JP5339748B2 - ヒトオステオポンチンの活性化を阻害する物質をスクリーニングする方法 - Google Patents

Description

本発明は、オステオポンチンの活性化を阻害する物質をスクリーニングする方法およびそのためのキット等に関する。

オステオポンチン（以下、ＯＰＮと表す）は、破骨細胞、骨芽細胞、マクロファージ、活性化T細胞、平滑筋細胞および上皮細胞などの多数の細胞型によって発現される細胞外マトリックスタンパク質を含有する、ＲＧＤ配列を有する細胞外マトリックス糖タンパク質の１種である。

ヒトＯＰＮは、その中心付近に存在するＲＧＤ配列を介してαＶβ３、αＶβ１およびαＶβ５インテグリンと相互作用することによって、血管の平滑筋細胞において細胞接着を媒介し、更にマクロファージ、リンパ球、内皮細胞および平滑筋細胞等の遊走に関係している。さらにヒトＯＰＮは、自身のＳＶＶＹＧＬＲ配列を介してα９β１、α４β１およびα４β７インテグリンと結合することも明らかにされている。

これらインテグリンとＯＰＮとの結合様式の研究から、ヒトＯＰＮの１３６−１４２番目のアミノ酸配列及び１６２−１６８番目のアミノ酸配列がα4インテグリンと相互作用する部位であることが確認されたことを受けて、当該部位を構成するアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いて、α４インテグリンとＯＰＮとの結合を阻害する物質のスクリーニング方法及びスクリーニングで得られた物質を用いた炎症疾患の治療方法が開発されている（特許文献１）。

一方、ヒトＯＰＮの場合、ｍＲＮＡのオルタナティブスプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ）によって３種類のアイソフォームａ〜ｃ（以下、ＯＰＮ−ａ、−ｂ、−ｃと表す）が生じ（非特許文献１）、さらにＯＰＮ−ａについては、シグナルペプチドが切断された成熟体ＯＰＮ−ａの１６８番目のアルギニン残基のＣ末端側が生体内のトロンビンによって切断されることで、Ｎ末端とＣ末端の２つのフラグメントとなって活性化される。このトロンビンの切断による活性化ＯＰＮは、リウマチや肝炎等の免疫疾患の増悪をもたらし得ることが報告されている（例えば非特許文献２、非特許文献３）。

このトロンビンによるＯＰＮの活性化に対して、細胞表面のプロテオグリカンの一種であるシンデカン４がＯＰＮに結合して、トロンビン切断に対する抵抗性をＯＰＮに与えること、シンデカン４を肝炎マウスモデルに投与することで肝炎治療効果が得られること、シンデカン４をノックアウトさせたマウスに肝炎を発症させると肝炎が増悪化するが、シンデカン４を投与すると疾患増悪が抑制されること、などが報告されている（非特許文献４）

このことは、シンデカン４の様に、ＯＰＮのトロンビンによる切断を抑制することができる物質は、炎症性疾患の治療剤となり得ることを意味するものであり、したがってＯＰＮに対するトロンビンの切断を抑制ないし阻害することのできる物質の探索は、ＯＰＮが関与する炎症性疾患に対する、新たな作用機序に基づく抗炎症剤を提供し得るものと期待することができる。しかしながら、ＯＰＮは巨大な糖タンパク質であり、同じくタンパク質であるトロンビンと組み合わせて使用することでトロンビンによる切断を抑制する物質を探索することは、それぞれのタンパク質の調製、トロンビン活性のアッセイなどを必要とし、所望の物質を効率的にスクリーニングする上で効率的であるとは言い難い。
Ｙ．Ｓａｉｔｏｈ、ｅｔ ａｌ．、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１９９５年、第７２巻、第５５−６３頁 Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２００３年、第１１２巻、第１８１−１８８頁 Ｄｉａｏ，Ｓ ｅｔ ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２００４年、第２１巻、第５３９−５５０頁 Ｋｏｎ，Ｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２００８、第２０５巻、第２５−３３頁 国際特許公開ＷＯ０１／７１３５８号パンフレット

本発明は、ＯＰＮに代わり得るターゲット分子を用いて、例えばハイスループットスクリーニング（ＨＴＰスクリーニング）への応用が可能な、効率的なＯＰＮ活性化抑制剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、シンデカン４がＯＰＮに結合する際に、その構成糖鎖であるヘパラン硫酸がＯＰＮにおける推定ヘパリン結合サイトの一つに結合すること、当該推定ヘパリン結合サイトにＯＰＮのトロンビン切断部位が含まれること、当該推定ヘパリン結合サイトに含まれるアミノ酸配列からなるポリペプチドがヘパラン硫酸との結合能を維持していることなどを見いだし、下記の各発明を完成した。なお、本明細書では、特に断らない限り、アミノ酸配列中のアミノ酸は一文字表記で表すこととする。

（１）式：ＸｎＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦＺｎ（ただしＸｎ及びＺｎはそれぞれ不在か、又は１〜４個の任意のアミノ酸を表す）で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は担体に結合した当該ポリペプチドと試験物質とをインキュベーションする工程ａ）、及び前記ポリペプチドと試験物質とからなる複合体の形成を検出する工程ｂ）を含む、ヒトオステオポンチンの活性化を阻害する物質をスクリーニングする方法。

（２）前記工程ａ）のインキュベーションが、ラベル化されたグリコサミノグリカンの共存下で行われる、（１）に記載の方法。

（３）グリコサミノグリカンがヘパラン硫酸及び／又はヘパリンである、（２）に記載の方法。

（４）グリコサミノグリカンがラベル化されている、（２）又は（３）に記載の方法。

（５）前記工程ｂ）の検出が、前記ポリペプチドと結合しているラベル化されたグリコサミノグリカンを測定することで行われる、（４）に記載の方法。

（６）担体がタンパク質である、（１）〜（５）の何れかに記載の方法。

（７）担体としてのタンパク質がＢＳＡ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ又はマルトース結合タンパク質である、（６）に記載の方法。

（８）ポリペプチドが、ＤＳＶＶＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰＤ（配列番号１）、ＶＶＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲ（配列番号２）又はＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦ（配列番号３）で示される何れかのアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（１）〜（７）の何れかに記載の方法。

（９）ポリペプチドがＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（８）に記載の方法。

（１０）式：ＸｎＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦＺｎ（ただし、式中、Ｘｎ及びＺｎはそれぞれ不在か、又は１〜４個の任意のアミノ酸を表す）で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該ポリペプチドが結合した担体と、ラベル化されたグリコサミノグリカンを含む、ヒトオステオポンチンの活性化を阻害する物質をスクリーニングするためのキット。

（１１）ポリペプチドが、ＤＳＶＶＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰＤ（配列番号１）、ＶＶＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲ（配列番号２）又はＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦ（配列番号３）で示される何れかのアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（１０）に記載のキット。

（１２）ポリペプチドがＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、（１１）に記載のキット。

本発明のスクリーニング方法は、ヒトＯＰＮやトロンビンなどのターゲットタンパク質を使用することなく、簡便な操作によってヒトＯＰＮ活性化抑制剤をスクリ−ニングすることができる。特に蛍光物質その他の標識化合物を利用することで、ＨＴＰスクリーニングへの応用も可能である。

本発明は、式：ＸｎＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦＺｎ（ただし、式中、Ｘｎ及びＺｎはそれぞれ不在か又は１〜４個の任意のアミノ酸を表す）で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は担体に結合した当該ポリペプチドと試験物質とをインキュベーションする工程ａ）、及び前記ポリペプチドと試験物質とからなる複合体の形成を検出する工程ｂ）を含む、ヒトＯＰＮの活性化を阻害する物質をスクリーニングする方法に関する。

上記アミノ酸配列において、Ｘｎ及びＺｎはそれぞれ不在であってもよく、この場合のポリペプチドのアミノ酸配列はＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦ（配列番号３）である。以下、このアミノ酸配列からなるポリペプチドをＨＳ１と表す。

また、上記式中のＸｎ及びＺｎは１〜４個のアミノ酸であってもよく、例えばＸｎはＶＶ、ＳＶＶ又はＤＳＶＶでもよく、ＺｎはＲＲ、ＲＲＰ又はＲＲＰＤでもよい。

Ｘｎ及びＺｎを有するポリペプチドの好ましいアミノ酸配列は、ＤＳＶＶＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰＤ（配列番号１、以下、かかるアミノ酸配列からなるポリペプチドをＢＳ３と表す）、又はＶＶＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲ（配列番号２、以下、かかるアミノ酸配列からなるポリペプチドをＢＳ１と表す）である。

後の参考例において詳しく説明するように、本発明者らは、ヘパラン硫酸及びヘパリンがヒトＯＰＮに結合すると、トロンビンによる切断に対してヒトＯＰＮが抵抗性を獲得することを、実験的に確認した。さらに、ヒトＯＰＮのアミノ酸配列から推定されるヘパリン結合領域をＯＰＮ上で２箇所特定し、それぞれの領域に相当するアミノ酸配列からなるポリペプチドを多数調製して、それらとヘパリンとの結合能を解析したところ、トロンビンによるヒトＯＰＮの切断部位である１６８番目のＡｒｇを含む前記ＨＳ１のアミノ酸配列を含むポリペプチドが、依然としてヘパリンとの結合能を保持していることを確認した。なお、上記のアミノ酸配列からなるポリペプチドのうち、ＢＳ１が最も高いヘパリン結合能を有し、次いでＨＳ１、ＢＳ３の順に高いヘパリン結合能を有していることが確認された。

以上の実験的確認から、シンデカン４によるトロンビン切断に対するヒトＯＰＮの抵抗性は、シンデカン４のヘパラン硫酸がＨＳ１のアミノ酸配列を含むヒトＯＰＮの推定ヘパリン結合領域に結合し、トロンビンによる切断部位である１６８番目のアルギニンとその前後をいわばマスクすることによって獲得されるものと考えられる。

従って、ＨＳ１及び／又はＨＳ１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに生理的条件下で結合することのできる物質、特にムコ多糖類は、生体内においてもトロンビン切断に対してヒトＯＰＮに抵抗性を与える物質、すなわちヒトＯＰＮのトロンビンによる活性化を抑制する物質として利用できるものと期待される。この様に、本発明は、ヒトＯＰＮとトロンビンを用いることなく、より低分子のポリペプチドを用いた結合アッセイを行うことで、ヒトＯＰＮの活性化を阻害する物質をスクリーニングする方法に関する発明である。また、本発明は、ＯＰＮを介した細胞接着を抑制する物質をスクリーニングする方法も提供する。

本発明の工程ａ）は、前記アミノ酸配列からなるポリペプチド又は担体に結合した当該ポリペプチドと試験物質とをインキュベーションする工程である。かかる工程において、本発明に係るポリペプチドは遊離の状態で使用してもよく、また担体に結合させて使用してもよい。本発明の方法において利用可能な担体としては、マイクロプレートに代表されるプレート、試験管、チューブ、ビーズ、ボール、フィルター、メンブレン、あるいはセルロース系担体、アガロース系担体、ポリアクリルアミド系担体、デキストラン系担体、ポリスチレン系担体、ポリビニルアルコール系担体、ポリアミノ酸系担体、あるいは多孔性シリカ系担体等のアフィニティークロマトグラフィーにおいて用いられる不溶性担体、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）などの可溶性タンパク質担体をはじめとする生物学的担体、等を挙げることができる。

本発明において使用するポリペプチドは、有機合成的手法により化学合成することもできるし、当該ポリペプチドをコードする核酸を用いた遺伝子組み換え的手法によって合成することもできる。有機化学的手法による化学合成、あるいは遺伝子組み換え的手法による合成は、いずれも当業者に公知ないし周知の各種方法を採用して行えばよい。また、ポリペプチドを不溶性担体に結合させる方法も種々知られており、それらの何れの方法を用いてもよい。本発明で使用するポリペプチドを可溶性タンパク質担体に結合させる方法としては、適当な化学試薬を用いたコンジュゲーション法の他に、当該ポリペプチドと可溶性タンパク質担体との融合タンパク質として、遺伝子組み換え手法によって調製してもよい。遺伝子組み換え手法によって当該ポリペプチドを調製する場合、ヒスチジンタグやＦＬＡＧタグなどのような、有用性の高いことが知られている機能性ペプチド配列をさらに付加してもよい。

前記ポリペプチドと試験物質とのインキュベーションは、ＰＢＳその他の適当な生理的な緩衝液中において両者を混合し、４℃〜５０℃、好ましくは室温〜３７℃、数分〜数時間の範囲において行うことが好ましい。

本発明の工程ｂ）は、前記ポリペプチドと試験物質とからなる複合体の形成を検出する工程である。ポリペプチドを含む複合体の形成は、様々な方法によって検出することができる。例えば、前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体を用意し、前記ポリペプチドと試験物質とからなる複合体を免疫学的に検出してもよく、また^３２Ｐ、^３５Ｓなどの放射性同位元素、蛍光標識化合物、酵素標識その他のラベル化合物を用いて前記ポリペプチド及び／または試験物質をラベル化し、蛍光、放射活性、酵素活性その他のシグナルを指標として複合体を検出してもよい。前記ポリペプチド及び／又は試験物質のラベル化方法は、用いるラベル化合物とラベルされる物質との組合せに応じた公知ないし周知の方法を適宜選択して行えばよい。

また本発明は、工程ａ）のインキュベーションを、グリコサミノグリカン、好ましくはヘパラン硫酸及び／又はヘパリンの共存下において行うことが好ましい。この態様によれば、本発明に係るポリペプチドに対して試験物質が親和性を有するかどうかを判定すると同時に、ヘパラン硫酸及び／又はヘパリンよりも当該ポリペプチドに対してさらに高い親和性を示す物質であるかどうかを、簡単に判定することができる。

この態様において、蛍光物質、放射性物質その他のラベル化合物でラベル化された前記グリコサミノグリカンを使用することが好ましく、さらに固相担体に固定化した前記ポリペプチドとラベル化された前記グリコサミノグリカンを使用することが更に好ましい。例えば、固相担体に固定化した前記ポリペプチドにラベル化された前記グリコサミノグリカンと試験物質とをインキュベートした後、前記ポリペプチドに結合したラベル化グリコサミノグリカン量を測定することで、前記グリコサミノグリカンよりも前記ポリペプチドに対して高い親和性を有する物質をスクリーニングすることができる。すなわち、前記ポリペプチドに結合したラベル化グリコサミノグリカンの量が多ければ、前記ポリペプチドに結合した試験物質の量は少ない（前記ポリペプチドに対する当該試験物質の親和性は低い）ことを意味し、逆に前記ポリペプチドに結合したラベル化グリコサミノグリカンの量が少なければ、前記ポリペプチドに結合した試験物質の量が多い（前記ポリペプチドに対する当該試験物質の親和性が高い）ことを意味するから、これを指標にして前記ポリペプチドに対して高い親和性を有する物質をスクリーニングできることとなる。この様に、ラベル化された前記グリコサミノグリカンを使用する方法は、試験物質が前記ポリペプチドに結合するかだけではなく、試験物質が前記グリコサミノグリカンよりも高い親和性を有するかどうかを、より簡便に調べることができる。

本発明の方法は、ポリペプチドと試験物質との結合アッセイを基本とする方法であり、こうしたアッセイ、特に固相担体に結合させた前記ポリペプチドあるいは試験物質を用いて行うアッセイは、ＨＴＰスクリーニングに容易に応用することができる。

また、本発明の方法における試験物質としては、任意の物質を使用することができるが、好適な試験物質としては、コンビナトリアルライブラリー、特定の構造を有する化学物質、ペプチドおよびペプチド誘導体、抗体、オリゴヌクレオチド、糖（多糖類を含む）が挙げられる。好ましい試験物質は、多糖類である。

試験物質の中から本発明の方法により選択される物質は、生体に投与されることによりＯＰＮと結合し、トロンビンによるＯＰＮの活性化を抑制ないし阻害する機能を示すことが期待され、したがってＯＰＮのトロンビン切断による活性化が関与すると考えられる各種疾患乃至症状、例えば、関節リウマチ、肝炎、アレルギー性疾患、多発性硬化症、腫瘍転移、心筋梗塞、肺線推症、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、虚血／再潅流性損傷、関節炎、炎症性腸疾患、Ｉ型糖尿病、全身性エリテマトーデスまたは外傷もしくは敗血症に随伴する多臓器機能不全症候群などに対する治療薬のスクリーニングに貢献することができる。

以下、実施例を示して本発明をより詳しく説明するが、本発明は実施例の記載に制限されるものではない。

＜実施例１＞
１）ポリペプチドの調製
ＳＩＧＭＡ ＧＥＮＯＳＹＳ社に依頼して、ＨＳ１、ＢＳ１及びＢＳ３の各アミノ酸配列のＮ末端にシステイン残基を付加したポリペプチドを合成、精製し、さらにＭＢＳ法（ｍ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）でＢＳＡとのコンジュゲートを作製した。

２）ラベル化ヘパラン硫酸の調製
ブタ腎由来のヘパラン硫酸（分子量約３０ｋＤａ、生化学工業株式会社）に対して、ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｉｎ−ＬＣ−Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（ＰＩＥＲＣＥ社）を、試薬に添付されたマニュアルに従って反応させた後、精製水で透析し、ビオチンでラベル化されたヘパラン硫酸（以下、Ｂｉｏ−ＨＳと表す）を調製した。

３）ポリペプチドとＢｉｏ−ＨＳとの結合
３種類のポリペプチドＨＳ１、ＢＳ１、ＢＳ３それぞれ３μｇ／ｍＬを溶解した緩衝液（０．１Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液：１０ｍＭ酢酸カルシウム＝１：１、ｐＨ７．０、以下、反応緩衝液とする）１００μＬをウェルに加え、４℃で一晩静置した。静置後、１５０μＬ／ウェルの０．５％ＢＳＡ／反応緩衝液を用いて、３７℃で１時間、ブロッキングを行った。さらに３００μＬの反応緩衝液でウェルを２回洗浄後、０．０２μｇ／ｍＬのＢｉｏ−ＨＳ／反応緩衝液を５０μＬ／ウェル（最終濃度は０．０１μｇ／ｍＬ）と０．００２、０．００６、０．０２、０．０６、０．２各μｇ／ｍＬのヘパリン／反応緩衝液又は０．００２、０．００６、０．０２、０．０６、０．２各μｇ／ｍＬの、上記２）でＢｉｏ−ＨＳに使用したブタ腎由来ヘパラン硫酸／反応緩衝液を５０μＬ／ウェル（最終濃度は０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１各μｇ／ｍＬ）加え、３７℃で３０分間インキュベートした。

３００μＬの反応緩衝液でウェルを２回洗浄後、５万倍稀釈したストレプトアビジン−ホースラディッシュパーオキシダーゼコンジュゲート（ＰＩＥＲＣＥ社）を各ウェルに１００μＬ加え、３７℃で３０分間反応させた。３００μＬの反応緩衝液でウェルを２回洗浄後、ＴＭＢ（ＢｉｏＦＸ社）を１００μＬ／ウェル加え、３７℃で１５分間反応させた後、４５０ｎｍＳＴＯＰ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＢｉｏＦＸ社）を１００μＬ／ウェル加え、４５０ｎｍ／６３０ｎｍでスペクトルを測定した。

結果として、表１及び表２に示すように、ＨＳ１、ＢＳ１、ＢＳ３はいずれもヘパリン及びブタ腎由来ヘパラン硫酸と結合することが確認された。

また、ポリペプチドとヘパリン及びブタ腎由来ヘパラン硫酸との結合能は、ＢＳ１、ＨＳ１、ＢＳ３の順に高いことが確認された（図１〜３）。

４）スクリーニング
３種類のポリペプチドＨＳ１、ＢＳ１、ＢＳ３それぞれ３μｇ／反応緩衝液の１００μＬをウェルに加え、４℃で一晩静置した。静置後、１５０μＬ／ウェルの０．５％ＢＳＡ／反応緩衝液を用いて、３７℃で１時間、ブロッキングを行った。さらに３００μＬの反応緩衝液でウェルを２回洗浄後、０．０２μｇ／ｍＬのＢｉｏ−ＨＳ／反応緩衝液を５０μＬ／ウェル（最終濃度は０．０１μｇ／ｍＬ）と、０．２μｇ／ｍＬのヒアルロン酸（分子量約３０ｋＤａ、ＨＡ３０、生化学工業株式会社）、Ｂｉｏ−ＨＳとは異なるヘパラン硫酸（分子量約３０ｋＤａ、ＨＳ３０、生化学工業株式会社）、ブタ腎由来ヘパラン硫酸（ＰＫＨＳ Ｄ１．１）、分子量１７〜１９ｋＤａのヘパリン（Ｓｉｇｍａ社）、分子量４〜６ｋＤａのヘパリン（低分子量ヘパリン、Ｓｉｇｍａ社）、アリクストラ（フォンダパリヌクスナトリウム、分子量１７２８．０８、グラクソ・スミスクライン社）それぞれを含む反応緩衝液５０μＬ／ウェル（最終濃度は０．１μｇ／ｍＬ）とを添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。

３００μＬの反応緩衝液でウェルを２回洗浄後、５万倍稀釈したストレプトアビジン−ホースラディッシュパーオキシダーゼコンジュゲート（ＰＩＥＲＣＥ社）を各ウェルに１００μＬ加え、３７℃で３０分間反応させた。３００μＬの反応緩衝液でウェルを２回洗浄後、ＴＭＢ（ＢｉｏＦＸ社）を１００μＬ／ウェル加え、３７℃で１５分間反応させた後、４５０ｎｍＳＴＯＰ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＢｉｏＦＸ社）を１００μＬ／ウェル加え、４５０ｎｍ／６３０ｎｍでスペクトルを測定した。

その結果、ＨＳ１、ＢＳ１、ＢＳ３に対して、ヘパラン硫酸、分子量１７〜１９ｋＤａのヘパリン及び分子量４〜６ｋＤａのヘパリンは結合するが、ヒアルロン酸とアリクストラは何れのポリペプチドに対しても結合しなかった（図４〜６）。

＜参考例＞ＯＰＮとシンデカン４との結合様式
１）組み換えＯＰＮの調製
Ｋｏｎら（Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０００年、第７７巻、第４８７−４９８頁）に記載された方法に従って、全長型ヒトＯＰＮ（配列番号４）、配列番号４の５〜１６８番目までのアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｎ−ｈａｌｆ）、配列番号４の１７０〜３１４番目までのアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｃ−ｈａｌｆ）をそれぞれコードするｃＤＮＡを作製し、ＰＧＥＸ−４Ｔベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）のＢａｍＨ１−Ｘｈｏ１サイトに組み込んで、全長型ＯＰＮとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質（ＯＰＮ ｆｕｌｌ／ＧＳＴ）、Ｎ−ｈａｌｆとＧＳＴとの融合タンパク質（ＯＰＮ Ｎｈａｌｆ／ＧＳＴ）、及びＣ−ｈａｌｆとＧＳＴとの融合タンパク質（ＯＰＮ Ｃｈａｌｆ／ＧＳＴ）を発現するベクターを作製した。それぞれの発現ベクターで大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、大腸菌内で融合タンパク質を発現させ、定法に従って融合タンパク質を回収、精製した。

また、全長型ヒトＯＰＮ、Ｎ−ｈａｌｆ、Ｃ−ｈａｌｆをそれぞれコードするｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＢａｍＨ１−Ｘｈｏ１サイトに組み込んで、全長型ＯＰＮ、Ｎ−ｈａｌｆ及びＣ−ｈａｌｆをそれぞれ発現するベクターを作製した。それぞれの発現ベクターをＣＨＯ細胞にトランスフェクションして形質転換細胞を調製し、Ｄ−ＭＥＭ：Ｆ−１２＝１：１の混合培地で培養して、培養上清にＯＰＮ、Ｎ−ｈａｌｆ、Ｃ−ｈａｌｆをそれぞれ生産させた。Ｍｏｒｉら（Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ．、２００７年、第２６巻、第４２−５３頁）に記載の方法に従い、前記培養上清からＯＰＮ（Ｏ−１７）抗体カラム（ＩＢＬ社）を用いて、ＯＰＮ、Ｎ−ｈａｌｆ及びＣ−ｈａｌｆを精製した。

２）組み換えシンデカン−４の調製
シンデカン−４（配列番号５）の細胞外領域（配列番号５の１〜１４５番目のアミノ酸、以下Ｓｙｎ４と表す）をコードするｃＤＮＡとヒトＩｇＧのＦｃ領域をコードするＤＮＡとを、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター上で連結させて、シンデカン−４の細胞外領域とＩｇＧのＦｃ領域とからなる融合タンパク質（Ｓｙｎ４Ｉｇ）を発現するベクターを調製した。発現ベクターをＣＨＯ細胞にトランスフェクションして形質転換細胞を調製し、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で培養して、培養上清からＰｒｏｔｅｉｎＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて、Ｓｙｎ４Ｉｇを精製した。

精製したＳｙｎ４Ｉｇを、０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ７．０と１０ｍＭ酢酸カルシウム緩衝液との等量混合液中で透析後、２０ｍＵのヘパリチナーゼ（ＨＳａｓｅ）Ｉ（生化学工業株式会社）、あるいは８５ｍＵのコンドロイチナーセ（ＣＳａｓｅ）ＡＢＣ（Ｓｉｇｍａ社）または両方を添加し、３７℃で１５時間反応させて、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸を除去したＳｙｎ４Ｉｇを調製した。

３）ＯＰＮとヘパリン及びＳｙｎ４Ｉｇとの結合
前記１）で作製したＯＰＮ ｆｕｌｌ／ＧＳＴ、ＯＰＮ Ｎｈａｌｆ／ＧＳＴ、ＯＰＮ Ｃｈａｌｆ／ＧＳＴ、全長型ヒトＯＰＮ、Ｎ−ｈａｌｆ及びＣ−ｈａｌｆをそれぞれ９６ウェルプレートに添加後、３７℃で１時開静置させて、ウェルに各ペプチドを固相化した。その後、ウェルを０．１％ＢＳＡ／ＴＢＳ／０．０５％ＮａＮ３溶液でブロッキングし、ＴＢＳを用いて２回洗浄し、１０μｇ／ｍＬのビオチン化ヘパリン（Ｓｉｇｍａ社）あるいはＳｙｎ４Ｉｇを加えて、３７℃で１時間反応させた。ビオチン化ヘパリンについては、競合阻害を目的としてヘパリンナトリウムを１００μｇ／ｍＬになるように添加した。ＴＢＳで３回洗浄後、ビオチン化ヘパリンについてはストレプトアビジン−ＨＲＰ(Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）を、Ｓｙｎ４Ｉｇについては抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ(Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）を1／５０００倍希釈して添加した。室温で３０分放置後、ＴＭＢ溶液（ＰＩＥＲＣＥ社）を添加し、１５分後に１Ｎの硫酸を加えて反応を停止させた。４５０ｎｍの吸光度を測定することで、ＯＰＮとヘパリンあるいはＳｙｎ４Ｉｇとの結合を定量化した。その結果を図７と図８に示す。

図７及び図８に示されるように、ＯＰＮ ｆｕｌｌ／ＧＳＴ及び全長型ＯＰＮはいずれもヘパリンと結合するが、ＯＰＮ Ｎｈａｌｆ／ＧＳＴ、ＯＰＮ Ｃｈａｌｆ／ＧＳＴ、Ｎ−ｈａｌｆ及びＣ−ｈａｌｆはいずれもヘパリンとの結合能を有していないことが確認された。

また、ＨＳａｓｅＩ処理によってヘパラン硫酸を、ＣＳａｓｅＡＢＣ処理によってコンドロイチン硫酸をそれぞれ除去したＳｙｎ４Ｉｇを用い、これらに対する全長型ＯＰＮの結合能を上記の方法で測定したところ、ヘパラン硫酸が除去されたＳｙｎ４ＩｇのＯＰＮに対する結合能は減弱する一方、コンドロイチン硫酸が除去されたＳｙｎ４ＩｇのＯＰＮに対する結合能には変化が認められなかった（図９）。このことから、シンデカン−４は、ヘパラン硫酸を介してＯＰＮに結合することが分かる。

４）Ｓｙｎ４Ｉｇが結合したＯＰＮのトロンビン切断
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液と１０ｍＭ酢酸カルシウム溶液の等量混合液中に０．１５μｇの全長型ＯＰＮと０．３μｇのＳｙｎ４Ｉｇを混合し、３７℃で６０分間インキュベーションした後、トロンビン２ｕｎｉｔを加えて、さらに３０分間インキュベーションした。その後、ＯＰＮ ＥＬＩＳＡキット（ＩＢＬ社）を用いて、トロンビンで切断されずに残存している全長型ＯＰＮの量を測定したところ、Ｓｙｎ４Ｉｇの代わりに等量のＩｇＧを加えたコントロールと比較して有意に全長型ＯＰＮが残存しており、Ｓｙｎ４Ｉｇの結合によって、ＯＰＮのトロンビンに対する抵抗性が亢進していることが確認された（図１０）。

５）合成ペプチドとの結合
下記のアミノ酸配列からなるポリペプチド１〜６を、ペプチドシンセサイザー（ＳｙｒｏＩＩ、Ｍｕｌｔｉ ＳｙｎＴｅｃｈ社）を用いて合成、精製した。

ポリペプチド１：ＩＰＶＫＱＡＤＳＧＳＳＥＥＫＱ（配列番号６）
ポリペプチド２：ＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦ（配列番号３）
ポリペプチド３：ＶＶＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲ（配列番号２）
ポリペプチド４：ＫＳＫＥＥＤＫＨＬＫＦＲＩＳＨＥ（配列番号７）
ポリペプチド５：ＧＤＳＶＶＹＧ（配列番号８）
ポリペプチド６：ＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰＤＩＱＹＰＤＡ（配列番号９）

前記３）と同様にして、９６ウェルプレートに固相化したポリペプチド１〜６とヘパリンとの結合を定量化した（図１１）。その結果、ポリペプチド２と３がヘパリンと結合することが確認されたが、ＯＰＮのＣ末端側にその存在が推定されるヘパリン結合領域に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチド４にはヘパリンは結合しなかった。なお、結合反応中にヘパリンナトリウムを共存させることで上記のポリペプチドとヘパリンとの結合能は減弱した（図１２）ことから、ポリペプチドとヘパリンとの結合は非特異的結合ではないことが確認された。

６）細胞接着性
１０μｇ／ｍＬになるように０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液と１０ｍＭ酢酸カルシウム溶液の等量混合液で希釈した全長型ＯＰＮ、及び１０μｇ／ｍＬ全長型ＯＰＮと２０μｇ／ｍＬのＳｙｎ４Ｉｇの混合液をそれぞれ９６ウェルプレートに加え、４℃で一晩放置することで、各ペプチドをウェルに固相化し、０．５％ＴＢＳでブロッキングした。５×１０^４個／ｍＬのＣＨＯ細胞／０．２５％ＢＳＡを含むＤＭＥＭ培地２００μＬを各ウェルに加え、３７℃で１時間反応させた。０．５％ＴＢＳで２回ウェルを洗浄後、ウェルに残った接着細胞を０．５％クリスタルバイオレット／２０％メタノールで固定化し、染色した。蒸留水で３回洗浄後、２０％酢酸で転溶させ、５９０ｎｍの吸光度を測定して定量化を行った。その結果、Ｓｙｎ４Ｉｇと結合したＯＰＮとＣＨＯ細胞との間の細胞接着が有意に抑制された。

さらに、ヘパリチナーゼＩ処理によってヘパラン硫酸を、コンドロイチナーゼＡＢＣ処理によってコンドロイチン硫酸をそれぞれ除去したＳｙｎ４Ｉｇを用いて、これらが結合した全長型ＯＰＮのＣＨＯ細胞に対する接着能を上記の方法で測定したところ、ヘパラン硫酸が除去されたＳｙｎ４Ｉｇにおいては細胞接着能を示す一方、コンドロイチン硫酸が除去されたＳｙｎ４Ｉｇでは細胞接着能が抑制されることが確認された。このことから、シンデカン−４のヘパラン硫酸は、ＯＰＮのＧＲＧＤＳ配列を介したＣＨＯ細胞への接着能を抑制することが分かる。

また、５×１０^４個／ｍＬのＣＨＯ細胞に代えて、α４インテグリンを発現しているＣＨＯ細胞を利用して、上記と同様の実験を行ったところ、Ｓｙｎ４Ｉｇと結合したＯＰＮとα４インテグリンを発現しているＣＨＯ細胞との間の細胞接着が有意に抑制された。

ポリペプチドＨＳ１、ＢＳ１及びＢＳ３と、ブタ腎由来ヘパラン硫酸及びヘパリンとの結合能を示すグラフである。 ポリペプチドＨＳ１、ＢＳ１及びＢＳ３とブタ腎由来ヘパラン硫酸との結合能を示すグラフである。 ポリペプチドＨＳ１、ＢＳ１及びＢＳ３とヘパリンとの結合能を示すグラフである。 ポリペプチドＨＳ１とＢｉｏ−ＨＳを用いた、ＨＡ３０、ＨＳ３０、ブタ腎由来ヘパラン硫酸（ＰＫＨＳＤ１．１）、分子量１７〜１９ｋＤａのヘパリン、分子量４〜６ｋＤａのヘパリン（低分子量ヘパリン）及びアリクストラに対するスクリーニング結果を示すグラフである。 ポリペプチドＢＳ１とＢｉｏ−ＨＳを用いた、ＨＡ３０、ＨＳ３０、ブタ腎由来ヘパラン硫酸（ＰＫＨＳＤ１．１）、分子量１７〜１９ｋＤａのヘパリン、分子量４〜６ｋＤａのヘパリン（低分子量ヘパリン）及びアリクストラのスクリーニング結果を示すグラフである。 ポリペプチドＢＳ３とＢｉｏ−ＨＳを用いた、ＨＡ３０、ＨＳ３０、ブタ腎由来ヘパラン硫酸（ＰＫＨＳＤ１．１）、分子量１７〜１９ｋＤａのヘパリン、分子量４〜６ｋＤａのヘパリン（低分子量ヘパリン）及びアリクストラのスクリーニング結果を示すグラフである。 ＯＰＮ ｆｕｌｌ／ＧＳＴ、ＯＰＮ Ｎｈａｌｆ／ＧＳＴ及びＯＰＮ Ｃｈａｌｆ／ＧＳＴとヘパリンとの結合能を示すグラフである。 全長型ＯＰＮ及びＮ−ｈａｌｆとヘパリンとの結合能を示すグラフである。 Ｓｙｎ４Ｉｇと全長型ＯＰＮとの結合に対するヘパリチナーゼ（ＨＳａｓｅ）Ｉ処理及びコンドロイチナーゼ（ＣＳａｓｅ）ＡＢＣ処理の影響を示すグラフである。 Ｓｙｎ４Ｉｇと結合した全長型ＯＰＮの、トロンビン切断に対する抵抗性を示すグラフである。 ポリペプチド１〜６とヘパリンとの結合能を示すグラフである。 ヘパリンナトリウムのポリペプチド２とヘパリンとの結合能に与える影響を表すグラフである。

Claims (12)

1. 式：ＸｎＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦＺｎ（ただしＸｎ及びＺｎはそれぞれ不在か、又は１〜４個の任意のアミノ酸を表す）で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は担体に結合した当該ポリペプチドと試験物質とをインキュベーションする工程ａ）、及び前記ポリペプチドと試験物質とからなる複合体の形成を検出する工程ｂ）を含む、ヒトオステオポンチンの活性化を阻害する物質をスクリーニングする方法。
2. 前記工程ａ）のインキュベーションがグリコサミノグリカンの共存下で行われる、請求項１に記載の方法。
3. グリコサミノグリカンがヘパラン硫酸及び／又はヘパリンである、請求項２に記載の方法。
4. グリコサミノグリカンがラベル化されている、請求項２又は３に記載の方法。
5. 前記工程ｂ）の検出が、前記ポリペプチドと結合しているラベル化されたグリコサミノグリカンを測定することで行われる、請求項４に記載の方法。
6. 担体がタンパク質である、請求項１〜５の何れかに記載の方法。
7. 担体としてのタンパク質がＢＳＡ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ又はマルトース結合タンパク質である、請求項６に記載の方法。
8. ポリペプチドが、ＤＳＶＶＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰＤ（配列番号１）、ＶＶＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲ（配列番号２）又はＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦ（配列番号３）で示される何れかのアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１〜７の何れかに記載の方法。
9. ポリペプチドがＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項８に記載の方法。
10. 式：ＸｎＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦＺｎ（ただし、式中、Ｘｎ及びＺｎはそれぞれ不在か、又は１〜４個の任意のアミノ酸を表す）で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又は当該ポリペプチドが結合した担体と、ラベル化されたグリコサミノグリカンを含む、ヒトオステオポンチンの活性化を阻害する物質をスクリーニングするためのキット。
11. ポリペプチドが、ＤＳＶＶＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲＰＤ（配列番号１）、ＶＶＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦＲＲ（配列番号２）又はＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦ（配列番号３）で示される何れかのアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１０に記載のキット。
12. ポリペプチドがＹＧＬＲＳＫＳＫＫＦ（配列番号３）で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１１に記載のキット。

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