JPH05336960A - 抗原特異的ｔリンパ球反応の誘導 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 抗原に特異的なＴリンパ球反応を誘導する。 【構成】 Ｔリンパ球中で抗原に特異なＴリンパ反応の
誘導が行われ、抗原誘導Ｔ細胞免疫ＭＨＣ結合ペプチド
で中空のＭＨＣ分子を運搬して抗原が存在するビヒクル
を装荷してＴリンパ球を培養する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫学の分野に関し、
特に抗原に特異的なＴリンパ球反応を誘導する方法、そ
の方法によって得られる抗原に特異的なＴリンパ球、そ
れを含む薬剤組成物およびＴ細胞免疫ペプチドを確認す
る方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】抗原特異的Ｔリンパ球、特に、抗原特異
的細胞障害Ｔリンパ球（以下、ＣＴＬと記す）は、前述
の抗原に誘導されるウイルスやバクテリアなどに原因と
される病気に対して哺乳類、通常ヒトの保護のための薬
剤の組成物において、有用で有り得る。抗原特異的Ｔリ
ンパ球は、自己由来の抗原としての特異性を有するとき
にもまた有用で有り得る。自己由来の抗原のための特異
性とは、たとえば前述の自己由来の抗原の増加した条件
や、前述の自己由来の抗原の変位種の表現による通常の
細胞と異なる腫瘍細胞に対する治療性である。

【０００３】異種のあるいは自己由来の抗原のいずれか
から誘導され、抗原が存在している細胞の表面に位置す
る腫瘍組織複合性（ＭＨＣ）分子を結合することがで
き、またＴ細胞反応を誘導することができるぺプチド
は、予防接種をする目的あるいは治療目的のためのいず
れかの薬剤の組成物に効用を有することも有り得る。

【０００４】インビトロにて抗原特異性Ｔリンパ球反応
の開始は、通常免疫にされた動物や、ヒトからのリンパ
球集団を要求する。何故なら、未感作な（免疫を有して
いない）個体における抗原特異性Ｔ細胞の前駆体物質
が、非常に少ないからである。たとえばマウスにおい
て、全ての脾臓細胞のほぼ１／１０⁶あるいは脾臓のＴ
細胞の１／３×１０⁵が個体特異性ＣＴＬ前駆体である
（参照１）。したがって、インビトロにて抗原特異性Ｔ
細胞反応の誘導は、通常インビボにて抗原あるいは抗原
パルスされた（たとえばウイルスが伝染した）細胞と予
防接種を要求する。次に、インビトロにて再び刺激を与
えられる。インビボにて免疫性を与えることのための必
要を回避することが好ましい。特に、腫瘍が会合したペ
プチドとしてウイルスや、他の抗原に対してＣＴＬ反応
の世代のために好ましい。何故なら、それは予防接種の
ための必要条件なしに、ＣＴＬ反応を導くためのそれら
の能力のために与えられたＭＨＣクラスＩ、対立遺伝子
のための示された結合能力とともにペプチドの迅速な選
別を許すだろうからである。本発明は、ＣＴＬ反応誘導
を可能とするＭＨＣ結合ペプチドを同定するために、イ
ンビボで免疫を与えるために、必要を妨げていることを
狙っている。ＣＴＬ反応の開始は、ＣＤ８⁺ ＣＴＬ先駆
者細胞（参照２〜５）へＭＨＣクラスＩ分子の抗原が存
在している溝に存在している小さなペプチドの認識を要
求する。小さなペプチドとは、長さにおいて８−１１個
のアミノ酸である。通常、ＣＤ４⁺ Ｔヘルパ細胞は、最
適のＣＴＬ反応を要求される（参照６，７）。今までウ
イルスが誘導された抗原が存在している細胞（以下、Ａ
ＰＣと記す）や、ウイルスのペプチドが充填されたＡＰ
Ｃに対してインビトロでＣＴＬ反応誘導は、ウイルスに
感染されたまたはウイルスのペプチドが充填された樹板
状の細胞（ＤＣ）で唯一成功している（参照８）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】先に指摘したように今
までは、インビトロのＣＬＴ反応では、ウイルス誘導抗
原が存在する細胞ＡＰＣあるいは活性ペプチドを装荷し
たＡＰＣに対する誘導はウイルスに感染され、あるいは
活性ペプチドの装荷された突起細胞で成功するのであっ
た。我々は、ペプチドを装荷したいわゆる抗原を所有す
る血管細胞もまた同じ目的に使われることができること
を発見した。後者の方法論は、我々によって最初に文献
（９）で公開されたのだか、これが本特許出願の主題で
ある。

【０００６】本発明の最重要点は、欠損プロセシング細
胞が刺激信号のこのような増大に通じるので、非常に少
ない数の特異的なペプチドの確認に対し、今や基本的な
ペプチドに効果のある特異的なＣＴＬ反応が、ＣＴＬ前
駆物質から誘導されることが可能になったということで
ある。刺激信号が非常に増大する理由は、該修正ペプチ
ドを装荷した欠損プロセシング細胞上の効果のある特異
的なペプチド−ＭＨＣクラスＩの比重が大変増加するこ
とにある。これは我々の出版物（９）および実施例１な
らび２において述べられている。

【０００７】現在我々は、ペプチドに装荷したねずみの
ＲＭＡ−Ｓ細胞の有する欠損およびペプチドを装荷した
ヒトのＰ２細胞の有する欠損の両者に対する基本的ＣＴ
Ｌ反応を誘導されることができる。基本的ペプチドの特
異的なＣＴＬ反応を誘導することをペプチドを装荷した
欠損プロセシング細胞系で出来、その他の細胞系で出来
ない重要な理由は、前者は後者よりもペプチドを装荷し
たＭＨＣクラスＩ分子に関連性が多いことにある。ペプ
チドの非常に大きな濃度は、標的細胞の感作に必要とす
ることにより、基本的なＣＴＬ反応を開始することに必
要とされる。またＣＴＬ上のＴ細胞状態およびＣＤ８分
子は、適切なペプチドで満たされた同じＭＨＣ分子で相
互に作用し合わなければならないということが報告され
ている（参照１０，１１）。

【０００８】ペプチド誘導性の基本的ＣＴＬ反応の生物
学的関連性は、この観点からペプチド誘導性の基本的Ｃ
ＴＬが、能率的にウイルス感染細胞を攻撃することにつ
ながるということを示している。さらに、根本的ＣＴＬ
反応の誘導を可能にするペプチドの１つセンダイウイル
ス１６ｍｅｒペプチドＨＧＥＦＡＰＧＮＹＰＡＬＷＳＹ
Ａの接種は、ＣＴＬメモリを生体内に誘導する（参照１
２）。そうでなければ、致命的なセンダイウイルスに対
する防御と連動しない。ウイルスのペプチドに特異的な
ＣＴＬが、大きな腫瘍を撲滅することができるというこ
とを示している（参照１３，１４）。

【０００９】前に述べたネズミの変位種欠損ポゼシング
細胞系ＲＭＡ−Ｓは、親細胞系のＲＭＡと比べて温度３
７℃の細胞表面上のＨ−２Ｄ^bＫ^bＭＨＣクラスＩの重い
鎖およびβにミクログロブリンの総量が１０％低い値を
示す（参照１５，１６）。下げられた１９℃〜３３℃の
温度でのＲＭＡ−Ｓ細胞の培養によってＭＨＣクラスＩ
分子の細胞表面発現の重大なレベルが規定される。ＭＨ
ＣクラスＩ分子のうち、ほんの少しの部分は内生的に得
られるペプチドを含み、このＭＨＣ分子は中空である。
これらの中空ＭＨＣ分子は、ＭＨＣ結合ペプチドを加え
ることにより安定化されることができる。最近の証拠
は、結論的にＭＨＣクラスＩ分子に内生的ペプチドを装
荷することに失敗したのは、ＭＨＣクラスＩＩ領域内に
位置するゲインをエンコード化するペプチドポンプによ
ってＨＡＭにおける突然変位によるものであることを示
している。

【００１０】内生的ペプチドによる競争の欠如におい
て、中空ＭＨＣクラスＩ分子は選択された外生的ＭＨＣ
クラスＩ結合ペプチドで効率よく画一的に満たされるこ
とができる。ＭＨＣの安定化と連動した外生的ペプチド
の培養によって達成されるＭＨＣクラスＩの発現レベル
は、親細胞のＭＨＣクラスＩのレベルには決して達しな
い。しかしながら、抗原の位置について単一の免疫ペプ
チドの画一的な装荷によって保証されるものである。

【００１１】本発明の目的は、さらに便利で、再生産で
きるＴリンパ球反応を導くための方法を提供することで
あり、また特にインビトロにて免疫性を与えるために必
要のない、ＭＨＣクラスＩが結合されているペプチドに
対して基本的なＣＴＬ反応を導くための方法を提供する
ことである。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、Ｔリンパ球培
養において抗原誘導Ｔ細胞免疫腫瘍組織複合性（ＭＨ
Ｃ）結合ペプチドで中空のＭＨＣ分子を運搬して抗原を
与えるビヒクルを装荷するステップから成り、ペプチド
を装荷した抗原を与えるビヒクルの中で特異なＴリンパ
球反応を誘導する条件下で、Ｔリンパ球を培養し、随意
に培養物から抗原に特異なＴリンパ球を分離し、前記分
離されたＴリンパ球を培養することを特徴とする抗原に
特異的なＴリンパ球反応を誘導する方法である。

【００１３】また本発明は、前記抗原を与えるビヒクル
が抗原が有する欠損を持った抗原を与える細胞から成る
中空のＭＨＣ分子を運搬するものであることを特徴とす
る・また本発明は、前記抗原が存在する細胞が約２０℃
〜３７℃の温度でペプチドで装荷される抗原が有する欠
損を持つ細胞であることを特徴とする。

【００１４】また本発明は、Ｔリンパ球培養において抗
原誘導Ｔ細胞免疫ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドで中空の
ＭＨＣクラスＩ分子を運搬して抗原を与えるビヒクルを
装荷するステップから成り、ペプチドを装荷した抗原を
与えるビヒクル中で特異な細胞傷害Ｔリンパ球（ＣＴ
Ｌ）反応を誘導する条件下でＣＤ８⁺Ｔ細胞前駆物質で
できるＴリンパ球を培養し、随意に培養物から抗原に特
異なＣＴＬを分離し、前記分離されたＣＴＬを培養する
ことを特徴とする抗原に特異なＣＴＬを誘導する方法で
ある。

【００１５】また本発明は、前記抗原が存在するビヒク
ルが欠損プロセシング抗原を有する細胞であって抗原が
存在する構成の中空のＭＨＣ分子で運搬するものである
ことを特徴とする。

【００１６】また本発明は、前記抗原提示細胞がネズミ
のＲＭＡ−Ｓ細胞かヒトの１７４ＣＥＭ Ｔ２細胞であ
ることを特徴とする。

【００１７】また本発明は、前記抗原を与えるビヒクル
が中空のＭＨＣ分子に加えてＴ細胞反応の開始を促進す
る分子を運搬するものであることを特徴とする。

【００１８】また本発明は、前記抗原を与えるビヒクル
が約８〜１１個のアミノ酸を持った抗原誘導Ｔ細胞免疫
ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドで装荷された中空のＭＨＣ
クラスＩ分子を運搬するものであることを特徴とする。

【００１９】また本発明は、前記培養がペプチド装荷の
抗原を与えるビヒクルと前記ＣＴＬ反応開始培養を支持
する基質の存在下で運搬されるＣＤ８⁺Ｔ細胞を構成す
るＴリンパ球の特異なＣＴＬ反応誘導条件下で行われる
ことを特徴とする請求項４記載の抗原に特異なＣＴＬを
誘導する方法である。

【００２０】また本発明は、前記抗原に特異的ＣＴＬ反
応が未感染のＴリンパ球培養中で誘導される第１次ＣＴ
Ｌ反応であることを特徴とする。

【００２１】また本発明は、前記ＣＴＬ反応が前記Ｔ細
胞免疫ＭＨＣクラスＩ結合ペプチド由来の自己由来の抗
原に特異的であることを特徴とする。

【００２２】また本発明は、抗原誘導Ｔ細胞免疫ＭＨＣ
クラスＩＩ結合ペプチドで中空のＭＨＣクラスＩＩ分子
を運搬して抗原を与えるビヒクルを装荷するステップか
ら成り、ペプチドを装荷した抗原を与えるビヒクル中で
特異なヘルパーＴリンパ球反応を誘導する条件下でＣＤ
４⁺Ｔ細胞前駆物質でできるＴリンパ球を培養し、随意
に培養物から抗原に特異なヘルパーＴリンパ球を分離
し、前記分離されたヘルパーＴリンパ球を培養すること
を特徴とする抗原に特異なヘルパーＴリンパ球を誘導す
る方法である。

【００２３】また本発明は、前記抗原を与えるビヒクル
が約１０〜１８個のアミノ酸を持った抗原誘導Ｔ細胞免
疫ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドで装荷された中空のＭ
ＨＣクラスＩＩ分子を運搬するものであることを特徴と
する。

【００２４】また本発明は、抗体誘導Ｔ細胞免疫ＭＨＣ
結合ペプチドで中空のＭＨＣ分子を運搬して抗原を与え
るビヒクルを装荷するステップから成り、ペプチドを装
荷した抗原を与えるビヒクルの中で特異なＴリンパ球反
応を誘導する条件下で、Ｔリンパ球を培養し、随意に培
養物から抗原に特異なＴリンパ球を分離し、前記分離さ
れたＴリンパ球を培養し、抗原に特異的なＴリンパ球を
誘導することによって得られることを特徴とする抗原に
特異的なＴリンパ球である。

【００２５】また本発明は、抗体誘導Ｔ細胞免疫ＭＨＣ
結合ペプチドで中空のＭＨＣ分子を運搬して抗原を与え
るビヒクルを装荷するステップから成り、ペプチドを装
荷した抗原を与えるビヒクルの中で特異なＴリンパ球反
応を誘導する条件下で、Ｔリンパ球を培養し、随意に培
養物から抗原に特異なＴリンパ球を分離し、前記分離さ
れたＴリンパ球を培養し、抗原に特異的なＴリンパ球を
誘導することによって得られる前記抗原に特異的なＴリ
ンパ球とその担体、賦形剤および賦活剤を含み、抗原に
特異な高い免疫効果を有することを特徴とする薬剤組成
物である。

【００２６】また本発明は、抗体誘導Ｔ細胞免疫ＭＨＣ
結合ペプチドで中空のＭＨＣ分子を運搬して抗原を与え
るビヒクルを装荷するステップから成り、ペプチドを装
荷した抗原を与えるビヒクルの中で特異的なＴリンパ球
反応を誘導する条件下で、Ｔリンパ球を培養する過程で
抗原に特異的なＴリンパ球反応を誘導することによって
得られる前記抗原誘導Ｔ細胞免疫ＭＨＣ結合ペプチドと
その担体、賦形剤および賦活剤を含む抗原に特異な高い
免疫効果を有することを特徴とする薬剤組成物である。

【００２７】また本発明は、候補ペプチドを合成するス
テップから成り、これらの候補ペプチド抗原を与えるビ
ヒクルによって運搬される中空のＭＨＣ分子に結合でき
るかテストし、ＭＨＣ結合ペプチドがＴリンパ球中でペ
プチドに特異的なＴリンパ球反応を誘導できるかテスト
することを特徴とするＴ細胞免疫ペプチドを確認する方
法である。

【００２８】また本発明は、前記抗原を与えるビヒクル
が欠損プロセシング抗原を有する細胞であって抗原が存
在し、中空のＭＨＣ分子を運搬するものであることを特
徴とする。

【００２９】また本発明は、前記抗原が存在する細胞が
ねずみのＲＭＡ−Ｓ細胞またはひとの１７４．ＣＥＭ
Ｔ２細胞から成る欠損プロセシング抗原を有することを
特徴とする。

【００３０】

【作用】本発明は、インビボにおける免疫の必要性のバ
イパスとなる、第１次ＭＨＣ結合性ペプチド特異的ＣＴ
Ｌ反応を引起こす方法論を提供する。

【００３１】その方法は、内因的ペプチドがＭＨＣクラ
スＩ分子に装荷することを排除するような欠損プロセシ
ング抗原による中空のＭＨＣクラスＩ分子を発現する抗
原提示性細胞の使用法に基づいている。結果として、こ
れらのＡＰＣは、特定のペプチドを結合する単一の外因
的ＭＨＣクラスＩを効果的に装荷し得る。ヒトのβ２−
マイクログロブリンの付加は、ＭＨＣ分子の装荷したペ
プチドの発現を増加し、第１次ＣＴＬ反応の誘導を改善
する。

【００３２】欠損プロセシングしないペプチド装荷親細
胞と対照的に、外因的ペプチド装荷性細胞は、第１次Ｃ
ＴＬ反応の誘導が可能である。本発明は、外因的ペプチ
ドで充満されたＭＨＣ分子を利用する。さらに効果的な
ペプチド提示の法則に基づく、非免疫性未感作の個体か
らの反応性リンパ球母集団を伴う第１次Ｔ細胞反応を誘
導する全ての方法論を含む。

【００３３】この方法論は、全体としてインビトロにお
いて進行し、異種のあるいは自己由来の双方のペプチド
に対してＴ細胞反応の誘導が可能であるところのペプチ
ド結合性ＭＨＣの同定を与える。

【００３４】１、第１次Ｔ細胞反応の誘導に好適な抗原
プロセシング欠損細胞系と、抗原提示ビヒクルを搬送す
る他の中空のＭＨＣ分子 本発明は、哺乳類の起源の欠損プロセシング細胞系を利
用する。これらの細胞系は、ＭＨＣクラスＩあるいはＭ
ＨＣクラスＩＩ分子の中にペプチド装荷が起こるところ
の副細胞区画の中へのペプチド輸送によって１つの細胞
遺伝子生成物に欠損を有する。欠損プロセシング細胞系
の原型は、ネズミ科の起源（参照１５，１８）のＲＭＡ
−Ｓと、ヒトの起源（参照２０）の１７４．ＣＥＭ Ｔ
２である。欠損プロセシングは、細胞表面のＭＨＣクラ
スＩあるいはクラスＩＩ分子の非常に大きな部分が内因
的にプロセシングされたペプチドを有しない限り、完全
である必要はない。１７４．ＣＥＭ Ｔ２細胞系は、た
とえば、欠損プロセシング（参照２１）を有するにも拘
わらず、小胞体の中に、明らかに細胞質から移動し得る
それの細胞表面ＭＨＣクラスＩ分子に結合した信号ペプ
チドを有する。同様に、ＲＭＡ−Ｓ細胞における欠損プ
ロセシング抗原は、完全でない（参照２３，２４）。そ
れにも拘わらず、両方の細胞系は、これらの親の片方と
対照的に、免疫原ペプチドに結合するＭＨＣクラスＩを
適切に装荷したとき第１次ＣＴＬ反応の誘導が可能であ
る。ＲＭＡ−Ｓの場合、欠損プロセシングはＭＨＣクラ
スＩＩ領域内に位置するＨＡＭ−２遺伝子に位置する。
感作されていないＨＡＭ−２遺伝子あるいはそのラット
アナログＭＴＰ−２のトランスフェクションは、内因的
ペプチド（参照１９，２４）のＲＭＡ−Ｓによるプロセ
シングを元に戻す。１７４．ＣＥＭ Ｔ２系は、ＨＬＡ
クラスＩＩ領域に大きな削除部分を有する結果としての
非常に類似した欠損プロセシングを有する。そしてこれ
は、蛋白質からの細胞質ペプチドの発生に含まれる可能
性を有するプロテアーゼエンコード領域と同様、ＨＡＭ
−１および２のヒトアナログを含む。

【００３５】発明の基本法則は、外因的、すなわち外部
から加えられた免疫原ペプチドを装荷し得る、そして抗
原提示のための高度に効果的なビヒクルとして作用し得
る中空のＭＨＣクラスＩあるいはクラスＩＩ分子の欠損
プロセシング細胞における発現である。故に、本発明
は、外因的ペプチドを装荷し得る中空のＭＨＣ分子を結
合させる全ての抗原提示脂質二重層搬送ビヒクルに拡張
される。これは、全ての動物、植物、昆虫、天然のもし
くは外来の中空ＭＨＣ分子を搬送する他の細胞、あるい
は、たとえば、中空ＭＨＣ分子を結合させるリポソーム
のような中空ＭＨＣ分子を搬送する人工の脂質二重層シ
ステムを含む。本発明は、ＣＤ４⁺Ｔ細胞前駆体に結合
したＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドの提示と
同様、ＣＤ８⁺Ｔ細胞前駆体に結合したＭＨＣクラスＩ
分子に結合するぺプチドの提示を含む。

【００３６】２、欠損プロセシング細胞系上における中
空ＭＨＣ分子の装荷と、外因的免疫原ペプチドを伴う抗
原提示ビヒクルを搬送する他の中空ＭＨＣ分子 欠損プロセシング細胞系と前記抗原提示ビヒクルを搬送
する中空ＭＨＣ分子は、非血清ビヒクル中での定義長
が、ＭＨＣクラスＩ装荷に対して８〜１１個のアミノ
酸；ＭＨＣクラスＩＩ装荷に対して約１０〜１８個のア
ミノ酸である外因的免疫原ペプチドを装荷する。ＭＨＣ
分子の急速な分解を防ぐため、ペプチド結合ＭＨＣとの
インキュベーションの間、温度を２０〜３０℃に下げて
もよい。ネズミ科欠損プロセシング細胞系ＲＭＡ−Ｓ上
のＭＨＣクラスＩ分子を装荷するペプチドの場合、ペプ
チド装荷中のこの温度低下は、細胞表面に（参照９）Ｍ
ＨＣクラスＩを装荷したペプチドの最適レベルを得るの
に有利である。ヒト細胞系１７４．ＣＥＭ Ｔ２の場
合、温度低下がＭＨＣクラスＩ分子に結合されたペプチ
ドのレベルを改善することはない。

【００３７】ヒトβ２−マイクロブロブリンの付加は、
ネズミ科ＲＭＡ−Ｓ細胞上とヒト１７４．ＣＥＭ Ｔ２
細胞上との両方に関して、ペプチド装荷ＭＨＣクラスＩ
の発現をさらに高める。以降の第１次ＣＴＬ反応の誘導
もまた高められる。

【００３８】一旦ペプチドがＭＨＣ分子に結合すると、
これらの分子は安定となる。この結果、独特の特定免疫
原ペプチドで充分に満たされて、ＭＨＣ分子の細胞表面
発現が増加する。

【００３９】ペプチド装荷細胞は、このとき３７℃の培
養においてＴリンパ球に対する抗原提示の準備が整う。
後の抗原提示を改善するために、欠損プロセシング細胞
系あるいは前記無細胞性抗原提示ビヒクルは、Ｔ細胞の
ＣＤ２８のための配位子であるＢ７分子のようなＴ細胞
上のＬＦＡ−１の配位子ＩＣＡＭ−１あるいはＩＣＡＭ
−２のような付属分子、あるいはＴ細胞反応の開始の効
果をさらに促進する何か他の分子のような、Ｔ細胞反応
開始のための相互刺激的信号として作用し得る付加分子
を装荷し得る。これらの相互刺激性分子の発現は、欠損
プロセシング細胞系におけるトランスフェクションによ
って、あるいは純粋化された付属分子の結合のような無
細胞性抗原提示ビヒクルにおける生化学的処理によって
得られる。

【００４０】３、ペプチドを装荷された欠損プロセシン
グ細胞系と、あるいは他のペプチドを装荷された抗原提
示ビヒクルと非感作個体からの反応リンパ球を伴う第１
次Ｔ細胞反応の誘導のための細胞培養 非免疫性個体からのリンパ球は、ペプチド装荷欠損プロ
セシング細胞系あるいは抗原提示ビヒクルを搬送する他
の中空のＭＨＣ分子とともに、３７℃で充分な時間、少
数の特異的抗原反応性前駆体細胞を増加させるために培
養される。一旦、Ｔ細胞反応が始まると培養は欠損プロ
セシングのない抗原提示細胞上のペプチドの存在を含む
種々の方法で再刺激を受ける。これは、またあるいは、
反応が特異的Ｔ細胞反応を計測するに充分な強さであれ
ば、培養は再刺激される必要はない。

【００４１】反応開始培養を保持するビヒクルは、無血
清であっても、血清含有であってもよい。また、エクス
トラサイトカインあるいは他の補足物を含んでいてもい
なくてもよい。

【００４２】４、Ｔ細胞反応を誘導可能なペプチドの発
生源 Ｔ細胞反応開始に使用されるペプチドは、たとえば、伝
染作用あるいは自己由来のペプチドの結果に由来する外
来ペプチドであり得る。外来ペプチドに対抗する反応開
始は、伝染作用に対抗する反応の標的ペプチドの同定に
重要である。自己由来のペプチドに対抗する反応開始
は、無ウイルス性に誘導される癌の免疫性根絶に基づい
て、Ｔ細胞に関する標的ペプチドの同定に重要であり、
自己免疫疾患に含まれるＴ細胞によって認識されるペプ
チドの同定に重要である。ペプチド装荷されたネズミ科
ＲＭＡ−Ｓ抗原提示細胞（参照９，実施例１）を用い
て、Ｔ細胞反応開始が免疫優性のペプチドに対して可能
であることを示した。また、ｐ５３の腫瘍抑制分子の自
己由来のペプチドに対抗するＴ細胞反応開始が、ｐ５３
のペプチド装荷１７４Ｐ．ＣＥＭ Ｔ２抗原提示細胞
（参照実施例２）に関して可能であることを証明した。

【００４３】

【実施例】

実施例１ プロセシング欠陥ＲＭＡ−Ｓ細胞の各表面におけるセン
ダイまたはアデノウイルスペプチドが装荷されたＴ^bお
よびＤ^b中空ＭＨＣクラスＩ分子に対する第１次ＣＴＬ
反応の誘導 本実施例の第１次ＣＴＬ反応誘導は、１９９１年１１月
２７日に発行されている（参照９）。本件特許出願に関
して、この刊行物に記載されていない事項を以下に述べ
る。

【００４４】材料と方法 １．マウス Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６，Ｈ−２^b）マウスを、我々の研
究所にて特異病原菌のない環境下で飼育した。エライサ
（ＥＬＩＳＡ）法にて、血清学的に試験を行った結果、
これら実験に使用されたマウスはセンダイウイルスを持
っておらず、またセンダイウイルスに感染したことがな
いことが明らかとなった。

【００４５】２．ペプチド メリフィールド（Merrifield）に従って（文献２５参
照）、バイオサーチ（ミリポア（Millipore），ベッド
フォード（Bedford），ＭＡ）９５００ペプチド合成機
を用いてペプチドを合成し、ＰＢＳ（リン酸緩衝溶液）
または無血清のアイスコフ（Iscove）改良形ダルベッコ
（Dulbecco）培地、（ＩＭＤＭ，フローラボラトリーズ
（Flow Laboratories），アイルビン（Irvine），スコ
ットランド）に溶解し、−２０℃で保存した。Ａｄ５
Ｅ１Ａペプチド（Ａ１６：アミノ酸（ａａ）配列２３２
〜２４７）は、Ｈ−２Ｄ^b制限ＣＴＬを得るためのアデ
ノウイルス５形の免疫優性ＣＴＬエピトープを包含し、
アデノウイルスＥ１誘導腫瘍（参照２６）を全滅させ得
るＣＴＬクローンにより認識されることが判った。ま
た、Ｈ−２Ｋ^b制限ＣＴＬ（参照１２）を得るために、
センダイウイルス核蛋白質の免疫優性ＣＴＬエピトープ
を含む合成ペプチド（Ｓ１６：アミノ酸配列３２１〜３
６６）を用いた。９アミノ酸（ａａ）のセンダイペプチ
ド（Ｓ９：アミノ酸配列３２４〜３３２）だけが、高い
親和性にてＭＨＣクラスＩ分子（文献４参照）に結合す
ることができる。このペプチドは、アミノ酸の数が９よ
りも大きい合成ペプチドを調整する際に、僅かに生成さ
れる副産物（minor species）としてもまた存在する
（参照４）。各ペプチドの単一文字コード配列は、Ｓ１
６がＨＧＥＦＡＰＧＮＹＰＡＬＷＳＹＡ、Ｓ９がＦＡＰ
ＧＮＹＰＡＬ、Ａ１６がＣＤＳＧＰＳＮＴＰＰＥＩＨＰ
ＶＶである。

【００４６】３．第１次ＣＴＬ反応の誘導 ＲＭＡ−ＳまたはＲＭＡ細胞を、２％のヒトプール血
清、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）、カナマイシン
（１００ μｇ／ｍｌ）、Ｓ（硫黄）および２−ＭＥ
（２−メルカプトエタノール，２×１０^-5Ｍ）が添加さ
れたＩＭＤＭ培地中にて、２２℃または３７℃で３６時
間予備培養を行った。細胞は、７５００ラド（ｒａｄ）
にて照射されるか、あるいはマイトマイシンＣにて処理
（無血清培地中５０μｇ／ｍｌ，２２℃にて２時間）さ
れ、３回洗浄され、続いてＡ１６、Ｓ１６またはＳ９の
合成ペプチドの存在下あるいは非存在下にて無血清のＩ
ＭＤＭ培地中２２℃で４時間インキュベーションを行っ
た。さらに洗浄を行わずに、これら（ペプチドが装荷さ
れた）ＲＭＡ−Ｓ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６ナイロンウー
ル通過脾臓細胞（Ｂ６ ＮＷＰ ＳＣ）に１：１（ｖ／
ｖ）で混合し、インキュベーションを行った。なお、イ
ンキュベーションは２４穴の培養プレートを用いて行わ
れ、各ウエル毎の培養培地１ｍｌには、４×１０⁶の免
疫応答細胞および１×１０⁶免疫刺激細胞が含まれてお
り、さらに培養培地には１０％のＦＣＳ、ペニシリン
（１００ ＩＵ／ｍｌ）、カナマイシン（１００ μｇ／
ｍｌ）および２−ＭＥ（２×１０^-5Ｍ）が添加されたＩ
ＭＤＭ培地を用いた。第１次ＣＴＬ反応のために、免疫
未感作のＣ５７ＢＬ／６マウスのＮＷＰ ＳＣを用い
た。

【００４７】４．ペプチド特異的ＣＴＬクローンの発生 上記の第３項目にて述べたように、第１次センダイＮＴ
ペプチドにより特異的に刺激された培養菌から得られる
バルクのＣＴＬに、ペプチドパルスされた正常脾臓細胞
を用いて、再び免疫刺激を２回行った。続いて、個々の
Ｔ細胞クローンを増やすためのインターロイキン−２を
豊富に含む培地の使用を含めた希釈操作を限定すること
により、センダイペプチド特異的ＣＴＬクローンを得た
（参照２６）。このようにして、数種類のセンダイペプ
チド特異的ＣＴＬクローンを得た。その中の１種のクロ
ーンを詳細に調べた結果、ペプチドがパルスされた標的
細胞およびセンダイウィルスに感染された細胞の両細胞
に対して、このクローンは溶菌能力を有していることが
判った。毒性センダイウィルスに対するインビボ活性の
結果では、ウィルス感染標的細胞に対するこのクローン
の活性は、センダイ感作マウスから発生したＣＴＬクロ
ーンの活性と大差はなかった（参照２７）。したがっ
て、このタイプのクローンは、養子免疫伝達阻止実験に
おいて活性があるものと思われる。

【００４８】５．第２次ＣＴＬ反応の誘導 第２次ＣＴＬ反応のために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＮ
ＷＰ ＳＣを使用した。なお、文献２８に示すように、
マウスに１０²血液凝集反応単位（ＨＡＵ）の非毒性セ
ンダイウイルス（ロット番号４０３４００８７，フロー
ラボラトリーズ（Flow Laboratories）−７℃保存）を
腹腔内注射して感作させ、免疫感作後４〜６週間の間で
使用した。

【００４９】６.Ｔ細胞サブセット（subsetes）の減少 抗−ＣＤ４ ｍＡＢ（ＳＮ１７２．４のハイブリドーマ
培養菌ＳＮの１：４０希釈，参照１４）および抗−Ｉ−
Ａ^bｍＡＢ（Ｂ１７／２６３およびＣ′の腹水体液１：
１０００希釈）による処理を行って、ＮＷＰ ＳＣから
ＣＤ４⁺細胞およびＭＨＣクラスＩＩ⁺細胞を減少させ、
細胞測蛍光法によりその減少の程度を確認した。幾つか
の実験においては、培養の間（Ｂ１７／２６３の腹水体
液の１：１０００希釈）抗−Ｉ−Ａ^bｍＡＢが存在し
た。コントロールとして、Ｃ′だけを用いてＮＷＰ Ｓ
Ｃの疑似処理を行った。抗−ＣＤ８ ｍＡｂによるＣＴ
Ｌ反応を阻止するため、５日培養における１：５０、
１：５００および１：５０００の異なる最終希釈液に、
ＨＰＬＣで精製された抗体５３．６．７をそれぞれ添加
した。

【００５０】これらの結果の広範囲な検討は、参考文献
９を参照されたい。この例は、第１次ペプチド特異性Ｃ
ＴＬ反応の刺激細胞としてのＲＭＡ−Ｓ細胞系の特異的
性質を利用した インビトロにおける有効な誘導を示
す。結果として生ずるＣＴＬ反応は、ペプチド特異的
（参照図１）であり、ウイルス伝染性標的細胞（参照図
３，図４）を溶解可能である。ペプチド滴定実験による
と、最適長の外因的ペプチドのみがＭＨＣクラスＩ分子
に効果的に結合するという考えかたに一致して、低濃度
ペプチドは、最適長のペプチドが反応する際必要とされ
る（参照図２）。そしてそれらはより長いペプチドの調
製中において少量存在する。その結果によると、標的細
胞の増感（参照図２Ｂ）は、インビトロにおける反応誘
導（参照図２Ａ）に必要とされるより、ずっと低い分量
のペプチドを用いて完成する。

【００５１】ＲＭＡ−Ｓ細胞系は、インビトロにおける
第１次ＣＴＬ反応に適した誘導体であるのに対して、そ
の親細胞系ＲＭＡはそうではない（参照図３、図４）。
ＲＭＡとＲＭＡ−Ｓは、このようにＭＨＣクラスＩ分子
の細胞表面の発現においてのみ異なることが知られてい
る。そして、この特性のためにＲＭＡ−Ｓが選ばれた。
ＲＭＡ−Ｓ細胞の相互刺激性活性を非装荷ＲＭＡ−Ｓ細
胞をペプチド装荷ＲＭＡ細胞の培養に付加し、試験した
際には、第１次ＣＴＬ反応は促進されなかった（データ
なし）。このように、ＲＭＡとＲＭＡ−Ｓ細胞間のＭＨ
ＣクラスＩ発現の唯一関係を有する相違の出現性と、相
互刺激性活性に関する分析評価とは、ＲＭＡとの比較に
おいてＲＭＡ−Ｓによって相互刺激活性が増加されると
いう意見を支持しない。ＲＭＡ−Ｓ細胞が３７℃に対照
して２２℃で前培養される際には（参照図３、図４）、
第１次反応の誘導は、低濃度ペプチドにおいて確立され
うる。ＭＨＣクラスＩ以外に試験された細胞表面マーカ
は、いずれも温度依存性発現を示さない（参照図６）。
低温におけるＲＭＡ−Ｓ細胞表面における、中空ＭＨＣ
分子の発現の増加は、明らかに、第１次ＣＴＬ反応の誘
導を容易にし（参照図３、図４）、このことは、細胞表
面の特異的ペプチド装荷ＭＨＣクラスＩ分子の数と、第
１次反応誘導との間の直接的相互関係と矛盾しないもの
である。

【００５２】第２次ＣＴＬ反応は、ペプチド装荷ＲＭＡ
−Ｓと細胞溶解能を有するＲＭＡ細胞とを用い、刺激細
胞のプレインキュベーション温度に依存して誘導される
（参照図５）。外因的ＭＨＣ結合ペプチドによって安定
化され得るような低温においては、さらに多くの中空Ｍ
ＨＣクラスＩ分子がＲＭＡ−ＳおよびＲＭＡ細胞の細胞
表面に出現する。

【００５３】１細胞基礎上につきＲＭＡ−Ｓ細胞に結合
したペプチドの量は、ＲＭＡ細胞上に対してより、２．
５倍高い（参照図６Ｂ）。第１次ＣＴＬ反応を誘導する
濃度でＲＭＡ−Ｓ細胞上に結合するペプチドのレベル
は、ＲＭＡ細胞上については標準に達せず高濃度におい
てさえも可能ではない（参照図６Ａ。データなし）。
２．５倍の差は大きくないように思われるが、それは閾
値と／あるいはＴ細胞反応誘導のためのＡＰＣの細胞表
面における関連ＭＨＣ／ペプチド複合体の濃度の考えか
たによるものであろう。他の考察は、ＲＭＡ−Ｓ細胞上
の中空ＭＨＣ分子の効果的装荷（参照図６Ｂ）と、ペプ
チド装荷ＲＭＡ−Ｓ細胞による第１次ＣＴＬ反応誘導の
ＣＤ８依存性（参照図８）とについて行われた。ＲＭＡ
上のＭＨＣ分子の大多数は無関係なペプチドを含んでい
るにも拘わらず、無関係なペプチドで充満されたＭＨＣ
分子は、ＲＭＡ−Ｓ細胞には殆どないであろうと予測さ
れる。結果として、ＣＴＬ前駆体質上のＴｃＲおよびＣ
Ｄ８分子は、ＲＭＡ細胞上よりもＲＭＡ−Ｓ上の方が関
連ＭＨＣ／ペプチド複合体に会合しやすい。ＣＴＬ上の
ＴｃＲとＣＤ８とは、同一クラスＩ分子と相互作用しな
ければならない（参照１０、１１）。ＭＨＣクラスＩ分
子は、関連ペプチドかあるいは無関係なペプチドかで充
満されており、ＣＤ８分子の配位子として作用する。そ
れ故、無関係なペプチドで占められたクラスＩ分子は、
関連ＭＨＣ／ペプチド複合体とＣＤ８との相互作用を妨
げ、そしてそれ故、インビボにおける特異的ＣＴＬのト
リガ作用を妨げると考えられる。

【００５４】反応体母集団からＣＤ１⁺とクラスＩＩ⁺細
胞を除去してもペプチド装荷ＲＭＡ−Ｓ細胞によって生
ずるＣＴＬ活性は減じられない（参照図７）。このよう
に、ペプチド装荷ＲＭＡ−Ｓ細胞による第１次反応の誘
導は、完全にＣＤ４⁺ Ｔｈ細胞とクラスＩＩとのいずれ
からも独立している。この研究に用いられるペプチドに
はクラスＩ分子が存在し、ＣＤ８⁺ ＣＴＬ前駆体を排他
的に刺激する。ＣＤ８⁺ ＣＴＬがペプチド装荷ＲＭＡ−
Ｓ細胞によってトリガされ、自身のＩＬ−２を生ずると
仮定すると、これによってＣＤ４⁺ Ｔｈ細胞あるいは外
因的ＩＬ−２への依存が妨げられると考えられる。

【００５５】他種の細胞タイプは、第１次ウイルス特異
性ＣＴＬ反応の誘導能について試験された（データな
し）。ＲＭＡ−Ｓ細胞を付加した唯一他の細胞は、第１
次ペプチド特異性ＣＴＬ反応の誘導可能であることが報
告されているが、それらは樹状細胞である（参照Ｍ.Ｌ.
Ｈ. de Bruijn，Ｊ.Ｄ. Nieland，Ｗ.Ｍ. Kast and Ｃ.
Ｊ.Ｍ. Melief.原稿提出）。けれども樹状細胞は、困難
な分離処理の後、少量しか得られず、その限りにおいて
系としてそれらを連続的に成長させようとする試みに反
する。樹状細胞は、第１次ＣＴＬ反応を刺激することが
可能であると考えられるが、それは極めて大きな表面部
分を有し、粘着性を有し、シアル酸を有する細胞表面グ
ルカンの占有が低いというような異なったメカニズムに
よるものであろう。

【００５６】以下に実験の結果を図面によって示す。

【００５７】図１には、ペプチドが装荷されたＲＭＡ−
Ｓ細胞を用いたインビトロにおける第１次ＣＴＬ反応の
誘導について示されている。

【００５８】Ｂ６〜ＳＣは、ＲＭＡ−Ｓ細胞とともに
１：１（ｖ／ｖ）でインビトロにて一回免疫刺激され、
２２℃で３６時間予備培養されて、そのままの状態のも
のを対照として、Ａ１６ペプチドを５０μＭまたはＳ１
６ペプチドを５０μＭそれぞれ添加しインキュベーショ
ンを行った。ペプチドは、２５μＭの濃度で、培養中５
日間存在した。

【００５９】エフェクタを収集し、標的細胞として、Ｂ
６マウス胚細胞（ＭＥＣ）およびＢ６ＬＰＳ誘導Ｂ細胞
芽（ＬＰＳ）を用いて、それぞれ５０μＭのＡ１６また
はＳ１６の存在下あるいは非存在下にて試験を行った。

【００６０】図２に、ペプチドが装荷されたＲＭＡ−Ｓ
細胞によって誘導された第１次ＣＴＬの誘導水準（Ａ）
と、標的水準（Ｂ）でのペプチド適定を示す。Ｂ６未成
作マウスＮＷＰ ＳＣは、ＲＭＡ−Ｓ細胞とともに、
１：１（ｖ／ｖ）でインビトロにて一回免疫刺激され、
２２℃で３６時間予備培養され、Ｓ９とＳ１６のセンダ
イペプチドの異なった濃度でインキュベーションされ
た。最終的なペプチド濃度は、図２（Ａ）に示されてい
る。エフェクタを収集し、Ｂ６マウスの胚細胞を用いて
１０μＭのＳ９ペプチドととともに試験を行った。図２
（Ｂ）において、マウスのＮＷＰ ＳＣは、ＲＭＡ−Ｓ
細胞とともに、１：１（ｖ／ｖ）でインビトロにて一回
免疫刺激され、２２℃で３６時間予備培養され、１０μ
ＭのＳ９ペプチドとともにインキュベーションされた。
エフェクタを収集し、そして細胞毒性分析において存在
するＳ９とＳ１６のセンダイペプチドの異なった濃度に
て、Ｂ６マウスの胚細胞を用いて試験が行われた。

【００６１】図３〜図５は、ペプチドが装荷されたＲＭ
Ａ−Ｓ細胞によって誘導された第１および第２次ＣＴＬ
反応を示している。第１次ＣＴＬ反応のために、Ｂ６未
感作マウスのＮＷＰ ＳＣが用いられた（図３および図
４参照）。第２次ＣＴＬ反応のために、Ｂ６マウスのＮ
ＷＰ ＳＣに、非毒性のセンダイウイルスを腹腔内注射
して感作させた（図５参照）。

【００６２】３７℃または２２℃で予備培養されたＲＭ
Ａ−ＳとＲＭＡ細胞に装荷するために、異なる濃度のＳ
９ペプチドを用いた。ペプチドが装荷されたＲＭＡとＲ
ＭＡ−Ｓ細胞は、図に示される最終ペプチド濃度にてＢ
６ ＮＷＰ ＳＣを１：１（ｖ／ｖ）で５日間培養され
た。ＥＬ４細胞は、１０μＭのＳ９とともに、あるいは
それを用いずに標的細胞として用いられるか、または⁵¹
ＣＲで標識される前に、１時間あるいは１２時間非毒性
センダイウイルスと感染させられる。

【００６３】図６は、ＲＭＡとＲＭＡ−Ｓ細胞における
直接ペプチド結合の考察を示している。ＲＭＡとＲＭＡ
−Ｓは、２６℃で３６時間培養される。¹²⁵Ｉ−標識Ｓ
９ペプチド（１μＭまたは１ｎＭ）は、無血清のＤＭＥ
Ｍで２．５×１０⁶細胞／ｍＬで４時間２６℃にてイン
キュベーションされる。ＭＨＣクラスＩ分子は、ウサギ
抗−Ｈ−２^b血清を用いて免疫沈降された。クラスＩ関
連ペプチドは、γ−分光分析によって定量された。結果
は２回測定した値の平均値で示し、正常の血清コントロ
ール沈澱をさし引いた後のｄｐｍで表示した（図６
（Ａ）参照）。図６（Ｂ）において、２６℃で予備培養
されたＲＭＡとＲＭＡ−Ｓ細胞は、表面がヨウ素化され
ており、そしてＨ−２抗原は、ウサギ抗−Ｈ−２^b血清
を用いて，等量のＴＣＡ沈降可能カウントにて沈澱させ
た。ＲＭＡ−Ｓ細胞における、細胞表面Ｈ−２の量は、
ＲＭＡ細胞における量に相対的に表現されており、ＲＭ
Ａ細胞における量を１任意単位として定められている。
２６℃で予備培養されたＲＭＡとＲＭＡ−Ｓ細胞の７０
０ｎＭ¹²⁵Ｉで標識されたＳ９ペプチドとともに２６℃
で１時間後インキュベーションし、続いて抗−Ｈ−２^b
血清にて免疫沈降させた後、ペプチド結合を測定した。

【００６４】ＲＭＡ−ＳにおけるクラスＩ関連ペプチド
は、ＲＭＡ細胞における量に相対的に表現されており、
ＲＭＡ細胞における量を１任意単位として定められてい
る。別々に３回測定を行ったが、同様の結果が得られ
た。

【００６５】図７は、ペプチドが装荷されたＲＭＡ−Ｓ
細胞により誘導された第１次ＣＴＬ反応が、ＣＤ４⁺細
胞とクラスＩＩ⁺細胞から独立していることを示してい
る。免疫応答個体細胞は、Ｂ６未感作マウスのＮＷＰ
ＳＣ（Ａ）、または抗−ＣＤ４（ＳＮ １７２．４）
と、抗−Ｉ−Ａ^b（Ｂ１７／２６３）ｍＡｂと、Ｃ′処
理とによって、ＣＤ４⁺細胞およびクラスＩＩ⁺細胞を空
にしたＮＷＰ ＳＣであった。（Ｂ）において、ＮＷＰ
ＳＣは、Ｃ¹だけの疑似処理が行われた。（Ｄ）におい
て、抗−Ｉ−Ａ^b ｍＡｂ（Ｂ１７／２６３）は、５日間
の培養の間存在した。これらの応答個体細胞は、２０μ
ＭのＳ９ペプチドとともにインキュベーションされ、２
２℃で予備培養されたＲＭＡ−Ｓ細胞を１：１（ｖ／
ｖ）にてインビトロにおいて、一回免疫刺激された。エ
フェクタを収集し、そして１０μＭのＳ９ペプチドなし
にまたはそれらを用いてＥＬ４標的細胞に対して試験
し、あるいは⁵¹Ｃｒで標識される前に１２時間センダイ
ウイルスに感染させた。ＮＷＰ ＳＣおよびＣＤ４⁺細胞
のないＮＷＰ ＳＣは、前述したように、完全にＣＤ４⁺
細胞依存性Ｂ６抗−ｂｍ６アロ特異的(allospecific）
ＣＴＬ反応において試験される（データ示さず、文献３
２参照）。応答個体集団からＣＤ４⁺細胞を除去する
と、完全にＢ６抗−ｂｍ６ ＣＴＬ反応を消滅させたこ
とから、ＣＤ４⁺細胞は機能的に消耗されたことを示し
た（文献３２参照）。

【００６６】図８は、ペプチドが装荷されたＲＭＡ−Ｓ
細胞によって誘導された第１次ＣＴＬ反応がＣＤ８に依
存することが示されている。Ｂ６未感作マウスのＮＷＰ
ＳＣを、図に示したように、抗−ＣＤ８ ｍＡＢ（５
３．６．７）の異なった希釈液の存在下、あるいは非存
在下にて、２０μＭのＳ９ペプチドとともにインキュベ
ーションされ、２２℃で予備培養されたＲＭＡ−Ｓ細胞
を用いて、インビトロにて１：１（ｖ／ｖ）で一回刺激
させた。５日後、エフェクタを収集し、１０μＭのＳ９
ペプチドでインキュベーションしたＥＬ４細胞を用いて
試験を行った。

【００６７】７．細胞毒性試験 ５日培養後、リンホプレプ（lymphoprep，ナイコムドフ
ァーマ（Nycomed Pharma），オスロ，ノルウェイ）グラ
ジエントを用いてエフェクタを収集し、２倍希釈法にて
Ｅ／Ｔ５０〜Ｅ／Ｔ０．８までの２０００⁵¹Ｃｒ−標識
標的細胞における細胞毒性機能を調べた。特異的⁵¹Ｃｒ
放射の１００分率を次の式により計算した。

【００６８】

【数１】

【００６９】バックグランド（培地）放射は常に、最高
（２％トリトン（Triton）×１００）放射の２５％未満
であった。培地での値を３倍したＳＥ（標準誤差）は、
常に、特異的⁵¹Ｃｒ放射の５％未満であった。個々の用
量作用曲線から計算された細胞溶解活性は、１０⁶エフ
ェクタ細胞毎の溶菌単位として表現される。計算は直線
回帰を用いて行われた。標的細胞として、γ−インター
フェロン（ＩＦＮ−γ）５０ Ｕ／ｍｌを用いて３７℃
で２日間処理したＢ６マウス胚芽細胞、Ｃ５７ＢＬ／６
マウス（ＬＰＳ）から得たＬＰＳ誘導Ｂ細胞芽（脾臓細
胞に３０μｇ／ｍｌのＬＰＳ−Ｂ，バクトラブ（Bacto
Lab.），ジフコ（Difco），デトロイト（Detroit），Ｍ
Ｉ，を添加し、３７℃で５日間処理したもの）、または
ＥＬ４細胞（Ｋ^bおよびＤ^bを発現するＣ５７ＢＬ／６起
源の胸線腫細胞系）が供された。標的細胞を５０μＭの
Ａ１６、５０μＭのＳ１６または１０μＭのＳ９の各ペ
プチドとともに１５〜３０分間インキュベーションした
後、１：１（ｖ／ｖ）でエフェクタ細胞に添加し、３７
℃で６時間インキュベーションを行った。ウイルス感染
標的細胞は、⁵¹Ｃｒで標識する前に、１ｍｌの培地中に
３００ＨＡＵの非毒性センダイウイルスとともに、１０
⁷標的細胞を１時間または１２時間インキュベーション
することによって調製された（参照２８）。

【００７０】８．直接ペプチド結合の考察 ＲＭＡおよびＲＭＡ−Ｓ細胞は、２％のヒトプール血清
が添加されたアイスコフ（Iscove）の培地で３６時間２
７℃にて培養された。Ｓ９ペプチドは、クロラミンＴ触
媒ヨウ素化によりヨウ素化されて、特異的活性が約５０
Ｃｉ／ｍｍｏｌとなった。¹²⁵Ｉ−標識Ｓ９ペプチドと
ともに、２６℃にて１〜４時間細胞をインキュベーショ
ンし、ＤＭＥＭにて３回洗浄し、１０ｍＭのトリトンＸ
−１００溶菌緩衝液（トリス，ｐＨ７．８，１４０ｍＭ
ＮａＣｌ，１％トリトンＸ−１００，１ｍＭＰＭＳＦ
（ｐ−メルクリベンゼンスルホン酸），１μｇ／ｍｌト
リプシン阻害剤，３０ｍＴＩＵ／ｍｌアプロチニン）中
氷上にて溶菌を行った。ＭＨＣクラスＩ分子は、ウサギ
抗−Ｈ−２^b血清を用いて免疫沈降させた（参照２
９）。クラスＩ関連ペプチドは、γ−分光法により定量
を行った。Ｈ−２レベルを決定するために、ラクトパー
オキシダーゼ−触媒ヨウ素化を用いて１０⁶細胞をヨウ
素化した。続いて、細胞をＰＢＳにて３回洗浄し、トリ
トンＸ−１００溶菌緩衝液にて溶菌した。Ｈ−２抗原
は、ウサギ抗−Ｈ−２^b（参照２９）を用いて、等量の
トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）−沈殿可能カウント（参照３
０）によって沈殿された。免疫沈降は、１２％ゲルのＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥより分析され、泳動後のゲルをコダック
（Kodak）（ロケスター（Rochester)，ＮＹ）Ｘ−ＡＲ
５フイルムに露出させた。結果は任意の単位で表現され
た。そのうちの１の単位は、各々ＲＭＡ細胞における、
細胞毎の細胞表面Ｈ−２レベルおよび細胞毎のペプチド
結合のレベルとして定義される。

【００７１】結 果 １．ペプチドが装荷されたＲＭＡ−Ｓ細胞による第１次
ウイルスペプチド特異的ＣＴＬ反応の誘導 この実験に用いられた１６−ｍｅｒアデノウイルスペプ
チド（Ａ１６）は、アデノウイルスＥＩ−誘導腫瘍を全
滅することができるＣＴＬクローンによる標的細胞の溶
菌を敏感にさせることが分かった（参照２６）。１６−
ｍｅｒセンダイウイルスペプチド（Ｓ１６）は、特異的
Ｈ−２Ｋ^b−制限ＣＴＬによる標的細胞の溶菌を敏感に
させ、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける致死セイダイウイ
ルス感染に対する防御免疫性を誘導することができた
（参照１２）。Ａ１６およびＳ１６ペプチドは、２２℃
で培養されたＲＭＡ−Ｓ細胞とともにインキュベーショ
ンされた。これらウイルスペプチドが装荷されたＲＭＡ
−Ｓ細胞により、第１次ＣＴＬ反応を誘導することがで
きた。この反応は、アデノおよびセンダイペプチドを誘
導することにより特異的に進行した（図１参照）。

【００７２】２．ペプチド装荷ＲＭＡ−Ｓ細胞による第
１次ＣＴＬ反応の誘導、およびペプチド装荷ＲＭＡ−Ｓ
細胞により誘導された第１次ＣＴＬバルクによる標的細
胞の溶菌に必要なペプチド濃度 ９ａａ（アミノ酸）より長い合成ペプチドの調製の際
に、副生成物として僅かに存在する９ａａのセンダイペ
プチドが、高い親和性でＨ−２Ｋ^bＭＨＣクラスＩ分子
に結合することが近年の研究により実証されている（参
照４）。ペプチド適定実験より、９−ｍｅｒペプチドは
１６−ｍｅｒペプチドの５０倍希釈濃度でＴ細胞反応の
誘導に十分であることがわかった（図２Ａ参照）。標的
細胞の感受性を調べるために同じペプチド適定が行われ
た。その結果、標的細胞の感受性は、インビトロにおけ
る反応誘導に必要な濃度の約１／１０００のペプチド濃
度で完了することを示す（図２Ｂ参照）。

【００７３】３．ペプチドが装荷されたＲＭＡ−Ｓ（Ｒ
ＭＡではない）細胞は、特異的第１次ＣＴＬ反応を誘導
することができる。

【００７４】第１次ＣＴＬ反応において、Ｓ９ペプチド
とともにインキュベーションした後の、ＲＭＡ−Ｓ細胞
と親細胞系ＲＭＡの提示能力を調べた（図３参照）。第
１次反応は、ペプチドを装荷させたＲＭＡ−Ｓ細胞とと
もにＴ細胞を刺激したときのみ見られた（図３参照）。
ＲＭＡ−Ｓ細胞を温度を下げて（２２℃）予備培養した
場合、３７℃で培養するときの約１／１００のペプチド
濃度が必要であり（図４参照）、このことはＭＨＣクラ
スＩ発現の同様の温度依存性に一致していた（図６参
照）。ペプチドとともにインキュベーションしたＲＭＡ
細胞は、いずれの濃度においてもどちらの温度でも刺激
されなかった（図３参照）。

【００７５】４．第１次ペプチド特異的ＣＴＬは、ウイ
ルス感染細胞に対して交差反応的である。

【００７６】センダイペプチドが装荷されたＲＭＡ−Ｓ
細胞により誘導された第１次ＣＴＬ反応は、センダイペ
プチドに特異的であり（図１参照）、Ｋ^bに制限される
（データ示さず）。また、ウイルス感染に続いて抗原決
定基を内因的に発現する標的細胞を溶菌することができ
た（図３および図４参照）。センダイウイルスに感染さ
れた標的細胞の溶菌は、ウイルスにさらされた時間に依
存した。センダイウイルスとともに１２時間インキュベ
ーションした標的細胞は、ペプチドが装荷された標的細
胞と同様に溶菌されたが、１時間感染させた標的細胞で
はペプチドを装荷させた標的細胞と比べて最大で半分程
度しか溶菌されなかった（図４参照）。感染時間が長け
れば長いほど、ＭＨＣクラスＩ分子により提示されるウ
イルスエピトブが増えるという理由から、この結果も予
測どおりである。

【００７７】５．ペプチド装荷ＲＭＡおよびペプチド装
荷ＲＭＡ−Ｓの両細胞により引き起こされた特異的第２
次ＣＴＬ反応 第１次ＣＴＬ反応とは対照的に、第２次反応はペプチド
装荷ＲＭＡ−ＳおよびＲＭＡの両細胞に認められた（図
５参照）。ＭＨＣクラスＩ発現を増加させるために、２
２℃でＲＭＡおよびＲＭＡ−Ｓ細胞を予備培養した場
合、反応性の向上が認められた（図５参照）。センダイ
ウイルス感染ＲＭＡ−Ｓ細胞は、センダイウイルス感染
ＲＭＡ細胞とは対照的に、第２次ＣＴＬ反応を引き起こ
さなかった（データ示さず）。このことは、ＲＭＡ−Ｓ
細胞が内因性の経路を経て抗原を提示する欠陥を有する
という見解に合致している（参照１８，３１）。

【００７８】６．ＲＭＡ細胞と対比したＲＭＡ−Ｓ細胞
の細胞におけるＭＨＣクラスＩ発現の温度依存性 ＲＭＡおよびＲＭＡ−Ｓ細胞において、Ｔｈｙ−１、Ｃ
Ｄ４５、ＬＦＡ−１α、ＬＦＡ−１βおよびＩＣＡＭ−
１の発現パターンが同様に認められた（参照９）。ＭＨ
ＣクラスＩＩ分子、Ｂ細胞および単球／マクロファージ
特異的標識の発現は、ＣＤ４およびＣＤ８の発現と同様
に実証できるものではない（参照９）。ＲＭＡおよびＲ
ＭＡ−Ｓ細胞は、ＭＨＣクラスＩ（Ｋ^bおよびＤ^b）細胞
表面発現のみが異なる（参照９）。このように、選ばれ
た分子すなわちＭＨＣ分子を除いて、特定された細胞表
面標識のいずれもがＲＭＡ−Ｓ細胞系を選択することに
より改変されない。さらに、試験を行ったすべての標識
の中で、ＲＭＡ−ＳおよびＲＭＡ細胞におけるＭＨＣク
ラスＩ発現のみが強く温度に依存している（参照９）。

【００７９】７．ＲＭＡおよびＲＭＡ−Ｓ細胞における
Ｈ−２複合体およびペプチド結合の相対的レベル ＲＭＡ細胞とＲＭＡ−Ｓ細胞との間のＭＨＣ／ペプチド
発現における相違をさらに調べるために、これらの細胞
におけるＳ９ペプチドのクラスＩ分子への直接結合をＨ
−２細胞表面発現と対比して測定した（図６ＡおよびＢ
参照）。ＲＭＡ（２６℃）およびＲＭＡ−Ｓ（２６℃）
におけるペプチドの結合を、それぞれ１μＭのＳ９ペプ
チドおよび１ｎＭのＳ９ペプチドを用いて比較した（図
６Ａ参照）。ペプチド装荷ＲＭＡ−Ｓ細胞により第１次
反応を誘導するために必要な最小濃度である２０μＭに
おいても（図３および図４参照）、ＲＭＡ細胞に結合す
るペプチドの量は、１μＭにおいてＲＭＡ−Ｓ細胞に結
合するペプチドの量にはおよばなかった（データ示さ
ず）。このように、ＲＭＡ細胞は、高いペプチド濃度に
おいてさえも、第１次反応誘導の条件下においてＲＭＡ
−Ｓ細胞が結合するペプチドの量とは比較にならない
程、その結合するペプチドの量はわずかであった。ＲＭ
ＡおよびＲＭＡ−Ｓ細胞における細胞毎のペプチド結合
は、２．５倍しか違わないが、ＲＭＡ−Ｓ細胞における
Ｈ−２分子毎に発現されるペプチド結合は、ＲＭＡ細胞
における結合の１０倍である（図６Ｂ参照）。このこと
から、提供された外因性のペプチドが、ＲＭＡ−Ｓ上の
ＭＨＣ分子に選択的に装荷されていることがわかる。

【００８０】８．ペプチド装荷ＲＭＡ−Ｓ細胞により誘
導される第１次ペプチド特異的ＣＴＬ反応のＣＤ４細胞
およびＭＨＣクラスＩＩ細胞に対する独立性 免疫応答個体集団からＣＤ４⁺およびクラスＩＩ⁺細胞を
取り除くことにより、ペプチドが装荷されたＲＭＡ−Ｓ
細胞により引き起こされたＣＴＬ活性を減少させない
（図７参照）。このように、ペプチド装荷ＲＭＡ−Ｓ細
胞により誘導された第１次反応は、ＣＤ４⁺Ｔｈ細胞お
よびクラスＩＩから完全に独立していた。

【００８１】９．ペプチド装荷ＲＭＡ−Ｓ細胞により誘
導された第１次ＣＴＬ反応のＣＤ８に対する独立性 ペプチド装荷ＲＭＡ−Ｓ細胞による第１次ＣＴＬ誘導
は、培養中に存在する抗−ＣＤ８ ｍＡｂにより完全に
遮断され得る（図８参照）。また、標的細胞レベルにお
いて、第１次ＣＴＬバルクのエフェクタ機能は、抗−Ｃ
Ｄ８ ｍＡｂにより遮断された（データ示さず）。

【００８２】実施例２ 細胞に欠陥のある１７４ＣＥＭ．Ｔ２列の表面におい
て、中空のＨＬＡ−Ａ２．１ＭＨＣクラスＩ分子が装荷
された自己由来のｐ５３腫瘍に対抗する抑制ペプチドの
第１次誘導作用について 方 法 １．血液提供者 献血者は、ＨＬＡ型を示すＮＩＨマイクロサイトキシサ
イテイ型上の対立遺伝子であるＨＬＡ−Ａ２．１を発現
する正常で健康な血液提供者である。

【００８３】２．反応性細胞 反応性Ｔ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２．１陽性の健康な提供者
の単核白血球（ＰＢＬ）中に含まれる。ＰＢＬはフィコ
ール（Ficoll）処置（Lynphoprep of Nycomde−pharm
a，オスロ，ノルウェー，カタログナンバ１０５０３
３）により軟層から分離され、ＲＰＭＩ１６４０（Gibc
o Paislan，スコットランド，カタログナンバ０４１−
０２４０９）中で２度洗浄され、プール状態のヒトの３
０％血清（補助として混合された培養リンパ球の容量が
分析される）と、２ｍＭのグルタミン（ICN Biochemcal
s，Inc，Costa Mesa，CA，アメリカ，カタログナンバ１
５−８０１−５５）と、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍ
ｌ，Brocades Phrma，Leiderdorp，ネーデルランド）
と、カナマイシン（１００μｇ／ｍｌ，Sigma，St．Lou
is，MO，アメリカ）とが補足される。

【００８４】３．ｐ５３ペプチド 方法４に記述されたその分析により、ＨＬＡ−Ａ２．１
と結合することによって強い力を有する、正常で突然変
異をしないｐ５３シーケンスからのｐ５３ペプチドは、
欠陥のある１７４ＣＥＭ．Ｔ２細胞を処理する上で表れ
るペプチドによって第１次誘導作用に用いられる。この
ペプチドのシーケンスはＬＬＧＲＮＳＦＥＶである。

【００８５】このペプチドは、フリーのカルボキシの末
端部を持ち、メリフィールド（Merrifield）法（２５）
によって合成された９５００のペプチドのバイオサーチ
（Biosearch）法（Milpore，Bedford，MA，アメリカ）
において合成される。またＰＢＳあるいは血清無添加の
アイスコフ（Iscove）が修正したダルベッコ（Dulbecc
o）培養液（IMDM，Flou Laboratoies，Irvine，スコッ
トランド）に溶かされ、また−２０℃で貯蔵される。

【００８６】４．ＨＬＡ−Ａ２．１と結合したペプチド （１７４．ＣＥＭ）Ｔ２細胞は、ＦＣＳを取り除いた培
養液中で２度洗浄され、血清無添加の培養液中で２×１
０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍｌの比重にされる。この懸濁液４０
μｌは９６穴の底部がＶ字型をしたプレート（Greiner
GmbH，Frickenhausen，ドイツ：６５１１０１）に個別
のペプチド希釈物（１ｍｇ／ｍｌ）１０μｌとともに載
置される。

【００８７】その最終濃度は８×１０⁴の（１７４．Ｃ
ＥＭ）Ｔ２細胞を含んだ２００μｇ／ｍｌペプチドであ
る。この溶液は湿気を含む空気中に５％濃度のＣＯ₂を
発生させ、３７℃で１６時間の間培養した後、３分間静
かに撹拌される。次に細胞は０．９％のＮａＣｌと、
０．５％のウシの血清アルブミン（Sigma St．Louis，
アメリカ；Ａ−７４０９）と、０．０２％のＮａＮ₃（M
erck Darmstadt，ドイツ：８２２３３５）との溶液１０
０μｌで１度洗浄される。毎分１２００回転の遠心分離
機にかけられた後、その小球は４℃で３０分間、特定の
マウスの単クローン性抗体ＢＢ７．２のＨＬＡ−Ａ２．
１の飽和状態に達したもの５０μｌ中に再び浸される。
次に細胞は２度洗浄され、１対４０の割合で希釈され全
重量２５μｌのフルオルセインイソチオシアネート（Ta
go Inc Burlingame，CA，アメリカ：４３５０）と結合
されたヤギのアンチ−マウスＩｇＧの断片Ｆ（ａｂ）₂
で３０分間培養される。

【００８８】最終の培養の後、細胞は２度洗浄され、蛍
光がＦＡＣＳｃａｎ型の流動細胞計測器（Becton Dicki
nson，Franklin Lakes，NJ，アメリカ）を用いて波長４
８８ｎｍで測定される。疫蛍光法でＨＬＡ−Ａ２．１と
結合の兆しがあるものが著しく増加している。

【００８９】５．第１次ＣＴＬ作用の誘導 １ｍｌ中、２×１０⁶の濃度中の１７４ＣＥＭ．Ｔ２
（Ｔ２）細胞は、グルタミン（２ｍＭ，ICN Biochemica
ls Inc．，Costa Mes，CA，アメリカ，カタログナンバ
１５−８０１，５５）と、２において言及した抗生物質
と、８０μｇ／ｍｌの最終濃度におけるｐ５３ペプチド
とを含む血清無添加のアイスコフ（Iscove）培養液（Bi
ochrom KG，Seromed，Berlin，ドイツ，カタログナンバ
ＦＯ４６５）中でＴ２５フラスコ（Falcom，Becton＆Di
ckinson，Plymouth，イギリス，カナログナンバ３０１
３）において３７℃で１３時間の間培養される。

【００９０】続いて、Ｔ２細胞は回転しながら沈殿し、
３７℃で１時間の間、血清無添加のＲＰＭＩ１６４０
（メーカは２参照のこと）培養液においてマイトマイシ
ンＣ（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）とともに２０×１０⁶
ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で処理される。その後、Ｔ２細
胞はＲＰＭＩ１６４０中で３度洗浄される。

【００９１】第１次ＣＴＬ作用は、８０μｇ／ｍｌの濃
度で含まれるペプチドと、培養液（グルタミンと、前述
した抗生物質とを含む血清無添加のＲＰＭＩ１６４０
液）の５０μｌ中のＴ２細胞で処理された１×１０⁵の
マイトマイシンＣを、９６穴の底部がＵ字型をしたプレ
ート（Costar，Cambridge，MA，アメリカ，カナログナ
ンバ３７９９）の全てのくぼみに滴下することにより誘
導される。これらの刺激細胞には、各々のくぼみの５０
μｌ溶液中の４×１０⁵ＨＬＡ−Ａ２．１陽性ＰＢＬが
加えられる。刺激剤と反応細胞とは加湿培養器（湿度９
０％）で空気中のＣＯ₂濃度５％において、３７℃で７
日間相互に培養される。

【００９２】６．細胞走性物質分析 標的細胞は３７℃で１時間、１００μＣｉ⁵¹Ｃｒでラベ
リングされたＴ２細胞を攻撃する。

【００９３】ラベリングの後、その細胞は血清無添加の
アイスコフ（Iscove）培養液で２度洗浄される。そして
血清無添加のアイスコフ（Iscove）培養液中１ｍｌ中細
胞数２．０×１０⁶の細胞濃度中の２０μｇ／ｍｌのペ
プチドとともに６０〜９０分間培養される。

【００９４】標的細胞はエフェクタ細胞を加える前にも
う１度洗浄される。エフェクタの標的の割合は２倍の希
釈で、２０：１から２．５：１まで分類される。細胞走
性物質作用は４％ＦＣＳと、プレートのくぼみ毎に２０
μｇ／ｍｌの濃度のペプチドとを含む、１００μｌＲＰ
ＭＩの全重量におけるくぼみごとの２０００の標的細胞
上で実験される。培養の全期間は３７℃で４時間であ
る。放射性⁵¹Ｃｒのパーセンテージは以下の式によって
算出される。

【００９５】

【数２】

【００９６】７．限定希釈によるＣＬＴのクローン培養
操作 第１次誘導作用（方法５参照のこと）の後、７〜１４日
でＰＢＬ（反応性細胞）はペプチドにより再び刺激され
る。この目的のために全ての細胞は採取される。有効な
細胞はフィコール（Ficool）処理によって単離され、Ｒ
ＰＭＩ１６４０中で洗浄される。これらの新しい９６穴
の底部がＵ字型をしたプレート中の有効な細胞の５００
０は、μｌ Ｉ培養液（ＲＰＭＩ（Gibco Paislan，ス
コットランド，カタログナンバ０４１−０２４０９）
と、１５％のプール状態のヒトの血清と、グルタミン
と、前述の抗生物質とともにどれも順調に生育する。

【００９７】２００００の自己由来のもののプレートの
くぼみ毎の、放射線を照射（２５００ｒａｄ）されたＰ
ＢＬと１００００の自己由来のものと、２００００の自
己由来のもののプレートのくぼみ毎の、放射線を照射
（５０００ｒａｄ）されたＥＢＶが変換したＢリンパ球
とは、ＩＩ培養液５０μｌ（ＲＰＭＩ（Gibco，Paisla
n，スコットランド、カタログナンバ０４１−０２４０
９）と、１５％のプール状態のヒトの血清と、グルタミ
ンと、前述の抗生物質と、８０μｇ／ｍｌの最終濃度中
のペプチドとがともに加えられる。

【００９８】その細胞はＣＯ₂濃度５％で湿度９０％の
培養器中で３７℃で、７日間培養される。第１次作用開
始後２１日で培養された細胞は採取される。有効な細胞
は、フィコール（Ficool）処理によって単離され、ＲＰ
ＭＩ１６４０中で洗浄される。この有効な細胞の容積は
限定希釈によってクローン培養される。新しい９６穴の
底部がＵ字型をしたプレート（Costar，Cambridge，カ
タログナンバ３７９９）の各々のくぼみの中の５０μｌ
のＩ培養液中には、１００，１０，１ないし０．３の有
効な細胞がともに混合される。プール状態で放射線を照
射（３０００ｒａｄ）された少なくとも３種の異なる提
供者からのＰＢＬ２０００と、プール状態で放射線を照
射（１００００ｒａｄ）された少なくとも２種の異なる
ＨＬＡ−Ａ２．１陽性の提供者からの、ＥＢＶが変換し
たＢ細胞１００００との全てのくぼみは、８０μｇ／ｍ
ｌの最終濃度中のペプチドと、２％濃度中の白色凝集源
と、１２０ＩＵ／ｍｌの濃度中のヒトの再合成されたＩ
Ｌ−２（Eurocetus,アムステルダム）と、５０μｌのＩ
Ｉ培養液とともに混合される。

【００９９】８．ＣＴＬクローン培養の拡大 ＬＤ培養の各々のプレートのくぼみには細胞の生長が規
則正しく観察される。大きく生長したくぼみ中の細胞は
より大きな培養地に移植され、照射されたＰＢＬとＥＢ
Ｖ Ｂ細胞陽性のＨＬＡ−Ａ２．１と、７に前述され、
細胞毒によって処理されたｐ５３ペプチドとがともに繰
返し刺激される。特異性が限定された有効なペプチドＨ
ＬＡ−Ａ２．１でクローン培養された各々のＣＴＬは、
７において概略した手順によって少なくとも１度は再び
クローン培養される。

【０１００】結 果 ＣＴＬクローン培養で限定された３種のＨＬＡ−Ａ２．
１の溶菌の活動は、自己由来のｐ５３ペプチドに対抗し
て支配する。３種のＣＴＬクローン培養の特殊な細胞毒
の活動は、明らかに５の部分において概略した手順によ
って、健康な提供者のＰＢＬからのｐ５３ペプチドＬＬ
ＧＲＮＳＦＥＶに対抗して発生する。なお方法７と８と
については表１に示す。

【０１０１】特殊なＣＴＬクローン培養の３種のｐ５３
ペプチドの溶菌の活動は、次の第１次ＣＴＬ化ペプチド
で発生する。

【０１０２】

【表１】

【０１０３】Ｃｌ，Ａ５，Ｄ５のＣＴＬクローンは、Ｔ
２細胞に装荷されたＡ８ペプチドとともにビトロ中で第
１次作用の誘導を達成する。クローンは、２倍の希釈段
階でＥ／Ｔ２０からＥ／Ｔ２．５まで分類された、⁵¹Ｃ
ｒでラベリングされた標的細胞と装荷したペプチド上で
特別に検査される。Ａ８は９種のアミノ酸のペプチド
で、野性種ｐ５３プロテインに由来する。Ｄ６ペプチド
もまた野性種ｐ５３シーケンスに由来し、負の制御とし
て用いられる。

【０１０４】両者のペプチドは方法４において記述のＨ
ＬＡ−Ａ２．１分子と結合する。２種のペプチドの１文
字コード中のシーケンスすなわちＡ８は、すなわちＬＬ
ＧＲＮＳＦＥＶで、Ｄ６はすなわち、ＲＭＰＥＡＡＰＰ
Ｖである。

【０１０５】ペプチドの滴定実験は、Ａ８ペプチドの２
０μｇ／ｍｌが標的細胞の感作に十分であることを示し
ている。この実験において用いられる濃度は２０μｇ／
ｍｌである。特殊ペプチドクローンは、ｐ５３ペプチド
で培養されたＨＬＡ−Ａ２．１陽性の標的細胞のみを溶
解し、ペプチドで培養されなかったＨＬＡ−Ａ２．１陽
性の標的細胞、あるいは無関係なペプチドと結合したＨ
ＬＡ−Ａ２．１で培養された標的細胞は溶解されない。
この結果は、もっぱらビトロ中において健康な非免疫感
作性ＨＬＡ−Ａ２．１陽性の提供者からのＰＢＬ中の反
応の誘導によって、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子生成物のペプ
チドのこの場合において、自己由来のペプチドに対抗し
て反応するＣＴＬを発生させることが容易であることを
示している。

【０１０６】

【発明の効果】本発明に従えば、内因的ペプチドがＭＨ
ＣクラスＩ分子に装荷することを排除するような欠損プ
ロセシング抗原による中空のＭＨＣクラスＩ分子を発現
する抗原提示性細胞の使用法に基づいている。結果とし
て、これらのＡＰＣは、特定のペプチドを結合する単一
の外因的ＭＨＣクラスＩを効果的に装荷し得る。またヒ
トのβ２−マイクログロブリンの付加は、ＭＨＣ分子の
装荷したペプチドの発現を増加し、第１次ＣＴＬ反応の
誘導を改善するという効果がある。

【０１０７】また本発明に従えば、欠損プロセシングし
ないペプチド装荷親細胞と対照的に、外因的ペプチド装
荷性細胞は、第１次ＣＴＬ反応の誘導が可能であり、外
因的ペプチドで充満されたＭＨＣ分子を利用する。さら
に効果的なペプチド提示の法則に基づく、非免疫性未感
作の個体からの反応性リンパ球母集団を伴う第１次Ｔ細
胞反応を誘導するという効果がある。

【０１０８】参考文献 1. B.A. Askonas, A. Mullbacher, R.B. Ashman. Cyt
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【図面の簡単な説明】

【図１】ペプチドか装荷されたＲＭＡ−Ｓ細胞にインビ
トロで第１次ＣＴＬ反応を誘導したときの標的ウイルス
と免疫刺激の関係を示すグラフである。

【図２】ペプチドが装荷されたＲＭＡ−Ｓ細胞によって
導かれたＣＴＬの誘導水準（Ａ）と標的水準（Ｂ）とで
の特異的溶菌（％）とペプチド濃度との関係を示すグラ
フである

【図３】ペプチドが装荷されたＲＭＡ−Ｓ細胞によって
導かれた第１次ＣＴＬ反応における溶菌単位とペプチド
濃度との関係を示すグラフである。

【図４】ペプチドが装荷されたＲＭＡ−Ｓ細胞によって
導かれた第１次ＣＴＬ反応における溶菌単位とペプチド
濃度との関係を示すグラフである。

【図５】ペプチドが装荷されたＲＭＡ−Ｓ細胞によって
導かれた第２次ＣＴＬ反応における溶菌単位とペプチド
濃度との関係を示すグラフである。

【図６】ＲＭＡ細胞およびＲＭＡ−Ｓ細胞とペプチドと
の結合のしやすさを示すグラフである。

【図７】各種応答個体集団による標的ウイルスの溶菌量
を示すグラフである。

【図８】抗ＣＤ８の濃度によるＥ／Ｔ比と溶菌割合の関
係を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 39/00 Ｇ 9284−4Ｃ (71)出願人 592132707 シード キャピタル インヴェストメンツ （エスシーアイ） ベー．ファウ. ＳＥＥＤ ＣＡＰＩＴＡＬ ＩＮＶＥＳＴ ＭＥＮＴＳ （ＳＣＩ） ＢＥＳＬＯＴＥ Ｎ ＶＥＮＮＯＯＴＳＨＡＰ オランダ国、3527 ゲーアー ウトレヒ ト、ベルナドッテラーン 15 (72)発明者 コルネリス ヨーゼフ マリア メリーフ オランダ国、2102 ベーテー ヘームシュ テーデ、ヨハン フェルメールシュトラー ト 15 (72)発明者 ヴィベ マルチン カースト オランダ国、2331 エヌイクス レイデ ン、マリアルトゲルスヴェク 106

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｔリンパ球培養において抗原誘導Ｔ細胞
   免疫腫瘍組織複合性（ＭＨＣ）結合ペプチドで中空のＭ
   ＨＣ分子を運搬して抗原を与えるビヒクルを装荷するス
   テップから成り、ペプチドを装荷した抗原を与えるビヒ
   クルの中で特異なＴリンパ球反応を誘導する条件下で、
   Ｔリンパ球を培養し、随意に培養物から抗原に特異なＴ
   リンパ球を分離し、前記分離されたＴリンパ球を培養す
   ることを特徴とする抗原に特異的なＴリンパ球反応を誘
   導する方法。
2. 【請求項２】前記抗原を与えるビヒクルが抗原が有する
   欠損を持った抗原を与える細胞から成る中空のＭＨＣ分
   子を運搬するものであることを特徴とする請求項１記載
   の抗原に特異的なＴリンパ球反応を誘導する方法。
3. 【請求項３】前記抗原が存在する細胞が約２０℃〜３７
   ℃の温度でペプチドで装荷される抗原が有する欠損を持
   つ細胞であることを特徴とする請求項２記載の抗原に特
   異的なＴリンパ球反応を誘導する方法。
4. 【請求項４】Ｔリンパ球培養において抗原誘導Ｔ細胞免
   疫ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドで中空のＭＨＣクラスＩ
   分子を運搬して抗原を与えるビヒクルを装荷するステッ
   プから成り、ペプチドを装荷した抗原を与えるビヒクル
   中で特異な細胞傷害Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応を誘導す
   る条件下でＣＤ８⁺Ｔ細胞前駆物質でできるＴリンパ球
   を培養し、随意に培養物から抗原に特異なＣＴＬを分離
   し、前記分離されたＣＴＬを培養することを特徴とする
   抗原に特異なＣＴＬを誘導する方法。
5. 【請求項５】前記抗原が存在するビヒクルが欠損プロセ
   シング抗原を有する細胞であって抗原が存在する構成の
   中空のＭＨＣ分子で運搬するものであることを特徴とす
   る請求項４記載の抗原に特異なＣＴＬを誘導する方法。
6. 【請求項６】前記抗原提示細胞がネズミのＲＭＡ−Ｓ細
   胞かヒトの１７４ ＣＥＭ Ｔ２細胞であることを特徴と
   する請求項５記載の抗原に特異なＣＴＬを誘導する方
   法。
7. 【請求項７】前記抗原を与えるビヒクルが中空のＭＨＣ
   分子に加えてＴ細胞反応の開始を促進する分子を運搬す
   るものであることを特徴とする請求項４記載の抗原に特
   異なＣＴＬを誘導する方法。
8. 【請求項８】前記抗原を与えるビヒクルが約８〜１１個
   のアミノ酸を持った抗原誘導Ｔ細胞免疫ＭＨＣクラスＩ
   結合ペプチドで装荷された中空のＭＨＣクラスＩ分子を
   運搬するものであることを特徴とする請求項４記載の抗
   原に特異なＣＴＬを誘導する方法。
9. 【請求項９】前記培養がペプチド装荷の抗原を与えるビ
   ヒクルと前記ＣＴＬ反応開始培養を支持する基質の存在
   下で運搬されるＣＤ８⁺Ｔ細胞を構成するＴリンパ球の
   特異なＣＴＬ反応誘導条件下で行われることを特徴とす
   る請求項４記載の抗原に特異なＣＴＬを誘導する方法。
10. 【請求項１０】前記抗原に特異的ＣＴＬ反応が未感染の
    Ｔリンパ球培養中で誘導される第１次ＣＴＬ反応である
    ことを特徴とする請求項４記載の抗原に特異なＣＴＬを
    誘導する方法。
11. 【請求項１１】前記ＣＴＬ反応が前記Ｔ細胞免疫ＭＨＣ
    クラスＩ結合ペプチド由来の自己由来の抗原に特異的で
    あることを特徴とする請求項４記載の抗原に特異なＣＴ
    Ｌを誘導する方法。
12. 【請求項１２】抗原誘導Ｔ細胞免疫ＭＨＣクラスＩＩ結
    合ペプチドで中空のＭＨＣクラスＩＩ分子を運搬して抗
    原を与えるビヒクルを装荷するステップから成り、ペプ
    チドを装荷した抗原を与えるビヒクル中で特異なヘルパ
    ーＴリンパ球反応を誘導する条件下でＣＤ４⁺Ｔ細胞前
    駆物質でできるＴリンパ球を培養し、随意に培養物から
    抗原に特異なヘルパーＴリンパ球を分離し、前記分離さ
    れたヘルパーＴリンパ球を培養することを特徴とする抗
    原に特異なヘルパーＴリンパ球を誘導する方法。
13. 【請求項１３】前記抗原を与えるビヒクルが約１０〜１
    ８個のアミノ酸を持った抗原誘導Ｔ細胞免疫ＭＨＣクラ
    スＩＩ結合ペプチドで装荷された中空のＭＨＣクラスＩ
    Ｉ分子を運搬するものであることを特徴とする請求項１
    ２記載の抗原に特異なヘルパーＴリンパ球を誘導する方
    法。
14. 【請求項１４】抗体誘導Ｔ細胞免疫ＭＨＣ結合ペプチド
    で中空のＭＨＣ分子を運搬して抗原を与えるビヒクルを
    装荷するステップから成り、ペプチドを装荷した抗原を
    与えるビヒクルの中で特異なＴリンパ球反応を誘導する
    条件下で、Ｔリンパ球を培養し、随意に培養物から抗原
    に特異なＴリンパ球を分離し、前記分離されたＴリンパ
    球を培養し、抗原に特異的なＴリンパ球を誘導すること
    によって得られることを特徴とする抗原に特異的なＴリ
    ンパ球。
15. 【請求項１５】抗体誘導Ｔ細胞免疫ＭＨＣ結合ペプチド
    で中空のＭＨＣ分子を運搬して抗原を与えるビヒクルを
    装荷するステップから成り、ペプチドを装荷した抗原を
    与えるビヒクルの中で特異なＴリンパ球反応を誘導する
    条件下で、Ｔリンパ球を培養し、随意に培養物から抗原
    に特異なＴリンパ球を分離し、前記分離されたＴリンパ
    球を培養し、抗原に特異的なＴリンパ球を誘導すること
    によって得られる前記抗原に特異的なＴリンパ球とその
    担体、賦形剤および賦活剤を含み、抗原に特異な高い免
    疫効果を有することを特徴とする薬剤組成物。
16. 【請求項１６】抗体誘導Ｔ細胞免疫ＭＨＣ結合ペプチド
    で中空のＭＨＣ分子を運搬して抗原を与えるビヒクルを
    装荷するステップから成り、ペプチドを装荷した抗原を
    与えるビヒクルの中で特異的なＴリンパ球反応を誘導す
    る条件下で、Ｔリンパ球を培養する過程で抗原に特異的
    なＴリンパ球反応を誘導することによって得られる前記
    抗原誘導Ｔ細胞免疫ＭＨＣ結合ペプチドとその担体、賦
    形剤および賦活剤を含む抗原に特異な高い免疫効果を有
    することを特徴とする薬剤組成物。
17. 【請求項１７】候補ペプチドを合成するステップから成
    り、これらの候補ペプチド抗原を与えるビヒクルによっ
    て運搬される中空のＭＨＣ分子に結合できるかテスト
    し、ＭＨＣ結合ペプチドがＴリンパ球中でペプチドに特
    異的なＴリンパ球反応を誘導できるかテストすることを
    特徴とするＴ細胞免疫ペプチドを確認する方法。
18. 【請求項１８】前記抗原を与えるビヒクルが欠損プロセ
    シング抗原を有する細胞であって抗原が存在し、中空の
    ＭＨＣ分子を運搬するものであることを特徴とする請求
    項１７記載のＴ細胞免疫ペプチドを確認する方法。
19. 【請求項１９】前記抗原が存在する細胞がねずみのＲＭ
    Ａ−Ｓ細胞またはヒトの１７４．ＣＥＭ Ｔ２細胞から
    成る欠損プロセシング抗原を有することを特徴とする請
    求項１８記載のＴ細胞免疫ペプチドを確認する方法。