CN103911387A - 含鼠lgG2a Fc标签的真核表达载体及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含鼠lgG2a Fc标签的真核表达载体及其构建方法，构建方法为：将mIgG-Fc序列和pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌，筛选得到重组载体mIgG-Fc-pMD18-T；将重组载体mIgG-Fc-pMD18-T和pcDNA3.1+质粒分别用Not I和Xba I进行双酶切，将分离纯化后的酶切产物进行连接，转化大肠杆菌，筛选获得含鼠lgG2a Fc标签的真核表达载体。该载体可以在哺乳动物细胞中表达目的蛋白，并通过小鼠IgG Fc作为标签，用抗小鼠IgG Fc的抗体即可检测，表达的蛋白液可以用ProteinA或Protein G的亲和柱纯化，以用于后续蛋白质活性的鉴定。

Description

含鼠lgG2a Fc标签的真核表达载体及其构建方法

技术领域

本发明属于载体构建领域，具体地说，本发明涉及一种含鼠lgG2a Fc标签的真核表达载体及其构建方法。 

背景技术

通过基因重组技术生产有价值的外源性蛋白质是当今生物技术研究与开发的热点之一。微生物、植物、动物都可以作为蛋白质的表达系统，但由于每一类表达系统都有其自身的特点和适用范围，并且不同的目的蛋白结构不同，并受其产率和蛋白的可溶性、稳定性、分子量大小的制约，因此如何选择高效的表达系统就显得尤为重要。 

大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早、目前应用最广泛的经典表达系统，是分子生物学产业化发展的重要工具。此系统具有遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化、稳定性好、抗污染能力强以及适用范围广等优点；但同时该表达系统也有明显的缺陷，如表达产物(蛋白质)缺少翻译后修饰，高表达时易折叠错误导致表达产物没有活性，而且大肠杆菌本身含有内毒素和有毒蛋白，可能混杂在终产物里，导致在医药方面的使用受到局限。许多真核蛋白的表达过程还需要有翻译后修饰，如单链修剪、糖基化、磷酸化和酰基化等，E.coli表达重组蛋白易于形成包涵体，限制了有活性产物的产量。 

毕赤酵母是近年来流行的原核和真核蛋白质的表达载体。它具有表达率高、遗传稳定、产物可分泌、发酵工艺成熟等优点。毕赤酵母能使外源真核基因正 确翻译和翻译后加工，并能对许多蛋白质产物进行分泌，有利于蛋白的分离纯化，能适应工业化生产的需要，易培养、繁殖快，遗传背景清楚，便于进行遗传操作；而且酵母毒性比细菌小，安全可靠，已长期广泛应用于酿酒和食品工业，因此酵母作为基因表达系统特别是在大分子真核生物基因研究方面得到日益广泛的应用。但是，由于通过酵母表达系统表达的外源蛋白质可能形成聚合体而影响表达效率，其信号肽加工不完全或蛋白质的内部降解等，可造成表达产物的差异，产生极不均一的现象，为表达产物纯化和工业化生产带来了困难。 

昆虫表达系统是一类应用广泛的真核表达系统，它具有同大多数高等真核生物相似的翻译后修饰加工以及转移外源蛋白的能力。利用双链DNA病毒感染昆虫作为宿主，因为缺少脂多糖(为毒性物质)，可分泌大量蛋白质到培养基中，使得后续的纯化更容易，可应用于抗生素和胞外水解酶的生产。但昆虫表达系统受到诸多因素的限制和影响，如培养基质量、供氧情况、保证对数生长等；此系统的主要缺点是外源蛋白表达处于极晚期病毒启动子的调控之下，而这时由于病毒感染，细胞开始死亡。解决办法是适当的启动子调控下的基因稳定转化。另一类新型的昆虫表达系统是建立在对果蝇等昆虫细胞进行稳定转化的基础上的，在稳定和表达效率方面有更为突出的优点。 

植物能够表达来自动物、细菌、病毒以及植物本身的蛋白质，易于大规模培养和生产，且在基因表达与修饰及安全性方面有特别的优势，因此利用植物生产外源蛋白质的研究展现了极其诱人的前景。人类有悠久的植物栽培史，在栽培、繁育、开发植物资源方面已形成较为完备的理论与技术体系。这一系统仅需要适宜的植物及其生长条件，省却了昂贵的发酵设备及厂房投资，免去了培养基和能源的消耗，可以实现低投入与高产出。利用组织特异性、诱导性调控元件、信号肽序列可以使此系统有更好的灵活性与实用性。 

哺乳动物细胞表达重组蛋白质的特点是表达产物不需要再折叠，合成是连续的，可完成翻译后修饰。由CHO(Chinese hamster ovary中国仓鼠卵巢细胞)分泌的蛋白质无需折叠，缺点是表达水平低或产物不稳定。外源基因在哺乳动物中的表达可分为：①病毒介导的表达，②外源基因在哺乳动物中的瞬时表达，③外源基因在哺乳动物中的稳定表达，④转基因动物，⑤核酸免疫等。表达载体的选择取决于：①外源基因导入的方法，②mRNA表达及蛋白质合成的调控元件。在选择稳定序列表达之前先进行瞬时表达研究，以鉴定整个系统是否适合外源蛋白的表达。基因工程嵌合抗体通常用COS细胞进行瞬时表达，病毒感染的中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)细胞系通常也用于蛋白的瞬时表达。采用异源启动子、增强子和可扩增的遗传标记，可提高蛋白产量。此系统在蛋白的起始信号、加工、分泌、糖基化方面具有独特优势，因此适合表达完整的大分子蛋白，但哺乳动物表达系统构成复杂、操作技术要求高、表达产量不大、产率低，且有时会导致病毒感染。 

哺乳动物表达系统在蛋白的起始信号、加工、分泌、糖基化方面具有独特优势，因此适合表达完整的大分子蛋白。目前常用的表达载体有pcDNA3.1+/-、pCE4、pCMV/Zeo、pCMV/myc/ER等。Invitrogen公司的pcDNA3.1+为最常见的真核表达载体之一，可在真核细胞中高水平的稳定表达目标蛋白。该载体具有Ampicillin、Neomycin的抗性，可同过抗生素筛选阳性克隆。但由于这个载体不具有鉴定的标签，表达的蛋白需要购买相应的特异性抗体用于检测，因此，给使用带来一定的不便。 

发明内容

基于此，本发明提供了一种含有鼠lgG2a的Fc标签的真核表达载体的构建 万法。 

一种含有鼠lgG2a Fc标签的真核表达载体的构建方法，包括以下步骤： 

(1)将mIgG-Fc序列和pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌，筛选得到重组载体mIgG-Fc-pMD 18-T； 

(2)将重组载体mIgG-Fc-pMD18-T和pcDNA3.1+质粒分别用Not I和Xba I进行双酶切，将分离纯化后的酶切产物进行连接，转化大肠杆菌，筛选获得含鼠lgG2a Fc标签的真核表达载体mIgG-Fc-pcDNA3.1+。 

在其中一个实施例中，所述mIgG-Fc序列是通过以下步骤制备得到的： 

(a)以小鼠脾脏总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链； 

(b)以cDNA第一链为模板，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2为扩增引物，进行梯度PCR扩增，纯化，得到mIgG-Fc序列；其中鼠lgG2a的Fc段基因的引物是根据GenBank：AB097847.1序列设计得到的，上游引物为：GAATGCGGCCGCATGCAGTCCATCACCTGCAATGTGG(SEQ ID NO：1)，含有Not I酶切位点；下游引物为：TGCTCTAGATTATTTACCCGGAGTCCGGGAGAAG(SEQ ID NO：2)，含有Xba I酶切位点和终止密码子。 

在其中一个实施例中，步骤(b)中所述梯度PCR扩增的反应体系为： 

反应程序为：95℃预变性2min，95℃变性30s，50-60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸10min。 

在其中一个实施例中，所述大肠杆菌为大肠杆菌DH5α。 

本发明还提供了上述构建方法构建得到的含有鼠lgG2a Fc标签的真核表达载体。 

本发明的重组载体是通过从小鼠脾细胞中克隆鼠lgG2a抗体的Fc段基因，该Fc段基因序列含有终止密码子，再将Fc段基因插入真核表达载体pcDNA3.1+的Not I和Xba I酶切位点处而构建得到的。该载体可以在哺乳动物细胞中表达目的蛋白，并通过小鼠IgG Fc作为标签，用抗小鼠IgG Fc的抗体即可检测，表达的蛋白液可以用ProteinA或Protein G的亲和柱纯化，以用于后续蛋白质活性的鉴定。 

附图说明

图1为本发明实施例1中梯度PCR扩增得到的目的产物mIgG-Fc片段的琼脂糖凝胶电泳鉴定图谱； 

图2为本发明实施例1中重组载体mIgG-Fc-pMD18-T进行双酶切后的琼脂糖凝胶电泳鉴定图谱； 

图3为本发明实施例1中构建的目的载体mIgG-Fc-pcDNA3.1+的阳性菌落进行PCR后的琼脂糖凝胶电泳鉴定图谱。 

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细 说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。 

实施例1含鼠lgG2a的Fc标签的真核表达载体的构建方法 

包括以下步骤： 

(1)合成cDNA

提取小鼠脾脏总RNA，以总RNA为模板，反转录合成cDNA；其中小鼠脾脏总RNA的提取方法如下： 

a通过眼球放血和颈椎脱臼法将Balb/c小鼠处死，剖开腹腔取出小鼠脾脏；将脾脏置于干净的放有一层尼龙网的培养皿上，用10ml玻璃注射器的针筒轻轻碾压脾脏，形成细胞悬液，转移至干净的离心管中，加入ACK红细胞裂解液(配方为：8.29g NH₄Cl，1g KH₂CO₃，37.2mg Na₂EDTA，加800ml水，调pH至7.2-7.4，定容至1L)使红细胞完全裂解，1500rpm离心10min；轻轻倒去上清，加入10mlPBS洗2次； 

b通过台盼蓝进行细胞计数，按5-10×10⁶个细胞加入1ml的Trizol(Invitrogen)的比例加入相应体积的Trizol，直接在培养皿中用枪吹打细胞数次使细胞裂解，将混合液转入一支洁净的无RNA酶的离心管中；室温静置5min使核蛋白复合物完全裂解，每1ml的Trizol加入0.2ml的氯仿，小心盖好离心管盖，剧烈涡旋振荡15s，室温静置2～3min，4℃，12000×g离心15min，将离心管小心倾斜45°，小心将上层水相溶液转移到另一小离心管中，加入与上层水相等体积的异丙醇，混匀，室温静置10min，4℃，12000×g离心10min。 弃上清，每1m的Trizol加入1ml的80％乙醇，短暂涡旋样品，然后4℃，7500×g离心5min，弃洗出液，在洁净环境中放置5～10min使RNA沉淀干燥。用适量DEPC水溶解RNA沉淀。通过M-MLV反转录试剂盒(Invitrogen)将mRNA反转录成cDNA。 

(2)设计引物

根据GenBank：AB097847.1序列设计鼠lgG2a的Fc段基因的引物，其中上游引物为：GAATGCGGCCGCATGCAGTCCATCACCTGCAATGTGG(SEQ IDNO：1)，含有Not I酶切位点；下游引物为：TGCTCTAGATTATTTACCCGGAGTCCGGGAGAAG(SEQ ID NO：2)，含有Xba I酶切位点和终止密码子； 

(3)扩增mIgG-Fc序列

以步骤(1)的cDNA第一链为模板，步骤(2)的引物为扩增引物，进行梯度PCR扩增，纯化，得到mIgG-Fc序列；梯度PCR的反应体系为： 

反应程序为：95℃预变性2min，95℃变性30s，50-60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸10min。 

图1为mIgG-Fc基因片段的PCR扩增图谱，从图1可以看出，第1-10泳道 在800bp左右具有明显条带，与目的片段大小(759bp)一致，表明成功扩增出了小鼠mIgG-Fc片段基因。 

(4)构建重组载体mIgG-Fc-pMD18-T

将PCR产物(mIgG-Fc片段)通过1％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯照射下切下目的条带，通过胶回收试剂盒回收PCR产物。回收的PCR产物按以下反应体系与pMD18-T simple vector(Takara)连接： 

16℃反应30min。将连接产物与100μl DH5α感受态混合，转化DH5α，通过氨苄平板筛选阳性克隆，挑取阳性克隆后在含氨苄抗性的LB培养基中培养，提取3个重组载体mIgG-Fc-pMD18-T，用Not I和Xba I进行双酶切鉴定，结果如图2所示，结果显示第1-3泳道在2700bp和800bp左右具有明显条带，与pMD18-T和mIgG-Fc的大小一致，表明mIgG-Fc成功构建到pMD18-T载体上。通过测序证明mIgG-Fc成功构建到pMD18-T simple vector，并且序列有100％同源性。mIgG-Fc-pMD18-T序列如SEQ ID NO：3所示。 

(5)构建重组载体mTgG-Fc-pcDNA3.1+

用NotI、XbaI同时酶切mIgG-Fc-pMD18-T质粒和pcDNA3.1+质粒，将目的片段胶回收后与具有相同粘性末端的pcDNA3.1+质粒连接，通过T4DNALigase连接后转化转化DH5α，通过氨苄平板筛选阳性克隆，挑取阳性克隆后在含氨苄抗性的LB培养基中培养，其中5个菌落的PCR鉴定结果如图3所示，结果显示第1-5泳道在800bp左右具有明显条带，与mIgG-Fc的大小一致，表 明mIgG-Fc成功构建到pcDNA3.1+载体上。测序结果表明其序列100％正确。重组载体mIgG-Fc-pcDNA3.1+的碱基序列如SEQ ID NO：4所示。 

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。 

序列表

 

Claims (5)

1.一种含鼠lgG2a Fc标签的真核表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将mIgG-Fc序列和pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌，筛选得到重组载体mIgG-Fc-pMD 18-T；

(2)将重组载体mIgG-Fc-pMD18-T和pcDNA3.1+质粒分别用Not I和Xba I进行双酶切，将分离纯化后的酶切产物进行连接，转化大肠杆菌，筛选获得含鼠lgG2a Fc标签的真核表达载体。

2.根据权利要求1所述的含鼠lgG2a Fc标签的真核表达载体的构建方法，其特征在于，所述mIgG-Fc序列是通过以下步骤制备得到的：

(a)以小鼠脾脏总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链；

(b)以cDNA第一链为模板，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2为扩增引物，进行梯度PCR扩增，纯化，得到mIgG-Fc序列。

3.根据权利要求2所述的含鼠lgG2a Fc标签的真核表达载体的构建方法，其特征在于，步骤(b)中所述梯度PCR扩增的反应体系为：

反应程序为：95℃预变性2min，95℃变性30s，50-60℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃延伸10min。

4.根据权利要求1-3任一项所述的含鼠lgG2a Fc标签的真核表达载体的构建方法，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌DH5α。

5.权利要求1-4任一项所述的的构建方法构建得到的含鼠lgG2a Fc标签的真核表达载体。