合、少なくとも１つのポリペプチド鎖がＩＬ－２又はその変異体に融合され、その他の（１つ又は複数の）ポリペプチド鎖は、共有結合又は非共有結合によって、融合された前記少なくとも１つのポリペプチド鎖に連結される。例えば、Ｆａｂ抗体の場合、Ｆａｂの重鎖をＩＬ－２又はその変異体に融合することができ、軽鎖は、ジスルフィド結合によって重鎖に連結される。
本明細書において、「Ｆｃ」なる語は、イムノグロブリン鎖の定常領域のことをいい、特に、イムノグロブリン重鎖の定常領域のＣ末端又はその一部のＣ末端のことをいう。Ｆｃは、抗原結合活性を持たず、抗体が、エフェクター分子又は細胞と相互作用する領域である。本明細書における「Ｆｃ」は、ヒト又は非ヒト哺乳類に由来する、あらゆるＦｃ又はその変異体であってもよい。例えば、イムノグロブリンのＦｃは、２つ以上の重鎖ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、又はＣＨ４）とイムノグロブリンのヒンジ領域との組み合わせを含んでもよい。Ｆｃは、異なる種に由来するものであってもよく、好ましくは、ヒトイムノグロブリンに由来してもよい。重鎖定常領域のアミノ酸配列にしたがって、イムノグロブリンを、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの５つのイムノグロブリンクラスを主に含む、異なるクラスに区分することができる。そのうちのいくつかは、さらに、ＩｇＧ－１、ＩｇＧ－２、ＩｇＧ－３、ＩｇＧ－４や、ＩｇＡ－１、ＩｇＡ－２などのサブクラス（アイソタイプ）に区分することができる。好ましくは、「Ｆｃ」は、ＩｇＧのＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインだけでなく、イムノグロブリンヒンジ領域を少なくとも１つ含む。より好ましくは、「Ｆｃ」は、ＩｇＧ１のＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインと、イムノグロブリンヒンジ領域とを含み、ヒンジ領域の開始アミノ酸位置は変化し得る。特に断りがない限り、本開示のＦｃ、定常領域、又は抗体のアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， 第５版， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ．， １９９１に説明されているような、ＥＵインデックスとしても知られているＥＵ付番システムにしたがって付番される。
本開示の「抗体」は、最も広い意味で用いられ、所望の抗原結合活性を発揮する限りにおいて、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、および抗原結合断片を含むがこれらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。抗体としては、ネズミ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、およびラクダ抗体が挙げられ得る。具体的には、抗体は、同一の重鎖２つと、鎖間ジスルフィド結合によって結合された同一の軽鎖２つとからなるテトラペプチド鎖構造である、イムノグロブリンであってもよい。イムノグロブリン重鎖の定常領域は、アミノ酸組成およびアミノ酸配列の点で異なっており、そのため、抗原性が異なる。したがって、イムノグロブリンは、５つのクラス、又はイムノグロブリンのアイソタイプ、すなわちＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥに区分することができ、その重鎖は、それぞれ、μ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖、およびε鎖に対応する。ヒンジ領域のアミノ酸組成の相違や重鎖のジスルフィド結合の数および位置の相違に応じて、同じクラスのＩｇを異なるサブクラスに区分することができ、例えば、ＩｇＧをＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４に区分することができる。定常領域の相違に応じて、軽鎖をκ鎖又はλ鎖に区分してもよい。Ｉｇの５つのクラスは、それぞれ、κ鎖又はλ鎖を有することができる。本開示における「抗体」は、ｓｃＦｖ、ｓｄＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖも含む。
本明細書において、「単離された」なる語は、ある物質を、その元の環境又は自然環境（例えば、その物質が天然に存在する環境）から取り出すことをいう。したがって、生きている動物に存在する天然ポリヌクレオチド又は天然ポリペプチドは単離されていないが、同じポリヌクレオチド又はポリペプチドが、ヒトが介在することによって、天然系において共存している物質のいくつか又はすべてから単離された場合、これらは単離されている。
「単離された核酸断片」とは、一重鎖又は二重鎖であるＲＮＡポリマー又はＤＮＡポリマーであり、合成ヌクレオチド塩基、非天然ヌクレオチド塩基、又は改変ヌクレオチド塩基を任意に含有する。ＤＮＡポリマー形態の単離された核酸断片は、１つ以上のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又は合成ＤＮＡ断片からなるものであってもよい。本開示の「核酸断片」は、ベクターの一部であってもよく、非相同部位において宿主細胞の染色体に組み込まれてもよい。本開示の「核酸断片」は、組成物の一部であってもよい。このようなベクター又は組成物は、その自然環境の一部ではないので、やはり単離されている。
本明細書において、「ベクター」なる語は、ＤＮＡベクター（例えば、プラスミド）、ＲＮＡベクター、ウイルス、又はその他の適切なレプリコン（例えば、ウイルスベクター）などの核酸ベクターを含む。異種タンパク質をコードするポリヌクレオチドを原核細胞又は真核細胞に送達するために、様々なベクターが開発されてきた。本開示の「ベクター」は、タンパク質を発現しかつ／又はこれらのポリヌクレオチド配列を哺乳類細胞のゲノムに組み込むための追加の配列要素、遺伝子の転写を誘導するための制御配列（プロモータ領域およびエンハンサー領域など）、あるいは遺伝子の翻訳速度を高める、又は遺伝子の転写によって産生されたｍＲＮＡの安定性もしくは核輸送を向上させるための配列を含有していてもよい。配列要素は、発現ベクター上の遺伝子を効率よく転写するために、例えば、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、およびポリアデニル化シグナル部位を含む。本開示の「ベクター」は、このようなベクターを含有する細胞を選択するためのマーカーをコードするポリヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。適切なマーカーとしては、例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、又はノーセオスリシンなどの抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子が挙げられる。
本明細書において、「宿主細胞」なる語は、外因性の核酸が導入された細胞のことをいい、このような細胞の子孫を含む。「子孫」は、核酸成分がその親と全く同じであってもよいし、変異を含有していて、親細胞と全く同じでなくてもよい。「子孫」は、元々の形質転換細胞において選別又は選択された機能又は生物学的活性と同じ機能又は生物学的活性を有する変異型子孫を含む。
本明細書において、「医薬組成物」なる語は、本開示のＩＬ－２変異体、融合タンパク質、核酸断片、ベクター、又は宿主細胞のうちの１つ以上を含有する混合物のことをいう。混合物は、他の成分をさらに含んでいてもよく、他の成分としては、薬学的に許容される担体、希釈剤、又はアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。本開示の医薬組成物の目的は、生物への薬物の投与を容易にすることであり、これによって、有効成分の吸収が促進されて生物学的活性が発揮される。
本開示の「治療」なる語は、外科的治療又は薬学的治療のことをいい、その目的は、治療を必要とする対象において、細胞増殖性障害（例えば、がん、又は感染症）、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス）などの望ましくない生理学的変化又は病変の進行を予防又は緩和（低減）することである。有益な臨床結果又は望ましい臨床結果としては、検出可能であるか不可能であるかにかかわらず、症状の緩和、疾患の重症度の抑制、病状の安定化（すなわち、悪化させないこと）、疾患の進行の遅延又は減速、病態の改善又は緩和、および寛解（部分寛解であっても完全寛解であっても）が挙げられるが、これらに限定されない。治療を必要とする対象としては、疾患又は障害を患っている人たち、疾患又は障害に罹りやすい人たち、又は疾患又は障害を予防しようとしている人たちが挙げられる。「抑制（alleviation）」、「低減（reduction）」、「緩和（mitigation）」、「改良（amelioration）」、および「寛解（remission）」なる語が用いられる場合、排除、消滅、不発生なども意味する。
本明細書において、「対象」なる語は、本明細書で述べる特定の疾患又は障害（がん、感染症、又は自己免疫疾患など）の治療を受けている生物のことをいう。対象および患者としては、例えば、ヒト、霊長類、ブタ、ヤギ、ウサギ、ハムスター、ネコ、イヌ、モルモット、ウシ又はその他のウシ科の動物、ヒツジ、およびウマなどの、疾患又は障害の治療を受けている哺乳類が挙げられる。
本明細書において、「有効量」なる語は、細胞、組織、又は対象に、治療薬を単独で、又は別の治療薬と組み合わせて、投与する場合に、疾患の症状又は進行を予防又は抑制するのに効果がある、治療薬の量のことをいう。「有効量」は、症状を緩和する（例えば、関連する医学的状態を治療、治癒、予防、又は緩和する）のに十分な化合物の量、又はそのような状態を治療、治癒、予防、又は緩和する速度を上昇させるのに十分な化合物の量のこともいう。有効成分を個体に一種のみ投与する場合、治療上有効な量は、その有効成分のみをいう。合わせて投与する場合、治療上有効な量とは、治療効果を有する有効成分を組み合わせて連続的に投与するか、同時に投与するかにかかわらず、それらを合わせた量のことである。
本開示の「自己免疫疾患」なる語は、対象の細胞、組織、および／又は臓器に対する自身の免疫応答によって引き起こされる細胞、組織、および／又は臓器の損傷を特徴とする病気のことをいう。一例として、自己免疫疾患としては、関節リウマチ、強直性脊椎炎、全身性エリテマトーデス、皮膚エリテマトーデス、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、乾癬、尋常性乾癬、円形脱毛症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、移植片対宿主疾患、臓器移植拒絶反応、自己免疫性肝炎、Ｉ型糖尿病、自己免疫性血管炎、湿疹、又は喘息が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示の「増殖性疾患」なる語は、細胞又は組織の増殖が制御不能および／又は異常であり、これが望ましくない病気又は疾患の発症につながり得る、病気のことをいう。癌性であっても、癌性でなくてもよく、その例として新生物、固形腫瘍、血液系腫瘍、悪性腹水、又は悪性胸水が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の「固形腫瘍」は、良性又は悪性のもの、原発性又は転移性のものであってもよく、悪性固形腫瘍は、癌腫又は肉腫であってもよい。一例として、本開示の「固形腫瘍」としては、上皮細胞癌、内皮細胞癌、扁平上皮細胞癌、奇形腫、肺腫瘍、パピローマウイルス誘発性がん、腺癌、癌腫、黒色腫、血管肉腫、神経芽細胞腫、転移性肺がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、乳がん、メルケル細胞がん、卵巣がん、腎細胞がん、転移性腎がん、頭頸部がん、膀胱がん、筋層非浸潤性膀胱がんが挙げられるが、これらに限定されない。一例として、本開示の「血液系腫瘍」としては、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞大顆粒リンパ球白血病などの白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において、「ＣＤ２５」としても知られている、「ＩＬ－２受容体αサブユニット」（ＩＬ－２Ｒα）なる語は、霊長類（例えば、ヒト）および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳類を含むあらゆる脊椎動物に由来する、あらゆる天然ＩＬ－２受容体αサブユニット又はその変異体のことをいう。「ＩＬ－２受容体αサブユニット」は、「全長」未処理ＩＬ－２受容体αサブユニット、処理された細胞由来ＩＬ－２受容体αサブユニットのあらゆる形態、天然に存在するＩＬ－２受容体αサブユニット変異体（スプライス変異体又は対立遺伝子変異体など）、および天然ＩＬ－２受容体αサブユニットを基に人工的に操作された変異体を含む。ある実施形態において、ＩＬ－２受容体αサブユニットは、配列番号５７に示す例示的な配列を有するヒトＩＬ－２受容体αサブユニットである。
本明細書において、「ＣＤ１２２」としても知られている、「ＩＬ－２受容体βサブユニット」（ＩＬ－２Ｒβ）なる語は、霊長類（例えば、ヒト）および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳類を含むあらゆる脊椎動物に由来する、あらゆる天然ＩＬ－２受容体βサブユニット又はその変異体のことをいう。ＩＬ－２受容体βサブユニットは、「全長」未処理ＩＬ－２受容体βサブユニット、処理された細胞由来ＩＬ－２受容体βサブユニットのあらゆる形態、天然に存在するＩＬ－２受容体βサブユニット変異体（スプライス変異体又は対立遺伝子変異体など）、および天然ＩＬ－２受容体βサブユニットを基に人工的に操作された変異体を含む。ある実施形態において、ＩＬ－２受容体βサブユニットは、配列番号５８に示す例示的な配列を有するヒトＩＬ－２受容体βサブユニットである。
本明細書において、「ＣＤ１３２」としても知られている、「ＩＬ－２受容体γサブユニット」（ＩＬ－２Ｒγ）なる語は、霊長類（例えば、ヒト）および齧歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳類を含むあらゆる脊椎動物に由来する、あらゆる天然ＩＬ－２受容体γサブユニット又はその変異体のことをいう。ＩＬ－２受容体γサブユニットは、「全長」未処理ＩＬ－２受容体γサブユニット、処理された細胞由来ＩＬ－２受容体γサブユニットのあらゆる形態、天然に存在するＩＬ－２受容体γサブユニット変異体（スプライス変異体又は対立遺伝子変異体など）、および天然ＩＬ－２受容体γサブユニットを基に人工的に操作された変異体を含む。ある実施形態において、ＩＬ－２受容体γサブユニットは、配列番号５９に示す例示的な配列を有するヒトＩＬ－２受容体γサブユニットである。
本明細書において、「制御性Ｔ細胞」又は「Ｔ制御性細胞」としても知られている、「Ｔｒｅｇ」なる語は、他のＴ細胞の応答を阻害することができる、特殊化したＣＤ４＋Ｔ細胞種のことをいう。Ｔｒｅｇは、ＩＬ－２受容体αサブユニット（ＣＤ２５）および転写因子であるフォークヘッドボックスタンパク質Ｐ３（ＦＯＸＰ３）を発現することを特徴とし、抗原に対する末梢性自己寛容を誘導および維持するのに重要な役割をはたす。Ｔｒｅｇは、その機能を発揮し、阻害性を発現、誘導するために、ＩＬ－２を必要とする。
本明細書において、「結合能」なる語は、対となる分子の間で発揮される結合又は相互作用のことをいう。対となる一般的な分子としては、リガンドと受容体、抗原と抗体、酵素と基質などが挙げられ、より具体的には、例えば、ＩＬ２とＩＬ－２Ｒβγサブユニット複合体、又はＩＬ－２とＩＬ－２Ｒαβγサブユニット複合体が挙げられる。本開示の「結合能」は、当該技術分野における従来の方法によって検出することができ、そのような方法としては、ＥＬＩＳＡ又はＦＡＣＳが挙げられるが、これらに限定されない。
図１は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって検出された、ＣＨＯ－Ｋ１のｈＩＬ－２－Ｒα組み換え細胞系（クローン１Ａ６）におけるヒトＩＬ－２受容体αタンパク質の発現レベルを示し、ＩＬ－２受容体αに対する抗体は、バイオレジェンド社から購入したものであり、ネガティブコントロールとは、アイソタイプコントロールのことである。 図２は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって検出された、ＣＨＯ－Ｋ１のｈＩＬ－２Ｒβ組み換え細胞系（クローン２Ａ５）におけるヒトＩＬ－２受容体βタンパク質の発現レベルを示し、ＩＬ－２受容体βに対する抗体は、バイオレジェンド社から購入したものであり、ネガティブコントロールとは、アイソタイプコントロールのことである。 図３は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって検出された、ＣＨＯ－Ｋ１のｈＩＬ－２Ｒβγ組み換え細胞系（クローン２Ｅ６）におけるヒトＩＬ－２受容体βγタンパク質の発現レベルを示し、ＩＬ－２受容体βおよびＩＬ－２受容体γそれぞれに対する抗体は、バイオレジェンド社から購入したものであり、ネガティブコントロールとは、アイソタイプコントロールのことである。 図３Ａは、ヒトＩＬ－２受容体βタンパク質の発現レベルを示す。 図３Ｂは、ヒトＩＬ－２受容体γタンパク質の発現レベルを示す。 図４は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって検出された、ＣＨＯ－Ｋ１のｈＩＬ－２Ｒαβγ組み換え細胞系（クローン２Ｄ６）におけるヒトＩＬ－２受容体αβγタンパク質の発現レベルを示し、ＩＬ－２受容体α、ＩＬ－２受容体β、およびＩＬ－２受容体γそれぞれに対する抗体は、バイオレジェンド社から購入したものであり、ネガティブコントロールとは、親ＣＨＯ－Ｋ１細胞における対応する受容体の発現レベルのことをいう。 図４Ａは、ヒトＩＬ－２受容体αタンパク質の発現レベルを示す。 図４Ｂは、ヒトＩＬ－２受容体βタンパク質の発現レベルを示す。 図４Ｃは、ヒトＩＬ－２受容体γタンパク質の発現レベルを示す。 図５は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって検出された、ＣＨＯ－Ｋ１のＩＬ－２受容体αβγ組み換え細胞およびＩＬ－２受容体βγ組み換え細胞に対するＩＬ－２変異体タンパク質の結合活性を示す。 図５Ａは、ＣＨＯ－Ｋ１のＩＬ－２受容体αβγ組み換え細胞に対するｍｕｔ７．３６－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ６１－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ６１．０８－リンカー２－ｈＦｃ、又はｍｕｔ６１．４６－リンカー２－ｈＦｃの結合活性を示す。 図５Ｂは、ＣＨＯ－Ｋ１のＩＬ－２受容体αβγ組み換え細胞に対するｍｕｔ１１．３１－リンカー２－ｈＦｃ又はｍｕｔ７．６６－リンカー２－ｈＦｃの結合活性を示す。 図５Ｃは、ＣＨＯ－Ｋ１のＩＬ－２受容体βγ組み換え細胞に対するｍｕｔ７．３６－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ６１－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ６１．０８－リンカー２－ｈＦｃ、又はｍｕｔ６１．４６－リンカー２－ｈＦｃの結合活性を示す。 図５Ｄは、ＣＨＯ－Ｋ１のＩＬ－２受容体βγ組み換え細胞に対するｍｕｔ１１．３１－リンカー２－ｈＦｃ又はｍｕｔ７．６６－リンカー２－ｈＦｃの結合活性を示す。 図６は、Ｔｒｅｇ（図６Ａから図６Ｃ）、ＣＤ４＋ＣＤ２５－ＦｏｘＰ３－Ｔ細胞（図６Ｄから図６Ｆ）、およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図６Ｇから図６Ｉ）におけるＳＴＡＴ５リン酸化レベルに及ぼすＩＬ－２変異体タンパク質の効果を示す。 図６Ａは、ＴｒｅｇにおけるＳＴＡＴ５リン酸化レベルに及ぼすｍｕｔ７．３６－リンカー２－ｈＦｃの効果を示す。 図６Ｂは、ＴｒｅｇにおけるＳＴＡＴ５リン酸化レベルに及ぼすｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃの効果を示す。 図６Ｃは、ＴｒｅｇにおけるＳＴＡＴ５リン酸化レベルに及ぼすｍｕｔ１１．３１－リンカー２－ｈＦｃ又はｍｕｔ７．６６－リンカー２－ｈＦｃの効果を示す。 図６Ｄは、ＣＤ４＋ＣＤ２５－ＦｏｘＰ３－Ｔ細胞におけるリン酸化レベルに及ぼすｍｕｔ７．３６－リンカー２－ｈＦｃの効果を示す。 図６Ｅは、ＣＤ４＋ＣＤ２５－ＦｏｘＰ３－Ｔ細胞におけるリン酸化レベルに及ぼすｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃの効果を示す。 図６Ｆは、ＣＤ４＋ＣＤ２５－ＦｏｘＰ３－Ｔ細胞におけるリン酸化レベルに及ぼすｍｕｔ１１．３１－リンカー２－ｈＦｃ又はｍｕｔ７．６６－リンカー２－ｈＦｃの効果を示す。 図６Ｇは、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるリン酸化レベルに及ぼすｍｕｔ７．３６－リンカー２－ｈＦｃの効果を示す。 図６Ｈは、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるリン酸化レベルに及ぼすｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃの効果を示す。 図６Ｉは、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるリン酸化レベルに及ぼすｍｕｔ１１．３１－リンカー２－ｈＦｃ又はｍｕｔ７．６６－リンカー２－ｈＦｃの効果を示す。 図７は、Ｔｒｅｇ（図７Ａおよび図７Ｂ）、ＣＤ４＋ＣＤ２５－ＦｏｘＰ３－Ｔ細胞（図７Ｃおよび図７Ｄ）、およびＣＤ８＋ＣＤ２５－Ｔ細胞（図７Ｅおよび図７Ｆ）の増殖レベルに及ぼすＩＬ－２変異体タンパク質の効果を示す。 図７Ａは、Ｔｒｅｇの増殖レベルに及ぼすｍｕｔ７．３６－リンカー２－ｈＦｃ又はｍｕｔ７．６６－リンカー２－ｈＦｃの効果を示す。 図７Ｂは、Ｔｒｅｇの増殖レベルに及ぼすｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃ又はｍｕｔ１１．３１－リンカー２－ｈＦｃの効果を示す。 図７Ｃは、ＣＤ４＋ＣＤ２５－ＦｏｘＰ３－Ｔ細胞の増殖レベルに及ぼすｍｕｔ７．３６－リンカー２－ｈＦｃ又はｍｕｔ７．６６－リンカー２－ｈＦｃの効果を示す。 図７Ｄは、ＣＤ４＋ＣＤ２５－ＦｏｘＰ３－Ｔ細胞の増殖レベルに及ぼすｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃ又はｍｕｔ１１．３１－リンカー２－ｈＦｃの効果を示す。 図７Ｅは、ＣＤ８＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の増殖レベルに及ぼすｍｕｔ７．３６－リンカー２－ｈＦｃ又はｍｕｔ７．６６－リンカー２－ｈＦｃの効果を示す。 図７Ｆは、ＣＤ８＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の増殖レベルに及ぼすｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃ又はｍｕｔ１１．３１－リンカー２－ｈＦｃの効果を示す。 図８は、ＮＫ細胞の増殖レベルに及ぼすＩＬ－２変異体タンパク質の効果を示す。 図９Ａは、脾臓のＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＴｒｅｇの百分率を示す。 図９Ｂは、脾臓のＣＤ４＋細胞におけるＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｆｏｘｏｐ３－細胞の百分率を示す。 図９Ｃは、脾臓のＣＤ３＋細胞におけるＣＤ３＋ＣＤ４－細胞の百分率を示す。 図１０Ａは、末梢血のＣＤ４＋細胞におけるＴｒｅｇの百分率を示す。 図１０Ｂは、末梢血のＣＤ４＋細胞におけるＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｆｏｘｏｐ３－細胞の百分率を示す。 図１０Ｃは、末梢血のＣＤ３＋細胞におけるＣＤ３＋ＣＤ４－細胞の百分率を示す。 図１１Ａは、野生型マウスＤＴＨモデルの異なる群におけるΔ耳厚の変化を示し、Δ耳厚とは、刺激前後における右耳の厚さの変化のことをいう。 図１１Ｂは、野生型マウスＤＴＨモデルの異なる群における体重の変化を示す。 図１２Ａは、野生型マウスＤＴＨモデルの異なる群におけるΔ耳厚の変化を示し、Δ耳厚とは、刺激前後における右耳の厚さの変化のことをいう。 図１２Ｂは、野生型マウスＤＴＨモデルの異なる群における体重の変化を示す。 図１３Ａは、ＮＯＧマウスの異なる群におけるＴｒｅｇ／Ｔｃｏｎを示す。 図１３Ｂは、ＮＯＧマウスの異なる群におけるＴｒｅｇ／ＣＤ８＋を示す。 図１４Ａは、ＮＯＧマウスの異なる群におけるＴｒｅｇの数を示す。 図１４Ｂは、ＮＯＧマウスの異なる群におけるＴｃｏｎの数を示す。 図１４Ｃは、ＮＯＧマウスの異なる群におけるＣＤ８＋細胞の数を示す。 図１５Ａは、ＮＯＧマウスの異なる群における体重の変化を示す。 図１５Ｂは、ＮＯＧマウスの異なる群におけるＧＶＨＤスコアを示す。 図１６Ａは、皮下投与後の野生型マウスにおける血漿薬物濃度を示す。 図１６Ｂは、皮下投与後の野生型マウスにおける血漿薬物濃度を示す。 図１７は、静脈投与後の野生型マウスにおける血漿薬物濃度を示す。 図１８は、皮下投与後のＰＢＭＣ接種マウスにおける血漿薬物濃度を示す。 図１９は、皮下投与後のカニクイザルにおける血漿薬物濃度を示す。 図２０Ａは、皮下投与後のカニクイザルにおけるＴｒｅｇの数を示す。 図２０Ｂは、皮下投与後のカニクイザルにおけるＴｒｅｇ数の倍率変化を示す。 図２０Ｃは、皮下投与後のカニクイザルにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞中のＴｒｅｇの百分率を示す。 図２０Ｄは、皮下投与後のカニクイザルにおけるＫｉ６７＋Ｔｒｅｇの百分率を示す。 図２０Ｅは、皮下投与後のカニクイザルにおけるＦｏｘＰ３の平均蛍光強度の倍率変化を示す。 図２０Ｆは、皮下投与後のカニクイザルにおけるＣＤ２５の平均蛍光強度の倍率変化を示す。 図２１Ａは、皮下投与後のカニクイザルにおけるＦｏｘＰ３－ＣＤ４＋細胞の数を示す。 図２１Ｂは、皮下投与後のカニクイザルにおけるＦｏｘＰ３－ＣＤ４＋細胞数の倍率変化を示す。 図２１Ｃは、皮下投与後のカニクイザルにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞の数を示す。 図２１Ｄは、皮下投与後のカニクイザルにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞数の倍率変化を示す。 図２１Ｅは、皮下投与後のカニクイザルにおけるＮＫ細胞の数を示す。 図２１Ｆは、皮下投与後のカニクイザルにおけるＮＫ細胞数の倍率変化を示す。
具体的な実施例を参照して、本開示を以下でさらに説明する。本開示の利点および特徴は、この説明によって明らかになるであろう。実施例において具体的な条件が示されていない場合、従来の条件又は製造業者に提案された条件に従うものとする。製造業者が示されていない場合、用いた試薬類および機器類は、市販されている従来品である。
以下の本開示の実施例は、単なる例示であって、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。本開示の技術的解決法の詳細および形態は、本開示の趣旨又は範囲から離れたり、これらを超えたりすることなく、変更又は置換することができ、このような変更および置換は、すべて本開示の保護の範囲内であるということを、当業者は理解するべきである。
実施例１－熱安定性が向上したＩＬ－２変異体の設計および発現プラスミドの構築
熱安定性が向上したＩＬ－２変異体を得るために、種々のアルゴリズムを用い、対応する配列の設計および合成を行った。野生型ＩＬ－２および上記ＩＬ－２変異体をコードする核酸断片をＦｃタグを有するｐＴＴ５ベクターにクローニングした後、分子生物学において確立されている標準的な方法によって、以下の融合タンパク質をコードするプラスミドを調製した：ＩＬ－２－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ０．０８－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ０．３１－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ０．３６－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ０．３９－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ０．４６－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ０．５７－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ０．６６－リンカー２－ｈＦｃ、およびｍｕｔ０．６８－リンカー２－ｈＦｃ。
上記融合タンパク質および構成要素の具体的な配列を表１に示す。表中、「ＩＬ－２」は、野生型ＩＬ－２を表し、「ｍｕｔＸＸ」は、野生型ＩＬ－２と比較して変異が生じているＩＬ－２変異体を表す。
表１ 安定性が向上したＩＬ－２変異体の配列
Figure 2023540761000002
Figure 2023540761000003
Figure 2023540761000004
実施例２－熱安定性が向上したＩＬ－２変異体の産生および精製
実施例１で構築したプラスミドを用いてＨＥＫ２９３細胞（中国科学院の細胞バンクから購入）を一過的にトランスフェクトし（ＰＥＩ、ポリサイエンス社）、その後、フリースタイル（登録商標）２９３発現培地（ギブコ社から購入）において、３７℃で増殖させた。７日後に、細胞培養培地を回収し、細胞成分を遠心分離によって除去して、ＩＬ－２－ｈＦｃ融合タンパク質を含有する培養上清を得た。
１０ｍＬのプロテインＡカラム（ベストクロム社から購入）を用いて、細胞培養上清中の融合タンパク質を精製した。まず、カラムの３倍から５倍の体積の平衡化緩衝液（ＰＢＳリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）でプロテインＡカラムを平衡化し、その後、１０ｍＬ／分の流速で、透明な培養上清をロードした。ロード後、カラムの３倍から５倍の体積の平衡化緩衝液でプロテインＡカラムを洗浄した。プロテインＡカラムに結合したタンパク質を、溶出緩衝液（０．０２Ｍクエン酸緩衝液、０．１Ｍグリシン、０．１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ３．０）を用いて溶出させ、その溶出を核酸／タンパク質検出器（Ａ２８０紫外吸収ピーク）でモニターした。溶出タンパク質を回収し、緩衝液（１Ｍアルギニン、０．４Ｍコハク酸、ｐＨ９．０）を添加して中和した。その後、緩衝システム（２０ｍＭ ＰＢ、２００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０からｐＨ６．５）を用いて分子篩（ベストクロム社から購入）を通過させて、標的タンパク質を回収した。０．２２μｍのフィルターによる無菌ろ過によって精製ＩＬ－２変異体融合タンパク質を得、無菌状態で保存した。
精製ＩＬ－２変異体融合タンパク質について、タンパク質の収量、濃度（Ａ２８０／１．４）、およびＳＥＣ純度の試験および解析を行った。熱安定性が向上した精製ＩＬ－２変異体融合タンパク質（ｍｕｔＸＸ－リンカー２－ｈＦｃ）を特定した。これらは、野生型ＩＬ－２（ＩＬ２－リンカー２－ｈＦｃ）と比較して、収量が有意に多かった。タンパク質の収量、濃度、および純度の結果を表２に示す。
表２ 熱安定性が向上したＩＬ－２変異体融合タンパク質の検出結果
Figure 2023540761000005
実施例３－熱安定性が向上したＩＬ－２変異体の示差走査蛍光定量（ＤＳＦ）アッセイ
５０倍希釈したプロテインサーマルシフトダイキット（アプライドバイオシステムズ社から購入、カタログ番号４４６１１４６）の緩衝液、０．５ｍｇ／ｍＬに希釈したＩＬ－２変異体タンパク質（実施例２に記載の方法で精製）、および２倍希釈した染料を、２０μＬの反応系に添加した。均一に混合した後、各試料につき二連で、８チューブストリップに混合物を添加した。チューブに蓋をし、遠心分離を５秒から１０秒行い、アプライドバイオシステムズ７５００で解析した。その後、ボルツマン法を用いて融解曲線を解析することで、Ｔｍ値を得た。表３に示すように、野生型ＩＬ－２（ＩＬ２－リンカー２－ｈＦｃ）と比較して、ＩＬ－２変異体（ｍｕｔＸＸ－リンカー２－ｈＦｃ）では３℃よりも大きくＴｍ値が上昇しており、それによって熱安定性が有意に向上していた。
表３ 熱安定性が向上したＩＬ－２変異体のＤＳＦアッセイの結果
Figure 2023540761000006
実施例４－ＩＬ－２変異体（βγサブユニットに対する結合能が低下したＩＬ－２変異体、およびβγサブユニットに対する結合能が低下し熱安定性が向上したＩＬ－２変異体）の設計、および発現プラスミドの構築
ＭＯＥソフトウェアを含む種々のアルゴリズムを用いて、ヒトＩＬ－２と、対応する受容体αサブユニット、受容体βサブユニット、受容体γサブユニットとの間の相互作用をシミュレートし、βγサブユニットに対する結合能が低下した変異部位を得た。βγサブユニットに対する結合活性が低下した変異部位を有するＩＬ－２変異体配列の設計および合成を行い、それとともに、このような変異部位と熱安定性が向上した変異部位との組み合わせを有するＩＬ－２変異体配列の設計および合成を行った。野生型ＩＬ－２および上記ＩＬ－２変異体をコードする核酸断片を、Ｆｃタグを有するｐＴＴ５ベクターにクローニングした後、分子生物学において確立されている標準的な方法にしたがって、以下の融合タンパク質をコードするプラスミドを調製した：ＩＬ－２－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ７－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ７．０８－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ７．３６－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ７．３９－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ７．４６－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ７．５７－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ７．６６－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ８－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ８．０８－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ８．３６－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ１１－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ１１．３１－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ１１．３６－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ１１．４６－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ６１－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ６１．０８－リンカー２－ｈＦｃ、およびｍｕｔ６１．４６－リンカー２－ｈＦｃ。融合タンパク質およびその構成要素の具体的な配列を表４に示す。表中、「ＩＬ－２」は、野生型ＩＬ－２を表し、「ｍｕｔＸＸ」は、野生型ＩＬ－２と比較して変異が生じているＩＬ－２変異体を表す。
表４ ＩＬ－２変異体の配列
Figure 2023540761000007
Figure 2023540761000008
Figure 2023540761000009
Figure 2023540761000010
Figure 2023540761000011
Figure 2023540761000012
実施例５－ＩＬ－２変異体の産生および精製
実施例４で構築したプラスミドを用いてＨＥＫ２９３細胞（中国科学院の細胞バンクから購入）を一過的にトランスフェクトし（ＰＥＩ、ポリサイエンス社）、その後、フリースタイル（登録商標）２９３発現培地（ギブコ社から購入）において、３７℃で増殖させた。７日後に、細胞培養培地を回収し、細胞成分を遠心分離によって除去して、ＩＬ－２－ｈＦｃ融合タンパク質を含有する培養上清を得た。
１０ｍＬのプロテインＡカラム（ベストクロム社から購入）を用いて、細胞培養上清中の融合タンパク質を精製した。まず、カラムの３倍から５倍の体積の平衡化緩衝液（ＰＢＳリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）でプロテインＡカラムを平衡化し、その後、１０ｍＬ／分の流速で、透明な培養上清をロードした。ロード後、カラムの３倍から５倍の体積の平衡化緩衝液でプロテインＡカラムを洗浄した。プロテインＡカラムに結合したタンパク質を、溶出緩衝液（０．０２Ｍクエン酸緩衝液、０．１Ｍグリシン、０．１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ３．０）を用いて溶出させ、その溶出を核酸／タンパク質検出器（Ａ２８０紫外吸収ピーク）でモニターした。溶出タンパク質を回収し、緩衝液（１Ｍアルギニン、０．４Ｍコハク酸、ｐＨ９．０）を添加して中和した。その後、緩衝システム（２０ｍＭ ＰＢ、２００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０からｐＨ６．５）を用いて分子篩（ベストクロム社から購入）を通過させて、標的タンパク質を回収した。０．２２μｍのフィルターによる無菌ろ過によって精製ＩＬ－２変異体融合タンパク質を得、無菌状態で保存した。
精製ＩＬ－２変異体融合タンパク質（ｍｕｔＸＸ－リンカー２－ｈＦｃ）について、タンパク質の濃度（Ａ２８０／１．４）およびＳＥＣ純度の解析を行った。精製ＩＬ－２変異体融合タンパク質を特定した。タンパク質の純度および濃度の結果を表５に示す。
表５ ＩＬ－２変異体融合タンパク質の検出結果
Figure 2023540761000013
実施例６ ＩＬ－２変異体のＤＳＦアッセイ
５０倍希釈したプロテインサーマルシフトダイキット（アプライドバイオシステムズ社から購入、カタログ番号４４６１１４６）の緩衝液、０．５ｍｇ／ｍＬに希釈したＩＬ－２変異体タンパク質（実施例５において精製）、および２倍希釈した染料を、２０μＬの反応系に添加した。均一に混合した後、各試料につき二連で、８チューブストリップに混合物を添加した。チューブに蓋をし、遠心分離を５秒から１０秒行い、アプライドバイオシステムズ７５００で解析した。その後、ボルツマン法を用いて融解曲線を解析することで、Ｔｍ値を得た。具体的なＴｍ値を表６に示す。
表６に示す結果によると、野生型ＩＬ－２（ＩＬ２－リンカー２－ｈＦｃ）と比較して、実施例４および実施例５のＩＬ－２変異体（ｍｕｔＸＸ－リンカー２－ｈＦｃ）では５℃よりも大きくＴｍ値が上昇しており、９℃よりも大きくＴｍ値が上昇しているＩＬ－２変異体もあった。以上のように、すべての変異体で熱安定性が有意に向上した。
驚くべきことに、βγサブユニットに対する結合能が低下したＩＬ－２変異体では、野生型ＩＬ－２と比較して、Ｔｍ値が上昇し、熱安定性が向上していた。熱安定変異をさらに組み合わせた変異体は、高いＴｍ値を維持しており、熱安定変異を組み合わせた変異体の中には、βγサブユニットに対する結合能を低下させる変異のみを有するＩＬ－２変異体と比較して、２℃を超えて最大６℃までＴｍ値が上昇したものもあり、熱安定性がさらに向上していた。
表６ ＩＬ－２変異体のＤＳＦアッセイの結果
Figure 2023540761000014
実施例７－ヒトＩＬ－２受容体又はマウスＩＬ－２受容体を過剰発現する、安定的にトランスフェクトされた細胞系の構築
Ａ．ヒトＩＬ－２受容体αを過剰発現する、安定的にトランスフェクトされた細胞系の構築
ヒトＩＬ－２受容体αサブユニットのアミノ酸配列（ＮＣＢＩにおける遺伝子登録番号はＰ０１５８９であり、具体的な配列は配列番号５７に示す通りである）を、レンチウイルスパッケージング用のｐＬＶＸ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏベクター（ユーバイオ社から購入、カタログ番号ＶＴ１４６４）にクローニングした。その後、ＣＨＯ－Ｋ１細胞系（中国科学院の細胞バンクから購入）を、レンチウイルスでトランスフェクトした。ウイルスで７２時間トランスフェクトした後、公知のＩＬ－２受容体αサブユニット抗体（商品番号３０２６０６、バイオレジェンド社から購入）を用いて、フローサイトメトリーによってＣＨＯ細胞を検出した。トランスフェクトされた細胞がヒトＩＬ－２受容体αサブユニットの発現を開始していることが検出されると、スクリーニングのためにピューロマイシン（ギブコ社から購入）を添加した。細胞を回収した後、限界希釈によって９６ウェル培養プレートにサブクローニングし、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２で培養した。約２週間後、いくつかのモノクローナル細胞を選択し、６ウェルプレートへと広げた。公知のＩＬ－２受容体αサブユニット抗体を用いて、フローサイトメトリーによって、増殖させたクローンをさらにスクリーニングした。増殖がより良好で、蛍光強度がより高いモノクローナル細胞系を、さらなる増殖のために選択し、フローサイトメトリーによって再検出し、その後、液体窒素中で凍結して、ヒトＩＬ－２受容体αサブユニットを発現する、安定的にトランスフェクトされた細胞系を得た。具体的な選択結果を表７および図１に示す。表７の陽性細胞（％）とは、細胞の全数における陽性細胞の百分率のことをいう。表７は、ＩＬ－２受容体αサブユニットを過剰発現する一連のＣＨＯ－Ｋ１細胞系が調製されたことを示す。
表７ ヒトＩＬ－２受容体αを発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞のＦＡＣＳ特性評価
Figure 2023540761000015
Ｂ．ヒトＩＬ－２受容体βを過剰発現する、安定的にトランスフェクトされた細胞系の構築
ヒトＩＬ－２受容体βサブユニットのアミノ酸配列（ＮＣＢＩにおける遺伝子登録番号はＰ１４７８４であり、具体的な配列は配列番号５８に示す通りである）を、レンチウイルスパッケージング用のｐＬＶＸ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏベクター（ユーバイオ社から購入、カタログ番号ＶＴ１４６４）にクローニングした。その後、ＣＨＯ－Ｋ１細胞系（中国科学院の細胞バンクから購入）を、レンチウイルスでトランスフェクトした。ウイルスで７２時間トランスフェクトした後、公知のＩＬ－２受容体βサブユニット抗体（カタログ番号３３９０１０、バイオレジェンド社から購入）を用いて、フローサイトメトリーによってＣＨＯ－Ｋ１細胞を検出した。トランスフェクトされた細胞がヒトＩＬ－２受容体βサブユニットの発現を開始していることが検出されると、スクリーニングのためにピューロマイシン（ギブコ社から購入）を添加した。細胞を回収した後、限界希釈によって９６ウェル培養プレートにサブクローニングし、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２で培養した。約２週間後、いくつかのモノクローナル細胞を選択し、６ウェルプレートへと広げた。公知のＩＬ－２受容体βサブユニット抗体を用いて、フローサイトメトリーによって、増殖させたクローンをさらにスクリーニングした。増殖がより良好で、蛍光強度がより高いモノクローナル細胞系を、さらなる増殖のために選択し、フローサイトメトリーによって再検出し、その後、液体窒素中で凍結して、ヒトＩＬ－２受容体βサブユニットを発現する、安定的にトランスフェクトされた細胞系を得た。具体的な選択結果を表８および図２に示す。表８の陽性細胞（％）とは、細胞の全数における陽性細胞の百分率のことをいう。表８は、ＩＬ－２受容体βサブユニットを過剰発現する一連のＣＨＯ－Ｋ１細胞系が調製されたことを示す。
表８ ヒトＩＬ－２受容体βを発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞のＦＡＣＳ特性評価
Figure 2023540761000016
Ｃ．ヒトＩＬ－２受容体βγを過剰発現する、安定的にトランスフェクトされた細胞系の構築
ヒトＩＬ－２受容体γサブユニットのアミノ酸配列（ＮＣＢＩにおける遺伝子登録番号はＰ３１７８５であり、具体的な配列は配列番号５９に示す通りである）を、レンチウイルスパッケージング用のｐＬＶＸ－ＩＲＥＳ－Ｈｙｇｒｏベクターにクローニングした。その後、ヒトＩＬ－２受容体βサブユニットを過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞系（ＣＨＯ－Ｋ１ ｈＩＬ－２Ｒβ、クローン２Ａ５）を、レンチウイルスでトランスフェクトした。ウイルスで７２時間トランスフェクトした後、公知のＩＬ－２受容体βサブユニット抗体およびＩＬ－２受容体γサブユニット抗体（カタログ番号３３９０１０および３３８６０８、バイオレジェンド社から購入）を用いて、フローサイトメトリーによってＣＨＯ－Ｋ１細胞を検出した。トランスフェクトされた細胞がヒトＩＬ－２受容体βγサブユニットの発現を開始していることが検出されると、スクリーニングのためにピューロマイシンおよびハイグロマイシン（ギブコ社およびサーモ社から購入）を添加した。細胞を回収した後、限界希釈によって９６ウェル培養プレートにサブクローニングし、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２で培養した。約２週間後、いくつかのモノクローナル細胞を選択し、６ウェルプレートへと広げた。公知のＩＬ－２受容体βサブユニット抗体およびＩＬ－２受容体γサブユニット抗体を用いて、フローサイトメトリーによって、増殖させたクローンをさらにスクリーニングした。増殖がより良好で、蛍光強度がより高いモノクローナル細胞系を、さらなる増殖のために選択し、フローサイトメトリーによって再検出し、その後、液体窒素中で凍結して、ヒトＩＬ－２受容体βγサブユニットを発現する、安定的にトランスフェクトされた細胞系を得た。具体的な選択結果を表９ならびに図３Ａおよび図３Ｂに示す。表９の陽性細胞（％）とは、細胞の全数における陽性細胞の百分率のことをいう。表９は、ＩＬ－２受容体βγサブユニットを過剰発現する一連のＣＨＯ－Ｋ１細胞系が調製されたことを示す。
表９ ヒトＩＬ－２受容体βγを発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞のＦＡＣＳ特性評価
Figure 2023540761000017
Ｄ．ヒトＩＬ－２受容体αβγを過剰発現する、安定的にトランスフェクトされた細胞系の構築
ヒトＩＬ－２受容体αサブユニットのアミノ酸配列を、レンチウイルスパッケージング用のｐＬＶＸ－ＩＲＥＳ－ｚｓＧｒｅｅｎベクターにクローニングした。ヒトＩＬ－２受容体βγサブユニットを過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞系を、ベンチウイルスでトランスフェクトした。ウイルスで７２時間トランスフェクトした後、公知のＩＬ－２受容体αサブユニット抗体、ＩＬ－２受容体βサブユニット抗体、およびＩＬ－２受容体γサブユニット抗体（同上、バイオレジェンド社から購入）を用いて、フローサイトメトリーによってＣＨＯ－Ｋ１細胞を検出した。トランスフェクトされた細胞がヒトＩＬ－２受容体αβγサブユニットの発現を開始していることが検出されると、スクリーニングのためにピューロマイシンおよびハイグロマイシン（ギブコ社およびサーモ社から購入）ならびにＧＦＰ（蛍光発現用）を添加した。細胞を回収した後、限界希釈によって９６ウェル培養プレートにサブクローニングし、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２で培養した。約２週間後、いくつかのモノクローナル細胞を選択し、６ウェルプレートへと広げた。公知のＩＬ－２受容体αサブユニット抗体、ＩＬ－２受容体βサブユニット抗体、およびＩＬ－２受容体γサブユニット抗体を用いて、フローサイトメトリーによって、増殖させたクローンをさらにスクリーニングした。増殖がより良好で、蛍光強度がより高いモノクローナル細胞系を、さらなる増殖のために選択し、フローサイトメトリーによって再検出し、その後、液体窒素中で凍結して、ヒトＩＬ－２受容体αβγサブユニットを発現する、安定的にトランスフェクトされた細胞系を得た。具体的な選択結果を表１０ならびに図４Ａおよび図４Ｂに示す。表１０の陽性細胞（％）とは、細胞の全数における陽性細胞の百分率のことをいう。表１０は、ＩＬ－２受容体αβγサブユニットを過剰発現する一連のＣＨＯ－Ｋ１細胞系が調製されたことを示す。
表１０ ヒトＩＬ－２受容体αβγを発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞のＦＡＣＳ特性評価
Figure 2023540761000018
表１１ 実施例７（Ａ～Ｄ）において、安定的にトランスフェクトされた細胞株の構築に用いた遺伝子、およびそれらがコードするタンパク質の配列情報
Figure 2023540761000019
実施例８－フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）による、受容体発現細胞に対するＩＬ－２変異体の結合活性の検出
ＩＬ－２受容体αβγを発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ－Ｋ１ ｈＩＬ－２Ｒαβγ ２Ｄ６）又はＩＬ－２受容体βγを発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ－Ｋ１ ｈＩＬ－２Ｒβγ ２Ｅ６）を、Ｔ－７５細胞培養フラスコにおいて９０％コンフルエンスになるまで増殖させた。培地を除去した後、ＰＢＳ緩衝液（ハイクロン社から購入、カタログ番号ＳＨ３０２５６．０１）でフラスコを１回洗浄した。０．２５％ＥＤＴＡを含有するトリプシン（インビトロジェン社から購入、カタログ番号２５２０００７２）２ｍＬを用いて２分から３分、細胞を処理し、１０％（ｗ／ｗ）ウシ胎児血清（ギブコ社から購入、カタログ番号１００９９－１４１Ｃ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ－１２（ギブコ社から購入、カタログ番号１２６３４－０１０）８ｍＬを用いて中和し、３回から４回ピペッティングを行い、その後、１５ｍｌ遠心管に回収して計数し、５分間室温にて１０００ｒｐｍで遠心分離を行った。培養培地を廃棄した後、２％（ｗ／ｗ）ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ－１６４０（ギブコ社から購入、カタログ番号Ａ１０４９１－０１）に細胞を再懸濁し、その後、１．４３×１０６細胞／ｍｌまで希釈した。細胞を、Ｕ底９６ウェルＦＡＣＳ反応プレートに１ウェルあたり７０μＬずつ添加し、後で用いるために４℃又は氷上に置いた。検出しようとするＩＬ－２変異体を２％（ｗ／ｗ）ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ－１６４０で希釈し、１ウェルあたり３０μＬずつ細胞に添加し、よく混合し、氷上で１時間インキュベートした。その後、プレートをＦＡＣＳ緩衝液（２％（ｗ／ｗ）ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ緩衝液）で２回洗浄した。蛍光標識二次抗体（バイオレジェンド社から購入、カタログ番号４０９３０６）を１ウェルあたり１００μＬずつプレートに添加し、氷上で３０分間インキュベートした。その後、プレートをＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ、ＢＤカンパニー社から購入）による検出および解析を行った。あるいは、２％（ｗ／ｗ）パラホルムアルデヒド（ディングオ社から購入、カタログ番号ＡＲ－０２１１）を含有するＦＡＣＳ緩衝液１００μＬに細胞を懸濁し、その後、さらなるＦＡＣＳ検出まで４℃で保管した。ＦＡＣＳ検出を行う前に、各ウェルに１００μＬのＰＢＳ緩衝液を添加した。ＦＡＣＳによる検出および解析を行った。結果を図５Ａから図５Ｄならびに表１２および表１３に示す。結果は、ＩＬ－２変異体が、細胞表面のヒトＩＬ－２受容体αβγ三量体に結合することができたということを示す。細胞表面のヒトＩＬ－２受容体βγ二量体に対するＩＬ－２変異体の結合活性は、野生型ＩＬ－２の結合活性よりも弱かった。ＣＨＯ－Ｋ１ ＩＬ－２Ｒβγ二量体に対するｍｕｔ６１－リンカー２－ｈＦｃ、ｍｕｔ６１．０８－リンカー２－ｈＦｃ、およびｍｕｔ６１．４６－リンカー２－ｈＦｃの結合活性は、大きく阻害されていた。以下の表におけるＭＦＩは、検出された細胞集団の平均蛍光強度である。
表１２ ＦＡＣＳによって検出した、ＣＨＯ－Ｋ１のＩＬ２受容体αβγ組み換え細胞系（ＣＨＯ－Ｋ１ ＩＬ２Ｒαβγ）に対するＩＬ－２変異体の結合活性
Figure 2023540761000020
表１３ ＦＡＣＳによって検出した、ＣＨＯ－Ｋ１のＩＬ２受容体βγ組み換え細胞系（ＣＨＯ－Ｋ１ ＩＬ２Ｒβγ）に対するＩＬ－２変異体の結合活性
Figure 2023540761000021
実施例９－ＳＴＡＴ５リン酸化アッセイによって検出した、異なる細胞におけるＩＬ－２によるシグナリング経路の活性化
凍結されている末梢血単核球（ＰＢＭＣ）（オールセルズ社から購入）を解凍した。５×１０５個のＰＢＭＣ５０μＬとＩＬ－２変異体５０μＬとを各ウェルに添加し、二酸化炭素インキュベーター内で１５分間反応させた。反応後、予め冷やしておいたＤＰＢＳ１００μＬを各ウェルに添加して反応を停止した。遠心分離後、ＰＢＭＣをライブデッドバイオレット（インビトロジェン－Ｌ３４９６４）を用いて染色し、ＦｉｘＩ（ＢＤ－５５７８７０）を用いて３７℃で１０分間固定し、ＰｅｒｍＩＩＩ（ＢＤ－５５８０５０）を用いて氷上で３０分間透過処理を行った。その後、室温で１時間、ＣＤ３－ＡＦ７００（ＢＤ－５５７９４３）、ＣＤ４－ＰｅｒＣＰ Ｃｙ５．５（ＢＤ－５６０６５０）、ＣＤ８－ＦＴＩＣ（ＢＤ－５５５３６６）、ＣＤ２５－ＰＥ（ＢＤ－５５７１３８）、ＦｏｘＰ３－ＡＦ６４７（ＢＤ－５６００４５）、およびｐＳＴＡＴ５－ＰＥ Ｃｙ７（インビトロジェン－２５－９０１０－４２）を用いてＰＢＭＣを染色し、検出前に２回洗浄した。結果を図６Ａから図６Ｉおよび表１４から表１６に示す。結果は、ＩＬ－２変異体によって活性化されたＳＴＡＴ５リン酸化のレベルが、Ｔｒｅｇ細胞においては野生型ＩＬ－２と比較して同様であるが、ＣＤ４＋ＣＤ２５－ＦｏｘＰ３－Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞においては有意に低下していたということを示している。以下の表におけるＭＦＩは、検出された細胞集団におけるＳＴＡＴ５リン酸化の平均蛍光強度である。
表１４．ＦＡＣＳによって検出した、ＴｒｅｇにおいてＩＬ－２変異体によって活性化されたＳＴＡＴ５リン酸化シグナル
Figure 2023540761000022
表１５．ＦＡＣＳによって検出した、ＣＤ４＋ＣＤ２５－ＦｏｘＰ３－Ｔ細胞においてＩＬ－２変異体によって活性化されたＳＴＡＴ５リン酸化シグナル
Figure 2023540761000023
表１６ ＦＡＣＳによって検出した、ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＩＬ－２変異体によって活性化されたＳＴＡＴ５リン酸化シグナル
Figure 2023540761000024
実施例１０－Ｔ細胞の増殖に対するＩＬ－２変異体の調節作用
凍結ＰＢＭＣを解凍し、１０％ＦＢＳ（ギブコ社から購入、カタログ番号１００９９－１４１Ｃ）を含有するＲＰＭＩ－１６４０（ギブコ社から購入、カタログ番号Ａ１０４９１－０１）に再懸濁し、１００ｎｇ／ｍｌのＣＤ３抗体（ＢＤ社から購入、カタログ番号５６６６８５）でプレコートした６ウェルプレートで２日間培養した。細胞を回収し、ＰＢＳ緩衝液（ハイクロン社から購入、カタログ番号ＳＨ３０２５６．０１）で３回洗浄し、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ－１６４０に再懸濁して、６ウェルプレートで５日間培養した。その後、細胞を回収し、ＰＢＳ緩衝液で１回洗浄し、セルトレースバイオレット（インビトロジェン社から購入、カタログ番号Ｃ３４５５７）で染色し、培養培地で１回洗浄し、培養培地に再懸濁して２４ウェルプレートに添加し（１ウェルあたり細胞９００μＬ）、ＩＬ－２変異体タンパク質試料を１００μＬ添加して、７日間培養した。その後、細胞を回収し、１％ＢＳＡ（サンゴンバイオテック社から購入、カタログ番号Ａ５０００２３－０１００）を含有するＰＢＳ（サンゴンバイオテック社から購入、カタログ番号Ｂ５４８１１７－０５００）に再懸濁し、９６ウェルプレートに添加した。
細胞を、ＢＶ６０５－ＣＤ８（バイオレジェンド社から購入、カタログ番号３４４７４２）を用いて室温で３０分間染色し、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄し、１ウェルあたり２００μＬの固定液（ｅバイオサイエンス社から購入、カタログ番号００－５５２３－００）を用いて４℃で３０分間固定し、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄した。その後、１ウェルあたり２００μＬの透過処理液（ｅバイオサイエンス社から購入、カタログ番号００－５５２３－００）を用いて４℃で３０分間、細胞の透過処理を行い、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄した。細胞を、ＡＰＣ－ＣＹ７－ＣＤ３抗体（バイオレジェンド社から購入、カタログ番号３４４８１８）、ＣＤ２５抗体（バイオレジェンド社から購入、カタログ番号３０２６０６）、およびＦｏｘｐ３抗体（サーモフィッシャー社から購入、＃１７－４７７７－４２）を用いて室温で３０分間さらに染色し、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ２００μＬに再懸濁し、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ、ＢＤ社から購入）による検出および解析を行った。結果を図７Ａから図７Ｆおよび表１７から表１９に示す。結果は、ＩＬ－２変異体のＴｒｅｇの増殖に対する作用は、野生型ＩＬ－２と比較して同様であるが、ＣＤ４＋ＣＤ２５－ＦｏｘＰ３－Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ ＣＤ２５－Ｔ細胞に対しては、やや低かったということを示している。以下の表におけるＭＦＩは、検出された細胞におけるセルトレースバイオレットの平均蛍光強度であり、増殖細胞では低下していた。すなわち、同じ検出時間において、細胞の増殖がより速いと、検出される平均蛍光強度はより低くなった。
表１７ ＦＡＣＳによって検出した、ＩＬ－２変異体によって活性化されたＴｒｅｇの増殖
Figure 2023540761000025
表１８ ＦＡＣＳによって検出した、ＩＬ－２変異体によって活性化されたＣＤ４＋ＣＤ２５－ＦｏｘＰ３－Ｔ細胞の増殖
Figure 2023540761000026
表１９ ＦＡＣＳによって検出した、ＩＬ－２変異体によって活性化されたＣＤ８＋Ｔ ＣＤ２５－Ｔ細胞の増殖
Figure 2023540761000027
実施例１１．ＮＫ細胞の増殖に対するＩＬ－２変異体の調節作用
ＮＫソーティングキット（ミルテニーバイオテック社から購入、カタログ番号１３０－０９２－６５７）を用いてＮＫ細胞を選別、計数し、その後、２５％ウシ血清（ギブコ社から購入、カタログ番号１００９９－１４１Ｃ）、０．２ｍＭイノシトール（シグマアルドリッチ社から購入、カタログ番号Ｉ７５０８－５０Ｇ）、０．１ｍＭβ－メルカプトエタノール（シグマアルドリッチ社から購入、カタログ番号Ｍ３１４８－１００ＭＬ）、および０．０２ｍＭ葉酸（シグマアルドリッチ社から購入、カタログ番号Ｆ８７５８－５Ｇ）を含むＭＥＭ培地（ギブコ社から購入、カタログ番号１２６３４－０１０）に再懸濁した。各ウェルにＦｃブロッカー（バイオレジェンド社から購入、カタログ番号４２２３０２）およびＩＬ－２変異体を添加した９６ウェルプレートに細胞を播種し、３日間培養した。最後の１８時間、ＢｒｄＵ（バイオレジェンド社から購入、カタログ番号４２３４０１）を添加した。細胞を回収し、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄、再懸濁し、同体積の４％パラホルムアルデヒド（ディングオ社から購入、カタログ番号ＡＲ－０２１１）を用いて室温で３０分間固定し、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄した。０．５％トリトン－Ｘ１００（サーモフィッシャー社から購入、カタログ番号ＨＦＨ１０）を用いて室温で１５分間、細胞の透過処理を行い、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄し、ＤｎａｓｅＩ（シグマアルドリッチ社から購入、カタログ番号Ｄ４５１３－１ＶＬ）を用いて３７℃で１時間切断した。１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで細胞を洗浄、再懸濁し、ＡＰＣ抗ＢｒｄＵ抗体（バイオレジェンド社から購入、カタログ番号３３９８０８）を用いて室温で２０分間染色し、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄した。１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ２００μＬに試料を再懸濁し、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ、ＢＤ社から購入）による検出および解析を行った。結果を図８および表２０に示す。結果は、ＩＬ－２変異体のＮＫ細胞の増殖に対する作用は、野生型ＩＬ－２と比較して有意に低下していたということを示している。表２０のデータは、ＮＫ細胞集団におけるＢｒｄＵ陽性細胞の割合である。
表２０ ＦＡＣＳによって検出した、ＩＬ－２変異体によって活性化されたＮＫ細胞の増殖
Figure 2023540761000028
実施例１２．皮下投与後の野生型マウスにおける薬力学（ＰＤ）の結果
６週齢から８週齢の雌のＢａｌｂ／ｃマウスをバイタルリバー社から購入した。Ｆｃ－リンカー－ＩＬ２＿Ｖ９１Ｋおよびｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃをＰＢＳで希釈し、マウス１匹あたり２００μＬをマウスの背中に皮下投与した。投与後、ＦＡＣＳ解析のために、マウスの全血試料および脾臓試料を異なる時点において回収した。Ｆｃ－リンカー－ＩＬ２＿Ｖ９１Ｋの配列は、配列番号６０に示す通りであり、実施例２で説明したように精製した。
ＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＣＥＥＱＹＧＳＴＹＲＣＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＫＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＡＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号６０）
マウス全血を２ｍＬのＥＤＴＡ／２Ｋ抗凝固チューブ（シンカンメディカル社、カタログ番号Ｘ４２４）に回収し、抗凝固剤と完全に接触するようにチューブを上下に傾けて、抗凝固剤とよく混合した。３００μＬの全血をＦＡＣＳチューブに移し、染色用抗体の混合溶液を添加して、室温、暗所で２０分間インキュベートした。その後、試料に赤血球溶解緩衝液（ハイブリマックス、カタログ番号Ｒ７７５７－１００ｍＬ）（１試料あたり１ｍＬ）を添加して、室温、暗所で５分間放置し、綿状沈殿物を観察した。その後、試料を２０℃で６分間、４００ｇで遠心分離した。上清を廃棄した後、細胞を分散させた。赤血球の溶解を繰り返した。細胞の洗浄として、細胞をＰＢＳ（１試料あたり４ｍＬ）に再懸濁し、４℃で６分間、５００ｇで遠心分離した。上清を廃棄して、細胞を分散させた。固定用緩衝液（１チューブあたり５００μＬ）をチューブに滴下し、滴下する度にＦＡＣＳチューブを断続的に振盪した。試料を４℃で１時間又は一晩固定した。
マウスの脾臓を７０μｍのセルストレーナー（ファルコンコーニング社、カタログ番号３５２３５０）上で粉砕し、５００ｇで遠心分離した。各脾臓に３ｍＬの赤血球溶解緩衝液を添加し、５分間溶解させた後、２０ｍＬのＰＢＳを添加して溶解を停止した。混合物を５００ｇで５分間遠心分離した。細胞を５ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、７０μｍのセルストレーナーでスクリーニングした。細胞計数後、各ＦＡＣＳチューブに１×１０６個の細胞を添加した。Ｆｃブロッカー（バイオレジェンド社、カタログ番号１５６６０３）（１チューブあたり５μＬ）を添加した後、細胞をボルテックして、４℃で２０分間インキュベートした（１０分毎にボルテックスした）。その後、細胞にＦＡＣＳ洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ）（１チューブあたり４ｍＬ）を添加し、４℃で６分間、４００ｇで遠心分離した。上清を廃棄し、チューブの口を、吸い取り紙を用いて乾燥させた。細胞に抗マウスＣＤ３ｅ（ＢＤバイオサイエンス社、カタログ番号７４００１４）、抗マウスＣＤ４（ＢＤバイオサイエンス社、カタログ番号５５３４０７）、および抗マウスＣＤ２５（バイオレジェンド社、カタログ番号１０２００８）を添加し、ボルテックスして、４℃で２０分間インキュベートした（１０分毎にボルテックスした）。その後、細胞にＦＡＣＳ洗浄緩衝液（１チューブあたり４ｍＬ）を添加し、４℃で６分間、４００ｇで遠心分離した。上清を廃棄し、チューブの口を、吸い取り紙を用いて乾燥させた。１回ボルテックスした後、固定用緩衝液（１チューブあたり５００μＬ）をチューブに滴下し、滴下する度にチューブを断続的に振盪した。試料を４℃で１時間又は一晩固定した。
固定用緩衝液としては、セット３９０１（ｅバイオサイエンス社、カタログ番号００－５５２３－００）の固定／透過処理用濃縮物および固定／透過処理用希釈剤を１：３の比率で混合して、固定用緩衝液を調製した。
透過処理用緩衝液およびｄｄＨ２Ｏを１：９の比率でよく混合して、透過処理液を調製した。細胞に透過処理液（１チューブあたり２ｍＬ）を添加し、４℃で６分間、５００ｇで遠心分離した。上清を廃棄し、チューブの口を、吸い取り紙を用いて乾燥させた。透過処理液（１チューブあたり３ｍＬ）を用いて透過プロセスを繰り返した。細胞にＦｏｘｐ３抗体（ｅバイオサイエンス社、カタログ番号２５－５７７３－８２）（１チューブあたり１０μＬ）を添加し、４℃で４０分間保持した（２０分毎にボルテックスした）。その後、細胞にＦＡＣＳ緩衝液（１チューブあたり４ｍＬ）を添加し、４℃で６分間、５００ｇで遠心分離した。上清を廃棄し、チューブの口を、吸い取り紙を用いて乾燥させた。１回ボルテックスした後、チューブに１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を添加して、検出用に細胞を再懸濁した。動物群におけるＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｆｏｘｐ３－Ｔ細胞、およびＣＤ３＋ＣＤ４－Ｔ細胞の百分率を、平均±標準偏差（平均±ＳＥＭ）で表し、グラフ化して、グラフパッドプリズム５ソフトウェアを用いて解析した。
図９Ａから図９Ｃおよび図１０Ａから図１０Ｃに示すように、一用量として１ｍｐｋを皮下投与した場合、ｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃは、マウスの脾臓および末梢血において、Ｔｒｅｇの百分率を有意に上昇させ、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｆｏｘｐ３－Ｔ細胞の百分率を有意に低下させた。ＣＤ３＋ＣＤ４－Ｔ細胞の百分率は、有意には変化しなかった。ｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃの効力は、Ｆｃ－リンカー－ＩＬ２＿Ｖ９１Ｋの効力よりも良好であった。
実施例１３．野生型マウスＤＴＨ（遅延型過敏症）モデル
感作相は、以下の通りである。抗原を、体積比が１：１：１である３ｍｇ／ｍＬのＫＬＨ（シグマ社、カタログ番号Ｈ７０１７、５０ｍｇ）、ＩＦＡ（シグマ社、カタログ番号Ｆ５５０６、１０ｍＬ）、およびＣＦＡ（シグマ社、カタログ番号Ｆ５５８１、１０ｍＬ）とともに、ダブルハブニードル法によって乳化させた。抗原を完全に乳化させることで、約１時間で粘性のあるエマルジョンを形成することができた。各マウスに対して、１００μＬの乳化剤、すなわち１００μｇのＫＬＨを注射した。各マウスに対して、肩甲骨の中央部の２箇所（各箇所５０μＬ）に乳化させたＫＬＨを皮下注射した。同時に、ＷＴ ＩＬ－２リンカー２－ｈＦｃ群、Ｆｃ－リンカー－ＩＬ２＿Ｖ９１Ｋ群、およびｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃ群として、それぞれ、マウス１匹あたり１ｍｐｋ、２００μＬの用量で、３日に１回、ＷＴ ＩＬ－２リンカー２－ｈＦｃ（ＷＴ ＩＬ－２、配列番号１２）、Ｆｃ－リンカー－ＩＬ２＿Ｖ９１Ｋ、又はｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃをマウスに皮下注射した。また、ＣｓＡ群として、マウス１匹あたり１０ｍｐｋ、２００μＬの用量で、１日に１回、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ、シグマ社、カタログ番号Ｆ５５８１、１０ｍＬ）をマウスに腹腔内注射した。また、賦形剤コントロール群として、ＰＢＳをマウスに腹腔内注射した。
感作後５日目に刺激を与えた。１０ｍｇ／ｍＬのＫＬＨをＰＢＳで１０倍に希釈し、１μｇ／μＬとした。各マウスに対して、右耳に１０μＬのＫＬＨ（すなわち、１０μｇのＫＬＨ）、コントロールとして左耳に１０μＬのＰＢＳを皮内注射した。
感作前に、各マウスの左右の耳厚をスパイラルマイクロメーター（０ｍｍから２５ｍｍ、精度：０．００１、南京ＳｕＣｅ測定器有限公司から購入）で測定し、記録した。刺激前に、各マウスの左右の耳厚をスパイラルマイクロメーターで測定し、基礎値とした。刺激から２４時間後、４８時間後、７２時間後、および９６時間後に、耳厚を測定した。各群における体重および耳厚の変化を、平均±標準偏差（平均±ＳＥＭ）で表し、グラフ化して、グラフパッドプリズム５ソフトウェアを用いて解析した。
結果を図１１Ａに示す。１ｍｐｋを１回皮下投与した後、ＷＴ ＩＬ－２群におけるΔ耳厚の変化は、賦形剤コントロール群と比較して有意ではなかったが、ｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃ群のマウスのΔ耳厚はより小さくなっており、このことは、ｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃの抗炎症作用を示唆しており、ｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃの抗炎症効力は、Ｆｃ－リンカー－ＩＬ２＿Ｖ９１ＫおよびＣｓＡの抗炎症効力よりも良好である。図１１Ｂに示すように、各群の動物の体重に有意な変化はなかった。
２回目の実験の結果を図１２Ａに示す。Ｆｃ－リンカー－ＩＬ２＿Ｖ９１Ｋの１用量（１ｍｐｋ）を皮下投与し、一方、ｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃは、１用量として、０．０４ｍｐｋ、０．２ｍｐｋ、１ｍｐｋ、又は５ｍｐｋを皮下投与した。ｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃの抗炎症作用は、用量依存的であった。０．２ｍｐｋのｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦの作用は、１ｍｐｋのＦｃ－リンカー－ＩＬ２＿Ｖ９１Ｋと同様であり、この条件下では、体重に異常な点は観察されなかった。図１２Ｂに示すように、５ｍｐｋのｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃを投与した場合、マウスの体重は変動し、減少したが、他の群の体重は正常であった。
実施例１４．皮下投与後のＰＢＭＣマウスにおけるＰＤの結果
１１週齢から１２週齢の雌のＮＯＧマウスをバイタルリバー社から購入した。１日目に、ＰＢＭＣを解凍し、ＣＤ３（ｅバイオサイエンス社から購入、カタログ番号１６－００３７－８５／２１０６８００、終濃度１２．５ｎｇ／ｍＬ）およびＣＤ２８（ｅバイオサイエンス社から購入、カタログ番号１６－０２８９－８５／２０７３９５４、終濃度２５ｎｇ／ｍＬ）を添加することで活性化し、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で１６時間、一晩インキュベートした。０日目に、ＰＢＭＣ（マウス１匹あたり２０×１０６個、４００μＬ）を回収し、尾静脈経由でＮＯＧマウスに接種した。体重に基づき、接種マウスを無作為に５群に分けた。その５群には、ＰＢＳコントロール群、ｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃ群（０．３ｍｐｋ、１ｍｐｋ）、およびＦｃ－リンカー－ＩＬ２＿Ｖ９１Ｋ群（０．３ｍｐｋ、１ｍｐｋ）が含まれ、各群のマウスは３匹であった。その後、薬物を１用量、首に皮下注射した（０日目）。投与後３日目に、安楽死させたマウスの脾臓をＦＡＣＳ解析のために取り出し、データを記録した。動物群におけるＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）、Ｔｃｏｎ（ＣＤ４＋ＣＤ２５－）、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数および倍率変化をグラフ化し、グラフパッドプリズム８ソフトウェアを用いて解析した。
実験結果を図１３Ａおよび図１３Ｂならびに図１４Ａから図１４Ｃに示す。１ｍｐｋを１回皮下投与した後、ｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃは、３日目に用量依存的にＴｒｅｇ／Ｔｃｏｎの比率およびＴｒｅｇ／ＣＤ８＋Ｔの比率を上昇させ、Ｆｃ－リンカー－ＩＬ２＿Ｖ９１Ｋよりも良好な結果を示した。投与後３日目には、Ｔｒｅｇの数が有意に変化したことを除いて、Ｔｃｏｎの数は増加したが有意ではなく、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数は有意には変化しなかった。
実施例１５．ＰＢＭＣマウス移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）モデル
１３週齢から１４週齢の雌のＮＯＧマウスをバイタルリバー社から購入した。プロトコールは実施例１４と同様とした。体重に基づき、ＮＯＧマウスを３群に分けた。この３群には、Ｇ１群（ＰＢＳ、活性化ＰＢＭＣは接種せず、３匹のマウス）、Ｇ２群（ＰＢＳ、１０匹のマウス）、およびＧ３群（０．２ｍｐｋのｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃを投与、１０匹のマウス）が含まれ、Ｇ２群およびＧ３群には、実施例１４にしたがって活性化ＰＢＭＣを接種した。その後、薬物を１用量、首に皮下注射した（０日目）。１週あたり２回、マウスの体重を測定し、現れたＧＶＨＤの特徴に基づいて採点を行った［採点システム：体重減少（０：＜１０％、１：１０％～２０％、２：＞２０％、３：＞３０％）；貧血（０：尾が赤色又は桃色、１：尾が白色）；姿勢（０：正常、１：猫背）；一般活動性（０：正常、１：限定的）；排出（０：排出なし、１：排出）；および黄疸（０：尾が白色又は赤色、１：尾が黄色）；疾患の最高重症度又は死は、８に相当する］。データを記録した。注釈１：マウスのスコアが最高重症度となった場合、他の症状は採点しない；注釈２：死後も、実験終了まで、死亡したマウスの採点を続けた。
実験結果を図１５Ａおよび図１５Ｂに示す。ＰＢＭＣ移植後１３日目には、Ｇ２群の体重は減少しており、また、Ｇ２群では、ＧＶＨＤの症状は早期に現れていた。ＰＢＭＣ移植後１７日目には、Ｇ３群の体重は減少しており、Ｇ３群の全体的な体重減少は、Ｇ１群の全体的な体重減少よりも小さく、Ｇ３群の体重減少は、Ｇ２群の体重減少よりも遅く生じていた。これらは、ｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃが、マウスにおいてＧＶＨＤが生じることを、薬物学的な期待値に応じて効果的に抑制することを示唆している。ｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃは、０．２ｍｐｋでは毒性作用および副作用を示さず、体重評価の通りに、良好な抗ＧＶＨＤ能を示した。さらに、Ｇ３群の動物の死亡率およびＧＶＨＤスコアは、Ｇ２群よりも低く、有意な差があった。
実施例１６．マウスにおける薬物動態
本実験のマウス血漿薬物濃度を求める方法は、以下の通りである。１μｇ／ｍＬのｈＩＬ２Ｒアルファタンパク質（ＡＣＲＯバイオシステムズ社、カタログ番号ＩＬＡ－Ｈ５２Ｈ９－１００μｇ）で、プレートをコーティングした。ブランク血清中、５００ｎｇ／ｍＬから３．９０６２５ｎｇ／ｍＬにわたる濃度で、薬物の検量線を作成した。高濃度／中濃度／低濃度の品質コントロールを調製し、検出対象の試料すべて、標準品、および品質コントロールを希釈剤で４０倍希釈し、その後、プレートに二連で添加した（１００μｌ／ウェル）（実際の状況に応じて、試料をさらに希釈してもよい）。検出抗体である「ペルオキシダーゼ・アフィニピュア・マウス抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的」（ジャクソン社、カタログ番号２０９－０３５－０９８）を１００００倍希釈し、その後、プレートに添加した。発色のために、ＴＭＢ発色溶液をプレートに添加し（１００μｌ／ウェル）、その後、１Ｍ硫酸（５０μｌ／ウェル）を用いて発色を停止した。
皮下投与（１ｍｐｋ）の後、野生型マウスにおける血漿薬物濃度を求めた。２つの実験結果を図１６Ａおよび図１６Ｂならびに表２１および表２２に示す。いずれの実験においても、ｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃの曝露量は、Ｆｃ－リンカー－ＩＬ２＿Ｖ９１Ｋ（コントロール群）の曝露量の４倍から６倍高く、Ｔｍａｘは、Ｆｃ－リンカー－ＩＬ２＿Ｖ９１Ｋと比較して遅延した。１回の皮下投与（１ｍｐｋ）の後、ｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃの曝露量は、ｍｕｔ１１－リンカー２－ｈＦｃの曝露量よりも高かった。
表２１ 皮下投与を１回行った後の野生型マウスにおける薬物動態パラメータ
Figure 2023540761000029
表２２ 皮下投与を１回行った後の野生型マウスにおける薬物動態パラメータ
Figure 2023540761000030
静脈投与（１ｍｐｋ）の後、野生型マウスにおける血漿薬物濃度を求めた。結果を図１７および表２３に示す。ｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃの曝露量は、Ｆｃ－リンカー－ＩＬ２＿Ｖ９１Ｋの曝露量よりも高かったが、皮下投与と比較して、その差は小さくなっていた（Ｃｍａｘ：３×→１．３×、ＡＵＣ：４×→２．４×）。ｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃの曝露量は、ｍｕｔ１１－リンカー２－ｈＦｃの曝露量よりも高かったが、皮下投与と比較して、その差は小さくなっていた（Ｃｍａｘ：２．４×→１．２×、ＡＵＣ：３．２×→１．６×）。
したがって、皮下投与されたｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃの生物学的利用能は、Ｆｃ－リンカー－ＩＬ２＿Ｖ９１Ｋおよびｍｕｔ１１－リンカー２－ｈＦｃの生物学的利用能よりも良好であった。安定化変異は、薬物曝露および生物学的利用能を上昇させた。
表２３ 静脈投与を１回行った後の野生型マウスにおける薬物動態パラメータ
Figure 2023540761000031
実施例１４で説明した方法によって、マウスにＰＢＭＣを接種した。皮下投与（１ｍｐｋ）の後、野生型マウスにおける血漿薬物濃度を求めた。結果を図１８および表２４に示す。ＰＢＭＣマウスにおいては、１回の皮下投与（１ｍｐｋ）の後、ｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃの曝露量は、Ｆｃ－リンカー－ＩＬ２＿Ｖ９１Ｋの曝露量よりも５倍から８倍高く、明らかに有利であり、ｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃのＴｍａｘは、Ｆｃ－リンカー－ＩＬ２＿Ｖ９１ＫのＴｍａｘよりも遅くなっていた。
表２４ 皮下投与を１回行った後のＰＢＭＣマウスにおける薬物動態パラメータ
Figure 2023540761000032
実施例１７．カニクイザルにおける薬物動態およびＰＤの結果
本実験のカニクイザル血漿薬物濃度を求める方法は、以下の通りである。１μｇ／ｍＬのｈＩＬ２Ｒアルファタンパク質（ＡＣＲＯバイオシステムズ社、カタログ番号ＩＬＡ－Ｈ５２Ｈ９－１００μｇ）で、プレートをコーティングした。カニクイザル由来のブランク血清中、１５ｎｇ／ｍＬから０．１１７１８ｎｇ／ｍＬにわたる濃度で、薬物の検量線を作成した。高濃度／中濃度／低濃度の品質コントロールを調製し、検出対象の試料すべて、標準品、および品質コントロールを５倍希釈し、その後、プレートに二連で添加した（１００μｌ／ウェル）。検出抗体である「ヤギ抗ヒトＩｇＧ、サルａｄｓ－ＢＩＯＴ」（サザンバイオテック社、カタログ番号２０４９－０８）を１０００倍希釈してからプレートに添加し、その後、５０００倍希釈したストレプトアビジン－ＨＲＰ（サーモ社、カタログ番号２１１２６）をプレートに添加した。最後に、発色のために、ＴＭＢ発色溶液を添加し（１００μｌ／ウェル）、その後、１Ｍ硫酸（５０μｌ／ウェル）を用いて発色を停止した。カニクイザルブランク血清は、上海Ｈｋｅｙ生物科技有限公司から購入した。
０．０５ｍｐｋの用量で、ＩＬ－２を４匹のカニクイザルに皮下投与した。そのうちの１匹には、ＷＴ ＩＬ－２－リンカー２－ｈＦｃ（ＷＴ ＩＬ－２と略記、配列番号１２に示す）を投与し、１匹にはＦｃ－リンカー－ＩＬ２＿Ｖ９１Ｋを投与し、２匹にはｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃ（それぞれＭｕｔ１１．０８－１およびＭｕｔ１１．０８－２と略記）を投与し、投与後に血漿薬物濃度を検出した。結果を図１９および表２５に示す。０．０５ｍｐｋの用量では、ＷＴ ＩＬ－２分子の終末相半減期は長く、Ｆｃ－リンカー－ＩＬ２＿Ｖ９１Ｋおよびｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃの終末相半減期は同程度であった。ＣｍａｘおよびＡＵＣの順位は、ｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃ＞Ｆｃ－リンカー－ＩＬ２＿Ｖ９１Ｋ＞ＷＴ ＩＬ２であった。
表２５ 皮下投与を１回行った後のカニクイザルにおける薬物動態パラメータ
Figure 2023540761000033
４匹のカニクイザルを用いて、ｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃを１回皮下投与した場合のカニクイザル由来のＴｒｅｇの増殖に対する作用を判定した。１匹にはＷＴ ＩＬ－２－リンカー２ーｈＦＣを投与し、１匹にはＦｃ－リンカー－ＩＬ２＿Ｖ９１Ｋを投与し、その他の２匹にはｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃを投与した。それぞれ０．０５ｍｐｋの用量を（１回の皮下投与にて）投与した。投与前ならびに投与後１日目、３日目、５日目、７日目、１０日目、及び１４日目に、カニクイザルの末梢血を回収した。異なる時点において回収したカニクイザルの血液試料２ｍＬからＰＢＭＣを単離し、凍結した。各時点における凍結ＰＢＭＣのバイアルを取り出し、解析のために一緒に解凍した。解凍したＰＢＭＣを１ｍＬの染色緩衝液（２％ＦＢＳを含有するＤＰＢＳ緩衝液）に再懸濁し、その後、各２００μＬを２枚の９６ウェルＶ底プレートに移し、パネル１およびパネル２とした。２枚のプレートをＰＢＳで１回洗浄し、その後、ライブ／デッド・フィクサブル・ニア－ＩＲ（サーモ社、カタログ番号１３４９７６）を用いて２０分間染色した。染色緩衝液を用いて染色を停止させた後、ヒト・トゥルーステイン・ＦｃＸ（バイオレジェンド社、カタログ番号４２２３０２）をプレートに添加し、２０分間インキュベートした。その後、異なる蛍光抗体の混合物を用いて、２枚のプレートを３０分間染色した。パネル１では、ＢＶ６０５マウス抗ヒトＣＤ３（ＢＤ社、カタログ番号５６２９９４）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５マウス抗ヒトＣＤ４（ＢＤ社、カタログ番号５５２８３８）、ＦＩＴＣマウス抗ヒトＣＤ８（バイオレジェンド社、カタログ番号３０１０５０）、およびＢＶ４２１マウス抗ヒトＣＤ２５（バイオレジェンド社、カタログ番号３０２６３０）を、ブリリアント染色緩衝液（ＢＤ社、カタログ番号５６３７９４）で希釈した。パネル２では、ＢＶ６０５マウス抗ヒトＣＤ３（ＢＤ社、カタログ番号５６２９９４）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５マウス抗ヒトＣＤ４（ＢＤ社、カタログ番号５５２８３８）、ＦＩＴＣマウス抗ヒトＣＤ８（バイオレジェンド社、カタログ番号３０１０５０）、およびブリリアントバイオレット４２１抗ヒトＣＤ１６（バイオレジェンド社、カタログ番号３０２０３８）を、ブリリアント染色緩衝液で希釈した。染色を停止させた後に細胞を１回洗浄し、Ｆｏｘｐ３／転写因子染色緩衝液キット（ｅバイオサイエンス社、カタログ番号００－５５２３－００）を用いて固定および透過処理を行った。２枚のプレートに異なる蛍光抗体の混合物を添加して、細胞を４５分間染色した。パネル１では、ＰＥ抗ヒトＦＯＸＰ３（バイオレジェンド社、カタログ番号３２０２０８）およびＫｉ６７モノクローナル抗体ＡＰＣ（ｅバイオサイエンス社、カタログ番号１７－５６９８－８２）を透過処理緩衝液で希釈した。パネル２では、Ｋｉ６７モノクローナル抗体ＡＰＣを透過処理緩衝液で希釈した。染色後、透過処理緩衝液で１回洗浄し、４００μＬの染色緩衝液に再懸濁して、その後、２００μＬの試料をＦＡＣＳで解析した。動物群におけるＴｒｅｇ、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３－Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞の数および倍率変化をグラフ化し、グラフパッドプリズム９ソフトウェアを用いて解析した。
実験結果を図２０Ａから図２０Ｆに示す。１回の皮下投与（０．０５ｍｐｋ）の後、ｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃは、カニクイザル末梢血中のＴｒｅｇの数および百分率を上昇させた。Ｔｒｅｇ／ＣＤ４＋Ｔの比率によると、ｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃは、Ｔｒｅｇの活性化に有利に働き、そのため、Ｔｒｅｇの百分率は、Ｆｃ－リンカー－ＩＬ２＿Ｖ９１Ｋの約２倍であった。Ｆｃ－リンカー－ＩＬ２＿Ｖ９１Ｋと比較して、ｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃは、Ｔｒｅｇの増殖を向上させる作用がより強く（１１．０８対Ｆｃ－リンカー－ＩＬ２＿Ｖ９１Ｋは、７９／５５対１８）、一方で、Ｆｃ－リンカー－ＩＬ２＿Ｖ９１Ｋはこの点においてＷＴよりも良好であった（１８対９．５）。Ｔｒｅｇ活性化マーカーの解析によると、異なる分子の投与後、Ｋｉ６７＋Ｔｒｅｇの％に差異はほとんどなかった。Ｔｒｅｇ活性化マーカー（Ｆｏｘｐ３およびＣＤ２５）の発現は有意に増加しており、これは、Ｔｒｅｇの増殖レベルと正に相関していた。
図２１Ａから図２１Ｆに示すように、Ｆｃ－リンカー－ＩＬ２＿Ｖ９１Ｋ（０．０５ｍｐｋ）を１回皮下投与した後、ＦｏｘｏＰ３－ＣＤ４＋Ｔ細胞の最大倍率変化は、約２倍であり、ＣＤ８＋Ｔ細胞ではやや高く、約４倍であった。ＦｏｘｏＰ３－ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖に対するｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃの作用は、Ｆｃ－リンカー－ＩＬ２＿Ｖ９１Ｋの作用よりも約２倍から３倍強く、一方で、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖に対する作用は、Ｆｃ－リンカー－ＩＬ２＿Ｖ９１Ｋの作用と同様かやや弱く、ＷＴの約１．５倍から２倍であった。Ｆｃ－リンカー－ＩＬ２＿Ｖ９１Ｋの投与後、ＮＫ細胞の数は有意に変化しなかった。ＮＫの増殖レベルに対するｍｕｔ１１．０８－リンカー２－ｈＦｃの作用は、Ｆｃ－リンカー－ＩＬ２＿Ｖ９１Ｋと同様であった。

Claims (30)

  1. 野生型ＩＬ－２と比較して、Ｑ１３、Ｌ１８、Ｇ２７、Ｙ３１、Ａ７３、Ｈ７９、Ｐ８２、Ｉ８９、Ｎ９０、Ｖ９１、Ｖ９３、Ｆ１１７、又はＲ１２０において１つ以上の変異を含む、ＩＬ－２変異体。
  2. 前記ＩＬ－２変異体は、Ｑ１３Ｌ、Ｌ１８Ｉ、Ｇ２７Ｗ、Ｙ３１Ｖ、Ａ７３Ｌ、Ｈ７９Ｑ、Ｐ８２Ｌ、Ｉ８９Ｌ、Ｎ９０Ｙ、Ｖ９１Ａ、Ｖ９３Ｉ、Ｆ１１７Ｗ、又はＲ１２０Ｆのうちの１つ以上の変異を含む、請求項１に記載のＩＬ－２変異体。
  3. 前記ＩＬ－２変異体は、（ａ）群から（ｈ）群のうちの少なくとも１つの群の変異を含む、請求項１に記載のＩＬ－２変異体：
    （ａ）．Ｙ３１／Ａ７３／Ｈ７９における変異；好ましくはＹ３１Ｖ／Ａ７３Ｌ／Ｈ７９Ｑにおける変異；
    （ｂ）．Ｑ１３における変異；好ましくはＱ１３Ｌにおける変異；
    （ｃ）．Ｒ１２０における変異；好ましくはＲ１２０Ｆにおける変異；
    （ｄ）．Ｌ１８／Ｖ９１／Ｆ１１７における変異；好ましくはＬ１８Ｉ／Ｖ９１Ａ／Ｆ１１７Ｗにおける変異；
    （ｅ）．Ｌ１８／Ｉ８９／Ｖ９３における変異；好ましくはＬ１８Ｉ／Ｉ８９Ｌ／Ｖ９３Ｉにおける変異；
    （ｆ）．Ｇ２７／Ｒ１２０における変異；好ましくはＧ２７Ｗ／Ｒ１２０Ｆにおける変異；
    （ｇ）．Ｐ８２／Ｒ１２０における変異；好ましくはＰ８２Ｌ／Ｒ１２０Ｆにおける変異；
    （ｈ）．Ｎ９０／Ｒ１２０における変異；好ましくはＮ９０Ｙ／Ｒ１２０Ｆにおける変異。
  4. 前記ＩＬ－２変異体は、配列番号２から配列番号９のいずれか１つに示すアミノ酸配列を有する、請求項３に記載のＩＬ－２変異体。
  5. 前記ＩＬ－２変異体のＴｍ値は、前記野生型ＩＬ－２のＴｍ値よりも高い、請求項１から４のいずれか一項に記載のＩＬ－２変異体。
  6. 前記ＩＬ－２変異体は、Ｈ１６、Ｄ２０、Ｎ８８、Ｖ９１、又はＱ１２６における変異、例えば、Ｈ１６Ｅ、Ｄ２０Ａ、Ｄ２０Ｈ、Ｄ２０Ｙ、Ｎ８８Ａ、Ｎ８８Ｉ、Ｎ８８Ｇ、Ｎ８８Ｒ、Ｎ８８Ｄ、Ｖ９１Ｒ、Ｖ９１Ｋ、Ｑ１２６Ｌ、又はＱ１２６Ｆからなる群から選択される１つ以上の変異をさらに含み；
    好ましくは、前記ＩＬ－２変異体は、（ｉ）群から（ｉｖ）群のうちから選択される少なくとも１つの群の変異をさらに含む、請求項１から３又は５のいずれか一項に記載のＩＬ－２変異体：
    （ｉ）．Ｈ１６における変異；好ましくはＨ１６Ｅにおける変異；
    （ｉｉ）．Ｄ２０における変異；好ましくはＤ２０Ａにおける変異；
    （ｉｉｉ）Ｖ９１における変異；好ましくはＶ９１Ｒにおける変異；
    （ｉｖ）．Ｈ１６／Ｖ９１における変異；好ましくはＨ１６Ｅ／Ｖ９１Ｒにおける変異。
  7. 前記ＩＬ－２変異体は、（ａ）群から（ｎ）群のうちの少なくとも１つの群の変異を含む、請求項６に記載のＩＬ－２変異体：
    （ａ）．Ｈ１６／Ｙ３１／Ａ７３／Ｈ７９における変異；好ましくはＨ１６Ｅ／Ｙ３１Ｖ／Ａ７３Ｌ／Ｈ７９Ｑにおける変異；
    （ｂ）．Ｈ１６／Ｒ１２０における変異；好ましくはＨ１６Ｅ／Ｒ１２０Ｆにおける変異；
    （ｃ）．Ｈ１６／Ｌ１８／Ｖ９１／Ｆ１１７における変異；好ましくはＨ１６Ｅ／Ｌ１８Ｉ／Ｖ９１Ａ／Ｆ１１７Ｗにおける変異；
    （ｄ）．Ｈ１６／Ｌ１８／Ｉ８９／Ｖ９３における変異；好ましくはＨ１６Ｅ／Ｌ１８Ｉ／Ｉ８９Ｌ／Ｖ９３Ｉにおける変異；
    （ｅ）．Ｈ１６／Ｇ２７／Ｒ１２０における変異；好ましくはＨ１６Ｅ／Ｇ２７Ｗ／Ｒ１２０Ｆにおける変異；
    （ｆ）．Ｈ１６／Ｐ８２／Ｒ１２０における変異；好ましくはＨ１６Ｅ／Ｐ８２Ｌ／Ｒ１２０Ｆにおける変異；
    （ｇ）．Ｄ２０／Ｙ３１／Ａ７３／Ｈ７９における変異；好ましくはＤ２０Ａ／Ｙ３１Ｖ／Ａ７３Ｌ／Ｈ７９Ｑにおける変異；
    （ｈ）．Ｄ２０／Ｒ１２０における変異；好ましくはＤ２０Ａ／Ｒ１２０Ｆにおける変異；
    （ｉ）．Ｖ９１／Ｙ３１／Ａ７３／Ｈ７９における変異；好ましくはＶ９１Ｒ／Ｙ３１Ｖ／Ａ７３Ｌ／Ｈ７９Ｑにおける変異；
    （ｊ）．Ｖ９１／Ｑ１３における変異；好ましくはＶ９１Ｒ／Ｑ１３Ｌにおける変異；
    （ｋ）．Ｖ９１／Ｒ１２０における変異；好ましくはＶ９１Ｒ／Ｒ１２０Ｆにおける変異；
    （ｌ）．Ｖ９１／Ｌ１８／Ｉ８９／Ｖ９３における変異；好ましくはＶ９１Ｒ／Ｌ１８Ｉ／Ｉ８９Ｌ／Ｖ９３Ｉにおける変異；
    （ｍ）．Ｈ１６／Ｖ９１／Ｙ３１／Ａ７３／Ｈ７９における変異；好ましくはＨ１６Ｅ／Ｖ９１Ｒ／Ｙ３１Ｖ／Ａ７３Ｌ／Ｈ７９Ｑにおける変異；
    （ｎ）．Ｈ１６／Ｖ９１／Ｌ１８／Ｉ８９／Ｖ９３における変異；好ましくはＨ１６Ｅ／Ｖ９１Ｒ／Ｌ１８Ｉ／Ｉ８９Ｌ／Ｖ９３Ｉにおける変異。
  8. 前記ＩＬ－２変異体は、配列番号２２から配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２から配列番号３５、又は配列番号３７又は配列番号３８のいずれかのアミノ酸配列を有する、請求項７に記載のＩＬ－２変異体。
  9. 前記ＩＬ－２変異体は、Ｆ４２、Ｙ４５、又はＬ７２からなる群から選択される１つ以上、好ましくはＦ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、又はＬ７２Ｇからなる群から選択される１つ以上の変異をさらに含む、請求項１から３又は５のいずれか一項に記載のＩＬ－２変異体。
  10. 野生型ＩＬ－２と比較して、Ｈ１６、Ｄ２０、又はＶ９１において１つ以上の変異を含む、ＩＬ－２変異体であって；好ましくは、前記ＩＬ－２変異体は、（ｉ）群から（ｉｖ）群のうちから選択される少なくとも１つの群の変異を含む、ＩＬ－２変異体：
    （ｉ）．Ｈ１６における変異；好ましくはＨ１６Ｅにおける変異；
    （ｉｉ）．Ｄ２０における変異；好ましくはＤ２０Ａにおける変異；
    （ｉｉｉ）．Ｖ９１における変異；好ましくはＶ９１Ｒにおける変異；
    （ｉｖ）．Ｈ１６／Ｖ９１における変異；好ましくはＨ１６Ｅ／Ｖ９１Ｒにおける変異。
  11. 前記ＩＬ－２変異体は、配列番号２１、配列番号２８、配列番号３１、又は配列番号３６に示すアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載のＩＬ－２変異体。
  12. 前記ＩＬ－２変異体は、Ｎ２６、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｎ７１、Ｑ１１、Ｌ１３２、Ｌ７０、Ｐ８２、Ｇ２７、又はＦ２８における変異からなる群から選択される１つ以上の変異をさらに含み；
    好ましくは、前記ＩＬ－２変異体は、Ｎ２６Ｑ、Ｎ２９Ｓ、Ｎ３０Ｓ、Ｎ７１Ｑ、Ｑ１１Ｃ、Ｌ１３２Ｃ、Ｌ７０Ｃ、Ｐ８２Ｃ、Ｇ２７Ｃ、又はＦ７８Ｃからなる群から選択される１つ以上の変異をさらに含み；
    より好ましくは、前記ＩＬ－２変異体は、（ａ）群から（ｇ）群における少なくとも１つの群の変異をさらに含む、請求項１から３、５から７、９又は１０のいずれか一項に記載のＩＬ－２変異体：
    （ａ）．Ｎ２６Ｑ；
    （ｂ）．Ｎ２９Ｓ；
    （ｃ）．Ｎ３０Ｓ；
    （ｄ）．Ｎ７１Ｑ；
    （ｅ）．Ｑ１１Ｃ／Ｌ１３２Ｃ；
    （ｆ）．Ｌ７０Ｃ／Ｐ８２Ｃ；
    （ｇ）．Ｇ２７Ｃ／Ｆ７８Ｃ。
  13. 前記ＩＬ－２変異体は、前記野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２Ｒβγサブユニット複合体に対する結合能が低下しており；好ましくは、結合能ＩＬ－２Ｒβγサブユニット複合体／結合能ＩＬ－２αβγサブユニット複合体が低下している、請求項６から８、１０から１２のいずれか一項に記載のＩＬ－２変異体。
  14. 前記変異体は、野生型ＩＬ－２と比較して、非制御性Ｔ細胞又はＮＫ（ナチュラルキラー）細胞に対する刺激能が低下しており；前記刺激としては、細胞内ＳＴＡＴ５リン酸化又は細胞増殖から選択することができ；
    あるいは、前記変異体は、非制御性Ｔ細胞又はＮＫ（ナチュラルキラー）細胞よりも末梢血内の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）又はＴ細胞集団を優先的に刺激し；前記優先的刺激としては、制御性Ｔ細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化を優先的に刺激すること、制御性Ｔ細胞の増殖を優先的に刺激すること、非制御性Ｔ細胞に対する制御性Ｔ細胞の比率を上昇させること、又はＮＫ細胞に対する制御性Ｔ細胞の比率を上昇させることから選択することができる、請求項１３に記載のＩＬ－２変異体。
  15. 前記変異は、欠失、挿入、又は置換を含み、好ましくは置換を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載のＩＬ－２変異体。
  16. 前記野生型ＩＬ－２は、配列番号６０又は配列番号１に示すアミノ酸配列を有する、請求項１から１５のいずれか一項に記載のＩＬ－２変異体。
  17. 第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質であって、前記第１のポリペプチドは、請求項１から１６のいずれか一項に記載のＩＬ－２変異体であり、前記第２のポリペプチドは、非ＩＬ－２ポリペプチドである、融合タンパク質。
  18. 前記第２のポリペプチドは、Ｆｃ、腫瘍抗原結合分子、又はＩＬ－２受容体サブユニットであり；
    前記Ｆｃは、任意に、ヒトＩｇＧのＦｃ、例えばヒトＩｇＧ１のＦｃであり；
    好ましくは、前記ヒトＩｇＧ１のＦｃは、（ａ）群から（ｉ）群のうちから選択される少なくとも１つの群の変異を含み：
    （ａ）．Ｃ２２０Ｓ；
    （ｂ）．Ｎ２９７Ｇ；
    （ｃ）．Ｃ２２０ＳおよびＮ２９７Ｇ；
    （ｄ）．Ａ３２７Ｑ；
    （ｅ）．Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ；
    （ｆ）．Ａ２８７ＣおよびＬ３０６Ｃ；
    （ｇ）．Ａ２５９ＣおよびＶ３０２Ｃ；
    （ｈ）．Ｒ２９２ＣおよびＶ３０６Ｃ；
    （ｉ）．Ｖ３２３ＣおよびＩ３３２Ｃ；
    より好ましくは、前記ヒトＩｇＧ１のＦｃは、配列番号１１に示すアミノ酸配列を有し；
    前記腫瘍抗原は、ＥＤＢ－ＦＮ（フィブロネクチンのエクストラドメイン）、Ｍｕｃ１、ｐ５３、ＦＡＰ、ＧＤ２、ＥｐＣＡＭ、テネイシン－Ｃ、ＣＤ２０、ＣＥＡ、ＭＡｄＣＡＭ－１、又はＷＴ１（ウィルムス腫瘍タンパク質１）を任意に含み；前記腫瘍抗原結合分子は、任意に、ｓｃＦｖ、ｓｄＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖなどの抗体であり；
    前記ＩＬ－２受容体サブユニットは、任意に、ＩＬ－２受容体αサブユニットである、請求項１７に記載の融合タンパク質。
  19. 前記第１のポリペプチドのＣ末端は、リンカーを介して、又はリンカーを介さずに、前記第２のポリペプチドのＮ末端に連結され；あるいは、前記第１のポリペプチドのＮ末端は、リンカーを介して、又はリンカーを介さずに、前記第２のポリペプチドのＣ末端に連結され；
    好ましくは、前記リンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＧＧＮＧＴ）ｎ、又は（ＹＧＮＧＴ）ｎから選択され、前記ｎは、１、２、３、４、又は５から選択され；
    より好ましくは、前記第１のポリペプチドのＣ末端は、リンカー（Ｇ４Ｓ）３によって前記第２のポリペプチドのＮ末端に連結されている、請求項１７又は１８に記載の融合タンパク質。
  20. 前記融合タンパク質は、配列番号１３から配列番号２０又は配列番号３９から配列番号５６のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の融合タンパク質。
  21. 請求項１から請求項１６のいずれか一項に記載の変異体又は請求項１７から請求項２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含み、前記変異体又は前記融合タンパク質に結合した安定剤、薬物、又はトレーサー分子をさらに含む、抱合体であって；前記安定剤としては、モノメトキシポリエチレングリコールなどのポリエチレングリコール類から選択することができる、抱合体。
  22. 請求項１から１６のいずれか一項に記載の変異体又は請求項１７から２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、単離核酸断片。
  23. 請求項２２に記載の核酸断片を含む、ベクター。
  24. 請求項２３に記載のベクターを含む、宿主細胞であって；前記宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であり；前記原核細胞又は前記真核細胞としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、又は哺乳類細胞から選択することができ；前記哺乳類細胞としては、ＣＨＯ細胞系又はＨＥＫ２９３細胞系から選択することができる、宿主細胞。
  25. 請求項１から１６のいずれか一項に記載の変異体又は請求項１７から２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を調製する方法であって、前記方法は、請求項２４に記載の宿主細胞を培養することと、前記宿主細胞によって発現された前記ＩＬ－２変異体又は前記融合タンパク質を単離することと、を含む、方法。
  26. 請求項２５に記載の方法に従って調製された、ＩＬ－２変異体又は融合タンパク質。
  27. 請求項１から１６のいずれか一項に記載の変異体、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項２１に記載の抱合体、請求項２２に記載の核酸断片、請求項２３に記載のベクター、請求項２４に記載の宿主細胞、又は請求項２６に記載の変異体もしくは融合タンパク質と、薬学的に許容される担体、希釈剤、又はアジュバントと、を含む、医薬組成物であって；
    好ましくは、前記医薬組成物は、例えば静脈注射又は皮下注射などの注射用の医薬組成物であり；より好ましくは、投与１回あたりの前記医薬組成物は、対象に投与される融合タンパク質を有効量含み；最も好ましくは、前記有効量は、０．００１ｍｐｋから１０ｍｐｋ、例えば、０．００１ｍｐｋ、０．００２ｍｐｋ、０．００３ｍｐｋ、０．００４ｍｐｋ、０．００５ｍｐｋ、０．００６ｍｐｋ、０．００７ｍｐｋ、０．００８ｍｐｋ、０．００９ｍｐｋ、０．０１ｍｐｋ、０．０２ｍｐｋ、０．０３ｍｐｋ、０．０４ｍｐｋ、０．０５ｍｐｋ、０．０６ｍｐｋ、０．０７ｍｐｋ、０．０８ｍｐｋ、０．０９ｍｐｋ、０．１ｍｐｋ、０．２ｍｐｋ、０．３ｍｐｋ、０．４ｍｐｋ、０．５ｍｐｋ、０．６ｍｐｋ、０．７ｍｐｋ、０．８ｍｐｋ、０．９ｍｐｋ、１ｍｐｋ、２ｍｐｋ、３ｍｐｋ、４ｍｐｋ、５ｍｐｋ、６ｍｐｋ、７ｍｐｋ、８ｍｐｋ、９ｍｐｋ、又は１０ｍｐｋである、医薬組成物。
  28. 疾患治療用の薬剤の製造における請求項１から１６のいずれか一項に記載の変異体、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項２１に記載の抱合体、請求項２２に記載の核酸断片、請求項２３に記載のベクター、請求項２４に記載の宿主細胞、又は請求項２６に記載の変異体もしくは融合タンパク質の使用であって；
    好ましくは、前記薬剤は、例えば静脈注射又は皮下注射などの注射用の薬剤であり；
    好ましくは、投与１回あたりの前記薬剤は、対象に投与される融合タンパク質を有効量含み；最も好ましくは、前記有効量は、０．００１ｍｐｋから１０ｍｐｋ、例えば、０．００１ｍｐｋ、０．００２ｍｐｋ、０．００３ｍｐｋ、０．００４ｍｐｋ、０．００５ｍｐｋ、０．００６ｍｐｋ、０．００７ｍｐｋ、０．００８ｍｐｋ、０．００９ｍｐｋ、０．０１ｍｐｋ、０．０２ｍｐｋ、０．０３ｍｐｋ、０．０４ｍｐｋ、０．０５ｍｐｋ、０．０６ｍｐｋ、０．０７ｍｐｋ、０．０８ｍｐｋ、０．０９ｍｐｋ、０．１ｍｐｋ、０．２ｍｐｋ、０．３ｍｐｋ、０．４ｍｐｋ、０．５ｍｐｋ、０．６ｍｐｋ、０．７ｍｐｋ、０．８ｍｐｋ、０．９ｍｐｋ、１ｍｐｋ、２ｍｐｋ、３ｍｐｋ、４ｍｐｋ、５ｍｐｋ、６ｍｐｋ、７ｍｐｋ、８ｍｐｋ、９ｍｐｋ、又は１０ｍｐｋであり；
    好ましくは、薬剤は、自己免疫疾患、増殖性疾患、又はウイルス感染を治療するために用いられ；
    より好ましくは、前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、強直性脊椎炎、全身性エリテマトーデス、皮膚エリテマトーデス、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、乾癬、尋常性乾癬、円形脱毛症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、移植片対宿主疾患、臓器移植拒絶反応、自己免疫性肝炎、Ｉ型糖尿病、自己免疫性血管炎、湿疹、又は喘息を含み；
    より好ましくは、前記増殖性疾患は、新生物、固形腫瘍、血液系腫瘍、悪性腹水、又は悪性胸水を含み；前記固形腫瘍は、良性又は悪性のもの、原発性又は転移性のものから選択されてもよく、前記悪性固形腫瘍は、がん又は肉腫、例えば、上皮細胞癌、内皮細胞癌、扁平上皮細胞癌、奇形腫、肺腫瘍、パピローマウイルス誘発性がん、腺癌、癌腫、黒色腫、血管肉腫、神経芽細胞腫、転移性肺がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、乳がん、メルケル細胞がん、卵巣がん、腎細胞がん、転移性腎がん、頭頸部がん、膀胱がん、筋層非浸潤性膀胱がんから選択されてもよく；血液系腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞大顆粒リンパ球白血病などの白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫から選択されてもよく；
    より好ましくは、前記ウイルス感染は、ＨＩＶ感染、新型コロナウイルス感染、又はＨＰＶウイルス感染から選択される、使用。
  29. 自己免疫疾患、増殖性疾患、又はウイルス感染を治療する方法であって、前記方法は、請求項１から１６のいずれか一項に記載のＩＬ－２変異体、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項２１に記載の抱合体、請求項２２に記載の核酸断片、請求項２３に記載のベクター、請求項２４に記載の宿主細胞、請求項２６に記載の変異体もしくは融合タンパク質、又は請求項２７に記載の医薬組成物を、対象に有効量投与するステップを含み；
    好ましくは、前記投与するステップは、例えば静脈注射又は皮下注射などの注射を介して行われ；
    好ましくは、前記有効量は、０．００１ｍｐｋから１０ｍｐｋ、例えば、０．００１ｍｐｋ、０．００２ｍｐｋ、０．００３ｍｐｋ、０．００４ｍｐｋ、０．００５ｍｐｋ、０．００６ｍｐｋ、０．００７ｍｐｋ、０．００８ｍｐｋ、０．００９ｍｐｋ、０．０１ｍｐｋ、０．０２ｍｐｋ、０．０３ｍｐｋ、０．０４ｍｐｋ、０．０５ｍｐｋ、０．０６ｍｐｋ、０．０７ｍｐｋ、０．０８ｍｐｋ、０．０９ｍｐｋ、０．１ｍｐｋ、０．２ｍｐｋ、０．３ｍｐｋ、０．４ｍｐｋ、０．５ｍｐｋ、０．６ｍｐｋ、０．７ｍｐｋ、０．８ｍｐｋ、０．９ｍｐｋ、１ｍｐｋ、２ｍｐｋ、３ｍｐｋ、４ｍｐｋ、５ｍｐｋ、６ｍｐｋ、７ｍｐｋ、８ｍｐｋ、９ｍｐｋ、又は１０ｍｐｋであり；
    好ましくは、前記自己免疫疾患は、関節リウマチ、強直性脊椎炎、全身性エリテマトーデス、皮膚エリテマトーデス、ループス腎炎、ＩｇＡ腎症、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、乾癬、尋常性乾癬、円形脱毛症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、移植片対宿主疾患、臓器移植拒絶反応、自己免疫性肝炎、Ｉ型糖尿病、自己免疫性血管炎、湿疹、又は喘息を含み；
    好ましくは、前記増殖性疾患は、新生物、固形腫瘍、血液系腫瘍、悪性腹水、又は悪性胸水を含み；前記固形腫瘍は、良性又は悪性のもの、原発性又は転移性のものから任意に選択され、前記悪性固形腫瘍は、がん又は肉腫、例えば、上皮細胞癌、内皮細胞癌、扁平上皮細胞癌、奇形腫、肺腫瘍、パピローマウイルス誘発性がん、腺癌、癌腫、黒色腫、血管肉腫、神経芽細胞腫、転移性肺がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、乳がん、メルケル細胞がん、卵巣がん、腎細胞がん、転移性腎がん、頭頸部がん、膀胱がん、筋層非浸潤性膀胱がんから任意に選択され；前記血液系腫瘍は、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞大顆粒リンパ球白血病などの白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫から任意に選択される、方法。
  30. Ｔ細胞集団又は末梢血内の制御性Ｔ細胞を優先的に刺激する方法であって、前記方法は、前記Ｔ細胞集団又は末梢血を、請求項１から１６のいずれか一項に記載のＩＬ－２変異体、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項２１に記載の抱合体、請求項２２に記載の核酸断片、請求項２３に記載のベクター、請求項２４に記載の宿主細胞、請求項２６に記載の変異体もしくは融合タンパク質、又は請求項２７に記載の医薬組成物に接触させるステップを含み；好ましくは、前記優先的に刺激することは：
    （ａ）非制御性Ｔ細胞又はＮＫ細胞よりも制御性Ｔ細胞のＳＴＡＴ５リン酸化を優先的に刺激すること；
    （ｂ）非制御性Ｔ細胞又はＮＫ細胞よりも制御性Ｔ細胞の増殖を優先的に刺激すること；および／又は
    （ｃ）非制御性Ｔ細胞に対する制御性Ｔ細胞の比率を上昇させること、又はＮＫ細胞に対する制御性Ｔ細胞の比率を上昇させること、を含む、方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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