KR102417845B1 - 시알산 화합물이 결합된 바이러스 수용체 모방 화합물 - Google Patents

시알산 화합물이 결합된 바이러스 수용체 모방 화합물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바이러스 수용체 모방 화합물에 관한 것으로, 일측에 시알산 화합물을 가지고 있어 바이러스에 대한 결합능을 가지고 있고, 다른 일측은 지질을 포함하는것을 특징으로 하는데, 이를 이용해 바이러스 감염증의 치료에 널리 활용할 수 있을 것이다.

Description

시알산 화합물이 결합된 바이러스 수용체 모방 화합물 {A viral receptor mimic compound bound with sialic acid compounds}
본 발명은 시알산 (sialic acid) 화합물이 결합된 바이러스 수용체 모방 화합물 및 이 바이러스 수용체 모방 화합물의 용도에 관한 것이다.
바이러스는 유기체의 살아있는 세포를 통해 생명활동을 하는 것을 특징으로 하는데, 이를 통해 다양한 질환을 일으킨다. 바이러스가 일으키는 대표적인 질환으로 후천성면역결핍증, 독감, 간염, 간암, 자궁경부암, 종양, 유행성 출혈열, 호흡기 질환, 식중독, 폐렴 등이 있다.
지금까지 개발된 바이러스 감염증 치료제로는 아만타딘 (amantadine) 또는 리만타딘 (rimantadine)계열의 M2 이온 채널 억제제 (M2 ion channel inhibitor), 오셀타미비르 (oseltamivir, 상품명 타미플루) 또는 자나미비르 (zanamivir, 상품명 리렌자) 계열의 뉴라미니데이즈 (neuraminidase) 억제제가 알려져 있으나, 이들 치료제는 그의 효과가 제한된다는 문제점이 있었다. 즉, 아만타딘 또는 리만타딘 계열의 유도체 화합물은 이에 대한 저항성 변종 바이러스가 빠르게 생성되고, 일부 지역에서 검출된 H5N1 타입의 인플루엔자 바이러스는 아만타딘 또는 리만타딘 계열의 화합물에 대하여 내성을 나타내며, 인플루엔자 B 바이러스는 아만타딘 유도체에 민감하지 않다고 알려져 있다. 또한, 오셀타미비르 또는 자나미비르 계열의 유도체 화합물 역시 이에 대한 저항성 바이러스가 증가하고 있다.
따라서, 상기와 같은 바이러스의 내성 문제를 해결할 수 있는 다양한 바이러스 치료방법이 필요하다.
대한민국 공개특허 제10-2021-0101792 (공개일자: 2021.08.19)에는 비드 표면에 코팅되어 있는 시알산 및 갈락토스 복합체가 포함된 마그네틱 비드로 인플루엔자 바이러스를 포획할 수 있음이 기재되어 있다. 대한민국 등록특허 제10-2065575 (공개일자: 2020.01.07)에는 시알산, 시알릴락토오스 또는 이들의 유도체가 포함된 결합체가 바이러스의 표면에 존재하는 헤마글루티닌과 결합하여 바이러스의 감염과정을 억제할 수 있음이 기재되어 있다.
본 발명에서는 바이러스 결합능이 우수한 바이러스 수용체 모방 화합물을 개발하고자 하며, 이 바이러스 수용체 모방 화합물의 용도를 제공하고자 한다.
본 발명은 제1형태로, 시알산 (sialic acid)에 갈락토오스 (galactose) 및 글루코오스 (glucose)가 결합되어 있는 시알산 화합물과, 아민기 (amine group, -NH2) 또는 아미노옥시기 (aminooxy group, NH2-0-)를 일측에 구비하고, 지질과 결합할 수 있는 작용기를 타측에 구비한 고분자인 스페이서 (spacer)가 상호 결합하여 형성된 바이러스 수용체 모방 화합물을 제공한다.
또한, 상기 제1형태의 본 발명 바이러스 수용체 모방 화합물에 있어서, 상기 지질과 결합할 수 있는 작용기는 바람직하게 티올기 (thiol group, -SH)인 것이 좋다.
또한, 상기 제1형태의 본 발명 바이러스 수용체 모방 화합물에 있어서, 상기 바이러스 수용체 모방 화합물은 바람직하게 스페이서에 인지질 (phospholipid) 또는 지방산(fatty acid) 중 선택되는 어느 한 개의 지질 (lipid)이 결합되어 있는 것이 좋다.
한편, 본 발명은 제2형태로, 시알산 (sialic acid)에 갈락토오스 (galactose) 및 글루코오스 (glucose)가 결합되어 있는 시알산 화합물과, 아민기 (amine group, -NH2) 또는 아미노옥시기 (aminooxy group, NH2-0-)를 일측에 구비하고 카르복실기 (carboxyl group, -COOH) 작용기를 타측에 구비하며 지질과 결합할 수 있는 고분자인 스페이서 (spacer)가 결합하여 형성된 바이러스 수용체 모방 화합물을 제공한다.
또한, 상기 제2형태의 본 발명 바이러스 수용체 모방 화합물에 있어서, 상기 바이러스 수용체 모방 화합물은 바람직하게 일측에 상기 스페이서의 카르복실기 (carboxyl group, -COOH) 말단과 결합할 수 있는 작용기를 가지고 있고, 타측에 지질과 결합할 수 있는 작용기를 갖는 화합물인 앵커가 결합되어 있는 것이 좋다.
또한, 상기 제2형태의 본 발명 바이러스 수용체 모방 화합물에 있어서, 상기 앵커는 바람직하게 지질과 결합할 수 있는 작용기로 티올기를 가진 것이 좋다.
한편, 상기 제2형태의 본 발명 바이러스 수용체 모방 화합물은 바람직하게 앵커에 지질 (phospholipid) 또는 지방산(fatty acid) 중 선택되는 어느 한 개의 지질 (lipid)이 결합되어 형성된 것이 좋다.
또한, 상기 제1형태 또는 제2형태의 본 발명 바이러스 수용체 모방 화합물에 있어서, 상기 스페이서는 바람직하게 라이신 (lysine)을 매개로 하여 복수개의 스페이서가 결합되어 형성된 스페이서 복합체인 것이 좋다.
한편, 상기 라이신은 바람직하게 복수개의 라이신이 상호 결합되어 형성된 라이신 복합체인 것이 좋다.
또한, 상기 제1형태 또는 제2형태의 본 발명 바이러스 수용체 모방 화합물에 있어서, 상기 시알산 화합물과 스페이서는 바람직하게 시알산 화합물 내 글루코오스의 알데하이드기 (aldehyde group)와 스페이서의 아민기가 반응하여 2차 아민 (secondary amine) 결합을 형성함으로써 결합하거나, 시알산 화합물 내 글루코오스의 알데하이드기 (aldehyde group)와 스페이서의 아미노옥시기 (aminooxy group, NH2-0-)가 반응하여 옥심 (oxime) 결합을 형성함으로써 결합하는 것이 좋다.
또한, 상기 제1형태 또는 제2형태의 본 발명 바이러스 수용체 모방 화합물에 있어서, 상기 시알산 화합물은 바람직하게 갈락토오스 및 글루코오스가 결합되어 있는 이당 형태를 한 세트로 해서 이 세트가 복수개 반복되는 올리고당이 시알산에 결합되어 있는 화합물인 것이 좋다.
또한, 상기 제1형태 또는 제2형태의 본 발명 바이러스 수용체 모방 화합물에 있어서, 상기 시알산 화합물은 바람직하게 시알릴락토오스 (sialyllactose)인 것이 좋다.
한편, 상기 시알릴락토오스는 바람직하게 3'-시알릴락토오스 또는 6'-시알릴락토오스인 것이 좋다.
또한, 상기 제1형태 또는 제2형태의 본 발명 바이러스 수용체 모방 화합물에 있어서, 상기 지질은 바람직하게 말레이미드기 (maleimide group, H2C2(CO)2N-), 피리딜다이설파이드기 (pyridyl disulfide, Py-S-S-), 할로아세틸기 (haloacetyl, X-CH2-CO-), 아크릴로일기 (acryloyl, H2C=CH-CO-), 비닐기 (vinyl, H2C=CR-) 중 선택되는 어느 하나의 작용기를 갖는 것이 좋다.
본 발명의 바이러스 수용체 모방 화합물은 바이러스 결합능이 우수하고, 이를 이용한 경우 효과적으로 바이러스를 억제할 수 있는 약물을 개발할 수 있다.
도 1은 본 발명의 바이러스 수용체 모방 화합물의 구조 이해를 위한 개략적인 모식도이다.
도 2는 본 발명의 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (SL-M) 및 다중 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (SL-T)의 합성 과정를 보여주는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 단일 가닥 링커, 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (SL-M), 다중 가닥 링커 및 다중 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (SL-T)의 ESI MS 결과를 보여준다.
도 4는 본 발명의 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (SL-M)의 1H-NMR 결과를 보여준다.
도 5는 본 발명의 다중 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (SL-T)의 1H-NMR 결과를 보여준다.
도 6은 본 발명의 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (SL-M) 및 다중 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (SL-T)이 가지는 바이러스와의 결합력 (affinity)를 확인하기 위한 표면 플라즈몬 공명 (Surface plasmon resonance - SPR) 분석 결과를 보여준다.
도 7은 본 발명의 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (SL-M)과 나노천공자 (Nanodisc)를 결합하는 과정을 보여준다.
도 8은 본 발명의 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (SL-M)와 나노천공자 (Nanodisc)의 결합생성 부산물인 pyridine-2-thione(P2T)를 이용하여 합성된 나노천공자가 가지고 있는 총 lipid에 대한 단일 가닥 수용체를 갖는 lipid의 비율 계산을 위해 측정한 흡광도 측정 결과이다.
도 9는 본 발명의 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (SL-M)과 나노천공자 (Nanodisc)를 결합 후 FPLC (Fast protein liquid chromatography)을 통해 결합 생성 부산물을 분리하는 것을 보여준다.
도 10은 본 발명의 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물이 결합된 나노천공자 (ND2,3SL)를 바이러스에 처리하여 얻는 결과이다.
도 11은 본 발명의 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물이 합성된 나노천공자 (ND2,6SL; ND2,3SL;)가 가지는 바이러스 스트레인에 따른 결합력 (affinity)를 확인하기 위한 표면 플라즈몬 공명 (Surface plasmon resonance - SPR) 분석 결과를 보여준다.
도 12는 본 발명의 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (SL-M) 및 다중 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (SL-T)을 Maleimide lipid와 결합하는 과정을 보여주는 모식도이다.
도 13은 본 발명의 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드(이하, '바이러스 수용체 모방 화합물 리피드'는 지질이 결합된 바이러스 수용체 모방 화합물을 지칭하는 것으로 함)의 H-NMR 결과를 보여준다.
도 14는 본 발명의 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드의 바이러스에 대한 결합능을 확인하기 위한 HI assay 결과를 보여준다.
도 15는 본 발명의 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드의 바이러스에 대한 억제능을 확인하기 위한 MUNANA assay 결과를 보여준다.
도 16은 3'-시알릴락토오스가 붙어있는 옥심 (oxime) 결합 기반 바이러스 수용체 모방 화합물의 H-NMR 결과를 보여준다.
도 17은 6'-시알릴락토오스가 붙어있는 옥심 (oxime) 결합 기반 바이러스 수용체 모방 화합물의 H-NMR 결과를 보여준다.
도 18은 옥심화 결합 기반의 수용체의 결합 조건 최적화를 위해 서로 다른 반응 조건 ((a) pH 4.6 acetate buffer, (b) Methanol, 0.1% acetic acid)으로 결합시킨 옥심화 결합 기반 수용체의 HPLC 분석 결과이다.
도 19는 반응 조건의 최적화 후의 링커의 아민 말단 또는 아미노옥시 말단을 이용하여 시알릴락토오스가 결합된 바이러스 수용체 모방 화합물의 합성과정을 보여주는 모식도이다.
도 20은 아미노옥시-다중가닥 기반 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드의 합성과정을 보여주는 모식도이다.
도 21은 3'-시알릴락토오스가 포함된 옥심결합 기반 다중가닥 바이러스 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드의 1H-NMR 결과를 보여준다.
도 22는 6'-시알릴락토오스가 포함된 옥심결합 기반 다중가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드의 1H-NMR 결과를 보여준다.
도 23은 본 발명의 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드가 이용하는 스페이서 길이에 따른 효과를 비교하기 위해 사용한 스페이서의 길이를 표시한 도면이다.
도 24는 본 발명의 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드가 이용한 스페이서의 존재 유무 및 길이 차이에 따른 바이러스 표면 단백질 (헤마글루티닌)과의 결합력을 보여주는 도면이다.
본 발명은 제1형태로 시알산 (sialic acid)에 갈락토오스 (galactose) 및 글루코오스 (glucose)가 결합되어 있는 시알산 화합물과, 아민기 (amine group, -NH2) 또는 아미노옥시기 (aminooxy group, NH2-0-)를 일측에 구비하고, 지질과 결합할 수 있는 작용기를 타측에 구비한 고분자인 스페이서 (spacer)가 상호 결합하여 형성된 바이러스 수용체 모방 화합물을 제공한다.
하기 본 발명의 실험에 의할 경우, 시알산 화합물에 스페이서가 결합되었음에도 불구하고, 시알산 화합물과 스페이서가 결합되어 형성된 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (SL-M)에 바이러스 결합능이 있음을 확인할 수 있었다. 즉, 스페이서가 존재하고, 더 나아가 그 길이가 길어질수록 바이러스 표면 단백질 (헤마글루티닌)과의 결합력이 달라질 수 있음을 실시예 13을 통해 확인할 수 있었다.
상기 제1형태의 본 발명 바이러스 수용체 모방 화합물에 있어서, 상기 지질과 결합할 수 있는 작용기는 바람직하게 티올기 (thiol group, -SH)를 사용할 수 있다. 티올기는 다른 작용기에 비해 화학선택적(chemoselective) 반응을 높은 선택능으로 형성시킬 수 있어, 지질이 이 위치에 특이적으로 결합시킬수 있게 하는 장점이 있다. 티올기는 말레이미드 또는 피리딜다이설파이드기 작용기를 갖는 지질과 결합하여 티올 (thiol) 결합을 형성할 수 있다.
한편, 본 발명은 제2형태로, 시알산 (sialic acid)에 갈락토오스 (galactose) 및 글루코오스 (glucose)가 결합되어 있는 시알산 화합물과, 아민기 (amine group, -NH2) 또는 아미노옥시기 (aminooxy group, NH2-0-)를 일측에 구비하고 카르복실기 (carboxyl group, -COOH) 작용기를 타측에 구비하며 지질과 결합할 수 있는 고분자인 스페이서 (spacer)가 결합하여 형성된 바이러스 수용체 모방 화합물을 제공한다.
본 발명의 제2형태에서 사용되는 스페이서는 지질에 결합할 수 있는 고분자인데, 일측에 아민기 (amine group, -NH2) 또는 아미노옥시기 (aminooxy group, NH2-0-)를 가지고 있고, 타측에 카르복실기 (carboxyl group, -COOH) 작용기를 가지고 있다. 아민기 (amine group, -NH2) 또는 아미노옥시기 (aminooxy group, NH2-0-)를 통해 시알산 화합물과 결합한다. 또한, 지질은 상기 카르복실기를 통해 연결될 수 있다. 바람직하게는 지질과의 선택적 결합을 위해, 일측에 상기 스페이서의 카르복실기 (carboxyl group, -COOH) 말단과 결합할 수 있는 작용기를 가지고 있고, 타측에 지질과 결합할 수 있는 작용기를 갖는 화합물인 앵커를 사용할 수 있다. 앵커가 사용되는 경우, 앵커는 스페이서와 지질 사이에 위치(매개)하여 이들을 결합시키는 역할을 수행한다. 앵커로는 바람직하게 시스테인(cystein)을 사용하는 것이 좋다.
한편, 상기 앵커에 있어서, 지질과 결합할 수 있는 작용기의 일 예로는 티올기 (thiol group, SH-), 아지도기 (azido group, N3-), 알키닐기 (alkynyl group, HC≡C-), 메틸케톤기 (methylketone, CH3CO-) 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.
티올기는 지질의 말레이미드기 (maleimide group, H2C2(CO)2N-), 할로아세틸기 (haloacetyl, X-CH2-CO-), 아크릴로일기 (acryloyl, H2C=CH-CO-), 비닐기 (vinyl, H2C=CR-)와 티오에테르 (thioether) 결합을 하거나, 지질의 피리딜다이설파이드기 (pyridyl disulfide, Py-S-S-)와 이황화 (disulfide) 결합을 할 수 있다. 아지도기는 지질의 알키닐기 (alkynyl group, HC≡C-)와 트라이아졸 (triazole) 결합을 할 수 있다. 알키닐기는 지질의 아지도기 (azido group, N3-)와 트라이아졸 (triazole) 결합을 할 수 있다. 메틸케톤기는 지질의 하이드라지노기 (hydrazino, NH2-NH-)와 하이드라자이드 (hydrazide) 결합을 할 수 있다.
따라서, 상기 앵커 일측에 결합되는 지질 (lipid)은 바람직하게 앵커와 결합하기 위해 알키닐기 (alkynyl group, HC≡C-), 아지도기 (azido group, N3-), 하이드라지노기 (hydrazino, NH2-NH-), 말레이미드기 (maleimide group, H2C2(CO)2N-), 할로아세틸기 (haloacetyl, X-CH2-CO-), 아크릴로일기 (acryloyl, H2C=CH-CO-), 비닐기 (vinyl, H2C=CR-), 피리딜다이설파이드기 (pyridyl disulfide, Py-S-S-) 중 선택되는 어느 하나의 작용기를 가지고 있는 것이 좋다.
한편, 상기 제1형태 또는 제2형태의 바이러스 수용체 모방 화합물은 스페이서에 인지질 (phospholipid) 또는 지방산(fatty acid) 중 선택되는 어느 한 개의 지질 (lipid)이 결합되어 있는 것이 좋다.
본 발명은 시알산 화합물에 스페이서가 결합되어 있고, 이 스페이서에 지질이 결합되어 있는 형태인데, 본 발명에서 지질은 본 발명의 바이러스 수용체 모방 화합물이 별도의 구조체에 안정되게 결합하는 역할을 수행한다. 즉, 별도의 구조체가 예로서, 인지질로 구성된 미셀 (micelle), 리포좀, 나노디스크 또는 본 발명자가 대한민국 등록특허 10-2181991호에서 등록받은 나노천공자인 경우, 본 발명의 바이러스 수용체 모방 화합물에 존재하는 지질은 그 구조체를 구성하는 인지질 사이에 끼어 들어가 인지질과 소수성 결합을 형성함으로써 인지질 내에서 안정하게 자리잡을 수 있는 것이다. 이를 통해 본 발명의 바이러스 수용체 모방 화합물은 구조적으로 한층 안정화될 수 있고, 또한 바이러스 치료제에 있어서, 바이러스 수용체 모방 화합물로서의 역할도 훌륭히 수행할 수 있게 된다.
한편, 상기 제1형태 또는 제2형태의 바이러스 수용체 모방 화합물에 있어서, 스페이서는 바람직하게 '일측에 상기 폴리에틸렌글리콜의 카르복실기 (carboxyl group, -COOH) 말단과 결합할 수 있는 작용기를 가지고 있고, 타측에 상기 폴리에틸렌글리콜의 아민기 (amine group, -NH2) 또는 아미노옥시기 (aminooxy group, NH2-0-) 말단과 결합할 수 있는 작용기를 가진 화합물'을 매개로 하여, 복수개의 스페이서가 결합되어 스페이서 복합체 형태로 사용하는 것이 좋다 (도 1 참조). 이와 같은 구조를 가질 경우, 본 발명의 단위 바이러스 수용체에 2개 이상의 폴리에틸렌글리콜을 부착시킬 수 있는 장점이 있다. 더욱 바람직하게는, 복수개의 '폴리에틸렌글리콜의 카르복실기 (carboxyl group, -COOH) 말단과 결합할 수 있는 작용기를 가지고 있고, 타측에 상기 폴리에틸렌글리콜의 아민기 (amine group, -NH2) 또는 아미노옥시기 (aminooxy group, NH2-0-) 말단과 결합할 수 있는 작용기를 가진 화합물'(일 예로, 라이신(lysine))을 매개로 하여, 복수개의 스페이서가 결합된 스페이서 복합체 형태로 사용하는 것이 더욱 좋다. 이와 같은 구조를 가질 경우, 본 발명의 단위 바이러스 수용체에 2개 이상의 폴리에틸렌글리콜 및 시알산 화합물을 부착시킬 수 있다.
이러한 구조가 가능한 이유는 본 발명에서 사용되는 라인신이 일측에 알파(alpha) 및 앱실론(epsilon) 아민 작용기를 가지고, 타측에 카르복실기를 가지고 있기 때문이다. 이로 인해 라이신의 알파(alpha) 또는 앱실론(epsilon) 아민기는 본 발명 스페이서 (시알산 화합물이 결합된 스페이서)의 카르복실기와 아마이드 결합을 형성할 수 있다. 또한, 라이신의 카르복실기는 또 다른 스페이서의 아민기와 결합하여 아마이드 결합을 형성할 수 있다.
또한, 더 나아가 라이신이 2개 이상 분지된 형태로 결합될 경우, 스페이서 (시알산 화합물이 결합된 스페이서)를 복수개 결합시킬 수 있다. 분지된 형태의 라이신은 복수개의 라이신이 그들 상호 간에 아민기와 카르복실기 사이에 아마이드 결합을 형성하여 만들어 질 수 있다 (도 1 참조). 이를 통해 스페이서 (시알산 화합물이 결합된 스페이서)를 다중 가닥으로 형성시킬 수 있다. 이 경우, 본 발명의 단위 바이러스 수용체 모방 화합물 당 더욱 많은 시알산을 부착시킬 수 있게 된다. 하기 실시예에 따르면, 일 예로 4중층을 형성하면, 단층으로 형성된 바이러스 수용체 모방 화합물 보다 더욱 뛰어난 바이러스 부착능을 가짐을 실험적으로도 확인할 수 있었다.
한편, 본 발명에서는 상기 시알산 (sialic acid)에 갈락토오스 (galactose) 및 글루코오스 (glucose)가 결합되어 있는 시알산 화합물을 사용한다. 시알산은 바람직하게 갈락토오스에 결합되어 있는 것이 좋다. 또한, 갈락토오스 및 글루코오스가 결합되어 있는 이당 형태는 특정한 형태로 반드시 한정되는 것은 아니나, 바람직하게 락토오스인 것이 좋다. 또한, 갈락토오스 및 글루코오스가 결합되어 있는 이당 형태 (바람직하게 락토오스)를 한 세트로 해서 이 세트가 복수개 반복되는 올리고당이 시알산에 결합되어 있는 화합물도 사용할 수 있다.
한편, 본 발명의 시알산 화합물로는 바람직하게 시알릴락토오스를 사용할 수 있는데, 3'-시알릴락토오스는 조류 감염 바이러스에 대한 결합능이 높고, 6'-시알릴락토오스는 인간 감염 바이러스에 대한 결합능이 높은 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명에서는 적용 대상에 따라서 3'-시알릴락토오스 또는 6'-시알릴락토오스를 선택적으로 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 바이러스 수용체 모방 화합물은 바이러스에 대한 결합능을 이용할 수 있는 모든 바이러스에 사용할 수 있는데, 일 예로 버니아비리데 (Bunyaviridae), 코로나비리데 (Coronaviridae), 필로비리데 (Filoviridae), 플라비비리데 (Flaviviridae), 헤파드나비리데 (Hepadnaviridae), 헤르페스비리데 (Herpesviridae), 오스소믹소비리데 (Orthomyxoviridae), 폭스비리데 (Poxviridae), 랍도비리데 (Rhabdoviridae), 레트로비리데 (Retroviridae), 토가비리데(Togavi ridae), 또는 헤르페스비리데 (Herpesviridae) 등의 과 (family) 에 속하는 바이러스가 될 수 있고, 다른 예로서, 버니아비리데 (Bunyaviridae) 과 에 속하는 시놈브레 한타바이러스 (SinNombre Hantavirus) 등; 코로나비리데 (Coronaviridae)과에 속하는 다양한 급성 호흡기 증후군에 관여하는 코로나 바이러스 (Coronavirus) 등; 필로비리데 (Filoviridae)과에 속하는 에볼라바이러스 (Ebola virus), 마르버그 바이러스 (Marburg virus) 등 ; 플라비비리데 (Flaviviridae)과에 속하는 웨스트닐 바이러스 (WestNile virus), 엘로우피버 바이러스 (YellowFever virus), 뎅기피버 바이러스 (Dengue Fever virus), C형 간염 바이러스 (Hepatitis C virus) 등; 헤파드나비리데 (Hepadnaviridae) 과에 속하는 B형 간염 바이러스 (Hepatitis B) 등; 헤르페스비리데(Herpesviridae) 과에 속하는 헤르페스 심플렉스 1 바이러스 (Herpes Simplex 1 virus), 헤르페스 심플렉스 2 바이러스 (Herpes Simplex 2 virus) 등; 오르소믹소비리데(Orthomyxoviridae) 과에 속하는 인플루엔자 바이러스 (Influenza virus) 등; 폭스비리데(Poxvir idae) 과에 속하는 스몰폭스 바이러스 (Smallpox virus), 백시니아바이러스 (Vaccinia virus), 몰루스컴콘타지오섬 바이러스 (Molluscum contagiosum virus), 멍키폭스 바이러스 (Monkeypox virus) 등 ; 랍도비리데 (Rhabdoviridae) 과에 속하는 라비스 바이러 (Rabies virus) 등; 레트로비리데 (Retroviridae)과에 속하는 HIV(Human Immunodef iciency virus) 등; 토가비리데 (Togaviridae)과에 속하는 치컹구니아 바이러스 (Chikungunya virus) 등; 헤르페스비리데 (Herpesviriae) 과에 속하는 수도라비에스 바이러스 (Pseudorabies virus), HHV 바이러스 등이 될 수 있다.
한편, 상기 시알산 화합물과 스페이서는 바람직하게 시알산 화합물 내 글루코오스의 알데하이드기 (aldehyde group)와 스페이서의 아민기가 반응하여 2차 아민 (secondary amine) 결합을 형성함으로써 결합하거나, 시알산 화합물 내 글루코오스의 알데하이드기 (aldehyde group)와 스페이서의 아미노옥시기 (aminooxy group, NH2-0-)가 반응하여 옥심 (oxime) 결합을 형성함으로써 결합할 수 있다.
한편, 본 발명에서 상기 스페이서는 바람직하게 에틸렌 글리콜 (ethylene glycol) 또는 이의 중합체를 사용하는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는 0.8 내지 1.2nm 길이의 것을 사용하는 것이 좋다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[실시예 1: 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (SL-M) 및 다중 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (SL-T)의 합성]
(1) 개요
본 실시예에서는 스페이서로 PEG (poly ethylene glycol)로서, 일측 말단에 아민기를 가지고 있고 타측 말단에 카르복실기를 갖는 9-amino-4,7-dioxanonanoic acid를 사용하고, 앵커로는 티올기를 가지는 시스테인(PEG의 카르복실기는 시알릴락토오스의 카르복실기와 동일한 반응특성을 가져서 선택적인 결합을 할 수 없기 때문에 화학선택적 (chemoselective) 반응이 가능한 티올기를 가진 앵커를 PEG의 카르복실기를 대체하기 위해 사용한다.)을 사용하여 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (SL-M) 및 다중 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (SL-T)을 합성하고자 하였다. 즉, 본 실시예에서는 '시알릴락토오스-PEG-시스테인'으로 구성되는 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (이하, 'SL-M'로 명명함) 및 '(시알릴락토오스-PEG)4-라이신3-PEG(스페이서)-시스테인'으로 구성되는 다중 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (이하, 'SL-T'로 명명함)을 합성하고자 했다. 이때, 시알릴락토오스의 알데히드기와 PEG의 아민기를 반응시키고 환원하여 2차 아민 (secondary amine) 결합을 유도하여 이들을 연결시켰다. 또한, PEG의 카르복실기와 시스테인의 아민기를 반응시켜 아마이드 (amide) 결합을 유도하여 이들을 연결시켰다.
한편, 시알릴락토오스는 시알산과 결합하는 갈락토오스의 알코올 그룹의 위치에 따라 3'-시알릴락토오스 (3'-SL)과 6'-시알릴락토오스 (6'-SL)이 존재하며, 각각은 인플루엔자 바이러스의 종에 따라 다른 선호도를 갖는다. 본 발명에서는, 여러 종류의 바이러스와의 affinity 및 억제능 차이를 확인하기 위해 3'-SL를 사용하였다.
한편, 본 실시예의 다중 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (SL-T)은 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물의 제조 방법에 라이신 (lysine)을 추가로 이용하여 합성해 입실론 아민을 추가해줌으로써 가닥을 늘려 나가는 전략을 통해 합성하였다.
한편, 이러한 상기 합성방법에 따른 과정을 도 2에 나타내었다.
2) 합성
링커(이하, '링커'는 본 발명의 바이러스 수용체 모방 화합물 구조에서 시알릴락토오스 및 지질이 결합되지 않은 상태를 지칭하는 것으로 함. 앵커는 포함)는 표준 Fmoc 기반 고체상 펩티드 합성방법에 의해 제조되었다.
2-클로로트리틸클로라이드 (2-CTC) 수지를 10분 간 DCM (dichloromethane) 용매로 팽윤시켰다. 그 후, Fmoc-Cys(Trt)-OH (3 당량) 및 DIPEA (N,N-diisopropylethylamine)(3 당량)을 DCM (dichloromethane) 용매에서 2-CTC 수지와 실온에서 3시간 동안 반응시켰다. 이어서 수지의 미반응 기능기를 메탄올로 30분 동안 말단-캡핑하였다. Fmoc기를 25%(v/v) 4-methylpyperidine/NMP (N-methyl-2-pyrrolidone) 용액으로 30분 동안 제거하고, 수지를 DMF (dimethylformamide) (x2), DCM (x3), MeOH (x3) 및 DMF (x2)로 세척하였다.
상기 수지를 9-[(9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonylamino]-4,7-dioxanonanoic acid, DIC 및 HOBt (각 3당량)와 NMP 용매 조건에서 상온에서 반응시켰다. 수지 상에서의 완전한 합성 후, 실온에서 2시간 동안 82.5% TFA, 5% 물, 5% 페놀, 5% 티오아니솔 및 2.5% 1,2-에탄디티올의 혼합물을 사용하여 수지로부터 단일 가닥 링커인 ADON-Cys 링커를 절단하였다.
회전식 증발기를 사용하여 용매를 제거한 후, 미정제 생성물을 빙냉 디에틸 에테르 (30 배 부피)로 침전시켜 미정제 생성물을 원심분리를 통해 수집하여 백색 고체를 수득하였다. 링커를 semi-preparative HPLC로 > 95 % 순도로 추가 정제하였다 (수율 > 85%). 이후, 환원성 아민화 (reductive amination)를 통해 3'-시알릴 락토오스 또는 6'-시알릴 락토오스를 링커에 결합시킴으로써 단일 가닥 수용체를 합성하고자 하였다. 환원성 아민화 반응은, 상기 단일 가닥 링커와 시알릴 락토오스(3 당량)의 pH 8.7 borate 버퍼 용액에 NaCNBH3 (1 당량)을 매일 한 차례 반응 혼합물에 첨가하면서 자기 교반 (400 rpm)으로 3 일 동안 50 ℃에서 진행하였다. 이후 semi-prep HPLC로 정제하여 단일 가닥 수용체 (3'-SL-M 또는 6'-SL-M)를 얻었다.
[실시예 2: 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (SL-M) 및 다중 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (SL-T)의 분석]
1) ESI - MS 분석
ESI MS 분석을 통해 링커 및 바이러스 수용체 모방 화합물의 합성 결과를 확인하였다. (도 3)
도 3의 a는 단일 가닥 링커, b는 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (SL-M, 링커에 시알릴락토오스가 결합된 형태), c는 다중 가닥 링커, d는 다중 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (SL-T, 링커에 시알릴락토오스가 결합된 형태)의 분석 결과를 나타낸다.
단일 가닥 링커에 3'-시알릴락토오스을 붙친 경우에 비하여, 다중 가닥 링커에 3'-시알릴락토오스를 붙친 경우 더욱 큰 분자량 증가량을 보여주는데, 이는 단일 가닥 링커 보다 다중 가닥 링커에 더욱 많은 3'-시알릴락토오스가 붙은 것을 의미한다.
2) H-NMR 분석
단일 및 다중 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물에 대한 1H-NMR 스펙트럼 분석을 수행하였다. 700 MHz NMR을 사용하여 중수소 옥사이드(D2O) 용매에 시료를 녹여 분석하였다. (도 4, 도 5)
도 4는 3'-시알릴락토오스가 붙은 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물(3'-SL-M)에 대한 NMR 스펙트럼을, 도 5는 3'-시알릴락토오스가 붙은 다중 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (3'-SL-T)에 대한 NMR 스펙트럼을 보여준다.
H-NMR 스펙트럼 결과를 통해, 링커의 델타 카본이 갖는 1.45 ppm과 SL(sialyllactose)의 아세틸기에 해당하는 2.07 ppm을 비교하여 링커에 결합된 SL의 양을 산출하였다. 이를 통해, 3'-SL이 결합된 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (3'-SL-T)은 거의 완벽하게 정량적으로(~100%) 아민 그룹에 시알릴락토오스가 결합된 것을 확인하였고, 3'-SL이 결합된 다중 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (3'-SL-M)은 약 97.5%의 아민 그룹에 시알릴락토오스가 결합된 것을 확인하였다.
[실시예 3: 단일 가닥 및 다중 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물의 바이러스 결합력 (affinity) 분석]
먼저 각 바이러스 수용체 모방 화합물 (3'-SL-M, 3'-SL-T)의 시스테인 말단에 maleimide-PEG2-biotin을 결합하여 바이오틴을 도입하였다. SPR 분석을 위해 gold chip에 streptavidin을 고정화하고 (도 6a), 이 위에 3'-SL-M-biotin과 3'-SL-T-biotin 용액(in phospate buffer pH 7.4)을 흘려줌으로써 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (3'-SL-M)과 다중 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (3'-SL-T)을 표면에 도입하였다 (도 6b). 이후, 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (3'-SL-M)과 다중 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (3'-SL-T)을 고정화된 표면에 같은 농도의 PR8 (Puerto/rico/8 H1N1) 바이러스를 처리하였다. 둘 다 바이러스 결합능을 확인할 수 있었고, 다중 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (3'-SL-T)의 결합력이 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (3'-SL-M)에 비해 약 3배 이상 높게 측정되었다 (도 6c).
[실시예 4: 이황화 결합 (disulfide bond)을 이용한 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물과 나노천공자 (Nanodisc)의 합성]
본 실시예에서 사용한 나노천공자 (Nanodisc)는 PDP-PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[3-(2-pyridyldithio)propionate])를 인지질 성분 중 하나로 사용하여 (대한민국 등록특허 10-2181991호에서 사용한 POPC(1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)의 1/5 -mol 비율 기준-을 PDP-PE로 대체하여 사용) 대한민국 등록특허 10-2181991호에 기재된 방법으로 제조한 것을 사용하였다.
이 나노천공자는 인지질 성분 중 하나로 PDP-PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[3-(2-pyridyldithio)propionate])를 사용하였는데, PDP-PE에 포함되어 있는 pyridyl disulfide 작용기는 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물(SL-M)에 존재하는 티올기와 pH 7.4 phosphate buffer saline에서 촉매없이 반응하여 이황화 결합 (disulfide bond)을 형성한다. 이와 같이 지질이 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물에 결합됨으로써 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드(이하, '바이러스 수용체 모방 화합물 리피드'는 지질이 결합된 바이러스 수용체 모방 화합물을 지칭하는 것으로 함)가 형성된다. 이에 따른 반응 모식도를 도 7에 나타내었다. 이때, 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물은 3'-SL이 붙은 것과, 6'-SL이 붙은 것을 각각 사용하였다.
이황화 결합 반응 부산물인 pyridine-2-thione (P2T)은 342 nm에서 흡광도를 갖는다. 이를 측정함으로써 나노천공자가 가지고 있는 총 지질에 대한 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물을 갖는 지질의 비율을 계산할 수 있었다. (도 8)
계산해 보면, 3'-SL 단일 가닥 바이러스 바이러스 수용체 모방 화합물을 갖는 나노천공자 (ND2,3'-SL)는 나노천공자 내 존재하는 PDP-PE의 44%의 비율로 결합된 것을 확인할 수 있고, 6'-SL이 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물을 갖는 나노천공자 (ND2,6'-SL)는 41.5%의 비율로 결합된 것을 확인할 수 있었다.
이후 FPLC (Fast protein liquid chromatography)를 통해, pyridine-2-thione (P2T)를 제거함으로써 온전한 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물이 결합된 나노천공자 (ND2,6'-SL 및 ND2,3'-SL)를 얻을 수 있었다. (도 9)
도 9의 Elution volume 12mL는 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물이 합성된 나노천공자 (ND2,6'-SL; ND2,3'-SL)를 의미하고, Elution volume 30mL은 pyridine-2-thione (P2T)를 의미한다.
[실시예 5: 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (SL-T)에 지질이 결합된 본 발명의 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드가 결합된 나노천공자(ND2,6'-SL; ND2,3'-SL;)의 항 바이러스 효능 실험]
Ganglioside를 수용체로 사용하는 기존 나노퍼포레이터는 일부 strain의 인플루엔자 바이러스에 대해 항 인플루엔자 효과를 나타내지 않는 문제를 가지고 있는데, 시알릴락토오스를 수용체로 이용한 경우 이러한 문제를 해결할 수 있는지 확인해보고자 했다.
이를 위해 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (SL-T)에 지질이 결합된 본 발명의 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드가 결합된 나노천공자 (ND2,6'-SL; ND2,3'-SL)와 바이러스 PR8 (H1N1), Sydney (H3N2), AIV (H5N2), X-31 (H3N2)을 이용하여 plaque reduction assay를 수행하였다(세포 병변 효과(바이러스에 의한 plaque 형성)를 얼마나 억제하는지를 분석하는 에세이). 실험 결과, ND2,6'-SL'의 경우 Ganglioside를 수용체로 사용하는 기존 나노천공자에서 효과를 보지 못한 X-31 strain에 대해 항바이러스 효과를 가지는 것을 확인할 수 있었다 (도 10).
추가적으로 단일 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (3'-SL-M, 6'-SL-M)의 X31(H3N2), PR8(H1N1) 바이러스 스트레인에 대한 결합능을 확인하기 위해 SPR binding assay를 수행하였다. (도 11). 도 11을 보면, 3'-시알릴락토오스 (3'-SL)를 바이러스 수용체 모방 화합물로 사용하는 경우 PR8 (H1N1)에 결합 능력이 좋은 것을 확인할 수 있다.
또한, 6'-시알릴락토오스 (6'-SL)를 수용체로 사용하는 경우, X-31 (H3N2)에 대해 결합 능력이 좋은 것을 확인할 수 있었다. 이는 상기 항바이러스 효과 실험과 일치하는 결과이다.
[실시예 6: 티오에테르 결합 (thioether bond)을 이용한 바이러스 수용체 모방 화합물 (SL-St) 제조]
1) 개요
상기 실시예 4와 같이 PDP-PE를 이용하여 앵커로 사용된 시스테인에 이황화 결합을 형성시킨 경우 환원 (reduction) 조건에서 이황화 결합이 분리될 수 있는 단점을 가지고 있다. 이는 나노천공체의 정제에 있어서도 영향을 줄 수 있기 때문에, 보다 안정한 공유결합을 이용하여 시스테인을 지질에 결합하고자 했다.
먼저 고체상 합성을 통해 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine (TEG)과 stearic acid (ST)를 결합하고, N-Succinimidyl 3-Maleimidopropionate (NHS-MAL)을 TEG-ST의 아민기에 반응시켜 말레이미드 (maleimide)를 도입하는 과정을 통해 말레이미드 (maleimide) 작용기를 가지는 지질 (maleimide-TEG-St)을 합성할 수 있었다. 이후 지질의 말레이미드기와 SL-M 또는 SL-T의 말단 시스테인의 티올기 간 반응을 통해 티오에테르 결합 (thioether bond)을 형성시켜 단일 및 다중 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물과 지질을 결합하였다. 이러한 상기 합성방법에 따른 모식도를 도 12에 나타내었다.
2) 합성
스테아린산의 말단에 티올 그룹에 반응성이 있는 말레이미드 그룹을 도입하고자 표준 고체상 합성 방법을 이용하였다. 2-CTC 수지에 커플링된 4, 7, 10-트리옥사-1, 13-트리데칸디아민 (TEG diamine)의 말단 아민기에 스테아르산을 아마이드 생성반응을 이용하여 결합하여 스테아릴-TEG-CTC (St-TEG-CTC)를 생성했다. 구체적으로, 2-CTC 수지를 건조 DCM에 용해된 TEG diamine (40 equiv.) 및 DIPEA (3 equiv.)로 2시간 동안 처리하여 TEG diamine을 수지에 로딩하였다.
반응이 끝났을 때 수지의 결합되지 않은 반응성 그룹을 메탄올로 30분 동안 말단 캡핑했다. 이어서, 스테아르산, DIC, HOBt의 NMP 용액 (수지상의 작용기에 대해 각각 3 당량)을 수지에 첨가한 후 실온에서 혼합물을 진탕하여 커플링 반응을 수행하였다. 카이저 닌히드린 시험에 의해 커플링을 확인하였다.
합성이 완료된 후, 95% TFA, 5% 물의 혼합물 용액을 사용하여 2.5시간 St-TEG-NH2를 수지로부터 절단하였다.
스테아릴-말레이미드 (MAL-TEG-St)는 스테아릴-TEG 아민(St-TEG-NH2)에 N-숙신 이미딜 3-말레이미도 프로피오네이트 (BMPS)를 첨가하여 합성하였다. MAL-TEG-St 및 BMPS를 건조 클로로포름에 용해시키고 둥근 바닥 플라스크에서 혼합하였다. 혼합물을 3시간 동안 자기교반기로 실온에서 배양하였다. 합성이 완료된 후 생성물을 플래쉬-컬럼 크로마토그래피로 정제하였다.
본 발명 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드 (SL-St)는 말레이미드-티올 반응에 의해 합성하였다. 수용체 (SL-M 또는 SL-T)를 물에 용해시키고 메탄올을 첨가하였다 (물 : 메탄올 = 1 : 4). MAL-TEG-St를 클로로포름에 용해시키고 메탄올 (클로로포름 : 메탄올 = 1 : 4)을 첨가하였다. 두 용액을 둥근바닥 플라스크에서 혼합하였고 밤새 자석 실온에서 자석 교반하였다. 반응의 진행은 TLC 분석으로 모니터링하였다.
3) 1H-NMR 스펙트럼을 이용한 검증
본 발명의 바이러스 수용체 모방 화합물 (SL-M-St 및 SL-T-St)을 중수소 옥사이드(D2O) 용매에 녹여 700 MHz NMR을 사용하여 분석하였다 (도 13). 이를 통해 본 발명 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드 (SL-St)가 성공적으로 합성된 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 7: 실시예 6에서 제조한 본 발명 단일 및 다중 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드 (SL-M-St 및 SL-T-St)를 이용한 리포좀 형성 1]
상기 실시예 6에서 제조한 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드 (SL-M-St 및 SL-T-St; 이하, 단일가닥, 다중가닥 두 종류를 통칭하여 SL-St로 표기)를 이용하여 디스크 형태의 나노천공자 (Nanodisc)가 아닌, 구 형태의 리포좀을 형성시키고자 했다.
1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 실시예 6에서 제조한 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드 (SL-St) 및 콜레스테롤을 클로로포름에 용해시켰다. 그런 다음 클로로포름 중 10 mol%가 되도록 콜레스테롤을 첨가했다. 용액은 내벽에 지질의 얇은 층만 남을 때까지 건조 질소 가스의 흐름 하에서 건조되었다. 뚜껑이 없는 바이알을 진공 데시케이터에 3시간 이상 두어 잔류 용매를 제거하였다. 그 후, 지질 혼합물을 PBS (pH 7.4)로 수화시켰다. 짧은 볼텍싱 후, 생성된 다중 층 리포좀을 5 분의 3주기 동안 프로브 초음파기를 사용하여 초음파 처리했다. 그런 다음 리포좀 분산액을 0.45mm 시린지 필터를 사용하여 압출하고 단일층 리포좀을 얻었다. 리포좀의 형성 및 크기는 DLS로 확인할 수 있었으며, 모든 리포좀은 120~150nm의 지름을 가지는 것을 확인하였다.
[실시예 8: 본 발명의 바이러스 수용체 모방 화합물, 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드 (SL-St) 이용 마이셀 및 리포좀의 바이러스 억제 효과 측정 실험 ]
1) hemagglutination inhibition assay (HI assay)
우선, 바이러스의 헤마글루티닌과 결합한다고 알려진 chicken red blood cell (cRBC)과 바이러스 (H1N2, H3N2)를 이용하여 cRBC가 침전되지 않는 바이러스 최소 농도(1 HAU)를 측정하고자 했다. 일정 농도 이상의 바이러스에 노출되었을 때, cRBC는 바이러스와 결합하며 lattice를 생성시키게 되어(이 현상을 hamaggultination이라 함) cRBC의 clumping을 억제하게 된다. HI assay는 분석하고자 하는 화합물 또는 물질이 바이러스의 헤마글루티닌과 얼마나 효과적으로 결합하는가를 평가할 수 있는 에세이 방법으로 인플루엔자 바이러스 연구에 널리 활용된다. 이 때, cRBC가 clumping되어 플레이트 위에서 관찰할 때 적색 dot 형태로 침전되기 시작하는 분석시료의 최소농도를 KiHAI라고 하며, KiHAI가 낮을 수록 효과적인 바이러스 저해제로 평가할 수 있다.
HI assay를 위해, 4HAU 농도의 바이러스를 각 수용체, 각 수용체 리피드, 각 수용체 리피드로 구성된 마이셀, 각 수용체가 포함된 리포좀으로 각각 처리한 후, cRBC에 첨가하여 HI assay를 수행하였다. 즉, 여러 농도의 3'-시알릴 락토오스, 단일- 및 다중 가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 (SL-M, SL-T), SL-M 또는 SL-T를 이용하여 합성한 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드 (SL-St; SL-M-St 및 SL-T-St) 기반 마이셀 (SL-M-micelle 및 SL-T-micelle), 상기 SL-M-St 또는 SL-T-St 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드를 이용하여 제조한 리포좀 (liposome)인 SL-M-Lip 또는 SL-T-Lip을 각각 37℃에서 30분 간 4HAU의 바이러스에 처리하였다. 이 처리한 혼합물 50㎕와 cRBC 50㎕를 섞어 최종적으로 1시간 동안 상온에서 인큐베이션시킨 후 cRBC가 적색 dot 형태로 침전되기 시작하는 농도 (KiHAI)를 확인하였다 (도 14).
2) 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-Neuraminic Acid based microneutralization assay (MUNANA assay)
MUNANA assay는 인플루엔자 바이러스 표면에 존재하는 neuraminidase 의 활성을 측정함으로써 인플루엔자 바이러스 감염 및 progeny 바이러스의 생성을 얼마나 효과적으로 억제하였는가를 평가하는 방법이다.
MDCK II 세포를 MEM (10% FBS 및 100 U/mL 페니실린 G, 100 μg/mL의 스트렙토마이신 및 0.25 μg의 암포테리신 B) 배양액에 준비하여 (2×105 cell/mL) 96-well plate의 각 well에 분주 (100 μL)하고 감염 하루 전에 37℃에서 5% CO2 하에 배양하였다. 감염 당일, PBS에 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드 (SL-M-St 또는 SL-T-St), 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드 (SL-M-St 또는 SL-T-St)를 이용하여 생성시킨 미셀 (micelle) 및 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드 (SL-M-St 또는 SL-T-St)를 이용하여 형성시킨 리포좀 (SL-M-Lip 또는 SL-T-Lip)을 2배 연속 희석하여 준비했다. 이러한 일련의 희석액 (5 μL)을 감염 배지 (1% 항생제를 사용한 195 μL MEM)에서 IAV와 혼합하고 (IAV 최종 농도 2×104 pfu/mL), 1시간 동안 5% CO2, 37℃에서 배양하였다.
세포를 PBS로 2회 세척하고 전처리 또는 온전한 바이러스 (MOI 0.2)를 감염 배지 (200 ㎕)에 첨가한 후 37℃에서 5% CO2 하에 24 시간 동안 배양하였다.
각각의 well에 PBS 중 50 μL의 4-MUNANA (4-Methylumbelliferyl-N-아세틸-α-D-Neuraminic Acid) 용액 (150 μM)을 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 추가로 배양하였다. 마지막으로, Synergy H1 (BioTek)을 사용하여 460 nm에서의 형광 (Excitation : 355 nm)을 측정하였다. (도 15)
3) 결과 분석
HI 분석 데이터 (도 14)는 3'-시알릴 락토오스 (3'-SL), 3'-SL-M은 사용한 최고 농도인 2mM에서도 hemagglutination을 억제하지 못하였음을 나타낸다. 반면, 다중 가닥 수용체인 SL-T는 PR8 바이러스에 대해 250 μM의 KiHAI를 보여줌에 따라 다중 가닥의 수용체가 바이러스 저해제로서 더 효율적임을 확인할 수 있었다. 이 SL-M, SL-T 각 수용체에 스테아릴 그룹이 결합된 형태인 SL-M-St, SL-T-St는 수용액 내에서 마이셀을 생성하게 된다. 각 마이셀을 SL-M-Micelle, SL-T-Micelle이라 할 때, 두 경우 모두 대략 6 μM의 KiHAI를 보임을 확인하였다. 이러한 결과는 각 수용체가 자기조립하여 나노구조를 이루면서 다가 효과 (multivalent effect)를 갖게 됨에 따라 저해능이 40배 이상 개선될 수 있음을 의미한다. SL-M-St를 포함한 리포좀 (SL-M-Lip)의 경우에는 SL-M-St가 2.5-10mol%의 조성비율로 포함되었을 때, 테스트한 농도범위에서 hemaggultination을 억제하지 못하였다. 반면, 다중 가닥 수용체 리피드 SL-T-St를 포함한 리포좀 (SL-T-Lip)의 경우에는 SL-T-St가 5-10mol% 조성비율로 포함되었을 때, 1.5-25 μM의 KiHAI를 보였다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때, 수용체 자체로는 다중 가닥의 다가 효과가 저해능 개선에 큰 역할을 하며, 이들 여러분자들이 자기조립되게 되면 단일 가닥, 다중 가닥 모두 다가 효과가 더 극대화되는 것으로 나타났다. 리포좀에 도입된 경우에는 다중 가닥의 수용체가 표면에 존재할 경우 저해능이 크게 향상되었으며 리포좀 내 조성비 조절을 통해 바이러스에 대한 저해능을 더욱 향상시킬 수 있었다. 이를 통해, SL-T 수용체 자체, 그리고 SL-M 또는 SL-T를 이용하여 제조한 나노소재 (마이셀, 리포좀)가 바이러스 결합능이 있음을 명확하게 확인할 수 있었다.
HI 분석 외에도 MDCK (MOI = 0.2)를 사용하여 MUNANA를 이용한 저해 에세이를 수행한 결과 (도 15), 단일 가닥 수용체 SL-M을 이용한 경우는 150 μM에서 12% 억제되었고 더 높은 농도에서도 더 이상의 효과는 관찰되지 않았다. 반면, 다중 가닥 수용체 SL-T를 이용한 경우는 300 μM에서 78 %까지 억제했다. 특히 150 μM에서 SL-T를 이용한 경우 억제율은 65%로 SL-M을 이용한 경우인 12%보다 약 5배 높았다. 따라서 SL-T를 이용한 경우 다가 결합 능력으로 인해 SL-M를 이용한 경우보다 항 바이러스 효과가 4 배 이상 높음을 확인하였다. SL-T의 경우, 137.3 μM의 IC50를 나타내었다. 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드 (SL-M-St 또는 SL-T-St)로 구성된 마이셀 (SL-M-Micelle 또는 SL-T-Micelle)의 경우에는 각각 19 μM, 44 μM의 IC50를 보임에 따라 여러 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드 분자가 자기조립되어 마이셀을 형성함으로써 다가 효과로 인해 바이러스 저해능이 크게 향상됨을 보여준다. 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드가 포함된 리포좀인 SL-M-Lip, SL-T-Lip 경우에는, 각각 149 μM, 44 μM의 IC50를 나타냈으며, 다중 가닥 수용체가 리포좀 표면에 존재할 때 인플루엔자 바이러스(PR8) 저해능이 향상됨을 명확히 보여주며, 잠재적인 항바이러스 활성을 가지고 있음을 나타내었다.
[실시예 9: 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드 (SL-ST)를 이용한 리포좀 형성 2]
각각의 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드 (SL-M-St, SL-T-St)를 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) 대비 2.5%, 5%, 7.5% 몰비율로 섞어 여섯 종류의 단일 및 다중가닥 수용체를 포함하는 리포좀을 형성할 수 있었다. 리포좀의 형성 및 크기는 DLS로 확인할 수 있었으며, 모든 리포좀은 65~75 nm의 지름을 가지는 것을 검증하였다. 리포좀 제조를 위한 기타의 사항은 상기 실시예 7에 기재한 방법을 차용하였다.
[실시예 10: 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드 (SL-ST)를 이용한 리포좀의 바이러스 억제 효과 측정 실험 2]
실시예 9에 따른 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드 (SL-ST), 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드 (SL-ST)를 이용한 리포좀 및 대조군을 이용하여 실시예 8에 따른 HI assay 및 MUNANA assay 실험을 하였고 하기 표 1의 결과를 얻을 수 있었다.
HI assay 및 MUNANA assay 측정 결과.
수용체 리피드(SL-St)의 몰비율 HI assay MUNANA assay
KI HAI tot*(μM) KI HAI receptor**(μM) IC50 tot(μM) IC50 receptor(μM)
0% N/A N/A N/A N/A
2.5% M N/A N/A 104 2.6
T N/A N/A 19.2 0.48
5% M N/A N/A 26 1.3
T 500 25 9.2 0.46
7.5% M N/A N/A 21.2 1.59
T 32 2.4 3.6 0.27
*tot : 리포좀 농도. **receptor : 수용체 농도.
상기 표 1에 따르면, 단일 가닥보단 다중 가닥을 이용한 경우 인플루엔자 바이러스에 대한 억제 효과가 더 높게 측정되었고, DSPC 대비 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드의 대체 비율이 높아질수록 인플루엔자 바이러스에 대한 억제 효과가 더 높게 측정되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 실시예 8에서 제작된 리포좀의 크기 (120-150 nm)에 비해 작은 크기 (65-75 nm)를 나타낼 때, 단일 가닥 수용체를 포함하는 리포좀 (SL-M-Lip) 또한 바이러스 (PR8) 저해활성을 나타냄을 알 수 있었다. 리포좀의 작은 크기가 바이러스와의 접촉면적을 증대시킬 수 있음을 확인하였다.
[실시예 11: 아미노옥시 그룹을 포함하는 링커 및 이를 이용한 바이러스 수용체 모방 화합물 합성]
1) 개요
실시예 1의 중간물인 단일 및 다중 가닥 링커의 경우 시알릭락토오스와 결합하는 말단 작용기로 아민 그룹을 가지는데, 시알릴락토오스를 결합하는 단계에서 장시간 (약 2주)이 소요되는 문제점이 있어 시알릴락토오스 커플링 스텝의 시간을 단축하고자 했다. 또한, 실시예 1의 중간물인 단일 및 다중 가닥 링커의 경우 시알릴락토오스 커플링 스텝 후 secondary amine이 남게 되어 양전하를 띠게 되는 특성을 갖고 있기 때문에 이러한 전하 특성을 조절하여 바이러스에 대한 친화도와 저해능을 향상시키고자 했다.
이를 위해 고체상 합성 과정에서 아민 그룹 말단을 갖는 다중가닥 링커에 (Boc-aminooxy)acetic acid를 커플링하고 deprotection하여 아미노옥시 그룹 말단을 갖는 다중가닥 링커를 합성한 후, 각각을 수지내에서 산 조건 하에 끊어내는 방식을 이용하였고, HPLC 정제까지 마친 결과, 수율 90%, 순도 95% 이상의 결과물을 얻어낼 수 있었다.
2) 아미노옥시 그룹을 포함하는 링커 및 이를 이용한 바이러스 수용체 모방 화합물 합성
다중 가닥 링커의 고체상 합성 후 N-말단에 2-aminooxyacetic acid를 고체상에서 추가로 DIC, HOBt를 이용하여 아마이드 결합으로 커플링 하였다.
수지상에서의 완전한 합성 후, 아미노옥시 다중 가닥 링커를 실온에서 2시간 동안 82.5% TFA, 5% 물, 5% 페놀, 5% 티오아니솔 및 2.5% 1,2-에탄디티올의 혼합물 용액을 사용하여 수지로부터 절단하였다. 회전식 증발기를 사용하여 용매를 제거한 후, 미정제 생성물을 빙냉 디에틸에테르 (30 배 부피)로 침전시켜 미정제 생성물을 수집하여 백색 고체를 수득 하였다. 아미노옥시 다중 가닥 링커를 semi-prep HPLC를 이용하여 > 95 % 순도로 추가 정제하였다.
옥심 (oxime) 결합을 통해 시알릴 락토오스를 상기 링커에 결합시킴으로써 아미노옥시 바이러스 수용체 모방 화합물을 제조하고자, 무수메탄올 용매에서 3 일 동안 50 ℃에서 자기 교반 (400 rpm)하여 반응시켰다.
3) 1H-NMR 분석
아미노옥시 수용체에 대한 1H-NMR 스펙트럼을 700 MHz NMR을 사용하여 중수소 옥사이드(D2O) 용매에 시료를 녹여 분석하였다. 상기 데이터 분석을 통해 링커에 결합된 SL의 양을 산출하였다. 링커의 델타 카본이 갖는 1.45 ppm과 SL의 아세틸기에 해당하는 2.07 ppm을 비교하여 얻어내었다 (도 16, 도 17). 도 16은 3'-시알릴 락토오스가 붙어 있는 옥심 (oxime) 결합 기반 다중 가닥 수용체의 1H-NMR 결과로 82.4%의 커플링 비율을 볼 수 있었다. 도 17은 6'-시알릴락토오스가 붙어있는 옥심 (oxime) 결합 기반 다중 가닥 수용체의 H-NMR 결과로 83%의 커플링 비율을 볼 수 있었다.
4) 옥심 (oxime) 반응 최적 조건 탐색
아미노옥시 링커와 시알릴락토오스의 옥심화 결합의 최적조건을 찾기 위해 다음과 같은 반응 조건((a) pH 4.6 acetate buffer, (b) Methanol, 0.1% acetic acid)을 설정하여 반응을 진행하였다. 반응 개시 24 h 이후, TLC 분석을 하고, iodine 염색을 통해 (a)와 (b) 모두에서 아미노옥시-다중가닥 링커가 소모된 것을 확인하였다. 다만, 두 조건 간의 반응시간 차이는 확인할 수 없었다. 이후 TLC (Silica gel 60G F254; EtOH:DI water=2:1), HPLC 분석을 통해 반응 경과를 확인하였다. (도 18)
아미노옥시-다중가닥 링커에 시알릴 락토오스의 컨쥬게이션 비율 (conjugation ratio)이 높을수록 HPLC 크로마토그램 상에서의 해당 피크의 retention time이 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 도 18을 통해 아세테이트 버퍼 (acetate buffer) 용매 조건에서보다 메탄올 용매 조건에서의 생성된 수용체 피크의 retention time이 전반적으로 짧은 것을 확인하였다. 즉, 메탄올 조건에서의 반응 속도 및 효율이 더 높은 것으로 확인되었다.
5) 다중가닥 링커 (아민 말단, 아미노옥시 말단) 기반 바이러스 수용체 모방 화합물 제조
실시예 1에 따른 아민 말단 기반 다중가닥 링커 기반 수용체 합성방법에서 기존의 reductive amination (pH 8.7 borate buffer, borane-pyridine complex(BPC)) 반응스텝의 반응효율을 개선하고 반응시간을 단축시키기 위하여, 버퍼 대신 무수메탄올 (methanol anhydrous)을 용매로 사용하고, 환원제 (reductant) 또한 시알릴락토오스의 환원성 말단 (reducing end)을 환원시키는 부작용이 있는 BPC 대신 sodium cyanoborohydride (NaCNBH3) 환원제 (reductant)을 사용하여 반응시킨 후 비교 실험하였다. 이의 합성방법에 따른 모식도를 도 19에 나타내었다.
실험 결과, 아미노옥시 그룹 말단 링커의 경우, 환원제 (reductant) 도움없이아미노옥시 그룹이 시알릴락토오스의 환원성 말단 (reducing end)와 반응하여 옥심 (oxime) 결합이 생성된 것을 확인할 수 있었다. 또한 아미노 그룹 말단과 달리 결합부분에서 전하를 띠지 않는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 12: 아미노옥시-다중가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드의 합성]
합성된 아미노옥시-다중가닥 기반 수용체를, maleimide 그룹을 한 쪽 말단으로 포함하는 리피드 (MAL-TEG-St)와 반응시켜 maleimide-thiol 반응을 통해 리피드화한 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드를 합성하였다. 유기용매/수용액 co-solvent 조건 (DI water:methanol:chloroform=1:4:1)에서 반응을 진행하였으며, thiol-maleimide 반응을 촉진하기 위해 triethylamine을 첨가하여 pH를 조절하였다. 12시간 동안 커플링 반응을 진행하는 것으로 합성할 수 있었다. 상기 합성과정에 따른 모식도를 도 20에 나타내었다. 이후 HPLC 정제하였다. 정제 후, 3'-, 6'-시알릴락토오스가 포함된 아미노옥시-다중가닥 바이러스 수용체 모방 화합물 리피드를 1H-NMR 분석하여 확인하였다. (도 21, 도 22)
도 21은 3'-시알릴락토오스가 포함된 옥심결합 기반 다중가닥 수용체 리피드를 나타내고, 도 22는 6'-시알릴락토오스가 포함된 옥심결합 기반 다중가닥 수용체 리피드를 나타내는데, 여기서 i는 시알산 내의 N-acetyl group (CH3)의 3H를, ii는 Stearic acid 내의 28H를, iii는 Stearic acid 내의 terminal CH3의 3H를 의미한다.
[실시예 13: 바이러스 수용체 모방 화합물의 스페이서 길이에 따른 바이러스 저해 활성 비교 평가]
바이러스 수용체 모방 화합물의 스페이서 길이에 따른 SL-리포좀 (SL-Lip)의 PR8 바이러스 저해활성 비교하고자 했다. 스페이서가 없는 Ganglioside GM3, 시스테인 (앵커)만을 포함하는 바이러스 수용체 모방 화합물, (EG)2Cys의 스페이서를 포함하는 수용체를 준비한 후 (도 23), 각 수용체가 도입된 리포좀을 각각 준비하였다 (리포좀 내 바이러스 수용체 모방 화합물 10 mol%). 동일조건에서 PR8 바이러스 (H1N1)와 각 수용체-리포좀을 30분 동안 인큐베이션한 후, MDCK 세포에 접종하고 16 h 배양한 후 생성된 progeny virus (증식된 바이러스)를 neuraminidase 활성 측정 기법인 MUNANA assay로 정량하였다. (도 24)
도 24를 보면, 상대적으로 스페이서 길이가 긴 (1 nm) SL-(EG)2Cys 바이러스 수용체 모방 화합물이 도입된 리포좀의 경우가 짧은 스페이서 (0.2 nm)를 이용한 리포좀, 스페이서가 존재하지 않는 GM3-리포좀에 비해, 각각 8.5배, 11.1배 높은 바이러스 저해 활성을 확인할 수 있다. 이를 통해, 스페이서의 존재의 유무 및 길이에 따라 바이러스 표면 단백질 (헤마글루티닌)과의 결합력이 달라질 수 있음을 확인하였다.

Claims (14)

  1. 시알산 (sialic acid)에 갈락토오스 (galactose) 및 글루코오스 (glucose)가 결합되어 있는 시알산 화합물과, 아민기 (amine group, -NH2) 또는 아미노옥시기 (aminooxy group, NH2-0-)를 일측에 구비하고 카르복실기 (carboxyl group, -COOH) 작용기를 타측에 구비한 폴리에틸렌글리콜 (polyethyleneglycol)이 상호 결합하여 형성되고, 지질과 결합할 수 있는 바이러스 수용체 모방 화합물에 있어서,
    상기 폴리에틸렌글리콜은, 복수개가 구비되고, 이 복수개의 폴리에틸렌글리콜은,
    일측에 상기 폴리에틸렌글리콜의 카르복실기 (carboxyl group, -COOH) 말단과 결합할 수 있는 작용기를 가지고 있고, 타측에 상기 폴리에틸렌글리콜의 아민기 (amine group, -NH2) 또는 아미노옥시기 (aminooxy group, NH2-0-) 말단과 결합할 수 있는 작용기를 가진 화합물을 매개로 하여 연결되는 것을 특징으로 하는 바이러스 수용체 모방 화합물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌글리콜은,
    지질과 결합할 수 있는 작용기로 티올기 (thiol group, -SH)가 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 바이러스에 결합할 수 있는 바이러스 수용체 모방 화합물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 바이러스 수용체 모방 화합물은,
    폴리에틸렌글리콜에 인지질 (phospholipid) 또는 지방산(fatty acid) 중 선택되는 어느 한 개의 지질 (lipid)이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 바이러스에 결합할 수 있는 바이러스 수용체 모방 화합물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 '폴리에틸렌글리콜의 카르복실기 (carboxyl group, -COOH) 말단과 결합할 수 있는 작용기를 가지고 있고, 타측에 상기 폴리에틸렌글리콜의 아민기 (amine group, -NH2) 또는 아미노옥시기 (aminooxy group, NH2-0-) 말단과 결합할 수 있는 작용기를 가진 화합물'은,
    상기 폴리에틸렌글리콜의 카르복실기 (carboxyl group, -COOH) 말단과 결합할 수 있는 작용기를 한 개 이상 가지고 있는 것을 특징으로 하는 바이러스에 결합할 수 있는 바이러스 수용체 모방 화합물.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 티올기는,
    시스테인을 폴리에틸렌글리콜에 결합시킴으로써 티올기가 폴리에틸렌글리콜에 도입되는 것을 특징으로 하는 바이러스에 결합할 수 있는 바이러스 수용체 모방 화합물.
  6. 삭제
  7. 제5항에 있어서,
    상기 바이러스 수용체 모방 화합물은,
    상기 시스테인에, 인지질 (phospholipid) 또는 지방산(fatty acid) 중 선택되는 어느 한 개의 지질 (lipid)이 결합되어 형성된 것을 특징으로 하는 바이러스에 결합할 수 있는 바이러스 수용체 모방 화합물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 '폴리에틸렌글리콜의 카르복실기 (carboxyl group, -COOH) 말단과 결합할 수 있는 작용기를 가지고 있고, 타측에 상기 폴리에틸렌글리콜의 아민기 (amine group, -NH2) 또는 아미노옥시기 (aminooxy group, NH2-0-) 말단과 결합할 수 있는 작용기를 가진 화합물'은,
    라이신 (lysine)인 것을 특징으로 하는 바이러스에 결합할 수 있는 바이러스 수용체 모방 화합물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 '폴리에틸렌글리콜의 카르복실기 (carboxyl group, -COOH) 말단과 결합할 수 있는 작용기를 가지고 있고, 타측에 상기 폴리에틸렌글리콜의 아민기 (amine group, -NH2) 또는 아미노옥시기 (aminooxy group, NH2-0-) 말단과 결합할 수 있는 작용기를 가진 화합물'은,
    복수개의 '폴리에틸렌글리콜의 카르복실기 (carboxyl group, -COOH) 말단과 결합할 수 있는 작용기를 가지고 있고, 타측에 상기 폴리에틸렌글리콜의 아민기 (amine group, -NH2) 또는 아미노옥시기 (aminooxy group, NH2-0-) 말단과 결합할 수 있는 작용기를 가진 화합물'이 상호 결합되어 형성된 복합체인 것을 특징으로 하는 바이러스에 결합할 수 있는 바이러스 수용체 모방 화합물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 시알산 화합물과 폴리에틸렌글리콜은,
    시알산 화합물 내 글루코오스의 알데하이드기 (aldehyde group)와 폴리에틸렌글리콜의 아민기가 반응하여 2차 아민 (secondary amine) 결합을 형성함으로써 결합하거나, 시알산 화합물 내 글루코오스의 알데하이드기 (aldehyde group)와 폴리에틸렌글리콜의 아미노옥시기 (aminooxy group, NH2-0-)가 반응하여 옥심 (oxime) 결합을 형성함으로써 결합하는 것을 특징으로 하는 바이러스에 결합할 수 있는 바이러스 수용체 모방 화합물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 시알산 화합물은,
    갈락토오스 및 글루코오스가 결합되어 있는 이당 형태를 한 세트로 해서 이 세트가 복수개 반복되는 올리고당이 시알산에 결합되어 있는 화합물인 것을 특징으로 하는 바이러스에 결합할 수 있는 바이러스 수용체 모방 화합물.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 시알산 화합물은,
    시알릴락토오스 (sialyllactose)인 것을 특징으로 하는 바이러스에 결합할 수 있는 바이러스 수용체 모방 화합물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 시알릴락토오스는,
    3'-시알릴락토오스 또는 6'-시알릴락토오스인 것을 특징으로 하는 바이러스에 결합할 수 있는 바이러스 수용체 모방 화합물.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 지질은,
    말레이미드기 (maleimide group, H2C2(CO)2N-), 피리딜다이설파이드기 (pyridyl disulfide, Py-S-S-), 할로아세틸기 (haloacetyl, X-CH2-CO-), 아크릴로일기 (acryloyl, H2C=CH-CO-), 비닐기 (vinyl, H2C=CR-) 중 선택되는 어느 하나의 작용기를 갖는 것을 특징으로 하는 바이러스에 결합할 수 있는 바이러스 수용체 모방 화합물.
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