KR20220037373A - 시알산 유도체가 결합된 필라멘트성 파지, 및 이의 바이러스 감염증 예방 또는 치료 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 본 발명은 시알산 유도체가 결합된 필라멘트성 파지, 및 이의 바이러스 감염증 예방 또는 치료 용도 등에 관한 것으로, 본 발명의 시알산-파지는 인플루엔자 바이러스와의 상대적 결합능이 우수하고, 세포단위에서의 인플루엔자 바이러스 생장 억제능 및 감염 억제능이 매우 우수하므로, 본 발명의 시알산-파지를 바이러스 감염증의 치료제로서 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명자들은 시알산-파지를 뉴라미니다제 억제제와 병용시 바이러스 플라크 형성 감소 효과가 유의하게 증가함을 확인하였는 바, 본 발명의 시알산-파지를 뉴라미니다제 억제제의 치료 보조제로서 유용하게 사용할 수 있을 것이다.

Description

시알산 유도체가 결합된 필라멘트성 파지, 및 이의 바이러스 감염증 예방 또는 치료 용도 {sialic acid derivatives-conjugated filamentous phage, and use thereof for preventing or treating viral infectious diseases}

본 발명은 시알산 유도체가 결합된 필라멘트성 파지, 및 이의 바이러스 감염증 예방 또는 치료 용도 등에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스(Influenza virus)는 오르소믹소 계통(Family Orthomyxoviridae)에 속하는 RNA 바이러스로서 혈청형은 A형, B형, C형 등 3가지로 구분된다. 그 중 B형과 C형은 사람에서만 감염이 확인되고 있으며, A형은 사람, 말, 돼지, 기타 포유류 그리고 다양한 종류의 가금과 야생조류에서 감염이 확인되고 있다. A형 인플루엔자 바이러스의 혈청형은 바이러스 표면의 두 가지 단백질인 헤마글루티닌(Hemagglutinin; HA)과 뉴라미니다제(Neuraminidase;NA)의 종류에 따라 구분되는데, 지금까지 144종류(HA 단백질 16종과 NA 단백질 9종)가 알려져있다. HA는 바이러스가 체세포에 부착하는 역할을 하며, NA는 바이러스가 세포 내로 침투할 수 있도록 한다.

지금까지 개발된 바이러스 감염증 치료제로는 아만타딘(amantadine) 또는 리만타딘(rimantadine) 계열의 M2 이온 채널 억제제(M2 ion channel inhibitor)와 오셀타미비르(oseltamivir, 상품명 타미플루) 또는 자나미비르 (zanamivir, 상품명 리렌자) 계열의 뉴라미니다제(neuraminidase) 억제제가 알려져 있으나, 이들 치료제는 그의 효과가 제한된다는 문제점이 있었다. 즉, 아만타딘 또는 리만타딘 계열의 유도체 화합물은 이에 대한 저항성 변종바이러스가 빠르게 생성되고, 일부 지역에서 검출된 H5N1 타입의 인플루엔자 바이러스는 아만타딘 또는 리만타딘 계열의 화합물에 대하여 내성을 나타내며, 인플루엔자 B 바이러스는 아만타딘 유도체에 민감하지 않다고 알려져 있다. 또한, 오셀타미비르 또는 자나미비르 계열의 유도체 화합물 역시 이에 대한 저항성 바이러스가 증가하고, 이러한 저항성 바이러스는 어린이에게서 빈번히 발생하고 있다고 알려져 있다.

이에 따라 최근 당쇄에 관한 구조 및 기능에 관한 연구가 급속하게 진행되어 생리 활성을 갖는 올리고당, 당 지질, 당 단백질 등의 의약품 또는 기능성 소재로서의 용도 개발이 활발히 이루어지고 있다. 그 중, 말단에 N-아세틸뉴라민산(NeuAc)을 함유하는 시알산 함유 당쇄는 세포 접착이나 바이러스 감염시 수용체가 되는 등 중요한 기능을 갖는 당쇄이다.

이에, 본 발명자들은 시알산 유도체를 사용하여 바이러스와의 연쇄적/비가역적 결합으로 인해 차단 효과가 월등할 것으로 기대되는 신개념 나노섬유 형태의 항인플루엔자 소재를 개발하고자 하였다.

대한민국 공개특허 10-2018-0026272호(2018.03.12.)

이에 본 발명자들은 필라멘트성 파지 표면에 시알산 유도체를 결합시킨 시알산-파지를 개발한 결과, 본 발명의 시알산-파지가 다양한 인플루엔자 바이러스의 생장 및 감염을 억제함을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 필라멘트성 파지;와 하나 이상의 시알산 유도체가 결합된 시알산-파지 복합체로서,

상기 시알산 유도체는 필라멘트성 파지의 표면에 결합되고,

상기 시알산 유도체가 파지 주 코트 단백질에 한 개 이상 결합된 경우, 서로 동일한 간격으로 배열된 것을 특징으로 하는, 시알산-파지 복합체를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 시알산-파지 복합체를 유효성분으로 포함하는, 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 시알산-파지 복합체를 유효성분으로 포함하는, 바이러스 감염증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 시알산-파지 복합체를 유효성분으로 포함하는, 바이러스 억제용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 필라멘트성 파지와 하나 이상의 시알산 유도체가 결합된 시알산-파지 복합체로서,

상기 시알산 유도체는 필라멘트성 파지의 표면에 결합되고,

상기 시알산 유도체가 주 코트 단백질에 한개 이상 결합된 경우, 서로 동일한 간격으로 배열된 것을 특징으로 하는, 시알산-파지 복합체를 제공한다.

또한, 본 발명은 필라멘트성 파지;와 하나 이상의 시알산 유도체가 결합된 시알산-파지 복합체로서,

상기 시알산 유도체는 필라멘트성 파지의 표면에 결합되고,

상기 시알산 유도체가 파지 주단백질의 모든 카피에 결합된 경우, 서로 동일한 간격으로 배열된 것을 특징으로 하는, 시알산-파지 복합체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 시알산-파지 복합체를 유효성분으로 포함하는, 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 시알산-파지 복합체를 유효성분으로 포함하는, 바이러스 감염증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 시알산-파지 복합체를 유효성분으로 포함하는, 바이러스 억제용 의약외품 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 시알산 유도체는 3'-시알릴락토스(3'-Sialyllactose), 6'-시알릴락토스(6'-Sialyllactose), α2, 3'-시알릴갈락토스(α2, 3'-sialylgalactose), α2, 6'-시알릴갈락토스(α2, 6'-sialylgalactose), 시알릴락토-N-테트라오스(sialyl lacto-N-tetraose), 디시알릴락토-N-테트라오스(disialyllacto-N-tetraose), α2, 3'-시알릴 N-아세틸락토사민(α2, 3'-sialyl N-acetyllactosamine), α2, 6'-시알릴 N-아세틸락토사민(α2, 6'-sialyl N-acetyllactosamine), 디시알릴락토스(Disialyllactose), 및 Stn 에피토프(STn epitope 또는 2-acetamido-6-O-(α-2-N--acetylneuraminyl)-2-deoxyl-α-D-galactopyranosyl serine)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 시알산 유도체는 시알릴올리고당(sialyloligosaccharide)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 시알산 유도체는 필라멘트성 파지의 작용기와 직접 결합하거나, 또는 링커를 통해 파지와 결합하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 필라멘트성 파지는 M13 파지, F1 파지, Fd 파지, If1 파지, Ike 파지, Zj/Z 파지, Ff 파지, Xf 파지, Pf1 파지 및 Pf3 파지로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 필라멘트성 파지는 야생형 파지 또는 음전하를 띠는 아미노산의 수가 야생형 파지보다 많도록 유전적으로 조작된 파지일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 필라멘트성 파지는 바이러스의 표면 항원에 대한 수용체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 필라멘트성 파지의 작용기는 파지의 주 코트 단백질(major coat protein)에 존재하는 아민기, 카르복실산기, 또는 티올기일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 시알산 유도체는 상기 필라멘트성 파지의 주 코트 단백질 1개에 대하여 1 내지 20개 결합되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 링커는 시알산 유도체를 필라멘트성 파지의 작용기와 아미드, 디설파이드, 옥심, 이민, 티오에테르 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 결합을 통해 연결하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 시알산 유도체가 주 코트 단백질에 1개 이상 결합된 경우, 상기 시알산 유도체는 1.0 내지 4.0 nm의 간격으로 배열된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 시알산-파지 복합체는 바이러스의 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA)와 결합하여 상기 바이러스의 감염을 억제하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 뉴라미니다제 억제제를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 뉴라미니다제 억제제는 오셀타미비르(oseltamivir), 자나미비르(zanamivir), 페라미비르(peramivir) 및 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 의약외품 조성물은 필터 코팅제, 핸드워시, 가그린, 소독청결제, 샤워폼, 물티슈, 세제비누, 가습기 충진제, 마스크 및 방향제로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 시알산-파지 복합체를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 시알산-파지 복합체를 유효성분으로 포함하는 조성물의 바이러스 감염증 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 시알산-파지 복합체의 바이러스 감염증 예방 또는 치료 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.

본 발명의 시알산-파지는 인플루엔자 바이러스와의 상대적 결합능이 우수하고, 세포단위에서의 인플루엔자 바이러스 생장 억제능 및 감염 억제능이 매우 우수하므로, 본 발명의 시알산-파지를 바이러스 감염증의 치료제로서 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명자들은 시알산-파지를 뉴라미니다제 억제제와 병용시 바이러스 플라크 형성 감소 효과가 유의하게 증가함을 확인하였는 바, 본 발명의 사알산-파지를 뉴라미니다제 억제제의 치료 보조제로서 유용하게 사용할 수 있을 것이다.

도 1은 시알릴락토실 리간드(3'SL-EG2-Cys 및 6'SL-EG2-Cys) 합성 스킴을 나타낸 것이다.
도 2는 (상단) 3'SL-EG2-Cys, 및 (하단) 6'SL-EG2-Cys의 ESI-MS 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3은 4가 시알릴락토실 리간드(T-3'SL-EG2-Cys 및 T-6'SL-EG2-Cys) 합성 스킴을 나타낸 것이다.
도 4는 T-3'SL-EG2-Cys의 1H NMR(700MHz, D₂O) 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5는 T-6'SL-EG2-Cys의 1H NMR(700MHz, D₂O) 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 6a는 시알릴락토실 리간드(3' 또는 6')가 파지에 조밀하게 결합되며, 규칙적으로 배열된 시알산-파지 복합체(SLPhage)의 구조를 나타낸 것이며, SL 리간드는 이황화 결합을 통해 파지의 pVIII 주 코트 단백질에 결합되었다. 피리딘-2-티온(P2T)은 티올 반응성 피리딜디설파이드 변형 파지와 시알릴락토실 리간드 사이의 이황화 결합 형성 시 방출되었다.
도 6b는 4가 3'-시알릴락토스-결합된 파지를 나타낸 것이다.
도 6c는 4가 6'-시알릴락토스-결합된 파지를 나타낸 것이다.
도 6d는 WT 파지(왼쪽), 3'SLPhage(가운데) 및 T-3'SLPhage(오른쪽)의 TEM 이미지를 통해 필라멘트 구조를 나타낸 것이다.
도 6e는 SLPhage 및 T-SLPhage의 특정 렉틴 결합 특성(MAA/MAL: 3'SL-특이적 렉틴; SNA/EBL: 6'SL-특이적 렉틴)을 형광값으로 나타낸 것이다. 오차 막대는 독립 실험(n = 4)의 표준 편차(SD)를 나타내고 별표는 스튜던트 t-검정에 의해 결정된 통계적 유의성을 나타낸다(*P <0.05, **P <0.01, ***P < 0.001).
도 6f는 특정 렉틴이 도입된 금 나노 입자에 의해 매개되는 6'SLPhage 응집체를 보여주는 TEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 7은 (a) 티올 반응성 PDS-파지와 시알릴락토실 리간드(PDS-파지 농도: 0.11 mg/mL) 사이의 이황화 형성시 방출된 피리딘-2-티온(P2T)의 대표적인 흡광도 스펙트럼, 및 (b) P2T의 표준 곡선과 P2T 농도 계산식을 계산한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 6'시알릴락토스-결합된 시알산-파지의 TEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 9는 SLPhage와 인플루엔자 바이러스의 상호작용 개략도를 나타낸 것이다.
도 10은 SLPhage-IAV 상호작용을 나타내는 TEM 이미지이다. a는 네이티브 PR8 바이러스(왼쪽) 및 X31 바이러스(오른쪽)이다. b는 WT 파지로 처리된 PR8 바이러스(왼쪽) 및 X31 바이러스(오른쪽)이다. c는 3'SL 파지로 처리된 PR8 바이러스로, 3'SL 파지가 인플루엔자 바이러스와 결합하여 응집체를 형성함을 나타내고(i 및 ii), 일부 파지가 인플루엔자 바이러스의 입자를 감싸는 모습을 나타낸다(iii 및 iv). d는 6'SL 파지로 처리된 X31 바이러스로, 6'SL 파지가 인플루엔자 바이러스와 결합하여 응집체를 형성함을 나타내고(i), 일부 파지가 인플루엔자 바이러스의 입자를 감싸는 모습을 나타낸다(ii). e는 T-3'SLPhage로 처리된 PR8 바이러스로, T-3'SLPhage가 인플루엔자 바이러스와 결합하여 응집체를 형성함을 나타내고(i), 일부 파지가 인플루엔자 바이러스의 입자를 감싸는 모습을 나타낸다(ii).
도 11은 a) MDCK 세포 및 b) A549 세포를 사용하여 WT 파지, SLPhage 및 T-SLPhage의 세포독성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 12a 내지 12f는 혈구응집 및 IAV 감염에 대한 SLPhage 및 T-SLPhage의 시험관내 억제 활성을 나타낸 것이다.
도 12a 및 도 12b는 WT 파지, 3'SL, 6'SL, 및 3'SLPhage로 처리된 IAV의 혈구응집을 분석한 결과를 나타낸다. Ki^HAI는 완전한 혈구 응집 억제에 필요한 SL-함유 파지의 최저 농도로 결정하였으며, 빨간색 화살표는 혈구 응집의 완전한 억제를 나타내는 첫 농도를 나타낸다.
도 12c는 T-6'SLPhage의 X31-유도-CPE 억제 활성을 나타내는 MDCK 세포 이미지를 나타낸 것이다. MDCK 세포는 X31(0.2 MOI)로 감염시키고, 고정한 뒤 감염 후 2일째 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 스케일 바: 300μm.
도 12d는 MDCK 세포에 대한 X31(0.1 MOI)-유도-CPE 억제 분석 결과를 나타낸 것이다. 억제율은 음성 대조군(파지 처리 없음)의 평균값으로부터 계산하였다.
도 12e는 MDCK 세포에 대한 PR8(0.1 MOI)-유도-CPE 억제 분석 결과를 나타낸 것이다. 억제율은 음성 대조군(파지 처리 없음)의 평균값으로부터 계산하였다.
도 12f는 6'SLPhage 단독 또는 오셀타미비르 카복실레이트(5μM)와 병용으로 PR8을 전처리 후 CPE 억제 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 MDCK 세포에서 (a) PR8(0.2 MOI) 및 (b) X31(0.2 MOI)에 대한 미세중화 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 MDCK 세포에서 오셀타미비르 카르복실레이트(OC)에 대한 IAV-유도-CPE 억제 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 A549 세포에 대한 IAV 미세중화 분석 결과를 나타낸 것이다. 시알산-파지 및 WT 파지가 X31(0.2 MOI)에 대한 중화 분석에서 테스트되었다.
도 16a는 SLPhage가 인플루엔자 바이러스의 억제 효과를 나타내는 단계를 식별하기 위한 첨가 시간 분석의 개략도를 나타낸 것이다.
도 16b는 6'SLPhage 첨가 시점(전처리, 동시처리, 후처리)에 따른 6'SLPhage의 PR8 억제율을 나타낸 것이다.
도 16c는 T-6'SLPhage 전처리와 T-6'SLPhage 후처리를 기반으로 한 플라크 형성 감소 분석의 개략도를 나타낸 것이다.
도 16d는 T-6'SLPhage(124 또는 620 pM)를 사용한 전처리 및 후처리에서 얻은 대표적인 바이러스 유발 플라크 이미지를 나타낸 것이다. MDCK 세포는 ~400pfu의 X31로 감염되었다.
도 16e는 전처리 또는 후처리 조건에서 T-6'SLPhage의 억제 활성을 평가하기 위해 플라크 면적 감소(%)를 음성대조군과 대비하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 16f는 OC(5 nM, 상단) 및 OC(5 nM)와 T-6'SLPhage(620 pM)의 혼합물(하단)을 처리한 뒤 얻은 플라크 이미지를 나타낸 것이다. MDCK 세포는 ~200pfu의 X31로 감염되었다.
도 16g는 플라크 형성 억제에 대한 OC와의 동시 배양 효과를 평가하기 위해 플라크 면적 감소(%)를 음성대조군과 대비하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 X31(H3N2)에 대한 야생형 파지의 항바이러스 활성 평가하기 위해 플라크 감소를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 인플루엔자 바이러스 핵단백질을 확인하기 위해 A549 세포에서 형광 면역세포화학을 수행한 결과를 나타낸 것이다. a는 A549 세포만 존재하며, b는 X31(MOI=0.1)로 24시간 동안 접종한 세포이며, c는 X31과 T-6'SLPhage를 접종한 세포이다.

본 발명은 필라멘트성 파지;와 하나 이상의 시알산 유도체가 결합된 시알산-파지 복합체로서,

상기 시알산 유도체는 필라멘트성 파지의 표면에 결합되고,

상기 시알산 유도체가 주 코트단백질에 한개 이상 결합한 경우, 서로 동일한 간격으로 배열된 것을 특징으로 하는, 시알산-파지 복합체를 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명에서, 용어 "파지(phage)" 또는 "박테리오파지(bacteriophage)"는 호환적으로 사용되며, 박테리아를 감염시키고, 박테리아 내에서 복제되는 바이러스를 의미할 수 있다. 파지 또는 박테리오파지는 탄소 물질과 선택적 또는 특이적으로 결합하는 펩티드를 디스플레이(display)하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 필라멘트성 파지는 M13 파지, F1 파지, Fd 파지, If1 파지, Ike 파지, Zj/Z 파지, Ff 파지, Xf 파지, Pf1 파지 및 Pf3 파지로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서, 파지란 시알산 유도체와 결합하여 시알산 유도체가 서로 동일한 간격으로 배열될 수 있게하는 지지체로서의 역할을 수행하는 선형의 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 파지는 야생형 또는 유전적으로 조작된 파지를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 용어 "유전적 조작 (genetic engineering)" 또는 "유전적으로 조작된 (genetically engineered)"은 시알산 유도체를 파지의 외피 단백질 또는 그의 단편에 결합시키기 위해 파지에 대하여 하나 이상의 유전적 변형 (genetic modification)을 도입하는 행위 또는 그에 의하여 만들어진 파지를 의미할 수 있다. 인플루엔자 바이러스의 외피 단백질은 헤마글루티닌(hemagglutinin)과 뉴라미니다아제(neuraminidase)로 이루어져 있으며, 그 비율은 약 10:1로 대부분이 헤마글루티닌으로 이루어져 있다. 이러한 헤마글루티닌은 숙주의 리셉터(receptor)의 메인 잔기인 시알산(sialic acid)과 결합하게 되는데, 이 때 헤마글루티닌의 binding site는 양전하를 띰으로써 정전기 상호작용(electrostatic interaction)을 통해 음전하를 띤 분자와 상호작용 한다. 파지는 약 3000개의 주 코트 프로틴(major coat protein)인 p8으로 이루어져 있으며, 외곽에는 N-terminal 도메인이 존재한다. 자연계에 존재하는 야생형 파지는 AEGDDPAK-로 이어지는 N-말단 아미노산 서열을 가지고 있으며, 유전자 조작을 통해 아미노산을 치환하거나 원하는 서열로 변환할 수 있다.

본 발명에서, 상기 유전적으로 조작된 파지는 야생형보다 음전하를 띠는 아미노산의 수가 많은 것일 수 있으며, 구체적으로 N-말단 아미노산 서열이 AEEEEPAK- (glutamic acid, E)를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 유전적으로 조작된 파지는 파지 1 개당 약 3000개의 p8 단백질이 존재하기 때문에, 야생형 파지에 비해 3000개의 음전하가 추가로 생성되는 효과를 야기할 수 있으며, 이러한 음전하 파지를 이용해 시알산 유도체가 표면에 도입된 SL 파지를 생성하게 되면, 인플루엔자 바이러스에 대한 결합 친화도를 향상시킬 수 있다. 상기 N-말단 아미노산 서열이 AEEEEPAK- (glutamic acid, E)를 포함하는 유전적으로 조작된 파지는 문헌 [Lee, B. Y., Zhang, J., Zueger, C., Chung, W. J., Yoo, S. Y., Wang, E.,...&Lee, S. W. (2012). Virus-based piezoelectric energy generation. Nature nanotechnology, 7(6), 351-356.]을 참조하여 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 용어 “시알산(sialic acid)”은 시알린산 또는 뉴라민산이라고도 호칭되며, 피루브산과 만노사민의 알돌축합체인 노이람산이 n-아세틸화, n-글리콜화 또는 o-아세틸화된 화학구조를 갖는 아미노당의 일종을 의미한다.

본 발명에서, 상기 시알산은 바이러스의 헤마글루티닌(HA)과 결합하여 그의 기능을 억제하는 리간드로서 사용될 수 있는데, 상기 리간드로는 시알산 뿐만 아니라 그의 유도체가 사용될 수도 있다.

본 발명에서, “유도체(derivative)”란, 목적 화합물의 일부를 화학적으로 변화시켜서 얻어지는 유사한 화합물을 의미하는데, 대체로 목적 화합물 중의 수소원자 또는 특정 원자단이 다른 원자 또는 원자단에 의하여 치환된 화합물이 될 수 있다.

본 발명에서, 상기 유도체는 시알산 또는 시알릴락토스의 유도체로 해석될 수 있는데, 상기 시알산 또는 시알릴락토스의 유도체는 바이러스의 HA와 결합하여 그의 기능을 억제할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 시알산에 당류가 결합된 시알릴올리고당이 될 수 있고, 다른 예로서, 3'-시알릴락토스(3'-Sialyllactose), 6'-시알릴락토스(6'-Sialyllactose), α2, 3'-시알릴갈락토스(α2, 3'-sialylgalactose), α2, 6'-시알릴갈락토스(α2, 6'-sialylgalactose), 시알릴락토-N-테트라오스(sialyl lacto-N-tetraose), 디시알릴락토-N-테트라오스(disialyllacto-N-tetraose), α2, 3'-시알릴 N-아세틸락토사민(α2, 3'-sialyl N-acetyllactosamine), α2, 6'-시알릴 N-아세틸락토사민(α2, 6'-sialyl N-acetyllactosamine), 디시알릴락토스(Disialyllactose), 및 Stn 에피토프(STn epitope 또는 2-acetamido-6-O-(α-2-N-acetylneuraminyl)-2-deoxyl-α-D-galactopyranosyl serine) 등이 될 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 시알산 유도체는 하기 표 1의 화학식으로 나타낼 수 있다:

구조식	명칭
	시알산(sialic acid)
	α2, 3'-시알릴갈락토스 (α2, 3'-sialylgalactose)
	α2, 6'-시알릴갈락토스 (α2, 6'-sialylgalactose)
	3‘-시알릴락토스
	6‘-시알릴락토스
	α2, 3'-시알릴 N-아세틸락토사민 (α2, 3'-sialyl N-acetyllactosamine)
	α2, 6'-시알릴 N-아세틸락토사민 (α2, 6'-sialyl N-acetyllactosamine)
	디시알릴락토스 (Disialyllactose)
	Stn 에피토프 (STn epitope)

본 발명에서, 상기 시알산 유도체는 필라멘트성 파지의 작용기와 직접 결합하거나, 또는 링커를 통해 파지와 결합하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 시알산 유도체는 바이러스의 표면 항원에 대한 수용체로서 작용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 필라멘트성 파지는 시알산 유도체 이외의 바이러스의 표면 항원에 대한 수용체를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, 상기 시알산-파지 복합체는 지질이중층의 외피를 가지는 바이러스의 표면 항원에 대한 수용체를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서, "표면항원 (surface antigen) " 이란 세포막 항원이 라고도 하며, 세포의 세포막에 존재하는 항원성을 나타내는 막결합 단백질을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 표면항원은 지질이중층의 외피를 가지는 바이러스의 지질이중층에 결합된 막결합 단백질을 의미하는 것으로 해석될 수 있는데, 상기 표면항원은 특별히 이에 제한되지 않으나, 인플루엔자 바이러스의 표면항원인 헤마글루티닌(Hemagglutinin; HA), 뉴라미니다제(Neuraminidase ;NA) 등 이 될 수 있다. 본 발명의 용어 헤마글루티닌(hemagglutinin;HA)" 이란, 인플루엔자 바이러스의 표면항원의 일종인 막투과 단백질로서, 트립신에 의해 절단될 수 있는 HA1 서브유닛과 HA2 서브유닛으로 구성된다. 상기 HA1 서브유닛은 시알산과 결합하고, 상기 HA2 서브유닛은 낮은 pH 조건에서 세포막 융합을 유발시킨다고 알려져 있다. 본 발명의 용어 "표면 항원에 대한 수용체“란, 상기 표면항원과 결합할 수 있는 수용체로서, 상기 표면항원에 대한 항체가 될 수도 있고, 상기 표면항원이 결합할 수 있는, 다른 세포막 결합 단백질 및 당사슬이 될 수도 있다. 본 발명에 있어서, 상기 표면항원에 대한 수용체는 지질이중층의 외피를 가지는 바이러스가 감염될 수 있는 숙주세포의 표면에 존재하고, 상기 바이러스의 표면항원과 결합할 수 있는 수용체를 의미하는 것으로 해석될 수 있다. 상기 수용체와 바이러스의 표면항원은 수소결합, 이온결합 등 다양한 상호작용에 의해 결합될 수 있으며, 예를 들어 바이러스의 헤마글루티닌의 HA1 서브유닛의 가장 바깥 면의 수용체 결합부위 (receptor binding site)와 시알산이 결합할 수 있다. 따라서 본 발명의 수용체는 대상 바이러스, 예를 들어 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다제를 포함하는 바이러스에 특이적 또는 친화적으로 결합할 수 있도록 하는 수용체일 수 있다.

본 발명에서, 상기 표면항원에 대한 수용체 종류는 이에 제한되지 않으나, 시알산 및/또는 시알산 유사 기능을 갖는 작용기 (예를 들어, 시알산모사펩타이드)를 포함하는 것일 수 있다. 상기 수용체는 시알릴올리고사카라이드 (sialyloligosaccharide), 예를 들어, 강글리오사이드(ganglioside), 글리코프로테인(glycoprotein), 및 폴리시알산(polysialic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 시알산을 포함하는 수용체라면 이에 한정되지 않는다. 상기 작용기는 수용체 자체가 지질이중층에 함입 또는 결합되거나 링커(linker)를 통하여 지질이중층에 함입 또는 결합될 수 있다. 상기 수용체는 수용체 자체 또는 수용체가 결합된 링커가 나노디스크 지질이중층의 지질과 수소결합, 이온결합, 공유결합, 이황화결합 등 다양한 상호작용에 의해 결합된 것일 수 있다. 상기 수용체의 일 예로서, 인플루엔자 바이러스의 표면항원인 헤마글루티닌과 결합할 수 있는 호흡기 세포의 세포막에 존재하는 시알산으로서, 예를 들어 상기 시알산을 포함하고 세포막에 결합된 강글리오사이드를 포함할 수 있다.

본 발명에서, 지질이중층의 외피를 가지는 바이러스는 버니아비리데(Bunyaviridae)과, 코로나비리데(Coronaviridae)과， 필로비리데(Filoviridae)과, 플라비비리데(Flaviviridae)과， 헤파드나비리데(Hepadnaviridae)과, 헤르페스 비리데(Herpesviridae)과， 오스소믹소비리데(Orthomyxoviridae)과, 폭스비리데(Poxviridae)과， 랍도비리데(Rhabdoviridae)과, 레트로 비리데(Retroviridae)과， 토가비리데(Togaviridae)과, 및 헤르페스비리데(Herpesviridae)과로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 필라멘트성 파지의 작용기는 파지의 주 코트 단백질(major coat protein)에 존재하는 아민기, 카르복실산기, 또는 티올기일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 시알산 유도체는 상기 필라멘트성 파지의 주 코트 단백질 1개에 대하여 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 13개, 1 내지 10개, 1 내지 9개, 1 내지 8개, 1 내지 7개, 1 내지 6개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 2 내지 8개, 2 내지 7개, 2 내지 6개, 2 내지 5개, 2 내지 4개, 3 내지 5개, 또는 약 4개 결합되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 시알산 유도체간의 간격은 1.0 nm 이상이 될 수 있고, 1.2 nm 이상이 될 수 있으며, 1.6 nm 이상이 될 수 있고, 1.9 nm 이상이 될 수 있으며, 2.0 nm 이상이 될 수 있고, 2.1 nm 이상이 될 수 있으며, 2.4 nm 이상이 될 수 있고, 3.1 nm 이상이 될 수 있으며, 1.0 내지 4.0 nm 가 될 수 있고, 1.2 내지 4.0 nm 가 될 수 있으며, 1.6 내지 4.0 nm 가 될 수 있고, 1.9 내지 4.0 nm 가 될 수 있으며, 2.0 내지 4.0 nm 가 될 수 있고, 2.1 내지 4.0 nm 가 될 수 있으며, 2.2 내지 4.0 nm 가 될 수 있고, 2.2 내지 3.5 nm 가 될 수 있다.

본 발명에서, 본 발명의 용어 “링커(linker)”란 시알산과 파지를 연결해주는 직선형 또는 말단에 가지가 다수 뻗어 있는 가지형 분자 사슬이다. 본 발명의 링커는 정확한 분자량과 구조를 갖고, 나노 크기의 입자 형성이 용이하고, 최외각에 반응기를 다수 보유할 수 있기 때문에, 화학적 또는 물리적으로 독특한 특성을 나타내며, 표면의 밀집된 말단기에 다양한 유도체와 반응기를 도입하는 것이 가능하다. 본 발명의 링커는 유도체와 결합하는 작용기의 개수 및 길이를 조절할 수 있다. 본 발명의 링커는 1 내지 8가, 1가, 2가, 3가, 4가, 5가, 6가, 7가, 또는 8가 결합 형태의 링커일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 1가(monovalent) 및 4가(tetravalent) 형태의 링커를 사용하여, 시알산-파지 복합체를 제조하였다.

본 발명에서, 상기 링커는 시알산 유도체를 필라멘트성 파지의 작용기와 아미드, 디설파이드, 옥심, 이민, 티오에테르 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 결합을 통해 연결하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, “시알산-파지 복합체”, “시알산-파지” 또는 “SLPhage”란 시알산 유도체와 파지가 결합된 형태의 물질을 의미하며, 보다 구체적으로 하나의 파지에 하나 이상, 다수의 시알산 유도체가 결합된 형태의 물질을 의미한다. 구체적으로, 상기 결합체는 시알산 유도체가 동일한 간격으로 코어에 결합된 형태일 수 있다. 또한, 본 발명의 결합체는 시알산 유도체가 파지의 작용기를 통해 결합되거나, 또는 가지형 링커를 통해 다수의 시알산 유도체가 파지에 결합된 형태일 수 있다. 이때, 상기 파지의 작용기는 시알산 유도체가 코어에 결합될 수 있는 한, 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 공지된 반응기를 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 박테리오파지 M13의 PVIII의 N 말단 아미노기를 PDS로 기능화하고, 시알산 유도체인 3‘-시알릴락토스 및 6’-시알릴락토스와 이황화 결합 시킴으로써 시알산-파지를 성공적으로 제작하였다(실시예 1 및 실시예 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는 제작된 시알산-파지가 야생형과 유사한 우수한 분산성을 나타내며, 응집 없이 필라멘트 형태를 잘 유지하고, 인플루엔자 바이러스와 결합함으로써 인플루엔자 바이러스를 억제할 수 있음을 확인하였다(실시예 2 내지 4 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명의 시알산-파지가 세포독성 없이 안전하게 사용할 수 있음을 확인하였다(실시예 5 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 HI 분석을 통해 본 발명의 시알산-파지가 적혈구가 아닌 바이러스에 우선적으로 결합함을 확인하였다(실시예 6 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 미세중화 분석 및 CPE 억제 분석을 통해 본 발명의 시알산-파지가 숙주세포의 바이러스 감염을 억제할 뿐만 아니라, 숙주세포의 자손 바이러스 생성 또한 억제함을 확인하였다(실시예 7-1 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명의 시알산-파지가 HA에 선택적으로 결합함으로써 바이러스를 억제함을 확인하였다(실시예 7-2 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명의 시알산-파지를 전처리한 경우, 동시처리 또는 후처리하였을 때와 비교하여 바이러스 억제 효과가 가장 높은 것을 확인하였다(실시예 7-3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명의 시알산-파지가 바이러스의 플라크 형성을 우수하게 억제할 뿐만 아니라, 뉴라미니다제 억제제인 오셀타미비르와 병용하였을 때 바이러스 감염을 완전히 차단시키는 것을 확인하였다(실시예 7-4 참조).

따라서, 본 발명의 시알산-파지를 바이러스 감염증의 치료에 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.

이에, 본 발명은 상기 시알산-파지 복합체를 유효성분으로 포함하는, 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 바이러스는 동물, 식물, 세균, 방사균과 같이 살아 있는 세포에 기생하며 세포 내에서만 증식할 수 있는 수백 μm이하의 감염성 입자로서, 상기 바이러스는 특별히 이에 제한되지 않으나, RNA형 바이러스 또는 DNA형 바이러스일 수 있다.

본 발명에서 바이러스는 특별히 제한되지는 않으며, 상기와 같은 RNA형 바이러스 또는 DNA형 바이러스를 모두 포함할 수 있고, 바람직하게는 오르쏘믹소바이러스(orthomyxovirus), 파라믹소바이러스(paramyxovirus), 코로나 바이러스(coronavirus), 아테리바이러스(arterivirus), 허피스바이러스(herpesvirus) 또는 아데노바이러스(adenovirus)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 한다.

본 발명에서, 상기 바이러스는 표면에 헤마글루티닌을 가지는 바이러스라면 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 코로나 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스일 수 있다.

본 발명의 용어 "인플루엔자 바이러스(influenza virus)"란, 바이러스성 호흡기 질환의 주요 원인 병원체를 의미하는데, NP(nuleocapsid)와 M(matrix) 단백질의 항원성 차이에 의해 크게 A, B 및 C형으로 구분된다. 이 중 A형은 다시 헤마글루티닌(hemagglutinin) 단백질 항원 특성에 따라 H1형에서 H16형까지, 뉴라미다아제(Neuramidase) 단백질 항원 특성에 따라 N1형에서 N9형의 아형으로 분류된다.

본 발명의 용어 “인플루엔자 바이러스 감염증”이란, 개체에 인플루엔자 바이러스가 감염되어 나타나는 병리학적 질환을 의미한다. 예를 들어, A형 인플루엔자 바이러스의 변이주의 감염에 의해 발생되는 질환인 "신종플루"는 발열, 오한, 두통, 기침, 인후통, 콧물, 호흡곤란 등의 상기도 증상, 근육통, 관절통, 피로감, 구토, 설사 등의 증상을 나타낸다고 알려져 있다.

본 발명에서, 상기 시알산-파지 복합체는 바이러스의 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA)와 결합하여 상기 바이러스의 감염을 억제하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 조성물은 뉴라미니다제 억제제를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 뉴라미니다제 억제제는 오셀타미비르(oseltamivir), 자나미비르(zanamivir), 페라미비르(peramivir) 및 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC) 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜 4000, 폴리에칠렌글리콜 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9%염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO₃), 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na₂S₂O₅), 아황산나트륨(Na₂SO₃), 질소가스(N₂), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 시알산-파지 복합체를 유효성분으로 포함하는, 바이러스 감염증 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 시알산-파지 복합체를 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 시알산-파지 복합체를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 시알산-파지 복합체는 원료에 대하여 15 중량% 이하, 또는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 또는 약 0.04-0.10g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명은 상기 시알산-파지 복합체를 유효성분으로 포함하는, 바이러스 억제용 의약외품 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 상기 의약외품 조성물은 필터 코팅제, 핸드워시, 가그린, 소독청결제, 샤워폼, 물티슈, 세제비누, 가습기 충진제, 마스크 및 방향제로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 "바이러스 억제용 의약외품 조성물"에 있어서, 의약외품은 약사법 제2조 제7호 다목에 기재된 감염병 예방을 위하여 살균ㆍ살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제로서, 사람 또는 동물의 보건을 위해 사용되는 파리, 모기 등의 기피제, 구제제, 방지제, 방제제 또는 유인살충제를 의미할 수 있다.

또한, 상기 의약외품은 피부외용제 및 개인위생용품을 포함할 수 있다. 예를 들어, 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 또는 연고제일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 따른 상기 의약외품 조성물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용 할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명의 의약외품 조성물은 일 예로, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조된 것일 수 있다. 예를 들어, 로션 등과 같은 유액, 크림, 연고, 스프레이, 오일젤, 젤, 오일, 에어로졸, 연막제와 같은 제형을 가질 수 있으나, 본 발명의 해충 방제 유도 효과를 나타내는 것이라면 제한되지 않고 사용할 수 있다. 또한 상기 의약외품 조성물은 각각의 제형에 일반적으로 의약외품 조성물에 배합되는 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제 또는 향료 등을 필요에 따라 적절히 배합하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 시알산-파지 복합체를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 바이러스 감염증 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 시알산-파지 복합체를 유효성분으로 포함하는 조성물의 바이러스 감염증 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 시알산-파지 복합체의 바이러스 감염증 예방 또는 치료 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실험방법]

1. 실험물질

2-클로로트리틸 클로라이드 수지, Fmoc-Cys(Trt)-OH (>98%), Fmoc-Lys(Fmoc)-OH (>98%), 및 1-하이드록시벤조트리아졸 (HOBt) (>99%)은 GLbiochem(Shanghai, China)에서 구입되었다. 9-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카보닐아미노]-4,7-디옥사노난산 (Fmoc-PEG2- OH) (>98%), 디메틸술폭시드 (DMSO) (>99%), N,N-디이소프로필에틸아민 (DIPEA) (>99%), 2-메틸피페리딘 (>98%), 보란-피리딘 결합체, 트리스(2-카복시에틸)포스핀 (TCEP) (>98%), 및 숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (NHS-PDS) (>98%)는 TCI (Tokyo, Japan)에서 수득되었다. 디클로로메탄 (DCM) (99.5%), N,N-디메틸포름아미드 (DMF) (99%), 메탄올 (MeOH) (99.5%), N-메틸-2-피롤리돈 (NMP) (99%), 트리플루오로아세트산 (TFA) (99%), 페놀 (>99%), 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), N,N'-디이소프로필카보디이미드 (DIC) (99%), 티애아니솔 (>99%) 및 1,2-에탄디티올 (>99%)은 Sigma Aldrich (St. Louis, USA)에서 구입하였다. 토실 페닐알라닐 클로로메틸 케톤 (TPCK)-처리된 트립신, 최소 필수 배지(MEM), 및 항생제/항진균제 용액 (Pen/Strep/Fungiezone)은 Hyclone (Pittsburgh, USA)에서 구입하였다. 2,3’-시알릴락토스 및 2,6’-시알릴락토스는 Carbosynth (Berkshire, UK)에서 구입하였다. M13KE 박테리오파지 및 E. coli ER2738는 New England Biolabs (Ipswich, USA)에서 구입하였다. PBS 및 4-메틸움벨리페릴-N-아세틸-α-D-뉴라민산 (MUNANA)은 GoldBio (St Louis, USA)에서 구입하였다. 닭 적혈구 (cRBCs; 5%)는 Innovated Research (Novi, USA)에서 제공되었다. 소태아혈청 (FBS)은 Atlas biologicals (Fort Collins, USA)에서 공급받았다. Maackia amurensis Lectin (MAA/MAL I)-FITC, Maackia amurensis Lectin (MAA/MAL I)-Colloidal Gold, Sambucus nigra Lectin (SNA/EBL I)-FITC, 및 Sambucus nigra Lectin (SNA/EBL I)-Colloidal Gold 는 Bio-world (Dublin, USA)에서 구입하였다.

2. 시알릴락토실 리간드(SL-EG2-Cys) 합성

NH₂-EG2-Cys 링커(9-아미노-4,7-디옥사노나노일-시스테인)는 표준 Fmoc 기반 고체상 펩티드 합성에 의해 합성하였다. C- 말단 시스테인을 Fmoc-Cys (Trt) -OH (1 당량) 및 DIPEA (2.5 당량)로 처리하여 DCM에서 팽윤된 2-클로로트리틸클로라이드 수지에 10분 간 팽윤시켰다. 실온에서 1 시간 동안 DCM에서 반응시킨 후, 이어서 수지의 나머지 반응성기를 메탄올로 30 분 동안 말단-캡핑하였다. Fmoc기를 NMP에서 25 % 4-메틸피페리딘으로 30 분 동안 제거하고, 수지를 각각 커플링 후에 DMF (x2), DCM (x3), MeOH (x3) 및 DMF (x2)로 세척하였다. 각 커플링은 카이저 닌히드린 시험에 의해 확인되었다. 유연한 스페이서는 실온에서 2시간 동안 NMP에서 Fmoc-PEG2-OH, DIC 및 HOBt(수지 상의 작용기에 대해 각각 3당량)와 수지를 반응시켜 시스테인 로딩된 수지에 결합되었다. 수지 상에서의 완전한 합성 후, NH₂-EG2-Cys 링커는 실온에서 2 시간 동안 82.5 % TFA, 5 % 물, 5 % 페놀, 5 % 티오아니솔 및 2.5 % 1,2-에탄디티올의 혼합물을 사용하여 수지로부터 절단하였다. 회전식 증발기를 사용하여 용매를 제거한 후, 미정제 생성물을 빙냉 디에틸에테르 (30 배 부피)로 침전시켜 미정제 생성물을 수집하여 백색 고체를 수득하였다. NH₂-EG2-Cys 링커는 반-준비 HPLC(Phenomenex, Torrance, USA)에 의해 추가로 정제하여 >95% 순도로 수득하고, LC-MS 분석(모델 번호 1100, Agilent, Santa Clara, USA)을 통해 확인하였다. SL-EG2-Cys는 환원성 아민화를 통해 NH2-PEG2-Cys에 시알릴락토스(3' 또는 6')를 결합시킴으로써 제조하였다. 시알릴락토스(3 당량)는 0.1M 붕산나트륨 완충액(pH 8.7)에서 보란-피리딘 착물을 사용하여 NH₂-EG2-Cys의 아미노 그룹에 자기 교반과 함께 50℃에서 3일 동안 접합되었다. 보란-피리딘 착물(1 당량)을 반응 혼합물에 매일 첨가하였다. 반응 종료 시점을 결정하기 위해 합성 중에 박막 크로마토그래피(TLC) 분석을 수행하였다. 생성된 3'SL-EG2-Cys 및 6'SL-EG2-Cys를 반-준비 HPLC로 정제하고 LC-MS 분석 및 1H-NMR로 확인하고 동결 건조하여 건조 상태로 회수하였다. 생성된 백색 분말 제품은 -20 ℃ 냉동고에 보관하였다.

3. 4가 시알릴락토실 리간드(T-SL-EG2-Cys) 합성

1가 SL-EG2-Cys와 동일한 스페이서-앵커 구조를 4가 시알릴락토실 리간드에 사용하였다. 먼저 Fmoc-Lys(Fmoc)-OH를 상기 2. 시알릴락토실 리간드(SL-EG2-Cys) 합성에 설명된 NH₂-EG2-Cys에 커플링시켰다. 도입된 라이신 잔기의 알파 및 엡실론 아민기에서 Fmoc의 탈보호 후, 수지를 NMP에서 Fmoc-Lys(Fmoc)-OH, DIC 및 HOBt(수지의 아미노 작용기에 대해 각각 3 당량)로 실온에서 4시간 동안 처리하였다. Fmoc 기의 탈보호 후, 수지는 실온에서 12시간 동안 NMP:DCM(2:1 v/v)에서 Fmoc-PEG2-OH, DIC 및 HOBt(수지의 아미노 작용기에 대해 각각 2 당량)로 처리하였다. 이어서, 커플링을 확인한 후 Fmoc-탈보호, 절단 및 정제를 수행하였다. 그런 다음, 2. 시알릴락토실 리간드(SL-EG2-Cys) 합성에서 설명한 것과 동일한 방식으로 시알릴락토스를 4가 링커 [NH2-EG2-Lys(EG2-NH2)]Lys[NH2-EG2-Lys(EG2-NH2)]-EG2-Cys 에 커플링시켰으며, 4가 링커 스폿이 TLC에서 사라질 때까지 1-2일 당 1당량의 NaCNBH₃ 또는 보란·피리딘 착물을 첨가하면서 최대 10일까지 커플링 시간을 연장하였다. 생성된 [(SL-EG2-Lys(EG2-SL)]Lys[SL-EG2-Lys(EG2-SL)]-EG2-Cys는 4가 3'SL 리간드인 T-3'SL-EG2-Cys 및 4가 6'SL 리간드인 T-6'SL-EG2-Cys를 반-준비 HPLC로 정제하고 1H-NMR로 확인하고 동결 건조하여 건조 상태로 회수하였다. 생성된 백색 분말 제품은 -20℃ 냉동고에서 보관하였다.

4. 시알산-파지(SLPhage) 및 4가 시알릴락토실 리간드-접합 파지(T-SLPhage, T-시알산-파지) 제조

M13KE 파지를 37℃에서 18시간 동안 진탕하면서(230 rpm) Luria Broth에서 성장시킨 ER2738 E. coli에서 증폭하고 4℃에서 20분 동안 원심분리(8,000g)하여 수 거하였다. 파지는 [S. Zhang, M.D. Cahalan, Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit, Journal of visualized experiments : JoVE (6) (2007) 247] 문헌 내 프로토콜을 기반으로 파지 DNA를 분리한 후 DNA 시퀀싱으로 식별 및 확인하였다. 1/4 부피의 20%(w/v) 폴리에틸렌글리콜(PEG) 8000/2.5M NaCl을 첨가하여 상청액으로부터 파지를 침전시켰다. 침전된 파지는 원심분리에 의해 분리되고 PBS에서 재현탁되었다. 파지 농도는 UV/VIS 분광기(OPTIZEN POP, KLAB, 대전, 한국)를 사용하여 측정되었으며, 다음 공식을 사용하여 계산하였다 : mL당 파지 mg = (A₂₆₉-A₃₂₀)/ 3.84. M13 파지 표면을 변형하기 위해 DMSO 중 50 μL의 NHS-PDS (파지 입자의 p8 단백질에 대해 1-100 당량)를 인산염 완충액 (pH 8, 20 mM, 10 mM EDTA) 중 M13 파지 2 mL에 첨가하고 부드럽게 흔들면서 실온에서 12시간 동안 인큐베이션하였다.

이어서 PBS로 투석(뱀가죽 투석 튜브, MWCO 10kDa)하여 과잉 시약을 제거하였다. 과량의 TCEP로 파지의 분취물을 처리함으로써 UV/VIS 분광계(343 nm)를 사용하여 피리딘-2-티온(P2T)의 방출을 정량화하기 위해, 파지 상의 피리딜디설파이드(PDS) 기의 로딩을 측정하였다. 활성화된 피리딜디설파이드-파지(PDS-파지)를 SL-PEG2-Cys(PDS-파지 상의 PDS 그룹에 대해 3 당량)와 접합시켰다. 접합으로부터 방출된 P2T는 흡광도를 이용하여 측정하고 P2T의 표준곡선을 기준으로 계산하였다.

5. 세포 배양

Madin-Darby 송곳니 신장 상피 세포(MDCK-II, NBL-2, ATCC에서 구입)를 10% FBS, 100μg/mL의 페니실린 G 및 100μg/mL의 스트렙토마이신이 보충된 MEM에서 37 ℃, 5 % CO₂ 조건에서 성장시켰다. 세포는 격주로 계대되었고 12-18의 계대 수 이후 실험에 사용하였다.

6. 바이러스 수확 및 정제

인플루엔자 A 바이러스(IAV) 균주 A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8), A/Aichi/2/1968(H3N2)(X31) 및 A/Sydney/5/97(H3N2)은 37 ℃ 및 40 % 습도에서 각 바이러스로 감염된 계란의 난포액으로부터 수확되었다. 3일 후, 난포액은 PBS 중 50, 40, 30 및 20%(w/v) 농도의 수크로스 8mL로 구성된 4단계 불연속 자당 구배에 의해 분리되었다. 바이러스 역가는 혈구응집 분석 및 플라크 형성 분석을 수행하여 결정하였다.

7. 혈구응집 억제(HI) 분석

혈구응집을 억제하는 파지의 능력은 표준 HI 분석 프로토콜을 사용하여 조사하였다. 바이러스의 HA 역가는 HI 연구 직전에 결정되었다. SLPhage 현탁액을 PBS로 2배 직렬 희석하고, 둥근 바닥 96웰 플레이트의 각 웰(25μL/웰)에 넣은 다음, 37 ℃에서 1시간 동안 IAV의 4개 HA 단위 25μL와 혼합하였다. 이어서, 50 μL의 1%(w/v) 닭 적혈구(cRBC)를 혼합물에 첨가한 다음 실온에서 1시간 동안 배양하였다(n = 3). 적혈구의 침전은 육안 검사에 의해 평가되었다. 혈구응집을 완전히 억제하는데 필요한 최소 농도를 Ki^HAI로 정의하였다.

8. 시험관 내 미세중화 분석

MDCK 세포(2 × 10⁴ cells/mL, 100 μL)를 MEM의 96-웰 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 분주하고 감염 하루 전에 5% CO_2, 37 ℃ 조건에서 배양하였다. 감염 당일 PBS에서 SLPhage의 2배 직렬 희석액을 준비하였다. 직렬 희석액(5 μL)의 분취액을 감염 배지(195 μL, IAV 최종 농도 2 x 10³ pfu/mL)에서 IAV와 혼합하고 37 ℃, 5% CO₂ 조건에서 1시간 동안 배양하였다. 한편, 세포를 PBS로 2회 세척하고, 전처리된 또는 온전한 바이러스(감염 다중도(MOI) 0.1)를 감염 배지(200 μL)에 첨가하였다. 이어서, 세포를 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 PBS 중 50 μL의 4-MUNANA 용액(150 μM)을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 1M Na₂CO₃ 수용액 50㎕로 반응을 종결시켰다. 마지막으로 마이크로플레이트 리더(Synergy H1, BioTek, Winooski, USA)를 사용하여 460 nm에서 형광(여기: 365 nm)을 측정하였다. 억제율은 다음 방정식을 사용하여 계산하였다 : 억제 활성(%)= [1 - (FI _460nm of “Cell + IAV phage-treated” - FI _460nm of “IAV only”) / (FI _{460 nm} of “Cell + IAV untreated” - FI _{460 nm} of “IAV only”)] × 100, 여기서 FI _460nm는 MUNANA 분석에서 관찰된 460 nm에서의 형광 강도를 나타낸다.

9. 세포변성 효과(CPE) 억제 분석

MDCK 세포를 96웰 플레이트(2 x 10⁴ cells/well)의 웰에 접종하고 24시간 동안 인큐베이션하였다. IAV는 CPE 배지 (HA 활성화를 위해 100U/mL의 페니실린 G, 100μg/mL의 스트렙토마이신, 0.25μg/mL 암포테리신 B 및 2μg/mL TPCK 처리 트립신을 포함하는 MEM)에서 MOI = 0.1-0.2로 희석되었다. SLPhage를 2배로 직렬 희석하고 각각을 감염 전에 1시간 동안 37℃에서 IAV 현탁액과 혼합하였다. MDCK 세포를 PBS로 세척한 다음 100 μL의 IAV-SLPhage 혼합물로 처리한 다음 37℃, 5% CO₂조건에서 1-2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 각 웰을 PBS로 세척한 다음 100 μL의 CPE 배지로 처리하고 37℃에서 5% CO₂로 24시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 4% 포름알데히드로 1시간 동안 고정하고 0.5%(w/v) 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 크리스탈 바이올렛을 메탄올에 녹이고 570 nm에서 메탄올 용액의 흡광도를 마이크로플레이트 리더(Synergy H1, BioTek, Winooski, USA)를 사용하여 측정하였다.

10. 플라크 형성 감소 분석

6-웰 플레이트의 컨플루언트된 MDCK 세포를 PBS로 2회 세척하고, 처리되지 않거나 620pM의 SLPhage로 처리한 IAV의 균주(100pfu/웰)로 접종하고, 시소(see-saw) 쉐이커를 사용하여 부드럽게 교반하면서 25℃에서 1시간 동안 배양하였다. PBS로 두 번 세척한 후, 세포를 1x Dulbecco의 변형된 이글 배지와 HA 활성화를 위한 2 μg/mL TPCK 처리 트립신을 포함하는 1%(w/v) 아가로스로 덮었다. SLPhage의 후처리 효과를 조사하기 위해, 처리되지 않은 세포가 유사하게 6'SLPhage와 중첩되었지만 추가로 포함되었다. 플레이트를 37℃, 5% CO₂ 조건에서 2일 동안 배양한 다음, 세포 단층을 3.8% 포름알데히드로 고정하고 시각화를 위해 0.5%(w/v) 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다.

11. 면역조직화학 분석

인간 폐 상피 암종(A549) 세포(CCL-185™, ATCC에서 구입)(1 x 10⁴ 세포)를 5% CO₂ 하에서 37℃에서 24시간 동안 커버 유리(6웰 플레이트)에 접종하였다. 감염 전에 X31 바이러스를 실온에서 30분 동안 6'SLPhage(620pM)로 전처리하였다. 세포를 PBS로 세척하고 37℃에서 24시간 동안 전처리 또는 미처리 바이러스(MOI 0.1)를 접종하였다.

그런 다음, 세포를 PBS 중 3.8%(v/v) 포름알데히드로 15분 동안 고정하고 PBS 중 0.5% Triton X-100으로 5분 동안 투명화시켰다. PBS에서 2시간 동안 3% 소 혈청 알부민(BSA)으로 차단한 후, 12시간 동안 4℃에서 1차 마우스 항-NP 단일클론항체(1:260 희석)(ab20343, Abcam)를 사용하여 면역염색을 수행하였다. PBS로 세척한 후, 세포를 Alexa Fluor 488-접합 염소 항-마우스 항체(1:200 희석)(A-11029, Invitrogen)와 함께 25℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 DNA는 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 사용하여 염색되었다. 형광현미경은 Leica(DMi8) 현미경(Buffalo Grove, USA)을 사용하였다. 획득한 이미지는 ImageJ 소프트웨어(http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html)를 사용하여 바이러스 뉴클레오프로틴(NP) 발현에 대해 분석하였다.

12. TEM 분석

PBS 완충액(20μL) 중 SLPhage 분산액(2 x 10¹⁰ 비리온/mL)을 PBS 중 20μL의 IAV(2 x 10⁷ pfu/mL)와 혼합하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 한편, 탄소 코팅된 구리 그리드(TED pella)는 50kHz, 20W, 10torr 및 N₂ 유량 5 cm/min에서 5분 동안 플라즈마 처리되었다(CUTE-MP/R; Femto-Science). 바이러스-파지 혼합물 용액(10 μL)의 방울을 배치하고 플라즈마 처리된 그리드에 10분 동안 인큐베이션하였다. 여분의 액체는 여과지를 사용하여 제거하고 우라닐 아세테이트(1% w/v) 방울을 그리드에 10초 동안 적용하였다. 초과분을 다시 닦아내고 그리드를 공기 건조시켰다. TEM(JEOL, JEM-3010)을 이용하여 180kV의 가속전압에서 시편(specimens)을 분석하였다.

13. 세포독성 분석

세포 생존율 분석은 제조사의 표준 프로토콜에 따라 Cell Counting Kit-8(Dojindo, Japan)을 사용하여 수행하였다. MDCK II 세포를 96웰 플레이트(3x10³ 세포/웰)에 접종하고 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다. 다음날, 세포를 PBS로 2회 세척한 다음, 다양한 최종 농도(97-6, 200 pM 파지)에서 SLPhage 분산액(PBS 중 10 μL)을 첨가하였다. 20 μL의 WST-8 시약을 각 웰에 첨가하기 전에 세포를 37℃에서 12, 24 및 48시간 동안 SLPhage로 유지시켰다. CO₂ 인큐베이터에서 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 450 nm에서의 흡광도를 기록하고 파지가 처리되지 않은 세포의 최대 세포 생존율로 데이터를 정규화하였다.

14. FITC 접합 렉틴으로 SLPhage의 라벨링

Maackia amurensis Lectin(MAA/MAL I)-FITC 및 Sambucus nigra Lectin(SNA/EBL I)-FITC는 각각 3'-시알릴락토스-특이적 및 6'-시알릴락토스-특이적 렉틴으로 사용되었다. PBS(pH 7.4)에 녹인 SLPhage 현탁액(50 μL, 0.1 mg/mL)을 렉틴-FITC 용액(50 μL, 8.33 g/mL)과 혼합하고 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 그 다음 혼합물을 원심분리 튜브 필터(CLS8160, Sigma-Aldrich, USA)를 사용하여 4,000g에서 10초 동안 여과하여 결합되지 않은 렉틴-FITC를 버렸다. 여과된 파지를 PBS로 재현탁시키고 PBS(200 ㎕)를 필터에 첨가하고 후속적으로 13,000 g에서 5분 동안 원심분리하여 수집하였다. 최종 여과액의 형광(520 nm)은 형광 모드에서 마이크로플레이트 판독기(Biotek synergy h1 hybrid multi-mode)를 사용하여 측정되었다.

15. 콜로이드 결합 렉틴으로 SLPhage의 라벨링

Sambucus nigra Lectin(SNA/EBL I)-colloidal gold는 6'sialyllactose-specific lectin으로 사용하였다. PBS(pH 7.4)에 녹인 6'SLPhage 현탁액(10 μL, 0.1 mg/mL)을 렉틴 콜로이드 금 용액(90 μL, 0.1 mg/mL)과 혼합하고 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 한편, 탄소 코팅된 구리 그리드(TED pella)는 50kHz, 20W, 10torr 및 N₂ 유량 5cm/min에서 5분 동안 플라즈마 처리되었다(CUTE-MP/R; Femto-Science). 파지-콜로이드 금 혼합물 용액(10 μL)의 방울을 배치하고 플라즈마 처리된 그리드에 10분 동안 인큐베이션하였다. 여분의 액체는 여과지를 사용하여 제거하고 우라닐 아세테이트(1% w/v) 방울을 그리드에 10초 동안 적용하였다. 초과분을 다시 닦아내고 그리드를 공기 건조시켰다. TEM(JEOL, JEM-3010)을 이용하여 180kV의 가속전압에서 시편을 분석하였다.

실시예 1. 시알릴락토실 리간드의 합성

도 1에 나타난 바와 같이, 파지에 연결 가능한 시알릴락토실 리간드를 설계하고 합성하였다. M13 파지에 시알릴 그룹을 연결하는 유연한 링커인 NH₂-EG2-Cys는 고체상 합성에 의해 합성되었다. 링커는 시알릴락토스와의 접합을 위한 아미노기와 양쪽 말단의 M13 파지 표면에 주 코트 단백질 pVIII에 고정하기 위한 티올기를 모두 가지도록 설계되었다. NH₂-EG2-Cys를 시알릴락토스(2,3' 또는 2,6')로 유도체화하여 환원성 아민화를 통해 SL-EG2-Cys를 생성하고 3'SL-EG2-Cys 및 6'SL-EG2-Cys를 유도하였다(도 1).

또한, 도 2에 나타난 바와 같이, 1가 시알릴락토실 리간드의 합성(90-94%)은 질량 분석에 의해 확인되었다.

또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 각 리간드의 4가 형태는 덴드리머 라이신 구조를 기반으로 성공적으로 합성되었으며, IAV 억제에 대한 다가 리간드 효과의 조사를 위해 T-3'SL-EG2-Cys 및 T-6'SL-EG2-Cys를 제공할 수 있었다. 4가 시알릴락토실 리간드의 형성(>90% 순도)은 NMR 분석에 의해 확인되었다(도 4 및 도 5).

실시예 2. 파지에 대한 시알릴락토실 리간드의 접합

M13 파지에 티올 반응성 부위를 도입하기 위해, 캡시드의 용매 노출 외부(~3000개 카피)에 존재하는 pVIII의 N-말단 아미노기를 PDS-파지 합성을 위한 PDS 기로 기능화하였다(도 6a). PDS-파지를 TCEP로 처리한 후 M13 파지에 존재하는 PDS 그룹으로부터 방출된 피리딘-2-티온(P2T)의 농도를 측정함으로써 M13 파지에 대한 PDS가 잘 로딩되었는지 평가하였다. PDS 로딩은 커플링 반응에서 M13 파지에 존재하는 pVIII에 대한 NHS-PDS의 등가 몰비에 의해 제어되는 파지 입자당 660-4000 PDS로 다양했다. 다음으로, SL-EG2-Cys를 시알릴락토실 그룹과 M13 파지 사이에 이황화 결합이 있는 PDS-파지에 결합하여 SLPhage를 얻었다(그림 6a). 시알릴락토실기의 성공적인 로딩은 상기 설명한 대로 방출된 P2T의 농도를 측정하여 결정되었다(도 7). 시스테인 잔기를 갖는 시알릴락토실 리간드는 파지 상에 PDS 그룹을 남기지 않고 이황화 결합을 통해 정량적으로 PDS-파지에 결합되었으며, 이는 후속 TCEP 처리 및 흡광도 측정에 의해 다시 확인되었다. 파지 상의 시알릴락토실 리간드의 로딩은 NHS-PDS 이중-가교제의 몰 당량을 조절함으로써 조절되었다(표 2). 가장 높은 로딩은 ~3000(pVIII N-말단 아미노기의 수)을 약간 초과하는 ~4000 시알릴락토실기를 파지에서 입증하였다. 이는 시알릴락토실 리간드와의 커플링에서 pVIII의 Lys8의 참여로부터 기인한 것일 수 있다. 4가 시알릴락토실 리간드가 결합된 SLPhage(T-3'SLPhage 및 T-6'SLPhage)도 동일한 방식으로 제조되었으며(도 6b 및 도 6c) 이들의 로딩 수준은 3990-4080 리간드/파지인 것으로 측정되었다.

NHS-PDS (equiv.)	Number of SL/phage
1	660-1140
1.5-2	1530-1830
10	2450-2730
100	3030-4230

실시예 3. SLPhage의 특성 확인

3-1. 분산성 및 형태 확인

인플루엔자 바이러스를 감싸기 위해서는 변형된 파지가 응집 없이 분산 안정성이 좋아야 한다. 제타 전위 측정 결과(n = 3), 인산완충식염수(PBS, pH 7.4) 상의 SLPhages는 -15.4 ± 1.5 mV의 제타 전위 값을 나타냈으며, 이는 야생형(WT) 파지보다 약간 낮은 값이었다. (-13.2 ± 1.5 mV). WT 파지는 pVIII의 노출면에 음전하를 띤 글루타메이트 및 아스파테이트 잔기로 인해 중성 pH에서 우수한 분산 안정성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 상기 결과는 시알릴락토실 리간드에서 2차 아민과 카르복실산 그룹의 공존이 리간드 고정화 후 파지의 제타 전위 값을 약간 이동시킨 것으로 보인다.

하지만, 도 6d 및 도 8에 나타난 바와 같이, TEM 이미지로부터 SLPhage와 T-SLPhage 또한 응집 없이 필라멘트 형태를 잘 유지한다는 것을 확인하였다.

3-2. 특정 렉틴 결합 특성 확인

파지에 시알릴락토스의 결합은 FITC-접합된 및 콜로이드 금-접합된 렉틴으로 파지를 라벨링하여 확인하였다. 라벨링을 위해 3'SL 특이적 렉틴 MAA/MAL I 및 6'SL 특이적 렉틴 SNA/EBL I이 사용되었다.

도 6e 및 도 6f에 나타난 바와 같이, 형광 측정 및 TEM 분석을 통해, 3'SLPhage(T-3'SLPhage) 및 6'SLPhage(T-6'SLPhage)가 각각 MAA/MAL I 및 SNA/EBL I에 대한 특정 상호작용 선호도를 나타내는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 파지의 성공적인 기능화를 뒷받침한다.

실시예 4. IAV-SLPhage의 상호작용 확인

도 9에 나타난 바와 같이, 표면에서 pVIII의 인접한 두 N-말단 사이의 거리는 M13 파지 필라멘트의 장축을 따라 약 3.2nm이고 나선 배열된 단백질을 따라 2.4nm였다. 시알릴락토실 그룹은 유연한 스페이서(완전히 신장된 길이 ~2 nm)를 통해 M13 파지에서 pVIII의 각 N-말단에 연결되어 있기 때문에, SLPhage가 HA 삼량체의 4.2 nm 위치에 맞는 시알릴락토실 그룹 사이의 간격을 조정할 수 있는 능력을 보여줄 수 있을 것이라 추측하였다. 또한, 자유롭게 회전하는 2개의 HA 삼량체에 존재하는 두 개의 표준 결합 포켓 사이의 거리는 4.9~15.4nm에 이르며, 이는 산술적으로 장축을 따라 많은 양의 시알릴락토실 그룹이 있는 단일 M13 파지(~1 μm)가 단일 인플루엔자 바이러스 입자에 존재하는 최대 65-200개의 HA 결합 포켓에 결합에 참여할 수 있음을 의미한다.

따라서, 단일 SLPhage 입자가 다음과 같이 나열된 인플루엔자 바이러스 입자에 결합할 때 두 가지 이벤트가 발생할 수 있다고 가정하였다 : (1) 필라멘트성 파지가 길이를 따라 여러 인플루엔자 바이러스 입자에 결합하여 파지와 인플루엔자 바이러스의 얽힌 집합체를 형성함, (2) 부분적으로 결합된 파지는 시간이 지남에 따라 인플루엔자 바이러스 입자 주위를 순차적으로 감쌀 것임.

이에, 도 10의 a에 나타난 바와 같이, IAV의 두 가지 하위 유형, 즉 A/Puerto Rico/8/34(PR8; H1N1) 및 A/Aichi/2/1968(X31; H3N2)을 사용하여 SLPhage-인플루엔자 바이러스 결합의 TEM 분석으로 상기 가정을 확인하였다.

도 10의 b 내지 10d에 나타난 바와 같이, WT 파지는 PR8 및 X31 바이러스에 대해 검출 가능한 결합을 나타내지 않은 반면, 사용된 모든 바이러스는 SLPhage 및 T-SLPhage(각각 3' 또는 6')와 상호작용하는 것을 확인하였다.

또한, 도 10의 c에 나타난 바와 같이, SLPhage 및 T-SLPhage로 처리된 IAV의 TEM 이미지는 두 가지 상호작용 패턴을 보여주었다 : (1) 각 필라멘트성 파지는 여러 바이러스 입자에 결합하여 파지-IAV 응집체를 형성하였다. (2) 몇 개의 파지가 바이러스 입자 주위를 감쌌다. 즉, TEM 분석을 통해 SLPhage와 IAV 사이의 접착 상호작용이 SLPhage의 굽힘 및 IAV 주위를 감싸기 위해 충분히 강함을 확인하였다.

실시예 5. 세포독성 확인

SLPhages가 IAV에 대한 강력한 결합제 및 차단제로 확인되었기 때문에 MDCK 및 A549 세포에서 SLPhages의 세포 독성을 평가하였다.

도 11에 나타난 바와 같이, 최대 3.2 nM 농도(3.7 x 10¹² 플라크 형성 단위(pfu)/mL)에서도 유의한 세포독성이 관찰되지 않았으며, 이는 SLPhage에 의해 운반되는 SL 모이어티의 ~100 μM을 기반으로 확인된 최고 농도였다. 상기 결과는 시알릴락토실화된 파지의 높은 세포 생존력을 나타내며, 서브나노몰 수준에서 IAV 감염의 효과적인 시험관내 억제 효과를 뒷받침한다.

실시예 6. HI 분석

HI 분석을 통해, 시알릴락토실기가 다양한 농도로 로딩된 SLPhage(660-4230 SL 그룹/파지 입자)가 세포 수용체에 대한 바이러스 결합을 차단하는지 조사하였다.

표 3에 나타난 바와 같이, 기능화되지 않은 WT 파지는 최대 180nM에 이르는 농도 범위에서도 혈구 응집을 억제하지 않았다.

또한, 도 12a 및 표 3에 나타난 바와 같이, 단량체성 시알릴락토스(3' 및 6')는 5mM의 높은 농도에서도 혈구응집의 억제를 나타내지 않았으며, 단순 시알릴락토스의 낮은 결합 상수를 나타낼 뿐이었다.

이에 반해, 도 12b에 나타난 바와 같이, SL 함량이 높은 SLPhage(2760-4230 SL/phage)는 적혈구가 아닌 SLPhage에 바이러스가 결합하기 때문에, 적혈구가 가라앉아 생기는 작은 점(button)의 형성을 유도하였다.

또한, 표 3에 나타난 바와 같이, 상기 SLPhage는 PR8의 경우 775pM~3.1nM, X31 균주의 경우 12.1~100pM의 농도 범위로 혈구응집을 효과적으로 억제하였다. 또한, PR8 및 X31 균주 모두 3'SLPhage보다 6'SLPhage에 우선적으로 결합하는 것으로 관찰되었다. SLPhage의 억제 활성은 파지에 결합된 SL의 부하가 낮을수록 유의하게 감소하였다. 상기 결과는 SL 로딩 수준이 바이러스 결합 능력의 중요한 결정 요인임을 나타낸다. 이와 대조적으로, 4가 SL 리간드-운반 파지(T-3'SLPhage 및 T-6'SLPhage)는 각각 3'SLPhage 및 6'SLPhage보다 높은 수준의 혈구 응집 억제를 나타냈다. 또한, 파지의 시알릴락토실 리간드가 단량체 SL에 의한 것과 비교하여 다가 결합 특징을 기반으로 최대 5배 이상으로 상당히 높은 억제 활성을 나타낼 수 있음을 관찰하였다. 이와 같이, 본 발명의 4가 SLPhage는 단량체 SLPhage와 비교해 억제 활성이 현저히 우수함을 확인하였다.

항목	물질	로딩 수준 (ligand/phage virion)	Ki HAI
			PR8 (H1N1)	X31 (H3N2)
1	3’SLPhage22	660	n.d. up to 31nM	n.d. up to 31nM
2	3’SLPhage61	1830	n.d. up to 31 nM	31nM
3	3’SLPhage92	2760	2.9 nM	100 pM
4	3’SLPhage133	3990	3.1 nM	50 pM
5	6’SLPhage141	4230	775 pM	12.1 pM
6	T-3’SLPhage113	3390	190 pM	-
7	T-3’SLPhage136	4080	194 pM	24.2 pM
8	T-6’SLPhage133	3990	97 pM	3.0 pM
9	WT phage	-	n.d. up to 180nM	n.d. up to 180nM
10	3’SL	-	n.d. up to 5 mM	n.d. up to 5 mM
11	6’SL	-	n.d. up to 5 mM	n.d. up to 5 mM

실시예 7. 세포 기반 억제 분석 및 작용 메커니즘 확인

7-1. 미세중화 분석 및 CPE 억제 분석

MUNANA 기반 미세중화 분석 및 CPE 억제 분석을 사용하여 SLPhage 및 T-SLPhage가 숙주 세포(MDCK)의 바이러스 감염을 억제하여 바이러스의 세포변성 효과와 함께 자손 바이러스 생성을 억제할 수 있는지 평가하였다. 고 SL-로딩 SLPhage 및 T-SLPhage는 미세중화 분석 결과로부터 관찰된 바와 같이, 14 내지 151 pM 범위의 IC50 값을 나타내어 현저한 억제 효과를 확인할 수 있었다(표 3).

도 12c에 나타난 바와 같이, CPE 억제 분석에서 X31의 0.2 MOI로 감염된 바이러스 대조군 세포는 접종 후 2일째에 세포변성 효과로 인해 깨끗한 영역을 나타내는 플레이트에서 분리된 것으로 나타났다. 이와 대조적으로, T-6'SLPhage₁₃₃으로 처리하면 5pM에서 CPE가 상당히 완화되었고 124pM에서 IV 유도 CPE로부터 세포가 명확하게 보호되었다.

또한, 표 4에 나타난 바와 같이, 고 SL-로딩 SLPhage 및 T-SLPhage는 CPE 억제 분석 결과에서 관찰된 바와 같이 PR8 및 X31에 대해 54pM에서 1.76nM 범위의 IC50으로 현저한 억제를 보여주었다. 한편, HI 분석 결과와 유사하게 T-3'SLPhage 및 T-6'SLPhage 모두 개선된 바이러스 억제 활성을 나타냈다. 그러나 SL 수에 따른 억제 효능은 비례하지 않았다. 상기 결과는 1가 SL 리간드(3300-4200 SL/파지)가 많이 로드된 SLPhage가 이미 다가 결합 기능을 이용하여 IV에 대해 높은 친화성을 나타냄을 뒷받침한다. 한편, WT 파지 및 단량체 SL은 미세중화 분석의 결과에서 관찰된 바와 같이 가장 높은 농도에서도 자손 바이러스 생성의 억제를 나타내지 않았다.

또한, 표 4에 나타난 바와 같이, 미세중화 분석에서 IC50 값을 기반으로 하여 단량체 SL과 비교하여 SL 함유 파지는 PR8 및 X31에 대해 각각 6370-13450배 이상 및 5000-9590배 이상 높은 억제율을 나타냈다. 이러한 결과는 파지 상의 SL이 단량체 SL에 비해 다가 결합 특징을 갖는 훨씬 더 강력한 억제 활성을 입증할 수 있음을 보여준다.

도 12d, 도 12e, 및 도 13에 나타난 바와 같이, SLPhage와 T-SLPhage는 시험관 내 세포 감염과 바이러스의 자손 생성을 농도 의존적으로 효과적으로 억제하였다.

또한, 표 5에 나타난 바와 같이, 또 다른 유행성 균주인 인플루엔자 A/Sydney/H3N2에 대해서도 3'SLPhage가 우수한 억제 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

또한, 표 4 및 도 14에 나타난 바와 같이, 항인플루엔자 뉴라미니다제 억제제인 오셀타미비르 카르복실레이트(OC)는 CPE 억제 분석에서 ~20 nM의 IC50을 나타내었다. A549 세포에 대한 미세중화 분석에서도 SLPhage와 T-SLPhage는 최대 2.4pM의 IC50을 나타내며 현저한 억제 활성을 나타내었으며(도 15), 이는 기존의 다른 유형의 다가 억제제와 비교하여 SLPhage의 우수한 시험관 내 활성을 뒷받침하는 결과이다.

Entry	Materials	Loading level	PR8 (H1N1)		X31 (IC50)
			IC50 - MUNANA	IC50 - CPE	IC50 - MUNANA	IC50 - CPE
1	3'SLPhage 133	3390	139 pM (471nM)	1.76 nM (6.0mM)	151 pM (602nM)	463 pM (1.57mM)
2	6'SLPhage141	4230	53 pM (224nM)	406 pM (1.7mM)	74 pM (313nM)	116 pM (491nM)
3	T-3'SLPhage136	4080	28 pM (114.2nM)	253 pM (1.03mM)	135 pM (551nM)	346 pM (1.41mM)
4	T-6'SLPhage133	3990	14 pM (55.9nM)	54 pM (215nM)	67 pM (267nM)	91 pM (363nM)
5	WT phage	-	n.d. up to 310 nM	-	n.d. up to 310 nM	-
6	3'SL	-	n.d. up to 3 mM	-	n.d. up to 3 mM	-
7	6'SL	-	n.d. up to 3 mM	-	n.d. up to 3 mM	-
8	Oseltamivir carboxylate	-	-	23.6 nM	-	18.3 nM

* 괄호 안은 시알릴락토실 리간드 수에 기초한 IC₅₀

SLPhage	Loading level (ligands/phage)	Sydney (H3N2)
		IC50 (MUNANA)
3’SLPhage120	3600	14.5 pM (52.2 nM)

7-2. SLPhages의 억제 활성에 대한 바이러스성 뉴라미니다제 효과

뉴라미니다제(NA)의 약 50개 카피가 IAV 표면에 존재하기 때문에 이러한 NA는 SLPhage의 SL 리간드의 가수분해에 참여할 수 있어 IAV 결합 능력의 손실 또는 감소를 초래할 수 있다. 따라서, 6'SLPhage 단독 또는 뉴라미니다제 억제제인 오셀타미비르 카르복실레이트(OC; 5 μM)와 함께 6'SLPhage로 사전 처리된 PR8(0.1 MOI)을 사용하여 CPE 억제를 조사했다.

도 12f에 나타난 바와 같이, 6'SLPhage와 오셀타미비르의 혼합물로 PR8을 전처리해도 억제가 개선되지는 않았다. 이는 SLPhage의 IAV-결합 능력이 가능한 경쟁적 NA-매개 가수분해에 의해 감소되지 않음을 시사한다. 상기 결과는 바이러스 표면의 NA(~50개 카피)에 의해 가수분해되는 것보다 HA(~400개 카피)에 결합하는 SLPhage가 더 높은 확률로 존재함을 나타낸다.

7-3. 첨가 시간에 따른 비교 분석

SLPhage의 항인플루엔자 효과의 메커니즘을 탐구하고 SLPhage가 IAV를 억제하는 단계를 설명하기 위해, time-of-addition MUNANA 분석을 수행하였다(도 16a).

도 16b에 나타난 바와 같이, 6'SLPhage(농도, 124 pM ~ 3.1 nM)는 접종 전에 바이러스와 함께 배양할 때 가장 높은 억제율을 보이고(53-95%), 세포에 함께 첨가할 때 중간 수준의 억제율(22-59%)을 나타냈다. 접종 2시간 후 세포에 첨가했을 때는 가장 낮은 억제율(10-42%)을 보였다.

이러한 결과는 6'SLPhage가 IAV의 혈구응집소 매개 진입을 억제함으로써 항바이러스제 역할을 한다는 가설을 뒷받침한다.

처리 후 단계에서 가장 낮은 억제 효율이 관찰되었지만 6'SLPhage는 3.1nM에서 최대 42%의 농도 의존적 억제를 나타냈다. 상기 결과는 SLPhage가 여전히 IAV에 대한 강력한 치료제가 될 수 있음을 나타내며, 단독 또는 현재 사용 가능한 억제제와 조합하여 IAV에 대한 잠재적인 치료제로 사용될 수 있음을 나타낸다.

따라서, 다음 두 가지 다른 방법, 즉 IAV의 전처리 또는 후처리를 통해 플라크 형성 감소 분석을 수행하였고, T-6'SLPhage의 치료 가능성을 평가하였다. T-6'SLPhage는 한천 오버레이에 포함되었다(도 16c).

도 17에 나타난 바와 같이, WT 파지는 처리 전과 후 모두에서 플라크 형성의 감소를 나타내지 않았다. .

이와 대조적으로, 도 16d 및 도 16e에 나타난 바와 같이, T-6'SLPhage는 처리 전 및 후 조건 모두에서 플라크 형성을 현저하게 감소시켰다. 즉, 바이러스 대조군(~400개의 플라크/웰)과 비교하여 처리 전 및 후 그룹은 플라크 크기가 상당히 감소한 것으로 나타났다. T-6'SLPhage의 124 pM에서 플라크 면적은 처리 전 및 후 그룹에 대해 각각 ~50% 및 ~43% 감소했다. 플라크 면적은 620 pM 파지 농도에서 처리 전 및 후 그룹에 대해 각각 ~87% 및 ~69%만큼 더 감소했다. 처리 후 그룹에서의 억제 효과는 다가 리간드를 가진 T-6'SLPhage가 감염된 세포에서 생성된 감염성 자손 바이러스를 효율적으로 포획하여 플라크의 성장을 강력하게 억제함을 나타낸다.

한편, 도 16b, 도 16d, 도 16e 내지 도 16g에 나타난 바와 같이, 처리 후 그룹이 처리 전 그룹에 비해 상대적으로 낮은 억제를 나타내었지만, SLPhage가 다음 두 가지 측면을 기반으로 여전히 큰 치료 잠재력을 가지고 있다고 생각된다: (1) 더 낮은 농도(620 pM)에서 4가 시알릴락토실 리간드를 제시하는 파지인 T-6'SLPhage는 처리 후 조건에서 플라크 감소 분석에서 최대 69-82%까지 개선된 IAV 감염 억제를 나타냈다. (2) T-6'SLPhage(620pM)와 현재 사용 가능한 치료제 oseltamivir(5nM)의 병용을 통해, 처리 후 조건에서 바이러스 감염을 완전히 차단하였다.

또한, T-6'SLPhage가 바이러스가 숙주 세포로 들어가는 것을 차단함으로써 IAV를 실제로 억제하는지 여부를 더 조사하기 위해, 바이러스 단독 (X31) 또는 파지 처리 바이러스로 접종한 후 바이러스 핵 단백질과 세포 핵을 표지하여 면역 조직 화학 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 18에 나타난 바와 같이, 파지 처리가 무처리에 비해 X31의 A549 세포 내로의 진입을 유의하게 감소시키는 것을 관찰하였다.

7-4. 플라크 감소에 대한 SLPhage 및 oseltamivir와의 병용 처리 효과 확인

플라크 감소에 대한 NA 억제제 oseltamivir와 T-6'SLPhage의 조합 효과를 조사하였다.

도 16g에 나타난 바와 같이, 바이러스 대조군이 웰당 ~200개의 플라크를 나타내었을 때, 플라크 면적은 각각 5nM OC 및 620pM T-6'SLPhage 처리에 의해 ~58% 및 ~82% 감소하였다.

또한, 도 16f 및 도 16g에 나타난 바와 같이, 두 항바이러스제의 조합은 바이러스 감염을 거의 완전히 차단하여, T-6'SLPhage가 현재 사용 가능한 뉴라미니다제 억제제와의 조합 요법으로 바이러스 치료에 유용할 수 있음을 나타낸다.

종합하면, 본 발명의 두 가지 유형의 시알릴락토실 리간드가 있는 일련의 SLPhage는 PR8 및 X31을 포함한 IAV의 두 가지 다른 하위 유형의 현저한 억제를 보여주었다. HAI 및 숙주 세포 감염 억제(예: MUNANA 기반 및 CPE 억제) 분석에서 SLPhages는 각각 3pM~3.1nM 범위의 HI 상수(Ki^HAI)와 2.4pM~1.76nM 범위의 IC50을 나타냈다. 또한, SLPhages가 기존의 다른 항-인플루엔자 제제와 비교하여 동등하거나 더 높은 억제 활성(시험관 내)을 갖는 매우 강력한 항인플루엔자제임을 확인하였다. 이는 T-6'SLPhage에 의한 PR8 및 X31에 대한 2.4-91 pM의 IC50으로 가장 잘 확인되었다.

따라서, 본 발명의 시알산이 결합된 파지를 인플루엔자 바이러스를 포함하는 바이러스 감염증의 치료에 유용하게 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (19)

1. 필라멘트성 파지와 하나 이상의 시알산 유도체가 결합된 시알산-파지 복합체로서,
   상기 시알산 유도체는 필라멘트성 파지의 표면에 결합되고,
   상기 시알산 유도체가 주 코트 단백질에 한개 이상 결합된 경우, 서로 동일한 간격으로 배열된 것을 특징으로 하는, 시알산-파지 복합체.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 시알산 유도체는 3'-시알릴락토스(3'-Sialyllactose), 6'-시알릴락토스(6'-Sialyllactose), α2, 3'-시알릴갈락토스(α2, 3'-sialylgalactose), α2, 6'-시알릴갈락토스(α2, 6'-sialylgalactose), 시알릴락토-N-테트라오스(sialyl lacto-N-tetraose), 디시알릴락토-N-테트라오스(disialyllacto-N-tetraose), α2, 3'-시알릴 N-아세틸락토사민(α2, 3'-sialyl N-acetyllactosamine), α2, 6'-시알릴 N-아세틸락토사민(α2, 6'-sialyl N-acetyllactosamine), 디시알릴락토스(Disialyllactose), 및 Stn 에피토프(STn epitope 또는 2-acetamido-6-O-(α-2-N--acetylneuraminyl)-2-deoxyl-α-D-galactopyranosyl serine)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 시알산-파지 복합체.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 시알산 유도체는 시알릴올리고당(sialyloligosaccharide)인 것을 특징으로 하는, 시알산-파지 복합체.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 시알산 유도체는 필라멘트성 파지의 작용기와 직접 결합하거나, 또는 링커를 통해 파지와 결합하는 것을 특징으로 하는, 시알산-파지 복합체.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 필라멘트성 파지는 M13 파지, F1 파지, Fd 파지, If1 파지, Ike 파지, Zj/Z 파지, Ff 파지, Xf 파지, Pf1 파지 및 Pf3 파지로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 시알산-파지 복합체.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 필라멘트성 파지는 야생형 파지 또는 음전하를 띠는 아미노산의 수가 야생형 파지보다 많도록 유전적으로 조작된 파지인 것을 특징으로 하는, 시알산-파지 복합체.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 필라멘트성 파지는 바이러스의 표면 항원에 대한 수용체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 시알산-파지 복합체.
   
8. 제4항에 있어서,
   상기 필라멘트성 파지의 작용기는 파지의 주 코트 단백질(major coat protein)에 존재하는 아민기, 카르복실산기, 또는 티올기인 것을 특징으로 하는, 시알산-파지 복합체.
   
9. 제1항에 있어서,
   상기 시알산 유도체는 상기 필라멘트성 파지의 주 코트 단백질 1개에 대하여 1 내지 20개 결합되는 것을 특징으로 하는, 시알산-파지 복합체.
   
10. 제4항에 있어서,
    상기 링커는 시알산 유도체를 필라멘트성 파지의 작용기와 아미드, 디설파이드, 옥심, 이민, 티오에테르 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 결합을 통해 연결하는 것을 특징으로 하는, 시알산-파지 복합체.
    
11. 제1항에 있어서
    상기 시알산 유도체가 주 코트 단백질에 한 개 이상 결합된 경우, 상기 시알산 유도체는 1.0 내지 4.0 nm의 간격으로 배열된 것을 특징으로 하는, 시알산-파지 복합체.
    
12. 제1항의 시알산-파지 복합체를 유효성분으로 포함하는, 바이러스 감염증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    
13. 제12항에 있어서,
    상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
    
14. 제12항에 있어서,
    상기 시알산-파지 복합체는 바이러스의 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA)과 결합하여 상기 바이러스의 감염을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
    
15. 제12항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 뉴라미니다제 억제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
    
16. 제15항에 있어서,
    상기 뉴라미니다제 억제제는 오셀타미비르(oseltamivir), 자나미비르(zanamivir), 페라미비르(peramivir) 및 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
    
17. 제1항의 시알산-파지 복합체를 유효성분으로 포함하는, 바이러스 감염증 예방 또는 개선용 식품 조성물.
    
18. 제1항의 시알산-파지 복합체를 유효성분으로 포함하는, 바이러스 억제용 의약외품 조성물.
    
19. 제18항에 있어서,
    상기 의약외품 조성물은 필터 코팅제, 핸드워시, 가그린, 소독청결제, 샤워폼, 물티슈, 세제비누, 가습기 충진제, 마스크 및 방향제로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 의약외품 조성물.
    

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