CN116323653A - Il-2突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了IL‑2突变体及其应用，具体公开IL‑2突变体及相应的融合蛋白、缀合物、核酸片段、载体、宿主细胞、所述突变体或融合蛋白的制备方法、根据所述方法制备而成的IL‑2突变体或融合蛋白、药物组合物、制药用途、疾病治疗方法和优先刺激调节性T细胞的方法。本发明所述IL‑2突变体与野生型IL‑2相比，Tm值升高，改善了IL‑2蛋白的稳定性；或与野生型相比，本发明所述IL‑2突变体产量升高，或者其与IL‑2Rβγ复合物的结合活性改变。

Description

IL-2突变体及其应用 技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及IL-2突变体及其应用。
背景技术
白细胞介素2(interleukin-2，IL-2)，最初被鉴定为T细胞生长因子(TCGF)，后续研究发现L-2可结合其受体，并激活T细胞、NK细胞等免疫细胞的增殖和活化。
IL-2受体包括IL-2Rα亚基(CD25)、IL-2Rβ亚基(CD122)和IL-2Rγ亚基(CD132)，不同的亚基之间可形成亲和力不同的受体复合物，包括高亲和力受体IL-2Rαβγ，中间亲和力受体IL-2Rβγ，低亲和力受体IL-2Rα或IL-2Rαβ。不同细胞表达的IL-2R亚基类型有所不同，例如，静息条件下的传统T细胞CD4 +T、CD8 +T表面一般表达IL-2受体β(IL-2Rβ，CD122)、IL-2受体γ(IL-2Rγ，CD132)，几乎不表达IL-2受体α(IL-2Rα，CD25)，而调节性T细胞(Treg)除了表达IL-2Rβ、IL-2Rγ之外，组成性高表达IL-2Rα。
目前，研究人员尝试借助IL-2或其突变体激活免疫细胞或某个亚群的免疫细胞，从而治疗肿瘤或者自身免疫性疾病。例如，高剂量的IL-2被批准用于治疗恶性黑色素瘤或转移性肾细胞癌，IL-2聚乙二醇偶联药物NKTR-358被批准开展自身免疫性疾病的临床试验。
而提高IL-2的稳定性、产量和/或改变其与某类受体复合物的结合能力，对IL-2类型药物的开发具有重要意义。有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明公开提供IL-2突变体、融合蛋白、缀合物、核酸片段、载体、宿主细胞、制备突变体或融合蛋白的方法、根据所述方法制备而成的突变体或融合蛋白、药物组合物、制药用途、治疗方法和优先刺激调节性T细胞的方法。
在第一方面，本发明公开提供一种IL-2突变体，与野生型IL-2相比，所述IL-2突变体包括发生在Q13、L18、G27、Y31、A73、H79、P82、I89、N90、V91、V93、F117或R120的一个或多个突变。
在一些具体的实施方式中，所述突变为插入、缺失或替换，优选为替换。
在一些具体的实施方案中，所述IL-2突变体包括Q13L、L18I、G27W、Y31V、A73L、H79Q、P82L、I89L、N90Y、V91A、V93I、F117W或R120F的一个或多个突变。
在一些具体的实施方案中，所述IL-2突变体包括(a)～(h)组中至少一组突变：
(a)Y31/A73/H79突变；优选地，Y31V/A73L/H79Q突变；
(b)Q13突变；优选地，Q13L突变；
(c)R120突变，优选地，R120F突变；
(d)L18/V91/F117突变；优选地，L18I/V91A/F117W突变；
(e)L18/I89/V93突变；优选地，L18I/I89L/V93I突变；
(f)G27/R120突变；优选地，G27W/R120F突变；
(g)P82/R120突变；优选地，P82L/R120F突变；
(h)N90/R120突变；优选地，N90Y/R120F突变。
在一些具体的实施方案中，所述IL-2突变具有如SEQ ID NO：2～9任一项所示氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，所述IL-2突变体的Tm值高于野生型IL-2。
在一些具体的实施方案中，所述野生型IL-2具有如SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，所述IL-2突变体还包括选自下组的一个或多个突变：H16、D20、N88、V91或Q126突变，例如H16E突变，D20A、D20H或D20Y突变，N88A、N88I、N88G、N88R或N88D突变，V91R或V91K突变，Q126L或Q126F突变；
优选地，所述IL-2突变体还包括选自(ⅰ)～(ⅳ)中至少一组的突变：
(ⅰ)、H16突变，优选H16E突变；
(ⅱ)、D20突变，优选D20A突变；
(ⅲ)、V 91突变，优选V91R突变；
(ⅳ)、H16/V91突变，优选H16E/V91R突变。
在一些具体的实施方案中，所述IL-2突变体包括(a)～(n)组中至少一组突变：
(a)、H16/Y31/A73/H79突变；优选为H16E/Y31V/A73L/H79Q突变；
(b)、H16/R120突变；优选H16E/R120F突变；
(c)、H16/L18/V91/F117突变；优选H16E/L18I/V91A/F117W突变；
(d)、H16/L18/I89/V93突变；优选H16E/L18I/I89L/V93I突变；
(e)、H16/G27/R120突变；优选H16E/G27W/R120F突变；
(f)、H16/P82/R120突变；优选H16E/P82L/R120F突变；
(g)、D20/Y31/A73/H79突变；优选D20A/Y31V/A73L/H79Q突变；
(h)、D20/R120突变；优选D20A/R120F突变；
(i)、V91/Y31/A73/H79突变；优选V91R/Y31V/A73L/H79Q突变；
(j)、V91/Q13突变；优选V91R/Q13L突变；
(k)、V91/R120突变；优选V91R/R120F突变；
(l)、V91/L18/I89/V93突变；优选V91R/L18I/I89L/V93I突变；
(m)、H16/V91/Y31/A73/H79突变；优选H16E/V91R/Y31V/A73L/H79Q突变；
(n)、H16/V91/L18/I89/V93突变；优选H16E/V91R/L18I/I89L/V93I突变。
在一些具体的实施方式中，所述IL-2突变体具有如SEQ ID NO：22～27、29～30、32～35或37～38任一项所述的氨基酸序列。
在一些具体的实施方式中，所述IL-2突变体还包括选自下组的一个或多个突变：N26、N29、N30、N71、Q11、L132、L70、P82、G27或F28突变；
优选地，所述IL-2突变体还包括选自下组的一个或多个突变：N26Q、N29S、N30S、N71Q、Q11C、L132C、L70C、P82C、G27C、F78C突变；
更优选地，所述IL-2突变体还包括(a)～(g)组中至少一组突变:
(a)、N26Q突变；
(b)、N29S突变；
(c)、N30S突变；
(d)、N71Q突变；
(e)、Q11C/L132C突变；
(f)L70C/P82C突变；
(g)G27C/F78C突变。
在一些具体的实施方式中，所述IL-2突变体还包括选自下组中的一个或多个突变：F42、Y45或L72突变，优选F42A、Y45A或L72G突变。
在一些具体的实施方式中，与野生型IL-2相比，所述突变体与IL-2Rβγ亚基复合物的结合能力下降；优选地，结合力 IL-2Rβγ亚基复合物/结合力 IL-2αβγ亚基复合物下降。
在一些具体的实施方式中，与野生型IL-2相比，所述突变体刺激非调节性T细胞或NK(自然杀伤)细胞的能力下降，所述刺激可选自：胞内STAT5磷酸化或细胞增殖。
在一些具体的实施方式中，与非调节性T细胞或NK(自然杀伤)细胞相比，所述突变体优先刺激外周血或T细胞群体中的调节性T细胞(Treg)；所述优先刺激可选自：优先刺激调节性T细胞内STAT5磷酸化、优先刺激调节性T细胞增殖、提高调节性T细胞与非调节性T细胞的比率，或提高调节性T细胞与NK细胞的比率。
在第二方面，本发明公开一种IL-2突变体，与野生型IL-2相比，所述IL-2突变体包括 发生在H16、D20或V91中的一个或多个突变；优选地，所述IL-2突变体包括选自下组的突变：
(ⅰ)、H16突变，优选H16E突变；
(ⅱ)、D20突变，优选D20A突变；
(ⅲ)、V 91突变，优选V91R突变；
(ⅳ)、H16/V91突变，优选H16E/V91R突变。
在一些具体的实施方式中，所述IL-2突变体具有如SEQ ID NO：21、28、31或36所示的氨基酸序列。
在一些具体的实施方式中，所述IL-2突变体还包括选自下组的一个或多个突变：N26、N29、N30、N71、Q11、L132、L70、P82、G27或F28突变；
优选地，所述IL-2突变体还包括选自下组的一个或多个突变：N26Q、N29S、N30S、N71Q、Q11C、L132C、L70C、P82C、G27C或F78C突变；
更优选地，所述IL-2突变体还包括(a)～(g)组中的至少一组突变:
(a)、N26Q突变；
(b)、N29S突变；
(c)、N30S突变；
(d)、N71Q突变；
(e)、Q11C/L132C突变；
(f)L70C/P82C突变；
(g)G27C/F78C突变。
在一些具体的实施方式中，与野生型IL-2相比，所述突变体与IL-2Rβγ亚基复合物的结合能力下降；优选地，结合力 IL-2Rβγ亚基复合物/结合力 IL-2αβγ亚基复合物下降。
在一些具体的实施方式中，与野生型IL-2相比，所述突变体刺激非调节性T细胞或NK(自然杀伤)细胞的能力下降，所述刺激可选自：胞内STAT5磷酸化或细胞增殖。
在一些具体的实施方式中，与非调节性T细胞或NK细胞相比，所述突变体优先刺激外周血或T细胞群体中的调节性T细胞(Treg)；所述优先刺激可选自：优先刺激调节性T细胞内STAT5磷酸化、优先刺激调节性T细胞增殖、提高调节性T细胞与非调节性T细胞的比率，或提高调节性T细胞与NK细胞的比率。
在一些具体的实施方式中，所述突变包括缺失、插入或替换，优选为替换。
在一些具体的实施方式中，所述野生型IL-2具有如SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：1 所示的氨基酸序列。
在第三方面，本发明公开一种融合蛋白，所述融合蛋白包括第一多肽和第二多肽，其中，所述第一多肽为前述IL-2突变体，所述第二多肽为非IL-2多肽。
在一些具体的实施方式中，所述第二多肽为Fc、肿瘤抗原结合分子或IL-2受体亚基；
可选地，所述Fc为人IgG Fc，例如人IgG1Fc；
优选地，所述人IgG1Fc包括选自(a)～(i)组中的至少一组突变：
(a)、C220S；
(b)、N297G；
(c)C220S和N297G；
(d)、A327Q；
(e)、L234A和L235A；
(f)、A287C和L306C；
(g)、A259C和L306C；
(h)、R292C和V302C；
(i)、V323C和I332C；
更优选地，所述人Ig G1Fc具有如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；
可选地，所述肿瘤抗原包括：EDB-FN(extra domain of fibronectin)、Muc1、p53、FAP、GD2、EpCAM、tenascin-C、CD20、CEA、MAdCAM-1或WT1(Wilms tumor protein1)；可选地，所述肿瘤抗原结合分子为抗体，例如scFv，sdFv、Fab、Fab’、F(ab’) 2或Fv；
可选地，所述IL-2受体亚基为IL-2受体α亚基。
在一些具体的实施方式中，所述第一多肽的C端通过或不通过连接肽与所述第二多肽的N端连接；或所述第一多肽的N端通过或不通过连接肽与所述第二多肽的C端连接；
所述连接肽优选选自：(G 4S) n、(GGNGT) n或(YGNGT) n，所述n选自1、2、3、4或5；更优选地，所述第一多肽的C端与所述第二多肽的N端通过连接肽(G 4S) 3连接。
在一些具体的实施方式中，所述融合蛋白包括SEQ ID NO：13～20或SEQ ID NO：39～56任一项所述的氨基酸序列。
在第四方面，本发明公开一种缀合物，所述缀合物包括前述突变体或融合蛋白，还包括缀合至所述突变体或融合蛋白的稳定剂、药物或者示踪分子，其中所述稳定剂可选自聚乙二醇，例如单甲氧基聚乙二醇。
在第五方面，本发明公开一种分离的核酸片段，所述核酸片段编码前述突变体或融合蛋 白。
在第六方面，本发明公开一种载体，所述载体包括前述核酸片段。
在第七方面，本发明公开一种宿主细胞，所述宿主细胞包含前述载体。
在一些具体的实施方式中，所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞；所述原核细胞或真核细胞可选自大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞可选自CHO细胞系或HEK293细胞系。
在第八方面，本发明公开一种制备前述IL-2突变体或融合蛋白的方法，所述方法包括培养前述宿主细胞，以及分离所述宿主细胞表达的IL-2突变体或融合蛋白。
在第九方面，本发明公开根据前述方法制备而成的IL-2突变体或融合蛋白。
在第十方面，本发明公开一种药物组合物，所述药物组合物包括前述突变体、融合蛋白、缀合物、核酸片段、载体或宿主细胞；以及药学上可接受的运载体、稀释剂或助剂；
优选地，所述药物组合物为可注射药物组合物，例如静脉注射药物组合物或皮下注射药物组合物；更优选地，每剂所述药物组合物包含能够给与受试者有效量的融合蛋白；最优选地，所述有效量为0.001～10mpk，例如0.001mpk、0.002mpk、0.003mpk、0.004mpk、0.005mpk、0.006mpk、0.007mpk、0.008mpk、0.009mpk、0.01mpk、0.02mpk、0.03mpk、0.04mpk、0.05mpk、0.06mpk、0.07mpk、0.08mpk、0.09mpk、0.1mpk、0.2mpk、0.3mpk、0.4mpk、0.5mpk、0.6mpk、0.7mpk、0.8mpk、0.9mpk、1mpk、2mpk、3mpk、4mpk、5mpk、6mpk、7mpk、8mpk、9mpk或10mpk。
在第十一方面，本发明公开前述突变体、融合蛋白、缀合物、核酸片段、载体或宿主细胞在制备药物中的用途；
优选地，所述药物为注射药物，例如静脉注射药物或皮下注射药物；
优选地，每剂所述药物包含能够给与受试者有效量的融合蛋白；最优选地，所述有效量为0.001～10mpk，例如0.001mpk、0.002mpk、0.003mpk、0.004mpk、0.005mpk、0.006mpk、0.007mpk、0.008mpk、0.009mpk、0.01mpk、0.02mpk、0.03mpk、0.04mpk、0.05mpk、0.06mpk、0.07mpk、0.08mpk、0.09mpk、0.1mpk、0.2mpk、0.3mpk、0.4mpk、0.5mpk、0.6mpk、0.7mpk、0.8mpk、0.9mpk、1mpk、2mpk、3mpk、4mpk、5mpk、6mpk、7mpk、8mpk、9mpk或10mpk；
优选地，所述药物用于治疗自身免疫性疾病，或增生性疾病，或病毒感染。
更优选地，所述自身免疫性疾病包括类风湿关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、皮肤红斑狼疮、狼疮性肾炎、IgA肾病、干燥综合征、多肌炎、皮肌炎、硬皮病、银屑病、斑块状银屑病、斑秃、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、自身免疫肝炎、I型糖尿病、自身免疫性血管炎、湿 疹或哮喘；
更优选地，所述增生性疾病包括赘生物、实体瘤、血液瘤、恶性腹水或恶性胸水；其中，所述实体瘤可为良性或恶性，原发性或转移性，所述恶性实体瘤可为癌或肉瘤，例如，上皮细胞癌、内皮细胞癌、鳞状细胞癌、畸胎瘤、肺部肿瘤、乳头瘤病毒引起的癌、腺癌、癌肿、黑色素瘤、血管肉瘤、神经母细胞瘤、转移性肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、Merkel细胞癌、卵巢癌、肾细胞癌、转移性肾癌、头颈癌、膀胱癌、非肌层浸润性膀胱癌；所述血液瘤可选自白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤，例如B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病；
更优选地，所述病毒感染选自HIV感染、新型冠状病毒感染或HPV病毒感染。
在第十二方面，本发明公开一种治疗自身免疫性疾病，或增生性疾病，或病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的前述IL-2突变体、融合蛋白、缀合物、核酸片段、载体、宿主细胞或药物组合物；
优选地，施用方式为注射，例如静脉注射或者皮下注射；
优选地，所述有效量为0.001～10mpk，例如0.001mpk、0.002mpk、0.003mpk、0.004mpk、0.005mpk、0.006mpk、0.007mpk、0.008mpk、0.009mpk、0.01mpk、0.02mpk、0.03mpk、0.04mpk、0.05mpk、0.06mpk、0.07mpk、0.08mpk、0.09mpk、0.1mpk、0.2mpk、0.3mpk、0.4mpk、0.5mpk、0.6mpk、0.7mpk、0.8mpk、0.9mpk、1mpk、2mpk、3mpk、4mpk、5mpk、6mpk、7mpk、8mpk、9mpk或10mpk；
优选地，所述自身免疫性疾病包括类风湿关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、皮肤红斑狼疮、狼疮性肾炎、IgA肾病、干燥综合征、多肌炎、皮肌炎、硬皮病、银屑病、斑块状银屑病、斑秃、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、自身免疫肝炎、I型糖尿病、自身免疫性血管炎、湿疹或哮喘；
优选地，所述增生性疾病包括赘生物、实体瘤、血液瘤、恶性腹水或恶性胸水；其中，所述实体瘤可为良性或恶性，原发性或转移性，所述恶性实体瘤可为癌或肉瘤，例如，上皮细胞癌、内皮细胞癌、鳞状细胞癌、畸胎瘤、肺部肿瘤、乳头瘤病毒引起的癌、腺癌、癌肿、黑色素瘤、血管肉瘤、神经母细胞瘤、转移性肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、Merkel细胞癌、卵巢癌、肾细胞癌、转移性肾癌、头颈癌、膀胱癌、非肌层浸润性膀胱癌；所述血液瘤可选自白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤，例如B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病；
更优选地，所述病毒感染选自HIV感染、新型冠状病毒感染或HPV病毒感染。
在第十三方面，本发明公开一种优先刺激T细胞群体或外周血中调节性T细胞的方法， 其中，所述方法包括将所述T细胞群体或外周血与前述的IL-2突变体或融合蛋白，或缀合物，或核酸片段，或载体，或宿主细胞，或的药物组合物接触；
优选地，所述所述优先刺激包括：
(a)与非调节性T细胞或NK细胞相比，优先刺激调节性T细胞的STAT5磷酸化；
(b)与非调节性T细胞或NK细胞相比，优先刺激调节性T细胞增殖；
和/或(c)提高调节性T细胞与非调节性T细胞的比率，或提高调节性T细胞与NK细胞的比率。
术语定义和说明
除非本发明另外定义，与本发明相关的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员所理解的含义。
除非另有说明，本发明所述术语“IL2”或“IL-2”，是指来自任何脊椎动物源，包括哺乳动物例如灵长类(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)和驯养或农业哺乳动物的任何天然或重组IL-2。本发明所述“IL2”或“IL-2”包括未加工成熟的IL-2(例如包含N端信号肽的IL-2)以及产生在细胞中加工成熟的IL-2的任何形式。本发明所述“IL2”或“IL-2”还包括IL-2的天然变体和片段，例如剪切变体或等位基因变体。本发明所述“IL2”或“IL-2”还包括非天然存在的突变体，例如通过基因工程人工改造的IL-2突变体。
“野生型IL-2”是在其他方面与IL-2突变体相同，只是在IL-2突变体的每个突变氨基酸位置保持野生型氨基酸的IL-2形式。示例性地，如果IL-2突变体是未加工成熟的IL-2，那么该突变体的野生型形式是未加工成熟的IL-2；如果IL-2突变体是加工成熟的IL-2，那么该突变体的野生型形式是加工成熟的IL-2；如果IL-2突变体是IL-2的截短形式，那么该突变体的野生型形式是具有野生型序列的相应的IL-2截短形式。示例性地，本发明所述“野生型IL-2”可具有如下所示氨基酸序列：
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITF XQSIISTLT(SEQ ID NO：60)；其中第125位氨基酸残基“X”代表C、S、A或V。
本发明术语“突变”包含氨基酸取代、缺失、插入或其任意组合。本发明所述“突变”可以使用本领域公知的遗传学或化学方法生成氨基酸突变，包括但不限于定点诱变、PCR、基因合成等方法。
本发明所述IL-2突变体的“突变位点”编号从SEQ ID NO：60所示“野生型IL-2”的第1位氨基酸残基A开始计数。示例性地，本发明“Q13突变”是指IL-2突变体在SEQ ID NO：60所示野生型IL-2第13位氨基酸残基(Gln，Q)处发生突变。示例性地，本发明“Q13L突变” 是指IL-2突变体在SEQ ID NO：60所示野生型IL-2第13位处氨基酸残基由Q(Gln)突变位L(Leu)。
本发明用于突变位点间的术语“/”表示“和”的意思，是指“/”前后的突变在同一个IL-2突变体中同时存在。示例性地，“Y31/A73/H79”是指在同一个IL-2突变体同时在Y31位点、A73位点和H79位点发生突变，“Y31V/A73L/H79Q”是指在同一个IL-2突变体同时存在Y31V、A73L和H79Q突变。
本发明术语“Tm”(melting temperature，熔点)，是指50％的蛋白质发生变性时的温度。本发明所述“Tm”可采用本领域公知的方法测定蛋白的Tm值，示例性地，可采用本发明实施例3或实施例6所示方法测定蛋白的Tm值。
本发明术语“融合蛋白”(fusion protein)是指，通过基因重组方法、化学方法或其它适当方法将两个或多个基因的编码区连接，在同一调控序列控制下表达基因重组所得的蛋白质产物。本发明的融合蛋白中，两个或多个基因的编码区之间可由编码连接肽的序列于一个或数个位置融合。连接肽可用于构建本发明的融合蛋白。
本发明术语“连接肽(Linker)”是指，在本发明中用于连接IL-2与另一蛋白分子或蛋白片段，以保证蛋白的正确折叠和稳定性的肽。所述另一分子包括但不限于Fc。本发明的“连接肽”优选为(GGGGS)n，其中n可以为0、1、2、3、4、5。如果连接肽序列太短，可能影响两蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰；如果连接肽序列太长，又涉及免疫原性的问题，因为连接肽序列本身就是新的抗原。
本发明术语“第二多肽”可为单链多肽，例如抗体中的scFv。所述“第二多肽”还包括多链多肽，其中的至少一条多肽与IL-2或其突变体融合，其他多肽链通过共价键或非共价键连接至发生融合的所述至少一条多肽上，例如抗体中的Fab，其中Fab的重链可与IL-2或其突变体融合，而轻链通过二硫键连接至所述重链上。
本发明术语“Fc”是指，免疫球蛋白链恒定区，特别是免疫球蛋白重链恒定区的羧基端或其中的一部分，无抗原结合活性，是抗体分子与效应分子或细胞相互作用的部位。本发明所述“Fc”可以是任何Fc或其变体，来源于人或非人哺乳动物。例如，免疫球蛋白Fc可包括重链CH1、CH2、CH3、CH4的两个或更多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合。Fc可以来源于不同的种属，优选人的免疫球蛋白。根据重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类，主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG-4；IgA-1和IgA-2。“Fc”优选包括至少一个免疫球蛋白绞链区，以及IgG的CH2和CH3结构域。更优选包括IgG1的一个CH2结构域，一个CH3结构域和一个免疫球蛋白绞链区，铰链区起始氨基酸位置可以变动。除非另外说明，否则本发明所述Fc、恒定区或抗体中的氨基酸残基根据如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interes,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述的EU编号体系，也称作EU索引，进行编号。
本发明“抗体”(antibody)在本发明中以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，只要它们展现出期望的抗原结合活性，所述抗体包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗原结合片段。抗体可以包括鼠源抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、骆驼抗体。例示性的，抗体可以是免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。本发明所述“抗体”还包括scFv，sdFv，Fab，Fab’，F(ab’) 2和Fv。
本发明术语“分离的”指将材料由其原始或天然环境(例如其天然存在的自然环境)中取出。因此，存在于活体动物中的天然多核苷酸或多肽不是分离的，但通过人为干预由天然系统中某些或全部共存材料中分离的相同多核苷酸或多肽是分离的。
“分离的核酸片段”是RNA或DNA聚合物，其为单链或双链，任选含合成的、非天然或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离核酸片段可由一个或多个cDNA、基因组DNA或合成DNA片段组成。本发明所述“核酸片段”可为载体的一部分，在异源位点整合入宿主细胞染色体。本发明所述“核酸片段”可为组合物的一部分。由于这种载体或组合物不是其天然存在环境的一部分，所以仍然是分离的。
本发明术语“载体”包括核酸载体，例如DNA载体(如质粒)，RNA载体，病毒或其他适合的复制子(例如病毒载体)。已经开发了多种载体用于将编码外源蛋白质的多核苷酸递送到原核或真核细胞中。本发明所述“载体”可含有用于表达蛋白质和/或将这些多核苷酸序列整合到哺乳动物细胞基因组中的附加序列元件、用于指导基因转录的调控序列(如启动子和增强子区域)或用于增强基因的翻译速率或改善由基因转录产生的mRNA的稳定性或核输出的序列。这些序列元件包括例如5’和3’非翻译区、内部核糖体进入位点(IRES)和聚腺苷酸化信号位点，以便指导表达载体上携带的基因的有效转录。本发明所述“载体”还可以含有以下多核苷酸，该多核苷酸编码用于选择含有这种载体的细胞的标记。适合的标记的实例包括编码抗生素(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或诺尔丝菌素)抗性的基因。
本发明术语“宿主细胞”是指已引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。所述“后代”在核酸内容物上可与亲本完全相同，也可含有突变，与亲本细胞不完全相同。所述“后代”包 括具有与原始转化细胞中所筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能或生物学活性的突变后代。
本发明术语“药物组合物”是指含有一种或多种本发明所述IL-2突变体、融合蛋白、核酸片段、载体或宿主细胞的混合物，所述混合物还含有其他组分，所述其他组分包括但不限于其在药学上可接受的运载体、稀释剂或助剂。本发明所述药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
本发明术语“治疗”是指外科手术或药物处理(surgical or therapeutic treatment)，其目的是预防、减缓(减少)治疗对象中不希望的生理变化或病变，如细胞增殖性病症(如癌症或传染性疾病)，如自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮)的进展。有益的或所希望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度减弱、疾病状态稳定(即，未恶化)、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和、以及缓解(无论是部分缓解或完全缓解)，无论是可检测的或不可检测的。需要治疗的对象包括已患有病症或疾病的对象以及易于患上病症或疾病的对象或打算预防病症或疾病的对象。当提到减缓、减轻、减弱、缓和、缓解等术语时，其含义也包括消除、消失、不发生等情况。
本发明术语“受试者”是指接受对如本发明所述的特定疾病或病症(如癌症或传染性疾病或自身免疫性疾病)的治疗的生物体。对象和患者的实例包括接受疾病或病症治疗的哺乳动物，如人、灵长类动物、猪、山羊、兔、仓鼠、猫、狗、豚鼠、牛或其他牛科家族成员、绵羊和马等。
本发明术语“有效量”指单独给予或与另一治疗剂组合给予细胞、组织或对象时能有效防止或缓解疾病病症或该疾病进展的治疗剂用量。“有效量”还指足以缓解症状，例如治疗、治愈、防止或缓解相关医学病症，或治疗、治愈、防止或缓解这些病症的速度增加的化合物用量。当将活性成分单独给予个体时，治疗有效剂量单指该成分。当应用某一组合时，治疗有效剂量指产生治疗作用的活性成分的组合用量，而无论是组合、连续或同时给予。
本发明术语“自身免疫病”指特征是对象对其自身的细胞、组织和/或器官产生免疫反应而引起的细胞、组织和/或器官损伤的对象病症。示例性地，自身免疫病包括但不限于类风湿关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、皮肤红斑狼疮、狼疮性肾炎、IgA肾病、干燥综合征、多肌炎、皮肌炎、硬皮病、银屑病、斑块状银屑病、斑秃、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、自身免疫肝炎、I型糖尿病、自身免疫性血管炎、湿疹或哮喘。
本发明术语“增生性疾病”指细胞或组织的生长不受调节和/或异常生长，可导致发展不需要的病况或疾病的病况，可为或可不为癌性的，其包括但不限于赘生物、实体瘤、血液瘤、恶性腹水或恶性胸水。本发明“实体瘤”可为良性(benign)或恶性(maligant)，原发性(Primary) 或转移性(metastatic)；恶性实体瘤可为癌(carcinomas)或肉瘤(sarcomas)。示例性地，本发明“实体瘤”包括但不限于上皮细胞癌、内皮细胞癌、鳞状细胞癌、畸胎瘤、肺部肿瘤、乳头瘤病毒引起的癌、腺癌、癌肿、黑色素瘤、血管肉瘤、神经母细胞瘤、转移性肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、Merkel细胞癌、卵巢癌、肾细胞癌、转移性肾癌、头颈癌、膀胱癌、非肌层浸润性膀胱癌。示例性地，本发明“血液瘤”包括但不限于白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤，例如B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病。
本发明术语“IL-2受体α亚基”(IL-2Rα)，又称“CD25”，指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物如灵长类(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的任何天然IL-2受体α亚基或其突变体，包括“全长”的未加工的IL-2受体α亚基以及源自细胞中的加工的任何形式的IL-2受体α亚基，还包括天然存在的IL-2受体α亚基变体，例如剪接变体或等位变体，还包括在天然IL-2受体α亚基基础上经过人工改造的突变体。在某些实施方案中，IL-2受体α亚基是人IL-2受体α亚基，例示性序列如SEQ ID NO：57所示。
本发明术语“IL-2受体β亚基”(IL-2Rβ)，又称“CD122”，指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物如灵长类(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的任何天然IL-2受体β亚基或其突变体，包括“全长”的未加工的IL-2受体β亚基以及源自细胞中的加工的任何形式的IL-2受体β亚基，还包括天然存在的IL-2受体β亚基变体，例如剪接变体或等位变体，还包括在天然IL-2受体β亚基基础上经过人工改造的突变体。在某些实施方案中，IL-2受体β亚基是人IL-2受体β亚基，例示性序列如SEQ ID NO：58所示。
本发明术语“IL-2受体γ亚基”(IL-2Rγ)，又称“CD132”，指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物如灵长类(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的任何天然IL-2受体γ亚基或其突变体，包括“全长”的未加工的IL-2受体γ亚基以及源自细胞中的加工的任何形式的IL-2受体γ亚基，还包括天然存在的IL-2受体γ亚基变体，例如剪接变体或等位变体，还包括在天然IL-2受体γ亚基基础上经过人工改造的突变体。在某些实施方案中，IL-2受体γ亚基是人IL-2受体γ亚基，例示性序列如SEQ ID NO：59所示。
本发明术语“Treg”，又称“调节性T细胞”或“T 调节细胞”，是指一种能抑制其它T细胞的应答的特殊化CD4 +T细胞类型。Treg的特征在于表达IL-2受体α亚基(CD25)和转录因子叉头框P3(Forkhead box protein P3，FOXP3)，并在诱导和维持对抗原的外周自体耐受中起着关键作用。Treg需要IL-2来实现其功能和发育以及其抑制性特征的诱导。
本发明术语“结合力”是指成对的分子之间表现出的相互间的结合或相互作用。常见的成对分子包括：配体与受体、抗原与抗体、酶和底物等，更具体地，例如本发明所示IL-2与IL-2βγ亚基复合物，或IL-2与IL-2αβγ亚基复合物。本发明所述“结合力”可通过本领域已经的常规 方法进行检测，包括但不限于ELISA或FACS。
附图说明
图1、流式细胞分析(FACS)方法检测CHO-K1 hIL2-Rα 1A6重组细胞系人源IL-2受体α蛋白表达水平的结果图，其中IL-2受体α抗体购自BioLegend；阴性对照指同型抗体对照；
图2、流式细胞分析(FACS)方法检测CHO-K1 hIL-2Rβ 2A5重组细胞系人源IL-2受体β蛋白表达水平的结果图，其中IL-2受体β抗体购自BioLegend；阴性对照指同型抗体对照；
图3、流式细胞分析(FACS)方法检测CHO-K1 hIL-2Rβγ 2E6重组细胞系人源IL-2受体βγ蛋白表达水平的结果图，IL-2受体β、γ抗体购自BioLegend；阴性对照指同型抗体对照；
图3A为IL2受体β蛋白表达水平结果图；
图3B为IL2受体γ蛋白表达水平的结果图；
图4、流式细胞分析(FACS)方法检测CHO-K1 hIL-2Rαβγ 2D6重组细胞系人源IL-2受体αβγ蛋白表达水平的结果图，IL-2受体α、β、γ抗体购自BioLegend；对照为CHO-K1空细胞对应受体表达水平；
图4A为IL2受体α蛋白表达水平结果图；
图4B为IL2受体β蛋白表达水平结果图；
图4C为IL2受体γ蛋白表达水平的结果图；
图5、流式细胞分析(FACS)方法检测IL-2突变蛋白与CHO-K1 IL-2受体αβγ、IL-2受体βγ重组细胞结合活性的结果图；
图5A为mut7.36-linker2-hFc、mut11.08-linker2-hFc、mut61-linker2-hFc、mut61.08-linker2-hFc或mut61.46-linker2-hFc与CHO-K1 IL2受体αβγ重组细胞结合活性的结果图；
图5B为mut11.31-linker2-hFc、mut7.66-linker2-hFc与CHO-K1 IL2受体αβγ重组细胞结合活性的结果图；
图5C为mut7.36-linker2-hFc、mut11.08-linker2-hFc、mut61-linker2-hFc、mut61.08-linker2-hFc或mut61.46-linker2-hFc与CHO-K1 IL2受体βγ重组细胞结合活性的结果图；
图5D为mut11.31-linker2-hFc、mut7.66-linker2-hFc与CHO-K1 IL2受体βγ重组细胞结合活性的结果图。
图6、检测IL-2突变蛋白对Treg(图6A-图6C)、CD4 +CD25 -FoxP3 -T细胞(图6D-图6F)、CD8 +T细胞(图6G-图6I)STAT5磷酸化水平的影响；
图6A为mut7.36-linker2-hFc对Treg STAT5磷酸化水平的影响；
图6B为mut11.08-linker2-hFc对Treg STAT5磷酸化水平的影响；
图6C为mut11.31-linker2-hFc、mut7.66-linker2-hFc对Treg STAT5磷酸化水平的影响；
图6D为mut7.36-linker2-hFc对CD4 +CD25 -FoxP3 -T细胞磷酸化水平的影响；
图6E为mut11.08-linker2-hFc对CD4 +CD25 -FoxP3 -T细胞磷酸化水平的影响；
图6F为mut11.31-linker2-hFc、mut7.66-linker2-hFc对CD4 +CD25 -FoxP3 -T细胞磷酸化水平的影响；
图6G为mut7.36-linker2-hFc对CD8 +T细胞磷酸化水平的影响；
图6H为mut11.08-linker2-hFc对CD8 +T细胞磷酸化水平的影响；
图6I为mut11.31-linker2-hFc、mut7.66-linker2-hFc对CD8 +T细胞磷酸化水平的影响；
图7、检测IL-2突变蛋白对Treg(图7A-图7B)、CD4 +CD25 -FoxP3 -T细胞(图7C-图7D)、CD8 +CD25 -T细胞(图7E-图7F)增殖水平的影响；
图7A为mut7.36-linker2-hFc、mut7.66-linker2-hFc对Treg增殖水平的影响；
图7B为mut11.08-linker2-hFc、mut11.31-linker2-hFc对Treg增殖水平的影响；
图7C为mut7.36-linker2-hFc、mut7.66-linker2-hFc对CD4 +CD25 -FoxP3 -T细胞增殖水平的影响；
图7D为mut11.08-linker2-hFc、mut11.31-linker2-hFc对CD4 +CD25 -FoxP3 -T细胞增殖水平的影响；
图7E为mut7.36-linker2-hFc、mut7.66-linker2-hFc对CD8 +CD25 -T细胞增殖水平的影响；
图7F为mut11.08-linker2-hFc、mut11.31-linker2-hFc对CD8 +CD25 -T细胞增殖水平的影响；
图8、检测IL-2突变蛋白对NK细胞增殖水平的影响；
图9A、脾脏中Treg细胞在CD4 +T细胞中的占比；
图9B、脾脏中CD4 +CD25 -Foxp3 -细胞在CD4 +细胞中的占比；
图9C、脾脏中CD3 +CD4 -细胞在CD3 +细胞中的占比；
图10A、外周血中Treg细胞在CD4 +细胞中的占比；
图10B、外周血中CD4 +CD25 -Foxp3 -细胞在CD4 +细胞中的占比；
图10C、外周血中CD3 +CD4 -细胞在CD3 +细胞中的占比；
图11A、野生型小鼠DTH模型不同组别的Δ耳厚变化，Δ耳厚是指刺激前后，右耳片厚度变化；
图11B、野生型小鼠DTH模型不同组别的体重变化；
图12A、野生型小鼠DTH模型不同组别的Δ耳厚变化，Δ耳厚是指刺激前后，右耳片厚度变化；
图12B、野生型小鼠DTH模型不同组别的体重变化；
图13A、NOG小鼠不同组别的Treg/Tcon；
图13B、NOG小鼠不同组别的Treg/CD8+；
图14A、NOG小鼠不同组别的Treg细胞数目；
图14B、NOG小鼠不同组别的Tcon细胞数目；
图14C、NOG小鼠不同组别的CD8+细胞数目；
图15A、NOG小鼠不同组别的体重变化；
图15B、NOG小鼠不同组别的GVHD评分；
图16A、野生型小鼠皮下给药后血药浓度；
图16B、野生型小鼠皮下给药后血药浓度；
图17、野生型小鼠静脉给药后血药浓度；
图18、PBMC接种小鼠皮下给药后血药浓度；
图19、食蟹猴皮下给药后血药浓度；
图20A、食蟹猴皮下给药后Treg数目；
图20B、食蟹猴皮下给药后Treg数目变化倍数；
图20C、食蟹猴皮下给药后Treg占CD4 +T细胞比例；
图20D、食蟹猴皮下给药后Treg Ki67 +细胞比例；
图20E、食蟹猴皮下给药后FoxP3平均荧光强度变化倍数；
图20F、食蟹猴皮下给药后CD25平均荧光强度变化倍数；
图21A、食蟹猴皮下给药后FoxP3 -CD4 +细胞数目；
图21B、食蟹猴皮下给药后FoxP3 -CD4 +细胞数目变化倍数；
图21C、食蟹猴皮下给药后CD8 +T细胞数目；
图21D、食蟹猴皮下给药后CD8 +T细胞数目变化倍数；
图21E、食蟹猴皮下给药后NK细胞数目；
图21F、食蟹猴皮下给药后NK细胞数目变化倍数。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 IL-2热稳定性突变的设计与表达质粒构建
使用多种算法获得热稳定性提高的IL-2突变，设计合成相应序列，将编码野生型IL2和前述突变型IL2的核酸片段克隆至带有Fc标签的pTT5载体上，并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒，所述质粒编码以下融合蛋白：IL2-linker2-hFc、mut0.08-linker2-hFc、mut0.31-linker2-hFc、mut0.36-linker2-hFc、mut0.39-linker2-hFc、mut0.46-linker2-hFc、mut0.57-linker2-hFc、mut0.66-linker2-hFc和mut0.68-linker2-hFc。
前述融合蛋白及各元件的具体序列信息如表1所示，其中，“IL2”表示野生型IL2，“mutXX”表示与野生型相比，发生突变的突变型IL2。
表1 IL-2稳定性突变序列
Figure PCTCN2021116463-APPB-000001
Figure PCTCN2021116463-APPB-000002
Figure PCTCN2021116463-APPB-000003
实施例2 IL-2热稳定性突变的生产与纯化
对HEK293细胞(购自中国科学院细胞库)瞬时转染实施例1构建的质粒(PEI，Polysciences)并使用FreeStyle TM 293 Expression Medium(购自Gibco)在37℃下进行扩大培养。7天后收集细胞培养液，离心去除细胞成分，获得含IL-2-hFc融合蛋白的培养上清液。
用10mL蛋白A柱(购自博格隆)纯化细胞培养上清液中的融合蛋白。蛋白A柱先用3～5倍柱体积的平衡缓冲液(PBS磷酸缓冲液，pH7.4)平衡，然后将澄清的培养上清液上样到蛋白A柱，控制流速在10mL/分钟。上样完毕后用平衡缓冲液清洗蛋白A柱，平衡缓冲液的体积为蛋白A柱柱床体积的3～5倍。用洗脱液(0.02M柠檬酸缓冲液，0.1M甘氨酸，0.1M氯化钠，pH3.0)洗脱结合在蛋白A柱上的蛋白，用核酸蛋白检测仪监测洗脱情况(A280紫外吸收峰)。收集洗脱的蛋白，加入1M精氨酸，0.4M丁二酸，pH9.0的缓冲液中和pH。然后过分子筛(购自博格隆)，缓冲体系为20mM PB，200mM氯化钠，pH6.0-6.5，收集目的蛋白。用0.22μm的滤器进行无菌过滤，无菌保存，即得纯化的IL-2突变融合蛋白。
将纯化的IL-2突变融合蛋白进行蛋白产量、蛋白浓度(A280/1.4)、SEC纯度等检测分析，纯化后的IL-2稳定性突变融合蛋白的质量合格，同时IL-2稳定性突变(mutXX-linker2-hFc)的产量也较野生型IL-2(IL2-linker2-hFc)有显著提高。其中关于蛋白产量、蛋白浓度和纯度的检测信息参见表2。
表2 IL-2稳定性突变融合蛋白的检测分析
Figure PCTCN2021116463-APPB-000004
实施例3 IL-2热稳定性突变DSF检测
将Protein Thermal Shift Dye Kit(购自Applied Biosystems，货号4461146)中的缓冲液稀释成50×，稀释通过实施例2所述方法纯化所得IL-2突变蛋白至0.5mg/mL，染料2×浓度，补充至20μL反应体系。混匀后加入到8连管中，每个样品2个复孔，盖上管盖，离心5-10秒，放置到检测仪器(Applied Biosystems 7500)检测，Boltzmann分析法分析熔解曲线，获得Tm值。结果如表3所示，稳定性IL-2突变(mutXX-linker2-hFc)与野生型IL-2(IL2-linker2-hFc)相比，Tm提高3℃以上，热稳定性有显著提高。
表3 IL-2稳定性突变DSF分析
突变号 Tm(℃)
突变号 Tm(℃)
IL2-linker2-hFc 46.74
mut0.08-linker2-hFc 54.91
mut0.31-linker2-hFc 57.53
mut0.36-linker2-hFc 56.59
mut0.39-linker2-hFc 55.93
mut0.46-linker2-hFc 53.83
mut0.57-linker2-hFc 57.98
mut0.66-linker2-hFc 57.24
mut0.68-linker2-hFc 54.77
实施例4 IL-2突变(与βγ亚基相互作用减弱的IL2突变及在此基础上组合热稳定性突变)的的设计与表达质粒构建
使用包括MOE软件在内的多种算法模拟人的IL-2与相应的受体α、β、γ亚基的相互作用界面，获得与βγ亚基相互作用减弱的突变位点。设计合成与βγ亚基相互作用减弱的IL-2突变体序列及其与热稳定突变组合后的IL-2突变体序列。将编码野生型IL-2和前述IL-2突变体的核酸片段克隆到带有Fc标签的pTT5载体上，并按已建立的标准分子生物学方法制备质粒，所述质粒编码以下融合蛋白：IL2-linker2-hFc、mut7-linker2-hFc、mut7.08-linker2-hFc、mut7.36-linker2-hFc、mut7.39-linker2-hFc、mut7.46-linker2-hFc、mut7.57-linker2-hFc、mut7.66-linker2-hFc、mut8-linker2-hFc、mut8.08-linker2-hFc、mut8.36-linker2-hFc、mut11-linker2-hFc、mut11.08-linker2-hFc、mut11.31-linker2-hFc、mut11.36-linker2-hFc、mut11.46-linker2-hFc、mut61-linker2-hFc、mut61.08-linker2-hFc和mut61.46-linker2-hFc。所述融合蛋白及其组成元件的具体序列信息如表4所示，其中，“IL2”表示野生型IL2，“mutXX”表示与野生型相比，发生突变的突变型IL2。
表4 IL-2突变序列
Figure PCTCN2021116463-APPB-000005
Figure PCTCN2021116463-APPB-000006
Figure PCTCN2021116463-APPB-000007
Figure PCTCN2021116463-APPB-000008
Figure PCTCN2021116463-APPB-000009
Figure PCTCN2021116463-APPB-000010
实施例5 IL-2突变的生产与纯化
对HEK293细胞(购自中国科学院细胞库)瞬时转染(PEI，Polysciences)实施例4构建的质粒并使用FreeStyle TM 293 Expression Medium(购自Gibco)在37℃下进行扩大培养。7天后收集细胞培养液，离心去除细胞成分，获得含IL-2-hFc融合蛋白的培养上清液。
用10mL蛋白A柱(购自博格隆)纯化细胞培养上清液中的融合蛋白。蛋白A柱先用3～5倍柱体积的平衡缓冲液(PBS磷酸缓冲液，pH7.4)平衡，然后将澄清的培养上清液上样到蛋白A柱，控制流速在10mL/分钟。上样完毕后用平衡缓冲液清洗蛋白A柱，平衡缓冲液的体积为蛋白A柱柱床体积的3～5倍。用洗脱液(0.02M柠檬酸缓冲液，0.1M甘氨酸，0.1M氯化钠，pH3.0)洗脱结合在蛋白A柱上的蛋白，用核酸蛋白检测仪监测洗脱情况(A280紫外吸收峰)。收集洗脱的蛋白，加入1M精氨酸，0.4M丁二酸，pH9.0的缓冲液中和pH。然后过分子筛(购自博格隆)，缓冲体系为20mM PB，200mM氯化钠，pH6.0-6.5，收集目的蛋白。用0.22μm的滤器进行无菌过滤，无菌保存，即得纯化的IL-2突变融合蛋白。
对纯化的IL-2突变融合蛋白(mutXX-linker2-hFc)进行蛋白浓度(A280/1.4)、SEC纯度等检测分析，纯化后的IL-2突变融合蛋白的质量合格。其中，关于蛋白纯度和浓度的检测信息参见表5。
表5 IL-2突变融合蛋白的检测分析
Figure PCTCN2021116463-APPB-000011
Figure PCTCN2021116463-APPB-000012
实施例6 IL-2突变DSF检测
将Protein Thermal Shift Dye Kit(购自Applied Biosystems，货号4461146)中的缓冲液稀释成50×，稀释实施例5纯化的IL-2突变蛋白至0.5mg/mL，染料2×浓度，补充至20μL反应体系。混匀后加入到8连管中，每个样品2个复孔，盖上管盖，离心5-10秒，放置到检测仪器(Applied Biosystems 7500)检测，Boltzmann分析法分析熔解曲线，获得Tm值。具体Tm值如表6所示。
根据表6所示结果可知，实施例4-5所示IL-2突变体(mutXX-linker2-hFc)与野生型IL-2(IL2-linker2-hFc)相比，Tm均提高5℃以上，其中部分IL-2突变体的Tm提高9℃以上，所有突变体的热稳定性均有显著提高。
令人意外，与βγ亚基相互作用减弱的IL-2突变体，较之野生型IL-2，其Tm值升高，热稳定性得到提升；在此基础上，进一步组合热稳定性突变的组合型突变体，均保持高Tm值，其中部分组合了热稳定突变的组合突变，与仅发生βγ亚基相互作用减弱的突变相比，Tm仍提高2℃以上，最高可以提高6℃以上，热稳定性获得进一步的提高。
表6 IL-2突变DSF分析
突变号 Tm(℃)
IL2-linker2-hFc 45.95
mut7-linker2-hFc 51.08
mut7.08-linker2-hFc 54.70
mut7.36-linker2-hFc 56.95
mut7.57-linker2-hFc 57.54
mut7.66-linker2-hFc 56.64
突变号 Tm(℃)
mut8-linker2-hFc 55.24
mut8.08-linker2-hFc 55.32
mut8.36-linker2-hFc 56.84
mut11-linker2-hFc 56.63
mut11.08-linker2-hFc 58.80
mut11.31-linker2-hFc 59.37
mut11.36-linker2-hFc 57.56
IL2-linker2-hFc 46.74
mut7-linker2-hFc 51.05
mut7.39-linker2-hFc 56.30
mut7.46-linker2-hFc 54.84
mut11-linker2-hFc 57.17
mut11.46-linker2-hFc 57.02
IL-2-linker2-hFc 46.86
mut61-linker2-hFc 56.84
mut61.08-linker2-hFc 57.71
mut61.46-linker2-hFc 56.84
实施例7过表达人或小鼠IL-2受体的稳转细胞株的构建
A.过表达人源IL-2受体α的稳转细胞株构建
将人的IL-2受体α亚基的氨基酸序列(NCBI中的基因登陆号为P01589，具体序列如SEQ ID NO：57所示)克隆到pLVX-IRES-Puro载体(购自优宝生物，货号：VT1464)中，进行慢病毒包装，随后感染CHO-K1细胞系(购自中国科学院细胞库)。病毒感染CHO-K1细胞72个小时后，用已知的IL-2受体α亚基抗体(货号302606，购自BioLegend)经流式细胞分析法进行检测。当确定转染后的细胞开始表达人IL-2受体α亚基，加入Puromycin(购自Gibco)进行筛选，待细胞恢复后用有限稀释法在96孔培养板中进行亚克隆，并置于37℃、5％(v/v)CO 2条件下培养，大约2周后选择部分单克隆孔扩增到6孔板中。对扩增后的克隆再用已知的IL-2受体α亚基抗体经流式细胞分析法进行筛选。选择长势较好、荧光强度较高、单克隆的细胞系继续扩大培养，用流式细胞分析法再次复测后并液氮冻存，即获得表达人IL-2受体α亚基的稳转细胞株。具体选择结果如表7和图1所示，表7中阳性细胞(％)指阳性细胞占总细胞数目的百分比。表7说明，已经制得一系列IL-2受体α亚基过表达的CHO-K1细胞系。
表7表达人源IL-2受体α的CHO-K1细胞FACS筛选检测结果
Figure PCTCN2021116463-APPB-000013
Figure PCTCN2021116463-APPB-000014
B.过表达人源IL-2受体β的稳转细胞株构建
将人的IL-2受体β亚基的氨基酸序列(NCBI中的基因登陆号为P14784，具体序列如SEQ ID NO：58所示)克隆到pLVX-IRES-Puro载体(购自优宝生物，货号：VT1464)中，进行慢病毒包装，随后感染CHO-K1细胞系(购自中国科学院细胞库)。病毒感染CHO-K1细胞72个小时后，用已知的IL-2受体β亚基抗体(货号339010，购自BioLegend)经流式细胞分析法进行检测。当确定转染后的细胞开始表达人IL-2受体β亚基，加入Puromycin(购自Gibco)进行筛选，待细胞恢复后用有限稀释法在96孔培养板中进行亚克隆，并置于37℃、5％(v/v)CO 2条件下培养，大约2周后选择部分单克隆孔扩增到6孔板中。对扩增后的克隆再用已知的IL-2受体β亚基抗体经流式细胞分析法进行筛选。选择长势较好、荧光强度较高、单克隆的细胞系继续扩大培养，用流式细胞分析法再次复测后并液氮冻存，即获得表达人IL-2受体β亚基的稳转细胞株。具体选择结果如表8和图2所示，表8中阳性细胞(％)指阳性细胞占总细胞数目的百分比。表8说明，已经制得一系列IL-2受体β亚基过表达的CHO-K1细胞系。
表8表达人源IL-2受体β的CHO-K1细胞FACS筛选检测结果
Figure PCTCN2021116463-APPB-000015
C.过表达人源IL-2受体βγ的稳转细胞株构建
将人的IL-2受体γ亚基的氨基酸序列(NCBI中的基因登陆号为P31785，具体序列如SEQ ID NO：59所示)克隆到pLVX-IRES-Hygro载体中，进行慢病毒包装，随后感染CHO-K1 IL2受体β亚基细胞系过表达细胞系(CHO-K1 hIL-2Rβ2A5)。病毒感染CHO-K1细胞72个小时后，用已知的IL-2受体β、γ亚基抗体(货号339010、338608，购自BioLegend)经流式细胞分析法进行检测。当确定转染后的细胞开始表达人IL-2受体βγ亚基，加入Puromycin、Hygromycin(购自Gibco、Thermo)进行筛选，待细胞恢复后用有限稀释法在96孔培养板中进行亚克隆，并置于37℃、5％(v/v)CO 2条件下培养，大约2周后选择部分单克隆孔扩增到6孔板中。对扩增后的克隆再用已知的IL-2受体β、γ亚基抗体经流式细胞分析法进行筛选。选择长势较好、荧光强度较高、单克隆的细胞系继续扩大培养，用流式细胞分析法再次复测后并液氮冻存，即获得表达人IL-2受体βγ亚基的稳转细胞株。具体选择结果如表9和 图3A-图3B所示，表9中阳性细胞(％)指阳性细胞占总细胞数目的百分比。表9说明，已经制得一系列IL-2受体βγ亚基过表达的CHO-K1细胞系。
表9表达人源IL-2受体βγ的CHO-K1细胞FACS筛选检测结果
Figure PCTCN2021116463-APPB-000016
D.过表达人源IL-2受体αβγ的稳转细胞株构建
将人IL-2受体α亚基的氨基酸序列克隆到pLVX-IRES-zsGreen载体中，进行慢病毒包装，随后感染IL-2受体βγ亚基过表达的CHO-K1细胞系。病毒感染CHO-K1细胞72个小时后，用已知的IL-2受体α、β、γ亚基抗体(同上，购自BioLegend)经流式细胞分析法进行检测。当确定转染后的细胞开始表达人IL-2受体αβγ亚基，加入Puromycin、Hygromycin(购自Gibco、Thermo)、GFP荧光表达进行筛选，待细胞恢复后用有限稀释法在96孔培养板中进行亚克隆，并置于37℃、5％(v/v)CO 2条件下培养，大约2周后选择部分单克隆孔扩增到6孔板中。对扩增后的克隆再用已知的IL-2受体α、β、γ亚基抗体经流式细胞分析法进行筛选。选择长势较好、荧光强度较高、单克隆的细胞系继续扩大培养，用流式细胞分析法再次复测后并液氮冻存，即获得表达人IL-2受体αβγ亚基的稳转细胞株。具体选择结果如表10和图4A-图4C所示，表10中阳性细胞(％)指阳性细胞占总细胞数目的百分比。表10说明，已经制得一系列IL-2受体αβγ亚基过表达的CHO-K1细胞系。
表10表达人源IL-2受体αβγ的CHO-K1细胞FACS筛选检测结果
Figure PCTCN2021116463-APPB-000017
表11实施例7A-D构建稳转细胞株使用的基因名称及其编码蛋白的序列信息
Figure PCTCN2021116463-APPB-000018
Figure PCTCN2021116463-APPB-000019
实施例8流式细胞实验(FACS)检测IL-2突变与受体表达细胞的结合
将CHO-K1 IL2受体αβγ或CHO-K1 IL2受体βγ细胞(CHO-K1 hIL-2R αβγ 2D6、CHO-K1 hIL-2R βγ 2E6)在T-75细胞培养瓶中扩大培养至90％汇合度。移除培养基，用PBS缓冲液(购自Hyclone，货号SH30256.01)洗涤一次，然后用2mL含有0.25％EDTA的胰酶(购自Invitrogen，货号25200072)处理细胞2-3分钟，加入8mL含有10％(w/w)胎牛血清(购自Gibco，货号10099-141C)的DMEM/F-12(购自Gibco，货号12634-010)进行中和，用移液器吹打3-4次，将吹散后的细胞收集到15毫升离心管中，进行细胞计数后，室温条件下1000rpm离心5分钟，弃去培养基。将细胞用含有2％(w/w)胎牛血清的RPMI-1640(购自Gibco，货号A10491-01)重悬并稀释至1.43×10 6个细胞每毫升，按每孔70μL加入到U型底96孔FACS反应板中，放在4℃或者冰上备用。用含有2％(w/w)胎牛血清的RPMI-1640稀释待测IL-2突变，按每孔30μL加入细胞中混匀，冰上孵育1小时。用FACS缓冲液[含有2％(w/w)牛血清蛋白的PBS缓冲液]离心洗涤2次，加入每孔100μL荧光标记的二抗(购自Biolegend，货号409306)，冰上孵育30分钟。用FACS缓冲液离心洗涤2次。用FACS(FACS Canto II，购自BD公司)检测和分析结果。或者用100μL含有2％(w/w)多聚甲醛(购自DingGuo，货号AR-0211)的FACS缓冲液悬浮细胞，放于4℃保存至上机检测，检测前每孔加入100μL PBS缓冲液，用FACS检测和分析结果。结果如图5A-图5D和表12-13示。 结果显示，IL-2突变可结合细胞表面的人源IL2受体αβγ三聚体。IL-2突变与细胞表面的人源IL2受体βγ二聚体的结合活性与野生型相比较弱，其中，mut61-linker2-hFc、mut61.08-linker2-hFc和mut61.46-linker2-hFc与CHO-K1 IL2Rβγ二聚体的结合活性受到极大抑制。表中数据MFI为所测细胞群的平均荧光强度值。
表12 FACS检测IL-2突变与CHO-K1 IL2受体αβγ重组细胞
(CHO-K1 IL2Rαβγ)的结合活性
Figure PCTCN2021116463-APPB-000020
表13 FACS检测IL-2突变与CHO-K1 IL2受体βγ重组细胞
(CHO-K1 IL2Rβγ)的结合活性
Figure PCTCN2021116463-APPB-000021
实施例9 STAT5磷酸化实验检测IL-2突变对不同细胞的信号通路激活作用
将冷冻的PBMC(购自Allcells)复苏，每孔加入50μl的5x10 5个细胞PBMC，以及50μl IL-2突变蛋白，二氧化碳培养箱中反应15分钟。反应结束后，每孔加100μl预冷的DPBS终止反应，离心后分别进行Livedead Violet染色(Invitrogen-L34964)，Fix I(BD-557870)37℃固定10分钟，PermIII(BD-558050)冰上破膜30分钟。用CD3-AF700(BD-557943)，CD4-PerCP cy5.5(BD-560650)，CD8-FTIC(BD-555366)，CD25-PE(BD-557138)，FoxP3-AF647(BD-560045)，pSTAT5-PE Cy7(Invitrogen-25-9010-42)室温染色1小时，洗涤两遍后上机检测。结果如图6A-图6I和表14-16所示。结果显示，与野生型IL-2相比，IL-2突变激活Treg细胞内STAT5磷酸化的水平相近，但是激活CD4 +CD25 -FoxP3 -T细胞或者CD8 +T细胞内的STAT5磷酸化水平显著降低。其中表中的数据MFI为所测细胞群内STAT5磷酸化的平均荧光强度值。
表14 FACS检测IL-2突变激活Treg STAT5磷酸化信号
蛋白浓度(pM) 10000 1000 100 10 1 0.1 0.01
IL2-linker2-hFc(MFI) 3706 3498 3607 3440 2554 680 662
mut7.36-linker2-hFc(MFI) 3463 3498 3498 3139 1250 735 522
IL2-linker2-hFc(MFI) 3371 3451 3382 3619 1909 464 415
mut11.08-linker2-hFc(MFI) 3451 3440 3668 3558 1365 462 366
IL2-linker2-hFc(MFI) 3807 3731 3706 3833 1955 561 467
mut7.66-linker2-hFc(MFI) 3718 3743 3280 2323 668 544 419
mut11.31-linker2-hFc(MFI) 3570 3522 3428 2149 680 465 473
表15 FACS检测IL-2突变激活CD4 +CD25 -FoxP3 -T细胞STAT5磷酸化信号
蛋白浓度(pM) 10000 1000 100 10 1 0.1
IL2-linker2-hFc(MFI) 1601 1370 1130 612 377 333
mut7.36-linker2-hFc(MFI) 527 473 388 371 368 336
IL2-linker2-hFc(MFI) 1111 960 833 485 362 370
mut11.08-linker2-hFc(MFI) 718 584 496 382 355 354
IL2-linker2-hFc(MFI) 1532 1361 1205 789 529 501
mut7.66-linker2-hFc(MFI) 592 564 481 496 496 501
mut11.31-linker2-hFc(MFI) 612 582 557 481 481 467
表16 FACS检测IL-2突变激活CD8+T细胞STAT5磷酸化信号
蛋白浓度(pM) 10000 1000 100 10 1 0.1
IL2-linker2-hFc(MFI) 973 413 274 221 233 239
mut7.36-linker2-hFc(MFI) 270 264 245 247 259 236
IL2-linker2-hFc(MFI) 758 381 321 260 270 288
mut11.08-linker2-hFc(MFI) 336 295 296 281 286 294
IL2-linker2-hFc(MFI) 910 481 372 361 344 339
mut7.66-linker2-hFc(MFI) 326 344 319 331 343 346
mut11.31-linker2-hFc(MFI) 311 324 346 327 326 317
实施例10 IL-2突变对T细胞增殖水平的调节作用
将冷冻的PBMC复苏，细胞重悬于RPMI-1640(购自Gibco，货号A10491-01)含10％FBS(购自Gibco，货号10099-141C)中，加入预包被有100ng/ml的CD3抗体(购自BD，货号566685)的六孔板中培养两天。收集细胞，用PBS缓冲液(购自Hyclone，货号SH30256.01)洗涤三次，重悬在RPMI-1640加10％FBS的培养基中，在六孔板中培养五天。收集细胞，用PBS缓冲液洗涤一次，用Celltrace Violet(购自Invitrogen，货号C34557)染色，加培养基洗涤一次，用培养基重悬，24孔板每孔加入900ul细胞，加100μl的IL2突变蛋白样品，培养七天。收集细胞，用含1％BSA(购自生工，货号A500023-0100)的PBS(购自生工，货号B548117-0500)重悬,细胞加入96孔板中。
用BV605-CD8(购自Biolengend，货号344742)室温染色30分钟，含1％BSA的PBS洗涤。每孔加入200μl固定液(购自eBioscience，货号00-5523-00)，4℃固定半小时，用含1％BSA的PBS洗涤，每孔加入200μl破膜液液(购自eBioscience，货号00-5523-00)，4℃破膜半小时，1％BSA的PBS洗涤。加入抗体APC-CY7-CD3(购自Biolengend，货号344818)，CD25抗体(购自Biolengend，货号302606)，Foxp3抗体(购自ThermoFisher#17-4777-42)，室温染色半小时。用含1％BSA的PBS洗涤，将样品重悬在200μl的含1％BSA的PBS中，FACS(FACS Canto II，购自BD公司)检测和分析结果。结果如图7A-7F和表17-19所示。结果显示：与野生型IL-2相比，IL-2突变对Treg细胞的增殖水平影响相近，但是对CD4 +CD25 -FoxP3 -T细胞或者CD8 +CD25 -T细胞细胞的增殖水平影响略微降低。其中表中的数据MFI为所测细胞群Celltrace Violet的平均荧光强度值，增殖后细胞内Celltrace Violet的平均荧光强度值降低，即，同样的检测时间内，细胞增殖越快，倍增数越多时，检测到的荧光强度平均值越低。
表17 FACS检测IL-2突变激活Treg细胞增殖
蛋白浓度(nM) 10 1 0.1 0.01 0.001 0.0001 0.00001
IL2-linker2-hFc(MFI) 1995 1670 2857 3362 3624 3863 4518
mut7.36-linker2-hFc(MFI) 1823 1407 2070 3162 3555 4077 4389
mut7.66-linker2-hFc(MFI) 1583 1437 2068 3384 4392 4027 4887
IL2-linker2-hFc(MFI) 1807 1838 2651 3319 3459 3691 4758
mut11.08-linker2-hFc(MFI) 1633 1536 1884 2371 2930 3369 3953
mut11.31-linker2-hFc(MFI) 1735 1855 1985 2669 2626 3379 4323
表18 FACS检测IL-2突变激活CD4 +CD25 -FoxP3 -T细胞增殖
蛋白浓度(nM) 10 1 0.1 0.01 0.001 0.0001 0.00001
IL2-linker2-hFc(MFI) 1653 2058 2216 3198 4578 5274 5602
mut7.36-linker2-hFc(MFI) 2361 2372 3317 4169 4971 5319 5815
mut7.66-linker2-hFc(MFI) 2258 2524 3160 4633 5374 5495 6022
IL2-linker2-hFc(MFI) 1679 1838 2055 2728 3997 4826 5314
mut11.08-linker2-hFc(MFI) 2254 2166 2538 3372 4154 5072 5391
mut11.31-linker2-hFc(MFI) 2332 2559 2885 3878 4779 5284 5509
表19 FACS检测IL-2突变激活CD8 +CD25 -T细胞增殖
蛋白浓度(nM) 10 1 0.1 0.01 0.001 0.0001 0.00001
IL2-linker2-hFc(MFI) 1128 1422 1696 3303 4907 5767 6303
mut7.36-linker2-hFc(MFI) 1955 1921 2640 3732 4917 5562 6179
mut7.66-linker2-hFc(MFI) 1820 1983 2683 4038 5539 5553 6617
IL2-linker2-hFc(MFI) 1064 1236 1435 2497 4087 5010 5715
mut11.08-linker2-hFc(MFI) 1876 1682 1956 2965 4124 5195 5567
mut11.31-linker2-hFc(MFI) 1750 1945 2252 3463 4610 5406 5583
实施例11 IL-2突变对NK细胞增殖水平的调节作用
用NK分选试剂盒(购自Miltenyi Biotec，货号130-092-657)将NK细胞分选并计数，重悬在MEM培养基(购自Gibco，货号12634-010)，培养基中含25％牛血清(购自Gibco，货号10099-141C)、0.2mM肌醇(购自Sigma Aldrich，货号I7508-50G)、0.1mMβ-巯基乙醇(购自Sigma Aldrich，货号M3148-100ML)、0.02mM叶酸(购自Sigma Aldrich，货号F8758-5G)。将细胞种入96孔板，每孔加入Fc blocker(购自Biolengend，货号422302)，再加入IL2突变蛋白培养三天。在最后18小时加入BrdU(购自Biolengend，货号423401)。收集细胞，用1％BSA的PBS洗涤并重悬，用等体积4％多聚甲醛(购自DingGuo，货号AR-0211)室温固定30分钟，用1％BSA的PBS洗涤，用0.5％Triton-X 100(购自ThermoFisher，货号HFH10)室温破膜15分钟，用1％BSA的PBS洗涤，加入DnaseI(购自Sigma Aldrich，货号D4513-1VL)37℃消化一小时。用1％BSA的PBS洗涤并重悬，加入APC anti-BrdU抗体(购自Biolengend，货号339808)室温染色二十分钟，用1％BSA的PBS洗涤，将样品重悬在200μl的1％BSA的PBS中，FACS(FACS Canto II，购自BD公司)检测和分析结果。结果如图8和表20所示。结果显示：与野生型IL-2相比，IL-2突变对NK细胞的增殖水平显著降低。其中表中的数据为所测NK细胞群BrdU阳性细胞比例。
表20 FACS检测IL-2突变激活NK细胞增殖
蛋白浓度(nM) 100.00 33.33 11.11 3.70 1.23 0.41 0.14 0.05
IL2-linker2-hFc(APC+％) 13.9 12.0 12.9 14.3 11.4 8.5 9.1 4.0
mut7.36-linker2-hFc(APC+％) 7.7 5.6 7.0 4.6 4.8 3.2 3.5 3.6
mut7.66-linker2-hFc(APC+％) 2.6 5.3 3.9 5.6 5.6 3.8 4.3 3.8
mut11.08-linker2-hFc(APC+％) 9.1 12.3 7.2 5.3 6.3 4.8 4.2 3.2
实施例12野生型小鼠皮下给药的PD(药效动力学)结果
采用Balb/c小鼠，雌性，6-8周龄，购自维通利华。Fc-linker-IL2_V91K、mut11.08-linker2-hFc蛋白，PBS稀释，小鼠背部皮下给药，给药体积为200μL/只，之后在不同时间点收取小鼠全血及脾脏样本，用于FACS检测。Fc-linker-IL2_V91K序列如SEQ ID NO:60所示，纯化方法参照实施例2。
Figure PCTCN2021116463-APPB-000022
Figure PCTCN2021116463-APPB-000023
2mL EDTA/2K抗凝管(新康医疗，货号X424)中收集小鼠全血，上下混匀血样及抗凝剂，使其充分接触。将300μL全血转入FACS管中，每管加入染色抗体的混合液，室温、避光孵育20min。随后在管中加入红细胞裂解液1mL/样品(Hybri-Max，货号R7757-100mL)，室温、避光，静置5min，见絮状物质，20℃，400g，离心6min，弃去上清，打散细胞。重复进行红细胞裂解。洗细胞：PBS 4mL/样品重悬细胞，4℃，500g，离心6min，弃去上清，打散细胞。加固定液，500μL/管，一滴滴加入，(点震)每次加入后间歇震动FACS管，于4℃固定一小时或者固定过夜。
取小鼠脾脏，70μm细胞滤网上碾磨(Falcon Corning，货号352350)，500g离心，每个脾脏加入3mL红细胞裂解液，裂解5min，加入20mL PBS终止裂解，500g离心5min，加入5mL PBS重悬细胞，过70μm细胞筛。细胞计数，每个FACS管加入1×10 6个细胞。加Fc blocker 5μL/管(Biolengend，货号156603)，涡旋振荡器上震荡，4℃孵育20min，每10min震荡一次。加4mL/管FACS洗液(PBS+1％BSA)，4℃，400g，离心6min。倒掉上清，用吸水纸吸干管口。加入Anti-Mouse CD3e(BD Bioscience，货号740014)、Anti-Mouse CD4(BD Bioscience，货号553407)、anti-mouse CD25(Biolengend，货号102008)，震荡一次，4℃孵育20min，每10min震荡一次。加4mL/管FACS洗液，4℃，400g，离心6min。倒掉上清，用吸水纸吸干管口，涡旋振荡器上震荡一次。加固定液，500μL/管，一滴滴加入，(点震)每次加入后间歇震动FACS管，于4℃固定一小时或者固定过夜。
固定液：Set3901(eBioscience，货号00-5523-00)中Fixation/Permeabilization Concentrate一份，Fixation/Permeabilization Diluent三份，1：3混合配置成固定液。
Permeabilization buffer1份+9份dd H 2O配制成穿核液，震荡混匀。2mL/管，4℃，500g，离心6min，倒掉上清，吸干管口。重复，加穿核液3mL/管。加Foxp3抗体(eBioscience，货号25-5773-82)，10μL/管，4℃，40min，每20min震荡一次。加4mL/管FACS洗液，4℃，500g，离心6min。倒掉上清，用吸水纸吸干管口，涡旋振荡器上震荡一次。加FACS洗液100μL/管，重悬上机。各组动物Treg(CD4 +CD25 +Foxp3 +)、CD4 +CD25 -Foxp3 -、CD3 +CD4 -T细胞占比均用平均值±标准差(Mean±SEM)表示，并用Graphpad Prism 5软件作图分析。
实验结果如图9A-图9C、图10A-10C所示，1mpk单次皮下给药，mut11.08-linker2-hFc显著提高小鼠脾脏及外周血Treg占比，CD4 +CD25 -Foxp3 -T细胞占比降低，CD3 +CD4 -T细胞变化不显著。mut11.08-linker2-hFc表现优于Fc-linker-IL2_V91K。
实施例13野生型小鼠DTH(delayed-type hypersensitivity)模型
致敏阶段3mg/mL KLH(Sigma，货号H7017-50mg)：IFA(Sigma，货号F5506-10mL)：CFA(Sigma，货号F5581-10mL)体积比为1：1：1，用连通管注射器法将抗原乳化，大约1h左右，可使抗原充分乳化形成粘稠的乳剂。每只小鼠100μL乳化剂，即注射100μg KLH。每只小鼠肩胛骨中间部位分两点皮下注射乳化的KLH，每点注射50μL。同时将WT IL-2-linker2-hFc(简称WT IL-2，参见SEQ ID NO：12)、Fc-linker-IL2_V91K、mut11.08-linker2-hFc蛋白给与皮下注射，剂量为1mpk，200μL/只鼠，每3天一次，作为WT IL-2组、Fc-linker-IL2_V91K组、mut11.08-linker-hFc组；将环孢菌素(Cyclosporin A，CsA,Sigma，货号F5581-10mL)给与腹腔注射，剂量为10mpk，200μL/只鼠，每天一次，作为CsA组；腹腔注射PBS，作为vehicle组。
致敏后第五天进行刺激。10mg/mL KLH用PBS 10倍稀释为1μg/μL，每只小鼠右耳皮内注射10μL，即注射10μg KLH，左耳皮内注射10μL PBS作为对照。
致敏前，螺旋测微器(0-25mm，精度0.001，购自南京苏测计量仪器有限公司)测量每只小鼠左右耳片厚度，做好记录。刺激前，螺旋测微器测量每只小鼠左右耳片厚度，作为本底值。刺激后，在24h、48h、72h、96h测定耳片厚度一次。各组动物体重及耳厚变化均用平均值±标准差(Mean±SEM)表示，并用Graphpad Prism 5软件作图分析。
实验结果如图11A所示，1mpk单次皮下给药，与vehicle组相比，WT IL-2给药组小鼠Δ耳厚没有明显变化，而mut11.08-linker2-hFc给药组小鼠Δ耳厚变小，表现出抑炎作用，且抑炎作用优于Fc-linker-IL2_V91K及CsA。如图11B所示，各组动物体重没有明显变化。
第二轮实验结果如图12A所示，Fc-linker-IL2_V91K 1mpk单次皮下给药，mut11.08-linker2-hFc使用0.04、0.2、1、5mpk四个剂量进行单次皮下给药。mut11.08-linker2-hFc的抑炎作用呈现剂量依赖；mut11.08-linker2-hFc 0.2mpk与Fc-linker-IL2_V91K 1mpk作用相当，该条件下体重均无异常；mut11.08-linker2-hFc 5mpk时小鼠体重出现波动及下降，其他组体重无异常，详见图12B。
实施例14 PBMC小鼠皮下给药的PD结果
采购NOG小鼠，雌性，11-12周龄，购自维通利华。在Day-1复苏PBMC并添加CD3(购自eBioscience，货号16-0037-85/2106800，终浓度为12.5ng/mL)和CD28(购自 eBioscience，货号16-0289-85/2073954，终浓度为25ng/mL)活化，置于37℃5％CO 2培养箱中过夜培养16h。在Day0收集PBMC(20×10 6个/鼠，400μL)尾静脉接种于NOG小鼠体内，然后根据体重随机分为对照组PBS，mut11.08-linker2-hFc组(0.3mpk，1mpk)，Fc-linker-IL2_V91K组(0.3mpk，1mpk)共5组，每组3只，并开始(Day0)颈部皮下注射药物，单次给药。在给药后Day3，安乐死小鼠取脾，用于流式检测，并记录数据。各组动物Treg(CD4 +CD25 +Foxp3 +)、Tcon(CD4 +CD25 -)、CD8 +T细胞的数目及变化倍数用Graphpad Prism 8软件作图分析。
实验结果如图13A-13B、图14A-14C所示，1mpk单次皮下给药，mut11.08-linker2-hFc在给药后3天表现出提高Treg/Tcon、Treg/CD8 +T比例，并且呈剂量依赖，提高占比优于Fc-linker-IL2_V91K。给药后3天除Treg数量显著变化外，Tcon有增加趋势但不显著，CD8 +T细胞数量没有显著变化。
实施例15 PBMC小鼠移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)模型
采购NOG小鼠，雌性，13-14周龄，购自维通利华。操作方式同实施例14，根据体重将NOG小鼠随机分为G1组(PBS，未接种活化的PBMC，3只)，G2组(PBS，10只)，G3组(按0.2mpk给药mut11.08-linker2-hFc，10只)，共3组，其中G2组和G3组参照实施例14接种活化的PBMC。开始(Day0)颈部皮下注射药物，单次给药。每周2次称重，待出现GVHD特征后开始评分【评分体系：体重减少(0分<10％，1分10％-20％，2分>20％，3分>30％)；贫血(0分 红色或粉红色的尾；1分 白色的尾)；姿势(0分 正常，1分 驼背)；一般活动(0分 正常，1分 受限)；脱毛(0分 无脱毛，1分 脱毛)和黄疸(0分 白色或红色的尾，1分 黄色的尾)；最大疾病严重程度或死亡对应于8分】并记录数据。注：1.如小鼠属于最大疾病严重程度评分其他症状将不评分；2.死亡小鼠死亡后一直评分到实验结束。
结果如图15A-15B所示，PBMC接种Day13后G2组体重下降，GVHD症状在该组提前发生；PBMC接种Day17后G3组体重下降，整体下降幅度不及G1，且发生时间较G2组晚，符合预期，mut11.08-linker2-hFc有效抑制小鼠发生GVHD。通过体重评估可见mut11.08-linker2-hFc在0.2mpk给药剂量无毒副作用，且表现出较好的抗GVHD能力。同时G3组动物死亡率和GVHD评分都低于G2组，有显著差异。
实施例16小鼠药代动力学
本实施例血药浓度检测方法如下所示：以1μg/mL hIL2R alpha(百普赛斯，货号ILA-H52H9-100μg)蛋白包被，在空白小鼠血清中以药物配制标准曲线，浓度范围为 500-3.90625ng/mL,同时配制高中低三个浓度的质控品，所有待测样品、标准品及质控品用稀释液稀释40倍后以100μL复孔入板(待测样品根据实际情况可进行额外稀释)，再加入10000倍稀释的检测抗体Peroxidase AffiniPure Mouse Anti-Human IgG,Fc fragment specific(Jackson，货号209-035-098)，最后加入100μL TMB显色液显色，50μL 1M硫酸终止读数。
野生型小鼠皮下给药，剂量为1mpk，检测小鼠血药浓度。两次结果如图16A-16B和表21-22所示，mut11.08-linker2-hFc暴露量均高于对照Fc-linker-IL2_V91K(4-6倍)，Tmax较Fc-linker-IL2_V91K延后。1mpk单次皮下给药，mut11.08-linker2-hFc暴露量高于mut11-linker2-hFc。
表21野生型小鼠单次皮下给药后的药代动力学参数
Mean T1/2(h) Tmax(h) Cmax(ng/mL) AUClast(h*ng/mL)
Fc-linker-IL2_V91K NA 6.00 1430.94 28208.77
mut11-linker2-hFc NA 12.00 1843.32 43254.14
mut11.08-linker2-hFc NA 24.00 4433.17 139652.97
表22野生型小鼠单次皮下给药后的药代动力学参数
Mean T1/2(h) Tmax(h) Cmax(ng/mL) AUClast(h*ng/mL)
Fc-linker-IL2_V91K NA 6.00 1628.30 42874.91
mut11.08-linker2-hFc 11.51 24.00 5391.62 177902.19
野生型小鼠静脉给药，剂量为1mpk，检测血药浓度。结果如图17和表23所示，mut11.08-linker2-hFc暴露量高于对照Fc-linker-IL2_V91K，但与皮下注射相比，差异变小(Cmax 3倍→1.3倍，AUC 4倍→2.4倍)。mut11.08-linker2-hFc暴露量高于mut11-linker2-hFc，但与皮下注射相比，差异变小(Cmax 2.4倍→1.2倍，AUC 3.2倍→1.6倍)。
因此，皮下给药mut11.08-linker2-hFc的生物利用度优于Fc-linker-IL2_V91K及mut11-linker2-hFc。稳定性突变提高药物的暴露量以及生物利用度。
表23野生型小鼠单次静脉给药后的药代动力学参数
Mean T1/2(h) Tmax(h) Cmax(ng/mL) AUClast(h*ng/mL)
Fc-linker-IL2_V91K 7.35 0.08 14518.61 92522.67
mut11-linker2-hFc 5.27 0.08 15450.84 138450.96
mut11.08-linker2-hFc 8.41 0.08 18761.22 217851.01
PBMC接种小鼠，方法如实施例14，皮下给药，剂量为1mpk，检测小鼠血药浓度。结果如图18和表24所示，PBMC小鼠中1mpk单次皮下给药，mut11.08-linker2-hFc的暴露量 具有明显优势，为Fc-linker-IL2_V91K暴露量的5-8倍，Tmax较Fc-linker-IL2_V91K延后。
表24 PBMC小鼠单次皮下给药后的药代动力学参数
Mean T1/2(h) Tmax(h) Cmax(ng/mL) AUClast(h*ng/mL)
Fc-linker-IL2_V91K 12.29 12.00 2338.82 99848.69
mut11.08-linker2-hFc 43.06 24.00 7405.26 546719.71
实施例17食蟹猴药代动力学及PD结果
本实施例食蟹猴血药浓度检测方法如下所示：1μg/mL包被hIL2R alpha蛋白(百普赛斯，货号ILA-H52H9-100μg)，在空白食蟹猴血清中以药物配制标准曲线，浓度范围为15-0.11718ng/mL,同时配制高中低三个浓度的质控品，所有待测样品、标准品及质控品用稀释液稀释5倍后以100μL复孔入板(待测样品根据实际情况可进行额外稀释)，后加入1000倍稀释的检测抗体Goat Anti-Human IgG,Monkey ads-BIOT(SoutherBiotech，货号2049-08)，再加入5000倍稀释的Streptavidin-HRP(Thermo，货号21126)，最后加入100μL TMB显色液显色，50μL1M硫酸终止读数。食蟹猴空白血清：上海禾开生物制药有限公司。
4只食蟹猴，按0.05mpk的剂量皮下给药IL-2，其中1只给药WT IL-2-linker2-hFc(简称WT IL-2，参见SEQ ID NO:12)，1只给药Fc-linker-IL2_V91K，2只给药mut11.08-linker2-hFc(分别简称为Mut11.08-1和Mut11.08-2)，并检测给药后的血药浓度。结果如图19和表25所示，0.05mpk剂量下，终末半衰期WT IL-2分子较长，Fc-linker-IL2_V91K和mut11.08-linker2-hFc近似。Cmax和AUC排序为mut11.08-linker2-hFc＞Fc-linker-IL2_V91K＞WT IL-2。
表25食蟹猴单次皮下给药后的药代动力学参数
mean T1/2(h) Tmax(h) Cmax(ng/mL) AUClast(h*ng/mL)
WT IL-2 204.97 4.00 57.70 1564.86
Fc-linker-IL2_V91K 13.20 24.00 125.07 4669.24
mut11.08-1 11.05 24.00 185.40 8165.21
mut11.08-2 11.80 24.00 355.50 15033.23
为检测mut11.08-linker2-hFc单次皮下给药对食蟹猴Treg细胞的扩增作用，共取4只食蟹猴。1只给药WT IL-2-linker2-hFc，1只给药Fc-linker-IL2_V91K，另外2只给药mut11.08-linker2-hFc。剂量为0.05mpk，一次皮下给药。在给药前以及给药后Day1、3、5、7、10、14取食蟹猴外周血。不同时间点取2mL食蟹猴血液，从中分离出PBMC并冻存。各时间点分别取一支冻存的PBMC，一同进行复苏检测。将复苏的PBMC用1mL染色液Staining Buffer(含2％FBS的DPBS缓冲液)重悬后，各取200μL转移至两块96孔V底板 中，标记为Panel 1和Panel2。两块板用DPBS洗一遍后，加入Live/Dead Fixable Near-IR染色(Thermo，货号L34976)20分钟。染色结束用Staining Buffer终止后，加入Human TruStain FcX(Biolegend，货号422302)孵育20分钟。随后两块板分别加入不同的荧光抗体混合液进行染色30min，Panel 1为BV605 Mouse Anti-Human CD3(BD，货号562994)、PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD4(BD，货号552838)、FITC Mouse Anti-Human CD8(Biolegend，货号301050)、BV421 Mouse Anti-Human CD25(Biolegend，货号302630)稀释至Brilliant stain buffer(BD，货号563794)，Panel 2为BV605 Mouse Anti-Human CD3、PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD4、FITC Mouse Anti-Human CD8、Brilliant Violet 421 anti-human CD16 (Biolegend，货号302038)稀释至Brilliant stain buffer。染色结束用Staining Buffer洗一遍后，用Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set试剂(eBioscience，货号00-5523-00)盒进行固定破膜。然后两块板分别加入不同的荧光抗体混合液进行染色45min，Panel 1为PE anti-human FOXP3(Biolegend，货号320208)和Ki67 Monoclonal Antibody APC(eBioscience，货号17-5698-82)稀释至Permeabilization Buffer，Panel 2为Ki67 Monoclonal Antibody APC稀释至Permeabilization Buffer。染色结束用Permeabilization Buffer洗一遍后，用400μL Staining Buffer将细胞重悬，用流式定量收取200μl样品进行检测。各组动物Treg、CD4+Foxp3-、CD8+T、NK细胞的数目及变化倍数用Graphpad Prism 9软件作图分析。
实验结果如图20A-20F所示，0.05mpk单次皮下给药，mut11.08-linker2-hFc显著提高食蟹猴外周血Treg数目及占比。根据Treg/CD4 +T比例，mut11.08-linker2-hFc具有Treg偏向性，且Treg占比约为Fc-linker-IL2_V91K的2倍。mut11.08-linker2-hFc对比Fc-linker-IL2_V91K对Treg的增殖能力更高(11.08vs Fc-linker-IL2_V91K＝79/55 vs 18)，Fc-linker-IL2_V91K优于WT(18 vs 9.5)。从Treg活化标志物分析，其中Ki67+Treg％不同分子给药后区分度不大。Treg活化标志Foxp3及CD25的表达量显著增加，与Treg增殖水平保持正相关。
实验结果如图21A-21F所示，0.05mpk单次皮下给药，Fc-linker-IL2_V91K给药后FoxP3 -CD4 +T变化倍数最大值在2倍左右，CD8 +T变化倍数最大值略高在4倍左右。mut11.08-linker2-hFc对FoxP3 -CD4 +T的扩增强于Fc-linker-IL2_V91K约2-3倍；对CD8 +T的扩增稍弱于或类似于Fc-linker-IL2_V91K，强于WT约1.5-2倍。Fc-linker-IL2_V91K给药后NK细胞数目变化不明显，mut11.08-linker2-hFc对NK的扩增水平类似于Fc-linker-IL2_V91K。

Claims (30)

  1. 一种IL-2突变体，其中，与野生型IL-2相比，所述IL-2突变体包括发生在Q13、L18、G27、Y31、A73、H79、P82、I89、N90、V91、V93、F117或R120的一个或多个突变。
  2. 根据权利要求1所述的IL-2突变体，其中，所述IL-2突变体包括Q13L、L18I、G27W、Y31V、A73L、H79Q、P82L、I89L、N90Y、V91A、V93I、F117W或R120F的一个或多个突变。
  3. 根据权利要求1所述的IL-2突变体，其中，所述IL-2突变体包括(a)-(h)组中至少一组突变：
    (a)、Y31/A73/H79突变；优选地，Y31V/A73L/H79Q突变；
    (b)、Q13突变；优选地，Q13L突变；
    (c)、R120突变，优选地，R120F突变；
    (d)、L18/V91/F117突变；优选地，L18I/V91A/F117W突变；
    (e)、L18/I89/V93突变；优选地，L18I/I89L/V93I突变；
    (f)、G27/R120突变；优选地，G27W/R120F突变；
    (g)、P82/R120突变；优选地，P82L/R120F突变；
    (h)、N90/R120突变；优选地，N90Y/R120F突变。
  4. 根据权利要求3所述的IL-2突变体，其中，所述IL-2突变体具有如SEQ ID NO：2-9任一项所示氨基酸序列。
  5. 根据权利要求1-4任一项所述的IL-2突变体，其中，所述IL-2突变体的Tm值高于野生型IL-2。
  6. 根据权利要求1-3、5任一项所述的IL-2突变体，其中，所述IL-2突变体还包括选自下组的一个或多个突变：H16、D20、N88、V91或Q126突变，例如H16E突变，D20A、D20H或D20Y突变，N88A、N88I、N88G、N88R或N88D突变，V91R或V91K突变，Q126L或Q126F突变；
    优选地，所述IL-2突变体还包括选自(ⅰ)-(ⅳ)中至少一组的突变：
    (ⅰ)、H16突变，优选H16E突变；
    (ⅱ)、D20突变，优选D20A突变；
    (ⅲ)、V91突变，优选V91R突变；
    (ⅳ)、H16/V91突变，优选H16E/V91R突变。
  7. 根据权利要求6所述的IL-2突变体，其中，所述IL-2突变体包括(a)-(n)组中至少一组突变：
    (a)、H16/Y31/A73/H79突变；优选为H16E/Y31V/A73L/H79Q突变；
    (b)、H16/R120突变；优选H16E/R120F突变；
    (c)、H16/L18/V91/F117突变；优选H16E/L18I/V91A/F117W突变；
    (d)、H16/L18/I89/V93突变；优选H16E/L18I/I89L/V93I突变；
    (e)、H16/G27/R120突变；优选H16E/G27W/R120F突变；
    (f)、H16/P82/R120突变；优选H16E/P82L/R120F突变；
    (g)、D20/Y31/A73/H79突变；优选D20A/Y31V/A73L/H79Q突变；
    (h)、D20/R120突变；优选D20A/R120F突变；
    (i)、V91/Y31/A73/H79突变；优选V91R/Y31V/A73L/H79Q突变；
    (j)、V91/Q13突变；优选V91R/Q13L突变；
    (k)、V91/R120突变；优选V91R/R120F突变；
    (l)、V91/L18/I89/V93突变；优选V91R/L18I/I89L/V93I突变；
    (m)、H16/V91/Y31/A73/H79突变；优选H16E/V91R/Y31V/A73L/H79Q突变；
    (n)、H16/V91/L18/I89/V93突变；优选H16E/V91R/L18I/I89L/V93I突变。
  8. 根据权利要求7所述的IL-2突变体，其中，所述IL-2突变体具有如SEQ ID NO：22-27、29-30、32-35或37-38所示的氨基酸序列。
  9. 根据权利要求1-3、5任一项所述的IL-2突变体，其中，所述IL-2突变体还包括选自下组的一个或多个突变：F42、Y45或L72的突变；优选F42A、Y45A或L72G突变。
  10. 一种IL-2突变体，其中，与野生型IL-2相比，所述IL-2突变体包括发生在H16、D20或V91中的一个或多个突变；优选地，所述IL-2突变体包括选自下组的突变：
    (ⅰ)、H16突变，优选H16E突变；
    (ⅱ)、D20突变，优选D20A突变；
    (ⅲ)、V91突变，优选V91R突变；
    (ⅳ)、H16/V91突变，优选H16E/V91R突变。
  11. 根据权利要求10所述的IL-2突变体，其中，所述IL-2突变体具有如SEQ ID NO：21、28、31或36所示的氨基酸序列。
  12. 根据权利要求1-3、5-7、9-10任一项所述的IL-2突变体，其中，所述IL-2突变体还包括选自下组的一个或多个突变：N26、N29、N30、N71、Q11、L132、L70、P82、G27或F28突变；
    优选地，所述IL-2突变体还包括选自下组的一个或多个突变：N26Q、N29S、N30S、N71Q、Q11C、L132C、L70C、P82C、G27C或F78C突变；
    更优选地，所述IL-2突变体还包括(a)-(g)组中的至少一组突变:
    (a)、N26Q突变；
    (b)、N29S突变；
    (c)、N30S突变；
    (d)、N71Q突变；
    (e)、Q11C/L132C突变；
    (f)、L70C/P82C突变；
    (g)、G27C/F78C突变。
  13. 根据权利要求6-8、10-12任一项所述的IL-2突变体，其中，与野生型IL-2相比，所述突变体与IL-2Rβγ亚基复合物的结合能力下降；优选地，结合力 IL-2Rβγ亚基复合物/结合力 IL-2αβγ 亚基复合物下降。
  14. 根据权利要求13所述的IL-2突变体，其中，与野生型IL-2相比，所述突变体对非调节性T细胞或NK(自然杀伤)细胞的刺激能力下降，所述刺激可选自：胞内STAT5磷酸化或细胞增殖；
    或者，与非调节性T细胞或NK(自然杀伤)细胞相比，所述突变体优先刺激外周血或T细胞群体中的调节性T细胞(Treg)；所述优先刺激可选自：刺激调节性T细胞内STAT5磷 酸化、刺激调节性T细胞增殖、提高调节性T细胞与非调节性T细胞的比率，或提高调节性T细胞与NK细胞的比率。
  15. 根据权利要求1-14任一项所述的突变体，其中，所述突变包括缺失、插入或替换，优选为替换。
  16. 根据权利要求1-15任一项所述的突变体，其中，所述野生型IL-2具有如SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
  17. 一种融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括第一多肽和第二多肽，其中，所述第一多肽为权利要求1-16任一项所述的IL-2突变体，所述第二多肽为非IL-2多肽。
  18. 根据权利要求17所述的融合蛋白，其中，所述第二多肽为Fc、肿瘤抗原结合分子或IL-2受体亚基；
    可选地，所述Fc为人IgG Fc，例如人IgG1 Fc；
    优选地，所述人IgG1 Fc包括选自(a)-(i)组中的至少一组突变：
    (a)、C220S；
    (b)、N297G；
    (c)、C220S和N297G；
    (d)、A327Q；
    (e)、L234A和L235A；
    (f)、A287C和L306C；
    (g)、A259C和V302C；
    (h)、R292C和V306C；
    (i)、V323C和I332C；
    更优选地，所述人Ig G1 Fc具有如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；
    可选地，所述肿瘤抗原包括：EDB-FN(extra domain of fibronectin)、Muc1、p53、FAP、GD2、EpCAM、tenascin-C、CD20、CEA、MAdCAM-1或WT1(Wilms tumor protein1)；可选地，所述肿瘤抗原结合分子为抗体，例如scFv，sdFv、Fab、Fab’、F(ab’) 2或Fv；
    可选地，所述IL-2受体亚基为IL-2受体α亚基。
  19. 根据权利要求17-18任一项所述的融合蛋白，其中，所述第一多肽的C端通过或不通过连接肽与所述第二多肽的N端连接；或所述第一多肽的N端通过或不通过连接肽与所述第二多肽的C端连接；
    所述连接肽优选选自：(G 4S) n、(GGNGT) n或(YGNGT) n，所述n选自1、2、3、4或5；
    更优选地，所述第一多肽的C端与所述第二多肽的N端通过连接肽(G 4S) 3连接。
  20. 根据权利要求17所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白包括SEQ ID NO：13-20或SEQ ID NO：39-56任一项所述的氨基酸序列。
  21. 一种缀合物，其中，所述缀合物包括权利要求1-16任一项所述突变体或权利要求17-20任一项所述融合蛋白，还包括缀合至所述突变体或融合蛋白的稳定剂、药物或者示踪分子，其中所述稳定剂可选自聚乙二醇，例如单甲氧基聚乙二醇。
  22. 一种分离的核酸片段，其中，所述核酸片段编码权利要求1-16任一项所述突变体或权利要求17-20任一项所述融合蛋白。
  23. 一种载体，其中，所述载体包括权利要求22所述核酸片段。
  24. 一种宿主细胞，其中，所述宿主细胞包含权利要求23所述载体；可选地，所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞；所述原核细胞或真核细胞可选自大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞可选自CHO细胞系或HEK293细胞系。
  25. 一种制备权利要求1-16任一项所述突变体或权利要求17-20任一项所述融合蛋白的方法，其中，所述方法包括培养权利要求24所述宿主细胞，以及分离所述宿主细胞表达的IL-2突变体或融合蛋白。
  26. 根据权利要求25所述方法制备而成的IL-2突变体或融合蛋白。
  27. 一种药物组合物，其中，所述药物组合物包括权利要求1-16任一项所述突变体、权利要求17-20任一项所述融合蛋白、权利要求21所述缀合物、权利要求22所述核酸片段、权利要求23所述载体、权利要求24所述宿主细胞或权利要求26所述突变体或融合蛋白；以及药学上可接受的运载体、稀释剂或助剂；
    优选地，所述药物组合物为可注射药物组合物，例如静脉注射药物组合物或皮下注射药物组合物；更优选地，每剂所述药物组合物包含能够给与受试者有效量的融合蛋白；最优选地，所述有效量为0.001-10mpk，例如0.001mpk、0.002mpk、0.003mpk、0.004mpk、0.005mpk、0.006mpk、0.007mpk、0.008mpk、0.009mpk、0.01mpk、0.02mpk、0.03mpk、0.04mpk、0.05mpk、0.06mpk、0.07mpk、0.08mpk、0.09mpk、0.1mpk、0.2mpk、0.3mpk、0.4mpk、0.5mpk、0.6mpk、 0.7mpk、0.8mpk、0.9mpk、1mpk、2mpk、3mpk、4mpk、5mpk、6mpk、7mpk、8mpk、9mpk或10mpk。
  28. 权利要求1-16任一项所述突变体、权利要求17-20任一项所述融合蛋白、权利要求21所述的缀合物、权利要求22所述核酸片段、权利要求23所述载体、权利要求24所述宿主细胞或权利要求26所述突变体或融合蛋白在制备药物中的用途；
    优选地，所述药物为注射药物，例如静脉注射药物或皮下注射药物；
    优选地，每剂所述药物包含能够给与受试者有效量的融合蛋白；最优选地，所述有效量为0.001-10mpk，例如0.001mpk、0.002mpk、0.003mpk、0.004mpk、0.005mpk、0.006mpk、0.007mpk、0.008mpk、0.009mpk、0.01mpk、0.02mpk、0.03mpk、0.04mpk、0.05mpk、0.06mpk、0.07mpk、0.08mpk、0.09mpk、0.1mpk、0.2mpk、0.3mpk、0.4mpk、0.5mpk、0.6mpk、0.7mpk、0.8mpk、0.9mpk、1mpk、2mpk、3mpk、4mpk、5mpk、6mpk、7mpk、8mpk、9mpk或10mpk；
    优选地，所述药物用于治疗自身免疫性疾病，或增生性疾病，或病毒感染；
    更优选地，所述自身免疫性疾病包括类风湿关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、皮肤红斑狼疮、狼疮性肾炎、IgA肾病、干燥综合征、多肌炎、皮肌炎、硬皮病、银屑病、斑块状银屑病、斑秃、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、自身免疫肝炎、I型糖尿病、自身免疫性血管炎、湿疹或哮喘；
    更优选地，所述增生性疾病包括赘生物、实体瘤、血液瘤、恶性腹水或恶性胸水；其中，所述实体瘤可为良性或恶性，原发性或转移性，所述恶性实体瘤可为癌或肉瘤，例如，上皮细胞癌、内皮细胞癌、鳞状细胞癌、畸胎瘤、肺部肿瘤、乳头瘤病毒引起的癌、腺癌、癌肿、黑色素瘤、血管肉瘤、神经母细胞瘤、转移性肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、Merkel细胞癌、卵巢癌、肾细胞癌、转移性肾癌、头颈癌、膀胱癌、非肌层浸润性膀胱癌；所述血液瘤可选自白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤，例如B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病。
    更优选地，所述病毒感染选自HIV感染、新型冠状病毒感染或HPV病毒感染。
  29. 一种治疗自身免疫性疾病，或增生性疾病，或病毒感染的方法，其中，所述方法包括向受试者施用有效量的权利要求1-16任一项所述的IL-2突变体或权利要求17-20任一项所述的融合蛋白，或权利要求21所述的缀合物，或权利要求22所述的核酸片段，或权利要求23所述的载体，或权利要求24所述的宿主细胞，或权利要求26所述突变体或融合蛋白，或权利要求27所述的药物组合物；
    优选地，施用方式为注射，例如静脉注射或者皮下注射；
    优选地，所述有效量为0.001-10mpk，例如0.001mpk、0.002mpk、0.003mpk、0.004mpk、0.005mpk、0.006mpk、0.007mpk、0.008mpk、0.009mpk、0.01mpk、0.02mpk、0.03mpk、0.04mpk、0.05mpk、0.06mpk、0.07mpk、0.08mpk、0.09mpk、0.1mpk、0.2mpk、0.3mpk、0.4mpk、0.5mpk、0.6mpk、0.7mpk、0.8mpk、0.9mpk、1mpk、2mpk、3mpk、4mpk、5mpk、6mpk、7mpk、8mpk、9mpk或10mpk；
    优选地，所述自身免疫性疾病自身免疫性疾病包括类风湿关节炎、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、皮肤红斑狼疮、狼疮性肾炎、IgA肾病、干燥综合征、多肌炎、皮肌炎、硬皮病、银屑病、斑块状银屑病、斑秃、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、自身免疫肝炎、I型糖尿病、自身免疫性血管炎、湿疹或哮喘；
    优选地，所述增生性疾病包括赘生物、实体瘤、血液瘤、恶性腹水或恶性胸水；其中，所述实体瘤可为良性或恶性，原发性或转移性，恶性实体瘤可为癌或肉瘤，例如，上皮细胞癌、内皮细胞癌、鳞状细胞癌、畸胎瘤、肺部肿瘤、乳头瘤病毒引起的癌、腺癌、癌肿、黑色素瘤、血管肉瘤、神经母细胞瘤、转移性肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、Merkel细胞癌、卵巢癌、肾细胞癌、转移性肾癌、头颈癌、膀胱癌、非肌层浸润性膀胱癌；所述血液瘤可选自白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤，例如B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病。
  30. 一种优先刺激T细胞群体或外周血中调节性T细胞的方法，其中，所述方法包括将所述T细胞群体或外周血与权利要求1-16任一项所述的IL-2突变体或权利要求17-20任一项所述的融合蛋白，或权利要求21所述的缀合物，或权利要求22所述的核酸片段，或权利要求23所述的载体，或权利要求24所述的宿主细胞，或权利要求26所述突变体或融合蛋白，或权利要求27所述的药物组合物接触；优选地，所述优先刺激包括：
    (a)与非调节性T细胞或NK细胞相比，优先刺激调节性T细胞的STAT5磷酸化；
    (b)与非调节性T细胞或NK细胞相比，优先刺激调节性T细胞增殖；
    和/或(c)提高调节性T细胞与非调节性T细胞的比率，或提高调节性T细胞与NK细胞的比率。
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