TW201726747A - 新穎抗ｅｍｒ２抗體及使用方法 - Google Patents

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霍格 卡遜基
漢能 費南度
凱西 法蘭克林
羅伯 Ａ 史杜爾
大衛 劉
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艾伯維史坦森特瑞斯有限責任公司
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Abstract

本發明提供新穎抗EMR2抗體及抗體藥物偶聯物，以及使用該等抗EMR2抗體及抗體藥物偶聯物治療癌症之方法。

Description

新穎抗EMR2抗體及使用方法
本申請案大體上係關於新穎的抗EMR2抗體或其免疫反應性片段及包含其等之組合物(包括抗體藥物偶聯物)，其等係用於治療、診斷或預防癌症及任何癌症復發或轉移。本發明所選實施例提供該等抗EMR2抗體或抗體藥物偶聯物用於治療癌症的用途，包含降低致瘤細胞頻率。
幹細胞及祖細胞之分化及增殖為正常進行之過程，其協同作用以支持器官形成期間的組織生長、細胞修復及細胞置換。系統經緊密調節以確保僅根據生物體之需要而產生適當信號。細胞增殖及分化通常僅在損傷或死亡細胞置換需要時或生長需要時發生。然而，多種因素會觸發此等過程發生中斷，包括各種信號傳導化學物質含量過少或過多、微環境發生變化、基因突變或其組合。正常細胞增殖及/或分化發生中斷會導致各種病症，包括增生性疾病，諸如癌症。
癌症的習知治療性療法包括化學療法、放射療法及免疫療法。此等療法往往是無效的且手術切除不能提供可行的臨床替代方案。當前標準照護療法的侷限特別明顯地存在於患者經歷第一線療法且隨後復發的彼等情況中。在此等情況下，頻繁產生難治性腫瘤，此等腫瘤往往具侵襲性及不可治癒性。許多腫瘤的總體存活率多年保持基本上不變，此至少部分地歸 因於現有療法預防復發、腫瘤復發及轉移的失敗。因此仍非常需要針對增生性病症開發更具靶向性且更強效的療法。本發明解決了此需要。
在一個廣泛態樣中，本發明提供特異性結合至人類EMR2決定子的分離抗體，及相應抗體藥物或診斷偶聯物(ADC)，或其組合物。在某些實施例中，EMR2決定子為表現於腫瘤細胞上的EMR2蛋白質，而在其他實施例中，EMR2決定子表現於腫瘤起始細胞上。在其他實施例中，本發明抗體結合至EMR2蛋白質且與結合至人類EMR2蛋白質上之抗原決定基的抗體競爭結合。
在某些實施例中，本發明包含EMR2抗體或ADC，其中抗體或ADC結合域特異性地結合至人類EMR2(SEQ ID NO：1)，且包含以下或與包含以下的抗體競爭結合：(1)SEQ ID NO：21之輕鏈可變區(VL)及SEQ ID NO：23之重鏈可變區(VH)；或(2)SEQ ID NO：25之VL及SEQ ID NO：27之VH；或(3)SEQ ID NO：29之VL及SEQ ID NO：31之VH；或(4)SEQ ID NO：33之VL及SEQ ID NO：35之VH；或(5)SEQ ID NO：37之VL及SEQ ID NO：39之VH；或(6)SEQ ID NO：41之VL及SEQ ID NO：43之VH；或(7)SEQ ID NO：45之VL及SEQ ID NO：47之VH；或(8)SEQ ID NO：49之VL及SEQ ID NO：51之VH；或(9)SEQ ID NO：53之VL及SEQ ID NO：55之VH；或(10)SEQ ID NO：57之VL及SEQ ID NO：59之VH；或(11)SEQ ID NO：61之VL及SEQ ID NO：63之VH；或(12)SEQ ID NO：65之VL及SEQ ID NO：67之VH；或(13)SEQ ID NO：69之VL及SEQ ID NO：71之VH；或(14)SEQ ID NO：73之VL及SEQ ID NO：75之VH；或(15)SEQ ID NO：77之VL及SEQ ID NO：79之VH；或(16)SEQ ID NO： 21之VL及SEQ ID NO：81之VH或(17)SEQ ID NO：83之VL及SEQ ID NO：75之VH。
在另一態樣中，本發明包含一種結合至EMR2的抗體，該抗體包含輕鏈可變區及重鏈可變區，其中該輕鏈可變區具有如SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：83所述之輕鏈可變區之三個CDR；且該重鏈可變區具有如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：81所述之重鏈可變區之三個CDR。
在其他態樣中，本發明包含人類化抗體，其具有(1)包含SEQ ID NO：101的VL及包含SEQ ID NO：103的VH或(2)包含SEQ ID NO：105的VL及包含SEQ ID NO：107的VH。在某些實施例中，人類化抗體將包含位點特異性抗體。在所選實施例中，位點特異性人類化抗體將包含(1)包含SEQ ID NO：101的VL及包含SEQ ID NO：103的VH或(2)包含SEQ ID NO：105的VL及包含SEQ ID NO：107的VH。
在其他所選實施例中，本發明將包含選自由以下組成之群的人類化抗體：hSC93.253(包含SEQ ID NO：110及111)、hSC93.253ss1(包含SEQ ID NO：110及113)、hSC93.256(包含SEQ ID NO：114及115)、hSC93.256ss1(包含SEQ ID NO：114及117)。
在本發明之一些態樣中，抗體包含嵌合的CDR移植人類化或人類抗體或其免疫反應性片段。在本發明的其他態樣中，較佳包含前述序列之全部或一部分的抗體為內化抗體。在又其他實施例中，抗體將包含位點特異性抗體。在其他所選實施例中，本發明包含併入任一種前述抗體的抗體藥物偶聯物。
在某些態樣中，本發明包含編碼本發明抗EMR2抗體或其片段的核酸。在其他實施例中，本發明包含含有一或多種上述核酸的載體或包含該載體的宿主細胞。
如上文所提及，本發明進一步提供抗EMR2抗體藥物偶聯物，其中如本文所揭示的抗體與有效載物結合。在某些態樣中，本發明包含免疫上優先締合或結合至hEMR2的ADC。本發明的相容抗EMR2抗體藥物偶聯物(ADC)通常可包含下式：Ab-[L-D]n，或其醫藥學上可接受之鹽，其中：a)Ab包含抗EMR2抗體；b)L包含可選的連接體；c)D包含藥物；且d)n為整數約1至約20。
在一個態樣中，本發明之ADC包含抗EMR2抗體，諸如上述彼等物，或其免疫反應性片段。在其他實施例中，本發明之ADC包含細胞毒性化合物，其選自放射性同位素、卡奇黴素(calicheamicin)、吡咯并苯并二氮呯(pyrrolobenzodiazepine)、苯并二氮呯衍生物、奧瑞斯他汀(auristatin)、倍癌黴素(duocarmycin)、類美登素(maytansinoid)或本文所述之另一治療部分。
進一步提供包含如本文所揭示之抗EMR2 ADC的醫藥組合物。
本發明之另一態樣為一種治療癌症之方法，其包含向有需要的個體投與醫藥組合物，諸如本文所述之彼等物。在某些態樣中，癌症包含血液科惡性疾病，諸如急性骨髓性白血病或瀰漫性大B細胞淋巴瘤。在其他態樣中，個體罹患實體腫瘤。就該等實施例而言，癌症較佳選自由以下組成之群：腎上腺癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、乳癌、胃癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮癌、食道癌、結腸直腸癌、前列腺癌、胰臟癌、肺癌(小細胞與非小細胞)、甲狀腺癌及神經膠母細胞瘤。在某些實施例中，個體罹患肺腺癌或鱗狀細胞癌。另外，在所選實施例中，治療上述癌症之方法包含向該個體投與除本發明之抗EMR2 ADC之外的至少一種其他治療部分。
在再另一實施例中，本發明包含一種減少腫瘤細胞群體中之腫瘤起始細胞的方法，其中該方法包含使腫瘤起始細胞群體與如本文所述之ADC或抗體接觸(例如活體外或活體內接觸)，藉此降低腫瘤起始細胞頻率。
在一個態樣中，本發明包含一種遞送細胞毒素至細胞之方法，其包含使該細胞與任一種上述ADC接觸。
在另一態樣中，本發明包含一種偵測、診斷或監測個體中之癌症(例如肺癌或血液科惡性疾病)的方法，該方法包含使腫瘤細胞與EMR2偵測劑接觸(例如活體外或活體內)及偵測與腫瘤細胞結合之EMR2藥劑的步驟。在所選實施例中，偵測劑應包含抗EMR2抗體或與EMR2基因型決定子結合之核酸探針。在相關實施例中，診斷方法將包含免疫組織化學(IHC)或原位雜交(ISH)。熟習此項技術者將瞭解，該等藥劑視情況可經如下文所揭示的效應子、標記物或報導子標記或與其結合且利用多種標準技術(例如MRI、CAT掃描、PET掃描等)中的任一者進行偵測。
在類似風格中，本發明亦提供適用於診斷、監測或治療EMR2相關病症(諸如癌症)的套組或裝置及相關方法。為此目的，本發明較佳提供一種適用於偵測、診斷或治療EMR2相關病症的製品，該製品包含含有EMR2 ADC及使用該EMR2 ADC治療、監測或診斷EMR2相關病症之說明材料的容器，或提供針對其的給藥方案。在所選實施例中，裝置及相關方法將包含接觸至少一個循環腫瘤細胞的步驟。在其他實施例中，所揭示之套組將包含說明書、標籤、插頁、閱讀器或其類似物，其指示套組或裝置係用於診斷、監測或治療EMR2相關癌症或針對其提供給藥方案。
前文具概述性且因此必然含有細節的簡化、概括及省略；因此，熟習此項技術者將瞭解，此概述僅具說明性且不希望以任何方式進行限制。本文所述方法、組合物及/或裝置及/或其他標的物的其他態樣、特徵及優勢將顯而易見於本文所闡述之教示內容中。提供[發明內容]是為了以簡化形式引入構思之選擇，此等構思進一步描述於下文[實施方式]中。
圖1A-1E分別提供EMR2同功異型物a之胺基酸序列註釋(圖1A)，以及其示意性圖示(圖1B)、EMR2域清單(圖1C)，以及EMR2同功異型物推定表(圖1D)及觀測表(圖1E)；圖2顯示EMR2的表現量，如對來源於患者源異種移植(PDX)癌症幹細胞(CSC)及非致瘤(NTG)細胞以及正常組織的RNA使用全轉錄組(Illumina)測序所量測；圖3描繪自正常組織分離及自多種PDX腫瘤分離之RNA樣品中之EMR2轉錄物的相對表現量，如藉由qRT-PCR所量測；圖4顯示藉由微陣列雜交法所量測之正常組織及多種PDX細胞株中之 EMR2轉錄物表現的標準化強度值；圖5顯示正常組織及原發性腫瘤中之EMR2轉錄物的表現，得自癌症基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)，一種公開可獲得的資料集；圖6描繪基於原發肺腺癌腫瘤中之EMR2轉錄物之高表現及低表現的卡普蘭-邁耶存活率曲線(Kaplan-Meier survival curves)，其得自TCGA資料集，其中臨限指標值係使用RPKM值的算術平均值確定；圖7以表格形式提供例示性抗EMR2抗體的染色、同型、細胞殺死及食蟹瀰猴交叉反應性特徵；圖8A-8E提供鼠類抗EMR2抗體的胺基酸及核酸序列註釋，其中圖8A及8B顯示例示性鼠類抗EMR2抗體之輕鏈(圖8A)及重鏈(圖8B)可變區(SEQ ID NO：21-83，奇數個)的鄰接胺基酸序列，圖8C顯示編碼前述輕鏈及重鏈可變區(SEQ ID NO：20-82，偶數個)的核酸序列，圖8D及8E分別描繪抗EMR2抗體之人類化VL及VH域的胺基酸序列及核酸序列，圖8F顯示全長重鏈及輕鏈構築體的胺基酸序列，且圖8G-8I描繪SC93.253、SC93.256及SC93.267鼠類抗體之輕鏈及重鏈可變區的CDR，如使用Kabat、Chothia、ABM及接觸方法所測定；圖9表明發現屬於C分組的例示性抗EMR2抗體識別EMR2之莖域；圖10A-10C顯示正常細胞及腫瘤細胞表面上的EMR2蛋白質表現，如藉由對各種AML患者樣品或PDX細胞株(圖10A)、各種肺癌PDX細胞株(圖10B)以及正常造血細胞及AML細胞(圖10C)進行流式細胞術所測定，其中對本發明的例示性抗體(黑線)與同型對照染色群體(灰色實心)進行比較； 圖11A及11B表明本發明之EMR2 ADC活體外有效地介導細胞毒性劑向EMR+細胞的遞送及內化(圖11A)，但對於EMR2-對照細胞則不然(圖11B)；圖12表明根據本文中的教示內容，例示性EMR2 ADC能夠抑制肺PDX腫瘤生長；圖13A及13B證明EMR2決定子與某種AML PDX細胞株中的腫瘤起始細胞結合，如藉由使用FACS分離的EMR2+細胞(圖13A)再現異源腫瘤(當植入免疫缺乏小鼠(圖13B)中時)所示；及圖14A及14B說明本發明的例示性人類化位點特異性ADC能夠活體內減少AML PDX腫瘤細胞株的白血病負荷。
交叉參考之申請案
本申請案主張2015年11月19日所申請之美國臨時申請案第62/257,606號的權益，及2016年11月10日所申請之美國臨時申請案第62/420,319號的權益，兩個臨時申請案均以全文引用的方式併入本文中。
序列表
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式、經由EFS-Web提交且以全文引用的方式併入本文中。該ASCII複本產生於2016年11月15日，名稱為S69697_1320WO_sc9301WO01_ST25.txt且大小為101KB(104035個位元組)。
本發明可以許多不同形式實施。本文中揭示本發明的非限制性、說明性實施例，該等實施例舉例說明本發明原理。本文所用之任何章節標題僅出於組織目的且不應理解為限制所述標的物。出於本發明之目的，所有 鑑別之序列寄存編號可發現於NCBI參考序列(RefSeq)資料庫及/或NCBI GenBank®歸檔序列資料庫中，除非另外說明。
已驚人地發現，EMR2表型決定子在臨床上與各種增生性病症(包括贅瘤)相關，且EMR2蛋白質及其變異體或同功異型物提供可用於治療相關疾病的適用腫瘤標記物。就此而言，本發明提供抗體藥物偶聯物，其包含經工程改造之抗EMR2抗體靶向劑及細胞毒性有效載物。如下文更詳細地論述及隨附實例中所闡述，所揭示之抗EMR2 ADC特別有效地排除致瘤細胞，且因此適用於治療與預防某些增生性病症或其進展或復發。另外，所揭示之ADC組合物可展現相對較高的DAR=2%及出人意料的穩定性，與包含相同組分的習知ADC組合物相比，其可提供改善的治療指數。
此外，已發現，EMR2標記物或決定子(諸如細胞表面EMR2蛋白質)在治療上與癌症幹細胞(亦稱為腫瘤永生化細胞)結合且可有效地用於排除或靜默癌症幹細胞。經由使用如本文所揭示之抗EMR2偶聯物選擇性地減少或排除癌症幹細胞的能力驚人之處在於該等細胞已知對於許多習知療法通常具有耐受性。亦即，傳統的以及最新的靶向治療方法之有效性往往因抗性癌症幹細胞之存在及/或出現而受到限制，此等抗性癌症幹細胞能夠使腫瘤生長永生化，即使面對此等多種治療方法。此外，與癌症幹細胞結合之決定子往往使得治療標靶不良，此係歸因於表現較低或不一致，未能保持與致瘤細胞結合或未能在細胞表面上呈現。與先前技術之教示形成鮮明對比，本發明所揭示之ADC及方法可有效地克服此固有抗性且特異性地排除、耗乏、靜默或促進該等癌症幹細胞之分化，從而抵消其維持或再誘導潛在腫瘤生長之能力。
因此，尤其值得注意的是，EMR2偶聯物(諸如本文中所揭示之彼等 物)可有利地用於治療及/或預防所選增生性(例如贅生性)病症或其進展或復發。應瞭解，雖然本發明之較佳實施例將在下文展開廣泛論述，尤其在特定的結構域或區域或抗原決定基方面或在包含神經內分泌特徵之癌症幹細胞或腫瘤及其與所揭示之抗體藥物偶聯物相互作用的背景下展開廣泛論述，但熟習此項技術者應瞭解，本發明之範疇不受該等例示性實施例限制。實情為，本發明的最廣闊實施例及隨附申請專利範圍廣泛地且明確地關於抗EMR2抗體及偶聯物，包括本文揭示的彼等物，及其用於治療及/或預防多種EMR2相關或介導性病症(包括贅生性或細胞增殖性病症)的用途，不論任何特定的作用機制或特異性靶向的腫瘤、細胞或分子組分。
I. EMR2生理學
EGF樣模組受體2(EMR2；亦稱為含有EGF樣模組的黏蛋白樣激素受體樣2、CD312及黏附性G蛋白偶聯受體E2或ADGRE2)為黏附型類別(ADGR、aGPCR或B類)中的G蛋白偶聯受體(GPCR)。對於所有GPCR而言典型的是，EMR2含有七跨膜域(7TM)，該七跨膜域使該蛋白質定位於質膜中，其中N末端暴露於細胞外空間中且C末端取向細胞內(Monk等人；PMID：25956432)。GPCR分類成不同家族，其中ADGR為在人類中33個成員的第二大家族(Hamann等人；PMID：25713288)。ADGR的特徵為N'末端往往相當大及近膜GPCR蛋白分解位點(GPS)位於更大的高保守性GPCR自身蛋白分解誘導序列(GAIN)內。對於EMR2及其他家族成員而言，已經表明蛋白質在GPS以自身蛋白分解方式裂解，而在內質網(eR)中，產生含有大部分胞外域(ECD)的N末端亞單元(亦稱為α亞單元)及含有7TM的C末端亞單元、細胞質域及極小ECD(β亞單元)(Huang等人；PMID：22310662)。蛋白分解裂解之後，兩個片段非共價結合且一起表現 於表面上。ADGR家族成員進一步分類成九個亞家族，其中EMR2連同EMR1(ADGRE1)、EMR3(ADGRE3)、EMR4(ADGRE4)及CD97(ADGRE5)一起屬於II類(亦稱為E級或EGF-TM7)亞家族。此亞家族的所有成員共同之處在於，其在其N'末端ECD內含有2至6種表皮生長因子樣域(EGF)。
編碼EMR2的基因首先基於其與CD97的高度同源性加以描述且發現定位於人類染色體19p13.1上(Lin等人；PMID：10903844)。人類EMR2(hEMR2)基因係由21個跨越約50kbp的外顯子組成。人類EMR2基因的轉錄產生至少六種已知mRNA轉錄物，包括6.5kbp的典型同功異型物(NM_013447)(其轉譯成823 aa蛋白質的全長蛋白質(NP_038475，SEQ ID NO：1，圖1A))，稱為同功異型物a，其示意性地描繪於圖1B中。應注意在圖1A中，前導序列呈粗體，胞外域加有下劃線且GPS域的裂解位點加框。hEMR2同功異型物a的各種域(如藉由其胺基酸殘基所定義)闡述於圖1C中。人類EMR2蛋白質的直系同源物包括(但不限於)黑猩猩(XP_512446)、恆河獼猴(NP_001033751)及犬(NP_001033756)，但值得注意的是，不存在鼠類直系同源物(Kwakkenbos等人；PMID：17068111)。
EMR2的至少六種其他較短同功異型物已描述於公有域中，該公有域跨越一或兩個轉譯外顯子，包括轉譯成765 aa蛋白質(NP_001257981)的6kbp轉錄物(NM_001271052)及其它。此等同功異型物以及其他同功異型物的證據(如圖1D及1E中所闡述)來源於如隨附實例中所述產生的下一代測序(NGS)資料集。大部分剪接變異體與較短轉錄物有關，該等轉錄物跨越一或多個轉譯外顯子，從而產生缺乏一個且最多三個EGF域或莖區減小的蛋白質同功異型物。此等較短同功異型物的生物結果當前未知，但可推 測出各種轉錄物展現差異的配位體結合(特異性及/或親和力)、下游信號傳導、局域化及內化。由於此等變異體展現不同ECD，因此應瞭解，根據本發明，可開發或選擇對所選同功異型物具有特異性或結合所有潛在同功異型物的hEMR2抗體。如下文實例10中更詳細地所述，可根據此等較短同功異型物的存在來解釋與正常及腫瘤樣品有關的各種EMR2抗體染色模式。
EMR2的正常組織表現咸信侷限於骨髓細胞，包括嗜中性白血球、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞的亞群，包括其在骨髓中的祖細胞(Kwakkenbos等人；PMID：11994511及Chang等人；PMID：17174274)。EMR2的表面表現已顯示在嗜中性白血球及巨噬細胞的活化及成熟期間上調，特定而言，在發炎組織中，包括在患有全身性發炎反應症候群的患者中。其亦已與乳癌(Davies等人；PMID：21174063)、較小的結腸直腸癌亞群(Aust等人；PMID：12761622)及神經膠質瘤(Ivan等人；PMID：25200831)有關。有趣的是，已顯示多種人類腫瘤中的許多ADGR頻繁地發生突變(O'Hayre等人；PMID：24508914)，然而對於此等突變中的大部分而言，不明確其是否具有直接的生物結果及是否改變ADGR的信號傳導或局域化。
唯一已知的EMR2配位體為硫酸軟骨素葡糖胺聚糖(Stacey等人；PMID：12829604)，表明在細胞黏附/遷移期間具有潛在的作用。此符合如下觀察結果：抗EMR2 Ab可活體外誘導嗜中性白血球的黏附及趨化激素CXCL12依賴性遷移(Yona等人；PMID：17928360)。通常咸信配位體對α-亞單元的結合可使細胞內信號經由7TM亞單元及G蛋白活化來傳輸。對於EMR2及其他AGRE而言，亦已推測出配位體結合可使α亞單元自受體複合物移除，從而可活化GPCR的β亞單元部分。對於緊密相關的家族成員 CD97而言，已顯示配位體接合可引起CD97表面表現下調(Karpus等人；PMID：23447688)，然而不明確此是否歸因於α/β複合物內化及/或α亞單元排出。最近，已顯示EMR2不僅以α/β雜二聚體形式表現，而且各亞單元可定位於質膜上且獨立地傳遞信號，從而開啟各亞單元結合不同配位體的可能性(Huang等人；PMID：22310662)。另外，已推測出ADGR可為混雜的，從而允許來自不同ADGR基因產物的α及β亞單元結合。
應瞭解，關於EMR2之表現及生物功能的一些先前觀察結果可能因使用結合至高保守性EGF域區域且與EMR2及CD97均反應的抗體試劑而混淆。
II. 癌症幹細胞
根據本發明模型，腫瘤包含非致瘤細胞及致瘤細胞。非致瘤細胞不具有自更新的能力且不能可再現地形成腫瘤，即使以過量的細胞數目移植至免疫功能不全小鼠中亦如此。致瘤細胞(在本文中亦稱為「腫瘤起始細胞」(TIC)，典型地構成腫瘤細胞群體中0.01-10%的分率)具有形成腫瘤的能力。對於造血惡性病而言，TIC尤其在急性骨髓惡性病(AML)中可具有非常罕見的範圍1：104至1：107或非常充裕存在於例如B細胞系的淋巴瘤中。致瘤細胞涵蓋腫瘤永生化細胞(TPC)(可互換地稱為癌症幹細胞(CSC))與腫瘤祖細胞(TProg)。
CSC，如支持正常組織中之細胞層次的正常幹細胞，能夠無限地自複製，同時維持多譜系分化的能力。就此而言，CSC能夠產生致瘤後代與非致瘤後代且能夠完整地再現親代腫瘤之非均質細胞組成，如根據少數的經分離CSC連續分離及移植至免疫功能不全小鼠中所證明。證據表明除非此等「種子細胞」被排除，否則腫瘤轉移或復發的可能性大得多，導致疾 病復發及最終進展。
TProgs(如CSC)具有促進初始移植體中之腫瘤生長的能力。然而，不同於CSC，其不能夠再現親代腫瘤之細胞非均質性且在隨後移植體中再起始腫瘤發生時不太有效，原因為TProgs典型地僅能夠發生有限次數的細胞分裂，如少數的高度純化TProg連續移植至免疫功能不全小鼠中所證明。TProgs可進一步分成早期TProgs及晚期TProgs，此可根據表型(例如細胞表面標記物)及其再現腫瘤細胞架構的不同能力來區分。雖然都不能使腫瘤再現至與CSC相同的程度，但早期TProgs再現親代腫瘤特徵的能力大於晚期TProgs。儘管存在前述不同，但已顯示，一些TProg群體可在罕見的情形下獲得通常歸因於CSC之自更新能力且自身可變成CSC。
CSC展現較高致瘤性且相對而言，往往比以下更靜息：(i)TProgs(早期TProgs與晚期TProgs)；及(ii)非致瘤細胞，諸如終末分化腫瘤細胞及腫瘤浸潤性細胞，例如纖維母細胞/基質、內皮及造血細胞，其可來源於CSC且典型地包含腫瘤塊。由於習知療法及方案大部分設計成使腫瘤塊消退及攻擊快速增殖性細胞，因此CSC對習知療法及方案的耐藥性大於更快速增殖的TProgs及其他塊體腫瘤細胞群體，諸如非致瘤細胞。可使CSC對習知療法產生相對耐化學性的其他特徵為耐多藥性轉運蛋白之表現增強、DNA修復機制及抗細胞凋亡基因表現的增強。該等CSC特性已牽涉旨在使患有晚期贅瘤之患者中產生持續反應之標準治療方案的失敗，原因在於標準化學療法不能有效地靶向實際上促進持續腫瘤生長及復發的CSC。
已驚人地發現，EMR2表現與各種致瘤細胞亞群相關，此方式使得其對治療敏感，如本文所闡述。本發明提供抗EMR2抗體，其可特別適用於靶向致瘤細胞且可用於靜默、致敏、中和、降低頻率、阻斷、消除、干擾、 減少、阻礙、限制、控制、耗乏、緩和、介導、減輕、再程式化、排除、殺死或以其他方式抑制(統稱為「抑制」)致瘤細胞，藉此促進增生性病症(例如癌症)之治療、管理及/或預防。有利地，本發明的抗EMR2抗體可經選擇以使得其在投與個體後較佳降低致瘤細胞頻率或致瘤性，不論EMR2決定子之形式(例如表型或基因型)。致瘤細胞頻率的降低可作為以下結果而發生：(i)抑制或根除致瘤細胞；(ii)控制致瘤細胞的生長、擴增或復發；(iii)中斷致瘤細胞的起始、繁殖、維持或增殖；或(iv)以其他方式阻礙致瘤細胞的存活、再生及/或轉移。在一些實施例中，致瘤細胞的抑制可作為一或多種生理學路徑變化的結果而發生。路徑的變化，不論致瘤細胞的抑制或排除、其潛在性的修改(例如誘導性分化或小生境中斷)或以其他方式干擾致瘤細胞影響腫瘤環境或其他細胞的能力，均允許藉由抑制腫瘤發生、腫瘤維持及/或轉移及復發而使EMR2相關病症得到更有效的治療。此外應瞭解，所揭示之抗體的相同特徵使得其在治療已證明對標準治療方案具耐藥性或難治性的復發性腫瘤時特別有效。
可用於評估致瘤細胞頻率降低的方法包括(但不限於)細胞學或免疫組織化學分析，較佳為活體外或活體內限制稀釋法分析(Dylla等人，2008,PMID：PMC2413402及Hoey等人，2009,PMID：19664991)。
活體外限制稀釋法分析可藉由在促進群落形成之固體培養基上培養經分級分離或未經分級分離之腫瘤細胞(例如分別來自經處理之腫瘤及未處理之腫瘤)且對生長的群落計數及表徵來進行。或者，腫瘤細胞可在含有液體培養基之孔盤上連續稀釋且各孔可在接種之後的任何時間、但較佳為接種之後超過10天，根據對群落形成呈陽性或陰性來評分。
活體內限制稀釋法如下進行：將來自未處理對照物或來自暴露於所 選治療劑之腫瘤的腫瘤細胞經連續稀釋而移植於免疫功能不全小鼠中且隨後根據對腫瘤形成呈陽性或陰性來對各小鼠評分。評分可在所植入腫瘤可偵測的任何時間進行，但較佳在移植之後的60天或超過60天進行。測定致瘤細胞頻率之限制稀釋法實驗的結果分析較佳使用泊松分佈統計學(Poisson distribution statistics)進行或評估預定義之決定性事件的頻率，諸如活體內產生或不產生腫瘤的能力(Fazekas等人，1982,PMID：7040548)。
亦可利用流式細胞術及免疫組織化學測定致瘤細胞頻率。兩種技術均使用一或多種抗體或試劑結合此項技術中所識別之已知可富集致瘤細胞的細胞表面蛋白質或標記物(參見WO 2012/031280)。如此項技術中所知，亦可利用流式細胞術(例如螢光活化細胞分選(FACS))表徵、分離、純化、富集或分選各種細胞群體，包括致瘤細胞。流式細胞術係藉由傳遞其中懸浮有混合細胞群體之液流通過能夠每秒量測多達數千粒子之物理學及/或化學特徵的電子偵測設備來量測致瘤細胞含量。免疫組織化學提供的其他資訊在於，其藉由用結合至致瘤細胞標記物的經標記抗體或試劑將組織樣品染色而實現原位(例如組織切片中)致瘤細胞的可視化。
因而，本發明抗體可經由諸如流式細胞術、磁性活化細胞分選(MACS)、雷射介導性切片或FACS之方法而適用於鑑別、表徵、監測、分離、切片或富集致瘤細胞群體或亞群。FACS為用於根據特定細胞表面標記物、以超過99.5%純度分離細胞亞群的可靠方法。用於表徵及操縱致瘤細胞(包括CSC)的其他相容技術可見於例如U.S.P.N.s 12/686,359、12/669,136及12/757,649中。
已與CSC群相關且已用於分離或表徵CSC的標記物列舉如下： ABCA1、ABCA3、ABCB5、ABCG2、ADAM9、ADCY9、ADORA2A、ALDH、AFP、AXIN1、B7H3、BCL9、Bmi-1、BMP-4、C20orf52、C4.4A、羧肽酶M、CAV1、CAV2、CD105、CD117、CD123、CD133、CD14、CD16、CD166、CD16a、CD16b、CD2、CD20、CD24、CD29、CD3、CD31、CD324、CD325、CD33、CD34、CD38、CD44、CD45、CD46、CD49b、CD49f、CD56、CD64、CD74、CD9、CD90、CD96、CEACAM6、CELSR1、CLEC12A、CPD、CRIM1、CX3CL1、CXCR4、DAF、核心蛋白聚糖(decorin)、easyh1、easyh2、EDG3、EGFR、ENPP1、EPCAM、EPHA1、EPHA2、FLJ10052、FLVCR、FZD1、FZD10、FZD2、FZD3、FZD4、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、GD2、GJA1、GLI1、GLI2、GPNMB、GPR54、GPRC5B、HAVCR2、IL1R1、IL1RAP、JAM3、Lgr5、Lgr6、LRP3、LY6E、MCP、mf2、mllt3、MPZL1、MUC1、MUC16、MYC、N33、NANOG、NB84、NES、NID2、NMA、NPC1、OSM、OCT4、OPN3、PCDH7、PCDHA10、PCDHB2、PPAP2C、PTPN3、PTS、RARRES1、SEMA4B、SLC19A2、SLC1A1、SLC39A1、SLC4A11、SLC6A14、SLC7A8、SMARCA3、SMARCD3、SMARCE1、SMARCA5、SOX1、STAT3、STEAP、TCF4、TEM8、TGFBR3、TMEPAI、TMPRSS4、TFRC、TRKA、WNT10B、WNT16、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT5A、YY1及CTNNB1。參見例如Schulenburg等人，2010,PMID：20185329；U.S.P.N.7,632,678及U.S.P.N.2007/0292414、2008/0175870、2010/0275280、2010/0162416及2011/0020221。
類似地，與某些腫瘤類型之CSC相關的細胞表面表型之非限制性實 例包括CD44高CD24低、ALDH+、CD133+、CD123+、CD34+CD38-、CD44+CD24-、CD46高CD324+CD66c-、CD133+CD34+CD10-CD19-、CD138-CD34-CD19+、CD133+RC2+、CD44+α2β1 高CD133+、CD44+CD24+ESA+、CD271+、ABCB5+以及此項技術中已知的其他CSC表面表型。參見例如Schulenburg等人，2010，同上；Visvader等人，2008,PMID：18784658；及U.S.P.N.2008/0138313。就本發明而言，包含實體腫瘤中之CD46高CD324+表型及白血病中之CD34+CD38-的CSC製劑備受關注。
「陽性」、「低」及「陰性」表現量當其應用於標記物或標記物表型時定義如下。具有陰性表現(亦即「-」)的細胞在本文中定義為表現小於或等於同型對照抗體在完整抗體染色混合物存在下、在螢光通道中所觀測到之表現之95%的彼等細胞，從而標記存在於其他螢光發射通道中之所關注之其他蛋白質。熟習此項技術者將瞭解，用於定義陰性事件的此程序稱為「螢光-1(fluorescence minus one)」或「FMO」染色。表現大於使用同型對照抗體、使用上述FMO染色程序所觀測到之表現之95%的細胞在本文中定義為「陽性」(亦即「+」)。如本文所定義，存在廣泛定義為「陽性」的各種細胞群體。若抗原表現平均觀測值大於如上文所述使用同型對照抗體、使用FMO染色所測定的95%，則細胞定義為呈陽性。若平均表現觀測值大於藉由FMO染色所測定的95%且在95%之一個標準差內，則該等陽性細胞可稱為表現低的細胞(亦即「lo」)。或者，若平均表現觀測值大於藉由FMO染色所測定的95%且比95%高一個標準差以上，則該等陽性細胞可稱為表現高的細胞(亦即「hi」)。在其他實施例中，較佳可使用99%作為陰性FMO染色與陽性FMO染色之間的分界點且在一些實施例中，百分位可大於99%。
CD46高CD324+或CD34+CD38-標記物表型及上文剛剛舉例說明的彼等物可聯合標準流式細胞學分析及細胞分選技術使用以表徵、分離、純化或富集TIC及/或TPC細胞或細胞群體用於進一步分析。
本發明抗體降低致瘤細胞頻率的能力因此可使用上述技術及標記物測定。在一些情況下，抗EMR2抗體可使致瘤細胞頻率降低10%、15%、20%、25%、30%或甚至35%。在其他實施例中，致瘤細胞頻率降低可為約40%、45%、50%、55%、60%或65%。在某些實施例中，所揭示之化合物可使致瘤細胞頻率降低70%、75%、80%、85%、90%或甚至95%。應瞭解，致瘤細胞頻率之任何降低可能引起贅瘤之致瘤性、持久性、復發性及侵襲性的相應降低。
III. 抗體 A. 抗體結構
抗體及其變異體及衍生物(包括接受的命名及編號系統)在例如Abbas等人(2010),Cellular and Molecular Immunology(第6版)，W.B.Saunders Company；或Murphey等人(2011),Janeway's Immunobiology(第8版)，Garland Science中已有廣泛描述。
「抗體」或「完整抗體」典型地係指Y形四聚蛋白質，其包含藉由共價二硫鍵及非共價相互作用結合在一起的兩條重鏈(H)及兩條輕鏈(L)多肽鏈。各輕鏈由一個可變域(VL)及一個恆定域(CL)組成。各重鏈包含一個可變域(VH)及恆定區，在IgG、IgA及IgD抗體的情況下，恆定區包含三個域，稱為CH1、CH2及CH3(IgM及IgE具有第四域CH4)。在IgG、IgA及IgD類別中，CH1及CH2域藉由柔性鉸鏈區分離，該鉸鏈區為長度可變之富含脯胺酸及半胱胺酸的區段(在各種IgG子類中為約10至約60個胺基 酸)。輕鏈與重鏈中的可變域藉由約12或超過12個胺基酸之「J」區域與恆定域連接且重鏈亦具有約10個額外胺基酸之「D」區域。各類抗體進一步包含由成對半胱胺酸殘基形成的鏈間及鏈內二硫鍵。
如本文中所用，術語「抗體」包括多株抗體(polyclonal antibodies)、多株抗體(multiclonal antibodies)、單株抗體、嵌合抗體、人類化及靈長類化抗體、CDR移植抗體、人類抗體(包括重組產生的人類抗體)、重組產生的抗體、胞內抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、單價抗體、多價抗體、抗個體基因型抗體；合成抗體，包括突變蛋白質及其變異體；免疫特異性抗體片段，諸如Fd、Fab、F(ab')2、F(ab')片段、單鏈片段(例如ScFv及ScFvFc)；及其衍生物，包括Fc融合物及其他修飾，及任何其他免疫反應性分子，只要其展現與決定子的優先締合或結合。此外，除非上下文限制條件另有指示，否則該術語進一步包含抗體的所有類別(亦即IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)及所有子類(亦即IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)。對應於抗體之不同類別的重鏈恆定域典型地分別藉由相應小寫希臘字母α、δ、ε、γ及μ指示。來自任何脊椎動物物種之抗體之輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列而歸為兩種明顯不同類型中之一種，這兩種明顯不同類型稱為κ及λ。
抗體可變域在胺基酸組成方面在不同抗體中顯示出相當大的差異且主要負責抗原識別及結合。各輕鏈/重鏈對之可變區形成抗體結合位點，使得完整IgG抗體具有兩個結合位點(亦即其為二價的)。VH及VL域包含三個極端可變區，稱為高變區，或更通常稱為互補決定區(CDR)，該等可變區由四個不大變化的區域(稱為構架區(FR))框住及分離。VH與VL區之間的非共價結合形成Fv片段(可變片段)，其含有抗體之兩個抗原結合位點 之一。
除非另外指出，否則如本文所用，可以根據以下所提供之方案之一將胺基酸分配至各域、構架區及CDR：Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(第5版)，美國健康及人類服務部(US Dept.of Health and Human Services),PHS,NIH,NIH出版號91-3242；Chothia等人，1987,PMID：3681981；Chothia等人，1989,PMID：2687698；MacCallum等人，1996,PMID：8876650；或Dubel編(2007)Handbook of Therapeutic Antibodies，第3版，Wily-VCH Verlag GmbH and Co；或AbM(Oxford Molecular/MSI藥典)。如此項技術中所熟知，可變區殘基編號典型地如Chothia或Kabat所述。包含如根據Kabat、Chothia、MacCallum(亦稱為接觸)所定義之CDR及如自Abysis網站資料庫(見下文)獲得之AbM的胺基酸殘基陳述於下文表1中。應注意MacCallum係使用Chothia編號系統。
抗體序列中之可變區及CDR可根據此項技術中已開發的通用規則(如上文所述，諸如Kabat編號系統)或藉由將序列針對已知可變區之資料庫比對來鑑別。用於鑑別此等區域之方法描述於Kontermann及Dubel編，Antibody Engineering,Springer,New York,NY,2001及Dinarello等人，Current Protocols in Immunology,John Wiley and Sons Inc.,Hoboken, NJ,2000中。抗體序列之例示性資料庫描述於「Abysis」網站www.bioinf.org.uk/abs(由倫敦大學生物化學及分子生物學系(Department of Biochemistry & Molecular Biology University College London,London,England)之A.C.Martin維護)及VBASE2網站www.vbase2.org，如Retter等人，Nucl.Acids Res.,33(資料庫期刊)：D671-D674(2005)中所述，且可經由此等網站存取。
較佳使用Abysis資料庫分析序列，該資料庫整合了來自Kabat、IMGT及蛋白質資料庫(PDB)的序列資料及來自PDB的結構資料。參見Dr.Andrew C.R.Martin的書中的章節：蛋白質序列及抗體可變域的結構分析(Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains)。於：Antibody Engineering Lab Manual(編者：Duebel,S.及Kontermann,R.,Springer-Verlag,Heidelberg,ISBN-13：978-3540413547，亦可在網站bioinforg.uk/abs上獲得)。Abysis資料庫網站進一步包括已開發的通用規則以便鑑別可根據本文中之教示內容使用的CDR。隨附的圖8G至8I在SC93.253、SC93.256及SC93.267抗體之例示性重鏈及輕鏈可變區之註釋中顯示該分析的結果。除非另外指明，否則本文所闡述之所有CDR均根據Abysis資料庫網站、根據Kabat等人獲得。
就本發明中所論述之重鏈恆定區胺基酸位置而言，編號係根據首次描述於Edelman等人，1969,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1)：78-85中的Eu索引進行，該索引描述骨髓瘤蛋白質Eu(據報導為第一種經測序的人類IgG1)之胺基酸序列。Edelman之Eu索引亦闡述於Kabat等人，1991(同上)。因此，術語「如Kabat中所闡述之Eu索引」或「Kabat之Eu索引」或「Eu索引」或「Eu編號」在重鏈之情形中係指基於Edelman等人之人類IgG1
Eu抗體的殘基編號系統，如Kabat等人，1991(同上)中所闡述。輕鏈恆定區胺基酸序列所用的編號系統類似地闡述於Kabat等人，(同上)中。下文緊接著闡述與本發明相容的例示性κ(SEQ ID NO：5)及λ(SEQ ID NO：8)輕鏈恆定區胺基酸序列： (SEQ ID NO：8)。
類似地，下文緊接著闡述與本發明相容的例示性IgG1重鏈恆定區胺基酸序列： (SEQ ID NO：2)。
熟習此項技術者將瞭解，野生型(例如參見SEQ ID NO：2、5或8)或為了提供不成對半胱胺酸(例如參見SEQ ID NO：3、4、6、7、9或10)而如本文所揭示經工程改造之該等重鏈及輕鏈恆定區序列可使用標準分子生物學技術可操作地與所揭示之重鏈及輕鏈可變區結合，以提供可併入本發明之EMR2抗體藥物偶聯物中的全長抗體。構成本發明之所選抗體(hSC93.253、hSC93.253ss1、hSC93.256及hSC93.256ss1)的全長重鏈及輕鏈的序列闡述於隨附的圖8E中。
免疫球蛋白分子中存在兩種類型的二硫橋或二硫鍵：鏈間二硫鍵及鏈內二硫鍵。如此項技術中所熟知，鏈間二硫鍵的位置及數目根據免疫球蛋白類別及物種而變化。雖然本發明不限於抗體的任何特定類別或子類， 但通篇本發明中應使用IgG1免疫球蛋白以用於說明之目的。在野生型IgG1分子中，存在十二個鏈內二硫鍵(四個位於各重鏈上且兩個位於各輕鏈上)及四個鏈間二硫鍵。鏈內二硫鍵一般受到某種程度的保護且與鏈間鍵相比相對不易發生還原。反之，鏈間二硫鍵位於免疫球蛋白表面上，可供溶劑近接且通常相對容易發生還原。重鏈之間存在兩個鏈間二硫鍵且各重鏈與其相應輕鏈存在一個鏈間二硫鍵。已證明鏈間二硫鍵並非鏈結合必需的。IgG1鉸鏈區在重鏈中含有半胱胺酸，其形成鏈間二硫鍵，從而提供結構支撐以及促進Fab移動的柔性。重鏈/重鏈IgG1鏈間二硫鍵位於殘基C226及C229(Eu編號)，而IgG1之輕鏈與重鏈(重鏈/輕鏈)之間的IgG1鏈間雙硫鍵係在κ或λ輕鏈之C214與重鏈之上部鉸鏈區中之C220之間形成。
B. 抗體產生及製造
本發明抗體可使用此項技術中已知之多種方法製得。
1. 宿主動物中產生多株抗體
在各種宿主動物中產生多株抗體在此項技術中為熟知的(參見例如Harlow及Lane(編)(1988)Antibodies：A Laboratory Manual,CSH Press及Harlow等人(1989)Antibodies,NY,Cold Spring Harbor Press)。為產生多株抗體，用抗原性蛋白質或包含抗原性蛋白質之細胞或製劑對具有免疫能力之動物(例如小鼠、大鼠、兔、山羊、非人類靈長類動物等)進行免疫。一段時間之後，藉由將動物放血或處死來獲得含有多株抗體的血清。該血清可以按自動物獲得之形式使用或可使抗體部分或完全純化以提供免疫球蛋白部分或經分離抗體製劑。
就此而言，本發明抗體可由誘導具有免疫能力的動物中產生免疫反應的任何EMR2決定子產生。如本文所用，「決定子」或「標靶」意謂與 特定細胞、細胞群體或組織可鑑別地關聯或特異性地發現於特定細胞、細胞群體或組織中或上的任何可偵測性狀、特性、標記物或因子。決定子或標靶可具有形態、功能或生物化學性質且較佳具有表型。在較佳實施例中，決定子為特定細胞類型或細胞在某些條件下(例如在細胞週期之特定點期間或特定小生境下之細胞)差異表現(過度表現或表現不足)的蛋白質。出於本發明之目的，決定子較佳差異表現於異常癌細胞上且可以包含EMR2蛋白質，或其剪接變異體、同功異型物、同源物或家族成員、或其特定域、區域或抗原決定基中之任一者。「抗原」、「免疫原性決定子」、「抗原決定子」或「免疫原」意謂當引入具有免疫能力的動物中時可刺激免疫反應且由免疫反應產生的抗體識別的任何EMR2蛋白質或其任何片段、區域或域。本文中所涵蓋之EMR2決定子的存在或不存在可用於鑑別細胞、細胞亞群或組織(例如腫瘤、致瘤細胞或CSC)。
任何形式的抗原或含有抗原的細胞或製劑可用於產生特異性針對EMR2決定子的抗體。如本文所闡述，術語「抗原」係在寬泛的意義上使用且可以包含所選靶標的任何免疫原性片段或決定子，包括單個抗原決定基、多個抗原決定基、單個域或多個域，或完整胞外域(ECD)或蛋白質。抗原可為經分離之全長蛋白質、細胞表面蛋白質(例如經由在表面上表現抗原之至少一部分的細胞免疫)，或可溶蛋白質(例如僅經由蛋白質之ECD部分免疫)或蛋白質構築體(例如Fc-抗原)。可在經基因修飾之細胞中產生抗原。任一種前述抗原可單獨或與此項技術中已知的一或多種免疫原性增強佐劑組合使用。編碼抗原的DNA可為基因組DNA或非基因組DNA(例如cDNA)且可編碼足以引起免疫原性反應的ECD之至少一部分。可使用將表現抗原之細胞轉型的任何載體，包括(但不限於)腺病毒載體、慢病毒 載體、質體及非病毒載體，諸如陽離子脂質。
2. 單株抗體
在所選實施例中，本發明涵蓋單株抗體之使用。如此項技術中所知，術語「單株抗體」或「mAb」係指一種自基本上均質抗體群體獲得的抗體，亦即構成該群體的個別抗體除可以少量存在的可能突變(例如天然存在之突變)之外相同。
單株抗體可使用此項技術中已知之多種多樣的技術製備，包括融合瘤技術、重組技術、噬菌體呈現技術、轉殖基因動物(例如XenoMouse®)或其某種組合。舉例而言，單株抗體可使用融合瘤及生物化學及遺傳學工程技術產生，諸如以下文獻中更詳細地所述：舉例而言，單株抗體可使用融合瘤及生物化學及基因工程改造技術製備，諸如以下文獻中更詳細所述：An,Zhigiang(編)Therapeutic Monoclonal Antibodies：From Bench to Clinic,John Wiley and Sons，第1版，2009；Shire等人(編)Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing,Springer Science+Business Media LLC，第1版，2010；Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988；Hammerling等人，於：Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)。特異性結合至決定子之多種單株抗體產生之後，可經由各種篩選方法、基於例如其對決定子的親和力或內化速率來選擇特別有效的抗體。如本文所述製備的抗體可用作「源」抗體且進一步經修飾以例如改良針對標靶的親和力、改良其在細胞培養物中的產生、降低活體內免疫原性、產生多特異性構築體等。單株抗體產生及篩選之更詳細說明闡述於下文及隨附實例中。
3. 人類抗體
在另一個實施例中，抗體可包含完全人類抗體。術語「人類抗體」係指一種抗體，其具有與人類所產生之抗體對應的胺基酸序列且/或已使用用於製備下述人類抗體的任一種技術製備。
可使用此項技術中已知之各種技術來產生人類抗體。一種技術為噬菌體呈現，其中在噬菌體上合成(較佳人類)抗體文庫，利用所關注的抗原或其抗體結合部分篩選文庫，且分離出結合抗原的噬菌體，利用其可獲得免疫反應性片段。製備及篩選該等文庫的方法在此項技術中已熟知且用於產生噬菌體呈現文庫的套組可市購(例如Pharmacia重組噬菌體抗體系統，目錄號27-9400-01；及Stratagene SurfZAPTM噬菌體呈現套組，目錄號240612)。亦存在可用於產生及篩選抗體呈現文庫的其他方法及試劑(參見例如U.S.P.N.5,223,409；PCT公開案第WO 92/18619號、第WO 91/17271號、第WO 92/20791號、第WO 92/15679號、第WO 93/01288號、第WO 92/01047號、第WO 92/09690號；及Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7978-7982(1991))。
在一個實施例中，重組人類抗體可藉由篩選如上所製備之重組組合抗體文庫來分離。在一個實施例中，文庫為scFv噬菌體呈現文庫，該文庫係使用自B細胞分離之mRNA所製備的人類VL及VH cDNA產生。
藉由初始文庫(天然或合成)所產生的抗體可以具有中等親和力(約106至107M-1之Ka)，但亦可藉由構築第二文庫及自第二文庫再選擇來活體外模擬親和力成熟，如此項技術中所述。舉例而言，可藉由使用易錯聚合酶(Leung等人，Technique,1：11-15(1989)中所報導)活體外隨機引入突變。另外，親和力成熟可如下進行：使所選個別Fv純系中的一或多個CDR發 生隨機突變(例如使用PCR、使用攜有跨越所關注之CDR之隨機序列的引子)且篩選較高親和力純系。WO 9607754描述一種誘導免疫球蛋白輕鏈之CDR發生突變以產生輕鏈基因文庫的方法。另一種有效方法為將藉由噬菌體呈現所選的VH或VL域與獲自未免疫供者之天然存在之V域變異體之譜系重組且在數輪鏈改組中根據較高親和力來篩選，如Marks等人，Biotechnol.,10：779-783(1992)中所述。此技術允許產生解離常數KD(k解離/k結合)為約10-9M或小於10-9M的抗體及抗體片段。
在其他實施例中，可使用包含真核細胞(例如酵母)的文庫、使用類似程序，該等真核細胞在其表面上表現結合對。參見例如U.S.P.N.7,700,302及U.S.S.N.12/404,059。在一個實施例中，人類抗體係選自噬菌體文庫，其中該噬菌體文庫表現人類抗體(Vaughan等人，Nature Biotechnology 14：309-314(1996)：Sheets等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：6157-6162(1998)。在其他實施例中，可自真核細胞(諸如酵母)中所產生的組合抗體文庫分離出人類結合對。參見例如U.S.P.N.7,700,302。該等技術有利地允許篩選大量候選調節劑且對候選序列提供相對容易的操縱(例如根據親和力成熟或重組改組)。
人類抗體亦可藉由將人類免疫球蛋白基因座引入轉殖基因動物(例如其中內源性免疫球蛋白基因已部分地或完全不活化且已引入人類免疫球蛋白基因的小鼠)中來製備。攻毒之後，觀測人類抗體產生，其在所有方面與在人類中所見極其類似，包括基因重排、組裝及抗體譜系。此方法描述於例如關於XenoMouse®技術的U.S.P.N.5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016及U.S.P.N.6,075,181及6,150,584；及Lonberg及Huszar,Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995) 中。或者，人類抗體可經由產生針對靶抗原之抗體之人類B淋巴細胞之永生化來製備(該等B淋巴細胞可自罹患贅生性病症之個體回收或可能已活體外免疫)。參見例如Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第77頁(1985)；Boerner等人，J.Immunol,147(1)：86-95(1991)；及U.S.P.N.5,750,373。
無論任何來源，應瞭解人類抗體序列可使用此項技術已知的分子工程技術製造且引入表現系統及宿主細胞中，如本文所述。該等非天然重組產生人類抗體(及本發明組合物)與本發明之教示內容完全相容且明確屬於本發明之範疇內。在某些選擇態樣中，本發明的EMR2 ADC將包含重組產生的人類抗體充當細胞結合劑。
4. 衍生抗體：
一旦源抗體已如上文所述產生、選擇且分離，則其可進一步改變以提供具有改良之醫藥特徵的抗EMR2抗體。源抗體較佳使用已知的分子工程改造技術修飾或改變以提供具有所要治療特性的衍生抗體。
4.1. 嵌合及人類化抗體
本發明之所選實施例包含免疫特異性結合至EMR2且可視為「源」抗體的鼠類單株抗體。在所選實施例中，本發明抗體可衍生自該等「源」抗體，視情況經由對源抗體之恆定區及/或抗原決定基結合胺基酸序列進行修飾。在某些實施例中，若源抗體中之所選胺基酸經由缺失、突變、取代、整合或組合發生改變，則抗體「衍生」自該源抗體。在另一個實施例中，「衍生」抗體為其中源抗體之片段(例如一或多個CDR或域或完整重鏈及輕鏈可變區)與受體抗體序列組合或併入受體抗體序列中的抗體，以提供衍生抗體(例如嵌合的CDR移植或人類化抗體)。此等「衍生」抗體可使用 來自抗體產生細胞的遺傳物質及如下文所述的標準分子生物技術(諸如改良決定子的親和力；改良抗體穩定性；改良細胞培養物中的產生及產量；減少活體內免疫原性；減少毒性；促進活性部分結合；或產生多特異性抗體)產生。該等抗體亦可經由化學方式或轉譯後修飾法修飾成熟分子(例如糖基化模式或聚乙二醇化)而衍生自源抗體。
在一個實施例中，本發明抗體包含衍生自已共價連接之蛋白質區段的嵌合抗體，該等蛋白質區段來自至少兩種不同物種或類別之抗體。術語「嵌合」抗體是關於構築體，其中重鏈及/或輕鏈的一部分與來自特定物種或屬於特定抗體類別或子類的抗體中的相應序列一致或同源，而鏈的剩餘部分與來自另一物種或屬於另一抗體類別或子類的抗體中的相應序列一致或同源；以及該等抗體之片段(U.S.P.N.4,816,567)。在一些實施例中，本發明之嵌合抗體可包含可操作地連接至人類輕鏈及重鏈恆定區之所選鼠類重鏈及輕鏈可變區的全部或大部分。在其他所選實施例中，抗EMR2抗體可「衍生」自本文揭示的小鼠抗體且包含小於完整的重鏈及輕鏈可變區。
在其他實施例中，本發明之嵌合抗體為「CDR移植」抗體，其中CDR(如使用Kabat、Chothia、McCallum等所定義)衍生自特定物種或屬於特定抗體類別或子類，而抗體之其餘部分基本上衍生自另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體。用於人類時，可將一或多個所選嚙齒動物CDR(例如小鼠CDR)移植至人類接受者抗體中，從而置換人類抗體之一或多個天然存在之CDR。此等構築體一般具有提供全部強度之人類抗體功能的優點，例如補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)，同時減少個體對抗體的非所需免疫反應。在一個實施例中，CDR移植抗體將包含一或多個併入人類構架序列中之獲自小鼠的CDR。
類似於CDR移植抗體的為「人類化」抗體。如本文所用，「人類化」抗體為包含一或多個衍生自一或多種非人類抗體(供者或源抗體)之胺基酸序列(例如CDR序列)的人類抗體(接受者抗體)。在某些實施例中，可將「回復突變」引入人類化抗體中，其中接受者人類抗體之可變區之一或多個FR中的殘基經來自非人類物種供者抗體的相應殘基置換。該等回復突變可有助於維持所移植CDR之適當三維組態且藉此改良親和力及抗體穩定性。可使用來自各種供者物種的抗體，包括(但不限於)小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物。此外，人類化抗體可包含未發現於接受者抗體中或供者抗體中的新殘基，例如進一步改進抗體效能的新殘基。包含來自源抗體之鼠類組分及來自接受者抗體之人類組分的與本發明相容之CDR移植及人類化抗體可如下文實例中所述提供。
可使用此項技術中公認的各種技術確定哪個人類序列用作接受者抗體以提供本發明之人類化構築體。相容性人類生殖系序列及確定其作為接受者序列之適合性之方法的彙編揭示於例如Dubel及Reichert(編)(2014)Handbook of Therapeutic Antibodies，第2版，Wiley-Blackwell GmbH；Tomlinson,I.A.等人(1992)J.Mol.Biol.227：776-798；Cook,G.P.等人(1995)Immunol.Today 16：237-242；Chothia,D.等人(1992)J.Mol.Biol.227：799-817；及Tomlinson等人(1995)EMBO J 14：4628-4638)。亦可使用V-BASE目錄(VBASE2-Retter等人，Nucleic Acid Res.33；671-674,2005)鑑別相容性受體序列，V-BASE目錄提供人類免疫球蛋白可變區序列之全面目錄(由Tomlinson,I.A.等人彙編，MRC Centre for Protein Engineering,Cambridge,UK)。另外，共同人類構架序列(例如U.S.P.N.6,300,064中所述)亦可證實為相容性受體序列，可根據本發明之教示使用。 一般而言，根據與鼠源構架序列之同源性來選擇人類構架接受者序列，同時對源抗體及接受者抗體之CDR典型結構進行分析。接著可使用此項技術中公認之技術合成所衍生抗體之重鏈及輕鏈可變區的衍生序列。
舉例而言，CDR移植及人類化抗體以及相關方法描述於U.S.P.Ns.6,180,370及5,693,762中。關於其他細節，參見例如Jones等人，1986,(PMID：3713831)；及U.S.P.Ns.6,982,321及7,087,409。
CDR移植或人類化抗體可變區與人類接受者可變區的序列一致性或同源性可如本文中所論述加以測定且按原樣量測時，較佳共有至少60%或65%序列一致性，更佳至少70%、75%、80%、85%或90%序列一致性，甚至更佳至少93%、95%、98%或99%序列一致性。不一致殘基位置的差異較佳為保守性胺基酸取代。「保守性胺基酸取代」為胺基酸殘基經側鏈(R基)之化學性質(例如電荷或疏水性)類似之另一胺基酸殘基取代的胺基酸取代。一般而言，保守性胺基酸取代不會實質上改變蛋白質之功能特性。在其中兩個或超過兩個胺基酸序列彼此間差異為保守性取代的情況下，可上調序列一致性或相似度百分比以根據保守取代性質加以校正。
應瞭解，如附圖8A及8B中提供的所註釋CDR及構架序列係使用專有的Abysis資料庫、根據Kabat等人加以定義。然而，如本文中所論述及圖8G至8I中所示，熟習此項技術者可根據Chothia等人、ABM或MacCallum等人以及Kabat等人所提供之定義容易鑑別CDR。因而，包含一或多個根據任一前述系統獲得之CDR的抗EMR2人類化抗體明確涵蓋於本發明範疇內。
4.2. 位點特異性抗體
本發明抗體可經工程改造以促進與細胞毒素或其他抗癌劑的結合(如 下文更詳細論述)。就細胞毒素相對於抗體之位置及藥物與抗體比率(DAR)而言，抗體藥物偶聯物(ADC)製劑包含均質ADC分子群體為有利的。熟習此項技術者根據本發明可容易製造如本文所述的位點特異性工程改造構築體。如本文所用，「位點特異性抗體」或「位點特異性構築體」意謂一種抗體或其免疫反應性片段，其中重鏈或輕鏈中之至少一個胺基酸發生缺失、改變或取代(較佳經另一胺基酸取代)以提供至少一個游離半胱胺酸。類似地，「位點特異性偶聯物」應意謂一種ADC，其包含位點特異性抗體及至少一種與不成對或游離半胱胺酸結合的細胞毒素或其他化合物(例如報導分子)。在某些實施例中，不成對半胱胺酸殘基將包含不成對鏈內半胱胺酸殘基。在其他實施例中，游離半胱胺酸殘基將包含不成對鏈間半胱胺酸殘基。在其他實施例中，游離半胱胺酸可經工程改造而置入抗體胺基酸序列中(例如CH3域中)。在任何情況下，位點特異性抗體可為各種同型，例如IgG、IgE、IgA或IgD；且在彼等類別內，抗體可為各種亞類，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。對於IgG構築體而言，抗體輕鏈可包含各併有C214的κ或λ同型，在所選實施例中，C214可為不成對的，此是因為IgG1重鏈中缺乏C220殘基。
因此，除非上下文另有指示，否則如本文中所用，術語「游離半胱胺酸」或「不成對半胱胺酸」可互換使用且應意謂抗體之任何半胱胺酸(或含硫醇)成分(例如半胱胺酸殘基)，不論天然存在或使用分子工程技術特定地併入所選殘基位置，在生理條件下，其不為天然存在(或「原生」)之二硫鍵的一部分。在某些所選實施例中，游離半胱胺酸可包含天然存在之半胱胺酸，其原生鏈間或鏈內二硫橋搭配物已取代、排除或以其他方式發生使得天然存在之二硫橋在生理條件下分裂的變化，藉此呈現適用於位 點特異性結合的不成對半胱胺酸。在其他較佳實施例中，游離或不成對半胱胺酸將包含選擇性地定位於抗體重鏈或輕鏈胺基酸序列內之預定位點的半胱胺酸殘基。應瞭解，在結合之前，游離或不成對半胱胺酸可以如下形式與另一半胱胺酸或硫醇基存在於相同或不同分子上：硫醇(還原的半胱胺酸)、封端的半胱胺酸(經氧化)，或非原生分子內或分子間二硫鍵(經氧化)的一部分，此視系統的氧化態而定。如下文更詳細地論述，適當地經工程改造之抗體構築體的輕度還原將提供可供位點特異性結合使用的硫醇。相應地，在尤其較佳的實施例中，對游離或不成對半胱胺酸(不論天然存在或併入)進行選擇性還原及隨後結合以得到均質DAR組合物。
應瞭解，所揭示之經工程改造偶聯物製劑所展現的有利特性至少部分地基於特定導引結合及基本上根據結合位置及組合物之絕對DAR限制所製造偶聯物的能力加以預測。不同於大部分習知ADC製劑，本發明完全無需依賴於抗體之部分或全部還原來提供隨機結合位點及相對不受控制的DAR物質產生。實情為，在某些態樣中，本發明較佳藉由工程改造靶向抗體以使一或多個天然存在(亦即「原生」)之鏈間或鏈內二硫橋鍵分裂或將半胱胺酸殘基引入任何位置來提供一或多個預定的不成對(或游離)半胱胺酸位點。為此目的，應瞭解，在所選實施例中，半胱胺酸殘基可沿著抗體(或其免疫反應性片段)重鏈或輕鏈的任何位置併入或使用標準分子工程改造技術與其附接。在其他較佳實施例，達成原生二硫鍵分裂可與非原生半胱胺酸(其接著將包含游離半胱胺酸)之引入組合，該非原生半胱胺酸接著可用作結合位點。
在某些實施例中，經工程改造之抗體包含鏈內或鏈間半胱胺酸殘基中之至少一個胺基酸缺失或取代。如本文所用，「鏈間半胱胺酸殘基」意 謂涉及抗體輕鏈與重鏈之間或抗體之兩條重鏈之間之原生二硫鍵的半胱胺酸殘基，而「鏈內半胱胺酸殘基」為與同一重鏈或輕鏈中之另一半胱胺酸天然成對的半胱胺酸殘基。在一個實施例中，缺失或經取代的鏈間半胱胺酸殘基涉及輕鏈與重鏈之間二硫鍵的形成。在另一個實施例中，缺失或經取代的半胱胺酸殘基涉及兩條重鏈之間的二硫鍵。在一個典型實施例中，由於抗體之互補結構(其中輕鏈與重鏈之VH及CH1域成對且其中一條重鏈之CH2及CH3域與互補重鏈之CH2及CH3域成對)，因此輕鏈或重鏈中之單一半胱胺酸的突變或缺失使得經工程改造之抗體中產生兩個不成對的半胱胺酸殘基。
在一些實施例中，鏈間半胱胺酸殘基缺失。在其他實施例中，鏈間半胱胺酸經另一個胺基酸(例如天然存在之胺基酸)取代。舉例而言，胺基酸取代可使得鏈間半胱胺酸經中性殘基(例如絲胺酸、蘇胺酸或甘胺酸)或親水性殘基(例如甲硫胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸)置換。在所選實施例中，鏈間半胱胺酸經絲胺酸置換。
在一些實施例中，本發明涵蓋的缺失或經取代之半胱胺酸殘基位於輕鏈(κ或λ)上，藉此在重鏈上得到游離半胱胺酸。在其他實施例中，缺失或經取代之半胱胺酸殘基位於重鏈上，從而在輕鏈恆定區上得到游離半胱胺酸。組裝後，應瞭解完整抗體之輕鏈或重鏈中之單一半胱胺酸的缺失或取代產生具有兩個不成對半胱胺酸殘基的位點特異性抗體。
在一個實施例中，IgG輕鏈(κ或λ)之位置214的半胱胺酸(C214)缺失或經取代。在另一個實施例中，IgG重鏈之位置220的半胱胺酸(C220)缺失或經取代。在其他實施例中，重鏈之位置226或位置229的半胱胺酸缺失或經取代。在一個實施例中，重鏈上的C220經絲胺酸取代(C220S)，以 在輕鏈中提供所要的游離半胱胺酸。在另一個實施例中，輕鏈中的C214經絲胺酸取代(C214S)，以在重鏈中提供所要的游離半胱胺酸。該等位點特異性構築體更詳細地描述於下文實例中。相容位點特異性構築體的概述緊接著顯示於下文表2中，其中編號通常根據如Kabat中所列之EU索引，WT表示無變異的「野生型」或原生恆定區序列且delta(A)表示胺基酸殘基的缺失(例如C214△表示位置214的半胱胺酸殘基已缺失)。
與本發明之位點特異性構築體相容的經工程改造之例示性輕鏈及重鏈恆定區緊接著闡述於下文中，其中SEQ ID NO：3及4分別包含C220S IgG1及C220△ IgG1重鏈恆定區，SEQ ID NO：6及7分別包含C214△及C214S κ輕鏈恆定區且SEQ ID NO：9及10分別包含例示性C214△及C214S λ輕鏈恆定區。在各種情況下，改變或缺失之胺基酸(連同側接殘基)的位點加有下劃線。
(SEQ ID NO：3)
(SEQ ID NO：4)
(SEQ ID NO：6)
(SEQ ID NO：7)
(SEQ ID NO：9)
(SEQ ID NO：10)
如上文所論述，重鏈及輕鏈變異體中的每一者可操作地與所揭示之重鏈及輕鏈可變區(或其衍生物，諸如人類化或CDR移植構築體)結合，以提供如本文所揭示的位點特異性抗EMR2抗體。該等經工程改造之抗體與所揭示之ADC的用途特別相容。
就引入或添加半胱胺酸殘基以提供游離半胱胺酸(相較於原生二硫鍵分裂)而言，抗體或抗體片段上的相容性位置可容易由熟習此項技術者辨別。因此，在所選實施例中，可將半胱胺酸引入CH1域、CH2域或CH3域或其任何組合中，此視所要DAR、抗體構築體、所選有效載物及抗體標靶而定。在其他較佳實施例中，可將半胱胺酸引入κ或λ CL域中且在尤其較佳的實施例中，引入CL域之C末端區域中。在每種情況下，半胱胺酸插入位點鄰近的其他胺基酸殘基可加以改變、移除或經取代，以促進分子穩定性、結合效率或在有效載物連接後為有效載物提供保護環境。在特定實施例中，經取代之殘基存在於抗體之任何可近接位點。藉由半胱胺酸取代該等表面殘基，從而使反應性硫醇基定位於抗體上之容易近接位點且可如本文中進一步所述選擇性地加以還原。在特定實施例中，經取代之殘基存在於抗體之可近接位點處。藉由半胱胺酸取代彼等殘基，從而使反應性硫 醇基定位於抗體之可近接位點且可用於選擇性地與抗體結合。在某些實施例中，以下殘基中之任一或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)；重鏈之A118(Eu編號)；及重鏈Fc區之S400(Eu編號)。其他取代位置及製造相容性位點特異性抗體之方法闡述於U.S.P.N.7,521,541中，該文獻全文併入本文中。
如本文所揭示用於產生具有定義之位點及化學計量之藥物負載量之抗體藥物偶聯物的策略廣泛適用於所有抗EMR2抗體，因為其主要涉及對抗體之保守性恆定域進行的工程改造。由於各類及子類抗體之胺基酸序列及原生二硫橋已有充分記錄，因此熟習此項技術者無需過度實驗便可容易製得不同抗體之經工程改造構築體，且相應地，該等構築體明確地涵蓋於本發明範疇內。對於包含如本發明中所述之重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列之全部或一部分的位點特異性構築體而言，此尤為真實。
4.3. 恆定區修飾及改變之糖基化
本發明的所選實施例亦可包含恆定區(亦即Fc區)之取代或修飾，包括(但不限於)胺基酸殘基取代、突變及/或修飾，其使得化合物具有包括(但不限於)以下之特徵：改變之藥物動力學、延長之血清半衰期、提高之結合親和力、減低之免疫原性、增加之產量、Fc配位體與Fc受體(FcR)之結合改變、增強或降低之ADCC或CDC、改變之糖基化及/或二硫鍵及經修改之結合特異性。
具有改良之效應功能的化合物可經由例如Fc域與Fc受體(例如FcγRI、FcγRIIA及B、FcγRIII及FcRn)之間相互作用所涉及之胺基酸殘基的改變來產生，從而可增強細胞毒性及/或改變藥物動力學，諸如延長的血清半衰期(參見例如Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)； Capel等人，Immunomethods 4：25-34(1994)；及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。
在所選實施例中，活體內半衰期延長的抗體可藉由修改(例如取代、缺失或添加)胺基酸殘基來產生，該等胺基酸殘基經鑑別為涉及Fc域與FcRn受體之間的相互作用(參見例如國際公開案第WO 97/34631號；第WO 04/029207號；U.S.P.N.6,737,056及U.S.P.N.2003/0190311)。關於該等實施例，Fc變異體在哺乳動物(較佳為人類)中的半衰期可為大於5天、大於10天、大於15天、較佳大於20天、大於25天、大於30天、大於35天、大於40天、大於45天、大於2個月、大於3個月、大於4個月，或大於5個月。半衰期延長使得血清效價較高，從而降低抗體投與頻率且/或降低所投與之抗體濃度。可分析人類FcRn高親和性結合多肽例如在轉殖基因小鼠或經表現人類FcRn之人類細胞株轉染之小鼠中或在具有變異型Fc區之多肽所投與的靈長類動物中對人類FcRn的活體內結合及血清半衰期。WO 2000/42072描述與FcRns之結合改良或減弱之抗體變異體。亦參見例如Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。
在其他實施例中，Fc變異可引起ADCC或CDC活性增強或降低。如此項技術中所知，CDC係指靶細胞在補體存在下溶解，且ADCC係指一種細胞毒性形式，其中結合至某些細胞毒性細胞(例如天然殺手細胞、嗜中性球及巨噬細胞)上所存在之FcRs的所分泌Ig使得此等細胞毒性效應細胞能夠特異性地結合至攜有抗原的靶細胞且隨後以細胞毒素殺死靶細胞。在本發明之上下文中，抗體變異體具有「改變」之FcR結合親和力，相較於親本或未修飾之抗體或相較於包含原生序列FcR的抗體，抗體變異體的結合增強或減弱。顯示減小之結合的該等變異體可具有極小或不明顯的結合， 例如相較於原生序列為0-20%之與FcR之結合，例如如藉由此項技術中熟知的技術所測定。在其他實施例中，相較於原生免疫球蛋白Fc域，變異體將展現增強的結合。應瞭解，此等類型的Fc變異體可有利地用於增強所揭示之抗體的有效抗贅生特性。在又其他實施例中，該等變異引起結合親和力增強、免疫原性降低、產量增加、糖基化及/或二硫鍵改變(例如用於結合位點)、結合特異性修改、吞噬增加；及/或細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)下調等。
其他實施例包含一或多種經工程改造之糖型，例如包含改變之糖基化模式或改變之碳水化合物組合物與蛋白質共價連接(例如在Fc域中)的位點特異性抗體。參見例如Shields,R.L.等人，(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740。經工程改造之糖型可適用於多種目的，包括(但不限於)增強或降低效應功能、提高抗體對標靶之親和力或促進抗體產生。在需要降低效應功能的某些實施例中，分子可經工程改造以表現去糖基化形式。可促使一或多個可變區構架糖基化位點排除以藉此排除該位點發生之糖基化的取代已熟知(參見例如U.S.P.Ns.5,714,350及6,350,861)。反之，藉由工程改造一或多個其他糖基化位點可賦予含Fc分子增強的效應功能或改良之結合。
其他實施例包括具有改變之糖基化組成的Fc變異體，諸如海藻糖基殘基之量減少之低海藻糖基化抗體或二等分GlcNAc結構增加之抗體。已證明該等經改變之糖基化模式會提高抗體之ADCC能力。經工程改造之糖型可藉由熟習此項技術者已知的任何方法產生，例如經工程改造經工程改造或變異型表現株系、藉由與一或多種酶(例如N-乙醯胺基葡萄糖轉移酶III(GnTIII))共表現、藉由在不同生物體或來自不同生物體之細胞株中表 現包含Fc區的分子或藉由在包含Fc區的分子已表現之後修飾碳水化合物(參見例如WO 2012/117002)。
4.4. 片段
不論選擇抗體之何種形式(例如嵌合、人類化等)來實施本發明，均應瞭解可根據本文中之教示內容使用其免疫反應性片段本身或將其免疫反應性片段作為抗體藥物偶聯物的一部分使用。「抗體片段」包含完整抗體之至少一部分。如本文所用，術語抗體分子之「片段」包括抗體之抗原結合片段，且術語「抗原結合片段」係指免疫球蛋白或抗體之多肽片段，其免疫特異性地結合所選抗原或其免疫原性決定子或與所選抗原或其免疫原性決定子反應或與片段所來源之完整抗體競爭用於特異性抗原結合。
例示性免疫反應性片段包括：可變輕鏈片段(VL)、可變重鏈片段(VH)、scFvs、F(ab')2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段、單域抗體片段、雙功能抗體、線性抗體、單鏈抗體分子及由抗體片段形成的多特異性抗體。另外，活性位點特異性片段包含抗體之一部分，該部分保持與抗原/受質或受體相互作用且以類似於完整抗體之方式修飾其(然而效率在某種程度上降低)的能力。該等抗體片段可進一步加以工程改造以包含如本文所述的一或多個游離半胱胺酸。
在尤其較佳的實施例中，EMR2結合域將包含scFv構築體。如本文所用，「單鏈可變片段(scFv)」意謂衍生自保留有與抗原結合之能力的抗體之單鏈多肽。scFv之實例包括藉由重組DNA技術形成之抗體多肽，且其中免疫球蛋白重鏈及輕鏈片段之Fv區域經由間隔子序列連接。scFv之各種製備方法已知，且包括U.S.P.N.4,694,778中所述之方法。
在其他實施例中，抗體片段為包含Fc區且保持至少一種通常與Fc區 相關之生物學功能(當存在於完整抗體中時，諸如FcRn結合、抗體半衰期調節、ADCC功能及補體結合)的片段。在一個實施例中，抗體片段為活體內半衰期實質上類似於完整抗體的單價抗體。舉例而言，該種抗體片段可包含連接至Fc序列的抗原結合臂，該Fc序列包含至少一個能夠賦予該片段活體內穩定性的游離半胱胺酸。
如熟習此項技術者所充分認知，片段可藉由分子工程改造或經由化學或酶促處理(諸如番木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)完整或整個抗體或抗體鏈或藉由重組方式獲得。關於抗體片段的更詳細描述，參見例如Fundamental Immunology,W.E.Paul編，Raven Press,N.Y.(1999)。
在所選實施例中，本發明之抗體片段將包含可以不同組態使用的ScFv構築體。舉例而言，該等抗EMR2 ScFv構築體可用於治療腫瘤的授受性免疫基因療法中。在某些實施例中，本發明抗體(例如ScFv片段)可用於產生免疫選擇性地與EMR2反應的嵌合抗原受體(CAR)。根據本發明，抗EMR2 CAR為包含本發明抗EMR2抗體或其免疫反應性片段(例如ScFv片段)、跨膜域及至少一個胞內域的融合蛋白。在某些實施例中，可將已經基因工程改造以表現抗EMR2 CAR的T細胞、天然殺手細胞或樹突狀細胞引入罹患癌症的個體中，以便刺激該個體之免疫系統特異性地靶向表現EMR2的腫瘤細胞。在一些實施例中，本發明之CARs將包含起始初級細胞質信號傳導序列(亦即，經由T細胞受體複合物起始抗原依賴性初始活化的序列)的胞內域，例如來源於CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d的胞內域。在其他實施例中，本發明之CAR將包含起始二次或共刺激信號的胞內域，例如來源於CD2、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD28、CD134、CD137、ICOS、 CD154、4-1BB及糖皮質激素誘導性腫瘤壞死因子受體的胞內域(參見U.S.P.N.US/2014/0242701)。
4.5. 多價構築體
在其他實施例中，本發明之抗體及偶聯物可為單價或多價的(例如二價、三價等)。如本文所用，術語「價數」係指與抗體相關之潛在標靶結合位點的數目。每個標靶結合位點特異性地結合一個靶分子或靶分子上的特定位置或基因座。當抗體為單價時，分子之各結合位點將特異性結合至單一抗原位置或抗原決定基。當抗體包含超過一個標靶結合位點(多價)時，各標靶結合位點可特異性結合相同或不同分子(例如可結合至不同配位體或不同抗原，或相同抗原上的不同抗原決定基或位置)。參見例如U.S.P.N.2009/0130105。
在一個實施例中，抗體為雙特異性抗體，其中兩條鏈具有不同特異性，如Millstein等人，1983,Nature,305：537-539中所述。其他實施例包括具有額外特異性的抗體，諸如三特異性抗體。其他更複雜的相容多特異性構築體及其製造方法闡述於U.S.P.N.2009/0155255以及WO 94/04690；Suresh等人，1986,Methods in Enzymology,121：210；及WO96/27011中。
多價抗體可免疫特異性結合至所要靶分子之不同抗原決定基或可免疫特異性地結合至靶分子以及異質抗原決定基，諸如異質多肽或固體載體物質。雖然所選實施例可僅結合兩種抗原(亦即雙特異性抗體)，但本發明亦涵蓋具有額外特異性的抗體，諸如三特異性抗體。雙特異性抗體亦包括交聯或「異結合」抗體。舉例而言，異偶聯物中之抗體之一可與抗生素蛋白偶合，另一抗體與生物素偶合。舉例而言，已提出該等抗體使免疫系統細胞靶向非所需細胞(U.S.P.N.4,676,980)及治療HIV感染(WO 91/00360、 WO 92/200373及EP 03089)。異偶聯物抗體可使用任何適宜的交聯方法製備。適合的交聯劑在此項技術中已熟知，且與多種交聯技術一起揭示於U.S.P.N.4,676,980中。
5. 抗體之重組產生
抗體及其片段可使用自產抗體細胞獲得之遺傳物質及重組技術產生或修飾(參見例如Dubel及Reichert(編)(2014)Handbook of Therapeutic Antibodies，第2版，Wiley-Blackwell GmbH；Sambrook及Russell(編)(2000)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第3版)，NY,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel等人，(2002)Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,John & Sons,Inc.；及U.S.P.N.7,709,611)。
本發明之另一態樣係關於編碼本發明抗體的核酸分子。核酸可存在於全細胞、細胞溶胞物中或以部分純化或基本上純的形式存在。核酸當藉由標準技術(包括鹼性/SDS處理、CsCl聚束、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及在此項技術中熟知的其他技術)而與其他細胞組分或其他污染物(例如其他細胞核酸或蛋白質)分離時，為「經分離」或呈實質上純的。本發明之核酸可為例如DNA(例如基因組DNA、cDNA)、RNA及其人工變異體(例如肽核酸)(不論單股或雙股或RNA、RNA)，且可或可不含有內含子。在所選實施例中，核酸為cDNA分子。
本發明之核酸可使用標準分子生物學技術獲得。對於由融合瘤(例如如下文實例中所述製備之融合瘤)表現的抗體而言，可藉由標準PCR擴增或cDNA選殖技術獲得編碼抗體輕鏈及重鏈的cDNA。對於獲自免疫球蛋 白基因文庫的抗體(例如使用噬菌體呈現技術)而言，可自文庫中回收編碼抗體的核酸分子。
編碼VH及VL區段的DNA片段可藉由標準重組DNA技術進一步操縱，例如將可變區基因轉變為全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在此等操縱中，編碼VL或VH之DNA片段可操作地連接至編碼另一蛋白質(諸如抗體恆定區或柔性連接體)之另一DNA片段。如本文中所用，術語「可操作地連接」意謂兩個DNA片段以使得由該兩個DNA片段編碼之胺基酸序列保持同框的方式連接。
編碼VH區之經分離DNA可藉由使編碼VH之DNA可操作地連接至編碼重鏈恆定區(在IgG1情況下，為CH1、CH2及CH3)之另一DNA分子來轉變成全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因序列在此項技術中已知(參見例如Kabat等人(1991)(同上))且涵蓋此等區域之DNA片段可以藉由標準PCR擴增獲得。重鏈恆定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但最佳為IgG1或IgG4恆定區。例示性IgG1恆定區闡述於SEQ ID NO：2中。對於Fab片段重鏈基因而言，編碼VH之DNA可操作地連接至僅編碼重鏈CH1恆定區之另一DNA分子。
編碼VL區之經分離DNA可藉由將編碼VL之DNA可操作地連接至編碼輕鏈恆定區CL之另一DNA分子來轉變成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因序列在此項技術中已知(參見例如Kabat等人(1991)(同上))且涵蓋此等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區，但最佳為κ恆定區。例示性相容κ輕鏈恆定區闡述於SEQ ID NO：5中，而例示性相容λ輕鏈恆定區闡述於SEQ ID NO：8中。
在各種情況下，可使VH或VL域可操作地連接至其相應恆定區(CH或CL)，其中恆定區為位點特異性恆定區且提供位點特異性抗體。在所選實施例中，所得位點特異性抗體將包含位於重鏈上的兩個不成對半胱胺酸，而在其他實施例中，位點特異性抗體將包含位於CL域中的兩個不成對半胱胺酸。
本文中涵蓋展現與本發明之多肽具有「序列一致性」、「序列相似性」或「序列同源性」的某些多肽(例如抗原或抗體)。舉例而言，衍生的人類化抗體VH或VL域可與源(例如鼠類)或接受者(例如人類)VH或VL域展現序列相似性。「同源」多肽可展現65%、70%、75%、80%、85%或90%序列一致性。在其他實施例中，「同源」多肽可展現93%、95%或98%序列一致性。如本文所用，兩個胺基酸序列之間的同源百分比等效於兩個序列之間的一致性百分比。在考慮為了達成兩個序列之最佳比對而需引入之空隙數目及各空隙長度的情況下，兩個序列之間的一致性百分比為該等序列所共有之一致位置之數目的函數(亦即同源%=一致位置數目/位置總數目×100)。如下文非限制性實例中所述，序列比較及測定兩個序列之間的一致性百分比可使用數學演算法完成。
兩個胺基酸序列之間的一致性百分比可使用E.Meyers及W.Miller(Comput.Appl.Biosci.,4：11-17(1988))之演算法(其已併入ALIGN程式(2.0版)中)、使用PAM120權重殘基表、空隙長度罰分12及空隙罰分4來確定。另外，兩個胺基酸序列之間的一致性百分比可使用Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))演算法(其已併入GCG軟體套件(可在www.gcg.com獲得)中之GAP程式中)，使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣，及空隙權數16、14、12、10、8、6或4及長度權數1、2、 3、4、5或6來確定。
另外地或可替代地，本發明之蛋白質序列可進一步用作「查詢序列」以對公共資料庫進行搜尋，例如鑑別相關序列。此等檢索可使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10之XBLAST程式(2.0版)進行。BLAST蛋白質搜尋可使用XBLAST程式、分數=50、字長=3來進行，以獲得與本發明之抗體分子同源的胺基酸序列。為使空隙比對達成比較目的，可如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中所述使用空隙式BLAST。當利用BLAST及空隙式BLAST程式時，可使用相應程式(例如XBLAST及NBLAST)之預設參數。
不一致的殘基位置可因保守性胺基酸取代或因非保守性胺基酸取代而不同。「保守性胺基酸取代」為胺基酸殘基經側鏈之化學性質(例如電荷或疏水性)類似之另一胺基酸殘基取代的胺基酸取代。一般而言，保守性胺基酸取代不會實質上改變蛋白質之功能特性。在其中兩個或超過兩個胺基酸序列彼此間差異為保守性取代的情況下，可上調序列一致性或相似度百分比以根據保守取代性質加以校正。在經非保守性胺基酸取代的情況下，在實施例中，展現序列一致性的多肽將保持本發明多肽(例如抗體)的所要功能或活性。
本文中亦涵蓋展現與本發明之核酸具有「序列一致性」、「序列相似性」或「序列同源性」的核酸。「同源序列」意謂展現至少約65%、70%、75%、80%、85%或90%序列一致性的核酸分子序列。在其他實施例中，核酸之「同源序列」可展現與參考核酸93%、95%或98%的序列一致性。
本發明亦提供包含上述該等核酸的載體，其可可操作地連接至啟動子(參見例如WO 86/05807；WO 89/01036；及U.S.P.N.5,122,464)；及 真核分泌路徑中之其他轉錄調節及加工控制元件。本發明亦提供含有彼等載體的宿主細胞及宿主表現系統。
如本文所使用，術語「宿主表現系統」包括任何種類的細胞系統，其可經工程改造以產生本發明之核酸或多肽及抗體。該等宿主表現系統包括(但不限於)經重組噬菌體DNA或質體DNA轉型或轉染的微生物(例如大腸桿菌(E.coli)或枯草桿菌(B.subtilis))；經重組酵母表現載體轉染的酵母(例如酵母屬(Saccharomyces))；或含有重組表現構築體的哺乳動物細胞(例如COS、CHO-S、HEK293T、3T3細胞)，該等重組表現構築體含有來源於哺乳動物細胞或病毒之基因組的啟動子(例如腺病毒晚期啟動子)。宿主細胞可經兩種表現載體共轉染，例如編碼重鏈衍生之多肽的第一載體及編碼輕鏈衍生之多肽的第二載體。
哺乳動物細胞轉型方法在此項技術中已熟知。參見例如U.S.P.N.s.4,399,216、4,912,040、4,740,461及4,959,455。宿主細胞亦可經工程改造以便產生具有不同特徵的抗原結合分子(例如經修飾之糖型或具有GnTIII活性的蛋白質)。
為長期高產量產生重組蛋白質，較佳為穩定表現。因此，穩定表現所選抗體的細胞株可使用此項技術所公認之標準技術加以工程改造且形成本發明之一部分。宿主細胞可經藉由適當表現控制元件(例如啟動子或增強子序列、轉錄終止子、聚腺苷酸化位點等)及可選標記物控制之DNA轉型，而非使用含有病毒複製起點的表現載體轉型。可使用此項技術中熟知的任一種選擇系統，包括為在所選條件下增強表現提供有效途徑的麩醯胺酸合成酶基因表現系統(GS系統)。GS系統完整或部分地論述於EP 0 216 846、EP 0 256 055、EP 0 323 997及EP 0 338 841及U.S.P.N.s 5,591,639 及5,879,936中。用於開發穩定細胞株的另一相容性表現系統為FreedomTM CHO-S套組(Life Technologies)。
本發明抗體已藉由重組表現或所揭示之任何其他技術產生後，其可藉由此項技術中已知之方法純化或分離，從而對其進行鑑別及自其天然環境中分離及/或回收及與會干擾抗體或相關ADC之診斷或治療性用途的污染物分離。分離抗體包括原位存在於重組細胞內的抗體。
此等經分離製劑可使用此項技術中公認的各種技術加以純化，諸如離子交換及尺寸排阻層析、透析、透濾及親和層析，特定言之，蛋白質A或蛋白質G親和層析。相容性方法更充分地論述於下文實例中。
6. 產生後選擇
不管如何獲得，抗體產生細胞(例如融合瘤、酵母群落等)可加以選擇、選殖且根據所要特徵(包括例如穩定生長、高抗體產量及所要抗體特徵，諸如針對所關注抗原之高親和性)進一步篩選。融合瘤可活體外在細胞培養物中擴增或活體內在同基因型免疫功能不全動物中擴增。選擇、選殖及擴增融合瘤及/或群落之方法已為一般技術者熟知。鑑別出所要抗體之後，可使用此項技術中公認的通用分子生物學及生物化學技術分離、操縱及表現相關遺傳物質。
藉由初始文庫(天然或合成)產生的抗體可具有中等親和力(Ka為約106至107M-1)。為了增強親和力，可以藉由構築抗體文庫(例如，藉由使用易錯聚合酶活體外引入隨機突變)且自彼等二級文庫再選擇對抗原具有高親和力之抗體(例如藉由使用噬菌體或酵母呈現術)來活體外模擬親和力成熟。WO 9607754描述一種誘導免疫球蛋白輕鏈之CDR發生突變以產生輕鏈基因文庫的方法。
可利用各種技術選擇抗體，包括(但不限於)噬菌體或酵母呈現術，其中利用噬菌體或酵母合成人類組合抗體或scFv片段之文庫，利用所關注之抗原或其抗體結合部分篩選文庫，且分離出結合抗原的噬菌體或酵母，利用該噬菌體或酵母可獲得抗體或免疫反應性片段(Vaughan等人，1996,PMID：9630891；Sheets等人，1998,PMID：9600934；Boder等人，1997,PMID：9181578；Pepper等人，2008,PMID：18336206)。用於產生噬菌體或酵母呈現文庫的套組可市購。亦存在可用於產生及篩選抗體呈現文庫的其他方法及試劑(U.S.P.N.5,223,409；WO 92/18619、WO 91/17271、WO 92/20791、WO 92/15679、WO 93/01288、WO 92/01047、WO 92/09690；及Barbas等人，1991,PMID：1896445)。該等技術有利地允許篩選大量候選抗體且提供相對容易的序列操控(例如藉由重組改組)。
IV. 抗體特徵
在某些實施例中，抗體產生細胞(例如融合瘤或酵母群落)可加以選擇、選殖且根據有利特性(包括例如穩定生長、高抗體產量及如下文更詳細論述的所要位點特異性抗體特徵)來進一步篩選。在其他情況下，可藉由選擇用於接種動物的特定抗原(例如特異性EMR2同功異型物)或靶抗原之免疫反應性片段來賦予抗體特徵。在其他實施例中，所選抗體可如上文所述經工程改造以增強或改進免疫化學特徵，諸如親和力或藥物動力學。
A. 中和抗體
在所選實施例中，本發明抗體可為「拮抗劑」或「中和」抗體，此意謂該抗體可與決定子結合且阻斷或抑制該決定子之活性，此阻斷或抑制為直接的或藉由防止決定子與結合搭配物(諸如配位體或受體)結合，藉此中斷原本會由分子相互作用引起的生物學反應。當過量抗體使結合至決定 子之結合搭配物的量降低至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或超過99%時，中和或拮抗劑抗體將實質上抑制決定子與其配位體或受質的結合，如例如藉由靶分子活性或在活體外競爭性結合分析中所量測。應瞭解，經調節之活性可直接使用此項技術中公認之技術量測或可根據改變之活性對下游的影響(例如致癌性或細胞存活)來量測。
B. 內化抗體
在某些實施例中，抗體可包含內化抗體，以便抗體結合至決定子且內化(隨著任何所結合之醫藥活性部分一起)至所選靶細胞(包括致瘤細胞)中。內化之抗體分子數目可足以殺死表現抗原之細胞，尤其表現抗原之致瘤細胞。視抗體或(在一些情況下)抗體藥物偶聯物之效能而定，單一抗體分子吸收於細胞中可足以殺死抗體所結合的靶細胞。就本發明而言，有證據表明所表現之EMR2蛋白質的實質性部分仍與致瘤細胞表面結合，從而允許所揭示之抗體或ADC定位及內化。在所選實施例中，該等抗體將與內化後殺死細胞的一或多種藥物締合或結合。在一些實施例中，本發明之ADC將包含內化位點特異性ADC。
如本文所用，「內化」的抗體為結合至相關決定子後被靶細胞吸收(與任何所結合之細胞毒素一起被吸收)的抗體。所內化之該等ADC的數目較佳足以殺死表現決定子的細胞，尤其表現決定子的癌症幹細胞。視細胞毒素或ADC整體上之效能而定，在一些情況下，少數抗體分子吸收至細胞中足以殺死抗體所結合的靶細胞。舉例而言，某些藥物(諸如PBD或卡奇黴素(calicheamicin))如此強效以致與抗體結合之少數毒素分子的內化足以殺死靶細胞。抗體結合至哺乳動物細胞後是否內化可藉由此項技術中 公認的各種分析(例如皂草素分析，諸如Mab-Zap及Fab-Zap；Advanced Targeting Systems)來確定，包括下文實例中所述的彼等分析。偵測抗體是否內化至細胞中的方法亦描述於U.S.P.N.7,619,068中。
C. 耗乏性抗體
在其他實施例中，本發明抗體為耗乏性抗體。術語「耗乏性」抗體係指一種抗體，其優先結合至細胞表面上或附近的抗原且誘導、促進或引起細胞死亡(例如藉由CDC、ADCC或引入細胞毒性劑)。在實施例中，所選耗乏性抗體將與細胞毒素結合。
較佳地，耗乏性抗體將能殺死所定義細胞群體中之至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%或99%之EMR2表現細胞。在一些實施例中，細胞群體可包含富集、切片、純化或分離之致瘤細胞，包括癌症幹細胞。在其他實施例中，細胞群體可包含全腫瘤樣品或包含癌症幹細胞的非均質腫瘤萃取物。可利用標準生物化學技術、根據本文中之教示內容來監測及量化致瘤細胞之耗乏。
D. 結合親和力
本文中揭示對特定決定子(例如EMR2)具有高結合親和力的抗體。術語「KD」係指特定抗體-抗原相互作用之解離常數或表觀親和力。當解離常數KD(k解離/k結合)為10-7M時，本發明抗體可免疫特異性地結合其靶抗原。當KD 5×10-9M時，抗體以高親和力特異性地結合抗原，且當KD 5×10-10M時，抗體以非常高的親和力特異性地結合抗原。在本發明之一個實施例中，抗體具有10-9M之KD及約1×10-4/sec之解離速率。在本發明之一個實施例中，解離速率為<1×10-5/sec。在本發明之其他實施例中，抗體將以約10-7M與10-10M之間的KD結合至決定子，且在又另一 個實施例中，其將以KD 2×10-10M結合。本發明之又其他所選實施例包含具有以下KD(k解離/k結合)之抗體：小於10-6M、小於5×10-6M、小於10-7M、小於5×10-7M、小於10-8M、小於5×10-8M、小於10-9M、小於5×10-9M、小於10-10M、小於5×10-10M、小於10-11M、小於5×10-11M、小於10-12M、小於5×10-12M、小於10-13M、小於5×10-13M、小於10-14M、小於5×10-14M、小於10-15M或小於5×10-15M。
在某些實施例中，免疫特異性結合至決定子(例如EMR2)的本發明抗體可具有至少105M-1s-1、至少2×105M-1s-1、至少5×105M-1s-1、至少106M-1s-1、至少5×106M-1s-1、至少107M-1s-1、至少5×107M-1s-1或至少108M-1s-1之結合速率常數或k 結合 (或k a )速率(抗體+抗原(Ag)k 結合←抗體-Ag)。
在另一實施例中，免疫特異性地結合至決定子(例如EMR2)的本發明抗體可具有的解離速率常數或k 解離 (或k d )速率(抗體+抗原(Ag)k 解離←抗體-Ag)小於10-1s-1、小於5×10-1s-1、小於10-2s-1、小於5×10-2s-1、小於10-3s-1、小於5×10-3s-1、小於10-4s-1、小於5×104s-1、小於10-5s-1、小於5×10-5s-1、小於10-6s-1、小於5×10-6s-1、小於10-7s-1、小於5×10-7s-1、小於10-8s-1、小於5×10-8s-1、小於10-9s-1、小於5×10-9s-1或小於10-10s-1。
結合親和力可使用此項技術中已知的各種技術測定，例如表面電漿子共振、生物層干涉法、雙重極化干涉法、靜態光散射、動態光散射、等溫滴定熱量測定法、ELISA、分析型超離心法及流式細胞術。
E. 分組及抗原決定基定位
本文中揭示的抗體可根據其所結合之離散抗原決定基加以表徵。「抗原決定基」為抗體或免疫反應性片段所特異性結合之決定子的一部分。免疫特異性結合可根據如上文所述的結合親和力或根據抗體對蛋白質及/或 大分子之複合混合物中之其靶抗原之優先識別(例如在競爭分析中)來證實及定義。「線性抗原決定基」係由抗原中之允許抗體發生免疫特異性結合之鄰接胺基酸形成。優先結合線性抗原決定基的能力典型地得以維持，即使抗原變性時。反之，「構形抗原決定基」在抗原之胺基酸序列中通常包含非鄰接胺基酸，但在抗原之二級、三級或四級結構的背景下，充分接近而被單一抗體伴隨性結合。當具有構形抗原決定基的抗原變性時，抗體典型地將不再識別抗原。抗原決定基(鄰接或非鄰接)在獨特的空間構形中典型地包括至少3個且更通常至少5個或8-10個或12-20個胺基酸。
本發明抗體亦可根據其所屬之群組或「分組」來表徵。「分組」係指使用競爭性抗體結合分析來鑑別不能同時結合免疫原性決定子的抗體對，從而鑑別「競爭」結合的抗體。競爭性抗體可藉由分析來確定，其中所測試之抗體或免疫功能片段防止或抑制參考抗體特異性結合至共同抗原。典型地，該種分析涉及使用結合至固體表面或細胞、未標記測試抗體及經標記參考抗體的純化抗原(例如EMR2或域或其片段)。競爭性抑制係藉由在測試抗體存在下測定結合至固體表面或細胞之標記的量來量測。關於測定競爭性結合之方法的其他細節提供於本文實例中。通常，當競爭性抗體過量存在時，其將參考抗體與共同抗原的特異性結合抑制至少30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些情況下，結合被抑制至少80%、85%、90%、95%或97%或超過97%。反之，當結合參考抗體時，其較佳將隨後添加之測試抗體(亦即EMR2抗體)之結合抑制至少30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些情況下，測試抗體之結合被抑制至少80%、85%、90%、95%或97%或超過97%。
一般而言，分組或競爭性結合可使用此項技術中公認的各種技術來測定，諸如免疫分析，諸如西方墨點法、放射免疫分析、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、「夾心」免疫分析、免疫沈澱分析、沈澱素反應、凝膠擴散沈澱素反應、免疫擴散分析、凝集分析、補體固著分析、免疫放射分析、螢光免疫分析及蛋白質A免疫分析。該等免疫分析為常規分析且在此項技術中已熟知(參見Ausubel等人編，(1994)Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons,Inc.,New York)。另外，可使用交叉阻斷分析(參見例如WO 2003/48731；及Harlow等人(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Harlow及David Lane編)。
用於測定競爭性抑制的其他技術(且因此為「分組」)包括：使用例如BIAcoreTM 2000系統(GE Healthcare)的表面電漿子共振；使用例如ForteBio® Octet RED(ForteBio)的生物層干涉法；或使用例如FACSCanto II(BD Biosciences)或多工LUMINEXTM偵測分析(Luminex)的流式細胞術珠粒陣列。
Luminex為基於珠粒的免疫分析平台，其能夠實現大規模多工抗體配對。該分析係比較抗體對針對靶抗原的同時結合模式。抗體對中之一抗體(捕捉mAb)結合至Luminex珠粒，其中各捕捉mAb結合至不同顏色之珠粒。另一抗體(偵測mAb)結合至螢光信號(例如藻紅素(PE))。該分析係分析抗體對抗原的同時結合(成對)且將具有類似成對概況之抗體歸類在一起。偵測mAb與捕捉mAb之概況類似表示此兩種抗體結合至相同或密切相關的抗原決定基。在一個實施例中，成對概況可使用皮爾森相關係數(Pearson correlation coefficients)來確定以鑑別與所測試之抗體群組中之任何特定 抗體最密切相關的抗體。在實施例中，若抗體對之皮爾森相關係數為至少0.9，則測試/偵測mAb確定為與參考/捕捉mAb同組。在其他實施例中，皮爾森相關係數為至少0.8、0.85、0.87或0.89。在其他實施例中，皮爾森相關係數為至少0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或1。分析獲自Luminex分析之資料的其他方法描述於U.S.P.N.8,568,992中。Luminex能夠同時分析100種不同類型之珠粒(或超過100種)使得抗原及/或抗體表面幾乎不受限制，從而改良生物感測分析中之處理量及抗體抗原決定基分析之解析度(Miller等人，2011,PMID：21223970)。
包含表面電漿子共振的類似分組技術與本發明相容。如本文所用，「表面電漿子共振」係指允許藉由偵測生物感測器基質內之蛋白質濃度變化來分析即時特異性相互作用的光學現象。若所選抗體彼此間競爭結合至所定義抗原，則其可容易使用市售設備(諸如BIAcoreTM 2000系統)測定。
在其他實施例中，可用於確定測試抗體是否與參考抗體「競爭」結合的技術為「生物層干涉法」，一種光學分析技術，其分析自兩個表面反射之白光的干涉圖案：生物感測器尖端上之所固著蛋白質層，及內部參考層。結合至生物感測器尖端之分子數目的任何變化導致可即時量測之干涉圖案的轉移。該等生物層干涉法分析可以使用ForteBio® Octet RED機器如下執行。參考抗體(Ab1)捕捉於抗小鼠捕捉晶片上，接著使用高濃度的非結合抗體阻斷晶片且收集基線。接著用特異性抗體(Ab1)捕捉單體、重組靶蛋白且將尖端浸漬於具有相同抗體(Ab1)作為對照物的孔中或具有不同測試抗體(Ab2)的孔中。若未發生進一步結合(如藉由與對照Ab1比較結合程度所確定)，則Ab1與Ab2確定為「競爭性」抗體。若觀測到Ab2存在另外的結合，則確定Ab1與Ab2彼此間無競爭。可擴大此方法，以使用全 列抗體在代表獨特分組的96孔盤中篩選獨特抗體之大型文庫。在實施例中，若參考抗體將測試抗體與共同抗原的特異性結合抑制至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%，則測試抗體將與參考抗體競爭。在其他實施例中，結合被抑制至少80%、85%、90%、95%或97%或超過97%。
包含一組競爭性抗體的分組已定義之後，可進行進一步表徵以確定該組抗體所結合之抗原上的特定域或抗原決定基。域層面的抗原決定基定位可使用Cochran等人，2004,PMID：15099763所述之方案的修改來進行。精細抗原決定基定位為確定抗原上之特定胺基酸(包含抗體所結合之決定子的抗原決定基)的方法。
在某些實施例中，精細抗原決定基定位可使用噬菌體或酵母呈現術來進行。其他相容性抗原決定基定位技術包括丙胺酸掃描突變體、肽墨點法(Reineke,2004,PMID：14970513)，或肽裂解分析。另外，可使用諸如抗原決定基切除、抗原決定基提取及化學修飾抗原之方法(Tomer,2000,PMID：10752610)，其使用酶，諸如蛋白水解酶(例如胰蛋白酶、內切蛋白酶Glu-C、內切蛋白酶Asp-N、胰凝乳蛋白酶等)；化學藥劑，諸如丁二醯亞胺基酯及其衍生物、含有一級胺的化合物、肼及碳醯肼、游離胺基酸等。在另一個實施例中，可利用修飾輔助式分析(亦稱為基於抗原結構之抗體分析(ASAP))，根據各抗體針對化學或酶促修飾之抗原表面之結合概況的相似性，對很多種針對相同抗原的單株抗體進行分類(U.S.P.N.2004/0101920)。
抗原上之所要抗原決定基確定之後，可產生針對該抗原決定基的其他抗體，例如使用本文所述之技術、藉由用包含所選抗原決定基的肽進行 免疫。
V. 抗體偶聯物
在一些實施例中，本發明抗體可與醫藥活性或診斷部分結合以形成「抗體藥物偶聯物」(ADC)或「抗體偶聯物」。術語「偶聯物」使用廣泛且意謂任何醫藥活性部分或診斷部分與本發明抗體的共價或非共價結合，不論結合方法。在某些實施例中，經由抗體之離胺酸或半胱胺酸殘基實現結合。在一些實施例中，醫藥活性或診斷部分可經由一或多個位點特異性游離半胱胺酸結合至抗體。所揭示之ADC可用於治療及診斷目的。
本發明之ADC可用於將細胞毒素或其他有效載物遞送至標靶位置(例如致瘤細胞及/或表現EMR2之細胞)。如本文所闡述，術語「藥物」或「彈頭」可互換使用且意謂生物學活性或可偵測分子或藥物，包括如下文所述的抗癌劑或細胞毒素。「有效載物」包含「藥物」或「彈頭」，可與可選的連接體化合物的組合。偶聯物中之「彈頭」包含活體內代謝為活性劑的肽、蛋白質或前藥；聚合物、核酸分子、小分子、結合劑、模擬劑、合成藥物、無機分子、有機分子及放射性同位素。在一個較佳實施例中，所揭示之ADC會將所結合的有效載物在相對無反應、無毒性狀態下導引至靶點，隨後釋放且活化彈頭(例如如本文所揭示的PBDS 1-5)。彈頭的此靶向釋放較佳經由有效載物的穩定結合(例如經由抗體上的一或多個半胱胺酸)及ADC製劑的相對均質組成達成，從而將過度結合的毒性ADC物質減到最少。在與經設計以在彈頭已遞送至腫瘤位點之後基本上釋放彈頭的藥物連接體偶聯的情況下，本發明之偶聯物可實質上降低不良的非特異性毒性。此有利地使得活性細胞毒素在腫瘤位點的含量相對較高，同時最小化非靶向細胞及組織的暴露，從而提供增強的治療指數。
應瞭解，雖然本發明之一些實施例包含併有治療性部分(例如細胞毒素)的有效載物，但併有診斷劑及生物相容性調節劑的其他有效載物可受益於由所揭示之偶聯物提供的靶向釋放。因此，除非上下文另有指示，否則與例示性治療性有效載物有關的任何揭示內容亦適用於包含診斷劑或生物相容性調節劑的有效載物，如本文中所論述。所選有效載物可共價或非共價連接至抗體且展現不同的化學計量莫耳比，此至少部分地視達成結合所用的方法而定。
本發明之偶聯物通常可由下式表示：Ab-[L-D]n，或其醫藥學上可接受之鹽，其中：a)Ab包含抗EMR2抗體；b)L包含可選的連接體；c)D包含藥物；且d)n為整數約1至約20。
熟習此項技術者將瞭解，根據前述式之偶聯物可使用多種不同連接體及藥物製得且結合方法將根據組分之選擇而變化。因而，與所揭示抗體之反應性殘基(例如半胱胺酸或離胺酸)結合的任何藥物或藥物連接體化合物與本文中之教示內容相容。類似地，允許所選藥物與抗體結合(包括位點特異性結合)的任何反應條件屬於本發明範疇內。不論前述，本發明之一些較佳實施例包含使用穩定劑與輕度還原劑之組合來使藥物或藥物連接體與游離半胱胺酸發生選擇性結合，如本文所述。該等反應條件傾向於使得製劑更均質、非特異性結合及污染物更少且相應地使毒性更低。
A. 彈頭 1. 治療劑
本發明抗體可與醫藥活性部分結合、連接或融合或以其他方式結合，該醫藥活性部分為治療部分或藥物，諸如抗癌劑，包括(但不限於)細胞毒性劑(或細胞毒素)、細胞生長抑制劑、抗血管生成劑、減積藥劑、化學治療劑、放射冶療劑、靶向抗癌劑、生物學反應調節劑、癌症疫苗、細胞激素、激素療法、抗轉移劑及免疫治療劑。
例示性抗癌劑或細胞毒素(包括其同源物及衍生物)包含1-去氫睪固酮(1-dehydrotestosterone)、安麯黴素(anthramycins)、放線菌素D(actinomycin D)、博萊黴素(bleomycin)、卡奇黴素(calicheamicin)(包括N-乙醯基卡奇黴素)、秋水仙鹼(colchicin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、細胞鬆弛素B(cytochalasin B)、放線菌素d(dactinomycin)(先前為放線菌素)、二羥基炭疽桿菌素(dihydroxy anthracin)、二酮、多卡米辛(duocarmycin)、吐根素(emetine)、表柔比星(epirubicin)、溴化乙錠(ethidium bromide)、依託泊苷(etoposide)、糖皮質激素(glucocorticoids)、短桿菌素D(gramicidin D)、利多卡因(lidocaine)、類美登素(maytansinoid)(諸如DM-1及DM-4(Immunogen))、苯并二氮呯衍生物(Immunogen)、光神黴素(mithramycin)、絲裂黴素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、普魯卡因(procaine)、普萘洛爾(propranolol)、嘌呤黴素(puromycin)、替尼泊苷(tenoposide)、四卡因(tetracaine)，及上述任一者的醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物、酸或衍生物。
其他相容性細胞毒素包含海兔毒素(dolastatins)及奧瑞斯他汀(auristatin)，包括單甲基奧瑞斯他汀E(MMAE)及單甲基奧瑞斯他汀F(MMAF)(Seattle Genetics)；瓢菌素(amanitin)，諸如α-瓢菌素、β-瓢菌素、 γ-瓢菌素或ε-瓢菌素(Heidelberg Pharma)；DNA小凹槽結合劑，諸如多卡米辛(duocarmycin)衍生物(Syntarga)；烷基化劑，諸如經修飾或二聚吡咯并苯并二氮呯(pyrrolobenzodiazepine)(PBD)、二氯甲二乙胺(mechlorethamine)、噻替哌(thioepa)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BCNU)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、環硫磷醯胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈佐黴素(streptozotocin)、絲裂黴素C(mitomycin C)及順二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑；剪接抑制劑，諸如米亞黴素(meayamycin)類似物或衍生物(例如如U.S.P.N.7,825,267中所闡述的FR901464)；管結合劑，諸如埃坡黴素(epothilone)類似物及妥布賴森(tubulysins)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)及DNA損傷劑，諸如卡奇黴素(calicheamicin)及埃斯波黴素(esperamicins)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤(methotrexate)、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)及5-氟尿嘧啶達卡巴嗪(5-fluorouracil decarbazine)；抗有絲分裂劑，諸如長春鹼(vinblastine)及長春新鹼(vincristine)；及蒽環黴素(anthracyclines)，諸如道諾黴素(daunorubicin)(先前為柔紅黴素(daunomycin))及小紅莓(doxorubicin)，及上述任一者之醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物、酸或衍生物。
在所選實施例中，本發明之抗體可與抗CD3結合分子結合以募集細胞毒性T細胞且使其靶向致瘤細胞(BiTE技術；參見例如Fuhrmann等人(2010)Annual Meeting of AACR摘要第5625號)。
在其它實施例中，本發明的ADC可包含使用適當連接體結合的包含治療放射性同位素之細胞毒素。可與該等實施例相容的例示性放射性同位 素包括(但不限於)碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、銅(62Cu、64Cu、67Cu)、硫(35S)、鐳(223R)、氚(3H)、銦(115In、113In、112In、111In)、鉍(212Bi、213Bi)、鎝(99Tc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga、67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、117Sn、76Br、211At及225Ac。其他放射性核素亦可以診斷劑及治療劑形式獲得，尤其60keV至4,000keV之能量範圍內的彼等物。
在其他所選實施例中，本發明之ADC將與細胞毒性苯并二氮呯衍生物彈頭結合。可與所揭示之抗體結合的相容苯并二氮呯衍生物(及可選的連接體)描述於例如U.S.P.N.8,426,402及PCT歸檔WO2012/128868及WO2014/031566中。如同PBD，咸信相容苯并二氮呯衍生物結合於DNA之較小凹槽中且抑制核酸合成。該等化合物據報導具有強抗腫瘤特性且因而特別適用於本發明之ADC中。
在一些實施例中，本發明之ADC可包含PBD及其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物、酸或其衍生物作為彈頭。PBD為藉由共價結合至小凹槽中之DNA及抑制核酸合成來發揮抗腫瘤活性的烷基化劑。PBD已顯示具有強抗腫瘤特性，同時展現最小的骨髓抑制。與本發明相容的PBD可使用若干類型的連接體(例如包含順丁烯二醯亞胺基部分及游離硫氫基的肽基連接體)連接至抗體，且在某些實施例中，呈二聚形式(亦即PBD二聚體)。可與所揭示之抗體結合的相容PBD(及可選的連接體)描述於例如U.S.P.N.s 6,362,331、7,049,311、7,189,710、7,429,658、7,407,951、7,741,319、7,557,099、8,034,808、8,163,736、2011/0256157及PCT歸 檔WO2011/130613、WO2011/128650、WO2011/130616、WO2014/057073及WO2014/057074中。與本發明相容之PBD化合物之實例緊接著更詳細地論述於下文中。
就本發明而言，PBD已顯示具有強抗腫瘤特性，同時展現最小骨髓抑制。與本發明相容的PBD可使用若干類型連接體中的任一者(例如包含順丁烯二醯亞胺基部分及游離硫氫基的肽基連接體)連接至EMR2靶向劑且在某些實施例中，呈二聚形式(亦即PBD二聚體)。PBD具有通式結構：
其在取代基之數目、類型與位置方面，在其芳族A環與吡咯并C環方面及在C環之飽和度方面可不同。在B環中，N10-C11位置存在亞胺(N=C)、甲醇胺(NH-CH(OH))，或甲醇胺甲基醚(NH-CH(OMe))，其為引起DNA烷基化的親電子中心。所有已知天然產物在對掌性C11a位置處均具有(S)組態，當由C環朝向A環檢視時該(S)組態為其提供右旋扭轉。由此賦予其具有B形式DNA之小凹槽的等螺旋適當三維形狀，從而在結合位點處產生緊密配合(Kohn，於Antibiotics III.Springer-Verlag,New York，第3-11頁(1975)；Hurley及Needham-VanDevanter,Acc.Chem.Res.,19,230-237(1986))。其在小凹槽中形成加合物之能力使其能夠干擾DNA加工且充當細胞毒性劑。如上文所提及，為了增強其效力，PBD往往以二聚形式使用，其可與如本文所述的抗EMR2抗體結合。
在尤其較佳的實施例中，可與所揭示之調節劑結合的相容PBD描述於U.S.P.N.2011/0256157中。在本發明中，較佳可為PBD二聚體，亦即 包含兩個PBD部分的彼等物。因此，本發明的較佳偶聯物為具有式(AB)或(AC)之彼等物：
其中：虛線指示C1與C2或C2與C3之間視情況存在雙鍵；R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且視情況進一步選自鹵基或二鹵基；其中RD獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基；R6及R9獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'NO2、Me3Sn及鹵基；R7獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；R10為連接至EMR2抗體或其片段或衍生物的連接體，如本文所述；Q獨立地選自O、S及NH；R11為H或R，或其中Q為O、SO3M，其中M為金屬陽離子；X係選自O、S或N(H)且在所選實施例中包含O； R"為C3-12伸烷基，其鏈可間雜有一或多個雜原子(例如O、S、N(H)、NMe及/或芳族環，例如苯或吡啶，該等環視情況經取代)；R及R'各自獨立地選自視情況經取代之C1-12烷基、C3-20雜環基及C5-20芳基，且視情況就基團NRR'而言，R及R'與其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之4員、5員、6員或7員雜環；及其中R2"、R6"、R7"、R9"、X"、Q"及R11"(當存在時)如分別根據R2、R6、R7、R9、X、Q及R11所定義，且RC為封端基團。
包含前述結構的所選實施例緊接著更詳細地描述於下文中。
雙鍵
在一個實施例中，C1與C2之間及C2與C3之間不存在雙鍵。
在一個實施例中，虛線指示C2與C3之間視情況存在雙鍵，如下文所示：
在一個實施例中，當R2為C5-20芳基或C1-12烷基時，C2與C3之間存在雙鍵。在一個較佳實施例中，R2包含甲基。
在一個實施例中，虛線指示C1與C2之間視情況存在雙鍵，如下文所
在一個實施例中，當R2為C5-20芳基或C1-12烷基時，C1與C2之間存在雙鍵。在一個較佳實施例中，R2包含甲基。
R 2
在一個實施例中，R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且視情況進一步選自鹵基或二鹵基。
在一個實施例中，R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR。
在一個實施例中，R2獨立地選自H、=O、=CH2、R、=CH-RD及=C(RD)2。
在一個實施例中，R2獨立地為H。
在一個實施例中，R2獨立地為R，其中R包含CH3。
在一個實施例中，R2獨立地為=O。
在一個實施例中，R2獨立地為=CH2。
在一個實施例中，R2獨立地為=CH-RD。在PBD化合物內，基團=CH-RD可以具有下文所示的任一組態：
在一個實施例中，該組態為組態(I)。
在一個實施例中，R2獨立地為=C(RD)2。
在一個實施例中，R2獨立地為=CF2。
在一個實施例中，R2獨立地為R。
在一個實施例中，R2獨立地為視情況經取代之C5-20芳基。
在一個實施例中，R2獨立地為視情況經取代之C1-12烷基。
在一個實施例中，R2獨立地為視情況經取代之C5-20芳基。
在一個實施例中，R2獨立地為視情況經取代之C5-7芳基。
在一個實施例中，R2獨立地為視情況經取代之C8-10芳基。
在一個實施例中，R2獨立地為視情況經取代之苯基。
在一個實施例中，R2獨立地為視情況經取代之萘基。
在一個實施例中，R2獨立地為視情況經取代之吡啶基。
在一個實施例中，R2獨立地為視情況經取代之喹啉基或異喹啉基。
在一個實施例中，R2具有1至3個取代基，其中1個及2個更佳，且經單取代之基團最佳。取代基可為任何位置。
在R2為C5-7芳基的情況下，單一取代基較佳位於與化合物之其餘部分之鍵結不相鄰的環原子上，亦即其對於化合物之其餘部分之鍵結而言較佳為β或γ。因此，在C5-7芳基為苯基的情況下，取代基較佳位於間位或對位，且更佳位於對位。
在一個實施例中，R2係選自：
其中星號表示連接點。
在R2為C8-10芳基(例如喹啉基或異喹啉基)的情況下，其可在喹啉或異喹啉環的任何位置攜有任意數目個取代基。在一些實施例中，其具有一個、兩個或三個取代基，且此等物可位於近側環及遠側環或兩者(若超過一個取代基)。
在一個實施例中，在R2視情況經取代之情況下，取代基係選自下文取代基章節中所指定的彼等取代基。
在R視情況經取代之情況下，取代基較佳選自： 鹵基、羥基、醚、甲醯基、醯基、羧基、酯、醯氧基、胺基、醯胺基、醯基醯胺基、胺基羰基氧基、脲基、硝基、氰基及硫醚。
在一個實施例中，在R或R2視情況經取代之情況下，取代基係選自由以下組成之群：R、OR、SR、NRR'、NO2、鹵基、CO2R、COR、CONH2、CONHR及CONRR'。
在R2為C1-12烷基的情況下，視情況存在之取代基可另外包括C3-20雜環基及C5-20芳基。
在R2為C3-20雜環基的情況下，視情況存在之取代基可另外包括C1-12烷基及C5-20芳基。
在R2為C5-20芳基的情況下，視情況存在之取代基可另外包括C3-20雜環基及C1-12烷基。
應瞭解，術語「烷基」涵蓋子類烯基及炔基以及環烷基。因此，在R2為視情況經取代之C1-12烷基的情況下，應瞭解烷基視情況含有一或多個碳-碳雙鍵或參鍵，其可形成所結合系統的一部分。在一個實施例中，視情況經取代之C1-12烷基含有至少一個碳-碳雙鍵或參鍵，且此鍵與存在於C1與C2之間或C2與C3之間的雙鍵結合。在一個實施例中，C1-12烷基為選自飽和C1-12烷基、C2-12烯基、C2-12炔基及C3-12環烷基的基團。
若R2上的取代基為鹵基，則其較佳為F或Cl，更佳為Cl。
若R2上的取代基為醚，則其在一些實施例中可為烷氧基，例如C1-7烷氧基(例如甲氧基、乙氧基)或其在一些實施例中可為C5-7芳氧基(例如苯氧基、吡啶氧基、呋喃氧基)。
若R2上的取代基為C1-7烷基，則其較佳可為C1-4烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基)。
若位於R2之取代基為C3-7雜環基，則其在一些實施例中可為含氮C6雜環基，例如嗎啉基、硫代嗎啉基、哌啶基、哌嗪基。此等基團可經由氮原子結合至PBD部分之其餘部分。此等基團可進一步經例如C1-4烷基取代。
若位於R2上之取代基為雙氧基-C1-3伸烷基，則此較佳為雙氧基-亞甲基或雙氧基-伸乙基。
R2之尤其較佳取代基包括甲氧基、乙氧基、氟、氯、氰基、雙氧基-亞甲基、甲基-哌嗪基、嗎啉基及甲基-噻吩基。
尤其較佳之經取代R2基團包括(但不限於)4-甲氧基-苯基、3-甲氧基苯基、4-乙氧基-苯基、3-乙氧基-苯基、4-氟-苯基、4-氯-苯基、3,4-雙氧基亞甲基-苯基、4-甲基噻吩基、4-氰基苯基、4-苯氧基苯基、喹啉-3-基及喹啉-6-基、異喹啉-3-基及異喹啉-6-基、2-噻吩基、2-呋喃基、甲氧基萘基及萘基。
在一個實施例中，R2為鹵基或二鹵基。在一個實施例中，R2為-F或-F2，該等取代基分別以(III)及(IV)說明於下文：
R D
在一個實施例中，RD獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基。
在一個實施例中，RD獨立地為R。
在一個實施例中，RD獨立地為鹵基。
R 6
在一個實施例中，R6獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn-及鹵基。
在一個實施例中，R6獨立地選自H、OH、OR、SH、NH2、NO2及鹵基。
在一個實施例中，R6獨立地選自H及鹵基。
在一個實施例中，R6獨立地為H。
在一個實施例中，R6與R7一起形成基團-O-(CH2)p-O-，其中p為1或2。
R 7
R7獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基。
在一個實施例中，R7獨立地為OR。
在一個實施例中，R7獨立地為OR7A，其中R7A獨立地為視情況經取代之C1-6烷基。
在一個實施例中，R7A獨立地為視情況經取代之飽和C1-6烷基。
在一個實施例中，R7A獨立地為視情況經取代之C2-4烯基。
在一個實施例中，R7A獨立地為Me。
在一個實施例中，R7A獨立地為CH2Ph。
在一個實施例中，R7A獨立地為烯丙基。
在一個實施例中，化合物為二聚體，其中各單體的R7基團一起形成連接單體的二聚體橋，其具有式X-R"-X。
R 9
在一個實施例中，R9獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、 NHR、NRR'、NO2、Me3Sn-及鹵基。
在一個實施例中，R9獨立地為H。
在一個實施例中，R9獨立地為R或OR。
R 10
較佳地，相容連接體(諸如本文所述的彼等物)在R10位置(亦即N10)使EMR2抗體經由共價鍵連接至PBD藥物部分。
Q
在某些實施例中，Q獨立地選自O、S及NH。
在一個實施例中，Q獨立地為O。
在一個實施例中，Q獨立地為S。
在一個實施例中，Q獨立地為NH。
R 11
在所選實施例中，R11為H或R，或在Q為O的情況下，可為SO3M，其中M為金屬陽離子。陽離子可為Na+。
在某些實施例中，R11為H。
在某些實施例中，R11為R。
在某些實施例中，在Q為O的情況下，R11為SO3M，其中M為金屬陽離子。陽離子可為Na+。
在某些實施例中，在Q為O的情況下，R11為H。
在某些實施例中，在Q為O的情況下，R11為R。
X
在一個實施例中，X係選自O、S或N(H)。
X較佳為O。
R"
R"為C3-12伸烷基，其鏈可間雜有一或多個雜原子，例如O、S、N(H)、NMe及/或芳族環，例如苯或吡啶，該等環視情況經取代。
在一個實施例中，R"為C3-12伸烷基，其鏈可間雜有一或多個雜原子及/或芳族環，例如苯或吡啶。
在一個實施例中，伸烷基視情況間雜有一或多個選自O、S及NMe之雜原子及/或芳族環，該等環視情況經取代。
在一個實施例中，芳族環為C5-20伸芳基，其中伸芳基涉及藉由自芳族化合物之兩個芳族環原子移除兩個氫原子而獲得的二價部分，該部分具有5至20個環原子。
在一個實施例中，R"為C3-12伸烷基，其鏈可間雜有一或多個雜原子，例如O、S、N(H)、NMe及/或芳族環，例如苯或吡啶，該等環視情況經NH2取代。
在一個實施例中，R"為C3-12伸烷基。
在一個實施例中，R"係選自C3、C5、C7、C9及C11伸烷基。
在一個實施例中，R"係選自C3、C5及C7伸烷基。
在一個實施例中，R"係選自C3及C5伸烷基。
在一個實施例中，R"為C3伸烷基。
在一個實施例中，R"為C5伸烷基。
上列伸烷基可視情況間雜有一或多個雜原子及/或芳族環，例如苯或吡啶，該等環視情況經取代。
上列伸烷基可視情況間雜有一或多個雜原子及/或芳族環，例如苯或吡啶。
上列伸烷基可為未經取代之直鏈脂族伸烷基。
R及R'
在一個實施例中，R獨立地選自視情況經取代之C1-12烷基、C3-20雜環基及C5-20芳基。
在一個實施例中，R獨立地為視情況經取代之C1-12烷基。
在一個實施例中，R獨立地為視情況經取代之C3-20雜環基。
在一個實施例中，R獨立地為視情況經取代之C5-20芳基。
上文關於R2所述的為關於較佳烷基及芳基及視情況存在之取代基之身分及數目的各種實施例。針對R2所述之適用於R的優選項適當時適用於所有其他基團R，例如其中R6、R7、R8或R9為R。
R之優選項亦適用於R'。
在本發明的一些實施例中，提供一種具有取代基-NRR'的化合物。在一個實施例中，R及R'與其所連接之氮原子一起形成視情況經取代之4員、5員、6員或7員雜環。該環可含有另一個雜原子，例如N、O或S。
在一個實施例中，雜環本身經基團R取代。在存在另一個N雜原子的情況下，取代基可位於N雜原子上。
除前述PBD之外，某些二聚PBD已顯示尤其具有活性且可結合本發明使用。為此目的，本發明之抗體藥物偶聯物(亦即如本文所揭示的ADC 1-6)可包含下文緊接著作為PBD 1-5闡述的PBD化合物。應注意下文PBD 1-5包含在連接體(諸如本文中更詳細描述的彼等物)分離之後所釋放的細胞毒性彈頭。PBD 1-5中的每一者作為藥物-連接體化合物組分的合成極詳細地呈現於WO 2014/130879中，該文獻關於該合成的內容以引用的方式併入本文中。鑒於WO 2014/130879，可包含本發明ADC之所選彈頭的 細胞毒性化合物可容易產生且使用，如本文所述。相應地，與連接體分離後可自所揭示之ADC釋放的所選PBD化合物緊接著闡述於下文中：
應瞭解，前述二聚PBD彈頭中之每一者較佳在經靶細胞內化且摧毀連接體之後釋放。如下文更詳細地描述，某些連接體將包含併有自分解部分的可裂解連接體，其允許活性PBD彈頭釋放而不保留連接體之任何部分。 釋放之後，PBD彈頭接著與靶細胞DNA結合且交聯。該結合據報導阻斷標靶癌細胞分裂而不使其DNA螺旋變形，從而潛在地避免突然出現之耐藥性的共同現象。在其他較佳實施例中，彈頭可經由不包含自分解部分的可裂解連接體連接至EMR2靶向部分。
根據本發明，該等化合物在腫瘤位點的遞送及釋放證明在臨床上可有效治療或管理增生性病症。就化合物而言，應瞭解所揭示之PBD中的每一者在每個C環中具有兩個sp2中心，其可允許在DNA之小凹槽中的結合更強(且因此毒性更大)於各C環中具有僅一個sp2中心的化合物。因此，所揭示之PBD當用於如本文所闡述之EMR2 ADC中時證明可特別有效地治療增生性病症。
前文提供與本發明相容的例示性PBD化合物且對於根據本文中的教示可成功併入抗EMR2偶聯物中的其他PBD決不意欲具限制性。實情為，可與如本文所述之抗體結合且闡述於下文實例中的任何PBD與所揭示之偶聯物相容且明確屬於本發明的邊界及界限內。
除前述藥劑之外，本發明之抗體亦可與生物學反應調節劑結合。在某些實施例中，生物反應調節劑將包含介白素2、干擾素，或各種類型的群落刺激因子(例如CSF、GM-CSF、G-CSF)。
更一般而言，相關藥物部分可為具有所要生物活性的多肽。該等蛋白質可包括例如毒素，諸如相思子毒素、蓖麻毒素A、豹蛙酶(Onconase)(或其他細胞毒性RNA酶)、綠膿桿菌外毒素、霍亂毒素、白喉毒素；細胞凋亡劑，諸如腫瘤壞死因子(例如TNF-α或TNF-β)；α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板衍生生長因子、組織纖維蛋白溶酶原活化因子、AIM I(WO 97/33899)、AIM II(WO 97/34911)、Fas配位體 (Takahashi等人，1994,PMID 7826947)及VEGI(WO 99/23105)、血栓劑、抗血管生成劑(例如血管生長抑素或內皮生長抑素)、淋巴激素(例如介白素-1(IL-1)、介白素-2(IL-2)、介白素-6(IL-6))、粒細胞巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)，及粒細胞群落刺激因子(G-CSF)，或生長因子，例如生長激素(GH)。
2. 診斷劑或偵測劑
在其他實施例中，本發明抗體或其片段或衍生物係與診斷劑或可偵測劑、標記物或報導子結合，其可為例如生物學分子(例如肽或核苷酸)、小分子、螢光團或放射性同位素。經標記之抗體可適用於監測過度增生性病症之發展或進展，或作為臨床測試程序的一部分用於測定特定療法(包括所揭示之抗體)(亦即治療診斷劑)的功效或確定未來治療過程。該等標記物或報導子亦可適用於純化所選抗體；用於抗體分析學(例如抗原決定基結合或抗體分組)，從而分離或單離致瘤細胞；或用於臨床前程序或毒理學研究。
該診斷、分析及/或偵測可藉由使抗體與可偵測物質偶合來完成，可偵測物質包括(但不限於)各種酶，包含例如辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；輔基，諸如(但不限於)抗生蛋白鏈菌素/生物素及抗生素蛋白/生物素；螢光物質，諸如(但不限於)傘酮(umbelliferone)、螢光素、螢光素異硫氰酸酯、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅素；發光物質，諸如(但不限於)魯米諾(luminol)；生物發光物質，諸如(但不限於)螢光素酶、螢光素及水母素；放射性物質，諸如(但不限於)碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(115In、113In、112In、111In)及鎝(99Tc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga、 67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、89Zr、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn及117Tin；正電子發射金屬(使用各種正電子發射斷層攝影術)、非放射性順磁金屬離子，及放射性標記或與特定放射性同位素結合的分子。在該等實施例中，適當偵測方法在此項技術中已熟知且容易自許多市售來源獲得。
在其他實施例中，抗體或其片段可與標記物序列或化合物(諸如肽或螢光團)融合或結合以促進純化或診斷或分析程序，諸如免疫組織化學、生物層干涉法、表面電漿子共振、流式細胞術、競爭性ELISA、FAC等。在一些實施例中，標記物尤其包含組胺酸標記，諸如pQE載體(Qiagen)所提供之組胺酸標記，其中多者可市購。適用於純化的其他肽標記包括(但不限於)紅血球凝集素「HA」標記，其對應於來源於流感紅血球凝集素蛋白質的抗原決定基(Wilson等人，1984,Cell 37：767)；及「flag」標記(U.S.P.N.4,703,004)。
3. 生物相容性調節劑
在所選實施例中，本發明抗體可與生物相容性調節劑結合，生物相容性調節劑可用於視需要來調節、改變、改良或緩和抗體特徵。舉例而言，活體內半衰期延長的抗體或融合構築體可藉由連接分子量相對較高之聚合物分子(諸如市售聚乙二醇(PEG)或類似生物相容性聚合物)來產生。熟習此項技術者將瞭解，PEG可以多種不同的分子量及分子組態獲得，該等分子量及分子組態可經選擇以賦予抗體特定的特性(例如可定製半衰期)。PEG可利用或不利用多官能性連接體、經由PEG與該等抗體或抗體片段之 N或C末端的結合或經由存在於離胺酸殘基上的ε-胺基來連接至抗體或抗體片段或衍生物。可使用使生物活性損失最小化之線性或分支聚合物衍生作用。結合度可藉由SDS-PAGE及質譜密切監測以確保PEG分子與抗體分子之最佳結合。未反應之PEG可藉由例如尺寸排阻法或離子交換層析法而與抗體-PEG偶聯物分離。所揭示之抗體可以類似方式與白蛋白結合以便使抗體或抗體片段在活體內更穩定或具有更長的活體內半衰期。該等技藝在此項技術中已熟知，參見例如WO 93/15199、WO 93/15200及WO 01/77137；及EP 0 413,622。其他生物相容性偶聯物對於一般技術者而言顯而易見且可容易根據本文中之教示內容加以鑑別。
B. 連接體化合物
如上文所指示，與本發明相容的有效載物包含一或多個彈頭且視情況包含使彈頭與抗體靶向劑結合的連接體。多種連接體化合物可用於本發明抗體與相關彈頭之結合。連接體僅需與抗體上的反應性殘基(較佳為半胱胺酸或離胺酸)及所選藥物化合物共價結合。因此，與所選抗體殘基反應且可用於提供本發明之相對穩定偶聯物(位點特異性或其他方式)的任何連接體與本文中之教示內容相容。
相容性連接體可有利地結合至具有親核性的經還原之半胱胺酸及離胺酸。涉及經還原之半胱胺酸及離胺酸的結合反應包括(但不限於)硫醇-順丁烯二醯亞胺、硫醇-鹵基(醯基鹵)、硫醇-烯、硫醇-炔、硫醇-乙烯基碸、硫醇-雙碸、硫醇-硫代磺酸酯、硫醇-吡啶基二硫化物及硫醇-對氟反應。如本文中進一步論述，硫醇-順丁烯二醯亞胺生物結合因其反應速率快及結合條件溫和而為使用最廣泛之方法之一。使用此方法的一個問題為可能發生逆-邁克爾反應(retro-Michael reaction)及經順丁烯二醯亞胺基連 接之有效載物發生損耗或自抗體轉移為血漿中的其他蛋白質，諸如人類血清白蛋白。然而，在一些實施例中，使用選擇性還原及如下文實例所闡述之位點特異性抗體可用於穩定偶聯物且減少此非所要轉移。硫醇-醯基鹵反應得到生物偶聯物，該等生物偶聯物不能經歷逆-邁克爾反應且因此更穩定。然而，硫醇-鹵化物反應通常具有比基於順丁烯二醯亞胺之結合慢的反應速率且因此在提供非所要藥物與抗體比率方面不太有效。硫醇-吡啶基二硫化物反應為另一種流行的生物結合途徑。吡啶基二硫化物與游離硫醇發生快速交換，產生混合二硫化物且釋放吡啶-2-硫酮。混合二硫化物可在還原性細胞環境中裂解，從而釋放有效載物。受到更多關注的其他生物結合方法為硫醇-乙烯基碸及硫醇-雙碸反應，其中之每一者與本文中之教示內容相容且明確地包括於本發明之範疇內。
在所選實施例中，相容性連接體將賦予ADC在細胞外環境中的穩定性，防止ADC分子聚集且保持ADC以單體狀態自由溶於水性介質中。轉運或遞送至細胞中之前，ADC較佳為穩定的且保持完整，亦即抗體保持連接至藥物部分。雖然連接體在靶細胞外部為穩定的，但其經設計可以某種有效的速率在細胞內部裂解或降解。因此，有效連接體將：(i)維持抗體之特異結合特性；(ii)允許偶聯物或藥物部分之胞內遞送；(iii)保持穩定及完整，亦即不裂解或降解，直至偶聯物已遞送或轉運至其靶向位點；及(iv)維持藥物部分之細胞毒性、細胞殺死效應或細胞抑制效應(在一些情況下，包括任何旁觀者效應)。ADC穩定性可藉由標準分析技術量測，諸如HPLC/UPLC、質譜、HPLC，及分離/分析技術LC/MS及LC/MS/MS。如上文所述，抗體與藥物部分之共價連接就反應性含義而言需要連接體具有兩個反應性官能基，亦即二價。適用於連接兩個或超過兩個功能性或生物 學活性部分(諸如MMAE及抗體)的二價連接試劑已知，且已描述提供與本文中之教示相容之所得偶聯物的方法。
與本發明相容的連接體可廣泛分類為可裂解連接體及不可裂解連接體。可包含酸不穩定連接體(例如肟及腙)、蛋白酶可裂解連接體及二硫化物連接體的可裂解連接體內化至靶細胞中且在細胞內部依核內體-溶酶體路徑裂解。細胞毒素之釋放及活化依賴於促進酸不穩定化學鍵聯(諸如腙或肟)發生裂解的內體/溶酶體酸性隔室。若溶酶體特異性蛋白酶裂解位點經工程改造而存在於連接體中，則細胞毒素將接近其胞內標靶釋放。或者，含有混合二硫化物的連接體提供細胞毒性有效載物藉以在胞內釋放(當其在細胞之還原環境中、而非在血流之富氧環境中選擇性地裂解時)的途徑。為了對比，含有醯胺連接之聚乙二醇或烷基間隔子的相容性不可裂解連接體在ADC發生溶酶體降解期間、在靶細胞內釋放毒性有效載物。在一些方面，連接體之選擇將視偶聯物中所用之特定藥物、特定適應症及抗體標靶而定。
因此，本發明之某些實施例包含可藉由存在於胞內環境中(例如溶酶體或內體或小窩內部)的裂解劑裂解的連接體。連接體可為例如由細胞內肽酶或蛋白酶裂解肽基連接體，該蛋白酶包括(但不限於)溶酶體或核內體蛋白酶。在一些實施例中，肽基連接體為至少兩個胺基酸長或至少三個胺基酸長。裂解劑可包括組織蛋白酶B及D及纖維蛋白溶酶，其中之每一者已知可使二肽藥物衍生物發生水解，從而使活性藥物釋放於靶細胞內部。由於已發現組織蛋白酶-B高度表現於癌組織中，因此可藉由硫醇依賴性蛋白酶組織蛋白酶-B裂解的例示性肽基連接體為包含Phe-Leu的肽。該等連接體之其他實例描述於U.S.P.N.6,214,345中。在特定實施例中，可藉由 胞內蛋白酶裂解的肽基連接體為Val-Cit連接體、Val-Ala連接體或Phe-Lys連接體。使用胞內蛋白水解釋放治療劑的一個優點為該藥劑當結合時典型地出現毒性降低且偶聯物之血清穩定性相對較高。
在其他實施例中，可裂解連接體具有pH敏感性。典型地，pH敏感性連接體在酸性條件下為可水解的。舉例而言，可使用在溶酶體中可水解的酸不穩定連接體(例如腙、肟、半卡巴腙(semicarbazone)、硫半卡巴腙、順-烏頭酸醯胺、原酸酯、縮醛、縮酮或其類似物)(參見例如U.S.P.N.5,122,368、5,824,805、5,622,929)。該等連接體在中性pH條件(諸如血液中之彼等條件)下相對穩定，但在低於pH 5.5或5.0(其為溶酶體之近似pH)時不穩定(例如可裂解)。
在又其他實施例中，連接體在還原條件下可裂解(例如二硫化物連接體)。多種二硫化物連接體在此項技術中已知，包括例如可使用SATA(N-丁二醯亞胺基-S-乙醯基硫基乙酸酯)、SPDP(N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯)、SPDB(N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯)及SMPT(N-丁二醯亞胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫基)甲苯)形成的彼等物。在然而其他特定實施例中，連接體為丙二酸酯連接體(Johnson等人，1995,Anticancer Res. 15：1387-93)、順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基連接體(Lau等人，1995,Bioorg-Med-Chem.3(10)：1299-1304)或3'-N-醯胺類似物(Lau等人，1995,Bioorg-Med-Chem.3(10)：1305-12)。
在本發明的某些態樣中，所選連接體將包含下式之化合物：
其中星號表示連至藥物的連接點，CBA(亦即細胞結合劑)包含抗 EMR2抗體，L1包含連接單元且視情況包含可裂解連接單元，A為使L1與抗體上之反應性殘基連接的連接基(視情況包含間隔子),L2較佳為共價鍵及U，其可或可不存在，可包含促進連接體與彈頭在腫瘤位點澈底分離之自分解單元的全部或一部分。
在一些實施例(諸如U.S.P.N.2011/0256157中所述的實施例)中，相容連接體可包含：
其中星號表示連至藥物的連接點，CBA(亦即細胞結合劑)包含抗EMR2抗體，L1包含連接體且視情況包含可裂解連接體，A為使L1與抗體上之反應性殘基連接的連接基(視情況包含間隔子)且L2為共價鍵或連同-OC(=O)-一起形成自分解型部分。
應瞭解，L1及L2(存在時)之性質可廣泛變化。此等基團係根據其裂解特徵加以選擇，其可根據偶聯物所遞送之位點的條件來指定。較佳為藉由酶作用裂解的彼等連接體，然而亦可使用藉由pH變化(例如酸或鹼不穩定性)、溫度或照射(例如光不穩定性)可裂解的連接體。在還原或氧化條件下可裂解的連接體亦可用於本發明。
在某些實施例中，L1可包含鄰接胺基酸序列。胺基酸序列可為酶促裂解之標靶受質，從而允許藥物釋放。
在一個實施例中，L1可藉由酶作用裂解。在一個實施例中，酶為酯酶或肽酶。
在另一個實施例中，L1為組織蛋白酶不穩定連接體。
在一個實施例中，L1包含二肽。二肽可表示為-NH-X1-X2-CO-，其 中-NH-及-CO-分別表示胺基酸基團X1及X2之N末端及C末端。二肽中之胺基酸可為天然胺基酸之任何組合。在連接體為組織蛋白酶不穩定連接體的情況下，二肽可為組織蛋白酶介導性裂解之作用位點。
另外，對於分別具有羧基或胺基側鏈官能基的彼等胺基酸基團(例如Glu及Lys)而言，CO及NH可表示該側鏈官能基。
在一個實施例中，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基團-X1-X2-係選自：-Phe-Lys-、-Val-Ala-、-Val-Lys-、-Ala-Lys-、-Val-Cit-、-Phe-Cit-、-Leu-Cit-、-Ile-Cit-、-Phe-Arg-及-Trp-Cit-，其中Cit為瓜胺酸。
二肽-NH-X1-X2-CO-中的基團-X1-X2-較佳選自：-Phe-Lys-、-Val-Ala-、-Val-Lys-、-Ala-Lys-及-Val-Cit-。
二肽-NH-X1-X2-CO-中的基團-X1-X2-最佳為-Phe-Lys-或-Val-Ala-或Val-Cit。在某些所選實施例中，二肽將包含-Val-Ala-。
在一個實施例中，L2係以共價鍵形式存在。
在一個實施例中，L2存在且連同-C(=O)O-一起形成自分解型連接體。在一個實施例中，L2為酶促活性之受質，從而允許彈頭釋放。
在一個實施例中，在L1藉由酶作用可裂解且存在L2的情況下，酶使L1與L2之間的鍵裂解。
L1及L2存在時可藉由選自以下的鍵連接：-C(=O)NH-、-C(=O)O-、-NHC(=O)-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、-NHC(=O)O-、-OC(=O)NH-及-NHC(=O)NH-。
連接至L2之L1之胺基可為胺基酸之N末端或可衍生自胺基酸側鏈(例如離胺酸胺基酸側鏈)之胺基。
連接至L2之L1之羧基可為胺基酸之C末端或可衍生自胺基酸側鏈(例 如麩胺酸胺基酸側鏈)之羧基。
連接至L2之L1之羥基可衍生自胺基酸側鏈(例如絲胺酸胺基酸側鏈)之羥基。
術語「胺基酸側鏈」包括發現於以下中之彼等基團：(i)天然存在之胺基酸，諸如丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸；(ii)次要胺基酸，諸如鳥胺酸及瓜胺酸；(iii)非天然胺基酸、β-胺基酸、天然存在之胺基酸之合成類似物及衍生物；及(iv)所有對映異構體、非對映異構體、異構體富集、同位素標記(例如2H、3H、14C、15N)、經保護之形式及其外消旋混合物。
在一個實施例中，-C(=O)O-與L2一起形成基團：
其中星號表示連至藥物或細胞毒性劑位置的連接點，波浪線表示連至連接體L1的連接點，Y為-N(H)-、-O-、-C(=O)N(H)-或-C(=O)O-，且n為0至3。伸苯基環視情況經一個、兩個或三個取代基取代。在一個實施例中，伸苯基視情況經鹵基、NO2、烷基或羥基烷基取代。
在一個實施例中，Y為NH。
在一個實施例中，n為0或1。n較佳為0。
在Y為NH且n為0的情況下，自分解型連接體可稱為對胺基苯甲基羰基連接體(PABC)。
在其他實施例中，連接體可包括自分解型連接體與二肽，其一起形 成基團-NH-Val-Cit-CO-NH-PABC-。在其他所選實施例中，連接體可包含基團-NH-Val-Ala-CO-NH-PABC-，其說明如下：
其中星號表示連至所選細胞毒性部分的連接點，且波浪線表示連至連接體之其餘部分(例如間隔子-抗體結合區段)的連接點，連接體之該其餘部分可與抗體結合。二肽發生酶促裂解後，當遠端位點活化時，自分解型連接體將允許經保護之化合物(亦即細胞毒素)發生澈底的釋放，此釋放係沿著下文所示之路線進行：
其中星號表示連至所選細胞毒性部分的連接點且其中L*為連接體其餘部分之活化形式，其包含現在裂解之肽基單元。彈頭之澈底釋放確保其維持所要毒性活性。
在一個實施例中，A為共價鍵。因此，L1與抗體直接連接。舉例而言，在L1包含鄰接胺基酸序列的情況下，序列N末端可直接連接至抗體殘基。
在另一個實施例中，A為間隔基團。因此，L1與抗體間接連接。
在某些實施例中，L1與A可藉由選自以下的鍵連接：-C(=O)NH-、-C(=O)O-、-NHC(=O)-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、-NHC(=O)O-、-OC(=O)NH-及-NHC(=O)NH-。
如下文更詳細地論述，本發明之藥物連接體較佳連接至半胱胺酸上 之反應性硫醇親核體，包括游離半胱胺酸。為此目的，抗體之半胱胺酸可藉由各種還原劑(諸如DTT或TCEP或如本文所闡述之輕度還原劑)處理而具備與連接試劑結合的反應性。在其他實施例中，本發明之藥物連接體較佳連接至離胺酸。
連接體較佳含有親電子官能基以便與抗體上的親核官能基發生反應。抗體上之親核性基團包括(但不限於)：(i)N末端胺基；(ii)側鏈胺基，例如離胺酸；(iii)側鏈硫醇基，例如半胱胺酸；及(iv)糖類羥基或胺基，其中抗體發生糖基化。胺、硫醇及羥基具親核性且能夠與連接體部分及連接試劑上的親電子基團發生反應而形成共價鍵，包括：(i)順丁烯二醯亞胺基團；(ii)活化二硫化物；(iii)活性酯，諸如NHS(N-羥基丁二醯亞胺)酯、HOBt(N-羥基苯并三唑)酯、鹵基甲酸酯及酸鹵化物；(iv)烷基及苯甲基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；及(v)醛、酮及羧基。
下文緊接著說明與本發明相容的例示性官能基：
在一些實施例中，半胱胺酸(包括位點特異性抗體之游離半胱胺酸)與藥物-連接體部分之間的連接係經由硫醇殘基及存在於連接體上的末端順丁烯二醯亞胺基團。在該等實施例中，抗體與藥物-連接體之間的連接可為：
其中星號表示連至藥物-連接體之其餘部分的連接點且波浪線表示連至抗體之其餘部分的連接點。在此實施例中，S原子較佳衍生自位點特異性游離半胱胺酸。
就其他相容性連接體而言，結合部分可包含可與抗體上之活化殘基反應以得到所要偶聯物的末端溴或碘乙醯胺。在任何情況下，熟習此項技術者可根據本發明容易使所揭示之藥物-連接體化合物中的每一者與相容性抗EMR2抗體(包括位點特異性抗體)結合。
根據本發明，本發明提供製備相容性抗體藥物偶聯物的方法，包含使抗EMR2抗體與選自由以下組成之群的藥物-連接體化合物結合：
出於本申請案的目的，DL用作「藥物-連接體」之縮寫且將包含如上文所述的藥物連接體1至6(亦即DL1、DL2、DL3、DL4、DL5及DL6)。 應注意DL1及DL6包含相同的彈頭及相同的二肽亞單元，但連接基間隔子不同。因此，連接體裂解後，DL1與DL6均釋放PBD1。
應瞭解，經連接體附接的末端順丁烯二醯亞胺基部分(DL1-DL4及DL6)或碘乙醯胺部分(DL5)可使用此項技術中公認的技術與所選EMR2抗體上的游離硫氫基結合。上述化合物的合成途徑闡述於WO2014/130879中，該文獻關於前述DL化合物的合成以引用的方式明確併入本文中，而使該等PBD連接體組合結合的特定方法闡述於下文實例中。
因此，在所選態樣中，本發明係關於與所揭示之DL部分結合的EMR2抗體以提供EMR2免疫偶聯物，該等EMR2免疫偶聯物緊接著基本上闡述於ADC 1-6中。因此，在某些態樣中，本發明係關於選自由以下組成之群的抗體藥物偶聯物：
其中Ab包含抗EMR2抗體或其免疫反應性片段。
在某些態樣中，本發明的EMR2 PBD ADC將包含如隨附實例中所述的抗EMR2抗體或其免疫反應性片段。在一個特定實施例中，ADC3將包含hSC93.253ss1(例如hSC93.253ss1 PBD3)。在其他態樣中，本發明的EMR2 PBD ADC將包含hSC93.256ss1(例如hSC93.256ss1 PBD3)。
C. 結合
應瞭解，多種熟知的反應可用於將藥物部分及/或連接體連接至所選抗體。舉例而言，利用半胱胺酸之硫氫基的各種反應均可用於所要部分之結合。一些實施例將包含含有一或多個游離半胱胺酸之抗體的結合，如下文所詳細論述。在其他實施例中，本發明之ADC可經由藥物與所選抗體 中存在之離胺酸殘基之暴露於溶劑中之胺基的結合來產生。其他實施例包含將N末端蘇胺酸及絲胺酸殘基活化，接著可利用其將所揭示之有效載物連接至抗體。所選結合方法較佳經定製以使連接至抗體之藥物數目最佳化且提供相對較高的治療指數。
用於使治療性化合物與半胱胺酸殘基結合的各種方法在此項技術中已知且對於熟習此項技術者而言為顯而易見的。半胱胺酸殘基在鹼性條件下將發生去質子化而產生可與軟親電子劑(諸如順丁烯二醯亞胺及碘乙醯胺)反應的硫醇鹽親核劑。一般而言，用於該等結合的試劑可直接與半胱胺酸硫醇反應而形成所結合之蛋白質或與連接體-藥物反應而形成連接體-藥物中間物。在連接體的情況下，使用有機化學反應、條件及試劑的若干途徑已為熟習此項技術者所知，包括：(1)使本發明之蛋白質之半胱胺酸基團與連接體試劑反應而經由共價鍵形成蛋白質-連接體中間物，隨後與活化化合物反應；及(2)使化合物之親核基團與連接體試劑反應而經由共價鍵形成藥物-連接體中間物，隨後與本發明之蛋白質之半胱胺酸基團反應。如熟習此項技術者根據前述內容將顯而易知，雙官能(或二價)連接體適用於本發明。舉例而言，雙官能連接體可包含用於與半胱胺酸殘基共價鍵聯的硫醇修飾基團及至少一個用於與化合物共價或非共價鍵聯的連接部分(例如第二硫醇修飾部分)。
結合之前，抗體可藉由還原劑(諸如二硫蘇糖醇(DTT)或(參(2-羧基乙基)膦(TCEP))處理而具備與連接試劑結合的反應性。在其他實施例中，其他親核基團可經由離胺酸與試劑(包括(但不限於)2-亞胺基硫雜環戊烷(妥特氏試劑(Traut's reagent))、SATA、SATP或SAT(PEG)4)反應、從而將胺轉化為硫醇來引入抗體中。
就該等結合而言，半胱胺酸硫醇或離胺酸胺基具有親核性且能夠與包括以下之連接試劑或化合物-連接體中間物或藥物上的親電子基團反應而形成共價鍵：(i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵基甲酸酯及酸鹵化物；(ii)烷基及苯甲基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；(iii)醛、酮、羧基及順丁烯二醯亞胺基團；及(iv)二硫化物，包括吡啶基二硫化物，經由硫化物交換。化合物或連接體上的親核基團包括(但不限於)胺、硫醇、羥基、醯肼、肟、肼、硫半卡巴腙、肼甲酸酯及芳基醯肼基團，其能夠與連接體部分及連接試劑上的親電子基團反應而形成共價鍵。
結合試劑包括順丁烯二醯亞胺、鹵乙醯基、碘乙醯胺丁二醯亞胺酯、異硫氰酸酯、磺醯氯、2,6-二氯三嗪基、五氟苯基酯及胺基磷酸酯，然而亦可使用其他官能基。在某些實施例中，方法包括例如使用順丁烯二醯亞胺、碘乙醯胺或鹵乙醯基/烷基鹵化物、氮丙啶、丙烯醯基衍生物與半胱胺酸之硫醇反應以產生與化合物反應的硫醚。游離硫醇與活化吡啶基二硫化物之二硫化物交換亦適用於產生偶聯物(例如使用5-硫基-2-硝基苯甲酸(TNB))。較佳使用順丁烯二醯亞胺。
如上文所指示，離胺酸亦可用作達成結合的反應性殘基，如本文所闡述。通常經由胺反應性丁二醯亞胺基酯靶向親核性離胺酸殘基。為了獲得最佳數目個去質子化離胺酸殘基，水溶液pH必須低於離胺酸銨基pKa(其為約10.5)，因此典型的反應pH為約8及9。偶合反應之常見試劑為NHS酯，其與親核性離胺酸經由離胺酸醯化機制發生反應。經歷類似反應的其他相容性試劑包含異氰酸酯及異硫氰酸酯，其亦可根據本文中之教示內容使用以得到ADC。一旦離胺酸已活化，則可使用多種前述連接基團使彈頭共價結合至抗體。
用於使化合物與蘇胺酸或絲胺酸殘基(較佳為N末端殘基)結合的方法在此項技術中亦已知。舉例而言，已描述自絲胺酸或蘇胺酸之1,2-胺基醇衍生得到羰基前驅物、可選擇性地且快速地藉由過碘酸鹽氧化而使羰基前驅物轉化成醛形式的方法。醛與連接至本發明蛋白質之化合物中之半胱胺酸的1,2-胺基硫醇反應形成穩定噻唑啶產物。此方法特別適用於在N末端絲胺酸或蘇胺酸殘基處標記蛋白質。
在一些實施例中，可藉由引入一個、兩個、三個、四個或超過四個游離半胱胺酸殘基(例如製備包含一或多個游離非原生半胱胺酸胺基酸殘基的抗體)而將反應性硫醇基引入所選抗體(或其片段)中。該等位點特異性抗體或經工程改造之抗體允許偶聯物製劑展現增強的穩定性及基本上均質性，此至少部分地歸因於提供經工程改造之游離半胱胺酸位點及/或本文所闡述之新穎結合程序。不同於完全或部分地還原鏈內或鏈間抗體二硫鍵中之每一者以提供結合位點(且與本發明完全相容)的習知結合方法，本發明另外提供所製備之某些游離半胱胺酸位點之選擇性還原及藥物-連接體與其之連接。
就此而言，應瞭解，藉由經工程改造之位點及選擇性還原促進的結合特異性允許在所要位置存在高百分比的定點結合。顯然，一些此等結合位點(諸如存在於輕鏈恆定區之末端區域中的彼等位點)典型地難以有效地結合，原因在於其傾向於與其他游離半胱胺酸發生交叉反應。然而，經由分子工程改造及選擇性還原所得游離半胱胺酸，可獲得有效的結合率，從而大大減少非所需的高DAR污染物及非特異性毒性。更一般而言，經工程改造之構築體及所揭示之包含選擇性還原的新穎結合方法提供具有改良之藥物動力學及/或藥效學且潛在地具有改良之治療指數的ADC製劑。
在某些實施例中，位點特異性構築體呈遞游離半胱胺酸，其還原時包含具有親核性且能夠與連接體部分(諸如上文所揭示之彼等物)上之親電子基團發生反應而形成共價鍵的硫醇基。如上文所論述，本發明抗體可具有可還原的不成對鏈間或鏈內半胱胺酸或所引入的非原生半胱胺酸，亦即提供該等親核性基團的半胱胺酸。因此，在某些實施例中，經還原之游離半胱胺酸之游離硫氫基與所揭示之藥物-連接體之末端順丁烯二醯亞胺基或鹵乙醯胺基的反應將提供所要結合。在此等情況下，抗體之游離半胱胺酸可藉由還原劑(諸如二硫蘇糖醇(DTT)或(參(2-羧基乙基)膦(TCEP))處理而具備與連接試劑結合的反應性。各游離半胱胺酸因此在理論上呈遞反應性硫醇親核劑。雖然該等試劑特別與本發明相容，但應瞭解，位點特異性抗體的結合可使用熟習此項技術者通常已知之各種反應、條件及試劑實現。
另外，已發現經工程改造之抗體之游離半胱胺酸可選擇性地還原以提供增強的定點結合且使得非所需的潛在毒性污染物減少。更特定言之，已發現「穩定劑」(諸如精胺酸)可調節蛋白質的分子內及分子間相互作用且可連同所選還原劑(較佳為相對而言輕度的還原劑)一起使用以選擇性地還原游離半胱胺酸及促進位點特異性結合，如本文所闡述。如本文所用，術語「選擇性還原」或「選擇性地還原」可互換地使用且應意謂游離半胱胺酸發生還原而經工程改造之抗體中所存在的原生二硫鍵未發生實質上的分裂。在所選實施例中，此選擇性還原可藉由使用某些還原劑或某些還原劑濃度來實現。在其他實施例中，選擇性還原經工程改造之構築體將包含使用穩定劑與還原劑(包括輕度還原劑)之組合。應瞭解，術語「選擇性結合」應意謂已在如本文所述之細胞毒素存在下選擇性地還原的經工程改造之抗體之結合。就此而言，該等穩定劑(例如精胺酸)與所選還原劑之組合 使用可明顯地改良位點特異性結合效率，如根據抗體重鏈及輕鏈之結合程度及製劑中之DAR分佈所測定。相容抗體構築體及選擇性結合技術及試劑廣泛揭示於WO2015/031698中，該文獻關於該等方法及構築體的內容特別併入本文中。
雖然不希望受任何特定理論束縛，但該等穩定劑可用來調節靜電微環境及/或調節所要結合位點發生的構形變化，從而允許相對而言的輕度還原劑(其不會實質上還原完整的原生二硫鍵)促進在所要游離半胱胺酸位點發生結合。該等藥劑(例如某些胺基酸)已知可形成鹽橋(經由氫鍵及靜電相互作用)且可以賦予穩定作用的方式調節蛋白質-蛋白質相互作用，從而可引起有利的構形變化及/或減少不利的蛋白質-蛋白質相互作用。此外，該等藥劑可用來在還原之後抑制非所要分子內(及分子間)半胱胺酸-半胱胺酸鍵之形成，從而促進所要的結合反應，其中經工程改造之位點特異性半胱胺酸結合至藥物(較佳經由連接體)。由於選擇性還原條件未能使完整的原生二硫鍵發生顯著還原，因此隨後的結合反應天然地驅向游離半胱胺酸上之相對較少反應性硫醇(例如較佳為每個抗體2個游離硫醇)。如先前所提及，該等技術可用於大大減少非特異性結合程度及相應非所需DAR物質在根據本發明所製得之偶聯物製劑中的含量。
在所選實施例中，與本發明相容的穩定劑通常將包含含有至少一個具有鹼性pKa之部分的化合物。在某些實施例中，該部分將包含一級胺，而在其他實施例中，胺部分將包含二級胺。在其他實施例中，胺部分將包含三級胺或鈲基團。在其他所選實施例中，胺部分將包含胺基酸，而在其他相容性實施例中，胺部分將包含胺基酸側鏈。在其他實施例中，胺部分將包含蛋白型胺基酸。在其他實施例中，胺部分包含非蛋白型胺基酸。在 一些實施例中，相容性穩定劑可包含精胺酸、離胺酸、脯胺酸及半胱胺酸。在某些較佳實施例中，穩定劑將包含精胺酸。另外，相容性穩定劑可包括具有鹼性pKa的胍及含氮雜環。
在某些實施例中，相容性穩定劑包含含有至少一個具有大於約7.5之pKa之胺部分的化合物；在其他實施例中，該胺部分具有大於約8.0之pKa；在又其他實施例中，該胺部分具有大於約8.5之pKa且在其他實施例中，穩定劑包含pKa大於約9.0的胺部分。其他實施例將包含穩定劑，其中胺部分將具有大於約9.5之pKa；而某些其他實施例將包含展現至少一個具有大於約10.0之pKa之胺部分的穩定劑。在其他實施例中，穩定劑將包含具有pKa大於約10.5之胺部分的化合物；在其他實施例中，穩定劑將包含具有pKa大於約11.0之胺部分的化合物；而在其他實施例中，穩定劑將包含pKa大於約11.5的胺部分。在又其他實施例中，穩定劑將包含具有pKa大於約12.0之胺部分的化合物；而在其他實施例中，穩定劑將包含pKa大於約12.5的胺部分。熟習此項技術者將瞭解，相關pKa可容易使用標準技術計算或測定且用於確定使用所選化合物作為穩定劑的適用性。
所揭示之穩定劑當與某些還原劑組合時顯示可特別有效地使結合靶向游離的位點特異性半胱胺酸。出於本發明的目的，相容性還原劑可包括產生經還原之游離位點特異性半胱胺酸用於結合而不會使經工程改造抗體之原生二硫鍵發生顯著分裂的任何化合物。在該等條件(較佳由所選穩定劑與還原劑之組合提供)下，活化藥物連接體基本上限於結合至所要游離位點特異性半胱胺酸位點。相對而言的輕度還原劑或在相對較低濃度下用以提供輕度條件的還原劑尤其較佳。如本文所用，術語「輕度還原劑」或「輕度還原條件」應意謂藉由在游離半胱胺酸位點提供硫醇而不會使經工 程改造抗體中所存在之原生二硫鍵發生實質上分裂的還原劑(視情況在穩定劑存在下)所產生的任何藥劑或狀態。亦即，輕度還原劑或條件(較佳與穩定劑組合)能夠有效地減少游離半胱胺酸(提供硫醇)而不會使蛋白質原生二硫鍵顯著分裂。所要的還原條件可由多種基於硫氫基之化合物提供，其為選擇性結合建立適當環境。在實施例中，輕度還原劑可包含具有一或多個游離硫醇的化合物，而在一些實施例中，輕度還原劑將包含具有單一游離硫醇的化合物。與本發明之選擇性還原技術相容之還原劑的非限制性實例包含麩胱甘肽、N-乙醯基半胱胺酸、半胱胺酸、2-胺基乙烷-1-硫醇及2-羥基乙烷-1-硫醇。
應瞭解，上文所述的選擇性還原方法特別有效地使結合靶向游離半胱胺酸。就此而言，與位點特異性抗體中之所要靶點結合的程度(本文中定義為「結合效率」)可藉由此項技術中所接受的各種技術測定。藥物與抗體發生位點特異性結合的效率可藉由評估標靶結合位點(例如各輕鏈C末端上的游離半胱胺酸)上之結合百分比(相對於所有其他結合位點)來測定。在某些實施例中，本文中的方法提供藥物與包含游離半胱胺酸之抗體的有效結合。在一些實施例中，結合效率為至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或超過98%，如根據標靶結合相對於所有其他結合位點的百分比所量測。
進一步將瞭解，能夠結合的經工程改造之抗體可含有包含硫氫基的游離半胱胺酸殘基，該等硫氫基在抗體產生或儲存時經封端(blocked或capped)。該等封端包括與硫氫基相互作用且防止或抑制偶聯物形成的小 分子、蛋白質、肽、離子及其他物質。在一些情況下，未結合的經工程改造抗體可包含結合相同或不同抗體上之其他游離半胱胺酸的游離半胱胺酸。如本文中所論述，該交叉反應可能在製造程序期間產生各種污染物。在一些實施例中，經工程改造之抗體可能需要在結合反應之前去除封端。在特定實施例中，本文中抗體經去除封端且呈現能夠結合的游離硫氫基。在特定實施例中，本文中抗體進行去除封端的反應，其不會使天然存在之二硫鍵發生分裂或重排。應瞭解，在大多數情況下，去除封端的反應將在正常還原反應(還原或選擇性還原)期間發生。
D. DAR分佈及純化
在所選實施例中，與本發明相容的結合及純化方法有利地提供產生包含窄DAR分佈之相對均質ADC製劑的能力。就此而言，根據藥物與經工程改造之抗體之間的化學計量比且根據毒素位置，所揭示之構築體(例如位點特異性構築體)及/或選擇性結合使得ADC物質在樣品內達成均質性。如上文所簡述，術語「藥物與抗體比率」或「DAR」係指藥物與抗體之莫耳比。在某些實施例中，偶聯物製劑根據其DAR分佈可為基本上均質的，此意謂在ADC製劑內，具有特定DAR(例如DAR為2或4)的位點特異性ADC為主要物質，根據負載位點(亦即游離半胱胺酸)，其亦為均一的。在本發明之其他某些實施例中，可經由使用位點特異性抗體及/或選擇性還原及結合達成所要均質性。在其他實施例中，所要均質性可經由使用位點特異性構築體與選擇性還原之組合來達成。在又其他實施例中，相容製劑可使用分析型或製備型層析技術純化，以得到所要均質性。在此等實施例中之每一者中，ADC樣品均質性可使用此項技術中已知的各種技術分析，包括(但不限於)質譜、HPLC(例如尺寸排阻HPLC、RP-HPLC、 HIC-HPLC等)或毛細管電泳。
就ADC製劑之純化而言，應瞭解可使用標準醫藥製備方法獲得所要純度。如本文中所論述，液相層析方法(諸如逆相(RP)及疏水性相互作用層析(HIC))可根據藥物負載值分離混合物中的化合物。在一些情況下，亦可利用離子交換(IEC)或混合模式層析(MMC)分離具有特定藥物負載的物質。
所揭示之ADC及其製劑可包含各種化學計量莫耳比的藥物及抗體部分，此視抗體組態而定且至少部分地視用於達成結合的方法而定。在某些實施例中，每個ADC的藥物負載可包含1至20個彈頭(亦即n為1至20)。其他所選實施例可包含藥物負載為1至15個彈頭的ADC。在其他實施例中，ADC可包含1至12個彈頭或更佳1至10個彈頭。在一些實施例中，ADC將包含1至8個彈頭。
雖然理論藥物負載量可能相對較高，但實際限制(諸如游離半胱胺酸交叉反應性及彈頭疏水性)傾向於限制包含該DAR之均質製劑之產生，原因在於聚集物及其他污染物。亦即，較高藥物負載量(例如>8或10)會引起某些抗體-藥物偶聯物之聚集、不可溶性、毒性或細胞滲透性損失，此視有效載物而定。鑒於該等擔心，本發明所提供的藥物負載量較佳在每個偶聯物1至8個藥物範圍內，亦即其中1、2、3、4、5、6、7或8個藥物共價連接至各抗體(例如對於IgG1而言，其他抗體可具有視二硫鍵數目而定的不同負載容量)。本發明之組合物的DAR較佳為約2、4或6且在一些實施例中，DAR包含約2。
儘管本發明所提供之均質性程度相對較高，但所揭示之組合物實際上包含偶聯物與一系列藥物化合物(在IgG1的情況下，潛在地為1至8)之混 合物。因而，所揭示之ADC組合物包括偶聯物之混合物，其中大部分組成性抗體共價連接至一或多個藥物部分且(儘管經工程改造之構築體及選擇性還原提供了相對偶聯物特異性)，其中藥物部分可藉由各種硫醇基連接至抗體。亦即，結合之後，本發明之ADC組合物將包含各種濃度之具有不同藥物負載量(例如每個IgG1抗體1至8個藥物)之偶聯物(連同主要由游離半胱胺酸交叉反應性引起之某些反應污染物一起)的混合物。然而，使用選擇性還原及製造後純化，可將偶聯物組合物驅向其中其基本上含有單一主要所要ADC物質(例如藥物負載量為2)而其他ADC物質之含量相對較低(例如藥物負載量為1、4、6等)的點。平均DAR值表示整個組合物(亦即所有ADC物質合在一起)之藥物負載量加權平均值。由於所用量化方法存在固有的不確定性及難以在商用背景下完全移除非主要ADC物質，因此可接受的DAR值或規格往往以平均值、範圍或分佈(亦即平均DAR為2+/-0.5)呈現。包含該範圍(亦即1.5至2.5)內之平均DAR量測值的組合物較佳在醫藥背景下使用。
因此，在一些實施例中，本發明將包含平均DAR為1、2、3、4、5、6、7或8(各+/-0.5)的組合物。在其他實施例中，本發明將包含2、4、6或8+/-0.5的平均DAR。最後，在所選實施例中，本發明將包含2+/-0.5或4+/-0.5之平均DAR。應瞭解，在一些實施例中，該範圍或偏差可小於0.4。因此，在其他實施例中，組合物將包含1、2、3、4、5、6、7或8(各+/-0.3)之平均DAR；2、4、6或8+/-0.3之平均DAR；甚至更佳為2或4+/-0.3之平均DAR，或甚至2+/-0.3之平均DAR。在其他實施例中，IgG1偶聯物組合物較佳包含平均DAR為1、2、3、4、5、6、7或8(各+/-0.4)且非主要ADC物質含量相對較低(亦即小於30%)的組合物。在其他實施例中， ADC組合物將包含2、4、6或8(各+/-0.4)之平均DAR且非主要ADC物質的含量相對較低(<30%)。在一些實施例中，ADC組合物將包含2+/-0.4之平均DAR且非主要ADC物質之含量相對較低(<30%)。在又其他實施例中，主要ADC物質(例如DAR為2或DAR為4)當相對於組合物中存在的所有其他DAR物質量測時，將以大於50%之濃度、大於55%之濃度、大於60%之濃度、大於大於65%之濃度、大於70%之濃度、大於75%之濃度、大於80%之濃度、大於85%之濃度、大於90%之濃度、大於93%之濃度、大於95%之濃度或甚至大於97%之濃度存在。
如下文實例中所詳述，結合反應所得之ADC製劑中的單位抗體藥物分佈可藉由習知方式表徵，諸如UV-Vis分光光度法、逆相HPLC、HIC、質譜法、ELISA及電泳。亦可根據單位抗體藥物數來確定量化ADC分佈。藉由ELISA可測定特定ADC製劑中之單位抗體藥物平均值。然而，單位抗體藥物之分佈值因抗體-抗原結合及ELISA偵測侷限性而無法辨別。此外，用於偵測抗體-藥物偶聯物的ELISA分析不能確定藥物部分在何處連接至抗體(諸如重鏈或輕鏈片段或特定胺基酸殘基)。
VI. 診斷學及篩選 A. 診斷學
本發明提供方法偵測、診斷或監測增生性病症的活體外及活體內方法以及篩選患者細胞以鑑別腫瘤細胞(包括致瘤細胞)的方法。該等方法包括鑑別患有癌症之個體以便治療或監測癌症進展，包含使患者或獲自患者之樣品(活體內或活體外)與能夠特異性地識別且與EMR2決定子結合的偵測劑(例如抗體或核酸探針)接觸及偵測樣品中的偵測劑存在或不存在或結合水準。在所選實施例中，偵測劑將包含與如本文所述之可偵測標記或報 導子分子結合的抗體。在某些其他實施例中，投與EMR2抗體且使用第二標記抗體(例如抗鼠類抗體)偵測。在又其他實施例(例如原位雜交或ISH)中，與基因組EMR2決定子反應的核酸探針將用於偵測、診斷或監測增生性病症。
更一般而言，EMR2決定子的存在及/或含量可使用可供一般技術者利用的多種蛋白質或核酸分析技術量測，例如直接物理量測(例如質譜)、結合分析(例如免疫分析、凝集分析及免疫層析分析)、聚合酶鏈反應(PCR、RT-PCR；RT-qPCR)技術、分支寡核苷酸技術、北方墨點技術、寡核苷酸雜交技術及原位雜交技術。該方法亦可包含量測由化學反應產生之信號，例如吸光度變化；螢光變化；化學發光或電化學發光的產生；反射率、折射率或光散射的變化；可偵測標記的積聚或自表面釋放；氧化或還原或氧化還原物質；電流或電位；磁場變化等。適合的偵測技術可藉由量測經標記之結合試劑的參與情況來偵測結合事件，此係經由標記之光致發光(例如經由量測螢光、時差式螢光、消散波螢光、上轉換磷光體、多光子螢光等)、化學發光、電化學發光、光散射、吸光度、放射性、磁場、酶促活性(例如經由引起吸光度或螢光變化或引起化學發光發射之酶反應來量測酶活性)來量測該等標記。或者，可使用不需要使用標記的偵測技術，例如基於量測質量(例如表面聲波量測)、折射率(例如表面電漿子共振量測)，或分析物固有發光的技術。
在一些實施例中，偵測劑與樣品中之特定細胞或細胞組分的結合指示樣品可能含有致瘤細胞，藉此表示患有癌症的個體可用如本文所述的抗體或ADC有效地治療。
在某些較佳實施例中，分析可包含免疫組織化學(IHC)分析或其變化 形式(例如螢光、顯色、標準ABC、標準LSAB等)、免疫細胞化學或其變化形式(例如直接、間接、螢光、顯色等)或原位雜交(ISH)或其變化形式(例如顯色原位雜交(CISH)或螢光原位雜交(DNA-FISH或RNA-FISH))。
就此而言，本發明之某些態樣包含使用經標記之EMR2用於免疫組織化學(IHC)。更特定言之，EMR2 IHC可作為診斷工具使用，從而有助於診斷各種增生性病症及監測對療法(包括EMR2抗體療法)的潛在反應。在某些實施例中，EMR2將與一或多個報導子分子結合。在其他實施例中，EMR2抗體未經標記且使用與一或多個報導子分子結合的獨立藥劑(例如抗鼠類抗體)加以偵測。如本文中所論述及下文實例中所示，可對已以化學方式固定(包括(但不限於)：甲醛、戊二醛、四氧化鋨、重鉻酸鉀、乙酸、醇、鋅鹽、氯化汞、四氧化鉻及苦味酸)且包埋(包括(但不限於)：二醇甲基丙烯酸酯、石蠟及樹脂)或經由冷凍保藏之組織進行相容性診斷分析。該等分析可用於指導治療決策及確定給藥方案及時機。
本發明之其他特別相容態樣涉及使用原位雜交來偵測或監測EMR2決定子。原位雜交技術或ISH已為熟習此項技術者所熟知。簡言之，固定細胞且將含有特定核苷酸序列的可偵測探針添加至所固定之細胞中。若細胞含有互補核苷酸序列，則可偵測的探針將與其雜交。使用本文所闡述之序列資訊，可設計出用於鑑別表現基因型EMR2決定子之細胞的探針。探針較佳與對應於該等決定子的核苷酸序列雜交。雜交條件可以常規方式最佳化以藉由非完全互補雜交來最小化背景信號，然而較佳地，探針較佳與所選EMR2決定子完全互補。在所選實施例中，探針經連接至探針的螢光染料標記，該螢光染料容易藉由標準螢光方法偵測。
相容性活體內治療診斷或診斷分析可以包含此項技術中公認的成像 或監測技術，諸如磁共振成像、電腦化斷層攝影術(例如CAT掃描)、正電子斷層攝影術(例如PET掃描)、放射攝影術、超音波等，如熟習此項技術者所知。
在某些實施例中，本發明之抗體可用於偵測及量化患者樣品(例如血漿或血液)中之特定決定子(例如EMR2蛋白質)的含量，此等含量又可用於偵測、診斷或監測與有關決定子相關的增生性病症。舉例而言，血液及骨髓樣品可配合流式細胞術用於偵測及量測EMR2表現(或另一共表現標記)及監測疾病進展及/或對治療的反應。在相關實施例中，本發明抗體可用於活體內或活體外偵測、監測及/或量化循環腫瘤細胞(WO 2012/0128801)。在其他實施例中，循環腫瘤細胞可包含致瘤細胞。
在本發明之某些實施例中，治療或療法之前，個體或個體樣品中之致瘤細胞可使用所揭示之抗體評估或表徵以確立基線。在其他實例中，可評估來源於經治療之個體之樣品中的致瘤細胞。
在另一個實施例中，本發明提供分析活體內癌症進展及/或發病機制的方法。在另一個實施例中，對活體內癌症進展及/或發病機制的分析包含測定腫瘤進展程度。在另一個實施例中，分析包含鑑別腫瘤。在另一個實施例中，對腫瘤進展的分析係針對原發腫瘤進行。在另一個實施例中，隨時間進行分析，此視癌症類型而定，如熟習此項技術者所知。在另一個實施例中，來源於原發腫瘤之轉移細胞之繼發性腫瘤的進一步分析係在活體內加以分析。在另一個實施例中，分析繼發性腫瘤的尺寸及形狀。在一些實施例中，進一步進行離體分析。
在另一個實施例中，本發明提供一種分析活體內癌症進展及/或發病機制的方法，包括測定細胞轉移或偵測及量化循環腫瘤細胞含量。在又另 一個實施例中，細胞轉移分析包含測定與原發腫瘤不連續之位點處之細胞漸進性生長。在一些實施例中，可執行監測腫瘤細胞的程序，該等腫瘤細胞經由血液脈管、淋巴管或其組合分散於體腔中。在另一個實施例中，細胞轉移分析係根據細胞遷移、擴散、外滲、增殖或其組合來進行。
在某些實例中，治療之前，個體或個體樣品中之致瘤細胞可使用所揭示之抗體評估或表徵以確立基線。在其他實例中，樣品來源於經治療之個體。在一些實例中，個體開始或終止治療之後至少約1、2、4、6、7、8、10、12、14、15、16、18、20、30、60、90天、6個月、9個月、12個月或>12個月，自個體獲得樣品。在某些實例中，一定次數之劑量之後(例如2、5、10、20、30次或超過30次劑量之治療之後)評估或表徵致瘤細胞。在其他實例中，接受一或多次療法後1週、2週、1個月、2個月、1年、2年、3年、4年或超過4年之後，表徵或評估致瘤細胞。
B. 篩選
在某些實施例中，本發明抗體可用於篩選樣品以便鑑別藉由與決定子相互作用而改變腫瘤細胞功能或活性的化合物或藥劑(例如抗體或ADC)。在一個實施例中，使腫瘤細胞與抗體或ADC接觸且可利用抗體或ADC篩選細胞表現特定標靶(例如EMR2)之腫瘤以便鑑別用於包括(但不限於)診斷目的之目的的該等細胞、監測可測定治療功效的該等細胞或富集該等表現標靶之細胞的細胞群體。
在又另一個實施例中，方法包括使腫瘤細胞直接或間接地與測試劑或化合物接觸及測定測試劑或化合物是否調節決定子相關腫瘤細胞之活性或功能，例如，細胞形態或存活率之變化、標記物之表現、分化或去分化、細胞呼吸、粒線體活性、膜完整性、成熟、增殖、存活率、細胞凋亡或細 胞死亡。直接相互作用之一個實例為物理相互作用，而間接相互作用包括例如組合物對中間物分子的作用，此作用又對所提及之實體(例如細胞或細胞培養物)起作用。
篩選方法包括高處理量篩選，其可包括視情況定位或安置於預定位置(例如培養碟、管、燒瓶、滾瓶或盤)上之細胞陣列(例如微陣列)。高處理量機器人或人工處置方法可探測化學相互作用且在短時間段內測定許多基因的表現量。已開發出利用分子信號的技術，例如經由螢光團或微陣列(Mocellin及Rossi,2007,PMID：17265713)及以極快速率處理資訊的自動化分析(參見例如Pinhasov等人，2004,PMID：15032660)。可篩選的文庫包括例如小分子文庫、噬菌體呈現文庫、完全人類抗體酵母呈現文庫(Adimab)、siRNA文庫及腺病毒轉染載體。
VII. 醫藥製劑及治療用途 A. 調配物及投藥途徑
本發明之抗體或ADC可使用此項技術中公認之技術、以各種方式調配。在一些實施例中，本發明之治療組合物可淨投與或與最少量之其他組分一起投與，而其他可視情況調配以含有醫藥學上可接受之適合載劑。如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」包含此項技術中熟知且可獲自商業來源的賦形劑、媒劑、佐劑及稀釋劑用於醫藥製備(參見例如Gennaro(2003)Remington：The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons：Drugfacts Plus，第20版，Mack Publishing；Ansel等人(2004)Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第7版，Lippencott Williams and Wilkins；Kibbe等人(2000)Handbook of Pharmaceutical Excipients，第3版，Pharmaceutical Press.)。
醫藥學上可接受之適合載劑包含相對呈惰性且可促進抗體或ADC投與或可有助於將活性化合物加工成醫藥學上針對遞送至作用位點最佳化之製劑的物質。
該等醫藥學上可接受之載劑包括可改變調配物之形式、稠度、黏度、pH、張力、穩定性、容積滲透濃度、藥物動力學、蛋白質聚集或溶解度的藥劑且包括緩衝劑、濕潤劑、乳化劑、稀釋劑、囊封劑及皮膚穿透增強劑。載劑之某些非限制性實例包括鹽水、緩衝鹽水、右旋糖、精胺酸、蔗糖、水、甘油、乙醇、山梨糖醇、聚葡萄糖、羧甲基纖維素鈉及其組合。全身性投與之抗體可根據經腸、非經腸或局部投藥來調配。實際上，所有三種類型的調配物可同時使用以達成活性成分的全身性投與。賦形劑以及用於非經腸及經腸藥物遞送之調配物闡述於Remington：The Science and Practice of Pharmacy(2000)第20版Mack Publishing中。
適用於經腸投與的調配物包括硬或軟明膠膠囊、丸劑、錠劑(包括包衣錠劑)、酏劑、懸浮液、糖漿或吸入劑及其控制釋放形式。
適用於非經腸投藥(例如注射)的調配物包括活性成分溶解、懸浮或以其他方式(例如脂質體或其他微粒)提供於其中的水性或非水性、等張性、無熱原質、無菌液體(例如溶液、懸浮液)。該等液體可另外含有醫藥學上可接受之其他載劑，諸如抗氧化劑、緩衝劑、防腐劑、穩定劑、抑菌劑、懸浮劑、增稠劑及使得調配物與預期接受者之血液(或其他相關體液)等張的溶質。賦形劑之實例包括(例如)水、醇、多元醇、丙三醇、植物油及其類似物。適用於該等調配物中之醫藥學上可接受之等張性載劑實例包括氯化鈉注射液、林格氏溶液(Ringer's Solution)或乳酸化林格氏注射液。
在尤其較佳的實施例中，經調配的本發明組合物可凍乾以提供抗體 或ADC之粉末形式，其接著可復原，隨後投與。用於製備可注射溶液的無菌粉末可藉由將包含所揭示之抗體或ADC的溶液凍乾來產生，以產生包含活性成分以及視情況存在之任何共溶生物相容成分的粉末。一般來說，分散液或溶液係藉由將活性化合物併入無菌媒劑中來製備，該無菌媒劑含有基本分散介質或溶劑(例如稀釋劑)及視情況存在之其他生物相容成分。相容稀釋劑為醫藥學上可接受(對於投與人類而言，安全且無毒)且適用於製備液體調配物(諸如凍乾之後復原的調配物)的稀釋劑。例示性稀釋劑包括無菌水、抑菌注射用水(BWFI)、pH緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝生理鹽水)、無菌生理鹽水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。在一個替代性實施例中，稀釋劑可包括鹽及/或緩衝劑的水溶液。
在某些較佳實施例中，抗EMR2抗體或ADC將與醫藥學上可接受之糖組合凍乾。「醫藥學上可接受之糖」為一種分子，其與所關注的蛋白質合併時顯著阻止或減少該蛋白質在儲存時的化學及/或物理不穩定性。此時希望凍乾調配物且接著復原。如本文中所用，醫藥學上可接受之糖亦可稱為「凍乾保護劑」。例示性糖及其相應糖醇包括：胺基酸，諸如麩胺酸單鈉或組胺酸；甲胺，諸如甜菜鹼；向液性鹽，諸如硫酸鎂；多元醇，諸如三元醇或較高分子量糖醇，例如甘油、聚葡萄糖、赤藻糖醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇及甘露醇；丙二醇；聚乙二醇；PLURONICS®；及其組合。其他例示性凍乾保護劑包括甘油及明膠，及糖類蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖及水蘇糖。還原糖之實例包括葡萄糖、麥芽糖、乳糖、麥芽酮糖、異麥芽酮糖及乳酮糖。非還原糖之實例包括選自糖醇及其他直鏈多元醇之多羥基化合物的非還原糖苷。較佳糖醇為單糖苷，尤其藉由還原雙醣而獲得的彼等化合物，諸如乳糖、麥芽糖、 乳酮糖及麥芽酮糖。糖苷側基可為葡萄糖苷或半乳糖苷。糖醇之其他實例為葡萄糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇及異麥芽酮糖。較佳的醫藥學上可接受之糖為非還原糖海藻糖或蔗糖。醫藥學上可接受之糖係以「保護量」(例如凍乾前)添加至調配物中，此意謂蛋白質在儲存期間(例如在復原及儲存之後)基本上保持其物理及化學穩定性及完整性。
熟習此項技術者將瞭解相容凍乾保護劑可在以下範圍內的濃度下添加至液體或凍乾調配物中：約1mM至約1000mM、約25mM至約750mM、約50mM至約500mM、約100mM至約300mM、約125mM至約250mM、約150mM至約200mM或約165mM至約185mM。在某些實施例中，可添加凍乾保護劑以提供約10mM、約25mM、約50mM、約75mM、約100mM、約125mM、約130mM、約140mM、約150mM、約160mM、約165mM、約170mM、約175mM、約180mM、約185mM、約190mM、約200mM、約225mM、約250mM、約300mM、約400mM、約500mM、約600mM、約700mM、約800mM、約900mM或約1000mM之濃度。在某些較佳實施例中，凍乾保護劑可包含醫藥學上可接受之糖。在尤其較佳的態樣中，醫藥學上可接受之糖將包含海藻糖或蔗糖。
在其他所選實施例中，本發明之液體及凍乾調配物可包含充當穩定劑或緩衝劑的某些化合物，包括胺基酸或其醫藥學上可接受之鹽。該等化合物可以約1mM至約100mM、約5mM至約75mM、約5mM至約50mM、約10mM至約30mM或約15mM至約25mM範圍內的濃度添加。在某些實施例中，可添加緩衝劑以得到約1mM、約5mM、約10mM、約15mM、約20mM、約25mM、約30mM、約35mM、約40mM、約50mM、約60mM、約70mM、約80mM、約90mM或約100mM之濃度。 在其他所選實施例中，可添加緩衝劑以得到約5mM、約10mM、約15mM、約20mM、約25mM、約30mM、約35mM、約40mM、約50mM、約60mM、約70mM、約80mM、約90mM或約100mM的濃度。在某些較佳實施例中，緩衝劑將包含組胺酸鹽酸鹽。
在又其他所選實施例中，本發明之液體及凍乾調配物可包含非離子型界面活性劑作為穩定劑，諸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60或聚山梨醇酯80。該等化合物可以約0.1mg/ml至約2.0mg/ml、約0.1mg/ml至約1.0mg/ml、約0.2mg/ml至約0.8mg/ml、約0.2mg/ml至約0.6mg/ml或約0.3mg/ml至約0.5mg/ml範圍內的濃度添加。在某些實施例中，可添加界面活性劑以得到約0.1mg/ml、約0.2mg/ml、約0.3mg/ml、約0.4mg/ml、約0.5mg/ml、約0.6mg/ml、約0.7mg/ml、約0.8mg/ml、約0.9mg/ml或約1.0mg/ml之濃度。在其他所選實施例中，可添加界面活性劑以得到約1.1mg/ml、約1.2mg/ml、約1.3mg/ml、約1.4mg/ml、約1.5mg/ml、約1.6mg/ml、約1.7mg/ml、約1.8mg/ml、約1.9mg/ml或約2.0mg/ml之濃度。在某些較佳實施例中，界面活性劑包含聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯40。
不論自凍乾粉末或原生溶液復原，所揭示之抗體或ADC用於非經腸投與(例如靜脈內注射)的相容調配物可包含濃度為約10μg/mL至約100mg/mL的ADC或抗體。在某些所選實施例中，抗體或ADC濃度將包含20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL或1mg/mL。在其他實施例中，ADC濃度將包含2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10 mg/mL、12mg/mL、14mg/mL、16mg/mL、18mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL或100mg/mL。
在某些較佳態樣中，本發明的組合物將包含含有10mg/ml EMR2 ADC、20mM組胺酸鹽酸鹽、0.175M蔗糖、0.4mg/mL聚山梨醇酯20的液體調配物(pH 6.0)。在一個態樣中，本發明之組合物包含10mg/ml EMR2 ADC、20mM組胺酸鹽酸鹽、0.175M蔗糖、0.4mg/mL聚山梨醇酯20(pH 6.0)。在另一態樣中，本發明之組合物包含10mg/ml EMR2 ADC、20mM組胺酸鹽酸鹽、0.175M蔗糖、0.4mg/mL聚山梨醇酯20(pH 6.0)。如本文所論述，該等液體調配物可經凍乾以提供粉末組合物，其可在使用之前用醫藥學上相容(例如水性)載劑復原。當處於液體溶液中時，該等組合物較佳應在-70℃避光儲存。凍乾時，EMR2 ADC粉末調配物較佳應在2-8℃避光儲存。前述溶液或粉末中的每一者較佳包含於與指示適當儲存條件之標記連帶的無菌玻璃瓶(例如USP I型10ml)中且可經組態以始終提供一定體積(例如3mL或5mL)的10mg/mL EMR2 ADC(存在於原生或復原溶液中)。
不論自凍乾粉末復原與否，液體EMR2 ADC調配物(例如如上文剛剛所述)可進一步稀釋(較佳存在於水性載劑中)，隨後投與。舉例而言，前述液體調配物可進一步在含有0.9%氯化鈉注射液USP或等效物(細節上作必要修改後)的輸液袋中稀釋，以達成投藥所要的劑量水準。在某些態樣中，完全稀釋的EMR2 ADC溶液將使用IV裝置經由靜脈內輸注投與。較佳地，所投與的EMR2 ADC藥物溶液(不論藉由靜脈內(IV)輸注或注射)為透明的、無色的且不含可見微粒。
本發明之化合物及組合物可活體內藉由多種途徑投與有需要的個體，包括(但不限於)口腔、靜脈內、動脈內、皮下、非經腸、鼻內、肌肉內、心內、室內、氣管內、頰內、直腸、腹膜內、皮內、局部、經皮及鞘內，或以其他方式藉由植入或吸入投與。本發明組合物可調配成呈固體、半固體、液體或氣態形式的製劑；包括(但不限於)錠劑、膠囊、散劑、顆粒、軟膏、溶液、栓劑、灌腸劑、注射劑、吸入劑及氣溶膠。適當調配物及投藥途徑可根據預定應用及治療方案選擇。
B. 劑量及給藥方案
特定給藥方案(亦即劑量、時序及重複次數)將視特定個體以及經驗考慮因素而定，諸如藥物動力學(例如半衰期、清除率等)。投藥頻率可由熟習此項技術者(諸如主治醫師)根據如下考慮因素確定：病狀及所治療病狀的嚴重程度、所治療個體之年齡及一般健康狀態及其類似因素。可根據所選組合物及給藥方案之功效評估來調節治療過程中之投藥頻率。該評估可根據特定疾病、病症或病狀之標記物來進行。在個體患有癌症的實施例中，此等評估包括經由觸診或目視觀測來直接量測腫瘤尺寸；藉由x射線或其他成像技術間接量測腫瘤尺寸；如藉由直接腫瘤活組織檢查及顯微鏡下檢查腫瘤樣品所評估出現改善；量測間接腫瘤標記物(例如前列腺癌之PSA)或根據本文所述方法鑑別的抗原；增殖性或致瘤細胞的數目減少、該等贅生性細胞之減少得以維持；贅生性細胞之增殖減少；或轉移之形成延遲。
本發明之EMR2抗體或ADC可以多種範圍投與。此等範圍包括每公斤體重每劑量約5μg至約100mg；每公斤體重每劑量約50μg至約5mg；每公斤體重每劑量約100μg至約10mg。其他範圍包括每公斤體重每劑量約100μg至約20mg及每公斤體重每劑量約0.5mg至約20mg。在某些實 施例中，劑量為每公斤體重至少約100μg、每公斤體重至少約250μg、每公斤體重至少約750μg、每公斤體重至少約3mg、每公斤體重至少約5mg、每公斤體重至少約10mg。
在所選實施例中，EMR2抗體或ADC將以每公斤體重每劑量約10、20、30、40、50、60、70、80、90或100μg投與(較佳為靜脈內)。其他實施例可包含以每公斤體重每劑量約200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000μg投與抗體或ADC。在其他實施例中，所揭示之偶聯物將以2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、9或10mg/kg投與。在其他實施例中，偶聯物可以每公斤體重每劑量12、14、16、18或20mg投與。在又其他實施例中，偶聯物可以每公斤體重每劑量25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90或100mg投與。利用本文中之教示內容，熟習此項技術者根據臨床前動物研究、臨床觀測結果及標準醫學及生物化學技術及量測結果可容易確定多種EMR2抗體或ADC的適當劑量。
可根據體表面積(BSA)計算來預測其他給藥方案，如U.S.P.N.7,744,877中所揭示。正如所熟知，BSA係使用患者身高及體重來計算且提供如藉由他或她體表面積所表示之個體體型之度量。在某些實施例中，偶聯物可以1mg/m2至800mg/m2、50mg/m2至500mg/m2之劑量及以100mg/m2、150mg/m2、200mg/m2、250mg/m2、300mg/m2、350mg/m2、400mg/m2或450mg/m2之劑量投與。亦將瞭解，可利用此項技術中公認之經驗技術確定適當劑量。
抗EMR2抗體或ADC可依特定時程投與。一般而言，將有效劑量的 EMR2偶聯物投與個體一或多次。更特定言之，向個體投與有效劑量之ADC，一月一次、一月超過一次或一月少於一次。在某些實施例中，有效劑量之EMR2抗體或ADC可投與多次，包括至少一個月、至少六個月、至少一年、至少兩年之時段或數年之時段。在又其他實施例中，所揭示之抗體或ADC投與之間隔時間可為數日(2、3、4、5、6或7日)、數週(1、2、3、4、5、6、7或8週)或數月(1、2、3、4、5、6、7或8個月)或甚至一年或數年。
在一些實施例中，涉及所結合抗體的治療過程將包含在數週或數月期間的多次劑量之所選藥品。更特定言之，本發明之抗體或ADC可每天、每兩天、每四天、每週、每十天、每兩週、每三週、每個月、每六週、每兩個月、每十週或每三個月投與一次。就此而言，應瞭解可根據患者反應及臨床實務來改變劑量或調整間隔時間。本發明亦涵蓋不連續投藥或分成數次部分投藥的日劑量。本發明組合物及抗癌劑可互換地隔日或隔週輪流投與；或可依序進行抗體治療，隨後為抗癌劑療法之一或多次治療。在任何情況下，如一般技術者所瞭解，化學治療劑的適當劑量通常大約為臨床療法中已使用的彼等劑量，其中化學治療劑單獨或與其他化學治療劑組合投與。
在另一個實施例中，本發明之EMR2抗體或ADC可在維持療法中用於降低或消除疾病初始呈現之後的腫瘤復發機率。較佳地，病症已經治療且初始腫瘤塊已消除、減小或以其他方式改善，因此患者無症狀或處於緩解狀態。此時，可向個體投與醫藥學上有效量之所揭示之抗體一或多次，即使疾病指示很少或無(使用標準診斷程序)。
在另一個較佳實施例中，本發明的調節劑可在預防上使用或作為輔 助療法用於在減積程序之後預防或減少腫瘤轉移可能性。如本發明中所使用，「減積程序」意謂減少腫瘤塊或改善腫瘤負荷或腫瘤增生的任何程序、技術或方法。例示性減積程序包括(但不限於)手術、放射療法(亦即放射束)、化學療法、免疫療法或消融。在熟習此項技術者根據本發明容易確定的適當時間，可投與所揭示之ADC，如藉由減少腫瘤轉移的臨床、診斷或治療診斷程序所表明。
本發明尚有的其他實施例包含將所揭示之抗體或ADC投與無症狀、但處於產生癌症之風險中的個體。亦即，本發明之抗體或ADC可真正地使用在預防意義且給予已檢查或測試且具有一或多個指定風險因素(例如基因組適應症、家族史、活體內或活體外測試結果等)、但尚未出現贅瘤的患者。
亦可憑經驗確定所揭示之治療組合物在已投藥一或多次之個體中的劑量及療法。舉例而言，可將遞增劑量之如本文所述製備之治療組合物給予個體。在所選實施例中，可分別根據憑經驗確定或所觀測之副作用或毒性來逐漸增加或降低或減少劑量。為評估所選組合物之功效，可如先前所述沿用特定疾病、病症或病狀之標記物。對於癌症而言，此等評估包括經由觸診或目視觀測來直接量測腫瘤尺寸、藉由x射線或其他成像技術間接量測腫瘤尺寸；如藉由直接腫瘤活組織檢查及顯微鏡下檢查腫瘤樣品所評估，出現改善；量測間接腫瘤標記物(例如前列腺癌之PSA)或根據本文所述方法鑑別的致瘤抗原；疼痛或麻痺減少；與腫瘤相關之言語、視力、呼吸或其他失能改善；食慾增加；或生活品質提高，如藉由所接受之測試或存活期延長所量測。對於熟習此項技術者顯而易見的是，劑量將視以下而變化：個體、贅生性病狀類型、贅生性病狀階段、個體之贅生性病狀是否 開始轉移至其他位置，及所用的以往療法及並行療法。
C. 組合療法
如上述組合療法所提及的組合可特別適用於減少或抑制非所需之贅生性細胞增殖、減少癌症發生率、減少或預防癌症復發，或減少或預防癌症擴散或轉移。在該等情況下，本發明之抗體或ADC可藉由移除CSC而具有敏化劑或化學敏化劑的作用(否則CSC會支持且維持腫瘤塊)，且藉此使得當前標準照護療法去腫塊劑或抗癌劑的使用更有效。亦即，所揭示之抗體或ADC在某些實施例中可提供增強的作用(例如相加或協同性質)，其增強另一種所投治療劑的作用模式。在本發明之上下文中，「組合療法」應寬泛解釋且僅指投與抗EMR2抗體或ADC及一或多種抗癌劑，該等抗癌劑包括(但不限於)細胞毒性劑、細胞生長抑制劑、抗血管生成劑、去腫塊劑、化學治療劑、放射療法及放射性治療劑、靶向抗癌劑(包括單株抗體與小分子實體)、BRM、治療抗體、癌症疫苗、細胞激素、激素療法、輻射療法及抗轉移劑及免疫治療劑，包括特異性與非特異性方法。
當各療法(例如抗體及抗癌劑)單獨執行時，不要求所觀測的效應具有相加的組合結果。雖然至少相加效應通常是所期望的，但任何增加的抗腫瘤效應超過該等單一療法之一是有益的。另外，本發明不要求組合療法展現協同效應。然而，熟習此項技術者將瞭解，使用包含較佳實施例的某些所選組合，可觀測到協同作用。
因而，在某些態樣中，在癌症治療中，組合療法具有治療協同作用或使可量測的治療作用改善而優於(i)單獨使用的抗EMR2抗體或ADC，或(ii)單獨使用的治療部分，或(iii)在不添加抗EMR2抗體或ADC的情況下，治療部分與另一治療部分的組合使用。如本文所用，術語「治療協同作用」 意謂抗EMR2抗體或ADC與一或多個治療部分組合的治療作用大於抗EMR2抗體或ADC與一或多種治療部分組合之相加作用。
藉由與對照或基線量測結果進行比較來量化所揭示之組合的所要結果。如本文所用，相對術語，諸如「改良」、「提高」或「減少」，指示相對於對照而言的值，諸如本文所述之療法起始之前，對同一個體的量測；或在本文所述之抗EMR2抗體或ADC不存在下、但在其他治療部分(諸如標準照護療法)存在下，對一個對照個體(或多個對照個體)的量測。代表性對照個體為所罹患癌症形式與所治療個體相同、年齡與所治療個體大約相同的個體(以確保所治療個體與對照個體之疾病階段類似)。
回應於療法的變化或改善通常具有統計顯著性。如本文所用，術語「顯著性」或「顯著」係指兩個或超過兩個實體之間存在非隨機關聯之機率的統計學分析。為了確定關係是否「顯著」或具有「顯著性」，可計算「p值」。低於使用者定義之截止點的P值視為顯著。p值小於或等於0.1、小於0.05、小於0.01、小於0.005或小於0.001可視為顯著。
協同治療作用可為比單一治療部分或抗EMR2抗體或ADC所引起之治療作用或所指定組合中之抗EMR2抗體或ADC或單一治療部分所引起之治療作用總和大至少約兩倍的作用，或至少約五倍大，或至少約十倍大，或至少約二十倍大，或至少約五十倍大，或至少約一百倍大。協同治療作用亦可觀測為治療作用相較於單一治療部分或抗EMR2抗體或ADC所引起之治療作用或所指定組合中之抗EMR2抗體或ADC或單一治療部分所引起之治療作用總和提高至少10%，或至少20%，或至少30%，或至少40%，或至少50%，或至少60%，或至少70%，或至少80%，或至少90%，或至少100%或超過100%。協同作用亦為當其組合使用時允許治療劑之劑量降 低的作用。
實施組合療法時，抗EMR2抗體或ADC及治療部分可以單一組合物或以兩種或超過兩種不同組合物使用相同或不同投與途徑同時投與個體。或者，抗EMR2抗體或ADC治療可先於或後於治療部分治療，例如數分鐘至數週範圍內之時間間隔。在一個實施例中，治療部分與抗體或ADC彼此間在約5分鐘至約兩週內投與。在又其他實施例中，抗體與治療部分之投與之間可間隔數天(2、3、4、5、6或7)、數週(1、2、3、4、5、6、7或8)或數月(1、2、3、4、5、6、7或8)。
組合療法可依各種時程(諸如每天一次、兩次或三次、每兩天一次、每三天一次、每週一次、每兩週一次、每個月一次、每兩個月一次、每三個月一次、每六個月一次)投與直至病狀經治療、緩解或治癒，或可連續投與。抗體與治療部分可隔日或隔週輪流投與；或可依序給予抗EMR2抗體或ADC療法，隨後為其他治療部分之一或多種療法。在一個實施例中，抗EMR2抗體或ADC係與一或多個治療部分組合投與較短的治療週期。在其他實施例中，組合療法投與較長的治療週期。組合療法可經由任何途徑投與。
在所選實施例中，本發明的化合物及組合物可聯合檢查點抑制劑(諸如PD-1抑制劑或PD-L1抑制劑)使用。PD-1連同其配位體PD-L1一起為抗腫瘤T淋巴細胞反應之負調節劑。在一個實施例中，組合療法可包含將抗EMR2抗體或ADC與抗PD-1抗體(例如派立珠單抗(pembrolizumab)、納武單抗(nivolumab)、皮立珠單抗(pidilizumab))及視情況存在之一或多種其他治療部分一起投與。在另一個實施例中，組合療法可包含將抗EMR2抗體或ADC與抗PD-L1抗體(例如艾維路單抗(avelumab)、阿特唑單抗 (atezolizumab)、德瓦魯單抗(durvalumab))及視情況存在之一或多種其他治療部分一起投與。在又另一個實施例中，組合療法可包含將抗EMR2抗體或ADC與抗PD-1抗體或抗PD-L1一起投與，投與在用檢查點抑制劑及/或靶向BRAF組合療法(例如維羅非尼(vemurafenib)或達博尼布(dabrafinib))治療之後繼續進展的患者。
在一些實施例中，抗EMR2抗體或ADC可與各種第一線癌症療法組合使用。因此，在所選實施例中，組合療法包含使用抗EMR2抗體或ADC及細胞毒性劑(諸如異環磷醯胺、絲裂黴素C、長春地辛、長春鹼、依託泊苷、伊立替康、吉西他濱、紫杉烷、長春瑞賓、甲胺喋呤及培美曲塞)及視情況存在之一或多種其他治療部分。在某些贅生性適應症(例如血液學適應症，諸如AML或多發性骨髓瘤)中，所揭示之ADC可與細胞毒性劑(諸如阿糖胞苷(AraC)加蒽環黴素(anthracycyline)(阿克拉黴素(aclarubicin)、安吖啶(amsacrine)、小紅莓(doxorubicin)、道諾黴素(daunorubicin)、依達比星(idarubixcin)等)或米托蒽醌(mitoxantrone)、氟達拉賓(fludarabine)、羥脲(hydroxyurea)、氯法拉濱(clofarabine)、克羅他欣(cloretazine))組合使用。在其他實施例中，本發明的ADC可與以下組合：G-CSF或GM-CSF致敏去甲基劑，諸如阿紮胞苷(azacitidine)或地西他濱(decitabine)；FLT3選擇性酪胺酸激酶抑制劑(例如米哚妥林(midostaurin)、來他替尼(lestaurtinib)及舒尼替尼(sunitinib))、全反式視黃酸(ATRA)及三氧化二砷(其中最後兩個組合對於急性前髓細胞性白血病(APL)可為特別有效的)。
在另一個實施例中，組合療法包含使用抗EMR2抗體或ADC及鉑基藥物(例如卡鉑(carboplatin)或順鉑(cisplatin))及視情況存在之一或多種其 他治療部分(例如長春瑞賓(vinorelbine)；吉西他濱(gemcitabine)；紫杉烷，諸如多西他賽(docetaxel)或太平洋紫杉醇(paclitaxel)；伊立替康(irinotecan)；或培美曲塞(pemetrexed))。
在某些實施例中，例如治療BR-ERPR、BR-ER或BR-PR癌症時，組合療法包含使用抗EMR2抗體或ADC及一或多個描述為「激素療法」的治療部分。如本文所用，「激素療法」係指例如他莫昔芬(tamoxifen)；促性腺素或促黃體釋放激素(GnRH或LHRH)；依維莫司(everolimus)及依西美坦(exemestane)；托瑞米芬(toremifene)；或芳香酶抑制劑(例如阿那曲唑(anastrozole)、來曲唑(letrozole)、依西美坦(exemestane)或氟維司群(fulvestrant))。
在另一個實施例中，例如在治療BR-HER2時，組合療法包含使用抗EMR2抗體或ADC及曲妥珠單抗(trastuzumab)或阿多-曲妥珠單抗恩他新(ado-trastuzumab emtansine)(卡德克拉(Kadcyla))及視情況存在之一或多種其他治療部分(例如帕妥珠單抗(pertuzumab)及/或多西他賽(docetaxel))。
在一些實施例中，例如治療轉移性乳癌時，組合療法包含使用抗EMR2抗體或ADC及紫杉烷(例如多西他賽或太平洋紫杉醇)及視情況存在之另一種治療部分，例如蒽環黴素(例如小紅莓或表柔比星(epirubicin))及/或艾日布林(eribulin)。
在另一個實施例中，例如治療轉移性或復發性乳癌或BRCA突變型乳癌時，組合療法包含使用抗EMR2抗體或ADC及甲地孕酮(megestrol)及視情況存在之另一種治療部分。
在其他實施例中，例如治療BR-TNBC時，組合療法包含使用抗EMR2抗體或ADC及聚ADP核糖聚合酶(PARP)抑制劑(例如BMN-673、奧 拉帕尼(olaparib)、如卡帕瑞(rucaparib)及維利帕尼(veliparib))及視情況存在之另一種治療部分。
在另一個實施例中，組合療法包含使用抗EMR2抗體或ADC及PARP抑制劑及視情況存在之一或多個其他治療部分。
在另一個實施例中，例如治療乳癌時，組合療法包含使用抗EMR2抗體或ADC及環磷醯胺及視情況存在之另一種治療部分(例如小紅莓、紫杉烷、表柔比星、5-FU及/或甲胺喋呤。
在另一個實施例中，用於治療EGFR陽性NSCLC的組合療法包含使用抗EMR2抗體或ADC及阿法替尼及視情況存在之一或多個其他治療部分(例如埃羅替尼(erlotinib)及/或貝伐單抗(bevacizumab))。
在另一個實施例中，用於治療EGFR陽性NSCLC的組合療法包含使用抗EMR2抗體或ADC及埃羅替尼及視情況存在之一或多個其他治療部分(例如貝伐單抗)。
在另一個實施例中，用於治療ALK陽性NSCLC的組合療法包含使用抗EMR2抗體或ADC及色瑞替尼(ceritinib)(載卡迪(Zykadia))及視情況存在之一或多個其他治療部分。
在另一個實施例中，用於治療ALK陽性NSCLC的組合療法包含使用抗EMR2抗體或ADC及克卓替尼(crizotinib)(薩科尼(Xalcori))及視情況存在之一或多個其他治療部分。
在另一個實施例中，組合療法包含使用抗EMR2抗體或ADC及貝伐單抗及視情況存在之一或多種其他治療部分(例如吉西他濱或紫杉烷，諸如多西他賽或太平洋紫杉醇；及/或鉑類似物)。
在另一個實施例中，組合療法包含使用抗EMR2抗體或ADC及貝伐 單抗及視情況存在之環磷醯胺。
在一個特定實施例中，用於治療耐鉑性腫瘤的組合療法包含使用抗EMR2抗體或ADC及小紅莓及/或依託泊苷及/或吉西他濱及/或長春瑞賓及/或異環磷醯胺及/或甲醯四氫葉酸調節之5-氟尿嘧啶及/或貝伐單抗及/或他莫昔芬；及視情況存在之一或多個其他治療部分。
在所選實施例中，所揭示之抗體及ADC可與某些類固醇組合使用，以潛在地使治療過程更有效且減少副作用，諸如發炎、噁心及過敏。可與本發明之ADC組合使用的例示性類固醇包括(但不限於)氫皮質酮(hydrocortisone)、地塞米松(dexamethasone)、甲基潑尼龍(methylprednisolone)及潑尼龍(prednisolone)。在尤其較佳的態樣中，類固醇將包含地塞米松。
在一些實施例中，抗EMR2抗體或ADC可與各種第一線黑色素瘤療法組合使用。在一個實施例中，組合療法包含使用抗EMR2抗體或ADC及達卡巴嗪(dacarbazine)及視情況存在之一或多個其他治療部分。在其他實施例中，組合療法包含使用抗EMR2抗體或ADC及替莫唑胺(temozolamide)及視情況存在之一或多個其他治療部分。在另一個實施例中，組合療法包含使用抗EMR2抗體或ADC及鉑基治療部分(例如卡鉑或順鉑)及視情況存在之一或多個其他治療部分。在一些實施例中，組合療法包含使用抗EMR2抗體或ADC及長春花生物鹼治療部分(例如長春鹼、長春瑞賓、長春新鹼或長春地辛)及視情況存在之一或多個其他治療部分。 在一個實施例中，組合療法包含使用抗EMR2抗體或ADC及介白素-2及視情況存在之一或多個其他治療部分。在另一個實施例中，組合療法包含使用抗EMR2抗體或ADC及干擾素-α及視情況存在之一或多個其他治療部分。
在其他實施例中，抗EMR2抗體或ADC可與輔助黑色素瘤療法及/或手術程序(例如腫瘤切除)組合使用。在一個實施例中，組合療法包含使用抗EMR2抗體或ADC及干擾素-α及視情況存在之一或多個其他治療部分。
本發明亦提供抗EMR2抗體或ADC與放射療法之組合。如本文所用，術語「放射療法」意謂局部誘導腫瘤細胞內發生DNA損傷的任何機制，諸如γ照射、X射線、UV照射、微波、電子發射及其類似機制。亦涵蓋使用放射性同位素定向遞送至腫瘤細胞的組合療法，且其可組合使用或以本文中揭示之抗EMR2抗體之偶聯物形式使用。典型地，在約1至約2週之時間段期間內脈衝投與放射療法。視情況，放射療法可以單一劑量投與或以多次劑量依序投與。
在其他實施例中，抗EMR2抗體或ADC可與一或多種下述化學治療劑組合使用。
D. 抗癌劑
如本文中所用，術語「抗癌劑」為「治療部分」之一亞群，其又為描述為「醫藥活性部分」之藥劑之一亞群。更特定言之，「抗癌劑」意謂可用於治療細胞增殖性病症(諸如癌症)的任何藥劑(或其醫藥學上可接受之鹽)，且包括(但不限於)細胞毒性劑、細胞生長抑制劑、抗血管生成劑、去腫塊劑、化學治療劑、放射性治療劑、靶向抗癌劑、生物反應調節劑、治療抗體、癌症疫苗、細胞激素、激素療法、抗轉移劑及免疫治療劑。應注意，抗癌劑之前述分類彼此不具有排他性且所選藥劑可能屬於一或多種類別。舉例而言，相容抗癌劑可歸類為細胞毒性劑及化學治療劑。因此，前述術語中的每一者應根據本發明來解釋且接著根據其在醫學技術中的用途來解釋。
在較佳實施例中，抗癌劑可包括抑制或消除或經設計可抑制或消除癌細胞或可能癌變或產生致瘤後代之細胞(例如致瘤細胞)的任何化學藥劑(例如化學治療劑)。就此而言，所選化學藥劑(細胞週期依賴性藥劑)往往針對細胞生長或分裂必需的細胞內過程，且因此特別有效地針對通常快速生長及分裂的癌細胞。舉例而言，長春新鹼使得微管解聚合且從而抑制快速分裂的腫瘤細胞進入有絲分裂。在其他情況下，所選化學藥劑為細胞週期非依賴性藥劑，其在細胞生命週期的任何點干擾細胞存活且可有效地用於定向治療劑(例如ADC)中。舉例而言，某些吡咯并苯并二氮呯結合至細胞DNA之小凹槽且在遞送至核後抑制轉錄。就組合療法或選擇ADC組分而言，應瞭解熟習此項技術者根據本發明可容易鑑別相容細胞週期依賴性藥劑及細胞週期非依賴性藥劑。
在任何情況下，且如上文所提及，應了解除所揭示之抗EMR2抗體及本文揭示之ADC之外，所選抗癌劑可彼此組合(例如CHOP療法)投與。此外，應進一步瞭解，在所選實施例中，該等抗癌劑可包含偶聯物且可與抗體結合之後投與。在某些實施例中，所揭示之抗癌劑將連接至抗EMR2抗體以提供如本文所揭示的ADC。
如本文中所用，術語「細胞毒性劑」(或細胞毒素)通常意謂對細胞有毒的物質，使得其減少或抑制細胞功能及/或引起腫瘤細胞毀壞。在某些實施例中，該物質為來源於活有機體的天然存在之分子或其類似物(自天然來源純化或合成製備)。細胞毒性劑之實例包括(但不限於)以下各者之小分子毒素或酶活性毒素：細菌(例如卡奇黴素、白喉毒素(Diptheria toxin)、假單胞菌(Pseudomonas)內毒素及外毒素、葡萄球菌腸毒素A(Staphylococcal enterotoxin A))、真菌(例如α-帚麴菌素(α-sarcin)、侷限 麴菌素(restrictocin))、植物(例如相思子毒素(abrin)、蓖麻毒素(ricin)、莫迪素(modeccin)、槲寄生素(viscumin)、商陸抗病毒蛋白、皂草素(saporin)、白樹素(gelonin)、苦瓜蛋白(momoridin)、天花粉蛋白(trichosanthin)、大麥毒素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、康乃馨(dianthin)蛋白、洋商陸(Phytolacca mericana)蛋白[PAPI、PAPII及PAP-S]、苦瓜(Momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(saponaria officinalis)抑制劑、絲林黴素(mitegellin)、侷限麴菌素、酚黴素(phenomycin)、新黴素(neomycin)及單端孢黴烯(tricothecene))或動物(例如細胞毒性核糖核酸酶，諸如細胞外胰臟核糖核酸酶；去氧核糖核酸酶I，包括其片段及/或變異體)。本文闡述其他相容細胞毒性劑，包括某些放射性同位素、類美登素(maytansinoid)、奧瑞斯他汀(auristatin)、海兔毒素(dolastatins)、倍癌黴素(duocarmycin)、瓢菌素(amanitin)及吡咯并苯并二氮呯。
更一般而言，可與本發明抗體組合使用(或結合)之細胞毒性劑或抗癌劑實例包括(但不限於)烷基化劑、磺酸烷基酯、阿那曲唑(anastrozole)、瓢菌素、氮丙啶、乙烯亞胺及甲基三聚氰胺、乙醯精寧(acetogenins)、喜樹鹼(camptothecin)、BEZ-235、硼替佐米(bortezomib)、苔蘚蟲素(bryostatin)、海洋抑素(callystatin)、CC-1065、色瑞替尼(ceritinib)、克卓替尼(crizotinib)、念珠藻環肽(cryptophycins)、海兔毒素(dolastatin)、多卡米辛(duocarmycin)、艾榴素(eleutherobin)、埃羅替尼(erlotinib)、水鬼蕉鹼(pancratistatin)、沙考地汀(sarcodictyin)、海綿抑素(spongistatin)、氮芥(nitrogen mustards)、抗生素、烯二炔達內黴素(enediyne dynemicin)、雙膦酸鹽、埃斯培拉黴素(esperamicin)、色蛋白烯二炔抗生素發色團、阿 克拉黴素(aclacinomysins)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycins)、放線菌素c(cactinomycin)、坎弗醯胺(canfosfamide)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycinis)、環磷醯胺、放線菌素d、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、小紅莓、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依西美坦(exemestane)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟維司群(fulvestrant)、吉非替尼(gefitinib)、艾達黴素(idarubicin)、拉帕替尼(lapatinib)、來曲唑(letrozole)、洛那法尼(lonafarnib)、麻西羅黴素(marcellomycin)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、絲裂黴素(mitomycins)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、帕唑帕尼(pazopanib)、培洛黴素(peplomycin)、潑非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、奎那黴素(quelamycin)、雷帕黴素(rapamycin)、羅多比星(rodorubicin)、索拉非尼(sorafenib)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈脲菌素(streptozocin)、他莫昔芬(tamoxifen)、他莫昔芬檸檬酸鹽、替莫唑胺(temozolomide)、替泊啶(tepodina)、替吡法尼(tipifarnib)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凡德他尼(vandetanib)、伏羅唑(vorozole)、XL-147、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物、葉酸類似物、嘌呤類似物、雄激素、抗腎上腺、葉酸補充劑(諸如亞葉酸)、乙醯葡醛酯(aceglatone)、醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)、胺基乙醯丙酸、恩尿嘧啶(eniluracil)、安吖啶(amsacrine)、貝斯布西(bestrabucil)、比生群(bisantrene)、艾達曲克(edatraxate)、得弗伐胺(defofamine)、秋 水仙胺(demecolcine)、地吖醌(diaziquone)、艾弗鳥胺酸(elfornithine)、依利醋銨(elliptinium acetate)、埃坡黴素(epothilone)、依託格魯(etoglucid)、硝酸鎵、羥脲、蘑菇多醣(lentinan)、氯尼達明(lonidainine)、類美登素(maytansinoid)、丙脒腙(mitoguazone)、米托蒽醌(mitoxantrone)、莫比達摩(mopidanmol)、二胺硝吖啶(nitraerine)、噴司他汀(pentostatin)、蛋氨氮芥(phenamet)、吡柔比星(pirarubicin)、洛索蒽醌(losoxantrone)、鬼臼酸(podophyllinic acid)、2-乙基醯肼、丙卡巴肼(procarbazine)、多醣複合物、雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；SF-1126、西索菲蘭(sizofiran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；單端孢黴烯(trichothecenes)(T-2毒素、弗納庫林A(verracurin A)、桿孢菌素A(roridin A)及胺癸叮(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)；環磷醯胺；噻替派(thiotepa)；類紫杉醇、苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲胺喋呤；鉑類似物、長春鹼；鉑；依託泊苷(etoposide)；異環磷醯胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼；長春瑞賓；諾凡特龍(novantrone)；替尼泊甙(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；柔紅黴素(daunomycin)；胺基喋呤(aminopterin)；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)、拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸；類視黃素(retinoids)；卡培他濱(capecitabine)；康柏斯達汀(combretastatin)；甲醯四氫葉酸(leucovorin)；奧沙利鉑(oxaliplatin)； PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR及VEGF-A之抑制劑XL518，其減少細胞增殖；及上述任一者之醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物、酸或衍生物。此定義中亦包括用來調節或抑制針對腫瘤之激素作用的抗激素劑，諸如抗雌激素及選擇性雌激素受體抗體；抑制芳香酶(芳香酶調節腎上腺產生雌激素)的芳香酶抑制劑，及抗雄激素；以及曲沙他濱(1,3-二氧雜環戊烷核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸、核糖核酸酶，諸如VEGF表現抑制劑及HER2表現抑制劑；疫苗PROLEUKIN® rIL-2；LURTOTECAN®拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX® rmRH；長春瑞賓及埃斯波黴素；及上述任一者之醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物、酸或衍生物。
相容細胞毒性劑或抗癌劑亦可包含商業上或臨床上可獲得的化合物，諸如埃羅替尼(TARCEVA®,Genentech/OSI Pharm.)、多西他賽(TAXOTERE®,Sanofi-Aventis)、5-FU(氟尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，CAS編號51-21-8)、吉西他濱(GEMZAR®,Lilly)、PD-0325901(CAS編號391210-10-9,Pfizer)、順鉑(順-二胺二氯鉑(II)，CAS編號15663-27-1)、卡鉑(CAS編號41575-94-4)、太平洋紫杉醇(TAXOL®,Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、曲妥珠單抗(trastuzumab)(HERCEPTIN®,Genentech)、替莫唑胺(temozolomide)(4-甲基-5-側氧基-2,3,4,6,8-五氮雜雙環[4.3.0]九-2,7,9-三烯-9-甲醯胺，CAS編號85622-93-1，TEMODAR®,TEMODAL®,Schering Plough)、他莫昔芬(tamoxifen)((Z)-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-N,N-二甲基乙胺，NOLVADEX®，ISTUBAL®，VALODEX®)及小紅莓(ADRIAMYCIN®)。 商業上或臨床上可獲得的其他抗癌劑包含依魯替尼(IMBRUVICA®，AbbVie)、奧沙利鉑(ELOXATIN®,Sanofi)、硼替佐米(VELCADE®, Millennium Pharm.)、舒癌特(SUNITINIB®,SU11248,Pfizer)、來曲唑(FEMARA®,Novartis)、甲磺酸伊馬替尼(GLEEVEC®,Novartis)、XL-518(Mek抑制劑，Exelixis，WO 2007/044515)、ARRY-886(Mek抑制劑，AZD6244，Array BioPharma,Astra Zeneca)、SF-1126(PI3K抑制劑，Semafore Pharmaceuticals)、BEZ-235(PI3K抑制劑，Novartis)、XL-147(PI3K抑制劑，Exelixis)、PTK787/ZK 222584(Novartis)、氟維司群(FASLODEX®,AstraZeneca)、甲醯四氫葉酸(亞葉酸)、雷帕黴素(西羅莫司(sirolimus)，RAPAMUNE®,Wyeth)、拉帕替尼(TYKERB®,GSK572016,Glaxo Smith Kline)、洛那法尼(SARASARTM,SCH 66336,Schering Plough)、索拉非尼(NEXAVAR®,BAY43-9006,Bayer Labs)、吉非替尼(IRESSA®,AstraZeneca)、伊立替康(CAMPTOSAR®,CPT-11,Pfizer)、替吡法尼(ZARNESTRATM,Johnson & Johnson)、ABRAXANETM(不含十六醇聚氧乙烯醚)、白蛋白工程化之太平洋紫杉醇奈米粒子調配物(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Il)、凡德他尼(rINN,ZD6474,ZACTIMA®,AstraZeneca)、苯丁酸氮芥(chloranmbucil)、AG1478、AG1571(SU 5271；Sugen)、坦羅莫司(temsirolimus)(TORISEL®,Wyeth)、帕唑帕尼(pazopanib)(GlaxoSmithKline)、坎弗醯胺(canfosfamide)(TELCYTA®,Telik)、噻替派及環磷醯胺(CYTOXAN®，NEOSAR®)；長春瑞賓(NAVELBINE®)；卡培他濱(XELODA®,Roche)、他莫昔芬(包括NOLVADEX®；他莫昔芬檸檬酸鹽)、FARESTON®(托瑞米芬檸檬酸鹽)；MEGASE®(乙酸甲地孕酮)、AROMASIN®(依西美坦(exemestane)；Pfizer)、福美斯坦(formestanie)、法屈唑(fadrozole)、RIVISOR®(伏羅 唑)、FEMARA®(來曲唑；Novartis)及ARIMIDEX®(阿那曲唑(anastrozole)；AstraZeneca)。
術語「醫藥學上可接受之鹽」或「鹽」意謂分子或大分子之有機鹽或無機鹽。酸加成鹽可經由胺基形成。例示性鹽包括(但不限於)硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、異菸鹼酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、酸式檸檬酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、丹寧酸鹽(tannate)、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、丁二酸鹽、順丁烯二酸鹽、龍膽酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、葡糖二酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、麩胺酸鹽、甲烷磺酸鹽、乙烷磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽及雙羥萘酸鹽(亦即1,1'-亞甲基-雙(2-羥基-3-萘甲酸鹽))。醫藥學上可接受之鹽可涉及另一分子(諸如乙酸根離子、丁二酸根離子或其他相對離子)之包含。相對離子可為使母化合物上之電荷穩定之任何有機或無機部分。此外，醫藥學上可接受之鹽在其結構中可具有超過一個帶電原子。在多個帶電原子為醫藥學上可接受之鹽之一部分的情況下，該鹽可具有多個相對離子。因此，醫藥學上可接受之鹽可具有一或多個帶電原子及/或一或多個相對離子。
類似地，「醫藥學上可接受之溶劑合物」或「溶劑合物」係指一或多個溶劑分子與分子或大分子之締合物。形成醫藥學上可接受之溶劑合物之溶劑實例包括(但不限於)水、異丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸及乙醇胺。
在其他實施例中，本發明之抗體或ADC可與當前臨床試驗或市售中之多種抗體(或免疫治療劑)中之任一者組合使用。所揭示之抗體可與選自由以下組成之群的抗體組合使用：阿巴伏單抗(abagovomab)、阿達木單 抗(adecatumumab)、阿托珠單抗(afutuzumab)、阿侖單抗(alemtuzumab)、阿妥莫單抗(altumomab)、阿瑪西單抗(amatuximab)、麻安莫單抗(anatumomab)、阿西莫單抗(arcitumomab)、阿特唑單抗(atezolizumab)、艾維路單抗(avelumab)、巴維昔單抗(bavituximab)、貝妥莫單抗(bectumomab)、貝伐單抗(bevacizumab)、比伐珠單抗(bivatuzumab)、布林莫單抗(blinatumomab)、貝倫妥單抗(brentuximab)、坎妥珠單抗(cantuzumab)、卡托莫西單抗(catumaxomab)、西妥昔單抗(cetuximab)、西他土珠(citatuzumab)、西妥木單抗(cixutumumab)、昔瓦土單抗(clivatuzumab)、康納木單抗(conatumumab)、達西珠單抗(dacetuzumab)、達洛圖單抗(dalotuzumab)、達土木單抗(daratumumab)、地莫單抗(detumomab)、德珠單抗(drozitumab)、杜里土單抗(duligotumab)、德瓦魯單抗(durvalumab)、杜西吉土單抗(dusigitumab)、依美昔單抗(ecromeximab)、埃羅妥珠單抗(elotuzumab)、恩斯土昔單抗(ensituximab)、鄂托默單抗(ertumaxomab)、埃達珠單抗(etaracizumab)、伐吐珠單抗(farletuzumab)、費拉妥珠單抗(ficlatuzumab)、非吉單抗(figitumumab)、法蘭土單抗(flanvotumab)、浮土西單抗(futuximab)、加尼圖單抗(ganitumab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、吉瑞昔單抗(girentuximab)、格雷巴土木單抗(glembatumumab)、異貝莫單抗(ibritumomab)、伊戈伏單抗(igovomab)、伊姆加土珠單抗(imgatuzumab)、因達西單抗(indatuximab)、伊諾妥珠單抗(inotuzumab)、英妥木單抗(intetumumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、伊妥木單抗(iratumumab)、拉貝珠單抗(labetuzumab)、拉立珠單抗(lambrolizumab)、來沙木單抗(lexatumumab)、林妥珠單抗(lintuzumab)、洛瓦土珠單抗(lorvotuzumab)、 魯卡木單抗(lucatumumab)、瑪帕單抗(mapatumumab)、馬妥珠單抗(matuzumab)、米拉珠單抗(milatuzumab)、明瑞莫單抗(minretumomab)、米妥莫單抗(mitumomab)、莫昔土莫單抗(moxetumomab)、納納土單抗(narnatumab)、那莫單抗(naptumomab)、萊西單抗(necitumumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、尼沃單抗(nivolumab)、諾伐木單抗(nofetumomabn)、歐比托珠單抗(obinutuzumab)、奧卡拉珠單抗(ocaratuzumab)、奧伐木單抗(ofatumumab)、奧拉單抗(olaratumab)、奧拉帕尼(olaparib)、奧那組單抗(onartuzumab)、奧普珠單抗(oportuzumab)、奧戈伏單抗(oregovomab)、帕尼單抗(panitumumab)、帕薩珠單抗(parsatuzumab)、帕特里土單抗(patritumab)、派立珠單抗(pembrolizumab)、潘妥莫單抗(pemtumomab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、皮立珠單抗(pidilizumab)、平妥單抗(pintumomab)、普托木單抗(pritumumab)、拉克莫單抗(racotumomab)、拉德瑞單抗(radretumab)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、里樂木單抗(rilotumumab)、利妥昔單抗(rituximab)、羅妥木單抗(robatumumab)、沙妥莫單抗(satumomab)、司美替尼(selumetinib)、西羅珠單抗(sibrotuzumab)、思圖昔單抗(siltuximab)、辛圖珠單抗(simtuzumab)、索利托單抗(solitomab)、他卡珠單抗(tacatuzumab)、他普莫單抗(taplitumomab)、泰納莫單抗(tenatumomab)、泰普洛單抗(teprotumumab)、替加珠單抗(tigatuzumab)、托西莫單抗(tositumomab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、土庫珠單抗(tucotuzumab)、尤必昔單抗(ublituximab)、維托珠單抗(veltuzumab)、沃爾希珠單抗(vorsetuzumab)、伏妥莫單抗(votumumab)、紮魯姆單抗(zalutumumab)、CC49、3F8、MEDI0680、MDX-1105及其組合。
其他實施例包含使用核准用於癌症療法的抗體，包括(但不限於)利妥昔單抗(rituximab)、吉妥單抗奧唑甘辛(gemtuzumab ozogamcin)、阿侖單抗(alemtuzumab)、異貝莫單抗泰澤坦(ibritumomab tiuxetan)、托西莫單抗(tositumomab)、貝伐單抗(bevacizumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、帕替塗單抗(patitumumab)、奧伐木單抗(ofatumumab)、伊匹單抗(ipilimumab)及貝倫妥單抗維多汀(brentuximab vedotin)。熟習此項技術者將能夠容易鑑別與本文中之教示內容相容的其他抗癌劑。
E. 放射療法
本發明亦提供抗體或ADC與放射療法(亦即，誘導腫瘤細胞內之DNA發生局部損傷的任何機制，諸如γ-照射、X射線、UV照射、微波、電子發射及其類似物)之組合。亦涵蓋使用放射性同位素定向遞送至腫瘤細胞的組合療法，且所揭示之抗體或ADC可聯合靶向抗癌劑或其他靶向方式使用。典型地，在約1至約2週之時間段期間內脈衝投與放射療法。放射療法可投與患有頭頸癌之個體約6至7週。視情況，放射療法可以單一劑量投與或以多次劑量依序投與。
VIII. 適應症
本發明提供本發明之抗體及ADC用於診斷、治療診斷、治療及/或預防各種病症(包括贅生性、發炎性、血管生成及免疫病症及由病原體引起的病症)的用途。在某些實施例中，所治療之疾病包含贅生性病狀，包含實體腫瘤。在其他實施例中，所治療之疾病包含血液科惡性疾病。在某些實施例中，本發明之抗體或ADC用於治療表現EMR2決定子的腫瘤或致瘤細胞。較佳地，所治療之「個體」或「患者」為人類，然而如本文所用，術語明確地包含任何哺乳動物物種。
應瞭解，本發明之化合物及組合物可用於治療個體之各種階段之疾病及其治療週期中之不同點。因此，在某些實施例中，本發明之抗體及ADC將用作一線療法且投與先前尚未針對癌性病狀加以治療的個體。在其他實施例中，本發明的抗體及ADC將用於治療第二線及第三線患者(亦即，先前已針對相同病狀分別治療一或兩次的彼等個體)。又其它實施例將包含治療第四線或高於第四線的患者(例如胃癌或結腸直腸癌患者)，該等患者已針對相同或相關病狀經所揭示之EMR2 ADC或不同治療劑治療三次或超過三次。在其他實施例中，本發明的化合物及組合物將用於治療先前已經(本發明的抗體或ADC或其他抗癌劑)治療且已復發或經確定為對先前治療具難治性的個體。在所選實施例中，本發明之化合物及組合物可用於治療患有復發性腫瘤的個體。
在某些實施例中，本發明之化合物及組合物將作為單一藥劑或以組合形式用作一線或誘導療法且投與先前尚未針對癌症病狀加以治療的個體。在其他實施例中，本發明的化合物及組合物將在鞏固或維持治療期間作為單一藥劑或以組合形式使用。在其他實施例中，本發明的化合物及組合物將用於治療先前已經(本發明的抗體或ADC或其他抗癌劑)治療且已復發或經確定為對先前治療具難治性的個體。在所選實施例中，本發明之化合物及組合物可用於治療患有復發性腫瘤的個體。在其他實施例中，本發明的化合物及組合物將用作調理療法的一部分，作好接受自體或同種異體造血幹細胞的準備，其中以骨髓、臍帶血液或移動之周邊血液作為幹細胞源。
就血液科惡性疾病而言，應進一步瞭解，本發明的化合物及方法可特別有效地治療多種白血病，包括急性骨髓性白血病(AML，基於FAB命名法(M0-M7)、WHO分類、分子標記物/突變、核型、形態及其他特徵識 別其各種亞型)、譜系急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、毛細胞白血病(HCL)、慢性骨髓單核細胞性白血病(CMML)、幼年型骨髓單核細胞性白血病(JMML)及大顆粒淋巴細胞性白血病(LGL)以及B細胞淋巴瘤，包括霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)(典型霍奇金氏淋巴瘤及結節淋巴細胞主導性霍奇金氏淋巴瘤)、非霍奇金氏淋巴瘤，包括瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、低級/NHL濾泡性細胞淋巴瘤(FCC)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、黏膜相關淋巴組織(MALT)淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)及伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma，BL)；中級/濾泡性NHL、中級瀰漫性NHL、高級免疫母細胞NHL、高級淋巴母細胞性NHL、高級小非裂解細胞NHL、大腫塊疾病NHL、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's Macroglobulinemia)、淋巴漿細胞樣淋巴瘤(LPL)、AIDS相關淋巴瘤、單核細胞性B細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞淋巴腺病變；瀰漫性小裂解細胞、大細胞免疫母細胞淋巴母細胞瘤；小非裂解伯基特氏及非伯基特氏、濾泡性、主要為大細胞；濾泡性、主要為小裂解細胞；及濾泡性、混合型小裂解及大細胞淋巴瘤。參見Gaidono等人，「Lymphomas」,IN CANCER：PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY，第2卷：2131-2145(DeVita等人編，5.sup.th版，1997)。對於熟習此項技術者顯而易見的是，此等淋巴瘤由於分類系統變化而往往具有不同名稱，且患有根據不同名稱分類之淋巴瘤的患者亦可受益於本發明的組合治療方案。
在其他較佳實施例中，增生性病症將包含實體腫瘤，包括(但不限於)腎上腺、肝臟、腎臟、膀胱、乳房、胃、卵巢、子宮頸、子宮、食道、結 腸直腸、前列腺、胰臟、肺(小細胞與非小細胞)、甲狀腺的癌瘤、肉瘤、神經膠母細胞瘤，及各種頭頸腫瘤。在某些所選態樣中，且如下文實例中所示，所揭示之ADC尤其有效地治療肺癌，包括肺腺癌、小肺癌(SCLC)及非小細胞肺癌(NSCLC)(例如鱗狀細胞非小細胞肺癌或鱗狀細胞小細胞肺癌)。在一個實施例中，肺癌具有難治性、復發或耐受鉑基藥劑(例如卡鉑、順鉑、奧沙利鉑)及/或紫杉烷(例如多西他賽、太平洋紫杉醇、拉洛他賽(larotaxel)或卡巴利他索(cabazitaxel))。在另一個實施例中，待治療之個體罹患大細胞神經內分泌癌瘤(LCNEC)。
如所指示，所揭示之抗體及ADC尤其有效地治療肺癌，包括以下亞型：小細胞肺癌及非小細胞肺癌(例如鱗狀細胞非小細胞肺癌或鱗狀細胞小細胞肺癌)。在其他實施例中，所揭示之組合物可用於治療肺腺癌。在所選實施例中，抗體及ADC可投與展現有限分期疾病或廣泛分期疾病的患者。在其他實施例中，所揭示之結合抗體將投與難治性患者(亦即其疾病在初始治療期間或在完成初始治療過程之後不久復發的患者)；敏感患者(亦即在初步治療之後長於2-3個月復發的患者)；或對鉑基藥劑(例如卡鉑、順鉑、奧沙利鉑)及/或紫杉烷(例如多西他賽、太平洋紫杉醇、拉洛他賽或卡巴利他索)展現耐藥性的患者。在某些較佳實施例中，本發明之EMR2 ADC可投與一線患者。在其他實施例中，本發明之EMR2 ADC可投與第二線患者。在其他實施例中，本發明之EMR2 ADC可投與第三線患者。
在尤其較佳的實施例中，所揭示之ADC可用於治療小細胞肺癌。就該等實施例而言，所結合之調節劑可投與展現有限分期疾病的患者。在其他實施例中，所揭示之ADC將投與展現廣泛分期疾病的患者。在其他較 佳實施例中，所揭示之ADC將投與難治性患者(亦即在初始治療過程中復發或在完成初始治療過程之後不久復發的彼等患者)或復發性小細胞肺癌患者。又其它實施例包含將所揭示之ADC投與敏感性患者(亦即初步治療之後長於2-3個月復發的彼等患者。在各種情況下，應瞭解相容ADC可與其他抗癌劑組合使用，此視所選給藥方案及臨床診斷而定。
更一般而言，根據本發明治療的贅生性病狀可為良性或惡性的；實體腫瘤或血液科惡性疾病；且可選自包括(但不限於)以下之群：腎上腺腫瘤、AIDS相關癌症、肺泡軟部分肉瘤、星形膠質細胞腫瘤、自主神經節腫瘤、膀胱癌(鱗狀細胞癌及移行細胞癌)、囊胚病症、骨癌(釉質瘤、動脈瘤骨囊腫、骨軟骨瘤、骨肉瘤)、腦及脊髓癌症、轉移性腦瘤、乳癌、頸動脈體腫瘤、子宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色細胞腎細胞癌、透明細胞癌瘤、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚良性纖維性組織細胞瘤、促結締組織增生小圓形細胞腫瘤、室管膜瘤、上皮病症、尤文氏腫瘤(Ewing's tumors)、骨外黏液樣軟骨肉瘤、骨纖維生成不良、骨纖維性發育不良、膽囊及膽管癌症、胃癌、胃腸、妊娠期滋養層疾病、生殖細胞腫瘤、腺病症、頭頸癌、下丘腦、腸癌症、胰島細胞瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's Sarcoma)、腎臟癌症(腎母細胞瘤、乳頭狀腎細胞癌)、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤樣腫瘤、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤樣腫瘤、肝癌(肝母細胞瘤、肝細胞癌)、淋巴瘤、淋巴瘤(霍奇金氏及非霍奇金氏淋巴瘤)、肺癌(小細胞癌瘤、腺癌、鱗狀細胞癌、大細胞癌等)、巨噬細胞病症、神經管胚細胞瘤、黑色素瘤、腦膜瘤、多發性內分泌瘤、多發性骨髓瘤(包括漿細胞瘤、局域化骨髓瘤及髓外骨髓瘤)、骨髓發育不良症候群、骨髓增生性疾病(包括骨髓纖維化、真性紅血球增多症及原發血小板減少症)、神經母細胞瘤、 神經母細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰臟癌、乳頭狀甲狀腺癌瘤、副甲狀腺腫瘤、兒科癌症、周邊神經鞘腫瘤、嗜鉻細胞瘤、腦垂體腫瘤、前列腺癌、後葡萄膜黑色素瘤、罕見血液學病症、腎轉移性癌症、橫紋肌樣腫瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌症、胃癌、基質病症、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移性癌症及子宮癌症(子宮頸癌瘤、子宮內膜癌瘤及平滑肌瘤)。
IX. 製品
本發明包括包含一或多個容器或貯器之醫藥包及套組，其中容器可包含一或多次劑量的本發明抗體或ADC。該等套組或藥包可具有診斷或治療性質。在某些實施例中，藥包或套組含有單位劑量，意謂預定量之組合物，該組合物包含例如本發明之抗體或ADC、含有或不含有一或多種其他藥劑及視情況存在之一或多種抗癌劑。在某些其他實施例中，藥包或套組含有可偵測量之抗EMR2抗體或ADC、含有或不含有相關報導子分子及視情況存在之一或多種其他藥劑用於偵測、量化及/或目測癌細胞。
在任何情況下，本發明之套組通常將在適合容器或貯器中包含本發明之抗體或ADC、醫藥學上可接受之調配物及視情況存在於同一或不同容器中之一或多種抗癌劑。套組亦可含有其他醫藥學上可接受之調配物或裝置，用於診斷或組合療法。診斷裝置或儀器之實例包括可用於偵測、監測、量化或分析與增生性病症相關之細胞或標記物的彼等物(關於該等標記物之完整清單，參見上文)。在一些實施例中，裝置可用於活體內或活體外偵測、監測及/或量化循環腫瘤細胞(參見例如WO 2012/0128801)。在其他實施例中，循環腫瘤細胞可包含致瘤細胞。本發明所涵蓋之套組亦可含有將本發明之抗體或ADC與抗癌劑或診斷劑組合的適當試劑(例如參 見U.S.P.N.7,422,739)。
當套組中之組分係以一或多種液體溶液提供時，該液體溶液可為非水溶液，但典型地，水溶液較佳，無菌水溶液尤其較佳。套組中之調配物亦可以乾粉或凍乾形式提供，其可經添加適當液體而復原。復原所用之液體可包含於獨立容器中。該等液體可包含醫藥學上可接受之無菌緩衝液或其他稀釋劑，諸如抑菌注射用水、磷酸鹽緩衝生理鹽水、林格氏溶液或右旋糖溶液。在套組包含本發明之抗體或ADC與其他療法或藥劑之組合的情況下，溶液可以莫耳當量組合或以其中一種組分超過其他之方式加以預混合。或者，本發明之抗體或ADC及任何視情況存在之抗癌劑或其他藥劑(例如類固醇)可在投與患者之前分開維持於不同容器中。
在某些較佳實施例中，包含本發明組合物的前述套組將包含指明套組內容物可用於治療、預防及/或診斷癌症的標籤、標記物、藥品說明書、條碼及/或讀本。在其他較佳實施例中，套組可包含指明套組內容物可根據某種劑量或給藥方案投與以治療罹患癌症之個體的標籤、標記物、藥品說明書、條碼及/或讀本。在一個尤其較佳的態樣中，標籤、標記物、藥品說明書、條碼及/或讀本指明套組內容物可用於治療、預防及/或診斷血液科惡性疾病(例如AML)或提供治療血液科惡性疾病的劑量或給藥方案。在其他尤其較佳的態樣中，標籤、標記物、藥品說明書、條碼及/或讀本指明套組內容物可用於治療、預防及/或診斷肺癌(例如腺癌)或提供治療肺癌的給藥方案。
適合的容器或貯器包括例如瓶子、小瓶、注射器、輸液袋(靜脈內輸液袋)等。容器可由多種材料形成，諸如玻璃或醫藥學相容塑料。在某些實施例中，貯器可包含無菌接取口。舉例而言，容器可為具有可藉由皮下 注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶。
在一些實施例中，套組可以含有藉以將抗體及視情況存在之任何組分投與患者的構件，例如一或多個針或針筒(預裝填或空的)、滴眼管、移液管或其他此種類似裝置，由此可將調配物注射或引入個體中或施加於身體之病變區域。本發明之套組亦典型地包括以緊密圍束方式包含小瓶或其類似物及其他組件的構件以便市售，諸如所要小瓶及其他裝置安置且保留於其中的吹塑成型塑膠容器。
X. 雜項
除非本文中另外定義，否則結合本發明使用之科學與技術術語應具有一般技術者通常瞭解之含義。此外，除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數術語且複數術語應包括單數術語。另外，本說明書及隨附申請專利範圍中提供的範圍包括兩個端點與介於端點之間的所有點。因此，2.0至3.0之範圍包括2.0、3.0及介於2.0與3.0之間的所有點。
一般而言，本文所述之細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳及化學技術為此項技術中熟知及常用的技術。本文中結合該等技術使用的命名法亦常用於此項技術中。除非另外指明，否則本發明之方法及技術通常根據此項技術中熟知之習知方法且如通篇本發明中所引用之各種參考文獻所述進行。
XI. 參考文獻
本文中所引用之所有專利、專利申請案及公開案及以電子方式可獲得之材料的完整揭示內容(包括例如提交於例如GenBank及RefSeq中的核苷酸序列，及提交於例如SwissProt、PIR、PRF、PBD中之胺基酸序列，及GenBank及RefSeq之編碼區註釋中的翻譯)以引用的方式併入本文中， 不論片語「以引用的方式併入」的使用是否與特定參考文獻相關。前述詳細說明及下述實例僅為了清楚理解而示出。不應理解其存在不必要的限制。本發明不限於所示及所述的確切細節。由申請專利範圍限定的本發明包括對於熟習此項技術者而言顯而易見的變化形式。本文所用之任何章節標題僅出於組織目的且不應理解為限制所述標的物。
實例
上文一般性描述之本發明參考以下實例將更容易瞭解，該等實例係為了說明而提供且不希望限制本發明。該等實例不希望表示下述實驗為所進行之所有實驗或唯一實驗。除非另外指明，否則份數為重量份，分子量為重量平均分子量，溫度以攝氏度計，且壓力為大氣壓或接近大氣壓。
序列表概述
表3提供本文中所包括的胺基酸及核酸序列之概述。
腫瘤細胞株概述
PDX腫瘤細胞類型係由縮寫指示，繼縮寫之後為表示特定腫瘤細胞株的編號。所測試樣品的繼代次數係由樣品標識隨附的p0-p#指示，其中p0指示直接自患者腫瘤獲得的未繼代樣品且p#指示測試之前，腫瘤已經由小鼠繼代的次數。如本文所用，腫瘤類型及亞型之縮寫顯示於如下表4中：表4
實例1 使用全轉錄組測序法鑑別EMR2表現
為了表徵實體腫瘤(當其存在於癌症患者中時)之細胞非均質性及鑑別臨床上相關的治療標靶時，開發大型PDX腫瘤庫且使用此項技術中認知的技術維持。包含許多離散腫瘤細胞株的PDX腫瘤庫經由最初獲自罹患多種實體腫瘤惡性疾病之癌症患者之腫瘤細胞的多次繼代而在免疫功能不全小鼠中繁殖。較低繼代的PDX腫瘤代表其原生環境中的腫瘤，從而對驅動腫瘤生長的潛在機制及針對當前療法之耐藥性提供臨床上相關的深入瞭解。
腫瘤細胞大體上可分成兩種類型的細胞亞群：非致瘤細胞(NTG)及腫瘤起始細胞(TIC)。TIC當植入免疫功能不全小鼠中時具有形成腫瘤的能力。癌症幹細胞(CSC)為能夠無限地自複製、同時維持多譜系分化之能力的TIC亞群。NTG雖然有時能夠在活體內生長，但植入時不形成再現初始腫瘤之非均質性的腫瘤。
為了執行全轉錄組分析，PDX腫瘤在其達到800至2,000mm3之後或對於AML而言，在骨髓中建立白血病之後自小鼠中切除(人類起源之骨髓細胞<5%)。經切除之PDX腫瘤於單一細胞懸浮液中使用此項技術中公認的酶消化技術(參見例如U.S.P.N.2007/0292414)解離。解離之塊體腫瘤細胞與偵測死細胞的4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、鑑別小鼠細胞的抗小鼠CD45及H-2Kd抗體以及鑑別人類細胞的抗人類EPCAM抗體一起培育。另外，腫瘤細胞與鑑別CD46高CD324+ CSC或CD46低/-CD324- NTG細胞的螢光結合抗人類CD46及/或CD324抗體一起培育且接著使用FACSAria細 胞分選儀(BD Biosciences)分選(參見U.S.P.Ns 2013/0260385、2013/0061340及2013/0061342)。對於AML而言，典型地利用PDX細胞株收集股骨和脛骨以萃取骨髓。單一細胞懸浮液用低張力銨-氯化物-鉀(ACK)溶液處理以耗乏紅血球且用針對CD45、CD33、CD34及CD38的抗人類抗體染色以偵測人類細胞。在一些情況下，使用直接獲自患者的周邊血液或骨髓樣品而不預先在小鼠中繁殖。
如下自腫瘤細胞中萃取RNA：將細胞溶解於補充有1% 2-巰基乙醇的RLTplus RNA溶胞緩衝液(Qiagen)中，在-80℃冷凍溶胞物，接著將溶胞物解凍以便使用RNeasy分離套組(Qiagen)進行RNA萃取。使用Nanodrop分光光度計(Thermo Scientific)及/或Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)量化RNA。正常組織RNA購自各種來源(Life Technology,Agilent,ScienCell,BioChain，及Clontech)。所得總RNA製劑藉由基因測序及基因表現分析加以評估。更特定言之，使用Illumina HiSeq 2000或2500下一代測序系統(Illumina,Inc.)分析某些急性骨髓性白血病(AML)及肺腫瘤樣品。
就此而言，使用cDNA進行Illumina全轉錄組分析，該cDNA係使用5ng自NTG或CSC腫瘤亞群萃取的總RNA產生，該腫瘤亞群係如上文在此實例1中所述分離。使用TruSeq RNA樣品製備套組v2(Illumina,Inc.)產生文庫。所得cDNA文庫加以片段化且帶條形碼。得自Illumina平台的測序資料名義上以片段表現值表示，該表現值使用與外顯子基因區域對應的公制FPKM(每百萬每千鹼基之片段數)，從而能使基本基因表現分析實現標準化及以FPKM轉錄物計數。如圖2中所示，AML及LU CSC腫瘤細胞亞群中的EMR2 mRNA表現(黑色條)通常高於正常細胞(灰色條)與NTG細 胞群體(白色條)中的表現。
鑑別AML與肺腫瘤CSC群體中的升高的EMR2 mRNA表現表明EMR2值得作為潛在的診斷及免疫治療靶標進一步評價。此外，EMR2在CSC中的表現相較於NTG在AML及LU PDX腫瘤中之表現增加表明EMR2為此等腫瘤類型之致瘤細胞的良好標記物。
實例2 使用QRT-PCR量測腫瘤中之EMR2 mRNA的表現
如圖1D及1E中所描繪及如上文所論述，人類EMR2基因潛在地編碼多種轉錄物，包括21個外顯子長的6.5kbp典型全長同功異型物(Genbank寄存號：NM_013447)、6.5kbp同功異型物及各種長度的若干較短同功異型物，其中一些先前已描述(Genbank寄存號：NM_001271052、NM_152916、NM_152916_17、NM_152918)；亦參見圖1D)，而其他轉錄物首次描述於本文中(參見圖1E)。EMR2蛋白質之長同功異型物(「hEMR2」)為328個胺基酸的七跨膜G蛋白偶聯受體蛋白質(NP_038475)。大部分所述同功異型物係藉由跳讀一或多個外顯子而產生，從而產生缺失一至三個EGF樣域的較短ECD或導致莖區縮短。所有同功異型物中僅有兩種具有完整的7TM域及GPS序列，表明膜結合及轉譯後自裂解仍然是完整的。外顯子16單獨或與外顯子17組合缺失的兩種同功異型物導致7TM內產生缺失且潛在地導致GPS內產生缺失且不明確此等同功異型物是否及如何影響EMR2蛋白質同功異型物的局域化及遷移。亦應注意，外顯子的各種所述省略可組合存在，從而進一步擴增潛在數目個同功異型物。由於所有所述同功異型物直接影響EMR2之ECD，因此此等同功異型物中任一者的表現可影響吾等在此所述抗體所靶向的某些抗原決定基。可 設想產生結合至所有潛在同功異型物(例如藉由靶向EGF樣域1及2)的Ab或產生更限制性地結合一種同功異型物或同功異型物亞群(例如藉由靶向EGF樣域3-5或莖區)的Ab。由於一些較短同功異型物主要發現於正常細胞中(參見圖1E)，因此此開啟了特異性地靶向AML及其他腫瘤細胞而與正常細胞的結合極小或不結合的機會。
為了證實腫瘤細胞中的EMR2 RNA表現，使用Fluidigm BioMarkTM HD系統，根據工業標準協定對各種PDX細胞株或初始患者樣品執行qRT-PCR。如實例1中所述，自塊體PDX腫瘤細胞或所分選之CSC及NTG亞群中萃取RNA。使用高容量cDNA封存套組(Life Technologies)，根據製造商說明書將1.0ng RNA轉變成cDNA。接著使用cDNA材料(使用EMR2探針特異性Taqman分析預擴增)進行隨後的qRT-PCR實驗。
對正常組織中的EMR2表現與AML、LU-Ad及LU-SCC PDX腫瘤細胞株中的表現進行比較(圖3；各點表示各個別組織或PDX細胞株之平均相對表現，其中小的水平線表示幾何平均值)。「正常」表示如下各種正常組織樣品：膀胱、周邊血液單核細胞(PBMC)、腦、乳房、前列腺、胸腺、腎上腺、結腸、背側根神經節、內皮細胞(動脈、靜脈、血管平滑肌)、食道、心臟、腎臟、肝臟、肺、胰臟、骨骼肌、皮膚(完整及分離的纖維母細胞及角質細胞)、小腸、脾、胃、氣管及睪丸。表現最高的兩種正常組織為脾及PBMC。圖3顯示相較於正常組織，AML以及LU-Ad及LU-SCC亞群中的平均EMR2表現更高，但LU腫瘤試樣的幾何平均值總體較低。此資料支持EMR2在AML中及在所選LU PDX中的表現升高(相較於正常組織)的較早發現。
實例3 使用微陣列測定腫瘤中之EMR2 mRNA表現
執行微陣列實驗以測定EMR2在各種腫瘤PDX細胞株中的表現量且如下分析資料。自AML、LYM、MM LU-Ad、LU-SCC及BL PDX腫瘤中萃取1-2μg全腫瘤總RNA。使用Agilent SurePrint GE Human 8x60 v2微陣列平台分析樣品，該平台含有50,599個生物學探針，其針對人類基因組中之27,958個基因及7,419個lncRNA所設計。使用標準行業實務來標準化及轉換強度值以量化各樣品中之基因表現。各樣品中之EMR2表現之標準化強度繪製於圖4中且藉由水平條指示各腫瘤類型中所得之幾何平均值。正常組織包括乳房、結腸、心臟、腎臟、肝臟、肺、卵巢、胰臟、PBMC、皮膚、脾及胃。
對圖4的更緊密審視顯示AML、LYM、MM及BL腫瘤細胞株中的EMR2表現及LU-Ad及LU-SCC之至少一些腫瘤樣品中的EMR2表現相較於正常組織而言上調。EMR2表現在前述腫瘤類型中升高的觀測結果證實前述實例之結果。特定言之，所有三種平台上所分析的AML腫瘤樣品顯示EMR2表現實質上升高。更一般而言，此等資料表明EMR2表現於多種腫瘤亞型中，包括AML、LYM、MM、LU-Ad、LU-SCC及BL，且可為開發針對此等適應症之基於抗體之治療劑的良好靶標。
實例4 使用癌症基因組圖譜所測之腫瘤中的EMR2表現
使用原發腫瘤及正常樣品之公開可獲得的大型資料集(稱為癌症基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA))證實hEMR2 mRNA在各種腫瘤中的過度表現。IlluminaHiSeq_RNASeqV2平台的hEMR2表現資料自TCGA資料入口(https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaDownload.jsp)下 載且解析以聚集得自各基因之個別外顯子的讀數，從而產生每百萬映射讀數每千鹼基外顯子之單一值讀數(RPKM)。圖5顯示AML、瀰漫性大B細胞(DLBC)及LU-Ad初始患者樣品中的EMR2表現相較於正常組織升高。此等資料進一步證實EMR2 mRNA之含量升高可發現於各種腫瘤類型中，表明抗EMR2抗體及ADC可為此等腫瘤之適用療法。
圖6顯示LU-Ad TCGA腫瘤亞群之卡普蘭邁耶存活率曲線(Kaplan Meier survival curves)，其中患者存活率資料是可獲得的。根據LU-Ad腫瘤中之EMR2 mRNA高表現(亦即表現高於臨限指數值)或EMR2 mRNA之低表現(亦即表現低於臨限指數值)來將患者分層。臨限指數值係以RPKM值之75%四分位數計算，其經計算為2.74。
圖下方所列之「處於風險中之數目」顯示各患者首次診斷日(第0天)之後的每2000天，資料集中剩餘之存活患者的數目。根據格漢-布雷斯洛-威爾科克森檢驗(Gehan-Breslow-Wilcoxon test)，根據p=0.0088之對數秩(Mantel-Cox)檢驗，兩個存活率曲線存在顯著差異(p=0.0066)。此等資料顯示患有展現EMR2高表現之LU-Ad腫瘤的患者的存活時間比患有展現EMR2低表現之LU-Ad腫瘤的患者短得多。此表明抗EMR2療法適用於治療LU-Ad且EMR2表現適用作預後生物標記，根據此生物標記可作出治療決策。
實例5 重組EMR2蛋白質的選殖及表現以及過度表現細胞表面EMR2蛋白質之細胞株的工程改造 全長人類EMR2(hEMR2)DNA構築體
為了產生過度表現全長hERM2蛋白質的細胞株，如下構建含有編碼 成熟hERM2蛋白質之開放閱讀框架的慢病毒載體。首先，利用標準分子選殖技術(System Biosciences)引入編碼IgK信號肽的核苷酸序列，隨後在pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP之多個選殖位點上游引入天冬胺酸/離胺酸抗原決定基，從而產生載體pLMEGPA。此雙啟動子構築體係使用CMV啟動子驅動天冬胺酸/離胺酸標記之細胞表面蛋白質的表現，此驅動獨立於下游EF1啟動子驅動copGFP T2A Puro報導子及可選標記的表現。pLMEGPA中的T2A序列促進核糖體跳過肽鍵縮合，從而引起兩種非依賴性蛋白質表現：T2A肽上游所編碼之報導子copGFP的高量表現，在T2A肽下游所編碼之Puro可選標記蛋白質的共表現，從而允許在嘌呤黴素存在下進行選擇。
使用NCBI寄存號NM_013447作為參考，自GeneArt(ThermoFisher Scientific)訂購編碼成熟hEMR2蛋白質的合成DNA片段(殘基Q24-N823)。合成基因根據在哺乳動物細胞株中的表現進行密碼子最佳化，且側接限制核酸內切酶位點以能夠同框次選殖入IgK信號肽-天冬胺酸/離胺酸抗原決定基標記下游的pLMEGPA中。由此產生pLMEGPA-hEMR2-NFlag慢病毒載體，其編碼其中天冬胺酸/離胺酸標記附接於成熟hEMR2蛋白質之N末端的融合蛋白。
hEMR2胞外域融合蛋白
為了產生含有hERM2蛋白質胞外域之一部分的融合蛋白，自GeneArt訂購編碼自成熟多肽之起點至GPS域之起點(例如Q24-Q478)之hERM2蛋白質N末端胞外區的合成DNA片段，或編碼蛋白質之ECD莖區(例如D291-Q478)的較小區域。此等DNA分子之序列係根據在哺乳動物細胞中的表現經密碼子最佳化。此等DNA片段均在含有hEMR2 ECD之表現 構築體之融合或經標記蛋白質或其片段的所有隨後工程改造中使用。特定而言，產生構築體，其中編碼hERM2多肽(殘基Q24-Q478)的DNA係使用標準分子技術與編碼9x-組胺酸標記(hERM2-ECD-His)或人類IgG2 Fc蛋白質(hERM2-ECD-Fc)的DNA同框融合。類似地，產生構築體，其中編碼hERM2多肽(殘基D291-Q478)的DNA係使用標準分子技術與編碼9x-組胺酸標記(hERM2-ECDstalk-His)或人類IgG2 Fc蛋白質(hERM2-ECDstalk-Fc)的DNA同框融合。
為了產生可用於針對hEMR2蛋白質之ECD產生免疫反應性抗體的免疫原，使用標準分子技術將上述嵌合融合基因同框次選殖入免疫球蛋白κ(IgK)信號肽序列下游的CMV驅動表現載體中。CMV驅動型表現載體允許高量短暫表現於HEK293T及/或CHO-S細胞中。使用聚乙烯亞胺聚合物作為轉染試劑，用選自以下之一的表現構築體轉染HEK293T細胞懸浮或黏附培養物或懸浮CHO-S細胞：hEMR2-ECD-His、hEMR2-ECD-Fc、hERM2-ECD莖-His，或hERM2-ECD莖-Fc。轉染後的三至五天，使用適用於標記的鎳-EDTA(Qiagen)或MabSelect SuReTM蛋白質A(GE Healthcare Life Sciences)管柱，自澄清的細胞上清液中純化hEMR2-ECD-His、hEMR2-ECD-Fc、hERM2-ECD莖-His或hERM2-ECD莖-Fc蛋白質。
全長食蟹獼猴EMR2(cEMR2)DNA構築體
為了產生本發明中關於食蟹獼猴(Macaca fascicularis)EMR2蛋白質(cEMR2)所必需的所有分子及細胞材料，首先如下推測cEMR2開放閱讀框架序列：對編碼hEMR2蛋白質之DNA序列進行BLAST(相對於NCBI之食蟹獼猴全基因組鳥槍鄰接序列資料庫)，觀測人類基因與食蟹獼猴基因 之間具保守性的外顯子/內含子邊界，及對編碼cEMR2之推定食蟹獼猴開放閱讀框架進行組裝。結果分析指明hEMR2與cEMR2蛋白質89.3%一致。
使用如上衍生的核苷酸序列作為參考，自GeneArt訂購編碼成熟cEMR2蛋白質(殘基Q24-N816)的合成DNA片段。合成基因根據在哺乳動物細胞株中的表現進行密碼子最佳化，且側接限制核酸內切酶位點以能夠同框次選殖入IgK信號肽-天冬胺酸/離胺酸抗原決定基標記下游的pLMEGPA中。由此產生pLMEGPA-cEMR2-NFlag慢病毒載體，其編碼其中天冬胺酸/離胺酸標記附接於成熟cEMR2蛋白質之N末端的融合蛋白。
食蟹獼猴EMR2(cEMR2)胞外域融合蛋白.
為了產生本發明中關於cEMR2蛋白質之胞外域所需要的所有分子及細胞材料，上述pLMEGPA載體內所含的cEMR2開放閱讀框架用作PCR反應的模板，以實現編碼自成熟多肽起點至GPS域起點(例如D25-Q471)之cERM2蛋白質N末端胞外區之DNA片段或編碼蛋白質之ECD莖區(例如D288-Q471)的擴增。編碼所要殘基之DNA側接適合限制位點以能夠在IgK信號肽序列下游且在9x-組胺酸標記或人類IgG2 Fc cDNA上游同框次選殖入CMV驅動型表現載體中。如上文針對類似人類融合蛋白所述產生重組cEMR2-ECD-His或cEMR2-ECD-Fc融合蛋白。
人類及食蟹獼猴CD97(hCD97及cCD97構築體).
基本上如上文剛剛針對篩選所揭示之抗體所述，產生人類及食蟹獼猴CD97構築體。更特定言之，使用NCBI寄存號NM_078481作為參考來設計人類CD97構築體。編碼全長成熟人類CD97蛋白質(殘基Q21-I845)的合成DNA片段係藉由GeneArt製造且以類似於上文針對hEMR2所述的方式次選殖入IgK信號肽-天冬胺酸/離胺酸抗原決定基標記下游的pLMEGPA 載體中，從而產生pLMEGPA-hCD97-NFlag。為了產生編碼人類CD97-ECD-His及hCD97-ECD-Fc融合蛋白的構築體，使用PCR擴增編碼殘基Q21-R552、側接適當限制位點的DNA片段，以便同框次選殖入IgK信號肽序列下游及9x-組胺酸標記或人類IgG2 Fc cDNA上游的CMV驅動型表現載體中。使用兩種所得DNA構築體CMV-hCD97-ECD-His及CMV-hCD97-ECD-Fc轉染HEK293T及/或CHO-S細胞，產生hCD97-ECD-His或hCD97-ECD融合蛋白，如上文針對類似hEMR2融合蛋白所述。
使用NCBI寄存號NM_005588243作為參考來設計編碼食蟹獼猴CD97 ECD(殘基Q23-R554)的合成CD97 DNA片段，藉由GeneArt製造，且直接同框次選殖入IgK信號肽序列下游及9x-組胺酸標記上游的CMV驅動型表現載體內。重組cCD97-His蛋白質如上文針對類似hCD97融合蛋白所述製得。
細胞株工程改造
使用熟習此項技術者熟知的標準慢病毒轉導技術，分別使用三種慢病毒載體pLMEGPA-hEMR2-NFlag、pLMEGPA-cEMR2-NFlag或pLMEGPA-hCD97-NFlag產生穩定的過度表現hEMR2、cEMR2或hCD97蛋白質之基於HEK293T的細胞株。使用嘌呤黴素選擇經轉導之細胞，隨後對高表現HEK293T次純系(例如對GFP及FLAG抗原決定基呈強陽性的細胞)進行螢光活化細胞分選(FACS)。
實例6 產生抗EMR2抗體
為了產生抗EMR2鼠類抗體，用10μg hEMR2-His蛋白質、10ug cEMR2-His莖蛋白質或過度表現hEMR2或cEMR2的293T細胞連同適當佐 劑一起接種一個Balb/c小鼠、一個FVB及一個CD-1。初始接種之後，將10μg hEMR2-His蛋白質連同適當佐劑一起注射至小鼠中，每週兩次歷時4週，其中最後接種係使用10μg hEMR2-His蛋白質、10ug cEMR2-His莖蛋白質或過度表現hEMR2或cEMR2的293T細胞連同適當佐劑一起執行。
將小鼠處死且解剖引流淋巴結(膕、腹股溝及內側髂)且用作抗體產生細胞之來源。使用BTX Hybrimmune型系統(BTX Harvard Apparatus)，藉由細胞電融合法將單一細胞懸浮液中之B細胞(430x106個細胞)與非分泌型Sp2/0-Ag14骨髓瘤細胞(ATCC # CRL-1581)以1：1比率融合。將細胞再懸浮於由補充有偶氮絲胺酸、15%胎兒純系I血清、10% BM條件培養基、1mM非必需胺基酸、1mM HEPES、100 IU青黴素-鏈黴素及50μM 2-巰基乙醇之DMEM培養基組成的融合瘤選擇培養基中，且在四個T225燒瓶中、在每個燒瓶100mL選擇培養基中培養。燒瓶在含有5% CO2及95%空氣的37℃增濕保溫箱中置放六天。
融合之後六天，自燒瓶中收集融合瘤文庫細胞且文庫於液氮中儲存。冷凍小瓶於T75燒瓶中解凍且次日，(使用FACSAria I細胞分選儀)將融合瘤細胞於90μL補充融合瘤選擇培養基(如上文所述)中以每孔一個細胞塗鋪於15個Falcon 384孔盤中。
將融合瘤培養10天且使用如下進行之流式細胞術篩選上清液中對hEMR2具有特異性之抗體。每孔1x105個經hEMR2穩定轉導之HEK293T細胞與25μL融合瘤上清液一起培育30分鐘。細胞用PBS/2% FCS洗滌，接著與每個樣品25μL於PBS/2% FCS中1：300稀釋之經DyeLight 649標記之二級特異性山羊抗小鼠IgG Fc片段一起培育15分鐘。細胞用PBS/2% FCS洗滌兩次且再懸浮於PBS/2% FCS+DAPI中且藉由流式細胞術、根 據螢光超過經同型對照抗體染色之細胞的螢光加以分析。剩餘未使用的融合瘤文庫細胞在液氮中冷凍用於未來的文庫測試及篩選。
免疫接種操作產生大量的鼠類抗體，其與表現hEMR2之HEK293T細胞發生免疫特異性反應且與未處理HEK293T細胞不發生免疫特異性反應。
實例7 抗EMR2抗體之特徵
使用各種方法，根據同型、抗原決定基分組及染色或殺死表現食蟹獼猴及人類EMR2及人類CD97之能力來表徵實例6中所產生的抗EMR2小鼠抗體。圖7提供概述大量例示性鼠類抗hEMR2抗體之特徵的表。「ND」表示不確定同型，而「混合」表示偵測到超過一種同型。
使用Milliplex小鼠免疫球蛋白同型分型套組(Millipore)，根據製造商方案確定多種代表性抗體的同型。EMR2特異性抗體的結果可見於圖7之最後一欄中。
使用多工競爭免疫分析(Luminex Corp.)將抗體分組。將濃度為10μg/mL的100μl各抗EMR2抗體(捕捉mAb)與已和抗小鼠κ抗體結合之磁性珠粒(Luminex)一起培育1小時(Miller等人，2011,PMID：21223970)。捕捉mAb/所結合珠粒複合物用PBSTA緩衝液(1% BSA/PBS+0.05% Tween20)洗滌，接著合併。移除殘餘洗滌緩衝液之後，將珠粒與2μg/mL hEMR2-His蛋白質一起培育1小時，洗滌，接著再懸浮於PBSTA中。將合併的珠粒混合物分佈於各孔含有抗EMR2抗體(偵測mAb)的96孔盤中，且在振盪下培育1小時。洗滌步驟之後，向孔中添加濃度為5μg/ml的抗小鼠κ抗體(與上文所用相同)且培育1小時。再次洗滌珠粒且再懸浮於PBSTA中。使用Luminex MAGPIX儀器量測平均螢光強度(MFI)值。抗體配對以根據 抗體對之皮爾森相關係數計算之距離矩陣樹枝狀圖可視化。根據樹枝狀圖及對抗體對之MFI值的分析來確定分組。圖7顯示所篩選的抗EMR2抗體可針對hEMR2蛋白質分成至少三個獨特分組(A-C)。
亦使用流式細胞術測試例示性抗體以測定其與細胞表面上所表現之hEMR2、cEMR2及CD97結合的能力。為此目的，將過度表現hEMR2、cEMR2及hCD97的經工程改造之HEK293T細胞(根據實例5製備)連同未處理的對照細胞與指定抗體一起培育30分鐘且使用BD FACS Canto II流式細胞儀、根據製造商說明書，藉由流式細胞術分析hEMR2表現。抗原表現係以經工程改造之細胞表面上所觀測到的幾何平均螢光強度變化(△MFI)量化，相較於已經同型對照抗體染色的相同細胞，該等細胞已經抗EMR2抗體染色。經工程改造之細胞與尚未經工程改造之細胞之間亦觀測幾何平均螢光強度變化(△MFI)。根據平均螢光強度的分析結果闡述於圖7中標有FC的一欄中。資料審查顯示若干種所揭示之抗體結合細胞表面上的hEMR2及cEMR2。此外，雖然此等相同抗體中的一些表觀上結合hCD97，而其他(諸如SC93.254及SC93.266)未表明其可向EMR2抗原提供增強的特異性。
為了確定本發明之抗EMR2抗體是否能夠內化以便介導細胞毒性劑遞送至活腫瘤細胞，使用例示性抗EMR2抗體及連接至皂草素的二級抗小鼠抗體FAB片段進行活體外細胞殺死分析。皂草素為一種植物毒素，其使核糖體不活化，藉此抑制蛋白質合成且導致細胞死亡。皂草素僅在細胞內部具有細胞毒性，其中其近接核糖體，但不能獨立地內化。因此，在此等分析中，皂草素介導細胞產生的細胞毒性表明抗小鼠FAB-皂草素構築體能夠在相關抗EMR2小鼠抗體結合及內化至靶細胞中之後內化。
以每孔500個細胞將單一細胞懸浮液中的過度表現hEMR2、cEMR2及hCD97之HEK293T細胞(根據實例5製備)塗鋪於BD組織培養盤(BD Biosciences)中。一天後，將圖7中所述之各種濃度的純化抗EMR2抗體與固定濃度的2nM抗小鼠IgG FAB-皂草素構築體(Advanced Targeting Systems)一起添加至培養物中。培育96小時之後，使用CellTiter-Glo®(Promega)，根據製造商說明書對活細胞計數。使用含有僅與二級FAB-皂草素偶聯物一起培育之細胞的培養物所得的原始發光計數設定為100%參考值且所有其他計數以參考值之百分比計算。結果係以存活細胞的百分比呈現。
此等資料表明，250pM濃度的一小組抗EMR2抗體-皂草素偶聯物以不同功效有效地殺死過度表現hEMR2、cEMR2及/或CD97的HEK293T細胞(圖7)，而未處理的293T對照物在相同條件下不排除。有趣的是，若干種所測試抗體(例如SC93.239、SC93.253、SC93.255)能夠排除表現hEMR2及cEMR2之細胞，但不能夠排除表現hCD97之細胞。如本文所論述，具有該等特徵之抗體可展現降低的細胞毒性且藉此提供特別有益的治療指數。
實例8 EMR2抗體的測序
如下文所述對實例6中所產生的抗EMR2小鼠抗體進行測序。使用RNeasy Miniprep套組(Qiagen)，根據製造商說明書自所選融合瘤細胞中純化總RNA。每個樣品使用104個與105個之間的細胞。所分離之RNA樣品在-80℃儲存直至使用。
使用兩種5'引子混合物擴增各融合瘤之Ig重鏈可變區，該等混合物包 含八十六個經設計以靶向完整小鼠VH譜系的小鼠特定前導序列引子與特異性針對所有小鼠Ig同型之3'小鼠Cγ引子之組合。類似地，含有六十四個經設計以擴增Vκ小鼠家族中之每一者之5' Vκ前導序列的兩種引子混合物係與特異性針對小鼠κ恆定區的單一反向引子組合使用以便對κ輕鏈擴增及測序。使用Qiagen一步RT-PCR套組，如下自100ng總RNA擴增VH及VL轉錄物。各融合瘤進行總共四次RT-PCR反應：Vκ輕鏈發生兩次反應且VH重鏈發生兩次反應。PCR反應混合物包括1.5μL RNA、0.4μL 100μM重鏈或κ輕鏈引子(由Integrated DNA Technologies定製合成)、5μL 5x RT-PCR緩衝液、1μL dNTPs及0.6μL含有逆轉錄酶及DNA聚合酶的酶混合物。熱循環儀程式為RT步驟，50℃歷時60分鐘，95℃歷時15分鐘，隨後為35個循環(94.5℃歷時30秒，57℃歷時30秒，72℃歷時1分鐘)。接著在72℃最後培育10分鐘。
使用與上文針對可變區擴增所述相同的特定可變區引子，對所萃取的PCR產物進行測序。將PCR產物傳送至外部測序供應商(MCLAB)用於PCR純化及測序服務。使用IMGT序列分析工具(http：//www.imgt.org/IMGTmedical/sequence_analysis.html)分析核苷酸序列以鑑別具有最高序列同源性的生殖系V、D及J基因成員。使用專有的抗體序列資料庫，藉由將VH及VL基因與小鼠生殖系資料庫比對來對所得序列與Ig V區域及J區域之已知生殖系DNA序列進行比較。
圖8A描繪來自抗EMR2抗體之許多新穎小鼠輕鏈可變區的鄰接胺基酸序列，而圖8B描繪來自相同抗EMR2抗體之新穎小鼠重鏈可變區的鄰接胺基酸序列。小鼠輕鏈及重鏈可變區胺基酸序列提供於SEQ ID NO：21-83奇數編號中。
更特定言之，圖8A及8B提供多種鼠類抗EMR2抗體的序列註釋，稱為SC93.15，其具有SEQ ID NO：21之VL及SEQ ID NO：23之VH；SC93.34，其具有SEQ ID NO：25之VL及SEQ ID NO：27之VH；SC93.51，其具有SEQ ID NO：29之VL及SEQ ID NO：31之VH；SC93.160，其具有SEQ ID NO：33之VL及SEQ ID NO：35之VH；SC93.216，其具有SEQ ID NO：37之VL及SEQ ID NO：39之VH；SC93.219，其具有SEQ ID NO：41之VL及SEQ ID NO：43之VH；SC93.221，其具有SEQ ID NO：45之VL及SEQ ID NO：47之VH；SC93.234，其具有SEQ ID NO：49之VL及SEQ ID NO：51之VH；SC93.239，其具有SEQ ID NO：53之VL及SEQ ID NO：55之VH；SC93.243，其具有SEQ ID NO：57之VL及SEQ ID NO：59之VH；SC93.252，其具有SEQ ID NO：61之VL及SEQ ID NO：63之VH；SC93.253，其具有SEQ ID NO：65之VL及SEQ ID NO：67之VH；SC93.255，其具有SEQ ID NO：69之VL及SEQ ID NO：71之VH；SC93.256，其具有SEQ ID NO：73之VL及SEQ ID NO：75之VH；及SC93.267，其具有SEQ ID NO：77之VL及SEQ ID NO：79之VH。另外，圖8A及8B顯示SC93.15.1及SC93.266之序列註釋，該SC93.15.1具有SEQ ID NO：21之VL(與SC93.15之VL一致)及SEQ ID NO：81之VH且該SC93.266具有SEQ ID NO：83之VL及SEQ ID NO：75之VH(與SC93.256之VL一致)。此等資料緊接著概述於下文表5中。
對VL及VH胺基酸序列進行註釋以鑑別根據Kabat定義的構架區(亦即FR1-FR4)及互補決定區(亦即圖8A中的CDRL1-CDRL3或圖8B中的CDRH1-CDRH3)。使用可提供CDR及FR名稱的Abysis資料庫專有版分析可變區序列。儘管CDR係根據Kabat定義，然而熟習此項技術者將瞭解CDR及FR名稱亦可根據Chothia、McCallum或任何其他所接受命名法系統定義。圖8C提供編碼圖8A及8B中所述之胺基酸序列的核酸序列(SEQ ID NO：20-82(偶數編號))。
如圖8A及8B中所見，各特定鼠類抗體之重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列的SEQ ID NO.通常為連續的奇數編號。因此，單株抗EMR2抗體SC93.15的輕鏈及重鏈可變區分別包含胺基酸SEQ ID NO：21及23；SC93.34的輕鏈及重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：25及27；SC93.51的輕鏈及重鏈可變區分別包含SEQ ID NO：29及31等。圖8A及8B中所述之編號方案例外為SC93.15.1(SEQ ID NO：21及81)及SC93.266(SEQ ID NO：83及75)，其中的每一者與其他所測序抗體之一共享可變區(分別為VL及VH)。在任何情況下，編碼鼠類抗體胺基酸序列的相應核酸序列包括於圖8C中且其SEQ ID NO.緊接著相應胺基酸SEQ ID NO.之前。因此，舉例而言，SC93.15抗體VL及VH核酸序列之SEQ ID NO.分別為SEQ ID NO：20及22。
除圖8A-8C中的序列註釋之外，圖8G-8I提供SC93.253、SC93.256及SC93.267之輕鏈及重鏈可變區的CDR名稱，如利用Kabat、Chothia、ABM及接觸方法所確定。圖8G-8I中所描繪的CDR名稱係利用如上文所論述之Abysis資料庫之專有版得到。如後續實例中所示，熟習此項技術者將瞭解，所揭示之鼠類CDR可移植至人類構架序列中，以根據本發明提供CDR移植抗EMR2抗體或人類化抗EMR2抗體。此外，鑒於本發明，可容易測定根據本文中之教示所製得及測序之任何抗EMR2抗體的CDR且利用所得CDR序列提供本發明之CDR移植抗EMR2抗體或人類化抗EMR2抗體。對於具有圖8A及8B中所述之重鏈及輕鏈可變區序列的抗體，此特別真實。
實例9 分組C之抗EMR2抗體識別EMR2之莖區
進一步研究前述實例之抗EMR2抗體以確定與所觀測分組相關之抗體抗原決定基的位置。
更特定言之，進行ELISA分析，以對所選抗體結合至EMR2蛋白質的位置進行定位。簡言之，96孔盤(VWR，610744)在4℃用含有1μg/mL hEMR2(Q24-Q478)-ECD-His或hEMR2(Q24-Q478)-ECD-Fc蛋白質之碳酸鈉緩衝液塗佈隔夜。洗滌培養盤且在37℃用2% FCS-PBS阻斷一小時且緊接著在4℃使用或保存。未稀釋之融合瘤上清液在培養盤上、在室溫下 培育一小時。洗滌培養盤且在室溫下用經HRP標記之山羊抗小鼠IgG(在1% BSA-PBS中1：10,000稀釋)探測一小時。與受質溶液一起培育之後，在OD 450讀盤。
分析結果顯示於圖9中，其中各資料點代表不同抗體且信號水準指示結合。如圖9所證明，發現經確定屬於分組C的抗體與EMR2蛋白質之莖區(亦即殘基261-478)有關。
實例10 利用流式細胞術偵測腫瘤上之EMR2表現
流式細胞術係用於評估本發明抗EMR2抗體特異性偵測初級及PDX AML腫瘤樣品及LU PDX腫瘤細胞株表面上之人類EMR2蛋白質之存在的能力。另外，亦測定LU CSC表面上之EMR2的表現。
藉由自小鼠中提取股骨與脛骨來收集AML PDX樣品。移除任何附接的肌肉組織後，將骨合併且使用研缽及杵磨碎以使骨髓脫離骨的其餘部分。收集細胞懸浮液且紅血球藉由暴露於低張力銨-氯化物-鉀溶液(ACK)而溶解。在冰上培育5分鐘後，藉由添加含有2%胎牛血清之PBS緩衝液(FSM)而中止紅血球溶解，藉由離心收集細胞且使用耐綸網濾出任何組織殘渣。獲得初級人類AML樣品，作為Ficol分離的單核細胞冷凍保存，解凍，用FSM洗滌一次且用於分析。將單一細胞懸浮液與可偵測死亡細胞的4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、可鑑別人類白血病細胞的抗人類CD45及CD33一起培育。所得單一細胞懸浮液包含腫瘤及非腫瘤細胞之塊狀樣品，包括NTG細胞及CSC。為了將塊狀AML白血病群體分成NTG及CSC亞群，進一步將PDX腫瘤細胞與抗人類CD34及CD38或候選AML CSC標記物一起培育。
收集LU PDX腫瘤且使用此項技術中公認的酶組織消化技術解離，以獲得PDX腫瘤細胞之單一細胞懸浮液(參見例如U.S.P.N.2007/0292414)。將PDX腫瘤單一細胞懸浮液與偵測死細胞的4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、抗小鼠CD45及鑑別小鼠細胞的H-2Kd抗體及鑑別人類癌瘤細胞的抗人類EPCAM抗體一起培育。所得單一細胞懸浮液包含腫瘤細胞塊狀樣品，包括NTG細胞與CSC。為了將塊狀LU PDX腫瘤細胞群體分成NTG及CSC亞群，將PDX腫瘤細胞與抗人類CD46及/或CD324及ESA抗體一起培育(U.S.P.N.2013/0260385、2013/0061340及2013/0061342)。
在任一情況下，使用BD FACS Canto II流式細胞儀，使用SC93.267(一種展現殺死CD97表現細胞之極小能力的抗EMR2抗體)，藉由流式細胞術分析塊狀或經分選之腫瘤細胞中的hEMR2表現。
圖10A顯示，相較於IgG同型對照抗體(灰色實心)，SC93.267抗體偵測到所測試之各AML樣品中的hEMR2表面表現量較高(黑線)。EMR2特異性染色發現於自患者血液或骨髓新鮮分離的多個個別原發AML樣品以及來自所建立人類AML PDX細胞株之白血病細胞中。資料表明EMR2表現於較寬範圍的AML細胞上，涵蓋此疾病之多種亞型。該等結果進一步表明本發明抗EMR2抗體可適用於診斷及治療AML。
圖10B顯示，與分選的NTG細胞或同型對照相比，抗hEMR2抗體SC93.267偵測到CSC LU細胞表面上之hEMR2表現升高。更特定言之，相較於IgG同型對照抗體(灰色實心)，PDX腫瘤樣品LU123、LU205、LU300(LU-Ad)及LU120(LU-SCC)顯示CSC(實心黑線)及LU及BR PDX腫瘤細胞之NTG亞群(虛線)上之hEMR2表現增加。此表明EMR2表現於多種LU腫瘤亞型(LU-Ad及LU-SCC)中之CSC上。基於MA及/或QPCR資料、 根據RNA量度不顯示EMR2表現的兩種LU PDX株系LU58及LU134明顯不顯示EMR2抗體的任何染色，此進一步表明EMR2抗體之特異性。
在各種情況下，表現可以已經抗EMR2抗體染色之腫瘤細胞表面上所觀測之幾何平均螢光強度相較於已經同型對照抗體染色之相同腫瘤的變化(△MFI)量化。概述所分析之各種腫瘤細胞株之△MFI的表以插圖顯示於圖10A及10B中。總之，此資料提出EMR2表現於LU及AML腫瘤細胞上，表明該等腫瘤對所揭示之抗EMR2抗體或包含其之抗體藥物偶聯物的治療敏感。
除圖10A及10B中所示之結合之外，圖10C表明選自不同抗原決定基分組的抗hEMR2抗體在其對正常血液及骨髓細胞、自AML PDX株系分離的細胞及來自血液科惡性疾病之各種細胞株的染色方面是不同的。就此而言，經EDTA或肝素處理以防止凝血的健康自願供者血液直接用抗hEMR2抗體SC93.239(分組A)及SC93.262(分組C)染色，培育，洗滌，藉由使用抗小鼠IgG螢光染料標記抗體偵測且與DAPI共染色以排除死亡細胞。接著使用FACSCanto(BD Biosciences)，根據製造商說明書，藉由流式細胞術分析血球。除分級分離之樣品之外，各種血液組分僅基於其正向/側向分散特性，以電子方式閘選。此冷凍保存的正常骨髓購自商業來源(AllCells)，解凍，洗滌且用EMR2特異性抗體染色且與抗人類CD34及CD38抗體及DAPI共染色。針對活CD34+或CD34+CD38-細胞閘選之後，分析hEMR2表現。
基於此等樣品及方法，圖10C顯示SC93.239及SC93.262抗體所偵測之hEMR2在血液粒細胞(Gran)、單核細胞(Mo)及淋巴細胞(LYM)上之表現的直方圖。實心粗線描繪EMR2表現，而灰色陰影直方圖顯示適當同型 對照之信號。正如所預期，該等純系中無一者將人類淋巴細胞染色，但對兩種經染色之單核細胞則不然(雖然強度不同)。反之，僅純系SC93.239將粒細胞亞群染色，表明純系SC93.262識別粒細胞(例如表現不被SC93.262識別之EMR2同功異型物的粒細胞)上不太豐裕的抗原決定基。類似地，分析人類正常骨髓細胞時，使用SC93.239獲得更強染色。
此外，如直方圖所示，純系SC93.239識別存在於CD34+骨髓細胞上的抗原決定基，而純系SC93.262不將任何CD34+細胞染色。分析來自AML PDX株系的白血病細胞時，亦觀測hEMR2特異性純系之間的染色模式差異。亦即，純系SC93.239將AML31p2染色，但不能將AML23p2染色，而純系SC93.262與AML23p2反應，但與AML31p2不反應。圖10C進一步顯示兩種血液細胞株KG1(AML)及DEL(組織細胞增多症)上之EMR2的表面表現差異，根據RNA量度，兩種細胞株對於EMR2表現均呈陽性。兩種純系均將DEL細胞染色，但僅純系SC93.239對KG1顯示陽性染色。EMR2陰性、但CD97陽性細胞株JVM2(套細胞淋巴瘤)未被任一種抗體識別，進一步表明其針對EMR2的特異性。
總之，此等資料表明產生各種抗原決定基特異性抗hEMR2且可用於以不同於正常及惡性細胞的結合概況特異性結合血液樣品。更特定言之，應瞭解可產生及/或選擇可與主要由致瘤細胞表現之抗原決定基反應的本發明抗體，藉此提供有益的治療指數。
實例11 嵌合及人類化抗EMR2抗體的產生
使用此項技術中公認的技術如下產生嵌合抗EMR2抗體。自融合瘤萃取總RNA且進行PCR擴增。經由個體核酸序列的分析來獲得關於以下鼠類 抗體：SC93.253及SC93.256之VH及VL鏈之V、D及J基因區段的資料(核酸序列參見圖8C)。使用以下限制位點設計專用於抗體VH及VL鏈之構架序列的引子組：用於VH片段的AgeI及XhoI，及用於VL片段的XmaI及DraIII。PCR產物使用Qiaquick PCR純化套組(Qiagen)純化，隨後用限制酶消化用於VH片段的AgeI及XhoI及用於VL片段的XmaI及DraIII。純化VH及VL消化的PCR產物且分別與IgH或Igκ表現載體連接。使用200U T4-DNA連接酶(New England Biolabs)、7.5μL經消化及純化之基因特異性PCR產物及25ng線性化載體DNA，以10μL總體積進行連接反應。勝任型大腸桿菌DH10B細菌(Life Technologies)在42℃經由熱衝擊經3μL連接產物轉型且以100ng/mL濃度塗鋪至安比西林(ampicillin)盤上。經擴增之連接產物純化及消化之後，將VH片段選殖入包含HuIgG1之pEE6.4表現載體(Lonza)的AgeI-XhoI限制位點中且將VL片段選殖入包含Hu-κ輕鏈恆定區之pEE12.4表現載體(Lonza)的XmaI-DraIII限制位點中。
包含完整鼠類重鏈及輕鏈可變區及人類恆定區之嵌合抗體係藉由用pEE6.4HuIgG1及pEE12.4Hu-κ表現載體共轉染CHO-S細胞且以PEI作為轉染試劑來表現。轉染之後第三至六天收集上清液。藉由800×g離心10分鐘來清除含有重組嵌合抗體之培養物上清液中的細胞殘渣且在4℃儲存。使用蛋白質A珠粒純化重組嵌合抗體。
亦使用專有的電腦輔助式CDR移植方法(Abysis資料庫，UCL Business)及標準分子工程技術如下對鼠類抗EMR2抗體進行CDR移植或發生人類化。可變區之人類構架區係根據人類生殖系抗體序列之構架序列及CDR典型結構與相關小鼠抗體之構架序列及CDR之間的最高同源性來設計。出於分析的目的，根據Kabat等人之編號方案指派各CDR域之胺基酸。 就此而言，圖5H至5J顯示使用各種分析方案所得之鼠類抗體SC93.253及SC93.256的重鏈及輕鏈CDR。包含鼠類Kabat CDR的可變區及所選人類構架一經設計，則利用合成基因區段產生其(Integrated DNA Technologies)。接著使用上文針對嵌合抗體所述之分子方法選殖及表現人類化抗體。例示性人類化EMR2抗體構築體(包括下文更詳細論述的某些位點特異性構築體)的細節緊接著闡述於下文表6中。
就此而言，應注意表6顯示在人類化方法期間，經由使用胺基酸取代T57N來移除SC93.253之CDR中的有希望糖基化位點，以便增強最終人類化抗體之穩定性及均質性。此取代包括於最終hSC93.253抗體中。
各衍生自相應鼠類抗體(例如SC93.253來源於SC93.256)之VL及VH序列的人類化抗體hSC93.253(SEQ ID NO：101及103)及hSC93.256(SEQ ID NO：105及107)的VL及VH胺基酸序列顯示於圖8D中。VL及VH之相應核酸序列闡述於圖8E中(SEQ ID NO：100-106，偶數編號)。人類化構築體序列之概述緊接著闡述於下文表7中。
表7
此實例中所述的例示性人類化抗體表明臨床上相容的抗體可如本文所揭示產生及衍生。在本發明之某些態樣中，該等抗體可併入EMR2 ADC中以提供包含有利治療指數的組合物。
實例12 位點特異性抗EMR2抗體的產生
如上文表6及7中所述，例示性位點特異性抗體係根據本文中之教示產生。藉由隨附於純系名稱之「ss1」後綴指示的此等位點特異性構築體包含hSC93.253及hSC93.256可變區。
關於表7中所述的構築體，hSC93.253及hSC93.253ss1包含相同的可變區胺基酸序列(亦即VL之SEQ ID NO：101及VH之SEQ ID NO：103)。類似地，單株抗體hSC93.256及hSC93.256ss1各自包含SEQ ID NO：105中所述之VL胺基酸序列及SEQ ID NO：107中所述之VH胺基酸序列。各種構築體(野生型IgG1與位點特異性)之全長輕鏈及重鏈胺基酸序列顯示於圖8F中，其中重鏈C220S突變點及相應的原生半胱胺酸結合搭配物各加下劃線。更特定言之，圖8F顯示例示性抗體hSC93.253(SEQ ID NO：110及111)、hSC93.253ss1(SEQ ID NO：110及113)、hSC93.256(SEQ ID NO：114及115)及hSC93.256ss1(SEQ ID NO：114及117)之全長重鏈及輕鏈胺基酸序列。
位點特異性構築體如下製造： 構建包含原生輕鏈(LC)恆定區及重鏈(HC)恆定區的經工程改造之人類IgG1/κ抗EMR2位點特異性抗體，其中HC之上部鉸鏈區中之半胱胺酸220(C220)(其與LC中之半胱胺酸214(C214)天然形成鏈間二硫鍵)經絲胺酸取代(C220S)。組裝時，HC與LC形成包含兩個適合與治療劑結合之游離半胱胺酸(輕鏈之位置214)的抗體。除非另外說明，否則恆定區殘基之所有編號均根據如Kabat等人所述之EU編號方案進行。
更特定言之，編碼人類化抗EMR2抗體hSC93.253 HC(SEQ ID NO：111)或hSC93.256 HC(SEQ ID NO：115)之一的表現載體用作PCR擴增及定點突變誘發的模板。使用Quick-change®系統(Agilent Technologies)，根據製造商說明書進行定點突變誘發。
將編碼hSC93.253(SEQ ID NO：113)之突變體C220S HC的載體與hSC93.253(SEQ ID NO：110)之κ LC共轉染至CHO-S細胞中且使用哺乳動物短暫表現系統表現。類似地，編碼hSC93.256(SEQ ID NO：117)之突變體C220S HC的載體與hSC93.256(SEQ ID NO：114)之κ LC共轉染且使用CHO-S細胞表現。
含有C220S突變體之經工程改造之抗EMR2位點特異性抗體稱為hSC93.253ss1及hSC93.256ss1。hSC93.253ss1(SEQ ID NO：110及113)及hSC93.256ss1(SEQ ID NO：114及117)位點特異性抗體之全長LC及HC的胺基酸序列顯示於圖8F中。經工程改造之抗EMR2抗體藉由SDS-PAGE表徵以證實已產生正確突變體。在還原劑(諸如DTT(二硫蘇糖醇))存在及不存在下，在得自Life Technologies的預澆注10% Tris-甘胺酸小型凝膠上進行SDS-PAGE。電泳之後，凝膠用膠態庫馬斯溶液(colloidal Coomassie solution)染色。在還原條件下，觀測到對應於游離LC及游離 HC的兩個色帶。此圖案為IgG分子在還原條件下的典型圖案。在非還原條件下，色帶圖案不同於原生IgG分子，表示HC與LC之間缺乏二硫鍵。觀測到對應於HC-HC二聚體的約98kD色帶。另外，觀測到對應於游離LC的暗色帶及對應於LC-LC二聚體的約48kD主色帶。由於各LC之C末端存在游離半胱胺酸，因此預期形成一些量的LC-LC物質。
如本文所論述，與標準先前技術ADC組合物相比，製造位點特異性EMR2抗體的能力允許製備較均質的組合物且可提供改良之治療指數。
實例13 抗EMR2抗體的結合
具有鼠類可變區及人類化抗EMR2抗體的各種嵌合抗體(包括hSC93.253及hSC93.256之位點特異性構築體)經由具有游離硫氫基的末端順丁烯二醯亞胺基部分而與吡咯并苯并二氮呯(例如PBD1及PBD3)結合，以產生抗體藥物偶聯物(ADC)，稱為SC93.239 PBD1、SC93.253 PBD1、SC93.256 PBD1、SC93.267 PBD1、hSC93.253ss1 PBD1、hSC93.253ss1 PBD3、hSC93.256ss1 PBD1及hSC93.256ss1 PBD3。此等偶聯物連同適當的結合及未結合對照物一起用於後續實例中。
如下製備原生抗EMR2 ADC。抗EMR2抗體中之半胱胺酸鍵經由在室溫下添加含有每莫耳抗體預定莫耳濃度之參(2-羧基乙基)-膦(TCEP)莫耳數之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)及5mM EDTA歷時90分鐘來部分地還原。所得經部分還原的製劑接著在室溫下經由順丁烯二醯亞胺連接體而與PBD1(PBD1結構提供於本說明書上文中)結合最少30分鐘。接著使用10mM製備於水中的儲備溶液，經由添加過量的N-乙醯基半胱胺酸(NAC)(相較於連接體-藥物)來淬滅反應。淬滅最少20分鐘時間之後，經由添加0.5 M乙酸將pH調節至6.0。ADC製劑藉由使用30kDa膜透濾而相對於透濾緩衝液進行緩衝交換。經透濾之抗EMR2 ADC接著用蔗糖及聚山梨醇酯-20調配至目標最終濃度。分析所得抗EMR2 ADC的蛋白質濃度(藉由量測UV)、聚集度(SEC)、藥物與抗體比率(DAR)(藉由逆相HPLC(RP-HPLC))及活性(活體外細胞毒性)。
使用經修改之部分還原方法使例示性位點特異性人類化抗EMR2 ADC結合。所要產物為一種ADC，其最大程度地在各LC恆定區之不成對半胱胺酸(ss1構築體中之C214)上結合，且使藥物與抗體比率(DAR)大於2(DAR>2)的ADC最少化、同時使DAR為2(DAR=2)的ADC最多化。為了進一步改良結合特異性，抗體在與連接體-藥物結合之前使用包含穩定劑(例如L-精胺酸)及輕度還原劑(例如麩胱甘肽)的方法選擇性地還原，隨後進行透濾及調配步驟。
各位點特異性抗體之製劑在室溫下、於具有預定濃度之還原麩胱甘肽(GSH)、含有1M L-精胺酸/5mM EDTA的緩衝液(pH 8.0)中維持最少兩小時而選擇性地還原。所有製劑接著使用30kDa膜(Millipore Amicon Ultra)、相對於20mM Tris/3.2mM EDTA pH 7.0緩衝液進行緩衝交換以移除還原緩衝液。所得選擇性還原製劑接著在室溫下經由順丁烯二醯亞胺連接體與PBD1或PBD3(PBD結構提供於上文中)結合最少30分鐘。接著使用製備於水中的10mM儲備溶液，經由添加過量NAC(相較於連接體-藥物)來淬滅反應。淬滅最少20分鐘時間之後，經由添加0.5M乙酸將pH調節至6.0。所得位點特異性ADC製劑使用30kDa膜、藉由透濾而在透濾緩衝液中緩衝交換。經透濾之抗EMR2 ADC接著用蔗糖及聚山梨醇酯-20調配至目標最終濃度。分析所得位點特異性抗EMR2 ADC的蛋白質濃度 (藉由量測UV)、聚集度(SEC)、藥物與抗體比率(DAR)(藉由逆相HPLC(RP-HPLC))及活性(活體外細胞毒性)。
所得偶聯物儲存至使用。
實例14 抗EMR2 ADC介導活體外殺死
為了確定本發明之抗EMR2 ADC是否能夠內化以便介導細胞毒性劑遞送至活腫瘤細胞，使用例示性抗EMR2 ADC、hSC93.253ss1 PBD1、hSC93.253ss1 PBD3、hSC93.256ss1 PBD1及hSC93.256ss1 PBD3(如上文實例中所述產生)進行活體外細胞殺死分析。在此情況下，使用DL6遞送PBD1以提供ADC 6且使用DL3遞送PBD3以提供ADC 3。
將過度表現hEMR2之HEK293T細胞的單一細胞懸浮液或未處理HEK293T細胞以每孔500個細胞塗鋪於BD組織培養盤(BD Biosciences)中。一天後，將各種濃度的經純化ADC或人類IgG1對照抗體與PBD1或PBD3偶聯物添加至培養物中。細胞在37℃/5% CO2下培育96小時。培育之後，使用CellTiter-Glo®(Promega)，根據製造商說明書對活細胞計數。使用含有未處理細胞之培養物所得的原始發光計數設定為100%參考值且所有其他計數均以參考值之百分比計算。
圖11A(EMR2+細胞)及11B(EMR2-細胞)顯示，表現EMR2決定子的細胞對人類化位點特異性抗EMR2 ADC(例如hSC93.253ss1 PBD3及hSC93.256ss1 PBD3)的敏感性比所結合的人類IgG1對照抗體大得多。另外，相較於過度表現EMR2的HEK293T細胞，EMR2 ADC對未過度表現EMR2之未處理HEK293T細胞的影響非常小，表明ADC對EMR2抗原的特異性(圖11B)。
上述結果表明抗EMR2 ADC能夠特異性地介導細胞毒性有效載物內化及遞送至表現EMR2之細胞。
實例15 EMR2抗體藥物偶聯物活體內抑制實體腫瘤生長
基於前述結果，努力證明本發明之所結合EMR2調節劑活體內縮減及抑制表現EMR2之人類腫瘤生長。就此而言，本發明之所選抗體(SC93.253、SC93.256及SC93.267)與PBD細胞毒性劑(PBD1、DL6)共價結合且測試所得ADC以證明其抑制免疫缺乏小鼠中之人類PDX腫瘤生長的能力。
為此目的，使用此項技術中公認的技術使患者源異種移植(PDX)肺腫瘤(LU187)在雌性NOD/SCID接受者小鼠之側腹中皮下生長。監測腫瘤體積及小鼠體重，每週兩次。當腫瘤體積達到150-250mm3時，將小鼠隨機分配至處理組且經由腹膜內注射而注射單次劑量之SC93 ADC(1.6mg/kg)或抗半抗原對照IgG2a PBD1(各基本上如實例13中所述產生)。處理之後，監測腫瘤體積及小鼠體重直至腫瘤超過800mm3或小鼠生病。在所有測試中，經處理之小鼠未展現不利的健康效應，超過了在具有腫瘤之免疫缺乏NOD/SCID小鼠中典型發現的彼等效應。
圖12顯示所揭示之ADC對具有LU187腫瘤之展現EMR2表現的小鼠中的腫瘤生長的影響。更特定言之，圖12顯示直接與媒劑(未圖示)或對照ADC IgG2a PBD1相比，抗EMR2 ADC的投與引起腫瘤抑制。
例示性結合抗體活體內抑制腫瘤體積的驚人能力進一步驗證了EMR2作為治療標靶用於治療增生性病症的用途。
實例16 使用抗EMR2抗體靶向CSC
如上文所論述，腫瘤細胞可大體分成兩種類型的細胞亞群：非致瘤細胞(NTG)及腫瘤起始細胞或致瘤細胞(TIC)。致瘤細胞當植入免疫功能不全小鼠中時具有形成腫瘤的能力，而非致瘤細胞則不能。癌症幹細胞(CSC)為致瘤細胞亞群且能夠無限地自複製，同時維持多譜系分化的能力。為了確定腫瘤中的EMR2表現是否會與增強的致瘤性相關，如下文所述分離及分析某些AML腫瘤細胞。
更特定言之，初級人類AML樣品用抗人類CD34及抗EMR2抗體(SC93.267)與生物素偶聯物染色。進行初始染色後，洗滌樣品且用抗生蛋白鏈菌素與APC偶聯物再染色以偵測SC93.267+細胞。接著使用FACSAriaTM流式細胞儀(BD Biosciences)將此樣品分選成CD34- SC93.267+、CD34-SC93.267高及CD34+SC93.267+亞群。每組五隻雌性NSG免疫功能不全小鼠藉由275拉德(rad)全身照射來調理且上述三種亞群中的每一者靜脈內注射15,000個細胞。將小鼠無痛處死且移植後第10週收集骨髓、周邊血液及脾以藉由流式細胞術測定白血病負荷。
圖13A顯示使用所揭示之EMR2抗體SC93.267的閘選條件及細胞群體分離，而圖13B表明致瘤細胞亞群當注射至免疫功能不全小鼠中時可再現親本腫瘤。就此而言，圖13A及13B顯示此樣品中的致瘤細胞存在於CD34+EMR2+細胞群體中(圖13B中的閉合三角形)。因此，靶向CD34+EMR2+細胞群體的藥劑(如本文所述的EMR2特異性ADC)可用於靶向腫瘤相關細胞的致瘤亞群。該靶向可引起明顯的腫瘤消退及預防腫瘤再現或復發。另外，偵測患者骨髓或血液樣品內的CD34+EMR2+細胞(例如藉由流式細胞術或共免疫組織化學)可用於診斷或預後目的。
實例17 人類化EMR2抗體藥物偶聯物活體內減少AML PDX腫瘤的白血病負荷
鑒於前述實例中EMR2 ADC所提供的給人深刻印象的結果及EMR2+致瘤細胞存在於血液科惡性疾病(例如以致瘤細胞形式)中的證明，進行其他實驗以證明所揭示之化合物治療各種血液科惡性疾病(諸如急性骨髓性白血病(AML))的能力。
更特定言之，表現EMR2的AML PDX株系(例如AML16及AML23)在播散性白血病模型中用於確定所揭示之ADC是否可有效地減少免疫功能不全小鼠中的腫瘤負荷。就此而言，使用Multirad 250 x射線照射器(Faxitron)，使NOD/SCID/共同γ鏈基因敲除小鼠(NSG)接受275亞致死劑量的全身輻射。在照射後的48小時內，小鼠靜脈內輸注AML細胞的單一細胞懸浮液。為了證實腫瘤移植，將三隻隨機選擇的小鼠在預定時間無痛處死，且收集骨髓、周邊血液及脾用於評估白血病負荷。就此而言，利用該等組織製備單一細胞懸浮液，用低滲透壓溶液溶解紅血球且細胞用識別CD45及CD33之經螢光染料標記之人類特異性抗體染色。所染色樣品使用FACSCantoTM流式細胞儀(BD Biosciences)分析且測定各組織中的人類白血病細胞負荷的相對數目。
確認移植之後，小鼠根據體重隨機分組且腹膜內注射抗EMR2 ADC或相應對照物。在AML16的情況下，向小鼠注射單次劑量之0.1mg/kg hSC93.253ss1 PBD1(例如ADC 6)、hSC93.256ss1 PBD1、對照HuIgG1.ss1 PBD1或單次劑量之媒劑對照物(圖14A)。在AML23的情況下，向小鼠注射單次劑量之0.2mg/kg SC93.239 PBD1、SC93.253 PBD1、SC93.256 PBD1、SC93.267 PBD1、對照小鼠IgG2a PBD1或單次劑量之 媒劑對照物(圖14B)。常規地監測經處理小鼠之健康狀況且當小鼠生病或在預定時間點生病時，將所有小鼠無痛處死且藉由流式細胞術分析各小鼠之骨髓、脾及血液中的白血病負荷，如先前所述。圖14A及14B展現在抗EMR2 ADC活體內治療之後，白血病負荷降低，此進一步驗證了EMR2作為治療標靶用於治療AML的用途。
抗抗EMR2 ADC特異性殺死表現EMR2之腫瘤細胞(包括致瘤細胞)且活體內顯著抑制腫瘤生長延長之時段的能力進一步驗證了抗EMR2 ADC用於治療性治療癌症且特定言之用於治療AML的用途。
熟習此項技術者應進一步瞭解，本發明可以其他特定形式實施而不背離本發明的精神或主要屬性。因為本發明之前述說明僅揭示其例示性實施例，所以應瞭解，本發明之範疇內涵蓋其他變化形式。因此，本發明不限於已在本文中詳細描述的特定實施例。實情為，應參考指示本發明範疇及內容的隨附申請專利範圍。
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<213> 小家鼠
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<400> 117

Claims (44)

  1. 一種經分離之抗體，其結合至表現EMR2的腫瘤起始細胞。
  2. 一種經分離之抗體，其結合至包含SEQ ID NO：1之人類EMR2。
  3. 一種經分離之抗體，其結合至EMR2且與包含以下的抗體競爭結合：SEQ ID NO：21之輕鏈可變區(VL)及SEQ ID NO：23之重鏈可變區(VH)；或SEQ ID NO：25之VL及SEQ ID NO：27之VH；或SEQ ID NO：29之VL及SEQ ID NO：31之VH；或SEQ ID NO：33之VL及SEQ ID NO：35之VH；或SEQ ID NO：37之VL及SEQ ID NO：39之VH；或SEQ ID NO：41之VL及SEQ ID NO：43之VH；或SEQ ID NO：45之VL及SEQ ID NO：47之VH；或SEQ ID NO：49之VL及SEQ ID NO：51之VH；或SEQ ID NO：53之VL及SEQ ID NO：55之VH；或SEQ ID NO：57之VL及SEQ ID NO：59之VH；或SEQ ID NO：61之VL及SEQ ID NO：63之VH；或SEQ ID NO：65之VL及SEQ ID NO：67之VH；或SEQ ID NO：69之VL及SEQ ID NO：71之VH；或SEQ ID NO：73之VL及SEQ ID NO：75之VH；或SEQ ID NO：77之VL及SEQ ID NO：79之VH；或 SEQ ID NO：21之VL及SEQ ID NO：81之VH；或SEQ ID NO：83之VL及SEQ ID NO：75之VH。
  4. 如請求項1至3中任一項之經分離之抗體，其為內化抗體。
  5. 如請求項1至4中任一項之經分離之抗體，其為嵌合的、CDR移植的、人類化或人類抗體，或其免疫反應性片段。
  6. 如請求項1至5中任一項之經分離之抗體，其中該抗體結合至hEMR2同功異型物a之胺基酸261-478之莖域內的抗原決定基。
  7. 如請求項1至6中任一項之經分離之抗體，其中該抗體不能免疫特異性地結合至CD97。
  8. 如請求項1至7中任一項之經分離之抗體，其中該抗體包含SEQ ID NO：101之輕鏈可變區(VL)及SEQ ID NO：103之重鏈可變區(VH)；或SEQ ID NO：105之VL及SEQ ID NO：107之VH。
  9. 如請求項1至7中任一項之經分離之抗體，其中該抗體包含SEQ ID NO：110之輕鏈及SEQ ID NO：111之重鏈；或SEQ ID NO：110之輕鏈及SEQ ID NO：113之重鏈；或SEQ ID NO：114之輕鏈及SEQ ID NO：115之重鏈；或SEQ ID NO：114之輕鏈及SEQ ID NO：117之重鏈。
  10. 如請求項1至7中任一項之經分離之抗體，其中該抗體包含位點特異性抗體。
  11. 如請求項1至10中任一項之抗體，其中該抗體偶聯至有效載物。
  12. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至10中任一項之抗體。
  13. 一種核酸，其編碼如請求項1至10中任一項之抗體的全部或一部分。
  14. 一種載體，其包含如請求項13之核酸。
  15. 一種宿主細胞，其包含如請求項13之核酸或如請求項14之載體。
  16. 一種具有式Ab-[L-D]n之ADC或其醫藥學上可接受之鹽，其中：a)Ab包含抗EMR2抗體；b)L包含可選的連接體；c)D包含藥物；且d)n為整數約1至約20。
  17. 如請求項16之ADC，其中該抗EMR2抗體包含嵌合的、CDR移植、人類化或人類抗體或其免疫反應性片段。
  18. 如請求項16之ADC，其中Ab為如請求項1至10中任一項之抗EMR2 抗體。
  19. 如請求項16之ADC，其中n包含整數約2至約8。
  20. 如請求項16之ADC，其中D包含選自由以下組成之群的化合物：奧瑞斯他汀(auristatin)、類美登素(maytansinoid)、吡咯并苯并二氮呯(pyrrolobenzodiazepine，PBD)、卡奇黴素(calicheamicin)及瓢菌素(amanitin)。
  21. 一種醫藥組合物，其包含如請求項16至20中任一項之ADC。
  22. 一種治療癌症之方法，其包含向有需要其的個體投與如請求項12或21之醫藥組合物。
  23. 如請求項22之方法，其中該癌症包含血液科惡性疾病。
  24. 如請求項23之方法，其中該血液科惡性疾病包含白血病或淋巴瘤。
  25. 如請求項24之方法，其中該血液科惡性疾病包含急性骨髓性白血病。
  26. 如請求項22之方法，其中該血液科惡性疾病包含非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)。
  27. 如請求項26之方法，其中該非霍奇金氏淋巴瘤包含瀰瀰漫性大B細胞淋巴瘤。
  28. 如請求項22之方法，其中該癌症包含實體腫瘤。
  29. 如請求項28之方法，其中該癌症選自由以下組成之群：腎上腺癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、乳癌、胃癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮癌、食道癌、結腸直腸癌、前列腺癌、胰臟癌、肺癌(小細胞與非小細胞)、甲狀腺癌及神經膠母細胞瘤。
  30. 如請求項28之方法，其中該癌症包含肺腺癌。
  31. 如請求項28之方法，其中該癌症包含鱗狀細胞癌。
  32. 如請求項22之方法，其進一步包含向該個體投與至少一種其他治療部分。
  33. 一種減少腫瘤細胞群體中之腫瘤起始細胞的方法，其中該方法包含使包含腫瘤起始細胞及除腫瘤起始細胞之外之腫瘤細胞的腫瘤細胞群體與如請求項16至20之ADC接觸，藉此降低腫瘤起始細胞頻率。
  34. 如請求項33之方法，其中該接觸係在活體內進行。
  35. 如請求項33之方法，其中該接觸係在活體外進行。
  36. 一種遞送細胞毒素至細胞之方法，其包含使該細胞與如請求項16至20中任一項之ADC接觸。
  37. 一種偵測、診斷或監測個體中之癌症的方法，該方法包含以下步驟：(a)使腫瘤細胞與如請求項1至10中任一項之抗體接觸；及(b)偵測該等腫瘤細胞上之該抗體。
  38. 如請求項37之方法，其中該接觸係在活體外進行。
  39. 如請求項37之方法，其中該接觸係在活體內進行。
  40. 一種產生如請求項16之ADC的方法，其包含使抗EMR2抗體(Ab)與藥物(D)偶聯之步驟。
  41. 如請求項40之方法，其中該抗體包含位點特異性抗體。
  42. 一種套組，其包含：(a)一或多個含有如請求項21之醫藥組合物的容器；及(b)與該一或多個容器連帶之標籤或藥品說明書，其指明該組合物用於治療患有癌症之個體。
  43. 一種套組，其包含：(a)一或多個含有如請求項21之醫藥組合物的容器；及(b)與一或多個容器連帶之標籤或藥品說明書，其指明用於患有癌症之個體之給藥方案。
  44. 如請求項42或43之套組，其中該癌症為AML。
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