BRPI0620141A2

BRPI0620141A2 - anticorpo anti-ilt7

Info

Publication number: BRPI0620141A2
Application number: BRPI0620141-5A
Authority: BR
Inventors: Yumiko Kamogawa; Minkwon Cho; Naoko Arai; Koji Ishida
Original assignee: Sbi Biotech Co Ltd
Priority date: 2005-12-20
Filing date: 2006-12-20
Publication date: 2011-11-01
Also published as: DK2913343T3; CN105111311A; HK1218126A1; RU2008129715A; DK2532681T3; EP1964852B1; JP5420688B2; SI1964852T1; PT2532681E; PT2913343T; PT1964852E; KR101624587B1; US20130259872A1; DK1964852T3; AU2006328470B2; EP3441403A1; CN105111311B; CA2994756C; LT2913343T; RS53752B1

Abstract

ANTICORPO ANTI-ILT7. Um anticorpo que se liga a IPC foi obtido, utilizando-se uma célula animal na qual uma proteína de membrana celular, associável a ILT7, foi co-expressa como imunogene. Anticorpo da invenção possui alta especificidade que possibilita distinção imunológica entre outras moléculas da família ILT e ILT7. Anticorpo anti-ILT7 da invenção ligou-se a IPO e inibiu a atividade da mesma. Com o anticorpo anti-ILT7 da invenção, é possível inibir a ati- vidade da IPC e uma doença relacionada com interferon pode ser tratada ou prevenida. A expressão de ILT7 é mantida, mesmo em IPC, na presença de lFN-<244>. Por conseguinte, pode-se prever inibição da atividade de IPO, pelo anticorpo anti-ILT7, mesmo em paciente portador de doença autoimune com produção aumentada de lFN-<244>.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPO ANTI-ILT7".

Estado da Técnica

A presente invenção refere-se a um anticorpo que se liga ao ILT7 humano.

Antecedentes da Técnica

O lnterferon-α (IFN-a: a seguir, "interferon" é abreviado como IFN) e o interferon-β (IFN-β) são conhecidos como IFNs tipo 1 e possuem atividade antiviral ou atividade antitumoral. Por outro lado, foi exposto tam- bém que o IFN-α está relacionado com doença auto-imune. Por exemplo, produção anormal de IFN-α foi relatada em pacientes com as doenças auto- imunes abaixo. Foi sugerido também que a neutralização do IFN-α pode re- duzir os sintomas das doenças auto-imunes.

Lupus eritematoso sistêmico (Shiozawa et ai, Arthr. & Rheum. 35,412,1992);

Reumatismo crônico (Hopkins et ai, Clin. Exp. Immunol. 73, 88, 1988)

Casos em que sintomas das doenças auto-imunes manifesta- ram-se ou pioraram por administração de IFN-a2 ou IFN recombinante foram relatados (Wada et ai, Am. J. Gastroenteroi 90, 136, I995; Perez et ai, Am. J. Hematol. 49, 365, 1995; Wilson LE etal, Semin Arthrítis. Rheum. 32, 163- 173,2002).

Ademais, foi exposto ainda que IFN-α induz diferenciação de células dendríticas. A célula dendrítica é também uma célula apresentadora de antígenos. Por conseguinte, a indução da diferenciação de células den- dríticas é considerada um importante mecanismo em doenças auto-imunes. Foi sugerido haver uma associação profunda entre a indução de diferencia- ção de células dendríticas, produtoras de IFN-α, e o aparecimento de Iupus eritematoso sistêmico (Blanco et ai, Science, 16:294, 1540-1543, 2001). Dessa forma, foi indicado que o IFN-α está estreitamente relacionado com atividade antitumoral, bem como com doenças auto-imunes. Ademais, o IFN- α está profundamente envolvido no aparecimento de psoríase (Nestle FO et ai, J. Exp. Med. 202, 135-143, 2005).

Células Produtoras de Interferon (IPCs) foram identificadas co- mo células que produzem IFN tipo 1 em grandes quantidades associadas com infecção viral. Há poucas IPCs presentes no sangue. Considera-se que linfócitos do sangue periférico sejam responsáveis por 1% ou menos das IPCs. No entanto, IPCs possuem uma capacidade muito grande para produ- zir IFN. A capacidade de produção de IFN das IPCs atinge, por exemplo, 3000 pg/ml/104 células. Ou seja, pode-se dizer que a maior parte do IFN-a ou IFN-β presente no sangue é produzido em infecção viral resulta de IPCs, embora exista apenas um número pequeno de células.

Por outro lado, IPCs são células dendríticas linfóides não dife- renciadas, consideradas células precursoras de células dendríticas, podendo ser referidas como células dendríticas Plasmocitóides. IPCs diferenciam-se em células dendríticas por estimulação de vírus e induzem a produção de IFN-γ ou IL-10 pelas células T. Elas diferenciam-se também em células den- dríticas por estimulação de IL-3. As células dendríticas diferenciadas, por estimulação de IL-3, induzem a produção de Th2 citoquina (IL-4, IL-5 e IL- 10) pelas células T. Dessa forma, as IPCs possuem propriedades que lhes permitem diferenciar-se em células dendríticas distintas quando estimuladas diferentemente.

De acordo com o mesmo, as IPCs possuem dois perfis: células produtoras de IFN e células precursoras de células dendríticas. Ambas as células desempenham importante papel no sistema imunológico. Em outras palavras, a IPC é uma das células importantes que dão sustentação ao sis- tema imunológico em vários aspectos.

Documento 1 não de patente: Shiozawa et ai, Arthr. & Rheum. 35,412,1992

Documento 2 não de patente: Hopkins et ai, Clin. Exp. Immunoi 73,88,1988

Documento 3 não de patente: Wada et ai, Am. J. Gastroenteroi

90, 136, 1995

Documento 4 não de patente: Parez et ai, Am. J. Hematol. 49, 365,1995

Documento 5 não de patente: Bianco et ai, Science, 16:294, 1540-1543,2001

Documento 6 não de patente: Ju et al., Gene. 28 de abril de 200428;331:159-64.

Documento 7 não de patente: Colonna M et ai, Seminars in Im- munology 12: 121-127, 2000.

Documento 8 não de patente: Nakajima H. et ai, J. Immunology 162:5-8.1999

Documento 9 não de patente: Wilson LE et al, Semin Arthritis.

Rheum. 32, 163-173, 2002

Documento 10 não de patente: Nestle FO et ai, J. Exp. Med. 202,135-143,2005

Documento 1 de patente: W003/12061 (Pedido de Patente Pu- blicado U.S. N9 2003-148316) Descrição da Invenção Questões a serem resolvidas pela Invenção

Um objetivo da invenção é prover um anticorpo que se ligue ao transcrito 7 semelhante à imunoglobulina (ILT7) e detectar, identificar ou iso- lar IPCs. Outro objetivo da presente invenção é regular a atividade de IPCs. 1 Meios para resolução das questões

A fim de regular a atividade de um fator humoral como o IFN, a administração de anticorpos que reconheçam o fator é efetiva. Por exemplo, foram efetuadas tentativas para tratamento de doenças auto-imunes por administração de anticorpos contra interleucina (IL)-I ou IL-4 (Guler et ai, Arthritis Rheum., 44. S307, 2001). E mais, supõe-se que anticorpos neutrali- zantes possam servir como agentes terapêuticos de doenças auto-imunes, conforme por meio de interferon (Stewart, TA. Cytokine Growth Factor Rev. 14; 139-154, 2003). Pode-se prever que algum tipo de abordagem, conforme descrito acima, tenha efeito sobre o IFN produzido pelas IPCs. No entanto, este tipo de abordagem baseia-se na inibição do efeito do fator humoral a- pós a produção deste fator. Se a produção do fator humoral desejado puder ser controlada diretamente, efeitos terapêuticos mais substanciais podem ser atingidos.

Foram relatados anticorpos que reconhecem IPC humana. Por exemplo, o anticorpo monoclonal anti-BDCA-2 é o anticorpo monoclonal es- pecífico contra IPC humana (Dzionek A. et ai J. Immunol. 165: 6037-6046, 2000). Foi descoberto que o anticorpo monoclonal anti-BDCA-2 inibe efeti- vamente a produção de IFN pelas IPCs humanas (J. Exp. Med. 194: 1823- 1834, 2001). Ademais, foi relatado também que anticorpos monoclonais que reconhecem células produtoras de interferon em camundongos, inibem a produção de interferon (Blood 2004 Jun 1; 103/11: 4201-4206.Epub 2003 Dec). Foi relatado que a redução do número de células dendríticas foi decor- rente de anticorpos monoclonais contra células dendríticas plasmocitóides em camundongos (J. Immunol. 2003, 171: 6466-6477).

Semelhantemente, será útil prover anticorpos que reconheçam IPCs humanas e que possam regular a sua atividade. Por exemplo, os pre- sentes inventores já demonstraram que um anticorpo que reconhece Ly49Q, liga-se especificamente a IPCs de camundongos. No entanto, o anticorpo contra Ly49Q não interferiu com a atividade de IPCs de camundongos (Blo- od, 19 de abril de 2005, Vol. 105, N9 7, e pág. 2787-2792.; W02004/13325). Por outro lado, ILT7 é conhecido como uma molécula cuja expressão espe- cífica é observada em células dendríticas Plasmocitóides (Ju XS et aí. e Ge- ne. 28 de abril de 2004; 331: 159-64.; W003/12061). Contudo, não foram obtidos anticorpos contra ILT7. Por conseguinte, os efeitos de anticorpos sobre IPCs são também desconhecidos.

ILT7 é uma proteína da membrana contendo motivo semelhante ao da imunoglobulina. Foi relatado que este seria uma das moléculas ex- pressadas em células do sistema mielóide ou sistema linfático (Colonna M et a/., Seminars in Immunology 12:121-127, 2000). Uma pluralidade de molécu- las com estruturas análogas a de ILT7 é referida como família ILT. A família ILT é também estruturalmente semelhante a receptores inibidores de células assassinas (KIR). ILT7 possui quatro domínios tipo C semelhante aos da imunoglobulina, conforme ocorre com outras moléculas da família ILT. De acordo com o considerado, o ILT7 envie sinais de ativação celular conforme observado com ILT1, proteína semelhante a ILT1, ILT8 e LIR6a. Foi confir- mado que moléculas pertencentes à família ILT são expressas em células do sistema hemócito (Young et ai, Imunogeneetics 53: 270-278, 2001; "The KIR Gene Clustei" Carrington, Mary e Norman, Paul. Bethesda (MD): Natio- nal Library of Medicine (US), NCBI; 2003).

De acordo com o mesmo, foram detectadas expressão alta de ILT7 em células dendríticas Plasmocitóides (PDC) e expressão baixa de ILT7 em células dendríticas derivadas de monócitos (MDDC), por hibridiza- ção subtrativa. ILT2 e ILT3 são expressos não só em PDC, mas também em DC, obtida de MDDC ou células CD34 positivas. No entanto, como o mRNA, no ILT7, foi expresso especificamente em PDC, foi constatado que o mRNA poderia servir como marcador de PDC. Adicionalmente, foi constatado que, nessa ocasião, a expressão de ILT7 foi reduzida por estimulação de CpG (Ju XS et al. Gene. 28 de abril de 2004; 331: 159-64.; W003/12061).

Os presentes inventores confirmaram que a expressão específi- ca de ILT7 em IPC foi facilitada por meio do estudo em IPC humana. Em seguida, os presentes inventores tentaram produzir anticorpos contra ILT7 e elucidar os seus efeitos. Por exemplo, moléculas que fazem parte de famí- lias ILT, como ILT2 e ILT3, possuem alto nível de conservação, especial- mente em relação a seqüências de aminoácidos de domínios extracelulares (Figura 9). Estas famílias ILT exibem, respectivamente, perfis de expressão característicos em várias células sangüíneas. Por conseguinte, é muito im- portante obter um anticorpo possa fazer a distinção, em termos imunológi- cos, entre moléculas de outras famílias ILT e a de ILT7. Contudo, de fato, foi difícil produzir um anticorpo que se ligue especificamente a IPCs humanas, empregando ILT7 como imunogene em virtude de os obstáculos descritos abaixo.

Em geral, uma proteína obtida por tecnologia de recombinação gênica é produzida sob a forma de imunogene para que possa ser obtido um anticorpo que reconheça traços de proteínas derivadas de organismos vivos. Os presentes inventores tentaram expressar ILT7 humano, com base em informação de uma seqüência de bases de cDNA de ILT7 humano, a qual já tinha sido descoberta, e na seqüência de aminoácidos codificada pela se- qüência de bases (N9 de acesso do GenBank NM_012276). No entanto, os presentes inventores não conseguiram produzir ILT7 humano recombinante, sob condições normais.

Freqüentemente, usa-se a seqüência parcial de aminoácidos da proteína natural como imunogene para se tentar obter um anticorpo contra a proteína. No entanto, existem poucas seqüências de aminoácidos em prote- ínas, específicas para ILT7 humano, uma vez que a homologia em relação a seqüências de aminoácidos é extremamente alta entre a família ILT. Ade- mais, é necessário selecionar a região que constitui a parte reconhecida co- mo epítopo por anticorpos na superfície de células, de forma a possibilitar que os anticorpos reconheçam as moléculas que se encontram na superfície celular. Por conseguinte, foi considerado que a formação de um anticorpo específico contra ILT7, utilizando-se um fragmento de seqüência de aminoá- cidos como imunogene, não é uma opção realista.

Os presentes inventores demonstraram que um anticorpo que se liga a IPCs poderia ser obtido empregando um imunogene especial, sob es- tas condições. Ademais, os presentes inventores constataram que o anticor- po assim obtido reconheceu especificamente IPCs humanas e que apresen- tava ainda efeito de regular a atividade, obtendo, pelo menos, êxito em con- cluir a presente invenção. Ou seja, a presente invenção refere-se ao anticor- po anti-ILT7 seguinte e a métodos de produção e uso deste anticorpo. Efeitos da invenção

A presente invenção provê um imunogene que pode ser utilizado na produção de um anticorpo que reconhece ILT7 humano e um método de produção de anticorpo anti-ILT7 humano, empregando o imunogene. ILT7 é uma proteína da membrana que pertence à família ILT. Particularmente, a seqüência de aminoácidos da região extracelular é altamente conservada entre famílias ILT. Por conseguinte, é extremamente difícil produzir um anti- corpo que faça a distinção entre famílias ILT por métodos gerais de imuniza- ção. Os presentes inventores demonstraram que o anticorpo que reconhece ILT7 humano pode ser facilmente obtido, utilizando-se células animais nas quais o ILT7 é cõ-expresso com proteína da membrana celular. Este anticor- po anti-ILT7, obtido pela presente invenção, possui alta especificidade pos- sibilitando a distinção entre células que expressam outras famílias ILT e a- quelas que expressam IPCs humanas.

Em uma concretização preferida, o anticorpo anti-ILT7 humano, provido pela presente invenção, liga-se a IPCs humanas. Ademais, o anti- corpo da presente invenção reconhece especificamente IPCs humanas. Por conseguinte, ele é útil na detecção e isolamento de IPCs. IPC é uma célula que produz a maior parte do interferon tipo 1. Por conseguinte, a detecção e isolamento são importantes no diagnóstico e estudo de doenças que envol- vem IPCs, como as doenças auto-imunes. Particularmente, de acordo com os achados da presente invenção, a expressão de ILT7 em IPCs não é re- duzida sob a presença de IFN-α. A expressão do IFN-α é freqüentemente facilitada em pacientes com doenças auto-imunes. Isso significa que o anti- corpo anti-ILT? da presente invenção pode ser utilizado na detecção e iso- lamento de IPCs, em pacientes com doenças auto-imunes, nos quais a ex- pressão do I FN-α é facilitada.

Em uma concretização preferida, o anticorpo anti-ILT7 provido pela invenção exerce efeito de regulação da atividade de IPCs humanas. Por 1 conseguinte, o anticorpo anti-ILT7 da presente invenção pode ser utilizado para inibir a atividade de IPCs. Conforme foi descrito previamente, a expres- são de ILT7 em IPCs. não é reduzida sob a presença de IFN-α. Por conse- guinte, se a inibição da atividade de IPCs pelo anticorpo da presente inven- ção for utilizada, pode-se esperar um efeito terapêutico sobre pacientes com doenças auto-imunes nos quais a expressão de IFNa encontra-se facilitada.

Poucas IPCs produzem grande quantidade de IFN. Para neutra- lização do IFN é necessário o mesmo número de moléculas de anticorpo e de IFN. No entanto, a ativação da produção de células é diretamente inibida na presente invenção. Em resultado, um forte efeito inibidor sobre IFN pode ser previsto mesmo se uma quantidade menor de anticorpos for utilizada, em comparação com a neutralização pelo anticorpo anti-IFN. Ademais, quando IFN é continuamente produzido, prevê-se que a neutralização por anticorpos contra IFN ocorra sob a forma de inibição transitória. Na presente invenção, como a atividade de IPCs é inibida, pode-se prever que ocorrerá um efeito inibidor sobre a produção de IFN por um período prolongado de tempo.

Breve Descrição resumida dos Desenhos

A Figura 1a exibe uma fotografia da expressão de mRNA do ge- ne de ILT7, examinada pelo método de RT-PCR. Ela reproduz o resultado da expressão de mRNA do gene de ILT7, analisada em imunocitos huma- nos.

A Figura 1b é um diagrama no qual a expressão de mRNA do gene de ILT7, em vários tecidos e células humanas, é comparada e exami- nada utilizando o método de PCR quantitativa. O eixo horizontal exibe os tecidos e células que foram examinados e o vertical, o nível de expressão de ILT7, padronizado de acordo com o nível de expressão do gene de GAPDH.

A Figura 2 é um diagrama exibindo estruturas da proteína ILT7, em que a Figura 2(a) exibe uma seqüência de aminoácidos da proteína ILT7 e exibe ainda a seqüência estimada de sinalização de secreção e domínio transmembrana no desenho, e a Figura 2(b) exibe um diagrama esquemáti- co de proteínas ILT7, codificadas por vetores construídos de expressão.

A Figura 3 é um diagrama resultante da introdução do vetor de expressão de ILT7 e do vetor de expressão de FcRy em células, no qual a expressão de moléculas de ILT7 na superfície celular foi examinada por FCM. O eixo horizontal exibe a intensidade de fluorescência detectada no anticorpo anti-FLAG, a saber, a intensidade, na superfície celular, da ex- pressão de moléculas de ILT7, às quais uma etiqueta (tag) FLAG foi anexa- da, e o eixo vertical exibe o número de células.

A Figura 4 exibe fotografias nas quais o vetor de expressão de ILT7 e o vetor de expressão de FcRy foram introduzidos nas células e a as- sociação de moléculas foi analisada por imunoprecipitação e pela técnica Western blotting. Os diagramas do lado esquerdo exibem resultados nos quais a molécula de ILT7 foi detectada com anticorpo anti-FLAG, após imu- noprecipitação da molécula de FcRy com o anticorpo anti-myc (o desenho acima), e a molécula de FcRyfoi detectada com anticorpo anti-myc (o dese- nho abaixo). Semelhantemente, os diagramas do lado direito exibem resul- tados nos quais a molécula de ILT7 foi detectada com anticorpo anti-FLAG após imunoprécipitação da molécula de FcRy com o anticorpo anti-FLAG (acima), e a molécula de FcRy foi detectada com anticorpo anti-myc (abai- xo).

A Figura 5 é uma fotografia na qual foi examinada glicosilação da molécula de ILT7 pela introdução do vetor de expressão de ILT7 e do vetor de expressão de FcRy na célula e tratamento com N-glicosidase. O lado esquerdo da fotografia exibe o tamanho de ILT7, quando este não foi tratado com N-glicosidase, e o lado direito da fotografia exibe o tamanho do ILT7 quando efetuado tratamento com N-glicosidase.

A Figura 6a é um diagrama no qual a responsividade do anticor- po monoclonal anti-ILT7 produzido foi examinada por análise de FCM.(a) exibe um resultado no qual a ligação do anticorpo anti-ILT7 à fração da IPC de BDCA-2 positivo foi analisada empregando linfócitos humanos do sangue periférico e dupla coloração com o anticorpo anti-ILT7 e anticorpo anti- BDCA-2. O eixo vertical exibe a responsividade ao anticorpo anti-BDCA-2, e o eixo horizontal, a responsividade a cada um dos anticorpos anti-ILT7 pro- duzidos.

A Figura 6b é um diagrama no qual a responsividade dos anti- corpos monoclonais anti-ILT7 produzidos foi examinada por análise de FCM. (b) exibe um resultado no qual a ligação do anticorpo anti-ILT7 à molécula de ILT7 foi examinada, utilizando-se células 293T, nas quais vetores de ex- pressão de ILT7 e de FcRy foram introduzidos. O eixo vertical exibe a res- ponsividade do anticorpo anti-FLAG, a saber, a intensidade de expressão de moléculas de ILT7, às quais uma etiqueta FLAG foi anexada, e o eixo hori- zontal, a responsividade dos respectivos anticorpos anti-ILT7.

A Figura 7 é um diagrama no qual a responsividade de dois clo- nes a linfócitos humanos de sangue periférico, entre os anticorpos monoclo- nais anti-ILT7 produzidos, foi examinada por análise de FCM. Três gráficos na esquerda exibem os resultados do nQ 11 e três gráficos na direita, os re- sultados do η917. Nos diagramas do lado esquerdo, cada eixo com a marca de ILT7 exibe a responsividade do ILT7 n9 11. Semelhantemente, nos dia- gramas do lado direito, cada eixo com a marca de ILT7 exibe a responsivi- dade do ILT7 n9 17.

A Figura 8 é um resultado no qual a atividade de ligação dos an- ticorpos monoclonais anti-ILT7 produzidos n9 11 e n9 17 a linfócitos humanos foi comparada e examinada àquela do anticorpo anti-BDCA-2. O eixo vertical exibe a responsividade do anticorpo anti-CD123 e o eixo horizontal, a res- ponsividade de cada anticorpo. Ou seja, cada anticorpo liga-se a uma parte da célula CD123 positiva. Este é um diagrama exibindo os resultados nos quais a responsividade foi analisada quando células linfócitos foram estimu- ladas por dois tipos de CpGs e IFN-a.

A Figura 9a é um diagrama exibindo seqüências de aminoácidos de moléculas de famílias com alta homologia a moléculas de ILT7. Cada se- qüência de aminoácidos da região extracelular é apresentada, principalmen- te, como alinhamento; a Figura 9b é continuação da Figura 9a; e a Figura 9c é continuação da Figura 9b.

A Figura 10 é um resultado no qual a responsividade dos anti- corpos monoclonais anti-ILT7 produzidos, ILT7 n9 11 e ILT7 n9 17, as molé- culas de ILT1, ILT2 e de ILT3 foi examinada, utilizando-se células nas quais seus vetores de expressão foram introduzidos. O diagrama superior exibe os resultados quando a responsividade a células, nas quais moléculas de ILT7 com etiqueta FLAG foram expressas concomitantemente com FcRy, foi rea- firmada. O diagrama inferior exibe os resultados quando a responsividade a células nas quais ILT1, ILT2, ILT3 e FcRyforam introduzidos (diagrama es- querdo: ILT7 n9 11, diagrama direito: ILT7 n9 17). O eixo horizontal exibe a responsividade de cada anticorpo anti-ILT7.

A Figura 11 é um diagrama exibindo o efeito dos anticorpos mo- noclonais anti-ILT7 produzidos, ILT7 n9 11 e ILT7 n9 17, sobre a capacidade interferogênica de linfócitos humanos. No diagrama, o eixo horizontal exibe a concentração de IFN-α, em sobrenadante de cultura, quando linfócitos hu- manos foram estimulados por vírus Influenza, e o eixo vertical exibe os anti- corpos tratados. O termo "sem infecções" indica os resultados de células que não foram estimuladas pelo vírus Influenza.

A Figura 12 é um diagrama exibindo o nível de atividade de CDC (citotoxicidade complemento-dependente) dos anticorpos monoclonais anti- ILT7 produzidos, ILT7 ns 37, ILT7 ns 28 e ILT7 ne 33. Mesmo quando utiliza- dos anticorpos monoclonais anti-ILT7 obtidos de qualquer hibridoma, foi exi- bido nível de atividade de CDC de 80% ou mais na concentração de anticor- pos de 0,1 μg/ml ou mais alta. Quando foram utilizados anticorpos diferentes do anticorpo monoclonal anti-ILT7, não foi observado nível atividade de CDC contra células-alvo.

A Figura 13 é um diagrama exibindo internalização em células- alvo dos anticorpos monoclonais anti-ILT7 produzidos, ILT7 n9 17, ILT7 n- 26, ILT7 ns 37, ILT7 ne 28 e ILT7 ns 33.

A intensidade de fluorescência da APC indica a quantidade do complexo imune ILT7-anticorpo anti-ILT7, presente na superfície de células antes de incubação, e esta é detectada independentemente se o complexo imune ILT7-anticorpo anti-ILT7 está presente na superfície da célula-alvo ou incorporado na célula após incubação. Por outro lado, a intensidade fluores- cente da FITC indica a quantidade do complexo imune ILT7-anticorpo anti- ILT7 que permanece sobre a superfície de células após incubação. Ou seja, a intensidade fluorescente da FITC é reduzida por internalização. Melhor modo para Conduzir a Invenção

De acordo com o relatado, ILT7 humano (transcrito 7 semelhan- te à imunoglobulina) é uma molécula que se expressa especificamente em células dendríticas Plasmocitóides (Gene. 28 de abril de 2004; 331:1 59-64.; W003/12061). Alternativamente, é também conhecido que ILT7 humano pode ser utilizado como indicador preditivo para prognóstico de Iinfoma (W02005/24043). No entanto, não foi estabelecido um método de produção de anticorpo que seja capaz de reconhecer ILT7 humano.

ILT7 humano consiste em 499 resíduos de aminoácidos, con- forme exibido na SEQ ID NO: 2 e é uma proteína transmembrana tipo 1 compreendendo quatro domínios semelhantes aos da imunoglobulina, na estrutura, e uma região transmembrana (445-466; de 429 a 450 na SEQ ID NO: 2). Entre os 444 resíduos de aminoácidos, incluindo o N-terminal, 16 resíduos de aminoácidos (de -15 a -1, na SEQ ID NO: 2) são seqüências de sinalização, e de 17 a 444 resíduos de aminoácidos (de 1 a 428, na SEQ ID NO: 2) constituem um domínio extracelular. Por outro lado, a região C- terminal é um domínio extracelular. A maior parte do ILT7 humano é consti- tuída por domínios extracelulares e 33 resíduos de aminoácidos constituem um domínio intracelular (de 467 a 499; de 451 a 483, na SEQ ID NO: 2). Não se prevê a presença de motivo envolvido em sinalização em domínio intrace- lular. Uma seqüência de aminoácidos, em extensão completa, do ILT7 é a- presentada na SEQ jD NO: 2, sendo exibida uma seqüência de bases do cDNA codificador da seqüência de aminoácidos, na SEQ ID NO: 1. Aqui, as regiões codificadoras do peptídeo maduro (72)..(1520), exibidas na SEQ ID NO: 1, não compreendem os códons de terminação e de iniciação. Ou seja, as seqüências que codificam a proteína, nas quais os códons de terminação e de iniciação na SEQ ID NO: 1 estão compreendidos, são de 24 a 1523.

Considera-se que o sinal do Iigante é transmitido a células por associação do ILT7 com uma molécula transdutora de sinal. Por exemplo, a maior parte das cadeias γ do receptor FC está presente em células. Além disso, o domínio intracelular contém um motivo de ativação de imunorecep- tor baseado em tirosina (ITAM), o qual está envolvido na sinalização. ITAM é uma parte da seqüência de aminoácidos, comumente observado em molécu- las adaptadoras, associadas com imunoreceptores, como receptores Fe. Um motivo como YxxL (SEQ ID NO: 76), alvo de tirosina fosforilação, está com- preendido no ITAM e o sinal é transmitido pela fosforilação. Exemplos co- nhecidos da molécula transdutora de sinal que compreenda ITAM em domí- nio intracelular inclui Οϋ3ζ e DAP12, além de cadeia γ do receptor Fc. Entre estas moléculas transdutoras de sinais, prevê-se que a molécula associada a ILT7 humano seria a cadeia γ do receptor Fc. Atualmente, não foi encon- trado um Iigante que se ligue a ILT7 humano.

Os presentes inventores confirmaram que ILT7 foi especifica- mente expresso em IPCs humanas por análise de expressão gênica. Os presentes inventores consideraram que seria útil, no estudo de IPCs1 se um anticorpo capaz de distinguir ILT7 humano de outras moléculas pudesse ser imunologicamente obtido. No entanto, existem muitas moléculas com estru- turas semelhantes na família ILT, incluindo ILT7. Moléculas como ILT1, ILT2, ILT3, ILT4, ILT5, ILT6 ou LIR-8 compreendem seqüências de aminoácidos altamente homólogas, especialmente em seus domínios extracelulares. Por conseguinte, os presentes inventores consideraram ser difícil obter um anti- corpo capaz de efetuar a distinção entre estas moléculas, utilizando um pep- tídeo de um domínio compreendendo uma seqüência parcial de aminoácidos que constitua um domínio extracelular, como imunogene. Dessa forma, os presentes inventores tentaram produzir um anticorpo contra ILT7 humano utilizando as células que expressam ILT7 como imunogenes.

No entanto, o uso de vetores gerais de expressão não fez com que ocorresse a expressão do cDNA de ILT7 humano em células animais. Foi relatado que a molécula do ILT1 com estrutura muito semelhante a do ILT7 associa-se com a cadeia γ do receptor Fe. Ou seja, quando células nas quais a cadeia γ do receptor Fc foi expressa, como células RBL (leucemia basofílica de rato) e células P815 (mastocitoma de camundongo), foram utili- zadas como células hospedeiras, foi observada a expressão do ILT1 sobre a superfície celular. No entanto, quando foi forçada a expressão de ILT1 em 1 células 293, nas quais a cadeia γ do receptor Fc não era originalmente ex- pressa, a expressão na superfície celular não foi observada. Por outro lado, foi demonstrado que a expressão na superfície celular do ILT1 poderia ser confirmada quando ILT1 era co-expresso com a cadeia γ do receptor Fc (Nakajima H. et ai, J. Immunology 162:5-8.1999). No entanto, não há infor- mação sobre um imunogene para produção de anticorpos contra ILT7.

Por exemplo, de acordo com o relatado, células RBL, nas quais o gene do ILT1 é introduzido, são utilizadas como imunogenes para produzir anticorpos contra ILT1. Os presentes inventores tentaram produzir anticor- pos contra ILT7 utilizando a combinação de células RBL com gene de ILT7 na mesma maneira descrita. No entanto, mesmo quando foi forçada a ex- pressão de ILT7 em células RBL (P815), a expressão sobre a superfície ce- lular do ILT7 não foi observada e, portanto, este não poderia ser utilizado como imunogene.

Os presentes inventores conduziram pesquisa dedicada para obter o anticorpo capaz de reconhecer ILT7 humano. Em resultado, os pre- sentes inventores constataram que o anticorpo desejado poderia ser produ- zido, utilizando-se uma célula especificamente transformada como imunoge- ne e concluíram a presente invenção. Ou seja, a presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal que se liga ao domínio extracelular do ILT7 hu- mano e refere-se a um fragmento compreendendo a região de ligação de seu antígeno.

Na presente invenção, o ILT7 humano pode ser definido como uma molécula natural expressa em IPCs humanas ou uma molécula imuno- logicamente equivalente ao ILT7 expresso em IPCs humanas. Na presente invenção, a ligação de anticorpos a ILT7 humano pode ser confirmada, por exemplo, da forma como segue.

- Confirmação fundamentada em responsividade a células humanas:

De acordo com os achados dos presentes inventores, foi obser- vada expressão específica do ILT7 humano em IPCs humanas. Originalmen- te, o ILT7 humano foi isolado como um gene cuja expressão é observada em células dendríticas Plasmocitóides (Blood. 2002 100; 3295-3303, Gene. 28 de abril de 2004; 331:159-64). Ademais, sabe-se também que ele pode ser utilizado como marcador de células dendríticas Plasmocitóides (W003/12061). Supõe-se que células dendríticas Plasmocitóides e IPCs se- jam populações de células em grande parte idênticas ou que grandes partes destas sejam comuns. Por conseguinte, não há contradição entre esses rela- tos e os achados dos presentes inventores.

Considerando esse perfil de expressão do ILT7 humano, inicial- mente, a atividade de ligação de IPCs ou de células dendríticas Plasmocitói- des, em relação a, pelo menos, um certo subconjunto, é uma das caracterís- ticas importantes do anticorpo que se liga a ILT humano na presente inven- ção. Marcadores de superfície celular, específicos das respectivas popula- ções celulares, podem ser utilizados para determinar se uma certa célula é IPC ou célula dendrítica Plasmocitóide. Por exemplo, a ligação às células desejadas pode ser confirmada por coloração dupla com o anticorpo que se liga a marcadores da superfície celular e o anticorpo cuja atividade de liga- ção deve ser verificada. Ou seja, IPCs na presente invenção compreendem, por exemplo, células que expressam BDCA2.

- Confirmação fundamentada em responsividade a células transformadas que expressam o gene de ILT7 humano:

Os presentes inventores constataram que uma característica imunológica do ILT7 expresso em IPCs humanas era reconstruída quando a expressão do gene do ILT7 era conduzida sob uma condição específica. Por conseguinte, a responsividade a ILT7 humano pode ser confirmada também com base na responsividade de anticorpos a células nas quais um gene co- dificador de ILT7 é artificialmente introduzido. A saber, a presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal compreendendo a seqüência de ami- noácidos, que constitui um domínio extracelular, como o domínio extracelu- lar, e que se liga a uma célula co-expressada com a molécula transdutora de sinal, ou refere-se a um fragmento compreendendo a região de ligação de seu antígeno. Nesse caso, o domínio extracelular é composto por uma se- qüência de aminoácidos que corresponde da 17§ à 44- posição da seqüên- cia N-terminal de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 2 (de 1 a 428, na SEQ ID NO: 2).

Por exemplo, a característica imunológica do ILT7 expresso em IPCs humanas é mantida em células co-transfectadas com um vetor de ex- pressão, compreendendo um DNA codificador de ILT7 humano e um vetor de expressão compreendendo um DNA codificador da molécula transdutora de sinal. Por conseguinte, uma molécula transformada que co-expresse ILT7 humano e a molécula transdutora de sinal é preferível para confirmar a afini- dade de ligação de anticorpos ao domínio extracelular do ILT7 na presente invenção. Na presente invenção, é desejável utilizar uma célula não trans- formada como controle quando a responsividade de anticorpos é confirmada pelo uso da célula transformada. Além disso, é importante também confirmar que a ligação de anticorpos não é detectada quando se utiliza a mesma cé- lula hospedeira que expressa somente a molécula transdutora de sinal como controle.

Na presente invenção, pode ser utilizada uma molécula que in- duza a expressão de ILT7 humano na superfície celular como a molécula transdutora de sinal para a co-expressão. A molécula transdutora de sinal na presente invenção pode ser definida também como uma molécula capaz de transmitir a característica imunológica do ILT7 humano a, pelo menos, o do- mínio extracelular da molécula do ILT7, em uma célula que expresse ILT7.

Conforme utilizado neste pedido, o termo "característica imunológica" de ILT7 humano natural significa reconhecimento por um anticorpo que se liga a IPCs humanas.

Especificamente, é preferível utilizar cadeia γ de receptor Fc ou DAP12 como molécula transdutora de sinal. Na presente invenção, a cadeia γ do receptor Fc é especialmente preferida como a molécula transdutora de sinal. A cadeia γ do receptor Fc é uma molécula que consiste em seqüências de aminoácidos exibidas na SEQ ID NO: 16. A molécula transdutora de sinal pode ser um fragmento, desde que ILT7 humano a ser co-expressado esteja localizado na superfície celular. Desde que ILT7 humano a ser co- expressado esteja localizado na superfície celular, a mutação ou adição da seqüência de é permitida nas seqüências de aminoácidos exibidas na SEQ ID NO: 16. Ou seja, a presente invenção provê métodos para produção de células que produzem um anticorpo monoclonal que se liga ao domínio ex- tracelular do ILT7 humano, compreendendo as seguintes etapas:

(1) administração de uma célula que expresse em meio exógeno uma proteína compreendendo domínio extracelular do ILT7 humano e uma molécula compreendendo seqüências de aminoácidos descritas na SEQ ID NO: 16 a animais imunes; e

(2) seleção de um anticorpo produtor de célula que produza o anticorpo que se liga a ILT7 humano entre células produtoras de anticorpo dos animais imunes.

Subseqüentemente, como o anticorpo liga-se a ILT7 humano na presente invenção, é preferível utilizar um anticorpo no qual o cruzamento com populações de células, as quais são conhecidas por expressar outras famílias ILT diferente de ILT7, não é observado. Especificamente, como o anticorpo liga-se a ILT7 humano na presente invenção, é preferível utilizar um anticorpo rio qual a ligação às populações celulares, as quais sabe-se expressam outras famílias ILT diferentes de ILT7, não pode ser observada sob a mesma condição na qual a ligação a IPCs foi confirmada. Conforme já descrito, por exemplo, ILT2 e ILT3 são expressos não só em PDC, mas tam- bém em DC obtidas de MDDC ou de células CD34 positiva (Gene. 28 de abril de 2004; 331: 159-64). Por outro lado, a expressão de ILT7 não pode 10 ser detectada em decorrência da diferenciação de IPCs em células dendríti- cas. Por conseguinte, o anticorpo não pode detectar a ligação a DCs, obti- das de MDDC ou de células CD34 positiva, sob a condição em que a possí- vel confirmação da ligação a IPCs esteja compreendida no anticorpo que se liga a ILT 7 humano na presente invenção.

Foram relatados os padrões de expressão a seguir, quanto a moléculas de outras famílias ILT ("The KIR Gene Clustef Carrington, Mary and Norman, Paul. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US), NCBI; 2003, Gene. 28 de abril de 2004; 331: 159-64). Por conseguinte, um anticor- po que se ligue a IPCs ou PDC humanos e cuja ligação às células seguintes não pode ser confirmada é incluído em anticorpos com especificidade para ILT7:

ILT1; células de linhagem mielóide (monócitos, DCs derivados de monócitos, macrófagos);

ILT2; PDCs, células B, células CD34 positivas, DCs derivadas de células CD34 positivas e DCs derivadas de monócitos;

ILT3; PDCs e DCs;

ILT5; monócitos, DCs derivadas de células CD34 positivas e DCs derivadas de monócitos; e

ILT8; células de linhagem de monócito.

Ou seja, o anticorpo monoclonal que se liga ao domínio extrace- lular de ILT7 humano na presente invenção compreende, de preferência, um anticorpo monoclonal que possua as seguintes características imunológicas: a) o anticorpo monoclonal liga-se a IPCs humanas; e

b) a ligação do anticorpo monoclonal a uma ou mais das células selecionadas do grupo constituído por monócitos, macrófagos, células B1 células CD34 positivas e células dendríticas derivadas destas células não pode ser confirmada, sob condições para que ocorra ligação a IPCs huma- nas.

Como o anticorpo monoclonal da presente invenção, é preferível utilizar um anticorpo em que a ligação a monócitos, macrófagos, células B, células CD34 positivas e células dendríticas derivadas destas células não possa ser confirmada, sob condições para que ocorra ligação, especialmen- te a IPCs humanas.

Alternativamente, o anticorpo monoclonal que se liga ao domínio extracelular do ILT7 humano na presente invenção, compreende, de prefe- rência um anticorpo monoclonal que possua as seguintes características imunológicas:

c) o anticorpo monoclonal liga-se à célula transformada que é co-transfectada com um vetor de expressão contendo expressamente o DNA que codifica ILT7 humano e um vetor de expressão contendo expressamen- te o DNA que codifica a molécula transdutora de sinal;

d) a ligação à célula hospedeira, anteriormente a transformação, não pode ser confirmada sob condições para a ligação às células co- transfectadas, conforme descrito em c); ou

o anticorpo monoclonal da presente invenção compreende um anticorpo monoclonal com as seguintes características imunológicas:

e) a ligação à célula hospedeira que expressa somente a molé- cula transdutora de sinal não pode ser confirmada, sob condições para a ligação às células co-transfectadas, conforme descrito em c).

Na presente invenção, o fato de o anticorpo monoclonal anti- ILT7 não se cruzar com a família ILT de outras moléculas pode ser confir- mado utilizando células nas quais foi forçada a expressão de cada família ILT. Ou seja, para expressão forçada, o cDNA que codifica seqüências de aminoácidos de cada família ILT é introduzido em uma célula hospedeira apropriada. O anticorpo monoclonal anti-ILT7', cujo cruzamento deve ser confirmado, é posto em contato com a célula transformada obtida. Em se- guida, pode ser confirmado que, se a ligação do anticorpo à célula, que ex- pressa moléculas de outra família que não a ILT7, não for observada, o anti- corpo é capaz de efetuar a distinção, imunologicamente, entre moléculas de ILT7 e de outras famílias ILT. Por exemplo, em exemplos descritos abaixo, o fato de que não há cruzamento do anticorpo monoclonal anti-ILT7, obtido pela presente invenção, com ILT1, ILT2 e ILT3 é confirmado. Por conseguin- te, um exemplo preferível do anticorpo monoclonal na presente invenção é o anticorpo monoclonal que se liga a ILT7, em que a ligação com a ILT1, ILT2 e ILT3 não pode ser detectada sob a mesma condição.

Particularmente, ILT2 e ILT3 são genes cuja expressão em IPCs foi confirmada (Ju et aí. Gene 331, 159-164, 2004). No entanto, estas molé- culas podem exibir perfis únicos de expressão para cada tipo de célula, de- pendendo dos respectivos níveis de diferenciação nas IPCs ou condições como a estimulação com vírus ou outras citoquinas. O uso de um anticorpo, capaz de distinguir imunologicamente estas moléculas da família ILT daque- las de ILT7, permite detecção específicas de alterações na expressão do ILT7.

A ligação de um anticorpo monoclonal, cuja atividade de ligação deve ser confirmada em relação a vários tipos de células, pode ser confir- mada com base em, por exemplo, o princípio da citometria de fluxo. A fim de confirmar a responsividade de anticorpos, com base no princípio da citome- tria de fluxo, é vantajosa para marcar antecipadamente anticorpos com mo- lécula ou grupo atômico que produza um sinal detectável. Em geral, são uti- lizadas as marcações fluorescentes ou luminescentes. Um classificador de células fluorescentes ativadas (FACS) pode ser utilizado para analisar a li- gação dos anticorpos fluorescentes marcados a células, com base no princí- pio da citometria de fluxo. O uso de FACS permite a confirmação com efici- ência da ligação de uma pluralidade de anticorpos a uma pluralidade de células.

Especificamente, por exemplo, o anticorpo A, previamente cons- tatado como capaz de identificar IPCs1 e o anticorpo B, cujas características de ligação a IPCS devem ser analisadas, reagem com populações celulares, compreendendo IPCs, ao mesmo tempo. O anticorpo Aeo anticorpo B são marcados com sinal fluorescente que é mutuamente distinguido por estes anticorpos com antecedência. No caso em que for constatada a detecção de ambos sinais provenientes das mesmas populações de células, a ligação destes anticorpos às mesmas populações de células pode ser confirmada. Em outras palavras, é constatado que ambos anticorpos, A e B1 possuem as mesmas características de ligação. No caso em que eles ligam-se a popula- ções de células diferentes, fica claro que ambos anticorpos possuem carac- terísticas de ligação distintas.

Um exemplo preferível do anticorpo monoclonal na presente in- venção pode compreender um anticorpo monoclonal produzido pelo hibri- doma ILT7 n9 11 ou ILT7 nQ 17. O hibridoma ILT7 n9 11 e o hibridoma ILT7 n9 17 foram depositados junto ao National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Organismo Internacional Depositário de Patentes, sob os Nos de Acesso: FERM BP-10704 e FERM BP-10705, em 21 de outu- bro de 2005.

O conteúdo do depósito especificado é conforme segue: (a) Nome e endereço da instituição depositária

Nome: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Organismo Internacional Depositário de Patentes

Endereço: AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki, Ja- pão (código postal 305-8566)

(b) Data do depósito: 21 de outubro de 2005

(c) Número de Acesso: FERM BP-10704 (hibridoma ILT7 n9 11) (c) Número de Acesso: FERM BP-10705 (hibridoma ILT7 n9 17)

O anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser um fragmento compreendendo a sua região de ligação a aritígeno. Por exemplo, um fragmento de anticorpo compreendendo a região de ligação a antígeno, obtido por digestão enzimática de IgG, pode ser utilizado como o anticorpo na presente invenção. Especificamente, fragmentos de anticorpos como Fab e F(ab')2 podem ser obtidos por digestão com papaína ou pepsina. É fato bem conhecido que estes fragmentos de anticorpos podem ser utilizados como moléculas de anticorpos que possuem afinidade por anticorpos. Alter- nativamente, anticorpos construídos por recombinação genética podem ser utilizados também desde que uma atividade ligação satisfatória a antígeno seja mantida. Exemplos dos anticorpos construídos por recombinação gené- tica compreendem anticorpos quiméricos, anticorpos transplantados com CDR, Fvs de cadeia simples, diabodies, anticorpos lineares e anticorpos po- liespecíficos, formados por fragmentos de anticorpos. É de conhecimento comum que estes anticorpos podem resultar de anticorpos monoclonais ou anticorpos que produzem células que produzem os anticorpos.

O anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser obtido, utilizando-se uma célula transformada específica como um imunogene. Ou seja, a presente invenção refere-se a um método para produção de células que produzem um anticorpo monoclonal que se liga ao domínio extracelular do ILT7 humano, compreendendo as seguintes etapas:

(1) administração de uma célula que expressa uma proteína e- xógena, compreendendo o domínio extracelular do ILT7 humano e uma mo- lécula exógena associada a ILT7 humano a animais imunes; e

(2) seleção de um anticorpo que produza a célula que produz o 1 anticorpo que se liga ao ILT7 humano, proveniente de anticorpo que produza células dos animais imunes.

O anticorpo produtor de células assim obtido ou as células pro- duzidas pelo anticorpo imortalizado são cultivados e os anticorpos monoclo- nais desejados podem ser recuperados das culturas. Com referência ao mé- todo de células produzidas por anticorpo imortalizado, vários métodos são conhecidos.

No método de produção do anticorpo monoclonal da presente invenção, exemplos utilizáveis da molécula, associada ao ILT7 humano para produção de célula transformada a ser utilizada como imunogene, compre- ende proteínas da membrana celular. Entre elas, é preferível utilizar uma molécula transdutora de sinal, localizada em membranas celulares, como a proteína da membrana celular. 0 termo "molécula transdutora de sinal" signi- fica uma molécula associada a proteínas e células com estruturas de recep- tor no domínio extracelular que transmite a estimulação de Iigantes a recep- tores em células. Exemplos da molécula transdutora de sinal compreendem cadeia γ do receptor Fc1 DAP12 ou assemelhados. Por exemplo, é preferível utilizar cadeia γ do receptor Fc como a proteína da membrana celular na presente invenção. Seqüências de aminoácidos de DAP12 e cadeia γ do re- ceptor Fc humanos, bem como seqüência de bases de cDNA que codifica as seqüências, são conhecidas publicamente. Uma seqüência de bases da ca- deia γ do receptor Fc humano e uma seqüência de aminoácidos que é codi- ficada pela seqüência de bases são apresentadas nas SEQ ID N0s: 15 e 16, respectivamente,

Na presente invenção, uma célula transformada a ser utilizada como imunogene pode ser obtida pelo preparo, por exemplo, de uma célula que carrega expressivamente (a) e (b) seguintes:

(a) um polinucleotídeo exógeno que codifica uma seqüência de aminoácidos compreendendo um domínio extracelular do ILT7 humano; e

(b) um polinucleotídeo exógeno que codifica a cadeia γ do recep- tor Fc.

Na presente invenção, polinucleotídeo exógeno significa um po- linucleotídeo que é introduzido artificialmente em uma célula hospedeira. Quando células humanas são utilizadas como as células, genes humanos são introduzidos em células humanas. Em combinação desse tipo, um poli- nucleotídeo introduzido artificialmente significa o polinucleotídeo exógeno. Por conseguinte, a expressão ectópica do ILT7 humano ou da cadeia γ do receptor Fc humano está compreendida na expressão do polinucleotídeo exógeno.

Conforme utilizado neste pedido, o termo "domínio extracelular do ILT7 humano" significa a seqüência de aminoácidos, da 17ê a 444- posi- ção da seqüência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 2, que corres- ponde ao domínio extracelular da seqüência de aminoácidos (de 1 a 428 na SEQ ID NO: 2). Como seqüência de aminoácidos compreendendo o domínio extracelular do ILT7 humano na presente invenção, é preferível utilizar a se- qüência de aminoácidos que compreende cada região, por exemplo, inician- do-se do N terminal, na seguinte ordem:

[Seqüência do sinal + domínio extracelular + domínio transmembrana + regi- ão intracelular]

Alternativamente, uma seqüência de aminoácidos, desprovida parcialmente de uma região intracelular conforme descrita abaixo, é incluída na seqüência de aminoácidos compreendendo o domínio extracelular do ILT7 humano na presente invenção.

[Seqüência do sinal + domínio extracelular + domínio transmembrana + uma parte da região intracelular]

Ademais, uma estrutura desprovida de região intracelular con- forme mencionada abaixo, é incluída na seqüência de aminoácidos compre- endendo o domínio extracelular do ILT7 humano na presente invenção. [Seqüência do sinal + domínio extracelular + domínio transmembrana]

Na estrutura, outras regiões diferentes do domínio extracelular podem ser seqüências de aminoácidos, selecionadas da seqüência de ami- noácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, ou podem ser combinadas a outras seqüências de aminoácidos com homologia às regiões. Por exemplo, a se- qüência de aminoácidos constituindo por seqüência do sinal, domínio trans- membrana e região intracelular pode ser uma outra seqüência de aminoáci- dos de moléculas da família ILT diferente daquela do ILT7. Ou, pode estar combinada à seqüência de aminoácidos da família ILT em outras espécies diferentes da humana. Ademais, a seqüência de aminoácidos que constitui outras regiões diferentes do domínio extracelular, pode compreender uma mutação incluída entre aquelas capazes de manter a função de cada região. Alternativamente, outras regiões podem intervir entre cada região. Por e- xemplo, uma etiqueta (tag) de epítopo, como FLAG, pode ser inserida tam- bém entre a seqüência do sinal e o domínio extracelular. Especialmente, a seqüência do sinal é removida por processamento durante a sua transferên- cia para superfície da membrana celular, após ter sido traduzida em proteí- na. Por conseguinte, seqüência arbitrária de aminoácidos que induza passa- gem da proteína traduzida para a membrana celular, pode ser utilizada como a seqüência do sinal. Mais especialmente, é preferível utilizar a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) do ILT7 humano como a seqüência de ami- noácidos compreendendo o domínio extracelular do ILT7 humano.

Portanto, na presente invenção, uma seqüência arbitrária de ba- ses que codifica a seqüência de aminoácidos constituindo a estrutura su- pramencionada [seqüência do sinal + domínio extracelular + domínio trans- membrana + região intracelular] pode ser utilizada como o polinucleotídeo que constitui o polinucleotídeo exógeno descrito em (a). Por exemplo, a se- qüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 é codificada pela seqüência de bases descrita em SEQ ID NO: 1.

Na presente invenção, um vetor de expressão que carregue ex- pressamente os polinucleotídeos (a) e (b) supramencionados pode ser intro- duzido em uma célula hospedeira apropriada a fim de ser obtida uma célula transformada a ser utilizada como imunogene. Os polinucleotídeos (a) e (b) podem ser carregados em um vetor ou em vetores diferentes. Quando cada polinucleotídeo é carregado em vetores diferentes, a células hospedeiras são co-transfectadas com dois tipos de vetores.

Exemplos preferíveis da célula hospedeira na presente invenção compreendem células de mamíferos. Exemplos específicos da célula hospe- deira compreendem células derivadas de seres humanos, macacos, camun- dongos ou ratos. As células derivadas de seres humanos são especialmente preferíveis como células hospedeiras. Por exemplo, é preferível utilizar célu- las 293T derivadas de seres humanos como a célula hospedeira na presente invenção. Células 293T podem ser obtidas como a ATCC CRL-11268. Além disso, células derivadas de animais imunes podem ser utilizadas também como células hospedeiras. Quando células derivadas de animais imunes são utilizadas como imunogenes, é conferida pouca resposta imunológica às cé- lulas hospedeiras. Por esse motivo, um anticorpo contra o domínio extracelu- lar de ILT7 expresso em meio exógeno pode ser obtido eficientemente. Por conseguinte, por exemplo, quando camundongos são utilizados como ani- mais imunes, células derivadas de camundongos podem ser utilizadas tam- bém como células hospedeiras.

Os polinucleotídeos supramencionados podem ser transforma- dos em células, fazendo com que estes sejam carregados em um vetor ca- paz de induzir èxpressão em células hospedeiras. Podem ser utilizados veto- res à disposição no mercado que possam induzir a expressão em células de mamíferos. Na presente invenção podem ser utilizados vetores de expres- são como o Vetor pCMV-Script(R), Vetor PSG5 (produzido pela Stratagene) e o pcDNA3.1 (produzido pela Invitrogen).

As células transformadas assim obtidas são administradas a a- nimais imunes juntamente com componentes adicionais como adjuvantes, se necessário. Exemplos úteis do adjuvante incluem o adjuvante completo de Freund e similares. No caso de serem utilizados camundongos como ani- mais imunes, as células transformadas podem ser administradas em um in- tervalo que varia de 104 a IO9 células, mais especificamente de 104 a 106 células. Em geral, doses múltiplas do imunogene são fornecidas em interva- los regulares até que o título do anticorpo esteja elevado. Por exemplo, no caso de imunização de curto prazo, as células transformadas são adminis- tradas em intervalos de 2 a 4 dias, mais especificamente, em intervalos de 3 dias. Após duas ou três administrações, é possível recuperar células que produzem anticorpos. Alternativamente, é efetuada a administração uma vez por semana e as células que produzem anticorpos podem ser recuperadas também após cinco ou seis administrações.

Na presente invenção, as células produtoras de anticorpos recu- peradas são clonadas para darem origem a anticorpos monoclonais. É prefe- rível que as células produtoras de anticorpos sejam imortalizadas para clo- nagem. Por exemplo, o método de fusão celular, conforme tipificado pelo método de hibridoma, ou transformação pelo vírus Epstein-Barr (EBV) po- dem ser utilizados como o método de imortalização de células produtoras de anticorpos.

Em relação às células produtoras de anticorpos, uma célula pro- duz um tipo de anticorpo. Por conseguinte, o estabelecimento de populações celulares derivadas de uma única célula (ou seja, clonagem) possibilita a produção de anticorpos monoclonais. O método de hibridoma envolve o pro- cesso no qual células produtoras de anticorpos são fundidas a uma linhagem celular apropriada, a qual é imortalizada e submetida, em seguida, à clona- gem. As células produtoras de anticorpos imortalizadas podem ser clonadas por técnica como o método de diluição limitada. É sabido que existem muitas linhagens celulares úteis para o método de hibridoma. Estas linhagens celu- lares são excelentes, em termos de eficiência, na imortalização de células linfocíticas e possuem vários marcadores genéticos, necessários para sele- cionar células qué possam ser fundidas com êxito. Ademais, quando a pro- dução de células produtoras de anticorpos é pretendida, é possível utilizar também linhagem celular desprovida da capacidade de produzir anticorpos.

Por exemplo, células P3x63Ag8.653 (ATCC CRL-1580) e P3x63Ag8U.1 (ATCCCRL-1597), de mielomás de camundongos, são am- plamente utilizadas como linhagens celulares úteis para o método de fusão celular de camundongos ou ratos. Em geral, é produzido um hibridoma pela fusão de células homogêneas, enquanto que é possível obter-se também anticorpo monoclonal proveniente de hetero-hibridoma de espécies diferen- tes entre espécies estreitamente relacionadas.

Protocolos específicos da fusão celular foram publicamente ex- postos. Ou seja, células produtoras de anticorpos de animais imunes são misturadas a parceiros apropriados de fusão para que possa ser conduzida a fusão celular. Exemplos úteis da célula produtora de anticorpos incluem células esplênicas, células de linfócitos recolhidas do Iinfonodo e células B de sangue periférico. Como parceiras da fusão, várias linhagens celulares, previamente descritas, podem ser utilizadas. O método de polietilenoglicol e o de fusão elétrica podem ser utilizados para a fusão celular.

Em seguida, com base em marcadores seletivos de células fun- didas, as células fundidas com êxito são selecionadas. Por exemplo, quando a linhagem celular sensível a HAT é utilizada para fusão celular, as células fundidas com êxito são selecionadas por seleção de células que crescem meio com HAT. Além disso, é efetuada a confirmação de que os anticorpos produzidos pelas células selecionadas possuem a responsividade desejada. Cada hibridoma é selecionado com base na responsividade de anticorpos. Ou seja, o hibridoma que produz anticorpos que se ligam ao ILT7 humano é selecionado pelo método descrito previamente. De preferência, quando o hibridoma selecionado é subclonado e, em seguida, a produção do anticorpo desejado é finalmente confirmada, o anticorpo confirmado é sele- cionado como um hibridoma que produz anticorpo monoclonal da presente invenção.

Especificamente, o hibridoma selecionado pode ser selecionado com base na responsividade a células humanas ou a responsividade à célu- Ia transformada que expressa gene de ILT7 humano. Os anticorpos que se ligam a células podem ser detectados com base no princípio empregado em imunoensaio. Por exemplo, a técnica ELISA, que usa células como antíge- nos, pode ser utilizada para detecção do anticorpo desejado. Especificamen- te, sobrenadante de cultura de hibridoma é posto em contato com um supor- te sobre o qual encontra-se IPC humana ou a célula transformada utilizada como imunogene. Quando o sobrenadante da cultura contiver o anticorpo desejado, o anticorpo é capturado na célula imobilizada sobre o suporte. Em seguida, a fase sólida é separada do sobrenadante da cultura, o qual é lava- do se necessário. Posteriormente, é possível detectar o anticorpo capturado na fase sólida. Um anticorpo que reconheça anticorpo pode ser utilizado pa- ra a detecção de anticorpos. Por exemplo, um anticorpo de camundongo pode ser detectado por um anticorpo antiimunoglobulina de camundongo. A detecção é fácil se o anticorpo, que reconhece um anticorpo, estiver marca- do. Exemplos úteis da marcação incluem enzimas, corantes Iuminescentes similares.

Por outro lado, partículas e uma parede interna de uma placa de microtitulação podem ser utilizadas como o suporte sobre o qual as células são imobilizadas. As células podem ser imobilizadas sobre partículas feitas em plástico ou a superfície de um recipiente por adsorção física. Exemplos úteis do suporte para imobilização de células incluem contas feitas em poli- estireno e recipientes de reação.

Na seleção de hibridomas, é possível prever a produção do anti- corpo contra não só ILT7, mas também a célula hospedeira da célula trans- formada utilizada como imunogene. Por exemplo, conforme ilustrado nos Exemplos, quando uma célula humana for utilizada como imunogene e ca- mundongo, como animal imune, a célula humana é reconhecida como subs- tância estranha. Dessa forma, é predita a produção de um anticorpo que se liga à substância estranha. Na presente invenção, pretende-se obter um an- ticorpo capaz de reconhecer ILT7 humano. Por conseguinte, não é necessá- rio obter um anticorpo que reconheça outros antígenos de células humanas a não ser ILT7 humano. A fim de remover hibridomas que produzam anticor- po desse tipo nâ seleção, anticorpos não desejados podem ser absorvidos antes de ser confirmada a responsividade do anticorpo.

Anticorpos não desejados podem ser absorvidos por um antíge- no ao qual um anticorpo supostamente existente liga-se. Especificamente, por exemplo, um anticorpo contra outros antígenos, presentes em célula humana, diferentes de ILT7 humano, podem ser absorvidos por uma célula que não consegue detectar a expressão do ILT7 humano. Na presente in- venção, é preferível empregar a célula hospedeira utilizada para o imunoge- ne, como antígeno para absorção dos anticorpos não desejados. Alternati- vamente, a célula hospedeira que não expressa o domínio extracelular do ILT7 humano, porém que expressa a molécula associada ao ILT7, pode ser utilizada como o antígeno para absorção dos anticorpos.

Quanto ao anticorpo monoclonal cuja atividade de ligação ao antígeno é confirmada, o seu efeito real sobre a atividade da IPC é confir- mado, se necessário. O efeito sobre IPC pode ser confirmado por método conforme aqueles descritos abaixo.

Quanto ao anticorpo monoclonal da presente invenção, um hi- bridoma produtor do anticorpo monoclonal é cultivado e o anticorpo mono- clonal da presente invenção é recuperado da cultura resultante. O hibridoma pode ser cultivado in vitro ou in vivo. Se in vitro, o hibridoma pode ser culti- vado em meio de cultura conhecido como o RPMI1640. A imunoglobulina secretada pelo hibridoma acumula-se no sobrenadante da cultura. Por con- seguinte, o anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser obtido pela coleta do sobrenadante da cultura e sua purificação, se necessário. É mais fácil purificar a imunoglobulina quando soro não é acrescentado ao meio de cultura. No entanto, para que ocorra proliferação mais rápida do hibridoma e facilitar a prodüção de anticorpo, soro bovino fetal a 10% pode ser também acrescentado ao meio de cultura.

O hibridoma pode ser cultivado também in vivo. Especificamen- te, a cultura intraperitoneal do hibridoma pode ser realizada pela inoculação do hibridoma na cavidade abdominal de camundongos sem pêlos. Anticor- pos monoclonais acumulam-se no líquido ascítico. Por conseguinte, se o líquido ascítico é obtido e purificado, conforme necessário, é possível produ- zir o anticorpo monoclonal requerido. Os anticorpos monoclonais obtidos podem ser apropriadamente modificados ou processados de acordo com o uso pretendido.

O anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser expres- so, obtendo-se cDNA que codifica a região de ligação ao antígeno do anti- corpo, proveniente do hibridoma, e inserção em vetor de expressão apropri- ado. A técnica pela qual é obtido cDNA que codifica uma região variável de anticorpo e, em seguida, expressado em célula hospedeira apropriada é co- nhecida. Ademais, o método pela qual é produzido um anticorpo quimérico por ligação de uma região variável, compreendendo a região de ligação a antígeno em uma região constante, é também conhecido.

Exemplos preferíveis do anticorpo monoclonal na presente in- venção compreendem anticorpos monoclonais produzidos pelo hibridoma nQ 11 (Número de acesso: FERM BP-10704), hibridoma nQ 17 (Número de a- cesso: FERM BP-10705) ou pelo hibridoma nQ 37. Seqüências de aminoáci- dos que constituem regiões variáveis destes anticorpos monoclonais, bem como seqüências de bases de cDNA que codifica os mesmos, são descritas abaixo. Por conseguinte, anticorpos quiméricos a serem obtidos pela conju- gação destas regiões variáveis a regiões constantes de outras imunoglobuli- nas são preferíveis na presente invenção. Em seqüências de aminoácidos descritas na Listagem de seqüências, a seqüência de aminoácidos de 1 ao C terminal constitui uma proteína madura. Ou seja, a seqüência de aminoá- cidos consecutivos de 1 ao C terminal, de cada seqüência de aminoácidos, é uma seqüência madura de cada seqüência de aminoácidos. Por outro lado, a° seqüência de aminoácidos representada por valor numérico de N terminal até-1 é uma seqüência do sinal.

Região variável de cadeia pesada Região variável de cadeia leve n°11 SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 40

(seqüência de bases) (seqüência de bases)

SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 41

(seqüência de aminoácidos) (seqüência de aminoácidos)

n°17 SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 44

(seqüência de bases) (seqüência de bases)

SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 45

(seqüência de aminoácidos) (seqüência de aminoácidos)

n°37 SEQ ID NO: 46 SEQ ID NO: 48

(seqüência de bases) (seqüência de bases)

SEQ ID NO: 47 SEQ ID NO: 49

(seqüência de aminoácidos) (seqüência de aminoácidos)

Por exemplo, é possível produzir um anticorpo quimérico consti- tuído por (região variável) de camundongo-(região constante) de ser humano pela ligação dos genes destas regiões variáveis em uma região constante da cadeia pesada de uma IgGI humana e um gene que codifica a região cons- tante da cadeia leve da Igkapa humana, respectivamente. Seqüências de aminoácidos de anticorpos quiméricos desse tipo e seqüências de bases que as codificam são descritas abaixo, respectivamente. Anticorpos quiméri- cos especificados por estas seqüências exibem a construção de uma con- cretização preferida de anticorpo monoclonal anti-ILT7 na presente inven- ção. Nas seqüências de aminoácidos seguintes de anticorpos quiméricos, a seqüência de aminoácidos de N terminal a -1 corresponde à seqüência do sinal, e a seqüência de aminoácidos de 1 a C terminal corresponde à proteí- na madura. Ou seja, na presente invenção, é preferível um anticorpo quimé- rico composto por cadeia pesada e leve, constituídas pela seqüência de a- minoácidos de 1 a C terminal de cada seqüência de aminoácidos. Cadeia pesada Cadeia leve

n°11 SEQ ID NO: 50 SEQ ID NO: 52 (seqüência de bases) (seqüência de bases)

SEQ ID NO: 51 SEQ ID NO: 53 (seqüência de aminoácidos) (seqüência de aminoácidos)

n°17 SEQ ID NO: 54 SEQ ID NO: 56 (seqüência de bases) (seqüência de bases)

SEQ ID NO: 55 SEQ ID NO: 57 (seqüência de aminoácidos) (seqüência de aminoácidos)

Além disso, a atividade de ligação a antígeno do anticorpo mo- noclonal pode ser enxertada também em outras imunoglobulinas. A região variável da imunoglobulina é composta por uma região determinante de complementaridade (CDR) e uma região estrutural. A propriedade de ligação a antígeno de cada imunoglobulina é determinada pela CDR e a estrutural mantém a estrutura da região de ligação ao antígeno. A seqüência de ami- noácidos da CDR é extremamente diversificada, enquanto que a seqüência de aminoácidos da porção estrutural é altamente conservada. Sabe-se que a seqüência de aminoácidos, que constitui a CDR, está incorporada na região estrutural de outras moléculas de imunoglobulina, possibilitando que a ativi- dade de ligação a antígeno seja enxertada. O método em que a propriedade de ligação a antígeno de imunoglobulinas diferentes é enxertada na imuno- globulina, empregando esse foi processo, foi estabelecido. Conforme utiliza- do neste pedido, o termo "região de ligação a antígeno" pode compreender a CDR que é enxertada na estrutura. Por conseguinte, o termo "fragmento compreendendo a região de ligação a antígeno" de um determinado anticor- po monoclonal compreende um fragmento de imunoglobulina humana, inclu- indo a região variável à qual a CDR do anticorpo monoclonal é enxertada. Por exemplo, cada uma das seqüências de aminoácidos das regiões variá- veis mencionadas acima compreende as seguintes seqüências de aminoáci- dos (SEQ ID NOs) como CDRs. <table>table see original document page 33</column></row><table>

Com base na informação da seqüência de bases que codifica as seqüências de aminoácidos acima mencionadas e a informação da seqüên- cia de bases que codifica a estrutura (FR) da imunoglobulina humana, pode- se criar um iniciador e o cDNA com uma seqüência de bases obtida pela conjugação de ambas as seqüências de bases, pode ser amplificado. A ope- ração é repetida para cada estrutura e uma região variável, em que CDR1, CDR2 e CDR3 de camundongos são unidas por FR humana, pode ser cons- truída. Ademais, quando a seqüência de bases, que codifica uma região constante da imunoglobulina humana, é conjugada conforme necessário, é possível obter um anticorpo humanizado com a região constante.

Como o anticorpo quimérico compreendendo as regiões variá- veis acima ou um anticorpo humanizado ao qual CDR constituindo uma regi- ão constante é enxertada, um tipo preferível de anticorpo, na presente in- venção, inclui aqueles contendo região constante derivada de IgG ou IgM. Os presentes inventores confirmaram que o anticorpo monoclonal contra ILT7 exibiu nível de atividade de CDC sobre células que expressam ILT7. Por conseguinte, o anticorpo contendo região constante derivada de IgG ou IgM exibe citotoxicidade contra células que expressam ILT7, em decorrência do efeito de CDC. Estes anticorpos são úteis para inibir o número de células que expressam ILT7, como as IPCs. O anticorpo quimérico capaz de reconhecer ILT7 ou anticorpo humanizado, provido pela presente invenção, pode ser produzido por enge- nharia genética empregando polinucleotídeos que codificam estes anticor- pos. Por exemplo, um polinucleotídeo representado pela seqüência de bases descritas nas SEQ ID NOs seguintes e que codifica a seqüência de aminoá- cidos que constitui uma proteína matura para cada seqüência de aminoáci- dos pode ser utilizado como polinucleotídeo codificador da região variável n911 ou nQ 17. A seqüência de aminoácidos consecutivos de 1 a C terminal, de cada seqüência de aminoácidos, corresponde a uma proteína madura.

Quando cada proteína madura é expressa como uma proteína separada, é preferível posicionar o sinal de secreção no N terminal de cada seqüência de aminoácidos. Por exemplo, nas seqüências de aminoácidos apresentadas nestas SEQ ID NOs, a seqüência de aminoácidos de N terminal a -1 pode ser utilizada como seqüência do sinal quando estas proteínas são expressas em células de animais. Alternativamente, estas regiões variáveis podem ser secretadas como proteínas maduras, empregando uma seqüência arbitrária do sinal que possibilita a secreção de imunoglobulina.

n-11 SEQ ID NO: 50 (seqüência de SEQ ID NO: 52 (seqüência de bases) bases)

n917 SEQ ID NO: 54 (seqüência de SEQ ID NO: 56 (seqüência de bases) bases)

Da mesma maneira conforme descrito acima, quanto ao polinu- cleotídeo codificador do anticorpo humanizado, é possível produzir um poli- nucleotídeo que expresse o anticorpo humanizado empregando a seqüência de bases que codifica uma proteína com a seqüência do sinal a ser acres- centada ao N terminal. Quando a cadeia pesada e a leve são carregadas em vetores separados, os dois vetores são transfectados na mesma célula hos- pedeira. As cadeias, pesada e leve, expressadas de cada vetor são utiliza- das para construir uma molécula de imunoglobulina contendo as duas ca- deias. Ou, um polinucleotídeo, codificador de cadeia pesada, e um polinu- cleotídeo, codificador de cadeia leve, podem ser carregados também no mesmo vetor. A célula hospedeira, na qual é co-transfectado um vetor carre- gando os dois polinucleotídeos, expressa a cadeia pesada e a leve e produz uma imunoglobulina com as duas cadeias.

Estes polinucleotídeos podem ser expressos como anticorpos, empregando um sistema hospedeiro-vetor capaz de expressar um gene de anticorpo. Ademais, quando são expressos sob a forma de molécula protéica simples, pela união da região variável de uma cadeia pesada com a região variável de uma cadeia leve, é possível posicionar uma seqüência do sinal no N terminal da molécula da proteína. Um exemplo conhecido deste tipo de molécula de anticorpo inclui a molécula scFv, na qual a região variável de uma cadeia pesada e a região variável de uma cadeia leve é unida por um ligante.

Cada anticorpo monoclonal assim produzido está incluído no anticorpo monoclonal da presente invenção. Em outras palavras, anticorpos monoclonais que consistem em imunoglobulina compreendendo a região de ligação a antígeno, codificada por polinucleotídeo derivado de cDNA codifi- cador da região de ligação a antígeno dos anticorpos monoclonais mencio- nados acima, estão incluídos no anticorpo monoclonal na presente invenção.

Conforme foi descrito previamente, células RBL1 nas quais foi forçada a expressão do gene de ILT1, poderiam ser utilizadas como imuno- gene para se obter anticorpos contra ILT1. No entanto, a expressão do ILT7 sobre a superfície das células RBL (P815) não pode ser confirmada e, dessa forma, estas não puderam ser utilizadas como o imunogene. Os presentes inventores constataram que a expressão do ILT7 humano sobre a superfície celular poderia ser induzida pela co-expressão do ILT7 humano e de outras proteínas da membrana celular que se associam ao IL.T7 humano. Em se- guida, os presentes inventores constataram que o anticorpo, que se liga a IPCs humanas, pode ser obtido empregando a célula transformada cuja ex- pressão é assim induzida como imunogene, e concluíram a presente inven- ção.

Ou seja, a presente invenção provê o imunogene para produção do anticorpo que se liga ao domínio extracelular do ILT7 humano, e compre- ende células de animal, nas quais (a) um polinucleotídeo que codifica a se- qüência de aminoácidos, contendo o domínio extracelular do ILT7 humano; e (b) um polinucleotídeo que codifica a cadeia γ do receptor Fcl são conserva- dos de forma a serem expressos em meio exógeno ou frações da membrana celular das mesmas.

Seis anos ou mais já transcorreram desde que a estrutura do ILT7 humano foi descoberta em 1998. No entanto, o anticorpo capaz de re- conhecer especificadamente o ILT7 ainda não foi obtido. O anticorpo capaz de reconhecer o ILT7 humano foi provido, empregando o imunogene da pre- sente invenção pela primeira vez. Ou seja, a presente invenção proveu o anticorpo capaz de reconhecer o ILT7 humano, o qual pode ser obtido, se- guindo-se as seguintes etapas:

(1) administração de uma célula que expressa em meio exógeno uma proteína, compreendendo o domínio extracelular do ILT7 humano e uma molécula que se associa ao ILT7 humano para animais imunes;

(2) seleção de um anticorpo produtor de células que produzem o anticorpo que se liga ao ILT7 humano, provenientes de células produtoras de anticorpos dos animais imunes; e

(3) cultura das células produtoras de anticorpos, selecionados na etapa (2), e recuperação de um anticorpo capaz de reconhecer o ILT7 hu- mano das culturas.

Foi descoberto que o ILT7 humano é expresso especificamente em IPC humana. Na análise de expressão gênica por SAGE, executada pe- los presentes inventores, a expressão específica do ILT7 humano em IPC humana foi confirmada também. No entanto, nos relatos anteriores, os níveis de expressão do ILT7 de ambos os casos foram analisados com base em mRNA. Como não havia sido provido o anticorpo capaz de detectar ILT7 humano, o estado da expressão protéica não foi analisada por meios con- vencionais. A análise protéica do ILT7 humano foi efetuada ao ser provido o anticorpo que se liga ao domínio extracelular do ILT7 humano na presente invenção.

Os presentes inventores confirmaram efetivamente que o anti- corpo monoclonal que se liga ao domínio extracelular do ILT7 humano, com base na the presente invenção, foi especificamente detectado em IPCs hu- manas. Ou seja, a presente invenção refere-se a um método de detecção de células que produzem células produtoras de interferon, o qual compreende as etapas de: ó contato de um anticorpo monoclonal que se liga ao domínio extracelular do ILT7 humano, ou a um fragmento compreendendo a região de ligação a antígeno, com uma célula em teste; e a detecção do anticorpo monoclonal ligado a células ou a um fragmento contendo a sua região de ligação a antígeno.

A detecção do ILT7 humano, de acordo com a presente inven- ção, possibilita a determinação se uma determinada célula é IPC. Ou seja, a presente invenção provê um método de identificação de IPCs, empregando ILT7 humano como indicador. Ou, IPCs humanas que possam ser separa- das pela separação das células nas quais ILT7 humano foi detectado, com base na presente invenção. Ou seja, a presente invenção prové um método para separação de IPCs, empregando ILT7 humano como indicador.

Com base na análise por anticorpo contra ILT7 humano, foi con- firmado que o nível de expressão do ILT7, em IPCs cuja diferenciação foi induzida por CpG e similares, foi reduzido. Ou seja, as IPCs antes de sua diferenciação ser induzida, podem ser especificadamente detectadas, em- pregando ILT7 como indicador. Em outras palavras, o anticorpo monoclonal da presente invenção é útil, especialmente na detecção de IPCs antes de sua diferenciação em células dendríticas. Conforme utilizado neste pedido, o termo "IPCs antes de sua diferenciação" pode ser definido como populações de células que mantêm a capacidade de produzir interferon.

Na presente invenção, o anticorpo monoclonal que se liga ao domínio extracelular do ILT7 humano ou o fragmento compreendendo sua região de ligação a antígeno pode ser marcado antecipadamente. Por e- xemplo, anticorpos podem ser facilmente detectados com marcação com corantes Iuminescentes ou corantes fluorescentes. Mais especificamente, o anticorpo marcado com corante fluorescente é posto em contato com uma população de células que pode compreender IPCs e, em seguida, células às quais o anticorpo da presente invenção ligou-se podem ser detectadas utili- zando o corante fluorescente como indicador. Além disso, as IPCs podem ser separadas, separando-se as células nas quais o corante fluorescente for detectado. Uma série das etapas pode ser facilmente executada de acordo com o princípio da técnica FACS.

Alternativamente, o anticorpo da presente invenção pode ligar-se a um suporte de fase sólida, como partículas magnetizadas antecipadamen- te. O anticorpo ligado ao suporte de fase sólida reconhece o ILT7 humano e, em seguida, as IPCs são capturadas no suporte de fase sólida, resultando na detecção ou separação das IPCs.

O anticorpo necessário para o método de detecção de IPCs, ba- seado na presente invenção, pode ser provido como reagente para detecção de IPCs. Ou seja, a presente invenção provê um reagente para detecção de células produtoras de interferon, compreendendo o anticorpo monoclonal que se liga ao domínio extracelular do ILT7 humano ou o fragmento compre- endendo a sua região de ligação a antígeno. O reagente para detecção de IPCs da presente invenção pode ser utilizado em combinação com um con- trole positivo ou controle negativo além de anticorpos. Por exemplo, as célu- las transformadas que expressam o domínio extracelular do ILT7 humano e são utilizada para o imunogene, bem como as IPCs obtidas de seres huma- nos, podem ser utilizadas como os controles positivos. Geralmente, somente poucas IPCs humanas podem ser obtidas do sangue periférico. Por conse- guinte, é preferível utilizar, em especial uma célula transformada como o controle positivo no reagente da presente invenção. Por outro lado, uma cé- lula arbitrária que não expressa ILT7 humano pode ser utilizada como o con- trole negativo.

Ou seja, a presente invenção provê um kit para detecção de IPCs humanas que compreende:

(a) o anticorpo monoclonal que se liga ao domínio extracelular do ILT7 humano ou o fragmento compreendendo sua região de ligação a antígeno; e

(b) a célula que expressa uma proteína exógena, compreenden- do o domínio extracelular do ILT7 humano e uma molécula exógena que é associada ao ILT7 humano.

Os presentes inventores analisaram o efeito do anticorpo que se liga ao domínio extracelular do ILT7 humano sobre IPCs. Em resultado, foi confirmado qué o anticorpo, que se liga ao domínio extracelular do ILT7 hu- mano, inibe a atividade de IPCs. Ou seja, a presente invenção refere-se a um método de inibição da atividade de células produtoras de interferon, compreendendo uma etapa em que é posto em contato qualquer um dos seguintes componentes com células produtoras de interferon:

(a) um anticorpo monoclonal que se liga ao ILT7 humano e inibe a atividade de células produtoras de interferon ou um fragmento compreen- dendo sua região de ligação a antígeno; e

(b) uma imunoglobulina à qual uma região determinante de complementaridade do anticorpo monoclonal descrito em (a) é enxertada ou um fragmento compreendendo sua região de ligação a antígeno.

Ou, a presente invenção refere-se a um método de inibição da atividade de células produtoras de interferon em organismos vivos, compre- endendo uma etapa de administração de qualquer um dos componentes se- guintes aos organismos vivos:

(a) o anticorpo monoclonal que se liga ao ILT7 humano e inibe a atividade de células produtoras de interferon ou um fragmento compreen- dendo sua região de ligação a antígeno;

(b) um fragmento compreendendo a imunoglobulina à qual uma região determinante de complementaridade do anticorpo monoclonal descri- to em (a) é enxertada ou um fragmento compreendendo sua região de Iiga- ção a antígeno; e

(c) um polinucleotídeo que codifica os componentes descritos em (a) ou (b).

Conforme utilizado neste pedido, o termo "células produtoras de interferon (IPCs)" significa células que possuem a capacidade de produzir IFN e expressar ILT7 na superfície celular. A seguir, a não se que observado de outra forma, o termo "IPCs" engloba não só células que são células pre- cursoras de células dendríticas, mas também as células que possuem a ca- pacidade de produzir IFN e expressar ILT7 sobre a superfície celular. Méto- dos de identificação destas IPCs são de conhecimento comum. IPCs podem ser distinguidas de outras células do sangue, utilizando alguns marcadores de superfície celular como indicadores. Especificamente, um perfil de mar- cadores de superfície celular de IPCs humanas é descrito abaixo (Shortman, K. e Liu, YJ. Nature Reviews 2: 151-161, 2002). Nos últimos anos, um de- terminado relatório sugeriu também que célula BDCA-2 positiva é também definida como IPC (Dzionek, A. et ai. J. Immunol. 165: 6037-6046, 2000). Perfil de antígenos de superfície celular de IPCs humanas CD4 positivo, CD123 positivo,

Linhagem (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56) negativa e CD11c nega- tiva.

Portanto, pode ser dito também que IPCs são células que pos- suem o perfil de expressão destes marcadores conhecidos e com a capaci- dade de produzir IFN. Além disso, IPCs incluem células em organismos vi- vos com a capacidade de produzir IFN, mesmo se as células pertencerem a uma população celular com perfis diferentes do padrão de expressão do per- fil de expressão destes marcadores. Ademais, exemplos das características comumente observadas em IPCs humanas, são conforme seguem:

Característica morfológica das células

- Semelhante a células plasmáticas

- Células arrendodadas com superfície celular lisa

- Núcleo relativamente grande [Característica funcional das células]

- Durante infecção viral, uma grande quantidade de interferons Tipo 1 é pro- duzida em um curto período de tempo.

- Diferenciam-se em células dendríticas após infecção viral.

Conforme utilizado neste pedido, o termo "inibição da atividade de IPCs" significa a inibição de, pelo menos, uma das funções das IPCs. E- xemplos da função de IPCs incluem a produção de IFN e a sobrevida celu- lar. A sobrevida celular pode ser traduzida também no número de células. Portanto, no caso de inibição de ambas ou de qualquer uma destas funções, diz-se que a atividade das IPCs está inibida. Foi descoberto que IFN tipo 1, produzido por IPCs1 leva a várias doenças. Por conseguinte, a inibição do número de IPCs e da produção de IFN é útil para uma abordagem de trata- mento médico destas doenças.

Por exemplo, foi ressaltada a relação entre a condição patológi- ca de doenças auto-imunes e IFN-α. A maior parte do IFN-α é produzida por IPCs. Portanto, condições patológicas causadas por IFN-α podem ser ate- nuadas por inibição da produção de IF-Να. Conforme utilizado neste pedido, o termo "inibição de produção de IFN por IPCs" significa a inibição da produ- ção de, pelo menos, um tipo do IFN produzido pelas IPCs. O IFN preferível na presente invenção é o IFN tipo 1. Entre eles, é importante o IFN-α.

Ou seja, a presente invenção refere-se a um inibidor da produ- ção de IFN que compreende um anticorpo que se liga ao domínio extracelu- lar do ILT7 como ingrediente ativo. Ou, a presente invenção provê um méto- do de inibição da produção de IFN1 compreendendo uma etapa de adminis- tração do anticorpo que se liga ao domínio extracelular do ILT7. Além disso, a presente invenção refere-se ao uso do anticorpo que se liga ao domínio extracelular do ILT7 na produção de uma composição farmacêutica para ini- bição da produção de IFN.

IPCs incluem células em que uma grande quantidade de IFN é 1 produzida por um número pequeno de células. Por exemplo, células precur- soras de células dendríticas, estimuladas por vírus e assemelhadas produ- zem a maior parte do. IFN produzida pelo organismo vivo. A inibição do nú- mero de IPCs que produzem muito IFN resulta na supressão da produção de IFN. Portanto, condições patológicas causadas por IFN-α podem ser reduzi- das por inibição do número de IPCs. Foi confirmado que anticorpo monoclo- nal anti-ILT7, ligado a células que expressam ILT7, e o efeito seguinte de citotoxicidade, foi conferido por Citotoxicidade Complemento-Dependente (CDC) em uma concretização preferida da presente invenção. O efeito de CDC é um dos importantes mecanismos do fármaco contendo o anticorpo. O anticorpo monoclonal anti-ILT7 da presente invenção possui também citoto- xicidade potente contra células que expressam ILT7, como IPCs, decorrente do efeito de CDC do mesmo. Ou seja, quanto ao anticorpo monoclonal anti- ILT7, o efeito de inibir a produção de IFN pode ser previsto pela citotoxicida- de contra IPCs, adicionalmente ao mecanismo de inibição da produção de IFN em uma concretização preferida.

O anticorpo, que reconhece o domínio extracelular do ILT7 hu- mano a ser utilizado para a presente invenção, pode ser obtido de acordo com o método descrito previamente. O anticorpo na presente invenção pode ser de qualquer classe. Espécies de organismos dos quais o anticorpo deri- va-se não são limitados também. Além disso, um fragmento de anticorpo compreendendo a região de ligação a antígeno pode ser utilizado como anti- corpo. Por exemplo, um fragmento de anticorpo compreendendo a região de ligação a antígeno, obtido por digestão enzimática de IgG, pode ser utilizado como o anticorpo na presente invenção. Especificamente, fragmentos de anticorpo como Fab e F(ab')2 podem ser obtidos por digestão com papaína ou pepsina. É bem conhecido que estes fragmentos de anticorpo podem ser utilizados como moléculas de anticorpo com afinidade de anticorpos. Alter- nativamente, anticorpos construídos por recombinação genética podem ser utilizados também, desde que seja mantida atividade satisfatória de ligação a antígeno. Exemplos dos anticorpos construídos por recombinação genética incluem anticorpos quiméricos, anticorpos com transplante de CDR1 Fvs de cadeia simples, diabodies, anticorpos lineares e anticorpos poliespecíficos formados de fragmentos de anticorpos. É de conhecimento comum que es- tes anticorpos podem ser formados empregando anticorpos monoclonais.

Na presente invenção, anticorpos podem ser modificados, se necessário. De acordo com a presente invenção, o anticorpo que reconhece o domínio extracelular do ILT7 humano possui efeito de inibição sobre a ati- vidade de IPCs. Ou seja, é contemplado que o próprio anticorpo possua cito- toxicidade contra IPCs. São conhecidas subclasses de anticorpos que exi- bem efeito potente sobre atividade. Alternativamente, ó efeito inibidor sobre a atividade de IPC pode ser intensificado ainda, modificando-se os anticor- pos com um agente citotóxico. Exemplos do agente citotóxico são descritos abaixo. Toxinas: Endotoxina de pseudomonas (PE), toxina diftérica, ricina RadioisotoposiTc99m,Sr89,131, Y90

Agentes anticâncer: caliquemicina, mitomicina, paclitaxel

Proteínas constituídas por toxinas podem ser conjugadas a anti- corpos ou a seus fragmentos com um agente bifuncional. Alternativamente, um gene codificador de toxina é unido a um gene codificador de anticorpo e as proteínas de fusão de ambos os genes podem ser obtidas também. Tam- bém é conhecido o método de conjugação de anticorpos a radioisótopos. Por exemplo, o método de marcação de anticorpos com radioisótopos, em que é empregado agente de quelação, é conhecido. Ademais, os agentes anticâncer podem ser conjugados a anticorpos usando cadeias de açúcares ou o reagente bifuncional.

Os presentes inventores confirmaram um fenômeno no qual um anticorpo monoclonal, ligado a ILT7 expresso em membrana celular, é incor- porado em células após a ligação (internalização). Por conseguinte, os agen- tes citotóxicos podem ser liberados para células pelo contato de anticorpos conjugados a estes agentes citotóxicos da presente invenção com células que expressam ILT7. Ou seja, a presente invenção provê um inibidor ativo de células que expressam ILT7, o qual compreende o anticorpo monoclonal anti-ILT7, ao qual o agente citotóxico é conjugado, como ingrediente ativo. Ou, a presente invenção refere-se ao uso de anticorpo anti-ILT7, ao qual o agente citotóxico é conjugado, na produção do inibidor ativo de células que expressam ILT7. Além disso, a presente invenção provê um método de inibi- ção da atividade de células que expressam ILT7, compreendendo a etapa de administração do anticorpo anti-ILT7 ao qual o agente citotóxico é conjugado.

Na presente invenção, um anticorpo cuja estrutura é artificial- mente modificada pode ser utilizado também como ingrediente ativo. Por exemplo, vários métodos de modificação são conhecidos para melhorar a citotoxidade e estabilidade de anticorpos. Especificamente, é conhecido um método em que cadeias de açúcar de cadeias pesadas de uma imunoglobu- Iina são modificadas (Shinkawa, T. et al. J. Biol. Chem. 278:3466-3473. 2003). A atividade de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) da imunoglobulina foi intensificada pela modificação de cadeias de açúcar. Ou, uma imunoglobulina em que a seqüência de aminoácidos da região Fc é modificada é um método conhecido também. Ou seja, a atividade de ADCC foi intensificada, aumentando-se artificialmente a atividade de ligação da i- munoglobulina ao receptor Fc (Shield, RL. et al. J. Biol. Chem. 276; 6591- 6604,2001).

IgG, ligada ao receptor Fc, é incorporada em células uma vez. Em seguida, a IgG liga-se ao receptor Fe, expresso no endossoma, e é Iibe- rada no sangue mais vez. Esse fenômeno foi descrito. IgG com alta afinida- de de ligação a receptor Fc apresenta uma chance melhor de ser liberada no sangue de novo após a sua incorporação em células. Em resultado, o tempo de permanência da IgG no sangue é ampliado (Hinton, PR. et al. J Biol Chem. 279: 6213-6216. 2004). Além disso, diz-se que a modificação da se- qüência de aminoácidos da região Fc faz que ocorra uma alteração na ativi- dade de citotoxicidade complemento-dependente (CDC). Estes anticorpos modificados podem ser utilizados como o anticorpo na presente invenção.

Quando o anticorpo que se liga ao domínio extracelular do ILT7 humano é posto em contato com IPCs, a atividade das IPCs é inibida. Por conseguinte, estes anticorpos podem ser utilizados para um inibidor ou mé- todo de inibição da atividade de IPCs. Ou seja, a presente invenção provê um inibidor ativo de IPCs, o qual compreende, pelo menos, um componente selecionado do grupo constituído por (a) a (c) seguintes como ingrediente ativo. Ou, a presente invenção refere-se a um método de inibição da ativida- de de IPCs, compreendendo uma etapa de administração de, pelo menos, um componente selecionado do grupo constituído por (a) a (c) seguintes. Além disso, a presente invenção refere-se ao uso de, pelo menos, um com- ponente selecionado do grupo constituído por (a) a (c) seguintes, na produ- ção de inibidor ativo de IPCs:

(a) o anticorpo monoclonal que se liga ao ILT7 humano ou um fragmento compreendendo sua região de ligação a antígeno;

(b) a imunoglobulina a qual uma região determinante de com- plementaridade do anticorpo descrito em (a) é enxertada ou um fragmento compreendendo sua região de ligação a antígeno; e

(c) um polinucleotídeo que codifica os componentes descritos em (a) ou (b).

Na presente invenção, o anticorpo monoclonal que pode reco- nhecer o domínio extracelular do ILT7 humano pode ser utilizado como o anticorpo monoclonal que inibe a atividade de IPCs. Na presente invenção, um ou mais anticorpos monoclonais podem ser utilizados. Por exemplo, um ou mais anticorpos monoclonais que reconhecem o domínio extracelular do ILT7 humano são misturados para uso na presente invenção.

Pode ser confirmado que anticorpos possuem efeito inibidor so- bre produção de IFN por IPCs da maneira descrita abaixo. IPCs produzem uma grande quantidade de IFN1 decorrente de estimulação viral. São forne- cidos anticorpos contra IPCs antes, após ou ao mesmo tempo da estimula- ção, de IPCs, com vírus. A capacidade de produzir IFN, individualmente para as IPCs resultantes, é comparada àquela de cada controle para o qual anti- corpos não foram fornecidos. A capacidade de produzir IFN pode ser avalia- da pela medição de IFN-α ou IFN-β, contido no sobrenadante da cultura de IPCs. Em resultado da comparação, pode ser confirmado que os anticorpos testados são eficazes na inibição da capacidade de produzir IFN quando a quantidade de IFN, no sobrenadante, é diminuída significativamente pela adição de anticorpos. Estes métodos de medição de IFN são conhecidos. IPCs produzem a maior parte do IFN presente no organismo vivo. Por con- seguinte, o nível de produção de IFN, no organismo vivo, pode ser regulado pela inibição da capacidade de produzir IFN de IPCs.

Na presente invenção, a atividade de IPCs abrange a manuten- ção do número de IPCs. Por conseguinte, a inibição da atividade de IPCs na presente invenção compreende a inibição do número de IPCs. Quando é confirmado que o número de IPCs é diminuído, sob a presença de anticor- pos, pode ser constatado que os anticorpos estão inibindo a atividade de IPCs. Conforme com a produção de IFN, uma imunoglobulina inerte, deriva- da da mesma espécie animal, como o anticorpo cuja atividade deva ser con- firmada, pode ser utilizada como controle comparativo. O número de IPCs pode ser quantitativamente comparado pela contagem de células. O número de células pode ser contato com FACS ou um microscópio.

Além disso, diz-se que IPCs são diferenciadas em células que induzem Th2, referidas como célula dendrítica 2 (DC2), em resultado de in- fecção com vírus ou similares. Se a produção de IFN de IPCs por estimula- ção viral pode ser inibida, a sua diferenciação em Th2 pode ser inibida tam- bém. Por conseguinte, pode ser previsto que o anticorpo monoclonal da pre- sente invenção, inibidor da produção de IFN, pode ter também um efeito te- rapêutico sobre várias doenças alérgicas.

Quando o anticorpo que reconhece o domínio extracelular do ILT7 humano é administrado a um hospedeiro de espécie diferente daquela do organismo do qual o anticorpo é derivado, pode ser desejado que o anti- corpo seja processado de forma a dificultar que o hospedeiro o reconheça como substância estranha. Por exemplo, a imunoglobulina não é facilmente reconhecida como substância estranha se o anticorpo for processado de forma a resultar as moléculas abaixo. A técnica de processamento de molé- culas de imunoglobulina, conforme descrita abaixo, é conhecida. Fragmento compreendendo a região de ligação a antígeno desprovida de região cons- tante (Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, terceira edição, Aca- demic Press Limited. 1995; Antibody Engineering, A Practical Approach1 IRL PRESS, 1996)

- Anticorpo quimérico composto pela região de ligação a antígeno do anti- corpo monoclonal e a região constante da imunoglobulina do hospedeiro {"Gene Expression Experiment Manuatx, Isao lshida, Tamie Ando, eds., Ko- dansha, 1994)

- Anticorpo com CDR substituída, no qual a região determinante de comple- mentaridade (CDR) da imunoglobulina do hospedeiro é substituída pela CDR do anticorpo monoclonal {"Gene Expression Experiment Manuat', Isao Ishi- da, Tamie Ando, eds., Kodansha, 1994)

Alternativamente, é possível obter um anticorpo humano, em- pregando-se animais não humanos, no qual um gene de anticorpo humano é incorporado, como animais imunes, embora os animais não humanos te- nham sido utilizados. Por exemplo, o uso de camundongos transgênicos com genes de anticorpo humanos, como animais imunes, foi posto em práti- ca para produção de anticorpos humanos (Ishida et ai, Cloning and Stem Cells, 4:85-95, 2002). O uso destes animais possibilita obter o anticorpo hu- mano que reconhece ILT7, empregando imunogenes conforme descrito an- teriormente. É preferível administrar anticorpo humano a seres humanos.

Alternativamente, um gene de região variável de imunoglobulina humana pode ser obtido também pelo método de exibição em fago (MacCaf- ferty J. et ai, Nature 348:552-554, 1990; Kretzschmar T et. al., Curr Opin Biotechnol. Dez. de 2002; 13(6): 598-602). No método de exibição em fago, um gene que codifica a região variável de uma imunoglobulina humana é incorporado em um gene de fago. É possível também produzir uma bibliote- ca em fago, utilizando-se vários genes de imunoglobulina como fonte. Um fago expressa uma região variável sob a forma de proteína de fusão da pro- teína composta pelo fago: A região variável expressa pelo fago, em sua su- perfície, mantém a atividade de ligação a antígeno. Por conseguinte, são selecionados fagos que se ligam a antígenos ou células nas quais antígenos são expressos e, pelo menos, possibilitando a triagem de um fago no qual uma região variável com a atividade de ligação desejada esteja conservada 1 nas partículas do fago assim selecionado. Ou seja, no método de exibição em fago, um gene que codifica uma região variável com a atividade de liga- ção desejada pode ser obtido, empregando-se a atividade de ligação como indicador.

No inibidor ativo de IPCs ou o método de inibição da atividade de IPCs na presente invenção, o anticorpo que reconhece o domínio extra- celular do ILT7 humano ou o fragmento de anticorpo que compreende, pelo menos, a região de ligação a antígeno do anticorpo pode ser administrado, sob a forma de proteína ou de polinucleotídeo que codifica a proteína. Na administração de polinucleotídeos, é conveniente utilizar um vetor, no qual um polinucleotídeo que codifica a proteína desejada esteja sob controle de um promotor apropriado para que ocorra a expressão da proteína desejada. Um intensificador e terminador podem ser também colocados no vetor. Veto- res que carregam gene da cadeia pesada e da leve que constituem uma i- munoglobulina e que são capazes de expressar uma molécula de uma imu- noglobulina são conhecidos.

O vetor capaz de expressar a imunoglobulina pode ser adminis- trado por sua introdução em células. Na administração a organismos vivos, um vetor que pode ser infectado com células pela administração aos orga- nismos vivos pode ser administrado diretamente. Uma vez separados os linfócitos dos organismos vivos, o vetor é então introduzido nos linfócitos, os quais podem ser, mais uma vez, devolvidos aos organismos vivos (ex vivo).

No inibidor ativo de IPCs ou o método de inibição da atividade de IPCs, de acordo com a presente invenção, em relação à quantidade de anticorpo monoclonal a ser administrada aos organismos vivos, a adminis- tração da imunoglobulina varia geralmente de 0,5 mg a 100 mg, por exem- pio, 1 mg a 50 mg, de preferência de 2 mg a 10 mg por kg de peso corporal. Intervalos de administração do anticorpo a organismos vivos podem ser a- dequadamente ajustados de forma a ser mantida uma concentração eficaz da imunoglobulina nos organismos vivos durante o período de tratamento. Especificamente, por exemplo, o anticorpo pode ser administrado de 1 a 2 semanas. A via de administração é opcional. Especialistas na técnica podem selecionar adequadamente uma via de administração efetiva em tratamen- tos. Exemplos específicos da mesma incluem administração oral ou parente- ral. Os anticorpos são administrados por via sistêmica ou tópica, por exem- plo, por injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, injeção subcutânea ou similares. Exemplos de formulação apropriada para administração parenteral na presente invenção incluem soluções injetáveis, supositórios e aerossóis. Quando o anticorpo é fornecido às células, a imu- noglobulina é acrescentada ao meio de cultura, em geral, em torno de 1 μg/ml, preferencialmente 10 μg/ml, mais preferencialmente 50 μg/ml e ainda mais preferencialmente, 0,5 mg/ml.

No inibidor ativo de IPCs ou o método de inibição da atividade de IPCs da presente invenção, o anticorpo monoclonal pode ser administra- do a organismos vivos por métodos opcionais. Geralmente, o anticorpo mo- noclonal é misturado a um adjuvante farmaceuticamente aceitável. Se ne- cessário, o anticorpo monoclonal pode ser misturado a agentes adicionais, como espessahtes, estabilizantes, conservantes e solubilizantes. Exemplos deste adjuvante ou agente adicional incluem lactose, ácido cítrico, ácido es- teárico, estearato de magnésio, sacarose, amido, talco, gelatina, ágar, óleo vegetal e etilenoglicol. O termo "farmaceuticamente aceitável" significa apro- vado por agência reguladora em cada governo ou listado na Farmacopéia em cada país ou outra farmacopéia geralmente reconhecida para uso em animais, em mamíferos e, mais especialmente, em seres humanos. O inibi- dor ativo de IPCs da presente invenção pode ser provido também sob a for- ma de pó liofilizado ou comprimidos em doses únicas ou múltiplas. Além dis- so, os pós liofilizados ou comprimidos podem ser utilizados em combinação com água para injetáveis esterilizada, solução de sal fisiológico ou solução para dissolução das composições para que atinjam a concentração desejada antes de serem administrados.

Além disso, quando o anticorpo monoclonal é administrado sob a forma de vetor que expressa imunoglobulina, a cadeia pesada e a leve são co-transfectadas em outro plasmídeo, e cada plasmídeo pode ser adminis- trado, variando de 0,1 a 10 mg, por exemplo, 1 a 5 mg por kg de peso corpo- ral. A fim de introduzir os plasmídeos nas células in vitro, o teor dos vetores a ser utilizado é de 1 a 5 μg/106 células. Abaixo, a presente invenção será especificamente descrita em referência a Exemplos.

Todos os documentos da técnica anterior, mencionados no pre- sente, são aqui incorporados em sua totalidade por referência neste pedido.

EXEMPLOS

Exemplo 1

A. Análise de expressão do ILT7

A-1) Análise utilizando biblioteca de SAGE

A expressão gênica em monócitos humanos, IPCs e em IPCs, tratadas com HSV, é comparada e analisada pelo método de Análise Serial de Expressão Gênica (Nome comercial; SAGE). O método da análise é exe- cutado de acordo com o seguinte. Os monócitos e IPCs1 provenientes de sangue periféricos, foram separados em células BDCA-4 positivas e células CD14 positivas, respectivamente, empregando um classificador de células.

Além disso, as IPCs foram permaneceram em cultura por 12 horas sob a presença do Vírus Herpes Simplex (HSV) e, em seguida, as IPCs diferencia- das foram preparadas. Foi obtido o RNA das respectivas células, seguido pela produção de biblioteca de SAGE, utilizando-se kit de I-SAGE (Nome comercial) (produzido por Invitrogen). Os dados sobre as seqüências de ba- ses obtidas de aproximadamente 100.000 etiquetas (tags) foram analisados com o Software de Análise de SAGE (produzido por Invitrogen). Em resulta- do, foi descoberto um gene cujo valor de pontuação de monóci- to/IPC/IPC+HSV é 0/16/0, a saber, ILT7 (Gen Bank Acc#NM_012276), co- nhecido como um gene que exibe expressão específica de IPC. ILT7 é uma proteína de membrana com domínios semelhantes aos de imunoglobulina, codificado por uma seqüência de bases apresentada na SEQ ID NO: 1 (Fi- gura 2 (a)). Foi relatado que o mRNA do ILT7 é expresso em IPCs (Blood 100,3295-3303(2002)).

A-2) RT-PCR

A expressão do ILT7 em células do sistema hemócito foi exami- nada mais detalhadamente. Cada célula foi isolada, de modo preparatório, de sangue periférico humano pelo classificador de células. Foram extraídos RNAs de cada população de célula isolada, das quais cDNA foi sintetizado. PCR quantitativa foi conduzida, de acordo com um método convencional, utilizado o cDNA resultante como modelo, e o nível de expressão do mRNA de ILT7 foi analisado. As condições usadas para as seqüências de bases de iniciadores e PCR são as que se seguem:

Dianteiro primer. 5' CTC CAA CCC CTA CCT GCT GTC 3' (SEQ ID NO: 3) Reverso primer. 5' TTC CCA AGG CTC CAC CAC TCT 3' (SEQ ID NO: 4) 1 ciclo de PCR (a 94 0C por 3 minutos)

25 ciclos de PCR [a 94°C por 30 segundos, a 58 0C por 30 segundos e a 72 °C por 1 minuto]

1 ciclo de PCR (a 72°C por 6 minutos) Quando IPCs estimuladas por monócitos, IPCs, HSVs e células CD19 positivas (ou seja, células B), células CD3 positivas (ou seja, células T), células T estimuladas por PMAs e células CD56 positivas (ou seja, célu- las NK) foram examinadas, foi constatado que ILT7 foi expresso espeçifica- mente em IPCs (Figura 1 (a)).

A-3) RT-PCR quantitativa

Além disso, a expressão em outros órgãos e tecidos foi exami- nada por PCR quantitativa, utilizando ABI PRISM 7000 (produzido por Appli- ed Biosystem). Foram utilizados como painel de cDNA , o Painel de cDNA de múltiplos tecidos MTC BD (Nome comercial) (Humano I; Cat. N°: 636742, Imuno Humano; Cat. N°: 636748, Frações dè sangue humano; Cat. N°: 636750; todos eles fabricados por Becton Dickinson) e o mesmo cDNA deri- vado de células do sistema hemócito, conforme descrito em (2).

As seqüências de bases utilizadas de iniciadores são as seguin- tes:

Dianteiro primer do ILT7: 5' CCT CAA TCC AGC ACA AAA GAA GT 3' (SEQ ID NO: 5)

Reverso primer do ILT7: 5' CGG ATG AGA TTC TCC ACT GTG TAA 3' (SEQ ID NO: 6)

Dianteiro primer do GAPDH: 5' CCA CCC ATG GCA AAT TCC 3' (SEQ ID NO: 7)

Reverso primer do GAPDH: 5' TGG GAT TTC CAT TGA TGA CAA G 3' (SEQ ID NO: 8)

A PCR foi realizada, utilizando o ABI PRISM 7000 (produzido por Applied Biosystem) e o kit de mistura máster verde de PCR, SYBR (produzi- do pela mesma companhia). O Software do Sistema de Detecção de Se- qüência (produzido pela mesma companhia) foi utilizado para análise.

As condições da reação foram as seguintes:

Etapa 1: 1 ciclo de PCR (a 50 °C por 2 minutos)

Etapa 2: 1 ciclo de PCR (a 95 °C por 10 minutos)

Etapa 3: 40 ciclos de PCR (a 95 °C por 15 segundos, a 60°C por 1 minuto)

A expressão do gene de ILT7 foi comparada entre cada tecido por padronização com o nível de expressão do gene de gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase (GAPDH), o qual é conhecido a ser expresso constitu- tivamente. Em resultado, foi observado que o ILT7 não foi expresso em quaisquer órgãos a não ser em tecidos iinfóides e, especificamente, em IPCs.

B. Produção de vetores de expressão de ILT7 e FcRy

Subseqüentemente, foi conduzida a clonagem de genes e pro- dução de vetores de expressão, a fim de serem expressas proteínas do ILT7.

B-1) Clonagem de genes de ILT7

Poli(A)+RNA separado de sangue periférico humano foi extraído de IPCs, do qual cDNA foi sintetizado, utilizando-se primer oligo dT e o Sis- tema de Escolha Super Script do kit de Síntese de cDNA. Um adaptador E- coRI foi unido ao cDNA sintetizado, o qual foi unido no vetor, clivado pelo EcoRI, resultando em produção de biblioteca de cDNA de IPC humana. O gene de ILT7 foi amplificado pelo método de PCR1 utilizado a biblioteca de cDNA produzida como modelo, bem como com iniciadores com as seguintes seqüências de bases. 1 unidade de KOD Plus DNA polimerase (produzido por TOYOBO CO., LTD.) foi utilizada para reação de PCR. As condições da reação foram estabelecidas em 25 ciclos de PCR [a 94 °C por 15 segundos, a 55 °C por 30 segundos e a 68 °C por 2 minutos], após 1 ciclo def PCR a 94 °C por 2 minutos.

Dianteiro primer. 5' CAG GGC CAG GAG GAG GAG ATG 3' (SEQ ID NO: 9) Reverso primer. 5' TCA GCA GAC ACT TCC CCA ACT 3' (SEQ ID NO: 10)

O fragmento cDNA de ILT7 de 2 kb amplificado foi separado e recuperado por eletroforese, empregando gel de agarose a 1%, o qual foi clonado no vetor de plasmídeo pCR4 BIunt-TOPO (produzido por Invitrogen), utilizando o kit de Clonagem por PCR, Zero Blunt TOPO (produzido por Invi- trogen). As seqüências de bases dos genes obtidos foram analisadas e foi constatado ter sido obtido o gene desejado de ILT7, apresentado na SEQ ID NO: 1.

B-2) Produção de vetores de expressão de ILT7 com etiqueta (tag) FLAG Foi construído um plasmídeo, expressando uma proteína na qual etiquetas FLAG foram fundidas ao N e C terminais do ILT7, respectivamente. O ILT7 foi fundido com uma etiqueta, possibilitando a confirmação da ex- pressão da proteína de ILT7, por detecção da etiqueta. A seqüência deseja- da foi amplificada pelo método de PCR, utilizando o gene de ILT7 produzido conforme descrito em (1) como modelo, bem como com iniciadores com as seguintes seqüências de bases. 1 unidade de KOD Plus DNA polimerase (produzido por TOYOBO CO., LTD.) foi utilizada para reação de PCR. As condições da reação foram estabelecidas em 25 ciclos de PCR [a 94°C por 15 segundos, a 55°C por 30 segundos e a 68°C por 2 minutos], após 1 ci- clo de PCR a 94°C por 2 minutos.

Para ILT7 com N-FLAG

Dianteiro primer (SEQ ID NO: 11): 5' CCG ctc gag ATG ACC CTC ATT CTC ACA AGC CTG CTC TTC TTT GGG CTG AGC CTG GGC ÍGAT TAC AAG GAT GAC GAC GAT AAGI CCC AGG ACC CGG GTG CAG GCA GAA 3' Reverso primer (SEQ ID NO: 12): 5' C TAG act agt TCA GAT CTG TTC CCA AGG CTC 3' Para ILT7 com C-FLAG

Dianteiro primer (SEQ ID NO: 13): 5' CCG ctc gag ATG ACC CTC ATT CTC ACA AGC 3'

Reverso primer (SEQ ID NO: 14): 5' C TAG act agt TCA [CTT ATC GTC GTC ATC CTT GTA ATC] GAT CTG TTC CCA AGG CTC 3'

Nas seqüências de bases mencionadas acima, cada parte subli- nhada em parênteses exibe uma seqüência de bases que codifica a etiqueta FLAG anexada, e as letras em minúsculo exibem o sítio de clivagem da en- zima de restrição Xhol ou Spel. Fragmentos de DNA, amplificados por PCR, foram clivados por Xhol e Spel, os quais foram, então, separados por eletro- forese em gel. Foram recuperados fragmentos de DNA de 2 kb, os quais foram ligados no vetor pME18X, clivado por Xhol e Spel, na mesma maneira conforme descrita acima. Em seguida, foram construídos dois tipos de plas- mídeos capazes de expressarem a proteína de fusão desejada, ou seja, pME18X-N-FLAG ILT7 e pME18 X-C-FLAG ILT7, respectivamente. B-3) Clonagem de genes de FcRy

A proteína FcRyfoi considerada como aquela capaz de se asso- ciar à proteína do ILT7. Esta molécula é um gene com seqüências de bases e seqüências de aminoácidos das SEQ ID NO: 15 e 16 (Genbank Acc#NM_004106, J. Biol. Chem. 265, 6448-6452 (1990)). Esta é uma molé- cula (cadeia γ) que constitui Fc ε RI, ou seja, um receptor de IgE de alta afi- nidade. Embora seja também denominada Fc ε Rl γ, ela será referida como FcRy a seguir. A esse respeito, esta molécula tem sido conhecida também como um componente do FcyR ou FcaR. O presente gene foi clonado pelo método de PCR, conforme apresentado abaixo, para produção de vetores de expressão. O gene de FcRyfoi amplificado pelo método de PCR, utilizando a biblioteca de cDNA de IPC humana, produzida conforme descrito em (1), como modelo, bem como com iniciadores com as seguintes seqüências de bases. 1 unidade de KOD Plus DNA polimerase (produzido por TOYOBO CO., LTD.) foi utilizada para reação de PCR. As condições da reação foram estabelecidas em 25 ciclos de PCR [a 94 ºC por 15 segundos, a 55 ºC por 30 segundos e a 68 0C por 1 minuto], após 1 ciclo de PCR a 94 ºC por 2 mi- nutos.

Dianteiro primer. 5' CCC AAG ATG ATT CCA GCA GTG 3' (SEQ ID NO: 17) Reverso primer. 5' GGA AGA ACC AGA AGC CAA AGA 3' (SEQ ID NO: 18) O fragmento amplificado de FcRycDNA de 0,3 kb foi separado e recuperado por eletroforese em gel, utilizando gel de agarose a 2%, o qual foi clonado para o vetor do plasmídeo pCR4 BIunt-TOPO (produzido por Invi- trogen), utilizando o kit de Clonagem em PCR, Zero Blunt TOPO (produzido por Invitrogen). As seqüências de bases dos genes obtidos foram analisadas e foi confirmado que o gene de FcRy desejado, apresentado na SEQ ID NO: 15, foi clonado.

B-4) Produção de vetores de expressão de FcRy com etiqueta Myc

Foi construído um plasmídeo que expressa uma proteína na qual a etiqueta Myc foi anexada ao C-terminal, de forma que a expressão da pro- teína do FcRy pudesse ser confirmada. A seqüência desejada foi amplificada pelo método de PCR, utilizando o gene de FcRy, produzido conforme descri- to em (3), como modelo, bem como com iniciadores com as seguintes se- qüências de bases. 1 unidade de KOD Plus DNA polimerase (produzido por TOYOBO CO., LTD.) foi utilizada para reação de PCR. As condições da rea- ção foram estabelecidas em 25 ciclos de PCR [a 94°C por 15 segundos, a 55°C por 30 segundos e a 68 0C por 1 minuto], após 1 ciclo de PCR a 94°C por 2 minutos.

Dianteiro primer (SEQ ID NO: 19): 5' CCG ctc gag ATG ATT CCA GCA GTG GTC TTG 3'

Reverso primer (SEQ ID NO: 20): 5' CTA Gac tag tCT AfCA GAT CCT CTT CAG AGA TGA GTT TCT GCT CICT GTG GTG GTT TCT CAT G 3'

Nas seqüências de bases mencionadas acima, cada parte subli- nhada em parênteses exibe uma seqüência de bases que codifica a etiqueta Myc anexada, e as letras em minúsculo exibem o sítio de clivagem da enzi- ma de Xhol ou Spel. Fragmentos de DNA, amplificados por PCR, foram cli- vados por Xhol e Spel, os quais foram então separados por eletroforese em gel. Fragmentos de DNA de aproximadamente 0,3 kb foram recuperados, os quais foram unidos no vetor pME18X, clivado por Xhol e Spel, na mesma maneira descrita acima. Em seguida, foi construído um plasmídeo capaz de expressar a proteína de fusão desejada, ou seja, pME18X-Myc-FcRy.

C. Expressão de ILT7 em células de animais

A expressão de ILT7 em células de animais foi examinada, utili- zando-se vetores de expressão, produzidos conforme descrito acima. C-1) Expressão em células 293T

DNAs constituídos pelas cinco combinações seguintes foram introduzidos em células 293T (7 χ 105 células), utilizando o kit de transfecção effectene (produzido por Qiagen). Dois dias depois da introdução, foi condu- zida análise por citometria de fluxo (análise por FCM).

(1)2 μg de pME18X-N-FLAG ILT7

(2) 2 μg de pME18X-C-FLAG ILT7

(3) 1 μg de pME18X-N-FLAG ILT7 + 1 μg de pME18X-Myc-FcRy

(4) 1 μg de pME18X-C-FLAG ILT7 + 1 μg de pME18X-Myc-FcRy

(5) 2 μg de pME18X-Myc-FcRy O método da análise por FCM foi conduzido da mesma maneira descrita em A-4 do Exemplo 2 seguinte. O anticorpo anti-Flag conjugado a Cy3 (produzido por Sigma) foi utilizado para a reação e o FACScan (fabrica- do por Becton Dickinson) foi utilizado para a análise. Em resultado, foi cons- tatado que uma quantidade pequena de ILT7 foi expressa na superfície celu- lar quando reagido isoladamente, enquanto que ILT7 foi expresso em meio extracelular e de maneira robusta quando presente também com FcRy (Figu- ra 3). Sabe-se que FcRy de camundongo possui alta homologia com FcRy humano. No entanto, quando células p815 (mastocitoma de camundongo), que expressam FcRyde camundongo, foram utilizadas como hospedeiras, a expressão de ILT7 não pode ser observada.

C-2) Análise pelo método de imunoprecipitação e western blotting

ILT7 foi expresso juntamente com FcRy sobre a superfície celu- lar, o que foi confirmado da seguinte maneira. Após imunoprecipitação, fo- ram analisados vários anticorpos para cada célula 293T, co-expressos com ambos os genes, em combinações correspondentes, descritas em (1) a (5). Os DNAs foram introduzidos em células 293T (7 χ 105 células), de cujas cé- lulas 293T foram recuperados dois após a introdução, na mesma maneira conforme descrita em (1). Frações de células foram dissolvidas em tampão de lise (Triton a 0,5%, NaCI a 150 mM), sendo então deixadas sobre gelo por 20 minutos. Posteriormente, foram repetidas várias vezes aspirações por agulha (27 G), seguidas por centrifugação a 15 Krpm por 20 minutos. Anti- corpo anti-myc (2 μg, produzido por tecnologia da Santa Cruz) ou anticorpo anti-Flag (2 μg, produzido por Sigma) foi acrescentado a 200 μg do Iisado dos produtos resultantes, os quais foram agitados posteriormente por rota- ção a 4 0C por 4 horas. Em seguida, a mistura Protein A/G Sepharose 4 Fast Flow (produzida por Amersham bioscience) foi acrescentada aos mesmos, os quais foram agitados por rotação a 4 0C por 1 hora. Em seguida, as fra- ções precipitadas resultantes foram lavadas, 3 vezes, com tampão de Iise com a seguinte composição.

Tampão de lise:

TritonX-100a 0,5%, HEPES a 50 mM (pH 7,6), NaCI a 150 mM, EDTA a 1 mM, glicerol a 10%, DTT a 1 mM, PMSF a 2 mM, 1 μg/ml de Aprotinina, 1 μg/ml de Leupeptina, 1 μg/ml de Pepstatina A, 0,1 μg/ml de Quimostatina, Na3VO4 a 1mM β-glicerofosfato a 0,1 mM.

Um tampão de amostra para SDS-PAGE foi acrescentado aos precipitados lavados, os quais foram fervidos por 5 minutos e centrifugados, seguido por eletroforese em gel com SDS a 10%. Amostras foram transferi- das de géis, após eletroforese, para membrana de PVDF (Membrana de transferência lmmobilon-p: produzida por Millipore), de acordo com um mé- todo convencional. A detecção foi efetuada com anticorpo anti-Flag anticorpo e anticorpo anti-myc. Foi confirmada a presença do ILT7 associado a FcRy em células 293T células, visto este estar presente em cada imunoprecipitado (Figura 4).

C-3) Análise de cadeia de açúcar

Como várias faixas de ILT7 foram observadas na análise por Western Blotting, foi examinada a possibilidade de ILT7 ter sido glicosilado. 200 μg do lisado de células 293T que expressam ILT7 N-FLAG e Myc-FcRy foram imunoprecipitados com anticorpo anti-Flag, na maneira descrita em (1) e (2). Posteriormente, as frações precipitadas foram suspensas em 60 μΙ de tampão de N-glicosidase, com a composição a seguir, e 30 μΙ de cada solu- ção resultante foram repartidas em alíquotas em dois tubos. Tampão de N-glicosidase: EDTAaIOmM, SDS a 0,2%, TritonX100 a 0,5%,

2-mercaptoetanol a 1% em PBS (tampão fosfato)

Em seguida, 3 unidades de 3 μl de N-glicosidase (#1365177, produzido pela Roche) foram acrescentadas a um tubo, sendo permitido que foram acrescentados ao tubo, sendo este aquecido a 100°C por 5 minutos, seguidos por eletroforese em gel com SDS a 10%. Após a eletrofo- rese, o gel foi transferido para uma membrana de PVDF, à qual foi acrescen- tado 1 μg de anticorpo policlonal anti-ILT7, conforme descrito em (4), tendo sido permitido qúe ocorresse a reação a 4°C durante a noite. O produto re- sultante foi lavado com tampão TBS-T e reagiu com anticorpo anti-HRP marcado de coelho (produzido por Jackson), diluído 100.000 vezes em tem- peratura ambiente. A seguir, o produto foi corado com o Sistema de Detec- ção ECL de Western Blotting (produzido por Amersham bioscience). Em re- sultado, o peso molecular aparente foi diminuído pelo tratamento com N- glicosidase. Dessa forma, previu-se que cadeias de açúcar tinham sido a - crescentadas ao ILT7 (Figura 5). C-4) Produção de anticorpo policlonal anti-ILT7

O anticorpo policlonal anti-ILT7 utilizado, conforme descrito em (3) foi produzido da seguinte maneira. Um peptídeo de 23 aminoácidos, cor- respondentes ao C-terminal do ILT7 (CSQEANSRKDNAPFRVVEPWEQI; SEQ ID NO: 21) foi sintetizado quimicamente e ligado à proteína KLH, que é veículo, e o produto resultante foi utilizado como imunogene. Coelhos foram imunizados por via intradérmica com o imunogene misturado ao adjuvante completo de Freund. Depois de, no total, seis imunizações (uma vez por se- mana) o título aumentado do anticorpo foi confirmado e, em seguida, foi co- letado sangue total. A seguir, algum soro foi purificado por afinidade, empre- gando coluna de peptídeo da mesma seqüência. O produto resultante foi determinado como o anticorpo policlonal anti-ILT7.

Exemplo 2

A. Produção de anticorpo monoclonal anti-ILT7 A-1) Produção de imunogene Células a serem utilizadas como imunogenes foram preparadas pela introdução de genes em células 293T, conforme descrito abaixo. 46,4 μg de transgene (23.2 μg de pME18 X-C-FLAG ILT7 e 23.2 μg de pME18X- Myc-FcRy) foram acrescentados ao fundo de um Prato de Revestimento em Colágeno de 100 mm (IWAKI), revestido com 3 ml de opti-MEM (GIBCO), e misturados. Subseqüentemente, à parte da solução do transgene, 58 μl de Lipofectamina (Nome comercial) 2000 (Invitrogen) foram diluídos com 3 ml de opti-MEM e deixados em repouso por 5 minutos em temperatura ambien- te, e a solução de Lipofectamina foi preparada. Posteriormente, a solução de Lipofectamina foi cuidadosamente acrescentada ao prato contendo a solu- ção do transgene e misturada. Após permanecer em temperatura ambiente por 20 minutos, 10 ml de células 293T-células, diluídas para 1 χ 10^6 célu- las/Ml, empregando meio de cultura DMEM (SIGMA), contendo FBS a 10% (soro fetal bovino), foram cuidadosamente acrescentados ao prato. O meio resultante foi submetido à cultura estática em incubadora a 37°C sob CO2 por 48 horas, do qual as células foram recuperadas por pipetas. As células obtidas foram utilizadas como transfectantes de imunogenes.

A-2) Produção de hibridomas

No dia anterior à imunização das células, 50 μl de emulsão, obti- da pela mistura de 200 μΙ de PBS com 200 μΙ de adjuvante completo (FRE- UND) (RM606-1, produzido por Mitsubishi Kagaku latron, Inc.), foram injeta- dos na parte inferior de ambas as patas de quatro camundongos Balb/c do sexo feminino (quatro· semanas de vida) para imunização. No dia seguinte, foi efetuada a imunização em 50 μl contendo 2 χ 10^7 células, suspensas em 400 μl de PBS. As segunda e terceira imunizações foram realizadas a cada quatro dias. Três dias depois da terceira imunização, foi conduzida a fusão celular conforme segue. As células foram coletadas de Iinfonodos da pata de camundongos imunizados. Células P3-X63-Ag8-U1 de mieloma de camun- dongo, cultivadas em meio de cultura RPM11640 (SIGMA) contendo FBS a 10%, foram misturadas às células derivadas dos linfonodos e mieloma, de forma que a relação das células de mieloma para as células derivadas de Iinfonodos e mieloma fosse de 2:1 a 10:1, sendo as células recuperadas da mistura por centrifugação. PEG4000 (MERCK) diluído equivalentemente com meio de cultura RPMI1640 foi acrescentado às frações celulares obti- das, as quais foram submetidas à fusão celular. Depois de lavagem das cé- lulas, o produto resultante foi suspenso em 160 ml de meio FBS-HAT a 15%, 5 contendo um complemento e, em seguida, inoculado em dezesseis placas de 96 cavidades, em 200 μΙ/cavidade. O meio de cultura foi trocado depois de três dias. Uma a duas semanas após observação da formação de colô- nias, foi realizada uma varredura primária. A-3) Varredura de hibridoma pelo método de ELISA celular

O hibridoma que produz o anticorpo alvo foi investigado pelo se- guinte método de ELISA celular. As células produzidas, conforme descrito em (1) foram utilizadas em concentração de 1 χ 107 células por placa de 96 cavidades, as quais foram suspensas em BSA a 0,5%/EDTA a 2 mM/PBS e, em seguida, transferidas em alíquotas para uma placa para condução do método de ELISA Celular (NUNC 249570 96V NW PS), em concentração de 100 μΙ/cavidade. Foi efetuada centrifugação a 2.000 rpm a 4 0C e, em segui- da, o sobrenadante foi descartado. Amostras de 50 μΙ/cavidade do sobrena- dante da cultura foram acrescentadas e deixadas reagir em temperatura ambiente por 30 minutos. Foi efetuada, por duas vezes, a operação de Iava- gem, envolvendo adição de BSA a 0,5%/EDTA a 2 mM e PBS a cada cavi- dade, centrifugação a 2.000 rpm a 4 0C por 2 minutos e, em seguida, descar- te do sobrenadante. 50 μΙ/cavidade de anticorpo de cabra anti-lgG de ca- mundongo marcado ligado à peroxidase (IM0819; Beckman Coulter), diluído 10.000 vezes, foram acrescentados a cada cavidade após lavagem, sendo permitida a reação por 30 minutos. A operação de lavagem com BSA a 0,5%/EDTA a 2 mM/PBS foi conduzida por duas vezes, seguida pela adição de uma solução corante. A solução preparada de anticorpos foi substituída por PBS (-), por membrana de diálise (10.000 cortes, fabricada por PIERCE), para fornecer anticorpos quiméricos anti-ILT7.

A-4) Exame de responsividade de anticorpo por análise por citometria de fluxo (FCM)

O sobrenadante da cultura de hibridomas foi analisado por cito- metria de fluxo (FCM). As células produzidas, conforme descrito em (1), fo- ram suspensas em BSA a 0,5%/EDTA a 2 mM/PBS, sendo 1 χ 105 por a- mostra destas transferidas para um tubo de centrífuga, seguido pela adição de 40 μl de cada cultura e reação em temperatura ambiente por 30 minutos.

Foi efetuada, por duas vezes, a operação de lavagem, envolvendo adição de 1 ml BSA a 0,5%/EDTA a 2 mM/PBS a cada tubo, centrifugação a 1200 rpm a 4°C por 3 minutos e, em seguida, descarte do sobrenadante. 40 μl μl/cavidade de anticorpo de cabra anti-lgG de camundongo marcado ligado à peroxidase (IM0819; Beckman Coulter), diluído 10.000 vezes, foram a- crescentados a cada cavidade após lavagem, sendo permitida a reação em temperatura ambiente por 30 minutos. A operação de lavagem com BSA a 0,5%/EDTA a 2 mM/PBS foi conduzida por duas vezes, seguida de análise por citometria de fluxo com FC500 (Beckman Coulter). Foi selecionado um hibridoma produtor de anticorpo que não respondeu somente á célula hos- pedeira e que respondeu especificamente à célula na qual o gene foi intro- duzido. O hibridoma selecionado foi clonado pelo método de diluição Iimitan- te, tendo sido obtidos os hibridomas nQ 11 e n9 17 que produzem anticorpos monoclonais.

B. Exame de responsividade do anticorpo anti-ILT7

O ILT7 com etiqueta FLAG anexada a N-terminal foi co- expressado com a molécula de FcRy em células 293T, da mesma maneira conforme descrito em C-1) do Exemplo 1. Em seguida, a responsividade do anticorpo, obtido no Exemplo 2, foi confirmada por análise de FCM com o FACScan (Becton Dickinson). Em resultado, foi confirmado que todos os anticorpos produzidos pelos hibridomas n9 11 e ng 17, obtidos conforme des- crito em A, responderam às células nas quais o gene do ILT7 foi introduzido e que expressaram ILT7 (Figura 6 (b)). Além disso, foram separados linfóci- tos de sangue periférico humano com Ficoll e, em seguida, foi efetuada a dupla coloração com o anticorpo anti-ILT7 produzido e anticorpo PE- marcado anti-BDCA-2 (Miltenyi). A seguir, foi examinada a responsividade aos linfócitos. Em resultado, a ligação do anticorpo monoclonal produzido pelos hibridomas n9 11 e n9 17 a célula BDCA-2 positiva foi detectada. Ou seja, foi confirmado que ambos os anticorpos monoclonais reconheceram moléculas de ILT7, expressas em IPCs humanas IPCs (Figura 6 (a)). Estes anticorpos monoclonais foram designados anticorpo anti-ILT7 n5 11 e anti- corpo anti-ILT7 n9 17, respectivamente. Foram conduzidas análises mais detalhadas.

Foi conduzida análise de coloração múltipla de linfócitos de san- gue periférico humano, utilizando-se o anticorpo anti-ILT7 produzido, anti- corpo anti-Linhagem-1 (anticorpos anti-CD3, CD14, CDI6, CD19, CD56; Becton Dickinson), anticorpo anti-CD123 (Becton Dickinson) e anticorpo anti- BDCA-2 (Miltenyi). Quanto às frações positivas de anticorpo contra ILT7, o Marcador de Linhagem foi negativo, CD123 foi positiva e BDCA-2 foi positi- va. A partir dos resultados, foi confirmado que IPCs eram coradas somente por ILT7 ne 11 e ILT7 ns 17 (Figura 7).

Além disso, a expressão de várias moléculas foi examinada por análise de FCM, quando linfócitos do sangue periférico humano foram esti- mulados por CpG ou IFN-α por 24 horas. CpGODN2216 foi utilizado como CpGA, o qual induz a produção de IFN, proveniente de IPCs, e Cp- GODN2006, foi utilizado como CpGB que facilita a maturação de células dendríticas (Moseman et ai. J. Immunology. 173, 4433-4442, 2004). Uma saída foi definida para fração negativa de Marcador de Linhagem. Quando a responsividade do anticorpo anti-BDCA-2 e do anticorpo anti-ILT7 à popula- ção de célula CD123 positiva foi analisada, a maioria das frações ILT7 posi- tivas desapareceram mesmo depois de estimulação por CpG de 24 horas. Por outro lado, algumas células de BDCA-2 foram positivas após estimula- ção por CpG de 24 horas (Figura 8). Foi considerado que IPCs diferencia- ram-se em células diferentes imediatamente depois da estimulação por CpG. Foi indicado que o anticorpo anti-ILT7 da presente invenção era útil como anticorpo em estágio específico para IPCs. Ademais, foi confirmado que IPCs1 em linfócitos de sangue periférico não se diferenciaram sob a presen- ça de IFN-α, neste caso em que o índice de sobrevida era alto, a expressão do ILT7 foi mantida em IPCs, além de ILT7 estar presente estavelmente em IPCs, em doenças auto-imunes, sendo possível que o nível de IFN no soro estivesse alto.

C. Exame de especificidade do anticorpo anti-ILT7

ILT7 pertence à família ILT/LIR, havendo uma pluralidade de moléculas com grande homologia, especialmente com alta homologia na região extracelular (Figura 9). Foi relatado que mRNAs de moléculas, espe- cialmente, ILT2 e ILT3, são expressas em IPCs (Ju et al. Gene 331, 159- 164, 2004). Por conseguinte, a responsividade destas moléculas foi confir- mada, utilizando-se células transgênicas.

C-1) Clonagem de molécula de ILT1 e produção de vetores de expressão

cDNA foi sintetizado a partir de RNA derivado de amídala huma- na, empregando primer oligo dTeo Sistema de Escolha Super Script do kit de Síntese de cDNA. Em seguida um adaptador Notl foi unido em vetor pME18S, clivado por Notl, resultando em produção de biblioteca de cDNA de amídala humana.

O gene de ILT1 com etiqueta FLAG no C terminal foi amplificado pelo método de PCR, utilizando a biblioteca de cDNA produzida como mode- lo, bem como com iniciadores com as seguintes seqüências de bases. 1 uni- dade de KOD Plus DNA polimerase (produzido por TOYOBO CO., LTD.) foi utilizada para reação de PCR. As condições da reação foram estabelecidas em 25 ciclos de PCR [a 94 0C por 15 segundos, a 55°C por 30 segundos e a 68°C por 2 minutos], após 1 ciclo de PCR a 94°C por 2 minutos.

Dianteiro primer (SEQ ID NO: 22): 5' CCG ctc gag ATG ACC CCC ATC CTC ACG GTC C 3' ·

Reverso primer (SEQ ID NO: 23): 5' CTA Gac tag tTC AfCT TAT CGT CGT CAT CCT TGT AAT CICC TCC CGG CTG CAT CTT G 3'

Nas seqüências de iniciadores mencionadas acima, cada parte sublinhada em parênteses exibe uma seqüência de bases que codifica a etiqueta FLAG anexada, e as letras em minúsculo exibem o sítio de clivagem da enzima de restrição Xhol ou Spel. Fragmentos de DNA, amplificados por PCR, foram clivados por Xhol e Spel, os quais foram, então, separados por eletroforese em gel. Fragmentos de DNA de aproximadamente 2 kb foram recuperados, os quais foram ligados no vetor pME18X, clivado por Xhol e Spel, na mesma maneira conforme descrita acima. Em seguida, foi construí- do um plasmídeo capaz de expressar a proteína de fusão desejada, ou seja, pME18X-C-FLAGILT1. A seqüência de bases e a seqüência de aminoácidos são apresentadas nas SEQ ID NO: 24 e 25.

C-2) Produção de células que expressam e exame de responsividade de anticorpo

Quanto ao ILT2 (SEQ ID NO: 26) e ILT3 (SEQ ID NO: 28), foram utilizados vetores de expressão nos quais os respectivos genes foram clo- nados para sítios de Xbal ou Xhol de pcDNA4.1 (produzidos por Invitrogen). DNAs das combinações abaixo foram introduzidos em células 293T (7 χ 105 células), da mesma maneira descrita em C-1). Dois depois da introdução, foi conduzida análise por FCM e o anticorpo anti-ILT7 foi então analisado.

(1) 1 μg de pME18X-N-FLAG ILT7 + 1 μ9 de pME18X-Myc-FcRy

(2) 0,5 μg de pME18X-C-FLAG ILT1 + 0,5 μg de pME18X-Myc-FcRy + 0,5 μg de pcDNA4.1-ILT2 + 0,5 μg de pcDNA4.1-ILT3

Em resultado, nenhum anticorpo respondeu às células nas quais ILT1 foi expresso. Por esse motivo, foi sugerido que estes anticorpos anti- ILT7 reconheceram especificamente moléculas de ILT7 em IPCs (Figura 10).

Exemplo 3

Efeito do anticorpo anti-ILT7 sobre a capacidade de produzir IFN humano

Linfócitos de sangue periférico humano foram inoculados em placa de 96 cavidades, 2 x 105 células/cavidade, os quais reagiram com 5 μg/ml de vários anticorpos a 37 °C. Depois de cultura por 1 hora, foi acres- centado aos mesmos o vírus Influenza PR8. Após 24 horas de cultura, IFN- α, no sobrenadante da cultura, foi medido por kit do método ELISA (Bender Med System). Em resultado, a produção de IFN foi inibida pela adição do anticorpo anti-ILT7 (Figura 11). A saber, foi constatado que a produção de IFN por IPCs foi afetada pelo anticorpo anti-ILT7 da presente invenção.

Exemplo 4

Atividade de CDC do anticorpo anti-ILT7

A. Produção do anticorpo monoclonal anti-ILT7

Foi obtido um clone que produz um anticorpo monoclonal, da mesma maneira conforme descrito em A-1) a A-4) do Exemplo 2. A respon- sividade foi examinada da mesma maneira, conforme descrita em B do E- xemplo 2 e a especificidade, na mesma maneira descrita em C do Exemplo 2. Em resultado, foram obtidos os hibridomas ne 37, nQ 28 e ne 33 que pro- duziram anticorpos monoclonais anti-ILT7 com boa responsividade e especi- ficidade. A atividade de CDC foi medida, conforme descrito abaixo, empre- gando anticorpo monoclonal anti-ILT7, em que três tipos destes hibridomas foram produzidos.

B. Determinação de atividade de CDC B-1) No dia anterior ao da Produção alvo de uma linhagem celular alvo (li- nhagem de células ILT7-CHO), foi introduzido o DNA abaixo em células CHO-k1 células, as quais foram inoculadas de forma a haver 6 χ 105 células por prato (6 αηφ), utilizando o Reagente de Transfecção Effectene (produzi- do por QLAGEN), e, em seguida, cepas resistentes foram selecionadas com 800 μg/ml de Zeocina (produzida por Invitrogen).

DNA introduzido: 1 μg de pcDNA3.1-C-FLAG ILT7 + 2 μg de pME18X-Myc FcRy

Posteriormente, uma linhagem celular, com nível de expressão alto de ILT7, foi obtida com o classificador de células (BD FACSAria, fabri- cado por Becton Dickinson). Foi confirmado, por análise de FCM, que a Ii- 1 nhagem celular selecionada apresentou nível alto de expressão de ILT7. A operação da análise de FCM foi conduzida de acordo com o método descrito em A-4) do Exemplo 2, exceto que o BD FACSCaIiber (fabricado por BD) foi utilizado para FCM. Os anticorpos seguintes foram utilizados para anticorpo primário e anticorpo secundário, respectivamente.

Anticorpo primário: 5 μg/ml de anticorpo anti-ILT7 de camundongo (ne 37), Anticorpo secundário: anticorpo policlonal específico de imunoglobulina de cabra de anti-R-ficoeritrina (R-PE) conjugado de camundongo (BD) B-2) Resposta de células-alvo a anticorpos anti-ILT7

As células-alvo obtidas, conforme descrito em B-1) (célula ILT7- CHO) foram recuperadas com solução de EDTA a EDTA/PBS, as quais fo- ram suspensas em meio CDC com a composição seguinte, de forma a apre- sentar concentração de 4 χ 105 células/ml. A suspensão foi dividida em alí- quotas de 50 μl/cavidade em placa de 96 cavidades. MeioCDC:

RPMI1640

BSA a 0,1%

100 unidades/ml de Penicilina

100 μg/ml de estreptomicina

Hepes a 10 mM (pH 7,6)

L-Glutamina a 2 mM

50 μl de solução de anticorpo anti-ILT7, preparada por meio CDC, foram adicionados a cada cavidade e misturados de forma que a con- centração final de anticorpos fosse de 0,1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 1 μg/ml e 5 μg/ml. Além disso, 50 μl de meio CDC, contendo um complemento com a composição abaixo, foram acrescentados à mesma e misturados de forma que a concentração final do complemento seja 6%, seguido por cultura a 37 °C por 2 horas.

Meio CDC contendo complemento:

1 ml de complemento de coelho jovem (N° de catálogo.: CL3441, produzido por CEDARLANE)

Meio CDC (vide acima)

Em seguida, a suspensão foi centrifugada (condição da centrifu- gação: a 250 G por 4 minutos) e o sobrenadante foi recuperado, tomando-se cuidado para não haver contaminação com células. LDH no sobrenadante foi medido por método convencional, o qual foi determinado como "a quantida- de de LDH extravasada da célula-alvo por atividade do complemento" (A- mostra Experimental).

Os parâmetros seguintes foram preparados também para deter- minar a atividade de CDC.

- Liberação Espontânea de LDH de Célula-Alvo: somente células-alvo foram cultivadas no mesmo volume, conforme a amostra, e preparada.

- Liberação Máxima de LDH de Célula-Alvo: somente células-alvo foram cul- tivadas no mesmo volume, conforme a amostra e, em seguida uma solução de TritonX-100, incluída com o kit, foi acrescentada, 60 minutos antes de recuperação do sobrenadante, de forma que a concentração final seja 0,8% e preparada.

- Controle de Correção de Volume: a mesma quantidade de TritonX-100, conforme aquela acrescentada quando a Liberação Máxima de LDH de Cé- lula-Alvo foi preparada, foi acrescentada ao meio de cultura do mesmo vo- lume da amostra e preparada.

- Formação do Meio de Cultura: o meio de cultura do mesmo volume con- forme a amostra e a solução à qual o meio de cultura CDC contendo o com- plemento foi acrescentado ao meio de cultura, de forma a ter o mesmo vo- lume conforme a amostra, foram preparados.

O mesmo volume de meio de cultura, conforme a amostra, foi subtraído da absorvência de Máxima de Alvo e Espontânea de Alvo. A solu- ção à qual o meio CDC contendo complemento foi acrescentado ao meio de cultura de forma a ter o mesmo volume conforme a amostra, foi subtraída da absorvência da Amostra Experimental e corrigido. A atividade de CDC foi calculada pela equação seguinte. Os resultados são apresentados na Tabela 1 e Figura 12. Mesmo o caso em que anticorpos monoclonais anti-ILT7, ob- tidos de qualquer hibridoma, foram utilizados, foi exibido 80% ou mais de atividade de CDC em concentração do anticorpo de 0,5 μg/ml ou mais alta.

Atividade

de CDC (%) = Amostra Experimental - Espontânea de Alvo x 100

Máxima de Alvo - Controle de Volume - Espontânea de Alvo [Tabela 1]

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Exemplo comparativo 1

A mesma operação foi conduzida exatamente da mesma manei- ra, conforme descrita em B e C do Exemplo 4, exceto que lgG2a de camun- dongo foi utilizado em vez de anticorpo anti-ILT7. Os resultados são mostra- dos no Exemplo 4, bem como na Tabela 5 e Figura A atividade de CDC con- tra as células-alvo não foi observada em outros anticorpos a não ser o anti- corpo monoclonal anti-ILT7.

Exemplo 5

Internalização de anticorpo anti-ILT7 em células-alvo

A. Anticorpo monoclonal anti-ILT7

Foram utilizados os seguintes anticorpos monoclonais anti-ILT7. Anticorpos monoclonais anti-ILT7: n° 17, n° 26, n° 37, n° 28 e n° 33.

B. Observação dê internalização

B-1) Produção de linhagem celular alvo (linhagem celular ILT7-CHO)

A linhagem celular alvo (linhagem celular ILT7-CHO) foi produzi- da da mesma maneira descrita em B-1 do Exemplo 4.

B-2) Resposta de células alvo a anticorpo anti-ILT7

As células ILT7-CHO recuperadas foram suspensas em tampão gelado (T(-) + FBS a 10%) com a seguinte composição, em 1 χ 106 célu- las/ml, utilizando 5 mM de solução de EDTA/PBS. Meio T (-):

RPMI1640

100 unidades/ml de Penicilina

100 μg/ml de estreptomicina

Hepesa 10 mM (pH 7,6)

L-Glutamina a 2 mM

Piruvato de sódio a 1 mM

2-mercaptoetanol a 50 μΜ

Soro Fetal Bovino a 10% inativado por calor

1 ml da suspensão conforme descrita acima foi colocado em um tubo de centrífuga de 15 ml, o qual foi centrifugado (condição da centrifuga- 1 ção: 1200 rpm, a 4 °C por 5 minutos) e, em seguida, o sobrenadante foi des- cartado. 200 μΙ de suspensão de anticorpo anti-ILT7 de 10 μg/ml foram a- crescentados a células em péletess que foram misturadas e incubadas a 4 °C por 30 minutos, seguido por duas lavagens com meio T (-) gelado (Quan- tidade do meio utilizada: 10 ml por lavagem; condição da centrifugação: 1200 rpm, a 4 °C por 5 minutos).

B-3) Modificação do complexo imune ILT7-anticorpo anti-ILT7, presente so- bre a superfície de células-alvo

Subseqüentemente, o complexo imune ILT7-anticorpo anti-ILT7, presente sobre a superfície de células foi modificado por um anticorpo se- cundário, o qual foi marcado com fluorescência para detecção. O método específico é descrito abaixo. Meio T (-) gelado, contendo anticorpo policlonal marcado de IgG de cabra anti-APC de camundongo (N° do catálogo: 550826BD, produzido por Biosciences), foi acrescentado a células em péle- tess, obtidas conforme descrito em B-2), sendo incubado sob sombra a 4 °C por 20 minutos, seguido por duas lavagens com meio T (-) gelado (quantida- de do meio utilizada: 10 ml por lavagem; condição de centrifugação: 1200 rpm, a 4 °C por 5 minutos). Em seguida, meio T (-) gelado foi acrescentado ao mesmo, que foi utilizado como suspensão de 1 χ 10^6 células/ml. B-4) Indução de internalização por incubação a 37 °C

A suspensão obtida, conforme descrito em B-3 foi dividida i- gualmente em dois tubos (ou seja, tubos (a) e (b)). Os tubos (a) e (b) foram incubados a 37 e 4 °C, respectivamente, sob condições de sombra por 60 minutos. Após a incubação, FBS/PBS a 1% (gelado) foi acrescentado à mesma para interromper a internalização. A solução resultante foi centrifu- gada (condições da centrifugação: 1200 rpm, a 4 °C por 5 minutos) e, em seguida, o sobrenadante foi descartada, seguido por 2 lavagens com FBS/PBS a 1% of FBS/PBS (gelado) (quantidade da solução: 10 ml por la- vagem; condição da centrifugação: 1200 rpm, a 4°Ç por 5 minutos). B-5)Modificação do complexo imune ILT7-anticorpo anti-ILT7 que permane- ceu na superfície de células-alvo após incubação

O complexo imune ILT7-anticorpo anti-ILT7 que permaneceu sobre a superfície celular após a incubação foi modificação com um anticor- po terciário para ser detectado por fluorescência. O método específico é descrito abaixo. 20 μl de suspensão contendo anticorpos terciários (anticor- po de burro anti-IgG de cabra com FITC-marcado (Número do catálogo: sc- 2024, produzido por Santa cruz biotechnology)) foram acrescentados a célu- las em péletess, obtidas conforme descrito em B-4), os quais foram mistura- dos e deixados em repouso a 4 °C por 15 minutos à sombra. A solução re- sultante foi lavada (quantidade da solução: 10 ml por lavagem; condição da centrifugação: 1200 rpm, a 4 °C por 5 minutos). B-6) Análise de anticorpo anti-ILT7, presente em células-alvo

Subseqüentemente, 150 μl de FBS/PBS a 1% foram acrescen- tados a células em péletess, obtidas conforme descrito em B-5), as quais foram suspensas e coletadas em tubo de microtitulação de 1,2 ml, seguido por análise por FCM. Na análise, a intensidade média de fluorescência (MPI) de cada células foi analisada separadamente em FITC e APC. Além disso, foi calculada a relação entre intensidade de fluorescência (%) pela equação seguinte.

<formula>formula see original document page 71</formula>

Os resultados são apresentados na Tabela 2, Tabela 3 e Figura 13.

[Tabela 2]

<table>table see original document page 71</column></row><table> [Tabela 3]

<table>table see original document page 72</column></row><table>

A intensidade de fluorescência de FITC é indicadora da quanti- dade do complexo imune ILT7-anticorpo anti-ILT7 que permaneceu na su- perfície celular após incubação. A intensidade média de fluorescência de FITC, em relação às células incubadas a 37 0C por 60 minutos, decresceu em aproximadamente 50%, em comparação às células incubadas a 4 °C.

Por outro lado, a intensidade de fluorescência de APC é indica- dora da quantidade do complexo imune ILT7-anticorpo anti-ILT7, presente na superfície celular antes de incubação. O complexo imune ILT7-anticorpo anti-ILT7 é detectado independentemente se presente na superfície celular ou se incorporado nas células após incubação. No Exemplo 5, a intensidade de fluorescência de APC, após incubação a 37 °C, foi equivalente àquela na incubação a 4 °C. Isso demonstra que o complexo imune ILT7-anticorpo an- ti-ILT7 pode estar presente em qualquer sítio das células-alvo, mesmo quando a incubação é realizada em quaisquer destas temperaturas. Con- forme mencionado acima, foi constatado que o anticorpo monoclonal anti- ILT7 promoveu a internalização do ILT7 pela incubação a 37°C.

Exemplo comparativo 2

A mesma operação foi conduzida exatamente da mesma manei- ra, conforme descrita no Exemplo 5, exceto que lgG2a de camundongo foi utilizado em vez de anticorpo anti-ILT7. Os resultados são mostrados no E- xemplo 5, bem como na Tabela 2, Tabela 3 e Figura 13. No caso em que o lgG2a de camundongo foi utilizado, não foram observadas alterações na intensidade de fluorescência de FITC e APC e, dessa forma, foi constatado que o lgG2a de camundongo não promoveu a internalização do ILT7. Exemplo 6

Referente à estrutura do anticorpo monoclonal de camundongo anti-ILT7 humano

[Seqüências de regiões variáveis]

A. Clonagem de cDNA codificador de região variável de anticorpo de ca- mundongo anti-ILT7

A-1) Referente a hibridomas que produzem anticorpos de camundongo anti- ILT7

Foram utilizados os seguintes hibridomas como hibridomas que produzem anticorpos de camundongo anti-ILT7.

-Hibridoma nõ 11 (Número de acesso: FERM BP-10704) -Hibridoma nQ 17 (Número de acesso: FERM BP-10705) A-2) Isolamento de RNAs totais

Os RNAs totais foram isolados dos hibridomas descritos em A- 1), utilizando um kit à disposição no mercado, "RNeasy Mini Kit" (Número de catálogo: 74106, produzido por Qiagen), de acordo com a instrução anexada ao kit. Em ambos os casos, foram obtidos aproximadamente 200 μg dos RNAs totais de 1 x 107 hibridomas. A-3) Amplificação e fragmentação de cDNA codificador de região variável de cadeia pesada de camundongo

O cDNA codificador de região variável de cadeia pesada de ca- mundongo foi amplificado pelo método 5'RACE, utilizando 5 μg dos RNAs totais, isolados conforme descrito em A-2. Quanto à amplificação, foi utiliza- do o kit à disposição no mercado,"5'RACE System for Rapid Amplification of cDNA ENDs, Kit Versão 2.0" (Número de catálogo: 18374-058, produzido por Invitrogen). Ele será especificamente descrito a seguir. Inicialmente, foi sintetizado um primeiro cDNA em fita, a partir dos RNAs totais, obtidos con- forme descritos em A-2), pela transcriptase reversa. As seqüências de bases de iniciadores antisentido (GSP1), então utilizadas, são apresentadas na Tabela 4. Iniciadores utilizados para amplificação de um gene codificador de região variá- vel de cadeia pesada de camundongo

<table>table see original document page 74</column></row><table>

Subseqüentemente, os RNAs totais foram degradados pela RNaseH e o primeiro cDNA em fita restante como fita simples foi purificado pelo método de agarose de baixo ponto de fusão (1,5%). Ademais, dC (ou seja, homopolímero de nucleotídeo) foi unido a 3'-terminal do primeiro cDNA em cadeia, empregando desoxinucleotidil terminal transferase (TdT). O cD- NA foi amplificado pelo método de PCR, utilizando iniciadores âncora (SEQ ID NO: 34) com complementaridade de polímero nucleotídeo a dC (seqüên- cia âncora) em 3'-terminal e iniciadores anti-sentido (GSP2), apresentados na Tabela 4. Além disso, os produtos obtidos por PCR foram utilizados como modelos. O cDNA foi amplificado pelo método de PCR aninhada (nested), empregando o primer AUAP (SEQ ID NO: 35) e iniciadores anti-sentido (GSP2), apresentados na Tabela 4. Além disso, os produtos da PCR foram purificados pelo método de agarose de baixo ponto de fusão (1,5%). Primer âncora para 5'RACE (SEQ ID NO: 34)

5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG Gll GGG IIG-3' (36-mero) Primer AUAP primer para 5'RACE (SEQ ID NO: 35) 5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3'(20-mero) A-4) Amplificação e fragmentação de cDNA codificador de região variável de cadeia leve de camundongo

O cDNA codificador de região variável de cadeia leve foi amplifi- cado a partir dos RNAs isolados, conforme descrito em A-2), da mesma ma- neira conforme descrita em A-3). As seqüências de bases de iniciadores en- tão utilizados são apresentadas na Tabela 5. Os produtos obtidos por PCR foram purificados pelo método de agarose de baixo ponto de fusão (1,5%). [Tabela 5]

Iniciadores utilizados para amplificação de um gene codificador de região variável de cadeia leve de camundongo

<table>table see original document page 75</column></row><table>

A-5) Confirmação de seqüência de bases de cDNA e determinação da regi- ão CDR

Uma região variável de cadeia pesada, obtida conforme descrito em A-3) e um fragmento de cDNA da região variável de cadeia leve, obtido conforme descrito em A-4) foram clonados no vetor pÇR4 Blunt-TOPO, utili- zando um kit à disposição no mercado "Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kif (Número de catálogo: 1325137, produzido por Invitrogen), de acordo com a instrução anexada ao kit, o qual foi, então, introduzido em células competen- tes de Escherichia eoli para fornecer Eseheriehia eoli transformante. O plas- mídeo mencionado acima foi obtido a partir do transformante e, em seguida, a seqüência de bases do cDNA no plasmídeo foi confirmada usando um se- qüenciador automático de DNA1 "Analisador Genético ABI PRISM 3100, ba- • seado em PCR" (fabricado por Applied Biosystems). Seqüências corretas foram extraídas por exclusão de transcritos obtidos de RNA inativo, decor- rente de deslocamento de estrutura e mutações sem sentido em torno da região determinante de complementaridade (a seguir referida como "região CDR"). Além disso, a homologia da seqüência de bases do cDNA seqüência de bases, contido no plasmídeo, foi comparada ao banco de dados Kabat, e seqüências da região CDR e a região variável, nas respectivas regiões vari- áveis, foram determinadas. Ademais, quanto ao hibridoma ne 37 produzido no Exemplo 4, seqüências da região CDR e da região variável em regiões variáveis foram determinadas no mesmo procedimento, conforme descrito em A-1) a A-5) do Exemplo 6, usando o hibridoma nQ 17. Seqüências de ba- ses do cDNA das regiões variáveis da cadeia pesada e regiões variáveis da cadeia leve dos anticorpos monoclonais anti-ILT7, produzidas por cada hi- bridoma, e seqüências de aminoácidos codificadas pelas seqüências são apresentadas nas seguintes SEQ ID NOs.

Região variável de cadeia pesada Região variável de cadeia leve

n°11 SEQ ID NO: 38 SEQ ID NO: 40 (seqüência de bases) (seqüência de bases)

SEQ ID NO: 39 SEQ ID NO: 41 (seqüência de aminoácidos) (seqüência de aminoácidos)

n°17 SEQ ID NO: 42 SEQ ID NO: 44 (seqüência de bases) (seqüência de bases)

SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 45 (seqüência de aminoácidos) (seqüência de aminoácidos)

n°37 SEQ ID NO: 46 SEQ ID NO: 48 (seqüência de bases) (seqüência de bases)

SEQ ID NO: 47 SEQ ID NO: 49 (seqüência de aminoácidos) (seqüência de aminoácidos)

Confirmação de isotipo de região constante

Quanto ao sobrenadante da cultura do hibridoma, o isotipo da região constante do anticorpo monoclonal produzido foi confirmado com um kit de isotipagem à disposição no mercado de anticorpo monoclonal de ca- mundongo (Número de catálogo: MMT1, produzido por Serotec Product). A região constante da cadeia pesada do anticorpo de camundongo anti-ILT7 humano n° 11 foi lgT3 e a região constante da cadeia leve foi IgK. Além dis- so, cada região constante da cadeia pesada anticorpo de camundongo anti- ILT7 humano n° 17 e anticorpo de camundongo anti-ILT7 humano n° 37 foi 1gγ2a e cada região constante da cadeia leve foi IgK.

Exemplo 7

Produção de anticorpos quiméricos

A. Clonagem de cDNA codificador de região constante de IgG humana

A região constante da cadeia pesada da IgG1 humana e a regi- ão constante da cadeia leve da Ig kapa humana foram selecionadas da bibli- oteca de cDNA de IPCs humanas. Em seguida, as regiões selecionadas fo- ram clonadas no vetor pCR4 BIunt-TOPO com um kit à disposição no mer- cado "Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kif (Número de catálogo: 1325137, produzido por Invitrogen), de acordo com a instrução anexada ao kit, o qual foi, então, introduzido em células competentes de Escherichia coli para for- necer Escherichia coli transformante. O plasmídeo mencionado acima foi obtido a partir do transformante e, em seguida, a seqüência de bases do cDNA no plasmídeo foi confirmada um seqüenciador automático de DNA, "Analisador Genético ABI PRISM 3100, baseado em PCR" (fabricado por Applied Biosystems).

B. Ligação de região variável com região constante e clonagem

O cDNA codificador da região constante de cadeia pesada obti- do conforme descrito em A, e o cDNA codificador da região variável da ca- deia pesada obtido conforme descrito em A-5 do Exemplo 6, foram utilizados respectivamente. Os dois DNAs contêm uma região na qual uma seqüência de bases de DNA é sobreposta. Em seguida, DNA de fita dupla foi obtido pelo método de extensão de sobreposição, utilizando a região. O processo específico é descrito abaixo.

C-1) Preparo de cDNA codificador de cadeia pesada de anticorpo quimérico contra ILT7

O "plasmídeo com cDNA codificador de regiões variáveis da ca- 1 deia pesada de ne 11 e n- 17", obtido conforme descrito em A-5), foi digerido com as enzimas de restrição Notl e Xbal e purificado pelo método de gel de agarose (1,5%). Os produtos resultantes foram dissolvidos em cada tampão TE com a seguinte composição, de forma a ser preparada uma solução de 100 pmols/μl do fragmento de cDNA que codifica a região variável da cadeia pesada. Tampão TE: Tris-HCIaIOmM EDTA a 1 mM pH 7,5 a 8,0

Além disso, o "plasmídeo com cDNA codificador da região cons- tante da cadeia pesada", obtido conforme descrito em B, foi tratado da mes- ma maneira conforme descrito acima para preparar 100 pmol/μl de solução. Subseqüentemente, ambas as soluções são misturadas e, em seguida, as duas regiões de sobreposição foram hibridizadas, inicialmente mantendo-as a 70 °C por 10 minutos e, em seguida, a 37 °C por 5 minutos. Posteriormen- 5 te, o cDNA foi amplificado pelo método de PCR e o cDNA, digerido com as enzimas de restrição Notl e Xbal e purificado pelo método de gel de agarose de baixo ponto de fusão (1,5%).

C-2) Preparo de cDNA codificador de cadeia leve de anticorpo quimérico contra ILT7

O cDNA codificador da região constante da cadeia leve, obtido conforme descrito em A, e o cDNA codificador da região variável da cadeia leve, obtido conforme descrito em A-5 do Exemplo 6, foram utilizados res- pectivamente. O cDNA que codifica a cadeia leve do anticorpo quimérico contra ILT7 foi obtido da mesma maneira conforme descrito em C-1), em- pregando estes cDNAs.

C-3) Clonagem

O cDNA obtido conforme descrito em Ç-1) foi clonado no vetor de plasmídeo pcDNA3.1-Zeocina (produzido por Invitrogen), empregando Notl e Xbal como sítios de clonagem, de forma a produzir um vetor de ex- pressão de cadeia pesada do anticorpo quimérico contra ILT7. Além disso, o cDNA obtido conforme descrito em C-2) foi clonado no vetor de plasmídeo pcDNA3.1-higromicina (produzido por Invitrogen), empregando Notl e Xbal como sítios de clonagem a fim de ser produzido vetor de expressão de ca- deia leve do anticorpo quimérico contra ILT7. Os nomes de cada vetor são apresentados na Tabela 6.

[Tabela 6]

Nomes de vetores de plasmídeos

<table>table see original document page 78</column></row><table> D. Expressão do anticorpo quimérico contra ILT7

D-1) Transformação transitória

1 μg do vetor de expressão da cadeia pesada do anticorpo qui- mérico contra ILT7 e 1 μg do vetor de expressão da cadeia leve do anticorpo quimérico contra ILT7, obtidos conforme descrito em C-3), foram co- transfectados em células 293T, utilizando o kit de transfecção effectine (Nú- mero de catálogo: 301427, produzido por Qiagen). Posteriormente, os produ- tos resultantes foram cultivados a 37°C com meio de cultura DMEM suple- mentado com 2% de FBS com baixa concentração de IgG1 contendo a com- posição seguinte.

Meio de cultura DMEM suplementado com 2% de FBS com baixa concentra- ção de IgG:

Meio de cultura DMEM (Número de catálogo: D5796, produzido por Sigma) FBS a 2% com baixa concentração de IgG (Número de catálogo:

SH30151.03, produzido por HyCIone)

L-Glutamina a 2 mM

100 U/ml de Penicilina

100 μg/ml de Estreptomicina

pH 7,2 a pH 7,4

Após introdução de vetores, o meio resultante foi cultivado por 96 horas e o sobrenadante da cultura foi coletado. Em seguida, os fragmen- tos de células foram retirados por centrifugação, fornecendo uma solução não purificada de anticorpos.

D-2) Transformação por homeostase

1 μg do vetor de expressão da cadeia pesada do anticorpo qui- mérico contra ILT7 e 1 μg of do vetor de expressão da cadeia leve do anti- corpo quimérico contra ILT7, obtidos conforme descrito em C-3), foram co- transfectados em células YB 2/0 (células derivadas de mieloma de rato, ATCC#CRL-1622) utilizando o kit de transfecção effectine (Número de catá- logo: 301427, produzido por Qiagen). Entre os vetores de plasmídeos utili- zados, o vetor para a expressão da cadeia pesada é um marcador para re- sistência à Zeocina, e o vetor para a expressão da cadeia leve é um marca- dor para resistência à higromicina. Por conseguinte, células nas quais am- bos os vetores foram introduzidos podem ser cultivadas em meio de cultura ao qual Zeocina e higromicina são acrescentadas ao mesmo tempo. Em se- guida, as células foram cultivadas em meio de cultura RPMI1 ao qual Zeocina e higromicina foram acrescentadas e uma cepa resistente foi selecionada. Meio de cultura RPMI suplementado com Zeocina e higromicina: Meio de cultura RPMI1640 (Número de catálogo: R8758, produzido por Sig- ma)

FBS a 10%

HEPES a 0,01 M (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfônico)

Piruvato de sódio a 1 mM

L-Glutamina a 2 mM

100 U/ml de Penicilina

100 μg/ml de Estreptomicina

2-mercaptoetanol a 55 μΜ

0,5 mg/ml de Zeocina

0,5 mg/ml de Higromicina

pH 7,2 a pH 7,4

Três dias depois, a quantidade de anticorpo produzido no sobre- nadante da cultura foi determinada pelo método ELISA. A linhagem celular produtora de anticorpo quimérico contra ILT7, em nível alto de expressão, e células que aumentaram suficientemente foram selecionadas. Ademais, uma única clonagem das linhagens celulares selecionadas foi conduzida, pelo método com classificador de células, para serem obtidas as seguintes Iinha- gens celulares.

Linhagem de célula produtora de anticorpo quimérico contra ILT7 n9 11: Li- nhagem celular n- 11 -5 e linhagem celular nQ 11-16

Linhagem de célula produtora de anticorpo quimérico contra ILT7 ns 17: Li- nhagem celular ne 17-24

As linhagens celulares mencionadas acima (linhagem celular ns 11-5, linhagem celular n9 11-16 e linhagem celular n9 17-24) foram cultiva- das, respectivamente, em meio de cultura RPMI suplementado com 5% de FBS com a composição seguinte. A temperatura de incubação e o tempo de incubação foram estabelecidos para 37°C e 96 horas, respectivamente. Meio de cultura RPMI suplementado com FBS a 5%: Meio de cultura RPM11640 (Número de catálogo: R8758S, produzido por Sigma) FBS a 5% HEPES a 0,01 M Piruvato de sódio a 1 mM L-Glutamina a 2 mM 100 U/ml de Penicilina 100 μg/ml de Estreptomicina 2-mercaptoetanol a 55 μΜ pH 7,2 a pH 7.4

O sobrenadante da cultura foi coletado e, em seguida, fragmen- tos de células foram retirados por centrifugação, fornecendo uma solução não purificada de anticorpos. E. Purificação de anticorpos

Cada solução não purificada de anticorpos, obtidas conforme descrito em D-1 e D-2 foram purificadas por coluna de afinidade por proteína A (rProtein A Sefarose FF, Número de catálogo: 17-1279-01, fabricada por Amershram Pharmacia). As condições da purificação são indicadas abaixo. A purificação por afinidade foi conduzida, utilizando tampão PBS (-) com a composição seguinte,, como tampão de adsorção, e tampão citrato de sódio a 0,1 M, como tampão de eluição, de acordo com o manual de instrução a- nexado. Tris-HCl a 1 M (pH 8,0) foi acrescentado às frações eluídas para ajustar o pH em torno de 7,2. As ODs, em comprimento de onda de 450 a 620 nm, foram medidas e, em seguida, cavidades exibindo reação positiva foram selecionadas. Com referência à concentração de anticorpos purifica- dos, a absorvência a 280 nm foi determinada e calculada com base em 1,38 OD/mg/ml. Na Tabela 7, foram resumidas as relações entre anticorpos qui- méricos contra ILT7 obtidos, os hibridomas dos quais o gene da região vari- ável foi derivado e as células hospedeiras. Tampão PBS (-):

0,2 g/l de fosfato dihidrogênio monopotássico 0,2 g/l de cloreto de potássio 8 g/l de cloreto de sódio 1,15g/l de fosfato monohidrogênio sódico anidro

[Tabela 7]

Anticorpos quiméricos produzidos

<table>table see original document page 82</column></row><table>

Seqüências de bases de cDNA e seqüências de aminoácidos da cadeia pesada e da leve dos anticorpos quiméricos produzidos são apresen- tadas abaixo, respectivamente. Em cada seqüência de aminoácidos, a se- qüência de aminoácidos do N-terminal a -1 é uma seqüência do sinal e a seqüência de aminoácidos de 1 a C terminal é uma seqüência de aminoáci- dos de proteína madura. Ou seja, a cadeia pesada e a leve que constituem estes anticorpos quiméricos consistem na seqüência de aminoácidos de 1 a C terminal de cada uma das seguintes seqüências de aminoácidos. Cadeia leve

SEQ ID NO: 52 (seqüência de bases)

SEQ ID NO: 53 (seqüência de aminoácidos)

SEQ ID NO: 56 (seqüência de bases)

SEQ ID NO: 57 (seqüência de aminoácidos)

A presente invenção forneceu o imunogene útil na produção do anticorpo que reconhece especificamente ILT7 humano e o método para produção do anticorpo anti-ILT7, empregando o imunogene. O anticorpo que reconhece especificamente ILT7 humano da presente invenção reconhece especificamente ILT7 na presença da família ILT. Por conseguinte, o anti- corpo da presente invenção pode ser utilizado para detecção e isolamento do ILT7 humano. Por exemplo, a localização do ILT7 pode ser analisada também, utilizando-se o anticorpo da presente invenção. O ILT7 é conside- rado uma molécula estreitamente relacionada com a diferenciação e função de IPCs ou células dendríticas. Por conseguinte, o anticorpo que reconhece ILT7 com alta especificidade é útil para a análise da função de IPCs ou célu- las dendríticas. São conhecidas células de câncer semelhantes a IPC (com a característica de que BDCA-2 é expressa) (Chaper of L et al. Eur. J. Immu- nol. 34; 418-426, 2004, Maeda T et al., Int. J. Hematol. 81; 148-154, 2005). A confirmação da expressão do ILT7 nestas células pode permitir o diagnósti- co de câncer e um agente terapêutico.

No caso de doenças auto-imunes, por exemplo, é ressaltada a relação profunda entre IFN-α, produzido por IPCs, e o desenvolvimento de psoríase, uma doença de pele (Nestle FO et al., J. Exp. Med. 202, 135-143, 2005). Por conseguinte, a gravidade da psoríase pode ser examinada pela identificação de IPCs no tecido cutâneo de pacientes portadores de psoría-

Cadeia pesada n911 SEQ ID NO: 50

(seqüência de bases) SEQ ID NO: 51 (seqüência de aminoácidos)

n917 SEQ ID NO: 54 (seqüência de bases)

SEQ ID NO: 55 (seqüência de aminoácidos)

Aplicabilidade Industrial se, ou seja, o uso do anticorpo anti-ILT7 em amostras de biópsia.

Sabe-se que o desenvolvimento de AIDS em pacientes infecta- dos por HIV está correlacionado com o número de IPCs. A saber, um núme- ro alto de IPCs foi observado em pacientes que não exibem sintomas e a redução em IPCs foi observada no aparecimento (Soumells V. et al., Blood 98; 906-912, 2001). Por conseguinte, ele é eficaz para predizer o prognósti- co de infecção viral, como por HIV.

Por exemplo, o ILT7 é uma molécula expressa especialmente em IPCs humanas. Portanto, o anticorpo anti-ILT7 da presente invenção po- de ser utilizado para detectar, identificar ou isolar IPCs. IPCs são células que produzem a maior parte do interferon tipo 1. Portanto, a detecção, identifica- ção ou isolamento é um objetivo importante no diagnóstico e estudo de do- enças que envolvem interferon tipo 1. Conforme com estas doenças, várias doenças auto-imunes e infecções, nas quais o interferon está envolvido na criação da condição patológica, podem ser ilustradas.

Adicionalmente, o anticorpo anti-ILT7 da presente invenção pos- sui efeito inibidor sobre a atividade de IPCs. Por conseguinte, a atividade de IPCs pode ser inibida com o uso do anticorpo anti-ILT7 da presente inven- ção. Ademais, as doenças que envolvem interferon tipo 1 podem ser trata- das por inibição da atividade de IPCs. Especificamente, o anticorpo anti-ILT7 da presente invenção é útil para várias doenças auto-imunes e infecções nas quais interferon está envolvido na criação da condição patológica. Especial- mente, como o anticorpo anti-ILT7 possui alta especificidade, ele pode re- mover IPCs eficientemente. LISTAGEM DE SEQÜENCIA

<110> GINKGO BIOMEDICAL RESEARCH INSTITUTE CO., LTD.

<120> ANTICORPO ANTI-ILT7

<130> G2-A0501P

<150> JP 2005-366465

<151> 2005-12-20

<160> 76

<170> Versão 3.3 do programa Patentln

<210> 1

<211> 1577

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (24)..(1520)

<220>

<221> sig-peptideo <222> (24).. (71)

<220>

<221> mat_peptide . <222> (72)..(1520)

<400> 1

cagggccagg aggaggagat gcc atg acc ctc att ctc aca age ctg ctc ttc 53

Met Thr Leu Ile Leu Thr Ser Leu Leu Phe -15 -10

ttt ggg ctg age ctg ggc ccc agg acc cgg gtg cag gea gaa aac cta 101

Phe Gly Leu Ser Leu Gly Pro Arg Thr Arg Val Gln Ala Glu Asn Leu -5 -11 5 10

ccc aaa ccc ate ctg tgg gcc gag cca ggt ccc gtg ate acc tgg cat 149

Pro Lys Pro Ile Leu Trp Ala Glu Pro Gly Pro Val Ile Thr Trp His 15 .20 25

aaç ccc gtg ácc ate tgg tgt cag ggc acc ctg gag gcc cag ggg tac 197

Asn Pro Val Thr Ile Trp Cys Gln Gly Thr Leu Glu Ala Gln Gly Tyr 30 35 40

cgt ctg gat aaa gag gga aac tca atg tcg agg cac ata tta aaa aca 245

Arg Leu Asp Lys Glu Gly Asn Ser Met Ser Arg His Ile Leu Lys Thr 45 50 55

ctg gag tet gaa aac aag gtc aaa ctc tcc ate cca tcc atg atg tgg 293

Leu Glu Ser Glu Asn Lys Val Lys Leu Ser Ile Pro Ser Met Met Trp 60 65 70

gaa cat gea ggg cga tat cac tgt tac tat cag age cct gea ggc tgg 341

Glu His Ala Gly Arg Tyr His Cys Tyr Tyr Gln Ser Pro Ala Gly Trp 75 80 85 90

tca gag ccc age gac ccc ctg gag ctg gtg gtg aca gcc tac age aga 3 89

Ser Glu Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Thr Ala Tyr Ser Arg 95 100 105

ccc acc ctg tcc gea ctg cca age cct gtg gtg acc tca gga gtg aac 437

Pro Thr Leu Ser Ala Leu Pro Ser Pro Val Val Thr Ser Gly Val Asn 110 115 120

gtg acc ctc cgg tgt gcc tca cgg ctg gga ctg ggc agg ttc act ctg 485

Val Thr Leu Arg Cys Ala Ser Arg Leu Gly Leu Gly Arg Phe Thr Leu 125 130 135

att gag gaa gga gac cac agg ctc tcc tgg acc ctg aac tca cac caa 533

Ile Glu Glu Gly Asp His Arg Leu Ser Trp Thr Leu Asn Ser His Gln 140 145 150

cac aac cat gga aag ttc cag gcc ctg ttc ccc atg ggc ccc ctg acc 581

His Asn His Gly Lys Phe Gln Ala Leu Phe Pro Met Gly Pro Leu Thr 155 160 165 170

ttc age aac agg ggt aca ttc aga tgc tac ggc tat gaa aac aac acc 629

Phe Ser Asn Arg Gly Thr Phe Arg Cys Tyr Gly Tyr Glu Asn Asn Thr 175 180 185

cca tac gtg tgg tcg gaa ccc agt gac ccc ctg cag cta ctg gtg tca 677

Pro Tyr Val Trp Ser Glu Pro Ser Asp. Pro Leu Gln Leu Leu Val Ser 190 195 200

ggc gtg tet agg aag ccc tcc ctc ctg acc ctg cag ggc cet gtc gtg 725

Gly Val Ser Arg Lys Pro Ser Leu Leu Thr Leu Gln Gly Pro Val Val 205 210 215

acc ccc gga gag aat ctg acc ctc cag tgt ggc tet gat gtc ggc tac 773

Thr Pro Gly Glu Asn Leu Thr Leu Gln Cys Gly Ser Asp Val Gly Tyr 220 225 230

ate aga tac act ctg tac aag gag ggg gcc gat ggc ctc ccc cag cgc 821

Xle Arg Tyr Thr Leu Tyr Lys Glu Gly Ala Asp Gly Leu Pro Gln Arg 235 240 245 250

cct ggc cgg cag ccc cag gct ggg ctc tcc cag gcc aac ttc acc ctg 869

Pro Gly Arg Gln Pro Gln Ala Gly Leu Ser Gln Ala Asn Phe Thr Leu 255 260 265

age cct gtg age cgc tcc tac ggg ggc cag tac aga tgc tac ggc gea 917

Ser Pro Val Ser Arg Ser Tyr Gly Gly Gln Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala 270 275 280

cac aac gtc tcc tcc gag tgg tcg gcc ccc agt gac ccc ctg gac ate 965

His Asn Val Ser Ser Glu Trp Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile 285 290 295

ctg ate gea gga cag ate tet gac aga ccc tcc ctc tca gtg cag ccg 1013 Leu Ile Ala Gly Gln Ile Ser Asp Arg Pro Ser Leu Ser Val Gln Pro 300 305 310

ggc ccc acg gtg acc tca gga gag aag gtg acc ctg ctg tgt cag tca 1061 Gly Pro Thr Val Thr Ser Gly Glu Lys Val Thr Leu Leu Cys Gln Ser 315 320 325 330

tgg gac ccg atg ttc act ttc ctt ctg acc aag gag ggg gea gcc cat 1109 Trp Asp Pro Met Phe Thr Phe Leu Leu Thr Lys Glu Gly Ala Ala His 335 340 345

ccc ccg ttg cgt ctg aga tca atg tac gga gct cat aag tac cag gct 1157 Pro Pro Leu Arg Leu Arg Ser Met Tyr Gly Ala His Lys Tyr Gln Ala 350 355 360

gaa ttc ccc atg agt cct gtg acc tca gcc cac gcg ggg acc tac agg 1205 Glu Phe Pro Met Ser Pro Val Thr Ser Ala His Ala Gly Thr Tyr Arg 365 370 375

tgc tac ggc tca cgc age tcc aac ccc tac ctg ctg tet cac ccc agt 1253 Cys Tyr Gly Ser Arg Ser Ser Asn Pro Tyr Leu Leu Ser His Pro Ser 380 385 390

gag ccc ctg gag ctc gtg gtc tca gga gea act gag acc ctc aat cca 1301 Glu Pro Leu Glu Leu Val Val Ser Gly Ala Thr Glu Thr Leu Asn Pro 395 400 405 410

gea caa aag aag tca gat tcc aag act gcc cca cac ctc cag gat tac 1349 Ala Gln Lys Lys Ser Asp Ser Lys Thr Ala Pro His Leu Gln Asp Tyr 415 420 425

aca gtg gag aat ctc ate cgc atg ggt gtg gct ggc ttg gtc ctg ctg 1397 Thr Val Glu Asn Leu Ile Arg Met Gly Val Ala Gly Leu Val Leu Leu 430 435 440

ttc ctc ggg att ctg tta ttt gag gct cag cac age cag aga age ccc 1445 Phe Leu Gly Ile Leu Leu Phe Glu Ala Gln His Ser Gln Arg Ser Pro 445 450 455

cea agg tgc age cag gag gea aac age aga aag gac aat gea ccc ttc 1493 Pro Arg Cys Ser Gln Glu Ala Asn Ser Arg Lys Asp Asn Ala Pro Phe 460 465 470

aga gtg gtg gag cct tgg gaa cag ate tgatgatctg aggaggttct 1540

Arg Val Val Glu Pro Trp Glu Gln Ile 475 480

ggaagactgg ggcagcagtt ggggaagtgt ctgctga 1577

<210> 2

<211> 499

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Thr Leu Ile Leu Thr Ser Leu Leu Phe Phe Gly Leu Ser Leu Gly -15 -10 -5 -1

Pro Arg Thr Arg Val Gln Ala Glu Asn Leu Pro Lys Pro Ile Leu Trp 1 5 10 15

Ala Glu Pro Gly Pro Val Ile Thr Trp His Asn Pro Val Thr Ile Trp 20 25 30

Cys Gln Gly Thr Leu Glu Ala Gln Gly Tyr Arg Leu Asp Lys Glu Gly 35 40 45

Asn Ser Met Ser Arg His Ile Leu Lys Thr Leu Glu Ser Glu Asn Lys 50 55 60

Val Lys Leu Ser Ile Pro Ser Met Met Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr 65 70 75 80

His Cys Tyr Tyr Gln Ser Pro Ala Gly Trp Ser Glu Pro Ser Asp Pro 85 90 95

Leu Glu Leu Val Val Thr Ala Tyr Ser Arg Pro Thr Leu Ser Ala Leu 100 105 110

Pro Ser Pro Val Val Thr Ser Gly Val Asn Val Thr Leu Arg Cys Ala 115 120 125

Ser Arg Leu Gly Leu Gly Arg Phe Thr Leu Ile Glu Glu Gly Asp His 130 135 140

Arg Leu Ser Trp Thr Leu Asn Ser His Gln His Asn His Gly Lys Phe 145 150 155 160

Gln Ala Leu Phe Pro Met Gly Pro Leu Thr Phe Ser Asn Arg Gly Thr 165 170 175

Phe Arg Cys Tyr Gly Tyr GlU Asn Asn Thr Pro Tyr Val Trp Ser Glu 180 185 190 Pro Ser Asp Pro Leu Gln Leu Leu Val Ser Gly Val Ser Arg Lys Pro 195 200 205

Ser Leu Leu Thr Leu Gln Gly Pro Val Val Thr Pro Gly Glu Asn Leu 210 215 220

Thr Leu Gln Cys Gly Ser Asp Val Gly Tyr Ile Arg Tyr Thr Leu Tyr 225 230 235 240

Lys Glu Gly Ala Asp Gly Leu Pro Gln Arg Pro Gly Arg Gln Pro Gln 245 250 255

Ala Gly Leu Ser Gln Ala Asn Phe Thr Leu Ser Pro Val Ser Arg Ser 260 265 270

Tyr Gly Gly Gln Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala His Asn Val Ser Ser Glu 275 280 285

Trp Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Ala Gly Gln Ile 290 295 300

Ser Asp Arg Pro Ser Leu Ser Val Gln Pro Gly Pro Thr Val Thr Ser 305 .310 315 320

Gly Glu Lys Val Thr Leu Leu Cys Gln Ser Trp Asp Pro Met Phe Thr 325 330 335

Phe Leu Leu Thr Lys Glu Gly Ala Ala His Pro Pro Leu Arg Leu Arg 340 345 .350

Ser Met Tyr Gly Ala His Lys Tyr Gln Ala Glu Phe Pro Met Ser Pro 355 360 365

Val Thr Ser Ala His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Arg Ser 370 375 380

Ser Asn Pro Tyr Leu Leu Ser His Pro Ser Glu Pro Leu Glu Leu Val 385 390 395 400

Val Ser Gly Ala Thr Glu Thr Leu Asn Pro Ala Gln Lys Lys Ser Asp 405 410 415

Ser Lys Thr Ala Pro His Leu Gln Asp Tyr Thr Val Glu Asn Leu Ile 420 425 430.

Arg Met Gly Val Ala Gly Leu Val Leu Leu Phe Leu Gly Ile Leu Leu 435 440 445

Phe Glu Ala Gln His Ser Gln Arg Ser Pro Pro Arg Cys Ser Gln Glu 450 455 460

Ala Asn Ser Arg Lys Asp Asn Ala Pro Phe Arg Val Val Glu Pro Trp 465 470 475 480

Glu Gln Ile <210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência de primer sintetizado artificialmente

<400> 3

ctccaacccc tacctgctgt c

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência de primer sintetizado artificialmente

<400> 4

ttcccaaggc tccaccactc t

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência de primer sintetizado artificialmente

<400> 5

cctcaatcca gcacaaaaga agt

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência de primer sintetizado artificialmente

<400> 6

cggatgagat tctccactgt gtaa

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência de primer sintetizado artificialmente

<400> 7

ccacccatgg caaattcc

<210> 8

<211> 22

< 212 > DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência de primer sintetizado artificialmente

<400> 8

tgggatttcc attgatgaca ag <210> 9

<21Χ> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência de primer sintetizado artificialmente

<400> 9

cagggccagg aggaiggagat g

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência de primer sintetizado artificialmente

<400> 10

tcagcagaca cttccccaac t

<210> 11

<211> 105

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência de primer sintetizado artificialmente <400> 11

ccgctcgaga tgaccctcat tctcacaagc ctgctcttct ttgggctgag cctgggcgat tacaaggatg acgacgataa gcccaggacc cgggtgcagg cagaa

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência de primer sintetizado artificialmente

<400> 12

ctagactagt tcagatctgt tcccaaggct c

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência de primer sintetizado artificialmente

<400> 13

ccgctcgaga tgaccctcat tctcacaagc

<210> 14

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência de primer sintetizado artificialmente

<400> 14

ctagactagt tcacttatcg tcgtcatcct tgtaatcgat ctgttcccaa ggctc

<210> 15 <211> 313 <212> DNA <213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS <222> (7).. (267)

<400> 15

cccaag atg att cca gca gtg gtc ttg ctc tta ctc ctt ttg gtt gaa

Met Ile Pro Ala Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Glu 1 5 10

caa gca gcg gcc ctg gga gag cct cag ctc tgc tat ate ctg gat gcc Gln Ala Ala Ala Leu Gly Glu Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu Asp Ala 15 20 25 30

ate ctg ttt ctg tat gga att gtc ctc acc ctc ctc tac tgt cga ctg Ile Leu Phe Leu Tyr Gly Ile Val Leu Thr Leu Leu Tyr Cys Arg Leu 35 40 45

aag ate caa gtg cga aag gca gct ata acc age tat gag aaa tca gat Lys Ile Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys Ser Asp 50 55 60

ggt gtt tac acg ggc ctg age acc agg aac cag gag act tac gag act Gly Val Tyr Thr Gly Lèu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr Glu Thr 65 70 75

ctg aag cat gag aaa cca cca cag tag ctttagaata gatgcggtca Leu Lys His Glu Lys Pro Pro Gln 80 85

tattcttctt tggcttctgg ttcttc

<210> 16

<211> 86

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

Met Ile Pro Ala Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Lèu Val Glu Gln Ala 1 5 10 15

Ala Ala Leu Gly Glu Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu Asp Ala Ile Leu 20 25 30

Phe Leu Tyr Gly Ile Val I^eu Thr Leu Leu Tyr Cys Arg. Leu Lys Ile 35 40 45

Gln Val Arg Lys Alá Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys Ser Asp Gly Val 50 55 60

Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys 65 70 75 80

His Glu Lys Pro Pro Gln 85

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência de primer sintetizado artificialmente <400> 17

cccaagatga ttccagcagt g

18 21 DNA

Artificial <220>

<223> seqüência de primer sintetizado artificialmente <400> 18

ggaagaacca gaagccaaag a

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência de primer sintetizado artificialmente

<400> 19

ccgctcgaga tgattccagc agtggtcttg

<210> 20

<211> 61

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência de primer sintetizado artificialmente

<400> 20

ctagactagt ctacagatcc tcttcagaga tgagtttctg ctcctgtggt ggtttctcat

<210> <211> <212> <213>

<210> 21

<211> 23

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência de peptídeos sintetizada artificialmente

<400> 21

Cys Ser Gln Glu Ala Asn Ser Arg Lys Asp Asn Ala Pro Phe Arg Val 1 5 10 15

Val Glu Pro Trp Glu Gln Ile 20

<210> 22

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência de primer sintetizado artificialmente

<400> 22

ccgctcgaga tgacccccat cctcacggtc c

<210> 23 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial

<220>

<223> seqüência de priraer sintetizado artificialmente <400> 23

ctagactagt tcacttatcg tcgtcatcct tgtaatccct cccggctgca tcttg 55

<210> 24

<211> 1425

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS <222> (1)..(1425)

<400> 24

atg acc ccc ate ctc' acg gtc ctg ate tgt etc ggg ctg agt ctg ggc 48

Met Thr Pro Ile Léu Thr Val Leu Ile Cys Leu Gly Leu Ser Leu Gly 1 5 10 15

ccc agg acc cac gtg cag gea ggg cac ctc ccc aag ccc acc ctc tgg 96

Pro Arg Thr His Val Gln Ala Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp 20 25 30

gct gag cca ggc tet gtg ate ate cag gga agt cct gtg acc ctc agg 144

Ala Glu Pro Gly Ser Val Ile Ile Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg 35 40 45

tgt cag ggg age ctt cag gct gag gag tac cat cta tat agg gaa aac 192

Cys Gln Gly Ser Leu Gln Ala Glu Glu Tyr His Leu Tyr Arg Glu Asn 50 55 60

aaa tca gea tcc tgg gtt aga cgg ata caa gag cct ggg aag aat ggc 240

Lys Ser Ala Ser Trp Val Arg Arg Ile Gln Glu Pro Gly Lys Asn Gly 65 70 75 80

cag ttc ccc ate cca tcc ate acc tgg gaa cac gea ggg cgg tat cac 288

Gln Phe Pro Ile Pro Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr His 85 90 95

tgt cag tac tac age cac aat cac tca tca gag tac agt gac ccc ctg 336

Cys Gln Tyr Tyr Ser His Asn His Ser Ser Glu Tyr Ser Asp Pro Leu 100 105 110

gag ctg gtg gtg aca gga gcc tac age aaa ccc acc ctc tca gct ctg 384

Glu Leu Val Val Thr Gly Ala Tyr Ser Lys Pro Thr Leu Ser Ala Leu 115 120 125

ccc age cct gtg gtg acc tta gga ggg aac gtg acc ctc cag tgt gtc 432

Pro Ser Pro Val Val Thr Leu Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Val 130 135 140

tca cag gtg gea ttt gac ggc ttc att ctg tgt aag gaa gga gaa gat 480

Ser Gln Val Ala Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp 145 150 155 160

gaa cac cca caa cgc ctg aac tcc cat tcc cat gcc cgt ggg tgg tcc 528

Glu His Pro Gln Arg Leu Asn Ser His Ser His Ala Arg Gly Tirp Ser 165 170 175

tgg gcc ate ttc tcc gtg ggc ccc gtg age ccg agt cgc agg tgg tcg 576

Trp Ala Ile Phe Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Ser 180 185 190

tac agg tgc tat gct tat gac tcg aac tet ccc tat gtg tgg tet cta 624

Tyr Arg Cys Tyr Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Val Trp Ser Leu 195 200 205

ccc agt gat ctc ctg gag ctc ctg gtc cca ggt gtt tet aag aag cca Pro Ser Asp Leu Leu Glu Leu Leu Val Pro Gly Val Ser Lys Lys Pro

672 210 215 220

tca ctc tca gtg cag cca ggt cct atg gtg gcc cct ggg gag age ctg 720

Ser Leu Ser Val Gln Pro Gly Pro Met Val Ala Pro Gly Glu Ser Leu 225 230 235 240

acc ctc cag tgt gtc tet gat gtc ggc tac gac aga ttt gtt ctg tat 768

Thr Leu Gln Cys Val Ser Asp Val Gly Tyr Asp Arg Phe Val Leu Tyr 245 250 255

aag gag gga gaa cgt gac ttc ctc cag cgc cct ggt tgg cag ccc cag 816

Lys Glu Gly Glu Arg Asp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Trp Gln Pro Gln 260 265 270

gct ggg ctc tcc cag gcc aac ttc acc ctg ggc cct gtg age ccc tcc 864

Ala Gly Leu Ser Gln Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser Pro Ser 275 280 285

cac ggg ggc cag tac aga tgc tac agt gea cac aac ctc tcc tcc gag 912

His Gly Gly Gln Tyr Arg Cys Tyr Ser Ala His Asn Leu Ser Ser Glu 290 295 300

tgg tcg gcc ccc agt gac ccc ctg gac ate ctg ate aca gga cag ttc 960

Trp Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Thr Gly Gln Phe 305 310 315 320

tat gac aga ccc tet ctc tcg gtg cag ccg gtc ccc aca gta gcc cca 1008

Tyr Asp Arg Pro Ser Leu Ser Val Gln Pro Val Pro Thr Val Ala Pro 325 330 335

gga aag aac gtg acc ctg ctg tgt cag tca cgg ggg cag ttc cac act 1056

Gly Lys Asn Val Thr Leu Leu Cys Gln Ser Arg Gly Gln Phe His Thr 340 345 350

ttc ctt ctg acc aag gag ggg gea ggc cat ccc cca ctg cat ctg aga 1104 Phe Leu Leu Thr Lys Glu Gly Ala Gly His Pro Pro Leu His Leu Arg 355 360 365

tca gag cac caa gct cag cag aac cag gct gaa ttc cgc atg ggt cct 1152 Ser Glu His Gln Ala Gln.Gln Asn Gln Ala Glu Phe Arg Met Gly Pro 370 375 380

gtg acc tca gcc cac gtg ggg acc tac aga tgc tac age tca ctc age 1200 Val Thr Ser Ala His Val Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Ser Ser Leu Ser 385 390 395 400

tcc aac ccc tac ctg ctg tet ctc ccc agt gac ccc ctg gag ctc gtg 1248 Ser Asn Pro Tyr Leu Leu Ser Leu Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val 405 410 415

gtc tca gea tcc cta ggc caa cac ccc cag gat tac aca gtg gag aat 1296 Val Ser Ala Ser Leu Gly Gln His Pro Gln Asp Tyr Thr Val Glu Asn 420 425 430

ctc ate cgc atg ggt gtg gct ggc ttg gtc ctg gtg gtc ctc ggg att 1344 Leu Ile Arg Met Gly Val Ala Gly Leu Val Leu Val Val Leu Gly Ile 435 440 445

ctg cta ttt gag gct cag cac age cag aga age cta caa gat gea gcc 1392 Leu Leu Phe Glu Ala Gln His Ser Gln Arg Ser Leu Gln Asp Ala Ala 450 455 460

ggg agg gat tac aag gat gac gac gat aag tga 1425

Gly Arg Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 465 470

<210> 25

<211> 474

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

Met Thr Pro Ile Leu Thr Val Leu Ile Cys Leu Gly Leu Ser Leu Gly 1 5 10 15

Pro Arg Thr His Val Gln Ala Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp 20 25 30

Ala Glu Pro Gly Ser Val Ile Ile Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg 35 40 45

Cys Gln Gly Ser Leu Gln Ala Glu Glu Tyr His Leu Tyr Arg Glu Asn . 50 55 60

Lys Ser Ala Ser Trp Val Arg Arg Ile Gln Glu Pro Gly Lys Asn Gly 65 70 75 80

Gln Phe Pro Ile Pro Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr His 85 90 95

Cys Gln Tyr Tyr Ser His Asn His Ser Ser Glu Tyr Ser Asp Pro Leu 100 105 110

Glu Leu Val Val Thr Gly Ala Tyr Ser Lys Pro Thr Leu Ser Ala Leu 115 120 125

Pro Ser Pro Val Val Thr Leu Gly Gly Asn Val Thr Leu.Gln Cys Val 130 135 140

Ser Gln Val Ala Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp 145 150 155 160

Glu His Pro Gln Arg Leu Asn Ser His Ser His Ala Arg Gly Trp Ser ■ 165 170 175

Trp Ala Ile Phe Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Ser 180 185 190

Tyr Arg Cys Tyr Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Val Trp Ser Leu 195 200 205

Pro Ser Asp Leu Leu Glu Leu Leu Val Pro Gly Val Ser Lys Lys Pro 210 215 220

Ser Leu Ser Val Gln Pro Gly Pro Mef Val Ala Pro Gly Glu Ser Leu 225 230 235 240

Thr Leu Gln Cys Val Ser Asp Val Gly Tyr Asp Arg Phe Val Leu Tyr 245 250 255

Lys Glu Gly Glu Arg Asp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Trp Gln Pro Gln 260 265 270

Ala Gly Leu Ser Gln Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser Pro Ser 275 280 285

His Gly Gly Gln Tyr Arg Cys Tyr Ser Ala His Asn Leu Ser Ser Glu 290 295 300 Trp Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Thr Gly Gln Phe 305 310 315 320

Tyr Asp Arg Pro Ser Leu Ser Val Gln Pro Val Pro Thr Val Ala Pro 325 330 335

Gly Lys Asn Val Thr Leu Leu Cys Gln Ser Arg Gly Gln Phe His Thr 340 345 350

Phe Leu Leu Thr Lys Glu Gly Ala Gly His Pro Pro Leu His Leu Arg 355 360 365

Ser Glu His Gln Ala Gln Gln Asn Gln Ala Glu Phe Arg Met Gly Pro 370 375 380

Val Thr Ser Ala His Val Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Ser Ser Leu Ser 385 390 395 400

Ser Asn Pro Tyr Leu Leu Ser Leu Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val 405 410 415

Val Ser Ala Ser Leu Gly Gln His Pro Gln Asp Tyr Thr Val Glu Asn 420 425 430

Leu Ile Arg Met Gly Val Ala Gly Leu Val Leu Val Val Leu Gly Ile 435 440 445

Leu Leu Phe Glu Ala Gln His Ser Gln Arg Ser Leu Gln Asp Ala Ala 450 455 460

Gly Arg Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 465 470

<210> 26

<211> 1953

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS <222> (1)..(1953)

<400> 26

atg acc ccc ate ctc acg gtc ctg ate tgt ctc ggg ctg agt ctg ggc 48

Met Thr Pro Ile Leu Thr Val Leu Ile Cys Leu Gly Leu Ser Leu Gly 1 5 10 15

ccc cgg acc cac gtg cag gea ggg cac ctc ccc aag ccc acc ctc tgg 96

Pro Arg Thr His Val Gln Ala Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp 20 25 30

gct gaa cca ggc tet gtg ate acc cag ggg agt cct gtg acc ctc agg 144

Ala Glu Pro Gly Ser Val Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg 35 40 45

tgt cag ggg ggc cag gag acc cag gag tac cgt cta tat aga gaa aag 192

Cys Gln Gly Gly Gln Glu Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys 50 55 60

aaa aca gea ccc tgg att aca cgg ate cca cag gag ctt gtg aag aag 240

Lys Thr Ala Pro Trp Ile Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys 65 70 75 80 ggc cag ttc ccc ate cca tcc ate acc tgg gaa cat gea ggg cgg tat 288

Gly Gln Phe Pro Ile Pro Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr 85 90 95

cgc tgt tac tat ggt age gac act gea ggc cgc tca gag age agt gac 336

Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser Asp Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp 100 105 110

ccc ctg gag ctg gtg gtg. aca gga gcc tac ate aaa ccc acc ctc tca 384

Pro Leu Glu Leu Val Val Thr Gly Ala Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser 115 120 125

gcc cag ccc age ccc gtg gtg aac tca gga ggg aat gta acc ctc cag 432

Ala Gln Pro Ser Pro Val Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln 130 135 140

tgt gac tca cag gtg gea ttt gat ggc ttc att ctg tgt aag gaa gga 480

Cys Asp Ser Gln Val Ala Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly 145 150 155 160

gaa gat gaa cac cca caa tgc ctg aac tcc cag ccc cat gcc cgt ggg 528

Glu Asp Glu His Pro'Gln Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly 165 170 175

tcg tcc cgc gcc ate ttc tcc gtg ggc ccc gtg age ccg agt cgc agg 576

Ser Ser Arg Ala Ile Phe Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg 180 185 190

tgg tgg tac agg tgc tat gct tat gac tcg aac tet ccc tat gag tgg 624

Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp 195 200 205

tet cta ccc agt gat ctc ctg gag ctc ctg gtc cta ggt gtt tet aag 672

Ser Leu Pro Ser Asp Leu Leu Glu Leu Leu Val Leu Gly Val Ser Lys 210 215 220

aag cca tca ctc tca gtg cag cca ggt cct ate gtg gcc cct gag gag 720

Lys Pro Ser Leu Ser Val Gln Pro Gly Pro Ile Val Ala Pro Glu Glu 225 230 235 240

acc ctg act ctg cag tgt ggc tet gat gct ggc tac aac aga ttt gtt 768

Thr Leu Thr Leu Gln Cys Gly Ser Asp Ala Gly Tyr Asn Arg Phe Val 245 250 255

ctg tat aag gac ggg gaa cgt gac ttc ctt cag ctc gct ggc gea cag 816

Leu Tyr Lys Asp Gly Glu Arg Asp Phe Leu Gln Leu Ala Gly Ala Gln 260 . 265 270

ccc cag gct ggg ctc tcc cag gcc aac ttc acc ctg ggc cct gtg age 864

Pro Gln Ala Gly Leu Ser Gln Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser 275 280 285

cgc tcc tac ggg ggc cag t,ac aga tgc tac ggt gea cac aac ctc tcc 912

Arg Ser Tyr Gly Gly Gln Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala His Asn Leu Ser 290 295 300

tcc gag tgg tcg gcc ccc age gac ccc ctg gac ate ctg ate gea gga 960

Ser Glu Trp Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Ala Gly 305 310 315 320

cag ttc tat gac aga gtc tcc ctc tcg gtg cag ccg ggc ccc acg gtg 1008 Gln Phe Tyr Asp Arg Val Ser Leu Ser Val Gln Pro Gly Pro Thr Val 325 330 335

gcc tca gga gag aac gtg acc ctg ctg tgt cag tca cag gga tgg atg 1056 Ala Ser Gly Glu Asn Val Thr Leu Leu Cys Gln Ser Gln Gly Trp Met 340 345 350

caa act ttc ctt ctg acc aag gag ggg gea gct gat gac cca tgg cgt 1104 Gln Thr Phe Leu Leu Thr Lys Glu Gly Ala Ala Asp Asp Pro Trp Arg 355 360 365

cta aga tca acg tac caa tet caa aaa tac cag gct gaa ttc ccc atg 1152 Leu Arg Ser Thr Tyr Gln Ser Gln Lys Tyr Gln Ala Glu Phe Pro Met 370 375 380 ggt cct gtg acc tca gcc cat gcg ggg acc tac agg tgc tac ggc tca 1200 Gly Pro Val Thr Ser Ala His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser 385 390 395 400

cag age tcc aaa ccc tac ctg ctg act cac ccc agt gac ccc ctg gag 1248 Gln Ser Ser Lys Pro Tyr Leu Leu Thr His Pro Ser Asp Pro Leu Glu 405 410 415

ctc gtg gtc tca gga ccg tet ggg ggc ccc age tcc ccg aca aca ggc 1296 Leu Val Val Ser Gly Pro Ser Gly Gly Pro Ser Ser Pro Thr Thr Gly 420 425 430

ccc acc tcc aca tet ggc cct gag gac cag ccc ctc acc ccc acc ggg 1344 Pro Thr Ser Thr Ser Gly Pro Glu Asp Gln Pro Leu Thr Pro Thr Gly 435 440 445

tcg gat ccc cag agt ggt ctg gga agg cac ctg ggg gtt gtg ate ggc 1392 Ser Asp Pro Gln Ser Gly Leu Gly Arg His Leu Gly Val Val Ile Gly 450 455 460

ate ttg gtg gcc gtc ate cta ctg ctc ctc ctc ctc ctc ctc ctc ttc 1440 Ile Leu Val Ala Val Ile Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe 465 470 475 480

ctc ate ctc cga cat cga cgt cag ggc aaa cac tgg aca tcg acc cag 1488 Leu Ile Leu Arg His Arg Arg Gln Gly Lys His Trp Thr Ser Thr Gln 485 490 495

aga aag gct gat ttc caa cat cct gea ggg gct gtg ggg cca gag ccc 1536 Arg Lys Ala Asp Phe Gln His Pro Ala Gly Ala Val Gly Pro Glu Pro 500 505 510

aca gac aga ggc ctg cag tgg agg tcc age cca gct gcc gat gcc cag 1584 Thr Asp Arg Gly Leu Gln Trp Arg Ser Ser Pro Ala Ala Asp Ala Gln 515 520 525

gaa gaa aac ctc tat gct gcc gtg aag cac aca cag cct gag gat ggg 1632 Glu Glu Asn Leu Tyr Ala Ala Val Lys His Thr Gln Pro Glu Asp Gly 530 535 540

gtg gag atg gac act cgg age cca cac gat gaa gac ccc cag gea gtg 1680 Val Glu Met Asp Thr Arg Ser Pro His Asp Glu Asp Pro Gln Ala Val 545 550 555 560

acg tat gcc gag gtg aaa cac tcc aga cct agg aga gaa atg gcc tet 1728 Thr Tyr Ala Glu Val Lys His Ser Arg Pro Arg Arg Glu Met Ala Ser 565 570 575

cct cct tcc cca ctg tet ggg gaa ttc ctg gac aca aag gac aga cag 1776 Pro Pro Ser Pro Leu Ser Gly Glu Phe Leu Asp Thr Lys Asp Arg Gln 580 585 590

gcg gaa gag gac agg cag atg gac act gag gct gct gea tet gaa gcc 1824 Ala Glu Glu Asp Arg Gln Met Asp Thr Glu Ala Ala Ala Ser Glu Ala 595 600 605

ccc cag gat gtg acc tac gcc cag ctg cac age ttg acc ctt aga cgg 1872 Pro Gln Asp Val Thr Tyr Ala Gln Leu His Ser Leu Thr Leu Arg Arg 610 615 620

aag gea act gag cct cct cca tcc cag gaa ggg ccc tet cca gct gtg 1920 Lys Ala Thr Glu Pro Pro Pro Ser Gln Glu Gly Pro Ser Pro Ala Val 625 630 635 640

ccc age ate tac gcc act ctg gcc ate cac tag 1953

Pro Ser Ile Tyr Ala Thr Leu Ala Ile His 645 . 650

<210> 27

<211> 650

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 27

Met Thr Pro Ile Leu Thr Val Leu Ile Cys Leu Gly Leu Ser Leu Gly 1 5 10 15

Pro Arg Thr His Val Gln Ala Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp 20 25 30

Ala Glu Pro Gly Ser Val Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg 35 40 45

Cys Gln Gly Gly Gln Glu Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys 50 55 60

Lys Thr Ala Pro Trp Ile Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys 65 70 75 80

Gly Gln Phe Pro Ile Pro Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr 85 90 95

Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser Asp Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp 100 105 110

Pro Leu Glu Leu Val Val Thr Gly Ala Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser 115 120 125

Ala Gln Pro Ser Pro Val Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln 130 135 140

Cys Asp Ser Gln Val Ala Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly. 145 150 155 160

Glu Asp Glu His Pro Gln Cys Leu Asn Sèr Gln Pro His Ala Arg Gly 165 170 175

Ser Ser Arg Ala Ile Phe Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg 180 185 190

Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp 195 200 205

Ser Leu Pro Ser Asp Leu Leu Glu Leu Leu Val Leu Gly Val Ser Lys 210 215 220

Lys Pro Ser Leu Ser Val Gln Pro Gly Pro Ile Val Ala Pro Glu Glu 225 230 235 240

Thr Leu Thr Leu Gln Cys Gly Ser Asp Ala Gly Tyr Asn Arg Phe Val 245 250 255

Leu Tyr Lys Asp Gly Glu Arg Asp Phe Leu Gln Leu Ala Gly Ala Gln 260 265 270

Pro Gln Ala Gly Leu Ser Gln Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser 275 280 285

Arg Ser Tyr Gly Gly Gln Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala His Asn Leu Ser 290 295 300

Ser Glu Trp Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Ala Gly 305 310 315 320

Gln Phe Tyr Asp Arg Val Ser Leu Ser Val Gln Pro Gly Pro -Thr Val 325 330 335

Ala Ser Gly Glu Asn Val Thr Leu Leu Cys Gln Ser Gln Gly Trp Met 340 345 350

Gln Thr Phe Leu Leu Thr Lys Glu Gly Ala Ala Asp Asp Pro Trp Arg 355 360 365

Leu Arg Ser Thr Tyr Gln Ser Gln Lys Tyr Gln Ala Glu Phe Pro Met 370 375 380

Gly Pro Val Thr Ser Ala His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser 385 390 395 400

Gln Ser Ser Lys Pro Tyr Leu Leu Thr His Pro Ser Asp Pro Leu Glu 405 410 415

Leu Val Val Ser Gly Pro Ser Gly Gly Pro Ser Ser Pro Thr Thr Gly 420 425 430

Pro Thr Ser Thr Ser Gly Pro Glu Asp Gln Pro Leu Thr Pro Thr Gly 435 440 445

Ser Asp Pro Gln Ser Gly Leu Gly Arg His Leu Gly Val Val Ile Gly 450 455 460

Ile Leu Val Ala Val Ile Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe 465 470 475 480

Leu Ile Leu Arg His Arg Arg Gln Gly Lys His Trp Thr Ser Thr Gln 485 490 495

Arg Lys Ala Asp Phe Gln His Pro Ala Gly Ala Val Gly Pro Glu Pro 500 505 510

Thr Asp Arg Gly Leu Gln Trp Arg Ser Ser Pro Ala Ala Asp Ala Gln 515 520 525

Glu Glu Asn Leu Tyr Ala Ala Val Lys His Thr Gln Pro Glu Asp Gly 530 535 540

Val Glu Met Asp Thr Arg Ser Pro His Asp Glu Asp Pro Gln Ala Val 545 550 555 560

Thr Tyr Ala Glu Val Lys His Ser Arg Pro Arg Arg Glu Met Ala Ser 565 570 575

Pro Pro Ser Pro Leu Ser Gly Glu Phe Leu Asp Thr Lys Asp Arg Gln 580 585 590 Ala Glu Glu Asp Arg Gln Met Asp Thr Glu Ala Ala Ala Ser Glu Ala 595 600 605

Pro Gln Asp Val Thr Tyr Ála Gln Leu His Ser Leu Thr Leu Arg Arg 610 615 620

Lys Ala Thr Glu Pro Pro Pro Ser Gln Glu Gly Pro Ser Pro Ala Val 625 630 635 640

Pro. Ser Ile Tyr Ala Thr Leu Ala Ile His 645 650

<210> <211> <212> <213>

28

1347 DNA

Homo sapiens

<220> <221> <222>

CDS

(1)..(1347)

<400> 28

atg ate ccc acc ttc acg gct ctg ctc tgc ctc ggg ctg agt ctg ggc Met Ile Pro Thr Phe Thr Ala Leu Leu Cys Leu Gly Leu Ser Leu Gly 1 5 10 15

48

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96

gct gag cca ggc tet gtg ate age tgg ggg aac tet gtg acc ate tgg Ala Glu Pro Gly Ser Val Ile Ser Trp Gly Asn Ser Val Thr Ile Trp 35 40 45

144

tgt cag ggg acc ctg gag gct cgg gag tae cgt ctg gat aaa gag gaa Cys Gln Gly Thr Leu Glu Ala. Arg Glu Tyr Arg Leu Asp Lys Glu Glu 50 55 60

192

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240

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288

cgc tgt tac tat cgc age cct gta ggc tgg tca cag ccc agt gac ccc Arg Cys Tyr Tyr Arg Ser pro Val Gly Trp Ser Gln Pro. Ser Asp Pro 100 105 110

336

ctg gag ctg gtg atg aca gga gcc tac agt aaa ccc acc ctt tca gcc Leu Glu Leu Val Met Thr Gly Ala Tyr Ser Lys Pro Thr Leu Ser Ala 115 120 125

384

ctg ccg agt cct ctt gtg acc tca gga aag age gtg acc ctg ctg tgt Leu Pro Ser Pro Leu Val Thr Ser Gly Lys Ser Val Thr Leu Leu Cys 130 135 140

432

cag tca cgg age cca atg gac act ttc ctt ctg ate aag gag cgg gea Gln Ser Arg Ser Pro Met Asp Thr Phe Leu Leu Ile Lys Glu Arg Ala 145 150 155 160

480

gcc cat ccc cta ctg cat ctg aga tca gag cac gga gct cag cag cac Ala His Pro Leu Leu His Leu Arg Ser Glu His Gly Ala Gln Gln His 165 170 175

528

cag gct gaa ttc ccc atg agt cct gtg acc tca gtg cac ggg ggg acc Gln Ala Glu Phe Pro Met Ser Pro Val Thr Ser Val His Gly Gly Thr 180 185 190

576 tac agg tgc ttc age tca cac ggc ttc tcc cac tac ctg ctg tca cac Tyr Arg Cys Phe Ser Ser His Gly Phe Ser His Tyr Leu Leu Ser His 195 200 205

624

ccc agt gac ccc ctg gag ctc ata gtc tca gga tcc ttg gag ggt ccc Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Ile Val Ser Gly Ser Leu Glu Gly Pro 210 215 220

672

agg ccc tca ccc aca agg tcc gtc tca aca gct gea ggc cct gag gac Arg Pro Ser Pró Thr Arg Ser Val Ser Thr Ala Ala Gly Pro Glu Asp 225 230 235 240

720

cag ccc ctc atg cct aca ggg tca gtc ccc cac agt ggt ctg aga agg Gln Pro Leu Met Pro Thr Gly Ser Val Pro His Ser Gly Leu Arg Arg 245 250 255

768

cac tgg gag gta ctg ate ggg gtc ttg gtg gtc tcc ate ctg ctt ctc His Trp Glu Val Leu Ile Gly Val Leu Val Val Ser Ile Leu Leu Leu 260 265 270

816

tcc ctc ctc ctc ttc ctc ctc ctc caa cac tgg cgt cag gga aaa cac Ser Leu Leu Leu Phe Leu Leu Leu Gln His Trp Arg Gln Gly Lys His 275 280 285

864

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912

gcc gag cca gag ccc aag gac ggg ggc cta cag agg agg tcc age cca Ala Glu Pro Glu Pro Lys Asp Gly Gly Leu Gln Arg Arg Ser Ser Pro 305 310 315 320

960

gct gct gac gtc cag gga gaa aac ttc tgt gct gcc gtg aag aac aca Ala Ala Asp Val Gln Gly Glu Asn Phe Cys Ala Ala Val Lys Asn Thr 325 330 335

1008

cag cct gag gac ggg gtg gaa atg gac act cgg cag age cca cac gat Gln Pro Glu Asp Gly Val Glu Met Asp Thr Arg Gln Ser Pro His Asp 340 345 350

1056

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1104

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1152

gac aca aag gac aga cag gea gaa gag gac aga cag atg gac act gag Asp Thr Lys Asp Arg Gln Ala Glu Glu Asp Arg Gln Met Asp Thr Glu 385 390 395 400

1200

gct gct gea tet gaa gcc ccc cag gat gtg acc tac gcc cgg ctg cac Ala Ala Ala Ser Glu Ala Pro Gln Asp Val Thr Tyr Ala Arg Leu His 405 410 415

1248

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1296

ggg gcc tet cca gct gag ccc agt gtc tat gcc act ctg gcc ate cac Gly Ala Ser Pro Ala Glu Pro Ser Val Tyr Ala Thr Leu Ala Ile His 435 440 445

1344

taa

1347

<210> <211> <212> <213>

29

448

PRT

Homo sapiens

<400> 29

Met Ile Pro Thr Phe Thr Ala Leu Leu Cys Leu Gly Leu Ser Leu Gly 1 5 10 15 Pro Arg Thr Asp Met Gln Ala Gly Pro Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp 20 25 30

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Leu Pro Ser Pro Leu Val Thr Ser Gly Lys Ser Val ThrLeu Leu Cys 130 135 140

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Arg Pro Ser Pro Thr Arg Ser Val Ser" Thr Ala Ala Gly Pro Glu Asp 225 230 235 240

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260 265 270

Ser Leu Leu Leu Phe Leu Leu Leu Gln His Trp Arg Gln Gly Lys His

275 280 285

Arg Thr Leu Ala Gln Arg Gln Ala Asp Phe Gln Arg Pro Pro Gly Ala

290 295 300 Ala Glu Pro Glu Pro Lys Asp Gly Gly Leu Gln Arg Arg Ser Ser Pro 305 310 315 320

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Glu Asp Pro Gln Ala Val Thr Tyr Ala Lys Val Lys His Ser Arg Pro 355 360 365

Arg Arg Glu Met Ala Ser Pro Pro Ser Pro Leu Ser Gly Glu Phe Leu 370 375 380

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Ala Ala Ala Ser Glu Ala Pro Gln Asp Val Thr Tyr Ala Arg Leu His 405 410 415

Ser Phe Thr Leu Arg Gln Lys Ala Thr Glu Pro Pro Pro Ser Gln Glu 420 425 430

Gly Ala Ser Pro Ala Glu Pro Ser Val Tyr Ala Thr Leu Ala Ile His 435 440 445

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência de primer sintetizado artificialmente

<400> 30

ccatagttcc attttacagt tacc

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência de primer sintetizado artificialmente

<400> 31

gggaccaagg gatagacaga

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência de primer sintetizado artificialmente

<400> 32

tccagagttc caggtcaagg tcac

<210> 33

<211> 20

<212> DNA <213> Artificial <220>

<223> Seqüência de primer sintetizado artificialmente <400> 33

gccagtggat agaccgatgg

<210> 34

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência de primer sintetizado artificialmente

<220>

<221> modified_base

<222> (24)..(25)

<223> I

<220>

<221> modified_base

<222> (29)..(30)

<223> I

<220>

<221> modified_base

<222> (34)..(35)

<223> I

<400> 34

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35 20 DNA

Artificial <220>

<223> Seqüência de primer sintetizado artificialmente <400> 35

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<210> 36

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência de primer sintetizado artificialmente

<400> 36

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<210> 37

<211> .21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência de primer sintetizado artificialmente

<400> 37

gatggataca gttggtgcag c

<210> <211> <212> <213>

<210> 38 <211> 408 <212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS <222> (1)..(408)

<220>

<221> sig-peptídeo <222> (1)..(54)

<220>

<221> mat peptide <222> (55)..(408)

<400> 38

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tet cag tet ctg tcc ctc acc tgc act gtc act ggc tac tca ate acc Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr 15 20 25 30

agt gat tat gcc tgg aac tgg ate cgg cag ttt cca gga aac aaa ctg Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu 35 40 45

gag tgg atg ggc tac ata age tac agt ggt age act age tac aac cca Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro 50 55 60

tet ctc aaa agt cga ate tet ate act cga gac aca tcc aag aac cag Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln 65 70/75

ttc ttc ctg cag ttg aat tet gtg act act gag gac aca gcc aca tat Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 80 85 90

tac tgt gea aga tet ccc cct tac tat gct atg gac tac tgg ggt caa Tyr Cys Ala Arg Ser Pro Pro Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 95 100 105 110

gga acc tca gtc acc gtc tcc tca Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115

<210> 39

<211> 136

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 39

Met Arg Val Leu Ile Leu Leu Trp Leu Phe Thr Ala Phe Pro Gly Ile -15 -10 -5

Leu Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro -11 5 10

Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr 15 20 25 30

Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu 35 40 45 Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro 50 55 60

Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln 65 70 75

Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 80 85 90

Tyr Cys Ala Arg Ser Pro Pro Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 95 100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115

<210> 40

<211> 381

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS <222> (1)..(381)

<220>

<221> sig-peptídeo <222> (1)..(60)

<220>

<221> mat_peptide <222> (61)..(381)

<400> 40

atg gag aca cat tct cag gtc ttt gta tac atg ttg ctg tgg ttg tct

Met Glu Thr His Ser Gln Val Phe Val Tyr Met Leu Leu Trp Leu Ser -20 -15 -10 -5

ggt gtt gaa gga gac att gtg atg acc cag tct cac aaa ttc atg tcc Gly Val Glu Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser -11 5 10

aca tca gta gga gac agg gtc age ate acc tgc aag gcc agt cag gat Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 15 20 25

gtg ggt act gct gta gcc tgg tat caa cag aaa cca ggg caa tct cct Val Gly Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 30 35 40

aaa cta ctg att tac tgg gea tcc acc cgg cac act gga gtc cct gat Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp 45 50 55 60

cgc ttc aca ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc att age Árg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75

aat gtg cag tct gaa gac ttg gea gat tat ttc tgt cag caa tat age Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser 80 85 90

age tat cct ctc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 95 100 105

<210> 41 <211> 127 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 41

Met Glu Thr His Ser Gln Val Phe Val Tyr Met Leu Leu Trp Leu Ser -20 -15 -10 -5

Gly Val Glu Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser -11 5 10

Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 15 20 25

Val Gly Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 30 35 40

Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp 45 50 55 60

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75

Asn Val' Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser 80 85 90

Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 95 100 105

<210> 42 <211> 414

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(414)

<220>

<221> sig-peptídeo

<222> (1)..(57)

<220>

<221> mat_peptide

<222> (58)..(414)

<400> 42

atg gga tgg age tgg gtc ttt ctc ttc ctc ctg tca gga act gea ggt

Met Gly Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly

-15 -10 -5

gtc cac tgc cag gtc cag ctg aag cag tet gga gct gag ctg gtg agg

Val His Cys Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg -11 5 10

cct ggg gct tca gtg aag ctg tcc tgc aag act tet gga tac ate ttc Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ile Phe 15 20 25

acc age tac tgg att cac tgg gta aaa cag agg tet gga cag ggc ctt Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45

gag tgg att gea agg att tat cct gga act ggt agt act tac tac aat Glu Trp Ile Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn 50

gag aag ttc aag ggc aag Glu Lys Phe Lys Gly Lys 65

act gcc tac atg cag ctc Thr Ala Tyr Met Gln Leu 80

tat ttc tgt gca aga tac Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr 95

ggc gca ggg acc acg gtc Gly Ala Gly Thr Thr Val 110 115

55

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age age ctg aaa tet gag Ser Ser Leu Lys Ser Glu 85

cct acc tac gac tgg tac Pro Thr Tyr Asp Trp Tyr 100 105

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60

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gac tet gct gtc 336

Asp Ser Ala Val 90

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Phe Asp Val Trp

414

<210> 43

<211> 138

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 43

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Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 65 70 75

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Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Pro Thr Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp 95 100 105

Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 110 115

<210> 44

<211> 381

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS <222> (1)..(381)

<220>

<221> sig-peptídeo <222> (1)..(60) <220>

<221> mat_peptide. <222> (61)..(381)

<400> 44

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-20 -15 -10 -5

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<210> 45 <211> 127 <212> PRT <213> Mus <400> 45

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Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn 65 70 75

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Ser Trp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 95 100 105

<210> 46

<211> 408

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS <222> (1)..(408)

<220>

<221> sig-peptídeo <222> (1)..(54)

<220>

<221> mat_peptide <222> (55)..(408)

<400> 46

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<210> 47

<211> 136

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 47

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Leu Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro -11 5 10

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<210> 48

<211> 381

<212> DNA

<213> Mus musculus

<220>

<221> CDS <222> (1)..(381)

<220>

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<220>

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<400> 48

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<210> 49

<211> 127

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<400> 49

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<210> 50

<211> 1401

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência de primer sintetizado artificialmente

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1398)

<220>

<221> sig-peptídeo

<222> (1)..(54)

<220>

<221> mat_peptide

<222> (55)..(1398)

<400> 50

atg aga gtg ctg att ctt ttg tgg Met Arg Val Leu Ile Leu Leu Trp -15

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Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Vãl Pro 175 180 185 190

tcc age age ttg ggc acc cag acc tac ate tgc aac gtg aat cac aag 672

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Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300

gtg gtc age gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag 1008 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315

gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc ate gag 1056 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 320 325 330

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acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg 1152 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365

acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc age gac ate gcc gtg gag tgg 1200 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380

gag age aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg 1248 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395

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gag gct ctg cac aac các tac acg cag aag age ctc tcc ctg tet ccg 1392 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445

ggt aaa tga 1401

Gly Lys

<210> 51

<211> 466

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construção sintética <400> 51

Met Arg Val Leu Ile Leu Leu Trp Leu Phe Thr Ala Phe Pro Gly Ile -15 -10 -5

Leu Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro.Gly Leu Val Lys Pro -11 5 10

Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr 15 20 25 30

Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu 35 40 45

Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro 50 55 60

Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln 65 70 75

Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 80 85 90

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Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly. Val His Thr Phe Pro Ala Val 160 165 170

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 175 180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 240 245 250

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 255 260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 320 325 330

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 335 340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365

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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 400 405 410

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 415 420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445

Gly Lys

<210> 52

<211> 705

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência de primer sintetizado artificialmente

<220>

<221> CDS <222> (1)..(702)

<220>

<221> sig-peptídeo <222> (1)..(60)

<220>

<221> mat_peptide <222> (61)..(702)

<400> 52

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-20 -15 -10 -5

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aat gtg cag tct gaa gac ttg gea gat tat ttc tgt cag caa tat age 336

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ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat 480 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 125 130 135 140

ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg 528

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ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac age aag gac age acc 576

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 160 165 170

tac age ctc age age acc ctg acg ctg age aaa gea gac tac gag aaa 624

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 175 180 185

cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg age tcg ccc 672

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 190 195 200

gtc aca aag age ttc.aac agg gga gag tgc tag 705

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 205 210

<210> 53 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção <400> 53

Met Glu Thr His Ser Gln Val Phe Val Tyr Met Leu Leu Trp Leu Ser -20 -15 -10 -5

Gly Val Glu Gly Asp Xle Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser -11' 5 10

Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp 15 20 25

Val Gly Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 30 35 40

Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp 45 50 55 60

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75

Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser 80 85 90

Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 95 100 105

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 110 115 . 120

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 125 130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 160 165 170

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 175 180 185

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 190 195 200

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 205 210

<210> 54

<211> 1407

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência' de primer sintetizado artificialmente

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1404)

<220>

<221> sig-peptídeo

<222> (1). . (57)

<220>

<221> mat_peptide

<222> (55)..(1404)

<400> 54

atg gga tgg age tgg gtc ttt,ctc ttc etc ctg tca gga act gea ggt 48

Met Gly Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly -15 -10-5

gtc cac tgc cag gtc cag ctg aag cag tet gga gct gag ctg gtg agg 96

Val His Cys Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg -11 5 10

cct ggg gct tca gtg aag ctg tcc tgc aag act tet gga tac ate ttc 144

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ile Phe 15 20 25 30

acc age tac tgg att cac tgg gta aaa cag agg tet gga cag ggc ctt 192

Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu 35 40 45

gag tgg att gea agg att tat cct gga act ggt agt act tac tac aat 240

Glu Trp Ile Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn 50 55 60

gag aag ttc aag ggc aag gcc aca ctg act gea gac aaa tcc tcc age 288

Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser

65 70 75

act gcc tac atg cag ctc age age ctg aaa tet gag gac tet gct gtc 336

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Ser Ala Val 80 85 90

tat ttc tgt gea aga tac cct acc tac gac tgg tac ttc gat gtc tgg 3 84

Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Pro Thr Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp 95 100 105 110

ggc gea ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca 432

Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125

tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag age acc tet ggg ggc aca 480

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140

gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg 528

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 .155

gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc age ggc gtg cac acc ttc ccg 576

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 160 165 170

gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc age age gtg gtg acc 624

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr.Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 175 180 185 190

gtg ccc tcc age age ttg ggc acc cag acc tac ate tgc aac gtg aat 672

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205

cac aag ccc age aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tet 720

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220

tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg 768

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235

ggg gga' ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc 816

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 240 245 250

atg ate tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age 864

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 255 260 265 270

cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag 912

His Glu Asp Pro Glu Vàl Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Vãl Glu 275 280 285

gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac age acg 960

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300

tac cgt gtg gtc age gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat 1008 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315

ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc 1056 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 320 325 330

ate gag aaa acc ate tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag 1104 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 335 340 345 350

gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc 1152 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365

age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc age gac ate gcc gtg 1200

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380

gag tgg gag age aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct 1248 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395

ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac age aag ctc acc 1296 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 400 405 410

gtg gac aag age agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg 1344 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 415 420 425 430

acg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag age ctc tcc ctg 1392 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 435 440 445

tet ccg ggt aaa tga 1407

Ser Pro Gly Lys 450

<210> 55 <211> 468 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Construção <400> 55

Met Gly Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly -15 -10 -5

Val His Cys Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg -11 5 10

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ile Phe 15 20 25

Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45

Glu Trp Ile Ala Arg Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn 50 55 60

Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 65 70 75

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Ser Ala Val 80 85 90

Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr Pro Thr Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp 95 100 105

Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 110 115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 160 165 170

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 175 180 185

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 190

195

200

205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 240 245 250

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 255 260 265

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 270 275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 320 325 330

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 335 340 345

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 350 355 360 365

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 400 405 410

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 415 420 425

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 430 435 440 445

Ser Pro Gly Lys

<210> 56

<211> 705

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência de primer sintetizado artificialmente <220>

<221> CDS <222> (1)..(702)

<220>

<221> sig-peptídeo <222> (1) . . (60)

<220>

<221> mat_peptide <222> (61)..(702)

<400> 56

atg gtt ttc aca cct cag att ctt gga ctt atg ctt ttc tgg att tca 48

Met Val Phe Thr Pro Gln Ile Leu Gly Leu Met Leu Phe Trp Ile Ser -20 -15 -10 -5

gcc tcc aga ggt gat att gtg cta act cag tct cca gcc acc ctg tct 96

Ala Ser Arg Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser -11 5 10

gtg act cca gga gat aga gtc agt ctt tcc tgc agg gcc agt caa agt 1.44

Val Thr Pro Gly Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 15 20 25

att age aac tac cta cac tgg tat caa caa aaa tca cat gag tct cca 192

Ile Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro 30 35 40

agg ctt ctc ate aag tat gct tcc cag tcc ate tct ggg ate ccc tcc 240

Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser 45 50 55 60

agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc act ctc agt ate aac 288

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn 65 70 75

agt gtg gag act gaa gat ttt gga atg tat ttc tgt caa cag agt aac 336

Ser Val Glu Thr Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn 80 .85 90

age tgg ccg ctc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa cga 3 84

Ser Trp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 95 100 105

act gtg gct gea cca tct gtc ttc ate ttc ccg cca tct gat gag cag 432

. Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 110 115 120

ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg .ctg aat aac ttc tat 480

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Va!l Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 125 130 , 135 140

ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg 528

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155

ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac age aag gac age acc 576

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 160 165 170

tac age ctc age age acc ctg acg ctg age aaa gea gac tac gag aaa 624

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 175 180 185

cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg age tcg ccc 672

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 190 195 200

gtc aca aag age ttc aac agg gga gag tgc tag 705

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 205 210 <210> 57

<211> 234

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Construção

<400> 57

Met Val Phe Thr Pro Gln Ile Leu Gly Leu Met Leu Phe Trp Ile Ser -20 -15 -10 -5

Ala Ser Arg Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser -1 1 5 10

Val Thr Pro Gly Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 15 20 25

Ile Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro 30 35 40

Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser 45 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn 65 70 75

Ser Val Glu Thr Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn 80 85 90

Ser Trp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 95 100 105

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 110 115 120

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 125 130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 160 165 170

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 175 180 185

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 190 195 200

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 205 210

<210> 58

<211> 6

<212> PRT

<213> Mus musculus <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(6)

<223> CDR

<400> 58

Ser Asp Tyr Ala Trp Asn 1 5

<210> 59

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(17)

<223> CDR

<400> 59

Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 15 10 15

Arg

<210> 60

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> MI SC_FEATURE

<222> (1) .. (9)

<223> CDR

<400> 60

Ser Pro Pro Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

<210> 61

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(11)

<223> CDR

<400> 61

Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Ala 15 10

<210> 62

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (1) .. (7) <223> CDR

<400> 62

Trp Ala Ser Thr Arg His Thr 1 5

<210> 63

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> MI SC_FEATURE

<222> (1) . . (9)

<223> CDR

<400> 63

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 64

<211> 5

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) .. (5)

<223> CDR

<400> 64

Ser Tyr Trp Ile His

1 5

<210> 65

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(17)

<223> CDR

<400> 65

Arg Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 66

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221 > MI SC_FEATURE

<222> (1)..(10)

<223> CDR <400> 66

Tyr Pro Thr Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10

<210> 67

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> MI SC_FEATURE

<222> (1)..(11)

<223> CDR

<400> 67

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr Leu His

1 5 10

<210> 68

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(7)

<223> CDR

<400> 68

Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser. 1 5

<210> 69

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

. < 2 21 > MI SC_FEATURE

<222> (1)..(9)

<223> CDR

<400> 69

Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu Thr

<210> 70

<211> 6

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1) .. (6)

<223> CDR

<400> 70

Ser Asp Tyr Ala Trp Asn

1 5

<210> 71 <211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> MI SC_FEATURE

<222> (1)..(17)

<223> CDR

<400> 71

Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

Arg

<210> 72

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(9)

<223> CDR

<400> 72

Ala Leu Pro Leu Pro Trp Phe Ala Tyr

<210> 73 <211> 11 <212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> MI SC_FE ATURE

<222> (1)..(11)

<223> CDR

<400> 73

Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Ala 1 5 10

<210>1 74

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(7)

<223> CDR

<400> 74

Trp Ala Ser Thr Arg His Thr

1 5

<210> 75

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus <220>

<221> MI SC_FE ATURE

<222> (1)..(9)

<223> CDR

<400> 75

Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 76

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência de peptídeos sintetizada artificialmente

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(3)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorra naturalmente

<400> 76

Tyr Xaa Xaa Leu 1

Claims

1. Anticorpo monoclonal que se liga a um domínio extracelular do ILT7 humano ou um fragmento compreendendo sua região de ligação a antígeno.

2. Anticorpo monoclonal ou o fragmento compreendendo sua região de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo monoclonal liga-se a uma célula humana produtora de interferon.

3. Anticorpo monoclonal produzido por hibridoma ILT7 nQ 11, depositado sob número de Acesso FERM BP-10704 ou hibridoma ILT7 n917 depositado sob número de Acesso FERM BP-10705, ou um fragmento com- preendendo sua região de ligação a antígeno.

4. Anticorpo monoclonal ou o fragmento compreendendo sua região de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo monoclonal compreende seqüências de aminoácidos, de acordo com qualquer um dos seguintes de i) a iii), como CDR1, CDR2 e CDR3, na região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve: i) CDR1 de uma região variável de cadeia pesada: SDYAWN (SEQ ID NO: -58); CDR2 de uma região variável de cadeia pesada: YISYSGSTSYNPSLKSR (SEQ ID NO: 59); e CDR3 de uma região variável de cadeia pesada: SPPYYAMDY (SEQ ID NO: -60); CDR1 de região variável de cadeia leve: KASQDVGTAVA (SEQ ID NO: 61); CDR2 de uma região variável de cadeia leve: WASTRHT (SEQ ID NO: 62); e CDR3 de uma região variável de cadeia leve: QQYSSYPLT (SEQ ID NO: -63); ii) CDR1 de região variável de cadeia pesada: SYWIH (SEQ ID NO: 64); CDR2 de uma região variável de cadeia pesada: RIYPGTGSTYYNEKFKG (SEQ ID NO: 65); e CDR3 de uma região variável de cadeia pesada: YPTYDWYFDV (SEQ ID NO: 66); CDR1 de uma região variável de cadeia leve: RASQSISNYLH (SEQ ID NO: -67); CDR2 de uma região variável de cadeia leve: YASQSIS (SEQ ID NO: 68); CDR3 de uma região variável de cadeia leve: QQSNSWPLT (SEQ ID NO: 69); iii) CDRI de uma região variável de cadeia pesada: SDYAWN (SEQ ID NO: 70); CDR2 de uma região variável de cadeia pesada: YISYSGSTSYNPSLKSR (SEQ ID NO: 71); CDR3 de uma região variável de cadeia pesada: ALPLPWFAY (SEQ ID NO: 72); CDR1 de uma região variável de cadeia leve: KASQDVGTAVA (SEQ ID NO: 73); CDR2 de uma região variável de cadeia leve: WASTRHT (SEQ ID NO: 74); e CDR3 de uma região variável de cadeia leve: QQYSSYPYT (SEQ ID NO: 75).

5. Anticorpo monoclonal ou o fragmento compreendendo sua região de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo monoclonal compreende uma seqüência madura de uma seqüên- cia de aminoácidos, selecionadas entre qualquer uma das seguintes combi- nações de (a) a (c), como a região variável da cadeia pesada e a região va- riável da cadeia leve: a) uma região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 39 e uma região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 41; b) uma região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 43 e uma região variável da cadeia levè da SEQ ID NO: 45; e c) uma região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 47 e uma região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 49.

6. Polinucleotídeo que codifica o anticorpo monoclonal ou o fragmento compreendendo sua região de ligação a antígeno, como definido na reivindicação 4 ou 5.

7. Vetor compreendendo um polinucleotídeo que codifica o anti- corpo monoclonal ou o fragmento compreendendo sua região de ligação a antígeno, como definio na reivindicação 4 ou 5.

8. Célula transformada conservando o vetor, como definido na reivindicação 7, de maneira que permita sua expressão.

9. Método de produção do anticorpo monoclonal ou o fragmento compreendendo sua região de ligação a antígeno, como definido na reivindi- cação 4 ou 5, compreendendo as etapas de: cultura da célula transformada, como definido na reivindicação 8; e recuperação do anticorpo monoclonal ou o fragmento compreendendo sua região de ligação a antígeno da cultura.

10. Hibridoma que produz qualquer um dos anticorpos monoclo- nais como definido na reivindicação 1 ou 2.

11. Hibridoma ILT7 n5 11, depositado sob o número de Acesso FERM BP-10704 ou hibridoma ILT7 n9 17 depositado sob o número de A- cesso FERM BP-10705.

12. Método de produção de um anticorpo monoclonal, compre- endendo as etapas de: cultura do hibridoma como definido na reivindicação -11; e coleta do anticorpo monoclonal da cultura.

13. Método de produção de uma célula que produz um anticorpo monoclonal que se liga a um domínio extracelular do ILT7 humano, compre- endendo as seguintes etapas: (1) administração a um animal imune de uma célula que expresse uma pro- teína exógena, compreendendo um domínio extracelular do ILT7 humano, e uma molécula exógena que se associa ao ILT7 humano; e (2) seleção de uma célula produtora de anticorpo que produz um anticorpo que se liga ao ILT7 humano, proveniente da célula produtora do anticorpo do animal imune.

14. Método como definido na reivindicação 13, em que a molé- cuia que se associa ao ILT7 humano é uma proteína da membrana celular.

15. Método como definido na reivindicação 14, em que a proteí- na da membrana celular é a cadeia γ do receptor Fc.

16. Método como definido na reivindicação 15, em que a célula que expressa ILT7 humano e a molécula que se associa ao ILT7 humano é uma célula que retém (a) e (b) seguintes, de maneira que permita a expres- são de: (a) um polinucleotídeo exógeno que codifica uma seqüência de aminoácidos, compreendendo um domínio extracelular do ILT7 humano; e b) um polinucleotídeo exógeno que codifica a cadeia γ do receptor Fc.

17. Método como definido na reivindicação 16, em que a célula é uma célula animal.

18. Método como definido na reivindicação 17, em que a célula é uma célula derivada de humano.

19. Método como definido na reivindicação 18, em que a célula derivada de humano é uma célula 293T.

20. Método como definido na reivindicação 13, compreendendo adicionalmente uma etapa de clonagem da célula produtora de anticorpo, obtida pelo método como definido na reivindicação 13.

21. Método de produção de um anticorpo monoclonal que se liga a um domínio èxtracelular do ILT7 humano, compreendendo as etapas de: cultura da célula produtora de anticorpo pelo método como definido na rei- vindicação 8; e recuperação do anticorpo monoclonal da cultura.

22. Anticorpo monoclonal capaz de reconhecer ILT7 humano ou um fragmento compreendendo sua região de ligação a antígeno que pode ser obtido pelas seguintes etapas: (1) administração a um animal imune de uma célula que expressa em meio exógeno uma proteína compreendendo um domínio extracelular do ILT7 humano e uma molécula que se associa ao ILT7 humano; (2) seleção de uma célula produtora de anticorpo que produz o anticorpo que se liga ao ILT7 humano, proveniente de célula produtora de anticorpo do animal imune; e (3) cultura da célula [Drodutora de anticorpo, selecionada pela etapa (2) e recuperação de um anticorpo capaz de reconhecer ILT7 humano da cultura.

23. Um imunogene para produção de um anticorpo que se liga a um domínio extracelular do ILT7 humano, compreendendo uma célula ani- mal na qual (a) um polinucleotídeo que codifica uma seqüência de aminoáci- dos compreendendo um domínio extracelular do ILT7 humano, e (b) um po- linucleotídeo que codifica a cadeia γ do receptor Fc são conservados de ma- neira a se expressarem em meio exógeno; ou uma fração de membrana ce- lular da mesma.

24. O imunogene como definido na reivindicação 23, em que a célula animal é uma célula derivada de humano.

25. Método de detecção de célula produtora de interferon, com- preendendo as etapas de: por em contato um anticorpo monoclonal que se liga a um domínio extracelu- lar do ILT7 humano ou um fragmento compreendendo sua região de ligação a antígeno com uma célula em teste; e detecção do anticorpo monoclonal ou o fragmento compreendendo sua regi- ão de ligação a antígeno que está ligado à célula.

26. Reagente para detecção de célula produtora de interferon, compreendendo um anticorpo monoclonal que se liga a um domínio extrace- lular do ILT7 humano ou um fragmento compreendendo sua região de liga- ção a antígeno.

27. Método de inibição da atividade de uma célula produtora de interferon, compreendendo uma etapa de por em contato qualquer um dos componentes seguintes com uma célula produtora de interferon: (a) um anticorpo monoclonal que se liga ao ILT7 humano e inibe a atividade de uma célula produtora de interferon ou um fragmento compre- endendo sua região de ligação a antígeno; e (b) uma imunoglobulina na qual uma região determinante de complementaridade do anticorpo monoclonal descrito em (a) é introduzida ou um fragmento compreendendo sua região de ligação a antígeno.

28. Método de inibição da atividade de uma célula produtora de interferon em um organismo vivo, compreendendo a etapa de administração de qualquer um dos componentes seguintes a um organismo vivo: (a) um anticorpo monoclonal que se liga ao ILT7 humano e inibe a atividade de uma célula produtora de interferon ou um fragmento compreendendo sua região de ligação a antígeno; (b) uma imunoglobulina na qual uma região determinante de complementari- dade do anticorpo monoclonal descrito em (a) é introduzida ou um fragmento compreendendo sua região de ligação a antígeno; e (c) um polinucleotídeo que codifica qualquer um dos componentes descritos em (a) ou (b).

29. Método como definido na reivindicação 27 ou 28, em que a atividade da célula produtora de interferon é decorrente de a atividade pro- dutora de interferon ou a sobrevida da célula produtora de interferon, ou ambas.

30. Inibidor para a atividade de célula produtora de interferon, compreendendo qualquer um dos seguintes componentes, como ingrediente ativo: (a) um anticorpo monoclonal que se liga ao ILT7 humano e inibe a atividade de uma célula produtora de interferon ou um fragmento compreendendo sua região de ligação a antígeno; (b) uma imunoglobulina na qual uma região determinante de complementari- dade do anticorpo monoclonal descrito em (a) é introduzida ou um fragmento compreendendo sua região de ligação a antígeno; e (c) um polinucleotídeo que codifica qualquer um dos componentes descritos em (a) ou (b).

31. Inibidor para a atividade de uma célula produtora de interfe- ron, como definido na reivindicação 30, em que a atividade da célula produ- tora de interferon é decorrente de a atividade produtora de interferon ou a sobrevida da célula produtora de interferon, ou ambas.