CN118165102A - 靶向hbv全长包膜蛋白的单域抗体及其用途 - Google Patents

靶向hbv全长包膜蛋白的单域抗体及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN118165102A
CN118165102A CN202410379305.1A CN202410379305A CN118165102A CN 118165102 A CN118165102 A CN 118165102A CN 202410379305 A CN202410379305 A CN 202410379305A CN 118165102 A CN118165102 A CN 118165102A
Authority
CN
China
Prior art keywords
envelope protein
length envelope
single domain
antibody targeting
hbv full
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202410379305.1A
Other languages
English (en)
Inventor
王文博
刘洪川
汤贝贝
冯爱华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Liling Biopharmaceutical Suzhou Co ltd
Original Assignee
Liling Biopharmaceutical Suzhou Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Liling Biopharmaceutical Suzhou Co ltd filed Critical Liling Biopharmaceutical Suzhou Co ltd
Publication of CN118165102A publication Critical patent/CN118165102A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/082—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5761—Hepatitis B
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)

Abstract

本发明公开了一种靶向HBV全长包膜蛋白的一系列单域抗体。本发明的单域抗体能够高亲和力地结合HBV全长包膜蛋白，并且具有较好的专一性，从而为靶向HBV全长包膜蛋白的抗肿瘤药物的开发奠定了新的物质基础。本发明的单域抗体还可以用于制备双特异性抗体、嵌合抗原受体、嵌合抗原受体‑T细胞、以及ADC和RDC等。

Description

靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体及其用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域。更具体地说，本发明涉及靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体及其用途。
背景技术
肝细胞癌(hepatellular carcinoma,HCC)是世界上最常见的高恶性程度的癌症之一，其特点是进展快、预后差、5年生存率不到5％。目前，肝癌患者的有效治疗方案仅限于肿瘤负荷较低的疾病早期阶段，针对HCC的临床治疗手段仍以手术切除、化疗和放疗为主，但患者获益程度不高，最终大多数患者死于疾病复发或转移。一些酪氨酸激酶抑制剂如索拉非尼、lenvatinib和cabozantinib已被批准用于HCC，但临床观察到晚期HCC患者的总体生存改善较差。免疫检查点阻断(ICB)疗法是一种新的肝癌治疗方法，其单独使用或联合激酶抑制剂的疗效在HCC患者中有不同的缓解率和生存获益(Kudo M et al.Lenvatinibversus sorafenib in first-line treatment of patients with unresectablehepatocellular carcinoma:a randomised phase 3non-inferiority trial.Lancet391,1163-1173(2018))。尽管现有的治疗方法取得了进展，但有效和持久的HCC全身治疗方案仍然有限。
中国是HCC高发地区，其中约75-80％的HCC患者是由乙型肝炎病毒(HBV)感染诱发的。这些HCC患者体内病毒特异性的T细胞往往被删除或功能障碍，导致其消除癌细胞的免疫攻击通常被延迟(Hao XS,et al.Twenty-year trends of primary liver cancerincidence rates in an urban Chinese population.Eur J Cancer Prev 12.273-279(2003))。这个问题可以通过TCR-T治疗来克服。90％以上的HBV-HCC具有HBV的DNA整合，并可能表达完整或截断形式的HBV抗原，在HBV感染的肝细胞或HCC细胞表面由MHC分子加工并递呈能被T细胞特异性识别的HBV表位。且HBV作为外来入侵者，与人内源基因组同源性不高，因此使用HBV特异性T细胞受体改造的T细胞(HBV-TCR T细胞)治疗HBV-HCC是值得预期的。目前已有多例晚期HBV-HCC患者在接受HBsAg特异性TCR重定向T细胞免疫治疗后，被报道是安全的，并具有潜在的治疗效果(Fanping Meng et al.,Immunotherapy of HBV-related advanced hepatocellular carcinoma with short-term HBV-specific TCRexpressed T cells:results of dose escalation,phase I trial.Hepatol Int 15(6),1402-1412(2021))。因此目前急需有效药物用于HBV感染以及HBV引起的肝癌的治疗。
单域抗体(sdAb)是一种特殊的分子量较小的抗体。单域抗体仅有两条相同的重链组成。与传统双链抗体150-160kDa的分子量相比，单域抗体分子量为110KD左右。单域抗体一般具有高特异性、高亲和力、低免疫原性、好的渗透性。单域抗体的抗原结合区仅由一条链组成，单域抗体的可变区(VHH)只有12-15kDa，因此在对单域抗体进行结构改造时非常简单，不会出现传统双联抗体轻重链错配的问题，也不会产生对抗原结合区单链改造而导致的亲和力降低情况。单域抗体可以识别细胞膜蛋白，也可以识别由主要组织相容性抗原呈递到细胞表面的来源于细胞内蛋白的多肽。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向HBV全长包膜蛋白的特异性单域抗体以及相应的靶向HBV全长包膜蛋白的特异性人源化单域抗体、双特异性抗体、嵌合抗原受体、嵌合抗原受体-T细胞和ADC等。
本发明的目的还在于提供所述单域抗体、人源化单域抗体、双特异性抗体、嵌合抗原受体、嵌合抗原受体-T细胞和ADC在治疗肿瘤或制备治疗肿瘤的药物中的用途。
在第一方面，本发明提供一种靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链，所述VHH链包括下表所示的CDR1、CDR2和CDR3：
在优选的实施方式中，所述HBV全长包膜蛋白的氨基酸序列如GLSPTVWLSV(SEQ IDNO:36)所示。
在优选的实施方式中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并能保留与HBV全长包膜蛋白高亲和力结合的衍生序列。
在优选的实施方式中，所述VHH链还包括框架区FR1、FR2、FR3和FR4。
在优选的实施方式中，所述靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或5所示。
在第二方面，本发明提供一种靶向HBV全长包膜蛋白的抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括下表所示的CDR1、CDR2和CDR3
在优选的实施方式中，所述靶向HBV全长包膜蛋白的抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或5所示。
在第三方面，本发明提供一种靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体，其具有第一方面所述的VHH链。
在第四方面，本发明提供一种人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链，以第一方面所述的VHH链为基础对框架区FR1、FR2、FR3和FR4进行人源化。
在优选的实施方式中，所述人源化的VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO:24-35中任一所示；优选地，如SEQ ID NO:24-30、32、33和35中任一所示。
在第五方面，本发明提供一种靶向HBV全长包膜蛋白的抗体，所述抗体包括一个或多个第一方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链或第四方面所述的人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链。
在优选的实施方式中，所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体包括单体、二价抗体、和/或多价抗体。
在第六方面，本发明提供一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体包括第一方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、或第二方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体的重链可变区、或第三方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体、第四方面所述的人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、或第五方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体。
在优选的实施方式中，所述第二抗体可以结合与第一抗体相同或不同的抗原，或结合与第一抗体相同抗原的不同表位。
在优选的实施方式中，所述第二抗体是单域抗体、单链抗体或双链抗体。
在优选的实施方式中，所述的双特异性抗体包括2-4个靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体；较佳地，包括2个靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体；更佳地，所述2个靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体形成靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体二聚体。
在第七方面，本发明提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包括第一方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、第二方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体的重链可变区、第三方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体、第四方面所述的人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、或第五方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体，任选的接头序列以及免疫球蛋白的Fc片段或半衰期延长结构域。
在优选的实施方式中，所述免疫球蛋白是是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4；优选IgG4。
在第八方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、第二方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体的重链可变区、第三方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体、第四方面所述的人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、第五方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体、第六方面所述的双特异性抗体或第七方面所述的融合蛋白。
在第九方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含第八方面所述的核酸分子。
在第十方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含第九方面所述的表达载体，或者其基因组上整合有第八方面所述的核酸分子。
在第十一方面，本发明提供一种制备第一方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、第二方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体的重链可变区、第三方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体、第四方面所述的人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、第五方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体、第六方面所述的双特异性抗体、或第七方面所述的融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
1)在适合的条件下，培养如第十方面所述的宿主细胞，从而获得含有所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、靶向HBV全长包膜蛋白的抗体的重链可变区、靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体、人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、靶向HBV全长包膜蛋白的抗体、双特异性抗体或融合蛋白的培养物；以及
2)任选地，从所述培养物中分离或回收所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、靶向HBV全长包膜蛋白的抗体的重链可变区、靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体、人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体、双特异性抗体或融合蛋白。
在第十二方面，本发明提供一种免疫偶联物，所述免疫偶联物含有：
1)如第一方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、第二方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体的重链可变区、第三方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体、第四方面所述的人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、第五方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体、第六方面所述的双特异性抗体或第七方面所述的融合蛋白；和
2)选自以下的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
在优选的实施方式中，所述偶联部分为药物或毒素。
在优选的实施方式中，所述免疫偶联物是抗体-药物偶联物(Antibody-Drug-Conjugate，ADC)或核素偶联药物(RDC)。
在优选的实施方式中，所述偶联部分为可检测标记物。
在优选的实施方式中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
在优选的实施方式中，所述免疫偶联物含有：多价(如二价)的如第一方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、第二方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体的重链可变区、第三方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体、第四方面所述的人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、第五方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体、第六方面所述的双特异性抗体或第七方面所述的融合蛋白。
在优选的实施方式中，所述多价是指，在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个重复的部分。
在第十三方面，本发明提供一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含第三方面所述的单域抗体或由第三方面所述的单域抗体制得。
在优选的实施方式中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:22或23所示。
在第十四方面，本发明提供一种免疫效应细胞，所述免疫效应细胞在其表面表达第十三方面所述的嵌合抗原受体。
在优选的实施方式中，所述免疫效应细胞包括但不限于T细胞或NK细胞；优选T细胞。
在第十五方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗或诊断有效量的第一方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、第二方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体的重链可变区、第三方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体、第四方面所述的人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、第五方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体、第六方面所述的双特异性抗体、第七方面所述的融合蛋白、第十二方面所述的免疫偶联物或第十四方面所述的免疫效应细胞，和任选的药学上可接受的赋形剂。
在优选的实施方式中，所述的药物组合物用于治疗HBV全长包膜蛋白相关疾病；优选地，所述HBV全长包膜蛋白相关疾病是肿瘤或乙肝病毒感染。
在优选的实施方式中，所述所述肿瘤是肝癌；优选肝细胞癌。
在第十六方面，本发明提供第一方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、第二方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体的重链可变区、第三方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体、第四方面所述的人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、第五方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体、第六方面所述的双特异性抗体、第七方面所述的融合蛋白、第十二方面所述的免疫偶联物、第十四方面所述的免疫效应细胞或第十五方面所述的药物组合物的用途，用于制备以下试剂：
1)检测HBV全长包膜蛋白的试剂；
2)阻断HBV全长包膜蛋白与PD-L1结合的试剂；
3)治疗HBV全长包膜蛋白相关疾病的药物。
在优选的实施方式中，所述HBV全长包膜蛋白相关疾病是肿瘤或乙肝病毒感染。
在优选的实施方式中，所述所述肿瘤是肝癌；优选肝细胞癌。
在第十七方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒中包括：
1)第一方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、第二方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体的重链可变区、第三方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体、第四方面所述的人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、第五方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体、第六方面所述的双特异性抗体、第七方面所述的融合蛋白、第十二方面所述的免疫偶联物、第十四方面所述的免疫效应细胞或第十五方面所述的药物组合物；
2)容器；和
3)任选的使用说明书。
在第十八方面，本发明提供一种检测样品中HBV全长包膜蛋白蛋白的方法，所述方法包括步骤：
1)将待测样品与第一方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、第二方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体的重链可变区、第三方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体、第四方面所述的人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、第五方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体、第六方面所述的双特异性抗体、第七方面所述的融合蛋白或第十二方面所述的免疫偶联物接触；
2)检测是否形成抗原-抗体复合物，如果形成复合物就表示样品中存在HBV全长包膜蛋白蛋白。
在第十九方面，本发明提供一种治疗疾病的方法，所述方法包括，给有此需要的对象施用治疗有效量的第一方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、第二方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体的重链可变区、第三方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体、第四方面所述的人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、第五方面所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体、第六方面所述的双特异性抗体、第七方面所述的融合蛋白、第十二方面所述的免疫偶联物、或第十四方面所述的免疫效应细胞或第十五方面所述的药物组合物。
在优选的实施方式中，所述的对象包括哺乳动物；优选人。
在优选的实施方式中，所述疾病是HBV全长包膜蛋白相关疾病；优选地，所述HBV全长包膜蛋白相关疾病是肿瘤或乙肝病毒感染。
在优选的实施方式中，所述所述肿瘤是肝癌；优选肝细胞癌。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示本发明的候选单域抗体可以高亲和力地结合抗原蛋白；
图2显示本发明的候选单域抗体可以在细胞水平高亲和力结合靶点蛋白；
图3显示本发明的候选单域抗体可以专一性在细胞水平结合HBV多肽-HLA-A02复合物抗原；
图4显示了本发明的CAR分子在T细胞上的表达情况；
图5显示了本发明的CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效应；
图6显示了本发明的CAR-T细胞能有效识别负载靶点多肽的T2，激活并传导免疫信号，分泌IFN-γ和IL-2细胞因子，其中HBV-CAR-T-02分子生物活性相对更好；
图7显示了本发明的人源化单域抗体能够以较高亲和力结合蛋白抗原。
具体实施方式
MHCⅠ类分子HLA-A02可以特异性地呈递HBV全长包膜蛋白的GLSPTVWLSV肽段，因此HBV抗原可以被呈递到细胞表面而被抗体识别。本发明利用结合HBV包膜蛋白的多肽的HLA-A02复合物作为抗原来筛选特异性的单域抗体分子。这些候选分子可以用来开发双特异性抗体、CAR-T或者ADC(Antibody drug conjugate)等生物药。本发明利用的多肽序列为HBV包膜蛋白所共有。
具体地说，本发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现一类靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体。本发明的单域抗体能够高亲和力地结合HBV全长包膜蛋白，并且具有较好的专一性。本发明还提供了利用所述单域抗体制备的双特异性抗体、嵌合抗原受体、嵌合抗原受体-T细胞、以及ADC等。在此基础上完成了本发明。
术语定义
本文所用的术语具有与本领域技术人员常规理解的相同或相似的含义。为清晰起见，对其中的一些术语定义如下。
单域抗体
在本文中，“单域抗体”、“单结构域抗体”、“纳米抗体”等具有相同或相似的含义，均是指缺失抗体轻链、而只有重链可变区的一类抗体分子。单域抗体是最小抗原结合单元，即具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，从而构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH)。
本发明的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体VHH链中，还包括框架区FR1、FR2、FR3和FR4。
在本发明的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体VHH链的基础上，本发明人还对该VHH链进行了人源化，从而得到了人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链。
在本发明的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体VHH链或人源化的VHH链的基础上，本发明还提供了靶向HBV全长包膜蛋白的抗体，其包括一个或多个所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链或人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链。本发明还提供了一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体可以是本发明的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、或人源化的VHH链。本领域技术人员可以按照实际需要选择所述双特异性抗体中的第二抗体。例如，所述第二抗体可以结合与第一抗体相同或不同的抗原；如果第二抗体结合与第一抗体相同的抗原，则优选结合在不同的表位上。在具体的实施方式中，所述第二抗体可以是单域抗体，也可以是单链抗体或双链抗体。
本领域技术人员还可以将本发明的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体VHH链或人源化的VHH链制成融合蛋白，例如制备成进一步包含免疫球蛋白的Fc片段或半衰期延长结构域的融合蛋白。如此得到的融合蛋白不仅具备单域抗体VHH链本身的生物学活性，还能够具备免疫球蛋白的Fc片段所赋予的其它特性，例如血浆半衰期延长、免疫原性降低、稳定性提高等等。在具体的实施方式中，所述融合蛋白包括本发明的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链或人源化的VHH链，任选的接头序列以及免疫球蛋白的Fc片段或半衰期延长结构域。在具体的实施方式中，所述免疫球蛋白是是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4；优选IgG4。
本发明不仅包括完整的抗体，还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有HBV全长包膜蛋白蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明单域抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据下表进行氨基酸替换而产生。
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒素；3.细胞因子，如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；9.治疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
双特异性抗体
双特异性抗体是经过蛋白质工程改造而成的重组抗体。双特异性抗体可以同时靶向两个不同的抗体结合表位，这两个表位可以来自于不同抗原，也可以来自于同一个抗原。目前的许多研究都已表明双特异性抗体在治疗肿瘤、自身免疫性疾病和病毒感染等疾病中显示了巨大的治疗潜力。与单克隆抗体相比，双特异性抗体的主要优势在于可介导两个识别表位的空间效应和双靶向的协同效用，产生两种抗体联合使用达不到的生物学效果。一种比较特殊的双特异性抗体被称为T细胞衔接器(T cell engager)，它可以通过同时结合肿瘤细胞表面的靶点和T细胞，激活内源性T细胞，导致肿瘤细胞的裂解，从而达到治疗肿瘤的目的。T细胞衔接器已经被证明可以用来治疗肿瘤。靶向CD20和CD19的双特异性T细胞衔接器已经获得FDA批准上市销售(Nat Rev Clin Oncol.2020Jul；17(7):418-434.)。双特异性抗体因为其不同于单克隆抗体的复杂性，技术门槛和研发成本都较高。
免疫细胞
在本文中，免疫细胞和免疫效应细胞具有相同的含义，并且与本领域技术人员常规理解的相同。其是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞和吞噬细胞。在具体的实施方式中，所述免疫细胞是指能识别抗原、从而产生特异性免疫应答的淋巴细胞。所述淋巴细胞主要是T淋巴细胞、B淋巴细胞、K淋巴细胞和NK淋巴细胞。除淋巴细胞外，参与免疫应答的细胞还有浆细胞、粒细胞、肥大细胞、抗原呈递细胞及单核吞噬细胞系统的细胞(例如巨噬细胞)。
嵌合抗原受体T细胞
嵌合抗原受体T细胞疗法是一种很有潜力的细胞免疫疗法。CAR-T细胞表达CAR(Chimeric Antigen Receptor)分子，CAR的结构分为：抗原结合区、铰链区和跨膜结构域以及胞内信号传导结构域。目前的CAR-T细胞通常使用来源于单克隆抗体抗原结合区域单链改造的scFv(Single Chain Fragment Variables)段作为抗原结合区。但是在进行scFv结构改造时，容易出现亲和力降低和专一性改变的问题，同时scFv分子量比较大而且容易形成多聚体，影响CAR的功能(Nat Rev Cancer.2021Mar；21(3):145-161.)。因此，含有新颖结构的抗原结合区的CAR。使用单域抗体构建CAR结构，可以直接将单域抗体可变区连接到CAR结构，设计简单方便。
免疫偶联物
ADC是携带细胞毒素药物的抗体，可以定点将细胞毒药递送到肿瘤细胞实现肿瘤细胞的特异性杀伤。靶向HER2、CD30和Trop2等靶点的ADC药物在临床研究中展示出很好的临床疗效和安全性(Nat Rev Clin Oncol.2021Jun；18(6):327-344.)。近年来有多款ADC药物，获得FDA批准上市销售。但是目前ADC药物的靶点都是细胞膜蛋白，靶向细胞内蛋白的ADC药物是未来发展的热门方向之一。
ADC药物可以特异性的靶向靶细胞并将有细胞毒性作用的分子递送到靶细胞内，从而产生特异性的杀伤效应。细胞毒性分子诱导的细胞杀伤可以打破和改善肿瘤抑制性微环境，有潜力提高免疫治疗等其他疗法的药效。本发明单域抗体可以内吞到细胞内，因此未来有希望开发基于本发明中单域抗体的ADC药物。
本发明还提供一种免疫偶联物，其含有本发明的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、人源化的VHH链等以及偶联部分。在具体的实施方式中，所述偶联部分可以是可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素或酶等，从而实现诊断、检测或治疗等等目的。
在优选的实施方式中，所述免疫偶联物是抗体-药物偶联物(Antibody-Drug-Conjugate，ADC)或核素偶联药物(RDC)。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接靶向肿瘤细胞表达的HBV全长包膜蛋白。因此，本发明的药物组合物可用于治疗肿瘤。在具体的实施方式中，所述肿瘤是HBV全长包膜蛋白相关肿瘤。在优选的实施方式中，所述肿瘤是黑色素瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌或乳腺癌等。此外，本发明的药物组合物还可与其他治疗剂联用。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％、较佳地0.01-90wt％、更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单域抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。
活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
试剂盒
本发明还提供了一种含有本发明的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、或人源化的VHH链、抗体、融合蛋白或免疫偶联物等的试剂盒。在具体的实施方式中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
本发明的优点：
1.本发明的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体高亲和力地结合HBV全长包膜蛋白；
2.本发明的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体具有较好的专一性；
3.利用本发明的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体可以进一步制备双特异性抗体、嵌合抗原受体、嵌合抗原受体-T细胞、以及ADC等，从而为靶向HBV全长包膜蛋白的治疗或诊断药物的开发奠定了新的物质基础。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例一：单域抗体序列获取
本发明选择两只成年健康羊驼(Alpaca)作为实验动物进行免疫。使用携带目的多肽的pMHC(peptide-Major histocompatibility complex)的重组蛋白作为抗原进行免疫的羊驼。本发明共进行4-5次免疫。免疫过程中，取不同时间点的羊驼外周血，使用ELISA法检测免疫后效价。免疫周期结束后取羊驼外周血，获取PBMCs细胞，提取mRNA并进行反转录，获取PBMCs细胞的cDNA。使用特异性引物扩增cDNA，得到带有单域抗体基因片段的PCR产物。然后使用电转仪将PCR产物和酵母文库载体导入到酵母感受态细胞，制备酵母展示文库。
然后使用携带目的多肽的pMHC重组蛋白或者负载靶点多肽的T2细胞对酵母库进行筛选。本发明使用携带目的多肽的pMHC重组蛋白为阳性抗原，使用携带阴性多肽的pMHC重组蛋白为阴性抗原。经过三轮正筛和三轮负筛获取特异性结合阳性抗原而不结合阴性抗原的单域抗体克隆。
将单域抗体克隆进行sanger测序，从而获取单域抗体全长基因序列。本发明共获得两种不同的单域抗体克隆，分别命名为：LL-HP001和LL-HP002。本发明单域抗体全长氨基酸序列以及CDR区氨基酸序列见表1，核酸序列表见表2。
表1.候选单域抗体氨基酸序列
表2.候选单域抗体核酸序列表
实施例二：单域抗体表达纯化
使用常规单克隆抗体的表达和纯化方法，将本发明中的两种候选单域抗体进行表达纯化。首先使用分子克隆技术构建单域抗体表达载体。载体构建成功后，使用瞬时转染HEK293悬浮细胞系的方法表达上述单域抗体。基本步骤：将单域抗体基因克隆至表达载体pCDNA4(Invitrogen，Cat V86220)中。使用瞬时转染HEK293悬浮细胞的方法对不同单域抗体进行表达。表达完成后，收取上清液，使用常规单克隆抗体纯化方法对本发明单域抗体进行纯化。
在纯化完成后，使用紫外分光光度法检测不同抗体的蛋白浓度和总蛋白量，然后根据表达体积来计算每个单域抗体的表达量。使用NanoDrop 1000在波长280nm处读取样品溶液吸光值A280，通过公式C(mg/mL)＝A280/ε(ε为1.482mL/mg·cm-1)计算样品的蛋白浓度。同时使用常规凝胶电泳SDS-PAGE方法评价不同抗体的纯度。基本步骤如下：采用Invitrogen公司电泳槽及SDS-PAGE梯度胶对样品进行电泳分离。将样品稀释至约1mg/mL，加入适量还原剂、loading buffer和纯水，混合均匀后，于70℃加热约10分钟，上样量为2～10μg，电泳电压约200V，电泳时间约35分钟，之后分别进行凝胶染色和脱色。脱色完成后利用常规凝胶成像系统拍照并分析计算主带的纯度。然后使用分子排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC法)评价不同抗体的纯度。基本步骤如下：将样品稀释至约1.0mg/mL，采用TSKgelG3000SWXL色谱柱，设置柱温为25℃，用100mM磷酸缓冲液、100mM硫酸钠、pH 7.0±0.2作为流动相，进样体积为20～50μL，在1.0mL/min的流速下，等度洗脱20min，280nm波长下进行检测，采用峰面积归一化法得到单体的含量。
本发明两种不同单域抗体的表达量和纯度信息见表3。本发明单域抗体表达量分别为890和826mg/L。说明本发明的单域抗体具有较高的表达量。本发明大多数单域抗体的还原SDS-PAGE和SEC-HPLC的纯度均在95％以上。以上结果说明本发明两种单域结构具有较好的表达量和较高的纯度。
表3.单域抗体的表达量和纯度检测结果
实施例三：单域抗体对靶点的结合能力检测
本实施例分别使用ELISA和流式细胞术从蛋白和细胞两个水平检测候选单域抗体与靶抗原的结合能力。具体操作步骤如下：
3.1蛋白水平结合能力检测
1)用PBS稀释链霉亲和素SA蛋白至0.3μg/mL，按100μL/孔加入到96孔透明酶标板中，封板膜封板后置于37℃孵育1h；
2)弃掉蛋白，用200μL PBST溶液(含0.05％ Tween20的PBS)洗板三次；
3)按100μL/孔加入封闭液(含2％BSA的PBS溶液)，封板膜封板后置于37℃孵育1h；
4)重复洗板步骤2)；
5)将生物素标记的负载HBV envelope多肽的pMHC蛋白复合物，然后用封闭液稀释至2ug/ml，每孔加入100μL稀释液，封板膜封板后置于37℃孵育1h；
6)重复洗板步骤2)；
7)用封闭液将候选单域抗体稀释至12个不同的浓度，最高浓度为0.3μg/mL，3倍梯度稀释，每孔加入100μL稀释液，封板膜封板后置于37℃孵育1h；
8)重复洗板步骤2)；
9)用封闭液按1:1000的比例稀释SA-HRP，每孔加入100μL，封板膜封板后置于37℃孵育30min；
10)重复洗板步骤2)；
11)每孔加入100μL TMB反应液，封板膜封板后置于微孔板振荡器反应10min后，加入100μL 2N H2SO4溶液中止反应，酶标仪读取450nm处吸光度值。
结果如图1所示。LL-PR001和LL-PR002单域抗体结合抗原蛋白的EC50值分别为：0.00252和0.00226μg/mL。结果显示本发明筛选到的两个单域抗体均能够结合蛋白抗原，并且具有较高的亲和力。
3.2细胞水平结合能力检测
1)取适量的T2细胞(上海生化细胞所细胞库)，调整细胞密度为2×106/ml，分装到96孔U底板中，每孔50μL(约1E5cells)；
2)多肽负载：用1640培养基配制浓度为60μM的多肽，按50μL/孔将多肽稀释液添加到孔板中与细胞混合均匀，37℃孵育2h，使多肽负载到T2细胞上。加入200μL 1640培养基重悬细胞，400g离心5min，去除上清；
3)抗体孵育：用抗体稀释液(PBS+0.5％FBS)将原始抗体起始浓度调整到1μg/mL，4倍稀释，共设置10个浓度梯度，取100μL稀释好的抗体加入到前面负载好的细胞中，吹打混匀后，4℃避光孵育60min；
4)抗体洗涤：孵育好的抗体细胞混合液中加入200μL抗体稀释液，400g离心5min后，弃上清，用200μL抗体稀释液重悬细胞，重复清洗一次；
5)二抗孵育：用抗体稀释液将荧光二抗APC anti-human IgG Fc(BDBiosciences)按1:200进行稀释，取100μL加入到弃上清后的细胞沉淀中，吹打混匀后，4℃避光孵育30min；
6)二抗洗涤：孵育好的抗体细胞混合液中加入200μL抗体稀释液，400g离心5min后，弃上清，用200μL抗体稀释液重悬细胞，重复清洗一次；
7)上机检测：每管加入100μL抗体稀释液重悬细胞，将细胞悬液转移到流式管中，流式细胞仪检测阳性标记率。
8)用FlowJo软件分析数据获得平均荧光强度值(MFI)，根据MFI值和抗体浓度值拟合剂量-效应非线性曲线，计算EC50值，评价候选抗体分子的抗原亲和活性。
结果如图2所示。LL-PR001和LL-PR002单域抗体在细胞水平结合抗原蛋白的EC50值分别为：0.0128和0.0161μg/mL。结果显示本发明筛选到的两个单域抗体均能够在细胞水平结合抗原，并且具有较高的亲和力。
实施例四：使用T2细胞模型检测单域抗体对靶点识别的专一性
1)取生长至对数期的T2细胞，用完全培养基重悬至2×106/mL；
2)使用培养基稀释靶点多肽和LL-OTP多肽至60μM，将多肽稀释液分别与细胞悬液按1:1的体积比混合均匀，置于37℃培养箱孵育1-2小时，使多肽装载到T2细胞表面；
3)孵育完成后，用培养基清洗掉多余的多肽，离心收集细胞，用缓冲液(含2％FBS的PBS溶液)重悬细胞至2×106/mL，按照50μL/孔将负载多肽的T2细胞接种到96孔U底细胞培养板中；
4)用缓冲液将候选抗体分子分别稀释为10μg/mL、2μg/mL、0.4μg/mL、0.08μg/mL，按照50μL/孔将抗体稀释液加入孔板中，与细胞充分混匀后，置于4℃孵育1h；
5)300g离心5min，去除抗体稀释液，用200μL缓冲液清洗细胞一次；
6)用缓冲液按照1:200的比例稀释荧光二抗APC anti-human IgG Fc(购自Biolegend，货号366906)，按照100μL/孔将抗体稀释液加入孔板中，重悬细胞并混匀，置于4℃孵育30min；
7)300g离心5min，去除抗体稀释液，用200μL缓冲液清洗细胞一次；
8)用100μL缓冲液重悬细胞，流式细胞仪检测APC通道的荧光结合强度；
9)用FlowJo软件分析数据获得平均荧光强度值(MFI)，评价候选抗体分子与脱靶多肽的非特异性结合水平。
表3.本发明使用的潜在脱靶多肽序列表
序号 多肽名称 多肽序列
1 HBVen GLSPTVWLSV(SEQ ID NO:17)
2 LL-OTP1 AQPTVWLTI(SEQ ID NO:18)
3 LL-OTP2 SLSPTVWFL(SEQ ID NO:19)
4 LL-OTP3 LVSGLSPTV(SEQ ID NO:20)
5 LL-OTP4 GLSPTVAVL(SEQ ID NO:21)
本发明检测了两种单域抗体的脱靶情况。图3统计了数据统计后的MFI值，展示了两种单域抗体脱靶分析结果。结果如图3所示，本发明筛选到的单域抗体分子具有较好的专一性，可以进行进一步开发。
以上结果说明，本发明筛选到的单域抗体可以高亲和力并且专一性的识别由HLA-A02呈递的HBV envelope多肽，未来有潜力开发成双特异性抗体(T细胞衔接器等)以及ADC和RDC等药物，用于HBV感染或者HBV相关癌症，价值较大。
实施例五：靶向HBV全长包膜蛋白的CAR序列分子设计和慢病毒载体构建
5.1设计靶向HBV全长包膜蛋白的CAR基因序列
靶向HBV全长包膜蛋白的CAR包含抗人HBV全长包膜蛋白的单域抗体序列、CD8铰链区和跨膜结构域、4-1BB共刺激信号传导区和CD3zeta信号传导结构域，按照依次串联的方式连接起来。本发明选取了两种单域抗体序列，共设计了两种CAR结构。将2个不同的CAR分子分别命名为：HBV-CAR-01、HBV-CAR-02，不同CAR对应的氨基酸序列见表4。本发明设计的两种靶向HBV全长包膜蛋白的CAR基因序列进行基因合成并亚克隆至pUC57载体(苏州金唯智生物科技有限公司)。
表4.靶向HBV全长包膜蛋白的CAR氨基酸序列表
5.2构建CAR慢病毒载体
设计引物利用PCR将2个不同的CAR分子分别从pUC57载体扩增下来，引物设计的时候需要在正向和反向引物的5’端带上慢病毒载体的同源臂，扩增得到的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后分别进行胶回收纯化(南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号DC301)得到DNA片段。将酶切回收的DNA片段通过同源重组的方式克隆至慢病毒载体上，慢病毒载体需用限制性内切酶BamHI(NEB：R3136V)和SalI(NEB：R3138V)酶切回收纯化。通过这样的方法得到2个不同的重组质粒：p-lenti-HBV-CAR-01、p-lenti-HBV-CAR-02。将2个慢病毒载体送苏州金唯智生物科技有限公司测序验证，测序引物为：Lenti-seqF：TTGAGTTTGGATCTTGGTTC(SEQ ID NO:37)，Lenti-seqR:CAGCAACCAGGATTTATACA(SEQ ID NO:38)，经sanger测序验证2个慢病毒载体质粒均构建正确。
实施例六：靶向HBV全长包膜蛋白的CAR-T细胞制备和功能评价
6.1制备慢病毒
测序验证正确的慢病毒质粒分别转化大肠杆菌stbl3(购自翌圣生物科技股份有限公司)。第二天从转化好的平板上挑取单克隆到2ml液体LB培养基的摇菌管中，培养基中已含有卡那霉素(50ug/ml)，37℃220rpm，摇床振荡培养8h。从活化好的菌液中吸取1ml接种到250ml含有卡那霉素的液体LB培养基中，37℃220rpm，摇床振荡培养12-16h。使用大提试剂盒NucleoBond Xtra Midi Plus(MN，货号：740412.50)按照试剂盒提供的实验流程进行质粒提取。提取质粒后使用Nanodrop(Thermo Fisher Scientific)测定质粒浓度并经sanger测序验证，同时通过DNA琼脂糖凝胶检测超螺旋质粒含量。
冻存的293T细胞(购自中国科学院细胞库)从液氮中取出后，在37℃水浴锅内融化后用75％酒精擦拭管口，移到已加入10ml预热的DMEM完全培养基(90％ DMEM+10％FBS+1％青霉素/链霉素)的15ml离心管中，轻轻吹匀，400g离心4min后吸弃上清。再加入10ml DMEM完全培养基，轻轻吹匀后接种到T25或者T75培养瓶中，在37℃含5％ CO2的细胞培养箱中培养。第二天当细胞密度达到80％以上时对其细胞进行传代后继续培养，培养到3代以上的293T细胞可以用来包装慢病毒。具体步骤为：
1)第一天，接种293T细胞：按照约1.0×107个/T175瓶(40mL培养基培养)接种细胞，培养至第二天细胞密度达到90％时可转染。
2)第二天，质粒转染：转染前将培养基换成有10％ FBS但无双抗的DMEM培养基。先准备质粒复合物：将以下质粒加入到1.5ml Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific；31985-070)内并混匀：18μg的psPAX2质粒(Addgene；货号：12260)，9μg的pMD2.G质粒(Addgene；货号：12259)，18μg的慢病毒载体质粒。慢病毒质粒分别为：p-lenti-HBV-CAR-01、p-lenti-HBV-CAR-02。接着准备转染试剂复合物：按照质粒与PEI质量比1:3，将67.5μL(2mg/mL)的PEI(polysciences：24765)加入到1.5mL Opti-MEM内混匀，室温静置5min；再将转染试剂复合物逐滴加入到质粒复合物中，混匀后静置20min。最后将转染复合物缓慢滴入到293T细胞培养瓶中，轻轻混匀，37℃含5％ CO2的细胞培养箱中继续培养。
3)第四天，收病毒：转染48h收取培养基上清，2000rpm离心10min去除细胞碎片。使用0.45μM滤膜(Millex-HV，货号SLHVR33RB)过滤上清，滤液转移到专用离心管中配平。使用超速离心机25000rpm超速离心2h。倒掉上清后，使用1ml的X-VIVO-15培养基重悬慢病毒，并将慢病毒分装后保存在-80℃超低温冰箱中。按照该流程分别制备含有HBV-CAR-01、HBV-CAR-02的慢病毒。
6.2制备CAR-T细胞和检测CAR分子表达情况
制备好的含有HBV-CAR-01、HBV-CAR-02的慢病毒分别感染原代人T细胞，制备携带不同CAR基因的CAR-T细胞。将携带2种CAR基因的CAR-T细胞分别命名为：HBV-CAR-T-01、HBV-CAR-T-02，将未转染的T细胞作为阴性对照并命名为NTD。具体步骤如下：
1)复苏健康人外周血来源的CD3+T细胞(妙顺(上海)生物科技有限公司)，用含300IU/mL IL-2的T细胞培养基重悬细胞，使其密度为1×106/mL，按照细胞与磁珠1:1的比例添加T细胞激活剂CD3/CD28磁珠(ACRO Biosystems，货号：MBS-C001)，充分混匀后，将细胞接种在6孔板中进行培养；
2)T细胞激活24小时后，对T细胞进行计数并接种到新的24孔板中，按照每孔500ul，5×105cells/孔接种细胞，接种结束后分别加入100μL携带不同CAR基因的慢病毒液感染T细胞，不加病毒液的T细胞作为阴性对照NTD，将细胞置于培养箱继续培养。
3)加入慢病毒感染48小时后，从培养孔吸出细胞，利用磁力架靠磁性吸附的方式去除磁珠，离心收集细胞重悬到新鲜的T细胞培养基中。
4)同时各取100μL加入了慢病毒的细胞悬液和阴性对照，离心收集细胞，用100μLFACS buffer重悬细胞，每管细胞分别加入APC标记的pMHC蛋白复合物四聚体，混合均匀，4℃避光孵育30分钟；
5)PBS清洗细胞2次，再用100μL FACS buffer重悬细胞，流式检测2种CAR在T细胞上的表达效率。
结果表明，本发明所述2个CAR分子均能成功在T细胞上表达，表达效率相对一致，为30-65％(图4)。
6.3检测CAR-T细胞杀伤能力
本实验采用2种HBV靶点表达的阳性细胞系作为靶细胞，分别为肝癌HepG2.2.15和PLC/PRF5。分别采用HepG2细胞作为阴性细胞，将上述实施例六制备的2种CAR-T细胞分别与靶细胞进行共培养检测杀伤效应，评估不同的CAR-T的生物学功能。具体步骤如下：
1)使用表达GFP荧光素酶(GenBank:AAR29591.1)的慢病毒液转染不同靶细胞，得到标记有荧光素酶的细胞系，标记为：HepG2.2.15-GFP-luc、PLC/PRF5和HepG2-GFP-luc；
2)将HepG2.2.15-GFP-luc、PLC/PRF5和HepG2-GFP-luc细胞，按照细胞浓度1×105/mL，50μL/孔接种至96孔平底不透明细胞培养板中，暂时放置于37℃孵育；
3)用NTD调整2种CAR-T细胞的阳性比率至30％，设置15:1、5:1和1:1共3个效靶比，分别按照50μL/孔将2种不同的CAR-T和对照T细胞NTD接种至靶细胞中共培养，充分混匀后，放置于37℃培养箱孵育过夜；
4)取出共培养后的不透明96孔平底板，向孔中加入100μL的等体积D-luciferin底物(Thermo Fisher Scientific：88293)混匀避光反应10分钟，在酶标仪用化学发光模式检测荧光强度。由于荧光素酶仅在靶细胞中表达，孔中的剩余荧光素酶活性与活靶细胞的数量直接相关，将培养基加入靶细胞来获得最大荧光素酶活性作为对照，通过扣除活细胞荧光信号值来计算靶细胞凋亡比率，即为CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效应，结果如图5所示。
结果表明，本发明所述2个CAR分子均能介导T细胞杀伤2种靶点阳性的细胞，对阴性细胞没有杀伤效果，其中PLC/PRF5细胞杀伤效果最强。
6.4检测CAR-T细胞因子分泌
为了进一步评价靶细胞特异性激活本发明所述CAR-T细胞并释放细胞因子的水平，用实施例六中制备的2种CAR-T细胞和靶细胞按照1:1的效靶比共培养24小时后，检测培养上清中T细胞分泌IFN-γ和IL-2细胞因子的水平。具体步骤如下：
1)取靶细胞HepG2.2.15、PLC/PRF5和HepG2，用完全培养基重悬至1×106/mL，将细胞悬液按照100μL/孔接种至96孔U底深孔板中；
2)将2种CAR-T和对照T细胞NTD计数后按照1:1效靶比，即细胞浓度1×106/mL，100μL/孔中加入到不同靶细胞中共培养。
3)上述细胞共培养过夜后，收集50μL培养上清，转移至新的U底96孔板，使用ELISA试剂盒(Thermo Fisher Scientific；货号88-7316)检测T细胞中IFN-γ和IL-2细胞因子的分泌情况，平板制备和上清细胞因子的检测按照试剂盒提供的说明书进行；
4)使用Graphpad Prism软件进行数据分析，拟合剂量依赖曲线，计算EC50值。
结果如图6所示。结果表明，候选CAR-T细胞均能有效识别靶细胞，激活并传导免疫信号，分泌IFN-γ和IL-2细胞因子，其中HBV-CAR-T-02分子生物活性相对更好。综合以上结果来看，本发明所述的CAR序列具有较好的亲和活性和生物学功能，提示本发明的CAR分子具有进一步开发应用的价值。
实施例七：单域抗体人源化
本发明将单域抗体候选分子LL-PR002分别进行人源化。基本步骤：
1)将单域抗体候选分子LL-PR002的序列输入IMGT数据库进行抗体序列比对。根据数据库序列比对结果，选取IGHV3-23*04作为LL-PR002人源化母本载体。
2)将LL-PR002单域抗体的CDR区移植到IGHV3-23*04。
3)参考现有技术文献对移植后的人源化抗体进行回复突变以确保人源化抗体的亲和力。
通过上述方法，以LL-PR002为人源化母本设计得到12个候选人源化单域抗体，抗体序列见表5。
表5.以LL-PR002为人源化母本设计的人源化单域抗体序列
实施例八：人源化单域抗体分子表达
人源化后的单域抗体分子的氨基酸序列先经过密码子优化得到核苷酸序列，通过基因合成将人源化抗体分子全长基因构建到单域抗体表达载体。载体构建成功后，使用瞬时转染HEK293悬浮细胞系的方法表达上述单域抗体，具体步骤参考实施例二。
不同人源化单域抗体的表达量和纯度见表6。本发明的人源化单域抗体使用瞬时表达系统的表达后，分子的表达量在650-850mg/L的范围，证明本发明的人源化单域抗体具有较高的表达量。并且大多数人源化单域抗体的还原SDS-PAGE和SEC-HPLC的纯度均在95％以上。这些结果证明本发明的人源化单域抗体具有较好的表达量和较高的纯度。
表6.人源化单域抗体的表达量和纯度检测
实施例九：人源化单域抗体分子对靶点的结合能力检测
本实施例通过ELISA检测人源化单域抗体分子与靶抗原的结合能力，从而判断人源化分子的亲和力。具体实验操作步骤参考实施例三3.1。结果显示LL-PR002分子经过人源化改造后得到的候选人源化单域抗体均能够结合蛋白抗原，并且都具有较高的亲和力(结果如图7所示)，可以应用于后续双抗、CAR-T、ADC和RDC等生物药项目研究与开发。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (19)

1.一种靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链，所述VHH链包括下表所示的CDR1、CDR2和CDR3：
2.一种靶向HBV全长包膜蛋白的抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括下表所示的CDR1、CDR2和CDR3
3.一种靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体，其具有权利要求1所述的VHH链。
4.一种人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链，以权利要求1所述的VHH链为基础对框架区FR1、FR2、FR3和FR4进行人源化。
5.一种靶向HBV全长包膜蛋白的抗体，所述抗体包括一个或多个权利要求1所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链或权利要求4所述的人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链。
6.一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体包括权利要求1所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、或权利要求2所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体的重链可变区、或权利要求3所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体、权利要求4所述的人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、或权利要求5所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体。
7.一种融合蛋白，所述融合蛋白包括权利要求1所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、权利要求2所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体的重链可变区、权利要求3所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体、权利要求4所述的人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、或权利要求5所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体，任选的接头序列以及免疫球蛋白的Fc片段或半衰期延长结构域。
8.一种核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、权利要求2所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体的重链可变区、权利要求3所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体、权利要求4所述的人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、权利要求5所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体、权利要求6所述的双特异性抗体或权利要求7所述的融合蛋白。
9.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求8所述的核酸分子。
10.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求9所述的表达载体，或者其基因组上整合有权利要求8所述的核酸分子。
11.一种制备权利要求1所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、权利要求2所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体的重链可变区、权利要求3所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体、权利要求4所述的人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、权利要求5所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体、权利要求6所述的双特异性抗体、或权利要求7所述的融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
1)在适合的条件下，培养如权利要求10所述的宿主细胞，从而获得含有所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、靶向HBV全长包膜蛋白的抗体的重链可变区、靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体、人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、靶向HBV全长包膜蛋白的抗体、双特异性抗体或融合蛋白的培养物；以及
2)任选地，从所述培养物中分离或回收所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、靶向HBV全长包膜蛋白的抗体的重链可变区、靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体、人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体、双特异性抗体或融合蛋白。
12.一种免疫偶联物，所述免疫偶联物含有：
1)如权利要求1所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、权利要求2所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体的重链可变区、权利要求3所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体、权利要求4所述的人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、权利要求5所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体、权利要求6所述的双特异性抗体或权利要求7所述的融合蛋白；和
2)选自以下的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
13.一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含权利要求3所述的单域抗体或由权利要求3所述的单域抗体制得。
14.一种免疫效应细胞，所述免疫效应细胞在其表面表达权利要求13所述的嵌合抗原受体。
15.一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗或诊断有效量的权利要求1所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、权利要求2所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体的重链可变区、权利要求3所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体、权利要求4所述的人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、权利要求5所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体、权利要求6所述的双特异性抗体、权利要求7所述的融合蛋白、权利要求12所述的免疫偶联物或权利要求14所述的免疫效应细胞，和任选的药学上可接受的赋形剂。
16.权利要求1所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、权利要求2所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体的重链可变区、权利要求3所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体、权利要求4所述的人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、权利要求5所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体、权利要求6所述的双特异性抗体、权利要求7所述的融合蛋白、权利要求12所述的免疫偶联物、权利要求14所述的免疫效应细胞或权利要求15所述的药物组合物的用途，用于制备以下试剂：
1)检测HBV全长包膜蛋白的试剂；
2)阻断HBV全长包膜蛋白与PD-L1结合的试剂；
3)治疗HBV全长包膜蛋白相关疾病的药物。
17.一种试剂盒，所述试剂盒中包括：
1)权利要求1所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、权利要求2所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体的重链可变区、权利要求3所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体、权利要求4所述的人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、权利要求5所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体、权利要求6所述的双特异性抗体、权利要求7所述的融合蛋白、权利要求12所述的免疫偶联物、权利要求14所述的免疫效应细胞或权利要求15所述的药物组合物；
2)容器；和
3)任选的使用说明书。
18.一种检测样品中HBV全长包膜蛋白蛋白的方法，所述方法包括步骤：
1)将待测样品与权利要求1所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、权利要求2所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体的重链可变区、权利要求3所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体、权利要求4所述的人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、权利要求5所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体、权利要求6所述的双特异性抗体、权利要求7所述的融合蛋白或权利要求12所述的免疫偶联物接触；
2)检测是否形成抗原-抗体复合物，如果形成复合物就表示样品中存在HBV全长包膜蛋白蛋白。
19.一种治疗疾病的方法，所述方法包括，给有此需要的对象施用治疗有效量的权利要求1所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、权利要求2所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体的重链可变区、权利要求3所述的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体、权利要求4所述的人源化的靶向HBV全长包膜蛋白的单域抗体的VHH链、权利要求5所述的靶向HBV全长包膜蛋白的抗体、权利要求6所述的双特异性抗体、权利要求7所述的融合蛋白、权利要求12所述的免疫偶联物、权利要求14所述的免疫效应细胞或权利要求15所述的药物组合物。
CN202410379305.1A 2023-08-28 2024-03-29 靶向hbv全长包膜蛋白的单域抗体及其用途 Pending CN118165102A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2023110903615 2023-08-28
CN202311090361 2023-08-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN118165102A true CN118165102A (zh) 2024-06-11

Family

ID=91356671

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410379305.1A Pending CN118165102A (zh) 2023-08-28 2024-03-29 靶向hbv全长包膜蛋白的单域抗体及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN118165102A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111542340A (zh) * 2017-11-16 2020-08-14 华盛顿大学 使用HBV包膜蛋白的HBV PreS1和/或PreS2和/或S-HBsAg区域的治疗乙型肝炎病毒(HBV)的疫苗
CN114702573A (zh) * 2022-02-28 2022-07-05 中国科学院生物物理研究所 乙肝病毒表面s蛋白高亲和力纳米抗体及其应用
CN116410315A (zh) * 2021-12-31 2023-07-11 博生吉医药科技(苏州)有限公司 一种新型靶向人flt3的嵌合抗原受体修饰的t细胞的构建及应用
WO2023143445A1 (zh) * 2022-01-25 2023-08-03 厦门大学 用于治疗hbv感染及相关疾病的表位肽及抗体

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111542340A (zh) * 2017-11-16 2020-08-14 华盛顿大学 使用HBV包膜蛋白的HBV PreS1和/或PreS2和/或S-HBsAg区域的治疗乙型肝炎病毒(HBV)的疫苗
CN116410315A (zh) * 2021-12-31 2023-07-11 博生吉医药科技(苏州)有限公司 一种新型靶向人flt3的嵌合抗原受体修饰的t细胞的构建及应用
WO2023143445A1 (zh) * 2022-01-25 2023-08-03 厦门大学 用于治疗hbv感染及相关疾病的表位肽及抗体
CN114702573A (zh) * 2022-02-28 2022-07-05 中国科学院生物物理研究所 乙肝病毒表面s蛋白高亲和力纳米抗体及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109096396B (zh) 一种抗pd-l1人源化纳米抗体及其应用
US11466085B2 (en) Anti-PD-L1 nanobody, coding sequence and use thereof
EP3369745B1 (en) Anti-pd-l1 nanobody and use thereof
US11912770B2 (en) Blocking type PD-L1 single-domain camel antibody and application thereof
US11292841B2 (en) Anti-PD-1 nano-antibody and application thereof
CN110835371A (zh) 抗ccr8单克隆抗体及其应用
CA3150886A1 (en) Anti-pd-l1 single-domain antibody and derivatives and use thereof
CN116003598B (zh) 靶向人gprc5d的重组人源化单克隆抗体及其应用
CN110835374A (zh) 抗ccr8×ctla-4双特异性抗体及其应用
CN110885376B (zh) 抗cd47/cd20双特异性抗体及其用途
CN118221811A (zh) 靶向prame多肽的单域抗体及其用途
CN110885377B (zh) 抗cd47/vegf双特异性抗体及其应用
WO2023125975A1 (zh) 一种新型靶向人flt3的嵌合抗原受体修饰的t细胞的构建及应用
EP4365202A1 (en) Anti-trop2 single-domain antibody and use thereof
CN114380907B (zh) 靶向cmtm6的纳米抗体及其制备方法和应用
CN115304680A (zh) 基于Pep42构建的双特异性细胞接合器分子的制备及其应用
CN116410312A (zh) 一种新型upar单域抗体的开发
CN118165102A (zh) 靶向hbv全长包膜蛋白的单域抗体及其用途
WO2023116781A1 (zh) 一种新型pd1单域抗体的开发
EP4458855A1 (en) Development of novel pdl1 single-domain antibody
CN115558029B (zh) 靶向pd-1的双特异性抗体、及其制备和应用
US20240368302A1 (en) Anti-trop2 single-domain antibody and use thereof
US20240360248A1 (en) Anti-ptk7 single-domain antibody and application thereof
CN116333121A (zh) 一种新型靶向cd33单域抗体的开发
CN118754989A (zh) 一种抗her2纳米抗体及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination