TW201829464A - 新穎的抗ｋｒｅｍｅｎ２抗體及使用方法 - Google Patents

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大衛 劉
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Abstract

本發明提供了新穎的抗KREMEN2抗體和抗體藥物軛合物，及使用此種抗KREMEN2抗體和抗體藥物軛合物治療癌症之方法。

Description

新穎的抗KREMEN2抗體及使用方法
本申請總體上涉及抗KREMEN2抗體或其免疫反應性片段或衍生物(包括抗體藥物軛合物(conjugate))，以及包含它們的組成物，用於治療、診斷或預防癌症及其任何復發或轉移。本發明的所選實施方式提供了這樣的抗KREMEN2抗體或抗體藥物軛合物用於治療癌症(包括降低腫瘤發生細胞頻率)之用途。
幹細胞和祖細胞的分化和增生係正常進程，其作用係在器官發生、細胞修復和細胞替換期間對組織生長提供支持。該系統被緊密調節以確保基於生物體的需求只有適當的信號生成。細胞增生和分化通常只在必要時因替換受損或垂死細胞或因生長而出現。然而，可以由許多因素觸發該等過程的破壞，該等因素包括各種傳訊化學物質不足或其過於豐富、存在改變的微環境、基因突變或其組合。正常細胞增生和/或分化的破壞可以導致各種病症，包括增生性病症，如癌症。
癌症的常規治療包括化學療法、放射療法和免疫療法。通常該等治療係無效的並且手術切除不能提供可行的臨床替 代方案。當前醫療標準的限制在患者經受一線治療並隨後復發的該等情況下是特別明顯的。在這種情況下，難治性腫瘤(通常是侵襲性且不能治癒的)頻繁出現。多年來，許多腫瘤的總生存率大體保持不變，至少部分歸因於現有療法預防復發、腫瘤復發和轉移的失敗。因此，對開發針對增生性病症更具靶向性並且有效的療法仍然存在巨大需求。本發明解決了這一需求。
在廣泛的方面，本發明提供了新穎的抗體以及相應的抗體藥物或診斷軛合物(ADC)或其組合，它們與人KREMEN2決定因子特異性結合。在某些實施方式中，該KREMEN2決定因子係在腫瘤細胞上表現的KREMEN2蛋白，而在其他實施方式中，該KREMEN2決定因子在腫瘤起始細胞上表現。在其他實施方式中，本發明的抗體與KREMEN2蛋白結合，並且與結合人KREMEN2蛋白上的表位的抗體競爭結合。
在所選實施方式中，本發明包括以下抗體，該抗體包含以下分離的抗體或與其競爭結合，該分離的抗體與表現人KREMEN2(具有SEQ ID NO：1)的細胞結合，其中該分離的抗體包含：(1)SEQ ID NO：21的輕鏈可變區(VL)和SEQ ID NO：23的重鏈可變區(VH)；或(2)SEQ ID NO：25的VL和SEQ ID NO：27的VH；或(3)SEQ ID NO：29的VL和SEQ ID NO：31的VH；或(4)SEQ ID NO：33的VL和SEQ ID NO：35的VH；或(5)SEQ ID NO：37的VL和SEQ ID NO：39的VH；或(6)SEQ ID NO：41的VL和SEQ ID NO：43的VH；或(7)SEQ ID NO：45的VL和SEQ ID NO：47的VH； 或(8)SEQ ID NO：49的VL和SEQ ID NO：51的VH；或(9)SEQ ID NO：53的VL和SEQ ID NO：55的VH；或(10)SEQ ID NO：57的VL和SEQ ID NO：59的VH；或(11)SEQ ID NO：61的VL和SEQ ID NO：63的VH；或(12)SEQ ID NO：65的VL和SEQ ID NO：67的VH；或(13)SEQ ID NO：69的VL和SEQ ID NO：71的VH；或(14)SEQ ID NO：73的VL和SEQ ID NO：75的VH；或(15)SEQ ID NO：77的VL和SEQ ID NO：79的VH；或(16)SEQ ID NO：49的VL和SEQ ID NO：81的VH。
在一個另外的方面，本發明包括與包含輕鏈可變區和重鏈可變區的KREMEN2結合的抗體，其中該輕鏈可變區具有如SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：77所示的輕鏈可變區的三個CDR，並且該重鏈可變區具有如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：81所示的重鏈可變區的三個CDR。
在其他方面，本發明包括人源化抗體，其中該人源化抗體包含SEQ ID NO：101的輕鏈可變區(VL)和SEQ ID NO：103的重鏈可變區(VH)；或SEQ ID NO：105的VL和SEQ ID NO：107 的VH；或SEQ ID NO：109的VL和SEQ ID NO：107的VH；或SEQ ID NO：113的VL和SEQ ID NO：115的VH；或SEQ ID NO：117的VL和SEQ ID NO：119的VH。在某些實施方式中，該等人源化抗體將包括位點特異性抗體。在其他實施方式中，這樣的抗體將包含N297A突變(MJ突變)。
在其他所選實施方式中，本發明將包括人源化抗體，其中該抗體包含SEQ ID NO：130的輕鏈和SEQ ID NO：131的重鏈；或SEQ ID NO：130的輕鏈和SEQ ID NO：133的重鏈；或SEQ ID NO：130的輕鏈和SEQ ID NO：135的重鏈；或SEQ ID NO：136的輕鏈和SEQ ID NO：137的重鏈；或SEQ ID NO：136的輕鏈和SEQ ID NO：139的重鏈；或SEQ ID NO：136的輕鏈和SEQ ID NO：141的重鏈；或SEQ ID NO：142的輕鏈和SEQ ID NO：137的重鏈；或SEQ ID NO：142的輕鏈和SEQ ID NO：139的重鏈；或SEQ ID NO：144的輕鏈和SEQ ID NO：145的重鏈；或SEQ ID NO：144的輕鏈和SEQ ID NO：147的重鏈；或SEQ ID NO：144的輕鏈和SEQ ID NO：149的重鏈；或SEQ ID NO：150的輕鏈和SEQ ID NO：151的重鏈；或SEQ ID NO：150的輕鏈和SEQ ID NO：153的重鏈。
在本發明的一些方面，該抗體包含嵌合抗體、CDR接枝抗體、人源化抗體或人抗體或其免疫反應性片段。在本發明的其他方面，該抗體(較佳的是包含上述序列的全部或部分)係內化抗體。在又其他實施方式中，所述抗體將包括位點特異性抗體。在其他所選實施方式中，本發明包括摻入任何前述抗體的抗體藥物軛合物。
在某些方面，本發明包括編碼本發明的抗KREMEN2抗體的核酸或其片段。在其他實施方式中，本發明包括包含一種或多種以上描述的核酸的載體或包含所述載體的宿主細胞。
如以上暗指的，本發明還提供了抗KREMEN2抗體藥物軛合物，其中如本文所揭露的抗體與有效載荷進行軛合。在一些方面，該抗體藥物軛合物或其藥學上可接受的鹽包括軛合、連接或以其他方式締合細胞毒性劑的單株抗體，其中該抗體結合人KREMEN2蛋白。在某些方面，本發明包括與hKREMEN2免疫優先締合或結合的ADC。本發明的相容性抗KREMEN2抗體藥物軛合物(ADC)通常可以包括式：Ab-[L-D]n或其藥學上可接受的鹽，其中a)Ab包括抗KREMEN2抗體；b)L包括視情況的接頭；c)D包括藥物；並且d)n係從約1到約20的整數。
在一方面，本發明的ADC包含如以上所述的那些抗KREMEN2抗體或其免疫反應性片段。在其他實施方式中，本發明的ADC包含細胞毒性化合物，該細胞毒性化合物選自放射性同位素、卡奇黴素(calicheamicin)、吡咯苯并二氮呯、苯并二氮呯衍生物、澳瑞他汀(auristatins)、多卡米新(duocarmycin)、美登木素生物鹼(maytansinoid)或本文所述的另外的治療性部分。在某些較佳的實施方式中，揭露的ADC將包含PBD。
進一步提供了包含如本文所揭露的抗KREMEN2 ADC的藥物組成物。在某些實施方式中，所述組成物將包含大於約50%、大於約60%、大於約70%、大於約80%、大於約90%或甚至大於約95%的所選藥物-抗體比(DAR)。在一些實施方式中所選DAR將是2，而在其他實施方式中所選DAR將是4，並且在其他實施方式中所選DAR將是6，並且在又其他實施方式中所選DAR將是8。
本發明的另一方面是一種治療癌症之方法，該方法包括向對有需要的受試者給予如本文所描述的那些藥物組成物。在某些方面，所述癌症包括血液系統惡性腫瘤，例如像急性骨髓性白血病或彌漫性大B細胞淋巴瘤。在其他方面，該受試者將患有實體瘤。關於這樣的實施方式，所述癌症較佳的是選自由以下各項組成之群組：腎上腺癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、乳癌、胃癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮癌、食管癌、結腸直腸癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌(小細胞肺癌和非小細胞肺癌兩者)、甲狀腺癌和神經膠質母細胞瘤。在某些實施方式中，該受試者將患有肺部鱗狀細胞癌(或鱗狀細胞肺癌)。在其他實施方式中，該受試者將患有乳癌，並且在某些實施方式中患有管腔上皮(luminal)B型乳癌。此外，在所選實施方式中，以上所描述的治療癌症的方法包括向受試者給予除了本發明的抗KREMEN2 ADC之外的至少一種另外的治療性部分。
在仍另一個實施方式中，本發明包括一種減少腫瘤細胞群中的腫瘤起始細胞的方法，其中該方法包括使腫瘤起始細 胞群與如本文所描述的ADC或抗體進行接觸(例如，體外或體內)，憑藉這個來降低腫瘤起始細胞的頻率。
在一方面，本發明包括一種將細胞毒素遞送到細胞中之方法，該方法包括使該細胞與以上所描述的ADC進行接觸。
在另一方面，本發明包括一種檢測、診斷或監測受試者中的癌症(例如，乳癌或鱗狀細胞肺癌)之方法，該方法包括以下步驟：使腫瘤細胞與KREMEN2檢測試劑進行接觸(例如，體外或體內)，並且檢測與所述腫瘤細胞締合的KREMEN2試劑。在所選實施方式中，該檢測試劑將包含抗KREMEN2抗體或與KREMEN2基因型決定因子締合的核酸探針。在本發明的這樣的方面中，該抗KREMEN2抗體可以包含SC78.29(SEQ ID NO：53的VL和SEQ ID NO：55的VH)或其免疫反應性片段。在相關實施方式中，該診斷方法將包括免疫組織化學(IHC)或原位雜交(ISH)。熟習該項技術者將進一步理解，這樣的KREMEN2檢測試劑可以用如以下所揭露的效應物、標記物或報導子進行標記或與其締合，並且使用多種標準體內成像技術(例如，MRI、CAT掃描、PET掃描等)中的任一種進行檢測。
類似地，本發明還提供了有用於診斷、監測或治療KREMEN2相關病症(如癌症)的套組(kit)或裝置及相關方法。為此，本發明較佳的是提供了一種有用於檢測、診斷或治療KREMEN2相關病症的製品，該製品包括含有KREMEN2 ADC的接受器(receptacle)及有關使用所述KREMEN2 ADC治療、監測或診斷該KREMEN2相關病症或為其提供給藥方案的指導材料。還提 供了用於將細胞毒素遞送至細胞中的套組。在所選實施方式中，所述裝置和相關方法將包括接觸至少一種循環腫瘤細胞的步驟。在其他實施方式中，所揭露的套組將包含說明書、標籤、插入物、閱讀器或指示該套組或裝置用於診斷、監測或治療KREMEN2相關癌症或為其提供給藥方案的類似物。
又其他方面涉及確定抗KREMEN2抗體藥物軛合物或其藥學上可接受的鹽的細胞毒性的方法。在一些方面，這樣的方法包括使癌細胞與該抗體藥物軛合物(例如，包含與細胞毒性劑軛合、連接或以其他方式締合的抗KREMEN2抗體的抗體藥物軛合物)進行接觸的步驟。一些方面進一步包括確定癌細胞被殺死的步驟。
前述係一種概述並因此，在必要時，含有簡化、概括及細節的省略；因此，熟習該項技術者將理解，該概述只是說明性的並且不旨在以任何方式進行限制。在此描述的方法、組成物和/或裝置和/或其他主題內容的其他方面、特徵及優勢將於在此所陳述的傳授內容中變得顯而易見。提供本概述從而以簡單的形式介紹概念的選擇，並在下面的詳細描述部分對其進一步描述。
圖1提供了蛋白質KREMEN2的帶注釋的胺基酸序列。
圖2顯示如使用對源自患者源性異種移植物(PDX)癌症幹細胞(CSC)和非腫瘤發生(NTG)細胞以及正常組織的 RNA進行全轉錄組(Illumina)定序而測量的KREMEN2的表現水平；圖3描繪了KREMEN2轉錄物的相對表現水平，如藉由在分離自正常組織和來自各種PDX腫瘤的RNA樣品中進行qRT-PCR所測量的；圖4顯示藉由在正常組織和各種PDX細胞系中進行微陣列雜交所測量的KREMEN2轉錄物表現的歸一化強度值；圖5顯示在來自癌基因組圖譜(TCGA)(一種公開可用的資料集)的正常組織和原發性腫瘤中的KREMEN2轉錄物的表現；圖6A-6J提供了鼠類抗KREMEN2抗體的帶注釋的胺基酸和核酸序列，其中圖6A和6B顯示示例性鼠類抗KREMEN2抗體的輕鏈(圖6A)和重鏈(圖6B)可變區的連續胺基酸序列(SEQ ID NO：21-81，奇數)，圖6C顯示編碼前述輕鏈和重鏈可變區的核酸序列(SEQ ID NO：20-80，偶數)，圖6D和6E分別描繪了抗KREMEN2抗體的人源化VL和VH結構域的胺基酸序列和核酸序列，圖6F顯示全長重鏈和輕鏈構建體的胺基酸序列，並且圖6G-6J描繪了SC78.9、SC78.43、SC78.56和SC78.59鼠類抗體的輕鏈和重鏈可變區的CDR，如使用Kabat、Chothia、ABM和Contact方法所確定的；圖7提供了示例性抗KREMEN2抗體的表格形式的同種型、分倉(binning)、親和性和交叉反應性特徵； 圖8顯示所選抗KREMEN2抗體可以干擾KREMEN2與其配位基DKK1的結合；圖9表明KREMEN2蛋白在許多PDX腫瘤細胞系的表面上表現。
圖10顯示KREMEN2在各種肺、卵巢和乳房PDX腫瘤細胞系上的表現水平，如藉由使用SC78.29抗體的免疫組織化學而測定的；圖11A-11C表明該KREMEN2蛋白在原發性患者卵巢(圖11A)、肺(圖11B)和乳房(圖11C)腫瘤中表現，如藉由使用SC78.29抗體的免疫組織化學而測定的；圖12A-12C顯示與同種型對照染色群體(實心灰色)相比，KREMEN2蛋白在NSCLC(圖12A)、卵巢(圖12B)或乳房(圖12C)、PDX CSC亞群(黑線)和NTG亞群(虛線)的表面上的表現，以及匯總該等群體的△MFI的表；圖13表明本發明的示例性KREMEN2抗體有效介導細胞毒性劑向KREMEN2+細胞的遞送和內化；圖14A和14B確定了，KREMEN2決定因子與示例性肺(圖14A)和卵巢(圖14B)PDX細胞系中的腫瘤起始細胞相關，如藉由使用FACS產生的KREMEN2+腫瘤發生細胞亞群重現當植入免疫缺陷小鼠中時的異種腫瘤所示；圖15A和15B表明，某些體細胞突變預言了KREMEN2在NSCLC PDX腫瘤細胞系(圖15A)中的表現並且PTCH 1突變預言了KREMEN2在各種PDX腫瘤細胞系(圖15B)中的表現；圖16圖解地說明KREMEN2抗體藥物軛合物在具有肺鱗狀細胞癌、乳癌和卵巢癌PDX的小鼠中產生持久的緩解；並且圖17顯示KREMEN2抗體藥物軛合物有效地耗盡肺鱗狀細胞癌PDX腫瘤中的癌症幹細胞群。
本發明能以許多不同的形式實施。本文揭露了本發明的非限制性的說明性實施方式，其例示了本發明的原理。在此使用的任何章節標題只是出於組織的目的，而不應被解釋為限制所描述的主題。除非另外指出，否則出於本揭露的目的，所有標識的序列登錄號都可以見於NCBI參考序列(RefSeq)資料庫和/或NCBI GenBank®檔案序列資料庫。
已經驚奇地發現，KREMEN2表型決定因子與各種增生性病症(包括瘤形成)臨床相關，並且KREMEN2蛋白及其變體或同種型提供可以用於治療相關疾病的有用腫瘤標記物。就這一點而言，本發明提供了抗體藥物軛合物，其包含工程化抗KREMEN2抗體靶向劑和細胞毒性有效載荷。如下面更詳細論述的和所附實例中所闡明的，所揭露的抗KREMEN2 ADC在消除腫瘤發生細胞方面特別有效，並且因此有用於某些增生性病症或其進展或復發的治療和預防。此外，所揭露的ADC組成物可以表現出當與包含相同組分的常規ADC組成物相比時相對較高的DAR=2百 分比和意外的穩定性，所述穩定性可以提供改進的治療指數。
另外，已經發現，KREMEN2標記物或決定因子(如細胞表面KREMEN2蛋白)在治療上與癌症幹細胞(又稱為腫瘤永存細胞)相關聯並且可以被有效地用於使癌症幹細胞消除或沈默。藉由使用如本文所揭露的抗KREMEN2軛合物選擇性減少或消除癌症幹細胞的能力係令人驚訝的，因為已知這樣的細胞一般對許多常規治療具有抗性。也就是說，傳統以及更近期的靶向治療方法的有效性經常受到抗性癌症幹細胞的存在和/或出現的限制，該等抗性癌症幹細胞甚至在面臨該等各樣的治療方法時也能夠保持腫瘤生長。另外，與癌症幹細胞相關聯的決定因子因表現量低或不一致、無法保持與腫瘤發生細胞的關聯或無法存在於細胞表面處而經常產生較弱的治療靶。與先前技術的傳授內容形成鮮明的對比，本揭露的ADC和方法有效地克服了這一固有的抗性並且特異性消除、耗竭、沈默該等癌症幹細胞或促進該等癌症幹細胞的分化，由此消除了它們持續或再誘導潛在腫瘤生長的能力。
因此，KREMEN2軛合物(如本文所揭露的那些)可以被有利地用於所選增生性(例如贅生性)病症或其進展或復發的治療和/或預防。應理解的是，儘管下文，特別是在特定結構域、區域或表位方面，或在包含神經內分泌特徵的癌症幹細胞或腫瘤及它們與所揭露的抗體藥物軛合物的相互作用的上下文中將廣泛地論述本發明的較佳的實施方式，但熟習該項技術者應理解的是，本發明的範圍不受該等示例性實施方式限制。相反地，本發明的最廣泛的實施方式和所附申請專利範圍廣泛地並且明確地針 對抗KREMEN2抗體和軛合物(包括本文所揭露的那些)以及它們在治療和/或預防多種KREMEN2相關或介導的病症(包括贅生性或細胞增生性病症)中的用途，不管任何特定的作用機制或特異性靶向的腫瘤、細胞組分或分子組分如何。
I. KREMEN2生理學
含Kringle結構域的跨膜蛋白2(KREMEN2，也稱為KRM2，標記眼和鼻子的含Kringle的蛋白質)係充當Dickkopf同系物1蛋白質(DKK1)的高親和力受體的49kDa蛋白質。KREMEN2與DKK1合作以形成具有LRP6(Wnt蛋白的輔助受體)的三元複合物，並且這一KREMEN2：DKK1：LRP6複合物被迅速內吞以從質膜上去除LRP6，這調節了Wnt傳訊(PMID：12050670)。代表性KREMEN2蛋白直系同源物包括但不限於，人(NP_757384)、黑猩猩(XP_009428528)、食蟹猴(XP_005591068)、大鼠(NP_001099237)和小鼠(NP_082692)。在人類中，該KREMEN2基因由跨越染色體16p13.3處的約4kBp的8個外顯子組成。人ASCL1基因座的轉錄產生編碼不同大小蛋白質(包括典型參考同種型)的替代性剪接的mRNA，所述剪接的mRNA由2068個核苷酸轉錄本(NM_172229)編碼，產生462個胺基酸的蛋白質(NP_757384，SEQ ID NO：1，圖1)。該蛋白質由以下構成：信號肽，隨後是由Kringle結構域、WSC結構域(推定的碳水化物結合結構域)和CUB結構域組成的胞外結構域，隨後是跨膜結構域和胞質尾區。誘變研究已經表明，每個胞外結構域都是與DKK1蛋白進行功能性相互作用並隨後抑制Wnt信號所必需的，如同膜錨定結 構域的存在一樣，而胞質尾區不是功能所必需的(PMID：120506705)。另外的剪接變體被報告在NCBI、UniProt和Ensemble中，其功能和生物相關性尚不清楚。
KREMEN2係顯示對DKK1、DKK2和DKK4(PMID：120506705，PMID：12527209)具有高親和力的細胞表面受體。KREMEN2與DKK1和LRP6進行複合以干擾LRP6與捲曲的胞外Wnt蛋白相互作用，這取消了胞內Wnt介導的Wnt/β-連環蛋白傳訊並進一步下調了表面LRP6(PMID：20543981)的表現。涉及KREMEN2的超表現和敲除實驗表明KREMEN2參與非洲爪蟾胚胎發生中的經由Wnt傳訊抑制進行的前後模式(PMID：12421700)。關於癌症，升高的KREMEN2表現已經報告發生在多發性骨髓瘤細胞系和患者中的骨基質細胞上，而分泌的DKK1可以參與作用於基質細胞以重建骨髓微環境的DKK-1：KREMEN2複合物(PMID：20846389)。細胞系和食管、結腸直腸、胰腺、胃癌以及其他胃腸道腫瘤的qRT-PCR和免疫組織化學實驗表明了KREMEN2在腫瘤和正常鄰近組織兩者中的一定表現，但KREMEN2不在該等適應症中的腫瘤中持續表現(PMID：1846165)。對經lemalidomide(FDA批准的免疫調節治療劑)體外和體內處理的結腸直腸細胞系進行的微陣列分析表明KREMEN2在體外被上調但在體內沒有被上調，並且表明該等結果的不一致可能是由於體內腫瘤微環境的免疫細胞浸潤和炎症反應所致(PMID：19597962)。在胰腺癌細胞系中，反義微小RNA MiR-29a對Wnt/β-連環蛋白傳訊的負向調控導致KREMEN2的表現增加，這敏化腫瘤細胞對吉西他濱(gemcitabine)的治療(PMID：23900458)。諸位發明人並未在文獻中發現表明 KREMEN2在非小細胞肺癌、乳癌或卵巢癌中的表現的任何報導。
II. 癌症幹細胞
根據當前模型，腫瘤包括非腫瘤發生細胞和腫瘤發生細胞。非腫瘤發生細胞不具有自我更新的能力並且不能可再生地形成腫瘤(甚至當以過量細胞數移植到免疫功能不全的小鼠中時)。腫瘤發生細胞，本文也稱為“腫瘤起始細胞”(TIC)具有形成腫瘤的能力，其通常構成腫瘤細胞群的0.01%-10%的分數。針對造血系統惡性腫瘤，TIC可以是非常罕見的，特別是在急性髓樣惡性腫瘤(AML)中在1：104至1：107範圍內，或者是非常充足的，例如在B細胞譜系的淋巴瘤中。腫瘤發生細胞涵蓋腫瘤永存細胞(TPC)(互換地稱為癌症幹細胞(CSC))和腫瘤祖細胞(TProg)兩者。
CSC，像在正常組織中支持細胞分類的正常幹細胞一樣，能夠無限自我複製同時保持多譜系(multilineage)分化的能力。就這一點而言，CSC能夠產生腫瘤發生的子代和非腫瘤發生的子代，並能夠完全重現親代腫瘤的異質細胞組成，如藉由連續的分離並將少數的分離的CSC移植到免疫功能不全的小鼠中所證明的。證據表明，除非該等“種子細胞”被消除，腫瘤才更可能轉移或重新出現，導致疾病的復發和最終進展。
TProg，像CSC一樣，具有給原代移植物中的腫瘤生長供給燃料的能力。然而，不像CSC，它們不能夠重現親代腫瘤的細胞異質性，並且在隨後的移植物中再起始腫瘤發生的效率較低，因為TProg通常只能夠進行有限數量的細胞分裂，如藉由將少 數的高度純化的TProg連續移植到免疫功能不全的小鼠中所證明的。TProg可以進一步分成早期TProg和晚期TProg，它們可以藉由表型(例如，細胞表面標記物)和重現腫瘤細胞架構的不同能力來區別。然而它們兩者都不能重現腫瘤至與CSC相同的程度，早期TProg具有比晚期TProg更大的重現親代腫瘤特徵的能力。儘管存在前述差別，但也已經顯示，一些TProg群在個別情況下可以得到通常歸因於CSC的自更新能力並且它們自身變為CSC。
CSC表現出更高的致瘤性，並且通常比以下相對更不活動：(i)TProg(早期和晚期TProg兩者)；和(ii)非腫瘤發生細胞，如終末分化腫瘤細胞和腫瘤浸潤細胞，例如，可以來源於CSC並且通常包含腫瘤塊的成纖維細胞/基質細胞、內皮細胞以及造血細胞。鑒於常規療法和方案在很大程度上已經被設計成使腫瘤減負荷並且迅速地攻擊增生性細胞，因此CSC比更快增生的TProg和其他塊狀腫瘤細胞群(如非腫瘤發生細胞)更耐受於常規療法和方案。可以使CSC相對地化學耐受於常規療法的其他特徵增加了多藥抗性轉運體的表現，增強了DNA修復機制及抗細胞凋亡基因表現。這樣的CSC性質已經被給晚期瘤患者提供持久響應的標準治療方案的失敗所牽連，因為標準的化學療法不能有效靶向實際上給持續的腫瘤生長和復發供給燃料的CSC。
已經驚奇地發現，KREMEN2表現以使腫瘤發生細胞亞群易感於如本文所陳述的治療的方式與各種腫瘤發生細胞亞群相關。本發明提供了抗KREMEN2抗體，其可以特別有用於靶向腫瘤發生細胞，並且可以用於沈默、敏化、中和、減少頻率、阻斷、 廢除、干擾、降低、阻礙、抑制、控制、耗盡、節制、調解、減少、重新程式設計、消除、殺死或以其他方式抑制(統稱為“抑制”)腫瘤發生細胞，從而促進增生性病症(例如，癌症)的治療、管理和/或預防。有利地，可以選擇本發明的抗KREMEN2抗體，因此，無論KREMEN2決定因子的形式(例如，表型的或基因型的)如何，它們較佳的是在給予於受試者後降低腫瘤發生細胞的頻率或致瘤性。腫瘤發生細胞頻率的降低可以因以下原因而發生：(i)腫瘤發生細胞的抑制或根除；(ii)控制腫瘤發生細胞的生長、擴增或復發；(iii)干擾腫瘤發生細胞的起始、繁殖、維持或增生；或(iv)藉由其他方式妨礙腫瘤發生細胞的存活、再生和/或轉移。在一些實施方式中，腫瘤發生細胞的抑制可以由於一個或多個生理途徑的改變而發生。該途徑的改變，無論是藉由腫瘤發生細胞的抑制或消除、其潛能的修飾(例如，藉由誘導的分化或小生境破壞)或以其他方式干擾腫瘤發生細胞影響腫瘤環境或其他細胞的能力，允許藉由抑制腫瘤發生、腫瘤維持和/或轉移及復發來進行KREMEN2相關病症的更有效治療。應進一步理解的是，所揭露的抗體的相同特徵使得它們在治療復發性腫瘤方面特別有效，所述復發性腫瘤已經證實對標準治療方案具有抗性或難治性。
可以用於評估腫瘤發生細胞的頻率降低的方法包括但不限於細胞計數分析或免疫組織化學分析，較佳的是藉由體外或體內有限稀釋分析進行(Dylla等人2008,PMID：PMC2413402和Hoey等人2009,PMID：19664991)。
可以藉由將分級或未分級的腫瘤細胞(例如，分別來自治療或未治療的腫瘤)在培育菌落形成的固體培養基上培養，並計數和表徵生長的菌落來進行體外有限稀釋分析。可替代地，可以將腫瘤細胞連續稀釋到含有液體培養基的平板的孔中，並且可以在接種後的任何時間，但較佳的是在接種後10天以上，將每個孔針對菌落形成評分為呈陽性或陰性。
藉由將來自未處理的對照或來自暴露於所選治療劑的腫瘤的腫瘤細胞以連續稀釋液移植到免疫功能不全的小鼠中並隨後將每一小鼠針對腫瘤形成評分為呈陽性或陰性來進行體內有限稀釋。該評分可以發生在植入的腫瘤係可檢測的之後的任何時間，但較佳的是在移植後60天或以上進行該評分。使用泊松分佈統計學或評估預先確定的確定性事件(如在體內產生或不產生腫瘤的能力)的頻率，較佳的是對確定腫瘤發生細胞的頻率的有限稀釋實驗的結果進行分析(Fazekas等人，1982，PMID：7040548)。
流式細胞測量術和免疫組織化學還可以用於確定腫瘤發生細胞頻率。這兩種技術使用一種或多種抗體或試劑，它們結合已知富集腫瘤發生細胞的領域認可的細胞表面蛋白或標記物(參見WO 2012/031280)。如本領域已知的，流式細胞測量術(例如，螢光啟動細胞分選術(FACS))還可以用於表徵、分離、純化、富集或分選包括腫瘤發生細胞的各種細胞群。流式細胞測量術藉由穿過流體流(其中細胞的混合群係懸浮的)，藉由能夠測量每秒多達數千顆粒的物理和/或化學特徵的電子檢測裝置而測量腫瘤發生細胞水平。免疫組織化學提供了以下另外的資訊，它使得 藉由用與腫瘤發生細胞標誌物結合的經標記的抗體或試劑染色組織樣品而使腫瘤發生細胞原位視覺化(例如，在組織切片中)成為可能。
因此，藉由以下方法，例如像流式細胞測量術、磁啟動細胞分選術(MACS)、雷射介導的切片或FACS，本發明的抗體可以用於鑒定、表徵、監測、分離、切片或富集腫瘤發生細胞群或亞群。FACS係用於以基於特定細胞表面標記物的大於99.5%的純度分離細胞亞群的可靠方法。用於表徵和操縱腫瘤發生細胞(包括CSC)的其他相容性技術例如可以見於U.S.P.N.12/686,359、12/669,136和12/757,649中。
以下列出的是與CSC群相關的並且已用於分離或表徵CSC的標誌物：ABCA1、ABCA3、ABCB5、ABCG2、ADAM9、ADCY9、ADORA2A、ALDH、AFP、AXIN1、B7H3、BCL9、Bmi-1、BMP-4、C20orf52、C4.4A、羧肽酶M、CAV1、CAV2、CD105、CD117、CD123、CD133、CD14、CD16、CD166、CD16a、CD16b、CD2、CD20、CD24、CD29、CD3、CD31、CD324、CD325、CD33、CD34、CD38、CD44、CD45、CD46、CD49b、CD49f、CD56、CD64、CD74、CD9、CD90、CD96、CEACAM6、CELSR1、CLEC12A、CPD、CRIM1、CX3CL1、CXCR4、DAF、飾膠蛋白聚糖(decorin)、easyh1、easyh2、EDG3、EGFR、ENPP1、EPCAM、EPHA1、EPHA2、FLJ10052、FLVCR、FZD1、FZD10、FZD2、FZD3、FZD4、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、GD2、GJA1、GLI1、GLI2、GPNMB、GPR54、GPRC5B、HAVCR2、IL1R1、IL1RAP、JAM3、Lgr5、Lgr6、LRP3、 LY6E、MCP、mf2、mllt3、MPZL1、MUC1、MUC16、MYC、N33、NANOG、NB84、NES、NID2、NMA、NPC1、OSM、OCT4、OPN3、PCDH7、PCDHA10、PCDHB2、PPAP2C、PTPN3、PTS、RARRES1、SEMA4B、SLC19A2、SLC1A1、SLC39A1、SLC4A11、SLC6A14、SLC7A8、SMARCA3、SMARCD3、SMARCE1、SMARCA5、SOX1、STAT3、STEAP、TCF4、TEM8、TGFBR3、TMEPAI、TMPRSS4、TFRC、TRKA、WNT10B、WNT16、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT5A、YY1以及CTNNB1。參見，例如，Schulenburg等人，2010，PMID：20185329；U.S.P.N.7,632,678以及U.S.P.N.2007/0292414、2008/0175870、2010/0275280、2010/0162416和2011/0020221。
類似地，與某些腫瘤類型的CSC相關聯的細胞表面表型的非限制性實例包括CD44hiCD24low、ALDH+、CD133+、CD123+、CD34+CD38-、CD44+CD24-、CD46hiCD324+CD66c-、CD133+CD34+CD10-CD19-、CD138-CD34-CD19+、CD133+RC2+、CD44+α2β1 hiCD133+、CD44+CD24+ESA+、CD271+、ABCB5+以及本領域中已知的其他CSC表面表型。參見，例如，Schulenburg等人，2010，同上文；Visvader等人，2008，PMID：18784658以及U.S.P.N.2008/0138313。關於本發明特別感興趣的是CSC製劑，其包含實體瘤中的CD46hiCD324+表型和白血病中的CD34+CD38-。
當其應用於標記物或標記表型時，“陽性”、“低”和“陰性”表現水平如下所定義。具有陰性表現(即“-”)的細胞在此處定義為在另外的螢光發射通道中存在用於其他感興趣的蛋白質的完全抗體染色混合物標記的情況下，表現小於或等於螢 光通道中用同種型對照抗體所觀察到的第95個百分位數表現的那些細胞。熟習該項技術者將理解的是，這種用於定義陰性事件的方法稱作“螢光扣除(fluorescence minus one)”或“FMO”染色法。在此將其表現大於使用上述FMO染色程序的用同種型對照抗體所觀察到的第95百分位數表現的細胞定義為“陽性”(即“+”)。如在此定義的，存在著寬泛定義為“陽性”的各種細胞群。如果平均觀察到的抗原的表現高於使用用如上所述同種型對照抗體進行FMO染色所測定的第95個百分位數，則將細胞定義為陽性。如果平均觀察到的表現高於藉由FMO染色所測定的第95個百分位數並且在第95個百分位數的一個標準差內，則可以將陽性細胞稱為具有低表現(即“lo”)的細胞。可替代地，如果平均觀察到的表現高於藉由FMO染色所測定的第95個百分位數並且比第95個百分位數大一個標準差以上，則可以將陽性細胞稱為具有高表現(即“hi”)的細胞。在其他實施方式中，第99百分位數可以較佳的是用作在陰性與陽性FMO染色之間的分界點並且在一些實施方式中，這個百分位數可以大於99%。
該CD46hiCD324+或CD34+CD38-標記表型和以上剛剛例證的那些可以與標準流式細胞分析和細胞分選技術聯合使用以表徵、分離、純化或富集TIC和/或TPC細胞或細胞群，用於進一步分析。
因此，可以使用以上所述的技術和標記物來確定本發明的抗體降低腫瘤發生細胞的頻率的能力。在一些情況下，該抗KREMEN2抗體可以使腫瘤發生細胞的頻率降低10%、15%、 20%、25%、30%或甚至35%。在其他實施方式中，腫瘤發生細胞的頻率的降低可以大約為40%、45%、50%、55%、60%或65%。在某些實施方式中，所揭露的化合物可以使腫瘤發生細胞的頻率降低70%、75%、80%、85%、90%或甚至係95%。應理解的是，腫瘤發生細胞的頻率的任何降低都可能導致瘤形成的腫瘤發生、持續、復發及侵襲性的相應降低。
III. 抗體
A. 抗體結構
包括接受的命名和編號系統的抗體及其變體和衍生物已經廣泛描述於例如Abbas等人(2010),Cellular and Molecular Immunology(6th Ed.),W.B.Saunders Company[細胞和分子免疫學，第6版，W.B.桑德公司]；或Murphey等人(2011),Janeway’s Immunobiology(8th Ed.),Garland Science[簡氏免疫生物學，第8版，加蘭德科學出版社]中。
“抗體”或“完整抗體”典型是指包含藉由共價二硫鍵和非共價相互作用保持在一起的兩條重(H)多肽鏈和兩條輕(L)多肽鏈的Y型四聚蛋白。每條輕鏈由一個可變結構域(VL)和一個恒定結構域(CL)組成。每條重鏈包含一個可變結構域(VH)和恒定區，在IgG、IgA和IgD抗體的情形中，該恒定區包含稱為CH1、CH2和CH3的三個結構域(IgM和IgE具有第四結構域CH4)。在IgG、IgA和IgD類別中，CH1和CH2結構域被柔性鉸鏈區分離，該鉸鏈區係可變長度(在各種IgG亞類中從約10至約60個胺基酸)的富含脯胺酸和半胱胺酸的區段。輕鏈和重鏈兩者中的可變結構 域藉由約12個或更多個胺基酸的“J”區連接到恒定結構域，並且重鏈還具有約10個另外的胺基酸的“D”區。每類抗體進一步包含由配對半胱胺酸殘基形成的鏈間和鏈內二硫鍵。
如在此使用的，術語“抗體”包括多株抗體(polyclonal antibodies)、多株抗體(multiclonal antibodies)、單株抗體、嵌合抗體、人源化抗體及靈長類化抗體、CDR接枝抗體、人抗體(包括重組產生的人抗體)、重組產生的抗體、胞內抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、單價抗體、多價抗體、抗獨特型抗體、合成抗體(包括突變蛋白及其變體)；免疫特異性抗體片段，如Fd、Fab、F(ab')2、F(ab')片段、單鏈片段(例如ScFv和ScFvFc)；及其衍生物，包括Fc融合物和其他修飾，及任何其他免疫活性分子，只要它展現與決定因子的優先締合或結合即可。另外，除非上下文約束另外規定，否則該術語另外包含抗體的所有類別(即，IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)及所有亞類(即，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)。對應於不同類別的抗體的重鏈恒定結構域典型地分別由相應的小寫希臘字母α、δ、ε、γ和μ表示。來自任何脊椎動物物種的抗體的輕鏈基於其恒定結構域的胺基酸序列可以被分配到兩種明顯相異的類型之一，稱為κ和λ。
抗體的可變結構域顯示出從一種抗體到另一種抗體的胺基酸組成的顯著變化，並且主要負責抗原識別和結合。每個輕鏈/重鏈對的可變區形成抗體結合位點，使得完整的IgG抗體具有兩個結合位點(即它係二價的)。VH和VL結構域包含具有極端變異性的三個區域，其被稱為高變區，或更通常地，其被稱為互 補決定區(CDR)，由稱為框架區(FR)的四個較少可變區框架化和分離。VH和VL區之間的非共價締合形成Fv片段(對於“片段變數”)，其含有抗體的兩個抗原結合位點之一。
如在此所使用，胺基酸與每個結構域、框架區和CDR的分配可以根據由Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(5th Ed.),US Dept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH Publication no.91-3242[具有免疫學興趣的蛋白的序列(第5版)，美國健康與人類服務部，PHS，NIH，NIH公開號91-3242]；Chothia等人，1987,PMID：3681981；Chothia等人，1989,PMID：2687698；MacCallum等人，1996,PMID：8876650；或Dubel編(2007)Handbook of Therapeutic Antibodies,3rd Ed.,Wily-VCH Verlag GmbH and Co or AbM(Oxford Molecular/MSI Pharmacopia)[治療性抗體手冊，第3版，德國威利出版公司或AbM(牛津大學分子/MSI藥典)]提供的方案之一進行，除非另有注解。如本領域所熟知的，通常如Chothia或Kabat中所陳述的進行可變區殘基編號。以下表1中示出了包含由Kabat、Chothia、MacCallum(也稱為Contact)定義的CDR的胺基酸殘基和從阿拜斯(Abysis)網站資料庫(下文)獲得的AbM。請注意，MacCallum使用Chothia編號系統。
抗體序列中的可變區和CDR可以根據本領域已經開發的一般規則(如以上所示出的，例如Kabat編號系統)或藉由將序列與已知可變區的資料庫比對來鑒定。用於鑒定該等區域的方法描述於Kontermann和Dubel編，Antibody Engineering,Springer,New York,NY,2001[抗體工程，施普林格，紐約州紐約，2001]和Dinarello等人，Current Protocols in Immunology,John Wiley and Sons Inc.,Hoboken,NJ[當前免疫學方案，約翰˙威利父子出版公司，新澤西州霍博肯市，2000]中。抗體序列的示例性資料庫描述於“阿拜斯”網站(www.bioinf.org.uk/abs)(由A.C.Martin在英國倫敦的倫敦大學生物化學和分子生物學學院維護)和VBASE2網站(www.vbase2.org)中，並可藉由其進行訪問，如Retter等人，Nucl Acids Res,33(Database issue)：D671-D674(2005)[核酸研究，33(資料庫發行號)：D671-D674(2005)]所述的。
較佳的是，使用阿拜斯資料庫分析該等序列，該阿拜斯資料庫將來自Kabat、IMGT和蛋白質資料庫(Protein Data Bank，PDB)的序列數據與來自PDB的結構數據進行整合。參見Andrew C.R.Martin博士的書，章節Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains[抗體可變區的蛋白質序列和結構分析].於Antibody Engineering Lab Manual[抗體工程實驗室手冊](Ed.：Duebel,S.and Kontermann,R.,Springer-Verlag,Heidelberg,ISBN-13：978-3540413547[編輯：Duebel,S.和 Kontermann,R.，施普林格出版社，海德堡，ISBN-13：978-3540413547]，也可在網站bioinforg.uk/abs上獲得)。阿拜斯資料庫網站還包括已經開發用於鑒定可以根據此處的傳授內容使用的CDR的一般規則。附圖6G-6J在SC78.9、SC78.43、SC78.56和SC78.59抗體的示例性重鏈和輕鏈可變區的注釋中顯示這種分析的結果。除非另有說明，此處陳述的所有CDR均根據Kabat等人的阿拜斯資料庫網站獲得。
對於本發明中論述的重鏈恒定區胺基酸位置，編號係根據Edelman等人，1969,Proc,Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]63(1)：78-85中首先描述的Eu索引進行的，描述了骨髓瘤蛋白質Eu的胺基酸序列(據報導它係第一個被定序的人類IgG1)。Edelman的Eu索引還陳述於Kabat等人，1991(同上)中。因此，“如Kabat中陳述的Eu索引”或“Kabat的Eu索引”或“Eu索引”或“Eu編號”在重鏈上下文中是指基於如Kabat等人，1991(同上)所陳述的Edelman等人的人類IgG1 Eu抗體的殘基編號系統。類似地，用於輕鏈恒定區胺基酸序列的編號系統陳述於Kabat等人(同上)中。與本發明相容的示例性κ(SEQ ID NO：5)和λ(SEQ ID NO：8)輕鏈恒定區胺基酸序列緊接著在以下陳述： (SEQ ID NO：5)。
(SEQ ID NO：8)。
類似地，與本發明相容的示例性IgG1重鏈恒定區胺基酸序列緊接著在以下陳述： (SEQ ID NO：2)。
熟習該項技術者將理解的是，可以使用標準分子生物學技術將這樣的重鏈和輕鏈恒定區序列(無論野生型的(例如，參見SEQ ID NO：2、5或8)或是如本文所揭露的被工程化以提供未配對的半胱胺酸的(例如，參見SEQ ID NO：3、4、6、7、9或10))可操作地與所揭露的重鏈和輕鏈可變區締合，以提供可以摻入本發明的KREMEN2抗體藥物軛合物中的全長抗體。包含本發明的所選抗體的全長重鏈和輕鏈的序列示於附圖6F中。
免疫球蛋白分子中有兩種類型的二硫橋或鍵：鏈間和鏈內二硫鍵。如本領域所熟知的，鏈內二硫鍵的位置和數量根據免疫球蛋白類別和種類而變化。雖然本發明不限於抗體的任何特定類別或亞類，但出於說明目的，貫穿本揭露應使用IgG1免疫球蛋白。在野生型IgG1分子中，存在十二個鏈內二硫鍵(每條重 鏈上四個以及每條輕鏈上兩個)和四個鏈間二硫鍵。鏈內二硫鍵通常在一定程度上受到保護，並且比鏈間鍵相對不易受還原影響。相反地，鏈間二硫鍵位於免疫球蛋白的表面，可到達溶劑，並且通常相對較易還原。兩個鏈間二硫鍵存在於重鏈之間，並且各自從一條重鏈連向其相應輕鏈。已經證明，鏈間二硫鍵對於鏈締合不是必需的。該IgG1鉸鏈區含有在重鏈中的形成鏈間二硫鍵的半胱胺酸，所述鏈間二硫鍵提供結構支持以及促進Fab移動的靈活性。該重/重IgG1鏈間二硫鍵位於殘基C226和C229(Eu編號)處，而IgG1(重/輕)的輕鏈和重鏈之間的IgG1鏈間二硫鍵在κ或λ輕鏈的C214和重鏈的上部鉸鏈區中的C220之間形成。
B. 抗體生成和產生
可以使用本領域已知的各種方法來生產本發明的抗體。
1. 在宿主動物中多株抗體的生成
在各種宿主動物中多株抗體的生產係本領域熟知的(參見例如，Harlow和Lane(編輯)(1988)Antibodies：A Laboratory Manual,CSH Press[抗體：實驗室手冊，CSH出版社]；以及Harlow等人(1989)Antibodies,NY,Cold Spring Harbor Press[抗體，紐約，冷泉港出版社])。為了生成多株抗體，將免疫活性動物(例如，小鼠、大鼠、兔、山羊、非人靈長類動物等)用抗原性蛋白或包含抗原性蛋白的細胞或製劑進行免疫。在一段時間之後，藉由對該動物進行抽血或將其處死來獲得含有多株抗體的血清。該血清能以從該動物獲得的形式使用，或該抗體可以部分地或完全地純化以提供免疫球蛋白級分或分離的抗體製劑。
就這一點而言，本發明的抗體可以從任何KREMEN2決定因子產生，該KREMEN2決定因子誘導免疫活性動物中的免疫應答。如在此所使用，“決定因子”或“靶標”意指與特定細胞、細胞群或組織可鑒定地締合或在其中或其上明確發現的任何可檢測的性狀、特性、標記物或因子。決定因子或靶標可以是形態性的、功能性的或生物化學性的，並且較佳的是表型性的。在較佳的實施方式中，決定因子係由特定細胞類型或由細胞在某些條件下(例如在該細胞週期或在特定小生境中的細胞的特定時點期間)有差別地表現(過表現或低表現)的蛋白質。出於本發明的目的，決定因子較佳的是在異常癌細胞上差異表現，並且可以包含KREMEN2蛋白或其任何剪接變體、同種型、同系物或家族成員，或者其特異性結構域、區域或表位。“抗原”、“免疫原性決定因子”、“抗原決定因子”或“免疫原”意指當引入免疫活性動物時可刺激免疫應答，並被由免疫應答產生的抗體識別的任何KREMEN2蛋白或其任何片段、區域或結構域。可使用在此涵蓋的KREMEN2決定因子的存在或不存在來鑒定細胞、細胞亞群或組織(例如腫瘤、腫瘤發生細胞或CSC)。
任何形式的抗原或含有該抗原的細胞或製劑都可以用於生成對KREMEN2決定因子具有特異性的抗體。如在此所陳述的，術語“抗原”在廣義上使用，並且可以包括所選靶標的任何免疫原性片段或決定因子，包括單表位、多表位、單或多結構域、或完整的胞外結構域(ECD)或蛋白質。該抗原可以是分離的全長蛋白質、細胞表面蛋白(例如，用在其表面上表現至少一部分抗原的細胞進行免疫的)、或可溶性蛋白質(例如，僅用該蛋白質 的ECD部分進行免疫的)或蛋白質構建體(例如，Fc抗原)。該抗原可以在基因修飾的細胞中產生。前述任何抗原可以單獨或與本領域已知的一種或多種免疫原性增強佐劑組合使用。編碼該抗原的DNA可以是基因組的或非基因組的(例如，cDNA)，並且可以編碼足以引起免疫原性應答的至少一部分ECD。可以使用任何載體來轉化其中表現抗原的細胞，所述載體包括但不限於腺病毒載體、慢病毒載體、質粒以及非病毒載體如陽離子脂質。
2. 單株抗體
在所選實施方式中，本發明考慮到單株抗體的使用。如本領域中所知，術語“單株抗體”或“mAb”係指從基本均質的抗體群獲得的一種抗體，即，構成該群體的單個抗體除可能以微量存在的可能的突變(例如，天然存在的突變)外是一致的。
單株抗體可以使用本領域中已知的多種技術製備，包括雜交瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術、轉基因動物(例如，XenoMouse®)或其某一組合。例如，可以使用雜交瘤以及生物化學和遺傳工程技術來產生單株抗體，如以下各項中更詳細地描述：An,Zhigiang(編輯)Therapeutic Monoclonal Antibodies：From Bench to Clinic[治療性單株抗體：從工作臺到診所]，John Wiley and Sons[約翰威立公司]，第1版，2009；Shire等人(編輯)Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing[當前單株抗體開發和製造的趨勢]，Springer Science+Business Media LLC[施普林格科學+商業媒體有限責任公司]，第1版，2010； Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual[抗體：實驗手冊]，Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港實驗室出版社]，第2版，1988；Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas[單株抗體及T細胞雜交瘤]563-681(紐約愛思唯爾公司(Elsevier,N.Y.)，1981)。產生多個與決定因子特異性結合的單株抗體之後，基於例如其對決定因子的親和力或內化速率，可以藉由各種篩選方法選擇特別有效的抗體。如在此所述產生的抗體可以用作“源”抗體並且進一步被修飾以，例如，改善對靶標的親和力，改善其在細胞培養中的產量，降低體內的免疫原性，創建多特異性構建體等。單株抗體生產和篩選的更詳細描述示於以下以及所附實例中。
3. 人抗體
在另一個實施方式中，該等抗體可以包含完全人抗體。術語“人抗體”係指這樣一種抗體，它具有對應於由人類產生的抗體的胺基酸序列的一個胺基酸序列和/或已經使用任何用於製備以下所述的人抗體的技術來產生。
人抗體可以使用本領域中已知的各種技術產生。一項技術係噬菌體展示，其中在噬菌體上合成(較佳的是人)抗體的文庫，用所關注抗原或其抗體結合部分對該文庫進行篩選，並且分離出結合該抗原的噬菌體，由此可以獲得免疫反應性片段。用於製備並篩選該等文庫的方法係本領域中眾所周知的並且用於產生噬菌體展示文庫的套組係可商購的(例如，法瑪西亞重組噬菌體抗體系統(Pharmacia Recombinant Phage Antibody System)， 目錄號27-9400-01；以及Stratagene SurfZAPTM噬菌體展示套組，目錄號240612)。還存在可以用於產生並篩選抗體展示文庫的其他方法和試劑(參見例如，U.S.P.N.5,223,409；PCT公開號WO 92/18619、WO 91/17271、WO 92/20791、WO 92/15679、WO 93/01288、WO 92/01047、WO 92/09690；以及Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]88：7978-7982(1991))。
在一個實施方式中，可以藉由對如以上製備的重組的組合抗體文庫進行篩選來分離重組人抗體。在一個實施方式中，該文庫係使用由從B細胞分離的mRNA製備的人VL和VH cDNA產生的scFv噬菌體展示文庫。
由天然文庫(天然或合成的)產生的抗體可以具有適度親和力(Ka為約106到107M-1)，但也可以如本領域中所描述，藉由構建第二文庫並從其中再選擇，在體外模擬親和力成熟。例如，可以在體外藉由使用易錯聚合酶隨機引入突變(報導於Leung等人，Technique[技術]，1：11-15(1989)中)。另外地，可以藉由在所選的單個Fv殖株中，例如使用以帶有跨所關注CDR的隨機序列的引物進行的PCR使一個或多個CDR隨機突變，並針對更高親和力的選殖進行篩選來進行親和力成熟。WO 9607754描述了一種用於在免疫球蛋白輕鏈的CDR中誘導誘變以建立輕鏈基因文庫之方法。另一種有效的方法係將藉由噬菌體展示所選擇的VH或VL結構域與自未免疫接種的供體獲得的天然存在的V結構域變體譜系重組並在若干輪鏈重新改組中針對更高親和力進行篩選，如Marks等人，Biotechnol.[生物技術]，10：779-783(1992)中所描述。這一 技術允許產生具有約10-9M或更低的解離常數KD(koff/kon)的抗體和抗體片段。
在其他實施方式中，可以採用類似的程序，使用包含在其表面上表現結合對的真核細胞(例如酵母)的文庫。參見例如，U.S.P.N.7,700,302和U.S.S.N.12/404,059。在一個實施方式中，人抗體選自噬菌體文庫，其中該噬菌體文庫表現人抗體(Vaughan等人，Nature Biotechnology[自然-生物技術]14：309-314(1996)：Sheets等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美國國家科學院院刊]95：6157-6162(1998))。在其他實施方式中，人類結合對可以從在如酵母等真核細胞中產生的組合抗體文庫分離。參見例如，U.S.P.N.7,700,302。該等技術有利地允許進行大量候選調節劑的篩選並且提供對候選序列的相對容易的操作(例如，藉由親和力成熟或重組改組)。
還可以藉由將人類免疫球蛋白基因座引入轉基因動物中來製備人抗體，該等轉基因動物例如為已經使內源免疫球蛋白基因部分地或完全地失活並且引入了人類免疫球蛋白基因的小鼠。在激發之後，觀察到人抗體的產生，這在所有方面都緊密地類似於在人類中所見，包括基因重排、組裝及抗體譜系(repertoire)。這一方法描述於例如U.S.P.N.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；及關於XenoMouse®技術的U.S.P.N.6,075,181和6,150,584；以及Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.[國際免疫學評述]13：65-93(1995)中。可替代地，可以經由產生針對靶抗原的抗體的人類B淋巴細胞 (該等B淋巴細胞可以從罹患贅生性病症的個體回收或可以是已經在體外進行免疫接種的)的永生化來製備人抗體。參見例如，Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy[單株抗體和癌症療法]，Alan R.Liss，第77頁(1985)；Boerner等人，J.Immunol[免疫學雜誌]，147(1)：86-95(1991)；以及U.S.P.N.5,750,373。
無論來源，應理解的是，人抗體序列可以使用領域已知的分子工程技術來製造並引入如本文所述的表現系統和宿主細胞中。這樣的非天然的重組產生的人抗體(和受試者組成物)係與本揭露的傳授內容完全相容的並明確地保持在本發明的範圍內。在某些所選方面，本發明的KREMEN2 ADC將包含充當細胞結合劑的重組產生的人抗體。
4. 衍生抗體：
一旦如上所述產生、選擇並分離源抗體，則它們進一步被改變以提供具有改進的藥學特徵的抗KREMEN2抗體。較佳的是，使用已知的分子工程技術來修飾或改變所述源抗體以提供具有所希望的治療特性的衍生抗體。
4.1. 嵌合和人源化抗體
本發明的所選實施方式包含免疫特異性結合KREMEN2的鼠類單株抗體，並且其可以被認為係“源”抗體。在所選實施方式中，本發明的抗體可以藉由對源抗體的恒定區和/或表位結合胺基酸序列的視情況修飾從這樣的“源”抗體衍生。在某些實施方式中，如果源抗體中所選擇的胺基酸藉由缺失、突變、 取代、整合或組合而改變，則抗體係從源抗體“衍生的”。在另一個實施方式中，“衍生”抗體係其中源抗體(例如，一個或多個CDR或結構域或整個重鏈和輕鏈可變區)的片段與受體抗體序列組合或併入其中以提供衍生抗體(例如嵌合、CDR接枝或人源化抗體)的一種抗體。可以使用來自產抗體的細胞的遺傳物質和如下所描述的標準分子生物技術來產生該等“衍生”抗體，例如像，以改善對決定因子的親和力；以改善抗體穩定性；以改善細胞培養的產量和產率；以降低體內的免疫原性；以減少毒性；以促進活性部分的軛合；或以產生多特異性抗體。此類抗體也可以藉由化學手段或翻譯後修飾來修飾成熟分子(例如糖基化模式或聚乙二醇化)而衍生自源抗體。
在一個實施方式中，本發明的抗體包含嵌合抗體，該等嵌合抗體衍生自來自已經共價接合的至少兩種不同物種或類別的抗體的蛋白質區段。術語“嵌合”抗體係針對這樣的構建體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與來自特定物種的或屬於特定抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而這個或該等鏈的剩餘部分與來自另一物種的或屬於另一個抗體類別或亞類的抗體、以及這類抗體的片段中的相應序列相同或同源(U.S.P.N.4,816,567)。在一些實施方式中，本發明的嵌合抗體可以包含與人輕鏈和重鏈恒定區可操作地連接的全部或大多數的所選鼠類重鏈和輕鏈可變區。在其他所選實施方式中，抗KREMEN2抗體可以“衍生”自本文所揭露的小鼠抗體並且包含比全部重鏈和輕鏈可變區更少的重鏈和輕鏈可變區。
在又其他實施方式中，本發明的嵌合抗體係“CDR-接枝”抗體，其中所述CDR(如使用Kabat、Chothia、McCallum等所定義的)衍生自特定物種或屬於特定抗體類別或亞類，同時抗體的剩餘部分大部分衍生自來自另一物種的或屬於另一抗體類別或亞類的抗體。對於用於人類中，一種或多種所選齧齒動物CDR(例如小鼠CDR)可以移植到人類受體抗體中，替代該人抗體的一個或多個天然存在的CDR。該等構建體一般具有以下益處：提供全強度的人抗體功能(例如，補體依賴性細胞毒性(CDC)和抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC))，同時減少了受試者對該抗體的不想要的免疫應答。在一個實施方式中，所述CDR接枝抗體將包含從摻入人框架序列的小鼠獲得的一種或多種CDR。
與該CDR接枝抗體類似的是“人源化”抗體。如本文所用，“人源化”抗體係包含衍生自一種或多種非人抗體(供體抗體或源抗體)的一種或多種胺基酸序列(例如CDR序列)的人抗體(受體抗體)。在某些實施方式中，“回復突變”可以引入到人源化抗體中，其中受體人抗體的可變區的一個或多個FR中的殘基被來自非人物種供體抗體的相應殘基替換。這樣的回復突變可以有助於保持一種或多種接枝CDR的適當三維組態並因此改進親和性和抗體穩定性。可以使用來自各種供體物種的抗體，該等供體物種包括但不限於小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物。另外，人源化抗體可以包含在受體抗體中或在供體抗體中未發現的新殘基，以例如進一步改善抗體性能。可以如以下實例中所陳述提供與本發明相容的CDR接枝和人源化抗體，所述抗體包含來自源抗體的鼠類組分和來自受體抗體的人類組分。
可以使用各種領域認可的技術來檢測哪些人類序列用作受體抗體，以提供根據本發明的人源化構建體。相容人類種系序列的合集和檢測它們作為受體序列的適合性的方法例如揭露於Dubel和Reichert(編輯)(2014)Handbook of Therapeutic Antibodies,2nd Edition,Wiley-Blackwell GmbH[治療性抗體手冊，第2版，威利-布萊克威爾股份有限公司]；Tomlinson,I.A.等人(1992)J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]227：776-798；Cook,G.P.等人(1995)Immunol.Today[今日免疫學]16：237-242；Chothia,D.等人(1992)J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]227：799-817；以及Tomlinson等人(1995)EMBO J[歐洲分子生物學學會雜誌]14：4628-4638中。V-BASE名錄(VBASE2-Retter等人，Nucleic Acid Res.[核酸研究]33；671-674,2005)，其提供了人類免疫球蛋白可變區序列的一個全面名錄(由Tomlinson,I.A.等人彙編，MRC Centre for Protein Engineering,Cambridge,UK[MRC蛋白質工程中心，英國劍橋])，可以用來鑒定相容受體序列。因此，描述於例如U.S.P.N.6,300,064中的共有人框架序列還可以被證明係相容的受體序列並且可以根據本傳授內容而使用。一般而言，根據與鼠類來源框架序列的同源性以及對來源抗體和受體抗體的CDR標準結構的分析來選擇人框架受體序列。然後可以使用領域認可的技術來合成衍生抗體的重鏈和輕鏈可變區的衍生序列。
舉例來說，CDR接枝和人源化抗體以及相關方法描述於U.S.P.N.6,180,370和5,693,762中。有關進一步細節，參見例如，Jones等人，1986(PMID：3713831)；以及U.S.P.N.6,982,321和7,087,409。
CDR接枝或人源化抗體可變區與人類受體可變區的序列同一性或同源性可以如本文所論述的進行測定，並且當這樣測量時，將較佳的是共用至少60%或65%的序列同一性，更較佳的是至少70%、75%、80%、85%或90%的序列同一性，甚至更較佳的是至少93%、95%、98%或99%的序列同一性。較佳的是，不相同的殘基位置因保守性胺基酸置換而不同。“保守胺基酸取代”係一個胺基酸殘基被具有類似化學特性(例如，電荷或疏水性)的側鏈(R基團)的另一個胺基酸殘基取代的胺基酸取代。一般而言，保守胺基酸取代不會實質上改變蛋白質的功能特性。在兩個或更多個胺基酸序列因保守取代而彼此不同的情形中，序列同一性百分比或相似性程度可以向上調整以校正該取代的保守性質。
應理解的是，如附圖6A和6B中提供的帶注釋的CDR和框架序列係根據Kabat等人，使用專有阿拜斯資料庫所定義的。然而，如本文所論述的和圖6G-6J中所示的，熟習該項技術者根據由Chothia等人、ABM或MacCallum等人以及Kabat等人所提供的定義容易鑒定CDR。因此，包含根據任何上述系統衍生的一種或多種CDR的抗KREMEN2人源化抗體明確地保持在本發明的範圍內。
4.2. 位點特異性抗體
本發明的抗體可以被工程化以促進與細胞毒素或其他抗癌劑(如以下更詳細地論述的)的軛合。根據抗體上細胞毒素的位置以及藥物與抗體比(DAR)，抗體藥物軛合物(ADC)製劑包含ADC分子的均質群體係有利的。基於本揭露，熟習該項技術者可以容易地製造如在此所述的位點特異性工程化構建體。如 本文所用，“位點特異性抗體”或“位點特異性構建體”意指如下抗體或其免疫反應性片段，其中重鏈或輕鏈中的至少一個胺基酸被缺失、改變或取代(較佳的是被另一個胺基酸)以提供至少一個游離半胱胺酸。類似地，“位點特異性軛合物”應保持為意指以下ADC，其包含位點特異性抗體以及與成對或游離半胱胺酸軛合的至少一種細胞毒素或其他化合物(例如，報導分子)。在某些實施方式中，未配對半胱胺酸殘基將包含未配對的鏈內半胱胺酸殘基。在其他實施方式中，游離半胱胺酸殘基將包含未配對的鏈間半胱胺酸殘基。在仍其他實施方式中，游離半胱胺酸可以被工程化到抗體的胺基酸序列中(例如，在CH3結構域中)。在任何情形中，位點特異性抗體可以具有不同同種型，例如，IgG、IgE、IgA或IgD；並且在那些類別內，抗體可以具有不同亞類，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。對於IgG構建體，抗體的輕鏈可以包含各自摻入C214的κ或λ同種型，在所選實施方式中，C214可能由於IgG1重鏈中缺少C220殘基而未配對。
因此，如在此所用，術語“游離半胱胺酸”或“未配對半胱胺酸”可以互換使用，除非上下文另有規定，並且應意指抗體的任何半胱胺酸(或含硫醇的)成分(例如，半胱胺酸殘基)，無論是天然存在還是使用分子工程技術特異性地摻入所選殘基位置的，其在生理條件下不是天然存在的(或“天然的”)二硫鍵的一部分。在某些較佳的實施方式中，游離半胱胺酸可以包含天然存在的半胱胺酸，其天然鏈間或鏈內二硫橋配偶體已經被取代、消除或以其他方式改變以在生理條件下破壞天然存在的二硫橋，從而使未配對半胱胺酸適合於位點特異性軛合。在其他較 佳的實施方式中，游離或未配對半胱胺酸將包含選擇性地位於抗體重鏈或輕鏈胺基酸序列內的預定位點的半胱胺酸殘基。應當理解，在軛合之前，游離或未配對半胱胺酸可以作為硫醇(經還原的半胱胺酸)、作為封端半胱胺酸(capped cysteine)(經氧化的)或作為與相同或不同分子上的另一半胱胺酸或硫醇基團一起的非天然分子內或分子間二硫鍵(經氧化的)的一部分存在，這取決於該系統的氧化態。如以下更詳細論述的，該適當工程化的抗體構建體的溫和還原將提供可用於位點特異性軛合的硫醇。因此，在特別較佳的實施方式中，游離或未配對半胱胺酸(無論是天然存在的或併入的)將經受選擇性還原和隨後的軛合以提供均質DAR組成物。
應當理解，所揭露的工程化軛合物製劑展現的有利特性至少部分地基於特異性引導軛合的能力，並且在軛合位置和組成物的絕對DAR值方面上大大限制所製造的軛合物。與大多數常規ADC製劑不同，本發明不需要完全依賴於抗體的部分或全部還原以提供隨機軛合位點和相對不受控制的DAR種類的產生。相反，在某些方面，本發明較佳的是藉由工程化靶向抗體來破壞一個或多個天然存在的(即，“天然”)鏈間或鏈內二硫橋或者藉由在任何位置引入半胱胺酸殘基來提供一個或多個預定的未配對(或游離)半胱胺酸位點。為此，應當理解，在所選實施方式中，可以使用標準分子工程技術將半胱胺酸殘基沿著抗體(或其免疫反應性片段)重鏈或輕鏈摻入任何位置或附加到其上。在其他較佳的實施方式中，天然二硫鍵的破壞可以與引入非天然半胱胺酸(其然後將包含游離半胱胺酸)組合實現，然後可以將其用作軛 合位點。
在某些實施方式中，工程化抗體包含鏈內或鏈間半胱胺酸殘基的至少一個胺基酸缺失或取代。如在此所使用的“鏈間半胱胺酸殘基”意指參與抗體的輕鏈和重鏈之間或抗體的兩條重鏈之間的天然二硫鍵的半胱胺酸殘基，而“鏈內半胱胺酸殘基”係在相同重鏈或輕鏈中與另一個半胱胺酸天然配對的半胱胺酸殘基。在一個實施方式中，缺失或取代的鏈間半胱胺酸殘基參與輕鏈和重鏈之間的二硫鍵的形成。在另一個實施方式中，缺失或取代的半胱胺酸殘基參與兩條重鏈之間的二硫鍵。在典型的實施方式中，由於抗體的互補結構，其中輕鏈與重鏈的VH和CH1結構域配對，並且其中一條重鏈的CH2和CH3結構域與互補重鏈的CH2和CH3結構域配對，輕鏈或重鏈中單個半胱胺酸的突變或缺失將在工程化抗體中產生兩個未配對半胱胺酸殘基。
在一些實施方式中，鏈間半胱胺酸殘基缺失。在其他實施方式中，鏈間半胱胺酸取代另一個胺基酸(例如，天然存在的胺基酸)。例如，胺基酸取代可導致鏈間半胱胺酸被中性(例如絲胺酸、蘇胺酸或甘胺酸)或親水性(例如甲硫胺酸、丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸或異亮胺酸)殘基替換。在所選實施方式中，鏈間半胱胺酸被絲胺酸替換。
在本發明涵蓋的一些實施方式中，缺失或取代的半胱胺酸殘基在輕鏈(κ或λ)上，從而在重鏈上留下游離半胱胺酸。在其他實施方式中，缺失或取代的半胱胺酸殘基位於重鏈上，在輕鏈恒定區上留下游離半胱胺酸。組裝時，應理解的是，完整抗 體的輕鏈或重鏈中的單個半胱胺酸的缺失或取代產生具有兩個未配對半胱胺酸殘基的位點特異性抗體。
在一個實施方式中，IgG輕鏈(κ或λ)的位置214處的半胱胺酸(C214)被缺失或取代。在另一個實施方式中，IgG重鏈上的位置220處的半胱胺酸(C220)被缺失或取代。在另外的實施方式中，重鏈上位置226或位置229處的半胱胺酸被缺失或取代。在一個實施方式中，重鏈上的C220被絲胺酸取代(C220S)，以在輕鏈中提供所希望的游離半胱胺酸。在另一個實施方式中，輕鏈中的C214被絲胺酸取代(C214S)，以在重鏈中提供所希望的游離半胱胺酸。這樣的位點特異性構建體更詳細描述於以下實例中。相容性位點特異性構建體的總結緊接著示於以下表2中，其中通常根據如Kabat中所陳述的Eu索引進行編號，WT代表“野生型”或沒有改變的天然恒定區序列並且△(△)表示胺基酸殘基的缺失(例如，C214△表明位置214處的半胱胺酸殘基已經被缺失)。
與本發明的位點特異性構建體相容的示例性工程化輕鏈和重鏈恒定區緊接著示於以下，其中SEQ ID NO：3和4分別包含C220S IgG1和C220△ IgG1重鏈恒定區，SEQ ID NO：6和7分別包含C214S和C214△ κ輕鏈恒定區，並且SEQ ID NO：9和10分別包含示例性C214S和C214△ λ輕鏈恒定區。在每種情況下，改變或缺失的胺基酸位點(連同側翼殘基)都加了底線。
(SEQ ID NO：3)
(SEQ ID NO：4)
(SEQ ID NO：6)
(SEQ ID NO：7)
(SEQ ID NO：9)
(SEQ ID NO：10)
如以上所論述，每個重鏈和輕鏈變體可以與所揭露的重鏈和輕鏈可變區(或其衍生物，如人源化的或CDR接枝構建體)可操作地締合以提供如本文所揭露的位點特異性抗KREMEN2抗體。這樣的工程化抗體對於在所揭露的ADC中的使用而言，特別相容。
關於引入或添加一個或多個半胱胺酸殘基以提供游離半胱胺酸(與破壞天然二硫鍵相反)，熟習該項技術者可以容易地辨別抗體或抗體片段上的一個或多個相容位置。因此，在所選實施方式中，可以將一個或多個半胱胺酸引入CH1結構域、CH2結構域或CH3結構域或其任何組合，這取決於希望的DAR、抗體構建體、所選有效載荷以及抗體靶標。在其他較佳的實施方式中， 半胱胺酸可以被引入到κ或λ CL結構域中，並且在特別較佳的實施方式中可以引入CL結構域的c-末端區域。在每個情形中，鄰近半胱胺酸插入位點的其他胺基酸殘基可以被改變、去除或取代，以促進分子穩定性、軛合效率或為有效載荷(一旦附接)提供保護環境。在具體實施方式中，取代的殘基出現在抗體的任何可及位點處。藉由用半胱胺酸取代該等表面殘基，從而反應性硫醇基團被定位在抗體上的易及位點處，並且可以如在此進一步描述的那樣被選擇性地還原。在具體實施方式中，取代的殘基出現在抗體的可及位點處。藉由用半胱胺酸取代該等殘基，從而反應性硫醇基團被定位在抗體的可及位點處，並且可以用於選擇性軛合抗體。在某些實施方式中，任何一個或多個以下殘基可以被半胱胺酸取代：輕鏈的V205(Kabat編號)；重鏈的A118(Eu編號)；和重鏈Fc區的S400(Eu編號)。另外的取代位置和製造相容性位點特異性抗體的方法陳述於U.S.P.N.7,521,541中，將其以其整體結合在此。
如在此所揭露的，以所定義的位點和化學計量的藥物荷載產生抗體藥物軛合物的策略廣泛地適用於全部抗KREMEN2抗體，因為其主要涉及抗體的保守恒定結構域的工程化。由於抗體的每個類別和亞類的胺基酸序列和天然二硫橋均已得到充分證明，熟習該項技術者可以容易地製造不同抗體的工程化構建體，而無需過多的實驗，因此，該等構建體被明確地涵蓋在本發明的範圍內。對於包含如本揭露所陳述的全部或部分重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列的位點特異性構建體而言尤其如此。
4.3. 恒定區修飾和改變的糖基化
本發明的所選實施方式還可以包括恒定區(即，Fc區)的取代或修飾，包括但不限於胺基酸殘基取代、突變和/或修飾，它們產生具有以下特徵的化合物，該等特徵包括但不限於：改變的藥物動力學、增加的血清半衰期、增加的結合親和力、降低的免疫原性、增加的產量、與Fc受體(FcR)的改變的Fc配位基結合、增強或減弱的ADCC或CDC、改變的糖基化和/或二硫鍵以及修飾的結合特異性。
可以生成具有改進的Fc效應子功能的化合物，例如，藉由涉及Fc結構域與Fc受體(例如，FcγRI、FcγRIIA和B、FcγRIII及FcRn)之間的相互作用的胺基酸殘基的變化，該化合物可以導致細胞毒性增加和/或藥物動力學改變，如血清半衰期增加(參見例如，Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol[免疫學年鑒]9：457-92(1991)；Capel等人Immunomethods[免疫方法]4：25-34(1994)；及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.[實驗與臨床醫學雜誌]126：330-41(1995))。
在所選實施方式中，具有增加的體內半衰期的抗體可以藉由對鑒定為涉及Fc結構域與FcRn受體之間的相互作用的胺基酸殘基進行修飾(例如，取代、缺失或添加)來產生(參見例如，國際公開號WO 97/34631；WO 04/029207；U.S.P.N.6,737,056和U.S.P.N.2003/0190311)。就該等實施方式來說，Fc變體可以在哺乳動物，較佳的是人類中提供超過5天、超過10天、超過15天、較佳的是超過20天、超過25天、超過30天、超過35天、超過40天、 超過45天、超過2個月、超過3個月、超過4個月或超過5個月的半衰期。半衰期的增加引起更高的血清滴度，由此使抗體給予的頻率降低和/或使有待給予的抗體的濃度降低。可以例如在表現人類FcRn的轉基因小鼠或轉染的人類細胞系中，或在給予了具有變體Fc區的多肽的靈長類動物中，對人類FcRn高親和力結合多肽在體內與人類FcRn的結合及血清半衰期進行檢驗。WO 2000/42072描述了使與FcRn的結合改善或減少的抗體變體。還參見例如，Shields等人，J.Biol.Chem.[生物化學雜誌]9(2)：6591-6604(2001)。
在其他實施方式中，Fc改變可以引起ADCC或CDC活性的增強或減弱。如本領域中所知，CDC係指在補體存在下靶細胞的溶解，並且ADCC係指一種細胞毒性形式，其中結合到存在於某些細胞毒性細胞(例如，自然殺手細胞、中性粒細胞及巨噬細胞)上的FcR的分泌型Ig使該等細胞毒性效應細胞能夠特異性結合到帶有抗原的靶細胞並且隨後用細胞毒素殺滅靶細胞。在本發明的上下文中，提供了具有“改變的”FcR結合親和力的抗體變體，如與親本或未修飾抗體或與包含天然序列FcR的抗體相比較，它具有增強或減少的結合。呈現出減少的結合的該等變體可以具有極少或沒有可感知的結合，例如與天然序列相比較，0%-20%結合到FcR，例如，如藉由本領域中眾所周知的技術所測定。在其他實施方式中，如與天然免疫球蛋白Fc結構域相比較，該變體將展現增強的結合。應理解的是，該等類型的Fc變體可以有利地用於增強所揭露的抗體的有效抗贅生特性。在又其他實施方式中，該等改變引起結合親和力的增加、免疫原性的降低、產量增加、糖基化和/或二硫鍵(例如，對於軛合位點)改變、結合特異性修飾、 胞噬作用增加，和/或細胞表面受體(例如，B細胞受體；BCR)下調等。
再其他實施方式包含一種或多種工程化糖形，例如，位點特異性抗體，其包含改變的糖基化模式或共價附接到該蛋白質(例如，在Fc結構域中)的改變的碳水化合物的組成。參見例如Shields,R.L.等人(2002),J.Biol.Chem.[生物化學雜誌]277：26733-26740。工程化糖形可以用於多種目的，包括但不限於，增強或減弱效應子功能、增加抗體對靶標的親和力或促進抗體的產生。在希望降低效應子功能的某些實施方式中，該分子可以被工程化以表現去糖基化的形式。可以引起一個或多個可變區框架糖基化位點的消除以借此消除該位點處的糖基化的取代係眾所周知的(參見例如，U.S.P.N.5,714,350和6,350,861)。相反地，可以藉由在一個或多個另外的糖基化位點中進行工程化來賦予含Fc分子增強的效應子功能或改善的結合。
其他實施方式包括具有改變的糖基化組成的Fc變體，如具有減少的岩藻糖基殘基量的低岩藻糖基化抗體或具有增加的二等分GlcNAc結構的抗體。已證明該等改變的糖基化模式可增加抗體的ADCC能力。工程化的糖形可以藉由熟習該項技術者已知的任何方法產生，例如，藉由使用工程化或變體表現株、藉由與一種或多種酶(例如，N-乙醯葡糖胺轉移酶III(GnTIII))共表現、藉由在不同生物體或來自不同生物體的細胞系中表現包含Fc區的分子、或藉由在表現了包含Fc區的分子之後對一種或多種碳水化合物進行修飾(參見例如，WO 2012/117002)。
4.4. 片段
無論選擇何種形式的抗體(例如，嵌合、人源化等形式)來實行本發明，應理解的是，其免疫反應性片段(其自身或作為抗體藥物軛合物的部分)都可以根據在此的傳授內容使用。“抗體片段”包含完整抗體的至少一部分。如在此所使用，術語抗體分子的“片段”包括抗體的抗原結合片段，並且術語“抗原結合片段”係指免疫球蛋白或抗體中與所選抗原或其免疫原性決定因子免疫特異性結合或反應，或與衍生該等片段的完整抗體競爭特異性抗原結合的多肽片段。
示例性免疫反應性片段包括：可變輕鏈片段(VL)、可變重鏈片段(VH)、scFv、F(ab')2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段、單結構域抗體片段、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體分子及由抗體片段形成的多特異性抗體。此外，活性位點特異性片段包含該抗體中保持它與抗原/底物或受體相互作用的能力並且以類似於完整抗體的方式(不過可能具有略微降低的效率)對其進行修飾的一部分。這樣的抗體片段可以進一步被工程化以包含一個或多個如本文所述的游離半胱胺酸。
在特別較佳的實施方式中，該KREMEN2結合結構域將包含scFv構建體。如在此所使用，“單鏈可變片段(scFv)”意指從保留結合抗原的能力的抗體衍生的單鏈多肽。scFv的實例包括利用重組DNA技術形成的抗體多肽，並且其中免疫球蛋白重鏈和輕鏈片段的Fv區經由間隔序列連接。用於製備scFv的各種方法係已知的，並且包括描述於U.S.P.N.4,694,778中的方法。
在其他實施方式中，抗體片段係包含Fc區並且保持當存在於完整抗體中時通常與Fc區相關的至少一種生物功能(如FcRn結合、抗體半衰期調節、ADCC功能及補體結合)的抗體片段。在一個實施方式中，抗體片段係具有基本上類似於完整抗體的體內半衰期的單價抗體。例如，此類抗體片段可以包含連接到能夠賦予該片段體內穩定性的Fc序列(包含至少一個游離半胱胺酸)的抗原結合臂。
如熟習該項技術者將充分認識到的，片段可以藉由分子工程或經由化學或酶處理(如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)完整或完全抗體或抗體鏈，或者藉由重組手段獲得。有關抗體片段的更詳細說明，參見例如，Fundamental Immunology[基礎免疫學]，W.E.Paul編，Raven Press,N.Y.[紐約瑞文出版社](1999)。
4.5. 多價構建體
在其他實施方式中，本發明的抗體和軛合物可以是單價或多價(例如二價、三價等)的。如在此所使用，術語“價態”係指與抗體締合的潛在靶結合位點的數目。每一靶結合位點特異性結合一個靶分子或在靶分子上的特定位置或基因座或表位。當抗體係單價時，該分子的每個結合位點將特異性結合到單一抗原位置或表位。當一種抗體包含超過一個靶結合位點(多價)時，每個靶結合位點可以特異性結合相同或不同的分子(例如，可以結合到不同的配位基或不同的抗原，或在同一抗原上的不同表位或位置)。參見例如，U.S.P.N.2009/0130105。
在一個實施方式中，所述抗體係雙特異性抗體，其 中兩條鏈具有不同的特異性，如Millstein等人，1983,Nature[自然]，305：537-539和WO 2014/124326中所描述。其他實施方式包括具有另外的特異性的抗體，如三特異性抗體。其他更複雜的相容性多特異性構建體及其製造方法陳述於U.S.P.N.2009/0155255，以及WO 94/04690；Suresh等人，1986,Methods in Enzymology[酶學方法]，121：210；及WO 96/27011中。
多價抗體可以免疫特異性結合到所希望的靶分子的不同表位或可以免疫特異性結合到靶分子以及異源表位，如異源多肽或固體支撐材料。儘管所選實施方式僅結合兩種抗原(即，雙特異性抗體)，但本發明也涵蓋具有另外的特異性的抗體，如三特異性抗體。雙特異性抗體還包括交聯或“異種軛合”抗體。舉例來說，在該異種軛合物中的一種抗體可以偶合到抗生物素蛋白，另一種偶合到生物素。已經例如提出該等抗體使免疫系統細胞靶向不想要的細胞(U.S.P.N.4,676,980)，並且用於治療HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373及EP 03089)。異種軛合抗體可以使用任何常規的交聯方法製備。適合的交聯劑以及多種交聯技術係本領域中眾所周知的，並且揭露於U.S.P.N.4,676,980中。
5. 抗體的重組產生
可以使用從抗體產生細胞和重組技術獲得的遺傳物質來產生或修飾抗體及其片段(參見例如；Dubel和Reichert(編輯)(2014)Handbook of Therapeutic Antibodies,2nd Edition,Wiley-Blackwell GmbH[治療性抗體手冊，第2版，威利-布萊克威爾股份有限公司]；Sambrook和Russell(編輯)(2000)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3rd Ed.),NY,Cold Spring Harbor Laboratory Press[分子選殖：實驗室手冊(第3版)，紐約，冷泉港實驗室出版社]；Ausubel等人(2002)Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,John & Sons,Inc.[精編分子生物學方案：當代分子生物學方案的方法概要，約翰威利父子公司]；以及U.S.P.N.7,709,611)。
本發明的另一個方面涉及編碼本發明的抗體的核酸分子。核酸可以存在於全細胞、細胞裂解物或者部分純化或基本上純的形式中。當藉由標準技術(包括鹼/SDS處理、CsCl成帶(CsCl banding)、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳和本領域眾所周知的其他技術)從其他細胞成分或其他污染物(例如其他細胞核酸或蛋白質)分離時，核酸係“分離的”或“呈現為基本上純的”。本發明的核酸可以例如是DNA(例如基因組DNA、cDNA)、RNA及其人工變體(例如，肽核酸)，無論單股或雙股或RNA，RNA並且可以包含或不包含內含子。在所選實施方式中，核酸係cDNA分子。
可以使用標準分子生物學技術得到本發明的核酸。對於由雜交瘤(例如，如以下實例所述製備的雜交瘤)表現的抗體，編碼抗體的輕鏈和重鏈的cDNA可藉由標準PCR擴增或cDNA選殖技術獲得。對於從免疫球蛋白基因文庫(例如使用噬菌體展示技術)獲得的抗體，可以從文庫中回收編碼該抗體的核酸分子。
可以藉由標準重組DNA技術進一步操縱編碼VH和VL區段的DNA片段，例如來將可變區基因轉化為全長抗體鏈基 因、Fab片段基因或scFv基因。在該等操縱中，編碼VL或VH的DNA片段可操作地連接到編碼另一種蛋白質的另一個DNA片段，例如抗體恒定區或柔性接頭。如本上下文中使用的術語“可操作地連接”意指連接兩個DNA片段，使得由這兩個DNA片段編碼的胺基酸序列保留在框架內。
藉由將編碼VH的DNA可操作地與編碼重鏈恒定區(在IgG1的情況下，為CHI、CH2和CH3)的另一DNA分子連接，而將所分離的編碼VH區域的DNA轉化成全長重鏈基因。人類重鏈恒定區基因的序列在本領域中是已知的(參見例如Kabat等人(1991)(同上))，並且涵蓋該等區域的DNA片段可藉由標準PCR擴增來獲得。該重鏈恒定區可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區，但最較佳的是IgG1或IgG4恒定區。示例性IgG1恒定區示於SEQ ID NO：2中。對於Fab片段重鏈基因，編碼VH的DNA可以可操作地連接到僅編碼重鏈CH1恒定區的另一DNA分子。
藉由將編碼VL的DNA與編碼輕鏈恒定區(CL)的另一DNA分子可操作地連接，可以將編碼VL區的分離的DNA轉化為全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恒定區基因的序列在本領域中是已知的(參見例如Kabat等人(1991)(同上))，並且涵蓋該等區域的DNA片段可藉由標準PCR擴增來獲得。輕鏈恒定區可以是κ或λ恒定區，但最較佳的是κ恒定區。示例性的相容性κ輕鏈恒定區示於SEQ ID NO：5中，而示例性的相容性λ輕鏈恒定區示於SEQ ID NO：8中。
在每種情況下，VH或VL結構域可以與它們各自的恒定區(CH或CL)可操作地連接，其中所述恒定區係位點特異性恒定區並且提供位點特異性抗體。在所選實施方式中，所得位點特異性抗體將包含重鏈上的兩個未配對的半胱胺酸；而在其他實施方式中，所述位點特異性抗體將包含CL結構域中的兩個未配對半胱胺酸。
本文預期的是與本發明的多肽表現出“序列同一性”、“序列相似性”或“序列同源性”的某些多肽(例如抗原或抗體)。例如，衍生的人源化抗體VH或VL結構域可以表現出與來源(例如，鼠類)或受體(例如，人類)VH或VL結構域的序列相似性。“同源性”多肽可以表現出65%、70%、75%、80%、85%或90%序列同一性。在其他實施方式中，“同源性”多肽可以表現出93%、95%或98%序列同一性。如在此所使用的，兩個胺基酸序列之間的百分比同源性與這兩個序列之間的百分比同一性係等同的。這兩個序列之間的百分比同一性係該等序列共有的相同位置的數目的函數(即，%同源性=相同位置的數目/位置的總數目×100)，並考慮到為這兩個序列的最優比對而需引入的空位數目和每個空位的長度。可以使用如下面的非限制性實例中所述的數學演算法完成序列的比較和兩個序列之間百分比同一性的確定。
兩個胺基酸序列之間的百分比同一性可以使用已經合併在ALIGN程式(版本2.0)中的E.Meyers和W.Miller的演算法(Comput.Appl.Biosci.[電腦應用生物科學]，4：11-17(1988))來確定，使用PAM120權重殘基表，空位長度罰分為12且空位罰分為 4。此外，兩個胺基酸序列之間的百分比同一性可以使用已經合併在GCG套裝軟體(可在www.gcg.com獲得)中的GAP程式裡的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]48：444-453(1970))演算法來確定，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣，且空位權重為16、14、12、10、8、6或4和長度權重為1、2、3、4、5或6。
另外地或可替代地，本發明的蛋白序列可以被進一步用作“查詢序列”以進行針對公共資料庫的檢索，以例如鑒定相關序列。這類檢索可以使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.[分子生物學雜誌]215：403-10的XBLAST程式(2.0版)來進行。可以用XBLAST程式，得分=50，字長=3進行BLAST蛋白質檢索來獲得與本發明的抗體分子同源的胺基酸序列。為獲得用於比較目的的空位比對，可利用如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.[核酸研究]25(17)：3389-3402中所述的缺口BLAST。當利用BLAST和缺口BLAST程式時，可以使用各程式(例如XBLAST和NBLAST)的默認參數。
不相同的殘基位置可以因保守胺基酸取代或非保守胺基酸取代而不同。“保守胺基酸取代”係一個胺基酸殘基被具有類似化學特性(例如，電荷或疏水性)的側鏈的另一個胺基酸殘基取代的胺基酸取代。一般而言，保守胺基酸取代不會實質上改變蛋白質的功能特性。在兩個或更多個胺基酸序列因保守取代而彼此不同的情形中，序列同一性百分比或相似性程度可以向上調整以校正該取代的保守性質。在存在非保守胺基酸取代的情形 中，在實施方式中，表現出序列同一性的多肽將保持本發明的多肽(例如，抗體)的所希望的功能或活性。
本文還預期了與本發明的核酸表現出“序列同一性”、“序列相似性”或“序列同源性”的核酸。“同源序列”係指表現出至少約65%、70%、75%、80%、85%或90%序列同一性的核酸分子的序列。在其他實施方式中，核酸的“同源序列”可以與參比核酸序列表現出93%、95%或98%序列同一性。
本發明還提供了包含可以可操作地連接到啟動子的上述核酸(參見例如WO 86/05807；WO 89/01036；和U.S.P.N.5,122,464)以及真核分泌途徑的其他轉錄調節和加工控制元件的載體。本發明還提供了攜帶那些載體和宿主表現系統的宿主細胞。
如在此所使用，術語“宿主表現系統”包括可被工程化以產生本發明的核酸或多肽和抗體的任何種類的細胞系統。這種宿主表現系統包括但不限於用重組噬菌體DNA或質粒DNA轉化或轉染的微生物(例如大腸桿菌或枯草芽孢桿菌)；用重組酵母表現載體轉染的酵母(例如酵母屬)；或具有重組表現構建體的哺乳動物細胞(例如，COS、CHO-S、HEK293T、3T3細胞)，所述構建體含有來源於哺乳動物細胞或病毒基因組的啟動子(例如，腺病毒晚期啟動子)。宿主細胞可用兩個表現載體共轉染，例如編碼重鏈衍生的多肽的第一載體和編碼輕鏈衍生的多肽的第二載體。
轉化哺乳動物細胞的方法係本領域中眾所周知的。參見例如，U.S.P.N.4,399,216、4,912,040、4,740,461及4,959,455。 宿主細胞也可以被工程化以允許產生具有不同特徵的抗原結合分子(例如經修飾的糖形或具有GnTIII活性的蛋白質)。
對於長期高產率產生重組蛋白來說，穩定表現係較佳的。因此，穩定地表現所選抗體的細胞系可以使用標準的本領域認可的技術進行工程化，並形成本發明的一部分。除使用含有病毒複製起點的表現載體外，可以用藉由適當表現控制元件(例如啟動子或增強子序列、轉錄終止子、聚腺苷酸位點等)和可選擇標記物控制的DNA來轉化宿主細胞。可以使用本領域中眾所周知的任何選擇系統，包括穀胺醯胺合成酶基因表現系統(GS系統)，該系統提供了用於在所選條件下增強表現的有效方法。以其全部或部分，結合EP 0 216 846、EP 0 256 055、EP 0 323 997和EP 0 338 841、以及U.S.P.N.5,591,639和5,879,936對該GS系統進行論述。用於開發穩定細胞系的另一相容性表現系統係FreedomTM CHO-S Kit(生命技術公司(Life Technologies))。
一旦本發明的抗體藉由重組表現或所揭露的任何其他技術產生，則可以藉由本領域已知的方法進行純化或分離，由此其被鑒定並從其天然環境中分離和/或回收並與會干擾抗體或相關ADC的診斷或治療用途的污染物分離。分離的抗體包括重組細胞內的原位抗體。
可以使用不同的本領域認可的技術，例如像離子交換和尺寸排阻層析、透析、滲濾和親和層析，特別是蛋白A或蛋白G親和層析，來純化該等分離的製劑。以下實例中更充分地論述了相容的方法。
6. 生產後選擇
不管如何獲得，都可以針對所希望的特徵(包括例如穩健生長、高抗體產量以及所希望的抗體特徵如感興趣的抗原的高親和性)對抗體產生細胞(例如，雜交瘤、酵母集落等)進行選擇、選殖並且進一步篩選。雜交瘤可以在體外細胞培養中或在體內同基因免疫功能不全動物中擴增。選擇、選殖及擴增雜交瘤和/或集落的方法係熟習該項技術者所熟知的。一旦所希望的抗體被鑒定，則可以使用常見的本領域認可的分子生物和生物化學技術來分離、操縱並表現相關遺傳物質。
由天然文庫產生的抗體(天然的或合成的)可以具有適度的親和性(Ka為約106至107M-1)。為了增強親和性，可以藉由構建抗體文庫(例如，藉由使用易錯聚合酶而引入體外隨機突變)並重新選擇對來自那些第二文庫的抗原具有高親和力的抗體(例如，藉由使用噬菌體或酵母展示)而在體外模仿親和力成熟。WO 9607754描述了用於在免疫球蛋白輕鏈的CDR中誘導誘變以建立輕鏈基因文庫的方法。
可以使用各種技術來選擇抗體，包括但不限於噬菌體或酵母展示，其中在噬菌體或酵母上合成人類組合抗體或scFv片段的文庫，用感興趣的抗原或其結合抗體的部分篩選該文庫，並且分離結合該抗原的噬菌體或酵母，從該噬菌體或酵母可以獲得抗體或免疫反應性片段(Vaughan等人，1996,PMID：9630891；Sheets等人，1998,PMID：9600934；Boder等人，1997,PMID：9181578；Pepper等人，2008,PMID：18336206)。用於產生噬菌體 或酵母展示文庫的套組可商業獲得。還存在可以用於產生並篩選抗體展示文庫的其他方法和試劑(參見U.S.P.N.5,223,409；WO 92/18619，WO 91/17271，WO 92/20791，WO 92/15679，WO 93/01288，WO 92/01047，WO 92/09690；以及Barbas等人，1991,PMID：1896445)。這樣的技術有利地允許進行大量候選抗體的篩選並且提供對序列的相對容易的操作(例如，藉由重組改組)。
IV. 抗體的表徵
在某些實施方式中，可以針對有利的特性，包括例如穩健生長、高抗體產量及如以下更詳細地論述的所希望的位點特異性抗體特徵，對抗體產生細胞(例如，雜交瘤或酵母集落)進行選擇、選殖並且進一步篩選。在其他情形中，可以藉由選擇用於接種動物的特定抗原(例如，特定KREMEN2同種型)或靶抗原的免疫反應性片段來實現該抗體的表徵。在再其他實施方式中，所選抗體可以如以上所描述進行工程化以增強或改善免疫化學特徵，如親和力或藥物動力學。
A. 中和抗體
在所選實施方式中，本發明的抗體可以是“拮抗劑”或“中和”抗體，這意味著抗體可以與決定因子締合併直接或者藉由阻止決定因子與結合配偶體(如配位基或受體)的締合而阻斷或抑制所述決定因子的活性，從而中斷否則將由分子的相互作用引起的生物反應。如例如藉由靶分子活性或體外競爭性結合測定中所測量的，當過量的抗體將與決定因子結合的結合配偶體的量降低至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、 90%、95%、97%、99%或更多時，中和抗體或拮抗劑抗體將實質上抑制決定因子與其配位基或底物的結合。應理解的是，改良的活性可以使用本領域認可的技術直接地測量，或可以藉由變化的活性的下游影響(例如，腫瘤發生或細胞存活)來測量。下面的實例中顯示了阻斷KREMEN2與其配位基DKK1的結合的某些示例性抗體，並且所揭露的測定可以用於根據本發明確定哪些抗體在進行中和。
B. 內化抗體
在某些實施方式中，所述抗體可以包括內化抗體，使得該抗體將結合決定因子並且將被內化(連同任何軛合的藥學活性部分一起)到所選靶細胞(包括腫瘤發生細胞)中。內化的抗體分子的數量可足以殺滅抗原表現細胞，尤其是抗原表現腫瘤發生細胞。取決於抗體或在一些情況下抗體藥物軛合物的效力，將單個抗體分子吸收到細胞中可足以殺滅該抗體所結合的靶細胞。關於本發明，有證據證明，相當大部分的所表現的KREMEN2蛋白保持與腫瘤發生細胞表面的締合，從而允許所揭露的抗體或ADC的定位和內化。在所選實施方式中，這樣的抗體將在內化後與殺滅細胞的一種或多種藥物締合或軛合。在一些實施方式中，本發明的ADC將包含內化的位點特異性ADC。
如在此所使用，“內化”的抗體係在與相關的決定因子結合後被靶細胞吸收(與任何軛合的細胞毒素一起)的抗體。這樣的內化的ADC的數量將較佳的是足以殺滅決定因子表現細胞，尤其是表現決定因子的癌症幹細胞。取決於細胞毒素或作為 一個整體的ADC的效力，在一些情況下，將若干抗體分子吸收到細胞中足以殺滅該抗體所結合的靶細胞。例如，某些藥物(如PBD或卡奇黴素)足以有效以致軛合到抗體的若干分子毒素的內化就足以殺滅靶細胞。可以藉由包括以下實例中所描述的那些的各種本領域認可的測定(例如皂草素測定，如Mab-Zap和Fab-Zap；先進的靶向系統)來確定抗體在與哺乳動物細胞結合後是否內化。檢測抗體是否內化到細胞中的方法也描述於U.S.P.N.7,619,068中。
C. 耗竭抗體
在其他實施方式中，本發明的抗體係耗竭抗體。術語“耗竭”抗體係指較佳的是與在細胞表面之上或附近的抗原結合並且誘導、促進或引起該細胞的死亡(例如，藉由CDC、ADCC或引入細胞毒性劑)的一種抗體。在實施方式中，所選耗竭抗體將與細胞毒素軛合。
較佳的是，耗竭抗體將能夠殺滅確定的細胞群中的至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%或99%的KREMEN2表現細胞。在一些實施方式中，該細胞群可以包含富集的、分割的、純化的或分離的腫瘤發生細胞(包括癌症幹細胞)。在其他實施方式中，該細胞群可以包含完整腫瘤樣品或包含癌症幹細胞的異種腫瘤提取物。可以使用標準生物化學技術，根據在此的傳授內容對腫瘤發生細胞的耗竭進行監測並定量。
D. 結合親和力
本文揭露的是對特異性決定因子例如KREMEN2具有高結合親和力的抗體。術語“KD”係指特定的抗體-抗原相互作用的解離常數或表觀親和力。當解離常數KD(koff/kon)10-7M時，本發明的抗體可以免疫特異性地結合其靶抗原。當KD 5 x 10-9M時，該抗體以高親和力特異性結合抗原，並且當KD 5 x 10-10M時以極高親和力特異性結合抗原。在本發明的一個實施方式中，該抗體具有10-9M的KD及約1 x 10-4/sec的解離速率。在本發明的一個實施方式中，解離速率為<1 x 10-5/sec。在本發明的其他實施方式中，所述抗體將以在約10-7M與10-10M之間的KD與決定因子結合，並且在又另一實施方式中，它將以KD 2 x 10-10M結合。本發明的仍其他所選的實施方式包含以下抗體，該等抗體具有小於10-6M、小於5 x 10-6M、小於10-7M、小於5 x 10-7M、小於10-8M、小於5 x 10-8M、小於10-9M、小於5 x 10-9M、小於10-10M、小於5 x 10-10M、小於10-11M、小於5 x 10-11M、小於10-12M、小於5 x 10-12M、小於10-13M、小於5 x 10-13M、小於10-14M、小於5 x 10-14M、小於10-15M或小於5 x 10-15M的KD(koff/kon)。
在某些實施方式中，免疫特異性結合到決定因子例如KREMEN2的本發明的抗體可以具有的締合速率常數或k on (或k a)速率(抗體+抗原(Ag)k on←抗體-Ag)為至少105M-1s-1、至少2 x 105M-1s-1、至少5 x 105M-1s-1、至少106M-1s-1、至少5 x 106M-1s-1、至少107M-1s-1、至少5 x 107M-1s-1或至少108M-1s-1。
在另一個實施方式中，免疫特異性結合到決定因子例如KREMEN2的本發明的抗體可以具有的解離速率常數或k off (或 k d)速率(抗體+抗原(Ag)k off←抗體-Ag)為小於10-1s-1、小於5 x 10-1s-1、小於10-2s-1、小於5 x 10-2s-1、小於10-3s-1、小於5 x 10-3s-1、小於10-4s-1、小於5 x 104s-1、小於10-5s-1、小於5 x 10-5s-1、小於10-6s-1、小於5 x 10-6s-1、小於10-7s-1、小於5 x 10-7s-1、小於10-8s-1、小於5 x 10-8s-1、小於10-9s-1、小於5 x 10-9s-1或小於10-10s-1。
可以使用本領域已知的各種技術來確定結合親和力，例如表面電漿共振、生物層干涉法、雙極化干涉法、靜態光散射、動態光散射、等溫滴定量熱法、ELISA、分析超速離心和流式細胞測量術。
E. 分倉和表位 作圖
本文所揭露的抗體可以根據它們所締合的離散表位來表徵。“表位”係抗體或免疫反應性片段特異性結合的決定因子的一個或多個部分。免疫特異性結合可以基於如上所述的結合親和力，或者藉由抗體對蛋白質和/或大分子的複雜混合物中的其靶抗原的優先識別(例如在競爭性測定中)來確認和定義。“線性表位”由允許抗體的免疫特異性結合的抗原中的連續胺基酸形成。即使當抗原變性時，也典型地保持了優先結合線性表位的能力。相反，“構象表位”通常包含抗原胺基酸序列中的非連續胺基酸，但在抗原的二級、三級或四級結構的情況下，該等非連續胺基酸足夠接近以被單一抗體同時結合。當具有構象表位的抗原變性時，抗體通常將不再識別該抗原。表位(連續或非連續)一般包括處於獨特空間構象的至少3個、並且更通常至少5個或8-10個或12-20個胺基酸。
根據抗體所屬的組或“倉”來表徵本發明的抗體也是可能的。“分倉”係指使用競爭性抗體結合測定來鑒定不能同時結合免疫原性決定因子的抗體對，從而鑒定“競爭”結合的抗體。可以藉由以下測定來確定競爭性抗體，在該測定中被測試的抗體或免疫學功能片段防止或抑制參比抗體與共同抗原的特異性結合。典型地，此類測定涉及使用結合到固體表面或細胞、未標記的測試抗體和標記的參比抗體的經純化的抗原(例如，KREMEN2或其結構域或片段)。在測試抗體存在下，藉由確定結合於固體表面或細胞的標記的量來測量競爭性抑制。有關用於確定競爭性結合的方法的其他細節提供於本文的實例中。通常，當競爭性抗體過量存在時，它將使參比抗體與共同抗原的特異性結合抑制至少30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些情況下，結合被抑制至少80%、85%、90%、95%、或97%或更多。相反地，當參比抗體結合時，它將較佳的是使隨後添加的測試抗體(即，KREMEN2抗體)的結合抑制至少30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些情況下，測試抗體的結合被抑制至少80%、85%、90%、95%或97%或更多。
通常可以使用各種本領域認可的技術來確定分倉或競爭性結合，例如像免疫測定如西方墨點法、放射免疫測定、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、“夾心”免疫測定、免疫沈澱測定、沈澱素反應、凝膠擴散沈澱素反應、免疫擴散測定、凝集測定、補體固定測定、免疫放射測定、螢光免疫測定以及蛋白A免疫測定。此類免疫測定係本領域常規且熟知的(參見，Ausubel等人，編著，(1994)Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,John Wiley & Sons,Inc.,New York[當前分子生物學方案，第1卷，約翰威立父子公司，紐約])。另外地，可以使用交叉阻斷測定(參見例如，WO 2003/48731；以及Harlow等人(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow and David Lane[抗體：實驗室手冊，冷泉港實驗室，Ed Harlow和David Lane])。
用於確定競爭性抑制(以及由此產生的“倉”)的其他技術包括：使用例如BIAcoreTM 2000系統(GE醫療集團)的表面電漿共振；使用例如ForteBio® Octet RED(福特生物公司(ForteBio))的生物層干涉法；或使用例如FACSCanto II(BD生物科學公司(BD Biosciences))的流式細胞測量術珠粒陣列；或多重LUMINEXTM檢測測定(路明克斯公司(Luminex))。
Luminex係能夠進行大規模的多重抗體配對的基於珠粒的免疫測定平臺。該測定比較了抗體對與靶抗原的同時結合模式。該對中的一種抗體(捕獲mAb)與Luminex珠結合，其中每個捕獲mAb與不同顏色的珠結合。另一種抗體(檢測器mAb)與螢光信號(例如藻紅蛋白(PE))結合。該測定分析了抗體與抗原的同時結合(配對)，並將具有類似配對譜的抗體組合在一起。檢測器mAb和捕獲mAb的相似譜表明這兩種抗體結合相同或緊密相關的表位。在一個實施方式中，可以使用皮爾森(Pearson)相關係數來確定配對譜以鑒定與被測試的抗體組中的任何特定抗體最密切相關的抗體。在實施方式中，如果抗體對的皮爾森相關係數為至少0.9，則確定測試/檢測器mAb處於與參考/捕獲mAb相同的倉 內。在其他實施方式中，皮爾森相關係數為至少0.8、0.85、0.87或0.89。在另外的實施方式中，皮爾森相關係數為至少0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或1。分析從Luminex測定獲得的數據的其他方法描述於U.S.P.N.8,568,992中。Luminex同時分析100種不同類型的珠(或更多)的能力提供了幾乎無限的抗原和/或抗體表面，這導致與生物感測器測定相比抗體表位譜分析中改善的通量和解析度(Miller等人，2011,PMID：21223970)。
類似地，包含表面電漿共振的分倉技術係與本發明相容的。如在此所使用，“表面電漿共振”係指一種光學現象，它允許藉由檢測生物感測器矩陣內蛋白濃度的變化來分析即時特異性相互作用。使用市售設備如BIAcoreTM 2000系統，可以容易地確定選擇的抗體是否與確定的抗原彼此競爭結合。
在其他實施方式中，可用於確定測試抗體是否與參比抗體“競爭”結合的技術係“生物層干涉法”，這係一種光學分析技術，其分析從兩個表面：生物感測器尖端(tip)上的一層固定化蛋白質和內部參比層反射的白光的干涉圖案。結合到生物感測器尖端的分子數量的任何改變都引起可以即時測量的干涉圖案的轉變。可以使用如下的ForteBio® Octet RED機器來進行這樣的生物層干涉測定。將參比抗體(Ab1)捕獲到抗小鼠捕獲晶片上，然後使用高濃度非結合抗體來阻斷該晶片並且收集基線。然後，藉由特異性抗體(Ab1)捕獲重組靶蛋白並且將尖端浸入與具有相同抗體(Ab1)的孔(作為對照)中或浸入具有不同測試抗體(Ab2)的孔中。如藉由將結合水平與對照Ab1相比較所測定的，如果未發 生另外的結合，那麼確定Ab1和Ab2為“競爭性”抗體。如果針對Ab2觀察到另外的結合，則確定Ab1和Ab2不相互競爭。這一方法可以擴大到使用代表獨特倉的96孔板中的一整行抗體來篩選較大的獨特抗體文庫。在實施方式中，如果參比抗體使測試抗體與共同抗原的特異性結合抑制至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%，則測試抗體將與參比抗體競爭。在其他實施方式中，結合被抑制至少80%、85%、90%、95%、或97%或更多。
一旦包含一組競爭性抗體的倉已被定義，則可以進行進一步表徵以確定該組抗體所結合的抗原上的特定結構域或表位。使用由Cochran等人，2004,PMID：15099763所描述的方案的修改來進行結構域水平表位作圖。精細表位作圖係在包含抗體所結合決定因子的表位的抗原上，確定特異性胺基酸的過程。
在某些實施方式中，可以使用噬菌體或酵母展示來進行精細表位作圖。其他相容的表位作圖技術包括丙胺酸掃描突變體、肽印跡(Reineke,2004,PMID：14970513)或肽切割分析。另外，可以利用諸如表位切除、表位提取和抗原的化學修飾等的方法(Tomer,2000,PMID：10752610)，使用酶如蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶、內蛋白酶Glu-C、內蛋白酶Asp-N、胰凝乳蛋白酶等)；化學試劑如琥珀醯亞胺酯及其衍生物，含一級胺的化合物，肼和碳水化合物，游離胺基酸等。在另一個實施方式中，修飾輔助的譜分析，又稱為基於抗原結構的抗體譜分析(ASAP)可以用於根據每一抗體與化學或酶促修飾的抗原表面的結合譜的相似性對針對相同抗原的大量單株抗體進行分類(U.S.P.N. 2004/0101920)。
一旦在抗原上確定了所希望的表位，就有可能例如藉由使用本文所述的技術，用包含所選表位的肽進行免疫接種來產生針對該表位的另外的抗體。
V. 抗體軛合物
在一些實施方式中，本發明的抗體可以與藥學活性部分或診斷部分軛合以形成“抗體藥物軛合物”(ADC)或“抗體軛合物”。術語“軛合”被廣泛地使用並且意指任何藥學活性部分或診斷部分與本發明的抗體的共價或非共價締合，而不管締合方法如何。在某些實施方式中，該締合藉由抗體的賴胺酸或半胱胺酸殘基來實現。在一些實施方式中，藥物活性部分或診斷部分可以經由一個或多個位點特異性游離半胱胺酸與抗體軛合。所揭露的ADC可以用於治療和診斷目的。
應理解的是，本發明的ADC可以用於選擇性地將預定的彈頭遞送到靶位置(例如，腫瘤發生細胞和/或表現KREMEN2的細胞)。如本文所陳述，術語“藥物”或“彈頭(warhead)”可以互換使用，並且將意指當引入受試者時具有生理作用或報導功能的任何生物活性的(例如，藥學活性化合物或治療性部分)或可檢測的分子或化合物。為了避免疑惑，這種彈頭包括如下所述的抗癌劑或細胞毒素。“有效載荷(payload)”可以包括藥物或彈頭與視情況的接頭化合物(例如，治療性有效載荷)的組合，該有效載荷較佳的是提供相對穩定的藥物複合物，直到ADC到達靶標。舉例來說，軛合物上的彈頭或藥物可以包含肽、蛋白質或 在體內代謝為活性劑的前藥、聚合物、核酸分子、小分子、結合劑、模擬劑、合成藥物、無機分子、有機分子及放射性同位素。在某些實施方式中，該藥物或彈頭將與抗體藉由接頭共價軛合。在其他實施方式(例如，放射性同位素)中，該藥物或彈頭將直接與抗體軛合或摻入抗體中。
在較佳的實施方式中，所揭露的ADC將在釋放並啟動彈頭(例如，如本文所揭露的PBDS 1-5)之前將結合的有效載荷(例如，藥物接頭)以相對不反應的無毒狀態引導到靶位點。彈頭的這種靶向釋放較佳的是藉由有效載荷和ADC製劑的相對均質的組成物的穩定軛合(例如，經由抗體上的一個或多個半胱胺酸或賴胺酸)來實現，其使過度軛合的(over-conjugated)毒性ADC種類最少化。與藥物相偶聯的接頭被設計為在遞送到腫瘤部位時大量釋放彈頭，本發明的軛合物可以顯著減少不希望的非特異性毒性。這有利地在腫瘤部位提供相對高水平的活性細胞毒素，同時使非靶向細胞和組織的暴露最小化，從而提供增強的治療指數。
如以上所暗示的，雖然本發明的一些實施方式包含摻入治療性部分(例如細胞毒素)的有效載荷，但是摻入診斷劑和生物相容性修飾劑的有效載荷可從所揭露的軛合物提供的靶向遞送中受益。因此，針對示例性治療有效載荷的任何揭露也適用於含有如在此所論述的診斷劑或生物相容性修飾物的有效載荷，除非上下文另有規定。所選有效載荷可以與該抗體共價或非共價連接，並且至少部分取決於用於實現該軛合的方法而展現不同的化學計量的莫耳比。
本發明的軛合物通常可以由下式表示：Ab-[L-D]n或其藥學上可接受的鹽，其中：a)Ab包括抗KREMEN2抗體；b)L包括視情況的接頭；c)D包括藥物；並且d)n係從約1到約20的整數。
熟習該項技術者將理解，根據上述式的軛合物可以使用許多不同的接頭和藥物製造，並且軛合方法將根據組分的選擇而變化。因此，與所揭露的抗體的反應性殘基(例如，半胱胺酸或賴胺酸)締合的任何藥物或藥物接頭化合物係與本文的傳授內容相容的。類似地，允許所選擇的藥物與抗體的軛合(包括位點特異性軛合)的任何反應條件都在本發明的範圍內。儘管如此，本發明的一些較佳的實施方式包含使用穩定劑與如在此所述的溫和還原劑的組合進行的藥物或藥物接頭與游離半胱胺酸的選擇性軛合。這種反應條件傾向於提供更均質的製劑，該製劑具有較少的非特異性軛合和污染物以及相應較少的毒性。
A. 有效載荷和彈頭
1. 治療劑
如所論述的，本發明的抗體可以與包含治療性部分的任何藥學活性化合物或藥物軛合、連接或融合或以其他方式締合，所述藥物如抗癌劑，包括但不限於細胞毒性劑(或細胞毒素)、 細胞生長抑制劑、抗血管生成劑、減瘤劑、化學治療劑、放射性治療劑、靶向性抗癌劑、生物反應修飾劑、癌症疫苗、細胞介素、激素療法、抗轉移劑和免疫治療劑。
示例性抗癌劑或細胞毒素(包括同系物及其衍生物)包含1-脫氫睾酮、安麯黴素(anthramycin)、放線菌素D、博來黴素(bleomycin)、卡奇黴素(包括n-乙醯基卡奇黴素)、秋水仙素(colchicin)、環磷醯胺、細胞鬆弛素(cytochalasin)B、更生黴素(dactinomycin)(以前稱為放線菌素)、二羥基炭疽菌( )、二酮、多卡米新(duocarmycin)、埃米汀(emetine)、表柔比星(epirubicin)、溴化乙錠(ethidium bromide)、依託泊苷(etoposide)、糖皮質激素、短桿菌肽D、利多卡因、(lidocaine)美登木素生物鹼如DM-1和DM-4(Immunogen公司)、苯并二氮呯衍生物(Immunogen公司)、光輝黴素(maytansinoid)、絲裂黴素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、紫杉醇(paclitaxel)、普羅卡因(procaine)、普萘洛爾(propranolol)、嘌呤黴素(puromycin)、替尼泊苷(tenoposide)、丁卡因及以上任一項的藥學上可接受的鹽或溶劑合物、酸或其衍生物。
另外的相容性細胞毒素包含朵拉司他汀和澳瑞他汀(auristatin)，包括單甲基澳瑞他汀E(MMAE)和單甲基澳瑞他汀F(MMAF)(賽特基因公司(Seattle Genetics))；鵝膏菌素，如α-鵝膏菌素、β-鵝膏菌素、γ-鵝膏菌素或ε-鵝膏菌素(海德伯格製藥公司(Heidelberg Pharma))；DNA小溝結合劑，如倍癌黴素(duocarmycin)衍生物(信達加公司(Syntarga))；烷化劑，如經修飾的或二聚的吡咯并苯并二氮呯(PBD)、氮芥、塞替派 (thioepa)、苯丁酸氮芥、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、環磷醯胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、鏈脲佐菌素(streptozotocin)、絲裂黴素(mitomycin)C以及順二氯二氨合鉑(II)(DDP)順鉑；剪接抑制劑，如米亞黴素(meayamycin)類似物或衍生物(例如FR 901464，如U.S.P.N.7,825,267中所陳述)；管結合劑(tubular binding agent)，如埃博黴素(epothilone)類似物和微管蛋白抑制劑(tubulysin)；紫杉醇；及DNA損傷劑，如卡奇黴素(calicheamicin)和埃斯波黴素(esperamicin)；抗代謝物，如胺甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷及5-氟尿嘧啶胺烯咪胺(5-fluorouracil decarbazine)；抗有絲分裂劑，如長春花鹼和長春新鹼；以及蒽環類，如柔紅黴素(daunorubicin)(以前稱為道諾黴素(daunomycin))和多柔比星(doxorubicin)；以及以上任一項的藥學上可接受的鹽或溶劑化物、酸或衍生物。
在所選實施方式中，本發明的抗體可以與抗CD3結合分子締合以募集細胞毒性T細胞並且使其靶向腫瘤發生細胞(百特技術公司(BiTE technology)；參見例如，Fuhrmann等人(2010)Annual Meeting of AACR Abstract No.5625[美國癌症研究學會年會摘要，第5625期])。
在另外的實施方式中，本發明的ADC可以包含使用適當接頭軛合的治療性放射性同位素的細胞毒素。可以與這樣的實施方式可相容的示例性放射性同位素包括但不限於，碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、銅(62Cu、64Cu、67Cu)、硫(35S)、鐳(223Ra)、氚(3H)、銦(115In、113In、112In、111In)、鉍(212Bi、 213Bi)、鍀(99Tc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga、67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、117Sn、76Br、211At以及225Ac。其他放射性核素也可用作診斷和治療劑，尤其是在60到4,000keV能量範圍內的那些。
在其他所選實施方式中，本發明的ADC將與細胞毒性苯并二氮呯衍生物彈頭進行軛合。可以與揭露的抗體軛合的相容性苯并二氮呯衍生物(和視情況的接頭)描述於例如U.S.P.N.8,426,402和PCT申請WO 2012/128868和WO 2014/031566中。與PBD一樣，相容性苯并二氮呯衍生物被認為在DNA的小溝中結合並抑制核酸合成。據報導，該等化合物具有有效的抗腫瘤特性，並且因此特別適用於本發明的ADC。
在一些實施方式中，本發明的ADC可包含PBD及其藥學上可接受的鹽或溶劑合物、酸或衍生物，作為彈頭。PBD係烷化劑，烷化劑藉由共價結合到小溝中的DNA並抑制核酸合成來發揮抗腫瘤活性。已經顯示PBD具有有效的抗腫瘤特性，同時展現出最少的骨髓抑制。與本發明可相容的PBD可以使用若干類型接頭(例如包含馬來醯亞胺部分並帶有游離巰基的肽基接頭)連接到抗體，並且在某些實施方式中呈二聚物形式(即，PBD二聚物)。可以軛合到所揭露的抗體的相容性PBD(和視情況的接頭)描述於例如U.S.P.N.6,362,331、7,049,311、7,189,710、7,429,658、7,407,951、7,741,319、7,557,099、8,034,808、8,163,736、 2011/0256157以及PCT文件WO 2011/130613、WO 2011/128650、WO 2011/130616、WO 2014/057073和WO 2014/057074中。下面緊接著詳細地論述了與本發明相容的PBD化合物的實例。
關於本發明，已經顯示PBD具有有效的抗腫瘤特性，同時表現出最小的骨髓抑制。與本發明相容的PBD可以使用若干類型接頭中的任一種(例如包含馬來醯亞胺部分並帶有游離巰基的肽基接頭)與KREMEN2靶向劑連接，並且在某些實施方式中呈二聚體形式(即，PBD二聚體)。PBD具有以下通用結構：
它們在其芳族A環和吡咯C環中的取代基的數量、類型和位置以及C環的飽和度方面都不同。在B環中，在N10-C11位置上存在亞胺(N=C)、甲醇胺(NH-CH(OH))或甲醇胺甲基醚(NH-CH(OMe))，該位置係負責烷化DNA的親電子中心。所有已知的天然產物在手性C11a位置處具有(S)-組態，當從C環向A環看時，該(S)-組態提供了右旋扭曲。這給予它們針對與B型DNA的小溝的同螺旋性的適當三維形狀，導致在結合位點處的緊密貼合(Kohn,In Antibiotics III.[抗生素III]Springer-Verlag[施普林格出版社]，紐約，第3-11頁(1975)；Hurley和Needham-VanDevanter,Acc.Chem.Res.[化學研究評述]，19,230-237(1986))。它們在小溝中形成加合物的能力使其能夠干擾DNA加工並充當細胞毒性劑。如上暗指的，為了增加其效能，PBD通常以可與本文所述的抗 KREMEN2抗體軛合的二聚體形式使用。
在特別較佳的實施方式中，可以與所揭露的調節劑軛合的相容性PBD描述於U.S.P.N.2011/0256157中。在本揭露中，PBD二聚物，即，包含兩個PBD部分的那些，可以是較佳的。因此，本發明的較佳的軛合物係具有式(AB)或(AC)的那些：
其中：虛線指示在C1與C2或C2與C3之間視情況的存在雙鍵；R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R以及COR，並且視情況進一步選自鹵基或二鹵基；其中RD獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基；R6和R9獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn及鹵基；R7獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、 NO2、Me3Sn及鹵基；R10為連接到如本文所描述的KREMEN2抗體或其片段或衍生物的接頭；Q獨立地選自O、S及NH；R11為H或R，或其中Q為O、SO3M，其中M係金屬陽離子；X選自O、S或N(H)，並且在所選實施方式中，包括O；R”係C3-12伸烷基，其鏈可以間雜有一個或多個雜原子(例如O、S、N(H)、NMe和/或芳香族環，例如苯或吡啶，該等環視情況被取代)；R和R’各自獨立地選自視情況取代的C1-12烷基、C3-20雜環基及C5-20芳基基團，並且視情況與基團NRR’有關，R和R’連同它們所附接的氮原子一起形成視情況取代的4-、5-、6-或7-員雜環狀環；並且其中R2”、R6”、R7”、R9”、X”、Q”以及R11”(如果存在)分別如根據R2、R6、R7、R9、X、Q以及R11所定義，並且RC為封端基團。
下面緊接著更詳細地描述包括上述結構的所選實施方式。
雙鍵
在一個實施方式中，在C1與C2和C2與C3之間不存在雙鍵。
在一個實施方式中，該等虛線指示了在C2與C3之間視情況存在雙鍵，如以下所示：
在一個實施方式中，當R2為C5-20芳基或C1-12烷基時，雙鍵存在於C2與C3之間。在一個較佳的實施方式中，R2包括甲基基團。
在一個實施方式中，該等虛線指示了在C1與C2之間視情況存在雙鍵，如以下所示：
在一個實施方式中，當R2為C5-20芳基或C1-12烷基時，雙鍵存在於C1與C2之間。在一個較佳的實施方式中，R2包括甲基基團。
R2
在一個實施方式中，R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R以及COR，並且視情況進一步選自鹵基或二鹵基。
在一個實施方式中，R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R以及COR。
在一個實施方式中，R2獨立地選自H、=O、=CH2、R、=CH-RD以及=C(RD)2。
在一個實施方式中，R2獨立地為H。
在一個實施方式中，R2獨立地為R，其中R包括CH3。
在一個實施方式中，R2獨立地為=O。
在一個實施方式中，R2獨立地為=CH2。
在一個實施方式中，R2獨立地為=CH-RD。在該PBD化合物內，基團=CH-RD可以具有以下所示的任一組態：
在一個實施方式中，該組態為組態(I)。
在一個實施方式中，R2獨立地為=C(RD)2。
在一個實施方式中，R2獨立地為=CF2。
在一個實施方式中，R2獨立地為R。
在一個實施方式中，R2獨立地為視情況取代的C5-20芳基。
在一個實施方式中，R2獨立地為視情況取代的C1-12烷基。
在一個實施方式中，R2獨立地為視情況取代的C5-20芳基。
在一個實施方式中，R2獨立地為視情況取代的C5-7芳基。
在一個實施方式中，R2獨立地為視情況取代的C8-10芳基。
在一個實施方式中，R2獨立地為視情況取代的苯基。
在一個實施方式中，R2獨立地為視情況取代的萘基。
在一個實施方式中，R2獨立地為視情況取代的吡啶基。
在一個實施方式中，R2獨立地為視情況取代的喹啉基或異喹啉基。
在一個實施方式中，R2帶有一個到三個取代基，其中1個和2個為更較佳的，並且單取代的基團係最較佳的。該等取代可以處於任何位置。
在R2為C5-7芳基的情況下，單一取代基較佳的是處於不與到該化合物的其餘部分的鍵相鄰的環原子上，即，較佳的是在相對於到該化合物的其餘部分的鍵的β或γ位。因此，在C5-7芳基為苯基的情況下，該取代基較佳的是在間位或對位，並且更較佳的是在對位中。
在一個實施方式中，R2選自：
其中星號指示附接點。
在R2為C8-10芳基，例如喹啉基或異喹啉基的情況下，它可以在該等喹啉或異喹啉環的任何位置處帶有任何數量的取代基。在一些實施方式中，它帶有一個、兩個或三個取代基，並且該等取代基可以位於近端或遠端環或兩者(如果有超過一個取代基)上。
在一個實施方式中，在R2視情況被取代的情況下，該等取代基選自以下取代基部分中所給的那些取代基。
在R視情況被取代的情況下，該等取代基較佳的是選自： 鹵基、羥基、醚、甲醯基、醯基、羧基、酯、醯氧基、胺基、醯胺基、醯基醯胺基、胺基羰氧基、脲基、硝基、氰基及硫醚。
在一個實施方式中，在R或R2視情況被取代的情況下，該等取代基選自由以下各項組成之群組：R、OR、SR、NRR’、NO2、鹵基、CO2R、COR、CONH2、CONHR以及CONRR’。
在R2為C1-12烷基的情況下，視情況的取代基可以另外地包括C3-20雜環基和C5-20芳基。
在R2為C3-20雜環基的情況下，視情況的取代基可以另外地包括C1-12烷基和C5-20芳基。
在R2為C5-20芳基的情況下，視情況的取代基可以另外地包括C3-20雜環基和C1-12烷基。
應瞭解的是，術語“烷基”涵蓋烯基和炔基以及環烷基亞類。因此，在R2為視情況取代的C1-12烷基的情況下，應瞭解的是，該烷基視情況含有一個或多個碳-碳雙鍵或三鍵，該等鍵可以形成軛合系統的一部分。在一個實施方式中，該視情況取代的C1-12烷基含有至少一個碳-碳雙鍵或三鍵，並且該鍵與出現在C1與C2或C2與C3之間的雙鍵軛合。在一個實施方式中，該C1-12烷基係選自飽和C1-12烷基、C2-12烯基、C2-12炔基和C3-12環烷基。
如果在R2上的取代基為鹵基，那麼它較佳的是為F或Cl，更較佳的是為Cl。
如果在R2上的取代基為醚，那麼在一些實施方式中，它可以是烷氧基，例如C1-7烷氧基(例如甲氧基、乙氧基)， 或在一些實施方式中，它可以是C5-7芳氧基(例如苯氧基、吡啶氧基、呋喃氧基)。
如果在R2上的取代基為C1-7烷基，那麼它可以較佳的是為C1-4烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基)。
如果在R2上的取代基為C3-7雜環基，那麼在一些實施方式中，它可以是含C6氮的雜環基，例如啉基、硫啉基、哌啶基、哌基。該等基團可以經由氮原子結合到PBD部分的其餘部分。該等基團可以進一步被例如C1-4烷基取代。
如果在R2上的取代基為雙-氧基-C1-3伸烷基，那麼這較佳的是為雙-氧基-亞甲基或雙-氧基-伸乙基。
R2的特別較佳的取代基包括甲氧基、乙氧基、氟代、氯代、氰基、雙-氧基-亞甲基、甲基-哌基、啉基及甲基-噻吩基。
特別較佳的取代的R2基團包括但不限於，4-甲氧基-苯基、3-甲氧基苯基、4-乙氧基-苯基、3-乙氧基-苯基、4-氟代-苯基、4-氯代-苯基、3,4-雙氧基亞甲基-苯基、4-甲基噻吩基、4-氰基苯基、4-苯氧基苯基、喹啉-3-基及喹啉-6-基、異喹啉-3-基及異喹啉-6-基、2-噻吩基、2-呋喃基、甲氧基萘基及萘基。
在一個實施方式中，R2為鹵基或二鹵基。在一個實施方式中，R2為-F或-F2，該等取代基在以下分別地以(III)和(IV)說明：
RD
在一個實施方式中，RD獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基。
在一個實施方式中，RD獨立地為R。
在一個實施方式中，RD獨立地為鹵基。
R6
在一個實施方式中，R6獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn-及鹵基。
在一個實施方式中，R6獨立地選自H、OH、OR、SH、NH2、NO2及鹵基。
在一個實施方式中，R6獨立地選自H和鹵基。
在一個實施方式中，R6獨立地為H。
在一個實施方式中，R6和R7一起形成基團-O-(CH2)p-O-，其中p為1或2。
R7
R7獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn及鹵基。
在一個實施方式中，R7獨立地為OR。
在一個實施方式中，R7獨立地為OR7A，其中R7A獨立地為視情況取代的C1-6烷基。
在一個實施方式中，R7A獨立地為視情況取代的飽和C1-6烷基。
在一個實施方式中，R7A獨立地為視情況取代的C2-4烯基。
在一個實施方式中，R7A獨立地為Me。
在一個實施方式中，R7A獨立地為CH2Ph。
在一個實施方式中，R7A獨立地為烯丙基。
在一個實施方式中，該化合物係一種二聚物，其中每一單體的R7基團一起形成連接單體的具有式X-R〃-X的二聚物橋。
R9
在一個實施方式中，R9獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn-及鹵基。
在一個實施方式中，R9獨立地為H。
在一個實施方式中，R9獨立地為R或OR。
R10
較佳的是相容性接頭(如本文所述的那些)藉由在R10位(即，N10)處的一個或多個共價鍵將KREMEN2抗體連接到PBD藥物部分。
Q
在某些實施方式中，Q獨立地選自O、S和NH。
在一個實施方式中，Q獨立地為O。
在一個實施方式中，Q獨立地為S。
在一個實施方式中，Q獨立地為NH。
R11
在所選實施方式中，R11為H或R，或其中Q為O，可以為SO3M，其中M為金屬陽離子。該陽離子可以是Na+。
在某些實施方式中，R11為H。
在某些實施方式中，R11為R。
在某些實施方式中，其中Q為O，R11為SO3M，其中M為金屬陽離子。該陽離子可以是Na+。
在某些實施方式中，其中Q為O，R11為H。
在某些實施方式中，其中Q為O，R11為R。
X
在一個實施方式，X選自O、S或N(H)。
較佳的是，X為O。
R”
R”係C3-12伸烷基，其鏈可以間雜有一個或多個雜原子，例如O、S、N(H)、NMe和/或芳香族環，例如苯或吡啶，該等環視情況被取代。
在一個實施方式中，R”為C3-12伸烷基，其鏈可以間雜有一個或多個雜原子和/或芳香族環，例如苯或吡啶。
在一個實施方式中，該伸烷基視情況間雜有一個或多個選自O、S及NMe的雜原子和/或芳香族環，該等環視情況被取代。
在一個實施方式中，該芳香族環為C5-20伸芳基，其中伸芳基屬於藉由從芳香族化合物的兩個芳香族環原子去除兩個氫原子獲得的二價部分，該部分具有從5到20個環原子。
在一個實施方式中，R”為C3-12伸烷基，其鏈可以間雜有一個或多個雜原子，例如O、S、N(H)、NMe和/或芳香族環，例如苯或吡啶，該等環視情況被NH2取代。
在一個實施方式中，R”為C3-12伸烷基。
在一個實施方式中，R”選自C3、C5、C7、C9以及C11伸烷基。
在一個實施方式中，R”選自C3、C5以及C7伸烷基。
在一個實施方式中，R”選自C3和C5伸烷基。
在一個實施方式中，R”為C3伸烷基。
在一個實施方式中，R”為C5伸烷基。
以上所列的伸烷基可以視情況間雜有一個或多個雜原子和/或芳香族環，例如苯或吡啶，該等環視情況被取代。
以上所列的伸烷基可以視情況間雜有一個或多個雜原子和/或芳香族環，例如苯或吡啶。
以上所列的伸烷基可以為未取代的線性脂肪族伸烷基。
R和R’
在一個實施方式中，R獨立地選自視情況取代的C1-12烷基、C3-20雜環基及C5-20芳基。
在一個實施方式中，R獨立地為視情況取代的C1-12烷基。
在一個實施方式中，R獨立地為視情況取代的C3-20雜環基。
在一個實施方式中，R獨立地為視情況取代的C5-20芳基。
以上關於R2的描述係與較佳的烷基和芳基以及視情況的取代基的身份和數目有關的不同實施方式。適當時，由於R2適用於R，故關於其所陳述的優先選擇適用於所有其他R，例如，其中R6、R7、R8或R9為R。
關於R的優先選擇也適用於R’。
在本發明的一些實施方式中，提供了一種具有取代基-NRR’的化合物。在一個實施方式中，R和R’連同它們所附接的氮原子形成視情況取代的4-、5-、6-或7-員雜環狀環。該環可以含有另外的雜原子，例如N、O或S。
在一個實施方式中，該雜環狀環本身被基團R取代。在另外的N雜原子存在的情況下，該取代基可以位於該N雜原子上。
除了上述PBD之外，某些二聚體PBD已經顯示出特別有活性並且可以與本發明結合使用。為此，本發明的抗體藥物 軛合物(即如本文所揭露的ADC 1-6)可以包含下文緊接著作為PBD 1-5列出的PBD化合物。請注意，下面的PBD 1-5包含分離接頭後釋放的細胞毒性彈頭，如本文更詳細描述的那些。作為藥物-接頭化合物的組分的PBD 1-5各自的合成極詳細地呈現於WO 2014/130879中，將其關於這樣的合成藉由引用結合在此。鑒於WO 2014/130879，可包含本發明的ADC的所選彈頭的細胞毒性化合物可以如本文所陳述地容易地生成和使用。因此，在從接頭分離時可以從所揭露的ADC中釋放的所選PBD化合物緊接著示於以下： 、 、 、 以及
應理解的是，上述每個二聚體PBD彈頭將較佳的是在靶細胞內化和接頭破壞時釋放。如下面更詳細描述的，某些接頭將包含可切割的接頭，其可以摻入允許活性PBD彈頭釋放而不保留接頭的任何部分的自滅部分。釋放後，PBD彈頭將與靶細胞的DNA結合並交聯。據報導，這種結合阻斷了靶癌細胞的分裂而不扭曲其DNA螺旋，從而潛在地避免了出現耐藥性的普遍現象。在其他較佳的實施方式中，彈頭可以藉由不包含自滅部分的可切割接頭而與KREMEN2靶向部分連接。
根據本揭露，這樣的化合物在一個或多個腫瘤部位的遞送和釋放可以證明在治療或管理增生性病症方面是臨床上有效的。關於所述化合物，應理解的是，每個揭露的PBD在每個C-環中具有兩個sp2中心，這可以允許比在每個C-環中僅具有一個sp2中心的化合物的在DNA的小溝中具有更強的結合(以及由此產生的更大的毒性)。因此，當用於如本文所陳述的KREMEN2 ADC時，所揭露的PBD可以證明對於增生性病症的治療特別有效。
上文提供了與本發明相容的示例性PBD化合物，並且決不意味著限制根據本文的傳授內容可以成功摻入抗KREMEN2軛合物中的其他PBD。而是，可以與如本文所述和下文實例中所陳述的抗體軛合的任何PBD係與所揭露的軛合物相容的，並且明確地在本發明的界限和範圍內。
除了上述試劑之外，本發明的抗體還可以與生物反應修飾劑軛合。在某些實施方式中，該生物反應修飾劑將包括白細胞介素2、干擾素或各種類型的集落刺激因子(例如，CSF、GM-CSF、G-CSF)。
更一般地，相關藥物部分可以是具有所希望的生物活性的多肽。這樣的蛋白質可以包括例如毒素，如相思豆毒素(abrin)、蓖麻毒素(ricin)A、豹蛙酶(Onconase)(或另一種細胞毒性RNA酶)、綠膿桿菌外毒素(pseudomonas exotoxin)、霍亂毒素(cholera toxin)、白喉毒素(diphtheria toxin)；凋亡劑，如腫瘤壞死因子(例如TNF-α或TNF-β)、α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板衍生的生長因子、組織纖溶酶原活化物、AIM I(WO 97/33899)、AIM II(WO 97/34911)、Fas配位基(Takahashi等人，1994,PMID：7826947)及VEGI(WO 99/23105))、血栓劑、抗血管生成劑(例如，血管抑素或內皮抑素)、淋巴因子(例如，白細胞介素-1(IL-1)、白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-6(IL-6)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)及粒細胞集落刺激因子(G-CSF))或生長因子(例如，生長激素(GH))。
2. 診斷劑或檢測劑
在其他實施方式中，將本發明的抗體或其片段或衍生物軛合到一種診斷或可檢測試劑、標記物或報導子(它可以例如為生物分子(例如肽或核苷酸)、小分子、螢光團或放射性同位素)。標記的抗體可以用於監測過度增生性病症的進展或進程，或作為一種臨床測試程序的一部分，以確定包括所揭露的抗體的特 定療法(即，治療診斷劑)的功效或確定治療的未來過程。該等標記物或報導子也可以用於純化所選抗體、用於抗體分析學(例如表位結合或抗體分倉)、分開或分離腫瘤發生細胞、或用於臨床前程序或毒理學研究中。
可藉由將抗體與可檢測物質偶聯完成這種診斷、分析和/或檢測，所述可檢測物質包括但不限於各種酶，包括例如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙醯膽鹼酯酶；輔基，例如但不限於，鏈酶親和素(streptavidinlbiotin)/生物素和親和素/生物素；螢光物質，例如但不限於傘形酮(umbelliferone)、螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、二氯三基胺螢光素、丹磺醯氯或藻紅蛋白；發光物質，例如但不限於，魯米諾(luminol)；生物螢光物質，例如但不限於，螢光素酶、螢光素和水母蛋白；放射性物質，例如但不限於，碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(115In、113In、112In、111In)、鍀(99Tc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga、67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、89Zr、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn以及117Tin；使用不同正電子發射斷層掃描的正電子發射金屬、非放射性順磁性金屬離子、以及放射性標記的或與軛合到特定放射性同位素的分子。在這樣的實施方式中，適當的檢測方法係本領域熟知的並且可容易地從眾多商業來源獲得。
在其他實施方式中，可以將抗體或其片段與標記物 序列或化合物(如肽或螢光團)融合或偶聯以促進純化或診斷或分析程序，如免疫組織化學、生物層干涉法、表面電漿共振、流式細胞測量術、競爭性ELISA、FAC等。在一些實施方式中，該標記物包含組胺酸標籤，如由pQE載體(凱傑公司(Qiagen))等提供的那些，其中有許多係可商購的。可用於純化的其他肽標籤包括但不限於，血球凝集素“HA”標籤，該標籤對應於衍生自流感血球凝集素蛋白的表位(Wilson等人，1984,Cell[細胞]37：767)；及“flag”標籤(U.S.P.N.4,703,004)。
3. 生物相容性修飾劑
在所選實施方式中，必要時，本發明的抗體可以與生物相容性修飾劑軛合，該等修飾劑可以用於調整、改變、改善或緩和抗體表徵。例如，可以藉由附接相對較高分子量的聚合物分子(如可商購的聚乙二醇(PEG)或類似的生物相容性聚合物)來產生具有增加的體內半衰期的抗體或融合構建體。熟習該項技術者應理解，獲得的PEG可以呈許多不同的分子量和分子構象，可以對該等進行選擇以賦予該抗體特定特性(例如，可以裁剪半衰期)。PEG可以在存在或不存在多官能接頭的情況下，藉由PEG與所述抗體或抗體片段的N-末端或C-末端軛合或經由賴胺酸殘基上存在的ε-胺基而附接到抗體或抗體片段或衍生物。可以使用使生物活性的損失最少的線性或分支聚合物衍生化。軛合程度可以藉由SDS-PAGE和質譜法密切監測，以確保PEG分子與抗體的最佳軛合。可以藉由例如尺寸排除或離子交換層析來從抗體PEG軛合物中分離未反應的PEG。以類似的方式，可以將所揭露的抗體軛合到白 蛋白，以使該抗體或抗體片段在體內更穩定或具有更長的體內半衰期。該等技術係本領域中眾所周知的，參見例如，WO 93/15199、WO 93/15200及WO 01/77137；及EP 0 413,622。其他生物相容性軛合物對於熟習該項技術者係顯而易見的並且可以容易地根據在此的傳授內容鑒定。
B. 接頭化合物
如上所指示，與本發明相容的有效載荷包括一個或多個彈頭以及視情況將彈頭與抗體靶向劑締合的接頭。許多接頭化合物可用於將本發明的抗體軛合到相關的彈頭上。所述接頭僅需要與抗體上的反應性殘基(較佳的是半胱胺酸或賴胺酸)和所選的藥物化合物共價結合。因此，與所選抗體殘基反應並可用於提供本發明的相對穩定的軛合物(位點特異性或其他)的任何接頭都與本文的傳授內容相容。
相容的接頭可以有利地與親核的經還原的半胱胺酸和賴胺酸進行結合。涉及經還原的半胱胺酸和賴胺酸的軛合反應包括但不限於，硫醇-馬來醯亞胺、硫醇-鹵(醯鹵)、硫醇-烯、硫醇-炔、硫醇-乙烯基碸、硫醇-雙碸、硫醇-硫代磺酸酯、硫醇-吡啶基二硫化物和硫醇-對氟反應。如在此進一步所論述的，硫醇-馬來醯亞胺生物軛合係最廣泛使用的方法之一，歸因於其快速反應速率和溫和的軛合條件。該方法的一個問題係反-邁克爾反應(retro-Michael reaction)以及來自抗體的馬來醯亞胺連接的有效載荷損失或轉移到電漿中的其他蛋白質(例如像人類血清白蛋白)的可能性。然而，在一些實施方式中，使用如在本文以下實例中 所陳述的選擇性還原和位點特異性抗體可用於穩定軛合物並減少這種不希望的轉移。硫醇-醯鹵反應提供了不能進行反-邁克爾反應並因此更穩定的生物軛合物。然而，與基於馬來醯亞胺的軛合相比，硫醇-鹵化物反應通常具有較慢的反應速率，並且因此在提供不希望的藥物與抗體比方面效率不高。硫醇-吡啶基二硫化物反應係另一種流行的生物軛合途徑。吡啶基二硫化物與游離硫醇進行快速交換，得到混合二硫化物和吡啶-2-硫酮的釋放。混合二硫化物可以在釋放有效載荷的還原性細胞環境中被裂解。在生物軛合中獲得更多關注的其他方法係硫醇-乙烯基碸和硫醇-雙碸反應，其中每一種都與此處的傳授內容相容並且明確地包括在本發明的範圍內。
在所選實施方式中，相容性接頭將賦予ADC在細胞外環境中的穩定性，防止ADC分子的聚集並保持ADC自由地溶解於水性介質中並處於單體狀態。在運輸或遞送到細胞中之前，ADC較佳的是為可溶的並且保持完整，即，該抗體保持連接到藥物部分。雖然所述接頭在靶細胞外係穩定的，但它們可以被設計成在細胞內部以某一有效速率裂解或降解。因此，有效的接頭將：(i)維持該抗體的特異性結合特性；(ii)允許該軛合物或藥物部分的細胞內遞送；(iii)保持穩定和完整，即，未裂解或降解，直到該軛合物已經被遞送或運輸到其靶位點；並且(iv)維持藥物部分的細胞毒性、殺細胞作用或細胞生長抑制作用(在某些情況下，包括任何旁觀者效應)。ADC的穩定性可以藉由標準分析技術如HPLC/UPLC、質譜、HPLC以及分離/分析技術LC/MS和LC/MS/MS來測量。如上所陳述，抗體與藥物部分的共價附接需要該接頭具 有兩個反應性官能團，即，在反應性的意義上為二價的。可用於附接兩個或更多個功能性或生物活性部分(如MMAE和抗體)的二價接頭試劑係已知的，並且已經描述了提供與本文的傳授內容相容的所得軛合物的方法。
與本發明相容的接頭可以廣泛地分類為可裂解和不可裂解的接頭。可以包括酸不穩定接頭(例如肟和腙)、蛋白酶可裂解接頭和二硫鍵接頭的可裂解接頭被內化到靶細胞中，並在細胞內部的內體-溶酶體途徑中被裂解。細胞毒素的釋放和活化依賴於促進酸不穩定化學鍵(如腙或肟)裂解的內體/溶酶體酸性區室。如果將溶酶體特異性蛋白酶裂解位點工程化成接頭，則細胞毒素將在其細胞內靶標附近釋放。可替代地，含有混合二硫化物的接頭提供了細胞毒性有效載荷在細胞內釋放的方法，因為它們在細胞的還原環境(而不是血流中的富氧環境)中被選擇性地裂解。相比之下，含有醯胺連接的聚乙二醇或烷基間隔物的相容性不可裂解的接頭在靶細胞內的ADC的溶酶體降解期間釋放有毒的有效載荷。在某個方面，接頭的選擇將取決於在軛合物、特定適應症和抗體靶標中使用的具體藥物。
因此，本發明的某些實施方式包含藉由裂解劑可裂解的接頭，該接頭存在於細胞內環境中(例如，在溶酶體或核內體或細胞凹陷內)。該接頭可以例如為一種肽基接頭，它被細胞內的肽酶或蛋白酶(包括但不限於，溶酶體或核內體蛋白酶)裂解。在一些實施方式中，該肽基接頭為至少兩個胺基酸長或至少三個胺基酸長。裂解劑可以包括組織蛋白酶B和D及纖溶酶，已知它們 各自水解二肽藥物衍生物，引起靶細胞內部活性藥物的釋放。藉由硫醇依賴性蛋白酶組織蛋白酶-B可裂解的示例性肽基接頭係包含Phe-Leu的肽，因為已經發現組織蛋白酶-B在癌組織中高度表現。這樣的接頭的其他實例例如描述於U.S.P.N.6,214,345中。在特定實施方式中，由細胞內的蛋白酶可裂解的肽基接頭為Val-Cit接頭、Val-Ala接頭或Phe-Lys接頭。使用該治療劑的細胞內蛋白水解釋放的一個優勢係當軛合時該藥劑典型地衰減，並且該軛合物的血清穩定性相對較高。
在其他實施方式中，該可裂解接頭係pH敏感的。典型地，該pH敏感性接頭將在酸性條件下可水解。例如，可以使用在溶酶體中可水解的酸不穩定性接頭(例如，腙、肟、縮胺基脲、縮胺基硫脲、順-烏頭醯胺、原酸酯、乙縮醛、縮酮等)(參見例如，U.S.P.N.5,122,368；5,824,805；5,622,929)。這樣的接頭在中性pH條件(如在血液中的那些)下相對穩定，但在低於pH 5.5或5.0(其與溶酶體的pH值近似)下不穩定(例如，可裂解)。
在又其他實施方式中，該接頭在還原條件下為可裂解的(例如，二硫化物接頭)。本領域中已知多種二硫化物接頭，包括例如，可以使用SATA(N-琥珀醯亞胺基-S-乙醯基硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)及SMPT(N-琥珀醯亞胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)形成的那些。在又其他特定實施方式中，該接頭係丙二酸酯接頭(Johnson等人，1995,Anticancer Res.[抗癌研究]15：1387-93)、馬來醯亞胺 苯甲醯基接頭(Lau等人，1995,Bioorg-Med-Chem.[生物有機化學與醫藥化學]3(10)：1299-1304)、或3′-N-醯胺類似物(Lau等人，1995,Bioorg-Med-Chem.[生物有機化學與醫藥化學]3(10)：1305-12)。
在本發明的某些方面，所選接頭將包含具有下式的化合物：
其中星號表示與藥物的自消附接點，CBA(即細胞結合劑)包含抗KREMEN2抗體，L1包含接頭單元和視情況可裂解的接頭單元，A係將L1連接到抗體上的反應性殘基的連接基團(視情況包含間隔子)，L2較佳的是共價鍵，並且可能存在或可能不存在的U可以包括全部或部分自消單元，其有利於在腫瘤部位完全分離接頭與彈頭。
在一些實施方式(例如在U.S.P.N.2011/0256157中所陳述的那些)中，相容性接頭可以包括：
其中星號表示與藥物的附接點，CBA(即細胞結合劑)包含抗KREMEN2抗體，L1包含接頭和視情況可裂解的接頭，A係將L1連接到抗體上的反應性殘基的連接基團(視情況包含間隔子)，並且L2係共價鍵或與-OC(=O)-一起形成自消部分。
應理解的是，在存在的情況下，L1和L2的性質可以變化極大。該等基團係基於其裂解特徵而選擇，該等特徵可以藉由該軛合物將被遞送到其的位點處的條件規定。在酶作用下裂解的那些接頭係較佳的，不過也可以使用藉由pH值(例如，酸或鹼不穩定的)、溫度改變或在照射時(例如，光不穩定的)而可裂解的接頭。在還原或氧化條件下可裂解的接頭也可以用於本發明中。
在某些實施方式中，L1可以包含連續的胺基酸序列。該胺基酸序列可以是酶裂解的靶底物，借此允許該藥物釋放。
在一個實施方式中，L1係藉由酶作用可裂解的。在一個實施方式中，該酶係酯酶或肽酶。
在另一個實施方式中，L1係組織蛋白酶不穩定性接頭。
在一個實施方式中，L1包含二肽。該二肽可以表示為-NH-X1-X2-CO-，其中-NH-和-CO-分別表示胺基酸基團X1和X2的N-末端和C-末端。該二肽中的胺基酸可以是天然胺基酸的任何組合。在該接頭為一種組織蛋白酶不穩定性接頭的情況下，該二肽可以是組織蛋白酶介導的裂解的作用位點。
另外地，對於具有羧基或胺基側鏈官能團的那些胺基酸(分別例如Glu和Lys)，CO和NH可以表示該側鏈的官能團。
在一個實施方式中，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基團-X1-X2-選自：-Phe-Lys-、-Val-Ala-、-Val-Lys-、-Ala-Lys-、-Val-Cit-、-Phe-Cit-、-Leu-Cit-、-Ile-Cit-、-Phe-Arg-以及-Trp-Cit-，其中Cit 係瓜胺酸。
較佳的是，二肽-NH-X1-X2-CO-中的基團-X1-X2-選自：-Phe-Lys-、-Val-Ala-、-Val-Lys-、-Ala-Lys-以及-Val-Cit-。
最較佳的是，二肽NH-X1-X2-CO-中的基團-X1-X2-為-Phe-Lys-或-Val-Ala-或Val-Cit。在某些所選實施方式中，該二肽將包含-Val-Ala-。
在一個實施方式中，L2以共價鍵的形式存在。
在一個實施方式中，L2係存在的並且與-C(=O)O-一起形成自消接頭。在一個實施方式中，L2為酶活性的底物，借此允許該彈頭釋放。
在一個實施方式中，在L1在酶作用下可裂解並且L2存在的情況下，該酶將L1與L2之間的鍵裂解。
L1和L2，在存在的情況下，可以藉由選自以下的鍵而連接：-C(=O)NH-、-C(=O)O-、-NHC(=O)-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、-NHC(=O)O-、-OC(=O)NH-以及-NHC(=O)NH-。
L1中連接到L2的胺基可以是胺基酸的N-末端，或可以衍生自胺基酸側鏈的胺基，例如賴胺酸胺基酸側鏈。
L1中連接到L2的羧基可以是胺基酸的C-末端，或可以衍生自胺基酸側鏈的羧基，例如穀胺酸胺基酸側鏈。
L1中連接到L2的羥基可以衍生自胺基酸側鏈的羥基，例如絲胺酸胺基酸側鏈。
術語“胺基酸側鏈”包括見於以下各項中的那些基團：(i)天然存在的胺基酸，如丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、穀胺醯胺、穀胺酸、甘胺酸、組胺酸、異亮胺酸、亮胺酸、賴胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸；(ii)微量胺基酸，如鳥胺酸和瓜胺酸；(iii)非天然胺基酸、β-胺基酸、天然存在的胺基酸的合成類似物和衍生物；及(iv)其所有對映異構體、非對映異構體、同分異構富集的、同位素標記的(例如，2H、3H、14C、15N)、受保護的形式及外消旋混合物。
在一個實施方式中，-C(=O)O-和L2一起形成以下基團：
其中星號指示與藥物或細胞毒性劑位置的附接點，波浪線指示與接頭L1的附接點，Y為-N(H)-、-O-、-C(=O)N(H)-或-C(=O)O-，並且n為0到3。該伸苯基環視情況被一個、兩個或三個取代基取代。在一個實施方式中，該伸苯基視情況被鹵基、NO2、烷基或羥基烷基取代。
在一個實施方式中，Y係NH。
在一個實施方式中，n係0或1。較佳的是，n為0。
在Y為NH並且n為0時，自消接頭可以稱為對-胺基苄基羰基接頭(PABC)。
在其他實施方式中，該接頭可以包括自消接頭並且與二肽一起形成基團-NH-Val-Cit-CO-NH-PABC-。在其他所選實施方式中，該接頭可以包括基團-NH-Val-Ala-CO-NH-PABC-，其示於以下：
其中星號指示與所選細胞毒性部分的附接點，並且波浪線指示與可軛合到該抗體的接頭(例如間隔子-抗體結合區段)的其餘部分的附接點。在酶促裂解該二肽之後，當遠端位點活化時，該自消接頭將允許完全釋放受保護的化合物(即，細胞毒素)，沿以下所示的路線進行：
其中星號指示與所選細胞毒性部分的附接點，並且L*係包含現在切割的肽基單元的接頭的其餘部分的活化形式。彈頭的完全釋放確保它將保持所希望的毒性活性。
在一個實施方式中，A係共價鍵。因此，L1和抗體係直接連接的。例如，在L1包含連續胺基酸序列的情況下，該序列的N-末端可以直接地連接到抗體殘基。
在另一個實施方式中，A係間隔基。因此，L1和抗體係間接地連接的。
在某些實施方式中，L1和A可以藉由選自以下的鍵連接：-C(=O)NH-、-C(=O)O-、-NHC(=O)-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、-NHC(=O)O-、-OC(=O)NH-以及-NHC(=O)NH-。
如將在以下更詳細論述的，本發明的藥物接頭將較佳的是與半胱胺酸(包括游離半胱胺酸)上的活性硫醇親核試劑連接。為此，抗體的半胱胺酸可以藉由用不同還原劑如DTT或TCEP或如在此所陳述的溫和還原劑進行處理而與接頭試劑軛合反應來製造。在其他實施方式中，本發明的藥物接頭將較佳的是與賴胺酸連接。
較佳的是，該接頭含有親電子官能團，用於與該抗體上的親核官能團反應。在抗體上的親核基團包括但不限於：(i)N-末端胺基；(ii)側鏈胺基，例如賴胺酸；(iii)側鏈硫醇基，例如半胱胺酸；及(iv)糖羥基或胺基，其中該抗體為糖基化的。胺、硫醇及羥基係親核性的並且能夠與接頭部分和接頭試劑上的親電子基團反應形成共價鍵，該等接頭部分和接頭試劑包括：(i)馬來醯亞胺基；((ii)活化的二硫化物；(iii)活性酯，如NHS(N-羥基琥珀醯亞胺)酯、HOBt(N-羥基苯并三唑)酯、鹵代甲酸酯及醯基鹵；(iv)烷基和苯甲基鹵化物，如鹵代乙醯胺；以及(v)醛、酮和羧基。
與本發明相容的示例性官能團緊接著示於以下：
在一些實施方式中，半胱胺酸(包括位點特異性抗體的游離半胱胺酸)與藥物-接頭部分之間的連接係藉由存在於接頭上的硫醇殘基和末端馬來醯亞胺基團進行的。在這樣的實施方式中，抗體與藥物-接頭之間的連接可以如下：
其中星號指示與藥物-接頭的其餘部分的附接點，並且波浪線指示與抗體的其餘部分的附接點。在該實施方式中，S原子較佳的是衍生自位點特異性游離半胱胺酸。
關於其他相容性接頭，結合部分可以包含可與抗體上的活化的殘基反應以提供所希望的軛合物的末端溴乙醯胺或碘乙醯胺。在任何情況下，鑒於本揭露，熟習該項技術者可以容易地將所揭露的每一藥物-接頭化合物與相容性抗KREMEN2抗體(包括位點特異性抗體)軛合。
根據本揭露，本發明提供了製備相容性抗體藥物軛合物之方法，該方法包括將抗KREMEN2抗體與選自下組的藥物-接頭化合物軛合，該組由以下組成： DL4 以及
出於即時應用的目的，將DL用作“藥物-接頭”(或式Ab-[L-D]n中的接頭-藥物“L-D”)的縮寫並且將包含如以上所示的藥物接頭1-6(即DL1、DL2、DL3、DL4、DL5和DL6)。請注意，DL1和DL6包含相同的彈頭和相同的二肽亞基，但連接基團間隔子不同。因此，切割接頭後，DL1和DL6都釋放PBD1。
應理解的是，使用本領域認可的技術，附有末端馬來醯亞胺部分(DL1-DL4和DL6)或碘乙醯胺部分(DL5)的接頭可以與所選KREMEN2抗體上的一個或多個游離巰基軛合。前述化合物的合成途徑陳述於WO 2014/130879中，其明確地藉由引用結 合在此，用於合成上述DL化合物，而在下面的實例中陳述了軛合該等PBD接頭組合的具體方法。
因此，在所選方面，本發明涉及與所揭露的DL部分軛合的KREMEN2抗體，以提供緊接著在下面的ADC 1-6中大體上示出的KREMEN2免疫軛合物。因此，在某些方面，本發明涉及選自下組的抗體藥物軛合物，該組由以下組成： ADC 3、 以及
其中Ab包含抗KREMEN2抗體或其免疫反應性片段，並且n係從1到20的整數。在某些實施方式中，n將包含從1到8的整數，並且在所選實施方式中，n將包含2或4。
熟習該項技術者將理解，上述ADC結構由式Ab-[L-D]n定義，並且如本文所描繪的多於一個藥物接頭分子可以共價軛合至KREMEN2抗體(例如，n可以是從約1到約20的整數)。更具體地說，如下面更詳細論述的，應理解，多於一個有效載荷可以與每個抗體軛合，並且以上示意圖必須如此解釋。舉例來說，如上所示的ADC6可以包含與1、2、3、4、5、6、7或8個或更多個有效載荷軛合的KREMEN2抗體，並且此類ADC的組成物通常將包含載藥物質的混合物。
在某些方面，本發明的KREMEN2 PBD ADC將包含如所附實例中所陳述的抗KREMEN2抗體或其免疫反應性片段。在一個具體的實施方式中，ADC3將包含hSC78.43ss1MJ(例如，hSC78.43ss1MJ PBD1)。在其他方面，本發明的KREMEN2 PBD ADC將包含hSC78.56ss1MJ(例如，hSC78.56ss1MJ PBD1)。在這樣的實施方式中，ADC將較佳的是包含2個有效載荷。在其他較佳的實施方式中，KREMEN2 ADC將包括ADC6，其中n係2。
C. 軛合
應理解的是，可以使用許多熟知的反應來將藥物部分和/或接頭附接到所選抗體上。例如，利用半胱胺酸的巰基的各種反應可用於軛合所希望的部分。一些實施方式將包含如以下詳細論述的抗體的軛合物，該抗體的軛合物包含一個或多個游離半胱胺酸。在其他實施方式中，本發明的ADC可以藉由將藥物與存在於所選抗體中的賴胺酸殘基的溶劑暴露的胺基基團進行軛合而產生。仍其他實施方式包括N-末端蘇胺酸和絲胺酸殘基的活化， 它們然後可用於將所揭露的有效載荷與抗體附接。將較佳的是裁剪所選軛合方法以優化與抗體附接的藥物的數量並提供相對較高的治療指數。
用於將治療性化合物與半胱胺酸殘基軛合的各種方法係本領域已知的，並且對於熟習該項技術者而言係顯而易見的。在鹼性條件下，半胱胺酸殘基將被去質子化以產生硫醇鹽親核試劑，其可以與軟親電子試劑如馬來醯亞胺和碘乙醯胺進行反應。通常用於這種軛合的試劑可以直接與半胱胺酸硫醇進行反應以形成軛合蛋白或與接頭-藥物進行反應以形成接頭-藥物中間體。在接頭的情況下，利用有機化學反應、條件和試劑的若干路徑係熟習該項技術者已知的，該等路徑包括：(1)本發明的蛋白的半胱胺酸基團與接頭試劑的反應，以經由共價鍵形成蛋白質-接頭中間體，之後與活化的化合物反應；和(2)化合物的親核基團與接頭試劑的反應，以經由共價鍵形成藥物-接頭中間體，之後與本發明的蛋白的半胱胺酸基團反應。從前述對於熟習該項技術者來說顯而易見的是，雙功能(或二價)接頭可用於本發明。例如，雙功能接頭可以包含用於與一個或多個半胱胺酸殘基共價連接的硫醇修飾基團以及用於與該化合物共價或非共價連接的至少一個附接部分(例如第二硫醇修飾部分)。
在軛合之前，可以藉由用還原劑如二硫蘇糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP))處理來使抗體對於與接頭試劑軛合具有反應性。在其他實施方式中，可以藉由賴胺酸與試劑(包括但不限於2-亞胺基硫雜環戊烷(Traut's試劑)、SATA、SATP 或SAT(PEG)4)進行反應導致胺轉化為硫醇而將另外的親核基團引入抗體中。
關於這樣的軛合，半胱胺酸硫醇或賴胺酸胺基基團係親核的並能與接頭試劑和化合物-接頭中間體或藥物上的親電子基團進行反應以形成共價鍵，所述接頭試劑和化合物-接頭中間體或藥物包括：(i)活性酯如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸鹽(haloformate)和醯基鹵；(ii)烷基和苄基鹵化物，如鹵代乙醯胺；(iii)醛、酮、羧基和馬來醯亞胺基團；和(iv)經由硫化物交換的二硫化物，包括吡啶基二硫化物。化合物或接頭上的親核基團包括，但不限於：能與接頭部分和接頭試劑上的親電子基團反應以形成共價鍵的胺、硫醇、羥基、醯肼、肟、肼、胺硫脲、肼羧化物和芳醯肼基團。
軛合試劑通常包括：馬來醯亞胺、鹵代乙醯基、碘乙醯胺琥珀醯亞胺酯、異硫氰酸酯、磺醯氯、2,6-二氯三基、五氟苯酯和亞磷醯胺，儘管也可利用其他的官能團。在某些實施方式中，方法包括例如使用馬來醯亞胺、碘乙醯亞胺或鹵代乙醯基/烷基鹵化物、氮丙啶、丙烯醯基衍生物與半胱胺酸的硫醇進行反應以產生與化合物具有反應性的硫醚。游離硫醇與活化的吡啶基二硫化物的二硫化物交換也可用於生產軛合物(例如，使用5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB))。較佳的是使用馬來醯亞胺。
如上所指示，賴胺酸也可以用作反應性殘基以實現如本文所陳述的軛合。該親核賴胺酸殘基通常藉由胺-反應性琥珀醯亞胺酯來靶向。為了獲得最佳數目的去質子化賴胺酸殘基，水 性溶液的pH必須低於賴胺酸銨基的pKa，該賴胺酸銨基的pKa為10.5，所以該反應的典型pH為約8和9。偶聯反應的常用試劑係NHS-酯，它藉由賴胺酸醯化機制與親核賴胺酸反應。其他經歷類似反應的相容性試劑包括異氰酸酯和異硫氰酸酯，其也可以與本文的傳授內容結合使用以提供ADC。一旦賴胺酸已被啟動，許多上述連接基團可用於將彈頭共價結合到抗體上。
用於將化合物與蘇胺酸或絲胺酸殘基(較佳的是N-末端殘基)進行軛合的方法也是本領域已知的。例如，已經描述了其中羰基先質衍生自絲胺酸或蘇胺酸的1,2-胺基醇的方法，所述羰基先質可以藉由高碘酸鹽氧化選擇性且快速地轉化為醛形式。醛和與本發明的蛋白質附接的化合物中的半胱胺酸的1,2-胺基硫醇的反應形成穩定的四氫噻唑產物。該方法對於在N-末端絲胺酸或蘇胺酸殘基處標記蛋白質特別有用。
在一些實施方式中，反應性硫醇基團可以藉由引入一個、兩個、三個、四個或更多個游離半胱胺酸殘基而引入所選抗體(或其片段)中(例如，製備包含一個或多個游離非天然半胱胺酸胺基酸殘基的抗體)。這樣的位點特異性抗體或工程化抗體允許軛合物製劑展現增強的穩定性和基本均質性，這至少部分地歸因於提供了一個或多個工程化游離半胱胺酸位點和/或在此所陳述的新型軛合程序。不同於完全或部分地還原每個鏈內或鏈間抗體二硫鍵以提供軛合位點的常規軛合方法(並且其與本發明完全相容)，本發明另外提供了某些製備的游離半胱胺酸位點的選擇性還原和藥物接頭與其的附接。
就這一點而言，應理解的是，由工程化位點促進的軛合特異性和選擇性還原允許在所希望的位置處的高百分比的定點軛合。值得注意的是，該等軛合位點中的一些(例如存在於輕鏈恒定區的末端區域中的那些)典型地難以在它們傾向與其他游離半胱胺酸交叉反應時有效軛合。然而，藉由所得的游離半胱胺酸的分子工程化和選擇性還原，可以獲得有效的軛合速率，其顯著減少不想要的高DAR污染物和非特異性毒性。更一般而言，工程化構建體和揭露的包含選擇性還原的新型軛合方法提供了具有改善的藥代動力學和/或藥效動力學和潛在地改善的治療指數的ADC製劑。
在某些實施方式中，位點特異性構建體提供一個或多個游離半胱胺酸，該一個或多個游離半胱胺酸在還原時包含親核的且能夠與接頭部分(例如以上所揭露的那些)上的親電子基團反應以形成共價鍵的硫醇基團。如以上所論述，本發明的抗體可以具有可還原的未配對的鏈間或鏈內半胱胺酸或引入的非天然半胱胺酸，即提供這種親核基團的半胱胺酸。因此，在某些實施方式中，經還原的游離半胱胺酸的游離巰基與所揭露的藥物-接頭的末端馬來醯亞胺或鹵代乙醯胺基團的反應將提供所希望的軛合。在這樣的情形中，可以藉由用還原劑如二硫蘇糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP)進行處理來使抗體的游離半胱胺酸對於與接頭試劑軛合具有反應性。因此，每個游離半胱胺酸理論上將呈現活性硫醇親核試劑。雖然這樣的試劑係與本發明特別相容的，但是應當理解，可以使用熟習該項技術者通常已知的不同反應、條件和試劑來實現位點特異性抗體的軛合。
此外，已經發現，可以選擇性地還原工程化抗體的游離半胱胺酸以提供增強的定點軛合和不想要的潛在毒性污染物的減少。更具體地，已經發現“穩定劑”如精胺酸可以調節蛋白質中分子內和分子間相互作用，並且可以與所選擇的還原劑(較佳的是相對溫和的)聯合使用來選擇性地還原游離半胱胺酸並促進如此處所陳述的位點特異性軛合。如在此所使用，術語“選擇性還原”或“選擇性地還原”可以互換使用，並且意指還原一個或多個游離半胱胺酸，而不實質性破壞工程化抗體中存在的天然二硫鍵。在所選實施方式中，這種選擇性還原可以藉由使用某些還原劑或某些還原劑濃度來實現。在其他實施方式中，工程化構建體的選擇性還原將包含與還原劑(包括溫和還原劑)組合使用穩定劑。應當理解，術語“選擇性軛合”意指在本文所述的細胞毒素存在下，已經選擇性地還原的工程化抗體的軛合。在這方面，這樣的穩定劑(例如精胺酸)與所選還原劑的組合使用可以顯著改善位點特異性軛合的效率，如藉由抗體重鏈和輕鏈上軛合的程度和該製劑的DAR分佈所測定的。WO 2015/031698中廣泛揭露了相容的抗體構建體和選擇性軛合技術以及試劑，將其關於這樣的方法和結構特別結合在此。
雖然不希望受任何特定理論的束縛，但是這種穩定劑可以調節靜電微環境和/或調節所希望的軛合位點處的構象變化，從而允許相對溫和的還原劑(其不會實質上還原完整的天然二硫鍵)促進所希望的一個或多個游離半胱胺酸位點處的軛合。已知此類試劑(例如某些胺基酸)形成鹽橋(藉由氫鍵和靜電相互作用)，並且能以此方式調節蛋白質-蛋白質的相互作用，以賦 予穩定效果，這可能導致有利的構象變化和/或減少不利的蛋白質-蛋白質相互作用。此外，該等試劑可以用於抑制還原後不希望的分子內(和分子間)半胱胺酸-半胱胺酸鍵的形成，從而促進所希望的軛合反應，其中工程化位點特異性半胱胺酸與藥物結合(較佳的是經由接頭)。由於選擇性還原條件不能顯著還原完整的天然二硫鍵，所以隨後的軛合反應自然地被驅動到游離半胱胺酸上的相對較少的反應性硫醇(例如，較佳的是2個游離硫醇/抗體)。如先前所暗指，這樣的技術可以用於顯著降低根據本揭露製造的軛合物製劑中的非特異性軛合和相應的不想要的DAR物質的水平。
在所選實施方式中，與本發明相容的穩定劑通常將包含具有鹼性pKa的至少一個部分的化合物。在某些實施方式中，該部分將包含一級胺，而在其他實施方式中，該胺部分將包含二級胺。在仍其他實施方式中，胺部分將包含三級胺或胍基。在其他所選實施方式中，胺部分將包含胺基酸，而在其他相容的實施方式中，胺部分將包含胺基酸側鏈。在又其他實施方式中，胺部分將包含蛋白原胺基酸。在仍其他實施方式中，胺部分包含非蛋白原胺基酸。在一些實施方式中，相容性穩定劑可以包含精胺酸、賴胺酸、脯胺酸和半胱胺酸。在某些較佳的實施方式中，穩定劑將包含精胺酸。此外，相容性穩定劑可以包括胍和具有鹼性pKa的含氮雜環。
在某些實施方式中，相容性穩定劑包含具有至少一個pKa大於約7.5的胺部分的化合物，在其他實施方式中，主題胺部分將具有大於約8.0的pKa，在又其他實施方式中，胺部分將具 有大於約8.5的pKa，並且在再其他實施方式中，穩定劑將包含具有大於約9.0的pKa的胺部分。其他實施方式將包含穩定劑，其中胺部分將具有大於約9.5的pKa，而某些其他實施方式將包含展現至少一個pKa大於約10.0的胺部分的穩定劑。在仍其他實施方式中，穩定劑將包含具有pKa大於約10.5的胺部分的化合物，在其他實施方式中，穩定劑將包含具有pKa大於約11.0的胺部分的化合物，而在仍其他實施方式中，穩定劑將包含pKa大於約11.5的胺部分。在又其他實施方式中，穩定劑將包含具有pKa大於約12.0的胺部分的化合物，而在再其他實施方式中，穩定劑將包含pKa大於約12.5的胺部分。熟習該項技術者將理解，可以使用標準技術容易地計算或確定相關的pKa，並用於確定使用所選化合物作為穩定劑的適用性。
顯示在與某些還原劑組合時，所揭露的穩定劑在靶向軛合到游離位點特異性半胱胺酸上係特別有效的。出於本發明的目的，相容性還原劑可以包括任何化合物，其產生用於軛合的還原的游離位點特異性半胱胺酸，而不顯著地破壞工程化抗體的天然二硫鍵。在較佳的是由選擇的穩定劑和還原劑的組合提供的這樣的條件下，活化的藥物接頭在很大程度上受限於結合所希望的一個或多個游離位點特異性半胱胺酸位點。特別較佳的是相對溫和的還原劑或以相對低濃度使用的還原劑，以提供溫和的條件。如在此所使用，術語“溫和還原劑”或“溫和還原條件”應保持為意指在一個或多個游離半胱胺酸位點提供硫醇而不實質性破壞工程化抗體中存在的天然二硫鍵的還原劑(視情況在穩定劑存在下)引起的任何試劑或狀態。也就是說，溫和還原劑或條件 (較佳的是與穩定劑組合)能夠有效還原一個或多個游離半胱胺酸(提供硫醇)，而不會顯著破壞蛋白質的天然二硫鍵。所希望的還原條件可以由許多基於巰基的化合物提供，該等化合物建立了用於選擇性軛合的適當環境。在實施方式中，溫和還原劑可以包含具有一個或多個游離硫醇的化合物，而在一些實施方式中，溫和還原劑將包含具有單個游離硫醇的化合物。與本發明的選擇性還原技術相容的還原劑的非限制性實例包括谷胱甘肽、正乙醯半胱胺酸、半胱胺酸、2-胺基乙烷-1-硫醇和2-羥基乙烷-1-硫醇。
應當理解，上面陳述的選擇性還原方法在與游離半胱胺酸的靶向軛合方面特別有效。在這方面，可以藉由本領域接受的不同的技術來確定軛合到位點特異性抗體中的希望靶位點的程度(在此定義為“軛合效率”)。可以藉由評估在一個或多個靶軛合位點(例如，在每條輕鏈的c-末端上的游離半胱胺酸)上相對於所有其他軛合位點的軛合百分比，來確定藥物與抗體的位點特異性軛合的效率。在某些實施方式中，本文的方法提供了將藥物有效軛合至包含游離半胱胺酸的抗體。在一些實施方式中，軛合效率係至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或更高，如藉由相對於所有其他軛合位點的靶軛合百分比所測量的。
還應當理解，能夠軛合的工程化抗體可以含有游離的半胱胺酸殘基，該游離的半胱胺酸殘基含有當產生或儲存該抗 體時被封閉或封端的巰基基團。這種帽包括與巰基基團相互作用並防止或抑制軛合形成的小分子、蛋白質、肽、離子和其他物質。在一些情況下，未軛合的工程化抗體可以包含結合相同或不同抗體上的其他游離半胱胺酸的游離半胱胺酸。如本文所論述，這種交叉反應性在製造程序中可導致不同污染物。在一些實施方式中，工程化抗體可能在軛合反應之前需要脫封端。在特定實施方式中，本文的抗體係未封端的並且展示出能夠軛合的游離巰基。在特定實施方式中，本文的抗體經歷不干擾或重排天然存在的二硫鍵的脫封端反應。應當理解，在大多數情況下，在正常還原反應(還原或選擇性還原)期間將發生脫封端反應。
D. DAR分佈和純化
在所選實施方式中，與本發明相容的軛合和純化方法有利地提供了產生包含窄DAR分佈的相對均質的ADC製劑的能力。就這一點而言，所揭露的構建體(例如位點特異性構建體)和/或選擇性軛合就藥物和工程化抗體之間的化學計量比以及關於毒素位置提供了樣品內的ADC物質的均質性。如上所簡單論述，術語“藥物與抗體比”或“DAR”係指ADC製劑中藥物與抗體的莫耳比。在某些實施方式中，軛合物製劑相對於其DAR分佈基本上可以是均勻的，這意味著在該ADC製劑內係具有相對於荷載位點(即游離半胱胺酸)也較佳的是一致的特定載藥量(例如，2或4的載藥量)的位點特異性ADC的主要種類。在本發明的其他某些實施方式中，可能的是，藉由使用位點特異性抗體和/或選擇性還原以及軛合來實現所希望的均質性。在其他實施方式中，可以藉 由使用與選擇性還原組合的位點特異性構建體來實現所希望的均質性。在又其他實施方式中，可以使用分析型或製備型層析技術來純化相容性製劑以提供所希望的均質性。在該等實施方式的每一個中，可以使用本領域已知的不同技術來分析ADC樣品的均質性，包括但不限於質譜法、HPLC(例如尺寸排阻HPLC、RP-HPLC、HIC-HPLC等)或毛細管電泳。
關於ADC製劑的純化，應當理解，可以使用標準藥物製備方法來獲得所希望的純度。如本文所論述，液相層析法如反相(RP)和疏水相互作用層析(HIC)可以藉由藥物荷載值分離混合物中的化合物。在一些情形中，離子交換層析(IEC)或混合模式層析(MMC)也可用於分離具有特定載藥量的物質。
在任何情形下，所揭露的ADC及其製劑可以包含不同化學計量莫耳比的藥物和抗體部分，這取決於抗體的組態，並且至少部分地取決於用於實現軛合的方法。在某些實施方式中，每個ADC的載藥量可以包括1-20個彈頭(即，n係1-20)。其他所選的實施方式可以包括具有從1到15個彈頭的載藥量的ADC。在仍其他實施方式中，ADC可以包含1-12個彈頭，或更較佳的是1-10個彈頭。在一些實施方式中，ADC將包含從1到8個彈頭。
雖然理論載藥量可能相對較高，但實際限制(如游離半胱胺酸交叉反應性和彈頭疏水性)傾向於限制包含由於聚集體和其他污染物而造成的此類DAR的均質製劑的產生。也就是說，較高的載藥量，例如>8或10，可能導致某些抗體-藥物軛合物的聚集、不溶性、毒性或喪失細胞滲透性，這取決於有效載荷。 鑒於該等問題，本發明提供的載藥量較佳的是在每個軛合物1至8個藥物的範圍內，即其中1、2、3、4、5、6、7或8個藥物共價附接到每一抗體上(例如，對於IgG1，其他抗體可以具有取決於二硫鍵數量的不同荷載能力)。較佳的是，本發明的組成物的DAR將為約2、4或6，並且在一些實施方式中，DAR將包含約2。
儘管本發明提供相對高水平的均質性，但所揭露的組成物實際上包含具有一系列藥物化合物(在IgG1的情形中，潛在地從1至8)的軛合物的混合物。因此，所揭露的ADC組成物包括軛合物的混合物，其中大部分構成抗體與一個或多個藥物部分共價連接，並且(儘管工程化構建體提供了相對軛合特異性以及選擇性還原)，其中藥物部分可以藉由不同硫醇基團附接到抗體上。也就是說，在軛合之後，本發明的組成物將包含在不同濃度下具有不同載藥量(例如，每個IgG1抗體1至8個藥物)的ADC的混合物(連同主要由游離半胱胺酸交叉反應性引起的某些反應污染物)。然而，使用選擇性還原和製造後純化，軛合組成物可以被驅動到其中它們大部分含有單個主要的希望的ADC種類(例如，2的載藥量)和相對低水平的其他ADC種類(例如，1、4、6等的載藥量)的點上。平均DAR值表示關於組成物作為整體(即，所有ADC種類一起)的藥物荷載的加權平均值。由於所採用的量化方法的固有不確定性和在商業環境中完全去除非主要的ADC種類的難度，可接受的DAR值或規格通常表示為平均值、範圍或分佈(即，2 +/- 0.5的平均DAR)。較佳的是，在藥物環境中使用包含在該範圍(即1.5至2.5)內的測量平均DAR的組成物。
因此，在一些實施方式中，本發明將包含平均DAR為1、2、3、4、5、6、7或8各自+/- 0.5的組成物。在其他實施方式中，本發明將包含2、4、6或8 +/- 0.5的平均DAR。最後，在所選實施方式中，本發明將包含2 +/- 0.5或4 +/- 0.5的平均DAR。應當理解，在一些實施方式中，範圍或偏差可以小於0.4。因此，在其他實施方式中，該等組成物將包含1、2、3、4、5、6、7或8各自+/- 0.3的平均DAR，2、4、6或8 +/- 0.3的平均DAR，甚至更較佳的是2或4 +/- 0.3的平均DAR，或甚至2 +/- 0.3的平均DAR。在其他實施方式中，IgG1軛合物組成物較佳的是包含1、2、3、4、5、6、7或8各自+/- 0.4的平均DAR和相對較低水平(即，小於30%)的非主要的ADC種類。在其他實施方式中，ADC組成物將包含2、4、6或8各自+/- 0.4的平均DAR與相對較低水平(<30%)的非主要的ADC種類。在一些實施方式中，ADC組成物將包含2 +/- 0.4的平均DAR與相對較低水平(<30%)的非主要的ADC種類。在又其他實施方式中，當針對存在於組成物中的所有其他DAR種類而測量時，主要ADC種類(例如，載藥量為2或載藥量為4)將以大於50%的濃度、以大於55%的濃度、以大於60%的濃度、以大於65%的濃度、以大於70%的濃度、以大於75%的濃度、以大於80%的濃度、以大於85%的濃度、以大於90%的濃度、以大於93%的濃度、以大於95%的濃度或甚至以大於97%的濃度存在。
如以下實例中詳述的，可以藉由常規手段如UV-Vis分光光度法、反相HPLC、HIC、質譜、ELISA和電泳，來表徵來自軛合反應的ADC的製劑中的藥物/抗體分佈。也可以確定依據藥物/抗體的ADC定量分佈。藉由ELISA，可以確定ADC的特定製劑 中藥物/抗體的平均值。然而，藉由抗體-抗原結合和ELISA檢測限制不能辨別藥物/抗體分佈。此外，用於檢測抗體-藥物軛合物的ELISA測定不能確定藥物部分附接到抗體的位置，例如重鏈或輕鏈片段或特定胺基酸殘基。
VI. 診斷和篩選
A. 診斷
本發明提供了用於檢測、診斷或監測增生性病症的體外和體內方法以及篩選來自患者的細胞以鑒定腫瘤細胞(包括腫瘤發生細胞)的方法。這樣的方法包括鑒定患有癌症需治療或監測癌症進展的個體，包括將患者或從患者獲得的樣品(體內或體外)與能夠特異性識別並締合KREMEN2決定因子的檢測劑(例如抗體或核酸探針)進行接觸並檢測與樣品中檢測劑的締合的存在與否或水平。在所選實施方式中，該檢測劑將包含與如本文所述的可檢測標記或報導分子締合的抗體。在某些其他實施方式中，KREMEN2抗體將被施用並使用二次標記的抗體(例如，抗鼠抗體)進行檢測。在又其他實施方式(例如，原位雜交或ISH)中，與基因組KREMEN2決定因子反應的核酸探針將用於增生性病症的檢測、診斷或監測。
更一般而言，KREMEN2決定因子的存在和/或水平可以使用熟習該項技術者可用於蛋白質或核酸分析的許多技術中的任一種來測量，例如，直接物理測量(例如質譜)、結合測定(例如免疫測定、凝集測定和免疫層析測定)、聚合酶鏈式反應(PCR、RT-PCR、RT-qPCR)技術、分支寡核苷酸技術、RNA印跡技術、 寡核苷酸雜交技術以及原位雜交技術。該方法還可以包括測量由化學反應引起的信號，例如光吸收的變化，螢光的變化，化學發光或電化學發光的產生，反射率、折射率或光散射的變化，可檢測標記從表面的積聚或釋放，氧化或還原或氧化還原物質，電流或電勢，磁場變化等。藉由測量經標記的結合試劑的參與，藉由測量標記的光致發光(例如，藉由測量螢光、時間解析螢光、消散波螢光、上轉換磷光體、多光子螢光等)、化學發光、電化學發光、光散射、光吸收、放射性、磁場、酶活性(例如，藉由引起光吸收或螢光變化或引起化學發光的發射的酶促反應來測量酶活性)，合適的檢測技術可以檢測結合事件。可替代地，可以使用不需要使用標記的檢測技術，例如基於測量質量(例如表面聲波測量)、折射率(例如，表面電漿共振測量)或者分析物的固有發光的技術。
在一些實施方式中，該檢測劑與樣品中特定細胞或細胞組分的締合表示該樣品可以含有腫瘤發生細胞，借此指示該患有癌症的個體可以用如本文所述的抗體或ADC有效地治療。
在某些較佳的實施方式中，測定可以包括免疫組織化學(IHC)測定或其變體(例如，螢光、顯色、標準ABC、標準LSAB等)、免疫細胞化學或其變體(例如，直接、間接螢光、顯色等)或原位雜交(ISH)或其變體(例如顯色原位雜交(CISH)或螢光原位雜交(DNA-FISH或RNA-FISH))。
就這一點而言，本發明的某些方面包括使用標記的KREMEN2進行免疫組織化學(IHC)。更具體地，KREMEN2 IHC 可以被用作一種診斷工具以幫助診斷各種增生性病症並監測對於包括KREMEN2抗體療法的治療的潛在響應。在某些實施方式中，KREMEN2將與一個或多個報導分子軛合。在其他實施方式中，該KREMEN2抗體將是未標記的，並將用與一種或多種報導分子締合的單獨的試劑(例如抗鼠抗體)進行檢測。如在此所論述並在下面實例中所示的，相容性診斷測定可以對已經化學地固定(包括但不限於：甲醛、戊二醛、四氧化鋨、重鉻酸鉀、乙酸、醇類、鋅鹽類、氯化汞、四氧化鉻及苦味酸)並包埋(包括但不限於：甲基丙烯酸乙二醇酯、石蠟及樹脂)或經由冷凍保存的組織進行。這樣的測定可以用於指導治療決定並且確定給藥方案及時程。
本發明的其他特別相容的方面涉及使用原位雜交來檢測或監測KREMEN2決定因子。原位雜交技術或ISH係熟習該項技術者所熟知的。簡而言之，將細胞固定，並將含有特定核苷酸序列的可檢測探針加入到固定的細胞中。如果細胞含有互補的核苷酸序列，則可以被檢測到的探針會與它們雜交。使用本文所陳述的序列資訊，可以設計探針來鑒定表現基因型KREMEN2決定因子的細胞。探針較佳的是與對應於這樣的決定因子的核苷酸序列雜交。可以對雜交條件進行常規優化，以藉由非完全互補雜交使背景信號最小化，儘管較佳的是探針較佳的是與所選KREMEN2決定因子完全互補。在所選實施方式中，用附接於探針的螢光染料標記探針，藉由標準螢光方法可容易地檢測螢光染料。
如熟習該項技術者所知，相容性體內治療劑或診斷測定可以包括本領域認可的成像或監測技術，如磁共振成像、電 腦斷層掃描(例如CAT掃描)、正電子斷層掃描(例如PET掃描)、放射線照相術、超音波等。
在某些實施方式中，本發明的抗體可用於檢測和定量患者樣品(例如血漿或血液)中特定決定因子(例如，KREMEN2蛋白)的水平，其轉而可以用於檢測、診斷或監測與相關決定因子相關的增生性病症。例如，血液和骨髓樣品可以與流式細胞測量術結合使用以檢測和測量KREMEN2表現(或另一種共表現的標記物)，並監測疾病和/或治療響應的進展。在相關實施方式中，本發明的抗體可以用於在體內或體外對循環腫瘤細胞進行檢測、監測和/或定量(WO 2012/0128801)。在仍其他實施方式中，循環腫瘤細胞可以包含腫瘤發生細胞。
在本發明的某些實施方式中，可以在療法或方案之前，使用所揭露的抗體對受試者或來自受試者的樣品中腫瘤發生細胞進行評估或表徵，以確立一個基線。在其他實例中，可從衍生自經過治療的受試者的樣品評估腫瘤發生細胞。
在另一個實施方式中，本發明提供了一種在體內分析癌症進展和/或發病機理的方法。在另一個實施方式中，體內癌症進展和/或發病機理的分析包括確定腫瘤進展的程度。在另一個實施方式中，分析包括腫瘤的鑒別。在另一個實施方式中，腫瘤進展的分析係針對原發腫瘤進行的。在另一個實施方式中，如熟習該項技術者所知，取決於癌症的類型，分析係隨時間而進行的。在另一個實施方式中，起源於原發腫瘤的轉移性細胞的繼發腫瘤的進一步分析係在體內進行的。在另一個實施方式中，分析了繼 發腫瘤的尺寸和形狀。在一些實施方式中，進行了進一步離體分析。
在另一個實施方式中，本發明提供了一種在體內分析癌症進展和/或發病機理之方法，該方法包括確定細胞轉移或對循環腫瘤細胞的水平進行檢測並定量。在又另一個實施方式中，細胞轉移的分析包括在與原發腫瘤不連續的部位處細胞的進行性生長的測定。在一些實施方式中，可以進行程序來檢測經由血管系統、淋巴腺、體腔內或其組合分散的腫瘤細胞。在另一個實施方式中，就細胞遷移、播散、外滲、增生或其組合進行了細胞轉移分析。
在某些實例中，可以在治療之前，使用所揭露的抗體對受試者或來自受試者的樣品中的腫瘤發生細胞進行評估或表徵，以確立一個基線。在其他實例中，樣品源自受治療的受試者。在一些實例中，在受試者開始或終止治療之後至少約1、2、4、6、7、8、10、12、14、15、16、18、20、30、60、90天、6個月、9個月、12個月或>12個月，從該受試者取得樣品。在某些實例中，在一定數量的劑量(例如，在2、5、10、20、30或更多劑量的療法之後)之後對腫瘤發生細胞進行評估或表徵。在其他實例中，在接受了一次或多次療法之後的1週、2週、1個月、2個月、1年、2年、3年、4年或更多年之後對腫瘤發生細胞進行表徵或評估。
B. 篩選
在某些實施方式中，本發明的抗體可用於篩選樣品，以鑒定藉由與決定因子相互作用而改變腫瘤細胞的功能或活 性的化合物或試劑(例如，抗體或ADC)。在一個實施方式中，使腫瘤細胞與抗體或ADC接觸，並且可以使用抗體或ADC來篩選表現某一靶標(例如KREMEN2)的細胞的腫瘤以鑒定這樣的細胞用於包括但不限於診斷目的的目的，以監測該等細胞以確定治療功效或以富集這種靶表現細胞的細胞群。
在又另一個實施方式中，方法包括直接或間接地使腫瘤細胞與檢測試劑或化合物接觸，並確定該測試劑或化合物是否調節與決定因子相關的腫瘤細胞的活性或功能，例如，細胞形態或生活力的變化、標記物的表現、分化或去分化、細胞呼吸、線粒體活性、膜完整性、成熟、增生、生活力、凋亡或細胞死亡。直接相互作用的一個實例係物理相互作用，而間接相互作用包括例如組成物對中間分子的作用，而這又作用於參比實體(例如，細胞或細胞培養物)。
篩選方法包括高通量篩選，其可以包括例如在培養皿、管、燒瓶、轉瓶或板上定位或放置(視情況在預定位置)細胞陣列(例如微陣列)。高通量機械或人工處理方法可以在較短時間段內探查化學相互作用並且確定許多基因的表現水平。已經開發了以下技術，該等技術利用分子信號，例如經由螢光團或微陣列(Mocellin和Rossi,2007,PMID：17265713)以及以非常快的速度處理資訊的自動化分析(參見，例如，Pinhasov等人，2004,PMID：15032660)。可以篩選的文庫包括例如，小分子文庫、噬菌體展示文庫、完全人抗體酵母展示文庫(艾迪瑪公司(Adimab))、siRNA文庫及腺病毒轉染載體。
VII. 藥物製劑和治療應用
A. 配製物和給藥途徑
本發明的抗體或ADC可以使用本領域認可的技術以各種方式配製。在一些實施方式中，本發明的治療性組成物能以純形式或與最少量的另外組分一起給予，而其他組分可以視情況被配製以含有合適的藥學上可接受的載體。如在此所使用，“藥學上可接受的載體”包含本領域熟知的賦形劑、媒介物、佐劑和稀釋劑，並且可以從商業來源獲得，用於藥物配製(參見，例如，Gennaro(2003)Remington：The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons：Drugfacts Plus,20th ed.,Mack Publishing[雷明頓製藥科學與實踐及藥物事實與比較：藥物事實]；Ansel等人(2004)Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,7th ed.[藥物劑型與藥物遞送系統，第7版]，Lippencott Williams和Wilkins；Kibbe等人.(2000)Handbook of Pharmaceutical Excipients,3 rd ed.,Pharmaceutical Press.[藥物賦形劑手冊，第3版，醫藥出版社])。
合適的藥學上可接受的載體包含相對呈惰性的物質並且可以促進抗體或ADC的施用，或者可以幫助將活性化合物加工成被藥學上優化用於遞送至作用部位的製劑。
這樣的藥學上可接受的載體包括可以改變配製物的形式、稠度、黏度、pH、張力、穩定性、滲透壓、藥代動力學、蛋白質聚集或溶解度的試劑，並且包括緩衝劑、潤濕劑、乳化劑、稀釋劑、成膠囊劑和皮膚滲透促進劑。載體的某些非限制性實例 包括鹽水、緩衝鹽水、右旋糖、精胺酸、蔗糖、水、甘油、乙醇、山梨糖醇、葡聚糖、羧甲基纖維素鈉及其組合。用於全身給藥的抗體可以被配製用於腸、腸胃外或局部給藥。事實上，可以同時使用全部三種類型的配製物來實現活性成分的全身給藥。賦形劑以及供腸胃外和非腸胃外藥物遞送的配製物陳述於Remington：The Science and Practice of Pharmacy(2000)20th Ed.Mack Publishing[雷明頓製藥科學與實踐(2000)第20版，默克出版公司]中。
用於腸給藥的適合配製物包括硬或軟明膠膠囊、丸劑、片劑(包括包衣片劑)、酏劑、懸浮液、糖漿或吸入劑及其控制釋放形式。
適用於胃腸外給藥(例如藉由注射)的配製物包括水性或非水性、等滲、無熱原的無菌液體(例如溶液、懸浮液)，其中活性成分溶解、懸浮或以其他方式提供(例如，在脂質體或其他微粒中)。該等液體可以另外含有其他藥學上可接受的載體，例如抗氧化劑、緩衝劑、防腐劑、穩定劑、抑菌劑、懸浮劑、增稠劑和使配製物與預期的受體的血液(或其他相關的體液)等滲的溶質。賦形劑的實例包括例如水、醇、多元醇、甘油、植物油等。用於這種配製物的合適的等滲的藥學上可接受的載體的實例包括氯化鈉注射液、林格氏溶液或乳酸林格氏注射液。
在特別較佳的實施方式中，可以將本發明的經配製的組成物凍乾以提供可在給予前重建的抗體或ADC的粉末形式。用於製備可注射溶液的無菌粉末可以藉由凍乾包含所揭露的抗體 或ADC的溶液來產生，以產生包含活性成分以及任何可選的共溶解的生物相容性成分的粉末。一般而言，藉由將活性化合物摻入含有基本分散介質或溶劑(例如，稀釋劑)以及視情況其他生物相容成分的無菌媒介物中來製備分散液或溶液。相容性稀釋劑係藥學上可接受的(對人給予係安全和無毒的)稀釋劑，並且可用於製備液體配製物，如凍乾後重構的配製物。示例性稀釋劑包括無菌水、抑菌性注射用水(BWFI)、pH緩衝溶液(例如磷酸緩衝鹽水)、無菌鹽水溶液、林格氏(Ringer's)溶液或葡萄糖溶液。在一個替代性實施方式中，稀釋劑可以包括鹽和/或緩衝劑的水性溶液。
在某些較佳的實施方式中，抗KREMEN2抗體或ADC將與藥學上可接受的糖組合一起凍乾。“藥學上可接受的糖”係當與感興趣的蛋白質結合時顯著防止或減少蛋白質在儲存時的化學和/或物理不穩定性的分子。當旨在凍乾配製物，然後重組。如在此所使用，藥學上可接受的糖也可以被稱為“凍乾保護劑”。示例性糖及其相應的糖醇包括：胺基酸，如穀胺酸一鈉或組胺酸；甲胺，如甜菜鹼；易溶鹽，如硫酸鎂；多元醇如三元或更高分子量的糖醇，例如甘油、葡聚糖、赤蘚糖醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇；丙二醇；聚乙二醇；PLURONICS®：及其組合。另外的示例性凍乾保護劑包括甘油和明膠以及糖，即蜜二糖、松三糖、棉子糖、甘露三糖和水蘇糖。還原糖的實例包括葡萄糖、麥芽糖、乳糖、麥芽酮糖、異麥芽酮糖和乳果糖。非還原糖的實例包括選自糖醇和其他直鏈多元醇的多羥基化合物的非還原糖苷。較佳的糖醇係單糖苷，尤其是藉由還原二糖(如乳 糖、麥芽糖、乳果糖和麥芽酮糖)而獲得的那些化合物。糖苷側基可以是糖苷的或半乳糖苷的。糖醇的另外的實例係葡萄糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇和異麥芽酮糖。較佳的藥學上可接受的糖係非還原糖，如海藻糖或蔗糖。藥學上可接受的糖以“保護量”加入到配製物中(例如凍乾前)，這意味著蛋白質在儲存期間(例如在重構和儲存之後)基本上保持其物理和化學穩定性和完整性。
無論是否從凍乾粉末重構，液體KREMEN2 ADC配製物(例如，如上所陳述)可以在給予之前進一步被稀釋(較佳的是在水性載體中)。例如，上述液體配製物可以進一步被稀釋到含有0.9%氯化鈉注射液、USP或等效物(作必要的修正)的輸液袋中，以達到用於給藥的所需劑量水平。在某些方面，完全稀釋的KREMEN2 ADC溶液將經由靜脈內輸注使用IV裝置進行給予。較佳的是，所給予的KREMEN2 ADC藥物溶液(無論藉由靜脈內(IV)輸注還是注射)係透明的、無色的並且沒有可見顆粒。
本發明的化合物和組成物可以藉由不同途徑在體內給予於對其有需要的受試者，包括但不限於，口服、靜脈內、動脈內、皮下、腸胃外、鼻內、肌肉內、心臟內、室內、氣管內、口腔、直腸、腹膜內、皮內、局部、透皮及胸內，或以其他方式藉由植入或吸入給予。主題組成物可以被配製成固體、半固體、液體或氣體形式的製劑；包括但不限於片劑、膠囊、粉劑、顆粒劑、軟膏劑、溶液劑、栓劑、灌腸劑、注射液、吸入劑和氣溶膠。適合的配製物和給藥途徑可以根據預定的應用和治療方案選擇。
B. 劑量和給藥方案
特定的劑量方案，即，劑量、時程及重複，將取決於特定的個體以及經驗考慮，如藥物動力學(例如半衰期、清除率等)。給藥頻率的確定可以由熟習該項技術者(如主治醫師)基於以下考慮來作出：所治療的病症和所治療的病症的嚴重程度，所治療的受試者的年齡和一般健康狀態等。可以在治療過程中基於評估所選組成物和給藥方案的療效來調整給藥頻率。可以基於特定疾病、障礙或病症的標記進行這種評估。在個體患有癌症的實施方式中，該等包括：經由觸診或目測觀察直接測量腫瘤大小；藉由x射線或其他成像技術間接測量腫瘤大小；如藉由直接腫瘤活檢和腫瘤樣品的顯微鏡檢查所評估的改善；間接腫瘤標記物(例如，對於前列腺癌的PSA)或根據本文描述的方法鑒別的抗原的測量；增生性細胞或腫瘤發生細胞的數量的減少；維持這樣的贅生性細胞的減少；贅生性細胞的增生的減少；或延緩轉移的發展。
本發明的KREMEN2抗體或ADC能以各種範圍給予。該等包括約5μg/kg體重至約100mg/kg體重/劑量；約50μg/kg體重至約5mg/kg體重/劑量；約100μg/kg體重至約10mg/kg體重/劑量。其他範圍包括每劑約100μg/kg體重到約20mg/kg體重，和每劑約0.5mg/kg體重到約20mg/kg體重。在某些實施方式中，該劑量為至少約100μg/kg體重、至少約250μg/kg體重、至少約750μg/kg體重、至少約3mg/kg體重、至少約5mg/kg體重、至少約10mg/kg體重。
在所選實施方式中，KREMEN2抗體或ADC將以每劑約10、20、30、40、50、60、70、80、90或100μg/kg體重給予(較 佳的是靜脈內)。其他實施方式可以包括以每劑約200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000μg/kg體重給予抗體或ADC。在其他實施方式中，所揭露的軛合物將以2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、9或10mg/kg給予。在仍其他實施方式中，該等軛合物能以每劑12、14、16、18或20mg/kg體重給予。在又其他實施方式中，該等軛合物能以每劑25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90或100mg/kg體重給予。根據此處的傳授內容，熟習該項技術者可以基於臨床前動物研究、臨床觀察結果以及標準醫療和生物化學技術及測量容易地確定不同KREMEN2抗體或ADC的適當劑量。
其他給藥方案可以根據體表面積(BSA)計算值判定，如U.S.P.N.7,744,877中所揭露。如眾所周知的，BSA係使用患者的身高和體重進行計算並且提供了如藉由他或他的體表面積所表示的受試者的體格的量度。在某些實施方式中，該等軛合物能以從1mg/m2到800mg/m2、從50mg/m2到500mg/m2的劑量並且以100mg/m2、150mg/m2、200mg/m2、250mg/m2、300mg/m2、350mg/m2、400mg/m2或450mg/m2的劑量給予。還應理解的是，可以使用本領域認可的並且憑經驗的技術來確定適當劑量。
可以按特定方案給予抗KREMEN2抗體或ADC。一般而言，將KREMEN2軛合物的有效劑量給予受試者一次或多次。更特別地，該ADC的有效劑量係一個月一次、一個月超過一次或一個月不到一次給予受試者。在某些實施方式中，KREMEN2抗體或 ADC的有效劑量可以給予多次，包括持續至少一個月、至少六個月、至少一年、至少兩年的時間或若干年的時間。在又其他實施方式中，所揭露的抗體或ADC的給藥之間可以間隔若干天(2、3、4、5、6或7)、若干周(1、2、3、4、5、6、7或8)或若干月(1、2、3、4、5、6、7或8)，或甚至一年或若干年。
在一些實施方式中，涉及軛合抗體的治療過程將包括在數週或數月的時間段內的多劑量的所選藥物。更具體地，本發明的抗體或ADC可以每天、每兩天、每四天、每週、每十天、每兩週、每三週、每個月、每六週、每兩個月、每十週或每三個月給予一次。就這一點而言，應理解的是，基於患者響應和臨床實踐，該等劑量可以改變或該時間間隔可以調整。本發明還涵蓋分成若干部分給藥的不連續給藥或每日劑量。本發明的組成物和抗癌劑可以在隔日或隔週可互換地給予；或可以給出一系列抗體治療，之後係一次或多次的抗癌劑療法治療。在任何情況下，如熟習該項技術者所瞭解，化學治療劑的適當劑量一般大約為將在臨床療法中已經採用的那些，其中該等化學治療劑係單獨或與其他化學治療劑組合給與。
在另一個實施方式中，本發明的KREMEN2抗體或ADC可以用於維持療法中以在該疾病最初出現之後降低或消除腫瘤復發的幾率。較佳的是，該病症將經過治療並且最初的腫塊消除、減小或以其他方式改善，由此該患者係無症狀的或得到緩和。此時，可以給予該受試者藥學上有效量的所揭露的抗體一次或多次，即使是使用標準診斷程序存在極少或無疾病指征。
在另一個較佳的實施方式中，本發明的調節劑可以用於預防或作為一種輔助療法以預防或降低在減瘤程序之後腫瘤轉移的可能性。如本揭露中所使用，“減瘤程序”意指任何減少腫瘤塊或減輕腫瘤負荷或腫瘤增生的程序、技術或方法。示例性減瘤劑包括但不限於，手術、放射治療(即，射束放射)、化學療法、免疫療法或切除。在熟習該項技術者根據本揭露容易地確定的適當時間，所揭露的ADC可以如藉由臨床、診斷或治療診斷程序所提出來給予，以減少腫瘤轉移。
本發明的又其他實施方式包括向無症狀但有發生癌症的風險的受試者給予所揭露的抗體或ADC。也就是說，本發明的抗體或ADC可以在真正預防意義上使用並且提供給經過檢查或測試並且具有一個或多個所述風險因素(例如，染色體組指征、家族史、體內或體外測試結果等)但尚未顯現贅瘤的患者。
對用於已經提供一次或多次給藥的個體中所揭露的治療性組成物的劑量和方案也可以憑經驗確定。舉例來說，可以給個體遞增劑量的如在此所描述製造的治療性組成物。在所選實施方式中，對應地基於憑經驗確定或觀察的副作用或毒性，可以使該劑量逐漸增加或減少或衰減。為了評估所選組成物的功效，可以如先前所描述，跟蹤特定疾病、病症或病狀的標記物。對於癌症，該等包括經由觸診或目測觀察來直接測量腫瘤大小、藉由x射線或其他成像技術來間接測量腫瘤大小；如藉由直接腫瘤活檢和腫瘤樣品的顯微鏡檢查所評估的改善；間接腫瘤標記物(例如，對於前列腺癌的PSA)根據在此描述的方法鑒定的腫瘤發生抗原的 測量；疼痛或麻痹的減少；言語、視力、呼吸或與腫瘤相關的其他能力喪失的改善；食欲增加；或如藉由公認的測試所測量的生活質量增加或存活期延長。熟習該項技術者應清楚的是，該劑量將取決於個體、贅生性病狀的類型、贅生性病狀的階段、該贅生性病狀是否已經開始轉移到個體中的其他位置以及過去和當前所使用的治療而變化。
C. 組合療法
如以上所暗指，組合療法可以特別有用於減少或抑制不想要的贅生性細胞增生，減少癌症的發生，減少或預防癌症的復發，或者減少或預防癌症的擴散或轉移。在該等情形中，本發明的抗體或ADC可以藉由去除CSC而充當敏化劑或化學敏化劑，該等試劑將以其他方式支持並且維持腫塊並借此允許更有效地使用當前的醫療標準的減瘤劑或抗癌劑。也就是說，在某些實施方式中，所揭露的抗體或ADC可以提供一種增強的作用(例如，加和性或協同性)，由此加強了另一種給予的治療劑的作用模式。在本發明的上下文中，“組合療法”應當在廣義上解釋並且僅僅係指抗KREMEN2抗體或ADC以及一種或多種抗癌劑的給予，該等抗癌劑包括但不限於，細胞毒性劑、細胞生長抑制劑、抗血管生成劑、減瘤劑、化學治療劑、放射療法及放射治療劑、靶向性抗癌劑(包括單株抗體和小分子實體)、BRM、治療性抗體、癌症疫苗、細胞介素、激素療法、放射療法以及抗轉移劑和免疫治療劑，包括特異性和非特異性方法。
該等組合的結果無需為當分開地進行每種治療(例 如抗體和抗癌劑)時所觀察的作用的加和。儘管至少加和作用一般是所希望的，但超出單一療法之一的任何增加的抗腫瘤作用都是有益的。另外，本發明不需要組合治療展現出協同作用。然而，熟習該項技術者應理解，在包含較佳的實施方式的某些所選組合情況下，可以觀察到協同作用。
因此，在某些方面，組合療法相比於(i)單獨使用的抗KREMEN2抗體或ADC，或(ii)單獨使用的治療性部分，或(iii)在不添加抗KREMEN2抗體或ADC的情況下使用治療性部分與另一治療性部分的組合，具有治療協同作用或改善了癌症治療中可測量的治療效果。如在此所使用的術語“治療協同作用”係指抗KREMEN2抗體或ADC以及一種或多種治療性部分的組合，該組合具有大於抗KREMEN2抗體或ADC或一種或多種治療性部分的組合的累加效應的治療效果。
藉由與對照或基線測量進行比較來量化所揭露的組合的期望結果。如在此所使用，相關術語，如“改善”、“增加”或“減少”指示相對於對照的值，如在本文所述的治療開始之前在同一個體中的測量，或在一個對照個體(或多個對照個體)中在不存在本文所述的抗KREMEN2抗體或ADC的情況下但在其他治療性部分(如標準護理治療)存在的情況下的測量。代表性對照個體係與所治療的個體患有相同類型的癌症的個體，其與所治療的個體係大約同一年齡的(以確保治療的個體和對照個體中的疾病階段係可比較的)。
協同治療效果可以是比由單一治療性部分或抗 KREMEN2抗體或ADC引起的治療效果，或由抗KREMEN2抗體或ADC或給定組合的單一治療性部分引起的治療效果的總和大至少約兩倍、或至少約五倍、或至少約十倍、或至少約二十倍、或至少約五十倍、或至少約一百倍的效果。與由單一治療性部分或抗KREMEN2抗體或ADC引起的治療效果，或由抗KREMEN2抗體或ADC或給定組合的單一治療性部分引起的治療效果的總和相比，協同治療效果也可以被觀察為至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少100%或更多的治療效果的增加。協同效應也是一種當組合使用時允許減少治療劑給藥劑量的效果。
在實行組合療法時，可以向受試者以單一組成物形式或以兩種或更多種相異的組成物形式使用相同或不同給藥途徑同時地給予抗KREMEN2抗體或ADC以及一種或多種治療性部分。可替代地，使用抗KREMEN2抗體或ADC的治療可以在治療性部分治療之前或之後以例如從數分鐘到數週範圍內的時間間隔進行。在一個實施方式中，該治療性部分和抗體或ADC係彼此在約5分鐘到約兩週內給予。在又其他實施方式中，該抗體與治療性部分的給藥之間可以間隔若干天(2、3、4、5、6或7)、若干週(1、2、3、4、5、6、7或8)或若干月(1、2、3、4、5、6、7或8)。
該組合療法可以被給予直至病症以不同時程(如每日一次、兩次或三次，每兩天一次，每三天一次，每週一次，每兩週一次，每個月一次，每兩個月一次，每三個月一次，每六個月一次)被治療、減輕或治癒，或者可以連續地給予。該抗體和 一種或多種治療性部分可以在隔日或隔週給予；或可以給出一系列抗KREMEN2抗體或ADC治療，之後係使用另外的治療性部分的一次或多次治療。在一個實施方式中，將抗KREMEN2抗體或ADC與一個或多個治療性部分組合給予用於短的治療週期。在其他實施方式中，給予該組合療法用於長的治療週期。可以經由任何途徑給予該組合療法。
在所選實施方式中，本發明的化合物和組成物可以與檢查點抑制劑(如PD-1抑制劑或PD-L1抑制劑)聯合使用。PD-1及其配位基PD-L1係抗腫瘤T淋巴細胞應答的負調節劑。在一個實施方式中，組合療法可以包括將抗KREMEN2抗體或ADC與抗PD-1抗體(例如，派姆單抗(pembrolizumab)、納武單抗(nivolumab)、佩蒂單抗(pidilizumab))以及視情況一種或多種其他治療性部分一起給予。在另一個實施方式中，組合療法可以包括將抗KREMEN2抗體或ADC與抗PD-L1抗體(例如，艾維單抗(avelumab)、阿特朱單抗(atezolizumab)、杜維單抗(durvalumab))以及視情況一種或多種其他治療性部分一起給予。在又另一個實施方式中，組合療法可以包括將抗KREMEN2抗體或ADC與抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體一起給予於在用檢查點抑制劑和/或靶向BRAF組合療法(例如，威羅菲尼(vemurafenib)或達拉菲尼(dabrafinib))治療後持續進展的患者。
在一些實施方式中，抗KREMEN2抗體或ADC可以與各種一線癌症療法組合使用。因此，在所選實施方式中，組合療法包括使用抗KREMEN2抗體或ADC和細胞毒性劑(如異環磷醯 胺、絲裂黴素C、長春地辛、長春鹼、依託泊苷、伊立替康、吉西他濱、紫杉烷、長春瑞濱(vinorelbine)、胺甲喋呤和培美曲塞)以及視情況一種或多種其他治療性部分。在某些贅生性指示物(例如，血液學指示物，如AML或多發性骨髓瘤)中，所揭露的ADC可以與細胞毒性劑如阿糖胞苷(cytarabine)(AraC)加上蒽環黴素(anthracycyline)(阿柔比星(aclarubicin)、安吖啶(amsacrine)、阿黴素(doxorubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、伊達比星(idarubixcin)等)或米托蒽醌(mitoxamtrone)、氟達拉濱(fludarabine)、羥基脲、氯法拉濱、cloretazine組合使用。在其他實施方式中，本發明的ADC可以與G-CSF或GM-CSF引發、脫甲基化試劑如阿紮胞苷(azacitidine)或地西他濱(decitabine)、FLT3選擇性酪胺酸激酶抑制劑(例如，米哚妥林(midostaurin)、來他替尼(lestaurtinib)和舒尼替尼(sunitinib))、全反式視黃酸(ATRA)和三氧化二砷組合給予(其中後兩種組合可以對急性前髓細胞白血病(APL)特別有效)。
在另一個實施方式中，該組合療法包括使用抗KREMEN2抗體或ADC和鉑基藥物(例如卡鉑或順鉑)以及視情況一種或多種其他治療性部分(例如長春瑞濱；吉西他濱；紫杉烷，例如像多西他賽或紫杉醇；伊立替康；或培美曲塞)。
在某些實施方式中，例如在BR-ERPR、BR-ER或BR-PR癌症的治療中，組合療法包括使用抗KREMEN2抗體或ADC和一種或多種描述為“激素療法”的治療性部分。如在此所使用的“激素療法”係指例如他莫昔芬；促性腺激素或黃體生成釋放 激素(GnRH或LHRH)；依維莫司(everolimus)和依西美坦(exemestane)；托瑞米芬(toremifene)；或芳香酶抑制劑(例如阿那曲唑(anastrozole)、來曲唑(letrozole)、依西美坦(exemestane)或氟維司群(fulvestrant))。
在另一個實施方式中，例如在BR-HER2的治療中，組合療法包括使用抗KREMEN2抗體或ADC和曲妥珠單抗或阿多-曲妥珠單抗恩他新(Kadcyla)以及視情況一種或多種其他治療性部分(例如帕妥珠單抗(pertuzumab)和/或多西他賽(docetaxel))。
在一些實施方式中，例如在轉移性乳癌的治療中，組合療法包括使用抗KREMEN2抗體或ADC和紫杉烷(例如多西他賽或紫杉醇)以及視情況一種或多種另外的治療性部分，例如蒽環黴素(例如阿黴素或表柔比星)和/或艾日布林(eribulin)。
在另一個實施方式中，例如，在轉移性或復發性乳癌或BRCA突變型乳癌的治療中，組合療法包括使用抗KREMEN2抗體或ADC和甲地孕酮以及視情況一種或多種另外的治療性部分。
在另外的實施方式中，例如，在BR-TNBC的治療中，組合療法包括使用抗KREMEN2抗體或ADC和聚ADP核糖聚合酶(PARP)抑制劑(例如BMN-673、奧拉帕尼(olaparib)、rucaparib和維利帕尼(veliparib))以及視情況一種或多種另外的治療性部分。
在另一個實施方式中，組合療法包括使用抗 KREMEN2抗體或ADC和PARP抑制劑以及視情況的一種或多種其他治療性部分。
在另一個實施方式中，例如在乳癌的治療中，組合療法包括使用抗KREMEN2抗體或ADC和環磷醯胺以及視情況一種或多種另外的治療性部分(例如阿黴素、紫杉烷、表柔比星、5-FU和/或胺甲喋呤)。
在另一個實施方式中，用於治療EGFR陽性NSCLC的組合療法包括使用抗KREMEN2抗體或ADC和阿法替尼以及視情況一種或多種其他治療性部分(例如埃羅替尼(erlotinib)和/或貝伐單抗(bevacizumab))。
在另一個實施方式中，用於治療EGFR陽性NSCLC的組合療法包括使用抗KREMEN2抗體或ADC和埃羅替尼以及視情況一種或多種其他治療性部分(例如貝伐單抗)。
在另一個實施方式中，用於治療ALK陽性NSCLC的組合療法包括使用抗KREMEN2抗體或ADC和色瑞替尼(Zykadia)以及視情況一種或多種其他治療性部分。
在另一個實施方式中，用於治療ALK陽性NSCLC的組合療法包括使用抗KREMEN2抗體或ADC和克唑替尼(Xalcori)以及視情況一種或多種其他治療性部分。
在另一個實施方式中，組合療法包括使用抗KREMEN2抗體或ADC和貝伐單抗以及視情況一種或多種其他治療性部分(例如吉西他濱或紫杉烷(例如像多西他賽或紫杉醇)； 和/或鉑類似物)。
在另一個實施方式中，組合療法包括使用抗KREMEN2抗體或ADC和貝伐單抗以及視情況環磷醯胺。
在一個具體的實施方式中，用於治療鉑抗性腫瘤的組合療法包括使用抗KREMEN2抗體或ADC和阿黴素和/或依託泊苷和/或吉西他濱和/或長春瑞濱和/或異環磷醯胺和/或亞葉酸調節的5-氟尿嘧啶和/或貝伐單抗和/或他莫昔芬(tamoxifen)；以及視情況一種或多種其他治療性部分。
在所選實施方式中，所揭露的抗體和ADC可以與某些類固醇組合使用，以潛在地使治療過程更有效並減少副作用，如炎症、噁心和過敏。可以與本發明的ADC組合使用的示例性類固醇包括但不限於氫化可體松(hydrocortisone)、地塞米松(dexamethasone)、甲基普賴蘇穠(methylprednisolone)和普賴蘇穠(prednisolone)。在特別較佳的方面，類固醇將包含地塞米松。
在一些實施方式中，抗KREMEN2抗體或ADC可以與各種一線黑素瘤療法組合使用。在一個實施方式中，組合療法包括使用抗KREMEN2抗體或ADC和達卡巴以及視情況一種或多種其他治療性部分。在另外的實施方式中，組合療法包括使用抗KREMEN2抗體或ADC和替莫唑胺以及視情況一種或多種其他治療性部分。在另一個實施方式中，組合療法包括使用抗KREMEN2抗體或ADC和鉑基治療性部分(例如卡鉑或順鉑)以及視情況一種或多種其他治療性部分。在一些實施方式中，組合療法包括使用抗KREMEN2抗體或ADC和長春花生物鹼治療性部分(例如長 春鹼、長春瑞濱、長春新鹼或長春地辛)以及視情況一種或多種其他治療性部分。在一個實施方式中，組合療法包括使用抗KREMEN2抗體或ADC和白細胞介素-2以及視情況一種或多種其他治療性部分。在另一個實施方式中，組合療法包括使用抗KREMEN2抗體或ADC和干擾素-α以及視情況一種或多種其他治療性部分。
在其他實施方式中，抗KREMEN2抗體或ADC可以與輔助性黑素瘤治療和/或外科手術(例如腫瘤切除術)組合使用。在一個實施方式中，組合療法包括使用抗KREMEN2抗體或ADC和干擾素-α以及視情況一種或多種其他治療性部分。
本發明還提供了抗KREMEN2抗體或ADC與放射療法的組合。如本文所使用的術語“放射療法”係指用於在腫瘤細胞內誘導局部DNA損傷的任何機制，如γ照射、X射線、UV照射、微波、電子發射等。還涵蓋了使用放射性同位素向腫瘤細胞的定向傳遞的組合療法，並且該療法可以組合或作為本文所揭露的抗KREMEN2抗體的軛合物使用。典型地，放射療法係以脈衝方式經一段從約1到約2週的時間給予。視情況，該放射療法可以按單次劑量或按多次連續劑量給予。
在其他實施方式中，抗KREMEN2抗體或ADC可以與下述一種或多種化學治療劑組合使用。
D. 抗癌劑
如在此所使用的術語“抗癌劑”係“治療性部分” 的一個子集，其又係被描述為“藥學活性部分”的藥劑的子集。更特別地，“抗癌劑”係指可以用於治療細胞增生性病症(如癌症)的任何藥劑(或其藥學上可接受的鹽)，並且包括但不限於，細胞毒性劑、細胞生長抑制劑、抗血管生成劑、減瘤劑、化學治療劑、放射治療劑、靶向性抗癌劑、生物反應修飾劑、治療性抗體、癌症疫苗、細胞介素、激素療法、抗轉移劑以及免疫治療劑。注意，前述抗癌劑的分類並不排除彼此，並且所選藥劑可以分為一個或多個類別。例如，相容性抗癌劑可以被分類為細胞毒性劑和化學治療劑。因此，前述術語中的每一個都應當根據本揭露並且然後根據它們在醫學領域中的使用來解釋。
在較佳的實施方式中，抗癌劑可以包括抑制或消除，或設計成抑制或消除癌細胞或可能變為癌性或產生腫瘤發生子代(例如腫瘤發生細胞)的細胞的任何化學試劑(例如化學治療劑)。就這一點而言，所選化學試劑(細胞週期依賴性試劑)經常針對細胞生長或分裂必需的細胞內過程，並且因此針對一般迅速生長並且分裂的癌性細胞特別有效。例如，長春新鹼使微管蛋白解聚合，並由此抑制迅速分裂的腫瘤細胞進入有絲分裂。在其他情況下，所選化學試劑係不依賴於細胞週期的試劑，其在其生命週期的任何時間點干擾細胞存活，並且可能對定向治療劑(例如ADC)有效。舉例來說，某些吡咯并苯并二氮呯與細胞DNA的小溝結合並在遞送至細胞核時抑制轉錄。關於組合療法或ADC組分的選擇，應理解的是，鑒於本揭露，熟習該項技術者可容易地鑒定相容性細胞週期依賴性試劑和不依賴於細胞週期的試劑。
在任何情況下，並且如上所暗指，應理解的是，除了本文所揭露的抗KREMEN2抗體和ADC之外，所選抗癌劑還可以彼此(例如，CHOP療法)組合給予。此外，應進一步理解的是，在所選實施方式中，這樣的抗癌劑可以包含軛合物並且可以在給藥之前與抗體締合。在某些實施方式中，所揭露的抗癌劑將與抗KREMEN2抗體連接以提供如本文所揭露的ADC。
如在此所使用，術語“細胞毒性劑”(或細胞毒素)通常是指對細胞有毒的物質，因為其降低或抑制細胞功能和/或引起腫瘤細胞的破壞。在某些實施方式中，該物質係源自活生物體或其類似物(從天然來源純化或合成製備的)的天然存在的分子。細胞毒性劑的實例包括但不限於以下小分子毒素或酶活性毒素：細菌(例如卡奇黴素、白喉毒素、綠膿桿菌內毒素和外毒素、葡萄球菌腸毒素A)、真菌(例如，α-帚麴菌素、局限麴菌素)、植物(例如，相思豆毒素、篦麻毒素、葫蓮根毒蛋白modeccin)、槲寄生素(viscumin)、美洲商陸抗病毒蛋白(pokeweed anti-viral protein)、皂草毒素(saporin)、白樹毒素(gelonin)、苦瓜毒素(momoridin)、天花粉毒素(trichosanthin)、大麥毒素、油桐蛋白(Aleurites fordii protein)、香石竹毒蛋白(dianthin protein)、垂序商陸蛋白(Phytolaeca mericana protein)[PAPI、PAPII及PAP-S]、苦瓜抑制劑、瀉果素、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、米特格林(mitegellin)、局限麴菌素、酚黴素、新黴素及單端孢黴烯族毒素)或動物(例如，細胞毒性RNA酶，如細胞外胰腺RNA酶；DNA酶I，包括其片段和/或變體)。本文陳述了包括某些放射性同位素、美登木素生物鹼、澳瑞他汀、朵拉司他汀(dolastatin)、多卡米新(duocarmyein)、鵝膏蕈鹼(amanitin)和 吡咯并苯并二氮呯的另外的相容性細胞毒性劑。
可以與本發明的抗體組合(或軛合)使用的細胞毒性劑或抗癌劑的實例包括但不限於：烷化劑、烷基磺酸酯、阿那曲唑、鵝膏蕈鹼、氮丙啶、乙烯亞胺及甲基三聚氰胺、多聚乙醯、喜樹鹼、BEZ-235、硼替佐米(bortezomib)、苔蘚抑素(bryostatin)、海綿他汀(callystatin)、CC-1065(CC-1065)、色瑞替尼(ceritinib)、克唑替尼(crizotinib)、念珠藻環肽(cryptophycins)、朵拉斯他丁(dolastatin)、多卡米新(duocarmycin)、伊斯羅賓(eleutherobin)、埃羅替尼(erlotinib)、水鬼蕉鹼(pancratistatin)、薩克丁特(a sarcodictyin)、海綿素(spongistatin)、氮芥(nitrogen mustards)、抗生素(antibiotics)、烯二炔達內黴素(enediyne dynemicin)、雙膦酸酯(bisphosphonates)、埃斯波黴素(esperamicin)、色蛋白烯二炔抗生素發色團、阿克拉黴素(aclacinomysins)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycins)、放線菌素C(cactinomycin)、坎磷醯胺(canfosfamide)、卡拉比星(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycinis)、環磷醯胺(cyclosphosphamide)、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-側氧基-L-正亮胺酸、阿黴素(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依西美坦(exemestane)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟維司群(fulvestrant)、吉非替尼(gefitinib)、伊達比星(idarubicin)、拉帕替尼(lapatinib)、來曲唑(letrozole)、洛那法尼(lonafarnib)、麻西羅黴素(marcellomycin)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、絲裂黴素(mitomycins)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾拉黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、帕唑帕尼(pazopanib)、培洛黴 素(peplomycin)、泊非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、雷帕黴素(rapamycin)、羅多比星(rodorubicin)、索拉非尼(sorafenib)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈脲佐菌素(streptozocin)、三苯氧胺(tamoxifen)、檸檬酸三苯氧胺(tamoxifen citrate)、替莫唑胺(temozolomide)、tepodina、替吡法尼(tipifarnib)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凡德他尼(vandetanib)、伏氯唑(vorozole)、XL-147、淨司他丁、佐柔比星；抗代謝物、葉酸類似物、嘌呤類似物、雄激素、抗腎上腺素、葉酸補充劑(如甲醯四氫葉酸)、醋葡醛內酯、醛磷醯胺糖苷、胺基乙醯丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、貝斯特布斯(bestrabucil)、比生群(bisantrene)、伊達曲沙(edatraxate)、地磷醯胺(defofamine)、秋水仙胺(demecolcine)、地吖醌(diaziquone)、依氟鳥胺酸(elfornithine)、依利醋銨(elliptinium acetate)、艾普塞隆(epothilone)、依託格魯(etoglucid)、硝酸鎵(gallium nitrate)、羥基脲(hydroxyurea)、香菇多糖(lentinan)、羅尼達寧(lonidainine)、類美登醇(maytansinoids)、米托胍腙(mitoguazone)、米托蒽醌(mitoxantrone)、莫哌達醇(mopidanmol)、尼曲瑞林(nitraerine)、噴司他丁(pentostatin)、蛋胺氮芥(phenamet)、比柔比星(pirarubicin)、洛索蒽醌(losoxantrone)、鬼臼酸(podophyllinic acid)、2-乙肼(2-ethylhydrazide)、丙卡巴肼、多糖複合物、雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；SF-1126、西佐喃；鍺螺胺；細交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2,2’,2"-三氯三乙胺；單端孢黴烯族毒素(T-2毒素、疣孢菌素A、漆斑菌素A及蛇形菌素)；烏拉坦；長春地辛；達卡巴；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴衛矛醇；哌泊溴烷；蓋克托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷；環磷醯胺；塞替派；紫杉烷、苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥嘌 呤；巰基嘌呤；胺甲喋呤；鉑類似物、長春花鹼；鉑；依託泊苷；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼；長春瑞賓；諾消靈；替尼泊苷；依達曲沙；道諾黴素；胺基喋呤；西羅達；伊班膦酸鹽；伊立替康、拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸；視黃醇；卡培他濱；康普瑞汀；亞葉酸；奧沙利鉑；XL518，PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR及VEGF-A的抑制劑，該等抑制劑減少細胞增生；及以上任一項的藥學上可接受的鹽或溶劑化物、酸或衍生物。這一定義中還包括用於調控或抑制對於腫瘤的激素作用的抗激素劑，如抗雌激素和選擇性雌激素受體抗體，抑制酶芳香酶的芳香酶抑制劑，該等抑制劑調控腎上腺中雌激素的產生，及抗雄激素；以及曲沙他濱(1,3-二氧雜環戊烷核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸、核糖酶，如VEGF表現抑制劑和HER2表現抑制劑；疫苗，PROLEUKIN® rIL-2；LURTOTECAN®拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX® rmRH；長春瑞濱和埃斯波黴素，及以上任一項的藥學上可接受的鹽或溶劑化物、酸或衍生物。
相容性細胞毒性劑或抗癌劑還可以包含商業上或臨床上可用的化合物，如埃羅替尼(TARCEVA®，基因技術公司(Genentech)/OSI製藥公司(OSI Pharm.))、多西他賽(TAXOTERE®，賽諾菲-安萬特公司(Sanofi-Aventis))、5-FU(氟尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，CAS號51-21-8)、吉西他濱(GEMZAR®，禮來公司(Lilly))、PD-0325901(CAS號391210-10-9，輝瑞公司)、順鉑(順式二胺，二氯鉑(II)、CAS號15663-27-1)、卡鉑(CAS號41575-94-4)、紫杉醇(TAXOL®，百時美施貴寶腫瘤學(Bristol-Myers Squibb Oncology)、新澤西州普林斯頓)、曲妥珠 單抗(HERCEPTIN®，基因技術公司)、替莫唑胺(4-甲基-5-側氧基-2,3,4,6,8-五氮雜雙環[4.3.0]壬-2,7,9-三烯-9-甲醯胺，CAS號85622-93-1，TEMODAR®，TEMODAL®，先靈葆雅公司(Schering Plough))、三苯氧胺((Z)-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-N,N-二甲基乙胺，NOLVADEX®，ISTUBAL®，VALODEX®)和阿黴素(ADRIAMYCIN®)。另外的商業上或臨床上可用的抗癌劑包括依魯替尼(IMBRUVICA®，艾伯維公司(AbbVie))、奧沙利鉑(ELOXATIN®，賽諾菲公司(Sanofi))、硼替佐米(VELCADE®，千禧製藥公司(Millennium Pharm.))、索坦(sutent)(SUNITINIB®，SU11248，輝瑞公司)、來曲唑(FEMARA®，諾華公司(Novartis))、甲磺酸伊馬替尼(GLEEVEC®，諾華公司)、XL-518(Mek抑制劑，Exelixis，WO 2007/044515)、ARRY-886(Mek抑制劑，AZD6244，陣列生物製藥公司(Array BioPharma)，阿斯利康公司)、SF-1126(PI3K抑制劑，薩馬福爾製藥公司(Semafore Pharmaceuticals))、BEZ-235(PI3K抑制劑，諾華公司)、XL-147(PI3K抑制劑，Exelixis)、PTK787/ZK 222584(諾華公司)、氟維司群(FASLODEX®，阿斯利康公司)、亞葉酸(醛葉酸)、雷帕黴素(西羅莫司，RAPAMUNE®，惠氏公司)、拉帕替尼(TYKERB®，GSK572016，葛蘭素史克公司(Glaxo Smith Kline))、洛那法尼(SARASARTM，SCH 66336，先靈葆雅公司)、索拉非尼(NEXAVAR®，BAY43-9006，拜耳實驗室)、吉非替尼(IRESSA®，阿斯利康公司)、伊立替康(CAMPTOSAR®，CPT-11，輝瑞公司)、替吡法尼(ZARNESTRATM，強生公司(Johnson & Johnson))、ABRAXANETM(不含克列莫佛)、紫杉醇的白蛋白工程化奈米顆粒 配製物(美國製藥合作夥伴公司(American Pharmaceutical Partners)，伊利諾州紹姆堡(Schaumberg，I1))、凡德他尼(rINN，ZD6474，ZACTIMA®，阿斯利康公司)、氯醌、AG1478、AG1571(SU 5271；蘇根公司(Sugen))、坦羅莫司(TORISEL®，惠氏公司)、帕唑帕尼(葛蘭素史克公司)、坎磷醯胺(TELCYTA®，泰力克公司(Telik))、噻替派和環磷醯胺(CYTOXAN®，NEOSAR®)、長春瑞濱(NAVELBINE®)、卡培他濱(XELODA®，羅氏公司)、三苯氧胺(包括NOLVADEX®；檸檬酸三苯氧胺)、FARESTON®(檸檬酸托他米芬)、MEGASE®(醋酸甲地孕酮)、AROMASIN®(依西美坦，輝瑞公司)、甲霜靈、法多唑、RIVISOR®(伏氯唑)、FEMARA®(來曲唑；諾華公司)和ARIMIDEX®(阿那曲唑；阿斯利康公司)。
術語“藥學上可接受的鹽”或“鹽”係指分子或大分子的有機或無機鹽。可以與胺基基團形成酸加成鹽。示例性鹽包括但不限於硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、異煙酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、酸式檸檬酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、鞣酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、龍膽酸鹽(gentisinate)、富馬酸鹽、葡萄糖酸鹽、葡萄糖醛酸鹽、糖質酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、穀胺酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、以及雙羥萘酸鹽(即1,1'亞甲基雙-(2-羥基3-萘甲酸鹽)。藥學上可接受的鹽可以涉及包含另一種分子，如乙酸根離子、琥珀酸根離子或其他平衡離子。該平衡離子可以是使母體化合物上的電荷穩定的任何有機或無機部分。 此外，藥學上可接受的鹽在其結構中可以具有多於一個帶電荷的原子。在多個帶電荷的原子係藥學上可接受的鹽的一部分的情況下，該鹽可以具有多個平衡離子。因此，藥學上可接受的鹽可以具有一個或多個帶電荷的原子和/或一個或多個平衡離子。
類似地，“藥學上可接受的溶劑化物”或“溶劑化物”係指一種或多種溶劑分子與分子或大分子的締合。形成藥學上可接受的溶劑化物的溶劑的實例包括但不限於水、異丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。
在其他實施方式中，本發明的抗體或ADC可以與目前臨床試驗中或可商購的多種抗體(或免疫治療劑)中的任一種組合使用。所揭露的抗體可以與選自下組的抗體組合使用，該組由以下組成：阿巴伏單抗(abagovomab)、阿德木單抗(adecatumumab)、阿托珠單抗(afutuzumab)、阿侖單抗(alemtuzumab)、阿妥莫單抗(altumomab)、阿托昔單抗(amatuximab)、anatumomab、阿西莫單抗(arcitumomab)、阿特朱單抗(atezolizumab)、艾維單抗(avelumab)、巴維昔單抗(bavituximab)、貝妥莫單抗(bectumomab)、貝伐單抗(bevacizumab)、比伐珠單抗(bivatuzumab)、博納吐單抗(blinatumomab)、布妥昔單抗(brentuximab)、坎妥珠單抗(cantuzumab)、卡妥索單抗(catumaxomab)、西妥昔單抗(cetuximab)、西他珠單抗(citatuzumab)、西妥木單抗(cixutumumab)、利伐珠單抗(clivatuzumab)、坎妥木單抗(conatumumab)、達西珠單抗(dacetuzumab)、多妥珠單抗(dalotuzumab)、達妥木單抗(daratumumab)、地莫單抗(detumomab)、曲茲妥單抗(drozitumab)、杜利妥單抗(duligotumab)、杜維單抗(durvalumab)、杜昔 妥單抗(dusigitumab)、依美昔單抗(ecromeximab)、艾妥珠單抗(elotuzumab)、恩脫昔單抗(ensituximab)、厄妥索單抗(ertumaxomab)、達珠單抗(etaracizumab)、法妥珠單抗(farletuzumab)、拉妥珠單抗(ficlatuzumab)、費妥木單抗(figitumumab)、法伏妥單抗(flanvotumab)、弗妥昔單抗(futuximab)、加尼妥單抗(ganitumab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、吉瑞昔單抗(girentuximab)、來巴妥單抗(glembatumumab)、替伊莫單抗(ibritumomab)、伊戈伏單抗(igovomab)、麥妥珠單抗(imgatuzumab)、印妥昔單抗(indatuximab)、伊珠單抗(inotuzumab)、英妥木單抗(intetumumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、伊妥木單抗(iratumumab)、拉貝珠單抗(labetuzumab)、lambrolizumab、來沙木單抗(lexatumumab)、林妥珠單抗(lintuzumab)、洛伐珠單抗(lorvotuzumab)、魯卡木單抗(lucatumumab)、曼妥木單抗(mapatumumab)、馬妥珠單抗(matuzumab)、米妥珠單抗(milatuzumab)、明瑞莫單抗(minretumomab)、米妥莫單抗(mitumomab)、莫妥木單抗(moxetumomab)、那妥單抗(narnatumab)、那莫單抗(naptumomab)、尼妥木單抗(necitumumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、納武單抗(nivolumab)、若莫單抗(nofetumomabn)、obinutuzumab、卡妥珠單抗(ocaratuzumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、奧拉妥單抗(olaratumab)、奧拉帕尼(olaparib)、昂妥珠單抗(onartuzumab)、奧妥珠單抗(oportuzumab)、瑞戈伏單抗(oregovomab)、帕尼單抗(panitumumab)、帕圖珠單抗(parsatuzumab)、帕托單抗(patritumab)、派姆單抗盤圖莫單抗(pembrolizumab pemtumomab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、pidilizumab(pidilizumab)、平妥單抗(pintumomab)、普立木單抗(pritumumab)、拉妥木單抗(racotumomab)、拉圖單抗(radretumab)、雷莫蘆單抗 (ramucirumab)、利妥木單抗(rilotumumab)、利妥昔單抗(rituximab)、羅妥木單抗(robatumumab)、沙妥莫單抗(satumomab)、昔洛珠單抗(selumetinib)、sibrotuzumab、司妥昔單抗(siltuximab)、司妥佐單抗(simtuzumab)、索利圖單抗(solitomab)、他妥珠單抗(tacatuzumab)、他妥莫單抗(taplitumomab)、替妥莫單抗(tenatumomab)、替普莫單抗(teprotumumab)、加珠單抗(tigatuzumab)、托西莫單抗(tositumomab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、托卡珠單抗(tucotuzumab)、烏妥昔單抗(ublituximab)、維妥珠單抗(veltuzumab)、沃妥珠單抗(vorsetuzumab)、伏妥莫單抗(votumumab)、紮魯木單抗(zalutumumab)、CC49、3F8、MEDI0680、MDX-1105及其組合。
其他實施方式包括被批准用於癌症療法的抗體的使用，包括但不限於，利妥昔單抗、吉妥珠單抗奧佐米星、阿侖單抗、替伊莫單抗、托西莫單抗、貝伐單抗、西妥昔單抗、帕木單抗、奧法木單抗、伊匹單抗及布妥昔單抗威多廷。熟習該項技術者將能夠容易地鑒定與在此的傳授內容相容的另外的抗癌劑。
E. 放射療法
本發明還提供了抗體或ADC與放射療法(即，用於在腫瘤細胞內誘導DNA損傷的任何機制，如γ照射、X射線、UV照射、微波、電子發射等)的組合。還涵蓋了使用放射性同位素向腫瘤細胞的定向傳遞的組合療法，並且所揭露的抗體或ADC可以與靶向性抗癌劑或其他靶向手段聯合使用。典型地，放射療法係以脈衝方式經一段從約1到約2週的時間給予。該放射療法可以給予患有頭頸癌的受試者，持續約6到7週。視情況，該放射療法可 以按單次劑量或按多次連續劑量給予。
VIII. 適應症
本發明提供了本發明的抗體和ADC用於診斷、治療性診斷、治療和/或預防各種病症(包括贅生性病症、炎症、血管生成性病症和免疫疾病以及由病原體引起的病症)的用途。在某些實施方式中，待治療的疾病包括包含實體瘤的贅生性病症。在其他實施方式中，待治療的疾病包括惡性血液病。在某些實施方式中，本發明的抗體或ADC將被用於治療表現KREMEN2決定因子的腫瘤或腫瘤發生細胞。較佳的是，有待治療的“受試者”或“患者”將為人類，不過如在此所使用，該等術語明確地被視作包含任何哺乳動物物種。
應理解的是，本發明的化合物和組成物可用於在疾病的不同階段和其治療週期的不同時間點治療受試者。因此，在某些實施方式中，本發明的抗體和ADC將被用作一線治療，並且被給予於之前沒有針對癌性病症進行治療的受試者。在其他實施方式中，本發明的抗體和ADC將被用於治療二線和三線患者(即，先前針對同一病症分別治療一次或兩次的那些患者)。仍其他實施方式將包括已經用所揭露的KREMEN2 ADC或用不同治療劑治療相同或相關病症三次或更多次的四線或更高線患者(例如胃癌或結腸直腸癌患者)的治療。在其他實施方式中，本發明的化合物和組成物將用於治療先前已經被治療(用本發明的抗體或ADC或用其他抗癌劑)並且已經復發或被確定為對先前的治療難以治療的受試者。在所選實施方式中，本發明的化合物和組成物可用於 治療具有復發性腫瘤的受試者。
在某些方面，該增生性病症將包含實體瘤，包括但不限於，腎上腺腫瘤、肝腫瘤、腎腫瘤、膀胱腫瘤、乳房腫瘤、胃腫瘤、卵巢腫瘤、宮頸腫瘤、子宮腫瘤、食管腫瘤、結腸直腸腫瘤、前列腺腫瘤、胰腺腫瘤、肺腫瘤(小細胞腫瘤和非小細胞腫瘤，包括肺腺癌)、甲狀腺腫瘤、癌瘤、肉瘤、神經膠質母細胞瘤及多種頭頸腫瘤。在其他較佳的實施方式中，所揭露的ADC在治療鱗狀細胞肺癌(SCC-LU)並且在所選方面，在治療管腔上皮B型乳癌B(BR-LumB)方面特別有效。在某些實施方式中，肺癌係難治性、復發性或對蒽環類藥物和/或紫杉烷(例如，多西他賽、紫杉醇、拉洛他賽或卡巴他賽)具有抗性的。在本發明的仍其他方面，所揭露的抗體和ADC可用於治療甲狀腺髓樣癌、大細胞神經內分泌癌(LCNEC)、神經膠質母細胞瘤、神經內分泌前列腺癌(NEPC)、高分級胃腸胰腺癌(GEP)和惡性黑素瘤。
在其他特別較佳的實施方式中，本發明的ADC可用於治療結腸直腸癌。如在此所使用的，術語“結腸直腸癌”旨在包括公認的醫學定義，定義了結腸直腸癌作為一種醫學病症，其特徵為低於小腸的腸道(即大腸(結腸)，包括盲腸、升結腸、橫結腸、降結腸、以及乙狀結腸、以及直腸)中的癌細胞。此外，如在此所使用的，術語“結腸直腸癌”旨在進一步包括其特徵係十二指腸和小腸中(空腸和迴腸)中的癌細胞的醫學病症。如在此所使用的結腸直腸癌的定義比通常的醫學定義更寬泛，但是如這樣來提供係因為十二指腸和小腸的細胞也可以適用於本發明的 方法。此外，本發明的化合物可用於治療I期結腸直腸癌、II期結腸直腸癌、III期結腸直腸癌或IV期結腸直腸癌。
在其他所選實施方式中，本發明的化合物和組成物可用於治療胃癌。
關於胰腺癌，本文所揭露的組成物可用於治療腺泡細胞胰腺癌、十二指腸胰腺癌、黏液性胰腺癌、神經內分泌胰腺癌、胰腺腺癌、胰腺腺癌外分泌型、導管胰腺腺癌和壺腹胰腺腺癌。
更一般而言，經歷根據本發明的治療的示例性贅生性病症可以是良性或惡性的；可以是實體瘤或惡性血液病；並且可以選自下組，該組包括但不限於：腎上腺腫瘤、AIDS相關癌症、蜂窩狀軟部肉瘤、星形細胞腫瘤、自主神經節腫瘤、膀胱癌(鱗狀細胞癌和移行細胞癌)、囊胚腔病症、骨癌(釉質上皮瘤、動脈瘤狀骨囊腫、骨軟骨瘤、骨肉瘤)、腦和脊髓癌、轉移性腦腫瘤、乳癌、頸動脈體瘤、子子宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、腎嫌色細胞癌瘤、腎透明細胞癌瘤、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚良性纖維性組織細胞瘤、促結締組織增生性小圓細胞瘤、室管膜瘤、上皮病症、尤文氏腫瘤(Ewing's tumor)、骨外黏液樣軟骨肉瘤、骨纖維生成不良、骨纖維異常增生症、膽囊和膽管癌、胃癌、胃腸癌、妊娠滋養細胞病、生殖細胞腫瘤、腺疾病、頭頸癌、下丘腦癌、腸癌、胰島細胞腫瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's Sarcoma)、腎癌(腎母細胞瘤、乳頭狀腎細胞癌)、白血病、脂肪瘤/良性脂肪性腫瘤、脂肪肉瘤/惡性脂肪性腫瘤、肝癌(肝母細胞瘤、肝細胞癌)、淋巴 瘤、肺癌(小細胞癌、腺癌、鱗狀細胞癌、大細胞癌等)、巨噬細胞病症、髓母細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、甲狀腺髓樣癌、多發性內分泌瘤、多發性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合症、成神經細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳頭狀甲狀腺癌瘤、甲狀旁腺腫瘤、兒科癌症、周圍神經鞘膜瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體瘤、前列腺癌、後葡萄膜黑素瘤(posterious unveal melanoma)、罕見血液性病症、腎轉移性癌、橫紋肌樣腫瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、基質病症、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺上皮癌(thymic carcinoma)、胸腺瘤(thymoma)、甲狀腺轉移性癌症及子宮癌(子子宮頸癌、子宮內膜癌及平滑肌瘤)。在某些實施方式中，本發明的化合物和組成物將被用作一線治療，並且被給予於先前沒有針對癌性病症進行治療的受試者。在其他實施方式中，本發明的化合物和組成物將用於治療先前已經被治療(用本發明的抗體或ADC或用其他抗癌劑)並且已經復發或被確定為對先前的治療難以治療的受試者。在所選實施方式中，本發明的化合物和組成物可用於治療具有復發性腫瘤的受試者。
在某些實施方式中，本發明的化合物和組成物將被用作一線治療，並且被給予於先前沒有針對癌性病症進行治療的受試者。在其他實施方式中，本發明的化合物和組成物將用於治療先前已經被治療(用本發明的抗體或ADC或用其他抗癌劑)並且已經復發或被確定為對先前的治療難以治療的受試者。在所選實施方式中，本發明的化合物和組成物可用於治療具有復發性腫瘤的受試者。
關於惡性血液病，應進一步理解的是，本發明的化合物和方法可以特別有效地治療多種白血病，包括急性骨髓性白血病(AML，基於FAB命名法(M0-M7)、WHO分類、分子標記/突變、核型、形態學以及其他特徵來識別其各種亞型)、世系急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、多毛細胞白血病(HCL)、慢性骨髓單核細胞性白血病(CMML)、青少年骨髓單核細胞性白血病(JMML)和大顆粒淋巴細胞性白血病(LGL)以及B細胞淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤(經典霍奇金淋巴瘤和結節淋巴細胞為主的霍奇金淋巴瘤)、非霍奇金淋巴瘤，包括彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、低等級/NHL濾泡細胞淋巴瘤(FCC)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、黏膜相關淋巴組織(MALT)淋巴瘤、套細胞淋巴瘤(MCL)和伯基特淋巴瘤(BL)；中等等級/濾泡性NHL、中等等級彌漫性NHL、高等級免疫母細胞性NHL、高等級淋巴母細胞性NHL、高等級小非卵裂細胞NHL、大包塊疾病NHL、華氏巨球蛋白血症、淋巴漿細胞樣淋巴瘤(LPL)、AIDS相關淋巴瘤、單核細胞性B細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞性淋巴結病、彌漫性小卵裂細胞淋巴瘤、大細胞免疫母細胞性成淋巴細胞瘤、小非卵裂淋巴瘤、伯基特氏和非伯基特氏淋巴瘤、濾泡性(主要為大細胞)淋巴瘤、濾泡性(主要為小卵裂細胞)淋巴瘤、以及濾泡性混合性小卵裂細胞和大細胞淋巴瘤。參見Gaidono等人，"Lymphomas",IN CANCER：PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY[“淋巴瘤”，癌症：腫瘤學原理與實踐]，第2卷：2131-2145(DeVita等人編輯，第5增版1997)。熟習該項技術者應當清楚的是，該等淋 巴瘤由於分類系統的改變而經常會具有不同的名稱，並且患有以不同名稱分類的淋巴瘤的患者也可以從本發明的組合治療方案獲益。
在某些所選方面，所揭露的ADC可有效治療胃癌，包括腸型、彌漫型、賁門癌、胃間質型、類癌和印戒細胞胃腺癌。在一個實施方式中，胃癌係難治性、復發性或對輻射、5-氟尿嘧啶、鉑基藥劑(例如卡鉑、順鉑、奧沙利鉑)或其組合具有抗性的。在所選實施方式中，抗體和ADC可以被給予於表現出非轉移性或轉移性胃癌的患者。在其他實施方式中，所揭露的軛合抗體將被給予於難治性患者(即，在完成初始治療的過程期間或之後不久疾病復發的患者)；敏感患者(即，初次治療後復發超過2-3個月的患者)；或對輻射、5-氟尿嘧啶和/或鉑基藥劑(例如卡鉑、順鉑、奧沙利鉑)表現出抗性的患者。在每個情形中，應當理解，取決於所選給藥方案和臨床診斷，可以將相容性ADC與其他抗癌劑組合使用。
如先前在其他所選方面中所指出的，所揭露的ADC在治療結腸直腸癌(包括腺癌、黏液性腺癌、腸類癌、腸間質平滑肌肉瘤、鱗狀細胞癌、神經內分泌癌以及小腸、結腸和直腸印戒細胞癌)方面特別有效。在一個實施方式中，結腸直腸癌係難治性、復發性或對輻射、5-氟尿嘧啶、鉑基藥劑(例如卡鉑、順鉑、奧沙利鉑)、VEGF-A靶向性藥劑、VEGF受體靶向性藥劑、EGFR靶向性藥劑及其組合具有抗性的。在所選實施方式中，抗體和ADC可以被給予於展現出非轉移性或轉移性結腸直腸癌的患者。
在其他實施方式中，所揭露的軛合抗體將給予於難治性患者(即，在完成初始治療的過程期間或之後不久疾病復發的患者)；敏感患者(即，初次治療後復發超過2-3個月的患者)；或對輻射、5-氟尿嘧啶、鉑基藥劑(例如卡鉑、順鉑、奧沙利鉑)、VEGF-A靶向性藥劑、VEGF受體靶向性藥劑和/或EGFR靶向性藥劑表現出抗性的患者。在每個情形中，應當理解，取決於所選給藥方案和臨床診斷，可以將相容性ADC與其他抗癌劑組合使用。
在又其他所選方面，所揭露的ADC在治療肺癌(包括肺腺癌、小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)(例如，鱗狀細胞非小細胞肺癌或鱗狀細胞小細胞肺癌))方面是有效的。在一個實施方式中，肺癌係難治性、復發性或對鉑基藥劑(例如，卡鉑、順鉑、奧沙利鉑)和/或紫杉烷(例如多西他賽、紫杉醇、拉洛他賽或卡巴他賽)具有抗性的。在另一個實施方式中，待治療的受試者患有大細胞神經內分泌癌(LCNEC)。
在某些較佳的實施方式中，本發明的KREMEN2 ADC可以給予於患有鱗狀細胞肺癌的一線患者。在其他實施方式中，本發明的KREMEN2 ADC可以給予於遭受同樣痛苦的二線患者。在仍其他實施方式中，本發明的KREMEN2 ADC可以給予於患有鱗狀細胞肺癌的三線患者。
如所示，所揭露的抗體和ADC在治療肺癌方面是有效的，所述肺癌包括以下亞型：小細胞肺癌和非小細胞肺癌(例如鱗狀細胞肺癌)。在其他實施方式中，所揭露的組成物可以用於治療肺腺癌。在所選實施方式中，抗體和ADC可以被給予於表現 出局限期疾病或擴散期疾病的患者。在其他實施方式中，所揭露的軛合抗體將被給予於難治性患者(即在完成初始治療過程期間或之後不久疾病復發的患者)；敏感患者(即，初次治療後復發超過2-3個月的患者)；或對鉑基藥劑(例如卡鉑、順鉑、奧沙利鉑)和/或紫杉烷(例如多西他賽、紫杉醇、拉洛他賽或卡巴他賽)表現出抗性的患者。在某些較佳的實施方式中，本發明的KREMEN2 ADC可以給予於一線患者。在其他實施方式中，本發明的KREMEN2 ADC可以給予於二線患者。在仍其他實施方式中，本發明的KREMEN2 ADC可以給予於三線患者。在每個情形中，應當理解，取決於所選給藥方案和臨床症狀，可以將相容性ADC與其他抗癌劑組合使用。
在某些方面，本發明的化合物和組成物可用於治療乳癌。應理解的是，乳癌係一種具有經鑒定的幾種生物亞型的異質性疾病。就這一點而言，根據雌激素受體(ER)、黃體酮受體(PR)和erbB2/Her2的表現，乳癌現在被認為包含至少四種不同的腫瘤亞型。該等亞型包括：基底樣/三陰性乳癌、Her2陽性乳癌、管腔上皮A型乳癌和管腔上皮B型乳癌。管腔上皮A型係最常見的乳癌亞型(占所有浸潤性乳癌的40%)，並且其特徵在於ER+和/或PR+/Her2-狀態、低級別腫瘤和良好預後。管腔上皮B型約占所有浸潤性乳癌的25%，並且以ER+和/或PR+/Her2+狀態欄分，結果不佳。具有陰性ER、PR和Her2狀態的乳癌亞型(所有浸潤性乳癌的20%)通常被稱為三陰性乳癌或基底樣乳癌。富含Her2的亞型(Her2+/ER-/PR-)最少見，占所有浸潤性乳癌的15%。儘管本發明的抗體和ADC可以用於治療所有不同類型的KREMEN2陽性乳 癌，但對於治療基底樣乳癌和管腔上皮B型乳癌(其中常見治療性抗性)可以是特別有效的，並且如以下實例中所示，其中分子譜分析將KREMEN2鑒定為有希望的新的治療靶標。
多基因表現研究已經複製了管腔上皮A和管腔上皮B亞型。這兩種亞型具有使人想起乳房的管狀上皮成分的表現模式，包括管狀細胞角蛋白8/18、ER和與ER啟動相關的基因如CCND1(細胞週期蛋白D1)的表現。這兩個管狀亞型之間的主要分子差異在於，一般而言，管腔上皮B型具有ER相關基因的較低表現和增生基因的較高表現。幾項基因表現研究的綜述指出，大約20%的管腔上皮B型乳癌係免疫組織化學的HER2陽性的。大約30%的免疫組織化學定義的HER2陽性腫瘤被分配到管腔上皮B亞型。在許多隨後的研究中，管腔上皮B型乳癌已被定義為增生增加的ER陽性乳癌。在基因表現研究中，增生基因如CCNB1、MKI67和MYBL2在管腔上皮B亞型中相比於管腔上皮A亞型更高表現，這與也在管腔上皮B型癌症中觀察到的更高比例的組織學分級III相關。增生一貫被鑒定為係若干個預後多基因標記(包括內在的分子分類)的最重要的特徵。在ER陽性/HER2陰性腫瘤中，增生係早期復發風險的最強預言者，其將高風險管腔上皮B型腫瘤與低風險管腔上皮A型腫瘤區分開來。
未經治療的管腔上皮B型乳癌的總體存活率與廣泛認為係高風險的基底樣和HER2陽性亞組相似。在一項使用50-基因分類器(50-gene classifier)為761個未經治療的乳癌患者分配內在亞型的研究中，亞型與結果相關；對未經治療的早期乳癌進行多 變數分析，使用管腔上皮A亞型作為參比，管腔上皮B型乳癌被證明針對無復發存活率(RFS)具有2.43(P<0.0001)的風險比，與對於erbB2/HER2增生腫瘤的風險比(2.53，P=0.00012)相似。三陰性/基底樣乳癌具有中等存活時間，死亡發生得比管腔上皮A型乳癌早。在針對Her2富集的亞型和管腔上皮B亞型的前3到4年的隨訪期間，存活率急劇下降，然後隨訪的隨後幾年下降放緩。三陰性亞型在前2至2.5年內顯示出相似的早期下降，在約13年的隨訪內顯示出更緩慢的下降。此外，管狀乳癌似乎傾向於轉移到肺、骨和胸膜。幾項研究表明，管腔上皮B型乳癌與管腔上皮A型乳癌相比，對內分泌療法相對不敏感，並且與HER2富集的乳癌和基底樣乳癌相比，對化學療法相對不敏感。
與目前的臨床情況相反，本發明的ADC和抗體已顯示出表現有如以下實例中所示的抗腫瘤活性。更具體而言，所揭露的抗KREMEN2 ADC顯示出與管腔上皮B型乳癌中的腫瘤發生細胞有效且特異性地締合。所選的腫瘤細胞的這種靶向指示藥劑具有實質治療潛力。
IX. 製品
本發明包括包含一個或多個容器(container)或接受器的藥物包裝和套組，其中容器可以包含一個或多個劑量的本發明的抗體或ADC。這樣的套組或包裝本質上可以是診斷性的或治療性的。在某些實施方式中，該包裝或套組包含單位劑量，意指組成物的預定量，該組成物例如包含本發明的抗體或ADC，含或不含一種或多種另外的試劑，以及視情況一種或多種抗癌劑。 在某些其他實施方式中，該包裝或套組含有可檢測量的抗KREMEN2抗體或ADC，具有或不具有相關的報導分子以及視情況一種或多種另外的試劑，用於癌性細胞的檢測、定量和/或視覺化。
在任何情況下，本發明的套組通常將包含在合適的容器或接受器中的本發明的抗體或ADC，藥學上可接受的配製物，以及視情況在相同或不同容器中的一種或多種抗癌劑。所述套組還可以含有其他藥學上可接受的配製物或裝置，用於診斷或組合療法。診斷裝置或儀器的實例包括可用於檢測、監測、量化或分析與增生性病症相關的細胞或標記物的那些(關於這樣的標記物的完整清單，參見上文)。在一些實施方式中，該等裝置可以用於在體內或體外對循環腫瘤細胞進行檢測、監測和/或定量(參見例如WO 2012/0128801)。在再其他實施方式中，循環腫瘤細胞可以包含腫瘤發生細胞。本發明預期的套組還可以含有合適的試劑以將本發明的抗體或ADC與抗癌劑或診斷劑進行組合(例如，參見U.S.P.N.7,422,739)。
當套組的組分被提供在一種或多種液體溶液中時，該液體溶液可以是非水性的，儘管通常較佳的是水性溶液，特別較佳的是無菌水性溶液。套組中的配製物還可以作為可以在加入合適的液體時重構的乾燥粉末或以凍乾形式提供。用於重構的液體可以包含在單獨的容器中。這樣的液體可以包含無菌的藥學上可接受的緩衝液或其它稀釋劑，如抑菌性注射用水、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液或葡萄糖溶液。在套組包含本發明的抗體或ADC組合另外的治療劑或試劑的情況下，能以莫耳當量組合或者一種 組分超過另一種組分來預先混合該溶液。可替代地，本發明的抗體或ADC以及任何視情況的抗癌劑或其他藥劑(例如類固醇)可以在給予患者之前分開保持在不同的容器中。
在某些較佳的實施方式中，包含本發明的組成物的上述套組將包含標籤、標記物、藥品說明書、條碼和/或閱讀器，這表明套組內容物可用於治療、預防和/或診斷癌症。在其他較佳的實施方式中，套組可以包括標籤、標記物、藥品說明書、條碼和/或閱讀器，這表明套組內容物可以根據某一劑量或給藥方案給予以治療患有癌症的受試者。在特別較佳的方面，所述標籤、標記物、藥品說明書、條碼和/或閱讀器表明套組內容物可用於治療、預防和/或診斷肺癌，或提供用於治療肺癌的劑量或給藥方案。在其他特別較佳的方面，所述標籤、標記物、藥品說明書、條碼和/或閱讀器表明套組內容物可用於治療、預防和/或診斷乳癌(例如，管腔上皮B型乳癌)或用於治療乳癌的給藥方案。
合適的容器或接受器包括例如瓶、小瓶、注射器、輸注袋(即，袋子)等。所述容器可以由多種材料形成，如玻璃或藥學上相容的塑膠。在某些實施方式中，所述一個或多個接受器可以包含無菌存取口。例如，該容器可以是具有可藉由皮下注射針刺穿的塞子的靜脈輸液袋或小瓶。
在一些實施方式中，該套組可以含有一種藉由其將該抗體和任何視情況的組分給予患者的構件，例如，一個或多個針或注射器(預裝滿的或空的)、滴眼管、移液管或其他此類裝置，由該裝置，可以將配製物注射或引入到受試者中或施用到身體的 患病區域。本發明的套組還將典型地包括一種用於容納小瓶或此類裝置及其他組分的緊密封閉的構件以供商業銷售，如例如吹塑的塑膠容器，在其中放置並且保持所希望的小瓶和其他裝置。
X. 其他
除非在此另外定義，否則結合本發明使用的科技術語應當具有熟習該項技術者通常所瞭解的意義。另外，除非上下文另外需要，否則單數形式的術語應當包括複數形式並且複數形式的術語應當包括單數形式。此外，說明書和所附申請專利範圍中提供的範圍包括端點和該等端點之間的所有點。因此，2.0到3.0的範圍包括2.0、3.0及2.0與3.0之間的所有點。
一般而言，在此所描述的細胞和組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學以及化學的技術係本領域中眾所周知並且常用的那些。在此使用的與這樣的技術相關聯的命名法也是本領域常用的。除非另外指明，否則本發明的方法及技術通常根據本領域中熟知的常規方法且如本說明書通篇所引用的各種參考文獻中所描述來進行。
XI. 參考文獻
將在此援引的全部專利、專利申請、和出版物、和以電子方式可獲得的材料(包括，例如，核苷酸序列提交，例如GenBank和RefSeq；和胺基酸序列提交，例如SwissProt、PIR、PRF、PBD；以及來自GenBank和RefSeq中經注釋的編碼區的翻譯)的完整揭露內容藉由引用結合，而不管短語“藉由引用結合”是否相 關於特定參考文獻使用。以上的詳細說明和後面的實例僅係出於清晰理解的目的而給出的。不應理解為由此構成任何不必要的限制。本發明不限於所顯示和描述的具體細節。由申請專利範圍限定的本發明包括對於熟習該項技術者而言顯而易見的變化。在此使用的任何章節標題只是出於組織的目的，而不應被解釋為限制所描述的主題。
以下緊接著列出了可能感興趣的某些論文：
‧ Davidson G, Mao B, del Barco Barrantes I, Niehrs C. Kremen proteins interact with Dickkopfl to regulate anteroposterior CNS patterning. Development. 2002 Dec;129(24):5587-96. Erratum in: Development. 2003 Jan;130(2):425.PMID: 12421700
‧ Dun X, Jiang H, Zou J, Shi J, Zhou L, Zhu R, Hou J., Differential expression of DKK-1 binding receptors on stromal cells and myeloma cells results in their distinct response to secreted DKK-1 in myeloma. Mol Cancer. 2010 Sep 16;9:247. doi: 10.1186/1476-4598-9-247. PMID: 20846389
‧ Li Y, Lu W, King TD, Liu CC, Bijur GN, Bu G., Dkk1 stabilizes Wnt co-receptor LRP6: implication for Wnt ligand-induced LRP6 down-regulation. PLoS One. 2010 Jun 8;5(6):e11014. doi: 10.1371/journal.pone.0011014. PMID: 20543981
‧ Liu WM, Laux H, Henry JY, Bolton TB, Dalgleish AG, Galustian C. A microarray study of altered gene expression in colorectal cancer cells after treatment with immunomodulatory drugs: differences in action in vivo and in vitro. Mol Biol Rep. 2010 Apr;37(4):1801-14. doi: 10.1007/s11033-009-9614-3. Epub 2009 Jul 14. PMID: 19597962
‧ Maehata T, Taniguchi H, Yamamoto H, Nosho K, Adachi Y, Miyamoto N, Miyamoto C, Akutsu N, Yamaoka S, Itoh F., Transcriptional silencing of Dickkopf gene family by CpG island hypermethylation in human gastrointestinal cancer. World J Gastroenterol. 2008 May 7;14(17):2702-14. PMID: 1846165
‧ Mao B, Wu W, Davidson G, Marhold J, Li M, Mechler BM, Delius H, Hoppe D, Stannek P, Walter C, Glinka A, Niehrs C. Kremen proteins are Dickkopf receptors that regulate Wnt/beta-catenin signalling. Nature. 2002 Jun 6;417(6889):664-7. Epub 2002 May 26. PMID: 120506705
‧ MaoB, Niehrs C. Kremen2 modulates Dickkopf2 activity during Wnt/LRP6 signaling. Gene. 2003 Jan 2;302(1-2):179-83. PMID: 12527209
‧ Nagano H, Tomimaru Y, Eguchi H, Hama N, Wada H, Kawamoto K, Kobayashi S, Mori M, Doki Y., MicroRNA-29a induces resistance to gemcitabine through the Wnt/β-catenin signaling pathway in pancreatic cancer cells. Int J Oncol. 2013 Oct;43(4):1066-72. doi: 10.3892/ijo.2013.2078. Epub 2013 Jul 24. PMID: 23900458
【實例】
藉由參照以下實例將更容易地瞭解總體如上所述的本發明，該等實例係藉由說明方式提供並且並非旨在成為本發明的限制。該等實例不旨在表示以下實驗係所進行的全部或唯一實驗。除非另外指示，否則份數係重量份，分子量係重量平均分子量，溫度係攝氏度，並且壓力係在大氣壓或接近大氣壓下。
序列表概述
表3提供了本文包括的胺基酸和核酸序列的概述。
腫瘤細胞系概述
PDX腫瘤細胞類型用縮寫表示，後面係數位，數位表示特定的腫瘤細胞系。測試樣品的傳代次數係由p0-p#外加樣品名稱指示，其中p0指示直接地從患者腫瘤獲得的未傳代樣品，並且p#指示在測試之前已經藉由小鼠對腫瘤進行傳代的次數。如在此所使用，腫瘤類型和亞型的縮寫示於以下表4中：
實例1
KREMEN2表現的鑒定
使用全轉錄組定序
為了表徵存在於癌症患者中的實體瘤的細胞異質性並鑒定臨床相關的治療靶標，使用本領域認可的技術開發並維持大的PDX腫瘤庫。包含大量離散的腫瘤細胞系的PDX腫瘤庫在免疫功能低下小鼠中藉由腫瘤細胞的多次傳代而增生，其中所述腫 瘤細胞最初從罹患多種實體瘤惡性腫瘤的癌症患者獲得。低傳代PDX腫瘤係其天然環境中腫瘤的代表，提供了對驅動腫瘤生長和抵抗目前治療的潛在機制的臨床相關見解。
如本文所論述，腫瘤細胞可以廣泛地分為兩種類型的細胞亞群：非腫瘤發生細胞(NTG)和腫瘤起始細胞(TIC)。當被植入進免疫功能低下的小鼠中時，TIC具有形成腫瘤的能力。癌症幹細胞(CSC)係TIC的一個亞組，其能夠無限期地自我複製同時維持多向分化的能力。NTG雖然有時能夠在體內生長，但不會形成當植入時重現原始腫瘤的異質性的腫瘤。
為了進行全轉錄組分析，在達到800-2000mm3後或在骨髓中建立白血病(<5%的人源骨髓細胞結構)後針對AML，從小鼠切除PDX腫瘤。使用本領域認可的酶消化技術將切除的PDX腫瘤解離成單細胞懸浮液(參見，例如，U.S.P.N.2007/0292414)。將分離的大量腫瘤細胞與4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)一起孵育以檢測死細胞，與抗小鼠CD45和H-2Kd抗體一起孵育以鑒定小鼠細胞，並且與抗人EPCAM抗體一起孵育以鑒定人細胞。此外，將腫瘤細胞與螢光軛合的抗人CD46和/或CD324抗體一起孵育以鑒定CD324+ CSC或CD324- NTG細胞，並且然後使用FACS Aria細胞分選儀(BD生物科學公司)進行分選(參見U.S.P.N 2013/0260385、2013/0061340和2013/0061342)。也使用抗人CD49f和EPCAM抗體來鑒定正常人乳房內的如藉由Lim等人，2009(PMID：19648928)所述的四種不同的亞群，包括分化的管腔上皮細胞、祖細胞和乳房幹細胞/基底上皮細胞以及間質細胞。類似 地，使用抗人EPCAM分選正常的肺上皮細胞群。
藉由在補充有1% 2-巰基乙醇的RLT加RNA(RLTplus RNA)裂解緩衝液(凱傑公司(Qiagen))中裂解細胞來從腫瘤細胞中提取RNA，在-80℃下冷凍裂解物，並且然後使用RNeasy分離套組(凱傑公司)解凍裂解物用於RNA提取。使用Nanodrop分光光度計(賽默科技公司(Thermo Scientific))和/或生物分析儀2100(Bioanalyzer 2100，安捷倫科技公司(Agilent Technologies))來量化RNA。正常組織RNA購自各種來源(生命技術公司(Life Technology)、安捷倫公司(Agilent)、ScienCell公司、生物鏈公司(BioChain)以及選殖技術公司(Clontech))。藉由遺傳定序和基因表現分析來評估所得的總RNA製劑。更特別地，使用Illumina HiSeq 2000或2500下一代定序系統(伊魯米那公司(Illumina,Inc.))進行高質量RNA的全轉錄組定序。
使用從如上所述分離的大量或分選的亞群中提取的5ng總RNA產生的cDNA進行Illumina全轉錄組分析。該文庫係使用TruSeq RNA樣品製備套組v2(伊魯米那公司)創建的。所得的cDNA文庫被片段化和條碼化。使用映射到基因外顯子區域的度量標準FPKM(片段/千鹼基/百萬)，將來自Illumina平臺的定序數據名義上表示為片段表現值，使得基本的基因表現分析能夠被標準化並列舉為FPKM轉錄物。
如圖2中所示，相對於來自該等相同腫瘤的匹配的NTG群體(白色條)，在來自管腔上皮B型PDX腫瘤的CSC群(黑條)和來自非小細胞肺癌腫瘤的CSC群(灰條)中KREMEN2 mRNA 表現係上調的。在腫瘤樣品中的KREMEN2表現通常比在正常組織以及各種分選的正常乳房和正常肺上皮細胞群兩者中的KREMEN2表現更高。
KREMEN2 mRNA在BR腫瘤、非小細胞肺腫瘤和CSC群中的升高的表現的鑒定表明了KREMEN2具有作為診斷性和免疫治療性靶標的潛力。此外，KREMEN2在分選群體中的增加的表現表明了KREMEN2係腫瘤發生細胞的良好標記物。
實例2
使用qRT-PCR在腫瘤中表現KREMEN2 mRNA
為了證實腫瘤細胞中的KREMEN2 RNA表現，使用Fluidigm BioMarkTM HD系統根據工業標準方案對各種PDX細胞系進行qRT-PCR。如實例1所述，從大量PDX腫瘤細胞或分選的CSC和NTG亞群中提取RNA。提取後，根據製造商的說明，使用大容量cDNA庫套組(生命技術公司)將1.0ng的RNA轉化為cDNA。然後將使用KREMEN2探針特異性Taqman測定法預擴增的cDNA材料用於隨後的qRT-PCR實驗。
將KREMEN2在正常組織(NormTox或Norm)中的表現與在乳房(BR)腫瘤(未分類BR、BR-基底樣、BR-CLDN低、BR-HER2陽性、BR-LumA和BR-LumB)以及NSCLC(LU-Ad和LU-SCC)、子宮內膜(EM)癌、卵巢(OV-漿液性/乳頭狀漿液性和MMMT)癌和MEL的各種分子亞型中的表現進行比較(圖3；每個點表示各個單獨組織或PDX細胞系的平均相對表現，小水平線 表示幾何平均數)。“NormTox”代表如下各種正常組織的樣品：腎上腺、結腸、背根神經節、內皮細胞(動脈、靜脈)、食道、心臟、腎、肝、肺、胰腺、骨骼肌、皮膚(成纖維細胞、角質形成細胞)、小腸、脾、胃和氣管。另外一組稱為“Norm”的正常組織代表關於ADC型藥物具有推測的較低毒性風險的下列正常組織樣品：外周血單核細胞及各種分選的亞群(B細胞、單核細胞、NK細胞、嗜中性粒細胞、T細胞)、脂肪、膀胱、腦、乳房、子宮頸、胎肝、黑素細胞、正常骨髓及各種分選的亞群、卵巢、前列腺、睾丸、胸腺、甲狀腺和子宮。
圖3顯示平均KREMEN2表現在不同亞型的BR PDX亞組中升高，其中大多數LumB樣品顯示升高的表現。類似地，大多數OV腫瘤對KREMEN2表現為強烈陽性的。此外，EM、LU-Ad、LU-SCC和MEL PDX的亞組在KREMEN2表現中升高。在該測定中，大多數正常和norm tox組織表現低水平的KREMEN2，除了在食道、皮膚、胰腺和氣管中的強(>104)相對表現。具有顯著信號的正常組織係胸腺和正常骨髓，這反過來可能是由於在淋巴細胞中檢測到的RNA表現。該等數據支持較早發現的在LumB中KREMEN2表現升高，並且另外突出了與大多數正常組織相比在各種類型的PDX腫瘤的重要亞組中的超表現。
實例3
使用微陣列分析
對KREMEN2 mRNA在腫瘤中的表現進行確定
進行微陣列實驗以確定KREMEN2在各種腫瘤細胞系中的表現水平，並如下分析數據。基本上如實例1所述，從PDX系提取1-2μg的全腫瘤總RNA。此外，使用基本上相同的程序從正常組織的樣品(例如，乳房、結腸、心臟、腎、肝、肺、卵巢、胰腺、皮膚、脾、PBMC和胃)提取RNA。使用Agilent SurePrint GE人8x60 v2微陣列平臺分析RNA樣品，該平臺包含針對人基因組中的27,958個基因和7,419個lncRNA而設計的50,599個生物學探針。標準的行業慣例被用於標準化和轉換強度值以量化每個樣品的基因表現。每個樣品中KREMEN2表現的歸一化強度繪製在圖4中，並且針對每個腫瘤類型匯出的幾何平均值由橫條表示。
仔細回顧圖4顯示，相對於正常組織所觀察到的，KREMEN2表現在BR、EN、LU-Ad、LU-SCC、OV和MEL中平均上調，儘管在每種PDX類型中通常存在KREMEN2表現水平的廣泛擴散。特別值得注意的是，BR-LumB亞型以及OV中的KREMEN2升高。對應於之前的結果，具有最高表現的KREMEN2的正常組織係皮膚，其中大多數其他正常組織表現KREMEN2少至少30倍。上述腫瘤類型中對KREMEN2表現升高的這一觀察證實了先前實例的結果。
實例4
使用癌症基因組圖譜，在腫瘤中的KREMEN2表現
使用稱為癌症基因組圖譜(TCGA)的、原發性腫瘤和正常樣品的大型公開可用資料集來證實KREMEN2 mRNA在各種腫瘤中的超表現。來自IlluminaHiSeq_RNASeqV2平臺和 IlluminaHiSeq_RNASeq平臺的KREMEN2表現數據從TCGA數據門戶(https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaDownload.jsp)下載並進行解析以聚合來自每個基因的各個外顯子的讀數，以產生單個值讀數/千鹼基外顯子/百萬個映射讀數(RPKM)。
相對於在TCGA資料庫中發現的正常組織，圖5中的KREMEN2表現在原發性BL、BR、ES、HN、LY、LU、OV、OR、SK和UT腫瘤中是升高的。該等數據意味著優於正常組織的良好的治療指數，並且因此抗KREMEN2抗體和ADC可以是用於治療該等腫瘤的有用治療劑。
實例5
重組KREMEN2蛋白的選殖與表現
編碼人KREMEN2蛋白的DNA片段。
為了產生與人KREMEN2(hKREMEN2)蛋白(GenBank登錄NP_757384，SEQ ID NO：1)有關的本發明所需的融合蛋白，使用NCBI登錄NM_172229作為參比，從GeneArt(賽默飛世爾科技公司)訂購編碼成熟hKREMEN2蛋白ECD(殘基G26-A364)的合成DNA片段。對合成的基因片段進行密碼子優化，用於在哺乳動物細胞系中表現。該DNA片段用於表現融合或標記蛋白的構建體的所有後續工程，該融合或標記蛋白含有hKREMEN2 ECD或其片段。具體而言，產生以下構建體，其中使用標準分子技術將該DNA片段與編碼9x-組胺酸標籤蛋白(hKREMEN2-ECD-His)或人IgG2 Fc蛋白(hKREMEN2-ECD-Fc) 的DNA進行框內融合。為生產可用於產生針對hKREMEN2蛋白的ECD的免疫反應性抗體的免疫原，使用標準分子技術將上述嵌合融合基因亞選殖到在框內和免疫球蛋白κ(IgK)信號肽序列下游的CMV驅動的表現載體中。CMV驅動的表現載體允許在HEK293T和/或CHO-S細胞中的高水平暫態表現。使用聚乙烯亞胺聚合物作為轉染試劑，用hKREMEN2-ECD-His或hKREMEN2-ECD-Fc轉染HEK293T細胞的懸浮液或貼壁培養物或者CHO-S細胞的懸浮液。轉染後三至五天，使用鎳-EDTA(凱傑公司)或MabSelect SuReTM蛋白A(GE醫療生命科學公司(GE Healthcare Life Sciences))柱(適合於標籤)，從澄清的細胞上清液中純化重組蛋白。
全長hKREMEN2 DNA構建體
為了產生超表現全長hKREMEN2蛋白的細胞系，如下構建含有編碼成熟hKREMEN2蛋白的開放閱讀框的慢病毒載體。首先，使用標準分子選殖技術來引入編碼IgK信號肽的核苷酸序列，隨後在pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP(System Biosciences)的多選殖位點的上游引入聚-Asp Lys表位標籤，產生載體pLMEGPA。該雙啟動子構建體使用CMV啟動子來驅動表位標記的細胞表面蛋白的表現，獨立於驅動copGFP T2A Puro報導子和選擇性標記的表現的下游EF1啟動子。pLMEGPA中的T2A序列促進肽鍵縮合的核糖體跳過，導致兩種獨立蛋白的表現：在T2A肽的上游編碼的報導子copGFP的高水平表現，與在T2A肽的下游編碼的Puro選擇性標記蛋白的共表現，這允許在嘌呤黴素存在下進行選擇。
使用NCBI登錄NM_172229作為參比，從GeneArt(賽 默飛世爾科技公司)訂購編碼成熟hKREMEN2蛋白(殘基G26-L462)的合成DNA片段。將合成基因進行密碼子優化，用於在哺乳動物細胞系中表現，並且側翼有限制性內切核酸酶位點，以使得能夠在pLMEGPA中的IgK信號肽-表位標籤的下游進行框內亞選殖。這產生了pLMEGPA-hKREMEN2-NFlag慢病毒載體，其編碼具有附著於成熟hKREMEN2蛋白的N-末端的表位標籤的融合蛋白。
編碼大鼠和食蟹猴KREMEN2蛋白的DNA片段。
為了產生與大鼠KREMEN2蛋白(rKREMEN2)有關的本發明所需的全部分子物質和細胞物質，使用GenBank登錄NM_001105767作為參比來設計編碼成熟ECD(NP_001099237；胺基酸G25-R373)或成熟全長(NP_001099237；胺基酸G25-L468)rKREMEN2蛋白的合成性cDNA片段。為了產生與食蟹猴(cynomolgus monkey)(食蟹猴(Macaca fascicularis))KREMEN2蛋白(cKREMEN2)有關的本發明所需的全部分子物質和細胞物質，使用GenBank登錄XM_005591011作為參比來設計編碼成熟ECD(XP_005591068；胺基酸G26-A364)或成熟全長(XP_005591068；胺基酸G26-L462)cKREMEN2蛋白的合成的cDNA片段。將所有合成的DNA片段都進行密碼子優化，用於在哺乳動物細胞系中表現。
使用標準分子技術，藉由將編碼各自成熟ECD片段的DNA片段亞選殖到框內和IgK信號肽序列的下游以及9-組胺酸標籤或人IgG2 Fc cDNA的上游的CMV驅動的表現載體中來構建大 鼠或食蟹猴KREMEN2 ECD和9-組胺酸標籤或人IgG2 Fc標籤的嵌合融合基因。如先前針對以上類似hKREMEN2融合蛋白所描述的，該等CMV驅動的表現載體被用於轉染HEK-293T細胞的懸浮液或貼壁培養物或者CHO-S細胞的懸浮液以產生重組蛋白。
為了產生超表現全長rKREMEN2或cKREMEN2蛋白的細胞系，使用標準分子技術構建含有編碼各自成熟的rKREMEN2或cKREMEN2蛋白的開放閱讀框的慢病毒載體，以亞選殖在pLMEGPA中的IgK信號肽-表位標籤下游的成熟全長rKREMEN2或cKREMEN2開放閱讀框，分別產生pLMEGPA-rKREMEN2-NFlag或pLMEGPA-cKREMEN2-NFlag。
細胞系工程化
使用上述各自的pLMEGPA載體來構建超表現hKREMEN2、rKREMEN2或cKREMEN2蛋白的工程化細胞系，以使用熟習該項技術者熟知的標準慢病毒轉導技術轉導HEK-293T細胞系。使用對嘌呤黴素抗性的高表現的HEK-293T亞殖株(例如對嘌呤黴素有抗性且對GFP和表位標籤具有強陽性的細胞)進行的螢光啟動細胞分選術(FACS)來選擇在每個例子中的KREMEN2陽性細胞。
實例6
抗KREMEN2抗體的產生
藉由用等體積的TiterMax® Gold佐劑(西格瑪奧德里奇公司#H4 T2684-1ML)乳化的10μg hKREMEN2蛋白接種一隻 BALB/c小鼠、一隻CD-1小鼠和一隻FVB小鼠來產生抗KREMEN2小鼠抗體。在最初接種後，以每週一次的間隔，使用用等體積的Imject® Alum(賽默科技公司)加“CpG”(英傑公司(InvivoGen))乳化的10μg hKREMEN2蛋白注射小鼠9次。融合前的最後一次注射係用PBS中的10μg hKREMEN2進行的。
將小鼠處死，並且對引流淋巴結(腿彎部、腹股溝以及髂骨肌)進行解剖並且將其用作抗體產生細胞的來源。產生B細胞的單細胞懸浮液，並使用模型BTX Hybrimmune系統(BTX哈佛裝置公司(BTX Harvard Apparatus))，藉由電促細胞融合將(3 x 108個細胞)與非分泌型SP2/0-Ag14骨髓瘤細胞(ATCC # CRL-1581)以1：1的比例進行融合。將細胞重懸於由DMEM培養基組成的雜交瘤選擇培養基中，該DMEM培養基補充有重氮絲胺酸、15%胎殖株I血清(賽默公司# SH30080-03)、10% BM condimed(羅氏公司(Roche)# 10663573001)、1mM非必需胺基酸(科寧公司(Corning)#25-025-CI)、1mM HEPES(科寧公司#25-060-CI)、100IU青黴素-鏈黴素(科寧公司# 30-002-CI)、100IU L-穀胺醯胺(科寧公司# 25-005-CI)，並在含有100mL選擇培養基的三個T225燒瓶中進行培養。將該等燒瓶放入一個含有7% CO2和95%空氣的潮濕的37℃培養箱中，保持6天。
在融合後的第6天和第7天，從燒瓶中分選雜交瘤細胞，並以在90μL的補充的雜交瘤選擇培養基(如上所述)中每孔一個細胞(使用BD FACSAria細胞分選儀)鋪板到12個Falcon 384孔板中。將剩餘的未使用的雜交瘤文庫細胞在液氮中冷凍以用於 將來的文庫測試和篩選。
將分選的殖株雜交瘤培養8天，並收集上清液，重新排列在384孔板上，並使用如下的流式細胞測量術篩選對在轉導的HEK/293T細胞(ATCC CRL-11268)表面上表現的hKREMEN2具有特異性的抗體。將每孔中穩定轉導有hKREMEN2的293T細胞與25μL雜交瘤上清液一起孵育30分鐘，並且然後用PBS/2% FCS洗滌。將細胞與25μL/樣品Alexa Fluor® 647 AffiniPure F(ab')2片段山羊抗小鼠IgG(稀釋於PBS/2% FCS中的Fcγ片段特異性第二抗體)一起孵育15分鐘，洗滌兩次並用PBS/2% FCS重懸。然後使用BD FACSCanto II機器藉由流式細胞測量術分析細胞。
還使用ELISA測定來篩選雜交瘤上清液的與rKREMEN2結合的抗體。如下進行該ELISA。用在PBS緩衝液中的0.5μg/mL的純化的rKREMEN2-His包被平板並在4℃下孵育過夜。然後將平板用PBST洗滌並用含5% FBS的PBS在37℃下封閉30分鐘。去除封閉溶液並將15μl PBST添加到各孔中。添加25μl雜交瘤上清液並在室溫下孵育1小時。用PBST洗滌後，在室溫下，添加30μL/孔的以1：10,000稀釋於PBSA中的HRP標記的山羊抗小鼠IgG，持續30分鐘。將平板洗滌，並在室溫下藉由添加25μL/孔的TMB底物溶液(賽默科技公司)進行顯色約5分鐘。添加等體積的0.2M H2SO4以使底物顯色停止。然後藉由分光光度計在OD 450下分析樣品。具有大於背景3倍的OD 450的樣品被認為係交叉反應性的。
使用這兩種測定，鑒定了許多hKREMEN2免疫特異 性抗體。在一些情況下，鑒定的抗體與rKREMEN2進行交叉反應。
實例7
KREMEN2抗體的定序
如下所述對實例6中產生的抗KREMEN2小鼠抗體進行定序。根據製造商的說明使用RNeasy微型套組(凱傑公司)從所選的雜交瘤細胞中純化總RNA。每個樣品使用104與105個之間的細胞。將分離的RNA樣品儲存在零下80℃直至使用。
使用了包含八十六種被設計成靶向完整小鼠VH譜系的小鼠特異性前導序列引物的兩種5’引物混合物，以及對所有小鼠Ig同種型具有特異性的3'小鼠Cγ引物來對每個雜交瘤的Ig重鏈的可變區進行擴增。類似地，使用包含六十四種被設計成擴增每個Vκ小鼠家族的5' Vκ前導序列的兩種引物混合物與對小鼠κ恒定區具有特異性的單個反向引物的組合來對κ輕鏈進行擴增並定序。如下使用凱傑One Step RT-PCR套組從100ng總RNA擴增VH和VL轉錄物。對每個雜交瘤執行總計四次RT-PCR反應：兩次針對Vκ輕鏈並且兩次針對VH重鏈。PCR反應混合物包括1.5μL的RNA、0.4μL的100μM的重鏈或κ輕鏈引物(由整合DNA技術公司(Integrated DNA Technologies)定制合成)、5μL的5x RT-PCR緩衝液、1μL dNTP、以及0.6μL的含有逆轉錄酶和DNA聚合酶的酶混合物。熱循環儀程式係RT步驟50℃持續60分鐘、95℃持續15分鐘，然後35個循環的(94.5℃持續30秒、57℃持續30秒、72℃持續1分鐘)。然後在72℃下最後孵育10分鐘。
使用與上述用於擴增可變區相同的特異性可變區引物對提取的PCR產物進行定序。PCR產物被送到外部定序供應商(MCLAB)進行PCR純化和定序服務。使用IMGT序列分析工具(http：//www.imgt.org/IMGTmedical/sequence_analysis.html)分析核苷酸序列，以鑒定具有最高序列同源性的種系V、D和J基因成員。藉由使用專有抗體序列資料庫將VH和VL基因與小鼠種系資料庫進行比對，將該等衍生序列與Ig V-和J-區的已知種系DNA序列進行比較。
圖6A描述了來自抗KREMEN2抗體的新型鼠類輕鏈可變區的連續胺基酸序列，同時圖6B描述了來自相同抗KREMEN2抗體的新型鼠類重鏈可變區的連續胺基酸序列。總之，鼠類輕鏈和重鏈可變區胺基酸序列在SEQ ID NO：21-81奇數中提供。此外，圖6C提供了編碼圖6A和6B所示胺基酸序列的核酸序列(SEQ ID NO：20-80，偶數)。
更具體地，圖6A和6B提供了鼠類抗KREMEN2抗體的帶注釋的序列，包括：(1)SEQ ID NO：21的輕鏈可變區(VL)和SEQ ID NO：23的重鏈可變區(VH)；或(2)SEQ ID NO：25的VL和SEQ ID NO：27的VH；或(3)SEQ ID NO：29的VL和SEQ ID NO：31的VH；或(4)SEQ ID NO：33的VL和SEQ ID NO：35的VH；或(5)SEQ ID NO：37的VL和SEQ ID NO：39的VH；或(6)SEQ ID NO：41的VL和SEQ ID NO：43的VH；或(7)SEQ ID NO：45的VL和SEQ ID NO：47的VH；或(8)SEQ ID NO：49的VL和SEQ ID NO：51的VH；或(9)SEQ ID NO：53的VL和SEQ ID NO：55的VH；或 (10)SEQ ID NO：57的VL和SEQ ID NO：59的VH；或(11)SEQ ID NO：61的VL和SEQ ID NO：63的VH；或(12)SEQ ID NO：65的VL和SEQ ID NO：67的VH；或(13)SEQ ID NO：69的VL和SEQ ID NO：71的VH；或(14)SEQ ID NO：73的VL和SEQ ID NO：75的VH；或(15)SEQ ID NO：77的VL和SEQ ID NO：79的VH；或(16)SEQ ID NO：49的VL和SEQ ID NO：81的VH。
所揭露的抗體(或產生它們的殖株)及其各自名稱(例如SC78.1、SC78.4等)和可變區核酸或胺基酸SEQ ID NO(參見圖6A-6C)的概述緊接著示於在下麵的表5中。
圖6A和圖6B中的VL和VH胺基酸序列被注釋以鑒定根據Kabat等人定義的框架區(即FR1-FR4)和互補決定區(即，圖6A中的CDRL1-CDRL3或圖6B中的CDRH1-CDRH3)。使用專有版本的阿拜斯資料庫分析可變區序列以提供CDR和FR名稱。雖然CDR係根據Kabat等人定義的，但熟習該項技術者應理解，還可以根據Chothia、McCallum或任何其他公認的命名系統來定義相容的CDR和FR名稱(例如，參見圖6G-6J)。
如圖6A和6B以及表5中所見，每個特定鼠類抗體的重鏈和輕鏈可變區胺基酸序列的SEQ ID NO通常是連續的奇數。因此，單株抗KREMEN2抗體SC78.1分別包含輕鏈和重鏈可變區的胺基酸SEQ ID NO：21和23；SC78.4包含SEQ ID NO：25和27；SC78.3包含SEQ ID NO：29和31，以此類推。圖6A和6B所示的順序編號方案的例外係在表5的末尾，並且包括與SC78.25共用輕鏈可變區(VL)的SC78.39。因此，SC78.39包含含有SEQ ID NO：49的輕鏈可變區(VL)和含有SEQ ID NO：81的重鏈可變區(VH)。在任何情況下，編碼鼠類抗體胺基酸序列(圖6C所示)的相應核酸序列具有緊接在相應胺基酸SEQ ID NO之前的SEQ ID NO：。因此，例如，SC78.1抗體的VL和VH的核酸序列的SEQ ID NO：分別係SEQ ID NO：20和22。
除了圖6A-6C中的注釋序列之外，圖6G-6J提供了 SC78.9、SC78.43、SC78.56和SC78.59的輕鏈和重鏈可變區的CDR名稱，如使用Kabat、Chothia、ABM和Contact方法所確定的。在圖6G-6J中描述的CDR名稱係使用如上所論述的阿拜斯資料庫的專有版本匯出的。如後續實例所示，熟習該項技術者應理解，所揭露的鼠類CDR可以接枝到人類構架序列中以提供根據本發明的CDR接枝或人源化的抗KREMEN2抗體。此外，鑒於本揭露，可以容易地確定根據本文的傳授內容製備和定序的任何抗KREMEN2抗體的CDR，並使用推斷的CDR序列提供本發明的CDR接枝或人源化的抗KREMEN2抗體。對於如圖6A-6B所示的具有重鏈和輕鏈可變區序列的抗體而言尤其如此。
實例8
嵌合和人源化抗KREMEN2抗體的產生
如下使用本領域認可的技術來產生嵌合抗KREMEN2抗體。從雜交瘤中提取總RNA並進行PCR擴增。從受試者核酸序列的分析獲得關於以下鼠類抗體：SC78.9、SC78.43、SC78.56和SC78.59的VH和VL鏈的V、D和J基因區段的數據(針對核酸序列參見圖6C)。使用以下限制性位點：對於VH片段的AgeI和XhoI、對於VL片段的XmaI和DraIII來設計對抗體的VH和VL鏈的框架序列特異的引物組。用Qiaquick PCR純化套組(凱傑公司)純化PCR產物，隨後用限制性內切酶AgeI和XhoI消化VH片段，並用XmaI和DraIII消化VL片段。將VH和VL消化的PCR產物進行純化並分別連接到IgH或Igκ表現載體中。連接反應係用200U T4-DNA連接酶(新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs))、7.5μL消化 並且純化的基因特異性PCR產物及25ng線性化載體DNA進行，總體積10μL。經由在42℃下熱休克，用3μL連接產物對感受態大腸桿菌DH10B細菌(生命技術公司)進行轉化，並且將其以100μg/mL的濃度鋪板到胺比西林板上。在對擴增的連接產物進行純化和消化之後，將VH片段選殖到包含HuIgG1的pEE6.4表現載體(龍沙公司(Lonza))的AgeI-XhoI限制性位點中，並將VL片段選殖到包含Hu-κ輕恒定區的pEE12.4表現載體(龍沙公司)的XmaI-DraIII限制性位點中。
藉由將CHO-S細胞與pEE6.4HuIgG1和pEE12.4Hu-κ表現載體以及PEI作為轉染試劑進行共轉染，來表現包含完整鼠類重鏈和輕鏈可變區以及人恒定區的嵌合抗體(SC78.9、SC78.43、SC78.56和SC78.59)。轉染後三至六天收穫上清液。藉由在800×g下離心10分鐘從細胞碎片清除含有重組嵌合抗體的培養上清液並保存在4℃。將重組嵌合抗體用蛋白A珠粒進行純化。
也使用專有的電腦輔助CDR接枝方法(阿拜斯資料庫，UCL商業公司(UCL Business))和標準分子工程技術，如下對鼠類抗KREMEN2抗體進行CDR接枝或人源化。基於人類種系抗體序列的框架序列和CDR經典結構與相關小鼠抗體的框架序列和CDR之間的最高同源性，設計可變區的人類框架區。出於分析的目的，將胺基酸分配到每個CDR結構域係根據Kabat等人的編號進行。就這一點而言，圖6G至6J顯示了使用鼠類抗體SC78.9、SC78.43、SC78.56和SC78.59的各種分析方案推斷的重CDR和輕CDR。一旦設計了包含鼠類Kabat CDR和所選人框架的可變區，就 從合成基因區段(整合DNA技術公司)產生它們。然後使用基本上如上文針對嵌合抗體所述的方法來選殖和表現人源化抗體。
人源化抗體hSC78.9(SEQ ID NO：101和103)、hSC78.43(SEQ ID NO：105和107)、hSC78.43 VKO8(SEQ ID NO：109和107)、hSC78.56(SEQ ID NO：113和115)以及hSC78.59(SEQ ID NO：117和119)的VL和VH胺基酸序列在圖6D中示出，並衍生自相應鼠類抗體的VL和VH序列(例如，hSC78.9衍生自SC78.9)。注意，hSC78.43 VKO8包含與人源化hSC78.43抗體(SEQ ID NO：105)不同的輕鏈框架(SEQ ID NO：109)，儘管它們具有共同的重鏈。VL和VH的相應核酸序列(SEQ ID NO：100-118，偶數)示於圖6E中，其中SEQ ID NO：110包含表現hSC78.43重鏈(SEQ ID NO：107)的密碼子優化的NA序列。下表6顯示了用於製造人源化構建體的組分，並且在一些情況下，引入了所選框架變化以維持所選抗體的有利特性。
如以下在實例9中所論述的，使用圖6D中所示的人源化VL和VH序列來製造許多位點特異性構建體。此外，將N297A突 變(EU編號)引入所選人源化抗體中以減少抗體與Fc受體的結合，這被認為係脫靶毒性的來源。可以將該修飾引入ss1或野生型人IgG1構建體中。在這種情況下，將N297A修飾引入由MJ尾碼表示的hSC78.9ss1和hSC78.43ss1抗體(即，hSC78.9ss1MJ和hSC78.43ss1MJ)中。使用Quikchange誘變套組在用於重鏈表現的質粒上引入突變，並使用與上述相同的方法表現和純化抗體。
表6中示出的示例性人源化抗體表明許多臨床上相容的抗體可以如本文所揭露的產生和衍生。在本發明的某些方面，可以將這樣的抗體摻入KREMEN2 ADC中以提供包含有利的治療指數的組成物。
除了上述VH和VL胺基酸和核酸序列之外，圖6F提供了表6中示出的示例性人源化抗體構建體的全長重鏈和輕鏈胺基酸序列。應理解的是，圖6F被注釋以指定產生可以如本文所論述的軛合的游離半胱胺酸的位點特異性突變的位置(連同側翼AA一起加底線)和可以被突變以減少Fc受體結合的N297A位置(連同側翼AA一起加底線和粗體)。
與每種人源化構建體(和圖6)相關的核酸和胺基酸序列的概述緊接著呈現於下表7中。注意，許多構建體以不同的排列使用相同的VL、VH或全長序列。
實例9
位點-特異性抗KREMEN2抗體的產生
構建了包含天然輕鏈(LC)恒定區和突變重鏈(HC)恒定區的工程化人IgG1/κ抗KREMEN2位點特異性抗體，其中與LC中的半胱胺酸214(C214)形成鏈間二硫鍵的、HC的靠上鉸鏈區中的半胱胺酸220(C220)被絲胺酸(C220S)替換。當組裝時，HC和LC形成包含適合與治療劑軛合的兩個游離半胱胺酸的抗體。除非另有說明，恒定區殘基的所有編號均根據Kabat等人所述的EU編號方案。
將VH核酸選殖到包含HC的恒定區中的C220S突變的表現載體上。將編碼hSC78.9、hSC78.43、hSC78.56或hSC78.59的突變體C220S HC的載體與編碼hSC78.9、hSC78.43、hSC78.43 VKO8、hSC78.56或hSC78.59的天然IgG1 κ Lc的載體共轉染於CHO-S細胞中，並使用哺乳動物暫態表現系統表現。含有C220S突變體的工程化抗KREMEN2位點特異性抗體分別被稱為hSC78.9ss1、hSC78.43ss1、hSC78.43ss1 VKO8、hSC78.56ss1或hSC78.59ss1。此外，還將N297A突變引入C220S突變的兩條重鏈中以提供hSC78.9ss1MJ和hSC78.43ss1MJ。
hSC78.9ss1、hSC78.9ss1MJ、hSC78.43ss1、hSC78.43ss1MJ、hSC78.56ss1、hSC78.56ss1MJ或hSC78.59ss1位點特異性抗體的全長重鏈(HC)的胺基酸序列(分別為SEQ ID NO：133、135、139、141、147、149和153)示於圖6F中。hSC78.9ss1和hSC78.9ss1MJ的輕鏈(LC)的胺基酸序列(SEQ ID NO：130)與hSC78.43ss1和hSC78.43ss1MJ的每個LC(SEQ ID NO：136)以及hSC78.56ss1和hSC78.56ss1MJ的每個LC(SEQ ID NO：144)的胺基酸序列相同，而hSC78.43ss1 VKO8或hSC78.59ss1的LC分別包含SEQ ID NO：142和150。因此，如以上表7所示，所述位點特異性抗體分別包含如以下所示的輕鏈和重鏈：SEQ ID NO：130和SEQ ID NO：133(hSC78.9ss1)、SEQ ID NO：130和SEQ ID NO：135(hSC78.9ss1MJ)、SEQ ID NO：136和SEQ ID NO：139(hSC78.43ss1)、SEQ ID NO：136和SEQ ID NO：141(hSC78.43ss1MJ)、SEQ ID NO：142和SEQ ID NO：139(hSC78.43ss1 VKO8)、SEQ ID NO：144和SEQ ID NO：147(hSC78.56ss1)、SEQ ID NO：144和SEQ ID NO：149(hSC78.56ss1MJ)、以及SEQ ID NO：150和SEQ ID NO：153(hSC78.59ss1)。
藉由SDS-PAGE表徵工程化的抗KREMEN2位點特異性抗體，以證實已經產生了正確的突變體。在存在和不存在還原劑如DTT(二硫蘇糖醇)的情況下，在來自生命技術公司的預製10%Tris-甘胺酸微型凝膠上進行SDS-PAGE。電泳後，用膠體考馬斯溶液對凝膠進行染色(數據未顯示)。在還原條件下，觀察到對應於游離LC和游離HC的兩個條帶。這種圖係還原條件下IgG分子的典型圖。在非還原條件下，條帶圖不同於天然IgG分子的條帶圖，指示在HC與LC之間不存在二硫鍵。觀察到對應於HC-HC二聚體的約98kD的條帶。此外，觀察到對應於游離LC的模糊條帶和對應於LC-LC二聚體的約48kD的主要條帶。由於每個LC的C-末端上的游離半胱胺酸，預期形成一定量的LC-LC物質。
實例10
抗KREMEN26抗體藥物軛合物的製備
經由具有游離巰基的末端馬來醯亞胺部分，將如表7中所示的那些天然的和位點特異性抗KREMEN2抗體與吡咯并苯并二氮呯(分別為PBD1和PBD3)進行軛合以產生抗體藥物軛合物(即ADC3和ADC6)。
如下製備天然的抗KREMEN2 ADC。在室溫下，在具有5mM EDTA的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中，藉由添加預定莫耳的莫耳三(2-羧乙基)-膦(TCEP)/莫耳抗體，對抗KREMEN2抗體的半胱胺酸鍵進行部分還原90分鐘。然後，在室溫下，經由馬來醯亞胺接頭，將所得的部分還原的製劑與PBD3(PBD3的結構在以上本說明書中提供)軛合最少30分鐘。然後藉由添加與接頭-藥 物相比過量的N-乙醯基半胱胺酸(NAC)，使用在水中製備的10mM儲備溶液來淬滅反應。20分鐘的最少淬滅時間之後，藉由添加0.5M乙酸將pH調節至6.0。藉由使用30kDa膜的滲濾而將ADC的製劑進行緩衝液交換到滲濾緩衝液中。然後用蔗糖和聚山梨醇酯-20配製滲濾的抗KREMEN2 ADC至目標終濃度。藉由反相HPLC(RP-HPLC)來分析所得的抗KREMEN2 ADC的蛋白濃度(藉由測量UV)、聚集(SEC)、藥物與抗體比(DAR)以及活性(體外細胞毒性)。
使用改進的部分還原過程來軛合位點特異性人源化抗KREMEN2 ADC。所需產物係在每個LC恒定區上最大軛合在未配對半胱胺酸(C214)上的ADC，並且使具有大於2(DAR>2)的藥物與抗體比(DAR)的ADC最小化，同時使具有DAR為2(DAR=2)的ADC最大化。為了進一步提高軛合的特異性，使用包含穩定劑(例如L-精胺酸)和溫和還原劑(例如谷胱甘肽)的方法在與接頭-藥物軛合之前選擇性還原抗體，然後係滲濾和配製步驟。
在含有預先確定濃度的還原型谷胱甘肽(GSH)的1M L-精胺酸/5mM EDTA的緩衝液(pH 8.0)中，將每種抗體的製劑在室溫下進行部分還原最少兩小時。然後使用30kDa膜(Millipore Amicon Ultra)將所有制劑進行緩衝液交換到20mM Tris/3.2mM EDTA緩衝液(pH 7.0)中以去除還原性緩衝液。然後，在室溫下，經由馬來醯亞胺接頭，將所得的部分還原的製劑與DL3和DL6(藥物接頭的結構在以上本說明書中提供)軛合最少30分鐘。然後藉由添加與接頭-藥物相比過量的NAC，使用在水中製備 的10mM儲備溶液來淬滅反應。20分鐘的最少淬滅時間之後，藉由添加0.5M乙酸將pH調節至6.0。藉由使用30kDa膜的滲濾而將ADC的製劑進行緩衝液交換到滲濾緩衝液中。然後用緩衝液配製滲濾的抗KREMEN2 ADC至目標終濃度。藉由反相HPLC(RP-HPLC)來分析所得的抗KREMEN2 ADC的蛋白濃度(藉由測量UV)、聚集(SEC)、藥物與抗體比(DAR)以及活性(體外細胞毒性)。
實例11
KREMEN2抗體的表徵
根據同種型、對hKREMEN2的親和力、與食蟹猴和大鼠KREMEN2(cKREMEN2和rKREMEN2)的交叉反應性以及結合動力學，使用各種方法來表徵實例6中產生的抗KREMEN2小鼠抗體。圖7提供了總結許多示例性鼠類抗體(上表)和所選人源化構建體(下表)的上述特徵的表。在圖7中，空白單元或“N/D”表示在該情況下未生成數據。
藉由RNA定序來確定代表性數目的抗體的同種型(參見實例7)。
從用ForteBio RED產生的動力學曲線如下來定性地確定所選人源化抗體對人(hKREMEN2-His)、食蟹猴(cKREMEN2-His)和大鼠(rKREMEN2-His)的親和力：將抗KREMEN2抗體固定在抗小鼠Fc捕獲生物感測器上，接觸時間為3分鐘，以及流速為1000rpm。從基線載入的捕獲抗體恒定在0.3-1 個單位。在抗體捕獲和50秒基線之後，將生物感測器浸入hKREMEN2-His、cKREMEN2-His或rKREMEN2-His的300nM溶液中持續4分鐘締合階段，然後係以1000rpm的振盪速度的4分鐘解離階段。在每個循環之後，藉由浸入10mM甘胺酸(pH 1.7)中來再生生物感測器。藉由從特異性抗體應答中減去對照小鼠IgG表面應答來處理數據，並將數據截短到締合和解離階段。使用締合和解離曲線來定性地估計所選抗體的親和力(數據未顯示)。鑒定了以高親和性與rKREMEN2蛋白交叉反應的抗體(圖7中的下表)。
使用Biacore T200儀器(GE醫療基團)，使用表面電漿共振來量化所選抗體對人、大鼠和食蟹猴(hKREMEN2、cKREMEN2和rKREMEN2)蛋白的親和力。使用抗小鼠抗體捕獲套組來固定抗小鼠抗體以在CM5生物感測器晶片上捕獲小鼠抗KREMEN2抗體。在每個抗原注射週期之前，將鼠類抗體以5μg/mL的濃度捕獲在表面上，接觸時間為30秒以及流速為20μL/min。從基線載入的捕獲抗體在80-120個響應單位之間。在抗體捕獲和10秒基線之後，將實例4中產生的hKREMEN2-His抗原以不同濃度流過表面持續60秒締合階段，然後係以50μL/min的流速的4分鐘解離階段。除了使用抗人抗體捕獲套組之外，使用類似的方案來測量人源化抗體的結合親和力。藉由從特異性抗體表面減去對照非結合抗體表面應答來處理數據。使用所得的響應曲線擬合1：1的朗繆爾(Langmuir)結合模型，並使用計算的ka和kd動力學常數Biacore T200評估軟體(GE醫療集團)產生平衡解離常數。抗體對納莫耳範圍內的hKREMEN2、cKREMEN2和rKREMEN2表現出親和力(數據未顯示)。
使用多工競爭免疫測定(路明克斯公司(Luminex Corp.))，將抗體分組成倉。將100μl濃度為10μg/mL的每個抗KREMEN2抗體(捕獲mAb)與已經軛合抗小鼠κ抗體的磁珠(路明克斯公司)一起孵育1小時(Miller等人，2011,PMID：21223970)。將捕獲mAb/軛合的珠複合物用PBSTA緩衝液(含0.05%吐溫20的PBS中的1% BSA)洗滌，並然後合併。去除殘留的洗滌緩衝液後，將珠與2μg/mL hKREMEN2-His蛋白一起孵育1小時，洗滌，並然後重懸於PBSTA中。將合併的珠混合物分配到96孔板中，每個孔含有抗KREMEN2抗體(檢測者mAb)，並在振盪下孵育1小時。在洗滌步驟之後，將軛合於PE的5μg/ml的濃度的抗小鼠κ抗體(與上面使用的相同)添加到各孔中並一起孵育1小時。將珠再次洗滌並重懸於PBSTA中。用Luminex MAGPIX儀器測量平均螢光強度(MFI)值。將抗體配對視覺化為從抗體對的皮爾森相關係數計算的距離矩陣的樹狀圖。根據樹狀圖和對抗體對的MFI值的分析來確定分倉。圖7顯示篩選的抗KREMEN2抗體可以分組成hKREMEN2蛋白上的至少五個獨特倉A、B、C、D、E。
實例12
抗KREMEN2抗體
對DKK1-KREMEN2相互作用的效果
WNT途徑係調節細胞生長和分化的關鍵發育途徑和幹細胞相關傳訊途徑。在典型的WNT/β-連環蛋白傳訊途徑中，WNT配位基結合捲曲蛋白(FZD)受體和LRP5/6共受體的複合物，這初始化傳訊級聯，導致蛋白GSK3的抑制，其中一個結果係在細 胞質中發現的通常不穩定的β-連環蛋白的穩定化。然後穩定的β-連環蛋白能夠積累，進入細胞核，並與TCF/LEF轉錄因子形成複合物以啟動含有該等轉錄啟動物的結合位點的基因。經典的WNT途徑在受體-配位基水平上受廣泛調控，具有由各種可溶性誘餌受體(例如，SFRP和FRZB)、結合WNT本身或調節其生物活性的因子(例如，WIF和NOTUM)、或調節FZD受體更新的因子(例如，KREMEN2、ZNRF3)構成的多個啟動和抑制性反饋回路，以及由調節調節劑的蛋白(例如，LGR和RSPO)構成的更精細的回路。該等激動劑、拮抗劑和抗拮抗劑網路一起使得能夠精確地控制強力和多效傳訊途徑的強度和持續時間。與本發明特別相關的是顯示出下調Wnt傳訊的DKK-1/LRP6/KREMEN2相互作用。
使用MSD發現平臺(細觀發現公司(Meso Scale Discovery)，MSD)開發電化學發光ELISA測定以測試實例7中產生的抗KREMEN2抗體阻斷KREMEN2與DKK-1的結合的能力。將MSD標準板用在PBS中的0.5μg/mL的人KREMEN2(R&D系統公司(R & D Systems)；# 1956-KR-025)進行包被，並在4℃孵育過夜。用具有0.05%吐溫20的PBS(PBST)洗滌平板後，將平板用在PBS中的3%(w/v)BSA在室溫下封閉1小時。用PBST洗滌平板後，添加10μg/ml的SC78抗體、msIgG同種型對照、無抗體或抗KREMEN2多株抗體(R & D系統公司；# AF1946)，並將平板在室溫下孵育1小時。再次將平板用PBST洗滌，然後在室溫下添加滴定的DKK-1蛋白(R & D系統公司；# 5439-DK-010)持續1小時。將平板用PBST洗滌，並且添加0.5μg/mL的抗DKK-1多株抗體(R & D系統公司；# AF1096)持續45分鐘，該抗體根據製造商的方案使用MSD® SULF0-TAG NHS酯進行硫基標記。在PBST中洗滌板。在水中將含表面活性劑的MSD讀取緩衝液T(MSD Read Buffer T)稀釋到1X並且向每孔中添加150μL。在MSD扇形成像儀2400(MSD Sector Imager 2400)上對板進行讀數。
示例性KREMEN2特異性抗體的結果可以在圖8中看到。將樣品在不同的平板上運行，並因此分開繪圖，並與合適的平板/圖上的適當的無抗體對照進行比較。與無抗體相比，結合抗KREMEN2抗體或同種型對照抗體的減少表明對KREMEN2/DKK-1相互作用的干擾或阻斷。多株抗KREMEN2抗體充當干擾相互作用的陽性對照。兩種抗體(SC78.9和SC78.43)具有適度的阻斷活性，而SC78.56和SC78.59不影響KREMEN2/DKK-1結合。
實例13
KREMEN2蛋白在腫瘤中的表現
考慮到以上實例中描述的與各種腫瘤相關的升高的KREMEN2 mRNA轉錄物水平，進行了測試在PDEM腫瘤中KREMEN2蛋白表現是否也升高的工作。為了檢測和量化KREMEN2蛋白表現，使用MSD發現平臺(細觀發現公司)開發了電化學發光KREMEN2夾心ELISA測定法。
從小鼠中切除PDX腫瘤並在乾冰/乙醇上進行急速冷凍。將蛋白質提取緩衝液(生物鏈協會公司(Biochain Institute))添加到解凍的腫瘤片中並使用Tissue Lyser系統(凱傑公司)將腫 瘤粉碎。藉由離心(20,000g，20分鐘，4℃)使裂解液變澄清，並且使用二喹啉甲酸對每種裂解液中的總蛋白濃度進行定量。將蛋白質裂解物歸一化至5mg/mL並儲存於-80℃直至測定。正常組織從商業來源購買並如上所述進行處理。
藉由內插來自標準蛋白濃度曲線的值確定來自裂解物樣品的KREMEN2蛋白濃度，該標準蛋白濃度曲線係使用具有組胺酸標籤的純化的重組KREMEN2蛋白產生的。如下進行KREMEN2蛋白標準曲線和蛋白定量測定：
在4℃下，將MSD 384孔標準板用在PBS中的15μL的2μg/mL抗KREMEN2捕獲抗體包被過夜。在PBST中洗滌板並且在振盪下在35μl MSD 3%阻斷劑A溶液中阻斷一小時。再在PBST中洗滌板。向該等孔中添加10μL的在含有10%蛋白提取緩衝液的MSD 1%阻斷劑A中的的5x稀釋的裂解液或連續稀釋的重組KREMEN2標準品並在振盪下孵育兩小時。再在PBST中洗滌板。然後根據製造商的方案使用MSD® SULF0-TAG NHS酯對抗KREMEN2檢測抗體進行硫基標記。在室溫下，在振盪下，將在MSD 1%阻斷劑A中的0.5μg/mL的10μL標記的抗KREMEN2檢測抗體添加到洗滌的板中持續1小時。在PBST中洗滌板。在水中將含表面活性劑的MSD讀取緩衝液T稀釋到1X並且向每孔中添加35μL。在MSD扇形成像儀2400上使用綜合軟體分析程式讀取板，以經由內插法從標準曲線推斷裂解物樣品中的KREMEN2濃度。然後，將值除以總蛋白濃度，得到每毫克總裂解物蛋白質中的KREMEN2的納克數。
結果示於圖9中，其中每個點表示來源於單個PDX腫瘤細胞系的KREMEN2蛋白濃度。儘管每個點來源於單個PDX系，但在大多數情形中，對來自同一PDX系的多個生物樣品進行測試並對多個值求平均值以提供數據點。
圖9顯示與正常組織相比，示例性PDX腫瘤細胞系表現出高KREMEN2蛋白表現。測試的正常組織包括腎上腺、動脈、結腸、食道、膽囊、心臟、腎、肝、肺、外周和坐骨神經、胰腺、骨骼肌、皮膚、小腸、脾、胃、氣管、紅細胞和白細胞以及血小板、膀胱、腦、乳房、眼睛、淋巴結、卵巢、腦下垂體、前列腺以及脊髓。在許多測試的PDX細胞系(例如BR202、LU120、LU139、LU85、OV89、OV119MET、OV27MET和OV72MET)中，KREMEN2蛋白表現與KREMEN2 mRNA表現之間具有良好的相關性(如藉由微陣列或qPCR所確定的)。該等數據結合以上所示的KREMEN2表現的mRNA轉錄數據加強了KREMEN2決定因子為治療性干預提供有吸引力的靶標的主題。
實例14
使用免疫組織化學對腫瘤上的KREMEN2進行檢測
對PDX腫瘤和患者活檢進行免疫組織化學(IHC)，以評估KREMEN2在腫瘤細胞中的表現和位置。
為了確定KREMEN2的患病率，使用抗KREMEN2抗體SC78.29對PDX腫瘤細胞系沈澱進行IHC。更具體地，如下所述，對如本領域中標準的福馬林固定和石蠟包埋(FFPE)的PDX腫瘤 細胞沈澱進行IHC。
將平面切片的細胞沈澱塊進行切割並在玻璃顯微鏡載玻片上封固。在二甲苯去石蠟化之後，將5μm切片用抗原修復溶液(Dako)在99℃下預處理20分鐘，冷卻至75℃，並且然後用PBS中的3%過氧化氫處理，然後用抗生物素蛋白/生物素阻斷溶液(載體實驗室公司(Vector Laboratories))處理。然後將FFPE載玻片用在PBS緩衝液中的3% BSA中的10%馬血清進行封閉，並在室溫下與在3% BSA/PBS中稀釋至10μg/ml的本發明的初級抗KREMEN2抗體一起孵育30分鐘。在室溫下，將FFPE載玻片與在3% BSA/PBS中稀釋至2.5μg/ml的生物素軛合的馬抗小鼠抗體(載體實驗室公司)一起孵育30分鐘，然後在鏈黴親和素-HRP(ABC Elite套組，載體實驗室公司)中進行孵育。在室溫下，將顯色檢測用3,3'-二胺基聯苯胺(賽默科技公司)進行顯色5分鐘，並將組織用Meyer's蘇木精(IHC世界公司(IHC World))複染，用乙醇脫水並浸入二甲苯中。藉由光學顯微鏡分析染色的載玻片。H評分被用來量化染色。H評分係利用以下公式評估染色程度的方法：在3+強度下染色的腫瘤細胞的3X百分比+在2+強度下染色的腫瘤細胞的2X百分比+在1+強度下染色的腫瘤細胞的1X百分比，範圍從0到300。
如藉由圖10中所列出的表格數據所示，抗KREMEN2抗體能夠確定hKREMEN2是否在各種肺、卵巢和乳房PDX模型中表現並提供如上所陳述的H評分。數據回顧顯示，KREMEN2蛋白表現在9/29(31%)的肺PDX腫瘤樣品、5/11(45%)的卵巢PDX 腫瘤樣品和10/15(67%)的乳房PDX腫瘤樣本中表現出。
使用基本上相同的程序，也對卵巢癌、肺癌和乳癌活檢樣品進行免疫組織化學。就這一點而言，圖11A顯示KREMEN2以12/92(13%)在卵巢漿液性乳頭狀癌和以12/54(22%)在子宮內膜樣腺癌中表現。圖11B顯示KREMEN2以8/82(10%)在乳房浸潤性導管癌和以2/26(8%)在被診斷為管腔上皮B型的浸潤性導管癌中表現。並且最後，圖11C顯示KREMEN2以3/58(5%)在肺腺癌、以29/187(16%)在肺鱗狀細胞癌和以2/12(17%)在小細胞肺癌中表現。
總之，該等數據強烈表明，KREMEN2蛋白以相當大百分比在各種腫瘤中表現並增強了使用該決定因子作為診斷性和治療性靶標的可行性。
實例15
KREMEN2蛋白在腫瘤發生細胞上表現
如下評估本發明的抗體結合在PDX腫瘤細胞上表現的KREMEN2的能力。
收集PDX腫瘤並使用本領域認可的酶組織消化技術解離以獲得PDX腫瘤細胞的單細胞懸液(參見，例如，U.S.P.N.2007/0292414)。將PDX腫瘤單細胞懸浮液與抗小鼠CD45和H-2Kd抗體一起孵育以鑒定小鼠細胞，並且與抗人EPCAM抗體一起孵育以鑒定人細胞。此外，將腫瘤細胞與抗人CD46 AlexaFluor-647和CD324 PerCP Cy5.5一起孵育以鑒定腫瘤發生細胞(例如，CSC、 TIC)(參見U.S.P.N.2013/0260385、2013/0061340和2013/0061342)。最後，將PDX腫瘤細胞與抗KREMEN2生物素醯化的殖株SC78.40一起孵育，以確定KREMEN2在PDX亞群上的細胞表面表現。將分離的細胞與第一抗體或與同種型匹配的對照抗體一起孵育30分鐘，並在PBS/2% FCS中洗滌兩次。將細胞與在PBS/2% FCS中以1：200稀釋的、每份樣品50μL藻紅蛋白標記的鏈黴親和素第二抗體一起孵育15分鐘，用1mL PBS/2% FCS洗滌兩次並重懸於具有4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的PBS/2% FCS中來區別活細胞和死細胞。然後根據製造商的說明使用BD FACS Canto Ii流式細胞儀，藉由流式細胞測量術來分析與PDX腫瘤細胞結合的抗體。
圖12A-12C顯示NSCLC(圖12A)、OV(圖12B)和BR(圖12C)PDX在活的人腫瘤細胞(LU85、LU306、LU409、LU296、LU450、BR163、BR164、BR165)和CSC亞群(黑色實線；LU37、LU300、LU120、LU253、LU128、OV27、OV72MET、OV63MET、OV89)上表現可檢測水平的KREMEN2蛋白，而NTG細胞(不表現CD324或CD46)(虛線)表明抗KREMEN2抗體顯著減少的染色。使用螢光扣除(FMO)和同種型對照抗體來確認染色特異性(灰色填充)。總結在CSC和NTG細胞表面上觀察到的抗KREMEN2抗體的差異染色的表顯示在圖12A-12C中，列舉表示為指示的抗KREMEN2抗體和各個腫瘤細胞亞群的同種型對照之間的幾何平均螢光強度(△MFI)的變化。該等數據進一步證實了KREMEN2在腫瘤發生細胞上的表現升高以及本發明的抗體選擇性結合該等細胞的能力。
在大多數NSCLC和OV-S PDX中的功能性CSC亞群係<1：100細胞，而包括CSC亞群的細胞群的表型細胞表面標記物在NSCLC和OV-S PDX腫瘤的1%-94%範圍內。由於觀察到KREMEN2在僅為大包塊腫瘤的一部分的CSC亞群中升高，所以與正常組織相比，與整個PDX腫瘤表現相比，CSC群與正常組織表現之間存在更大的表現差異。這導致在腫瘤中的CSC與正常組織表現之間的更大的KREMEN2表現差異，指向抗KREMEN2調節劑在治療CSC亞群中具有KREMEN2表現的腫瘤中的有益用途。
實例16
抗KREMEN2抗體促進細胞毒性劑的遞送
為了確定本發明的抗KREMEN2抗體是否能夠內化以介導細胞毒性劑向細胞的遞送，使用所選抗KREMEN2抗體和與第二抗小鼠抗體FAB片段連接的皂草素進行體外細胞殺傷測定。皂草素係使核糖體失活的植物毒素，由此抑制蛋白質合成並導致細胞死亡。皂草素僅在細胞內具有細胞毒性，它可以進入核糖體，但不能自行內化。因此，在該等測定中皂草素介導的細胞毒性指示抗小鼠FAB-皂草素構建體在相關鼠類或人源化抗KREMEN2抗體結合和內化時內化到靶細胞中的能力。
將超表現hKREMEN2的HEK293T細胞的單細胞懸浮液以每孔500個細胞鋪板到BD組織培養板(BD生物科學公司)中。一天后，將各種濃度的純化的抗KREMEN2抗體(鼠類或人源化的)與固定濃度的2nM抗小鼠IgG FAB-皂草素軛合物(高級靶向系統公司(Advanced Targeting Systems))(用於測試小鼠抗體)或2nM 抗人IgG FAB-皂草素軛合物(用於測試人源化抗體)一起添加到培養物中。孵育96小時後，根據製造商的說明使用CellTiter-Glo®(普洛麥格公司(Promega))對活細胞進行計數。使用含有僅與第二FAB-皂草素軛合物一起孵育的細胞的培養物的原發光計數被設定為100%參考值，並且所有其他計數被計算為參考值的百分比。100pM濃度的大亞組的抗KREMEN2鼠類抗體以不同的效力有效地殺死超表現hKREMEN2的HEK293T細胞，而相同濃度的小鼠IgG2b同種型對照抗體(mIgG2b)則沒有(數據未顯示)。此外，抗KREMEN2人源化抗體(hSC78.9、hSC78.43、hSC78.56和hSC78.59)以及相應的嵌合抗體對照有效地殺死超表現KREMEN2的HEK293T細胞(圖13)。人源化抗體顯示出與衍生它們的嵌合抗體可比較的功效(在hSC78.9、hSC78.56和hSC78.59的情況下)(hSC78.43嵌合抗體不結合KREMEN2並且不能用作對照)。
以上結果證明了抗KREMEN2抗體介導內化的能力及其遞送細胞毒性有效載荷的能力，這支持抗KREMEN2抗體可以具有作為ADC的靶向部分的治療效用的假設。
實例17
KREMEN2表面標記物表現
在體內的腫瘤中富集腫瘤起始細胞
以上實例15表明KREMEN2的表現可以與NSCLC和OV-S PDX中的表型腫瘤起始細胞相關。
為了理解表現KREMEN2的腫瘤細胞充當CSC並在 細胞分離後重新生長腫瘤的功能性能力，使用實例15中描述的方法將LU205(LU-AD)和OV89(OV-S)進行解離並染色。使用BD FACS ARIA II流式細胞儀使用螢光啟動細胞分選術來分離表現KREMEN2的高和低/陰性的活的人腫瘤細胞。將分離的腫瘤細胞分離到含有PBS/2% FCS的埃彭道夫(Eppendorf)管中。將SC78陽性和SC78陰性的分離的腫瘤細胞皮下注射到5隻受體小鼠中，各自為LU205的每隻受體小鼠接種50個細胞以及OV89的每隻受體小鼠接種180個細胞。
陽性腫瘤生長被定義為超過200mm3的腫瘤生長。在LU205中，5/5注射有KREMEN2陽性腫瘤細胞的小鼠生長腫瘤，而僅3/5注射有KREMEN2陰性腫瘤細胞小鼠生長腫瘤(圖14A)。在OV89中，5/5小注射有KREMEN2陽性腫瘤細胞的鼠生長腫瘤，而僅4/10注射有KREMEN2陰性腫瘤細胞的小鼠生長腫瘤(圖14B)。該等結果表明，雖然KREMEN2在該模型中並不專門標記腫瘤起始細胞，但該標記物的表現確實富集了細胞分離後更能夠重新生長腫瘤的腫瘤起始細胞群，而不是不表現KREMEN2的腫瘤細胞。
數據表明KREMEN2在特定細胞群中的表現係在NSCLC和OV-S腫瘤內更具攻擊性的腫瘤發生細胞，並且表明靶向性抗KREMEN2療法可以有效地靶向該亞群。
實例18
KREMEN2表現狀態和體細胞突變
在乳癌、NSCLC和卵巢癌(BR、NSCLC、OV)患者源的異種移植物(PDX)系中各種相關基因的突變狀態可以藉由對基因組DNA(gDNA)進行靶向重新定序來確定。
可以使用來自每個BR、NSCLC、OV PDX細胞系的gDNA來進行gDNA的靶向重新定序，以產生具有Ion AmpliSeq文庫套組2.0和AmpliSeq引物(生命技術公司)的定制組的文庫，其涵蓋超過3000個長達250bp的擴增子並覆蓋多個基因的編碼區和非編碼區。每個樣品可以與Ion Xpress條碼適配子(生命技術公司)連接，以允許為每個定序輪次彙集多個樣品。然後可以在Ion Torrent PGM機器(生命技術公司)上進行定序，並且可以進行數據分析來鑒定導致gDNA、mRNA轉錄物和蛋白質水平變化的腫瘤相關基因的序列變化。
在一些實施方式中，可以使用腫瘤相關基因的突變狀態作為替代性生物標記物(如下面更詳細描述的)以確定各種基因突變與KREMEN2的表現之間是否存在相關性，這可以告知用本發明的抗KREMEN2抗體或ADC治療腫瘤(例如BR、NSCLC、OV-S)的效力。在其他實施方式中，可以使用BR、NSCLC和OV相關基因的突變狀態來確定基因突變與用本發明的抗KREMEN2抗體或ADC治療的應答之間是否存在相關性。在另外的實施方式中，可以使用BR、NSCLC或OV-S相關基因的突變狀態來確定有效的組合療法。
為了確定與KREMEN2的表現相關的突變的顯著性，使用以上所述的Ion Ampliseq和Ion Torrent PGM技術評估BR、 NSCLC和OV-SPDX腫瘤的主要癌症驅動基因的靶向重新定序。藉由微陣列確定具有KREMEN2高表現和低表現的BR、NSCLC和OV-S腫瘤，並用於將突變數據與KREMEN2表現相關聯。編碼突變由在定序基因的蛋白質編碼區中發生的任何非同義改變而定義，所述非同義改變包括密碼子的非同義的錯義、插入或缺失，擴增子缺失或擴增子擴增、無義非同義、移碼和突變，其導致定序基因的改變的剪接位點變體。分析結果示於下面的表8和9中以及附圖15A和15B中。
發現高度表現KREMEN2的NSCLC PDX腫瘤與在FGFR2中攜帶突變變異(例如非同義的編碼突變、缺失和獲得的外顯子)的PDX系相關聯。KREMEN2表現也與整個FGFR2、GRIN2A和PTCH1中編碼外顯子的缺失有關(圖15A和表8)。包含FGFR2中的編碼突變或缺失的NSCLC PDX腫瘤系與微陣列資料集中KREMEN2的低3.6倍表現(相比於不攜帶突變的PDX腫瘤)顯著相關，如藉由Welch's T-檢驗所確定的。PTCH1中的外顯子缺失似乎預測KREMEN2的2倍更高表現。在NSCLC PDX資料集的GRIN2A外顯子的缺失中所觀察到的顯著性缺乏可能是由於PDX資料集中該突變的相對罕見或由於在NSCLC PDX腫瘤內攜帶該突變的低頻率腫瘤細胞殖株所致。
對於OV-S PDX，PTCH1中的編碼突變預測了KREMEN2的更高表現，而觀察到OV-S和BR PDX兩者中PTCH1外顯子的缺失與KREMEN2的更高表現相關(圖15B和表9)。對於OV和BR PDX，PTCH1突變與KREMEN2表現的關聯不明顯。再次，顯著性的缺乏可能是由於小的樣品組或存在於PDX腫瘤中的罕見的突變腫瘤細胞殖株所致。該等數據表明在該等基因中檢測到的非同義突變可能與KREMEN2的表現或表現的缺失相關。因此，這樣的突變可以用作生物標誌物以預測KREMEN2在患者群中的表現，並且更精確地指導該等腫瘤亞組的治療。
實例19
抗KREMEN2抗體藥物軛合物
體內誘導持久的腫瘤消退
為了評估抗KREMEN2抗體藥物軛合物在代表性腫瘤環境中的活性，在肺鱗狀(LU)、乳房(BR)和卵巢(OV)PDX模型中進行體內功效研究。ADC包含人源化位點特異性抗KREMEN2抗體，該抗體含有N297A突變以使用可裂解接頭(即ADC6)減少與PBD1軛合的非特異性Fc介導的結合。
當腫瘤體積為100-250mm3時，將攜帶PDX腫瘤的NOD/SCID小鼠隨機分成至少5隻動物的各組，並藉由腹膜內注射單劑量媒介物或0.4mg/kg人源化IgG1同種型對照ADC、hSC78.43ss1 PBD1、hSC78.43ss1MJ PBD1或hSC78.56ss1MJ PBD1進行處理。處理後每週測量並記錄腫瘤體積，並且當腫瘤體積超 過1000mm3時或在研究持續130天后處死動物。結果以圖表示於圖16中。
在肺鱗狀細胞癌模型LU495中，hSC78.43ss1MJ PBD1或hSC78.56ss1MJ PBD1的單劑量處理在所有處理的動物中都產生了持續的響應，在給藥後76天未觀察到腫瘤復發，而媒介物或同種型ADC對照處理的動物表現出迅速的腫瘤生長，需要14天后終止。在乳癌PDX Br202中進行了類似的觀察，其在五隻動物中的兩隻中表現出治癒性持續響應，並且在用hSC78.43ss1 PBD1處理後超過123天在第三隻動物中無痛復發(indolent recurrence)，而媒介物或同種型ADC對照處理的超過1000mm3的動物分別在15和26天內無痛復發。此外，用單劑量的hSC78.43ss1 PBD1處理的攜帶卵巢OV119MET的小鼠在給藥後至少128天表現出持久的治癒性響應，而用媒介物或人IgG1 LD6.23 ADC對照處理的所有動物都復發了。
該等數據表明，SC78靶向的抗體藥物軛合物在特異性靶向和根除體內的肺腫瘤、乳房腫瘤和卵巢腫瘤方面是有效的。
實例20
抗KREMEN2抗體藥物軛合物
有效耗竭癌症幹細胞
為了研究抗KREMEN2抗體藥物軛合物靶向和消除癌症幹細胞群的能力，進行體內有限稀釋分析(LDA)。
簡言之，將攜帶LU450肺鱗狀細胞癌PDX腫瘤的 NOD/SCID動物隨機分組，並如上用媒介物或0.1mg/kg的人源化IgG1同種型ADC對照、hSC78.43ss1MJ PBD3或hSC78.56ss1MJ PBD3(即兩個ADC3)進行處理。給藥七天后，處死每組兩隻動物，收集腫瘤，如前所述分解成單細胞懸浮液，並且在4℃下在埃彭道夫管中以50μl體積將每組的200萬個細胞用抗小鼠CD45 FITC、抗小鼠H2kD FITC、抗人-ESA PE-Cy7、抗人CD46 APC和抗人CD324 PerCP進行染色持續20分鐘。將細胞相繼地用1mL PBS/2% FCS洗滌兩次，重懸於含有DAPI的PBS/2% FCS中，並且用以下系列的FACS Aria II細胞分選儀在限定的接種物下將活的人細胞鑒定並分選為DAPI-低、CD45/H2kD FITC陰性、人ESA PE-Cy7陽性：
‧媒介物(3001、1001、301、101個細胞/小鼠)
‧同種型對照ADC(3002、1002、3002、102個細胞/小鼠)
‧hSC78.43ss1MJ PBD3(3003、1003、303、103個細胞/小鼠)
‧hSC78.56ss1MJ PBD3(3004、1004、304、104個細胞/小鼠)
每個接種物皮下注射十隻NOD/SCID動物。每週監測動物並記錄腫瘤生長直到4週時間過去，沒有另外的腫瘤生長。將在此期間具有腫瘤生長的動物記為TG+，而刪除在腫瘤生長之前已經死亡的動物。藉由使用L-Calc(幹細胞技術公司(STEMCELL Technologies))的泊松分佈分析來確定腫瘤起始(TIC)頻率。
在所評估的每個稀釋組中的所有存活動物中的媒介物和同種型對照ADC處理的動物生長腫瘤，這突出TIC頻率分別為至少23.3和22.7/1000個細胞(圖17)。相反，在任何接種水平的hSC78.43ss1MJ PBD3或hSC78.56ss1MJ PBD3處理的動物中，沒有腫瘤生長，這突出TIC頻率分別為小於0.03和0.02/1000個細胞。
該等數據表明，本發明的抗KREMEN2 ADC有效耗竭來自人肺鱗狀細胞癌PDX模型的腫瘤起始細胞，這表明KREMEN2決定因子係可行的治療靶標。
熟習該項技術者將進一步理解的是，本發明能以其他特定形式實施而不脫離其精神或中心屬性。由於本發明的前述說明僅僅揭露了其示例性實施方式，所以應當理解的是，其他變化也被考慮為在本發明的範圍之內。因此，本發明並不局限於在此已經詳細描述的具體實施方式。而是，應參考所附的如本發明的範圍和內容所指示的申請專利範圍。
<110> 艾伯維史坦森特瑞斯有限責任公司(Abbvie Stemcentrx LLC)
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<212> PRT
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<221> 尚未歸類的特徵
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<221> 尚未歸類的特徵
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<221> 尚未歸類的特徵
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<221> 尚未歸類的特徵
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<213> 家鼷鼠(Mus musculus)
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<221> 尚未歸類的特徵
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<213> 家鼷鼠
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<221> 尚未歸類的特徵
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<221> 尚未歸類的特徵
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<213> 家鼷鼠
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<221> 尚未歸類的特徵
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<221> 尚未歸類的特徵
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<221> 尚未歸類的特徵
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<213> 家鼷鼠
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<221> 尚未歸類的特徵
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<221> 尚未歸類的特徵
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<221> 尚未歸類的特徵
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<221> 尚未歸類的特徵
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<213> 家鼷鼠
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<221> 尚未歸類的特徵
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<221> 尚未歸類的特徵
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<213> 家鼷鼠
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<221> 尚未歸類的特徵
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<221> 尚未歸類的特徵
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<213> 家鼷鼠
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<221> 尚未歸類的特徵
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<213> 家鼷鼠
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<221> 尚未歸類的特徵
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<213> 家鼷鼠
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<221> 尚未歸類的特徵
<223> SC78.29 VL
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<213> 家鼷鼠
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<221> 尚未歸類的特徵
<223> SC78.29 VH
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<221> 尚未歸類的特徵
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<221> 尚未歸類的特徵
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<213> 家鼷鼠
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<221> 尚未歸類的特徵
<223> SC78.30 VL
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<213> 家鼷鼠
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<221> 尚未歸類的特徵
<223> SC78.30 VH
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<221> 尚未歸類的特徵
<223> SC78.30 VH
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<221> 尚未歸類的特徵
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<221> 尚未歸類的特徵
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<213> 家鼷鼠
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<221> 尚未歸類的特徵
<223> SC78.43 VH
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<213> 家鼷鼠
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<221> 尚未歸類的特徵
<223> SC78.43 VH
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<213> 家鼷鼠
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<221> 尚未歸類的特徵
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<221> 尚未歸類的特徵
<223> SC78.47 VH
<400> 66
<210> 67
<211> 120
<212> PRT
<213> 家鼷鼠
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> SC78.47 VH
<400> 67
<210> 68
<211> 321
<212> DNA
<213> 家鼷鼠
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> SC78.53 VL
<400> 68
<210> 69
<211> 107
<212> PRT
<213> 家鼷鼠
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> SC78.53 VL
<400> 69
<210> 70
<211> 351
<212> DNA
<213> 家鼷鼠
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> SC78.53 VH
<400> 70
<210> 71
<211> 117
<212> PRT
<213> 家鼷鼠
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> SC78.53 VH
<400> 71
<210> 72
<211> 321
<212> DNA
<213> 家鼷鼠
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> SC78.56 VL
<400> 72
<210> 73
<211> 107
<212> PRT
<213> 家鼷鼠
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> SC78.56 VL
<400> 73
<210> 74
<211> 366
<212> DNA
<213> 家鼷鼠
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> SC78.56 VH
<400> 74
<210> 75
<211> 122
<212> PRT
<213> 家鼷鼠
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> SC78.56 VH
<400> 75
<210> 76
<211> 339
<212> DNA
<213> 家鼷鼠
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> SC78.59 VL
<400> 76
<210> 77
<211> 113
<212> PRT
<213> 家鼷鼠
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> SC78.59 VL
<400> 77
<210> 78
<211> 357
<212> DNA
<213> 家鼷鼠
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> SC78.59 VH
<400> 78
<210> 79
<211> 119
<212> PRT
<213> 家鼷鼠
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> SC78.59 VH
<400> 79
<210> 80
<211> 348
<212> DNA
<213> 家鼷鼠
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> SC78.39 VH
<400> 80
<210> 81
<211> 116
<212> PRT
<213> 家鼷鼠
<220>
<221> 尚未歸類的特徵
<223> SC78.39 VH-在圖6B中以SEQ ID NO 83指出
<400> 81
<210> 82
<400> 82 000
<210> 83
<400> 83 000
<210> 84
<400> 84 000
<210> 85
<400> 85 000
<210> 86
<400> 86 000
<210> 87
<400> 87 000
<210> 88
<400> 88 000
<210> 89
<400> 89 000
<210> 90
<400> 90 000
<210> 91
<400> 91 000
<210> 92
<400> 92 000
<210> 93
<400> 93 000
<210> 94
<400> 94 000
<210> 95
<400> 95 000
<210> 96
<400> 96 000
<210> 97
<400> 97 000
<210> 98
<400> 98 000
<210> 99
<400> 99 000
<210> 100
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.9 VL hSC78.9ss1 VL hSC78.9ss1MJ VL
<400> 100
<210> 101
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.9 VL hSC78.9ss1 VL hSC78.9ss1MJ VL
<400> 101
<210> 102
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.9 VH hSC78.9ss1 VH hSC78.9ss1MJ VH
<400> 102
<210> 103
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.9 VH hSC78.9ss1 VH hSC78.9ss1MJ VH
<400> 103
<210> 104
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.43ss1MJ VL hSC78.43ss1 VL hSC78.43 VKB3 VL
<400> 104
<210> 105
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.43 VL hSC78.43ss1 VL hSC78.43ss1MJ VL
<400> 105
<210> 106
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.43ss1MJ VH hSC78.43ss1 VH hSC78.43 VKB3 VH
<400> 106
<210> 107
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.43 VH；hSC78.43ss1 VH；hSC78.43ss1MJ VH；hSC78.43 VKO8 VH； hSC78.43ss1 VKO8 VH
<400> 107
<210> 108
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.43 VKO8和hSC78.43ss1 VKO8 VL
<400> 108
<210> 109
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.43 VKO8 VL hSC78.43ss1 VKO8 VL
<400> 109
<210> 110
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.43 VKO8和hSC78.43ss1 VKO8 VL
<400> 110
<210> 111
<400> 111 000
<210> 112
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.56 VL hSC78.56ss1 VL
<400> 112
<210> 113
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.56 VL hSC78.56ss1 VL
<400> 113
<210> 114
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.56 VH hSC78.56ss1 VH
<400> 114
<210> 115
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.56 VH hSC78.56ss1 VH
<400> 115
<210> 116
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.59 VL hSC78.59ss1 VL
<400> 116
<210> 117
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.59 VL hSC78.59ss1 VL
<400> 117
<210> 118
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.59 VH hSC78.59ss1 VH
<400> 118
<210> 119
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.59 VH hSC78.59ss1 VH
<400> 119
<210> 120
<400> 120 000
<210> 121
<400> 121 000
<210> 122
<400> 122 000
<210> 123
<400> 123 000
<210> 124
<400> 124 000
<210> 125
<400> 125 000
<210> 126
<400> 126 000
<210> 127
<400> 127 000
<210> 128
<400> 128 000
<210> 129
<400> 129 000
<210> 130
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.9；hSC78.9ss1；hSC78.9ss1MJ全長輕鏈蛋白
<400> 130
<210> 131
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.9全長重鏈蛋白
<400> 131
<210> 132
<400> 132 000
<210> 133
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.9ss1全長重鏈蛋白
<400> 133
<210> 134
<400> 134 000
<210> 135
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.9ss1MJ全長重鏈蛋白
<400> 135
<210> 136
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.43；hSC78.43ss1；hSC78.43ss1MJ全長輕鏈蛋白
<400> 136
<210> 137
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.43；hSC78.43 VKO8全長重鏈蛋白
<400> 137
<210> 138
<400> 138 000
<210> 139
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.43ss1；hSC78.43ss1 VKO8全長重鏈蛋白
<400> 139
<210> 140
<400> 140 000
<210> 141
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.43ss1MJ全長重鏈蛋白
<400> 141
<210> 142
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.43 VKO8；hSC78.43ss1 VKO8全長輕鏈蛋白
<400> 142
<210> 143
<400> 143 000
<210> 144
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.56；hSC78.56ss1全長輕鏈蛋白
<400> 144
<210> 145
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.56全長重鏈蛋白
<400> 145
<210> 146
<400> 146 000
<210> 147
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.56ss1全長重鏈蛋白
<400> 147
<210> 148
<400> 148 000
<210> 149
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.56ss1MJ全長重鏈蛋白
<400> 149
<210> 150
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.59和hSC78.59ss1全長輕鏈蛋白
<400> 150
<210> 151
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.59全長重鏈蛋白
<400> 151
<210> 152
<400> 152 000
<210> 153
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hSC78.59ss1全長重鏈蛋白
<400> 153

Claims (39)

  1. 一種單株抗體，該單株抗體與表現KREMEN2的腫瘤起始細胞結合。
  2. 一種單株抗體，該單株抗體與包含SEQ ID NO：1的人KREMEN2結合。
  3. 一種單株抗體，該單株抗體與人KREMEN2結合，並且包含抗體或與抗體競爭結合，該抗體包含：SEQ ID NO：21的輕鏈可變區(VL)和SEQ ID NO：23的重鏈可變區(VH)；或SEQ ID NO：25的VL和SEQ ID NO：27的VH；或SEQ ID NO：29的VL和SEQ ID NO：31的VH；或SEQ ID NO：33的VL和SEQ ID NO：35的VH；或SEQ ID NO：37的VL和SEQ ID NO：39的VH；或SEQ ID NO：41的VL和SEQ ID NO：43的VH；或SEQ ID NO：45的VL和SEQ ID NO：47的VH；或SEQ ID NO：49的VL和SEQ ID NO：51的VH；或SEQ ID NO：53的VL和SEQ ID NO：55的VH；或SEQ ID NO：57的VL和SEQ ID NO：59的VH；或SEQ ID NO：61的VL和SEQ ID NO：63的VH；或SEQ ID NO：65的VL和SEQ ID NO：67的VH；或SEQ ID NO：69的VL和SEQ ID NO：71的VH；或SEQ ID NO：73的VL和SEQ ID NO：75的VH；或SEQ ID NO：77的VL和SEQ ID NO：79的VH；或SEQ ID NO：49的VL和SEQ ID NO：81的VH。
  4. 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之單株抗體，該單株抗體係內化抗體。
  5. 如申請專利範圍第1-4項中任一項所述之單株抗體，該單株抗體係嵌合抗體、CDR接枝抗體、人源化抗體或人抗體，或其免疫反應性片段。
  6. 如申請專利範圍第1-5項中任一項所述之單株抗體，其中該抗體包含SEQ ID NO：101的輕鏈可變區(VL)和SEQ ID NO：103的重鏈可變區(VH)；或SEQ ID NO：105的VL和SEQ ID NO：107的VH；或SEQ ID NO：109的VL和SEQ ID NO：107的VH；或SEQ ID NO：113的VL和SEQ ID NO：115的VH；或SEQ ID NO：117的VL和SEQ ID NO：119的VH。
  7. 如申請專利範圍第1-6項中任一項所述之單株抗體，其中該抗體包含SEQ ID NO：130的輕鏈和SEQ ID NO：131的重鏈；或SEQ ID NO：130的輕鏈和SEQ ID NO：133的重鏈；或SEQ ID NO：130的輕鏈和SEQ ID NO：135的重鏈；或SEQ ID NO：136的輕鏈和SEQ ID NO：137的重鏈；或SEQ ID NO：136的輕鏈和SEQ ID NO：139的重鏈；或SEQ ID NO：136的輕鏈和SEQ ID NO：141的重鏈；或SEQ ID NO：142的輕鏈和SEQ ID NO：137的重鏈；或SEQ ID NO：142的輕鏈和SEQ ID NO：139的重鏈；或SEQ ID NO：144的輕鏈和SEQ ID NO：145的重鏈；或SEQ ID NO：144的輕鏈和SEQ ID NO：147的重鏈；或SEQ ID NO：144的輕鏈和SEQ ID NO：149的重鏈；或SEQ ID NO：150的輕鏈和SEQ ID NO：151的重鏈；或SEQ ID NO：150的輕鏈和SEQ ID NO：153的重鏈。
  8. 如申請專利範圍第1-6項中任一項所述之單株抗體，其中該抗體包含位點特異性抗體。
  9. 如申請專利範圍第1-8項中任一項所述之抗體，其中該抗體係與有效載荷軛合的。
  10. 一種藥物組成物，其包含如申請專利範圍第1-8項中任一項所述之抗體。
  11. 一種核酸，其編碼如申請專利範圍第1-8項中任一項所述之抗體的全部或部分。
  12. 一種載體，其包含如申請專利範圍第11項所述之核酸。
  13. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第11項所述之核酸或如申請專利範圍第12項所述之載體。
  14. 一種抗體藥物軛合物(ADC)或其藥學上可接受的鹽，其包含與細胞毒性劑軛合、連接或以其他方式締合的單株抗體，其中該單株抗體與人KREMEN2蛋白結合。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之ADC，其包含式Ab-[L-D]n，其中：a)Ab包括抗KREMEN2抗體；b)L包括視情況的接頭；c)D包括藥物，該藥物為細胞毒性劑；並且d)n係從約1到約20的整數。
  16. 如申請專利範圍第14或15項所述之ADC，其中該抗KREMEN2抗體包括嵌合抗體、CDR接枝抗體、人源化抗體或人抗體或其免疫反應性片段。
  17. 如申請專利範圍第14-16項中任一項所述之ADC，其中Ab係如申請專利範圍第1-8項中任一項所述之抗KREMEN2抗體。
  18. 如申請專利範圍第15-17項中任一項所述之ADC，其中載藥量係從約2至約8。
  19. 如申請專利範圍第14-18項中任一項所述之ADC，其中該細胞毒性劑包含選自下組的化合物，該組由以下組成：澳瑞他汀、美登木素生物鹼、吡咯并苯并二氮呯(PBD)、苯并二氮呯衍生物、卡奇黴素和鵝膏蕈鹼。
  20. 一種具有式Ab-[L-D]n的ADC，其包括選自下組的結構，該組由以下組成： 以及 其中Ab包含抗KREMEN2抗體或其免疫反應性片段，並且n係從約1至約8的整數。
  21. 如申請專利範圍第20項所述之ADC，其中抗KREMEN2抗體包括hSC78.43ss1MJ(SEQ ID NO：136和141)。
  22. 如申請專利範圍第20項所述之ADC，其中抗KREMEN2抗體包括hSC78.56ss1MJ(SEQ ID NO：144和149)。
  23. 一種具有式Ab-[L-D]n的ADC，其包括以下結構： 其中Ab包含hSC78.43ss1MJ(SEQ ID NO：136和141)並且n係2。
  24. 一種藥物組成物，其包含如申請專利範圍第14至23項中任一項所述之ADC。
  25. 一種治療癌症之方法，該方法包括向對有需要的受試者給予如申請專利範圍第10項或如申請專利範圍第24項所述之藥物組成物。
  26. 如申請專利範圍第25項所述之方法，其中該癌症包括實體瘤。
  27. 如申請專利範圍第25或26項中任一項所述之方法，其中該癌症選自由以下各項組成之群組：腎上腺癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、乳癌、胃癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮癌、食管癌、結腸直腸癌、前列腺癌、黑素瘤、胰腺癌、肺癌(小細胞肺癌和非小細胞肺癌兩者)、甲狀腺癌和神經膠質母細胞瘤。
  28. 如申請專利範圍第27項所述之方法，其中該癌症係非小細胞肺癌，並且該非小細胞癌症包括鱗狀細胞肺癌。
  29. 如申請專利範圍第27項所述之方法，其中該癌症係乳癌，並且該乳癌係管腔上皮B型乳癌。
  30. 一種減少腫瘤細胞群中的腫瘤起始細胞之方法，其中該方法包括使腫瘤 細胞群與如申請專利範圍第14-23項中任一項所述之ADC或如申請專利範圍第10或24項所述之藥物組成物進行接觸，由此降低腫瘤起始細胞的頻率，該腫瘤細胞群包含腫瘤起始細胞和除腫瘤起始細胞外的腫瘤細胞。
  31. 一種將細胞毒素遞送至細胞之方法，該方法包括使該細胞與如申請專利範圍第14至23項中任一項所述之ADC或如申請專利範圍第10或24項所述之藥物組成物進行接觸。
  32. 一種檢測、診斷或監測受試者中癌症之方法，該方法包括以下步驟：(a)使腫瘤細胞與如申請專利範圍第1-9項中任一項所述之抗體進行接觸；和(b)檢測該等腫瘤細胞上的該抗體。
  33. 一種產生如申請專利範圍第14-23項中任一項所述之ADC之方法，該方法包括將抗KREMEN2抗體(Ab)與藥物(D)軛合的步驟。
  34. 一種套組，其包含：一個或多個容器，所述一個或多個容器含有如申請專利範圍第10或24項所述之藥物組成物或如申請專利範圍第14-23項中任一項所述之ADC；以及與該一個或多個容器相關聯的標籤或藥品說明書，該標籤或藥品說明書指示該組成物或ADC用於治療患有癌症的受試者。
  35. 一種套組，其包含：一個或多個容器，該一個或多個容器含有如申請專利範圍第10或24項所述之藥物組成物或如申請專利範圍第14-23項中任一項所述之ADC；以及 與該一個或多個容器相關聯的標籤或藥品說明書，該標籤或藥品說明書指示針對患有癌症的受試者的給藥方案。
  36. 如申請專利範圍第34或申請專利範圍35項所述之套組，其中該癌症係肺癌。
  37. 一種套組，其包含：一個或多個容器，該一個或多個容器含有如申請專利範圍第10或24項所述之藥物組成物或如申請專利範圍第14-23項中任一項所述之ADC；以及與該一個或多個容器相關聯的標籤或藥品說明書，該標籤或藥品說明書指示該組成物或ADC用於將細胞毒素遞送到細胞。
  38. 一種確定抗KREMEN2抗體藥物軛合物或其藥學上可接受的鹽的細胞毒性之方法，該方法包括以下步驟：(a)使癌細胞與該抗體藥物軛合物進行接觸，其中該抗體藥物軛合物包含與細胞毒性劑軛合、連接或以其他方式締合的抗KREMEN2抗體以及(b)確定該癌細胞被殺死。
  39. 如申請專利範圍第38項所述之方法，其中該抗體藥物軛合物係如申請專利範圍第14-23項中任一項所述之抗體藥物軛合物。
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