JP3782100B2 - Ｈｌａ結合性ペプチド及びその用途 - Google Patents

Description

本願は、USSN 07／926,666号の一部係属出願であるUSSN 08／027,746号の一部係属出願である。これらUSSNは引用することで本明細書に組入れる。
発明の背景
本発明はウィルス性障害及び癌の如きの数多くの病理的症状を予防、処置又は診断するための組成物及び方法に関する。特に、本発明は特定の主要組織適合性複合体（MHC）分子に結合することができ、且つ免疫応答を誘発することができる新規ペプチドを提供する。
MHC分子はクラスＩ又はクラスII分子に分類されている。クラスII MHC分子は免疫応答を開始及び持続することにかかわっている細胞、例えばＴリンパ球、Ｂリンパ球、マクロファージ等の上に主に発現される。クラスII MHC分子はヘルパ−Ｔリンパ球により認識され、そしてヘルパ−Ｔリンパ球の繁殖及び表示される特定の免疫原性ペプチドに対する免疫応答の増幅を誘発する。クラスＩ MHC分子はほとんど全ての有機細胞上で発現され、そして細胞障害性Ｔリンパ球（CTLs）により認識される。これによりこのＴリンパ球はこの抗原担持細胞を破壊する。CTLsは腫瘍拒絶において、及びウィルス感染症との戦いにおいて特に重要である。CTLは、完全な外来抗原自体よりはむしろ、MHCクラスＩ分子に結合したペプチドフラグメントの形態における抗原を認識する。この抗原は通常は細胞により内生的に合成されねばならず、そしてこのタンパク質抗原の一部は細胞質の中で小さなペプチドフラグメントへと分解される。これらの小さなペプチドの一部はプレ−ゴルジ区画に移動し、そしてクラスＩ重鎖と相互作用して適正な折りたたみ及びβ２ミクログロブリンサブユニットとの会合を助長する。このペプチド−MHCクラスＩ複合体は次いで発現及び特異的なCTLによる潜在的な認識のために細胞表層へと送られる。
ヒトMHCクラスＩ分子HLA-A2.1の結晶構造の調査は、クラスＩ重鎖のα１及びα２ドメインの折りたたみによりペプチド結合性溝（groove）が作られることを示唆している（Bjorkmanら、Nature 329：506（1987））。しかしながら、これらの調査において、溝に結合するペプチドの種類は決定されていない。
Buusら、Science 242：1065（1988）は最初にMHCからの結合ペプチドの酸性溶離のための方法を述べている。その後、Rammesee及びその協同研究者は（Falkら、Nature 351：290（1991））はクラスＩ分子に結合した天然プロセスを受けたペプチドを特定する手法を開発した。その他の研究者は、質量分析法によりＢタイプ（Jardetzkyら、Nature 353：326（1991））及びA2.1タイプ（Huntら、Science 225：1261（1992））のクラスＩ分子から溶離させたペプチドの、慣用の自動配列決定による、様々なHPLC画分中のより豊富なペプチドの直接的なアミノ酸配列決定の成功を収めている。MHCクラスＩにおける天然にプロセスを受けたペプチドの特徴の所見については

に紹介されている。
Setteら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86：3296（1989）は、MHC結合性能力を推定するのにMHCアレル特異性モチーフを利用できることを示している。Schaefferら、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86：4649（1989）はMHC結合が免疫原性に関係していることを示している。幾人かの著者（De Brujinら、Eur.J.Immunol., 21：2963-2970（1991）；Pamerら、991 Nature 353：852-955（1991））は、クラスＩ結合性モチーフを動物モデルにおける潜在的な免疫原性ペプチドの同定に応用できうる予備的な証拠を提供している。一定のクラスＩアイソタイプの多数のヒトアレルに対して特異的なクラスＩモチーフはまだ開示されていない。このような異なるアレルの組合せ頻度は、ヒト異系交配集団の大部分又はおそらくは過半数を包括するほど十分に高いべきことが所望される。
当業界における開発にもかかわらず、従来技術はこの研究を基礎とする有用なヒトペプチドベースワクチン又は治療剤を供していない。本発明はこれら及びその他の利点を提供する。
発明の概要
本発明はMHCクラスＩ分子に対する結合性モチーフを有する免疫原性ペプチドを含んで成る組成物を提供する。この免疫原性ペプチドは一般に約８〜約11残基数であり、そして適当なMHCアレルによりエンコードされる結合性タンパク質にかかわる保存残基を含んで成る。
例えば、HLA-A3.2に関するモチーフは、Ｎ末端からＣ末端に至るまで、２位においてのＬ，Ｍ，Ｉ，Ｖ，Ｓ，Ａ，Ｔ及びＦの第一保存残基並びにＣ末端においてのＫ，Ｒ又はＹの第二保存残基を含んで成る。その他の第一保存残基はＣ，Ｇ又はＤ、そして他にＥである。その他の第二保存残基はＨ又はＦである。第一と第二保存残基とは好ましくは６〜７残基離れている。
HLA-A1に関するモチーフは、Ｎ末端からＣ末端に至るまで、Ｔ，Ｓ又はＭの第一保存残基、Ｄ又はＥの第二保存残基、及びＹの第三保存残基を含んで成る。その他の第二保存残基はＡ，Ｓ又はＴである。第一及び第二保存残基は隣接しており、そして好ましくは６〜７残基で第三保存残基と離れている。第二モチーフはＥ又はＤの第一保存残基及びＹの第二保存残基より成り、ここで第一と第二保存残基とは５〜６残基離れている。
HLA-A11に関するモチーフは、Ｎ末端からＣ末端に至るまで、２位においてのＴ又はＶの第一保存残基及びＫのＣ末端保存残基を含んで成る。この第一と第二保存残基とは好ましくは６又は７残基離れている。
HLA-A24.1に関するモチーフは、Ｎ末端からＣ末端に至るまで、２位においてのＹ，Ｆ又はＷの第一保存残基及びＦ，Ｉ，Ｗ，Ｍ又はＬのＣ末端保存残基を含んで成る。この第一と第二保存残基とは６〜７残基離れている。
いくつかの潜在的な標的タンパク質上のエピトープがこの方法で同定されうる。適当な抗原の例には、前立腺特異性抗原（PSA）、Ｂ型肝炎コア及び表層抗原（HBVc, HBVs）、Ｃ型肝炎抗原、悪性黒色腫抗原（MAGE-1）、エプスタイン−バーウィルス抗原、ヒト免疫不全１−型ウィルス（HIV1）及びパピロマウィルス抗原が含まれる。これらのペプチドは従って生体内及び生体外の両方における治療及び診断用途にとっての薬理組成物において有用である。
定 義
「ペプチド」なる語は、本明細書においては「オリゴペプチド」と同義語で、一連の残基、典型的にはＬ−アミノ酸であって、互いと、典型的には隣り合うアミノ酸のアルファーアミノ基とカルボニル基との間でのペプチド結合によって連結し合っているものを意味するために用いている。本発明のオリゴペプチドは長さにおいて約15残基未満であり、そして通常は約８〜約11残基、好ましくは９又は10残基より成る。
「免疫原性ペプチド」とは、アレル特異性モチーフを含んで成り、従ってMHCアレルと結合し、そしてCTL応答を誘発することのできるペプチドである。従って、免疫原性ペプチドは適当なクラスＩ MHC分子に結合することができ、そして免疫原性ペプチドが起源とする抗体に対する細胞障害性Ｔ細胞応答を誘発することができる。
「保存残基」とは、ペプチドモチーフ中の特定の位置においてランダム分布により予測されるであろうものよりも有意に高い頻度において認められるアミノ酸である。典型的には、保存残基は、それにおいて免疫原性ペプチドがMHC分子との接点を供しうるものである。規定の長さのペプチド内の１〜３、好ましくは２の保存残基が免疫原性ペプチドについてのモチーフを規定する。これらの残基は典型的にはペプチド結合溝と密着しており、ここでその側鎖は溝自体の特定のポケットの中に埋まっている。典型的には、免疫原性ペプチドは３まで保存残基、より通常には２の保存残基を含んで成るであろう。
本明細書において用いている「ネガティブ結合性残基」とは、ペプチド内に適切な保存残基が存在しているにもかかわらず、それが一定の位置にあるとしたならば非結合因子又は弱結合因子であるペプチドをもたらすであろう、換言すればCTL応答を誘発することのないペプチドをもたらすであろうアミノ酸である。
「モチーフ」なる語は、特定のMHCアレルにより認識される、規定の長さ、通常は約８〜約11のアミノ酸のペプチドにおける残基のパターンを意味する。このペプチドモチーフは典型的には各ヒトMHCアレルに関して異なり、そして保存性の高い残基のパターンにおいて相違する。
アレルに関する結合性モチーフは精度の度合いの上昇と共に特定されうる。あるケースにおいては、保存残基は全てペプチドの中の適正な位置に存在しており、そしてネガティブな結合性残基はない。
「単離」又は「生物学的に純粋」なる表現は、その天然状態において認められる通常付随している成分を実質的に又は本質的に含まない物質を意味する。従って、本発明のペプチドはインシトウ（in situ）の環境において通常結合している物質、例えば抗原表示細胞上のMHCＩ分子を含まない。たとえタンパク質が均質又は主要バンドに至るまで単離されても、所望のタンパク質と一緒に精製されてしまう５〜10％の範囲の天然タンパク質の微量夾雑物がある。本発明の単離ペプチドはかかる内生共精製タンパク質を含まない。
「残基」なる語は、アミド結合又は擬アミド結合によりオリゴペプチドの中に組まれたアミノ酸又は擬アミノ酸を意味する。
【図面の簡単な説明】
図１はHLA-A精製法の流れ図である。
図２は、プロテインA-Sepharoseに結合させたmAb GAP A3で調製したアフィニティーカラムを用いての細胞系EHMからのアフィニティー精製したHLA-A3.2のSDS-PAGE分析である。
レーン１−分子量標準品。
レーン２−A3.2酸性溶離物
レーン３−A3.2第二酸性溶離物
レーン４−塩基溶離＃１
レーン５−塩基溶離＃２
レーン６−濃縮塩基溶離＃１
レーン７−濃縮塩基溶離＃２
レーン８−BSA−10μｇ
レーン９−BSA−３μｇ
レーン10−BSA−１μｇ
図３はHLA-A3酸性溶離ペプチドの逆相高性能液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）を示す。
図４は％結合放射活性により測定した、MHC分子に対する本発明の放射活性ラベル化ペプチドの結合性を示す。
図５は３種のペプチド〔HBc 18-27（924.07）、前立腺特異性抗原ペプチド（939.01）及びHIV nef 73-82（940.03）〕の存在下でのMHC分子に対する本発明のペプチドの結合の阻害を示す。
図６はβ２ミクログロブリンの存在下又は非存在下でのMHC濃度に基づく結合性の依存性を示す。
図７は未ラベルペプチドの添加を伴う結合性の投与量依存性阻害を示す。
図８は６nMの見かけ上のＫ_Dを確証する、MHC A11に対する結合性のスキャッチャード分析。
図９は％結合反応性により測定した、MHC A1に対する本発明の放射活性ラベル化ペプチドの結合性を示す。
図10は未ラベルペプチドの添加を伴う結合性の投与量依存性阻害を示す。
図11は21nMの見かけ上のＫ_Dを確証する、MHC A1に対する結合性のスキャッチャード分析。
図12は％結合反応性により測定した、MHC A24の濃度の関数としての本発明の２つのペプチドの結合性を示す。
図13は未ラベルペプチドの添加を伴う、MHC A24に対する結合性の投与量依存性阻害を示す。
図14は30及び60nMそれぞれを確証する、２つのペプチドのMHC A24に対する結合性のスキャッチャード分析を示す。
図15は、β２ミクログロブリンのMHCクラスＩ分子に及ぼす作用及び特定のペプチドの酸ストリップPHAブラストに及ぼす作用を示す。
図16は、777.03-924.07-927.32ペプチドプールの負荷された（loaded）GC43 A2.1応答体及び自己酸ストリップ化PBMs又はPHAブラストを用いるCTL誘発を示す。
図17は1044.04-1044.05-1044.06ペプチドプールを負荷した後のX351又はX355 A2.1応答体及び自己酸ストリップ化PBMCs又はPHAブラストを用いるCTL誘発を示す。
図18は939.03ペプチドを負荷した後の刺激因子としてのGC49 A2.1応答体及び自己酸ストリップ化PHAブラストを用いるCTL誘発を示す。
図19はペプチド938.01の負荷後の刺激因子としてのGC66 A1応答体及び自己酸性ストリップ化PBMCsを用いるCTL誘発を示す。
図20はMAGE3ペプチドを負荷したSAC-I活性化PBMCsによる刺激を経たペプチド感作化標的及び内因性標的の溶解を示す。
図21は酸ストリップ負荷と低温インキュベーションとの対比を示す。
図22はMAGE／A11に関する免疫原性ペプチドに対するCTL応答を示す。
図23はHIV／A3に関する免疫原性ペプチドに対するCTL応答を示す。
図24はHCV／A3に関する免疫原性ペプチドに対するCTL応答を示す。
図25はHBV／A1に関する免疫原性ペプチドに対するCTL応答を示す。
好適な態様の詳細
本発明はヒトクラスＩ MHC（時折りHLAと呼ぶ）アレルサブタイプに関するアレル特異性ペプチドモチーフの決定に関する。これらのモチーフは任意の所望の抗原、特にヒトウィルス性障害又は癌にかかわるものに由来するＴ細胞エピトープであって、それに関する潜在的な抗原標的のアミノ酸配列が公知であるものを特定するのに利用できる。
いくつかの潜在的な標的タンパク質上のエピトープがこの方法で同定できうる。適切な抗原の例には、前立腺特異性抗原（PSA）、Ｂ型肝炎コア及び表層抗原（HBVc, HBVs）、Ｃ型肝炎抗原、エプスタイン−バーウィルス抗原、黒色腫抗原（例えばMAGE-1）、パピロマウィルス（HPV）抗原が含まれる。
これらのエピトープを含んで成るペプチドを合成し、次いで適当なMHC分子に対するその結合能力について、例えば、精製クラスＩ分子及び放射性ヨウ素化ペプチド並びに／又はエンプティー（空の）クラスＩ分子を用いるアッセイ、例えば免疫蛍光染色及びフローマイクロフルオロリメトリー、ペプチド依存性クラスＩ集成アッセイ、並びにペプチド競合によるCTL認識の阻害で、試験する。クラスＩ分子に結合するこれらのペプチドを、潜在的な治療剤としての、感染又は免疫化個体に由来するCTLsにとっての標的として働くその能力、及びウィルス感染化標的細胞又は腫瘍細胞と反応することのできるCTL集団を発生せしめうる一次インビトロ又はインビボCTL応答を誘発するその能力について更に評価する。
MHCクラスＩ抗原はHLA-A, B及びＣ遺伝子座によりエンコードされる。HLA-A及びＢ抗原は細胞表層においてほぼ同等の密度において発現され、一方、HLA-Cの発現は有意に低い（おそらくは10分の１）。これらの遺伝子座それぞれはいくつかのアレルを有する。
本発明のペプチド結合性モチーフは各アレルのサブタイプに対して相対的に特異性である。
ペプチドベースワクチンに関して、本発明のペプチドは好ましくはヒト集団において幅広い分布を有するMHCＩ分子により認識されるモチーフを含んで成る。MHCアレルは異なる人種群及び民族において異なる頻度で認められるため、標的MHCアレルの選択は標的集団に基づきうる。表１は様々な民族間でのHLA-A遺伝子座産物での様々なアレルの頻度を示す。例えば、コーカサス人の集団の過半数は４種のHLA-Aアレルサブタイプ、詳しくはHLA-A2.1, A1, A3.2及びA24.1に結合するペプチドにより包括されうる。同様に、アジア人の集団の過半数は５番目のHLA-A11.2に結合するペプチドの追加で包括されうる。

ペプチド化合物を説明するために用いる命名法は慣用の習慣に従っており、それにおいてはアミノ基を各アミノ酸残基の左側（Ｎ−末端）、そしてカルボキシル基をその右側（Ｃ−末端）に示している。本発明の特定の選ばれた態様を示す式においては、そのアミノ末端基及びカルボキシル末端基は、特に示していないが、何らかのことわりのない限り、生理学的pHにおいてそれらが帯びるであろう形態にある。アミノ酸構造式において、各残基は一般に標準の３文字又は１文字表示により表わしている。Ｌ−型のアミノ酸残基は大文字１文字により、又は３文字記号の最初の文字の大文字により表わされ、そしてそのＤ−型は小文字１文字により、又は３文字記号の最初の文字の小文字により表わされる。グリシンは不斉炭素原子を有さず、そして単に「Gly」又はＧで称している。
本発明のペプチドを同定するために用いる手順は一般に、引用することで本明細書に組入れるFalkらのNature 351：290（1991）に開示の方法に従う。簡単には、この方法はMHCクラスＩ分子の、典型的には適当な細胞又は細胞系からの免疫沈殿又はアフィニティークロマトグラフィーによる大量スケール単離を包括する。当業者に同等に知られる所望のMHC分子の単離のためのその他の方法の例にはイオン交換クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、サイズ排除、高性能リガンドクロマトグラフィー、及び上記の技術全ての組合せが含まれる。
特定のMHC分子、特にMHCクラスＩ分子を有する数多くの細胞が知られ、そして容易に入手できる。例えば、ヒトEBV形質転換Ｂ細胞系はクラスＩ及びクラスII MHC分子の分取単離にとっての優れた起源であることが知られている。よく特性化された細胞系が私的及び商業的起源、例えばアメリカン タイプ カルチャー コレクション（「Catalogue of Cell Lines and Hybridomas」第６版（1988）Rockville, Maryland, U.S.A）；ナショナル インスティチュート オブ ゼネラル メディカル サイエンス 1990／1991 Catalog of Cell Lines（NIGMS）；ヒューマン ジェネティック ミュータント セル レポジトリー、Camden, NJ；及びASHIレポジトリー，ビングハム アンド ウォメンズ ホスピタル, 75 Francis Street, Boston, MA 02115より入手できる。表２はHLA-Aアレルにとっての起源として利用するのに適当ないくつかのＢ細胞系を挙げている。これらの細胞系は全て大型バッチの中で増殖でき、それ故、MHC分子の大量生産にとって有用である。当業者は、これらは単なる代表的な細胞系であり、そして数多くのその他の細胞起源が採用されうることを認識しているであろう。HLA-B及びHLA-Cに対してホモ接合性の類似のEBV B細胞系がHLA-B及びHLA-Cアレルそれぞれにとっての起源として働きうる。

典型的なケースにおいては、免疫沈殿を所望のアレルに単離するために用いる。使用する抗体の特異性に応じて数多くのプロトコールが使用されうる。例えば、アレル−特異性mAb試薬はHLA-A, HLA-B及びHLA-C分子のアフィニティー精製のために使用できうる。HLA-A分子の単離のためにいくつかのmAb試薬が入手できる（表３）。従って、標的化HLA-Aアレルそれぞれに関して、HLA-A分子の直接的な単離のために利用することのできうる試薬が入手できる。標準の技術を用いてこれらのmAbで調製されたアフィニティーカラムは関連のHLA-Aアレル産物を精製するのに効果的に利用される。
アレル特異性mAbに加えて、広域反応性抗−HLA-A, B, C mAbs、例えばW6／32及びB9.12.1、並びに一の抗−HLA-B, C mAb, B1.23.2が、下記の実施例の章に記載の他のアフィニティー精製プロトコールに利用できうる。

単離MHC分子のペプチド結合性溝に結合したペプチドは酸処理を利用して一般に溶離される。ペプチドは様々な標準変性手段、例えば熱、pH、清浄剤、塩、カオトロピック剤又はそれらの組合せによりクラスＩ分子から解離することもできる。
ペプチド画分を逆相高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）によりMHC分子から更に分離させ、そして配列決定する。ペプチドは当業者によく知られている様々なその他の標準手段、例えば濾過、限外濾過、電気泳動、サイズクロマトグラフィー、特異的な抗体による沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動等により分離されうる。
単離ペプチドの配列決定は標準の技術、例えばエドマン分解により実施されうる（Hunkapiller, M.W.ら、Methods Enzymol. 91, 399〔1983〕）。配列決定にとって適当なその他の方法には、従来から述べられている個々のペプチドの質量分析配列決定が含まれる（Huntら、Science 225：1261（1992）、これは引用することで本明細書に組入れる）。様々なクラスＩ分子由来のバルクの異種ペプチド（例えばプールしたHPLC画分）のアミノ酸配列決定は典型的には各クラスＩアレルにとっての特徴的な配列モチーフを示す。
種々のクラスＩアレルに特異的なモチーフの特定は、アミノ酸配列のわかっている抗原性タンパク質由来の潜在的なペプチドエピトープの同定を可能にする。典型的には、潜在的なペプチドエピトープの同定は、まずモチーフの存在について、所望の抗原のアミノ酸配列をスキャンするコンピューターを使用して行われる。エピトープの配列を次に合成する。MHCクラス分子に結合する能力は様々な異なる方法で測定される。一の手段は下記の実施例10に記載のクラスＩ分子結合アッセイである。文献に記載されているその他の択一的な方法には、抗原表示（Setteら、J.Immunol. 141：3893（1991））、インビトロ集成アッセイ（Townsendら、Cell 62：285（1990））及び突然変異ellsを用いるFACSベースアッセイ、例えばRMA.S（Meliefら、Eur.J.Immunol. 21：2963（1991））が含まれる。
次に、MHCクラスＩ結合アッセイにおいて試験陽性であるペプチドを、インビトロで、特異的なCTL応答を誘発するペプチドの能力についてアッセイする。例えば、ペプチドとインキュベートした抗原表示細胞は、応答細胞集団におけるCTL応答を誘発する能力についてアッセイされうる。抗原表示細胞は正常細胞、例えば末梢血液単核細胞又は樹状細胞（Inabaら、J.Exp.Med. 166：182（1987）；Boog, Eur.J.Immunol. 18：219〔1988〕）でありうる。
他方、クラスＩ分子に内部プロセスを受けたペプチドを負荷する能力を欠く突然変異哺乳動物細胞系、例えばマウス細胞系RMA-S

及び人体Ｔ細胞ハイブリドーマ、Ｔ−２（Cerundoloら、Nature 345：449-452（1990））、並びに適当なヒトクラスＩ遺伝子でトランスフェクトされたものが、インビトロで一次CTL応答を誘発するペプチドの能力について試験するために、それにペプチドを加えるとき、好適に利用される。使用できうるその他の真核細胞系には様々な昆虫細胞系、例えば蚊の幼虫（ATCC細胞系CCL 125, 126, 1660, 1591, 6585, 6586）、蚕（ATCC CRL 8851）、行列うじ（ATCC CRL 1711）、蛾（ATCC CCL 80）及びしょうじょうばえ細胞系、例えばシュナイダー（Schneider）細胞系（Schneider J.Embryol.Exp.Morphol. 27：353-365（1927））が含まれる。それらは、適当なヒトクラスＩ MHCアレルをエンコードする遺伝子及びヒトβ２ミクログロブリン遺伝子でトランスフェクトされている。
末梢血液リンパ球は好都合には、正常ドナー又は患者の単純な静脈穿刺又は白血球搬送に従って好適に単離され、そしてCTL前駆体の応答細胞起源として使用される。一の態様において、適当な抗原表示細胞を、無血清培地中の10〜100μＭのペプチドと、適当な培養条件下で４時間インキュベートする。このペプチド負荷した抗原表示細胞を次にインビトロで７〜10日間、最適培養条件下で応答細胞集団とインキュベートする。陽性CTL活性化は、放射性ラベル化標的細胞、即ち、特異的なペプチドをパルスした標的、並びにペプチド配列が由来する関連のウィルス又は腫瘍抗原の内性プロセスを受けた形態を発現する標的細胞の両者を殺障するCTLの存在について培養物をアッセイすることにより決定できうる。
CTLの特異性及びMHC制限は、適切な又は不適切なヒトMHCクラスＩを発現する様々なペプチド標的細胞に対して試験することにより決定される。MHC結合アッセイにおいて試験陽性であり、且つ特異的なCTL応答を発生せしめるペプチドを本明細書において免疫原性ペプチドと呼んでいる。
免疫原性ペプチドは合成的に、もしくは組換DNA工学的に調製されうるか、又は天然起源、例えば完全ウィルスもしくは腫瘍から単離されうる。このペプチドはその他の天然の宿主細胞タンパク質及びそのフラグメントを実質的に含まないことが好ましいが、しかしながら一部の態様においては、このペプチドは天然フラグメント又は粒子に合成的に抱合されうる。このポリペプチド又はペプチドは様々な長さであってよく、その天然（無帯電）形態又は塩の形態のいづれかでよく、そして改質、例えばグリコシル化、側鎖酸化もしくはリン酸化を含んでいないか、又はこれらの改質を、その改質が本明細書に記載のポリペプチドの生物活性を破壊しないことを条件として含んでいてよい。
所望するには、このペプチドは可能な限り小さく、同時に、大型のペプチドの生物活性全てを実質的に保持し続ける。可能ならば、本発明のペプチドを、細胞表層上のMHCクラスＩ分子に結合している内生プロセスを受けたウィルス性ペプチド又は腫瘍細胞ペプチドとサイズにおいてつり合った９又は10のアミノ酸残基の長さへと最適化することが所望される。
所望の活性を有するペプチドは、一定の所望の性質、例えば向上した薬理的特徴を供し、同時に未改質ペプチドの所望のMHC分子に結合する及び適当なＴ細胞を活性化させる生理学的活性を高める又は少なくとも実質的にその全てを維持するように必要なだけ改質してよい。例えば、これらのペプチドは様々な改変、例えば置換（保存的又は非保存的）にかけてよく、この場合、かかる改変はその用途において一定の利点、例えば向上したMHC結合性を供しうる。保存的置換とは、あるアミノ酸残基を、生物学的及び／又は化学的に類似の別のものと交換すること、例えばある疎水性残基を別のもの、又はある極性残基を別のものと交換することをいう。この置換には、Gly, Ala；Val, Ile, Leu, Met；Asp, Glu；Asn, Gln；Ser, Thr；Lys, Arg；及びPhe, Tyrの如きの組合せが含まれる。単一のアミノ酸置換はＤ−アミノ酸を用いて行ってもよい。かかる改質は公知のペプチド手順、例えば引用することで本明細書に組入れる、Merrifield, Science 232：341-347（1986）, BaranyとMerrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer編（N.Y. Academic Press）頁1-284（1979）；及びStewartとYoung, Solid Phase peptide Synthesis,（Rockford, I11., Pierce）第２版（1984）に記載の手順を用いて行われうる。
これらのペプチドはその化合物のアミノ酸配列を伸ばす又は減らすことにより、例えばアミノ酸の付加又は欠失により改質させてもよい。本発明のペプチド又は類似体は一定の残基の順序又は組成を変えることにより改質することもでき、生物学的活性にとって必須の一定のアミノ酸残基、例えば重要な接触部位にあるもの又は保存残基は、生物学的活性に悪影響を及ぼすことなく一般に改変することができないことは容易に理解されるであろう。重要でないアミノ酸はタンパク質中の天然のもの、例えばＬ−α−アミノ酸又はそのＤ−異性体に限らず、非天然アミノ酸、例えばβ−γ−δ−アミノ酸、及びＬ−α−アミノ酸の数多くの誘導体が含まれうる。
典型的には、単一のアミノ酸置換を有する一連のペプチドを、結合に及ぼす静電荷、疎水性等の作用を決定するために採用する。例えば、一連の正帯電した（例えばLys又はArg）又は負帯電した（例えばGlu）アミノ酸置換を、様々なMHC分子及びＴ細胞レセプターに対して種々の感受性パターンを示しているペプチド伝いに施す。更に、小さな、比較的中性な成分、例えばAla, Gly, Pro又は類似の残基を用いる多重置換を採用してよい。これらの置換はホモオリゴマー又はヘテロ−オリゴマーであってよい。置換又は付加する残基の数及び種類は、必須の接点間の間隔及び期待する一定の機能的性質（例えば疎水性、対、親水性）に依存する。親ペプチドの親和性に比しての、MHC分子又はＴ細胞レセプターに対する高められた結合親和性も、かかる置換によって達し得る。あらゆる状況において、かかる置換は、結合性を破壊しうる例えば立体及び帯電障害を回避するように選ばれるアミノ酸残基又はその他の分子フラグメントを採用すべきである。
アミノ酸置換は典型的には単一残基とする。置換、欠失、挿入又は任意のそれらの組合せを最終ペプチドにおいて現れるように組合せてよい。置換変異体はペプチドのうちの少なくとも一残基が除去され、そしてその場所に別の残基が挿入されているものである。かかる置換は、ペプチドの特徴を適当に調節することを所望するとき、一般には下記の表４に従って行う。

機能（例えば、MHC分子又はＴ細胞レセプターに対する親和性）の実質的な変更は、表４におけるものより保存性の低い置換を選ぶ、即ち、（ａ）置換領域におけるペプチド骨格の構造、例えばシートもしくはヘリックスコンホメーション、（ｂ）標的部位での分子の帯電もしくは疎水性、又は（ｃ）側鎖のかさ高さ、の維持に及ぼすその効果においてより有意に異なる残基を選ぶことによりなされる。一般にはペプチドの特性において最大の変更をもたらすものと予測される置換は、（ａ）親水性残基、例えばセリルを（により）疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルもしくはアラニルに（を）置換する；（ｂ）正電側鎖を有する残基、例えばリシル、アルギニルもしくはヒスチジルを（により）、負電側鎖を有する残基、例えばグルタミルもしくはアスパルチルに（を）置換する；又は（ｃ）かさ高い側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンを（により）、側鎖を有さないもの、例えばグリシンに（を）置換する、ものであろう。
これらのペプチドは免疫原性ペプチドの中に２以上の残基の同配体（isostere）も含んで成りうる。ここで定義する同配体とは、２以上の残基数の配列であって、第二配列を置換することのできる配列であり、なぜならこの第一の配列の立体コンホメーションが第二配列に特異的な結合部位に整合するからである。この語は特に、当業者によく知られているペプチド骨格改質を含む。かかる改質にはアミド窒素、α−炭素、アミドカルボニルの改質、アミド結合の完全交換、伸長、欠失又は骨格架橋が含まれる。一般にはSpatola, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, peptides and Proteins, Vol.VII（Weinstein編、1983）を参照のこと。
様々な擬アミノ酸又は非天然アミノ酸によるペプチドの改質はインビボでのペプチドの安定性を高めるうえで特に有用である。安定性は数多くの方法でアッセイされうる。例えば、ペプチダーゼ及び様々な生物学的媒体、例えば血漿及び血清が安定性を試験するのに用いられている。例えば、Verhoefら、Eur.J.Drug Metab Pharmacokin. 11：291-302（1986）を参照のこと。本発明のペプチドの半減期は25％のヒト血清（ｖ／ｖ）アッセイを用いて慣用的に決定される。このプロトコールは一般に下記の通りである。プールしたヒト血清（AB型、非熱不活性化）を使用前に遠心により脱脂する。次にこの血清をRPMI組織培養培地で25％にまで希釈し、そしてペプチドの安定性を試験するために用いる。所定の時間間隔において、少量の反応溶液を取出し、そして６％の水性トリクロロ酢酸又はエタノールに加える。濁った反応サンプルを15分間冷やし（４℃）、次いで沈殿した血清タンパク質をペレットにするために遠心する。次に、ペプチドの存在を逆相HPLCにより、安定−特異的なクロマトグラフィー条件を利用して決定する。
本発明のペプチド又はCTL刺激活性を有するその類似体は、向上した半減期以外の所望の性質を供するように改質してよい。例えば、CTL活性を誘発するペプチドの能力は、Ｔヘルパー細胞応答を誘発することのできる少なくとも一のエピトープを含む配列への結合によって高めることができうる。特に好適な免疫原性ペプチド／Ｔヘルパーコンジュゲートはスペーサー分子を介して連結させる。このスペーサーは典型的には比較的小さい天然分子、例えばアミノ酸又は擬アミノ酸であって、生理的条件下で実質的に無帯電であるものを含んで成る。これらのスペーサーは典型的には例えばAla, Gly又はその他の非極性のアミノ酸もしくは中性の極性のアミノ酸の中性スペーサーより選ばれる。任意的に存在しているスペーサーは同一の残基より成っている必要はなく、従ってヘテロ−又はホモ−オリゴマーでありうる。存在しているとき、このスペーサーは通常少なくとも１又は２の残基数、より通常には３〜６の残基数であろう。他方、CTLペプチドはスペーサー抜きでＴヘルパーペプチドに連結されていてよい。
免疫原性ペプチドを、CTLペプチドのアミノ又はカルボキシ末端のいづれかに直接又はスペーサーを介してＴヘルパーペプチドに連結してよい。免疫原性ペプチド又はＴヘルパーペプチドのアミノ末端はアシル化してよい。
一定の態様においては、本発明の薬理組成物の中にCTLを感作するのに補助する少なくとも一の成分を含ませることが所望されうる。脂質はウィルス性抗原に対してインビボでCTLを感作することを補助できる因子として同定されている。例えば、パルミチン酸残基をLys残基のアルファー及びエプシロンアミノ基に付加し、次いで例えば１又は複数の連結残基、例えばGly, Gly-Gly, Ser, Ser-Ser、等を介して免疫原性ペプチドに連結させる。脂質付加ペプチドを次に、ミセル形態で直接的に、リポソームの中に含ませて、又は不完全フロインドアジュバントの如きのアジュバントの中に乳化させて注射してよい。好適な態様において、特に有効な免疫原は、免疫原性ペプチドのアミノ末端にSer-Serの如きの連結を介して付加されているLysのアルファー及びエプシロンアミノ基に付加されたパルミチン酸を含んで成る。
CTL応答の脂質感作の別の例として、Ｅ．コリ（E. coli）リポタンパク質、例えばトリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステインリセリル−セリン（P₃CSS）が、適当なペプチドに共有結合させているとき、ウィルス特異性CTLを感作するのに用いることができうる。引用することで本明細書に組入れるDeresら、Nature 342：561-564（1989）を参照のこと。例えば本発明のペプチドはP₃CSSに複合させてよく、そして標的抗原に対するCTL応答を特異的に感作するために個体にそのリポペプチドを投与してよい。更に、中和用抗体の誘発も適当なエピトープを表示するペプチドに抱合されたP₃CSSで感作することができるため、これらの２つの組成物を、感染に対する体液及び細胞媒介型応答をより効果的に誘発するように組合せることができる。
更に、追加のアミノ酸をペプチドの末端に付加して、ペプチド同志の連結のし易さ、担体支持体もしくは大型のペプチドへのカップリング、ペプチドもしくはオリゴペプチドの物理的もしくは化学的性質の改質、等を供することができる。アミノ酸、例えばチロシン、システイン、リジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸等を、ペプチド又はオリゴペプチドのＣ−又はＮ−末端に導入してよい。あるケースにおいてはＣ末端の改質はペプチドの結合特性を変えてしまいうる。更に、ペプチド又はオリゴペプチドの配列は、天然配列とは、末端NH₂アシル化により、例えばアルカノイル（Ｃ₁−Ｃ₂₀）又はチオグリコイルアセチル化、末端−カルボキシルアミド化（例えばアンモニア、メチルアミン等）により改質されていることで異なりうる。ある状況において、これらの改質は支持体又はその他の分子に対する連結のための部位を担いうる。
本発明のペプチドは様々な方法で調製できうる。その比較的小さなサイズを理由に、これらのペプチドは慣用の技術に従って溶液中又は固相支持体上で合成されうる。様々な自動合成装置が市販され、そして公知のプロトコールに従って利用されうる。例えばStewartとYoung, Solid Phase Peptide Synthesis、第２版、Pierce Chemical Co.（1984）前掲を参照のこと。
他方、組換DNA工学を採用してよく、この場合、課題の免疫原性ペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を発現ベクターの中に挿入し、適当な宿主細胞に形質転換又はトランスフェクトし、そして発現にとって適当な条件下で培養する。これらの手順は当業界に一般に知られ、一般には引用することで本明細書に組入れるSambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York（1982）に記載されている。従って、本発明の１又は複数のペプチド配列を含んで成る融合タンパク質を適当なＴ細胞エピトープを提供するために使用できうる。
ここで考慮する長さのペプチドについてのコード配列は化学技術、例えばMatteucciらJ.Am.Chem.Soc. 103：3185（1981）のホスホトリエステル法により合成できうるため、改質は適当な塩基で天然ペプチド配列をエンコードするものを置換することにより簡単に行われうる。次にコード配列に適当なリンカーを施し、そして当業界において一般に入手できる発現ベクターにリゲートし、そしてそのベクターを所望の融合タンパク質を作るために適当な宿主を形質転換するのに使用する。数多くのかかるベクター及び適当な宿主系が現在入手できる。融合タンパク質の発現のためには、コード配列には、作動連結した開始及び終止コドン、プロモーター及びターミネーター領域、並びに通常は所望の細胞性宿主の中での発現のための発現ベクターを供するように複製系が施されている。例えば、細菌宿主と適合性なプロモーター配列を、所望のコード配列の挿入のために好都合な制限部位を含むプラスミドの中に供する。得られる発現ベクターを適当な細菌宿主に形質転換させる。むろん、酵母又は哺乳動物細胞宿主も、適当なベクター及びコントロール配列を採用しながら利用してよい。
本発明のペプチド並びにその薬理及びワクチン組成物はウィルス感染症及び癌を処置及び／又は予防するために哺乳動物、特にヒトに投与するのに有用である。本発明の免疫原性ペプチドを利用して処置できうる障害の例には前立腺癌、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、AIDS、腎細胞癌、頸部癌、リンパ腫、CMV及び尖圭コンジローム症が含まれる。
薬理組成物に関して、本発明の免疫原性ペプチドは癌で既に苦しんでいる、又は課題のウィルスで感染した個体に投与する。感染症の潜伏期又は急性期における者は個別に、又は適宜その他の処置と一緒に免疫原性ペプチドで処置できうる。治療的用途においては、組成物はウィルス又は腫瘍抗原に対する効果的なCTL応答を誘発するのに、並びに症状及び／又は合併症を治癒又は少なくとも軽減するのに十分な量で患者に投与する。これを成し遂げるのに適当な量を「治療的に有効な投与量」と定義する。この用途にとって有効な量は例えばペプチドの組成、投与方法、処置すべき障害の段階及び重症度、患者の体重及び一般的な健康状態、並びにかかりつけの医師の判断に依存するであろうが、しかし一般には、70kgの体重の患者に関して約1.0μｇ〜約5000μｇのペプチドに範囲する初期免疫（即ち、治療的又は予防的投与）、それに続く患者の血液における比CTL活性を測定することを介する患者の応答及び状態に依存して数週間から数ヶ月にわたる、ブースト療法に依存して約1.0μｇ〜約1000μｇのペプチドのブースト投与量に範囲する。本発明のペプチド及び組成物は一般に重症な障害症状、即ち生命を脅やかす又は潜在的に生命を脅やかす状況において採用されうることを念頭に置かねばならない。かかるケースにおいては、外来物質の最少限化、及びこのペプチドの比較的無毒な性質の観点において、実質的に過剰なこれらのペプチド組成物を投与することを処置医師は可能であり、且つ所望すると感じうるであろう。
治療的用途にとっては、投与はウィルス感染症の最初の徴候において、又は腫瘍の検査もしくは外科除去において、又は急性感染症の場合は診断の直後において開始すべきである。これに、症状が少なくとも実質的に和らぐまで、且つその後一定期間までブースト投与を続ける。慢性感染症においては、負荷投与、それに続くブースト投与が必要とされうる。
本発明の組成物による感染個体の処置は急性感染個体における感染症の消散を早めうる。慢性感染症に進行し易い（又はかかり易い）個体にとって、この組成物は急性から慢性感染症に至る進行を阻止する方法において特に有用である。感受性の個体が感染前又は感染中に例えばここに記載の通りに同定された場合、この組成物をそれを標的とすることができ、大集団に投与する必要性が最少限となる。
このペプチド組成物は慢性感染症の処置のため及びキャリヤー中のウィルス感染細胞を排除するように免疫系を刺激するためにも利用できうる。細胞障害性Ｔ細胞応答を効果的に刺激するのに十分な量の製剤中の免疫相剰化ペプチド及び投与方法を提供することが重要である。従って、慢性感染症の処置にとって、代表的な用量は、70kgの患者にとって一回の投与当り約1.0μｇ〜約5000μｇ、好ましくは約５μｇ〜1000μｇに範囲する。免疫投与、それに続く樹立された間隔、例えば１〜４週間でのブースト投与が、おそらくは個体を有効に免疫するために長期間にわたって必要とされうる。慢性感染症においては、投与は、臨床症状又は実験室検査が、ウィルス感染症が排除されたか又は実質的に緩和されたことを示唆するまで、及びその後の一定期間まで少なくとも続けるべきである。
治療的処置のための薬理組成物は非経口、塗布、経口又は局所投与を意図する。好ましくは、この薬理組成物は非経口的に、例えば静脈内的に、皮下的に、皮内的に、又は筋肉内的に投与する。従って、本発明は、許容担体、好ましくは水性担体の中に溶解又は懸濁されている免疫原性ペプチドの溶液を含んで成る非経口投与用組成物を提供する。様々な水性担体、例えば水、緩衝水、0.9％の食塩水、0.3％のグリシン、ヒアルロン酸等が使用されうる。これらの組成物は慣用のよく知られた滅菌技術により滅菌されうるか、又は滅菌濾過されうる。得られる水性溶液はそのまま使用するように包装するか、又は凍結乾燥してよく、凍結乾燥調製品は投与前に滅菌溶液と組合せる。この組成物は必要ならば生理条件に近づけるための薬理学的に許容されている補助物質、例えばpH調整剤及び緩衝剤、毒性調節剤、湿潤剤等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート等を含みうる。
薬理製剤中の本発明のCTL刺激ペプチドの濃度は大幅に変えてよく、即ち、約0.1重量％未満から、通常は約２重量％以上から、20〜50重量％、又はそれより大に変えてよく、そしてそれは主に流体容量、粘度等により、選ばれた投与の特定の態様に従って選ばれる。
本発明のペプチドはリポソームを介して投与してもよく、リポソームはペプチドを特定の組織、例えばリンパ組織に狙い打ちさせるのに働くか、又は感染細胞を特異的に狙い打ちさせ、更にペプチド組成物の半減期を長くする。リポソームにはエマルジョン、フォーム、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散体、ラメラ層等が含まれる。これらの調製品において、輸送すべきペプチドはリポソームの一部として、単独で、又は例えばリンパ球細胞にわたって広がるレセプターに結合する分子と、例えばCD45抗原に結合するモノクローナル抗体と、又はその他の治療的もしくは免疫原性組成物と一緒に組込まれる。即ち、所望の本発明のペプチドの詰まったリポソームは、リンパ球細胞の部位に導かれることができ、そこにリポソームは選ばれた治療的／免疫学的ペプチド組成物を導入する。本発明において利用するリポソームは標準の小胞体形成脂質より形成され、これは一般に中性及び負帯電リン脂質とステロール、例えばコレステロールとを含む。脂質の選択は一般に例えばリポソームのサイズ、酸不安定性及び血液中でのリポソームの安定性を考慮して導かれる。様々な方法がリポソームを調製するのに有用であり、例えば引用することで本明細書に組入れる、Szokaら、Ann.Rev.Biophys.Bioeng. 9：467（1980）、米国特許第4,235,871、4,501,728、4,837,028及び5,019,369号に記載されている。
免疫細胞を狙い打ちするため、リポソームの中に組込むリガンドには、例えば所望の免疫系細胞の細胞表層決定基に特異的な抗体又はそのフラグメントが含まれうる。ペプチドを含むリポソーム懸濁物には静脈内的に、局所的に、塗布的に、等により、とりわけ投与の方法、導入すべきペプチド、及び処置すべき障害の段階に従って変わる投与量で投与されうる。
固形組成物に関して、慣用の無毒の固形単体が使用でき、これには例えば薬理級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等が含まれる。経口投与のためには、薬理学的に許容される無毒の組成物は、任意の通常採用されている賦形剤、例えば先に挙げた担体と、一般には10〜95％の、そしてより好ましくは25％〜75％の活性成分、即ち、１又は複数種の本発明のペプチドとを一体化させることにより作られる。
エアゾール投与のためには、この免疫原性ペプチドは好ましくは界面活性剤及び噴射剤と一緒に細く分割した形態で供給する。ペプチドの典型的なパーセンテージは0.01〜20重量％、好ましくは１〜10重量％である。むろん界面活性剤は無毒でなくてはならず、そして好ましくは噴射剤中で可溶性である。かかる試薬の代表は６〜22個の炭素原子を含む脂肪酸、例えばカプロン酸、オクタノン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノーレニン酸、オレステリン酸及びオレイン酸と、脂肪式多価アルコール又はその環状無水物とのエステル又は半エステルである。混合エステル、例えば混合又は天然グリセリドを使用してよい。この界面活性剤はこの組成物の0.1〜20重量％、好ましくは0.25〜５重量％を構成しうる。この組成物の残りを通常は噴射剤とする。所望するならば、経鼻導入のためのレシチンの如き、担体をも含ませてよい。
別の観点において、本発明は、活性成分として本明細書に記載の免疫学的に有効な量の免疫原性ペプチドを含むワクチンに向けられている。このペプチドは宿主、例えばヒトに、それ自体の担体に結合させておいて、又は活性ペプチド単位のホモポリマー又はヘテロポリマーとして導入することができうる。かかるポリマーは免疫反応を高める長所と、そのポリマーを作るのに種々のペプチドを使用しているときは、ウィルス又は腫瘍細胞の種々の抗原決定基と反応する抗体及び／又はCTLを誘発する追加の能力とを有する。有用な担体は当業界によく知られており、そして例えばチログロブリン、アルブミン、例えば牛血清アルブミン、破傷風毒素、ポリアミノ酸、例えばポリ（リジン：グルタミン酸）、Ｂ型肝炎ウィルスコアタンパク質、Ｂ型肝炎ウィルス組換ワクチン等が含まれる。このワクチンは生理学的に寛容（許容）されている希釈剤、例えば水、リン酸緩衝食塩水、又は食塩水も含み、そして更に典型的にはアジュバントを含む。アジュバント、例えば不完全フロインドアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム又はみょうばんが当業界においてよく知られている物質である。更に、上記した通り、CTL応答は本発明のペプチドを脂質、例えばP₃CSSに抱合させることにより感作させることができうる。本明細書に記載のペプチド組成物による、注射、エアゾール、経口、経皮又はその他のルートを介しての免疫により、宿主の免疫系は所望の抗原に対して特異的な大量のCTLを産生することによりそのワクチンに応答し、そしてその宿主はその後の感染に対して少なくとも部分的に免疫されるか、又は慢性感染症の進行に耐性となる。
本発明のペプチドを含むワクチン組成物をウィルス感染症又は癌にかかり易い又はそうでなければその危険性にある患者に投与して、抗原に対する免疫応答を誘発させ、そしてこれによって患者自身の免疫応答能力を高める。かかる量を「免疫学的に有効な量」と定義する。この用途において、ここでもその正確な量は患者の健康状態及び体重、投与態様、製剤の種類等に依存するが、しかしながら一般には70kgの患者当り約1.0μｇ〜約5000μｇ、より通常には70kgの体重当り約10μｇ〜約500μg mgに範囲する。
ある状況においては、本発明のペプチドワクチンを、課題のウィルス、特にウィルスエンベロープ抗原に対して応答する中和抗体と組合せることが所望されうる。
治療的又は免疫化の目的のためには、本発明のペプチドは弱毒化ウィルス宿主、例えばワクシニア又は伝染性上皮腫ウィルスにより発現させることもできる。この手法は、本発明のペプチドをエンコードするヌクレオチド配列を発現させるためのベクターとしてのワクシニアウィルスの利用を包括する。急性もしくは慢性感染宿主、又は未感染宿主への導入により、組換ワクシニアウィルスは免疫原性ペプチドを発現し、それ故宿主CTL応答を誘発する。
免疫プロトコールにおいて有用なワクシニアベクター及び方法は、例えば引用することで本明細書に組入れる米国特許第4,722,848号に記載されている。他のベクターはBCG（Bacille Calmette Guerin）である。BCGベクターは引用することで本明細書に組入れるStoverら（Nature 351：456-460（1991））を参照のこと。本発明のペプチドの治療的投与又は免疫化にとって有用な幅広い様々なその他のベクター、例えばサルモネラ チフィ（Salmonella typhi）ベクター等は、本明細書より当業者にとって明らかとなるであろう。
抗原性ペプチドは同様に生体外でCTLを誘発するのに使用できうる。得られるCTLは、他の慣用の治療様式では応答しない、又はペプチドワクチン治療手法に応答しないであろう患者の慢性感染症（ウィルス性又は細菌性）又は腫瘍を処置するのに利用できうる。特定の病原体（感染因子又は腫瘍抗原）に対する生体外CTL応答は、組織培養において患者のCTL前駆細胞（CTLp）を、抗原表示細胞（APC）の起源及び適当な免疫原性ペプチドとインキュベートすることにより誘発させる。CTLpが活性化され、そして成熟し、そしてエフェクターCTLへと増殖する適当なインキュベーション時間後（典型的には１〜４週間）、それらの細胞を患者に戻し注入し、そこでこれらはその特異的な標的細胞（感染細胞又は腫瘍細胞）を破壊するであろう。特異的な細胞障害性Ｔ細胞の発生のためのインビトロ条件を最適化するため、刺激細胞の培養物を適当な無血清培地の中に維持する。
刺激細胞を、活性化すべき細胞、例えばCD8⁺前駆細胞とインキュベートする前に、抗原性ペプチドを刺激細胞培養物に、刺激細胞の表層上に発現されるヒトクラスＩ分子の上にそれが負荷されるに十分な量で加える。本発明において、十分な量のペプチドとは、約200、そして好ましくは200以上のヒトクラスＩ MHC分子が、各刺激細胞の表層上に発現されるペプチドで負荷される量をいう。好ましくは、この刺激細胞は＞20μｇ／mlのペプチドとインキュベートする。
休止又は前駆CD8⁺細胞を次に培養物の中で、適当な刺激細胞と、CD8⁺細胞を活性化させるに十分な時間にわたってインキュベートする。好ましくは、CD8⁺細胞は抗原特異的な様式で活性化させる。休止又は前駆CD8⁺（エフェクター）細胞、対、刺激細胞の比は、個体間で変わりうるものであり、そして更には培養条件に対するその個体のリンパ球の適合性、並びに障害の症状の種類及び重症度、又は記載の処置様式を使用する条件の如きの変化に依存しうる。しかしながら、好ましくは、リンパ球：刺激細胞の比は約30：１〜300：１の範囲とする。エフェクター／刺激培養物は、治療的に有用又は有効な数のCD8⁺細胞を刺激するのに必要な時間維持する。
インビトロでのCTLの誘発は、APC上のアレル特異的MHCクラスＩ分子に結合しているペプチドの特異的な認識を必要とする。APC当りの特異的MHC／ペプチド複合体の数は、CTLの刺激、特に一次免疫応答において重要である。細胞当り少量のペプチド／MHC複合体が細胞をCTLによる溶解を受け易くするのに、又は二次CTL応答を刺激するのに十分であるが、一次応答中でのCTL前駆体（pCTL）の有効な活性化は有意に多量なMHC／ペプチド複合体を必要とする。細胞上のエンプティーな主要組織適合性複合分子のペプチド負荷は一次細胞障害性Ｔリンパ球応答の誘発をもたらす。細胞上のエンプティーな主要組織適合性複合分子のペプチド負荷は一次細胞障害性Ｔリンパ球応答の誘発を可能にする。
突然変異細胞系は全てのヒトMHCアレルに存在していないため、APCの表層から内性MHC結合化ペプチドを除去し、次いで得られるエンプティーなMHC分子に課題の免疫原性ペプチドを負荷する技術を利用するのが好都合である。非形質転換（非腫瘍原性）、非感染細胞、そして好ましくは患者の自己細胞のAPCとしての利用が、生体外CTL療法の開発に向けられているCTL誘発プロトコールのデザイルにとって所望される。本願はAPCから内性MHC結合化ペプチドをストリップ（脱離）し、次いで所望のペプチドを負荷する方法を開示する。
安定なMHCクラスＩ分子は下記の要素より成る三量複合体である：１）通常８〜10残基数のペプチド、２）α１及びα２ドメインにおいてペプチド結合性部位を抱えているトランスメンブラン多形成タンパク質重鎖、並びに３）非共有結合した非多形性軽鎖、β２ミクログロブリン。この複合体から結合ペプチドを除去及び／又はβ２ミクログロブリンを解離することは、MHCクラスＩ分子を非機能性に、且つ不安定にし、迅速分解をもたらす。PBMCから単離したMHCクラスＩ分子全てに内生ペプチドが結合している。従って、第一段階は、APC上のMHCクラスＩ分子に結合している全ての内生ペプチドを、外生ペプチドを加える前に、それを壊すことなく除去することにある。
MHCクラスＩ分子を結合ペプチドから解放する二通りの考えられる方法には、β２ミクログロブリンを不安定化するために培養温度を一夜かけて37℃から26℃に下げること、及び温和な酸処理を利用して細胞から内生ペプチドをストリップすることが含まれる。この方法は既に結合しているペプチドを細胞外環境へと放出させ、新たな外生ペプチドがそのエンプティーなクラスＩ分子に結合することを可能にする。低温インキュベーション法は外生ペプチドがMHC複合体に効率的に結合することを可能にするが、26℃での一夜のインキュベーションを必要とし、これは細胞の代謝率を遅めうる。勢力的にMHC分子を合成しない細胞（例えば休止PBMC）は低温手順によっては大量のエンプティーな表層MHC分子を供しないであろう。
苛酷な酸ストリップには、トリフルオロ酢酸、pH２によるペプチドの抽出、又は免疫アフィニティー精製したクラスＩ−ペプチド複合体の酸変性が含まれる。これらの方法は、CTL誘発にとっては可能でなく、なぜなら内生ペプチドを除去し、同時に抗原表示にとって重要である。APCの生存及び最適な代謝状態を保持することが重要だからである。グリシン又はクエン酸−リン酸バッファーの如きのpH３の温和な酸性溶液が、内生ペプチドを同定するために、及び腫瘍結合化Ｔ細胞エピトープを同定するために使用される。この処理は、MHCクラスＩ分子のみが不安定となり（従って結合ペプチドが遊離する）、一方、MHCクラスII分子を含むその他の表層抗原が完全のままである点で特に有効である。最も重要には、温和な酸溶液による細胞の処理は細胞の生存率又は代謝状態に影響を及ぼさない。この温和な酸処理は迅速であり、なぜなら内生ペプチドのストリップは４℃で２分において起こり、そしてAPSは適当なペプチドを負荷した後にその機能を発揮する準備ができているからである。この技術はここでは一次抗原特異的CTLの発生のためのペプチド特異的CTLを作るのに利用されている。得られるAPCはペプチド特異的CD8⁺CTLを誘発するうえで有効である。
活性化CD8⁺細胞は様々な公知の方法のどれかを利用して刺激細胞から効率的に分離することができうる。例えば、刺激細胞に対して、刺激細胞上に負荷したペプチドに対して、又はCD8⁺細胞に対して特異的なモノクローナル抗体（又はそのフラグメント）を、その適当な補体リガンドを結合せしめるために利用してよい。次に抗体標識分子を適当な手段を介して、例えばよく知られている免疫沈殿又はイムノアッセイ法を介して、刺激−エフェクター細胞混合物から抽出してよい。
活性化CD8⁺細胞の効果的な細胞障害性の量はインビトロ及びインビボ用途間で、並びにこれらのキラー細胞の究極的な標的である細胞の量及び種類により変わりうる。その量は患者の症状に依存しても変わり、そして医師による全ての適当な要因の考慮を通じて決定されるべきである。しかしながら、好ましくは約１×10⁶〜約１×10¹²、より好ましくは約１×10⁸〜約１×10¹¹、そして更により好ましくは約１×10⁹〜約１×10¹⁰の活性化CD8⁺細胞を成人に利用し、対比してマウスにおいては約５×10⁶〜５×10⁷の細胞を利用する。
好ましくは、前述の通り、活性化CD8⁺細胞は細胞培養物より、処置すべき個体へのCD8⁺細胞の投与前に回収する。しかしながら、その他の現状の及び提唱されている処置様式と異なり、本法は腫瘍原性でない細胞培養系を使用することを認識しておくことが重要である。従って、もし刺激細胞を活性化CD8⁺細胞の完璧な分離が達せない場合でも、少ない数の刺激細胞の投与に関して知られている。固有の危険性はなく、一方、哺乳動物腫瘍促進性細胞の投与は非常に有害でありうる。
細胞成分の再導入法は当業界に知られ、そして米国特許第4,844,893号Hookら及び米国特許第4,690,915号Rosenbergに例示の如き手順が含まれる。例えば、静脈内点滴を介しての活性化CD8⁺細胞の投与が適当である。
本発明の免疫原性ペプチドはモノクローナル抗体を作るのにも利用できうる。かかる抗体は有効な診断又は治療剤として有用でありうる。
これらのペプチドは診断試薬としても有用でありうる。例えば、本発明のペプチドは、このペプチド又は近縁のペプチドを採用する処置療法に対する特定の個体の感受性を決定するのに使用することができ、それ故現存の処置プロトコールを改良するうえで、又は冒されている個体にとっての予後を決定するうえで役立ちうる。更に、このペプチドは慢性感染症に進行する実質的な危険性にあるであろう個体を推測するのに利用されもする。
下記の実施例は例示であって限定のために提示するのではない。
実施例１
クラスＩ抗原の単離
HLA-A抗原精製法の流れ図を図１に示す。簡単には、適当なアレルを抱えている細胞を大量バッチ（６〜８リットル；〜５×10⁹細胞を生み出す）で増殖させ、遠心により回収し、そして洗った。全ての細胞系を、10％の胎児牛血清（FBS）及び抗生物質の添加したRPMI 1640培地の中に維持しておいた。大量スケール培養物のため、細胞を10％のFBS又は10％のウマ血清及び抗生物質を有するRPMI 1640の中でローラーボトル培養で増殖させた。細胞は259ローターの付いたIEC-CRV 5000遠心機による1500RPMの遠心によって回収し、そしてリン酸緩衝食塩水PBS（0.01ＭのPO₄、0.154ＭのNaCl、pH7.2）で３回洗った。
細胞をペレットにし、そして−70℃で保管するか、又は清浄剤リゼートを調製するために清浄剤溶解溶液で処理した。細胞リゼートはストック清浄剤溶液〔１％のNP-40（sigma）又はRenex 30（Accurate Chem.Sci.Corp., Westbury, NY 11590）、150mMのNaCl、50mMのトリス、pH8.0〕の、細胞ペレット（予めカウント済み）への、清浄剤溶液のml当り50〜100×10⁶細胞の比での添加により調製した。プロテアーゼインヒビターのカクテルを予め測定しておいた容量のストック清浄溶液に、細胞ペレットへの添加の直前に加えた。プロテアーゼインヒビターカクテルの添加は下記の最終濃度をもたらした：フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）２mM；アプロチニン５μｇ／ml；ロイペプチン10μｇ／ml；ペプスタチン10μｇ／ml；ヨードアセトアミド100μＭ；及びEDTA 3ng／ml。細胞溶解は４℃で１時間、定期的に混合して進行させた。通常５〜10×10⁹の細胞を50〜100mlの清浄剤溶液の中で溶解させた。このリゼートを４℃で15,000×ｇで30分間の遠心、及び上清画分の0.2μのフィルターユニット（Nalgene）へのその後の通過によって清澄化した。
HLA-A抗原の精製は、mAb−コンジュゲート化Sepharoseビーズにより調製したアフィニティーカラムを用いて成し遂げた。抗体製造のため、細胞を大型組織培養フラスコ（Corning 25160-225）の中で10％のFBSを有するRPMI中で増殖させた。抗体を清澄組織培養培地から、硫酸アンモニウム分画、それに続くプロテインA-Sepharose（Sigma）上でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。簡単には、飽和硫酸アンモニウムを、撹拌しながらゆっくりとこの組織培養上清液に45％（容量、対、容量）に至るまで加えて４℃で一夜イムノグロブリンを沈殿させた。その沈殿タンパク質を10000×ｇで30分の遠心により回収した。次いでこの沈殿物を最少容量のPBSに溶かし、そして透析チューブ（Spectro／Por 2, Mol.wt.カットオフ値12,000〜14,000；Spectum Medical Ind.）に移し入れた。透析はPBS（タンパク質溶液の容量の≧20倍）に対して、４℃で24〜48時間にわたり、４〜６回透析バッファーを交換しながら行った。透析したタンパク質溶液を遠心により（10,000ｇで30分）清澄化し、そしてその溶液のpHを１ＮのNaOHでpH8.0に調整した。プロテイン−A-Sepharose（Sigma）をその製造者の仕様書に従って水和し、そしてプロテイン−A-Sepharoseカラムを用意した。10mlベット容量のカラムは一般に50〜100mgのマウスIgGを結合せしめる。
タンパク質サンプルは、大量の装填容量に関してはペリスタルポンプを、又は少容量（＜100ml）に関しては重力を利用してプロテイン−A-Sepharoseカラムに載せた。そのカラムを数倍容量のPBSで洗い、そして溶出物を光度計によりＡ₂₈₀で基底線に達するまでモニターした。結合抗体は適当なpHの0.1Ｍのクエン酸（１ＮのNaOHで適当なpHに調整）を用いて溶離させた。マウスIgG-1に関しては、pH6.5を使用し、IgG2aに関してはpH4.5を使用し、そしてIgG2b及びIgG3に関してはpH3.0を使用した。２Ｍのトリスベースを溶離物を中和するために用いた。抗体を含む画分（Ａ₂₈₀によりモニター）をプールし、PBSに対して透析し、そしてAmicon Stirred Cellシステム（Amicon Model 8050；YM30膜付き）を用いて更に濃縮した。抗−A2 mAb, BB7.2、及び抗−A3 mAb, GAPA3がアフィニティー精製にとって特に有用である。
HLA-A抗原はmAb−コンジュゲートをSepharoseビーズで準備したアフィニティーカラムを用いて精製した。このアフィニティーカラムはプロテイン−A-Sepharoseビーズ（Sigma）を上記の通りにアフィニティー精製mAbとインキュベートすることにより準備した。ビーズのml当り５〜10mgのmAbが好適な比である。mAb結合ビーズを硼酸バッファー（硼酸バッファー：100mMの四硼酸ナトリウム、154mMのNaCl、pH8.2）で、洗浄液がＡ₂₈₀で基底線を示すまで洗った。200mMのトリエタノールアミン中のジメチルピメリミデート（20mM）を、結合mAbをプロテイン−A-Sepharoseに共有架橋させるために加えた（Schneiderら、J.Biol.Chem. 257：10766（1982））。ローテーター上で室温において45分インキュベートした後、過剰な架橋剤は、そのビーズを10〜20mlの20mMのエタノールアミン、pH8.2で洗うことにより除去した。各洗浄の間、そのスラリーをローテーター上に室温で５分間載せておいた。そのビーズを硼酸バッファー及びPBS＋0.2％のアジ化ナトリウムで洗った。
次いで細胞リゼート（５〜10×10⁹細胞当量）を５〜10mlのアフィニティーカラムにゆっくり通し（0.1〜0.25ml／分の流速）、固定化抗体にその抗原を組合させた。そのリゼートをカラムに通した後、そのカラムを順に20カラム容量の清浄剤ストック溶液＋0.1％のドデシル硫酸ナトリウム、20カラム容量の0.5ＭのNaCl、20mMのトリス、pH8.0、及び10カラム容量の20mMのトリス、pH8.0で洗った。mAbに結合したHLA-A抗原を塩基性バッファー溶液（水中の50mMのジエチルアミン）で溶離させた。別の方法として、酸性溶液、例えば0.15〜0.25Ｍの酢酸も結合抗原を溶離させるために用いた。溶離物のアリコート（１／50）を、比色アッセイ（BCAアッセイ、Pierce）もしくはSDS-PAGEのいづれか、又は両者を利用するタンパク質定量のために取出した。SDS-PAGE分析はLaemmli（Laemmli, U.K., Nature 227：680（1970））に記載の通りにして、既知量の牛血清アルブミン（Sigma）をタンパク質標準品として使用して行った。
特異的MHC分子を精製するためにアレル特異的分子を使用した。HLA-A2及びHLA-A3 mAbの場合、それぞれBB7.2及びGAPA3を使用した。精製したHLA-A3.2分子のSDS-PAGE分析の例を図２に示す。
図２は細胞系EHMよりアフィニティー精製したHLA-A3.2のSDS-PAGE（12.5％）分析を示す。アフィニティーカラム（10ml）は、HLA-A3に対して特異的なモノクローナル抗体GAPA3にカップルさせたプロテイン−A-Sepharoseビーズにより準備した。５×10⁹細胞の清浄剤リゼートをこのカラムに通し、そしてこのカラムをよく洗った。結合したHLA-A3.2分子を0.15Ｍの酢酸50mlでこのカラムから溶離させた。１mlの溶離物を取出し、そして凍結乾燥してこのサンプルを濃縮させた。このサンプルをLaemmliサンプルバッファーで50μｌにし、そして20μｌをレーン２に載せた。レーン１は分子量標準品を含む：ミオシン230kD；β−ガラクトシダーゼ116kD；ホスホリラーゼＢ 97.4kD；牛血清アルブミン66.2kD；オブアルブミン45kD；カルボニックアンヒドラーゼ31kD；ダイズトリプシンインヒビター21.5kD；及びリゾチーム14.4kD。牛血清アルブミンの標準の濃度10μｇをレーン８に、３μｇを９に、そして１μｇを10に、タンパク質の収率の評価に役立させるために流した。この特定のHLA-A3.2調製品に関して、推定収量は約112μｇであった。
HLA-A11, A24.1及びA1に関しては、抗−HLA-B及びＣモノクローナル抗体をHLA-B及びＣ分子を枯渇するために用いる別の方法を利用した。残りのHLA-A分子を次にW6／32 mAbを用いて下記の通りに精製した。
免疫蛍光染色分析の結果により示唆されるクラスＩ発現の密度を基礎に、EBV B細胞系より単離したクラスＩ抗原の平均収量は10¹⁰細胞当量当り800〜1200μｇに範囲するであろうと期待された。
実施例２
クラスＩの別の精製プロトコール
HLA-A2.1分子を、HLA-A抗原によってではなく、HLA-B及びＣアレル分子により現わされるエピトープを検出するmAb B1.23.2を用いて単離した。mAb w6／32は、HLA-A, B及びＣを含む全てのヒトクラスＩ分子を検出する。上記の通り、これらのmAbはHLA-A抗原の起源を担うＢ細胞系とよく反応する。B1.23.2 mAbは様々なヒトＢ細胞系と反応するが、トランスフェクトされたHLA-A2.1タンパク質又はキメラA2.1マウスＫ^b分子を発現するマウス細胞系とは反応しない。それは、HLA-A及びＢ分子の発現性を欠くが、しかし低レベルのHLA-C分子を発現するヒト細胞系CIR（Alexander, J.らImmunogenetics, 29, 380（1989））と反応する。この反応性パターンは、HLA-B及びＣ分子のＢ細胞リゼートを枯渇させるのにどのようにしてB1.23.2 mAbを使用できるかを示す。
アフィニティーカラムを上記の通りにアフィニティー精製したB1.23.2及びW6／32 mAbを用いて準備した。このアフィニティーカラムの準備のための手順は上記したアレル−特異的mAbカラムの準備に関して述べた手順と本質的に同一である。上述のプロトコールを利用し、HLA-B及びＣ分子の清浄剤リゼートを枯渇するためにB1.32.2 mAbアフィニティーカラムを使用した。次にHLA-B及びＣの枯渇した細胞リゼートをW6／32 mAbアフィニティーカラムに通した。この第二の通過より溶離したMHC分子はＡアレル産物である。
この別のアフィニティー精製は任意のHLA-Aアレル産物の精製にとって有用であり、そしてアレル−特異的mAbについての必要性を頼りとしない。更に、これはトランスフェクトされた細胞系から任意のクラスＩ分子タイプを単離するためにも使用できうる。
実施例３
天然プロセスを受けたペプチドの単離及び配列決定
塩基（50mMのジエチルアミン）溶離プロトコールに由来するHLA-A調製品のため、この溶離物を１Ｎの酢酸で直ちにpH7.0〜7.5に中和した。この中和溶離物をAmicon撹拌セル〔Modol 8050, YM3膜（Amicon）付き〕中で１〜２mlの容量に濃縮した。10mlの酢酸アンモニウム（0.01Ｍ、pH8.0）をこの濃縮器に加えて非揮発性塩を取除き、そしてこのサンプルを約１mlに濃縮した。少量のサンプル（１／50）を上記したタンパク質定量のために取出した。残りを15mlのポリプロピレン製コニカル遠沈管（Falcon, 2097）（Becton Dickinson）に回収した。氷酢酸を加えて10％の酢酸の最終濃度を得た。酸性にしたサンプルを沸騰湯浴の中に５分間入れて結合ペプチドを解離させた。このサンプルを氷の上で冷やし、濃縮器に戻し、そしてその濾液を集めた。更なる10％の氷酢酸のアリコート（１〜２ml）を濃縮器に加え、そしてその濾液をオリジナルの濾液と一緒にプールした。最後に、１〜２mlの蒸留水を濃縮器に加え、そしてその濾液を同様にプールした。
その抑留物はHLA-A重鎖及びβ２−ミクログロブリンのバルクを含み、一方、その濾液は天然プロセスを受けた結合ペプチドと、約3000未満の分子量を有するその他の成分とを含む。プールした濾液材料を凍結乾燥してペプチド画分を濃縮した。これでこのサンプルは更なる分析のための用意が整った。
ペプチド画分のHPLC（高性能液体クロマトグラフィー）分離のため、凍結乾燥したサンプルを50μｌの蒸留水に溶かすか、又は水中の0.1％のトリフルオロ酢酸（TFA）（Applied Biosystems）に溶かし、そしてStoneとWilliams（Stone, K.L. and Williams K.R. のMacromolecular Sequencing and Synthesis；Selected Methods and Applications, A.R.Liss, New York, 1988、頁7-24）に記載の勾配系を利用して、Ｃ18逆相細穴カラム（Beckman C18 Ultrasphere, 10×250mm）に注入した。バッファーＡは水中の0.06％のTFA（Burdick-Jackson）とし、そしてバッファーＢは80％のアセトニトリル中の0.052％のTFA（Burdick-Jackson）とした。流速は、0.250ml／分とし、下記の勾配を伴わせた：０〜60min., ２〜37.5％のＢ；60〜95min., 37.5〜75％のＢ；95〜105min., 75〜98％のＢ。Gilson細穴HPLC配置がこの目的にとって特に有用であるが、その他の配置も同等に機能する。
数多くのピークが214nmでの吸収により検出され、その多くは潤沢性が低いようであった（図３）。一定のピークが単一ペプチドを表わすか、又はペプチドの混合物を表わしているかは決定されなかった。プールした画分を下記の通りに配列決定にかけて各アレルに特異的なモチーフを決定した。
上記の通りに調製したプールペプチド画分をApplied Biosystems Model 477A自動シーケンサーを用いて自動エドマン配列決定によって分析した。この配列決定法は構成アミノ酸の配列を決定するためのタンパク質及びペプチドの順次分解に関する1950年代にPehr Edmanにより開発された技術を基礎とする。
配列決定すべきタンパク質又はペプチドを加熱アルゴンパージ反応槽の中で直径12mmの孔質ガラスファイバーフィルターディスクにより保持した。このフィルターは一般にBio Brene Plus（商標）で予備処理し、次いで１又は数回のエドマン反応の反復に循環させて夾雑物を減らし、且つその後のサンプルの配列決定の効率を高める。フィルターの予備処理に続き、サンプルタンパク質又はペプチドの溶液（10pmol〜５nmolの範囲）をガラスフィルターの上に載せ、そして乾燥させる。即ち、サンプルは予備処理したディスクのフィルムの中に包埋させたままとする。フィルターに対するサンプルの共有結合は通常必要とされず、なぜならエドマン化学品は比較的非極性な溶媒を使用し、その中ではタンパク質及びペプチドは可溶性でないからである。
簡単に述べると、エドマン分解反応は３工程を有している：カップリング、切断及び転換。カップリング工程においては、フェニルイソチオシアネート（PITC）を加える。PITCは塩基性の環境の中で、タンパク質の自由アミノ末端アミノ酸と定量的に反応してフェニルチオカルバミル−タンパク質を形成する。カップリング工程にとっての一定の時間の後、過剰の化学品を抽出し、そしてタンパク質のアミノ末端からPITC−カップル化アミノ酸残基を切断してアミノ酸のアニリノチアゾリノン（ATZ）誘導体を生み出すために高揮発性有機酸、トリフルオロ酢酸及びTFAを使用する。残りのタンパク質／ペプチドには新たなアミノ末端が残っており、そして次のエドマンサイクルの用意が整っている。このATZアミノ酸を抽出し、次いで転換フラスコに移し、ここでは水中の25％のTFAの添加に基づき、ATZアミノ酸は、分析のためにマイクロボアC-18逆相HPLCカラムを使用するMode 120 PTHアナライザーへの自動注入に従って同定及び定量することのできうるより安定なフェニルチオヒダントイン（PTH）アミノ酸へと転換する。
本手順においては、ペプチド混合物をガラスフィルターの上に載せる。従って、単独のアミノ酸配列は通常得られない。むしろ、異なる収量のアミノ酸の混合物が見い出せる。特定の残基が、配列決定すべきペプチド間で保存されているなら、そのアミノ酸についての高い収量が認められる。
実施例４
A3.2特異的モチーフの特定
Ａ３アレルの国際命名法においていくつかのあいまいな点がある。ここでいうA3.2アレルは細胞系EHM, HO301及びGM3107より発現される。この特定のサブタイプは現状3.2アレル（YangのImmunobiology of HLA、第１巻、Dupont編、Springer-Verlag, New York頁43-44及び54-55, 1989）と呼ばれるか又はA^*0301遺伝子の産物（その配列はStrachanら、EMBO J., 3：887（1984）により公開されたものに相当する）と呼ばれ、そしてEHM細胞系の中で見い出されたＡ３遺伝子の直接クローニング及び配列決定により確証されている。本明細書で言及しているA^*0301遺伝子によりエンコードされるHLA-A3.2は共通に発現されるHLA-A3アレル形態である。
MAT細胞を利用する一のケースにおいて、上記の実施例３に記載の通りにして調製したプール画分をHLA-A3.2ホモ接合細胞系、例えばCM3107より得た。このプールした画分は７％〜19％のCH₃CNに相当するHPLC画分である。このクラスＩ分に関して、クロマトグラフィーのこの領域が最もペプチドに富んでいた。個々の実験由来のデーターを下記の通りに平均した。
４つの個別の実験からのアミノ酸配列分析結果を分析し、そしてその結果を表５に示す。第一位を除く各位置に関して、このデーターは様々なHLAタイプ由来の実験の対比のため、Falkらにより述べられている方法を改良することにより分析した。この改良した手順は定量的、且つ標準化値をもたらしながら、同一のHLAタイプを包括する様々な実験に由来するデーターの平均を可能にする。
生の連続データーを簡単な10列（それぞれ１エドマン分解サイクルを表わす）及び16行（それぞれ20のアミノ酸の１つを表わす；Ｗ，Ｃ，Ｒ及びＨは技術的な理由により排除した）の行列に変換した。第１列（第１サイクル）に相当するデーターは考慮せず、なぜならこのサイクルは通常遊離のアミノ酸がかなり夾雑しているからである。各列の値を総計してその特定のサイクルについての総pmole値を得た。次に各列に関して、各アミノ酸についての値を対応の総収量値で除して、総シグナルのどの画分が各サイクルでの各アミノ酸に帰しているかを決定した。これを行うことにより、「絶対頻度」（“Absolute Frequency”）表を作成した。この絶対頻度表は各サイクルの傾斜収量（declining yields）についての補正を可能にする。
絶対頻度表から出発して、次に様々なアミノ酸間の対比を可能にするために「相対頻度」表を作成した。これを行うため、各行由来のデーターを総計し、次いで平均した。次に、各値を平均行値で除し、相対頻度値を得た。標準化様式においてサイクル当り上昇及び下降するこれらの値は異なる16のアミノ酸のタイプそれぞれについて定量的に表わす。種々の実験由来のデーターから作成した表は従って平均的な相対頻度値（及びその標準偏差）を作成するために合計してよい。全ての標準偏差を次に平均して、各表由来のサンプルに適用できる標準偏差値を評価することができる。1.00を２標準偏差より大で大きい任意の特定の値を有意な上昇に相当すると考える。
HLA-A3.2についての上記の分析結果は下記の通りであった：２位において、バリン（Ｖ）の2.2倍の上昇と、構造的に類似な残基ロイシン（Ｌ）及びメチオニン（Ｍ）についての低めの上昇（1.5〜1.7）。３位において、チロシン（Ｙ）及びアスパラギン酸（Ｄ）は頻度の上昇を示した。７位において、イソロイシン（Ｉ）は上昇し、そして８位において、アスパラギン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）が上昇した。９及び10位において、リジン（Ｋ）が予測のランダム収量より２倍を越えて上昇した。
システインは修飾されず、従って検出されない。PTH−トリプトファンはジフェニルウレアと一緒に溶離し、そしてある実験においては、PTH−アルギニンはPTH−スレオニンの主要誘導体と一緒に溶離した。従って、システイン及びトリプトファンは検出できず、そしてアルギニンはスレオニンの非存在下でのみ検出される。
既に述べられているMHC構造は２位（又は３位）及びＣ末端（９位又は10位のいづれか）の臨界的保存領域の事実を示している。これらの残基は「保存」残基と呼ばれている。本発明の改良データー分析はＮ及びＣ末端での保存位置を考慮した。
即ち、HLA-A3.2モチーフはＶ，Ｌ又はＭにより占拠された２位、９又は10のアミノ酸の長さ、及びＫにより占拠されたＣ末端位を有すべきである。

実施例５
HLA-A1−特異的ペプチドモチーフの特定
HLA-A1分子を単離し、そしてその天然プロセスを受けたペプチドを上記の実施例３に記載の通りに特定した。MAT細胞を利用する一のケースにおいては、19％〜50％のCH₃CNに相当するプール画分を使用した。先の実施例のように、第一位を除く任意の一定の位置において、ランダムに予測した収量より少なくとも２標準偏差の上昇を示す残基を同定し、そして表６に示す。これらのデーターを基礎に、セリン（Ｓ）及びスレオニン（Ｔ）のみ２位において上昇した。３位においては、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）が上昇し、そして９及び10位においてはチロシン（Ｙ）がめざましい上昇を示した。認められたその他の上昇は４位でのプロリン（Ｐ）及び７位でのロイシン（Ｌ）である。従って、これらのデーターに基づくHLA-A1についてのモチーフは、Ｓ又はＴにより占拠される２位の残基、９又は10アミノ酸のペプチドの長さ、及びＹのＣ末端残基を有するであろう。他方、別のモチーフは３位のＤ又はＥを、ＹのＣ末端残基と共に含んで成るであろう。

実施例６
HLA-A11アレル特異的ペプチドモチーフの特定
HLA-A11モチーフを、プールしたHPLC画分（あるケースにおいては、細胞系BVRより精製したHLA-A11分子より溶離された７％〜45％のCH₃CNの分画ペプチド）のアミノ酸配列分析により特定した。表７に示すデーターに基づき、Ａ11についてのモチーフは、２位のスレオニン（Ｔ）又はバリン（Ｖ）の保存残基、９又は10アミノ酸のペプチドの長さ、及びリジン（Ｋ）のＣ−末端保存残基より成る。３位において、メチオニン（Ｍ）及びフェニルアラニン（Ｆ）の上昇も認められ、そして８位においてグルタミン（Ｑ）が上昇していた。

実施例７
HLA-A24.1特異的ペプチドモチーフの特定
HLA-A24.1アレル特異的モチーフは、プールした画分（−のケースにおいては、細胞系KT3より精製したHLA-A24.1分子より溶離させた７％〜19％のCH₃CNのHPLC分画ペプチドに相当する）のアミノ酸配列分析により特定した。表８に示すデーターを基礎に、HLA-A24.1についてのモチーフは、２位においてチロシン（Ｙ）により占拠されている保存残基、９又は10アミノ酸のペプチドの長さ、及びフェニルアラニン（Ｆ）又はロイシン（Ｌ）のＣ−末端保存残基より成る。上昇はいくつかのその他の位置でも認められた：３位でのイソロイシン（Ｉ）及びメチオニン（Ｍ）；４位でのアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、グリシン（Ｇ）、リジン（Ｋ）及びプロリン（Ｐ）；５位でのリジン（Ｋ）、メチオニン（Ｍ）及びアスパラギン（Ｎ）；６位でのバリン（Ｖ）；７位でのアスパラギン（Ｎ）及びバリン（Ｖ）；並びに８位でのアラニン（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）、リジン（Ｋ）、グルタミン（Ｑ）及びセリン（Ｓ）。

実施例８
免疫原性ペプチドの同定
様々なMHCクラスＩについての上記のモチーフを利用し、様々なウィルス性及び腫瘍関連タンパク質由来のアレルアミノ酸配列をこれらのモチーフの存在について分析した。全ての標的抗原についての配列をGenBankデーターベース（Release No. 71.0；3／92）より入手した。モチーフの同定は「FINDPATTERNS」プログラム（Devereux, Haeberli and Smithes（1984）, Nucleic Acids Research 12（1）；387-395）を用いて行った。
アミノ酸配列又はヌクレオチド配列エンコード産物はGenBankデーターベースより入手した。ヒトパピロマウィルス（HPV）、前立腺特異的抗原（PSA）、ｐ53癌遺伝子、エプスタイン バー核抗原−１（EBNA-1）及びc-erb2癌遺伝子（HER-2/neuとも呼ばれている）及び黒色腫抗原−１（MAGE-1）においては単核の配列がある。
Ｂ型肝炎ウィルス（HBV）、Ｃ型肝炎ウィルス（HCV）及びヒト免疫不全ウィルス（HIV）の場合には複数の株／単離体が存在し、そして多くの配列がGenBankに入れられている。
HBVに関して、結合性モチーフをadr, adw及びaywタイプについて同定した。同一配列の複製を避けるため、adrモチーフの全て、並びにadrにおいて存在していないadw及びaywのみに由来するモチーフをペプチドのリストに加えた。
HCVの場合においては、残基１〜残基782由来の共通配列を９つのウィルス単離体より誘導した。モチーフは、この９つの単離体間で全く又は極くわずかな（１残基）変動しかない領域上で同定した。５つのウィルス単離体由来の残基783から3010の配列も分析した。全ての単離体に共通するモチーフを同定し、そしてペプチドリストに加えた。
最後に、北米（North American）ウィルス単離体（10〜12のウィルス）についてHIVタイプ１に関する共通配列をLos Alamos National Laboratoryデーターベース（1991年５月リリース）より入手し、そしてほとんどのウィルス単離体間で一定であるモチーフを同定するために分析した。小さな度合いの変動（２形態において１残基）を抱えるモチーフもペプチドリストに加えた。
下記に示している各アレルについてのいくつかのモチーフをいくつかの抗原をスクリーンするために用いた。上記に開示した全てのアレルに由来するモチーフを利用しているヒトパピロマウィルス（HPV）のタンパク質Ｅ６を示す（表９）。HPVタイプ18のタンパク質Ｅ７も全てのアレルについて探索した（表９）。黒色腫抗原MAGE１，２及び３を全てのアレルに由来するモチーフについて探索した（表10）。抗原PSAを全てのアレルに由来するモチーフについて探索した（表11）。最後に、Ｃ型肝炎ウィルス由来のコア及びエンベロープタンパク質も探索した（表12）。これらの表及びモチーフの詳細において、各アミノ酸についての慣用の記号文字を使用した。文字「Ｘ」は万能札文字（任意のアミノ酸）を表わしている。
下記のモチーフを本探索においてスクリーンした：
HLA-A1（A ^* 0101）について：

HLA-A3.2（A ^* 0301）について：

HLA-A11（A ^* 1101）について：

HLA-A24.1（A ^* 2401）について：

実施例９
定量的HLAクラスＩ結合アッセイ
モチーフ含有ペプチド配列が本当に適当なクラスＩ分子に結合できるかを確認するため、特異的結合アッセイを樹立した。HLA-A3.2分子をGM3107 EBV細胞より、A3.2を単離するためのGAPA3mAb（抗−Ａ３）を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。この工程の前に、そのリゼートは一般的に上記の実施例２に記載の通りB1.23.2カラム（この抗体はＢ，Ｃ特異的である）に繰り返し通すことによってHLA Ｂ及びＣ分子が枯渇されている。
放射性ラベルプローブとして、Ａ3.2モチーフを含むペプチド941.12（KVFPYALINK）を使用した。このペプチドは上記のＡ3.2特異的バインダーの結合したアンカー残基Ｖ₂及びＫ₁₀を含む。Ｙ残基を５位に挿入して放射性ヨウ素化を可能にした。ペプチドを、引用することで本明細書に組入れるBuusら Science 235：1352（1987）のクロラミンＴ液の利用によりラベルした。
投与量範囲の精製Ａ3.2を10nMの941.12と、pH7.0及び23℃で、プロテアーゼインヒビターカクテル（１mMのPMSF、1.3mMの1.10フェナノスロリン、73μＭのペプスタチンＡ、８mMのEDTA及び200μＭのNap−トシル−Ｌ−リジンクロロメチルケトン（TLCK））及び１μＭの精製β₂−ミクログロブリンの存在でインキュベートした。２日後、％結合放射活性を、引用することで本明細書に組入れるSeHeらのSeminars in Immunology、第３巻、Gafter編（W.B. Saunders, Philadelphia, 1991）、頁195−202のクラスIIペプチド結合アッセイについて前記した通りに、TSK 2000カラムでのゲル濾過により測定した（図４参照のこと）。35〜300nMに範囲するＡ3.2の濃度に関して良好な結合性（60〜100％の範囲）が認められた。15nMのＡ3.2では30％の結合性が認められた。
Ａ3.2の使用量を最少限にし、且つアッセイの感度を高めるため、５〜10nMのＡ3.2の濃度を更なるアッセイのために選んだ。図５に示す実験において、７nMのＡ3.2及び等濃度の放射性ラベル化941.12を上記の条件を利用し、且つ投与量範囲の３種のペプチド（HBC 18-27（924.07）、前立腺特異的抗原ペプチド（939.01）及びHIV nef 73-82（940.03））の存在下でインキュベートした。ペプチド940.03は22nMの50％阻害濃度（IC50％）で強く阻害され、一方ペプチド939.01では弱い阻害（IC50％ 940nM）が観察された。最後に、ペプチド924.07は30μＭのレベルに至るまでなんら阻害は示されなかった。即ち、ペプチド940.03及び939.01はそれぞれ高及び中親和性バインダーであり、一方ペプチド924.07は低親和性又はネガティブなバインダーに分類されるものと考えられる。
本明細書にわたり、結果はIC₅₀で表わしている。アッセイを行う条件を一定にすると（即ち、MHC及びラベル化ペプチド濃度を限定すると）、これらの値はＫ_D値に近づく。IC₅₀値はアッセイ条件を変えたとき、及び使用した特定の試薬に依存して（例えばクラスＩ調製品等）しばしば劇的に変動しうることに注目すべきである。例えば、過剰な濃度のMHCは一定のリガンドの見かけ測定されたIC₅₀を高めるであろう。
これらの不確定性を回避するための結合性データーを表わす別の様式の対照ペプチドに対する相対値である。対照ペプチドは全アッセイに含ませる。特定のアッセイの感度が高まる又は低くなるにつれ、ペプチドのIC₅₀は若干変動しうる。しかしながら、対照ペプチドに相対する結合性は変動しないであろう。例えば、対照ペプチドのIC₅₀が10倍上昇するような条件下で流すアッセイにおいては、全てのIC₅₀も約10倍シフトするであろう。従って、あいまいさを避けるため、ペプチドが良好か、中程度か、弱いか、又はネガティブなバインダーであるかを決定するために用いる規定値は対応の系数により修正すべきことが理解されうるであろう。例えば、もしＡ2.1結合アッセイにおいて、Ａ2.1標準品（941.01）のIC₅₀を５nMの代わりに８nMで測定すると、ペプチドリガンドは、通常の50nMのカットオフ値の代わりに80nM（即ち、８nM×0.1）未満のIC₅₀を有する場合にのみ良好なバインダーと呼ばれるであろう。
ここに記載の実験系は様々な異なる種のクラスＩ特異性に対する多大な数の合成ペプチドの結合性を試験するのに利用できうる。特異的結合アッセイは下記のようにして実施される。
HLA-A11特異的アッセイ
細胞系BVRをHLAの起源として用いた。β₂Ｍの存在下又は非存在下でのMHC濃度に及ぼす結合力の依存性を図６に示し、一方図７は過剰非ラベル化リガンドによる阻害の投与量依存性を示す。−６nMの見かけ上のＫ_Dの値及び10％の活性レセプターが得られ、そしてＡ2.1及びＡ3.2について得られた値に対するその類似性がめざましかった。放射性プローブとして用いたペプチドの配列はAVDLYHFLKである。
HLA-A1-特異的アッセイ
本ケースにおいては、EBV細胞スタインリン（Steinlin）を精製HLAの起源として使用した。他のHLAアレルの精製に予め適用したのと同一のプロトコール（即ち、B1.23.2 mAbカラムによるＢ，Ｃ分子の枯渇、それに続くW632 mAbカラムによるＡ分子の精製）を利用した。プール配列決定データーを基礎に、共通ペプチドを合成し、直接放射性ラベルし、そして標準のプロトコール（１mMのβ₂Ｍ；プロテアーゼインヒビターの存在下で２日間のRTインキュベーション）を利用してHLA結合性について試験した。％結合性とμＭ仕込みHLA A1との関係を示すグラフを図９に示す。このデーターより、HLA A2, 3及び11について観察されたものとの類似性において、〜10％の結合性を得るのに30nMほどの少なさで十分であることが考えられる。放射性ラベル化プローブ（944.02）として用いたペプチドの配列はYLEPAIAKYである。次のセットの実験において、樹立したアッセイの特異性を、過剰の未ラベル化ペプチドによるその居住性によって確認した。IC50％は〜20nMと測定された（図10）。更なるスキャッチャード分析（図11）は、相互作用の見かけ上のＫ_Dが21nMに相当し、活性レセプターの％が5.1％に相当することを確証した。
HLA-A24特異的アッセイ
HLA-A24分子をKT3 EBV細胞系から精製した。このケースにおいて、配列がプール配列決定データーを基礎とする２つの共通ペプチドを合成した。その配列は：979.01, AYIDNVYKF、及び979.02, AYIDNYNKFである。仕込みMHCの関数としてのこれらの２種のペプチドの％結合性を測定する実験の結果を図12に示す。両ケースにおいて、10〜15％の結合性が20〜50nMのMHCほどの小ささで得られた。MHC濃度を限定した低温阻害実験（図13）は、結合が未ラベル化ペプチドにより、それぞれ30及び60nMの見かけ上のＫ_Dで容易に阻害性であることを示した。更なるスキャッチャード実験は136nm及び28nMの値それぞれを確証した。有用なレセプター（活性MHC）の見かけ上の％はそれぞれ8.3％及び7.4％であった（図９ａ及びｂ）。これらのデーターに基づき、ペプチド979.02をＡ24アッセイのための標準ラベルインジケーターとして任意的に選んだ。更に、ここに記載のデーターに基づき、Ａ24−特異的結合性アッセイを樹立する目標が達成されたものとも我々は考えた。結果として、５種の主要HLAアレルについての特異的アッセイを述べてきた。
実施例10
HLA-Aモチーフの展開
インビトロ結合アッセイの樹立は、課題の様々なアレル（HLA-A1, A2, A3, A11及びA24）に対する様々な合成ペプチドの結合能のインビトロ定量を容易にする。このことは、様々なHLA Ａモチーフを担持するペプチドを介してのこのモチーフの、精製HLA分子に結合するその能力についての真偽を確証せしめる。典型的には、アラニン残基のみより成る中性骨格の中にかくれた特異的なHLAモチーフでペプチドを合成する。あるケースにおいては、可溶性を高める目的で、配列の中にＫ残基も導入する。クラスII分子の場合に適用するかかる「中性」ポリＡ骨格の利用は例えばJardetzkyら（Jardetzkyら、EMBO J. 9（6）：1797, 1990）に詳細されている。
例えば、Ａ3.2の場合、モチーフは２位の疎水性残基及び９位の正帯電（Ｋ）で特定される。即ち、これらの２つのアンカー残基の存在がポリＡ骨格に関してＡ3.2結合を可能にするかを確証するため、配列AMAAAAAAKを有するポリＡ類似体を合成した（表13）。
同様に、その他のHLAモチーフを担持するその他のペプチドも合成し、そしてHLA結合性について試験した。全てのケースにおいて、特異的なHLAモチーフの存在は、125〜2.8nMより成る推定Ｋ_Dでの対応のHLAアレルに対する結合を誘発することが認められた。ほとんどのケースにおいて、この結合は、無関係なアレルに対する結合が検出されない点で、絶対的に特異的でもある。この一般的な法則に反する２つの例外のみが認められた。一つは、Ａ３とＡ11ペプチドは互いとかなり交差反応し、それはおそらくこれら２つのアレルについてのモチーフはかなり似ていることにより予測されうる。第二に、一部のＡ１ペプチドはかかる低めの親和性にもかかわらず、Ａ11及びＡ3.2と交差反応した。
ペプチドエピトープと課題の様々なクラスＩアレルとの相互作用にとっての構造的な要件を更に特定するため、表13に示す９残基ペプチドの一部の長さ10残基数の類似体を合成した（表14）。これらの類似体はポリＡ骨格の中に追加のAla残基を挿入して、そのアンカー残基が２位及び10位に位置しないようにする（先の表における２及び９と異なるようにする）ことにより作った。得られる結果は、10残基数のモチーフもそのやや低めの効率性にかかわらず、対応のクラスＩアレルに特異的に結合することができることを示した。
まとめると、これらのデーターは、適当なモチーフを含む９量体及び10量体のペプチドは共にHLAに結合できることを確証した。これらのデーターに基づき、８量体又は11量体のペプチドも、おそらくは低親和性であるかもしれないが結合可能であろう。
上記のデーターは、アンカー位置における所定の残基の存在がHLA結合性を（少なくとも「中性」ポリＡ骨格において）可能にすることを示す。この重要なアンカー位置においてどの程度その他のアミノ酸（例えば化学的に近縁するアミノ酸）が寛容されうるかを調べるため、表13のポリＡペプチドの一部の類似体を合成し、ここでその２位（又は３位）又は９位にある残基を変えておいた。この分析の結果を表15〜19に示す。
Ａ3.2の場合（表15）、２位におけるＬ，Ｍ，Ｉ，Ｖ，Ｓ，Ａ，Ｔ及びＦが好ましいことが見い出され（先に特定したアンカー残基に対して結合力≧0.1）、一方、Ｃ，Ｇ及びＤが許容された（先に特定したアンカー残基に対して結合力≧0.01〜0.1）。この位置における、Ｄとの類似性を理由とするＥの置換も寛容されうる。９位においては、Ｋ，Ｒ及びＹが好ましい。性質における類似性を理由に、Ｈ及びＦも好適であろう。その他の残基はどれもＡ３結合に関して９位では寛容されなかった。
Ａ11の場合（表16）、２位における好適な残基はＬ，Ｍ，Ｉ，Ｖ，Ａ，Ｓ，Ｔ，Ｇ，Ｎ（Ｌ及びＱは類似性による）である。寛容されたのはＣ，Ｆ，Ｄ（及び類似性によりＥ）であった。９位においては、Ｋが好ましく、そしてＲが寛容された。Ｈも類似性により寛容されるであろう。
Ａ24の場合（表17）、Ｙ及びＦ（そして類似性によりＷ）が好ましく、その他の残基は寛容されなかった。９位においては、Ｆ，Ｉ及びＬ（並びに延長によりＷ及びＭ）が好ましい。その他の残基は寛容されなかった。
Ａ１のケースにおいては、３つの異なるアンカー残基が既に特定されている。先の章に示す結果は、それらが互いに独立して作用することを示している（即ち、３つのアンカーのうちの２つが結合にとって十分であろう）。これは真実である。この理由のため、２つのアンカーを含む類似体を合成してどの残基が各位置において好ましい又は寛容されうるかを特定した。表18に示すデーターは、２位において、Ｔ，Ｓ及びＭが好ましく、そしてその他の残基は寛容されないことを示す。３位においては（表19）、Ｄ及びＥが好ましく、そしてＡ，Ｓ（及び類似性により）Ｔが寛容された。最後に、９位においては、Ｙのみが好ましくは、その他の残基は寛容されなかった（表19）。
従って、このデーターに基づき、２つの好適な残基の任意の組合せを担持するペプチドが結合できると考えられる。「不完全」モチーフを含むペプチド、即ち、一の位置において好適な残基を、そして他方のアンカー位において寛容されているものを担持するものは、若干低めの親和性にかかわらず、結合可能であろう。様々なMHCクラスＩアレルについての本発明のモチーフを利用して、様々なウィルス及び腫瘍関連タンパク質由来のアミノ酸配列をモチーフの存在について分析した。このモチーフ分析の結果を表23ａ〜ｋに示す。
実施例11
HPV16ペプチドのかたよりのないセットによるHLAペプチド結合性モチーフのバリデーション
ヒトパピロマウィルス（HPVs）は、頸部癌の病因（Pfister, H.（1974）Biology and biochemistry of papillomaviruses, Rev. Physiol. Biochem. 99:111；zur Hausen, H.（1991）。Human papillomaviruses in the pathogenesis of anogenital cancer. Virology. 184:9）にかかわり、そして世界中の癌に基づく全死亡数の10％までを占める（zur Hausen, H.（1991）。Viruses in Human Cancers. Science, 254:1167）。頸部癌は世界中の女性の癌に関連する死の２番目の最も一般的な原因である（Parkin, D.M., Laara, E.及びMuir, C.S.（1988）, Estimates of the worldwide frequency of sixteen major cancers（1980）. Int. J. Cancer. 41:184）。HPV DNAは90％より大の頸部癌腫及びほとんどのHPV 16ゲノタイプに存在している（Resnick, R.M., Cornelissen, M.T., Wright, D.K., Eichinger, G.H., Fox, H.S., ter Schegget, J., and Manos, M.M.（1990）。Detection and typing of human papillomavirus in archival cervical cancer specimens by DNA amplification with consensus primers. J. Natl. Cancer Inst；Van den Brule, A.J.C., Walboomers, J.M.M., du Maine, M., Kenemans, P., and Meijer, C.J.L.M.（1991）。Difference in prevalence of human papillomavirus genotypes in cytomorphologically normal smears is associated with a history of cervical intraepithetal neoplasia. Int. J. Cancer. 48:404）。HPV 16初期領域６及び７（Ｅ６，Ｅ７）オープンリーディングフレームの、げっ歯動物細胞（Yasumoto, S., Burkhardt, A.L., Doniger, J., and Dipaolo, J.A.（1986）。Human Papillomaviruses type 16 DNA induced malignant transformation of NIH3T3 cells. J. Virol. 57:572）及びヒトケラチノサイト（Pirisi. L., Yasumoto, S., Feller, M., Doniger, J., and Dipaolo, J.A.（1987）。Trans-formation of human fibroblasts and keratinocytes with human papillomavirus type 16 DNA. J. Virol, 61:1061）をインビトロで不死する能力並びにヒト線維芽細胞（Smits, H.L., Raadsheer, E., Rood, I., Mehendale, S., Slater, R.M., van der Noordaa, J., and ter Schegget, J.（1988）。Induction of anchorage-independent growth of human embryonic fibroblasts with a deletion in the short arm of chromosome 11. J. Virol. 62:4538）を形質転換する能力は、頸部発癌の多段過程におけるHPV 16の直接的なかかわり合いを示唆する。
一般に、Ｔ細胞免疫性、特に細胞障害性Ｔリンパ球（CTL）により媒介されるものがウィルス誘発型腫瘍に対する防御において重要である（Melief, C.J.（1992）。Tumor eradication by adoptive transfer of cytotoxic T lymphocytes。Adv. Cancer Res. 58:143；Melief, C.J., and Kast, W.M.（1992）。Lessons from T cell responses to virus induced tumors for cancer eradication in general. Cancer Surv. 13:81）。近年、マウスのモデルにおいて、HPV 16 E7発現性腫瘍に対する多少の度合いの防御が、HPV 16 E7発現細胞による免疫を経たCTLより得られることが報告されている

CTLによるインビボ防御が近年マウスモデルにおいて示され、それにおいてはCTLエピトープ含有合成ペプチドがウィルス感染に対するマウスの効果的な感作のために使用されている（Schulz, M., Zinkernagel, R.M., and Hengarter, H.（1991）。Peptide-induced antiviral protection by cytotoxic T cells。Proc. Natl. Sci. USA 88:991；Kast, W.M., Roux, L., Curren, J., Blom, H.J.J., Voordouw, A.C., Meleon, R.H., Kolakofski, D., and Melief, C.J.M.（1991）。Protection against lethal Sendai virus infection by in vivo priming of virus-specific cytotoxic T lymphocytes with an unbound peptide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:2283）。更に、マウスのモデルにおいて、HPV 16誘発型腫瘍に対する完全な防御はウィルス癌遺伝子Ｅ７に由来するCTLエピトープによるペプチド種痘により達せられることが現在示されている。
HPV 16 E6及びE７遺伝子生成物がHPV 16誘発型腫瘍に対する種痘のために最も所望されている標的抗原である。両方ともHPV 16形質転換癌細胞の中で保持され、且つインビボで高く発現され（Baker, C.J., Phelps, W.C., Lindgren, V., Braun, M.J., Gonda, M.A., and Howley, P.M.［1987］。Structural and transcriptional analysis of human papillomavirus type 16 sequences in cervical carcinoma cell lines。J. Virol. 61:962；Smotkin, D., and Wettstein, F.O.［1986］。Transcription of human papillomavirus type 16 early genes in a cervical cancer and cancer-derived cell line and identification of the E7 protein。Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83:4680）、そしてインビトロでの細胞形質転換の誘発及び維持にかかわっている（Crook, T., Morgenstern, J.P., Crawford, L., and Banks, L.［1989］。Continued expression of HPV-16 E7 protein is required for maintenance of the transformed phenotype of cells co-transformed by HPV-16 plus EJ ras。EMBO J. 8:513；Hawley-Nelson, P., Vousden, K.H., Hubbert, N.L., Lowy, D.R., and Schiller, J.T.［1989］。HPV 16 E6 and E7 proteins cooperate to immortalize human foreskin keratinocytes。EMBO J. 8:3905）。Ｅ６及びＥ７の発現への頸部癌に由来する細胞系のインビトロ増殖の依存性は頸部癌腫細胞系の表現型の維持におけるこれらの癌遺伝子のかかわり合いを強調する（Von Knebel Doeberitz, M., Bauknect, T., Bartch, D., and zur Hausen, H.［1991］。Influence of chromosomal integration on glucocorticoid-regulated transcription of growth-stimulation papillomavirus genes E6 and E7 in cervical carcinoma cells。Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:1411）。ヒトについてのCTLエピトープ及びHPV 16の有能なワクチン候補を決定するため、我々はHPV 16 E6及びE７タンパク質配列に広がるペプチドを、最も頻度の高いヒトMHC分子、即ち、HLA-A1, A3.2, A11.2及びA24に対する結合能力についてスクリーンした。組合せたこれら５つのアレルは世界の人口の約90％を占めるであろう（Dupont, B., ed.［1987］. Immunology of HLA Vol. I --Histocompatibility Testing. Springer-Verlag, New York）。
全HPV 16 E6及びE7癌遺伝子配列を重複してカバーする長さ９aa及び８aaの240通りの重複合成ペプチドの完全なセットを合成した。これらのペプチドを上記した結合アッセイにおける上記のHLA分子との結合能力について試験した。この分析の結果は、対応HLAアレルに対する全てのペプチドの相対親和力を示し、そして表20（ａ）−（ｄ）におけるヒトに対するペプチドベースワクチンにおいて使用するための可能な候補となるCTLエピトープを示した。
この結果は、上記したHLAアレルに対する本発明に記載のペプチド結合性モチーフが、タンパク質のどのペプチドが特定のHLA分子の溝の中に結合する傾向にあるかを推定せしめる。我々は大型、且つかたよりのないペプチドのセットを使用したため、このペプチド結合性分析の結果を、これらのモチーフの、その予測の能力、並びにペプチドにおいて２位（３）及び９位上に特定のアンカーaa残基を有する必要性の両方についての値を評価するために用いた。
ペプチド。ペプチドは固相手法により、多重ペプチド合成装置（Abimed AMS422）で、Fmoc保護化アミノ酸のポリスチレンの樹脂への添加をFmoc−脱保護手順で交互に行う繰り返しサイクルによって作った（Gausepohl, H., Kraft, M., Boulin, Ch., and Frank, R.W.［1990］。Automated multiple peptide synthesis with BOP activation。Proc. of the 11th American peptide symposium。J.E. Rivier and G.R. Marshall, Ed. ESCOM, Leiden. 1003-1004）。Ｃ末端においてCOOH基を抱える全てのペプチドを樹脂から切り、そして側鎖保護基を水性TFAによる処理によって除去した。ペプチドを逆相HPLCにより分析し、凍結乾燥し、そして使用前に３％のDMSO（Sigma, St. Louis, MD 63175）を含むリン酸緩衝食塩水の中で１mg／mlの濃度に溶解した。溶解したら、これらのペプチドを−70℃で保存した。システイン含有ペプチドは合成及び操作中に（空気）酸化を受け易いので、これらのペプチドはシステインの代わりにアラニンで合成した。
種々のHLA-Aアレルに結合するHPV 16 E6及びE7タンパク質に由来するペプチドの同定。全HPV 16 E6及びE7タンパク質の配列をカバーする長さ９aaであり、そして８aaで重複する240通りのペプチドの完全なセットを５種のHLA-A分子に対する結合性について試験した。
この分析の結果を表20（ａ）−（ｄ）に示す。表20（ａ）にはHLA-A1分子に結合するHPV 16のペプチドが記載されている。全てのペプチドを試験した。リストしているのは≧0.001の比の値をもたらすペプチドのみである。２つのペプチドがこの分子に対して高親和性で結合し（＞0.1）、６が中程度の親和性（0.1〜0.01）、そして１が低親和性（0.01〜0.001）で結合することがわかった。ペプチドを、様々な実験で得られたデーターとの対比を可能にするため、比の値でランク分けした。50％の阻害投与量（IC₅₀）をもたらすのに必要なペプチドの濃度を計算するため、標準IC₅₀の値をこの比で除しなければならない。例えば、ペプチドE6-80は23nMのIC₅₀を有する（81／3.5）。
表20（ｂ）にはHLA-A3.2分子に結合するペプチドが記載されている。７つのペプチドが高親和性バインダーとして、６が中親和性バインダーとして、そして13が低親和性バインダーとして同定された。表20（ｃ）にはHLA-A11.2分子に結合するペプチドが記載されている。６の高親和性ペプチド、４の中親和性ペプチド、そして10の低親和性ペプチドが同定された。この高親和性結合ペプチド（E6-59 IVYRDGNPY及びE6-80 ISEYRHYAY）並びに９位にＹを有するこの弱親和性結合性ペプチド（E6-42 QQLLRREVY, E6-69 VADKALKFY）がHLA-A11.2に関して同定された。最初の２つのペプチドの高結合力及び９位においてＹが好適である。HLA-A11.2モチーフとHLA-A3.2モチーフとの類似性を考え、チロシンがHLA-A11.2モチーフの９位に含まれているべきである。表21（ｂ）と（ｃ）とを対比し、Ａ3.2及びＡ11.2分子の両者に結合するペプチドの大きな重複があることが明らかである。これらの２つのHLA分子に結合する28のＥ６及びＥ７ペプチドのうちの18が重複しており、そして８のペプチドのみがHLA-A3.2にとって、そしてこのペプチドが、HLA-A11.2にとって固有であった。
最後に、表20（ｄ）にはHLA-A24分子に結合するペプチドが記載されている。ここで、２のペプチドが高親和性結合性ペプチドとして、５が中親和性結合性ペプチドとして、そして５が低親和性結合性ペプチドとして同定された。１の高親和性ペプチド（E6-72 KALKFYSKI）及び１の中親和性ペプチド（E7-49 RAHYNIVTF）が同定され、２位のＡがHLA-A24モチーフに許容されているべきことを示唆している。これらの関係は全て表20−ｅに示している。これらの表を分析するうえで、２〜７の高親和性結合性ペプチドが試験したHLA-A分子の全てに関して同定されることが考えられうる。時折り、いくつかのペプチドはより多くのアレルに結合する。３のペプチド（Ｅ６−７，Ｅ６−37及びＥ６−79）がHLA-A2.1, A3.2及びA11.2に結合した。１のペプチド（Ｅ６−38）がHLA-A3.2, A11.2及びA24に、そして２のペプチド（Ｅ６−69及びＥ６−80）がHLA-A1, A3.2及びA11.2に結合した。しかし、これらの交差反応性ペプチドは１又は複数の異なるHLA分子と弱くしか結合しなかった。しかしながら、一般に、HLA-A3.2及びHLA-A11.2分子を除き、ほぼ全てのHLA分子が固有のペプチドと結合できることが考えられうる。
HLA 16 E6及びE7ペプチドのかたよりのないセットによるHLA-Aペプチド結合性モチーフのバリデーション。
我々は、本明細書に記載のアンカー位置についてのモチーフがペプチドの結合性をどのようによく予測せしめるか、及びその逆、即ちどのようによく結合性ペプチドが同定モチーフに従うかを分析した。このため、ペプチドを強バインダー、中バインダー、弱バインダー及びネガティブバインダーとしてランク分けし、そして多ペプチドに関して、表６のアンカーモチーフの法則を基礎とするモチーフ推定を分析した。２（３）及び９アンカーモチーフの全体的な効率性を計算し、そして表20（ｅ）にまとめた種々のHLA-A分子について前述したモチーフはかなり正確であるものと考えられうる。100％のHLA-A1, A3.2及びA24の強バインダー並びに67％のHLA-A11.2のそれが推定されるであろう。中バインダーについてさえも分析したHLA-A分子に依存して40〜100％が予測されるであろう。更に、予測されうる弱結合性ペプチドのパーセントは低く、そして結合すると予測されたが実際には結合しなかったペプチドのパーセンテージはこれらアレル全てに関して非常に低かった。
別々に分析したHLA-A1に結合すると予測された12のペプチドは高又は中親和性で結合した。このことは、これらの潜在的なCTLエピトープを見い出すのに数種のペプチドを作るだけでよいことを示唆する。HLA-A3.2, A11.2及びA24についての数字はそれぞれ10／32,7／26及び４／７であった。このことは、これらのアレル全てについての推定値が良好であることを意味する。先に記載のモチーフにより推定されていない一部のペプチド（表21（ａ）〜（ｄ）における（−））の他に、２，（３）及び９アンカーモチーフにより推定されたいくつかのペプチドは結合せず、適正なアンカー残基を有することが常に結合のために十分であるのではなく、そして非アンカー残基がペプチドの結合性に負の寄与を及ぼしうることを意味している。
実施例12
モチーフの存在は必要であるが、高親和性クラスＩ結合にとって十分でない
種々のモチーフの存在がどのように、対応のHLAアレルに対する種々のペプチドの結合能力に影響を及ぼしうるかを調べるため、様々な潜在的な標的分子の配列をモチーフ含有ペプチドについてスキャンした。このようにして同定したペプチドを合成し、そして結合について試験した。Ａ3.2の場合、205のペプチドのうちの39（19％）のみが１〜50nMの範囲における高親和力で結合することが見い出せた（表20）。そのうちの22.4％が中親和力（50〜100nMの範囲）で結合し、一方、34.6％が弱く結合した（500nM〜50μＭの範囲）。最後に、その23.9％が少なくとも50μＭのレベルで全く結合しなかった。Ａ11の場合、100ペプチドのうちの33（33％）が１〜50nMの範囲の高親和力で結合した。そのうちの35％が中親和力（50nMの範囲）で、一方24％が弱く（500nM〜50μＭの範囲）で結合した。最後に、その８％が少なくとも50μＭのレベルで全く結合しなかった。
類似の結果がＡ１及びＡ24の場合においても得られた（データーは示さず）。
同タイプの分析をＡ3.2及びＡ11モチーフのいづれかを担持する10量体ペプチドのケースにおいても行った（表22（ａ）及び（ｂ））。これらのケースにおいて、良好なバインダーの頻度でさえも低かった（それぞれ17.5％及び29.8％）。これらのデーターは、10量体ペプチドを含むモチーフが、一般に低い親和力にもかかわらず実際に結合できうることを確証せしめうる。
まとめると、この章に示すデーターは、適正なアンカー残基の存在は良好なHLA結合を可能にするのに本質的でないことを明確に示す。それ故、２（３）及び９（又は10）以外の位置に含まれている残基の種類が結合に影響を及ぼしうることが明らかである。この所見の最も好適な解釈は、所定の残基の（２及び９以外の位置での）存在はペプチド決定基の結合能力を無効に又は高めることができることにある。
先の章に示したデーターは、モチーフ含有ペプチド内の免疫原性であるペプチドを同定するのにどのようにして結合性アッセイを使用できるかを述べている。我々はまた、別の手法、即ち、モチーフ含有ペプチド内のどのペプチドが良好又は中間的なバインダーであり、そしてそれ故免疫原性でありうるかを推定できるであろう手順を誘導する手法を企立てることを要望する。他の実験においては中間的又は良好なバインダーと示されていないものが免疫原性であると示された。特に、結合にネガティブな影響を及ぼす残基を同定するため、Ａ3.2,Ａ11並びに９量体及び10量体を含む全てのモチーフ含有ペプチドについての全ての分析を行った。Ａ11の場合、非結合性ペプチドの少なさのため、その分析が一方では良好と中間的なバインダーとを、そして他方では弱と結合しないバインダーとを対比するために異なるカットオフ値を利用した。
実施例13
免疫原性ペプチドを同定する計算法
上記の実施例13に示す結果を鑑みて、アンカー又は保存残基に加えて、ペプチド配列の各位置においての様々な残基の効果に基づく結合性のより正確な推定因子を供する計算法を開発した。より詳しくは、我々は、ペプチド伝いの各位置においての各アミノ酸についての点数を規定する。各特定のアレルについての計算法を開発するために、Ａ１，３，11又は24モチーフ含有ペプチドの我々のコレクションのスクリーニング中に得られたデーターバンクを利用した。各残基についての点数は、良好及び中間的なバインダーにおけるその残基の頻度、対、非バインダーにおけるその残基の存在頻度の比とした。
本計算法において、残基は類似性によりグループ分けした。このことは、統計学的に有意な比を得るには存在数が少なすぎる稀な残基、例えばトリプトファンにより遭遇する問題を回避する。リスト表は、モチーフを規定する保存残基を含む９量体ペプチド（２／９モチーフ）ついての位置によって20のアミノ酸それぞれについてグループ分けすることによって得られる点数より成る。ペプチドは各残基の点数の積としてこの計算式において点数付けした。
結合力を補正する計算式の力は、良好なバインダーの最も高い存在率を有するペプチドの集団を推定する能力により更に裏付けされる。特定のMHCアレルに結合する９量体ペプチドを推定するために例えば単に２／９モチーフのみを頼りにすると、大量の数のモチーフ含有ペプチドが良好なバインダーと推定されうるであろう。実際にはこれらのペプチドのうちのわずかしか中間的なバインダーでなく、同時にこのモチーフにより推定されるペプチドの大多数は弱結合性又は結合できないペプチドのいづれかである。他方、本発明のグループ分け計算法を用いると、より高いパーセンテージの良好なバインダー、更により高いパーセンテージの中間的なバインダーを有するペプチドの集団が作り上げられ、そしてモチーフ含有ペプチドにより推定されるのより小さいパーセンテージのものは弱及び非バインダーである。
本計算式の例はペプチドの各位置の特定の残基の影響を測定するための、バインダー及び非バインダーにおけるアミノ酸の存在頻度の比を利用する。類似の計算式を作り出すのに別の方法があることを当業者は直ちに理解するであろう。例えば、計算表を作成するために、平均結合親和値又はポリアラニン骨格を有するモチーフ含有ペプチドにおける単個アミノ酸置換の相対結合を利用しうる。
平均結合親和力を利用する計算式は、分析において全てのペプチドを含み、そして良好／中間的バインダー及び非バインダーだけでないという利点を有する。更に、これは単純なグループ比計算法より親和力のより定量的な測定値を供する。我々はかかる計算法を、各アミノ酸について、位置により、我々のモチーフ含有ペプチドのセットの中に特定の残基が存在しているときの結合力の平均対数を計算することによって作った。ペプチドについての計算点数は、各残基についての位置による点数の合計とする。
実施例14
有効なHLAアレル特異的抗原表示細胞の調製
本例は有効なHLAアレル特異的抗原表示細胞（APC）を調製するための低温インキュベーション又は酸ストリップ／ペプチド負荷方法の利用を実例する。APCは、抗原特異的細胞障害細胞の開発へと導かれる前駆細胞障害性Ｔリンパ球を感作するために用いた。これはフィトヘムアルグニチン（PHA）Ｔ細胞ブラスト又は末梢血液単核細胞（PBMC）又はスタフィロコッカス アウレウス（Staphylococcus aureus）Cowan I（SAC-I）活性PBMCをAPCとして用いることによって行った。これらの結果は他のAPC及び他のMHCアレルに適用できる。
以下には下記の実施例において使用した材料の起源を記載する：
Ｌ−アスコルビン酸、Cat #B582, J.T. Baker, Phillipsburg, NJ。
抗−HLA A2（BB7.2）, Cat #HB82, ATCC, Rockville, MD。
抗−HLA DR（LB3.1）, J.Gorga, Children's Hospital, Pittsburgh, PA由来。
抗−HLAアルファー鎖パンABC（9.12.1）, R. DeMars, University of Wisconsin, Madison, Wl由来。
抗−マウスIgG FITCコンジュゲート、Cat #F2883, Sigma, St. Louis, MO。
β₂ミクログロブリン、Cat #MO114, Scripps Labs, San Diego, CA。
BSA画分V, Cat #A9418, Sigma, St. Louis, MO。
50ccコニカル遠沈管、Cat #2070, Falcon, Lincoln, Park, NJ。
Cryo 1℃凍結用容器、Cat #5100-0001, Nalge, Rochester, NY。
凍結バイアル、Cat #5000-0012, Nalge, Rochester, NY。
ジメチルスルホキシド（DMSO）、Cat #D2650, Sigma, St. Louis, MO。
DNAse, Cat #260912, Calbiochem, San Diego, CA。
Dynabeads M-450ヤギ抗−マウスIgG, Cat #110.06, Dynal, Great Neck, NY。
EDTA四ナトリウム塩、Cat #ED4SS, Sigma, St. Louis, MO。
FACScan, Becton Dickinson, San Jose, CA。
胎児牛血清（FCS）、Cat #3000, Irvine Scientific, Irvine, CA。
フィコル−パク、Cat #17-0840-03, Pharmacia, Piscataway, NJ。
ジェンタマイシン、Cat #600-5750AD, Gibco, Grand Island, NY。
Ｌ−グルタミン、Cat #9317, Irvine Scientific, Irvine, CA。
GS-6KR遠心器、Beckman Instruments, Palo Alto, CA。
ヒトAB血清（HS）、Cat #100-112, Gemini Bioproducts, Calabasas, CA。
ヒトrIL-2, Sandoz, Basel, Switzerland。
ヒトrIL-7, Cat #F1-1587-1, Genzyme, Cambridge, MA。
イソプロパノール、Cat #A464-4, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA。
MicroCELLector T-150培養フラスコ（CD4+細胞選別用）、Cat #8030, Applied Immune Sciences, Menlo Park, CA。
Micromedic自動ガンマーカウンター、ICN Micromedics Systems, Huntsville, AL。
OKT4ハイブリドーマ上清液、Cat #CRL 8002, ATCC, Rockville, MD。
パラホルムアルデヒド、Cat #T-353, Fisher, Pittsburgh, PA。
PBSカルシウム及びマグネシウムフリー（CMF）、Cat #17-516B, BioWhittaker, Walkersville, MD。
本研究において使用したペプチドはCytelで合成し、そして表24ａに示す。
フィトヘムアグルチニン（PHA）、Cat #HA-16, Wellcome, Dartford, England。
RPMI 1640＋ヘペス＋グルタミン、Cat #12-115B, BioWhittaker, walkersville, MD。
RPMI 1640＋ヘペス＋グルタミン、Cat #380-2400AJ, Gibco, Grand Island, NY。
塩化ナトリウム（NaCl）、Cat #3624-05, J.T. Baker, Phillipsburg, NJ。
クロム酸（⁵¹Cr）ナトリウム、Cat #NEZ 030, NEN, Wilmington, DE。
リン酸ナトリウムモノベース、Cat #S9638, Sigma, St. Louis, MO。
Triton X-100, Cat #X-100, Sigma, St. Louis, MO。
24穴組織培養プレート、Cat #3047, Falcon, Becton Dickinson, San Jose, CA。
96穴Ｕ−底クラスタープレート、Cat #3799, Costar, Cambridge, MA。
培養培地。PHAブラスト及びCTL誘発は、２nMのＬ−グルタミン（Irvine Scientific）、50μｇ／mlのゲンタマイシン（Gibco）及び５％の熱不活性化プールヒトAB型血清（Gemini Bioproducts）〔RPMI／５％HS〕の添加されたRPMI 1640＋ヘペス＋グルタミン（Gibco）の中で行った。EBV形質転換リンパ腺維芽細胞系（LCL）を、上記のＬ−グルタミン及びゲンタマイシン並びに10％の熱不活性化胎児牛血清（Irvine Scientific）〔RPMI／10％のFCS〕の添加されたRPMI 1640＋ヘペス＋グルタミン〔Biowhittaker〕の中に維持した。クロム放出アッセイをRPMI／10％のFCSの中で行った。
サイトカイン。組換ヒトインターロイキン−２（rIL-2）（Sandoz）を10Ｕ／mlの最終濃度で使用した。組換ヒトインターロイキン−７（rIL-7）（Genzyme）を10ng／mlの最終濃度で使用した。
末梢血液単核細胞（PBMC）の単離。全血をヘパリン（10Ｕ／ml）含有シリンジの中に集め、そして50ccのコニカル遠沈管（Falcon）の中で1600rpm（Beckman GS-6KR）15min遠心した。その血漿層を除き、そして10mlのバッフィーコートを10mlのピペットで円運動により集めた。そのバッフィーコートを徹底的に混合し、そして等容量の無血清RPMI 1640で希釈した。希釈したバッフィーコートを次に50ccのコニカルチューブの中の20mlのフィコル−パク（Pharmacia）の上に載せ、そして400ｇで室温でブレーキをオフにして遠心した。PBMCを含むそのフィコル−血漿界面を分注ピペットを用いて集め（50ccのチューブ当り２界面）、そして50mlのRPMIで10分３回（1700, 1500及び1300rpm）洗った。
PBMCの凍結融解。PBMCを凍結バイアル（Nalge）を用い、１mlのアリコートにおいて、30×10⁶細胞／１mlの90％のFCS＋10％のDMSO（Sigma）において凍結した。凍結バイアルをイソプロパノール（Fisher）を含むCryo１℃凍結用容器（Nalge）の中に入れ、そして−70℃に４hr（最短）〜一夜（最長）置いた。イソプロパノールは５回の使用毎に交換した。凍結バイアルを長期保存のために液体窒素に移し入れた。PBMCは37℃の湯浴の中で最後の結晶がほぼ融解するまで連続振盪しながら融解させた。細胞を直ちにDNAase 30μｇ／mlを含む無血清RPMI培地（凝集を防ぐため）（Calbiochem）に希釈し、そして２回洗った。
リンパ球サブ集団の枯渇。CD4リンパ球枯渇は抗体コート化フラスコを用いて行った：CD4＋細胞の選別のためのMicro CELLector T-150フラスコ（Applied Immune Sciences）をその製造者の仕様書に従って、25mlのPBS CMF＋１mMのEDTA（Sigma）により、そのフラスコを30秒間攪拌し、それに続いて平らな面の上で室温で１hrインキュベートすることによって洗った。バッファーをアスピレート吸引し、そしてフラスコを２回更に30sec攪拌し、且つ結合面の被覆を保持することで洗った。洗った各フラスコに、25mlの培養培地＋５％のHSを加え、そして平な面の上で室温で20minインキュベートした。培地が細胞を受け入れる準備が整うまでフラスコの中に放置した。PBMCを30μｇ／mlのDNAseを含むRPMI／５％のHSの中で融触し、そして２回洗った。洗浄液中のHSはPBMCS上のFcレセプターをブロックする。１本のフラスコ当り最大で12×10⁷の細胞を25mlの培養培地の中に再懸濁させた。培養培地をフラスコからアスピレートし、次いでその細胞懸濁物をMicro CELLectorに慎重に入れた。細胞を含むフラスコを平らな面の上で室温で１hrインキュベートした。インキュベーションの終了時に、そのフラスコを横にゆっくりと10秒間ゆらして非接着細胞を再懸濁した。非接着CD4枯渇細胞を集約させ、次いでフラスコをPBS CMFで２回洗って非接着細胞を集めた。集めたCD4−枯渇細胞を遠心によりペレット化し、そして完全培養培地（RPMI／５％／HS）の中に再懸濁した。
PHAブラストの作成。PBMCを標準のフィコールパクプロトコールを用いて単離した。凍結細胞を使用前に２回洗った。細胞を１μｇ／mlのPHA（Wellcome）及び10Ｕ／mlのrIL-2を含むRPMI／５％ HS中で２×10⁶／mlで培養した。PHAブラストを10Ｕ／mlのrIL-2を含む培養培地の中で必要なだけ供給及び分割しながら維持した。PHAブラストは培養６日目にAPCとして用いた。エンプティーとなったクラスＩ分子の作成及びペプチド負荷は、これらのAPCを用いたときに酸ストリップ洗によってのみ実施した。
PBMC及びPHAブラストの酸ストリップ／ペプチド負荷。PBMCをフィコルーパクプロトコールを利用して単離した。凍結細胞を利用するとき、PBMCは使用前に２回洗った。細胞を用意したら、それらを低温滅菌0.9％NaCl（J.T. Baker）＋１％のBSAの中で一回洗った。50ccのコニカル遠沈管の中で、これらの細胞を低温滅菌クエン酸−リン酸バッファー〔０〜13ＭのＬ−アスコルビン酸（J.T. Baker）、0.06Ｍのリン酸ナトリウムモノベース（Sigma）、pH３，１％のBSA、３μｇ／mlのβ₂ミクログロブリン（Scripps Labs）〕の中に10⁷／mlで再懸濁し、そして氷上で２分インキュベートした。直ちに、５容量の低温滅菌中和バッファー＃１〔0.15Ｍのリン酸ナトリウムモノベースpH7.5, １％のBSA、３μｇ／mlのβ₂ミクログロブリン、10μｇ／mlのペプチド〕を加え、そして細胞を1500rpmで５分、４℃でペレットにした。細胞を１容量の低温滅菌中和バッファー＃２〔PBS CMF, １％のBSA, 30lig／mlのNDAase, ３μｇ／mlのβ₂ミクログロブリン、40μｇ／mlのペプチド〕の中に再懸濁し、そして20℃で４hrインキュベートした。細胞を培養培地で約５×10⁶／mlに希釈し、そして6000radsで照射した。次に細胞を1500rpmで５min室温で遠心し、そして培養培地に再懸濁した。この酸ストリップ／ペプチド負荷細胞をCTL誘発培養（以下）に直ちに使用した。
酸ストリップ／ペプチド負荷した自己PBMC又はPHAブラストを刺激因子として使用する一次CTLの誘発。PBMC及びPHAブラストの酸ストリップ／ペプチド負荷は上記の通りである。刺激細胞とペプチドとの最後の４時間のインキュベーションの際、応答性細胞集団を調製した：応答体はCD4＋細胞の枯渇したPBMCである（上記）。応答細胞を培養培地の中に３×10⁶／mlで再懸濁した。１mlの応答細胞懸濁物を24穴組織培養プレート（Falcon, Becton Dickinson）の各ウェルに分注した。このプレートを37℃，５％のCO₂のインキュベーターの中に、刺激集団の用意が整うまで入れておいた。照射を付したら、刺激APCを、PBMCについては10⁶／ml、PHAブラストについては３×10⁵／mlにおいて20ng／mlのrIL-7を含む培養培地の中に再懸濁した。ウェル当り１mlの刺激細胞懸濁物を応答付含有プレートに加えた。誘発して７日後、200ng／mlのrIL-7を含む100μｌの培養培地を各ウェルに加えた（最終的には20ng／ウェルのrIL-7）。誘発して10日後、200Ｕ／mlのrIL-2を含む100μｌの培養培地を各ウェルに加えた（最終的には20Ｕ／ウェルのrIL-2）。
CTLの抗原再刺激。誘発の12〜14日目において、この一次CTLを接着APCを用いてペプチドで再刺激した。自己PBMCを融解し、そして上記の通りに洗った。細胞を6000radsで照射に付した。細胞をペレットにし、そして培養培地に４×10⁶／mlで再懸濁した。24穴組織培養プレートの各ウェルに１mlの細胞懸濁物を加え、そして37℃，５％のCO₂で２hrインキュベートした。非接着細胞を各ウェルを無血清RPMIで３回洗うことにより除去した。この工程の後、３μｇ／mlのβ₂ミクログロブリン及び20μｇ／mlの全ペプチドを含む0.5mlの培養培地を各ウェルに加えた。APCを２hr，37℃で、５％のCO₂下で、このペプチド及びβ₂ミクログロブリンをインキュベートした。ウェルをアスピレートに付し、そして培養培地中の1.5×10⁶／mlの応答細胞１mlを各ウェルに加えた。２日後、20Ｕ／mlのrIL-2を含む培養培地１mlを各ウェルに加えた。
細胞障害性クロム放出アッセイ。一次誘発の再刺激の７日後、この培養物の細胞障害活性を評価した。
ａ．エフェクター細胞の調製：この工程では「エフェクター」と呼ぶ応答細胞を遠心し、そしてRPMI／10％のFCSの中で10⁷／mlで再懸濁させた。エフェクターの３倍系列希釈を行って100：１，33：１，11：１及び３：１のエフェクター、対、標的の比を得た。エフェクター細胞をデュプリケートで、96穴Ｕ底クラスタープレート（Costar）で100μｌ／ウェルに小分けした。
ｂ．標的細胞の調製：アッセイの約16〜20hr前に、標的細胞を、３μｇ／mlのβ₂ミクログロブリン及び10μｇ／mlの総ペプチドの存在下又は非存在下でRPMI／10％のFCSの中で３×10⁵／mlにおいて再懸濁した。プレインキュベーション後、標的細胞を遠心し、そしてペレットを200μｌ（300μCi）のクロム酸（⁵¹Cr）ナトリウム（NEN）の中に再懸濁した。細胞を攪拌しながら37℃で１hrインキュベートした。ラベル化標的細胞をRPMI／10％のFCSで３回洗った。
ｃ．アッセイの準備：標的細胞濃度をRPMI／10％のFCSの中で10⁵／mlに調整し、そして100μｌのアリコートを応答体を含む各ウェルに加えた。Ｋ562細胞（NK及びLAK活性をブロックする寒冷（cold）標的）を洗い、そしてRPMI／10％のFCSの中に10⁷／mlで再懸濁した。20μｌのアリコートを各ウェル当りに加え、20：１の寒冷Ｋ562標的：ラベル化標的を得た。自発性⁵¹Cr放出の決定のため、100μｌ／ウェルのRPMI／10％のFCSを100μｌ／ウェルのラベル化標的細胞及び20μｌ／ウェルのＫ562に加えた。最大⁵¹Cr放出のため、PBS CMF中の100μｌの１％のTriton-X100（Sigma）を100μｌ／ウェルのラベル化標的細胞及び20μｌ／ウェルのＫ562に加えた。プレートを1200rpmで２分遠心して細胞抱合形成を加速させた。アッセイを５hr37℃、５％のCO₂でインキュベートした。アッセイをそのプレートを1200rpmで５min遠心し、そして100μｌ／ウェルの上清液を集めることにより回収した。標準のガンマー計測技術を％比分解を決定するために使用した（Micromedic自動ガンマーカウンター、0.5min／チューブ）。
培養細胞系。HLA A2.1発現性ヒトEBV−形質転換Ｂ細胞系であるJYをRPMI／10％のFCSの中で増殖させた。NK細胞感受性赤芽球系であるＫ562をRPMI／10％のFCSの中で増殖させた。Ｋ562はクロム放出アッセイにおいてNK及びLAK細胞によるバックグランド殺傷を下げるために用いた。
ペプチド。これらの研究において用いるペプチドはCytelで合成し、そしてその配列を表24ａに記載する。ペプチドを100％のDMSOの中で20mg／mLで希釈し、小分けし、そして−20℃で保存した。
FACS分析。約10⁶の細胞を試験すべき各抗体に関して使用した。細胞にPBS CNU＋0.1％のBSAで２回洗った。各サンプルに、100μｌのPBS CMF＋0.1％のBSA＋一次抗体２μｇ／ml（BB7.2, ATCC）又は（9.12.1, Inserm-CNRS, Marseille, France）又は（LB3.1, Childrens's Hospital Pittsburgh）を加えた。ネガティブなコントロールを常に加えておいた。細胞を氷の上で20分インキュベートし、そしてPBS CMF＋0.1％のBSAで２回洗った。細胞を100μｌの抗−マウスIgG FITCコンジュゲート（Sigma）の中に再懸濁し、PBS CMF＋0.1％のBSAの中に１：50で希釈し、そして氷の上で20minインキュベートした。細胞をPBS CMF＋0.1％のBSAで２回洗い、そしてFACScan（Becton Dickinson）分析のためにPBSの中に再懸濁した。分析を後日に延期する必要があるとき、細胞をPBS／１％のパラホルムアルデヒド（Fisher）で固定し、そして１週間以内に分析した。
完全細胞及び放射性ラベル化ペプチドを用いる結合性アッセイ。JY細胞をクエン酸−リン酸バッファー及び中和バッファー＃１で上記の通りに処理した。JYコントロール細胞は組織培養培地の中で未処理のままとしておいた。処理後、両細胞集団を無血清RPMIで２回洗い、そして¹²⁵Ｉ−放射性ラベル化941.01（HBC 15-27）ペプチド（標準クロラミンＴヨウ素化）を負荷した。結合特異性を決定するため、２×10⁶の細胞を¹²⁵Ｉ−941.01（10⁵cpms）±100μｇの未ラベル941.01を含む200μｌの中和バッファー＃２（上記）の中に再懸濁した。細胞を20℃で４hrインキュベートし、そして無血清RPMIで２回洗って遊離ペプチドを除去した。細胞を200μｌの無血清RPMIに再懸濁した。マイクロ遠沈管の中で、細胞懸濁物を800μｌのFCSの上に載せ、そして５秒の遠心によりペレットにした。上清駅をアスピレート除去し、そしてペレットの中に残っている放射活性を測定した（Micromedic自動ガンマーカウンター、１min／チューブ）。
実施例15
温和な酸処理によるクラスＩ MHC分子ペプチドストリップ／負荷。
グリシン又はクエン酸−リン酸バッファーの如きの温和なpH３の酸性溶液が、内生ペプチドを同定及び腫瘍肉連Ｔ細胞エピトープを同定するために様々なグループにより利用されている。この処理は、MHCクラスＩ分のみが不安定化され（そしてペプチドが放出され）、MHCクラスII分子を含むその他全ての表層抗原は完全のままとなっている点で固有である。最も重要には、本実施例の温和な酸溶液による細胞の処理が細胞の生存性及び代謝状態に影響しないことにある。この温和な処理は迅速であり、なぜなら内生ペプチドのストリップは４℃で２分において起こり、そしてAPCは適当なペプチドを負荷した後にその機能を発揮する用意が整っているからである。本例においては、我々は一次抗原−特異的CTLの発生のためにペプチドをAPCに対して特異的にする技術を利用する。得られるAPCはペプチド特異的CD8＋CTLを誘発するのに有効である。
FACS分析による測定。PHA−誘発化Ｔ−細胞ブラストを実施例15記載の方法に従って酸ストリップ／ペプチドを負荷した。得られる細胞を抗-HLA-A2（BB7.2）及び抗−HLAアルファー鎖−特異的（9.12.1）モノクローナル抗体を用いてFACS分析のために染めた。この実験のためのコントロールは、pH３では処理していない（しかしpH7.2のPBSバッファーで処理した）細胞集団と、クエン酸−リン酸バッファーでは処理したが（MHCを除去するため）、β₂ミクログロブリン及びペプチドの非存在下で中和した細胞とを含む。図15に示す結果は、これらの細胞のクエン酸−リン酸（pH３）バッファーによる処理が、両方の抗−HLAクラスＩ抗体単独（抗-HLA-A2及びアルファー鎖特異性）に対する細胞の反応性を有意に下げるが（10分の１）、クラスII MHC分子（抗-HLA-DR）に特異的なモノクローナル抗体に対しての反応性は下げないことを示唆する。最も重要には、β₂ミクログロブリン及びペプチドの存在下での酸ストリップ細胞の中和は蛍光強度において2.5分の１の低下のみを保って、有意な量のクラスＩ MHC抗−反応性部位の保存をもたらすことになる。重要には、この酸処理細胞は、トリパンブルー排出及び前進／後退FACSスキャッター分析により測定される通り、生存し続ける。同様の結果がEBV形質転換Ｂ細胞系、新鮮（又は凍結）PBMC）、及びその他のペプチド（HLA-A2.1又はHLA-A1）のいづれかと結合するもの）を用いて得られた（データーは示さず）。
エンプティーなMHC分子に対する放射性ラベル化ペプチドの結合。低温インキュベーション又は酸ストリップ／ペプチド負荷プロトコールを利用するペプチド負荷の効率を決定するため、JY細胞（HLA-A2.1 EBV−形質転換Ｂ細胞系）を26℃で一夜プレインキュベートするか、又は酸ストリップに付して内性MHC結合化ペプチドを除去し、そして外生ペプチドの負荷を¹²⁵Ｉ−放射性ラベル化HLA-A2.1結合性ペプチドを用いて決定した。この反応の特異性を、同じ配列の寒冷ペプチドを用いてラベル化ペプチドの結合の阻害を測定することにより決定した。表24ｂに示す結果は、細胞の酸処理が、JY細胞に対するラベル化ペプチドの結合量を有意に（約10倍）高めることを示した。更に、ラベル化ペプチドの結合は寒冷ペプチドの添加により完全にブロックされ、特異的な結合を示した（データーは示さず）。
酸ストリップ／ペプチド負荷APCSを用いる一次抗原特異的CTLのインビトロ誘発。低温インキュベーション及び酸ストリッププロトコールの両者を利用する一次CTLの誘発のための追加の臨界的なパラメーターは：１）応答細胞集団中のCD8＋Ｔ−細胞の富化（又はCD4＋Ｔ−細胞の枯渇）、２）０日目由来のCTL誘発培養に対するrIL-7の添加、及び３）ペプチドをパルスした自己接着細胞を用いての12〜14日目での抗原によるこの培養物の再刺激；である。図16及び17に示す結果は、PBMC及びPHA−誘発化Ｔ細胞ブラストのAPCとして用いて行った実験を示している。図18はAPCとしてPHA誘発化Ｔ−細胞ブラストを用いる実験を示し、一方、図19はAPCとしてのPBMCの利用を示す。
実施例16
CTLエピトープを同定するためのペプチドのスクリーニング
CTLエピトープを同定するために、CTLをAPCとしてのSAC-I活性化PBMCにより刺激した。クラスＩβ−２ミクログロブリン複合体が不安定であるMHCの低温発現を酸ストリップに加えて利用してPBMC APCを作った。
完全培養培地。本研究において用いた細胞培養培地は、RPMI 1640とヘペス及びＬーグルタミン（Gibco）とより成り、２mMのＬ−グルタミン（Irvine Scientific）、0.5mMのピルビン酸ナトリウム（Gibco）、100Ｕ／100μｇ／mlのペニシリン／ストレプトマイシン（Irvine）及び５％の熱不活性化AB型ヒト血清（RPMI／５％のHS；Gemini Bioproducts）が添加されている。EBV−形質転換系の増殖に用いる培養培地はヒト血清の代わりに10％の熱不活性化胎児牛血清（RPMI／10％のFCS, Irvine）を含む。
サイトカイン。組換ヒトインターロイキン−２（rIL-2）及びインターロイキン−４（rIL-4）をSandozより入手し、そしてそれぞれ10Ｕ／ml及び10ng／mlの最終濃度で使用した。ヒトインターロイキン−２（IFN-2）及び組換ヒトインターロイキン−７（rIL-7）をGenzymeより入手し、そしてそれぞれ20Ｕ／ml及び10ng／mlで使用した。
ペプチド。ペプチドはCytelで合成し、そして表24ａに記載してある。ペプチドを100％のDMSOの中に20mg／mlに通常に希釈し、小分けし、そして使用するまで−70℃で保存した。
細胞系。JY、スタインリン、EHM、BVR及びKT3はそれぞれHLA A2.1, A1, A3, A11及びA24を発現するホモ接合ヒトEBV−形質転換Ｂ細胞系である。これらはRPMI／10％のFCSの中で増殖する。RPMI／10％のFCSの中で増殖させたNK細胞感受性の赤芽球系Ｋ562をCTLアッセイにおけるバックグランド殺傷を低下するために使用した。MAGE抗原を発現するmel397及びmel 938、又はMAGE抗原を発現しないmel888のいづれかの黒色腫細胞系もRPMI／10％のFCSの中で増殖させた。
末梢血液単核細胞の単離（PBMCs）。全血をヘパリン含有シリンジの中に集め、そして50ccのチューブの中で1600RPM（Beckman GS-6KD）で15分遠心した。次いで血漿層を除去し、そして10mlのバッフィーコートをピペットで円運動を利用して集めた。このバッフィーコートをよく混合し、そして等容量のRPMIで希釈した。次にこのバッフィーコート（30ml）を20mlのフィコルーパク（Pharmacia）の上に載せ、そしてブレーキをオフにして1850RPM（400ｇ）で20分、25℃で遠心した。フィコルもPBMC含有血漿との界面を分注ピペットで回収し（50mlのチューブ当り２界面）、そして50mlのRPMIで３回洗った（1700, 1500及び1300RPMで10分）。細胞を10〜20mlの培養培地に再懸濁し、計測し、そして適当な濃度に調整した。
PBMCの凍結。３千万の細胞／チューブ（90％のFCS／10％のDMSO；Sigma）を、イソプロパノール（Fisher）を含むNalgene Cryo １℃凍結用容器に挿入し、そして−70℃で４hr（最短）〜一夜（最）放置した。イソプロパノールは５回毎に交換した。チューブを液体窒素に長期保存のために移し入れた。融解のため、PBMCを37℃の湯浴の中で最後の結晶がほぼ融解するまで連続振盪した（チューブはそれ以上は湯浴又は室温で放置しなかった）。細胞を30μｇ／mlのDNaseを含む無血清RPMIに希釈して死んだ細胞DNAによる凝塊を防ぎ、次いで２回洗った。
APCとしてのSAC-I活性化PBMCを用いる一次CTLの誘発
ａ．APCの調製：PBMCを標準のフィコル−パク プロトコールを用いて精製し、そして0.005％のパンソービン（Pansorbin）細胞（プロテインＡを発現するSAC-I細胞；Calbiochem）、20μｇ／mlのImmunobeads（ウサギ抗−ヒトIgM；Biorad）及び20ng／mlのヒトrIL-4を含むRPMI／５％のFCSの中に１×10⁶／mlで再懸濁した。ウェル当り２mlの細胞を24穴プレート（Falcon, Becton Dickinson）の中でプレートし、そして37℃で培養した。３日後、培地を除去し、そして細胞を３回洗い、次いでRPMI／10％のHSを加えた。細胞はRPMI／10％のHSの中で更に２日間培養した後に用いた。
ｂ．APCの表層上でのエンプティーなクラスＩ分子の発現及びAPCのペプチド負荷。
１．低温インキュベーション：
ａ．APCにおけるエンプティーなMHCの発現：APCを、10ng／mlのrIL-4, 20Ｕ／mlのヒトIFN-2及び３μｇ／mlのβ₂−ミクログロブリン（β₂ｍ；Scripps Lab）を含む完全培養培地の中で２×10⁶／mlの濃度に調整した。これらの細胞を次に５％のCO₂の存在下で26℃で一夜インキュベートした。これらの細胞はエンプティーな状態でわずかなクラスＩ分子しか発現しないことに注目すべきである（≒10％）。
ｂ．APC刺激細胞のペプチド負荷：
エンプティーなクラスＩを発現するAPCを無血清RPMI（＋Ｌ−グルタミン及びヘペス）で１〜２回洗い、そして全部で50μｇ／mlのペプチドプール（即ち、３プールにおいては16.7μｇ／mlづつのペプチド；２プールにおいては25μｇ／mlづつのペプチド；単一プールにおいては50μｇ／mlづつのペプチド）、30μｇ／mlのDNAse及び３μｇ／mlのβ₂ｍを含む無血清RPMIの中に１×10⁷に再懸濁した。20℃で４時間のインキュベーション後、これらの細胞を6100radsで照射し（５×10⁶／ml；２千５百万細胞／チューブ）、洗い、そして誘発培養物への添加のために適当な濃度に調整した（下記参照）。
２．酸ストリップ：これはAPCの表層上にエンプティーなMHCを作り上げるための別の方法として利用した。SAC-I活性化PBMCを１％のBSAを含む低温の0.9％の塩化ナトリウム（J.T. Baker）の中で１回洗った。その細胞を１％のBSA及び３μｇ／mlのβ₂ｍを含む低温クエン酸−リン酸バッファー（0.13ＭのＬ−アスコルビン酸（J.T. Baker）、0.06Ｍのリン酸ナトリウムモノベース（Sigma），pH３）の中で10⁷／mlに再懸濁し、そして氷上でインキュベートした。２分後、５容量の１％のBSA、３μｇ／mlのβ₂ｍ及び10μｇ／mlのペプチドを含む低温の0.15Ｍのリン酸ナトリウムモノベースpH7.5（中和バッファー＃１）を加え、そして細胞を1500RPMで５分４℃で遠心した。その細胞を、１％のBSA、30μｇ／mlのDNase、３μｇ／mlのβ₂ミクログロブリン及び50μｇ／mlのペプチドを含む１mlの低温PBS（中和バッファー＃２）に再懸濁し、そして20℃で４時間インキュベートした。上記の通り、20℃で４時間のインキュベーション後、その細胞を6100radsで照射し（５×10⁶／ml；２千５百万細胞／チューブ）、洗い、次いで誘発培養物への添加のために適当な濃度に調整した（下記参照）。
ｃ．CD4＋枯渇PBMC応答細胞集団の調製（AISフラスコを利用するリンパ球サブ集団の枯渇）AIS Micro Cellector T-150フラスコ（CD4＋Ｔ細胞の枯渇のために特製；Menlo Park, CA）を25mlのPBS／１mMのEDTAを加えることにより下準備し、全ての表面が湿るように30秒攪拌し、次いで結合面を下にして室温で１時間インキュベートした。このインキュベーション後、フラスコを30秒強く攪拌し、PBS／EDTAで１回、PBSで更に２回洗い、次いで25mlの培養培地と15分インキュベートした。PBMCを30μｇ／mlのDNaseを含む無血清RPMI（＋Ｌ−グルタミン＋ヘペス）の中に融解し、１回洗い、そして培養培地の中で15分インキュベートした。フラスコからの培養培地のアスピレーション後、１億８千万個までのPBMCを30μｇ／mlのDNAseを含む25mlの培養培地に加えた。室温で１時間後、そのフラスコを10秒ゆっくりとゆらして非接着細胞を再懸濁させた。CD8＋Ｔ細胞を含む非接着細胞懸濁物を集め、そしてそのフラスコをPBSで２回洗った。このCD4＋Ｔ細胞枯渇PBMCを遠心し、そして誘発培養物への添加のために計測した。CD4＋枯渇細胞集団のCD4＋及びCD8＋表現型をFACS分析により決定した（以下参照）。一般に、この技術はCD8＋T細胞の２倍富化をもたらし、CD4＋Ｔ細胞枯渇を経て約40〜50％のCD8＋Ｔ細胞及び15〜20％の残留CD4＋Ｔ細胞となる。CD4＋Ｔ細胞の枯渇は抗体及び補体又は抗体コート化磁性ビーズ（Dynabeads）によっても成し遂げられうる。CD4＋Ｔ細胞の枯渇はCTLpを富化する、及び細胞栄養素に関して競合し、且つCTLp増殖を阻害しうる細胞を除去する目的を担う。
ｄ．一次CTLの誘発。刺激APCの４時間にわたるペプチド負荷の際、応答集団として使用すべきCD4＋枯渇PBMCをCD4＋Ｔ細胞の枯渇にわたる（上記）CD8＋Ｔ細胞の選別のためにAISフラスコを利用して調製した。この応答細胞を１mlの容量において３×10⁶／mlでプレートし（24穴プレート）、そしてペプチド負荷刺激APCが調製されるまで37℃に入れておいた。照射したペプチド負荷APCを無血清RPMI（＋Ｌ−グルタミン及びヘペス）で１回洗い、完全培地の中で１×10⁶／mlに調整し、そして24穴プレートに１ml／プレートでプレート培養した。PBMCに関しては、１×10⁶の刺激細胞（１ml容量）を応答細胞含有ウェルの中でプレート培養した。SAC-I活性化PBMC及びPHAブラストに関しては、１mlの３×10⁵／mlの刺激細胞を各ウェルの中でプレート培養した。10μｇ／mlの最終濃度の追加ペプチドを10ng／mlの最終濃度のrIL-7（２mlの総容量）の他に加えた。７日目にて、更に10μｇ／mlのrIL-7をこの培養物に加え、そしてその後３日毎に10Ｕ／mlのrIL-2を加えた。12日目において、この培養物をペプチドパルスした接着細胞で再刺激し、そして７日後に細胞溶解活性について試験した（以下）。
接着APCを用いる一次CTLの再刺激のためのプロトコール。PBMCを30μｇ／mlのDNAseを含む無血清RPMI（＋Ｌ−グルタミン及びヘペス）の中で融解し、２回洗い、そしてDNAseを含む培養培地の中で５×10⁶／mlに調整した。PBMC（２千５百万細胞／５mlのチューブ）を6100Ｒで照射した。１回の洗浄後、PBMCを培養培地に再懸濁し、そして４×10⁶／mlに調整した。１mlの照射PBMCを24穴プレートのウェル当りに加えた。このPBMCを37℃で２時間インキュベートし、非接着細胞を除去するために３回洗い、そして0.5mlの容量において20μｇ／mlの全ペプチド及び３μｇ／mlのβ₂ミクログロブリンを含む培地の中で培養し、そして37℃で２時間インキュベートした。このペプチドをアスピレートし、そして培養培地の中に再懸濁した1.5×10⁶の応答細胞を１mlの容量で加えた。２日後、20Ｕ／mlのrIL-2を含む１mlの培養培地を加えた。
FACS分析。百万の細胞／チューブを遠心し、100μｌ／チューブにおいてPBS／0.1％のBSA／0.02％のアジ化ナトリウム（Sigma）と10μｌ／チューブの直接コンジュゲート化抗体（Becton Dickinson）の中に再懸濁し、そして氷の上で15〜20分インキュベートした。次いで細胞をPBS／0.1％のBSA／0.02％のアジ化ナトリウムで２回洗い、そしてPBSの中に再懸濁してFACScan（Beckton Dickinson）で分析した。サンプルを１〜２日以内で分析できないとき、細胞を１％のパラホルムアルデヒド（Fisher）を含むPBSで固定し、そして１週間以内に分析した。
細胞障害アッセイ
ａ．標的細胞の調製。CTLアッセイの約16〜20時間前に、標的細胞（クラスＩ対合EBV−形質転換系）を１回洗い、そして10μｇ／mlの全ペプチドの存在下又は非存在下でRPMI／５％のFCSの中で３×10⁵／mlにおいて10mlの容量に再懸濁した。
ｂ．標的細胞のラベリング：標的細胞を遠心し、そして200μｌ／チューブのクロム酸（⁵¹Cr）ナトリウム（NEN）の中に再懸濁し、次いで37℃で１時間シェーカー上でインキュベートした。標的をRPMI／10％のFCSで３回洗い（10ml／洗浄）、そして10mlに再懸濁した（ラベリングの効率を決定するため、50μｌ／標的をMicromedic自動ガンマーカウンターで計測した）。
ｃ．CTLアッセイ。標的細胞を２×10⁵／mlに合わせ、そして50μｌの細胞培養物をＵ底96穴プレート（Costar Corp.）の各ウェルに１×10⁴／ウェルの最終濃度で加えた。Ｋ562細胞を１回洗い、４×10⁶／mlに再懸濁し、そして50μｌ／ウェルを２×10⁵／ウェルの最終濃度で加えた（寒冷Ｋ562、対、標的の比は20：１）。応答細胞を１回洗い、９×10⁶／mlで再懸濁し、そして90：１，30：１，10：１及び３：１のエフェクター、対、標的の比のために３倍系列希釈を行った。応答細胞をデュプリケートウェルにおいて100μｌの容量で加えた。自発性放出のため、50μｌ／ウェルのラベル化標的細胞、50μｌ／ウェルのＫ562及び100μｌ／ウェルの培地を加えた。最大放出のため、50μｌ／ウェルの標的、50μｌ／ウェルのＫ562及び100μｌ／ウェルの0.1％Triton-X100（Sigma）を加えた。プレートを1200RPMで５分遠心した。37℃で５時間のインキュベーション後、プレートを再び1200RPMで５分遠心し、そして100μｌ／ウェルの上清液を回収した。標準ガンマー計測技術（Micrmedic自動ガンマーカウンター；0.5分／チューブ）を利用し、次式に従ってパーセント比溶解を決定した：％比溶解＝実験値cpm−自発放出cpm／最大放出cpm−自発放出cpm×100。
細胞障害アッセイ（CTLアッセイ）は、最も高い２つのエフェクター、対、標的（Ｅ：Ｔ）の比での特異的なペプチドで感作した標的のCTLによる溶解がコントロール標的（即ち、ペプチドなしの標的細胞）の溶解より15％大であるときに陽性と考えた。細胞障害アッセイ（CTLアッセイ）は、最も高い２つのエフェクター、対、標的（Ｅ：Ｔ）の比での特異的なペプチドで感作した標的のCTLによる溶解がコントロール標的（即ち、ペプチドなしの標的細胞）の溶解より６％大であるときボーダーラインにあると考えた。
ｄ．結果。表示のアレルに結合するペプチドのうちで、49MAGEペプチドの９、45HIVペプチドの10、25HCVペプチドの３及び20HBVペプチドの２をインビトロでの誘発一次CTLのデーターのために試験した。様々な免疫原ペプチドに対するCTL応答を示す代表的なグラフをMAGE（図22）、HIV（図23）、HCV（図24）及びHBV（図２）に関して示す。CTL誘発データーは、適当なMHCに結合し、そしてインビトロで一次CTLを誘発する免疫原性ペプチドをリストしている表24にまとめた。表示しているのはペプチドの配列、対応の抗原及びそれが結合するHLAアレルである。図20に示す結果は、ペプチド感作標的及び内生標的であって低温及びインキュベーション技術によりMAGE3ペプチド1044.07を負荷したSAC-I活性化PBMCによる刺激を経たものの溶解を示す。図21は酸ストリップ負荷技術（パネルａ）と低温インキュベーション技術（パネルｂ）との対比を示す。
本発明のわかり易さのために具体例及び実施例により多少詳しく説明してきたが、所定の変更及び改良が本発明の範囲を逸脱することなくなせることが明らかであろう。

Claims (16)

1. HLA−Ａ１構造モチーフを有するエピトープを同定する方法であって：
   注目の抗原からアミノ末端及びカルボキシル末端を有するアミノ酸配列を用意し；そして
   下記の群から選ばれるアミノ酸モチーフを含んで成る８〜11個のアミノ酸残基から成るサブ配列を同定し：
   （ｉ）前記サブ配列のアミノ末端から２位の位置にあるＴ及びＳから成る群から選ばれる第一アミノ酸残基及び当該サブ配列のカルボキシル末端にあるＹである第二アミノ酸残基を含んで成る第一モチーフ；並びに
   （ii）前記サブ配列のアミノ末端残基から３位にあるＤ及びＥから成る群から選ばれる第一アミノ酸残基及び当該サブ配列のカルボキシル末端にあるＹである第二アミノ酸残基を含んで成る第二モチーフ；
   かくて前記エピトープを同定する工程を含んで成る方法。
2. 更に、
   前記エピトープを含んで成るHLA−Ａ１モチーフ保有ペプチドを獲得し；
   当該ペプチドとHLA−Ａ１分子との複合体のHLA−Ａ１制限細胞障害Ｔ細胞により認識され、それ故当該エピトープに対する細胞障害Ｔ細胞応答を誘導する能力について試験し；そして
   当該エピトープに対する細胞障害Ｔ細胞応答を誘導するペプチドを選定する；
   工程を含んで成る請求項１記載の方法。
3. 更に：
   前記エピトープを含んで成るモチーフ保有ペプチドのHLA−Ａ１分子に対する結合親和力を決定し；そして
   約500nM未満のHLA−Ａ１分子に対するIC50を有するペプチドを同定する；
   工程を含んで成る請求項１記載の方法。
4. 免疫原性ペプチドを作製する方法であって：
   注目の抗原からアミノ末端及びカルボキシル末端を有するアミノ酸配列を用意し；
   HLA−Ａ１分子に対するペプチド結合能の備った構造モチーフを含んで成る長さ８〜11アミノ酸残基のエピトープを前記アミノ酸配列内で同定し、ここで当該構造モチーフは
   （ｉ）前記エピトープのアミノ末端残基から２位にあるＴ及びＳから成る群から選ばれる第一アミノ酸残基及び当該エピトープのカルボキシル末端にあるＹである第二残基を含んで成る第一構造モチーフ；並びに
   （ii）前記エピトープのアミノ末端残基から３位にあるＤ及びＥから成る群から選ばれる第一アミノ酸残基及び当該エピトープのカルボキシル末端にあるＹである第二アミノ酸残基を含んで成る第二構造モチーフ；
   から成る群から選ばれ；
   前記HLA−Ａ１構造モチーフを含んで成る前記抗原に由来する少なくとも一のペプチドフラグメントを獲得し；
   前記少なくとも一のペプチドフラグメントとHLA−Ａ１分子との複合体のHLA−Ａ１制限細胞障害Ｔ細胞により認識され、それ故当該エピトープに対する細胞障害Ｔ細胞応答を誘導する能力について試験し；そして
   当該エピトープに対する細胞障害Ｔ細胞応答を誘導する、前記同定工程のHLA−Ａ１構造モチーフを含んで成る１又は複数のペプチドフラグメントを選定する；
   工程を含んで成る方法。
5. 約500nM未満のIC50においてHLA−Ａ１分子に結合するペプチドを作製する方法であって：
   注目の抗原からアミノ末端及びカルボキシル末端を有するアミノ酸配列を用意し；
   HLA−Ａ１分子に対するペプチド結合能の備った構造モチーフを含んで成る長さ８〜11アミノ酸残基のエピトープを前記アミノ酸配列内で同定し、ここで当該構造モチーフは
   （ｉ）前記エピトープのアミノ末端残基から２位にあるＴ及びＳから成る群から選ばれる第一アミノ酸残基及び当該エピトープのカルボキシル末端にあるＹである第二残基を含んで成る第一構造モチーフ；並びに
   （ii）前記エピトープのアミノ末端残基から３位にあるＤ及びＥから成る群から選ばれる第一アミノ酸残基及び当該エピトープのカルボキシル末端にあるＹである第二アミノ酸残基を含んで成る第二構造モチーフ；
   から成る群から選ばれ；
   前記HLA−Ａ１構造モチーフを含んで成る注目の抗原に由来する少なくとも一のペプチドフラグメントを獲得し；
   当該少なくとも一のペプチドのHLA−Ａ１分子に対する結合親和力を決定し；そして
   HLA−Ａ１に対して約500nM未満のIC50を有するペプチドを選定する；
   工程を含んで成る方法。
6. 前記獲得工程が長めのペプチドを占める前記少なくとも一のペプチドフラグメントの獲得を含んで成り、但しこの長めのペプチドは天然抗原全体でないことを条件とする、請求項４又は５記載の方法。
7. 前記獲得工程が前記少なくとも一のペプチドフラグメントをコードする組換核酸分子の発現を含んで成る、請求項４又は５記載の方法。
8. 前記注目の抗原が癌関連抗原である、請求項４又は５記載の方法。
9. 前記癌関連抗原がCEA,HER2／neu、ｐ53、MAGE又は前立腺抗原である、請求項８記載の方法。
10. 前記注目の抗原が病原因子に由来する、請求項４又は５記載の方法。
11. 前記病原因子がHIV,HBV,HCV又はマラリア抗原である、請求項10記載の方法。
12. 前記獲得工程が８，９，10又は11残基のペプチドフラグメントの獲得を含んで成る、請求項４又は５記載の方法。
13. 少なくとも二のペプチドフラグメントを獲得する、請求項４又は５記載の方法。
14. 更に、
    HLA−Ａ１分子に対する獲得ペプチドフラグメントの結合親和力を決定する工程を含んで成る、請求項４記載の方法。
15. 約500nM未満のHLA−Ａ１分子に対するIC50の結合親和力を有する獲得ペプチドフラグメントを同定する工程を更に含んで成る請求項14記載の方法。
16. 更に、
    HLA−Ａ１制限細胞障害Ｔリンパ球を前記選定のペプチドとHLA−Ａ１分子との複合体と接触させる工程を含んで成る、請求項５記載の方法。

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