ME02111B - Antitijelo protiv ILT7 - Google Patents

Antitijelo protiv ILT7

Info

Publication number
ME02111B
ME02111B MEP-2014-157A MEP15714A ME02111B ME 02111 B ME02111 B ME 02111B ME P15714 A MEP15714 A ME P15714A ME 02111 B ME02111 B ME 02111B
Authority
ME
Montenegro
Prior art keywords
ilt7
antibody
cells
human
cell
Prior art date
Application number
MEP-2014-157A
Other languages
English (en)
Inventor
Yumiko Kamogawa
Minkwon Cho
Naoko Arai
Koji Ishida
Original Assignee
Sbi Biotech Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sbi Biotech Co Ltd filed Critical Sbi Biotech Co Ltd
Publication of ME02111B publication Critical patent/ME02111B/me

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/555—Interferons [IFN]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6866—Interferon

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oncology (AREA)

Description

Tehničko polje
Ovaj pronalazak se odnosi na antitelo koje veže humani ILT7.
Sadašnje stanje tehnike
Interferon α (IFNα: nadalje, "interferon" je skraćen sa IFN) i interferon β (IFNβ) su poznati kao tip 1 IFN koji poseduju antiviralno delovanje ili antitumorsko delovanje. Sa druge strane, bilo je otkriveno da je IFNα povezan sa auto-imunom bolesti. Na primer, abnormalna proizvodnja IFNα je primećena kod pacijenata sa dole navedenim auto-imunim bolestima. Takođe je sugerisano da simptomi auto-imunih bolesti mogu da se smanje uz pomoć neutralizovanja IFNα.
Sistemski lupus erythematosus (Shiozawa et al., Arthr. & Rheum. 35, 412, 1992).
Hronični reumatizam (Hopkins et al., Clin. Exp. Imunol. 73, 88, 1988).
Slučajevi u kojima se simptomi auto-imunih bolesti manifestuju ili se pogoršavaju uz pomoć administracije rekombinantnog IFNα2 ili IFN su takođe poznati (Wada et al., Am. J. Gastroenterol. 90, 136, 1995; Perez et al., Am. J. Hematol. 49, 365, 1995; Wilson LE et al, Semin Arthritis. Rheum. 32, 163-173, 2002.).
Nadalje, takođe je bilo primećeno da IFNα indukuje diferencijaciju dendrita. Dendrit je takođe i ćelija koja prezentira antigen. Prema tome, smatra se da je indukovanje diferencijacije dendrita važan mehanizam kod auto-imunih bolesti. Bilo je sugerisano da postoji dublja povezanost između indukcije diferencijacije dendrita sa IFNα i pojave sistemskog lupus erythematosus (Blanco et al., Science, 16:294, 1540-1543, 2001). Tako, bilo je zaključeno da je IFNα blisko povezan sa delovanjem protiv tumora i auto-imunih bolesti. Dodatno, IFNα je značajno uključen u pojavi psorijaze (Nestle FO et al., J. Exp. Med. 202, 135-143, 2005).
Ćelije koje proizvode interferon (IPC) su identifikovane kao ćelije koje stvaraju tip 1 IFN u velikim količinama, a u vezi sa virusnom infekcijom. U krvi se nalazi malo IPC. Smatra se da limfociti iz periferne krvi čine 1% ili manje IPC. Međutim, IPC imaju veoma veliki kapacitet da stvaraju IFN. Kapacitet IPC za stvaranje IFN raste, na primer, 3000 pg/mL/104 ćelija. Odnosno, može da se kaže da najveći deo IFNα ili IFNβ u krvi, koji je nastao tokom viralne infekcije, dolazi iz IPC, mada ih je malo.
Sa druge strane, IPC su nediferencirani limfoidni dendriti za koje se smatra da su prekursorske ćelije dendrita. IPC mogu da se označe kao plazmacitoidni dendriti. IPC se diferenciraju u dendrite uz pomoć virusne stimulacije i indukovanja proizvodnje IFNy ili IL-10 od strane T-ćelija. IPC se takođe diferenciraju u dendrite uz pomoć IL-3 stimulacije. Diferencirani dendriti uz pomoć IL-3 stimulacije indukuju proizvodnju Th2 citokina (IL-4, IL-5, i IL-1 0) od strane T-ćelija. Tako, IPC imaju karakteristike koje im dozvoljavaju da se diferenciraju u različite dendrite nakon tačno određene stimulacije.
Prema tome, IPC imaju dva profila: ćelije koje proizvode IFN i prekursorske ćelije dendrita. Oba tipa ćelija imaju važnu ulogu u imuno-sistemu. Drugim rečima, IPC je veoma važna ćelija koja podržava imuno-sistem u brojnim aspektima.
Dokument koji nije patent 1: Shiozawa et al., Arthr. & Rheum. 35, 412, 1992
Dokument koji nije patent 2: Hopkins et al., Clin. Exp. Imunol. 73, 88, 1988
Dokument koji nije patent 3: Wada et al., Am. J. Gastroenterol. 90, 136, 1995
Dokument koji nije patent 4: Parez et al., Am. J. Hematol. 49, 365, 1995
Dokument koji nije patent 5: Bianco et al., Science, 16:294, 1540-1543, 2001
Dokument koji nije patent 6: Ju et al., Gene. 2004 Apr 28; 331: 159-64
Dokument koji nije patent 7: Colonna M et al., Seminars in Imunology 12: 121-127, 2000
Dokument koji nije patent 8: Nakajima H. et al., J. Imunology 162: 5-8. 1999
Dokument koji nije patent 9: Wilson LE et al., Semin Arthritis. Rheum. 32, 163-173, 2002
Dokument koji nije patent 10: Nestle FO et al., J. Exp. Med. 202, 135-143, 2005
Patent 1: WO03/12061 (Američka Objavljena Patentna Aplikacija Br. 2003-148316).
Razotkrivanje pronalaska
Problemi koji se trebaju rešiti sa ovim pronalaskom
Cilj ovoga pronalaska je da obezbedi antitelo koje veže transcript-7 koji je sličan imunoglobulinu (ILT7) sa ciljem da negativno reguliše delovanje IFN iz IPC.
Sredstva za rešavanje pomenutih problema
Sa ciljem da se reguliše delovanje humoralnog faktora poput IFN, poželjna je administracija antitela koja prepoznaju pomenuti faktor. Na primer, realizovan je pokušaj da se tretiraju auto-imune bolesti uz pomoć antitela protiv interleukina (IL)-1 ili IL-4 (Guler et al., Arthritis Rheum., 44. S307, 2001). Dodatno, pretpostavlja se da neutralizujuća antitela mogu da služe kao terapeutski agensi za auto-imune bolesti kao i za interferon (Stewart, TA. Cytokine Growth Factor Rev. 14; 139-154, 2003). Može da se predvidi da je isti pristup, kao šta je malopre opisano, efektivan i za IFN koji je proizveden uz pomoć IPC. Međutim, takav pristup se bazira na inhibiciji efekta humoralnog faktora nakon njegove proizvodnje. Kada bi proizvodnja željenog humoralnog faktora mogla da bude direktno kontrolisana, mogli bi se postići značajni terapeutski efekti. Antitela koja prepoznaju humani IPC su već poznata. Na primer, anti-BDCA-2 monoklonsko antitelo je humano monoklonsko antitelo specifično za IPC (Dzionek A. et al. J. Imunol. 165: 6037-6046, 2000). Pronađeno je da je anti-BDCA-2 monoklonsko antitelo efektivno u inhibiranju proizvodnje IFN preko humanih IPC (J. Exp. Med. 194: 1823-1834, 2001). Dodatno, bilo je prijavljeno da monoklonska antitela, koja prepoznaju ćelije koje kod miša proizvode interferon, inhibiraju proizvodnju interferona (Blood 2004 Jun 1; 103/11: 4201-4206. Epub 2003 Dec). Bilo je objavljeno da se smanjeni broj dendrita kod miševa javlja zbog monoklonskih antitela protiv plazmacitoidnih dendrita (J. Imunol. 2003, 171: 6466-6477).
Slično, bilo bi korisno da se obezbede antitela koja prepoznaju humane IPC i mogu da regulišu njihovo delovanje. Na primer, ovi pronalazači su već pokazali da antitelo, koje prepoznaje Ly49Q, specifično veže mišje IPC. Međutim, antitelo protiv Ly49Q ne interferiše sa delovanjem mišjih IPC (Blood, 1 april 2005, Vol. 105, Br. 7, i str. 2787-2792.; WO2004/13325). Sa druge strane, ILT7 je poznat kao molekul čija je specifična ekspresija primećena u plazmacitoidnim dendritima (Ju XS et al. & Gene. 2004 Apr 28; 331: 159-64.; WO03/12061). Međutim, nije bilo dobiveno niti jedno antitelo protiv ILT7. Prema tome, efekti antitela na IPC su takođe nepoznati. ILT7 je membranska belančevina koja sadrži imunoglobulinski motiv. Bila je objavljena kao jedan od molekula koji se eksprimiraju u ćelijama mijeloidnog sistema ili limfnog sistema (Colonna M et al., Seminars in Imunology 12:121-127, 2000). Mnoštvo molekula sa strukturama koje su analogne ILT7 se grupiše u ILT porodicu. ILT porodica je takođe strukturalno slična sa inhibitornim receptorima na ćelijama ubojicama (KIR). ILT7 ima četiri imunoglobulinska domena tipa C kao i drugi molekuli iz ILT porodice. Smatra se da ILT7 šalje aktivacione signale u ćeliju kao i ILT1, belančevine koja je slična ILT1, ILT8, i LIR6a. Potvrđeno je da se molekul koji pripada ILT porodici eksprimira u ćelijama hemocitnog sistema (Young et al., Imunogenetics 53: 270-278, 2001; "The KIR Gene Cluster. "Carrington, Mary & Norman, Paul. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US), NCBI; 2003).
Tada je, uz pomoć subtraktivne hibridizacije, detektovana visoka ekspresija ILT7 u plazmacitoidnim dendritima (PDC) i niska ekspresija ILT7 u dendritima proizišlih iz monocita (MDDC). ILT2 i ILT3 se eksprimiraju ne samo u PDC već takođe u DC dobivenih iz MDDC ili CD34 pozitivnih ćelija. Međutim, budući se mRNK u ILT7 specifično eksprimira u PDC, bilo je pronađeno da mRNK može da služi kao marker PDC. Dodatno, bilo je pronađeno da se u tom slučaju ekspresija ILT7 smanjuje uz pomoć stimulacije sa CpG (Ju XS et al. Gene. 2004 Apr 28; 331: 159-64.; WO03/12061).
Ovi pronalazači su potvrdili da je kod humanih IPC specifična ekspresija ILT7 ubrzana. Tada su ovi pronalazači pokušali da stvore antitela protiv ILT7 i da procene efekte. Na primer, molekuli koji čine ILT porodice poput ILT2 i ILT3 su veoma konzervisani, posebno u amino-kiselinskim sekvencama koje se odnose na izvan-ćelijske domene (Sl. 9). Ove ILT porodice pokazuju karakteristične ekspresione profile u različitim krvnim ćelijama. Prema tome, veoma je važan cilj da se dobije antitelo koje može da čini imunološku razliku između ostalih molekula iz ILT porodice i samog ILT7. Međutim, u stvari, bilo je teško da se proizvede antitelo koje se specifično veže na humane IPC koristeći ILT7 kao imunogena zbog prepreka koje su opisane ispod.
Generalno, belančevina koja je proizvedena uz pomoć tehnologije genske rekombinacije se koristi kao imunogen sa ciljem da se dobije antitelo koje prepoznaje tragove (veoma male količine) belančevina koje su izvedene iz živih organizama. Ovi pronalazači su pokušali da eksprimiraju humani ILT7 na bazi informacije bazne sekvence cDNK humanog ILT7, koja je poznata od pre, i amino-kiselinske sekvence koja je kodirana sa baznom sekvencom (GenBank pristupni br. NM_012276). U normalnim uslovima, međutim, ovi pronalazači nisu uspeli da proizvedu humani ILT7 kao rekombinanta. Delomična amino-kiselinska sekvenca prirodne belančevine je često korišćena kao imunogen sa ciljem da se dobije belančevina antitela. Međutim, postoji svega nekoliko amino-kiselinskih sekvenca koje su specifične za humani ILT7 zbog toga šta je homologija amino-kiselinske sekvence veoma visoka između članova ILT porodice. Dodatno, potrebno je da se izdvoji region koji se sastoji od dela koji se prepoznaje kao epitop od strane antitela na površini ćelija sa ciljem omogućavanja pomenutih antitela da prepoznaju molekule na površini ćelija. Prema tome, smatralo se da stvaranje antitela koje je specifično za ILT7, uz pomoć fragmenta sa amino-kiselinskom sekvencom kao imunogenom, nije realistično.
Ovi pronalazači su pokazali da antitelo, koje se veže na IPC, može da se dobije uz pomoć specijalnog imunogena u takvim uslovima. Nadalje, ovi pronalazači su pronašli da antitelo koje je tako dobiveno specifično prepoznaje humane IPC i dodatno pokazuje efekt regulisanja njihovog delovanja čime je kompletovan ovaj pronalazak. Drugim rečima, ovaj pronalazak se odnosi na sledeće anti-ILT7 antitelo, na postupak za njegovu proizvodnju, i na njegovu upotrebu.
Efekti ovoga pronalaska
Ovaj pronalazak obezbeđuje imunogen koji je koristan u proizvodnji antitela koje se veže na humani ILT7, ali se ne veže na humani ILT1, humani ILT2 i humani ILT3, i suprimira proizvodnju interferona-α (IFNα) u ćelijama koje eksprimiraju ILT7, ili fragmenta koji obuhvata njegov region koji veže antigen. Postupak za proizvodnju takvog anti-humanog ILT7 antitela koristi pomenuti imunogen.
ILT7 je membranska belančevina koja pripada ILT porodici. Posebno, amino-kiselinska sekvenca iz izvan-ćelijskog regiona je veoma konzervisana među ILT porodicama. Prema tome, izuzetno je taško da se proizvede antitelo koje može da razlikuje između ILT porodica koristeći opšte postupke imunizovanja. Ovi pronalazači su pokazali da pomenuto antitelo, koje prepoznaje humani ILT7, može lako da se dobije uz pomoć životinjskih ćelija u kojima se ILT7 ko-eksprimira sa belančevinom iz ćelijske membrane. Anti-ILT7 antitelo, koje može da se dobije uz pomoć ovog pronalaska, ima visoku specifičnost koja razlikuje ćelije koje eksprimiraju druge ILT familije od onih koje eksprimiraju humani IPC.
U preferiranoj izvedbi, anti-humano ILT7 antitelo koje je obezbeđeno sa ovim pronalaskom se veže na humane IPC. Dodatno, pomenuto antitelo iz ovoga pronalaska specifično prepoznaje humane IPC. Prema tome, korisno je kod detektovanja i izolovanja IPC. IPC je ćelija koja najviše proizvodni interferon tipa 1. Prema tome, detektovanje i izolovanje su važni u dijagnostici i istraživanju bolesti koji uključuju IPC poput auto-imunih bolesti. Posebno, u skladu sa nalazima ovih pronalazača, ekspresija ILT7 u IPC nije smanjena kada je IFNα prisutan. Ekspresija IFNα se često ostvaruje kod pacijenata sa auto-imunim bolestima. Ovo znači da anti-ILT7 antitelo iz ovoga pronalaska može da se koristi za detektovanje i izolovanje IPC kod pacijenata sa auto-imunim bolestima kod kojih je ekspresija IFNα pojačana.
Anti-ILT7 antitelo koje je obezbeđeno uz pomoć ovoga pronalaska poseduje efekt koji reguliše delovanje humanih IPC u jednoj preferiranoj izvedbi. Prema tome, anti-ILT7 antitelo iz ovoga pronalaska može da se koristi sa ciljem da se inhibira delovanje IPC. Kao šta je opisano ranije, ekspresija ILT7 u IPC nije smanjena u prisutnosti IFN. Prema tome, ako se koristi inhibicija delovanja IPC uz pomoć pomenutog antitela, može da se očekuje terapeutski efekt kod pacijenata sa auto-imunim bolestima u kojima je ekspresija IFNα pojačana.
Veoma mala količina IPC proizvodi veliku količinu IFN. Za neutralizovanje IFN potrebno je onoliko antitela koliko i molekula IFN. Međutim, ćelijsko aktivisanje je direktno inhibirano u ovom pronalasku. Kao rezultat, može da se očekuje snažan inhibitorni efekt na IFN čak i ako se koristi manja količina antitela u odnosu na neutralizovanje uz pomoć anti-IFN antitela. Nadalje, u slučaju kada se IFN kontinuirano proizvodi, predviđa se da je neutralizovanje uz pomoć IFN samo privremeno. U ovom pronalasku, budući je delovanje IPC inhibirano, može da se očekuje inhibitorni efekt na proizvodnju IFN tokom dugog vremenskog perioda.
Kratki opis Slika
Sl. 1a predstavlja fotografiju istraživanja ekspresije mRNK ILT7 gena uz pomoć postupka RT-PCR. Radi se o rezultatu analizirane ekspresije mRNK ILT7 gena iz humanih imunocita.
Sl. 1b predstavlja dijagram u kojem je ekspresija mRNK ILT7 gena u različitim humanim tkivima i ćelijama upoređena i ispitana uz pomoć kvantitativnog PCR postupka. Horizontalna os prikazuje ispitana tkiva i ćelije, a vertikalna os prikazuje nivo ekspresije ILT7, koji je standardizovan u skladu sa nivoom ekspresije GAPDH gena.
Sl. 2 predstavlja dijagram koji prikazuje strukture ILT7 belančevine, pri čemu Sl. 2(a) prikazuje amino-kiselinske sekvence ILT7 belančevine i još pokazuje predviđenu sekvencu signala za sekreciju i transmembranski domen, a Sl. 2(b) prikazuje shematski dijagram ILT7 belančevina koje su kodirane uz pomoć konstruisanih ekspresionih vektora.
Sl. 3 predstavlja dijagram koji prikazuje rezultat nakon uvođenja ILT7 ekspresionog vektora i FcRy ekspresionog vektora u ćeliju, pri čemu je ekspresija ILT7 molekula na površini ćelije ispitana uz pomoć FCM. Horizontalna os prikazuje intenzitet fluorescencije koje je detektovan kod anti-FLAG antitela, naime, intenzitet površinske ekspresije ILT7 molekula na koje je bio vezan FLAG privesak, a vertikalna os prikazuje broj ćelija.
Sl. 4 prikazuje fotografije kada su ILT7 ekspresioni vektor i FcRy ekspresioni vektor bili uvedeni u ćelije, a asocijacija molekula je analizirana uz pomoć imunoprecipitacije i Western-blota. Leva strana dijagrama prikazuje rezultate kada je ILT7 molekul bio blotiran sa anti-FLAG antitelom nakon imunoprecipitacije FcRy molekula sa anti-myc antitelom (gornji crtež), a FcRy molekul je bio blotiran sa anti-myc antitelom (donji crtež). Slično, leva strana dijagrama prikazuje slučaj kada je ILT7 molekul bio blotiran sa anti-FLAG antitelom nakon imunoprecipitiranja FcRy molekula sa anti-FLAG antitelom (gore), a FcRy molekul je bio blotiran sa anti-myc antitelom (ispod) .
Sl. 5 je fotografija u kojoj je glikozilacija ILT7 molekula bila ispitana uz pomoć uvođenja ILT7 ekspresionog vektora i FcRy ekspresionog vektora u ćeliju i tretmanom sa N-glikozidazom. Leva strana fotografije prikazuje veličinu ILT7 u slučaju kada ILT7 nije bio tretiran sa N-glikozidazom, a desna strana fotografije prikazuje veličinu ILT7 u slučaju kada je tretman sa N-glikozidazom proveden.
Sl. 6a je dijagram u kojem je odgovor proizvedenog monoklonskog anti-ILT7 antitela bio ispitan uz pomoć FCM analize. (a) prikazuje rezultat vezanja anti-ILT7 antitela na IPC frakciju BDCA-2 pozitivno analiziran uz pomoć humanih limfocita periferne krvi i dvostrukog bojanja sa anti-ILT7 antitelom i anti-BDCA-2 antitelom. Vertikalna os prikazuje odgovor BDCA-2 antitela, a horizontalna os prikazuje odgovor na svako od proizvedenih anti-ILT7 antitela.
Sl. 6b je dijagram u kojem je pomenuti odgovor proizvedenog monoklonskog anti-ILT7 antitela ispitan uz pomoć FCM analize. (b) prikazuje rezultat kada je vezanje anti-ILT7 antitela na ILT7 molekul bilo ispitano uz pomoć 293T ćelija u kojima su bili uvedeni ILT7 i FcRy ekspresioni vektori. Vertikalna os prikazuje odgovor anti-FLAG antitela, naime, intenzitet ekspresije ILT7 molekula na koje je bio vezan FLAG privesak, a horizontalna os prikazuje odgovor odgovarajućeg anti-ILT7 antitela.
Sl. 7 je dijagram u kojem među proizvedenim monoklonskim anti-ILT7 antitelima, odgovor dva klona humanih limfocita iz periferne krvi je bio ispitan uz pomoć FCM analize. Tri grafikona na levoj strani prikazuju rezultate #11, a tri grafikona na desnoj strani prikazuje rezultate #17. Na levoj strani dijagrama, svaka os sa oznakom ILT7 prikazuje odgovor ILT7#11. Slično, na desnoj strani dijagrama, svaka os sa oznakom ILT7 prikazuje odgovor ILT7#17.
Sl. 8 prikazuje rezultat ispitivanja veznog delovanja proizvedenih monoklonskih anti-ILT7 antitela ILT7#11 i ILT7#17 u humanim limfocitima u odnosu na anti-BDCA-2 antitela. Vertikalna os prikazuje odgovor anti-CD123 antitela, a horizontalna os prikazuje odgovor svakog antitela. Odnosno, svako antitelo se veže na deo CD123 pozitivne ćelije. Ovaj dijagram prikazuje rezultate analize odgovor kada su limfociti stimulisani sa CpGs i IFNα.
Sl. 9a je dijagram koji prikazuje amino-kiselinske sekvence porodice molekula sa visokom homologijom prema ILT7 molekulima. Svaka amino-kiselinska sekvenca izvan-ćelijskog regiona je uglavnom prikazana kao alajniranje (poravnanje); Sl. 9b je nastavak Sl. 9a; a Sl. 9c je nastavak Sl. 9b.
Sl. 10 prikazuje rezultat analize odgovora proizvedenih monoklonskih anti-ILT7 antitela ILT7#11 i ILT7#17 protiv ILT1, ILT2, i ILT3 molekula uz pomoć ćelija koje su sadržavale njihove ekspresione vektore. Gornji dijagram prikazuje rezultate analize odgovora u ćelijama u kojima ILT7 molekuli sa FLAG priveskom su bili ko-eksprimirani sa FcRγ. Donji dijagram prikazuje rezultate za odgovor u ćelijama u kojima su bili uvedeni ILT1, ILT2, ILT3, i FcRy (levi dijagram: ILT7#11, desni dijagram: ILT7#17). Horizontalna os prikazuje odgovor svakog anti-ILT7 antitela.
Sl. 11 je dijagram koji prikazuje efekt proizvedenih monoklonskih anti-ILT7 antitela ILT7#11 i ILT7#17 na interferogeni kapacitet humanih limfocita. U pomenutom dijagramu, horizontalna os prikazuje IFNα koncentraciju u supernatantu kulture kada su humani limfociti stimulirani sa virusom influence, a vertikalna os prikazuje tretirana antitela. Termin "bez infekcija" pokazuje rezultat iz ćelija koje nisu bile stimulisane uz pomoć virusne influence.
Sl. 12 je dijagram koji prikazuje CDC delovanje na proizvedena monoklonska anti-ILT7 antitela ILT7#37, ILT7#28, i ILT7#33. Čak i kada su korišćena monoklonska anti-ILT7 antitela dobivena iz bilo kojeg hibridoma, 80% ili više CDC aktivnosti je zadržano kod koncentracije antitela od 0.1 µg/ml ili više. U slučaju antitela različitih od monoklonskog anti-ILT7 antitela, CDC aktivnost u ciljanim ćelijama nije bila primećena.
Sl. 13 je dijagram koji prikazuje internalizovanje proizvedenih monoklonskih anti-ILT7 antitela ILT7#17, ILT7#26, ILT7#37, ILT7#28, i ILT7#33 u ciljane ćelije.
Intenzitet fluorescencije APC je indikator količine imuno-kompleksa ILT7-anti-ILT7 antitelo koji je prisutan na površini ćelije pre inkubacije i može da se detektuje bez razlike da li je imuno-kompleks ILT7-anti-ILT7 antitelo prisutan na površini ciljane ćelije ili je ugrađen u samu ćeliju nakon inkubacije. Sa druge strane, intenzitet fluorescencije FITC je indikator količine imuno-kompleksa ILT7-anti-ILT7 antitelo koji ostaje na površini ćelija nakon inkubacije. Odnosno, intenzitet fluorescencije FITC se smanjuje internalizovanjem.
Pokazano je da je humani ILT7 (transkript-7 sličan imunoglobulinu) molekul koji se specifično eksprimira u plazmacitoidnim dendritima (Gene. 2004 Apr 28; 331:1 59-64.; WO03/12061). Alternativno, poznato je da humani ILT7 može da se koristi kao indikator za prognozu limfoma (WO2005/24043 ). Međutim, postupak za proizvodnju antitela koje bi bilo sposobno da prepozna humani ILT7 nije uspostavljen (pronađen).
Humani ILT7 se sastoji od 499 amino-kiselinskih ostataka kao šta je prikazano u SEQ ID Br: 2 i predstavlja transmembransku belančevinu tipa 1 koja obuhvata četiri domena slična imunoglobulinu u strukturi i jedan transmembranski region (445-466; od 429 do 450 u SEQ ID Br: 2). Među 444 amino-kiselinska ostatka uključujući N-terminalni, 16 amino-kiselinskih ostataka (od -15 do -1, u SEQ ID Br: 2) su signalne sekvence, a 17 do 444 amino-kiselinska ostatka (od 1 do 428, u SEQ ID Br: 2) čine izvan-ćelijski domen. Sa druge strane, C-terminalni region je intra-ćelijski domen. Najveći broj delova humanog ILT7 su izvan-ćelijski domeni, a 33 amino-kiselinska ostatka čine intra-ćelijski domen (od 467 do 499; od 451 do 483, u SEQ ID Br: 2). Nije predviđeno da motiv, koji je uključen u signalizaciji, bude prisutan u intra-ćelijskom domenu. Puna dužina amino-kiselinske sekvenca iz humanog ILT7 je prikazana u SEQ ID Br: 2, a bazna sekvenca cDNK koja kodira amino-kiselinsku sekvencu je prikazana u SEQ ID Br: 1. U ovom slučaju, kodirajući regioni zrelog peptida (72)..(1520), prikazani u SEQ ID Br: 1, ne sadrže kodone za terminaciju i inicijaciju. Odnosno, sekvence koje kodiraju belančevinu koja sadrži kodone za terminaciju i inicijaciju u SEQ ID Br: 1 se prostiru od 24 do 1523.
Smatra se da se signal liganda prenosi u ćelije uz pomoć asocijacije humanog ILT7 sa molekulom za prenos signala. Na primer, najveći deo γ-lanaca iz Fc receptora je prisutno u ćelijama. Dodatno, intra-ćelijski domen sadrži imunoreceptorski aktivacioni motiv na bazi tirozina (ITAM) koji je uključen u signaliziranju. ITAM je deo amino-kiselinske sekvence, koji je uobičajeno prisutan kod adapter-molekula koji su povezani sa imunoreceptorima poput Fc receptora. Motiv poput YxxL (SEQ ID Br: 76), koji je meta za tirozinsku fosforilaciju, se sadrži u ITAM, a signal se prenosi uz pomoć fosforilacije. Poznati primeri molekula koji prenosi signal, koji obuhvata ITAM koji je intra-ćelijski domen, uključuju CD3ζ i DAP12 osim γ-lanaca Fc receptora. Među pomenutim molekulima koji prenose signal, molekuli koji su povezani sa humanim ILT7 se smatra da su γ-lanci Fc receptora. Do sada nije pronađen ligand koji bi se vezao na humani ILT7.
Ovi pronalazači su potvrdili da se ILT7 specifično eksprimira u humanim IPC koristeći se analizom genske ekspresije. Ovi pronalazači su smatrali da će biti korisno da se ispitaju IPC sa ciljem da se vidi da li može imunološki da se dobije antitelo koje je sposobno da razlikuje humani ILT7 od ostalih molekula. Međutim, u ILT porodici postoje mnogi molekuli sa sličnim strukturama, uključujući ILT7. Molekuli poput ILT1, ILT2, ILT3, ILT4, ILT5, ILT6, ili LIR-8 sadrže visoko homologne amino-kiselinske sekvence, posebno u svojim izvan-ćelijskim domenima. Prema tome, ovi pronalazači su smatrali da je teško ostvarivo da se dobije antitelo koje može da razlikuje između pomenutih molekula koristeći peptidni domen koji sadrži delomičnu amino-kiselinsku sekvenca koja sadrži izvan-ćelijski domen kao imunogen. Zbog toga su ovi pronalazači pokušali da proizvedu antitelo protiv humanog ILT7 koristeći ćelije koje eksprimiraju humani ILT7 kao imunogene.
Međutim, upotreba opštih ekspresonih vektora ne omogućava ekspresiju cDNK humanog ILT7 u životinjskim ćelijama. Poznato je da se ILT1 molekul koji ima strukturu veoma sličnu sa ILT7 spaja sa γ-lancem Fc receptora. Odnosno, kada su ćelije u kojima se eksprimira γ-lanac Fc receptora, poput RBL (bazofilna leukemija pacova) ćelija i P815 (mišji mastocitom) ćelija, korišćene kao ćelije domaćini, na površini ćelija je bila primećena ekspresija ILT1. Međutim, ako se pokušalo eksprimirati ILT1 u 293 ćelijama u kojima γ-lanac Fc receptora nije bio eksprimiran, ekspresija na površini ćelija nije bila primećena. Sa druge strane, bilo je pokazano da ekspresija ILT1 na površini ćelija može da se potvrdi kada se ILT1 ko-eksprimira sa γ-lancem Fc receptora (Nakajima H. et al., J. Imunology 162:5-8.1999). Međutim, ne postoji informacija o imunogenu za proizvodnju ILT7 antitela.
Kao sažetak, RBL ćelije u kojima je uveden ILT1 gen se koriste kao imunogeni za proizvodnju ILT1 antitela. Ovi pronalazači su pokušali da proizvedu ILT7 antitela koristeći se sa kombinacijom RBL ćelija sa ILT7 genom na isti način kao šta je opisano. Međutim, čak i kada je pokušano da se ILT7 eksprimira u RBL ćelijama (P815), ekspresija ILT7 na površini ćelije nije primećena, pa prema tome ne može da se koristi kao imunogen.
Ovi pronalazači su proveli seriozno istraživanje sa ciljem da dobiju antitelo koje je sposobno da prepozna humani ILT7. Kao rezultat, ovi pronalazači su pronašli da se željeno antitelo može proizvesti uz pomoć korišćenja specifičnih transformisanih ćelija (kao imunogen) čime su kompletovali ovaj pronalazak. Odnosno, ovaj pronalazak se odnosi na monoklonsko antitelo koje se veže na humani ILT7, pri čemu se ne veže na niti jedan od sledećih: humani ILT1, humani ILT2 i humani ILT3, i suprimira proizvodnju interferona-α (IFNα) u ćelijama koje eksprimiraju ILT7, ili na fragment koji sadrži njegovo vezno mesto za antigen.
U ovom pronalasku, humani ILT7 može da se definiše kao prirodni molekul koji se eksprimira u humanim IPC ili kao molekul koji je imunološki ekvivalentan sa ILT7 koji se eksprimira u humanim IPC. U ovom pronalasku, vezanje antitela na humani ILT7 može da se potvrdi, na primer, kako sledi.
Potvrda na osnovi odgovora prema humanim ćelijama:
U skladu sa nalazima ovih pronalazača, specifična ekspresija humanog ILT7 je primećena u humanim IPC. Originalno, humani ILT7 je izolovan kao gen čija se ekspresija primećuje u plazmacitoidnim dendritima (Blood. 2002 100; 3295-3303, Gene. 2004 Apr 28; 331:159-64). Dodatno, poznato je da može da se koristi kao marker za plazmacitoidne dendrite (WO03/12061). Pretpostavlja se da plazmacitoidni dendriti i IPC su uglavnom identične ćelijske populacije ili su njihovu glavni delovi zajednički. Prema tome, ne postoji kontroverza između ovih saznanja i nalaza ovih pronalazača.
Razmatrajući takav ekspresioni profil humanog ILT7, najpre, vezna aktivnost IPC ili plazmacitoidnih dendrita kod barem određene podgrupe je najvažnija karakteristika antitela koje se veže na humani ILT iz ovoga pronalaska. Markeri na površini ćelija koji su specifični za odgovarajuće ćelijske populacije mogu da se koriste sa ciljem da se odredi da li je određena ćelija IPC ili plazmacitoidni dendrit. Na primer, vezanje na željene ćelije može da se potvrdi uz pomoć dvostrukog bojanja sa antitelom koje se veže na površinske ćelijske markere i sa antitelom čija se vezna aktivnost treba proveriti. Odnosno, IPC iz ovoga pronalaska obuhvataju, na primer, ćelije koje eksprimiraju BDCA2.
Potvrda na bazi odgovora na transformirane ćelije koje eksprimiraju humani ILT7 gen:
Ovi pronalazači su pronašli da je jedna imunološka karakteristika ILT7, koji se eksprimira u humanim IPC, bila obnovljena kada je ekspresija humanog ILT7 gena provedena u specifičnim uslovima. Prema tome, odgovor na humani ILT7 može takođe da se potvrdi na bazi odgovora antitela na ćelije u kojima je umetno uveden gen koji kodira ILT7. Naime, ovaj pronalazak se odnosi na monoklonsko antitelo koje obuhvata amino-kiselinsku sekvencu koja čini izvan-ćelijski domen i može da se veže na molekul koji se ko-eksprimira sa molekulom koji prenosi signal ili se odnosi na fragment koji obuhvata njegov region za vezanje antigena. U ovom slučaju, izvan-ćelijski domen se sastoji od amino-kiselinske sekvence koja odgovara odsečku od 17. do 444. pozicije u N-terminalnoj amino-kiselinskoj sekvenci koja je prikazana u SEQ ID Br: 2 (od 1 do 428 u SEQ ID Br: 2).
Na primer, imunološka karakteristika ILT7 koji se eksprimira u humanim IPC se održava u ćelijama koje su ko-transfektovane sa ekspresionim vektorom koji sadrži DNA koja kodira humani ILT7 i ekspresionim vektorom koji sadrži DNA koja kodira molekul koji prenosi signal. Prema tome, transformisana ćelija, koja ko-eksprimira humani ILT7 i molekul koji prenosi signal, je preferirana za potvrdu vezne sposobnosti antitela prema izvan-ćelijskog domena iz humanog ILT7 iz ovog pronalaska. U ovom pronalasku je poželjno da se kao kontrola koristi ćelija koja nije transformirana kada se pomenuti odgovor antitela potvrđuje uz pomoć korišćenja transformirane ćelije. Nadalje, takođe je važno da se potvrdi da vezanje antitela nije detektovano uz pomoć istih ćelija domaćina koje eksprimiraju molekul koji prenosi signal (kao kontrola).
U ovom pronalasku, molekul, koji indukuje ekspresiju humanog ILT7 na površini ćelija, može da se koristi kao molekul za prenos signala za potrebe ko-ekspresije. Pomenuti molekul koji prenosi signal iz ovog pronalaska može takođe da se definiše kao molekul koji može da poseduje imunološku karakteristiku prirodnog humanog ILT7 barem na pomenuti izvan-ćelijski domen iz ILT7 molekula u ćelijama koje eksprimiraju ILT7. Kao šta se ovde koristi, termin "imunološka karakteristika" prirodnog humanog ILT7 označava prepoznavanje od strane antitelom koje veže humane IPC.
Specifično, preferirano je da se koristi γ-lanac Fc receptora ili DAP12 kao molekul koji prenosi signal. U ovom pronalasku, pomenuti γ-lanac Fc receptora je posebno preferiran kao molekul koji prenosi signal. Pomenuti γ-lanac Fc receptora je molekul koji poseduje amino-kiselinske sekvence prikazane u SEQ ID Br: 16. Pomenuti molekul koji prenosi signal može da bude fragment koji je dug kao i humani ILT7 koji se ko-eksprimira i se nalazi na površini ćelije. Dug kao i humani ILT7 koji se ko-eksprimira je lokalizovan na površini ćelije, pri čemu je mutacija ili adicija amino-kiselinske sekvenca dozvoljena u amino-kiselinskim sekvencama koje su prikazane u SEQ ID Br: 16. Odnosno, ovaj pronalazak obezbeđuje postupke za proizvodnju ćelija koje proizvode monoklonsko antitelo koje se veže na humani ILT7, pri čemu ne veže niti jedan od sledećih: humani ILT1, humani ILT2 i humani ILT3, i suprimira proizvodnju interferona-α (IFNα) u ćelijama koje eksprimiraju ILT7, ili neki fragment koji obuhvata njegov region vezanja antigena, pri čemu pomenuti postupci obuhvataju sledeće korake:
(1) administriranja ne-ljudskoj životinji ćeliju koja zadržava komponente pod (a) i (b) tako da mogu da se eksprimiraju:
a. egzogeni polinukleotid koji kodira amino-kiselinsku sekvencu koja sadrži izvan-ćelijski domen humanog ILT7; i
b. egzogeni polinukleotid koji kodira γ-lanac Fc receptora (FcRγ); i
(2) proizvodnje i selektiranja ćelija koje proizvode antitelo koje može da se veže na humani ILT7 iz samih ćelija koje proizvode pomenuto antitelo, a koje potiču od pomenute ne-humane životinje; i
(3) uzgajanja ćelija koje su na taj način selektirane i obnavljanja monoklonskog antitela iz pomenute kulture.
Nakon toga, kao antitelo koje se veže na humani ILT7 iz ovoga pronalaska, preferirana je upotreba antitela kod kojeg nije primećena unakrsna reakcija sa ćelijskim populacijama za koje se zna da eksprimiraju ILT porodice koje su različite od ILT7. Specifično, kao antitelo koje se veže na humani ILT7 iz ovoga pronalaska, preferirano je da se koristi antitelo kod kojeg vezanje na pomenute ćelijske populacije, za koje se zna da eksprimiraju ILT porodice koje su različite od ILT7, ne može da se primeti u istim uslovima kao i uslovi kod kojih je vezanje na IPC potvrđeno. Kao šta je već opisano, na primer, ILT2 i ILT3 se eksprimiraju ne samo u PDC već takođe i u DC koje su dobivene iz MDDC ili CD34 pozitivnih ćelija (Gene. 2004 Ap 28; 331: 159-64). Sa druge strane, ekspresija ILT7 ne može da se detektuje zbog diferencijacije IPC u dendrite. Prema tome, pomenuto antitelo ne može da detektuje vezanje na DC koje su dobivene iz MDDC ili CD34 pozitivnih ćelija u uslovima kod kojih se vezanje na IPC može potvrditi pri čemu je takvo vezanje moguće za pomenuto antitelo koje se veže na humani ILT 7 iz ovoga pronalaska.
Sledeći ekspresioni obrasci prema drugim molekulima iz ILT porodice su poznati ("The KIR Gene Cluster" Carrington, Mary & Norman, Paul. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US), NCBI; 2003, Gene. 2004 Apr 28; 331: 159-64). Prema tome, antitelo koje može da veže humani IPC ili PDC i čije vezanje na sledeće ćelije ne može da se potvrdi je uključeno u antitelu koje ima specifičnost prema ILT7:
ILT1; ćelije mijeloidne linije (monociti, DC izvedeni iz monocita, makrofagi);
ILT2; PDC, B ćelije, CD34 pozitivne ćelije, DC izvedeni iz CD34 pozitivnih ćelija, i DC izvedeni iz monocita;
ILT3; PDC i DC;
ILT5; monociti, DC izvedeni iz CD34 pozitivnih ćelija, i DC izvedeni iz monocita; i
ILT8; ćelije monocitne linije.
Odnosno, pomenuto monoklonsko antitelo, koje se veže na izvan-ćelijski domen iz humanog ILT7 iz ovog pronalaska preferirano obuhvata monoklonsko antitelo koje ima sledeće imunološke karakteristike:
a) pomenuto monoklonsko antitelo se veže na humane IPC; i
b) vezanje pomenutog monoklonskog antitela na jednu ili više ćelija koje su izabrane iz grupe koja obuhvata monocite, makrofage, B ćelije, CD34 pozitivne ćelije, i dendrite izvedene iz ove ćelije ne može da se potvrdi u uslovima vezanja na humane IPC.
Kao monoklonsko antitelo iz ovoga pronalaska, preferirana je upotreba antitela u kojem vezanje na monocite, makrofage, B ćelije, CD34 pozitivne ćelije, i dendrite izvedene iz pomenutih ćelija ne može da se potvrdi u uslovima za vezanje, posebno na humane IPC.
Alternativno, pomenuto monoklonsko antitelo, koje se veže na izvan-ćelijski domen iz humanog ILT7 iz ovoga pronalaska, preferirano obuhvata monoklonsko antitelo koje ima sledeće imunološke karakteristike:
c) pomenuto monoklonsko antitelo se veže na transformisane ćelije koje su ko-transfektovane sa ekspresionim vektorom koji nosi DNA koja kodira humani ILT7 i koja može da se eksprimira i ekspresionim vektorom koji nosi DNA koja kodira za molekul za prenos signala koji može da se eksprimira;
d) pomenuto vezanje na ćeliju domaćina pre transformacije ne može da se potvrdi u uslovima za vezanje na pomenute ko-transfektovane ćelije kao šta je opisano pod c);
ili pomenuto monoklonsko antitelo iz ovoga pronalaska obuhvata monoklonsko antitelo koje ima sledeće imunološke karakteristike:
e) pomenuto vezanje na ćeliju domaćina koja eksprimira samo molekul koji prenosi signal ne može da se potvrdi u uslovima za vezanje na ko-transfektovane ćelije kao šta je opisano pod c).
U ovom pronalasku, činjenica da monoklonsko anti-ILT7 antitelo ne reaguje sa ILT porodicom drugih molekula može da se potvrdi uz korišćenje ćelija u kojima se eksprimira svaka ILT porodica. Odnosno, kod poticane ekspresije, cDNK za ILT porodicu amino-kiselinskih sekvenca se uvodi u odgovarajuću ćeliju domaćina. Monoklonsko anti-ILT7 antitelo čije unakrsno vezanje treba da se potvrdi se dovodi u kontakt sa dobivenim transformisanim ćelijama. Tada može da se potvrdi da vezanje pomenutog antitela na pomenutu ćeliju, koja eksprimira molekule ILT porodice koji nisu ILT7, nije primećeno, šta znači da je pomenuto antitelo sposobno da imunološki razlikuje između ILT7 i drugih molekula iz ILT porodice. Na primer, u primerima koji su opisani ispod, činjenica da monoklonsko anti-ILT7 antitelo, dobiveno uz pomoć ovoga pronalaska, ne reaguje sa ILT1, ILT2, i ILT3 je potvrđena. Prema tome, preferiran primer monoklonskog antitela iz ovoga pronalaska je monoklonsko antitelo koje se veže na ILT7 pri čemu vezanje na ILT1, ILT2, i ILT3 ne može da se detektuje u istim uslovima.
Posebno, ILT2 i ILT3 su geni čija je ekspresija u IPC potvrđena (Ju et al. Gene 331, 159-164, 2004). Međutim, ovi molekuli mogu da pokažu ekspresione profile koji su jedinstveni za svaki tip ćelije u zavisnosti o odgovarajućem nivou diferencijacije u IPC ili uslovima poput pomenutog stimulisanja sa virusima ili drugim citokinima. Upotreba antitela, koje je sposobno da imunološki razlikuje pomenute molekule iz ILT porodice od molekula ILT7, dozvoljava specifično detektovanje promena u ekspresiji ILT7.
Vezanje monoklonskog antitela čija se vezna aktivnost treba potvrditi na različitim tipovima ćelija može da se provede na bazi, na primer, principa protočne citometrije. Sa ciljem da se potvrdi odgovor antitela na bazi pomenutih principa protočne citometrije, potrebno je da se antitela označe sa molekulom ili atomskom grupom koja proizvodi signal koji može da se detektuje unapred. Opšte uzeto, koriste se fluorescentne ili luminescentne oznake. Sorter ćelija koji se aktiviše na bazi fluorescencije (FACS) može da se koristi sa ciljem da se analizira vezanje fluorescentno-označenih antitela na ćelije na bazi principa protočne citometrije. Upotreba FACS dozvoljava efikasnu potvrdu vezanja mnoštva antitela na mnoštvo ćelija.
Specifično, na primer, antitelo A za koje je prethodno pokazano da je sposobno da identifikuje IPC i antitelo B čije vezne karakteristike prema IPCS treba da se analiziraju reaguju sa ćelijskim populacijama koje sadrže IPC istovremeno. Antitelo A i antitelo B su označeni sa fluorescentnim signalima koji se međusobno razlikuju unapred. U slučaju kada su oba signala detektovana na istim ćelijskim populacijama, vezanje pomenutih antitela na iste ćelijske populacije može da se potvrdi. Drugim rečima, bilo je pronađeno da oba antitela, A i B, imaju iste vezne karakteristike. U slučaju kada su pomenuta bila vezena na različite ćelijske populacije, jasno je da oba antitela imaju različite vezne karakteristike.
Preferiran primer monoklonskog antitela u ovom pronalasku može da obuhvata monoklonsko antitelo koje je proizvedeno uz pomoć hibridoma ILT7#11 ili ILT7#17. Hibridom ILT7#11 i hibridom ILT7#17 se nalaze u National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary pod pristupnim br. FERM BP-10704 i FERM BP-10705, 21 oktob., 2005.
Specifični sadržaj depozitorija je sledeći:
(a) Apelacija i adresa institucije koja je obavila depozitorij, Apelacija: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, adresa: AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan (poštanski broj 305-8566)
(b) Datum depozitorija: 21 oktobar 2005
(c) Pristupni broj: FERM BP-10704 (hibridom ILT7#11)
(d) Pristupni broj: FERM BP-10705 (hibridom ILT7#17).
Pomenuto monoklonsko antitelo iz ovoga pronalaska može da bude fragment koji sadrži njegov region vezanja antigena. Na primer, fragment antitela koji sadrži pomenuti region vezanja antigena koji je dobiven uz pomoć encimske digestije IgG može da se koristi kao pomenuto antitelo u ovom pronalasku. Specifično, fragmenti antitela poput Fab i F(ab')2 mogu da se dobiju uz pomoć digestije sa papainom ili pepsinom. Treba da se zna da oni fragmenti antitela koji mogu da se koriste kao molekuli antitela imaju afinitet pomenutih antitela. Alternativno, antitela koja su konstruisana uz pomoć genetičke rekombinacije mogu da se koriste ako može da se ostvari zadovoljavajuća aktivnost vezanja antigena. Primeri pomenutih antitela koja su konstruisana uz pomoć genetičke rekombinacije obuhvataju himerna antitela, CDR-transplantirana antitela, pojedinačne lance Fv, dijatela, linearna antitela, i polispecifična antitela koja se sastoje od fragmenata antitela. Poznato je da ova antitela mogu da se dobiju uz pomoć korišćenja monoklonskih antitela ili ćelija koje proizvode antitelo.
Pomenuto monoklonsko antitelo iz ovoga pronalaska može da se dobije uz pomoć korišćenja specifično transformisane ćelije (kao imunogen). Odnosno, ovaj pronalazak se odnosi na postupak za proizvodnju ćelija koje proizvode monoklonsko antitelo koje se veže na izvan-ćelijski domen iz humanog ILT7, koji obuhvata sledeće postupke:
(1) administriranje ćelije koja eksprimira egzogenu belančevinu koja obuhvata izvan-ćelijski domen iz humanog ILT7 i egzogeni molekul koji je povezan sa humanim ILT7 sa ciljem da se životinja imunizuje; i
(2) selektiranje ćelija koje proizvode antitelo koje može da se veže na humani ILT7 iz samih ćelija koje proizvode antitelo u imunizovanim životinjama.
Ćelije koje proizvode antitelo koje su dobivene na pomenuti način ili imortalizovane ćelije koje proizvode antitelo se uzgajaju, a željena monoklonska antitela mogu da se obnove iz pomenutih kultura. Šta se tiče postupka za imortalizovanje ćelija koje proizvode antitelo, može da se nabroji nekoliko poznatih postupaka.
U postupku za proizvodnju monoklonskog antitela iz ovoga pronalaska, korisni primeri za molekul, koji je povezan sa humanim ILT7 za proizvodnju transformisane ćelije koja će se koristiti kao imunogen, obuhvataju belančevine ćelijske membrane. Među njima, molekul koji prenosi signal, koji je lokalizovan u ćelijskim membranama, preferirano se koristi kao ćelijska membranska belančevina iz ovoga pronalaska. Termin "molekul koji prenosi signal" označava molekul koji je povezan sa belančevinama i ćelijama koje imaju receptorske strukture u pomenutom izvan-ćelijskom domenu i prenose stimulaciju vezanja liganada na receptore u ćeliju. Primeri za molekul koji prenosi signal obuhvataju γ-lanac Fc receptora, DAP12, i slično. Na primer, γ-lanac Fc receptora je preferiran za upotrebu kao belančevina ćelijske membrane iz ovoga pronalaska. Amino-kiselinske sekvence humanog DAP12 i γ-lanca Fc receptora kao i bazna sekvenca cDNK, koja kodira pomenute sekvence, su javno dostupne. Bazna sekvenca humanog γ-lanca Fc receptora i amino-kiselinska sekvenca koja je kodirana uz pomoć bazne sekvence su prikazane u SEQ ID Br: 15 i 16.
U ovom pronalasku, transformisana ćelija koja se koristi kao imunogen može da se dobije uz pomoć pripreme, na primer, ćelije koja sadrži (a) i (b) na način da mogu da se eksprimiraju:
(a) egzogeni polinukleotid koji kodira amino-kiselinsku sekvencu koja sadrži izvan-ćelijski domen iz humanog ILT7; i
(b) egzogeni polinukleotid koji kodira γ-lanac Fc receptora.
U ovom pronalasku, egzogeni polinukleotid označava polinukleotid koji je veštački uveden u ćeliju domaćin. Kada se koriste humane ćelije, humani geni se uvode u humane ćelije. U takvoj kombinaciji, veštački uvedeni polinukleotid označava egzogeni polinukleotid. Prema tome, ektopična ekspresija humanog ILT7 ili humanog γ-lanca Fc receptora je sadržana u ekspresiji pomenutog egzogenog polinukleotida.
Kao šta se ovde koristi, termin "izvan-ćelijski domen humanog ILT7" označava amino-kiselinsku sekvencu od 17. do 444. pozicije amino-kiselinske sekvence koja je opisana u SEQ ID Br: 2 koja odgovara pomenutom izvan-ćelijskom domenu (od 1 do 428 u SEQ ID Br: 2). Kao amino-kiselinska sekvenca koja obuhvata pomenuti izvan-ćelijski domen iz humanog ILT7 iz ovog pronalaska, preferirano je da se koristi amino-kiselinska sekvenca koja obuhvata svaki pojedini region, na primer, započinjući od N-terminusa, i prateći sledeći redosled:
[Signalna sekvenca + izvan-ćelijski domen + transmembranski domen + intraćelijski domen].
Alternativno, amino-kiselinska sekvenca, kojoj delimično nedostaje intraćelijski region kao šta je opisano ispod, se nalazi u amino-kiselinskoj sekvenci koja obuhvata izvan-ćelijski domen iz humanog ILT7 iz ovoga pronalaska.
[Signalna sekvenca + izvan-ćelijski domen + transmembranski domen + deo intraćelijskog domena].
Dodatno, struktura, kojoj nedostaje intraćelijski region kao šta je pomenuto ispod, se nalazi u amino-kiselinskoj sekvenci koja obuhvata izvan-ćelijski domen iz humanog ILT7 iz ovoga pronalaska.
[Signalna sekvenca + izvan-ćelijski domen + transmembranski domen].
U toj strukturi regioni koji su drugačiji od izvan-ćelijskog domena mogu da budu amino-kiselinske sekvence koje su izabrane iz amino-kiselinskih sekvenci koje su prikazane u SEQ ID Br: 2, ili mogu da budu kombinovane sa drugim amino-kiselinskim sekvencama koje imaju homologiju sa pomenutim regionima. Na primer, amino-kiselinska sekvenca koja čini signalnu sekvencu, transmembranski domen, i intraćelijski region može da bude amino-kiselinska sekvenca iz molekula iz ILT porodice koji su različiti od ILT7. Ili, može da se kombinuje sa amino-kiselinskom sekvencom iz ILT porodice iz vrsta koje nisu ljudske. Dodatno, amino-kiselinska sekvenca, koja čini regione koji su različiti od izvan-ćelijskog domena, može da sadrži i mutaciju, ali koja ne narušava funkciju svakog regiona. Alternativno, drugi regioni mogu da se nalaze između svakog pojedinog regiona. Na primer, epitopni privesak poput FLAG takođe može da bude uveden između signalne sekvence i izvan-ćelijskog domena. Posebno, signalna sekvenca se odstranjuje uz pomoć procesiranja tokom prenosa na površinu ćelijske membrane nakon šta je translatovana u belančevinu. Prema tome, arbitrarna amino-kiselinska sekvenca, koja indukuje prenos translatovane belančevine u ćelijsku membranu, može da se koristi kao signalna sekvenca. Specifičnije, preferirano je da se koristi amino-kiselinska sekvenca (SEQ ID Br: 2) iz humanog ILT7 kao amino-kiselinska sekvenca koja sadrži izvan-ćelijski domen iz humanog ILT7.
Prema tome, u ovom pronalasku, arbitrarna bazna sekvenca koja kodira pomenutu amino-kiselinsku sekvenca koja čini već pomenutu strukturu [signalna sekvenca + izvan-ćelijski domen + transmembranski domen + intraćelijski region] može da se koristi kao polinukleotid koji čini pomenuti egzogeni polinukleotid koji je opisan pod (a). Na primer, amino-kiselinska sekvenca iz SEQ ID Br: 2 je kodirana uz pomoć bazne sekvence koja je opisana u SEQ ID Br: 1.
U ovom pronalasku, ekspresioni vektor koji nosi već pomenute polinukleotide pod (a) i (b), pri čemu pomenuti mogu da se eksprimiraju, može da se uvede u odgovarajuću ćeliju domaćina sa ciljem da se dobije transformirana ćelija koja će se koristiti kao imunogen. Pomenuti polinukleotidi pod (a) i (b) mogu da se nalaze na jednom vektoru ili na različitim vektorima. Kada se svaki polinukleotid nalazi na različitim vektorima, ćelije domaćini se ko-transfektuju sa dva različita tipa vektora.
Preferirani primeri ćelija domaćina iz ovoga pronalaska obuhvataju ćelije sisara. Specifični primeri ćelije domaćina obuhvataju ćelije koje su dobivene od ljudi, majmuna, miševa i pacova. Pobliže, ćelije koje su dobivene od ljudi su preferirane ćelije domaćina. Na primer, preferirano je da se koriste 293T ćelije koje su dobivene od ljudi kao ćelije domaćini iz ovoga pronalaska. 293T ćelije mogu da se dobiju kao ATCC CRL-11268. Dodatno, ćelije koje su izvedene iz imunizovanih životinja takođe mogu da se koriste kao ćelije domaćini. Kada se ćelije dobivene iz imunizovanih životinja koriste kao imunogeni, ćelijama je omogućen mali imunološki odgovor. Zbog toga, antitelo protiv izvan-ćelijskog domena egzogeno eksprimiranog ILT7 može da se dobije efikasno. Prema tome, na primer, kada se koriste miševi kao imunizovane životinje, ćelije dobivene od miševa takođe mogu da se koriste kao ćelije domaćini.
Već pomenuti polinukleotidi mogu da se uvedu u ćelije uz pomoć vektora koji je sposoban da indukuje ekspresiju u ćelijama domaćinima. Mogu da se koriste komercijalno dostupni vektori, koji mogu da indukuju ekspresiju u ćelijama sisara. Ekspresioni vektori poput pCMV-Script (R) Vektor, PSG5 Vektor (proizvedeni kod Stratagene), pcDNA3.1 (proizvedeni kod Invitrogen) mogu da se koriste za ovaj pronalazak.
Transformisane ćelije dobivene na takav način se daju životinjama za imunizovanje sa dodatnim komponentama poput dodataka, ako je potrebno. Korisni primeri za dodatke uključuju Freund-ov kompletan dodatak, i slično. Kada se koriste miševi kao životinje za imunizovanje, transformisane ćelije mogu da se administriraju u rasponu od 104 do 109 ćelija, bolje 104 do 106 ćelija. Opšte uzeto, višestruke doze imunogena se daju u pravilnim intervalima dok se ne dobije tirar antitela. Na primer, u slučaju kratko-trajne imunizacije, transformisane ćelije se administriraju u intervalima od 2 do 4 dana, bolje u intervalima od 3 dana. Nakon administriranja dva ili tri puta, mogu da se obnove ćelije koje proizvode antitelo. Alternativno, pomenuti se administriraju jednom sedmično, a ćelije koje proizvode antitelo mogu takođe da se obnove nakon administriranja pet ili šest puta.
U ovom pronalasku, obnovljene ćelije koje proizvode antitelo se kloniraju sa ciljem proizvodnje monoklonskih antitela. Preferirano je da se ćelije koje proizvode antitelo imortalizuju za kloniranje. Na primer, postupak fuzije ćelija uz pomoć postupka sa hibridomom ili uz pomoć transformiranja sa Epstein-Barr virusom (EBV) može da se koristi kao postupak za imortalizovanje ćelija koje proizvode antitelo.
Šta se tiče ćelija koje proizvode antitelo, jedna ćelija proizvodi jedan tip antitela. Prema tome, uspostava ćelijskih populacija koje su dobivene iz jedne ćelije (na primer, uz pomoć kloniranja) dozvoljava proizvodnju monoklonskih antitela. Postupak sa hibridomom uključuje proces u kojem se ćelije koje proizvode antitelo fuzionišu sa odgovarajućom ćelijskom linijom, koja je imortalizovana, a tada je klonirana. Imortalizovane ćelije koje proizvode antitelo mogu da se kloniraju uz pomoć tehnika poput postupka ograničenog razređenja. Poznato je da postoji više ćelijskih linija koje su korisne za postupak sa hibridomom. Ove ćelijske linije su izvrsne u svojoj efikasnosti imortalizovanja limfocita i imaju brojne genetičke markere koji su potrebni da se izdvoje uspešno fuzionisane ćelije. Dodatno, kada se namerava proizvodnja ćelija koje proizvode antitelo, takođe može da se koristi ćelijska linija kojoj nedostaje sposobnost da proizvodi antitela.
Na primer, mišji mijelomi P3x63Ag8.653 (ATCC CRL-1580) i P3x63Ag8U.1 (ATCCCRL-1597) se veoma često koriste kao korisne ćelijske linije za postupak fuzije ćelija kod miševa i pacova. Opšte uzeto, hibridom se proizvodi uz pomoć fuzije homogenih ćelija, dok se monoklonsko antitelo takođe može dobiti iz hetero-hibridoma iz različitih vrsta koje su blisko srodne.
Specifični protokoli za ćelijsku fuziju su javno poznati. Odnosno, ćelije koje proizvode antitelo iz imunizovanih životinja se mešaju sa odgovarajućim partnerima za fuziju sa ciljem postizanja fuzije. Korisni primeri ćelija koje proizvode antitelo uključuju ćelije slezine, limfocite koji su sakupljeni iz limfnih čvorova, i B ćelije iz periferne krvi. Kao partnere za fuziju mogu da se koriste brojne ćelijske linije koje su ranije opisane. Postupak sa polietilen glikolom i postupak električne fuzije mogu da se koriste za fuziju ćelija.
Sledeće, na bazi selektivnih markera fuzionisanih ćelija izdvajaju se uspešno fuzionisane ćelije. Na primer, kada se koristi HAT osetljiva ćelijska linija za fuziju ćelija, uspešno fuzionisane ćelije se izdvajanju uz pomoć selektiranja ćelija koje rastu na HAT medijumu. Dalje, potvrđuje se da li antitela koja se proizvode uz pomoć izdvojenih ćelija daju željeni odgovor.
Svaki hibridom se selektira na bazi odgovora antitela. Odnosno, hibridom koji proizvodi antitela koja vežu humani ILT7 se selektira uz pomoć metoda koji je opisan ranije. Preferirano, kada je izabrani hibridom sup-kloniran, a proizvodnja željenog antitela konačno potvrđena, potvrđeno antitelo je izabrano preko hibridoma koji proizvodi monoklonsko antitelo iz ovoga pronalaska.
Specifično, željeni hibridom može da se selektira na bazi odgovora prema humanim ćelijama ili odgovora prema transformisanim ćelijama koje eksprimiraju humani ILT7 gen. Pomenuta antitela, koja se vežu na ćelije, mogu da se detektuju na bazi principa imuno-testa. Na primer, ELISA, koja koristi ćelije kao antigene, može da se koristi za detektovanje željenog antitela. Specifično, supernatant hibridoma se priprema za kontakt sa potporom na kojoj se nalaze humane IPC ili transformirane ćelije koje se koriste kao imunogen. U slučaju kada pomenuti supernatant sadrži željeno antitelo, pomenuto antitelo ostaje zarobljeno na ćelijama koje su imobilizirane na potpori. Tada se kruta faza odvaja iz supernatanta, koji se ispere, ako je potrebno. Nakon toga, antitelo koje je zarobljeno na čvrstoj fazi može da se detektuje. Antitelo, koje prepoznaje neko antitelo, može da se koristi za detektovanje pomenutog antitela. Na primer, mišje antitelo može da se detektuje uz pomoć anti-mišjeg imunoglobulinskog antitela. Detektovanje je lako ako je pomenuto antitelo, koje prepoznaje antitelo, označeno. Korisni primeri za oznaku uključuju encime, fluorescentne boje, luminescentne boje, i slično.
Sa druge strane, čestice i unutarnji zid mikrotitarske pločice mogu da se koriste kao potpora na kojoj se ćelije imobiliziraju. Ćelije mogu da se imobiliziraju na česticama koje su načinjene od plastike ili na površini kontejnera uz pomoć fizičke adsorpcije. Korisni primeri potpore za imobiliziranje ćelija uključuju kuglice načinjene od polistirena i reakcione posude.
Kod selekcije hibridoma, može da se predvidi proizvodnja antitela protiv transformisanih ćelija domaćina (ne protiv ILT7) koje se koriste kao imunogen. Na primer, kao šta je ilustrovano u Primerima, u slučaju kada se koriste humane ćelije kao imunogen i kada se miševi koriste kao životinje za imunizovanje, pomenuta humana ćelija se prepoznaje kao strana supstancija. Tako, predviđena je proizvodnja antitela, koje se veže na pomenutu stranu supstancu. U ovom pronalasku, namera je da se dobije antitelo koje je sposobno da prepozna humani ILT7. Prema tome, nije neophodno da se dobije antitelo koje prepoznaje antigene na humanoj ćeliji koji nisu humani ILT7. Sa ciljem da se odstrane hibridomi, koji proizvode takvo antitelo tokom pretrage, neželjena antitela mogu da se absorbiraju pre potvrde odgovora pomenutog antitela.
Neželjena antitela mogu da se absorbiraju uz pomoć antigena na kojeg može da se veže predviđeno antitelo. Specifično, na primer, antitelo protiv antigena iz humane ćelije koji su različiti od humanog ILT7 može da se absorbira od strane ćelije u kojoj ne može da se detektuje ekspresija humanog ILT7. U ovom pronalasku, preferirano je da se koristi ćelija domaćin koja se koristila kao imunogen, a sada se koristi kao antigen za absorbiranje neželjenih antitela. Alternativno, ćelija domaćin koja je eksprimira pomenuti izvan-ćelijski domen iz humanog ILT7, ali eksprimira molekul koji se povezuje sa ILT7 može da se koristi kao antigen za absorbiranje antitela.
Šta se tiče monoklonskog antitela čija je vezna aktivnost za određeni antigenu potvrđena, takođe se potvrđuje njegov aktualan efekt na IPC delovanje, ako potrebno. Efekt na IPC može da se potvrdi uz pomoć postupaka poput onih koji su opisni ispod.
Šta se tiče monoklonskog antitela iz ovoga pronalaska, hibridom koji proizvodni pomenuto monoklonsko antitelo se uzgaja, a monoklonsko antitelo iz ovoga pronalaska se obnavlja iz nastale kulture. Hibridom može da se kultivira in vitro ili in vivo. U slučaju kada se kultivira in vitro, hibridom može da se kultivira uz pomoć poznatog medijuma poput RPMI1640. Imunoglobulin koji se luči iz hibridoma se nakuplja u supernatantu kulture. Prema tome, monoklonsko antitelo iz ovoga pronalaska može da se dobije uz pomoć sakupljanja pomenutog supernatanta i njegovog prečišćavanja, ako je potrebno. Lakše je da se prečisti pomenuti imunoglobulin kada se u kulturu ne dodaje serum. Međutim, za potrebe brže proliferacije pomenutog hibridoma i ubrzavanja proizvodnje antitela, u kulturu može da se doda 10% fetalni kravlji serum.
Hibridom može takođe da se kultivira in vivo. Specifično, intraperitonealna kultivacija hibridoma može da se postigne uz pomoć inokuliranja pomenutog hibridoma u abdominalnu šupljinu golog miša. Monoklonska antitela se nakupljaju tokom ascitesa. Prema tome, ako se dobije ascites i ako se pomenuta prečiste kao šta je potrebno, može da se proizvede traženo monoklonsko antitelo. Dobivena monoklonska antitela mogu da se prikladno modifikuju ili proceraju u skladu sa njihovom namenom.
Monoklonsko antitelo iz ovoga pronalaska može da se eksprimira uz pomoć dobijanja cDNK koja kodira region za vezanje antigena iz antitela iz pomenutog hibridoma i ugradnje u odgovarajući ekspresioni vektor. Tehnika s kojom može da se dobije cDNK, koja kodira za varijabilni region iz antitela, koja tada može da se eksprimira u nekoj odgovarajućoj ćeliji domaćina je poznata. Dodatno, postupak u kojem je neko himerno antitelo načinjeno pomoću ligacije varijabilnog regiona, koji sadrži region za vezanje antigena, sa konstantnim regionom je takođe poznat.
Preferirani primeri za monoklonsko antitelo iz ovoga pronalaska obuhvataju monoklonska antitela koja se proizvode uz pomoć hibridoma #11 (Pristupni broj: FERM BP-10704), hibridoma #17 (Pristupni broj: FERM BP-10705), ili hibridoma #37. Amino-kiselinske sekvence koje sadrže varijabilne regione pomenutih monoklonskih antitela kao i bazne sekvence cDNK koja ih kodira takođe su opisane ispod. Prema tome, himerna antitela koja treba da se dobiju uz pomoć konjugacije pomenutih varijabilnih regiona u konstantne regione iz drugih imunoglobulina su preferirana u ovom pronalasku. U amino-kiselinskim sekvencama koje su opisane u Popisu sekvenca, amino-kiselinska sekvenca od 1 do C-terminusa sadrži zrelu belančevinu. Odnosno, sledeća amino-kiselinska sekvenca od 1 do C-terminusa je zrela sekvenca u svakoj amino-kiselinskoj sekvenci. Sa druge strane, amino-kiselinska sekvenca koja je predstavljena uz pomoć numeričke vrednosti od N-terminusa do -1 je signalna sekvenca.
Varijabilni region iz teškog lanca
Varijabilni region iz lakog lanca
#11
SEQ 1 D Br: 38 (bazna sekvenca)
SEQ ID Br: 40 (bazna sekvenca)
SEQ 1 D Br: 39 (amino-kiselinska sekvenca)
SEQ ID Br: 41 (amino-kiselinska sekvenca)
#17
SEQ 1 D Br: 42 (bazna sekvenca)
SEQ ID Br: 44 (bazna sekvenca)
SEQ 1 D Br: 43 (amino-kiselinska sekvenca)
SEQ ID Br: 45 (amino-kiselinska sekvenca
#37
SEQ 1 D Br: 46 (bazna sekvenca)
SEQ ID Br: 48 (bazna sekvenca)
SEQ 1D Br: 47 signalna sekvenca
SEQ ID Br: 49 (amino-kiselinska sekvenca)
Na primer, mišje (varijabilni region) - humano (konstantni region) himerno antitelo može da se načini uz pomoć ligiranja gena za pomenute varijabilne regione u konstantni region iz teškog lanca humanog IgG1 i gena koji kodira konstantni region iz lakog lanca humanog Ig kapa. Amino-kiselinske sekvence takvog himernog antitela i bazne sekvence koje ih kodiraju su opisane ispod. Himerna antitela koja su specifikovana uz pomoć pomenutih sekvenca omogućuju konstrukciju preferirane izvedbe monoklonskog anti-ILT7 antitela iz ovoga pronalaska. U sledećim amino-kiselinskim sekvencama iz himernog antitela, amino-kiselinska sekvenca od N-terminusa do -1 odgovara signalnoj sekvenci, a amino-kiselinska sekvenca od 1 do C-terminusa odgovara zreloj belančevini. Odnosno, himerino antitelo sastavljeno od teškog i lakog lanaca, koji se sastoji od amino-kiselinske sekvence od 1 do C-terminusa za svaku amino-kiselinsku sekvencu, je preferirano u ovom pronalasku.
Teški lanac
Laki lanac
#11
SEQ 1D Br: 50 (bazna sekvenca)
SEQ ID Br: 52 (bazna sekvenca)
SEQ 1D Br: 51 (amino-kiselinska sekvenca)
SEQ ID Br: 53 (amino-kiselinska sekvenca)
#17
SEQ 1D Br: 51 (bazna sekvenca)
SEQ ID Br: 56 (bazna sekvenca)
SEQ 1D Br: 55(amino-kiselinska sekvenca)
SEQ ID Br: 57 (amino-kiselinska sekvenca)
Nadalje, antigen-vezna aktivnost monoklonskog antitela može takođe da se presadi na druge imunoglobuline. Varijabilni region imunoglobulina se sastoji od regiona koji određuje komplementarnost (CDR) i okvirnog regiona. Antigen-vezna karakteristika svakog imunoglobulina je određena sa CDR, a okvir održava strukturu regiona za vezanje antigena. Amino-kiselinska sekvenca CDR je izuzetno raznolika, dok amino-kiselinska sekvenca dela koji se odnosi na okvir je veoma konzervisana. Poznato je da se amino-kiselinska sekvenca koja čini CDR može ugraditi u okvirni region drugih imunoglobulinskih molekula, šta dozvoljava presađivanje antigen-vezne aktivnosti. Postoji postupak u kojem se antigen-vezna karakteristika različitih imunoglobulina presađuje na humani imunoglobulin uz pomoć poznatog procesa. Kao šta se ovde koristi, termin "region koji veže antigen" može da obuhvata pomenuti CDR koji se presađuje u pomenuti okvir. Prema tome, termin "fragment koji nosi region za vezanje antigena" iz nekog monoklonskog antitela obuhvata fragment humanog imunoglobulina koji sadrži varijabilni region u kojem je presađen CDR iz pomenutog monoklonskog antitela. Na primer, svaka amino-kiselinska sekvenca iz već pomenutih varijabilnih regiona obuhvata sledeće amino-kiselinske sekvence (SEQ ID Br) kao CDR.
CDR1 .
CDR2
CDR3
#11 teški lanac
SDYAWN (58)
YISYSGSTSYNPSLKSR (59)
SPPYYAMDY (60)
#11 laki lanac
KASQDVGTAVA (61)
WASTRHT (62)
QQYSSYPLT (63)
#17 teški lanac
SYWIH (64)
RIYPGTGSTYYNEKFKG (65)
YPTYDWYFDV (66)
#17 laki lanac
RASQSISNYLH (67)
YASQSIS (68)
QQSNSWPLT (69)
#37 teški lanac
SDYAWN (70)
YISYSGSTSYNPSLKSR (71)
ALPLPWFAY (72)
#37 laki lanac
KASQDVGTAVA (73)
WASTRHT (74)
QQYSSYPYT (75)
Na bazi informacije iz baznih sekvenca koje kodiraju već pomenute amino-kiselinske sekvence i informacije iz bazne sekvence koja kodira okvir (FR) humanog imunoglobulina, može da se dizajnira prajmer uz pomoć kojeg može da se umnoži cDNK koja ima baznu sekvencu koja je nastala konjugiranjem obiju baznih sekvenca. Operacija se ponavlja za svaki okvir pri čemu može da se konstruira varijabilni region u kojem su mišji CDR1, CDR2, i CDR3 spojeni sa humanim FR. Nadalje, kada je bazna sekvenca, koja kodira konstantni region iz humanog imunoglobulina, spojena kao šta je već potrebno, dobija se humanizovano antitelo sa pomenutim konstantnim regionom.
Kao himerno antitelo koje sadrži već pomenute varijabilne regione ili humanizovano antitelo na koje je presađen CDR koji čini varijabilni region, u ovom pronalasku je preferirano antitelo sa konstantnim regionom koji je izveden iz IgG ili IgM. Ovi pronalazači su potvrdili da pomenuto monoklonsko antitelo protiv ILT7 pokazuje CDC delovanje na ćelijama koje eksprimiraju ILT7. Prema tome, antitelo koje ima konstantni region koji je izveden iz IgG ili IgM pokazuje citotoksičnost protiv ćelija koje eksprimiraju ILT7 zbog CDC efekta. Takva antitela su korisna u inhibiranju brojnih ćelija koje eksprimiraju ILT7 poput IPC.
Himerno antitelo koje može da prepozna ILT7 ili humanizovano antitelo, koje je obezbeđeno uz pomoć ovog pronalaska, može da se proizvede uz pomoć genetičkog inženjeringa koristeći polinukleotide koji kodiraju pomenuta antitela. Na primer, polinukleotid koji je bazna sekvenca koja je opisana u sledećim SEQ ID Br i koji kodira amino-kiselinsku sekvencu koja sadrži zrelu belančevinu može da se koristi kao polinukleotid koji kodira varijabilni region #11 ili #17. Sledeća amino-kiselinska sekvenca od 1 do C-terminusa za svaku amino-kiselinsku sekvencu odgovara zreloj belančevini. U slučaju kada je svaka zrela belančevina eksprimirana kao odvojena belančevina, preferirano je da se postavi signal za sekreciju na N-terminusu svake amino-kiselinske sekvence. Na primer, u amino-kiselinskim sekvencama prikazanima u SEQ ID Br, amino-kiselinska sekvenca od N-terminusa do -1 može da se koristi kao signalna sekvenca kada su takve belančevine eksprimirane u životinjskim ćelijama. Alternativno, pomenuti varijabilni regioni mogu da se izluče kao zrele belančevine uz pomoć arbitrarne signalne sekvence koja omogućava izlučivanje imunoglobulina.
#11
SEQ ID Br: 50 (bazna sekvenca)
SEQ I D Br: 52 (bazna sekvenca)
#17
SEQ ID Br: 54 (bazna sekvenca)
SEQ ID Br: 56 (bazna sekvenca)
Na isti način kao šta je malopre opisno, kao polinukleotid koji kodira humanizovano antitelo, može da se konstruiše polinukleotid koji eksprimira pomenuto humanizovano antitelo uz pomoć bazne sekvence koja kodira belančevinu koja ima signalnu sekvencu koja treba da se doda na N-terminus. Kada se teški i laki lanac nalaze na različitim vektorima, oba vektora su ko-transfektovana u istu ćeliju domaćina. Teški i laki lanac koji su eksprimirani sa svakog vektora se koriste da se konstruira imunoglobulinski molekul sa oba lanaca. Ili, polinukleotid koji kodira teški lanac i polinukleotid koji kodira laki lanac takođe mogu da se nalaze u istom vektoru. Ćelija domaćin u koju je ko-transfektovan vektor koji nosi oba polinukleotida eksprimira teški i laki lanac i proizvodi imunoglobulin koji ima oba lanaca.
Pomenuti polinukleotidi mogu da se eksprimiraju kao antitela uz pomoć sistema domaćin-vektor koji je sposoban da eksprimira jedan gen za antitelo. Nadalje, u slučaju kada se pomenuti eksprimiraju kao pojedinačni molekul belančevine uz pomoć spajanja varijabilnog regiona iz teškog lanca sa varijabilnim regionom iz lakog lanca, signalna sekvenca može da se postavi u N-terminus pomenutog molekula belančevine. Poznat primer takvog molekula antitela uključuje scFv molekul u kojem su varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca spojeni uz pomoć linkera.
Svako monoklonsko antitelo koje je tako proizvedeno je monoklonsko antitelo iz ovoga pronalaska. Drugim rečima, monoklonsko antitelo koje sadrži imunoglobulin koji obuhvata region za vezanje antigena koji je kodiran uz pomoć polinukleotida koji je izveden iz cDNK koja kodira region za vezanje antigena već pomenutog monoklonskog antitela je monoklonsko antitelo iz ovoga pronalaska.
Kao šta je već opisno, RBL ćelije u kojima je ILT1 gen bio potaknut da se eksprimira mogu da se koriste kao imunogen za dobijanje ILT1 antitela. Međutim, ekspresija ILT7 na površini RBL ćelija (P815) ne može da se potvrdi pa prema tome ne može da se koristi kao imunogen. Ovi su pronalazači pronašli da ekspresija humanog ILT7 na ćelijskoj površini može da se indukuje uz pomoć ko-ekspresije humanog ILT7 i drugih belančevina ćelijske membrane koji se povezuju sa humanim ILT7. Pri tome su ovi pronalazači pronašli da se antitelo, koje se veže na humane IPC, može dobiti uz pomoć korišćenja transformisanih ćelija pri čemu se ekspresija potiče uz pomoć imunogena čime su kompletovali ovaj pronalazak.
Odnosno, ovaj pronalazak obezbeđuje imunogen za proizvodnju antitela koje se veže na izvan-ćelijski domen iz humanog ILT7, i sadrži životinjske ćelije koje sadrže (a) polinukleotid koji kodira amino-kiselinsku sekvencu koja obuhvata izvan-ćelijski domen humanog ILT7; i (b) polinukleotid koji kodira γ-lanac Fc receptora pro čemu se pomenuti mogu eksprimirati egzogeno ili kao ćelijske membranske frakcije.
Šest godina ili više je prošlo od rešavanja strukture humanog ILT7 u 1998. Međutim, antitelo koje je sposobno da specifično prepozna ILT7 još uvek nije dobiveno. Antitelo koje je sposobno da prepozna humani ILT7 je obezbeđeno uz pomoć imunogena iz ovoga pronalaska po prvi pita. Odnosno, ovaj pronalazak obezbeđuje antitelo koje je sposobno da prepozna humani ILT7 koje može da se dobije uz pomoć sledećih koraka:
(1) administriranje životinji za imunizovanje ćeliju koja egzogeno eksprimira belančevinu koja sadrži izvan-ćelijski domen humanog ILT7 i molekul koji je spojen sa humanim ILT7;
(2) selektiranje ćelije koja može da proizvodi pomenuto antitelo koje se veže na humani ILT7 iz ćelija koje proizvode antitela iz imunizovane životinje; i
(3) uzgajanje ćelija koje proizvode pomenuto antitelo i koje su selektirane uz pomoć koraka (2) i obnavljanje antitela koje je sposobno da prepozna humani ILT7 iz pomenute kulture.
Pronađeno je da se humani ILT7 specifično eksprimira u humanim IPC. Tokom analize genske ekspresije uz pomoć SAGE koja je bila provedena od strane ovih pronalazača, takođe je bila potvrđena i ekspresija humanog ILT7 u humanim IPC. Međutim, u prijašnjim izveštajima, nivoi ekspresije ILT7 u oba slučaja su analizirani na bazi mRNK. Budući nije bilo obezbeđeno antitelo koje je sposobno da detektuje humani ILT7, stanje ekspresije belančevine nije bilo analizirano konvencionalno. Analiza humane ILT7 belančevine je realizovana uz pomoć obezbeđivanja antitela koje se veže na izvan-ćelijski domen iz humanog ILT7 iz ovog pronalaska.
Ovi pronalazači su u stvari potvrdili da monoklonsko antitelo koje se veže na izvan-ćelijski domen iz humanog ILT7 na bazi ovog pronalaska specifično detektuje humane IPC. Odnosno, ovaj pronalazak se odnosi na postupak za detektovanje ćelija koje proizvode interferon koji obuhvata sledeće korake: kontaktiranje monoklonskog antitela koje veže izvan-ćelijski domen iz humanog ILT7 ili fragmenta koji sadrži region za vezanje antigena sa testiranom ćelijom; i detektovanje monoklonskog antitela koje je vezano na ćelije ili fragmenta koji obuhvata region za vezanje antigena.
Detektovanje humanog ILT7 na bazi ovog pronalaska omogućava određivanje da li određena ćelija je IPC. Odnosno, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za identifikovanje IPC koristeći humani ILT7 kao indikator. Ili, humane IPC mogu da se odvoje uz pomoć odvajanja ćelija u kojima je humani ILT7 detektovan na bazi ovoga pronalaska. Odnosno, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za odvajanje IPC uz pomoć humanog ILT7 kao indikatora.
Na bazi pomenute analize sa antitelom za humani ILT7, bilo je potvrđeno da je nivo ekspresije ILT7 u IPC, čija je diferencijacija bila indukovana sa CpG, i slično, smanjen. Odnosno, IPC pre indukovanja diferencijacije mogu da se specifično detektuju uz pomoć ILT7 kao indikatora. Drugim rečima, monoklonsko antitelo iz ovoga pronalaska je korisno u detektovanju IPC pre njihove diferencijacije u dendrite. Kao šta se ovde koristi, termin "IPC pre njihove diferencijacije" može da se definiše kao da opisuje ćelijske populacije koje zadržavaju kapacitet proizvodnje interferona.
U ovom pronalasku, monoklonsko antitelo koje se veže na izvan-ćelijski domen iz humanog ILT7 ili fragment koji sadrži njegov region za vezanje antigena može da se označi unapred. Na primer, antitela mogu lako da se detektuju uz pomoć označavanja sa luminescentnim bojama ili fluorescentnim bojama. Bolje, antitelo označeno sa fluorescentnom bojom se dovodi u kontakt sa ćelijskom populacijom koja može da obuhvata IPC, a tada se ćelije na koje se vezalo antitelo iz ovoga pronalaska mogu detektovati uz pomoć fluorescentne boje kao indikatora. Nadalje, IPC može da se odvoji uz pomoć odvajanja ćelija u kojima je detektovana fluorescentna boja. Serije koraka mogu da se lako provedu na bazi principa FACS. Alternativno, antitelo iz ovoga pronalaska može da se veže na potporu od čvrste faze poput magnetskih čestica. Antitelo vezano na potporu od čvrste faze prepoznaje humani ILT7, nakon čega IPC ostaju zarobljene na pomenutoj potpori od čvrste faze. Kao rezultat, IPC mogu da se detektuju ili odvoje.
Antitelo koje je neophodno za postupak detektovanja IPC na bazi ovoga pronalaska može da se obezbedi kao reagens za detektovanje IPC. Odnosno, ovaj pronalazak obezbeđuje reagens za detektovanje ćelija koje proizvode interferon, koji sadrži monoklonsko antitelo koje se veže na izvan-ćelijski domen iz humanog ILT7 ili fragment koji sadrži njegov region koji veže antigen. Pomenuti reagens za detektovanje IPC iz ovoga pronalaska može da se koristi u kombinaciji sa pozitivnom kontrolom ili negativnom kontrolom osim samog antitela. Na primer, transformisane ćelije koje eksprimiraju izvan-ćelijski domen iz humanog ILT7 i se koriste kao imunogen kao i IPC koji su dobiveni iz ljudskih bića mogu da se koriste kao pozitivne kontrole. Uobičajeno, veoma malo humanih IPC može da se dobije iz periferne krvi. Prema tome, preferirano je da se koristi transformirana ćelija kao pozitivna kontrola u reagensu iz ovoga pronalaska. Sa druge strane, kao negativna kontrola može da se koristi neka arbitrarna ćelija, koja ne eksprimira humani ILT7.
Odnosno, ovaj pronalazak obezbeđuje komplet hemikalija za detektovanje humanih IPC koji obuhvata:
(a) monoklonsko antitelo koje se veže na izvan-ćelijski domen iz humanog ILT7 ili fragment koji sadrži njegov region za vezanje antigena; i
(b) ćeliju koja eksprimira egzogenu belančevinu koja obuhvata izvan-ćelijski domen iz humanog ILT7 i jedan egzogeni molekul koji se povezuje sa humanim ILT7.
Ovi su pronalazači analizirali efekt antitela koje se veže na izvan-ćelijski domen iz humanog ILT7 na IPC. Kao rezultat, potvrđeno je da pomenuto antitelo, koje se veže na izvan-ćelijski domen iz humanog ILT7, inhibira delovanje IPC. Odnosno, ovaj pronalazak se odnosi na postupak za inhibiranje delovanja ćelija koje proizvode interferon, koji obuhvata korak kontaktiranja bilo koje komponente od dole pomenutih sa ćelijama koje proizvode interferon:
(a) monoklonsko antitelo koje se veže na humani ILT7 i inhibira delovanje ćelija koje proizvode interferon ili fragment koji obuhvata njegov region za vezanje antigena; i
(b) imunoglobulin u kojeg je presađen region koji određuje komplementarnost iz monoklonskog antitela koje je opisano pod (a) ili fragment koji sadrži region koji veže antigen.
Ili, ovaj pronalazak se odnosi na postupak za inhibiranje delovanja ćelija koje proizvode interferon u živim organizmima, koji obuhvata korak administriranja bilo koje od sledećih komponenta živim organizmima:
(a) monoklonsko antitelo koje veže humani ILT7 i inhibira delovanje ćelija koje proizvode interferon ili fragment koji sadrži region koji veže antigen;
(b) fragment koji sadrži imunoglobulin u kojeg je bio presađen region koji određuje komplementarnost iz monoklonskog antitela koje je opisano pod (a) ili fragment koji sadrži njegov region koji veže antigen; i
(c) polinukleotid koji kodira komponente opisane pod (a) ili (b).
Kao šta se ovde koristi, termin "ćelije koje proizvode interferon (IPC)" označava ćelije koje imaju sposobnost da proizvode IFN i eksprimiraju ILT7 na površini ćelije. U daljnjem tekstu, osim ako je drugačije navedeno, termin "IPC" obuhvata ne samo ćelije koje su prekursorske ćelije dendrita već takođe i ćelije koje imaju sposobnost da proizvode IFN i eksprimiraju ILT7 na površini ćelije. Postupci za identifikovanje takvih IPC su uobičajeno poznati. IPC mogu da se razlikuju od ostalih krvnih ćelija uz pomoć markera sa površine ćelije kao indikatore. Specifično, profil površinskih markera za humane IPC je opisan ispod (Shortman, K. & Liu, YJ. Nature Reviews 2: 151-161, 2002 ). Nedavno, neki autori su takođe predložili da se BDCA-2 pozitivna ćelija definiše kao IPC (Dzionek, A. et al. J. Imunol. 165: 6037-6046, 2000 .). [Profil površinskih antigena iz humanih IPC] CD4 pozitivan, CD123 pozitivan, Linija (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56) negativni, i CD11c negativan.
Prema tome, takođe može da se kaže da se IPC ćelije koje imaju ekspresioni profil već pomenutih poznatih markera i imaju sposobnost da proizvode IFN. Konačno, ćelije u živim organizmima sa sposobnosti da proizvode IFN su sadržane u IPC, čak i ako se radi o ćelijskoj populaciji sa profilima koji su različiti od obrasca ekspresije iz ekspresionog profila pomenutih markera.
Nadalje, primeri za karakteristike, koje se uobičajeno primjećuju kod humanih IPC, su kako sledi:
[Morfološke karakteristike ćelija]
· Slične plazma-ćelijama
· Okrugle ćelije sa maznom ćelijskom površinom
· Jedro je relativno veliko
[Funkcionalne karakteristike ćelija]
· Tokom virusne infekcije, velika količina interferona Tipa-1 se proizvodi u kratkom vremenskom periodu.
· Diferenciraju u dendrite nakon virusne infekcije.
Kao šta se ovde koristi, termin "inhibicija delovanja IPC" označava inhibiciju najmanje jedne od funkcija IPC. Primeri za funkciju IPC uključuju proizvodnju IFN i ćelijsko preživljavanje. Ćelijsko preživljavanje može takođe da se prenese na brojne ćelije. Prema tome, u slučaju inhibiranja obe ili bilo koje funkcije, smatra se da je aktivnost IPC inhibirana. Pronađeno je da IFN tipa 1 koji se proizvodi od IPC dovodi do različitih bolesti. Prema tome, inhibicija velikog broja IPC i proizvodnje IFN je korisno za strategiju za medicinski tretman pomenutih bolesti.
Na primer, poznat je odnos između patološkog stanja auto-imunih bolesti i IFNα. Najviše IFNα se proizvodi u IPC. Prema tome, patološka stanja uzrokovana sa IFNα mogu da se ublaže uz pomoć inhibiranja proizvodnje IFNα. Kao šta se ovde koristi, termin "inhibicija proizvodnje IFN sa IPC" označava inhibiciju proizvodnje najmanje jednog od IFN koji se proizvodi u IPC. Preferirani IFN iz ovoga pronalaska je IFN tipa 1. Među njima, IFNα je važan.
Odnosno, ovaj pronalazak se odnosi na inhibitor proizvodnje IFN šta podrazumeva antitelo koje se veže na izvan-ćelijski domen ILT7 kao aktivni sastojak. Ili, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za inhibiranje proizvodnje IFN šta podrazumeva korak administriranja pomenutog antitela koje se veže na izvan-ćelijski domen iz ILT7. Nadalje, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu pomenutog antitela koje se veže na izvan-ćelijski domen iz ILT7 za proizvodnju medicinske kompozicije za inhibiranje proizvodnje IFN.
Ćelije u kojima se proizvodi velika količina IFN (sa malim brojem ćelija) su uključene u IPC. Na primer, prekursorske ćelije dendrita stimulisanih sa virusom i slično proizvode najviše IFN od onog koji se proizvodi u živom telu. Inhibicija brojnih IPC koje proizvode puno IFN rezultuje u suprimiranje proizvodnje IFN. Prema tome, patološka stanja uzrokovana sa IFNα mogu da se umanje uz pomoć inhibiranja brojnih IPC. U preferiranoj izvedbi ovoga pronalaska, nakon što je potvrđeno da monoklonsko se anti-ILT7 antitelo vezalo na ćelije koje eksprimiraju ILT7, efekt citotoksičnosti je određen uz pomoć parametra citotoksičnost koja je zavisna o komplementu (CDC). CDC efekt je jedan od važnih mehanizama leka koji se sastoji od antitela. Monoklonsko anti-ILT7 antitelo iz ovoga pronalaska takođe pokazuje snažnu citotoksičnost protiv ćelija koje eksprimiraju ILT7 poput IPC zbog CDC efekta. Odnosno, u jednoj preferiranoj izvedbi, šta se tiče monoklonskog anti-ILT7 antitela, efekt koji inhibira proizvodnju IFN može da se očekuje zbog citotoksičnosti protiv IPC, osim mehanizma inhibicije proizvodnje IFN.
Pomenuto antitelo, koje prepoznaje izvan-ćelijski domen iz humanog ILT7 koje se koristi u ovom pronalasku, može da se dobije na bazi postupka koji je ranije opisan. Antitelo u ovom pronalasku može da pripada bilo kojoj klasi. Životinjske vrste iz kojih je dobiveno antitelo takođe nisu ograničene. Nadalje, fragment koji sadrži njegov region koji prepoznaje antigen može takođe da se koristi kao antitelo. Na primer, fragment antitela koji obuhvata region koji prepoznaje antigen koji je dobiven uz pomoć encimske digestije IgG može da se koristi kao antitelo iz ovoga pronalaska. Specifično, fragmenti antitela poput Fab i F(ab')2 mogu da se dobiju uz pomoć digestije sa papainom ili pepsinom. Dobro je poznato da ovi fragmenti antitela mogu da se koriste kao molekule antitela koje imaju afinitet za antitela. Alternativno, antitela koja su konstruisana uz pomoć genetičke rekombinacije mogu takođe da se koriste ukoliko je zadržana antigen-vezna aktivnost. Primeri antitela koja su konstruisana uz pomoć genetičke rekombinacije uključuju himerna antitela, CDR-transplantirana antitela, jedno-lančani Fv, dijatela, linearna antitela, i polispecifična antitela nastala kao fragmenti antitela. Opšte je poznato da ova antitela mogu da se dobuju uz pomoć monoklonskih antitela.
U ovom pronalasku, antitela mogu da se modifikuju, ako je potrebno. U skladu sa ovim pronalaskom, pomenuto antitelo, koje prepoznaje izvan-ćelijski domen iz humanog ILT7, poseduje efekt inhibiranja delovanja IPC. Odnosno, smatra se da samo antitelo poseduje citotoksičnost protiv IPC. Pod-klase antitela koje pokazuju snažnu efektorsku aktivnost su poznate. Alternativno, efekt inhibiranja delovanja IPC može dodatno da se pojača uz pomoć modifikovanja antitela sa nekim citotoksičnim agensom. Primeri citotoksičnih agenasa su opisani ispod.
Toksini: Pseudomonas endotoksin (PE), difterija toksin, ricin
Radioizotopi: Tc99m, Sr89, I131, Y90
Agensi protiv raka: kalihemicin, mitomicin, paklitaksel.
Toksini koji se sastoje od belančevina mogu da se konjugiraju sa antitelima ili njihovim fragmentima sa bifunkcionalnim reagensom. Alternativno, takođe može da se dobije gen koji kodira toksin i koji je spojen na gen koji kodira antitelo šta daje fuzionu belančevinu oba gena. Postupak za konjugiranje antitela sa radioizotopima je takođe poznat. Na primer, postupak za označavanje antitela sa radioizotopima koji koristi agens za heliranje je takođe poznat. Nadalje, agensi protiv raka mogu da se konjugiraju sa antitelima koristeći šećerne lance ili neki bifunkcionalni reagens.
Ovi pronalazači su potvrdili fenomen u kojem se monoklonsko antitelo, koje je vezano na ILT7 koji se eksprimira na ćelijskoj membrani, inkorporira u ćelije nakon vezanja (internalizovanje). Prema tome, citotoksični agensi mogu da se dostave u ćelije uz pomoć kontaktiranja antitela konjugiranih sa pomenutim citotoksičnim agensima iz ovog pronalaska sa ćelijama koje eksprimiraju ILT7. Odnosno, ovaj pronalazak obezbeđuje aktivni inhibitor ćelija koje eksprimiraju ILT7 koji obuhvata monoklonsko anti-ILT7 antitelo na koje je konjugiran pomenuti citotoksični agens kao aktivni sastojak. Ili, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu monoklonskog anti-ILT7 antitela na koje je konjugiran citotoksični agens u proizvodnji aktivnog inhibitora ćelija koje proizvode ILT7. Nadalje, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za inhibiranje delovanja ćelija koje eksprimiraju ILT7 koji obuhvata korak administriranja monoklonskog anti-ILT7 antitela na koje je konjugiran citotoksični agens.
U ovom pronalasku, antitelo čija je struktura veštački modifikovana može takođe da se koristi kao aktivni sastojak. Na primer, brojni postupci za modifikovanje su poznati, a koriste se sa ciljem da se poboljša citotoksičnost i stabilnost antitela. Specifično, poznat je imunoglobulin u kojem su šećerni lanci iz teškog lanca modifikovani (Shinkawa, T. et al. J. Biol. Chem. 278:3466-3473. 2003). Ćelijski-potpomognuta citotoksičnost zavisna o antitelu (ADCC) je bila pojačana kod imunoglobulina uz pomoć modifikovanja šećernih lanaca. Ili, takođe je poznat imunoglobulin u kojem je modifikovana amino-kiselinska sekvenca Fc regiona. Odnosno, ADCC delovanje je pojačano uz pomoć veštačkog pojačavanja vezne aktivnosti imunoglobulina protiv Fc receptora (Shield, RL. et al. J. Biol. Chem. 276; 6591-6604, 2001.).
IgG, koji se veže na Fc receptor, se ugrađuje u ćelije. Tada, IgG se veže na Fc receptor koji se eksprimira u endosomu pa se oslobađa u krv. Ovaj fenomen je poznat od ranije. IgG sa visokom veznom aktivnosti za Fc receptorom ima bolju šansu da se oslobodi u krv nakon šta se inkorporira u ćelije. Kao rezultat, produženo je retenciono vreme IgG u krvi (Hinton, PR. et al. J Biol Chem. 279: 6213-6216. 2004 ). Osim toga, pokazano je da modifikovanje amino-kiselinske sekvence Fc regiona dovodi do promene delovanja citotoksičnosti koja je zavisna o komplementu (CDC). Ovako modifikovana antitela mogu da se koriste kao antitelo iz ovoga pronalaska.
Kada antitelo, koje veže izvan-ćelijski domen iz humanog ILT7, kontaktira IPC, delovanje IPC se inhibira. Prema tome, ova antitela mogu da se koriste kao inhibitor ili postupak za inhibiranje delovanja IPC. Odnosno, ovaj pronalazak obezbeđuje aktivni inhibitor IPC koji obuhvata najmanje jednu komponentu koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od sledećih komponenata, (a) do (c), kao aktivni sastojak. Ili, ovaj pronalazak se odnosi na postupak za inhibiranje delovanja IPC šta obuhvata korak administriranja najmanje jedne komponente koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od sledećih, (a) do (c). Nadalje, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu najmanje jedne komponente koja je izabrana iz grupe koja se sastoji od sledećih, (a) do (c), u proizvodnji aktivnog inhibitora IPC:
(a) monoklonsko antitelo koje veže humani ILT7 ili fragment koji sadrži njegov region koji prepoznaje antigen;
(b) imunoglobulin u kojeg je presađen region koji određuje komplementarnost iz antitela koje je opisano pod (a) ili fragment koji sadrži njegov region koji prepoznaje antigen; i
(c) polinukleotid koji kodira komponente opisane pod (a) ili (b). U ovom pronalasku, monoklonsko antitelo, koje prepoznaje izvan-ćelijski domen iz humanog ILT7, može da se koristi kao monoklonsko antitelo, koje inhibira delovanje IPC. U ovom pronalasku može da se koristi jedno ili više monoklonskih antitela. Na primer, jedno ili više monoklonskih antitela, koja prepoznaju izvan-ćelijski domen iz humanog ILT7 su pomešana za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom.
Može da se potvrdi da antitela poseduju efekt inhibiranja proizvodnje IFN u IPC na način koji je opisan ispod. IPC proizvode velike količine IFN zbog virusne stimulacije. Antitela se daju IPC pre, nakon, ili istovremeno kao i stimulacija IPC sa virusima. Tada je upoređen kapacitet da se proizvodi IFN za sve slučajeve i u odnosu na kontrolu koja nije primila antitela. Sposobnost da proizvode IFN može da se proceni uz pomoć merenja IFNα ili IFNβ koji se nalaze u supernatantu kulture IPC. Kao rezultat uporedbe, može da se potvrdi da su testirana antitela efektivna u inhibiranju sposobnosti proizvodnje IFN kada je količina IFN u supernatantu značajno smanjena zbog dodavanja antitela. Postupci za merenje IFN su poznati. IPC proizvode najviše IFN u telu. Prema tome, stanje proizvodnje IFN u živom telu može da se reguliše uz pomoć inhibiranja sposobnosti da IPC proizvode IFN.
U ovom pronalasku, delovanje IPC obuhvata održavanje broja IPC. Prema tome, inhibiranje delovanja IPC u ovom pronalasku obuhvata inhibiciju broja IPC. Kada se potvrđuje da je broj IPC inhibiran zbog prisustva antitela, može takođe da se pokaže da pomenuta antitela inhibiraju delovanje IPC. Šta se tiče proizvodnje IFN, inertni imunoglobulin koji je izveden iz iste životinjske vrste kao i antitelo čije se delovanje treba potvrditi može da se koristi kao komparativna kontrola. Broj IPC može da se kvantitativno poredi uz pomoć brojanja ćelija. Broj ćelija može da se utvrdi uz pomoć FACS ili mikroskopa.
Nadalje, poznato je da se IPC diferenciraju u ćelije koje indukuju Th2 i koje su poznate kao dendritne ćelije 2 (DC2) kao rezultat infekcije sa virusom ili slično. Kada bi se proizvodnja IFN u IPC nakon virusne stimulacije mogla inhibirati, takođe može da se inhibira njihova diferencijacija u Th2. Prema tome, može da se očekuje da monoklonsko antitelo iz ovoga pronalaska, koje inhibira proizvodnju IFN, takođe može da poseduje terapeutski efekt kod različitih alergijskih bolesti. Kada se antitelo, koje prepoznaje izvan-ćelijski domen iz humanog ILT7, administrira u domaćina koji je različit od organizma iz kojeg je pomenuto antitelo dobiveno, poželjno je da se pomenuto antitelo procesira u oblik koji ne može da se lako prepozna kao strana supstancija od strane domaćina. Na primer, imunoglobulin ne može da se lako prepozna kao strana supstancija ako se pomenuto antitelo procesira u dole navedene molekule. Poznata je tehnika za procesiranje imunoglobulinskih molekula, a opisana je ispod. Fragment koji sadrži region za vezanje antigena kojemu nedostaje konstantni region (Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, treće izdanje, Academic Press Limited. 1995; Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996).
Himerno antitelo koje je sastavljeno od regiona za vezanje antigena i konstantnog regiona imunoglobulina od domaćina ("Gene Expression Experiment Manual", Isao Ishida, Tamie Ando, ur., Kodansha, 1994)
CDR-supstituisano antitelo u kojem je region koji određuje komplementarnost (CDR) imunoglobulina iz domaćina zamenjen sa CDR od monoklonskog antitela ("Gene Expression Experiment Manual", Isao Ishida, Tamie Ando, ur., Kodansha, 1994).
Alternativno, humano antitelo može da se dobije uz korišćenje ne-humanih životinja, u kojima je gen za humano antitelo ugrađen, kao domaćine za imunizovanje. Na primer, transgeni miševi sa genima za humana antitela se koriste sa ciljem da se stvore humana antitela u imunizovanim životinjama (Ishida et al., Cloning and Stem Cells, 4: 85-95, 2002). Upotreba takvih životinja dozvoljava dobijanje humanog antitela koje prepoznaje ILT7 uz pomoć imunogena kao šta je ranije opisano. Preferirano je da se humano antitelo daje ljudima.
Alternativno, gen za varijabilni region iz humanog imunoglobulina može takođe da se dobije uz pomoć postupka izlaganja faga (phage display) (McCafferty J. et al., Nature 348:552-554, 1990; Kretzschmar T et. al., Curr Opin Biotechnol. 2002 Dec; 13(6): 598-602). U postupku izlaganja faga, gen koji kodira za varijabilni region iz humanog imunoglobulina se ugrađuje u genom faga. Takođe može da se pripremi biblioteka faga uz pomoć korišćenja više imunoglobulinskih gena. Fag eksprimira varijabilni region kao fuzionu belančevinu sa nekom belančevinom koja pripada fagu. Varijabilni region koji se eksprimira uz pomoć faga na površini faga zadržava veznu aktivnost prema nekom antigenu. Prema tome, fagi, koji se vežu na antigene ili ćelije u kojima se eksprimiraju pomenuti antigeni, se selektiraju, čime se omogućava pretraživanje biblioteke kako bi se pronašao onaj fag u kojem se eksprimira varijabilni region koji poseduje željenu vaznu aktivnost. Nadalje, gen koji kodira varijabilni region, koji ima željenu veznu aktivnost, se nalazi u česticama koje su na taj način selektirane. Odnosno, uz pomoć postupka izlaganja faga, gen koji kodira varijabilni region sa željenom veznom aktivnosti može da se dobije uz pomoć korišćenja pomenutu veznu aktivnost varijabilnog regiona kao indikatora.
U aktivnom inhibitoru IPC ili tokom postupka za inhibiranje delovanja IPC iz ovoga pronalaska, antitelo koje prepoznaje izvan-ćelijski domen iz humanog ILT7 ili fragment antitela koji sadrži barem region koji prepoznaje antigen iz pomenutog antitela može da se administrira belančevina ili polinukleotid koji kodira pomenutu belančevinu. Kod administriranja polinukleotida, poželjno je da se koristi vektor u kojem se polinukleotid koji kodira željenu belančevinu nalazi pod kontrolom odgovarajućeg promotora koji omogućava eksprimiranje željene belančevine. Pojačivač i terminator mogu takođe da se postave u pomenuti vektor. Vektor koji nosi gen za teški i laki lanac koji čine imunoglobulin i koji je sposoban da eksprimira pomenuti imunoglobulinski molekul je poznat.
Vektor koji je sposoban da eksprimira pomenuti imunoglobulin može da se administrira uz pomoć uvođenja u ćelije. Kod administriranja u žive organizme, vektor, koji može inficirati ćelije koje se administriraju živom organizmu, može da se administrira direktno. Tako, limfociti se odvajaju iz živih organizama, a tada se pomenuti vektor uvodi u pomenute limfocite, koji sada mogu da se vrate u pomenute žive organizme (ex vivo).
Kod aktivnog inhibitora IPC ili postupka za inhibiranje delovanja IPC na bazi ovoga pronalaska, šta se tiče količine monoklonskog antitela koje se administrira u žive organizme, pomenuti imunoglobulin se administrira u rasponu od 0.5 mg do 100 mg, na primer, 1 mg do 50 mg, preferirano 2 mg do 10 mg po kg telesne težine. Intervali administracije pomenutog antitela u žive organizme mogu da se prikladno podese tako da se održava efektivna koncentracija imunoglobulina u živim organizmima tokom trajanja tretmana. Specifično, na primer, pomenuto antitelo može da se administrira u intervalima od 1 do 2 sedmice. Ruta administracije je prema izboru. Stručnjaci u polju mogu da pravilno izaberu efektivnu rutu za administraciju tokom tretmana. Specifični primeri uključuju oralnu ili parenteralnu administraciju. Antitela se administriraju sistematski ili topikalno na primer, uz intravenoznu injekciju, intramišićnu injekciju, intraperitonealnu injekciju, supkutanu injekciju, ili slično. Primeri odgovarajuće formulacije za parenteralnu administraciju iz ovoga pronalaska uključuje rastvore za injektiranje, čepiće, i sprejove. Kada se antitelo daje ćelijama, imunoglobulin se dodaje u medijum kulture uobičajeno u rasponu od 1 µg/mL, preferirano 10 µg/mL, bolje 50µg/mL, još bolje 0.5 mg/mL. Kod aktivnog inhibitora IPC ili postupka za inhibiranje delovanja IPC iz ovoga pronalaska, pomenuto monoklonsko antitelo može da se administrira u žive organizme uz pomoć postupaka po izboru. Uobičajeno, pomenuto monoklonsko antitelo se meša sa nekom farmaceutski prihvatljivom potporom. Ako je potrebno, pomenuto monoklonsko antitelo može da se pomeša sa aditivima poput agenasa za ugušćivanje, stabilizera, prezervativa, i agenasa za rastvaranje. Primeri takve potpore ili aditiva uključuju, limunsku kiselinu, stearinsku kiselinu, magnezijum stearat, saharozu, skrob, talk, želatin, agar, biljno ulje, i etilen glikol. Termin "farmaceutski prihvatljiv" označava da je proizvod odobren od neke regulacione agencije određene zemlje ili je izlistan u Pharmacopeia iz svake zemlje ili se, opšte uzeto, radi o prepoznatoj Pharmacopeia koja se odnosu na upotrebu kod životinja, sisara, a specifično, ljude. Aktivni inhibitor IPC iz ovoga pronalaska može takođe da se obezbedi u formi pojedinačne ili višestrukih doza liofilizovanih prahova ili tableta. Nadalje, liofilizovani prahovi ili tablete mogu da se koriste u kombinaciji sa sterilnom vodom za injektiranje, slanim fiziološkim rastvorom ili puferovanim rastvorom za rastvaranje kompozicija sa ciljem da se dobije željena koncentracija pre administracije.
Nadalje, kada se monoklonsko antitelo administrira kao vektor, koji eksprimira imunoglobulin, teški i laki lanac se ko-transfektuju u različite plazmide i svaki plazmid može da se administrira u rasponu od 0.1 do 10 mg, na primer, 1 do 5 mg po kg telesne težine. Sa ciljem da se plazmidi uvedu u ćelije in vitro, sadržaj vektora za upotrebu je 1 do 5 µg/106 ćelija. U daljnjem tekstu ovaj će pronalazak biti specifično opisan uz pomoć Primera.
PRIMERI
Primer 1
A. Analiza ekspresije ILT7
A-1) Analiza uz pomoć SAGE biblioteke
Ekspresija gena u humanim monocitima, IPC, i HSV-tretiranim IPC je upoređena i analizirana uz pomoć postupka serijske analize genske ekspresije (Skraćeno od engleskog naziva: SAGE). Pomenuti postupak je sedeći. Monociti su odvojeni kao BDCA-4 pozitivne ćelije, a IPC su odvojeni kao CD14 pozitivne ćelije iz ljudske periferne krvi uz pomoć ćelijskog sortera. Nadalje, IPC se uzgajaju tokom 12 h u prisustvu Herpes simplex virusa (HSV), a tada su pripremljene diferencirane IPC. RNK je dobivena iz odgovarajućih ćelija, nakon pripreme SAGE biblioteke uz pomoć kompleta hemikalija I-SAGE (Poslovno ime) (proizvedenog od Invitrogen). Podaci o dobivenim baznim sekvencama za oko 100,000 privesaka su analizirani uz pomoć programa za analizu SAGE (proizvedenog od Invitrogen). Kao rezultat je pronađen gen čija je vrednost za monocite/IPC/IPC+HSV iznosila 0/16/0, naime, ILT7 (GenBank Pr. br.#NM_012276) koji je poznat kao gen, sa specifičnom ekspresijom u IPC. ILT7 je membranska belančevina sa domenima sličnim imunoglobulinu koja je kodirana uz pomoć bazne sekvence koja je prikazan u SEQ ID Br: 1 (Sl. 2(a)). Poznato je da se mRNK ILT7 eksprimira u IPC (Blood 100, 3295-3303 (2002)).
A-2) RT-PCR
Ekspresija ILT7 u hemocitima je ispitana u više detalja. Svaka ćelija je preparativno izolovana iz ljudske periferne krvi uz pomoć ćelijskog sortera. RNK su bile ekstrahovane iz svake izolovane ćelijske populacije, a nakon toga je sintetizovana cDNK. Kvantitativni PCR je proveden u skladu sa uobičajenim postupkom koristeći nastalu cDNK kao kalup, a nakon toga je analiziran nivo ekspresije mRNK ILT7. Korišćeni uslovi za PCR i bazne sekvence prajmera su sledeći:
Forward-prajmer: 5' CTC CAA CCC CTA CCT GCT GTC 3' (SEQ ID Br: 3)
Reverse-prajmer: 5' TTC CCA AGG CTC CAC CAC TCT 3' (SEQ ID Br: 4)
1 ciklus PCR (na 94° C tokom 3 min)
25 ciklusa PCR [na 94° C tokom 30 s, na 58° C tokom 30 s, i na 72° C tokom 1 min]
1 ciklus PCR (na 72° C tokom 6 min)
Ispitane su IPC stimulisane sa monocitima, IPC, HSV, i CD19 pozitivne ćelije (na primer, B-ćelije), CD3 pozitivne ćelije (na primer, T-ćelije), T-ćelije stimulisane sa PMA, i CD56 pozitivne ćelije (na primer, NK ćelije), a pronađeno je da se ILT7 eksprimira specifično u IPC (Sl. 1 (a)) .
A-3) Kvantitativni RT-PCR
Nadalje, ekspresija u drugim organima i tkivima je ispitana uz pomoć kvantitativnog PCR koristeći ABI PRISM 7000 (proizveden od Applied Biosystem). Kao cDNK panel su korišćeni BD (Poslovno ime) MTC cDNK panel višestrukog tkiva (Human I; Kat. Br. 636742, Humani imun; Kat. Br. 636748, Humane krvne frakcije; Kat. Br. 636750; svi su proizvedeni od Becton Dickinson) i ista cDNK koja je dobivena iz hemocita, kao šta je opisano pod 2).
Bazne sekvence prajmera su kako sledi:
Forward-prajmer za ILT7: 5' CCT CAA TCC AGC ACA AAA GAA GT 3' (SEQ ID Br: 5)
Reverse-prajmer za ILT7: 5' CGG ATG AGA TTC TCC ACT GTG TAA 3' (SEQ ID Br: 6)
Forward-prajmer za GAPDH: 5' CCA CCC ATG GCA AAT TCC 3' (SEQ ID Br: 7)
Reverse-prajmer za GAPDH: 5' TGG GAT TTC CAT TGA TGA CAA G 3' (SEQ ID Br: 8).
PCR je proveden uz pomoć ABI PRISM 7000 (proizveden od Applied Biosystem) i kompleta hemikalija SYBR green PCR master mix (proizveden od iste kompanije). Za analizu je korišćen program Sequence Detection System Software (proizveden od iste kompanije).
Uslovi reakcije su kako sledi:
Korak 1: 1 ciklus PCR (na 50° C tokom 2 min)
Korak 2: 1 ciklus PCR (na 95° C tokom 10 min).
Korak 3: 40 ciklusa PCR (na 95° C tokom 15 s, na 60° C tokom 1 min). Ekspresija ILT7 gena je bila upoređena za svako tkivo uz pomoć standardiziranja nivoa ekspresije gena za gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu (GAPDH), za kojeg se zna da se konstitutivno eksprimira. Kao rezultat je bilo primećeno da ILT7 nije bio eksprimiran organima koji nisu limfoidna tkiva, ali se eksprimira specifično u IPC.
B. Proizvodnja ILT7 i FcRγ ekspresioni vektori
Nakon toga, sa ciljem da se eksprimiraju ILT7 belančevine, provedeno je kloniranje i proizvodnja ekspresionih vektora.
B-1) Kloniranje ILT7 gena
Poli (A)+ RNK koja je izdvojena iz humane periferne krvi je ekstrahovana iz IPC, od kud je sintetizovana i cDNK koristeći se sa oligo dT prajmerom i sistemom Super Script Choice iz kompleta hemikalija cDNA Synthesis. EcoR I adapter je spojen na sintetizovanu cDNK, koja je ligirana u pME18S vektor koji je pocepan sa EcoR I, šta omogućava stvaranje biblioteke humane IPC cDNK. ILT7 gen je amplifikovan uz pomoć PCR koristeći proizvedenu biblioteku cDNK kao kalup kao i prajmere sa sledećim baznim sekvencama. 1 jedinica KOD Plus DNA polimeraze (proizvedene od TOYOBO CO., LTD.) je korišćena u PCR reakciji. Reakcioni uslovi su podešeni na 25 ciklusa PCR [na 94° C tokom 15 s, na 55° C tokom 30 s, i na 68° C tokom 2 min] nakon 1 ciklusa PCR na 94° C tokom 2 min. Forward-prajmer: 5' CAG GGC CAG GAG GAG GAG ATG 3' (SEQ ID Br: 9); Reverse-prajmer: 5' TCA GCA GAC ACT TCC CCA ACT 3' (SEQ ID Br: 10).
Amplifikovani fragment ILT7 cDNK od 2 kb je bio odvojen i obnovljen uz pomoć elektroforeze na 1% agaroznom gelu, koji je kloniran u plazmidni vektor pCR4 Blunt-TOPO (proizveden od Invitrogen) koristeći komplet hemikalija Zero Blunt TOPO PCR Cloning (proizveden od Invitrogen). Bazne sekvence dobivenih gena su analizirane, pri čemu je dobiven željeni ILT7 gen prikazan u SEQ ID Br: 1.
B-2) Proizvodnja FLAG-označenih ILT7 ekspresionih vektora
Konstruiran je plazmid koji eksprimira belančevinu u kojoj su FLAG privesci fuzionisani na N- i C-terminusu iz ILT7. ILT7 je bio fuzionisan sa priveskom koji omogućava potvrđivanje ekspresiju ILT7 belančevine uz pomoć detektovanja pomenutog priveska. Željena sekvenca je amplifikovana uz pomoć PCR koristeći ILT7 gen koji je proizveden kao šta je opisano pod 1) kao kalup kao i prajmere sa dole navedenim baznim sekvencama. 1 jedinica KOD Plus DNA polimeraze (proizvedene od TOYOBO CO., LTD.) je bila korišćena za PCR reakciju. Reakcioni uslovi su podešeni na 25 ciklusa PCR [na 94° C tokom 15 s, na 55° C tokom 30 s, i na 68° C tokom 2 min] nakon 1 ciklusa PCR na 94° C tokom 2 min.
Za N-FLAG ILT7
Forward-prajmer (SEQ ID Br: 11): 5' CCG ctc gag ATG ACC CTC ATT CTC ACA AGC CTG CTC TTC TTT GGG CTG AGC CTG GGC [GAT TAC AAG GAT GAC GAC GAT AAG] CCC AGG ACC CGG GTG CAG GCA GAA 3'
Reverse-prajmer (SEQ ID Br: 12): 5' C TAG act agt TCA GAT CTG TTC CCA AGG CTC 3' za C-FLAGILT7
Forward-prajmer (SEQ ID Br: 13): 5' CCG ctc gag ATG ACC CTC ATT CTC ACA AGC 3'
Reverse-prajmer (SEQ ID Br: 14): 5' C TAG act agt TCA [CTT ATC GTC GTC ATC CTT GTA ATC] GAT CTG TTC CCA AGG CTC 3'.
U malopre pomenutim baznim sekvencama, svaki podvučeni deo u uglatoj zagradi pokazuje baznu sekvencu koja kodira spojeni FLAG privesak, a svako malo slovo prikazuje mesto cepanja restrikcionog encima Xho I ili Spe I. DNA fragmenti koji su amplifikovani uz pomoć PCR su pocepani sa Xho I i Spe I, a nakon toga su razdvojeni uz pomoć gel-elektroforeze. Dobivenu su DNA fragmenti od 2 kb, koji su bili ligirani u pME18X vektor koji je pocepan sa Xho I i Spe I na isti način kao i malopre. Na taj način su konstruisana dva tipa plazmida, odnosno pME18X-N-FLAG ILT7 i pME18 X-C-FLAG ILT7, koji mogu da eksprimiraju željenu fuzionu belančevinu.
B-3) Kloniranje FcRγ gena
FcRγ belančevina je konstruisana kao belančevina koja je sposobna da se spaja sa ILT7 belančevinom. Ovaj molekul je gen sa baznim sekvencama i amino-kiselinskim sekvencama SEQ ID Br: 15 i 16 (Genbank Pris.# NM_0041 06, J. Biol. Chem. 265, 6448-6452 (1990)). Pomenuti molekul je molekul (γ-lanac) koji čini FcεRI, odnosno IgE receptor visokog afiniteta. Mada se takođe označava i sa FcεRIy, ovde će se koristiti oznaka FcRγ. U tom pogledu, ovaj molekul je takođe poznat kao komponenta od FcRγ ili FcαR. Ovaj gen je kloniran uz pomoć PCR postupka kao šta je prikazano ispod sa ciljem da se proizvedu ekspresioni vektori. FcRγ gen je amplifikovan uz pomoć PCR postupka koji koristi cDNK biblioteku iz humanih IPC, koja je načinjena kao šta je opisano pod 1), kao kalup i takođe uz korišćenje prajmera sa sledećim baznim sekvencama. 1 jedinica KOD Plus DNA polimeraze (proizvedena od TOYOBO CO., LTD.) je korišćena za PCR reakciju. Reakcioni uslovi su podešeni na 25 ciklusa PCR [na 94° C tokom 15 s, na 55° C tokom 30 s, i na 68° C tokom 1 min] nakon 1 ciklusa PCR na 94° C tokom 2 min.
Forward-prajmer: 5' CCC AAG ATG ATT CCA GCA GTG 3' (SEQ ID Br: 17).
Reverse-prajmer: 5' GGA AGA ACC AGA AGC CAA AGA 3' (SEQ ID Br: 18). cDNK fragment od 0.3 kb od FcRγ je amplifikovan, odvojen i obnovljen uz pomoć elektroforeze koristeći 2% agarozni gel, koji je kloniran u pCR4 Blunt-TOPO plazmidni vektor (proizveden od Invitrogen) uz pomoć kompleta hemikalija Zero Blunt TOPO PCR Cloning (proizveden od Invitrogen). Bazne sekvence dobivenih gena su analizirane, čime je potvrđeno da je kloniran željeni FcRγ gen koji je prikazan u SEQ ID Br: 15.
B-4) Proizvodnja Myc-označenih FcRγ ekspresionih vektora
Plazmid koji eksprimira belančevinu kojoj je dodan Myc-privesak na C-terminusu je konstruirana tako da se može potvrditi ekspresija FcRγ belančevine. Željena sekvenca je amplifikovana uz pomoć PCR postupka koristeći FcRγ gen, koji je bio proizveden kao šta je opisano pod 3), kao kalup i takođe uz korišćenje prajmera sa sledećim baznim sekvencama. 1 jedinica KOD Plus DNA polimeraze (proizvedena od TOYOBO CO., LTD.) je korišćena za PCR reakciju. Uslovi su podešeni na 25 ciklusa PCR [na 94° C tokom 15 s, na 55° C tokom 30 s, i na 68° C tokom 1 min] nakon 1 ciklusa PCR na 94° C tokom 2 min.
Forward-prajmer (SEQ ID Br: 19): 5' CCG ctc gag ATG ATT CCA GCA GTG GTC TTG 3'
Reverse-prajmer (SEQ ID Br: 20): 5' CTA Gac tag tCT A[CA GAT CCT CTT CAG AGA TGA GTT TCT GCT C] CT GTG GTG GTT TCT CAT G 3'.
U malopre pomenutim sekvencama za prajmere, podcrtani deo u uglatim zagradama označava baznu sekvencu koja kodira spojeni Myc-privesak, a mala slova pokazuju mesto cepanja za restrikcione encime Xho I ili Spe I. DNA fragmenti koji su amplifikovani uz pomoć PCR su pocepani sa Xho I i Spe I, koji su tada odvojeni uz pomoć gel-elektroforeze. Dobiveni su DNA fragmenti od oko 0.3 kb, koji su ligirani u pME18X vektor koji je pocepan sa Xho I i Spe I na isti način kao šta je malopre opisano. Na taj način je konstruisan plazmid, odnosno pME18X-Myc-FcRγ, koji je sposoban da eksprimira željenu fuzionu belančevinu.
C. Ekspresija ILT7 u životinjskim ćelijama
Ekspresija ILT7 u životinjskim ćelijama je ispitana uz pomoć ekspresionih vektora koji su proizvedeni kao šta je malopre opisano.
C-1) Ekspresija u 293T ćelijama
DNA koje sadrže sledećih pet kombinacija (navedene ispod) su uvedene u 293T ćelije (7x105 ćelija) uz pomoć kompleta hemikalija Effectene transfection (proizveden od Qiagen). Dva dana nakon uvođenja je provedena analiza uz pomoć protočne citometrije (FCM analiza).
(1) pME18X-N-FLAG ILT7 2 g
(2) pME18X-C-FLAG ILT7 2 g
(3) pME18X-N-FLAG ILT7 1 g + pME18X-Myc-FcRγ 1 g
(4) pME18X-C-FLAG ILT7 1 g + pME18X-Myc-FcRγ 1 g
(5) pME18X-Myc-FcRγ 2 g.
Postupak FCM analize se proveden na isti način kao šta je opisano u A-4 Primer 2. Cy3 koji je konjugiran sa anti-Flag antitelom (proizvedeno od Sigma) je korišćen za reakciju, analiza je provedena na FACScan (proizveden od Becton Dickinson). Kao rezultat je bilo pronađeno da je veoma mala količina ILT7 bila eksprimirana na površini ćelije kada je bio sam za sebe, dok je ILT7 bio eksprimiran izvan-ćelijski i u puno većoj količini kada je bio zajedno sa FcRγ, (Sl. 3). Poznato je da mišji FcRγ poseduje veoma visoku homologiju sa humanim FcRγ. Međutim, kada su kao domaćini bile korišćene p815 ćelije (mišji mastocitom) koji eksprimiraju mišji FcRγ, ekspresija ILT7 se nije mogla primetiti.
C-2) Analiza uz pomoć imunoprecipitacije i Western-blota
ILT7 je eksprimiran zajedno sa FcRγ na površini ćelije, šta je bio potvrđeno kako je opisanu u sledećem tekstu. Nakon imunoprecipitacije, analizirana su brojna antitela za svaku 293T ćeliju koja je ko-eksprimirala oba gena u kombinacijama koje su opisane od (1) do (5). DNA su bile uvedene u 293T ćelije (7x105 ćelije), koje su bile obnovljene na isti način, dva dana nakon uvođenja, kao šta je opisano pod 1). Ćelijske frakcije su rastvorene u puferu za lizu (0.5% Triton, 150 mM Nacl), koji je ostavljen da stoji na ledu tokom 20 min. Nakon toga, uz pomoć igle (27G) je provedena aspiracija koja je bila ponovljena nekoliko puta, a nakon toga je usledilo centrifugovanje na 15 Krpm tokom 20 min. Dodano je anti-myc antitelo (2 g, proizvedeno od Santa Cruz biotechnology) ili anti-Flag antitelo (2 g, proizvedeno od Sigma) u 200 g lizata nastalih produkata, a sve je pomešano rotacijom na 4° C tokom 4 h. Tada je dodana mešavina Protein A/G Sepharose 4 Fast Flow (proizvedena od Amersham Bioscience), sve je mešano rotiranjem na 4° C tokom 1 h. Tada su nastale precipitirane frakcije oprane sa puferom za lizu uz pomoć sledeće kompozicije sa puferom za lizu, 3 puta:
0.5% TritonX-100,
50 mM HEPES (pH 7.6),
150 mM NaCl,
1 mM EDTA,
10% glicerol,
1 mM DTT,
2 mM PMSF,
1 g/ml aprotinin,
1 g/ml leupeptin,
1 g/ml pepstatin A,
0.1 g/ml himostatin,
1 mM Na3VO4,
0.1 mM –glicerofosfat.
Dodan je pufer za SDS-PAGE u isprane precipitate, sve je grejano tokom 5 min i centrifugovano, a nakon toga je provedena elektroforeza na 10% SDS gelu. Nakon elektroforeze, primerci su preneseni na PVDF membranu (membrana: Immobilon-P transfer, proizvedena od Millipore) u skladu sa uobičajenim postupkom. Blotiranje je provedeno sa anti-Flag antitelom i anti-myc antitelom. Bilo je potvrđeno da je ILT7, spojen sa FcRγ, prisutan u 293T ćelijama zbog njihovog prisustva u svakom imuno-precipitatu (Sl. 4).
C-3) Analiza šećernog lanca
Budući je bilo primećeno nekoliko vrpci ILT7 tokom Western-blot analize, ispitana je mogućnost da je ILT7 bio glikozilovan. 200 g lizata 293T ćelija koje su eksprimirale N-FLAG ILT7 i Myc-FcRγ je imunoprecipitirano sa anti-Flag antitelom na način koji je opisan pod 1) i 2). Nakon toga, precipitirane frakcije su suspendovane u 60 L pufera za N-glikozidazu sa sledećom kompozicijom (ispod), a 30 µL svakog nastalog rastvora je smešteno u dve tube. Pufer za N-glikozidazu:
10 mM EDTA,
0.2% SDS,
0.5% TritonX100,
1% 2-merkaptoetanol u PBS (fosfatni pufer)
Tada, 3 jedinice (3 µL) N-glikozidaze (#1365177, proizvedene od Roche) su dodane u jednu tubu, koja je držana na 37° C tokom 15 h. Nadalje, dodano je 7 µL pufera za primerak, koji je bio grejan na 100° C tokom 5 min, a nakon toga je usledila elektroforeza na 10% SDS-gelu. Nakon elektroforeze, gel je prenesen na PVDF membranu, kojoj je dodan 1 µg poliklonskog anti-ILT7 antitela kao šta je opisano pod 4) i sve je čuvano na 4° C tokom noći. Nastao produkt je ispran sa TBS-T puferom i reagovan sa HRP-označenim anti-zečjim antitelom (100,000-puta razređeno) (proizvedeno od Jackson) na sobnoj temperaturi. Tada je sve obojeno sa sistemom ECL Western Blotting Detection (proizveden od Amersham Bioscience). Kao rezultat, molekularna masa je opala kao posledica tretmana sa N-glikozidazom. Tako, zaključilo se da je ILT7 imao šećerne lance (Sl. 5).
C-4) Proizvodnja poliklonskog anti-ILT7 antitela
Korišćeno poliklonsko anti-ILT7 antitelo kao šta je opisano pod 3) je proizvedeno kako sledi. Peptid od 23 amino-kiseline koji odgovara C-terminusu ILT7 (CSQEANSRKDNAPFRWEPWEQI; SEQ ID Br: 21) je hemijski sintetizovan i vezan na KLH belančevinu koja je nosilac, a nastao produkt je korišćen kao imunogen. Zečevi su odmah imunizovani sa imunogenom pomešanim sa Freund-ovim kompletnim dodatkom. Nakon ukupno šest imunizovanja (jednom sedmično), povećani titar antitela u serumu je potvrđen, a nakon toga se sakupljena sva krv. Tada, malo seruma je afinitetno prečišćeno uz pomoć peptidne kolone iste sekvence. Nastao produkt je određen kao poliklonsko anti-ILT7 antitelo.
Primer 2
A. Proizvodnja monoklonskog anti-ILT7 antitela
A-1) Proizvodnja imunogena
Ćelije koje se koriste kao imunogeni su pripremljene uz pomoć uvođenja gena u 293T ćelije kao šta je opisano ispod. 4 µg transgena (pME18 X-C-FLAG ILT7 23.2 µg i pME18X-Myc-FcRy 23.2 g) je dodano u dno posude od 100 mm koja je bila prekrivena sa kolagenom (IWAKI) i u koju je bilo dodano 3 mL opti-MEM (GIBCO), a onda je sve pomešano. Nakon toga, osim rastvora transgena, 58 L lipofektamina (Poslovno ime) 2000 (Invitrogen) je razređeno sa mL opti-MEM, sve je ostavljeno da stoji na sobnoj temperaturi tokom 5 min, a nakon toga je pripremljen rastvor lipofektamina. Nakon toga, rastvor lipofektamina je pažljivo dodan u posudu koja je sadržavala rastvor sa transgenom i sve je mešano. Nakon stajanja na sobnoj temperaturi tokom 20 min u posudu je pažljivo dodano 10 mL 293T-ćelija, razređenih do 1x106 ćelija/mL koristeći medijum DMEM (SIGMA) koji je sadržavao 10% FBS (fetalni kravlji serum). Nastao medijum je uzgajan kao statička kultura u inkubatoru na 37° C u atmosferi CO2 tokom 48 h, iz koje su ćelije obnovljene uz pomoć pipete. Dobivene ćelije su korišćene kao transfektanti za imunogene.
A-2) Proizvodnja hibridoma
Jedan dan pre imunizovanja ćelija, 50 L emulzije, koja je dobivena uz pomoć mešanja 200 L PBS sa 200 L kompletnog dodatka (FREUND) (M606-1, proizveden od Mitsubishi Kagaku Latron, Inc.), je uvedena u obe stražnje noge četiri ženke miša soja Balb/c (koje su bile stare četiri sedmice) sa ciljem imunizovanja. Sledećeg dana je imunizovano 50 L 2x107 ćelija suspendovanih u 400 L PBS. Druga i treća imunizacija su provođene svaka četiri dana. Tri dana nakon trećeg imunizovanja, ćelijska fuzija je provedena kako sledi. Ćelije su sakupljene iz limfnih čvorova stražnjih nogu imunizovanih miševa. Mišje ćelije mijeloma P3-X63-Ag8-U1 koje su bile uzgajane u medijumu RPM11640 (SIGMA), koji je sadržavao 10% FBS, su pomešane sa ćelijama koje su dobivene iz limfnih čvorova tako da je omer ćelija mišjeg mijeloma u odnosu na ćelije dobivene iz limfnih čvorova bio od 2:1 do 10:1, a ćelije su bile sakupljene uz pomoć centrifugovanja. Dobivenim ćelijskim frakcijama je dodan PEG4000 (MERCK) koji je bio ekvivalentno razređen sa medijumom RPMI 1640, a ćelije su podvrgnute fuziji. Nakon ispiranja ćelija, nastao produkt je suspendovan u 160 mL 15% medijuma FBS-HAT koji je sadržavao dodatak, a tada je inokuliran u šesnaest pločica sa 96-rupica u koncentraciji od 200 L/rupici. Medijum za kulturu je izmenjen nakon tri dana. Jedna do dve sedmice nakon pojave kolonija, provedena je primarna pretraga.
A-3) Pretraga hibridoma uz pomoć postupka ćelijske ELISA
Hibridom, koji proizvodi željeno antitelo, je pretražen uz pomoć sledećeg postupka (ćelijska ELISA). Ćelije koje su proizvedene kao šta je opisano pod 1) su korišćene u koncentraciji od 1x107 ćelija po pločici sa 96-rupica, pri čemu su pomenute ćelija bile suspendovane u 0.5% BSA/2 mM EDTA/PBS, a tada su dodane u pločicu za ćelijsku ELISA (NUNC 249570 96V NW PS) u koncentraciji od 100 L/rupici. Sve je centrifugovano na 2,000 rpm na 4° C, a supernatant je odbačen. Dodan je supernatant kulture sa primercima u koncentraciji od 50 µL/rupici, i sve je ostavljeno na sobnoj temperaturi tokom 30 min. Operacija ispiranja je provedena dodavanjem 0.5% BSA/2 mM i EDTA/PBS u svaku rupicu, centrifugovanjem na 2,000 rpm na 4° C tokom 2 min, a odbacivanje supernatanta je provedeno dva puta. Nakon ispiranja u svaku rupicu je dodano 50 µL/rupici 10,000-puta razređenog kozjeg anti-mišjeg IgG antitela označenog sa peroksidazom (IM0819; Beckman Coulter) i sve je ostavljeno tokom 30 min. Operacija ispiranja sa 0.5% BSA/2 mM-EDTA/PBS je provedena dva puta, a nakon toga je dodan rastvor za bojanje. Pripremljeni rastvor antitela je zamenjen sa PBS (-) uz pomoć membrane za dijalizu (10,000 rezova, proizvedena od PIERCE) sa ciljem da se dobije prečišćena anti-ILT7 himerna antitela.
A-4) Ispitivanje odgovora antitela uz pomoć analize sa protočnom citometrijom (FCM)
Supernatant iz kulture hibridoma je bio analiziran uz pomoć protočne citometrije (FCM). Ćelije proizvedene kao šta je opisano pod 1) su suspendovane u 0.5% BSA/2 mM EDTA/PBS, sve je stavljeno u tubu za centrifugovanje (1x105 po primerku), a nakon toga je dodano 40 L svake kulture i ostavljeno da stoji na sobnoj temperaturi tokom 30 min. Operacija ispiranja uključuje dodavanje 1 ml 0.5% BSA/2 mM i EDTA/PBS u svaku tubu, centrifugovanje na 1200 rpm na 4° C tokom 3 min, i odbacivanje supernatanta što je provedeno dva puta. Nakon ispiranja u svaku rupicu je dodano 40 L 100-puta razređenog kozjeg anti-mišjeg IgG antitela označenog sa FITC (IM0819; Beckman Coulter), i sve je ostavljeno na sobnoj temperaturi tokom 30 min. Operacija ispiranja je provedena dva puta sa 0.5% BSA/2 mM-EDTA/PBS, a nakon toga je sve analizirano uz pomoć protočne citometrije FC500 (Beckman Coulter). Selektiran je hibridom koji proizvodi antitelo, koje odgovara specifično na ćeliju u kojoj je uveden gen i ne odgovara na druge ćelije domaćine. Selektirani hibridom je kloniran uz pomoć postupka ograničenog razređenja nakon čega su dobiveni hibridomi #11 i #17 koji proizvode monoklonska antitela.
B. Ispitivanje odgovora anti-ILT7 antitela
ILT7 koji nosi FLAG-privesak na N-terminusu je ko-eksprimiran sa FcRγ molekulom u 293T ćelijama na isti način kao šta je opisano pod C-1) iz Primera 1. Tada, odgovor antitela koje je dobiveno u Primeru 2 je potvrđen uz pomoć analize FCM koristeći FACScan (Becton Dickinson). Kao rezultat je bilo potvrđeno da su sva antitela, koja su proizvedena od hibridoma #11 i #17, koji su dobiveni kao šta je opisano pod A, odgovorila na ćelije u kojima je ILT7 gen bio uveden i koje su eksprimirale ILT7 (Sl. 6 (b)). Nadalje, limfociti su odvojeni iz ljudske periferne krvi koristeći Ficoll, a tada je provedeno dvostruko bojanje uz pomoć proizvedenog anti-ILT7 antitela i anti-BDCA-2 antitela označenog sa PE (Miltenyi). Tada je ispitan odgovor na limfocite. Kao rezultat, detektovano je vezanje monoklonskog antitela proizvedenog od hibridoma #11 i #17 na BDCA-2 pozitivne ćelije. Odnosno, bilo je potvrđeno da oba monoklonska antitela prepoznaju ILT7 molekule koji se eksprimiraju na ljudskim IPC (Sl. 6 (a)). Ova monoklonska antitela su označena kao anti-ILT7 antitelo #11 i anti-ILT7 antitelo #17. Provedena je detaljna analiza.
Analiza višestrukog bojanja limfocita iz ljudske periferne krvi je provedena uz pomoć proizvedenog anti-ILT7 antitela, anti-Linija-1 antitela (anti-CD3, CD14, CD16, CD19, CD56 antitela; Becton Dickinson), anti-CD123 antitela (Becton Dickinson), i anti-BDCA-2 antitela (Miltenyi). Šta se tiče frakcija koje su bile pozitivne na ILT7 antitelo, marker za liniju je bio negativan, CD123 je bio pozitivan, a BDCA-2 je bio pozitivan. Iz rezultata je bilo potvrđeno da su IPC bili obojeni samo sa ILT7#11 i ILT7#17 (Sl. 7).
Nadalje, ekspresija brojnih molekula je ispitana uz pomoć FCM analize kada su limfociti iz ljudske periferne krvi bili stimulisani sa CpG ili IFNα tokom 24 h. CpGODN2216 je korišćen kao CpGA, šta potiče proizvodnju IFN u PC, a CpGODN2006 je korišćen kao CpGB šta potiče sazrevanje dendrita (Moseman et al. J. Imunology. 173, 4433-4442, 2004 ). Prolaz je bio podešen na frakciju koja je bila negativna na linijski marker. Kada je analiziran odgovor anti-BDCA-2 antitela i anti-ILT7 antitela na CD123 pozitivne ćelije, najveći broj frakcija pozitivnih za ILT7 je nestao čak i nakon 24-časovne stimulacije sa CpG. Sa druge strane, neke ćelije BDCA-2 su se pokazale pozitivnima nakon 24-časovne stimulacije sa CpG (Sl. 8). Bilo je razmatrano da se IPC diferenciraju u različite ćelije odmah nakon CpG stimulacije. Pokazalo se da je anti-ILT7 antitelo iz ovoga pronalaska korisno kao antitelo koje je specifično za razvojnu fazu IPC. Nadalje, bilo je potvrđeno da IPC u limfocitima iz periferne krvi nisu bili diferencirani u prisustvu IFNα, u slučaju kada je omer preživljenja visok, da se ekspresija ILT7 održavala u IPC, da je ILT7 je bio stabilno prisutan na IPC kod auto-imunih bolesti pri čemu je postojala mogućnost da IFN iz seruma pokazuje visoki nivo.
C. Ispitivanje specifičnosti anti-ILT7 antitela
ILT7 pripada ILT/LIR porodici, a postoji i mnoštvo drugih molekula sa visokom homologijom, pobliže sa visokom homologijom u odnosu na izvan-ćelijski region (Sl. 9). Poznato je da se mRNK pomenutih molekula, posebno takvih kao ILT2 i ILT3, eksprimira u IPC (Ju et al. Gene 331, 159-164, 2004 ). Prema tome, odgovor ovih molekula je bio potvrđen uz pomoć transgenih ćelija.
C-1) Kloniranje ILT1 molekula i proizvodnja ekspresionih vektora
cDNK je sintetizovana iz RNK koja je dobivena iz ljudskih krajnika koristeći oligo dT prajmere uz pomoć kompleta hemikalija SuperScript Choice System za sintezu cDNK. Sledeće, Not I adapter je bio ligiran u pME18S vektor koji je prethodno bio pocepan sa Not I; šta je omogućilo konstruiranje cDNK biblioteke iz ljudskih krajnika.
ILT1 gen sa FLAG-priveskom na C-terminusu je umnožen uz pomoć PCR koristeći već pomenutu cDNK biblioteku kao kalup kao i prajmere sa dole navedenim sekvencama. 1 jedinica KOD Plus DNA polimeraze (proizvedene od TOYOBO CO., LTD.) je korišćena za PCR reakciju. Reakcioni uslovi su podešeni na 25 ciklusa PCR [na 94° C tokom 15 s, na 55° C tokom 30 s, i na 68° C tokom 2 min] nakon 1 ciklusa PCR na 94° C tokom 2 min.
Forward-prajmer (SEQ ID Br: 22): 5' CCG ctc gag ATG ACC CCC ATC CTC ACG GTC C 3'.
Reverse-prajmer (SEQ ID Br: 23): 5' CTA Gac tag tTC A[CT TAT CGT CGT CAT CCT TGT AAT C]CC TCC CGG CTG CAT CTT G 3'.
U malopre pomenutim prajmerskim sekvencama, podcrtani deo u zagradama pokazuje baznu sekvencu koja kodira spojeni FLAG-privesak, a svako malo slovo pokazuje mesto cepanja restrikcionog encima Xho I ili Spe I. DNA fragmenti amplifikovani uz pomoć PCR su pocepani sa Xho I i Spe I, a tada su razdvojeni na gel-elektroforezi. Dobiveni su DNA fragmenti od oko 2 kb, koji su bili ligirani u pME18X vektor koji je bio pocepan sa Xho I i Spe I na isti način kao šta je malopre opisano. Na taj način je konstruisan plazmid koji je sposoban da eksprimira poželjnu fuzionu belančevinu, odnosno pME18X-C-FLAGILT1. Bazna sekvenca i amino-kiselinska sekvenca su prikazane u SEQ ID Br: s: 24 i 25.
C-2) Proizvodnja ćelija koje mogu da vrše ekspresiju i ispitivanje odgovora antitela
Šta se tiče ILT2 (SEQ ID Br: 26) i ILT3 (SEQ ID Br: 28), korišćeni su ekspresioni vektori u kojima su odgovarajući geni klonirani u Xho I ili Spe I mesta iz pcDNA4.1 (proizveden od Invitrogen). DNA sledećih kombinacija su uvedene u 293T ćelije (7 x 105 ćelija) na isti način kao šta je opisano pod C-1). Dva dana nakon uvođenja provedena je FCM analiza, a tada je analizirano anti-ILT7 antitelo.
(1) pME18X-N-FLAG ILT7 1 µg + pME18X-Myc-FcRy 1 µg
(2) pME18X-C-FLAG ILT1 0.5 µg + pME18X-Myc-FcRγ 0.5 µg + pcDNA4.1-ILT2 0.5µg + pcDNA4.1-ILT3 0.5 µg.
Kao rezultat niti jedno antitelo nije odgovorilo u ćelijama u kojima se ILT1 eksprimirao. Zbog toga je sugerisano da pomenuta anti-ILT7 antitela specifično prepoznaju ILT7 molekule na IPC (Sl. 10).
Primer 3
Efekt anti-ILT7 antitela na sposobnosti proizvodnje humanog IFN
Limfociti iz ljudske periferne krvi su inokulirani u pločicu sa 96-rupica u koncentraciji od 2 x105 ćelija/rupici, i sve je bio reagovano sa 5 µg/mL različitih antitela na 37° C. Nakon kultiviranja tokom 1 h, dodan je virus PR8 (influenca). Nakon kultiviranja tokom 24 h, IFNα u supernatantu iz kulture je izmeren uz pomoć kompleta hemikalija za ELISA test (Bender Med System). Kao rezultat, proizvodnja IFN je bila inhibirana uz pomoć dodavanja anti-ILT7 antitela (Sl. 11). Naime, bilo je pronađeno da je proizvodnja IFN u IPC bila narušena zbog delovanja anti-ILT7 antitela iz ovoga pronalaska.
Primer 4
CDC aktivnost anti-ILT7 antitela
A. Proizvodnja monoklonskog anti-ILT7 antitela
Klon koji proizvodi monoklonsko antitelo je dobiven na isti način kao šta je opisano u koracima A-1) do A-4) iz Primera 2. Odgovor je ispitan na isti način kao šta je opisano u koraku B iz Primera 2, a specifičnost je ispitana na isti način kao šta je opisano u koraku C iz Primera 2. Kao rezultat, dobiveni su hibridomi #37, #28, i #33 koji su proizvodili monoklonska anti-ILT7 antitela sa dobrim odgovorom i specifičnosti. CDC aktivnost je izmerena kao šta je opisano ispod uz pomoć monoklonskog anti-ILT7 antitela pri čemu su ispitana tri tipa pomenuta hibridoma.
B. Određivanje CDC aktivnosti
B-1) Tokom prethodnog dana proizvodnje cilja
Za proizvodnju ciljane ćelijske linije (ILT7-CHO ćelijska linija), dole navedena DNA je bila uvedena u CHO-k1 ćelije, koje su bile inokulirane u koncentraciji od 6 x 105 ćelija po jednoj posudi (6 cm) koristeći Effectene Transfection Reagent (proizveden od QLAGEN), a nastali sojevi su selektirani uz pomoć 800 Lg/ml Zeocina (proizveden od Invitrogen).
Uvedena DNA: pcDNA3.1-C-FLAG ILT7 1 µg + pME18X-Myc FcRγ 2 µg.
Nakon toga je, uz pomoć ćelijskog sortera, dobivena ćelijska linija koja veoma dobro eksprimira ILT7 (BD FACSAria, proizveden od Becton Dickinson). Uz pomoć FCM analize je bilo potvrđeno da selektirana ćelijska linija veoma dobro eksprimira ILT7. Operacija FCM analize je bila provedena u skladu sa postupkom koji je opisan pod A-4) iz Primera 2 osim šta je korišćen BD FACSCaliber (proizveden od BD) umesto FCM. Sledeća antitela su korišćena kao primarno antitelo i sekundarno antitelo.
Primarno antitelo: 5 µg/ml mišje anti-ILT7 antitelo (#37),
Sekundarno antitelo: poliklonsko kozje anti-mišje antitelo specifično za imunoglobulin konjugirano sa R-fikoeritrin (R-PE) (BD).
B-2) Odgovor ciljanih ćelija na anti-ILT7 antitela
Dobivene ciljne ćelije kao šta je opisano pod B-1) (ILT7-CHO ćelije) su obnovljene uz pomoć 5 mM rastvora EDTA/PBS, a nakon toga su suspendovane u CDC medijumu sa sledećom kompozicijom tako da se postigne koncentracija od 4 x 105 ćelija/ml. Suspenzija je raspoređena u svaku rupicu na pločici sa 96-rupica u koncentraciji od 50 µl/rupici.
CDC medijum:
RPMI1640
0.1% BSA
100 jedinica penicilina po ml
100 µg/ml streptomicina
10 mM Hepes (pH 7.6)
2 mM L-glutamin.
50 µl rastvora sa anti-ILT7 antitelom pripremljenog u CDC medijumu je dodano u svaku rupici i sve je pomešano tako da konačna koncentracija antitela bude 0.1 µg/ml, 0.5 µg/ml, 1 µg/ml, i 5 µg/ml. Nadalje, 50 µl CDC medijuma koji sadrži komplement sa dole navedenom kompozicijom je dodano i sve je pomešano tako da je konačna koncentracija komplementa bila 6%, a nakon toga je usledilo kultiviranje na 37° C tokom 2 h. CDC medijum koji sadrži komplement:
1 ml komplementa mladog zeca (Kataloški Br.: CL3441, proizveden od CEDARLANE) CDC medijum (vide supra).
Tada je suspenzija centrifugovana (uslovi centrifugovanja: na 250 G tokom 4 min), a supernatant je obnovljen vodeći brigu da ne bude kontaminovan sa ćelijama. LDH u supernatantu je izmeren uz pomoć običnog postupka, koji je određen kao "Količina LDH koji je iscurio iz ciljnih ćelija preko delovanja komplementa" (Eksperimentalni primerak).
Sledeći parametri su takođe određeni sa ciljem da se proceni CDC aktivnost.
Spontano oslobađanje LDH iz ciljnih ćelija: samo ciljne ćelije su kultivisane i pripremljene u istom volumenu kao i primerak.
Maksimalno oslobađanje LDH iz ciljanih ćelija: samo ciljane ćelije su kultivisane i pripremljene u istom volumenu kao i primerak, a tada je dodan rastvor TritonX-100, koji se nalazi u kompletu hemikalija, 60 min pre obnavljanja supernatanta tako da je konačna koncentracija 0.8%.
Kontrola za korekciju volumena: u medijum kulture sa istim volumenom kao i primerak je dodana ista količina TritonX-100 istovremeno kada je pripremljeno maksimalno oslobađanje LDH iz ciljanih ćelija.
Pozadina medijuma za kulturu: medijum za kulturu istog volumena kao i primerak i rastvor koji je dodan CDC medijum koji sadrži komplement su dodani u kulturu u istom volumenu kao i primerak.
Isti volumen medijuma za kulturu kao i kod primerka je oduzet od apsorbancije od pokušaja Ciljano maksimalno i Ciljano spontano. Rastvor u kojem je dodan CDC medijum, koji sadrži komplement tako da se postigne isti volumen kao i kod primerka, je oduzet od apsorbancije za Eksperimentalni primerak i sve je korigirano. CDC aktivnost je izračunata uz pomoć dole navedene jednačine. Rezultati su prikazani u Tabli 1 i na Sl. 12. Čak i u slučaju kada su korišćena monoklonska anti-ILT7 antitela dobivena iz hibridoma, 80% ili više CDC aktivnosti je prisutno kada je koncentracija antitela bila 0.5 µg/ml ili više.
Tabela 1
Koncentracija antitela
Citotoksičnost (Pros.)
Citotoksičnost (STD)
#37
0.1
14.78
3.16
0.5
85.50
0.60
1
86.13
2.93
5
90.26
1.87
#28
0.1
18.52
0.60
0.5
80.97
1.62
1
83.64
1.99
5
88.17
3.32
#33
0.1
4.42
1.58
0.5
82.16
3.35
1
85.39
2.78
5
86.18
1.71
Mišji IgG2a
0.1
1.53
0.60
0.5
1.47
2.50
1
3.68
2.90
5
3.06
1.72
bez Ab
0
2.10
0.49
Komparativni primer 1
Potpuno ista operacija je bila provedena na isti način kao šta je opisano pod B i C iz Primera 4 osim što je korišćeno mišje IgG2a umesto anti-ILT7 antitelo. Rezultati su prikazani u Primeru 4 kao i u Tabeli 5 i u Sl. CDC aktivnost prema ciljanim ćelijama nije primećena sa antitelima koja su različita od monoklonskog anti-ILT7 antitela.
Primer 5
Internalizacija anti-ILT7 antitela u ciljane ćelije
A. Monoklonsko anti-ILT7 antitelo
Sledeća monoklonska anti-ILT7 antitela su korišćena. Monoklonska anti-ILT7 antitela: #17, #26, #37, #28, i #33.
B. Posmatranje internalizacije
B-1) Proizvodnja ciljane ćelijske linije (ILT7-CHO ćelijska linija)
Pomenuta ciljana ćelijska linija (ILT7-CHO ćelijska linija) je proizvedena na isti način kao šta je opisano pod B-1 u Primeru 4.
B-2) Odgovor ciljanih ćelija na anti-ILT7 antitelo
Obnovljene ILT7-CHO ćelije su suspendovane u ledeno hladnom puferu (T(-) + 10% FBS) sa sledećom kompozicijom kod koncentracije od 1 x 106 ćelija/mL koristeći 5 mM rastvor EDTA/PBS.
T (-) medijum:
RPMI1640
100 jedinica penicilina po ml
100 µg/ml streptomicina
10 mM Hepes (pH 7.6)
2 mM L-glutamin
1 mM natrijum piruvat
50 M 2-merkaptoetanol
10% Fetalni kravlji serum inaktivisan toplinom
1 mL suspenzije koja je opisana malopre je stavljen u tubu za centrifugovanje od 15 mL, pa je sve centrifugovano (uslovi centrifugovanja: 1200 rpm, na 4° C, tokom 5 min), a supernatant je odbačen. U pelet je dodano 200 µL suspenzije monoklonskog anti-ILT7 antitela (10 µg/mL), sve je pomešano i inkubirano na 4° C tokom 30 min, a nakon toga je isprano sa ledeno hladnim T (-) medijumom (dva puta) (količina korišćenog medijuma: 10 mL po ispiranju, uslovi centrifugovanja: 1200 rpm, na 4° C, tokom 5 min).
B-3) Modifikovanje imuno-kompleksa ILT7-anti-ILT7 antitelo koji je prisutan na površini ciljanih ćelija
Nakon toga, imuno-kompleks ILT7-anti-ILT7 antitelo koji je prisutan na površini ćelija je modifikovan sa sekundarnim antitelom, koje je označeno sa fluorescencijom radi detektovanja. Specifičan postupak je opisan ispod. Ledno hladni T (-) medijum koji sadrži poliklonsko kozje anti-mišje IgG antitelo označeno sa APC (Kataloški broj: 550826BD, proizvedeno od Biosciences) je dodan u ćelijske pelete koji su dobiveni kao šta je opisano pod B-2), sve je inkubirano uz zatamnjenje na 4° C tokom 20 min, a nakon toga je usledili ispiranje sa ledeno hladnim T (-) medijumom (dva puta) (količina korišćenog medijuma: 10 mL po ispiranju, uslovi za centrifugovanje: 1200 rpm, na 4° C, tokom 5 min). Tada je dodan ledeno hladni T (-) medijum, koji je korišćen kao suspenzija sa 1 x 106 ćelija/mL.
B-4) Indukovanje internalizacije uz pomoć inkubiranja na 37° C
Suspenzija koja je dobivena kao šta je opisano pod B-3 podeljena je podjednako u dve tube (na primer, tuba (a) i (b)). Pomenute tube (a) i (b) su inkubirane na 37° C i 4°C uz zatamnjenje tokom 60 min. Nakon inkubacije je dodan 1% FBS/PBS (ledeno hladni) sa ciljem da se zaustavi internalizacija. Nastao rastvor je centrifugovan (uslovi centrifugovanja: 1200 rpm, na 4° C, tokom 5 min), a tada je supernatant odbačen, nakon čega sledi ispiranje sa 1% FBS/PBS (ledeno hladni) (dva puta) (količina rastvora: 10 mL po ispiranju, uslovi centrifugovanja: 1200 rpm, na 4° C, tokom 5 min).
B-6) Modifikovanje imuno-kompleksa ILT7-anti-ILT7 antitelo koji je preostao na površini ciljanih ćelija nakon inkubacije
Imuno-kompleks ILT7-anti-ILT7 antitelo koji je preostao na površini ćelije nakon inkubacije je modifikovan sa tercijarnim antitelom sa ciljem detektovanja, uz pomoć fluorescencije. Specifičan postupak je opisan ispod. 20 µL suspenzije koja sadrži tercijarna antitela (magareće anti-kozje IgG antitelo označeno sa FITC (Kataloški broj: sc-2024, proizveden od Santa Cruz Biotechnology)) je dodano u ćelijske pelete koji su dobiveni kao šta je opisano pod B-4), sve je mešano i ostavljeno da stoji na 4° C tokom 15 min uz zatamnjenje. Nastao rastvor je ispran (količina rastvora: 10 mL po ispiranju, uslovi centrifugovanja: 1200 rpm, na 4° C, tokom 5 min).
B-5) Analiza anti-ILT7 antitela koje je prisutno na ciljanim ćelijama
Nakon toga, 150 µL 1% FBS/PBS je dodano u ćelijske pelete koji su dobiveni kao šta je opisano pod B-5), sve je suspendovano i sakupljeno u mikrotitarske tube od 1.2 ml, a nakon toga je usledila FCM analiza. Tokom analize, srednji intenzitet fluorescencije (MPI) je bio analiziran za svaku ćeliju odvojeno u FITC i APC. Nadalje, omer intenziteta fluorescencije (%) je izračunat uz pomoć sledeće jednačine.
Rezultati su prikazani u Tabeli 2, Tabeli 3, i na Sl. 13.
Intenzitet fluorescencije FITC je indikator količine imuno-kompleksa ILT7-anti-ILT7 antitelo koji je preostao na površini ćelija nakon inkubacije. Srednja fluorescencija, intenzitet FITC kod ćelija koje su inkubirane na 37° C tokom 60 min je oko 50% od onog kod ćelija koje su inkubirane na 4° C.
Sa druge strane, intenzitet APC fluorescencije je indikator količine imuno-kompleksa ILT7-anti-ILT7 antitelo na površini ćelije pre inkubacije. Imuno-kompleks ILT7-anti-ILT7 antitelo se detektuje bez obzira na to da li je prisutan na površini ćelija ili je bio ugrađen u ćeliju nakon inkubacije. U Primeru 5, intenzitet APC fluorescencije nakon inkubacije kada je inkubacija provođena na 37° C je podjednak kao i kada je inkubacija provođena na 4° C. Pokazuje da imuno-kompleks ILT7-anti-ILT7 antitelo može da bude prisutan u bilo kojem delu ciljanih ćelija čak i kada se inkubacija provodi na bilo kojoj od pomenutih temperatura. Kao šta je već pomenuto, bilo je pronađeno da monoklonsko anti-ILT7 antitelo dovodi do internalizacije ILT7 kada se inkubacija provodi na 37° C.
Komparativni primer 2
Ista operacija je bila provedena na isti način kao šta je opisano u Primeru 5 osim šta je korišćen mišji IgG2a umesto anti-ILT7 antitelo. Rezultati su prikazani u Primer 5 kao i u Tabeli 2, Tabeli 3, i na Sl. 13. U slučaju kada je korišćen mišji IgG2a, nisu bile primećene nikakve promene u intenzitetu fluorescencije FITC i APC, šta znači da mišji IgG2a ne dovodi do internalizacije ILT7.
Primer 6
Razmatranje strukture mišjeg monoklonskog anti-humanog ILT7 antitela [Sekvence varijabilnih regiona]
A. Kloniranje cDNK koja kodira varijabilni region mišjeg anti-ILT7 antitela
A-1) Hibridomi koji proizvode mišja anti-ILT7 antitela
Sledeći hibridomi se koriste kao hibridomi koji proizvode mišja anti-ILT7 antitela.
Hibridom #11 (Pristupni broj: FERM BP-1 0704)
Hibridom #17 (Pristupni broj: FERM BP-10705).
A-2) Izolovanje totalne RNK
Totalna RNK je izolovana iz hibridoma koji su opisani pod A-1) uz pomoć komercijalno dostupnog kompleta hemikalija "RNeasy Mini Kit" (Kataloški broj: 74106, proizveden od Qiagen) u skladu sa navedenim instrukcijama. U oba slučaja, oko 200 µg totalne RNK je dobiveno iz 1 x 107 hibridoma.
A-3) Amplifikovanje i fragmentacija cDNK koja kodira varijabilni region iz mišjeg teškog lanca
cDNK koja kodira varijabilni region iz mišjeg teškog lanca je amplifikovana uz pomoć 5' RACE postupka koristeći 5 µg totalne RNK koja je izolovana kao šta je opisano pod A-2. Šta se tiče amplifikovanja, korišćen je komercijalno dostupni komplet hemikalija "5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA ENDs, Version 2. 0 Kit" (Kataloški broj: 18374-058, proizveden od Invitrogen). Specifično je opisan kako sledi. Najpre je, iz totalne RNK, koja je dobivena kao šta je opisano pod A-2), sintetizovan prvi lanaca cDNK uz pomoć reverzne transkriptaze. Bazne-sekvence antisense-prajmera (GSP1), koji su tada korišćeni, su prikazani u Tabeli 4.
Prajmeri korišćeni za amplifikovanje gena koji kodira varijabilni region iz mišjeg teškog lanca
Korišćeni hibridomi
Oznake prajmera
SEQ ID Br.
Sekvenca
#11
Mu IgG3VH5RACE-GSP1
30
5' CCA TAG TTC CAT TTT ACA GTT ACC 3' (24-mer)
Mu IgG3VH5RACE-GSP2
31
5' GGG ACC AAG GGA TAG ACA GA 3' (20-mer)
#17
Mu IgG2aVH5RACE-GSP1
32
5' TCC AGA GTT CCA GGT CAA GGT CAC 3' (24-mer)
Mu IgG2aVH5RACE-GSP2
33
5' GCC AGT GGA TAG ACC GAT GG 3' (20-mer)
Nakon toga, totalna RNK je degradirana uz pomoć RNaseH, a prvi lanac cDNK je preostao kao jedno-lančana struktura koja je bila prečišćena uz pomoć postupka sa agarozom niske tačke topljenja (1.5%). Nadalje, dC (odnosno, nukleotidni homopolimer) je spojen na 3'-terminus prvog lanca cDNK koristeći terminalnu deoksinukleotidil transferazu (TdT). cDNK je amplifikovana uz pomoć PCR postupka i anchor-prajmera (SEQ ID Br: 34) koji su na 3'-terminusu sadržavali nukleotidni polimer koji je komplementaran sa dC (anchor-sekvenca) i antisense-prajmera (GSP2) prikazanih u Tabeli 4. Nadalje, dobiveni PCR produkti se koriste kao kalupi. cDNK je amplifikovana uz pomoć postupka nested-PCR koristeći AUAP prajmer (SEQ ID Br: 35) i antisense-prajmere (GSP2) koji su prikazani u Tabeli 4. Nadalje, PCR produkti su bili prečišćeni uz pomoć postupka sa agarozom sa niskom tačkom topljenja (1.5%).
Anchor-prajmer za 5'RACE (SEQ ID Br: 34)
5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG-3' (36-mer)
AUAP prajmer za 5'RACE (SEQ ID Br: 35)
5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3' (20-mer).
A-4) Amplifikovanje i fragmentacija cDNK koja kodira varijabilni region iz mišjeg lakog lanca
cDNK koja kodira varijabilni region iz mišjeg lakog lanca je amplifikovana iz totalne RNK koja je izolovana kao šta je opisano pod A-2) na isti način kao šta je opisano pod A-3). Bazne-sekvence korišćenih prajmera su prikazane u Tabeli 5. Dobiveni PCR produkti su prečišćeni uz pomoć postupka sa agarozom niske tačke topljenja (1.5%) (Tabela 5).
Prajmeri korišćeni za amplifikovanje gena koji kodira varijabilni region iz mišjeg lakog lanca
Korišćeni hibridomi
Oznake prajmera
SEQ ID Br.
Sekvenca
#11, #17
Mu IgVL5RACE-GSP1
36
5' TTC ACT GCC ATC AAT CTT CCA CTT 3' (24-mer)
Mu IgVL5RACE-GSP2
37
5' GAT GGA TAC AGT TGG TGC AGC 3' (21-mer)
A-5) Potvrda bazne-sekvence cDNK i određivanje CDR regiona
Varijabilni region iz teškog lanca koji je dobiven kao šta je opisano pod A-3) i cDNK fragment varijabilnog regiona iz lakog lanca koji je dobiven kao šta je opisano pod A-4) su klonirani u vektor pCR4 Blunt-TOPO uz pomoć komercijalno dostupnog kompleta hemikalija "Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit" (Kataloški broj: 1325137, proizveden od Invitrogen) u skladu sa instrukcijama proizvođača, koji je tada uveden u kompetentne ćelije bakterije Escherichia coli sa ciljem da se dobiju transformanti Escherichia coli. Malopre pomenuti plazmid je dobiven iz pomenutog transformanta, a bazna sekvenca cDNK u plazmidu je potvrđena uz pomoć automatskog DNA sekvencera "PCR-based ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer" (proizveden od Applied Biosystems). Tačne sekvence su ekstrahovane uz pomoć isključivanja transkripata dobivenih iz inaktivne RNK zbog pomaka okvira i nonsense-mutacija oko regiona koji određuje komplementarnost (nadalje označen kao "CDR region"). Nadalje, homologija bazne-sekvence cDNK koja se nalazi u pomenutom plazmidu je upoređena sa bazom podataka Kabat i sa sekvencama CDR regiona pri čemu je otkriven varijabilni region iz odgovarajućih varijabilnih regiona. Takođe, šta se tiče hibridoma #37, koji je proizveden u Primeru 4, sekvence CDR regiona i varijabilnog regiona iz varijabilnih regiona su određene uz pomoć iste procedure kao šta je opisano od A-1) do A-5) iz Primera 6 koristeći hibridom #17. Bazne sekvence cDNK varijabilnih regiona iz teškog lanca i varijabilni regioni iz lakog lanca iz monoklonskog anti-ILT7 antitela, proizvedenog uz pomoć pomenutih hibridoma, i amino-kiselinske sekvence kodirane sa pomenutim sekvencama su prikazane u sledećim SEQ ID Br.
Varijabilni region iz teškog lanca
Varijabilni region iz lakog lanca
#11
SEQ ID Br: 38 (bazna sekvenca)
SEQ ID Br: 40 (bazna sekvenca)
SEQ ID Br: 39 (amino-kiselinska sekvenca)
SEQ ID Br: 41 (amino-kiselinska sekvenca)
#17
SEQ ID Br: 42 (bazna sekvenca)
SEQ ID Br: 44 (bazna sekvenca)
SEQ ID Br: 43 (amino-kiselinska sekvenca)
SEQ ID Br: 45 (amino-kiselinska sekvenca)
#37
SEQ ID Br: 46 (bazna sekvenca)
SEQ ID Br: 48 (bazna sekvenca)
SEQ ID Br: 47 (amino-kiselinska sekvenca)
SEQ ID Br: 49 (amino-kiselinska sekvenca)
[Potvrda izotipa konstantnog regiona]
Šta se tiče supernatanta iz kulture hibridoma, izotip konstantnog regiona proizvedenog monoklonskog antitela je potvrđen uz pomoć komercijalno dostupnog kompleta hemikalija za izotipiranje mišjeg monoklonskog antitela (Kataloški broj: MMT1, proizveden od Serotec Product). Konstantni region teškog lanca iz mišjeg anti-humanog ILT7 antitela #11 je Ig 3, a konstantni region iz lakog lanca je Igk. Nadalje, svaki konstantni region iz teškog lanca iz mišjeg anti-humanog ILT7 antitela #17 i mišjeg anti-humanog ILT7 antitela #37 je Ig 2a, a svaki konstantni region iz lakog lanca je Igk.
Primer 7
Proizvodnja himernih antitela
A. Kloniranje cDNK koja kodira konstantni region iz humanog IgG
Konstantni region iz teškog lanca iz humanog IgG1 i konstantni region iz lakog lanca iz humanog Ig kapa su izabrani iz cDNK biblioteke humanih IPC. Tada su selektirani regioni klonirani u vektor pCR4 Blunt-TOPO uz pomoć komercijalno dostupnog kompleta hemikalija "Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit" (Kataloški broj: 1325137, proizveden od Invitrogen) u skladu sa instrukcijama proizvođača, koji je nakon toga bio uveden u kompetentne ćelije bakterije Escherichia coli sa ciljem da se dobiju transformanti Escherichia coli. Malopre pomenuti plazmid je dobiven iz pomenutog transformanta, a tada je bazna-sekvenca cDNK iz plazmida potvrđena uz pomoć automatskog DNA sekvencera "PCR-based ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer" (proizveden od Applied Biosystems).
B. Ligacija varijabilnog regiona sa konstantnim regionom i kloniranje
Korišćene su cDNK koja kodira konstantni region iz teškog lanca koja je dobivena kao šta je opisano pod A i cDNK koja kodira varijabilni region iz teškog lanca koja je dobivena kao šta je opisano pod A-5 iz Primera 6. Obe DNA imaju region u kojem se bazna-sekvenca DNA preklapa. Tako, dvo-lančana DNA je dobivena uz pomoć postupka preklapanja ekstenzija iz pomenutog regiona. Specifični proces je opisan u donjem tekstu.
C-1) Priprema cDNK koja kodira teški lanac iz himernog ILT7 antitela
Pomenuti "plazmid sa cDNK koja kodira varijabilne regione iz teškog lanca iz #11 i #17" koji je dobiven kao šta je opisano pod A-5) je pocepan sa restrikcionim encimima Not I i Xba I, pa je prečišćen uz pomoć agaroznog gela (1.5%). Nastali produkti su rastvoreni u TE puferu sa dole navedenom kompozicijom tako da se dobije 100 pmol/L sa ciljem da se pripremi rastvor cDNK fragmenta koji kodira varijabilni region iz teškog lanca.
TE pufer:
10 mM Tris-HCl
1 mM EDTA
pH 7.5 do 8.0.
Nadalje, pomenuti "plazmid sa cDNK koja kodira konstantni region iz teškog lanca", dobiven kao šta je opisano pod B, je tretiran na isti način kao šta je opisano malopre sa ciljem da se dobije rastvor od 100 pmol/L. Nakon toga, oba rastvora su pomešana, nakon čega je usledilo hibridizovanje regiona koji se preklapaju tako da je sve najpre držano na 70° C tokom 10 min, a tada na 37° C tokom 5 min. Posle toga, cDNK je amplifikovana uz pomoć PCR postupka, a dobivena cDNK je pocepana sa restrikcionim encimima Not I i Xba I, pa je prečišćena uz pomoć postupka sa agarozom za niskom tačkom topljenja (1.5%).
C-2) Priprema cDNK koja kodira laki lanac iz himernog ILT7 antitela
Korišćene su cDNK koja kodira konstantni region iz lakog lanca koja je dobivena kao šta je opisano pod A i cDNK koja kodira varijabilni region iz lakog lanca koja je dobivena kao šta je opisano pod A-5 iz Primera 6. cDNK koja kodira laki lanac iz himernog ILT7 antitela je dobivena na isti način kao šta je opisano pod C-1) uz korišćenje pomenute cDNK.
C-3) Kloniranje
cDNK koja je dobivena kao šta je opisano pod C-1) je klonirana u plazmidni vektor pcDNA3.1-Zeocin (proizveden od Invitrogen) uz pomoć Not I i Xba I, kao mesta za kloniranje, sa ciljem da se proizvede vektor koji eksprimira teški lanac iz himernog ILT7 antitela. Nadalje, cDNK koja je dobivena kao šta je opisano pod C-2) je klonirana u plazmidni vektor pcDNA3.1-higromicin (proizveden od Invitrogen) uz pomoć Not I i Xba I, kao mesta za kloniranje, sa ciljem da se proizvede vektor koji eksprimira laki lanac iz himernog ILT7 antitela. Oznake svakog vektora su prikazane u Tabeli 6.
Tabela 6
Oznake plazmidnih vektora
Teški lanac iz himernog ILT7 antitela za ekspresiju
Laki lanac iz himernog ILT7 antitela za ekspresiju
#11
pcDNA-#11VH
pcDNA-#11VL
#17
pcDNA-#17VH
pcDNA-#17VL
D. Ekspresija himernog ILT7 antitela
D-1) Prolazna transformacija
1 µg vektora koji eksprimira teški lanac iz himernog ILT7 antitela i 1 µg vektora koji eksprimira laki lanac iz himernog ILT7 antitela, koji su dobiveni kao šta je opisano pod C-3), su ko-transfektovani u 293T ćelije koristeći komplet hemikalija Effectine transfection (Kataloški broj: 301427, proizveden od Qiagen). Nakon toga, nastali produkti su kultivisani na 37º C koristeći medijum DMEM u kome je dodano 2% IgG FBS sa sledećom kompozicijom.
Medijum DMEM u kome je dodano 2% IgG FBS:
medijum DMEM (Kataloški broj: D5796, proizveden od Sigma)
2% IgG FBS (Kataloški broj: SH30151.03, proizveden od HyClone)
2 mM L-glutamin
100 U/ml penicilin
100 µg/ml streptomicin
pH 7.2 do pH 7.4.
Nakon uvođenja vektora, nastao medijum je kultivisan tokom 96 h, a nakon toga je sakupljen supernatant iz kulture. Tada su odstranjeni delovi ćelija uz pomoć centrifugovanja sa ciljem da se dobije grubi rastvor antitela.
D-2) Homeostatska transformacija
1 µg vektora koji eksprimira teški lanac iz himernog ILT7 antitela i 1 µg vektora koji eksprimira laki lanac iz himernog ILT7 antitela, koji su dobiveni kao šta je opisano pod C-3), su ko-transfektovani u YB 2/0 ćelije (ćelije koje su dobivene iz mijeloma pacova, ATCC#CRL-1622) koristeći komplet hemikalija Effectine transfection kit (Kataloški broj: 301427, proizveden od Qiagen). Među korišćenim plazmidnim vektorima, vektor za ekspresiju teškog lanca je ujedno i marker za rezistenciju na zeocin, vektor za ekspresiju lakog lanca je ujedno i marker za rezistenciju na higromicin. Prema tome, ćelije u kojima se nalaze oba vektora mogu da rastu u medijumu sa zeocinom i higromicinom. Tako, ćelije su kultivisane u medijumu RPMI u kojem su dodani zeocin i higromicin pri čemu je selektiran rezistentan soj.
Medijum RPMI koji sadrži zeocin-higromicin:
medijum RPMI1640 (Kataloški broj: R8758, proizveden od Sigma) 10% FBS
0.01 M HEPES (N-2-hidroksietilpiperazin-N'-2-etansulfonska kiselina)
1 mM natrijum piruvat
2 mM L-glutamin
100 U/ml penicilin
100 µg/ml streptomicin
55 µM 2-merkaptoetanol
0.5 mg/ml zeocin
0.5 mg/ml higromicin
pH 7.2 do pH 7.4.
Tri dana nakon toga, količina proizvedenog antitela u supernatantu kulture je određena uz pomoć ELISA postupka. Selektirani su ćelijska linija koja proizvodi ILT7 himerno-antitelo koje se eksprimira u visokom nivou i ćelije kod kojih je taj nivo dovoljno visok. Nadalje, kloniranje selektirane ćelijske linije je provedeno uz pomoć ćelijskog sortera sa ciljem da se dobiju sledeće ćelijske linije.
#11 ćelijska linija koja proizvodi ILT7 himerno-antitelo: #11-5 ćelijska linija i #11-16 ćelijska linija
#17 ćelijska linija koja proizvodi ILT7 himerno-antitelo: #17-24 ćelijska linija.
Malopre pomenute ćelijske linije (#11-5 ćelijska linija, #11-16 ćelijska linija, i #17-24 ćelijska linija) su kultivisane u medijumu RPMI sa 5% FBS sa dole navedenom kompozicijom. Temperatura inkubacije i vreme inkubacije su podešeni na 37° C i 96 h.
Medijum RPMI sa 5% FBS:
medijum RPMI1640 (Kataloški broj: R8758S, proizveden od Sigma)
5% FBS
0.01 M HEPES
1 mM natrijum piruvat
2 mM L-glutamin
100 U/ml penicilin
100 g/ml streptomicin
55 M 2-merkaptoetanol
pH 7.2 do pH 7.4.
Supernatant iz kulture je sakupljen, a ćelijski fragmenti su odstranjeni uz pomoć centrifugovanja sa ciljem da se dobije grubi rastvor antitela.
E. Prečišćavanje antitela
Svaki grubi rastvor antitela koji je dobiven kao šta je opisano pod D-1 i D-2 je bio prečišćen uz pomoć afinitetne kolone sa belančevinom A (rProtein A Sepharose FF, Kataloški broj: 17-1279-01, proizveden od Amershram Pharmacia). Uslovi prečišćavanja su kako sledi. Afinitetno prečišćavanje je provedeno uz pomoć PBS (-) pufera sa dole navedenom kompozicijom koji je korišćen kao pufer za apsorpciju i pufera sa 0.1M natrijum citratom (pH 3) kao pufer za eluciju u skladu sa instrukcijama proizvođača. U eluirane frakcije je dodan 1M Tris-HCl (pH 8.0) sa ciljem podešavanja pH na oko 7.2. Izmerene su vrednosti OD kod 450 do 620 nm, pri čemu su selektirane rupice koje pokazuju pozitivnu reakciju. Šta se tiče koncentracije prečišćenih antitela, određena je iz apsorbancije kod 280 nm pri čemu je izračunata na bazi 1.38 OD/mg/ml. Odnosi između dobivenih himernih ILT7 antitela, hibridoma iz kojeg je dobiven gen za varijabilni region, i ćelija domaćini su sažeto prikazani u Tabeli 7.
PBS (-) pufer:
0.2 g/L mono-kalijum dihidrogen fosfat
0.2 g/L kalijum hlorid
8 g/L natrijum hlorid
1.15 g/L di-natrijum monohidrogen fosfat, bezvodni.
Tabela 7
Proizvedena himerna antitela
Oznake proizvedenih himernih antitela
Korišćeni hibridomi
Forma transformacije
Ćelije domaćini
#11 ILT7 himerno antitelo
#11
Prolazna
293T
#17 ILT7 himerno antitelo
#17
#11-5 ILT7 himerno antitelo
#11
Homeostaza
YB 2/0
#11-16 ILT7 himerno antitelo
#11
#17-24 ILT7 himerno antitelo
#17
Bazne sekvence cDNK i amino-kiselinske sekvence teškog i lakog lanca iz proizvedenih himernih antitela su prikazane ispod. U svakoj amino-kiselinskoj sekvenci, amino-kiselinska sekvenca od N-terminusa do -1 je signalna sekvenca, a amino-kiselinska sekvenca od 1 do C-terminusa je amino-kiselinska sekvenca zrele belančevine. Odnosno, teški i laki lanac, koji čine pomenuta himerna antitela, se sastoje od amino-kiselinske sekvence od 1 do C-terminusa iz svake od sledećih amino-kiselinskih sekvenca.
Teški lanac
Laki lanac
#11
SEQ ID Br: 50 (bazna sekvenca)
SEQ ID Br: 52 (bazna sekvenca)
SEQ ID Br: 51 (amino-kiselinska sekvenca)
SEQ ID Br: 53 (amino-kiselinska sekvenca)
#17
SEQ ID Br: 54 (bazna sekvenca)
SEQ ID Br: 56 (bazna sekvenca)
SEQ ID Br: 55 (amino-kiselinska sekvenca)
SEQ ID Br: 57 (amino-kiselinska sekvenca)
Industrijska primena
Ovaj pronalazak obezbeđuje imunogen koji je koristan za proizvodnju antitela koje specifično prepoznaje humani ILT7 i postupak za proizvodnju anti-ILT7 antitela uz korišćenje pomenutog imunogena. Pomenuto antitelo koje specifično prepoznaje humani ILT7 iz ovoga pronalaska specifično prepoznaje ILT7 u uslovima kada je prisutna ILT porodica. Prema tome, antitelo iz ovoga pronalaska može da se koristi za detektovanje i izolovanje humanog ILT7. Na primer, lokalizovanje ILT7 takođe može da se analizira uz pomoć pomenutog antitela iz ovoga pronalaska. Smatra se da je ILT7 molekul koji je blisko povezan sa diferenciranjem i funkcijom IPC ili dendrita. Prema tome, pomenuto antitelo, koje prepoznaje ILT7 sa visokom specifičnosti, je korisno za analizu funkcije IPC ili dendrita. Poznate su ćelije raka koje su slične IPC (imaju karakteristiku da je eksprimiran BDCA-2) (Chaperot L et al. Eur. J. Imunol. 34; 418-426, 2004, Maeda T et al., Int. J. Hematol. 81; 148-154, 2005). Potvrda ekspresije ILT7 u pomenutim ćelijama može da omogući dijagnozu raka i da obezbedi terapeutski agens.
U slučaju auto-imunih bolesti, na primer, istaknut je duboki odnos između IFNα koji je proizveden od IPC i razvoja psorijaze, koja je kožna bolest (Nestle FO et al., J. Exp. Med. 202, 135-143, 2005). Prema tome, jačina psorijaze može da se ispita uz pomoć identifikovanja IPC u koži pacijenata sa psorijazom, tj. u primercima biopsije koristeći pomenuto anti-ILT7 antitelo.
Poznato je da je razvoj bolesti SIDA kod pacijenata inficiranih sa HIV korelisan sa brojem IPC. Naime, mnoštvo IPC je primećeno kod pacijenata koji ne pokazuju simptome, a smanjivanje broja IPC je primećen kada se bolest pojavljuje (Soumells V. et al., Blood 98; 906-912, 2001). Prema tome, ovaj parametar može da bude efektivan kod predviđanja i prognoze virusne infekcije, poput HIV.
Na primer, ILT7 je molekul koji se specifično eksprimira u humanim IPC. Prema tome, pomenuto anti-ILT7 antitelo iz ovoga pronalaska može da se koristi za detektovanje, identifikovanje, ili izolovanje IPC. IPC su ćelije koje proizvode najviše interferona tipa 1. Prema tome, detektovanje, identifikovanje, ili izolovanje je važan cilj u dijagnozi i studiranju bolesti koje uključuju interferon tipa 1. Kao bolesti u kojima je uključen interferon u nastanku patološkog stanja mogu da se pomenu razne auto-imune bolesti i infekcije.
Dodatno, pomenuto anti-ILT7 antitelo iz ovoga pronalaska ima inhibitoran efekt na delovanje IPC. Prema tome, delovanje IPC može da se inhibira uz pomoć anti-ILT7 antitela iz ovoga pronalaska. Nadalje, bolesti koje uključuju interferon tipa 1 mogu da se tretiraju uz pomoć inhibiranja delovanja IPC. Specifično, pomenuto anti-ILT7 antitelo iz ovoga pronalaska je korisno za razne auto-imune bolesti i infekcije u kojima je interferon uključen u nastanku patološkog stanja. Pobliže, budući anti-ILT7 antitelo poseduje visoku specifičnost, može da efikasno odstrani IPC.
LISTA SEKVENCI
<110> GINKGO BIOMEDICAL RESEARCH INSTITUTE CO., LTD.
<120> ANTI-ILT7 ANTITELO
<130> G2-A0501P
<150> JP 2005-366465
<151> 2005-12-20
<160> 76
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1577
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (24)..(1520)
<220>
<221> sig_peptide
<222> (24)..(71)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (72)..(1520)
<400> 1
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Veštačka
<220>
<223> veštački sintetizovana prajmer sekvenca
<400> 3
ctccaacccc tacctgctgt c    21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Veštačka
<220>
<223> veštački sintetizovana prajmer sekvenca
<400> 4
ttcccaaggc tccaccactc t    21
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Veštačka
<220>
<223> veštački sintetizovana prajmer sekvenca
<400> 5
cctcaatcca gcacaaaaga agt    23
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Veštačka
<220>
<223> veštački sintetizovana prajmer sekvenca
<400> 6
cggatgagat tctccactgt gtaa    24
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> Veštačka
<220>
<223> veštački sintetizovana prajmer sekvenca
<400> 7
ccacccatgg caaattcc    18
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Veštačka
<220>
<223> veštački sintetizovana prajmer sekvenca
<400> 8
tgggatttcc attgatgaca ag    22
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Veštačka
<220>
<223> veštački sintetizovana prajmer sekvenca
<400> 9
cagggccagg aggaggagat g    21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Veštačka
<220>
<223> veštački sintetizovana prajmer sekvenca
<400> 10
tcagcagaca cttccccaac t    21
<210> 11
<211> 105
<212> DNA
<213> Veštačka
<220>
<223> veštački sintetizovana prajmer sekvenca
<400> 11
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> Veštačka
<220>
<223> veštački sintetizovana prajmer sekvenca
<400> 12
ctagactagt tcagatctgt tcccaaggct c    31
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> Veštačka
<220>
<223> veštački sintetizovana prajmer sekvenca
<400> 13
ccgctcgaga tgaccctcat tctcacaagc    30
<210> 14
<211> 55
<212> DNA
<213> Veštačka
<220>
<223> veštački sintetizovana prajmer sekvenca
<400> 14
ctagactagt tcacttatcg tcgtcatcct tgtaatcgat ctgttcccaa ggctc    55
<210> 15
<211> 313
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (7)..(267)
<400> 15
<210> 16
<211> 86
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Veštačka
<220>
<223> veštački sintetizovana prajmer sekvenca
<400> 17
cccaagatga ttccagcagt g    21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Veštačka
<220>
<223> veštački sintetizovana prajmer sekvenca
<400> 18
ggaagaacca gaagccaaag a    21
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> Veštačka
<220>
<223> veštački sintetizovana prajmer sekvenca
<400> 19
ccgctcgaga tgattccagc agtggtcttg    30
<210> 20
<211> 61
<212> DNA
<213> Veštačka
<220>
<223> veštački sintetizovana prajmer sekvenca
<400> 20
<210> 21
<211> 23
<212> PRT
<213> Veštačka
<220>
<223> veštački sintetizovana peptidna sekvenca
<400> 21
<210> 22
<211> 31
<212> DNA
<213> Veštačka
<220>
<223> veštački sintetizovana prajmer sekvenca
<400> 22
ccgctcgaga tgacccccat cctcacggtc c    31
<210> 23
<211> 55
<212> DNA
<213> Veštačka
<220>
<223> veštački sintetizovana prajmer sekvenca
<400> 23
ctagactagt tcacttatcg tcgtcatcct tgtaatccct cccggctgca tcttg    55
<210> 24
<211> 1425
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1425)
<400> 24
<210> 25
<211> 474
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
<210> 26
<211> 1953
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1953)
<400> 26
<210> 27
<211> 650
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
<210> 28
<211> 1347
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1347)
<400> 28
<210> 29
<211> 448
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> Veštačka
<220>
<223> Veštački sintetizovana prajmer sekvenca
<400> 30
ccatagttcc attttacagt tacc    24
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Veštačka
<220>
<223> Veštački sintetizovana prajmer sekvenca
<400> 31
gggaccaagg gatagacaga    20
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> Veštačka
<220>
<223> Veštački sintetizovana prajmer sekvenca
<400> 32
tccagagttc caggtcaagg tcac    24
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Veštačka
<220>
<223> Veštački sintetizovana prajmer sekvenca
<400> 33
gccagtggat agaccgatgg    20
<210> 34
<211> 36
<212> DNA
<213> Veštačka
<220>
<223> Veštački sintetizovana prajmer sekvenca
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(25)
<223> I
<220>
<221> modified_base
<222> (29)..(30)
<223> I
<220>
<221> modified_base
<222> (34)..(35)
<223> I
<400> 34
ggccacgcgt cgactagtac gggnngggnn gggnng    36
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Veštačka
<220>
<223> Veštački sintetizovana prajmer sekvenca
<400> 35
ggccacgcgt cgactagtac    20
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> Veštačka
<220>
<223> Veštački sintetizovana prajmer sekvenca
<400> 36
ttcactgcca tcaatcttcc actt    24
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> Veštačka
<220>
<223> Veštački sintetizovana prajmer sekvenca
<400> 37
gatggataca gttggtgcag c    21
<210> 38
<211> 408
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(408)
<220>
<221> si_peptide
<222> (1)..(54)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (55)..(408)
<400> 38
<210> 39
<211> 136
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 39
<210> 40
<211> 381
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(381)
<220>
<221> sig_peptide
<222> (1)..(60)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (61)..(381)
<400> 40
<210> 41
<211> 127
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 41
<210> 42
<211> 414
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(414)
<220>
<221> sig_peptide
<222> (1)..(57)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (55)..(414)
<400> 42
<210> 43
<211> 138
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 43
<210> 44
<211> 381
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(381)
<220>
<221> sig_peptide
<222> (1)..(60)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (61)..(381)
<400> 44
<210> 45
<211> 127
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 45
<210> 46
<211> 408
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(408)
<220>
<221> sig-peptide
<222> (1)..(54)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (55)..(408)
<400> 46
<210> 47
<211> 136
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 47
<210> 48
<211> 381
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(381)
<220>
<221> sig_peptide
<222> (1)..(60)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (61)..(381)
<400> 48
<210> 49
<211> 127
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 49
<210> 50
<211> 1401
<212> DNA
<213> Veštačka
<220>
<223> Veštački sintetizovana nukleotidna sekvenca
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1398)
<220>
<221> si_peptide
<222> (1)..(54)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (55)..(1398)
<400> 50
<210> 51
<211> 466
<212> PRT
<213> Veštačka
<220>
<223> Sintetski konstrukt
<400> 51
<210> 52
<211> 705
<212> DNA
<213> Veštačka
<220>
<223> Veštački sintetizovana nukleotidna sekvenca
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(702)
<220>
<221> sig_peptide
<222> (1)..(60)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (61)..(702)
<400> 52
<210> 53
<211> 234
<212> PRT
<213> Veštačka
<220>
<223> Sintetski konstrukt
<400> 53
<210> 54
<211> 1407
<212> DNA
<213> Veštačka
<220>
<223> Veštački sintetizovana nukleotidna sekvenca
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1404)
<220>
<221> sig_peptide
<222> (1)..(57)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (55)..(1404)
<400> 54
<210> 55
<211> 468
<212> PRT
<213> Veštačka
<220>
<223> Sintetski konstrukt
<400> 55
<210> 56
<211> 705
<212> DNA
<213> Veštačka
<220>
<223> Veštački sintetizovana nukleotidna sekvenca
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(702)
<220>
<221> sig_peptide
<222> (1)..(60)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (61)..(702)
<400> 56
<210> 57
<211> 234
<212> PRT
<213> Veštačka
<220>
<223> Sintetski konstrukt
<400> 57
<210> 58
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(6)
<223> CDR
<400> 58
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(17)
<223> CDR
<400> 59
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(9)
<223> CDR
<400> 60
<210> 61
<211> 11
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(11)
<223> CDR
<400> 61
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> CDR
<400> 62
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(9)
<223> CDR
<400> 63
<210> 64
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(5)
<223> CDR
<400> 64
<210> 65
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(17)
<223> CDR
<400> 65
<210> 66
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(10)
<223> CDR
<400> 66
<210> 67
<211> 11
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(11)
<223> CDR
<400> 67
<210> 68
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> CDR
<400> 68
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(9)
<223> CDR
<400> 69
<210> 70
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(6)
<223> CDR
<400> 70
<210> 71
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(17)
<223> CDR
<400> 71
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(9)
<223> CDR
<400> 72
<210> 73
<211> 11
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(11)
<223> CDR
<400> 73
<210> 74
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> CDR
<400> 74
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(9)
<223> CDR
<400> 75
<210> 76
<211> 4
<212> PRT
<213> Veštačka
<220>
<223> Veštački sintetizovana peptidna sekvenca
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> Xaa može biti bilo koja prirodna aminokiselina
<400> 76
122

Claims (9)

1.Monoklonsko antitelo, naznačeno time, što se veže na humani ILT7, što se ne veže na humani ILT1, humani ILT2 i humani ILT3, pri čemu pomenuto suprimira proizvodnju interferona-α (IFNα) u ćelijama koje eksprimiraju ILT7, ili fragment koji sadrži njegov region koji veže antigen.
2.Monoklonsko antitelo u skladu sa zahtevom 1, naznačeno time, što ćelija koja eksprimira ILT7 je istovremeno i ćelija koja proizvodi interferon (IPC).
3.Monoklonsko antitelo u skladu sa zahtevom 1 ili 2, naznačeno time, što pomenuta ćelija je CD123 pozitivna ili BDCA-2 pozitivna.
4.Monoklonsko antitelo u skladu sa bilo kojim od zahteva od 1 do 3, naznačeno time, što pomenuta ćelija je CD3 negativna, CD14 negativna, CD16 negativna, CD19 negativna, CD20 negativna, i CD56 negativna.
5.Monoklonsko antitelo u skladu sa bilo kojim od zahteva od 1 do 4, naznačeno time, što se pomenuto monoklonsko antitelo proizvodi uz pomoć postupka koji obuhvata sledeće korake: (1)administriranje ne-humanoj životinji ćeliju koja sadrži sledeće, (a) i (b), tako da pomenuti mogu da se eksprimiraju: (a)egzogeni polinukleotid koji kodira amino-kiselinsku sekvencu koja sadrži izvan-ćelijski domen iz humanog ILT7; i (b)egzogeni polinukleotid koji kodira γ-lanac Fc receptora (FcRγ); (2)proizvodnju i selektiranje ćelije koja proizvodi antitelo koje može da se veže na humani ILT7 iz ćelije koja proizvodi pomenuto antitelo iz pomenute ne-humane životinje; i (3)kultivisanje pomenute ćelije koja je tako selektirana i obnavljanje monoklonskog antitela iz kulture.
6.Monoklonsko antitelo u skladu sa zahtevom 5, naznačeno time, što pomenuta ćelija je životinjska ćelija; a ponekad što pomenuta ćelija je neka ćelija koja je dobivena od ljudi; i nadalje što ponekad pomenuta humana ćelina je 293T ćelija.
7.Monoklonsko antitelo u skladu sa bilo kojim od zahteva od 1 do 4, naznačeno time, što pomenuti fragment koji sadrži njegov region koji veže antigen je Fab, F(ab')2, jedno-lančani Fv, ili dijatelo.
8.Postupak za detektovanje ćelija koje proizvodne interferon, naznačen time, što sadrži korake: kontaktiranja pomenutog monoklonskog antitela iz bilo kojeg od zahteva od 1 do 7 uz pomoć testne ćelije; i detektovanja pomenutog monoklonskog antitela, ili fragmenta koji sadrži njegov region koji veže antigen, koje je vezano na pomenutu ćeliju.
9.Agens za suprimiranje interferona α (IFNα), naznačen time, što sadrži pomenuto monoklonsko antitelo u skladu sa bilo kojim od zahteva od 1 do 7 kao aktivni sastojak.
MEP-2014-157A 2005-12-20 2006-12-20 Antitijelo protiv ILT7 ME02111B (me)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005366465 2005-12-20
EP12168586.1A EP2532681B1 (en) 2005-12-20 2006-12-20 Anti-ILT7 antibody

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ME02111B true ME02111B (me) 2015-10-20

Family

ID=38188642

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MEP-2014-157A ME02111B (me) 2005-12-20 2006-12-20 Antitijelo protiv ILT7

Country Status (29)

Country Link
US (6) US8084585B2 (me)
EP (4) EP3441403A1 (me)
JP (2) JP5020828B2 (me)
KR (3) KR101585532B1 (me)
CN (5) CN105111311B (me)
AU (1) AU2006328470B2 (me)
BR (1) BRPI0620141B1 (me)
CA (2) CA2634116C (me)
CY (3) CY1114227T1 (me)
DK (3) DK1964852T3 (me)
ES (3) ES2526079T3 (me)
HK (1) HK1218126A1 (me)
HR (2) HRP20130494T1 (me)
HU (1) HUE039865T2 (me)
IL (1) IL192266A (me)
LT (1) LT2913343T (me)
ME (1) ME02111B (me)
MX (1) MX2008007682A (me)
NZ (3) NZ616992A (me)
PL (3) PL2532681T3 (me)
PT (3) PT2913343T (me)
RS (2) RS52860B (me)
RU (2) RU2456298C2 (me)
SG (2) SG10201602095PA (me)
SI (3) SI1964852T1 (me)
TR (1) TR201816574T4 (me)
UA (1) UA97946C2 (me)
WO (1) WO2007072866A1 (me)
ZA (1) ZA200805850B (me)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2892724B1 (fr) * 2005-11-02 2008-01-04 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps cytotoxiques diriges contre des anticorps inhibiteurs du facteur viii.
US20120269814A1 (en) * 2009-11-10 2012-10-25 Amgen Inc. Anti-c mpl antibodies
WO2011063237A2 (en) * 2009-11-19 2011-05-26 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Jagged-binding agents and uses thereof
SMT201700139T1 (it) 2010-02-24 2017-05-08 Immunogen Inc Immunoconiugati contro il recettore 1 del folato e relativi usi
EP2563393B1 (en) * 2010-04-26 2016-06-08 Abraxis BioScience, LLC Sparc binding antibodies and uses thereof
CN114441757A (zh) 2011-04-01 2022-05-06 伊缪诺金公司 用于增加folr1癌症治疗的功效的方法
PT2828284T (pt) 2012-03-20 2019-06-17 Biogen Ma Inc Jcv neutralizando anticorpos
CA2867910C (en) 2012-03-20 2023-09-26 Biogen Idec Ma Inc. Jcv neutralizing antibodies
ES2848052T3 (es) * 2012-08-03 2021-08-05 Dana Farber Cancer Inst Inc Anticuerpos de unión dual anti-PD-L1 y PD-L2 de agente individual y métodos de uso
MX362514B (es) 2012-08-31 2019-01-22 Immunogen Inc Kits y ensayos de diagnostico para la deteccion del receptor 1 de folato.
SG11201601037YA (en) 2013-08-30 2016-03-30 Immunogen Inc Antibodies and assays for detection of folate receptor 1
US10035847B2 (en) 2013-10-02 2018-07-31 The Rockefeller University Amyloid protofibril antibodies and methods of use thereof
KR20160099083A (ko) * 2013-12-24 2016-08-19 아스테라스 세이야쿠 가부시키가이샤 신규 항인간 bdca-2 항체
ES2941897T3 (es) 2014-11-12 2023-05-26 Seagen Inc Compuestos que interaccionan con glicanos y procedimientos de uso
US10722592B2 (en) * 2015-03-18 2020-07-28 Seattle Genetics, Inc. CD48 antibodies and conjugates thereof
KR20240063203A (ko) * 2015-06-29 2024-05-09 이뮤노젠 아이엔씨 항-cd123 항체 및 이들의 접합체와 유도체
JP6880006B2 (ja) 2015-09-17 2021-06-02 イミュノジェン， インコーポレイテッド 抗ｆｏｌｒ１免疫複合体を含む治療組み合わせ
AU2016353153B2 (en) 2015-11-12 2023-11-23 Seagen Inc. Glycan-interacting compounds and methods of use
AU2016355206A1 (en) * 2015-11-19 2018-05-24 Abbvie Stemcentrx Llc Novel anti-EMR2 antibodies and methods of use
WO2017130060A1 (en) 2016-01-26 2017-08-03 Ciriello Christopher John Automated dental treatment system
US20190031780A1 (en) * 2016-01-27 2019-01-31 Siamab Therapeutics, Inc. Compositions and methods for targeting cancer stem cells
BR112018067522A2 (pt) * 2016-03-01 2019-02-05 Univ Of Rijeka Faculty Of Medicine anticorpos específicos para receptor de poliovírus humano (pvr)
EP3426298A4 (en) * 2016-03-10 2019-11-27 Viela Bio, Inc. ILT7-BINDING MOLECULES AND METHOD OF USE THEREOF
KR20240096672A (ko) * 2016-04-04 2024-06-26 바이오버라티브 유에스에이 인코포레이티드 항-보체 인자 bb 항체 및 이의 용도
SG11201907889YA (en) 2017-03-03 2019-09-27 Seattle Genetics Inc Glycan-interacting compounds and methods of use
CN111050792B (zh) * 2017-08-30 2024-05-31 凡恩世制药(北京)有限公司 抗lag-3抗体及其用途
JP7369121B2 (ja) 2017-10-11 2023-10-25 バイオベラティブ・ユーエスエイ・インコーポレイテッド 補体活性を誘発する方法
EP3710479A2 (en) * 2017-11-17 2020-09-23 Merck Sharp & Dohme Corp. Antibodies specific for immunoglobulin-like transcript 3 (ilt3) and uses thereof
US11396538B2 (en) 2017-12-20 2022-07-26 Radimmune Therapeutics, Inc. Antibodies to centrin-1, methods of making, and uses thereof
CN111542546B (zh) * 2018-01-18 2022-08-16 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 抗lag-3抗体及其用途
US20200017596A1 (en) * 2018-05-10 2020-01-16 Abvision, Inc. Monoclonal antibodies activating cd40 and uses thereof
BR112020022690A2 (pt) 2018-05-10 2021-02-09 Cyberdontics (Usa), Inc. broca dental automatizada
CA3150428A1 (en) * 2019-08-12 2021-02-18 Biond Biologics Ltd. Antibodies against ilt2 and use thereof
EP4069288A4 (en) * 2019-12-06 2024-01-17 Viela Bio, Inc. TREATMENT METHODS USING ILT7 BINDING PROTEINS
IL297444A (en) 2020-04-20 2022-12-01 Genzyme Corp Humanized antibodies against complement factor bb and their use
WO2022051516A1 (en) 2020-09-03 2022-03-10 Cyberdontics (Usa), Inc. Method and apparatus for cna analysis of tooth anatomy
US20240287176A1 (en) 2021-05-04 2024-08-29 Viela Bio, Inc. Methods of treatment of autoimmune disorders using ilt7 binding proteins
AR130042A1 (es) 2022-07-27 2024-10-30 Viela Bio Inc Formulaciones que comprenden una proteína de unión al transcripto 7 similar a inmunoglobulina (ilt7)
CN115819604B (zh) * 2022-09-09 2025-04-15 季华实验室 抗双链dna抗体、核苷酸片段、磁珠及提取外周血游离dna的方法
AU2024235162A1 (en) * 2023-03-16 2025-09-11 Inmagene Pte. Ltd. Ilt7-targeting antibodies and uses thereof
CN116948032B (zh) * 2023-09-19 2023-12-12 汇智生物技术(苏州)有限公司 人源cd4单克隆抗体及其制备方法和应用
CN120098124A (zh) * 2023-12-05 2025-06-06 苏州普乐康医药科技有限公司 一种抗bdca-2抗体及其制备方法和应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ZA952797B (en) * 1994-04-12 1996-10-07 Res Dev Foundation Method of treating auto-immune diseases using type one interferons
US6107090A (en) * 1996-05-06 2000-08-22 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of prostate cancer with antibodies to extracellur PSMA domains
EP1156823B1 (en) * 1999-02-12 2008-10-29 The Scripps Research Institute Methods for treatment of tumors and metastases using a combination of anti-angiogenic and immuno therapies
BR0108188A (pt) * 2000-02-10 2003-02-25 Abbott Lab Anticorpos que se ligam a interleucina-18 humana e métodos de produção e uso
US6897067B2 (en) * 2000-11-03 2005-05-24 Regents Of The University Of Michigan Surface transfection and expression procedure
AU2002318944A1 (en) * 2001-08-01 2003-02-17 Coley Pharmaceutical Gmbh Methods and compositions relating to plasmacytoid dendritic cells
DE60233674D1 (de) * 2001-10-13 2009-10-22 Asterion Ltd Glykosylphosphatidylinositolhaltige polypeptide
EP2316921B1 (en) * 2002-05-24 2014-05-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Neutralizing human anti-IGFR antibody
AU2003252328A1 (en) 2002-08-01 2004-02-23 Ginkgo Biomedical Research Institute Co., Ltd. Method of detecting mouse interferon-producing cells
AU2003289716A1 (en) * 2002-09-12 2004-04-30 Incyte Corporation Molecules for diagnostics and therapeutics
AU2004271192B2 (en) 2003-09-03 2011-11-17 Government Of The United States Of America, As Represented By Secretary, Department Of Health And Human Services Methods for identifying, diagnosing, and predicting survival of lymphomas
GB0417487D0 (en) 2004-08-05 2004-09-08 Novartis Ag Organic compound

Also Published As

Publication number Publication date
CY1116031T1 (el) 2017-01-25
BRPI0620141A2 (pt) 2011-11-01
CA2634116C (en) 2018-03-27
CA2994756A1 (en) 2007-06-28
TR201816574T4 (tr) 2018-11-21
CN103360492A (zh) 2013-10-23
CA2994756C (en) 2020-10-27
CA2634116A1 (en) 2007-06-28
RU2456298C2 (ru) 2012-07-20
US8470992B2 (en) 2013-06-25
BRPI0620141B1 (pt) 2024-04-30
KR20140053232A (ko) 2014-05-07
US20130259872A1 (en) 2013-10-03
CN110776566A (zh) 2020-02-11
IL192266A0 (en) 2008-12-29
PT1964852E (pt) 2013-07-10
RU2008129715A (ru) 2010-01-27
IL192266A (en) 2014-09-30
ES2699428T3 (es) 2019-02-11
JP2012143232A (ja) 2012-08-02
HK1124347A1 (en) 2009-07-10
CN105111311A (zh) 2015-12-02
RU2012112046A (ru) 2013-10-10
EP1964852A1 (en) 2008-09-03
SI2532681T1 (sl) 2015-03-31
CN101379089A (zh) 2009-03-04
CN101379089B (zh) 2013-08-07
CN110776566B (zh) 2025-07-15
EP2913343B1 (en) 2018-08-08
CY1121294T1 (el) 2020-05-29
US20090280128A1 (en) 2009-11-12
SG10201602095PA (en) 2016-05-30
US8084585B2 (en) 2011-12-27
NZ569910A (en) 2012-06-29
KR20080090430A (ko) 2008-10-08
EP2913343A1 (en) 2015-09-02
HK1179638A1 (en) 2013-10-04
CN120718150A (zh) 2025-09-30
US20200339682A1 (en) 2020-10-29
ES2416716T3 (es) 2013-08-02
NZ616992A (en) 2015-07-31
EP3441403A1 (en) 2019-02-13
KR20150031485A (ko) 2015-03-24
HUE039865T2 (hu) 2019-02-28
KR101585532B1 (ko) 2016-01-14
SI2913343T1 (sl) 2019-01-31
LT2913343T (lt) 2018-11-26
SG170749A1 (en) 2011-05-30
EP1964852A4 (en) 2010-02-24
ZA200805850B (en) 2009-04-29
KR101624587B1 (ko) 2016-05-26
HRP20141226T1 (hr) 2015-02-27
US20160130343A1 (en) 2016-05-12
AU2006328470A2 (en) 2008-10-09
PL2913343T3 (pl) 2019-03-29
HK1214603A1 (en) 2016-07-29
EP2532681A1 (en) 2012-12-12
AU2006328470B2 (en) 2012-08-16
RS53752B1 (sr) 2015-06-30
DK2532681T3 (en) 2015-01-05
UA97946C2 (ru) 2012-04-10
HRP20130494T1 (en) 2013-08-31
JP5020828B2 (ja) 2012-09-05
RS52860B (sr) 2013-12-31
PL2532681T3 (pl) 2015-03-31
US20120135003A1 (en) 2012-05-31
EP2532681B1 (en) 2014-10-01
RU2599450C2 (ru) 2016-10-10
MX2008007682A (es) 2008-10-23
SI1964852T1 (sl) 2013-09-30
JP5420688B2 (ja) 2014-02-19
AU2006328470A1 (en) 2007-06-28
KR101526934B1 (ko) 2015-06-26
ES2526079T3 (es) 2015-01-05
PL1964852T3 (pl) 2013-09-30
US20170204179A1 (en) 2017-07-20
JPWO2007072866A1 (ja) 2009-06-04
WO2007072866A1 (ja) 2007-06-28
PT2913343T (pt) 2018-11-21
CN105111311B (zh) 2019-10-18
DK2913343T3 (en) 2018-11-26
CY1114227T1 (el) 2016-08-31
HK1218126A1 (zh) 2017-02-03
DK1964852T3 (da) 2013-07-08
NZ599683A (en) 2013-11-29
EP1964852B1 (en) 2013-04-17
PT2532681E (pt) 2014-12-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101585532B1 (ko) 항-ｉｌｔ7 항체
HK40004633A (en) Anti-ilt7 antibody
AU2019203877A1 (en) Anti-ilt7 antibody
HK1214603B (en) Anti-ilt7 antibody
HK1179638B (en) Anti-ilt7 antibody