CN101379089B

CN101379089B - 抗ilt7抗体

Info

Publication number: CN101379089B
Application number: CN200680053131XA
Authority: CN
Inventors: 鸭川由美子; 赵民权; 新井直子; 石田晃司
Original assignee: SBI Biotech Co Ltd
Current assignee: SBI Biotech Co Ltd
Priority date: 2005-12-20
Filing date: 2006-12-20
Publication date: 2013-08-07
Anticipated expiration: 2026-12-20
Also published as: ES2416716T3; RS53752B1; PL2913343T3; ME02111B; RU2012112046A; CY1116031T1; JP5020828B2; PT2532681E; CA2634116A1; AU2006328470B2; JP5420688B2; US20130259872A1; PT2913343T; CA2634116C; US20120135003A1; ES2526079T3; US8470992B2; PL2532681T3; SI2532681T1; NZ599683A

Abstract

能够结合IPC的抗体是通过利用动物细胞来获得的，在该细胞中与ILT7结合的细胞膜蛋白是作为免疫原共表达的。本发明的抗体具有高特异性，使得该抗体能够从免疫学上将ILT7与其他ILT家族分子区分开来。本发明的抗ILT-7的抗体能够结合IPC并抑制其活性。通过本发明的抗ILT-7的抗体可以抑制IPC的活性，并且可以治疗或预防干扰素相关疾病。在IFNα存在的情况下，ILT7在IPC中的表达仍可维持。因此，在IFNα生成量增加的多种自身免疫病病人体内，可以预期抗ILT-7的抗体对于IPC活性的抑制作用。

Description

抗ILT7抗体

技术领域

本发明涉及能够结合人ILT7的抗体。

背景技术

干扰素α(IFNα：在下文中“干扰素”以缩写IFN代表)以及干扰素β(IFNβ)作为1型IFN为人们所知，该类型IFN具有抗病毒活性或者抗肿瘤活性。另一方面，已经有研究表明IFNα涉及自身免疫病。例如，已经报道过在以下的自身免疫病的病人体内有IFNα的异常产生。已经有研究提示可以通过中和IFNα来减轻自身免疫病的症状。

系统性红斑狼疮(Shiozawa et al.，Arthr.&Rheum.35，412，1992)

慢性风湿(Hopkins et al.，Clin.Exp.Immunol.73，88，1988)

已经有报道在给药重组的IFNα2或IFN之后自身免疫病的症状出现或者恶化的例子(Wada et al.，A m.J.Gastroenterol.90，136，1995；Perez et al.，Am.J.Hematol.49，365，1995；Wilson LE et al，Semin Arthritis.Rheum.32，163-173，2002.).

进一步地，还有研究提示IFNα能够诱导树突细胞(dendritic cell)的分化。树突细胞也是一种抗原呈递细胞。因此，认为树突细胞的分化诱导包括自身免疫病的重要的机制。已经有研究表明在IFNα诱导树突细胞分化和系统性红斑狼疮的发作之间有很深的联系(Blanco et al.，Science，16：294，1540-1543，2001)。因此，已经有研究指出IFNα与抗肿瘤活性以及自身免疫病密切相关。而且，IFNα与银屑病的发作有密切的关系(Nestle FO et al.，J.Exp.Med.202，135-143，2005)。

将当病毒感染时能够产生大量1型IFN的细胞鉴定为干扰素生成细胞(Interferon Producing cell，IPC)。很少有IPC在血液中出现。研究者认为在外周血淋巴细胞中仅有1％或者更少的IPC。然而，IPC具有很高的产生IFN的能力。IPC产生IFN的能力能够达到，例如，3000pg/毫升/10⁴细胞。也就是说，可以说虽然只有很少的细胞，但是在病毒感染时血液中产生的大部分的IFNα或IFNβ是由IPC产生的。

另一方面，IPC是未分化的淋巴样树突细胞，该细胞被认为是树突细胞的前体细胞。IPC可能指的是类浆树突细胞(Plasmacytoid dendritic cell)。在病毒的刺激下IPC会分化成树突细胞并且诱导T细胞产生IFNγ或IL-10。IPC也可以在IL-3的刺激下分化成树突细胞。在IL-3的刺激下所分化的树突细胞会诱导T细胞产生Th2细胞因子(IL-4，IL-5和IL-10)。因此，IPC具有在不同的刺激下分化成不同树突细胞的性质。

相应地，IPC具有两种类型：IFN产生细胞和树突细胞的前体细胞。在免疫系统中两种细胞都起重要的作用。换言之，IPC是在多个方面支持免疫系统的重要细胞。

非专利文献1：Shiozawa et al.，Arthr.&Rheum.35，412，1992

非专利文献2：Hopkins et al.，Clin.Exp.Immunol.73，88，1988

非专利文献3：Wada et al.，Am.J.Gastroenterol.90，136，1995

非专利文献4：Parez et al.，Am.J.Hematol.49，365，1995

非专利文献5：Bianco et al.，Science，16：294，1540-1543，2001

非专利文献6：Ju et al.，Gene.2004 Apr 28；331：159-64.

非专利文献7：Colonna M et al.，Seminars in Immunology 12：121-127，2000.

非专利文献8：Nakajima H.et al.，J.Immunology 162：5-8.1999

非专利文献9：Wilson LE et al，Semin Arthritis.Rheum.32，163-173，2002

非专利文献10：Nestle FO et al.，J.Exp.Med.202，135-143，2005

专利文献1：WO03/12061(U.S.Patent Published Application No.2003-148316)

发明内容

[本发明所要解决的问题]

本发明的目的是提供能结合免疫球蛋白样转录物7(Immunoglobulin-Like transcript-7，ILT7)的抗体，并且检测，鉴定或者分离IPC。本发明的另一个目的是调节IPC的活性。

为了调节诸如IFN这样的体液因子的活性，给药能够识别该因子的抗体是有效的。例如，已经实现了通过针对白介素(IL)-1或者IL-4的抗体来治疗自身免疫病的尝试(Guler et al.，Arthritis Rheum.，44.S307，2001)。进一步地，设想中和抗体可以和干扰素一样作为种自身免疫病的治疗制剂来起作用(Stewart，TA.Cytokine Growth Factor Rev.14；139-154，2003)。可以预言与上述相同的方法对于由IPC所产生的IFN同样有效。然而，这样的方法是基于在产生体液因子之后抑制该因子的效力。如果可以直接地控制所需体液因子的产生，就可以得到更明显的疗效。

已经报道过能够识别人IPC的抗体。例如，抗BDCA-2单克隆抗体是人IPC-特异的单克隆抗体(Dzionek A.et al.J.Immunol.165：6037-6046，2000)。研究者发现抗BDCA-2单克隆抗体能够有效地抑制人IPC产生IFN(J.Exp.Med.194：1823-1834，2001.)。而且，还报道过能够识别小鼠中干扰素生成细胞的单克隆抗体能够抑制干扰素的产生(Blood 2004 Jun 1；103/11：4201-4206.Epub 2003 Dec)。已经有报道称针对小鼠类浆树突细胞的单克隆抗体会造成树突细胞数目的减少(J.Immunol.2003，171：6466-6477)。

相似地，如果能够提供识别人IPC、并且调节其活性的抗体，那么会非常有用。例如，本发明的发明者已经显示了能够识别Ly49Q的抗体会特异地结合小鼠的IPC。然而，针对Ly49Q的抗体不会干扰小鼠IPC的活性(Blood，1 April 2005，Vol.105，No.7，和pp.2787-2792.；WO2004/13325)。另一方面，已知ILT7是一种特异表达在类浆树突细胞中的分子(Ju XS et al.and Gene.2004 Apr 28；331：159-64.；WO03/12061)。然而，还没有获得过任何针对ILT7的抗体。因此，抗体对于IPC的作用仍然未知。

ILT7是一种含有免疫球蛋白样基序的膜蛋白。已经有报道称该分子是在骨髓系统或者淋巴系统的细胞中表达的分子之一(Colonna M et al.，Seminars in Immunology 12：121-127，2000.)。一类具有类似于ILT7结构的分子被指定为ILT家族。ILT家族也与杀伤细胞抑制受体(killer cell inhibitoryreceptor，KIR)的结构、功能相近。ILT7与ILT家族其它分子一样具有4个C-型免疫球蛋白样结构域。研究者认为ILT7像ILT1、ILT1样蛋白、ILT8和LIR6a等一样将活化的信号送入到细胞内。已经确认了，在血系统细胞中有属于ILT家族的分子的表达(Young et al.，Immunogenetics 53：270-278，2001；“The KIR Gene Cluster.“Carrington，Mary and Norman，Paul.Bethesda(MD)：National Library of Medicine(US)，NCBI；2003)。

于是，通过减除杂交法检测到了ILT7在类浆树突细胞(Plasmacytoiddendritic cell，PDC)中的高表达以及在单核细胞衍生的树突细胞(monocyte-derived dendritic cell，MDDC)中的低表达。ILT2和ILT3不仅在 PDC中有表达，而且在从MDDC或CD34阳性细胞中获得的DC中也有表达。然而，由于ILT7的mRNA在PDC中特异地表达，所以发现了可以使用该mRNA作为PDC的标记。另外，当时已经发现了，通过CpG的刺激可以降低ILT7的表达(Ju XS et al.Gene.2004 Apr 28；331：159-64.；WO03/12061)。

本发明的发明者通过研究人IPC确认了：在IPC中ILT7的表达特异性地亢进。于是，本发明的发明者尝试了制备ILT7抗体，并且阐述其作用。例如，诸如ILT2和ILT3这样的构成ILT家族的分子，特别是在其胞外域的氨基酸序列上具有高保守性(图9)。这些ILT家族分子分别在不同的血细胞中展示特有的表达谱。因此，获得能够从免疫学上区分ILT7与其他的ILT家族分子的抗体是非常重要的。然而，实际上，由于下述的障碍，制备以ILT7为免疫原特异性结合人IPC的抗体是困难的。

通常，将通过基因重组技术制备的蛋白用作免疫原，以便获得能够识别从活体组织中得到的微量蛋白的抗体。本发明的发明者以人ILT7的cDNA序列、以及根据该碱基序列翻译而成的氨基酸序列的信息(GenBankAccession No.NM_012276)为基础设法表达了人ILT7。然而，在常规条件，不能作为重组体表达人ILT7。

为了获得蛋白的抗体，也经常尝试使用天然蛋白的部分氨基酸序列作为免疫原。然而，由于在ILT家族中其氨基酸序列同源性极高，所以对于人ILT7几乎没有氨基酸序列是特异的。而且，为了使抗体能够识别细胞表面的分子，选择位于细胞表面的区域是必要的，其中该区域是由能够作为抗原表位被抗体识别的部分组成的。因此，研究者已经认识到利用氨基酸序列片段作为免疫原来制备特异针对ILT7的抗体是不现实的。

本发明的发明者明确了在这种条件下可以通过利用特异的免疫原获得能够结合IPC的抗体。更进一步地，本发明的发明者发现：以这种方法获得的抗体能够特异地识别人IPC并且进一步地具有调节其活性的作用，因此成功的完成了本发明。就是说，本发明涉及下述的抗ILT-7抗体、其制备方法及其应用。

[本发明的效果]

本发明提供了可以用于制备能够识别人ILT7的抗体的免疫原以及利用该免疫原制备抗人ILT-7抗体的方法。ILT7是属于ILT家族的一种膜蛋白。具体地，ILT家族的胞外区的氨基酸序列是高度保守的。因此，想要通过常规的免疫方法来制备能够区分ILT家族成员的抗体是非常困难的。本发明的发明者显示了可以很方便地利用动物细胞来获得能够识别人ILT7的抗体，其中该动物细胞共表达了ILT7与细胞膜蛋白。通过本发明的方法获得的抗ILT-7抗体具有高特异性，该抗体能够区分人IPC与其他表达ILT家族成员的细胞。

在优选应用实例中，本发明所提供的抗人ILT-7抗体能够结合人IPC。另外，本发明的抗体特异地识别人IPC。因此，该抗体可用于检测和分离IPC。IPC是产生大部分1型干扰素的细胞。因此，在诊断和研究诸如自身免疫病这样的与IPC相关的疾病时，检测和分离IPC是很重要的。具体地，按照本发明的发明者的发现，IPC中ILT7的表达不因IFNα的存在而降低。在患有自身免疫病的病人体内，IFNα的表达经常被促进。这意味着可以使用本发明的抗ILT-7的抗体来检测和分离患有自身免疫病的病人的IPC，在该病人体内IFNα的表达受到了促进。

在优选应用实例中，本发明提供的抗ILT-7抗体具有调节人IPC的活性的作用。因此，可以使用本发明的抗ILT-7抗体来抑制IPC的活性。如前所述，在IFNα存在的情况下，IPC中ILT7的表达不会减少。因此，如果利用本发明的抗体对IPC的活性的抑制，那么可以预期该抗体对于患有自身免疫病的病人具有治疗效果，其中在该病人体内IFNα的表达被促进了。

少量的IPC就可以产生大量的IFN。需要与IFN分子一样多的抗体来中和IFN。然而，在本发明中直接抑制了生成细胞的活化。因此，可以预期与利用抗IFN抗体中和IFN相比，即使使用少量的抗体也能获得强效的IFN抑制作用。此外，在持续产生IFN的情况中，可以预言通过IFN抗体来进行中和是暂时的抑制。在本发明中，由于抑制了IPC的活性，可以预期对IFN的产生的抑制作用可以在很长的时间内有效。

附图说明

图1a是通过RT-PCR方法检测ILT7基因的mRNA的表达的照片。该图是对人免疫细胞中ILT7基因的mRNA的表达的分析结果。

图1b是利用定量PCR方法检测和比较多种人组织和细胞中ILT7基因的mRNA的表达的图表。横轴显示的是所检测的组织和细胞，纵轴显示的是 ILT7的表达水平，其中ILT7的表达水平按照GAPDH的表达水平进行了标准化。

图2是显示ILT7蛋白结构的图表。其中图2(a)显示的是ILT7蛋白的氨基酸序列，并且进一步在图中显示了推定的分泌信号序列以及跨膜区；图2(b)显示了由构建的表达载体所编码的ILT7蛋白的简图。

图3是一张图片，该图片显示了将ILT7表达载体和FcRγ表达载体导入到细胞内、并且利用FCM检测ILT7分子在细胞表面的表达的结果。横轴表示利用抗FLAG抗体检测的荧光强度，即带有FLAG标签ILT7分子在细胞表面的表达强度，同时纵轴表示细胞数目。

图4是一张照片，该照片显示的是利用免疫沉淀和Western印迹方法分析的、在导入了ILT7表达载体和FcRγ表达载体的细胞中的分子结合。左边的图表显示了在利用抗myc抗体对FcRγ分子进行了免疫沉淀之后，利用抗FLAG抗体对ILT7分子进行印迹的结果的图片(上方的图片)、以及利用抗myc抗体对FcRγ分子进行印迹的结果的图片(下方的图片)。相似地，右边的图片显示的是在利用抗FLAG的抗体对FcRγ分子进行免疫沉淀之后，利用抗FLAG抗体(上方的图片)和抗myc抗体(下方的图片)进行印迹的结果的图片。

图5是显示了通过将ILT7表达载体和FcRγ表达载体导入到细胞内、并利用N糖苷酶处理来检测ILT7分子糖基化的照片。左侧的照片显示的是没有利用N糖苷酶处理ILT7时ILT7的大小，右侧的照片显示的是利用N糖苷酶处理ILT7后ILT7的大小。

图6a是利用FCM分析来检测所产生的抗ILT7单克隆抗体的反应性的图片。(a)显示的是抗ILT-7抗体与BDCA-2阳性IPC结合的结果，该结果是利用人外周血淋巴细胞以及利用抗ILT-7抗体和抗BDCA-2抗体进行双染色来分析的。纵轴显示的是与BDCA-2抗体的反应性，横轴显示的是每种制备各种抗ILT7抗体的反应性。

图6b是显示了利用FCM分析检测制备的抗ILT7单克隆抗体的反应性的图片。(b)显示了抗ILT-7抗体与ILT7分子结合能力的检测结果，其中该检测是利用导入了ILT7和FcRγ表达载体的293T细胞进行的。纵轴显示的是抗FLAG抗体的反应性，即带有FLAG标签的ILT7分子的表达强度，横轴显示的是各抗ILT7抗体的反应性。

图7是一张图片，该图片显示了通过FCM分析检测制备的抗ILT7单克隆抗体中的两个克隆对于人外周血淋巴细胞的反应性。左侧的三个图片显示的是#11的结果，右侧的三个图片显示的是#17的结果。在左侧图表中，带有ILT7标记的每个轴表示的是ILT7#11的反应性。相似地，在右侧图表中，带有ILT7标记的每个轴表示的是ILT7#17的反应性。

图8是制备的抗ILT7单克隆抗体ILT7#11和ILT7#17与人淋巴细胞的结合能力的检测结果和与抗BDCA-2抗体的相应结合能力的比较结果。纵轴显示的是抗CD123抗体的反应性，横轴显示的是每种抗体的反应性。就是说，每种抗体结合CD123阳性细胞的一部分。该图显示了当利用CpG和IFNα刺激淋巴细胞时分析反应性得到的结果。

图9a是显示了与ILT7分子具有高同源性的家族分子的氨基酸序列的图片。主要显示每个胞外区的氨基酸序列的比对；图9b是图9a的续图；图9c是图9b的续图。

图10是制备的抗ILT7单克隆抗体ILT7#11、ILT7#17针对ILT1分子、ILT2分子和ILT3分子的反应性的检测结果，该检测是利用导入了该三种分子的表达载体的细胞进行的。上方的图片显示的是对反应性的结果的再确定，该反应性是针对共表达具有FLAG标记的ILT7分子和FcRγ的细胞的。下方的图片显示的是针对导入了ILT1、ILT2、ILT3以及FcRγ的细胞的反应性的结果(左侧图片：ILT7#11，右侧图片：ILT7#17)。横轴显示的是每种抗ILT-7抗体的反应性。

图11是显示了制备的抗ILT7单克隆抗体ILT7#11和ILT7#17对于人淋巴细胞的干扰素产生活性的作用的图片。在该图片中，横轴显示的是当利用流感病毒刺激人淋巴细胞时培养上清中IFNα的浓度，纵轴显示的是处理的抗体。术语“无感染”是指没有用流感病毒刺激的细胞的结果。

图12是显示了制备的抗ILT7单克隆抗体ILT7#37，ILT7#28和ILT7#33的CDC活性的图片。使用从任何杂交瘤中获得的抗ILT7单克隆抗体，当抗体浓度为0.1μg/毫升或更高时，均显示了80％或更高的CDC活性。在除了抗ILT7单克隆抗体之外的抗体的例子中，没有观察到针对目标细胞的CDC活性。

图13是显示了制备的抗ILT7单克隆抗体ILT7#17、ILT7#26、ILT7#37、ILT7#28和ILT7#33在目标细胞中的内化(internalization)的图片。APC的荧光强度是在孵育之前出现在细胞表面的ILT7-抗ILT-7抗体免疫复合物的量的指示剂，并且无论ILT7-抗ILT-7抗体免疫复合物是在目标细胞表面还是在孵育之后整合到细胞里都可以检测到该复合物。另一方面，FITC的荧光强度是在孵育之后仍然存在于细胞表面的ILT7-抗ILT-7抗体免疫复合物的量的指示剂。就是说，内化会降低FITC的荧光强度。

发明的具体实施方式

已经有报道人ILT7(免疫球蛋白样转录本7)是在类浆树突细胞中特异表达的分子(Gene.2004 Apr 28；331：159-64.；WO03/12061)。或者，已知可以使用人ILT7作为预测淋巴瘤的预测指示剂(WO2005/24043)。然而，还没有找到制备能够识别人ILT7的抗体的方法。

人ILT7由在SEQ ID NO：2中显示的499个氨基酸残基构成，并且该蛋白是在结构上具有4个免疫球蛋白样结构域和一个跨膜区(445-466；在SEQ ID NO：2中显示的从429到450)的1型跨膜蛋白。在包括N末端的444个氨基酸残基中，16个氨基酸残基(在SEQ ID NO：2中显示的从-15到-1)构成信号序列，从17位到444位氨基酸残基(在SEQ ID NO：2中显示的从1到428)构成的胞外域。另一方面，C末端区是胞内区。人ILT7的大部分是胞外域，由33个氨基酸残基组成胞内结构域(从467到499；在SEQ IDNO：2中显示的从451到483)。目前还没有预测与信号作用相关的基序出现在胞内域中。人ILT7的全长氨基酸序列在SEQ ID NO：2中显示，并且编码该氨基酸序列的cDNA碱基序列在SEQ ID NO：1中显示。此处，如SEQ ID NO：1中显示的成熟肽的编码区(72)..(1520)不包含终止和起始密码子(終始コドン)。就是说，在SEQ ID NO：1中的包含终止和起始密码子的蛋白编码序列是从24到1523。

可以认为配体信号是通过人ILT7与信号转导分子的结合传导到细胞的。例如，大部分Fc受体的γ链存在于细胞中。另外，胞内域含有参与信号作用的免疫受体的以酪氨酸为基础的激活基序(ITAM)。ITAM是氨基酸序列部分，该氨基酸序列部分在与诸如Fc受体这样的免疫受体相关的转接子分子中常见。诸如YxxL(SEQ ID NO：76)这样的络氨酸磷酸化靶点的基序是包含在ITAM中的并且该信号是通过磷酸化传导的。已知的在胞内域含有ITAM的信号转导分子的例子除了Fc受体的γ链还包括CD3ζ和DAP12。目前还没有找到能够结合人ILT7的配体。

本发明的发明者通过基因表达分析确认了ILT7在人IPC的特异表达。本发明的发明者认为如果可以获得能够在免疫学上从其他的免疫分子中区分人ILT7的抗体，那么可以将该抗体用于针对IPC的研究中。然而，包括ILT7在内在ILT家族中存在很多分子具有相似的结构。诸如ILT1，ILT2，ILT3，ILT4，ILT5，ILT6或LIR-8这样的分子含有高同源性的氨基酸序列，特别是在其胞外域中。因此，本发明的发明者认为利用含有组成胞外域的部分氨基酸序列作为免疫原很难获得能够区分这些分子的抗体。于是，本发明的发明者利用表达人ILT7的细胞作为免疫原来设法制备了针对人ILT7的抗体。

然而，使用常规的表达载体不能够导致人ILT7的cDNA在动物细胞中的表达。已经有报道具有与ILT7非常相似的结构的ILT1分子与Fc受体的γ链相关。就是说，当将诸如RBL(大鼠噬碱细胞性白血病)细胞和P815(小鼠肥大细胞瘤)细胞这样的表达Fc受体的γ链的细胞作为宿主细胞时，可以观察到ILT1在细胞表面的表达。然而，如果强迫ILT1在293这样原本不表达Fc受体的γ链的细胞中表达，那么不能观察到该蛋白在细胞表面的表达。另一方面，研究表明当ILT1与Fc受体的γ链共表达时可以确认ILT1在细胞表面的表达(Nakajima H.et al.，J.Immunology 162：5-8.1999)。然而，还没有用于制备ILT7抗体的免疫原的信息。

例如，在该报道中，将导入了ILT1基因的RBL细胞作为免疫原来制备ILT1抗体。本发明的发明者设法利用与上述相同的方式使用导入了ILT7基因的RBL细胞制备了ILT7抗体。然而，即使ILT7被迫在RBL细胞(P815)中表达，也没有观察到ILT7在细胞表面的表达，因此不能将该细胞用作抗原。

本发明的发明者为了获得能够识别人ILT7的抗体进行了专门的研究。因此，本发明的发明者发现了可以使用指定的转化细胞作为免疫原来制备所需抗体，并完成了本发明。就是说，本发明涉及能结合人ILT7胞外域的单克隆抗体，并且涉及含有其抗原结合区的片段。

在本发明中，将人ILT7定义为：在人IPC中表达的天然分子或者在免疫学上与人IPC中表达的ILT7等价的分子。在本发明中，可以通过例如以下方法确认抗体与人ILT7的结合。

-基于与人细胞的反应性的确认：

根据本发明的发明者的发现，在人IPC中观察到了人ILT7的特异表达。最初，是将人ILT7作为在类浆树突细胞中观察到有表达的基因而分离的(Blood.2002 100；3295-3303，Gene.2004 Apr 28；331：159-64.)。另外，还已知可以将其用作类浆树突细胞的标记(WO03/12061)。假设类浆树突细胞和IPC是基本相同的细胞种群或者其大部分是相同的。因此在这些报道与本发明的发明者的发现之间没有矛盾。

考虑到人ILT7这样的表达谱，首先，本发明中能够结合人ILT的抗体的一个重要性质是与IPC或者类浆树突细胞的，至少部分亚类(サブセツト)的结合活性。可以使用各个细胞种群的特异的细胞表面标记来确定某细胞是IPC还是类浆树突细胞。例如，可以通过利用能结合细胞表面标记的抗体和需要检测结合活性的抗体进行的双染色来确认该待测抗体与目标细胞的结合。就是说，本发明中的IPC包含例如表达BDCA2的细胞。

-基于与表达人ILT7基因的转化细胞的反应性的确认：

本发明的发明者发现当人ILT7基因的表达是在一定条件下进行的时候，可以重构在人IPC中表达的ILT7的免疫学性质。因此，也可以基于抗体针对人为导入了编码ILT7的基因的细胞的反应性来确认针对人ILT7的反应性。也就是，本发明涉及单克隆抗体或者含有该抗体的抗原结合区的片段，其中该抗体含有具有胞外域的氨基酸序列并且能够结合与信号转导分子共表达的分子。此处，该胞外域包括与在SEQ ID NO：2中显示的氨基酸序列的N末端第17到第444位(在SEQ ID NO：2中从1到428)相应的氨基酸序列。

例如，表达在人IPC中的ILT7的免疫学性质可以在共转染了两种载体的细胞中维持，其中该两种载体分别为含有编码人ILT7的DNA的表达载体和含有编码信号转导分子的DNA的表达载体。因此，在本发明中，优选将共表达人ILT7和信号转导分子的转化细胞用作确认本发明中的抗体与人ILT7胞外域的亲和性的细胞。在本发明中，当利用转化细胞来确认抗体的反应性时，需要利用没有被转化的细胞作为对照。此外，利用只表达信号转导分子的相同宿主细胞作为对照，来确认没有检测到抗体的结合能力也是很重要的。

在本发明中，可以将能够诱导人ILT7在细胞表面表达的分子作为共表达的信号转导分子来使用。本发明中的信号转导分子也可以被定义为：在表达ILT7的细胞中，能够将天然人ILT7的免疫学性质赋予ILT7分子的至少胞外域的分子。此处，天然人ILT7的免疫学性质是指能够被能结合人IPC的抗体所识别。

具体地，优选地使用Fc受体的γ链或者DAP12作为信号转导分子。在本发明中，特别优选Fc受体的γ链作为信号转导分子。Fc受体的γ链是由SEQID NO：16所示的氨基酸序列构成的分子。信号转导分子也可以是片段，只要共表达的人ILT7定位在细胞表面。只要共表达的人ILT7定位在细胞表面，可以在如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列上进行突变或者增加。也就是说，本发明提供制备细胞的方法，该细胞能够制备能结合人ILT7胞外域的单克隆抗体，该方法包括以下步骤：

(1)给免疫动物施用细胞，其中，该细胞外源表达含有人ILT7的胞外域的蛋白和含有如SEQ ID NO：16中所述的氨基酸序列的分子；和

(2)从免疫动物的抗体生成细胞中选择产生能够结合人ILT7的抗体的抗体生成细胞。

随后，作为在本发明中能够结合人ILT7的抗体，优选地使用能与细胞种群交叉反应的抗体，已知在该细胞种群中没有观察到除了ILT7以外的ILT家族其他成员的表达。具体地，作为在本发明中能够结合人ILT7的抗体，优选地使用能与指定细胞种群结合的抗体，其中该细胞种群已知没有观察到除了ILT7以外的ILT家族其他成员的表达，并且该观察是在与确认对于IPC的结合的条件相同的条件下进行的。如已经描述的，例如，ILT2和ILT3不仅在PDC中有表达，而且在从MDDC或者CD34阳性细胞中所获得的DC中也有表达(Gene.2004 Ap 28；331：159-64.)。另一方面，由于IPC分化成树突细胞，所以不能检测到ILT7的表达。因此，在可以确认对于IPC的结合的条件下，不能检测到与从MDDC或者CD34阳性细胞中获得的DC结合的抗体也包括在本发明的能够结合人ILT7的抗体中。

已经报道过下述其他ILT家族分子的表达图式(“The KIR Gene Cluster”Carrington，Mary and Norman，Paul.Bethesda(MD)：National Library ofMedicine(US)，NCBI；2003，Gene.2004 Apr 28；331：159-64.)。因此，能结合人IPC或者PDC、并且不能确认与下述细胞结合的抗体也包括在具有针对ILT7的特异性的抗体中：

ILT1；骨髓系细胞(单核细胞、单核细胞来源DC、巨噬细胞)；

ILT2；PDC、B细胞、CD34阳性细胞、来源于CD34阳性细胞的DC以及来源于单核细胞的DC；

ILT3；PDC和DC；

ILT5；单核细胞，来源于CD34阳性细胞的DC和来源于单核细胞的DC；以及

ILT8；单核细胞系。

就是说，本发明中能够结合人ILT7的胞外域的单克隆抗体优选地包含具有以下免疫学性质的单克隆抗体：

a)结合人IPC的单克隆抗体；

b)该单克隆抗体在与人IPC结合的条件下，能够确认不与从含有单核细胞、巨噬细胞、B细胞、CD34阳性细胞和由这些细胞衍生出的树突细胞的组中选择出来的一种或多种细胞的结合。

特别是，作为本发明的单克隆抗体，优选的是在与人IPC结合的条件下，不能确认与单核细胞、巨噬细胞、B细胞、CD34阳性细胞和由这些细胞衍生出的树突细胞结合的抗体。

或者，在本发明中能够结合人ILT7胞外域的单克隆抗体优选地包括具有以下免疫学性质的单克隆抗体：

c)能够结合共转染了两种表达载体的转化细胞的单克隆抗体，其中这两种表达载体分别为具有编码人ILT7的DNA的表达载体和具有编码信号转导分子的DNA的表达载体；

d)在与c)中所描述的与共转染细胞结合的条件下，可以不能确认与转化之前的宿主细胞结合；或者

本发明的单克隆抗体包括具有以下免疫学性质的单克隆抗体：

e)在与c)中所描述的与共转染细胞结合的条件下，不能确认与仅表达信号转导分子的宿主细胞结合。

在本发明中，可以通过使用被迫表达每种其他ILT家族分子的细胞来确认抗ILT7的单克隆抗体与ILT家族的其他分子没有交叉反应的事实。也就是说，为了强迫表达，将编码每种ILT家族分子的氨基酸序列的cDNA导入到合适的宿主细胞中。向获得的宿主细胞中加入需要验证交叉反应的抗ILT7的单克隆抗体。然后，可以确认如果抗体与细胞的结合，那么该抗体能够从免疫学上将ILT7与其他的ILT家族分子区分开来，其中在该细胞中没有观察到除了ILT7以外的ILT家族分子的表达。例如，在下述的例子中，确认了通过本发明的方法获得的抗ILT7的单克隆抗体与ILT1，ILT2和ILT3没有交叉反应的事实。因此，本发明中的单克隆抗体的优选的应用实例是能够结合ILT7的单克隆抗体，并且在相同条件下不能检测到该单克隆抗体与ILT1，ILT2和ILT3的结合。

具体地ILT2和ILT3是已经证明在IPC中有表达的基因(Ju et al.Gene331，159-164，2004)。然而，根据IPC的分化水平或者一定条件，这些分子各自对于每种细胞可能显示出固有表达谱，其中一定条件是诸如用病毒或者其他细胞因子刺激。使用能够在免疫学上将这些ILT家族分子与ILT7区分开来的抗体，可以特异的测定ILT7表达的变化。

可以基于例如流式细胞技术的原理来确认需要确认结合能力的单克隆抗体对于各种类型细胞的结合。为了基于流式细胞技术的原理来确认抗体的反应性，用可以产生可检测的信号的分子或者原子团来预先标记抗体是很方便的。通常使用荧光或者发光标记。基于流式细胞技术的原理可以使用荧光活化细胞分检器(FACS)来分析荧光标记抗体与细胞的结合。使用FACS可以有效地确认多种抗体与细胞的结合。

具体的，例如以前已经发现能够鉴定IPC的抗体A和需要分析其与IPC结合性质的抗体B与含有IPC的细胞群同时反应。抗体A和抗体B预先标记了能够互相区分这些抗体的荧光信号。在相同的细胞群中检测到两种信号的例子中，可以确认这些抗体与相同的细胞群结合。换言之，抗体A和B具有相同的结合性质。在抗体结合到不同的细胞群的例子中，很明显两种抗体具有不同的结合性质。

本发明中的优选单克隆抗体包含由杂交瘤ILT7#11或ILT7#1 7产生的单克隆抗体。已经于2005年10月21日在独立行政法人国立产业技术综合研究所专利微生物保藏中心保藏了杂交瘤ILT7#11和杂交瘤ILT7#17，保藏号为FERM BP-10704和FERM BP-10705。

具体保藏事项如下：

(a)保藏机构名称和地址

名称：独立行政法人国立产业技术综合研究所专利微生物保藏中心

地址：AIST Tsukuba Central 6，1-1-1，Higashi，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan(zip code 305-8566)

(b)保藏日期：2005年10月21日

(c)保藏号：FERM BP-10704(杂交瘤ILT7#11)

(c)保藏号：FERM BP-10705(杂交瘤ILT7#17)

本发明的单克隆抗体也可以是含有其抗原结合区的片段。例如，可以将酶消化IgG所得的含有其抗原结合区的抗体片段用作本发明中的抗体。具体的，可以通过用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化来获得诸如Fab和F(ab’)₂这样的抗体片段。已经众所周知可以将这些抗体片段用作具有抗原亲合性的抗体分子。或者，也可以使用通过基因重组构建的抗体，只要能够维持良好的抗原结合活性即可。通过基因重组构建的抗体的例子包括嵌合抗体、CDR移植抗体、单链Fv、双体(diabodies)、线性抗体以及由抗体片段形成的多特异性抗体。已经众所周知可以通过使用单克隆抗体或者能够产生该抗体的抗体生成细胞来获得这些抗体。

可以使用一定的转化细胞作为免疫原来获得本发明的单克隆抗体。就是说，本发明涉及制备细胞的方法，其中该细胞产生能结合人ILT7胞外域的单克隆抗体，该方法包括以下步骤：

(1)给免疫动物施用细胞，其中该细胞能表达含有人ILT7胞外域的外源蛋白和与人ILT7结合的外源分子；以及

培养如此获得的抗体生成细胞或者永生化的抗体生成细胞，并且从该培养物中回收所需的单克隆抗体。关于永生化抗体生成细胞的方法，很多方法是已知的。

在制备本发明的单克隆抗体的方法中，可以使用的分子的例子包括细胞膜蛋白，其中所述分子用于制备可以作为免疫原的转化细胞、并能与人ILT7结合。其中，本发明优选的细胞膜蛋白是定位在细胞膜上的信号转导分子。“信号转导分子”是指在细胞膜上与在胞外域具有受体结构的蛋白质结合、将配体结合到受体的刺激转导到细胞内的分子。信号转导分子的例子包括Fc受体γ链，DAP12以及诸如此类的分子。例如，在本发明中优选使用的细胞膜蛋白是Fc受体γ链。人DAP12和Fc受体γ链的氨基酸序列以及编码该氨基酸序列的cDNA碱基序列是广为人知的。人Fc受体γ链的碱基序列以及由该碱基序列编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：15和16所示。

在本发明中，用作免疫原的转化细胞可以通过制备例如具有下述(a)和(b)的细胞来获得：

(a)编码含有人ILT7细胞外域的氨基酸序列的外源多核苷酸；以及

(b)编码Fc受体的γ链的外源多核苷酸。

在本发明中，外源多核苷酸指被人为导入到宿主细胞中的多核苷酸。当使用人细胞作为宿主细胞时，人基因被导入到人细胞中。在该组合中，人为导入的多核苷酸是外源多核苷酸。因此，外源多核苷酸的表达包括人ILT7或人Fc受体γ链的异位表达(異所生の発現)。

此处，“人ILT7的胞外域”指SEQ ID NO：2的氨基酸序列中、相当于其胞外域的第17位到第444位的氨基酸序列(在SEQ ID NO：2中显示的从1到428)。在本发明中，作为含有人ILT7胞外域的氨基酸序列，优选的是例如：，从N末端侧开始按照下述顺序含有各区域的氨基酸序列：

[信号序列+胞外域+跨膜区+胞内区]

或者，本发明中人ILT7胞外域的氨基酸序列也包括如下所述的部分缺失胞内区的氨基酸序列。

[信号序列+胞外域+跨膜区+胞内区的一部分]

此外，本发明中人ILT7胞外域的氨基酸序列也包括如下所述的缺失胞内区的结构。

[信号序列+胞外域+跨膜区]

在上述结构中，除了胞外域以外的区域可以是从SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中选择出来的氨基酸序列，或者可以是与这些区域具有同源性的其他氨基选序列的组合。例如，组成信号序列、跨膜区和胞内区的氨基酸序列可以是除了ILT7以外的ILT家族分子的氨基酸序列。或者，可以是与除了人以外的其它物种的ILT家族的氨基酸序列的组合。此外，组成除了胞外域以外的区域的氨基酸序列中，可以包括在保持每个区域的功能的范围内的突变。或者，可以将其他的区域插入到任意区域之间。例如，可以将诸如FLAG这样的表位标签插入到信号序列和胞外域之间。具体地，在翻译成蛋白质之后、转移到细胞膜表面的过程中会通过加工去掉信号序列。因此，可以将任何诱导翻译后的蛋白通过细胞膜的氨基酸序列用作信号序列。更具体地，优选地将人ILT7的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)作为含有人ILT7胞外域的氨基酸序列来使用。

因此，在本发明中可以将编码含有上述结构[信号序列+胞外域+跨膜区+胞内区]的氨基酸序列的任意碱基序列作为(a)中描述的外源多核苷酸中的多核苷酸使用。例如，SEQ ID NO：2的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1中所述的碱基序列编码的。

在本发明中，为了获得可以用作免疫原的转化细胞，可表达的带有上述的(a)和(b)多核苷酸的表达载体可以被导入到合适的宿主细胞中。可以在一个载体或者不同载体上带有(a)和(b)的多核苷酸。当不同的载体上带有不同的多核苷酸时，利用两种载体共转染宿主细胞。

本发明中，优选的宿主细胞包括哺乳动物细胞。宿主细胞的具体例子包括人、猴子、小鼠或者大鼠来源的细胞。特别优选的宿主细胞是来源于人的细胞。例如，本发明中来源于人的宿主细胞优选使用293T细胞。可以从ATCC CRL-11268获得293T细胞。另外，也可以将来源于免疫动物的细胞用作宿主细胞。当将来源于免疫动物的细胞用作免疫原时，对于宿主细胞的免疫反应很少。因为这样的理由，可以有效地获得针对外源表达的ILT7的胞外域的抗体。因此，例如当将小鼠用作免疫动物时，也可以将来源于小鼠的细胞用作宿主细胞。

可以通过可在宿主细胞中诱导表达的载体将上述多核苷酸导入到细胞内。可以使用可在哺乳动物细胞中诱导表达的市售载体。可以将诸如pCMV-Script(R)载体、pSG5载体(由Stratagene生产)、pcDNA3.1(由Invitrogen生产)这样的表达载体用于本发明。

如果需要，可以将如此获得的转化细胞和诸如佐剂这样的附加成分一起施用于免疫动物。可以使用的佐剂的例子包括弗氏完全佐剂，等等。在使用小鼠作为免疫动物的例子中，可以施用的转化细胞的数目在10⁴到10⁹的范围之内，更具体的是10⁴到10⁶个细胞。通常，多倍剂量给药是每隔一段时间间隔就给药一次免疫原，直到抗体滴度升高。例如，在短期免疫的例子中，每隔2到4天就施用一次转化细胞，更具体的是每隔3天。在施用两或三次后，可以回收抗体生成细胞。或者，可以每周施用一次并且在施用五或六次之后回收抗体生成细胞。

在本发明中，对回收的抗体生成细胞进行克隆化来得到单克隆抗体。为了克隆化，优选将抗体生成细胞永生化。例如，可以使用以杂交瘤法为代表的细胞融合法、或者利用EB病毒(EBV)的转化作为使抗体生成细胞永生化的方法

作为抗体生成细胞，一个细胞可以产生一种抗体。因此，建立来源于一个细胞的细胞种群(即克隆化)，就可以获得单克隆抗体。杂交瘤方法是指使抗体生成细胞与合适的细胞系融合、永生化，再进行克隆化的方法。可以利用诸如有限稀释法这样的技术来克隆化永生化抗体生成细胞。已知有很多的细胞系可以用于杂交瘤方法。这些细胞系在淋巴细胞的永生化方面表现良好，并且具有所需的用于选择融合细胞的多种遗传标记。此外，当需要获得抗体生成细胞时，也可以使用缺乏抗体产生能力的细胞系。

例如，在小鼠或大鼠细胞融合方法中，广泛使用小鼠骨髓瘤P3×63Ag8.653(ATCC CRL-1580)和P3×63Ag8U.1(ATCCCRL-1597)作为细胞系。通常，杂交瘤是通过同种细胞的融合来制备的，然而也可以通过亲缘关系较近的异种的异质杂交瘤来获得单克隆抗体。

细胞融合的具体方案已经广为人知。就是说，将免疫动物的抗体生成细胞与合适的融合伴侣进行混合来进行细胞融合。可用的抗体生成细胞的例子包括脾细胞，从淋巴结收集到的淋巴细胞以及外周血B细胞。作为融合伴侣，可以使用前述的各种细胞系。可以使用聚乙二醇方法和电融合方法来进行细胞融合。

此后，以融合细胞的选择标记为基础，选择成功融合的细胞。例如，当使用HAT敏感细胞系进行细胞融合时，选择在HAT培养基中生长的细胞作为成功融合的细胞。此外，已经确认了由选择出来的细胞产生的抗体具有所需的反应性。

基于抗体反应性对每一种杂交瘤进行筛选。就是说，可以通过上述的方法来选择能够结合人ILT7的杂交瘤产生的抗体。优选地，先对选择出来的杂交瘤进行亚克隆然后对所需抗体进行最终的确认，将经过确认的抗体选择出来作为本发明的杂交瘤产生的单克隆抗体。

具体的，可以基于针对人细胞的反应性或者针对表达人ILT7基因的转化细胞的反应性来选择所需的杂交瘤。可以基于免疫分析的原理来检测能够结合细胞的抗体。例如，可以使用将细胞作为抗原进行的ELISA来检测所需抗体。具体的，向固定有作为免疫原的或转化细胞的支撑物中加入杂交瘤的培养上清。在该例子中培养上清液中含有所需抗体，固定在支撑物上的细胞会募集抗体。然后，从培养上清中分离固定相，如果需要，对其进行清洗。其后，可以检测募集在固定相上的抗体。可以使用能够识别抗体的抗体来检测抗体。例如，可以通过抗小鼠免疫球蛋白抗体来检测小鼠抗体。如果标记了能够识别抗体的抗体，那么可以很容易进行这种检测。可用的标记的例子包括酶，荧光染料，发光染料以及诸如此类的。

另一方面，可以使用微粒和微孔板的内壁作为固定细胞的支撑物。可以通过物理吸附作用将细胞固定在由塑料制成的微粒或者容器的表面。固定细胞可用的支撑物的例子包括聚苯乙烯制成的珠子和反应器。

在杂交瘤的选择中，有时可以预测：产生了针对用作免疫原的转化细胞的宿主细胞的、而不是针对ILT7的抗体。例如，在实施例中展示的，在以人细胞为免疫原并且以小鼠作为免疫动物的例子中，可以预计人细胞是作为外源物质被识别从而产生了与之结合的抗体。在本发明中，希望获得能够识别人ILT7的抗体。因此，没有必要获得能够识别除了人ILT7以外其他人细胞抗原的抗体。在筛选中，为了去除能够产生这样的抗体的杂交瘤，可以在确认抗体反应性之前对非所需的抗体进行吸收。

可以通过与推测存在的抗体结合的抗原来吸收非所需抗体。具体的，例如，可以通过不能检测到人ILT7表达的细胞来吸收能够识别除了人ILT7以外其他人细胞抗原的抗体。在本发明中，优选地使用作为免疫原的宿主细胞来作为吸收非所需抗体的抗原。或者，可以使用不表达人ILT7的胞外域而表达与ILT7结合的分子的宿主细胞作为吸收抗体的抗原。

作为已经确认了其与抗原结合活性的单克隆抗体，如果需要，可以确认其对于IPC活性的实际影响。可以通过诸如以下所述的方法来确认其对于IPC的影响。

作为本发明的单克隆抗体，培养产生单克隆抗体的杂交瘤并且从得到的培养物中回收本发明的单克隆抗体。可以在体内或体外培养该杂交瘤。在体外的例子中，可以通过诸如RPMI1640此类的已知培养基来培养该杂交瘤。该杂交瘤分泌的免疫球蛋白会在培养物上清中累积。因此，如果需要，可以通过收集并且纯化培养物上清来获得本发明的单克隆抗体。不在培养基中加入血清，会使对于免疫球蛋白的纯化更容易。然而，出于使该杂交瘤快速扩增以及增加抗体产量的目的，可以在培养基中添加10％的胎牛血清。

也可以在体内培养该杂交瘤。具体的，可以通过将该杂交瘤接种到裸鼠的腹腔内的方法来实现腹膜内培养。单克隆抗体会在腹水内累积。因此，如果按照需要来获得并纯化腹水就可以制备所需的单克隆抗体。依照预期的用途可以对获得的单克隆抗体进行合适的修饰或处理。

可以通过从杂交瘤中获得编码抗体的抗原结合区的cDNA并将其插入到合适的表达载体中来表达本发明的单克隆抗体。获得编码抗体可变区的cDNA并在合适的宿主细胞中表达该cDNA的技术是已知的。另外，通过将含有抗原结合区的可变区与恒定区连接起来以便获得嵌合抗体的方法也是已知的。

发明中优选的单克隆抗体包括由杂交瘤#11(保藏号：FERM BP-10704)、杂交瘤#17(保藏号：FERM BP-10705)或杂交瘤#37所产生的单克隆抗体。组成这些单克隆抗体的可变区的氨基酸序列以及编码该氨基酸序列的cDNA碱基序列如下所示。因此，例如，本发明中优选的是通过将这些可变区与其他免疫球蛋白的恒定区连接起来形成的嵌合抗体。在序列列表中描述的氨基酸序列中，从第1位到C末端的氨基酸序列组成了成熟的蛋白。就是说，对于每种氨基酸序列来说从第1位到C末端的连续的氨基酸序列是每种氨基酸序列的成熟序列。另一方面，由从N末端到-1的数值表示的氨基酸序列是信号序列。

重链可变区轻链可变区

#11 SEQ ID NO：38 SEQ ID NO：40

(碱基序列) (碱基序列)

SEQ ID NO：39 SEQ ID NO：41

(氨基酸序列) (氨基酸序列)

#17 SEQ ID NO：42 SEQ ID NO：44

(碱基序列) (碱基序列)

SEQ ID NO：43 SEQ ID NO：45

(氨基酸序列) (氨基酸序列)

#3 SEQ ID NO：46 SEQ ID NO：48

7 (碱基序列) (碱基序列)

SEQ ID NO：47 SEQ ID NO：49

(氨基酸序列) (氨基酸序列)

例如，通过将这些可变区基因分别地连接到人IgG1重链恒定区和人Igк轻链恒定区来制备小鼠(可变区)-人(恒定区)嵌合抗体。这样嵌合抗体的氨基酸序列和编码该抗体的碱基序列分别如下所述。用这些序列表示的嵌合抗体显示了本发明的抗ILT7单克隆抗体的构建物的优选实施方案。在以下嵌合抗体的氨基酸序列中，从N末端到-1的氨基酸序列对应信号序列，并且从1到C末端的氨基酸序列对应成熟蛋白。就是说，含有重链和轻链的嵌合抗体在本发明中是优选的，其中该嵌合抗体含有每种氨基酸序列的从1到C末端的氨基酸序列。

重链轻链

#1 SEQ ID NO：50 SEQ ID NO：52

1 (碱基序列) (碱基序列)

SEQ ID NO：51 SEQ ID NO：53

(氨基酸序列) (氨基酸序列)

#1 SEQ ID NO：54 SEQ ID NO：56

7 (碱基序列) (碱基序列)

SEQ ID NO：55 SEQ ID NO：57

(氨基酸序列) (氨基酸序列)

此外，也可以将单克隆抗体的抗原结合活性移植到其他的免疫球蛋白上。免疫球蛋白的可变区含有互补性决定区(CDR)和框架区。每种免疫球蛋白抗原结合性是由CDR决定的，并且框架维持了抗原结合区的结构。CDR的氨基酸序列具有极其丰富的多样性，然而框架部分的氨基酸序列是高度保守的。已知通过将组成CDR的氨基酸序列整合到其他免疫球蛋白分子的框架区的方法可以对抗原结合活性进行移植。已经确立了通过这样的过程将不同免疫球蛋白的抗原结合性移植到人免疫球蛋白的方法。本发明中，“抗原结合区”可以包含被移植到框架区的CDR。因此，指定单克隆抗体的“包含抗原结合区的片段”包括含有可变区的人免疫球蛋白的片段，其中该单克隆抗体的CDR被移植到该可变区上。例如，上述的可变区的氨基酸序列分别含有以下的氨基酸序列(SEQ ID NO)作为CDR。

CDR1 CDR2 CDR3

#11重链 SDYAWN(58) YISYSGSTSYNPSLKSR(59) SPPYYAMDY(60)

#11轻链 KASQDVGTAVA(61) WASTRHT(62) QQYSSYPLT(63)

#17重链 SYWIH(64) RIYPGTGSTYYNEKFKG(65) YPTYDWYFDV(66)

#17轻链 RASQSISNYLH(67) YASQSIS(68) QQSNSWPLT(69)

#37重链 SDYAWN(70) YISYSGSTSYNPSLKSR(71) ALPLPWFAY(72)

#37轻链 KASQDVGTAVA(73) WASTRHT(74) QQYSSYPYT(75)

基于编码上述氨基酸序列的碱基序列以及编码人免疫球蛋白的框架(FR)的碱基序列的信息，可以设计引物并且可以扩增cDNA，其中该cDNA的碱基序列是通过将该两种碱基序列连接起来形成的。对于每种框架的操作是重复的，并且可以构建将小鼠的CDR1、CDR2和CDR3连接到人FR上所形成的可变区。此外，当将编码人免疫球蛋白的恒定区的碱基序列按照需要连接起来的时候，可以获得具有该恒定区的人化抗体。

作为含有上述可变区的嵌合抗体或者移植了由CDR组成的可变区的人化抗体，本发明的抗体优选地含有具有来源于IgG或IgM的恒定区的抗体。本发明的发明者确认了针对ILT7的单克隆抗体显示了针对ILT7表达细胞的CDC作用。因此，具有来源于IgG或IgM的恒定区的抗体由于其CDC作用显示出针对ILT7表达细胞的细胞毒性。可以使用这样的抗体来抑制诸如IPC这样的ILT7表达细胞的数目。

可以通过使用编码能够识别ILT7的嵌合抗体或者人化抗体的多核苷酸、并利用基因工程来制备本发明所提供的能够识别ILT7的嵌合抗体或者人化抗体。例如，可以将以下SEQ ID NO所述的碱基序列的多核苷酸和编码氨基酸序列的多核苷酸作为编码可变区#11或#17的多核苷酸来使用，其中该氨基酸序列是组成每种氨基酸序列的成熟蛋白的。对于每一种氨基酸序列的从1到C末端的连续的氨基酸序列对应一种成熟蛋白。在每种成熟蛋白作为分离蛋白表达的例子中，优选的是将分泌信号置于每种氨基酸序列的N末端。例如，当这样的蛋白在动物细胞表达时，在这些SEQ ID NO所显示的氨基酸序列中可以将从N末端到-1的氨基酸序列作为信号序列来使用。或者，通过使用能够保证免疫球蛋白分泌的任意信号序列，这些可变区可以作为成熟蛋白被分泌。

#11 SEQ ID NO：50(碱基序列) SEQ ID NO：52(碱基序列)

#17 SEQ ID NO：54(碱基序列) SEQ ID NO：56(碱基序列)

在如上所述的相同的方法中，对于编码人化抗体的多核苷酸，可以通过使用编码具有信号序列的蛋白的碱基序列来制备表达人化抗体的多核苷酸，其中该信号序列是被加到蛋白的N末端的。当重链和轻链是由不同的载体携带的时候，将两种载体共转染到相同的宿主细胞中。用由每种载体表达的重链和轻链来构建具有两条链的免疫球蛋白。或者也可以在同一载体上带有编码重链的多核苷酸和编码轻链的多核苷酸。转化了带有两种多核苷酸的载体的宿主细胞可以表达重链和轻链并且可以制备具有两种链的免疫球蛋白。

使用能够表达抗体基因的宿主载体系统，可以将这些多核苷酸表达为抗体。此外，在通过将重链可变区和轻链可变区连接起来的方法将其表达为单一蛋白分子的例子中，可以将信号序列置于蛋白分子的N末端。这样的抗体分子的已知的例子包括scFv分子，在该scFv分子中通过连接子将重链可变区与轻链可变区连接起来。

本发明的单克隆抗体包含每种如此制备的单克隆抗体。换言之，本发明中的单克隆抗体包括由免疫球蛋白组成的单克隆抗体，该免疫球蛋白含有由多核苷酸所编码的抗原结合区，该多核苷酸是由编码上诉单克隆抗体的抗原结合区的cDNA衍生来的。

如前所述，可以使用ILT1基因强制表达的RBL细胞作为获得ILT1抗体的免疫原。然而，不能够确认ILT7在RBL细胞(P815)表面的表达，因此不能将其作为免疫原。本发明的发明者发现了可以通过将人ILT7与其他与人ILT7结合的细胞膜蛋白共表达来诱导人ILT7在细胞表面的表达。于是，本发明的发明者发现了可以通过利用转化细胞作为免疫原来获得能结合人IPC的抗体并完成了本发明，其中该转化细胞的表达是通过上述方法诱导的。

就是说，本发明提供能够用于制备能结合人ILT7胞外域的抗体的免疫原，并且包含动物细胞或其细胞膜成分，在该动物细胞中携带以下的多核苷酸用于外源表达，其中该多核苷酸包括(a)编码含有人ILT7的胞外域的氨基酸序列的多核苷酸；以及(b)编码Fc受体的γ链的多核苷酸。

自从1998发现了人ILT7的结构以来已经过了六年或者更长的时间了。然而，仍然没有获得能够特异地识别ILT7的抗体。通过使用本发明的免疫原首次提供了能够识别人ILT7的抗体。就是说，本发明提供了能够识别人ILT7的抗体，该抗体是通过以下的步骤获得的：

(1)对免疫动物施用细胞，该细胞能够外源表达含有人ILT7胞外域的蛋白和与人ILT7结合的分子；

(2)从免疫动物的抗体生成细胞中选择能够产生能够结合人ILT7的抗体的抗体生成细胞；并且

(3)培养步骤(2)中选择出来的抗体生成细胞，并且从培养物中回收能够识别人ILT7的抗体。

已经发现人ILT7在人IPC中有特异性的表达。本发明的发明者利用SAGE对基因表达进行了分析，也确认了人ILT7在人IPC中的特异表达。然而，在以前的报道中，基于mRNA对两个例子中的ILT7的表达水平进行了分析。由于不能提供能够检测人ILT7的抗体，所以没有按照惯例来分析蛋白的表达状态。通过提供本发明的能结合人ILT7胞外域的抗体实现了对于人ILT7蛋白的分析。

本发明的发明者实际上确认了能够结合到基于本发明的人ILT7的胞外域的单克隆抗体能够特异的检测人IPC。就是说，本发明涉及检测干扰素生成细胞的方法，该方法包括以下步骤：向受试细胞中加入能结合人ILT7胞外域的单克隆抗体或者含有其抗原结合区的片段；并且检测结合到细胞上的单克隆抗体或者含有其抗原结合区的片段。

通过对于基于本发明的人ILT7的检测可以确定特定细胞是否是IPC。就是说，本发明提供了利用人ILT7作为指示剂来鉴定IPC的方法。或者，通过分离检测到人ILT7的细胞可以分离人IPC，其中检测人ILT7的方法是基于本发明的。就是说，本发明提供了利用人ILT7作为指示剂来分离IPC的方法。

基于通过人ILT7抗体进行的分析，确认了ILT7在IPC中的表达水平降低了，其中该IPC的分化是由CpG诱导的。就是说，通过利用ILT7作为指示剂可以特异的检测在其分化被诱导之前的IPC。换言之，本发明的单克隆抗体可以特别的用于在IPC分化成树突细胞之前检测该细胞。可以将此处所使用的术语“分化之前的IPC”定义为具有产生干扰素能力的细胞群。

在本发明中，可以预先标记能够结合人ILT7胞外域的单克隆抗体或者含有其抗原结合区域的片段。例如，通过标记发光染料或者荧光染料可以很容易的检测抗体。更具体的，将制备的荧光染料标记的抗体加入到可能含有IPC的细胞群中然后可以通过利用荧光染料作为指示剂来检测本发明的抗体结合的细胞。进一步地，可以通过分离检测到荧光染料的细胞来分离IPC。基于FACS的原理可以很容易的进行一系列的步骤。

或者，可以预先将本发明的抗体结合到诸如磁性颗粒这样的固相支持物上。结合到固定相支持物上的抗体会识别人ILT7然后IPC被捕获到固定相支持物上。因此，可以对IPC进行检测和分离。

基于本发明可以提供对于检测IPC的方法必需的抗体作为检测IPC的试剂。就是说，本发明提供用于检测干扰素生成细胞的试剂，该试剂含有能够结合人ILT7的胞外域的单克隆抗体或含有其抗原结合区的片段。除了将该检测本发明的IPC的试剂用作抗体以外还可以将其与正对照或负对照组合使用。例如，可以将表达人ILT7的胞外域并且被用作免疫原的转化细胞以及从人体内获得的IPC用作正对照。通常，从外周血中只能获得很少的人IPC。因此，特别优选的在本发明的试剂中使用转化细胞作为正对照。另一方面，可以使用任意不能表达人ILT7的细胞作为负对照。

就是说，本发明提供检测人IPC的试剂盒，该试剂盒包括：

(a)能够结合人ILT7胞外域的单克隆抗体或者含有其抗原结合区域的片段；以及

(b)表达外源蛋白和外源分子的细胞，该外源蛋白含有人ILT7的胞外域，该外源分子能与人ILT7结合。

本发明的发明者分析了能结合人ILT7胞外域的抗体对于IPC的作用。因此，可以确认能够结合人ILT7胞外域的抗体抑制IPC的活性。就是说，本发明涉及抑制干扰素生成细胞活性的方法，该方法包括向干扰素生成细胞中加入以下任意成分的步骤：

(a)能够结合人ILT7并且抑制干扰素生成细胞活性的单克隆抗体、或者含有其抗原结合区的片段；以及

(b)移植了(a)所述的单克隆抗体的互补性决定区的免疫球蛋白、或者其含有抗原结合区的片段。

或者，本发明涉及抑制活体组织中的干扰素生成细胞活性的方法，该方法包括向活体组织中加入以下任意成分的步骤：

(a)能够结合人ILT7并且抑制干扰素生成细胞活性的单克隆抗体、或者其含有抗原结合区的片段；

(b)含有移植了(a)所述的单克隆抗体的互补性决定区的免疫球蛋白、或者其含有抗原结合区的片段；以及

(c)编码(a)或(b)所述成分的多核苷酸。

此处，“干扰素生成细胞(Interferon Producing cell，IPC)”是指具有产生IFN能力的、并且在细胞表面表达ILT7的细胞。在下文中，除非特别提及，“IPC”不仅包括树突细胞的前体细胞还包括具有产生IFN并且在细胞表面表达ILT7的能力的细胞。鉴定此类IPC的方法已经广为人知。可以利用一些细胞表面标记作为指示剂来区分IPC和其他血细胞。具体的，人IPC的细胞表面标记物谱如下所述(Shortman，K.and Liu，YJ.Nature Reviews 2：151-161，2002)。近年来，特定的报道建议将BDCA-2阳性的细胞定义为IPC(Dzionek，A.et al.J.Immunol.165：6037-6046，2000.)。

[人IPC细胞表面抗原谱]

CD4阳性，CD123阳性，

谱系(CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56)阴性以及CD11c阴性

因此，也可以说IPC是具有这些已知标记的表达谱并且具有产生IFN能力的细胞。此外，甚至即使细胞是一群具有这些已知标记的表达图式不同的表达谱的细胞，只要活体组织中的细胞具有产生IFN能力，该细胞就也包括在IPC中。此外，人IPC的共同特征如下：

[细胞的形态特征]

-与浆细胞相似

-具有平滑细胞表面的圆细胞

-核相对大

[细胞的功能特征]

-在病毒感染的过程中，在短时间内会产生大量的1型干扰素。

-在病毒感染之后分化成树突细胞。

“抑制IPC的活性”是指对于至少一项IPC功能的抑制。IPC的功能的例子包括产生IFN以及细胞存活。也可以将细胞存活说成是细胞数目。因此，在抑制这两个功能中的一项或者两项的例子中，可以说抑制了IPC的活性。已经发现由IPC产生的1型IFN能够导致多种疾病。因此，对IPC的数目和IFN的产生的抑制可以用于这些疾病的内科治疗方法。

例如，已经指出了多种自身免疫病的病理状态与IFNα之间的关系。大部分IFNα是由IPC产生的。因此，可以通过抑制IFNα的产生来缓解由IFNα导致的病理状态。此处，“抑制由IPC产生的IFN”是指抑制至少一种IPC产生的IFN的产生。本发明中优选的IFN是1型IFN。其中IFNα是重要的。

就是说，本发明涉及抑制IFN产生的抑制剂，该抑制剂包括作为活性成分的能够结合ILT7胞外域的抗体。或者，本发明提供能够抑制IFN的产生的方法，该方法包括给药能够结合ILT7胞外域的抗体的步骤。此外，本发明涉及能够结合ILT7胞外域的抗体在生产用于抑制IFN产生的药用成分的用途。

在IPC之中包含以少量细胞产生大量的IFN的细胞。例如，通过病毒或诸如此类的条件来刺激树突细胞的前体细胞，该细胞会产生活体中所产生的大部分IFN中。对于能够产生很多IFN的IPC的数目的抑制能够抑制IFN的产生。因此，通过抑制IPC的数目可以减轻由IFNα所引起的病理状态。已经确认了在本发明优选的实施方案中，抗ILT7的单克隆抗体会结合到ILT7表达细胞上，然后通过互补依赖细胞毒性(CDC)发挥了细胞毒性的作用。CDC作用是抗体药物的一种重要的机理。由于本发明的抗ILT7的单克隆抗体的CDC作用，该抗体也具有针对诸如IPC此类的ILT7表达细胞的潜在细胞毒性。就是说，对于抗ILT7的单克隆抗体，除了在优选的实施方案中的对于IFN产生的抑制的机理以外，可以预期通过针对IPC的细胞毒性来获得对于IFN的产生的抑制作用。

可以通过基于前述的方法来获得本发明所使用的能够识别人ILT7的胞外域的抗体。本发明中的抗体可以是任意级别的。抗体来源的物种也没有特殊限制。此外，可以将含有抗体的抗原结合区的片段用作抗体。例如，可以将通过酶解IgG所获得的含有其抗原结合区的抗体片段用作本发明中的抗体。具体的，可以通过利用木瓜蛋白酶或者胃蛋白酶来进行酶解以获得诸如Fab和F(ab’)₂这样的抗体片段。已经广为人知可以将这些抗体片段用作具有抗体亲和力的抗体分子。或者，只要能够维持良好的抗原结合活性，也可以使用通过遗传重组技术构建的抗体。通过遗传重组构建的抗体的例子包括嵌合抗体、CDR移植抗体单链Fv、双体、线性抗体以及由抗体片段组成的多特异性抗体。已知通过利用单克隆抗体可以获得这些抗体。

在本发明中，如果需要可以对抗体进行修饰。按照本发明，能够识别人ILT7的胞外域的抗体具有对IPC的活性的抑制作用。就是说，可以预期抗体本身具有针对IPC的细胞毒性。展示了潜在的效应子活性的抗体的亚类是已知的。或者，通过使用细胞毒试剂来修饰抗体可以进一步的增强其对IPC活性的抑制效果。细胞毒试剂的例子如下所述。

毒素：假单胞菌内毒素(PE)、白喉毒素、蓖麻毒素

放射性同位素：Tc^99m、Sr⁸⁹、I¹³¹、Y⁹⁰

抗肿瘤试剂：加利刹霉素，丝裂霉素，紫杉醇

可以通过双功能试剂将由蛋白组成的毒素连接到抗体或其片段上。或者，将编码毒素的基因连接到编码抗体的基因上，也可以获得两条基因的融合蛋白。将抗体与同位素连接起来的方法也是已知的。例如，利用螯化试剂将放射性同位素标记到抗体上的方法是已知的。此外，可以利用糖链或者双功能试剂将抗肿瘤试剂连接到抗体上。

本发明的发明者已经确认了一种现象，该现象是结合到表达在细胞表面的ILT7上的单克隆抗体会在结合之后整合到细胞之内(内化作用)。因此，可以通过向ILT7表达细胞中加入连接了本发明的细胞毒试剂的抗体来把该细胞毒试剂转运到细胞内。就是说，本发明提供了ILT7表达细胞的活性抑制剂，该抑制剂包括连接了作为活性成分的细胞毒试剂的抗ILT7的单克隆抗体。或者，本发明涉及抗ILT7的单克隆抗体在生产ILT7表达细胞的活性抑制剂中的用途，该抗体上连接了细胞毒试剂。此外，本发明提供抑制ILT7表达细胞活性的方法，该方法包括给药连接了细胞毒试剂的抗ILT7的单克隆抗体的步骤。

在本发明中，也可以将人为改变过结构的抗体作为活性成分来使用。例如，为了提高抗体的细胞毒性和稳定性而对其进行修饰的方法是已知的。具体的，对其重链的糖链进行了修饰的免疫球蛋白是已知的(Shinkawa，T.etal.J.Biol.Chem.278：3466-3473.2003.)。通过修饰糖链增强了免疫球蛋白的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)的活性。或者，修饰了Fc区的氨基酸序列的免疫球蛋白也是已知的。就是说，通过人为增加免疫球蛋白对于Fc受体的结合活性增强了ADCC的活性(Shield，RL.et al.J.Biol.Chem.276；6591-6604，2001.)。

已经发现这种现象：结合到Fc受体的IgG会立即整合到细胞内。然后IgG结合到表达在内涵体内的Fc受体上，并且会被再次释放到血液中。具有针对Fc受体高结合活性的IgG在整合到细胞内之后，具有更多的机会被释放到血液中。因此，延长了IgG在血液中的维持时间(Hinton，PR.et al.JBiol Chem.279：6213-6216.2004)。除此之外，有报道称对于Fc区氨基酸序列的修饰可以引起互补依赖的细胞毒性(CDC)的活性的改变。可以将这些改良的抗体作为本发明中的抗体使用。

向IPC中加入能够结合人ILT7胞外域的抗体，可以抑制IPC的活性。因此，可以将这些抗体用作抑制IPC的活性的抑制剂或者用于抑制IPC的活性的方法。就是说，本发明提供了IPC的活性抑制剂，该抑制剂包括从由(a)到(c)组成的组中选择出来的至少一种成分，该成分是作为活性成分使用的。或者，本发明涉及抑制IPC的活性的方法，该方法包括给药从由以下的(a)到(c)组成的组中选择出来的至少一种成分的步骤。此外，本发明涉及从由以下的(a)到(c)组成的组中选择出来的至少一种成分的用于制备IPC活性抑制剂的用途：

(a)能够结合人ILT7的单克隆抗体、或者含有其抗原结合区的片段；

(b)移植了(a)中描述的抗体的互补性决定区的免疫球蛋白、或其含有抗原结合区的片段；以及

(c)编码(a)或(b)描述的成分的多核苷酸。

在本发明中，可以将能够识别人ILT7的胞外域的单克隆抗体用作能够抑制IPC活性的单克隆抗体。在本发明中，可以使用一种或多种单克隆抗体。例如，在本发明中可以混合使用一种或多种能够识别人ILT7的胞外域的单克隆抗体。

可以通过下述的方法确认抗体对IPC的IFN产生活性的抑制作用。用病毒刺激IPC会产生大量的IFN。在利用病毒刺激IPC之前，之后或者同时，向IPC中加入抗体。将得到的每种IPC的产生IFN的能力与相应的没有加入抗体的每种对照的能力进行比较。通过测定IPC的培养上清中含有的IFNα或IFNβ来评估生成IFN的能力。作为比较的结果，当加入了抗体的组的上清中的IFN的量明显降低的时候可以确认所测试的抗体具有抑制IFN生成能力的作用。测定IFN的方法是已知的。在活体中IPC生成大多数IFN。因此，可以通过抑制IPC的生成IFN的能力来调节活体中的IFN的生成状态。

在本发明中，IPC的活性包括维持IPC的数目。因此，本发明中对于IPC的活性的抑制包括抑制IPC的数目。当确认了在抗体存在时IPC的数目受到了抑制，可以发现抗体在抑制IPC的活性。当测量IFN的生成时，可以使用来源于相同的动物品种的无活性的免疫球蛋白作为测定抗体活性的比较对照组。可以通过细胞计数来在数量上比较IPC的数目。可以通过FACS或者显微镜来计算细胞的数目。

此外，有报道称由于病毒感染或此类的刺激，IPC可以分化成Th2也被称作树突细胞2(DC2)。如果可以抑制由于病毒刺激IPC所产生的IFN，那么也可以抑制其分化成Th2。因此，可以预期能够抑制IFN的产生的本发明的单克隆抗体，对于多种过敏疾病可能也具有治疗的作用。

当向与获得抗体的组织种类不同的宿主中加入能够识别人ILT7的胞外域的抗体时，需要将抗体加工成不会被宿主识别成外源成分的形态。例如，通过将抗体加工成以下的分子的方法使得免疫球蛋白不会很容易的被识别成外源物质。下述的对免疫球蛋白加工的技术是已知的。含有抗原结合区的片段缺乏恒定区。(Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，thirdedition，Academic Press Limited.1995；Antibody Engineering，A PracticalApproach，IRL PRESS，1996)

-含有单克隆抗体的抗原结合区和宿主的免疫球蛋白的恒定区的嵌合抗体(“Gene Expression Experiment Manual”，Isao Ishida，Tamie Ando，eds.，Kodansha，1994)

-CDR替代抗体，在该抗体中用单克隆抗体的互补决定区(CDR)替换宿主的免疫球蛋白的CDR(“Gene Expression Experiment Manual”，IsaoIshida，Tamie Ando，eds.，Kodansha，1994)

或者，当使用非人动物时，可以通过将人抗体基因整合到作为免疫动物的非人动物中的方法来获得人抗体。例如，已经将具有人抗体基因的转基因小鼠作为免疫动物付诸实际应用来制备人抗体(Ishida et al.，Cloning andStem Cells，4：85-95，2002)。可以通过使用此类动物以及上诉的免疫原来获得能够识别ILT7的人抗体。优选的是对人给药人抗体。

或者，可以通过噬菌体展示方法来获得人免疫球蛋白的可变区基因(McCafferty J.et al.，Nature 348：552-554，1990；Kretzschmar T et.al.，CurrOpin Biotechnol.2002 Dec；13(6)：598-602.)。在噬菌体展示方法中，将编码人免疫球蛋白可变区的基因整合到噬菌体基因中。也可以通过使用多种免疫球蛋白基因作为调整来制备噬菌体库。噬菌体会将可变区作为组成噬菌体的蛋白的融合蛋白来表达。由噬菌体表达在噬菌体表面的可变区保持了与抗原的结合活性。考虑到从噬菌体库中筛选表达了具有所需结合活性的可变区的噬菌体，因此，选择出能够结合抗原或者表达抗原的细胞的噬菌体。此外，如此筛选得到的噬菌体颗粒保持了编码具有所需结合活性的可变区的基因。就是说，在噬菌体展示方法中，可以使用可变区的结合活性作为指示剂来获得编码具有所需结合活性的可变区的基因。

在本发明中的IPC的活性抑制剂中或者抑制IPC的活性的方法中，可以将能够识别人ILT7的胞外域的抗体或者至少含有抗体的抗原结合区域的抗体片段作为蛋白或多核苷酸编码的蛋白进行给药。在多核苷酸的给药中，需要使用载体来表达所需蛋白，在该载体中将编码所需蛋白的多核苷酸置于合适的启动子的调控之下。也可以将增强子和终止子插入到载体中。带有组成免疫球蛋白的重链和轻链的基因以及能够表达免疫球蛋白分子的基因的载体是已知的。

可以通过将能够表达免疫球蛋白的载体导入到细胞中来给药。在对活体组织的给药中，对于可以通过对活体组织给药来感染细胞的载体可以直接给药。先从活体组织中分离出淋巴细胞，然后将载体导入到能够被重新注射回活体组织的淋巴细胞中(回体法)。

在基于本发明IPC的活性抑制剂中或者抑制IPC的活性的方法中，对于活体组织给药单克隆抗体的量来说通常给药免疫球蛋白的范围为每公斤体重0.5mg到100mg，例如，每公斤体重1mg到50mg，优选的是每公斤体重2mg到10mg。对于活体组织给药抗体的间隔可以进行适当的调整，以便在治疗的过程中能够维持活体组织中免疫球蛋白的有效浓度。具体的，例如，给药抗体的间隔可以是1到2周。给药途径是可选的。本领域技术人员可以适当地选择在治疗中有效地给药途径。其具体的例子包括口服给药或者非经肠道给药。抗体可以进行全身给药或者局部给药，例如，通过静脉注射，肌肉注射，腹腔内注射，皮下注射或者此类方法。本发明中非经肠道给药的合适的剂型包括注射液剂，栓剂以及喷剂。当向细胞中加入抗体时，向培养基中加入免疫球蛋白，加入的浓度的范围通常为1μg/毫升，优选的是10μg/毫升，更优选的是50μg/毫升，再进一步优选的是0.5mg/毫升。

在本发明中的IPC的活性抑制剂中或者抑制IPC的活性的方法中，可以通过可选的方法对活体组织进行单克隆抗体的给药。通常，是将单克隆抗体与药学上可接受的支持物进行混合。如果需要，可以将单克隆抗体与诸如稠化剂、稳定剂、防腐剂以及增溶剂此类的添加试剂混合。这样的支持物或者添加试剂的例子包括乳糖、柠檬酸、硬脂酸、硬脂酸镁、蔗糖，淀粉、滑石粉、凝胶、琼脂、植物油以及乙二醇。术语“药学上可接受”是指各个政府的管理机构所认可的或者列在各个国家药典上的或者被用于动物，哺乳动物以及更具体的人的药典所普遍公认的。也可以通过单剂量或多剂量的冻干粉末或者药片的形式提供本发明的IPC的活性抑制剂。此外，可以将冻干粉末或者药片与使用注射用无菌水，生理盐水溶液或者缓冲溶液联合使用以便在给药之前将合成物溶解成所需的浓度。

此外，当以能够表达免疫球蛋白的载体的形式进行单克隆抗体的给药的时候，共转染具有重链和轻链的质粒，每种质粒的给药范围为0.1到10mg，例如，1到5mg每公斤体重。为了将质粒导入到细胞内，所使用的载体的浓度为1到5μg/106细胞。下文中将结合实施例来具体描述本发明。

此处所引用的所有文献其全部内容已以参考方式并入本文。

实施例

实施例1

A.对ILT7表达的分析

A-1)利用SAGE库进行分析

通过SAGE^TM(Serial Analysis of Gene Expression；基因表达连续分析)方法将基因在人单核细胞，IPC以及HSV处理过的IPC中的表达进行比较和分析。分析的方法如下。利用细胞分选仪从人外周血中分离了作为CD14阳性细胞的单核细胞，并且分离了作为BDCA-4阳性细胞的IPC。此外，在存在单纯疱疹病毒(HSV)的情况下将IPC培养了12小时，制备了分化的IPC。利用I-SAGE^TM试剂盒(Invitrogen生产)从各种细胞中获得了RNA，然后制备了SAGE库。利用SAGE分析软件(由Invitrogen生产)分析了获得的大约100,000个标签的碱基序列的数据。其结果，发现了已知基因ILT7(GenBank Acc#NM_012276)，对于该基因，单核细胞/IPC/IPC+HSV的得分是0/16/0，即，该基因显示IPC特异性表达。ILT7是由SEQ ID NO：1中显示的碱基序列所编码的、具有免疫球蛋白样结构域的膜蛋白(图2(a))。已经报道了ILT7的mRNA在IPC中的表达(Blood 100，3295-3303(2002))。

A-2)RT-PCR

更加详细的考察了ILT7在血细胞中的表达。利用细胞分选仪从人外周血中分离了每种细胞。从每种分离的细胞群中分离了RNA，以该RNA为模板合成了cDNA。利用所得的cDNA按照通常的方法进行了定量PCR，并且分析了ILT7的mRNA的表达水平。所使用的PCR条件以及引物的碱基序列如下：

正向引物：5’CTC CAA CCC CTA CCT GCT GTC 3’(SEQ ID NO：3)

反向引物：5’TTC CCA AGG CTC CAC CAC TCT 3’(SEQ ID NO：4)

94℃3分钟，1个循环

[94℃30秒，58℃30秒，72℃1分钟]，25个循环

72℃6分钟，1个循环

当对单核细胞、IPC、HSV刺激过的IPC、CD19阳性细胞(即B细胞)、CD3阳性细胞(即T细胞)、用PMA刺激过的T细胞以及CD56阳性细胞(即NK细胞)进行考察时，发现了ILT7在IPC中的特异表达(图1(a))。

A-3)定量RT-PCR

此外，利用ABI PRISM 7000(由Applied Biosystem生产)进行定量PCR，检测了在其他组织和器官中的表达。作为cDNA模板(cDNAパネル)，使用了BD^TM MTC多组织cDNA模板(MTC multiple tissue cDNA panel；Human I；Cat.No.636742，Human immune；Cat.No.636748，Human blood fractions；Cat.No.636750；均由Becton Dickinson制造)以及与上述2)相同的血细胞来源的cDNA。

所使用的引物的碱基序列如下：

ILT7的正向引物：5’C CT CAA TCC AGC ACA AAA GAA GT 3’(SEQID NO：5)

ILT7的反向引物：5’CGG ATG AGA TTC TCC ACT GTG TAA 3’(SEQID NO：6)

GAPDH的正向引物：5’CCA CCC ATG GCA AAT TCC 3’(SEQ ID NO：7)

GAPDH的反向引物：5’TGG GAT TTC CAT TGA TGA CAA G 3’(SEQID NO：8)

利用ABI PRISM 7000(由Applied Biosystem生产)和SYBR green PCR预混合试剂盒(由相同公司生产)进行了PCR。利用Sequence Detection System Software(由相同公司生产)进行了分析。

反应条件如下：

第1步：50℃2分钟，1个循环

第2步：95℃10分钟，1个循环

第3步：(95℃15秒，60℃1分钟)，40个循环

通过将ILT7基因针对磷酸-3-甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因进行标准化，比较了ILT7基因在每种组织中的表达，其中已知该磷酸-3-甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的表达是稳定的。其结果，观察到了ILT7在除了淋巴组织以外的其他器官中没有表达，其特异地在IPC中表达。

B.ILT7和FcRγ表达载体的制备

此后，为了表达ILT7蛋白进行了基因的克隆和表达载体的制备。

B-1)ILT7基因的克隆

从IPC中抽提多聚(A)⁺RNA，所述IPC是从人外周血分离的，并利用寡聚dT引物和Super Script Choice System for cDNA Synthesis kit合成了cDNA。在合成的cDNA上连接了EcoRI接头，然后将该cDNA连接到了用EcoRI酶切之后的pME18S载体上，其结果是制备了人IPC cDNA库。

利用制备的cDNA库作为模板，利用具有以下碱基序列的引物通过PCR的方法扩增了ILT7基因。在PCR反应中使用了1活力单位的KOD Plus DNA聚合酶(由TOYOBO CO.，LTD制造)。反应条件为：94℃2分钟，1个循环；然后，[94℃15秒，55℃30秒，68℃2分钟]，25个循环。

正向引物：5’CAG GGC CAG GAG GAG GAG ATG 3’(SEQ ID NO：9)

反向引物：5’TCA GCA GAC ACT TCC CCA ACT 3’(SEQ ID NO：10)

利用1％的琼脂糖凝胶进行电泳对扩增出的约2kb的ILT7cDNA片段进行了分离和回收，然后利用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(由Invitrogen生产)将该片段克隆到了pCR4Blunt-TOPO质粒载体(由Invitrogen生产)中。对获得的基因的碱基序列进行了分析，确认获得了在SEQ ID NO：1中显示的目的ILT7基因。

B-2)具有FLAG标签的ILT7表达载体的制备

分别构建了如下表达质粒，所述表达质粒表达在ILT7的N末端或C末端融合了FLAG标签所形成的蛋白。ILT7融合了标签，通过检测该标签可以确认ILT7蛋白的表达。利用1)中得到的ILT7基因作为模板，并且使用具有下述碱基序列的引物，通过PCR的方法扩增了目的序列。在PCR反应中使用了1活力单位的KOD Plus DNA聚合酶(由TOYOBO CO.，LTD制造)。反应条件为：94℃2分钟，1个循环；然后，[94℃15秒，55℃30秒，68℃2分钟]，25个循环。

对于N-FLAG ILT7

正向引物(SEQ ID NO：11)：5’CCG ctc gag ATG ACC CTC ATT CTCACA AGC CTG CTC TTC TTT GGG CTG AGC CTG GGC [GAT TAC AAGGAT GAC GAC GAT AAG] CCC AGG ACC CGG GTG CAG GCA GAA 3’

反向引物(SEQ ID NO：12)：5’C TAG act agt TCA GAT CTG TTC CCAAGG CTC 3’

对于C-FLAGILT7

正向引物(SEQ ID NO：13)：5’CCG ctc gag ATG ACC CTC ATT CTCACA AGC 3’

反向引物(SEQ ID NO：14)：5’C TAG act agt TCA[CTT ATC GTC GTCATC CTT GTA ATC]GAT CTG TTC CCA AGG CTC 3’

在上述的碱基序列中，在括号中的具有下划线的部分显示的是编码FLAG标签的碱基序列，并且每组小写字母显示的是限制性内切酶XhoI或SpeI的酶切位点。用XhoI和SpeI酶切了PCR扩增出的DNA片段，然后利用凝胶电泳分离了该片段。回收了约2kb的DNA片段，然后将该片段连接到了按照上述相同方法用XhoI和SpeI酶切过的pME18X载体之中。这样，分别构建了能够表达目的蛋白的两种质粒，即pME18X-N-FLAG ILT7和pME18X-C-FLAG ILT7。

B-3)对FcRγ基因的克隆

FcRγ蛋白被认为是能够与ILT7蛋白结合的蛋白。该分子是具有在SEQID NO：15和16中显示的碱基序列和氨基酸序列的基因(GenbankAcc#NM_004106，J.Biol.Chem.265，6448-6452(1990))。该分子是组成FcεRI(高亲和性IgE受体)的分子(γ链)。虽然也将其命名为FcεRIγ，但这里将该分子称为FcRγ。在这方面，已知该分子也是FcγR或FcαR的组成分子。通过以下显示的PCR方法克隆了该基因，制备了表达载体。

利用1)中制备的人IPC cDNA库作为模板，并且利用具有以下碱基序列的引物，通过PCR方法扩增了FcRγ基因。在PCR反应中使用了1活力单位的KOD Plus DNA聚合酶(由TOYOBO CO.，LTD制造)。反应条件为：94℃2分钟，1个循环；然后，[94℃15秒，55℃30秒，68℃1分钟]，25个循环。

正向引物：5’CCC AAG ATG ATT CCA GCA GTG 3’(SEQ ID NO：17)

反向引物：5’GGA AGA ACC AGA AGC CAA AGA 3’(SEQ ID NO：18)

利用2％琼脂糖凝胶对扩增得到的约0.3kb的FcRγcDNA片段进行了分离和回收，然后利用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(由Invitrogen生产)将该片段克隆到了pCR4Blunt-TOPO质粒载体(由Invitrogen生产)中。对所获得的该基因的碱基序列进行了分析，确认已经克隆了SEQ ID NO：15中所示的目的FcRγ基因。

B-4)具有Myc标签的FcRγ表达载体的制备

构建了能够表达C末端连接了Myc标签的蛋白的表达质粒，以确认FcRγ蛋白的表达。利用上述3)中制备的FcRγ基因作为模板，并且利用具有以下碱基序列的引物进行PCR，扩增了目的序列。在PCR反应中使用了1活力单位的KOD Plus DNA聚合酶(由TOYOBO CO.，LTD制造)。。反应条件为：94℃2分钟，1个循环；[94℃15秒，55℃30秒，68℃1分钟]，25个循环。

正向引物(SEQ ID NO：19)：5’CCG ctc gag ATG ATT CCA GCA GTGGTC TTG 3’

反向引物(SEQ ID NO：20)：5’CTA Gac tag tCT A[CA GAT CCT CTTCAG AGA TGA GTT TCT GCT C]CT GTG GTG GTT TCT CAT G 3’

在上述的碱基序列中，在括号中的具有下划线的部分显示的是编码Myc标签的碱基序列，并且每组小写字母显示的是限制性内切酶XhoI或SpeI的酶切位点。用XhoI和SpeI酶切了PCR扩增出的DNA片段，然后利用凝胶电泳分离了该片段。回收了大约0.3kb的DNA片段，然后将该片段连接到了按照上述相同方法用XhoI和SpeI酶切过的pME18X载体之中。这样，构建了能够表达所需蛋白的质粒，即pME18X-Myc-FcRγ。

C.ILT7在动物细胞中的表达

利用上述制备的表达载体检测了ILT7在动物细胞中的表达。

C-1)在293T细胞中的表达

使用Effectene Transfection Kit(由Qiagen制造)将以下五种组合的DNA 导入到293T细胞(7×10⁵个细胞)中。导入两天之后，进行了流式细胞技术分析(FCM分析)。

(1)pME 18X-N-FLAG ILT72μg

(2)pME 18X-C-FLAG ILT72μg

(3)pME 18X-N-FLAG ILT71μg+pME18X-Myc-FcRγ1μg

(4)pME 18X-C-FLAG ILT71μg+pME18X-Myc-FcRγ1μg

(5)pME 18X-Myc-FcRγ2μg

按照如以下实施例2中A-4所述的相同的方法进行了FCM分析。使用连接了Cy3的抗FLAG抗体(由Sigma生产)进行了反应，并且使用FACScan(由Becton Dickinson制造)进行了分析。其结果，明确了：当单独反应时，仅有少量ILT7在细胞表面表达；然而，当与FcRγ共存的时候，ILT7在细胞外强表达(图3)。而且，已知小鼠的FcRγ与人的FcRγ具有高度的同源性，但当使用内源性表达小鼠FcRγ的p815细胞(小鼠肥大细胞瘤)作为宿主时，没有观察到ILT7的表达。

C-2)通过免疫沉淀反应和Western印迹的方法进行分析

按照以下的方法确认了在细胞表面上ILT7是与FcRγ共同表达的。对以上述(1)～(5)的组合的形式共表达两种基因的293T细胞，在免疫沉淀反应后，使用各种抗体进行了分析。

像上述1)那样，将DNA导入了293T细胞(7×10⁵个细胞)，两天后回收了293T细胞。用裂解缓冲液(0.5％Triton，150mM NaCl)溶解了细胞组分，然后将该溶液冰浴了20分钟。其后，使用针头(27G)进行了数次吹吸，然后15Krpm离心了20分钟。向200μg得到的裂解产物中加入了抗myc抗体(2μg，由Santa cruz生物技术生产)或抗FLAG抗体(2μg，由Sigma生产)，然后在4℃旋转搅拌了4小时。然后，向其中加入了Protein A/G Sepharose 4 FastFlow mix(由Amersham bioscience生产)，在4℃旋转搅拌了1小时。然后，利用具有以下的成分的裂解缓冲液洗涤了所得的沉淀成分3次。

裂解缓冲液：

0.5％TritonX-100，

50mM HEPES(pH 7.6)，

150mM NaCl，

1mM EDTA，

10％甘油，

1mM DTT，

2mM PMSF，

1μg/毫升抑肽酶，

1μg/毫升亮抑肽酶，

1μg/毫升胃酶抑制剂A，

0.1μg/毫升糜蛋白酶抑制剂，

1mM Na₃VO₄，

0.1mM β-甘油磷酸酯

向洗涤过的沉淀加入SDS-PAGE样品缓冲液，煮沸5分钟并且离心，然后利用10％SDS凝胶进行了电泳。在电泳之后，按照常规的方法将样品从胶上转移到了PVDF膜上(Immobilon-p-转移膜：由Millipore生产)。利用抗FLAG抗体和抗myc抗体进行印迹实验。由于在每个免疫沉淀组分中观察到了其存在，所以确认了ILT7与FcRγ二者在293T细胞中是结合存在的(图4)。

C-3)糖链的分析

由于在Western分析中观察到了几条ILT7的带，所以考察了ILT7被糖基化了的可能性。利用抗FLAG抗体按照在1)和2)中所描述的方法对200μg的293T细胞裂解物进行了免疫沉淀反应，其中该293T细胞表达N-FLAG ILT7和Myc-FcRγ。此后，用60μL具有以下组分的N-糖苷酶缓冲液重悬了沉淀，并且向两个管中各分装了30μL。

N-糖苷酶缓冲液：

10mM EDTA，

0.2％SDS，

0.5％TritonX100，

含有1％2-巯基乙醇的PBS(磷酸盐缓冲液)

然后向一个管子中加入3μL的N糖苷酶(#1365177，由Roche生产)3个活力单位，37℃反应了15小时。并且，向其中加入了7μL上样缓冲液，100℃加热5分钟，然后用10％SDS凝胶进行了电泳。电泳之后，将胶转移到PVDF膜上，加入4)中所描述的抗ILT7多克隆抗体1μg，并在4℃反应了一夜。用TBS-T缓冲液洗涤，并且与100,000倍稀释的HRP标记的抗兔抗体(由Jackson制造)在室温的条件下进行了反应。然后利用ECL WesternBlotting Detection System(由Amersham bioscience生产)进行了显色。结果是，通过N糖苷酶处理之后表观分子量下降了。因此，认为ILT7上带有糖链(图5)。

C-4)抗ILT7多克隆抗体的制备

按照如下方法制备了在3)中使用的抗ILT7多克隆抗体。化学合成了对应于ILT7的C末端的23个氨基酸的肽(CSQEANSRKDNAPFRVVEPWEQI；SEQ ID NO：21)，并且用作为载体的KLH蛋白结合了该肽，作为免疫原。利用混合了弗氏完全佐剂的免疫原，对兔子进行了皮内免疫。在总共六次免疫之后(每周进行一次)，确认了血清中抗体滴度的增加并且收集了全血。然后，利用相同序列的肽亲和柱对一部分血清进行了亲和纯化，作为抗ILT7多克隆抗体。

实施例2

A.抗ILT7单克隆抗体的制备

A-1)免疫原的制备

按照如下描述的方法将基因导入到293T细胞中，通过该方法制备了免疫原。向扑满100mm/Collagen Coated Dish(培养涂铺盘)(IWAKI)的整个底部的3mL的opti-MEM(GIBCO)中，加入46.4μg转基因(pME18X-C-FLAGILT723.2μg以及pME18X-Myc-FcRγ23.2μg)，并且进行混合。此后，将转基因溶液放在一边，用3mL的opti-MEM稀释58μL的Lipofectamine(商品名)2000(Invitrogen)，室温下放置5分钟，通过这样的步骤制备了Lipofectamine溶液。此后，向含有转基因溶液的培养皿中加入Lipofectamine溶液并进行了混合。在室温下放置了20分钟，利用含有10％FBS(胎牛血清)的DMEM培养基(SIGMA)将的293T-细胞稀释成1×10⁶个细胞/mL的细胞溶液，然后向该培养皿中轻柔地加入了该细胞溶液10mL。37℃下，在CO₂培养箱中静置培养48小时，然后通过移液管回收了细胞，作为免疫原用转染子(トランスフエクタント)。

A-2)杂交瘤的制备

在进行细胞免疫前一天，对四只Balb/c雌性小鼠(四周大)的双脚脚底各注射了50μL乳剂进行免疫，该乳剂是通过将200μLPBS与200μL佐剂(完全佐剂FREUND)(RM606-1，由Mitsubishi Kagaku Iatron，Inc.生产)混合制备的。在此后一天，将2×10⁷个细胞悬浮在400μL的PBS中，各利用50μL进行了免疫。此后，每隔三天进行了第二次和第三次免疫。在第三次免疫三天以后，按如下方法进行了细胞融合。

从免疫小鼠的双脚淋巴结中收集了细胞。将其与培养在含有10％FBS的RPMI1640培养基(SIGMA)中的小鼠骨髓瘤细胞P3-X63-Ag8-U1混合，使得从淋巴结和骨髓瘤获得的细胞的比例为2∶1～10∶1，然后通过离心分离回收了细胞。向所得的细胞组份中加入了用等量RPMI1640培养基稀释过的G4000(MERCK)，进行了细胞融合。在洗涤细胞之后，用含有添加物(supplement)的160mL的15％FBS-HAT培养基重悬，然后将该混合物以200μL/孔接种到了16个96孔板中。三天之后更换了培养基。观察到克隆形成一到两周之后，进行了初步筛选。

A-3)通过Cell ELISA的方法筛选杂交瘤

通过以下的Cell ELISA对产生目标抗体的杂交瘤进行了筛选。以1×10⁷个细胞每个96孔板的浓度使用按照在1)中制备的细胞，利用0.5％BSA/2mM EDTA/PBS溶液重悬，然后以100μL/孔的量分装到Cell ELISA用培养板(NUNC 249570 96V NW PS)中。在4℃以2,000rpm的速度进行了2分钟的离心，然后弃去了上清。以50μL/孔的量加入了取样过的上清，室温下反应了30分钟。进行了两次洗涤操作，其中该洗涤操作如下进行：向每孔中加入0.5％BSA/2mM-EDTA/PBS，在4℃以2,000rpm的速度离心2分钟，然后弃去上清。洗涤之后向每孔中加入了50μL的10,000倍稀释的过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体(IM0819；Beckman coulter)，并反应了30分钟。使用0.5％BSA/2mM-EDTA/PBS进行了3次洗涤操作，然后加入显色溶液，测定OD450nm-620nm，选择呈阳性反应的孔。

A-4)利用流式细胞技术(FCM)分析考察抗体反应性

利用流式细胞技术(FCM)分析的方法分析了杂交瘤培养上清。用0.5％BSA/2mM EDTA/PBS重悬了上述1)中制备的细胞，然后以每个样品1×10⁵的量收集到离心管中，此后加入每种培养上清40μL，并且在室温下反应30分钟。进行了两次洗涤操作，该洗涤操作如下：向每管中加入1ml 0.5％BSA/2mM-EDTA/PBS，在4℃以1,200rpm的速度离心3分钟，然后弃去上清。洗涤之后向每孔中加入了40μL的100倍稀释的FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体(IM0819；Beckman coulter)，在室温下反应了30分钟。进行了两次使用0.5％BSA/2mM-EDTA/PBS的洗涤操作，然后利用流式细胞仪FC500(Beckman coulter)进行了分析。选择了产生抗体的杂交瘤，其中该抗体不与宿主细胞产生反应，而特异地与导入了基因的细胞产生反应。利用极限稀释法克隆化了选择出来的杂交瘤，并且获得了产生单克隆抗体的杂交瘤#11和#17。

B.抗ILT-7的抗体反应性的考察

在293T细胞中，按照实施例1中的C-1)所描述的相同的方法对N末端连接了FLAG标签的ILT7和FcRγ分子进行了共表达。然后，利用FACScan(Becton Dickinson)通过FCM分析确认了实施例2中所获得的抗体的反应性。其结果，确认了由A中获得的杂交瘤#11和#17产生的抗体均对于导入了ILT7基因并表达ILT7的细胞有反应(图6(b))。

此外，利用聚蔗糖从人外周血中分离了淋巴细胞，然后利用制备的抗ILT-7抗体和PE标记的抗BDCA-2抗体(Miltenyi)对其进行了双染色。然后，考察了该抗体对于淋巴细胞的反应性。其结果，检测到了由杂交瘤#11和#17所产生的单克隆抗体对于BDCA-2阳性细胞的结合。就是说，确认了两种抗体都识别人IPC上表达的ILT7分子(图6(a))。将该单克隆抗体分别命名为抗ILT-7抗体#11和抗ILT-7抗体#17。还进行了更详细的分析。

利用制备的抗ILT-7抗体，抗谱系1抗体(抗CD3，CD14，CD16，CD19，CD5 6抗体；Becton Dickinson)，抗CD123抗体(Becton Dickinson)以及抗BDCA-2抗体(Miltenyi)对人外周血淋巴细胞进行了多重染色分析。对于ILT7抗体阳性的组分，谱系标记物(Lineage Marker)是阴性的，CD123是阳性的并且BDCA-2是阳性的。从这些结果中，确认了ILT7#11和ILT7#17仅对IPC进行了染色(图7)。

此外，当利用CpG或者IFNα对外周血淋巴细胞刺激了24小时的时候，利用FCM分析对多种分子的表达进行了检测。将CpGODN2216用作诱导IPC产生IFN的CpGA，并且将CpGODN2006用作促进树突细胞成熟的CpGB(Moseman et al.J.Immunology.173，4433-4442，2004)。对谱系标记物阴性组分设置了标准，当分析抗BDCA-2抗体和抗ILT-7抗体针对CD123阳性细胞群的反应性的时候，在CpG刺激24小时之后，ILT7阳性组分基本上消失了。另一方面，对于BDCA-2，一部分细胞在CpG刺激24小时之后仍显示阳性(图8)。认为在CpG刺激之后IPC立即分化成不同的细胞，这表明可以将本发明的抗ILT-7抗体用作IPC的阶段特异性抗体。此外，可以确认：在IFNα存在时，外周血淋巴细胞中的IPC不会分化，存活率高，但此时在IPC上维持了ILT7的表达，在血清中的IFN可能处于高水平的自身免疫病中，IPC上的ILT7是稳定存在的。

C.对抗ILT-7抗体特异性的考察

ILT7属于ILT/LIR家族，并且该家族有许多分子具有高同源性，特别是在胞外区具有高同源性(图9)。已经报道过在IPC中有诸如ILT2和ILT3的mRNA的表达(Ju et al.Gene 331，159-164，2004)。因此，利用转基因细胞确认了该类分子的反应性。

C-1)ILT1分子的克隆以及表达载体的制备

利用寡聚dT引物和SuperScript Choice System cDNA合成试剂盒，以从人扁桃体得到的RNA为模板合成了cDNA。在合成的cDNA上连接了NotI接头，然后将其连接到了用NotI酶切之后的pME18S载体上，其结果是制备了人扁桃体cDNA库。

利用所得的cDNA库作为模板，并且使用具有下述碱基序列的引物，通过PCR的方法扩增了C末端连接了FLAG标签的ILT1基因。在PCR反应中使用了1活力单位的KOD Plus DNA聚合酶(由TOYOBO CO.，LTD制造)。反应条件为：94℃2分钟，1个循环；然后，[94℃15秒，55℃30秒，68℃2分钟]，25个循环。

正向引物(SEQ ID NO：22)：5’CCG ctc gag ATG ACC CCC ATC CTCACG GTC C 3’

反向引物(SEQ ID NO：23)：5’CTA Gac tag tTC A[CT TAT CGT CGTCAT CCT TGT AAT C]CC TCC CGG CTG CAT CTT G 3’

在上述的引物序列中，在括号中的具有下划线的部分显示的是编码FLAG标签的碱基序列，并且每组小写字母显示的是限制性内切酶XhoI或SpeI的酶切位点。用XhoI和SpeI酶切了PCR扩增出的DNA片段，然后利用凝胶电泳分离了该片段。回收了约2kb的DNA片段，然后将该片段连接到了按照上述相同方法用XhoI和SpeI酶切过的pME18X载体之中。这样，构建了能够表达目的融合蛋白的质粒，即pME18X-C-FLAGILT1。其碱基序列和氨基酸序列如SEQ ID NO：24和25所示。

C-2)表达细胞的制备以及抗体反应性的考察

对于ILT2(SEQ ID NO：26)以及ILT3(SEQ ID NO：28)，使用了将两种基因分别克隆到pcDNA4.1(由Invitrogen生产)的XbaI、XhoI位点所制备的表达载体。使用与C-1)中所描述的相同的方法向293T细胞(7×10⁵个细胞)中导入了以下的DNA组合。导入两天之后，进行了流式细胞技术分析(FCM分析)，分析了抗ILT7抗体。

(1)pME18X-N-FLAG ILT7 1μg+pME18X-Myc-FcRγ1μg

(2)pME18X-C-FLAG ILT1 0.5μg+pME18X-Myc-FcRγ0.5μg+pcDNA4.1-ILT2 0.5μg+pcDNA4.1-ILT3 0.5μg

其结果，任何抗体对于表达了ILT1等的细胞都没有反应。因为这样的原因，证明了该抗ILT7抗体特异地识别IPC上的ILT7分子(图10)。

实施例3

抗ILT-7抗体对产人IFN能力的影响

将人外周血淋巴细胞以2×10⁵个细胞/孔的量接种到96孔板中，然后在37℃与各种抗体进行了反应，各种抗体的量均为5μg/mL。培养1小时之后，向其中加入了流感病毒PR8。培养24小时之后，利用ELISA试剂盒(Bender Med System)测定了培养上清中的IFNα。其结果，通过加入抗ILT-7抗体抑制了IFN的产生(图11)。也就是，明确了本发明的抗ILT-7抗体对IPC的产IFN活性有影响。

实施例4

抗ILT-7抗体的CDC活性

A.抗ILT7的单克隆抗体的制备

按照实施例2中A-1)～A-4)所描述的相同的方法获得了产生单克隆抗体的克隆。按照实施例2中B所描述的相同的方法测定了反应性，并且按照实施例2中C所描述的相同的方法测定了特异性。其结果，获得了产生反应性和特异性良好的抗ILT7单克隆抗体的杂交瘤#37，#28以及#33。利用由这三种杂交瘤所产生的抗ILT7单克隆抗体按照下述方法测定了CDC活性。

B.CDC活性的确定

B-1)在前一天，利用Effectene Transfection Reagent(由QLAGEN生产)将以下的DNA导入到了CHO-k1细胞中，所述CHO-k1细胞是以每盘6×10⁵个细胞的数量接种在6cmφ盘上的，然后利用800μg/毫升的Zeocin(由 Invitrogen生产)选择了抗性株。

导入的DNA：pcDNA3.1-C-FLAG ILT71μg+pME18X-Myc FcRγ2μg

此后，利用细胞分选仪(BD FACSAria，由Becton Dickinson制造)获得了大量表达ILT7的细胞系。通过FCM分析确认了所选择的细胞系大量表达ILT7。除了将BD FACSCaliber(由BD生产)用于FCM以外，按照实施例2中A-4)中所描述的相同的方法实施了FCM分析操作。分别使用了以下的抗体作为第一抗体和第二抗体。

第一抗体：5μg/毫升小鼠抗ILT-7抗体(#37)，

第二抗体：R藻红蛋白(R-PE)连接的山羊抗小鼠免疫球蛋白特异性多克隆抗体(BD公司)

B-2)目标细胞与抗ILT7抗体的反应

利用5mM EDTA/PBS溶液回收了B-1)中获得的目标细胞(ILT7-CHO细胞)，然后利用含有以下成分的CDC培养基重悬了该细胞而获得4×10⁵个细胞/毫升的浓度。将该重悬液按50μl/孔浓度分装到V形底96孔板中。

CDC培养基：

RPMI1640

0.1％BSA

100活力单位/毫升青霉素

100μg/毫升链霉素

10mM Hepes(pH 7.6)

2mM L-谷氨酰胺

向每个孔中加入了50μl用CDC培养基制备的抗ILT-7抗体溶液，并且进行了混匀以使最终的抗体浓度为0.1μg/毫升，0.5μg/毫升，1μg/毫升以及5μg/毫升。此外，向其中加入了50μl含有具有以下成分的含补体的CDC培养基，并且进行了混合以使补体的终浓度为6％，然后在37℃培养了2小时。

含补体的CDC培养基：

1ml幼兔的补体(Catalog No.：CL3441，由CEDARLANE生产)

CDC培养基(同上)

然后，将悬浮液进行了离心(离心条件：250G离心4分钟)并且回收了上清，在回收的时候注意不要带入细胞的污染。利用常规的方法测定了上清中的LDH，将该结果确定为“由补体活性引起的目标细胞渗漏出的LDH的量(实验样本)”。

为了确定CDC的活性也测定了以下的参数。

-目标细胞自发的LDH的释放(Target Cell Spontaneous LDH Release)：仅培养了与样品相同体积的目标细胞并对其进行了制备。

-目标细胞最大的LDH释放(Target Cell Maximum LDH Release)：仅培养了与样品相同体积的目标细胞，然后在回收上清液之前60分钟，向其中加入了试剂盒里包含的TritonX-100溶液以使最终浓度为0.8％，这样对其进行了制备.

-体积修正对照(Volume Correction Control)：向与样品具有相同体积的培养基中加入了与制备目标细胞最大的LDH释放时所加入的相同的量的TritonX-100，这样对其进行了制备.

-培养基的本底(Culture Medium Background)：制备了与样品具有相同的体积的培养基，以及，向培养基中加入了含补体的CDC培养基使之与样品具有相同体积而成的溶液。

如下进行了修正：从目标最大以及目标自发的吸收中减去了与样品具有相同体积的培养基的吸收，从实验样品的吸收中减去了向培养基中加入了含补体的CDC培养基使之与样品具有相同体积而成的溶液的吸收。

通过以下的等式计算了CDC活性。结果在表1和图12中显示。在使用了从任何杂交瘤中获得的抗ILT7单克隆抗体的例子中，当抗体浓度为0.5μg/毫升或者更高时，显示出80％或者更多的CDC活性。

CDC活性＝[(实验样品-目标自发)/(目标最大-体积对照-目标自发)]×100

[表1]

比较例1

除了将抗ILT7抗体替换成小鼠IgG2a以外，其他完全按照实施例4的B和C中所描述的相同的方法进行操作。其结果与实施例4一起显示在表5和图12中。在除了抗ILT7单克隆抗体以外的其他抗体中没有观察到针对目标细胞的CDC活性。

实施例5

抗ILT-7抗体在目标细胞上的内化

A.抗ILT7单克隆抗体

使用了以下的抗ILT7单克隆抗体。抗ILT7单克隆抗体：#17，#26，#37，#28以及#33

B.内化的观察

B-1)目标细胞系(ILT7-CHO细胞系)的制备

按照实施例4的B-1中所描述的相同的方法制备了目标细胞系(ILT7-CHO细胞系)。

B-2)目标细胞与抗ILT-7抗体的反应

用含有以下成分的冰预冷的(T(-)+10％FBS)缓冲液重悬了回收的ILT7-CHO细胞，重悬后的浓度为1×10⁶个细胞/毫升，回收细胞时使用的是5mM EDTA/PBS溶液。

T(-)培养基：

RPMI1640

100活力单位/毫升青霉素

100μg/毫升链霉素

10mM Hepes(pH7.6)

2mM L-谷氨酰胺(Glutamin)

1mM丙酮酸钠

50μM 2-巯基乙醇

10％热灭活的胎牛血清

将1毫升上述的悬浮液放入15毫升离心管中，进行离心(离心条件：在4℃以1200rpm的速度离心5分钟)，然后弃去了上清。向细胞沉淀中加入了200μL抗ILT7单克隆抗体悬液(10μg/毫升)，然后对其进行了混合，并且在4℃孵育30分钟，此后利用冰预冷的T(-)培养基洗涤两次(所使用的培养基的量：每次洗涤用10毫升，离心条件：在4℃以1200rpm的速度离心5分钟)。

B-3)对存在于目标细胞表面的ILT7-抗ILT-7抗体免疫复合物的修饰

随后，利用第二抗体对存在于细胞表面的ILT7-抗ILT-7抗体免疫复合物进行了修饰，使得能够通过荧光进行检测。具体方法如下所述。向B-2)中获得的细胞沉淀中加入了含有APC-标记的山羊抗小鼠IgG多克隆抗体(目录号：550826BD，由Biosciences生产)的冰预冷的T(-)培养基，然后在4℃避光孵育20分钟，此后用冰预冷的T(-)培养基洗涤两次(所使用的培养基的量：每次洗涤用10毫升，离心条件：在4℃以1200rpm的速度离心5分钟)。然后向其中加入了冰预冷的T(-)培养基，作为浓度为1×10⁶个细胞/毫升的悬液。

B-4)通过在37℃孵育来诱导内化

将按照B-3中获得的悬液平均分到两个管子里(即管(a)和(b))。将管(a)和(b)分别在37℃和4℃避光孵育了60分钟。在孵育之后，向其中加入了1％FBS/PBS(冰预冷的)来终止内化。对其进行了离心(离心条件：在4℃以1200rpm的速度离心5分钟)，然后弃去了上清，接着利用1％的FBS/PBS(冰预冷的)洗涤两次(溶液的量：每次洗涤用10毫升，离心条件：在4℃以1200rpm的速度离心5分钟)。

B-5)对在孵育之后仍存在于目标细胞表面的ILT7-抗ILT-7抗体免疫复合物的修饰

利用第三抗体对孵育之后仍保留在细胞表面的ILT7-抗ILT-7抗体免疫复合物进行修饰，使得能够通过荧光来检测。具体方法如下所述。向B-4)中获得的细胞沉淀中加入了20μL含有第三抗体(FITC标记的驴抗山羊IgG抗体(目录号：sc-2024，由Santa cruz生物技术生产))的悬浮液，然后在4℃避光孵育15分钟。然后用1％的FBS/PBS(溶液的量：每次洗涤用10毫升，离心条件：在4℃以1200rpm的速度离心5分钟)对所得的溶液进行了洗涤。B-6)对目标细胞中存在的抗ILT-7的抗体的分析

随后，向B-5)中获得的细胞沉淀中加入了150μL的1％FBS/PBS，然后将其重悬并收集到1.2毫升的微量滴定管中，对其进行FCM分析。在分析中，分FITC和APC分析了每种细胞的平均荧光强度(MPI)。进一步，按照以下的等式计算了荧光强度比(％)。

荧光强度比(％)＝(37℃孵育了60分钟的细胞的平均荧光强度/4℃孵育了60分钟的细胞的平均荧光强度)×100

该结果在表2，表3和图13中显示。

[表2]

[表3]

FITC的荧光强度是在孵育之后仍保留在细胞表面的ILT7-抗ILT-7抗体免疫复合物的量的指示剂。与在4℃孵育的细胞相比较，在37℃孵育60分钟的细胞的FITC的平均荧光强度降低到了大约50％。

另一方面，APC的荧光强度是在孵育之前存在于细胞表面的ILT7-抗ILT-7抗体免疫复合物的量的指示剂。在孵育之后，无论ILT7-抗ILT-7抗体免疫复合物是存在于细胞表面还是整合到细胞内，都能够检测到该复合物。在实施例5中，在37℃孵育的例子与在4℃孵育的例子相比，孵育之后的APC荧光强度是相等的。该结果表明：无论在两种温度中任何一种温度中孵育，ILT7-抗ILT-7抗体免疫复合物均存在于目标细胞的任何部位。如上所述，可知通过37℃孵育，抗ILT7单克隆抗体引起了ILT7的内化。

比较例2

除了将抗ILT7抗体替换成小鼠IgG2a以外，其他完全按照实施例5中所描述的相同的方法进行操作。其结果实施例5一起显示在表2，表3以及图13中。在使用小鼠IgG2a的例子中没有观察到FITC的荧光强度的任何变化，因此可知小鼠IgG2a没有引起ILT7的内化。

实施例6

关于小鼠抗人ILT7单克隆抗体的结构

[可变区的序列]

A.编码小鼠抗ILT-7抗体可变区的cDNA的克隆

A-1)关于产生小鼠抗ILT7抗体的杂交瘤

使用了以下的杂交瘤作为产生小鼠抗ILT7抗体的杂交瘤。

-杂交瘤#11(保藏号：FERM BP-10704)

-杂交瘤#17(保藏号：FERM BP-10705)

A-2)总RNA的分离

利用市售试剂盒“RNeasy Mini Kit”(目录号：74106，由Qiagen制造)按照试剂盒中所附的说明，从A-1)中所述的杂交瘤中抽提了总RNA。均是从1×10⁷个杂交瘤细胞中获得了大约200μg的总RNA。

A-3)对于编码小鼠重链可变区的cDNA的扩增和片段化

以5μg的A-2中分离的总RNA作为模板，并利用5’RACE的方法扩增了编码小鼠重链可变区的cDNA。对于扩增，使用了市售试剂盒“5’RACESystem for Rapid Amplification of cDNA ENDs，Version 2.0 Kit”(目录号：18374-058，由Invitrogen生产)。其具体描述如下。首先，利用反转录酶以A-2中分离的总RNA作为模板合成了cDNA的第一条链。此时，所使用的反义引物(GSP1)的碱基序列如表4所示。

[表4]

用于扩增小鼠重链可变区编码基因的引物

此后，利用RNaseH降解了总RNA，并且利用低熔点琼脂糖法(1.5％)纯化了保持单链形式的cDNA的第一链。此外，利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)将dC(即核苷酸同聚物)连接到cDNA的第一条链的3’末端。利用锚定引物(SEQ ID NO：34)以及如表4中所示的反向引物(GSP2)通过PCR的方法扩增了cDNA，其中该锚定引物在3’末端具有与dC(锚定序列)互补的核苷酸多聚物。此外，将所获得的PCR产物用作模板，利用AUAP引物(SEQID NO：35)以及如表4中所示的反向引物通过巢式PCR的方法扩增了cDNA。此外，通过低熔点琼脂糖法(1.5％)的方法纯化了该PCR产物。

用于5’RACE(SEQ ID NO：34)的锚定引物

5’-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG-3’(36个寡核苷酸)

用于5’RACE的AUAP引物(SEQ ID NO：35)

5’-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3’(20个寡核苷酸)

A-4)编码小鼠轻链可变区的cDNA的扩增和片段化

以A-2)中分离的总RNA作为模板，并利用A-3)中所述的相同的方法扩增了编码小鼠轻链可变区的cDNA。此时，所使用的引物的碱基序列如表5所示。利用低熔点琼脂糖法(1.5％)纯化了所得的PCR产物。

[表5]

用于扩增小鼠轻链可变区编码基因的引物

A-5)对cDNA碱基序列的确认以及CDR区的确定

利用市售试剂盒“Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit”(目录号：1325137，由Invitrogen生产)按照试剂盒中所附的说明，将A-3)中获得的重链可变区以及A-4)中获得的轻链可变区的cDNA片段克隆到pCR4Blunt-TOPO载体中，然后将所得的载体导入到大肠杆菌感受态细胞中，获得了大肠杆菌转化株。从上述的转化株中获得了上述的质粒，然后利用自动DNA测序仪“PCR-based ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer”(由Applied Biosystems生严)确认了质粒中的cDNA碱基序列。通过排除从无活性RNA获得的转录子获得了正确的序列，其中该无活性RNA是由于在互补性决定区(此后称为“CDR区”)周围的移码以及无意义突变造成的。此外，将该质粒中所包含的cDNA碱基序列的同源性与Kabat数据库进行了比较，并且确定了各个可变区中CDR区和可变区的序列。

同样，对于实施例4中制备的杂交瘤#37，按照利用杂交瘤#17的实施例6中A-1)～A-5)所描述的程序确定了可变区中CDR区和可变区的序列。在以下的SEQ ID NO中显示的是由每种杂交瘤产生的抗ILT7单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的cDNA的碱基序列以及由该序列编码的氨基酸序列。

重链可变区轻链可变区

#11 SEQ ID NO：38 SEQ ID NO：40

(碱基序列) (碱基序列)

SEQ ID NO：39 SEQ ID NO：41

(氨基酸序列) (氨基酸序列)

#17 SEQ ID NO：42 SEQ ID NO：44

(碱基序列) (碱基序列)

SEQ ID NO：43 SEQ ID NO：45

(氨基酸序列) (氨基酸序列)

#37 SEQ ID NO：46 SEQ ID NO：48

(碱基序列) (碱基序列)

SEQ ID NO：47 SEQ ID NO：49

(氨基酸序列) (氨基酸序列)

[恒定区同种型(アイソタイプ)的确认]

对于杂交瘤培养上清，使用市售小鼠单克隆抗体分型试剂盒(目录号：MMT1，由Serotec Product生产)确认了制备的单克隆抗体的恒定区的同种型。小鼠抗人ILT-7抗体#11的重链恒定区是Igγ3，而轻链恒定区是Igк。此外，小鼠抗人ILT-7抗体#1 7的重链恒定区和小鼠抗人ILT-7抗体#37的重链恒定区都是Igγ2a，并且其轻链恒定区都是Igк。

实施例7

嵌合抗体的制备

A.编码人IgG恒定区的cDNA的克隆

从人IPC的cDNA库选择了人IgG1的重链恒定区以及人Igк的轻链恒定区。然后，利用市售试剂盒“Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit”(目录号：1325137，由Invitrogen生产)按照试剂盒中所附的说明将选出的区域克隆到pCR4 Blunt-TOPO载体中，然后将所得的载体导入到大肠杆菌感受态细胞中，获得了大肠杆菌转化株。从上述的转化株中获得了上述的质粒，然后利用自动DNA测序仪“PCR-based ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer”(由Applied Biosystems生产)确认了质粒中的cDNA的碱基序列。

B.可变区与恒定区的连接和克隆

分别使用了A中获得的重链恒定区的编码cDNA以及实施例6的A-5中获得的重链可变区的编码cDNA。两种DNA具有DNA的碱基序列重叠的区域。因此，利用该区域使用重叠延伸方法获得了双链DNA。详细方法如下。

C-1)制备编码嵌合ILT7抗体的重链的cDNA

利用限制性内切酶NotI和XbaI消化了A-5)中获得的“具有编码#11和#17重链可变区的cDNA的质粒”，然后利用琼脂糖凝胶方法(1.5％)对其进行了纯化。利用具有以下成分的TE缓冲液溶解了所得的产物，制备了浓度为100pmol/μL的编码重链可变区的cDNA片段的溶液。

TE缓冲液：

10mM Tris-HCl

1mM EDTA

pH 7.5～8.0

此外，按照上述相同的方法处理了B中获得的“具有编码重链恒定区的cDNA的质粒”了制备浓度为100pmol/μL的溶液。随后，将两种溶液进行了混合，然后通过最初将混合液在70℃放置10分钟，然后在37℃放置5分钟来使二者的重合区杂交。其后，通过PCR的方法扩增了cDNA，并且利用限制性内切酶NotI和XbaI对所得的cDNA进行了消化，然后利用低熔点琼脂糖凝胶方法(1.5％)对其进行了纯化。

C-2)制备编码嵌合ILT7抗体的轻链的cDNA

分别使用了A中获得的轻链恒定区的编码cDNA以及实施例6的A-5中获得的轻链可变区的编码cDNA。使用这些cDNA按照C-1)中所描述的相同的方法获得了编码嵌合ILT7抗体的轻链的cDNA。

C-3)克隆化

使用NotI和XbaI作为克隆位点将C-1)中获得的cDNA克隆到质粒载体pcDNA3.1-Zeocin(由Invitrogen生产)中，制备了嵌合ILT7抗体重链表达载体。此外，使用NotI和XbaI作为克隆位点将C-2)中获得的cDNA克隆到质粒载体pcDNA3.1-hygromycin(由Invitrogen生产)中，制备了嵌合ILT7抗体轻链表达载体。

表6中显示的是每种载体的名称。

[表6]

质粒载体的名称

	嵌合ILT7抗体重链表达用	嵌合ILT7抗体轻链表达用
			#11	pcDNA-#11VH	pcDNA-#11VL
#17	pcDNA-#17VH	pcDNA-#17VL

D.嵌合ILT7抗体的表达

D-1)瞬时转染

利用effectine transfection kit(目录号：301427，由Qiagen制造)将1μg的嵌合ILT7抗体重链表达载体和1μg的嵌合ILT7抗体轻链表达载体共转染了293T细胞，其中两种载体是在C-3)中制备的。此后，使用含有以下成分的加入了2％Low IgG FBS的DMEM培养基，在37℃进行了培养。

加入了2％Low IgG FBS的DMEM培养基：

DMEM培养基(目录号：D5796，由Sigma生产)

2％Low IgG FBS(目录号：SH30151.03，HyClone产)

2mM L-谷氨酰胺(Glutamin)

100U/毫升青霉素

100μg/毫升链霉素

pH 7.2～pH 7.4

在导入了载体之后，培养96小时，收集了培养上清。然后，通过离心去除了细胞碎片，获得了粗制的抗体溶液。

D-2)稳定转染

利用effectine transfection kit(目录号：301427，由Qiagen制造)将1μg的嵌合ILT7抗体的重链表达载体和1μg的嵌合ILT7抗体的轻链表达载体共转染了YB2/0细胞(该细胞来自于大鼠骨髓瘤，ATCC#CRL-1622)，其中两种载体是C-3)中制备的。在所使用的质粒载体中，重链表达载体的标记是Zeocin抗性，而轻链表达载体的标记是潮霉素抗性。因此，导入了两种载体的细胞能够在同时加入了Zeocin和潮霉素的培养基中生长。然后，利用加入了Zeocin和潮霉素的RPMI培养基培养该细胞并且选择了抗性株。

加入了Zeocin-潮霉素的RPMI培养基：

RPMI1640培养基(目录号：R8758，由Sigma生产)

10％FBS

0.01M HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸钠)

1mM丙酮酸钠

2mM L-谷氨酰胺

100U/毫升青霉素

100μg/毫升链霉素

55μM 2-巯基乙醇

0.5mg/毫升Zeocin

0.5mg/毫升潮霉素

pH 7.2～pH 7.4

在此操作三天以后，通过ELISA方法确定了培养上清中的抗体产量。选择了具有高抗体表达水平以及细胞明显增加的ILT7嵌合抗体生成细胞系。此外，通过细胞分选的方法进行单克隆化，获得了以下的细胞系。

#11 IL T7嵌合抗体生成细胞系：#11-5细胞系和#11-16细胞系

#17 IL T7嵌合抗体生成细胞系：#17-24细胞系

将上述的细胞系(#11-5细胞系，#11-16细胞系和#17-24细胞系)分别在具有以下成分的加入了5％FBS的RPMI培养基中培养。将孵育温度和孵育时间分别设置为37℃和96小时。

加入了5％FBS的RPMI培养基：

RPMI1640培养基(目录号：R8758，由Sigma生产)

5％FBS

0.01M HEPES

1mM丙酮酸钠

2mM L-谷氨酰胺

100U/毫升青霉素

100μg/毫升链霉素

55μM 2-巯基乙醇

pH 7.2～pH 7.4

收集了培养上清并且通过离心去除了细胞碎片以便，获得了粗制的抗体溶液。

E.抗体的纯化

通过蛋白A亲和柱(rProtein A Sepharose FF，目录号：17-1279-01，由Amershram Pharmacia生产)纯化了D-1和D-2中获得的每种粗制抗体溶液。纯化条件如下。使用具有如下成分的PBS(-)缓冲液作为吸附缓冲液，以及0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH3)作为洗脱缓冲液，按照附带的说明书进行了亲和纯化。向洗脱组分中加入了1M Tris-HCl(pH 8.0)将pH调节至大约7.2。对于调整好pH的抗体溶液，使用透析膜将其交换成PBS(-)，得到了纯化的抗ILT7嵌合抗体。关于纯化抗体的浓度，测定了在280nm处的吸收值，并且以1.38 OD为1mg/毫升进行了换算。表7中总结了所获得的嵌合ILT7抗体、其可变区基因的来源杂交瘤以及宿主细胞之间的关系。

PBS(-)缓冲液：

0.2g/L磷酸二氢钾

0.2g/L氯化钾

8g/L氯化钠

1.15g/L无水磷酸氢二钠

[表7]

制备的嵌合抗体

制备的嵌合抗体的重链和轻链的氨基酸序列以及cDNA碱基序列分别如下所示。在每种氨基酸序列中，从氨基酸序列N末端到-1是信号序列的氨基酸序列，从氨基酸序列的1到C末端是成熟蛋白的氨基酸序列。就是说，组成这些嵌合抗体的重链和轻链是由以下每种氨基酸序列的从1到C末端的氨基酸序列所组成的。

重链轻链

#11 SEQ ID NO：50 SEQ ID NO：52

(碱基序列) (碱基序列)

SEQ ID NO：51 SEQ ID NO：53

(氨基酸序列) (氨基酸序列)

#17 SEQ ID NO：54 SEQ ID NO：56

(碱基序列) (碱基序列)

SEQ ID NO：55 SEQ ID NO：57

(氨基酸序列) (氨基酸序列)

工业实用性

本发明提供了可用于制造特异性识别人ILT7的抗体的免疫原，以及利用该免疫原生产抗ILT-7抗体的方法。本发明的特异识别人ILT7的抗体能够在ILT家族存在的情况下特异地识别ILT7。因此，可以使用本发明的抗体来测定和分离人ILT7。例如，也可以使用本发明的抗体来分析ILT7的定位。已经认识到ILT7是与IPC或树突细胞的分化和功能密切相关的分子。因此，可以使用能够识别ILT7并且具有高特异性的抗体来分析IPC或树突细胞的功能。IPC样的(具有表达BDCA-2的特性)癌细胞是已知的(Chaper ofL et al.Eur.J.Immunol.34；418-426，2004，Maeda T et al.，Int.J.Hematol.81；148-154，2005)。对于在这些细胞中ILT7的表达的确认可能会使得对癌症的诊断和治疗成功。

在自身免疫病的例子中，例如，已经有人指出由IPC产生的IFNα与银屑病的发展之间有很深的关系，其中的银屑病是一种皮肤病(Nestle FO etal.，J.Exp.Med.202，135-143，2005)。因此，可以通过鉴定银屑病病人皮肤组织中的IPC来测定银屑病的程度，即在活检标本中使用抗ILT-7的抗体。

已知HIV感染的病人的AIDS的发展是与IPC的数目相关的。也就是，在还没有显示出症状的病人中观察到了很多的IPC并且在发病时观察到了IPC的减少(Soumells V.et al.，Blood 98；906-912，2001)。因此，可以有效地对诸如HIV的病毒的感染的预后进行预测。

例如，ILT7是在人源IPC中特异表达的分子。因此，可以使用本发明的抗ILT-7的抗体来检测，鉴定或者分离IPC。IPC是产生大多数1型干扰素的细胞。因此，在诊断和研究与1型干扰素相关的疾病时对该分子的检测，鉴定或者分离是重要的指标。可能已经展示了诸如多种自身免疫病以及感染这样的在病理状态形成的过程中牵涉到干扰素的疾病。

另外，本发明的抗ILT-7的抗体对IPC的活性具有抑制作用。所以，可以使用本发明的抗ILT-7的抗体来抑制IPC的活性。此外，可以通过抑制IPC的活性来治疗涉及1型干扰素的疾病。具体的，本发明的抗ILT-7的抗体可以用于多种自身免疫病以及感染这样的在病理状态形成的过程中涉及到干扰素的疾病。特殊地由于该抗ILT-7的抗体具有高特异性，该抗体可以有效地去除IPC。