KR20160060537A - 유도형질로 활성화되는 다기능성 항암제 전구체, 이의 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 카스파제에 의해 활성화된 항암제 프로드럭 컨쥬게이트 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 기능기, 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커, 및 항암 화학요법제를 구성으로 하는 항암제 프로드럭 컨쥬게이트 및 이의 용도에 관한 것이다.
상기 항암제 프로드럭 컨쥬게이트는 여러 가지의 암조직 기능성 물질들과 카스파제에 의해 가수분해되는 펩타이드 서열, 항암 화학요법제를 하나의 분자로 병합하여 현재 임상적으로 쓰이고 있는 항암 화학요법제들의 문제점을 극복한 신물질에 관한 것으로 본 발명을 이용해 개발된 물질들은 직접적으로 신약으로 사용될 수 있다.

Description

유도형질로 활성화되는 다기능성 항암제 전구체, 이의 제조방법 및 이의 용도 {Multifunctional anticancer prodrugs activated by the induced phenotype, their preparation methods and applications}
본 발명은 카스파제에 의해 활성화된 약제의 방출, 이와 관련된 세포사멸 유도, 세포사멸 증폭 및 암 치료 방법에 관련한 항암제 프로드럭 컨쥬게이트 및 이의 용도에 관한 것이다.
항암 화학요법제(또는 항암제)는 강력한 항암 효과로 인해 항암치료에서 제일 빈번하게 사용됨에도 불구하고 심각한 부작용과 독성으로 투여가 종종 제한되기도 한다. 따라서 항암 화학요법제가 정상 조직에서는 작용하지 않도록 하고, 암 조직에서만 선택적으로 작용하도록 할 필요성이 있다.
이를 위해 기존에는 정상세포에서는 발현되지 않거나 드물게 발현되고 종양 세포에 특이적으로 발현되는 생체지표를 인식하여 이에 결합하는 항체나 펩타이드 등을 항암 화학요법제에 도입하여 암조직에만 선택적으로 약물이 전달되도록 하는 약물이 보편적으로 응용되어 왔다. 이러한 약물은 동일한 암 종류라하더라도 환자별로 그 유전 형질이 상이하기 때문에 해당 약물의 표적대상이 되는 생체지표를 발현하는 암이 발병되어 있는 환자에게만 제한적으로 사용할 수 있어 본질적으로 광범위한 환자에게 사용할 수 없다는 한계점이 존재한다.
또한, 최근 연구 결과에서 하나의 암 조직 안에서도 서로 다른 종양 세포 간에 유전형질이 상이하다는 종양 내 이질성(intratumor heterogeneity)이 밝혀져, 발병된 암의 특성을 결정하기 위해 통상적으로 시행하는 생검이 해당 암의 유전형질을 대표할 수 없다는 것이 알려졌다. 이는 곧 생검을 통해 표적대상이 되는 생체지표가 발현됨이 확인되었어도 상기 약물의 효과가 불분명하다는 것을 의미한다.
항암 화학요법제는 강력한 항암효과로 인해 항암치료에서 제일 빈번하게 사용됨에도 불구하고 심각한 부작용과 독성으로 투여가 종종 제한되기도 한다. 따라서 화학요법제가 정상 조직에서는 작용하지 않도록 하고, 암 조직에서만 선택적으로 작용하도록 할 필요성이 있다. 이를 위해 기존에는 정상세포에서는 발현되지 않거나 드물게 발현되고 종양 세포에 특이적으로 발현되는 생체지표를 인식하여 이에 결합하는 항체나 펩타이드 등을 항암 화학요법제에 도입하여 암 조직에만 선택적으로 약물이 전달되도록 하는 약물이 보편적으로 응용되어 왔다. 이러한 약물은 동일한 암 종류라 하더라도 환자별로 그 유전형질이 상이하기 때문에 해당 약물의 표적대상이 되는 생체지표를 발현하는 암이 발병되어 있는 환자에게만 제한적으로 사용할 수 있어 본질적으로 광범위한 환자에게 사용할 수 없다는 한계점이 존재한다.
또한, 최근 연구 결과에서 하나의 암 조직 안에서도 서로 다른 종양 세포 간에 유전형질이 상이하다는 종양 내 이질성(intratumor heterogeneity)이 밝혀져, 발병된 암의 특성을 결정하기 위해 통상적으로 시행하는 생검이 해당 암의 유전형질을 대표할 수 없다는 것이 알려졌다. 이는 곧 생검을 통해 표적대상이 되는 생체지표가 발현됨이 확인되었어도 상기 약물의 효과가 불분명하다는 것을 의미한다.
더욱이 표적대상의 생체지표를 발현하는 종양 세포가 암조직 내의 전체 종양 세포의 다수를 차지한다고 해도, 나머지 종양 세포들에 상기 약물이 영향을 미치지 못하므로, 치료 후에도 그 나머지 종양 세포들에 의해 암 성장이 재발하게 된다.
따라서 이와 같은 이유로 기존의 약물은 항암 화학요법제를 발병된 모든 종양 세포에 약물을 전달하는데 있어 근본적인 한계가 있어 이상적인 항암 화학요법제의 전달 시스템이라고 할 수 없으며 효과적인 암 치료에의 응용에 부적합하다.
나아가, 대부분의 암 조직들이 표적 분자를 발현하는 경우, 항암 화학요법제가 상기 암 조직과 근접하거나 이와 접하는 다른 세포에 영향을 줘 부작용 또는 독성을 야기한다.
이러한 문제를 해결하기 위한 일환으로, 종양 세포 및 암 조직 내에서 특이적으로 활성화를 가능케 하는 프로드럭이 개발되었다. 예를 들어, 미국 특허등록 제7,445,764호는 절단 가능한 매트릭스 메탈로프로테이나제(matrix metalloproteinase, MMP), 절단 가능한 펩타이드 및 독소루비신 항암제의 컨쥬게이트를 제시하였다. 그리고, 미국특허 공개 제2010/0111866호는 말레이미드-하이드라존-독소루비신 형태를 갖는 프로드럭 컨쥬게이트를 개시하고 있다. 또한, 미국특허 공개 제2013/0338422호는 펩타이드 시퀀스-DEVD-독소루비신 형태의 프로드럭 컨쥬게이트를 언급하고 있다. 그러나, 이들 컨쥬게이트들은 하나 또는 그 이상의 낮은 효능, 낮은 선택성 및/또는 잦은 투약 등과 같은 문제가 여전히 남아 있다.
이에, 종양 세포에만 선택적으로 작용하고, 정상 조직에는 영향을 미치지 않으며, 부작용을 최소화하고 우수한 효능을 발휘하는 프로드럭과 같은 항암 화학요법제의 개발이 요구된다.
한국공개특허 제2013-0110218호(한국과학기술연구원, 2013.10.08 공개) 미국 특허등록 제7,445,764호(KTB TUMORFORSCHUNGSGESELLSCHAFT MBH, 2008.11.04 공개) 미국특허 공개 제2010/0111866호 (KTB TUMORFORSCHUNGSGESELLSCHAFT MBH, 2010.05.06. 공개) 미국특허 공개 제2013/0338422호 (한국과학기술연구원, 2013.12.19. 공개)
상기한 문제를 해결하기 위해, 본 출원인은 다각적으로 연구를 수행한 결과 기능기, 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커, 및 항암 화학요법제가 결합된 항암제 프로드럭 컨쥬게이트를 제조하고, 이를 이용하여 종양세포에 적용한 결과 유의적으로 암 성장 억제 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 종양 세포에만 선택적으로 작용하고, 정상 조직에는 영향을 미치지 않으며, 부작용을 최소화하고 우수한 효능을 갖는 항암제 프로드럭 컨쥬게이트를 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 항암제 프로드럭 컨쥬게이트를 이용하여 다양한 종류의 암의 치료에 사용하는 용도를 제공하는 데 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 (i) 기능기 (ii) 상기 기능기에 직접 또는 링커를 통하여 연결되고, 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커 (iii) 상기 펩타이드 링커에 직접 또는 링커를 통해 연결되는 항암 화학요법제를 포함하고, 이때 상기 기능기가 표적 세포의 위치추적, 표적세포에 대한 결합, 종양 조직 내 축적, 컨쥬게이트의 혈장 순환시간 연장으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 기능을 발휘하는 항암제 프로드럭 컨쥬게이트를 제공한다.
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 항암제 프로드럭 컨쥬게이트를 이용하여 세포사멸 유도 방법 및/또는 세포사멸 증가 방법을 제공한다.
또 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 항암제 프로드럭 컨쥬게이트를 이용한 암 치료 방법을 제공한다.
바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 (i) 기능기 (ii) 상기 기능기에 직접 또는 링커를 통하여 연결되고, 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커 (iii) 상기 펩타이드 링커에 직접 또는 링커를 통해 연결되는 항암 화학요법제를 포함하고, 이때 상기 기능기가 표적세포의 위치추적, 표적세포에 대한 결합, 종양 조직 내 축적, 컨쥬게이트의 혈장 순환시간 연장으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 기능을 발휘하는 항암제 프로드럭 컨쥬게이트를 제공한다.
몇몇 구현예에 따르면, 상기 기능기는 말레이미드(maleimide), N-하이드록시숙신이미드 에스터(N-hydroxysuccinimide ester), 할로겐 아세트아마이드(halogenacetamide), 할로겐 아세테이트(halogenacetate), 아지리딘(aziridine), 디설파이드(disulfide), 아세틸렌(acetylene), 피리딜티오(pyridylthio), 비닐카보닐(vinylcarbonyl), 알부민(albumin), 트랜스페린(transferrin), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 및 히알루론산(hyaluronic acid)으로 이루어진 군에서 선택된다. 다른 구현예에 따르면, 상기 기능기는 종양 세포 또는 종양 내피 세포에 대해 선택적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 압타머, 올리고뉴클레오타이드, 및 당류로 이루어진 군에서 선택된다. 또 다른 구현예에 따르면, 상기 기능기는 RGD, 사이클릭(cyclic)-RGD, 폴릭산(folic acid)과, Cys-Gln-Arg-Pro-Pro-Arg (서열번호 9)의 아미노산 시퀀스를 포함하는 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 기능기는 말레이미드이다.
몇몇 구현예에 따르면, 상기 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커는 카스파제-3, 카스파제-7, 및 카스파제-9로 이루어진 군에서 선택된 하나의 카스파제에 의해 절단 가능하다. 바람직한 구현예에 따르면, 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커의 4개의 C-말단 아미노산 잔기는 Asp-Xaa-Xaa-Asp (서열번호 1), Leu-Xaa-Xaa-Asp (서열번호 2), 및 Val-Xaa-Xaa-Asp (서열번호 3)로 이루어진 군에서부터 선택되고, 이때 Xaa는 임의의 아미노산 잔기를 나타낸다. 다른 구현예에 따르면, 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커의 4개의 C-말단 아미노산 잔기는 Asp-Glu-Val-Asp (서열번호 4), Asp-Leu-Val-Asp (서열번호 5), Asp-Glu-Ile-Asp (서열번호 6), 및 Leu-Glu-His-Asp (서열번호 7)로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직한 구현예에 따르면, 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커의 6개의 C-말단 아미노산 잔기는 Lys-Gly-Asp-Glu-Val-Asp (서열번호 8)로 이루어진다.
바람직한 구현예에 따르면, 항암 화학요법제는 종양 세포의 세포사멸을 유도한다. 몇몇 구현예에 따르면, 상기 항암 화학요법제는 안트라사이클린계, 항생제, 알킬화제, 백금계 제제, 항대사성 물질, 토포이소머라아제 억제제 및 유사분열 억제제로 이루어진 군에서 선택된다. 몇몇 구현예에 따르면, 상기 항암 화학요법제는 독소루비신, 나우노루비신, 에피루비신, 이다루비신, 발루비신, 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된다. 또 다른 구현예에 따르면, 상기 항암 화학요법제는 사이클로포스파아마이드(cyclophosphamide), 메클로레타민(mecholrethamine), 우라무스틴(uramustine), 멜파란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 이포스파미드(ifosfamide), 벤다무스틴(bendamustine), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 스트렙토조신(streptozocin), 부설판(busulfan), 다카바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide), 티오테파(thiotepa), 알트레타민(altretamine), 듀오카르마이신(duocarmycin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 옥사리플라틴(oxaliplatin), 사트라플라틴(satraplatin), 트리플라틴 테트라나이트레이트(triplatin tetranitrate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 카페시타빈(capecitabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시스타르빈(cystarbine), 플록스유리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 겜시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드(pemetrexed), 펜토스타틴(pentostatin), 티오구아닌(thioguanine), 캠토테신(camptothecin), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 에토포사이드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 미토산트론(mitoxantrone), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 이자베필론(izabepilone), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 에스트라머스틴(estramustine), 메이탄신(maytansine), DM1 (mertansine, 메르탄신), DM4, 돌라스타틴(dolastatin), 아우리스타틴 E(auristatin E), 아우리스타틴 F(auristatin F), 모노메틸 아우리스타틴 E(monomethyl auristatin E), 모노메틸 아우리스타틴 F(monomethyl auristatin F) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된다.
바람직한 구현예에 따르면, 상기 기능기는 말레이미드이고, 상기 카스파제-절단 가능한 펩타이드 링커는 Lys-Gly-Asp-Glu-Val-Asp (서열번호 8)로 이루어진 아미노산 시퀀스를 가지며, 항암 화학요법제는 독소루비신이다.
다른 구현예에 따르면, 상기 컨쥬게이트는 말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신, 말레이미드-KGDEVD-PABC-다우노루비신, 말레이미드-KGDEVD-PABC-파클리탁셀, 말레이미드-KGDEVD-PABC-MMAE, 말레이미드-DEVD-PABC-독소루비신, 말레이미드-DEID-PABC-독소루비신, 말레이미드-DLVD-PABC-독소루비신, 말레이미드-DEVD-독소루비신, 피리딜디티올-KGDEVD-PABC-독소루비신, 올리에이트-KGDEVD-PABC-독소루비신, 폴리에틸렌 글리콜-KGDEVD-PABC-독소루비신, 히알루로난-KGDEVD-PABC-독소루비신, 폴레이트-KGDEVD-PABC-독소루비신, RGDEVD-PABC-독소루비신, CQRPPRDEVD-PABC-독소루비신, RGDEVD-MBA-독소루비신, DEVD-다우노루비신-RGDSC, 및 HSA-말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신으로 이루어진 군에서 선택된다.
바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드, 이는 링커와 직접 또는 간접 결합되고, (ⅱ) 다우노루비신, 이의 14-CH3는 링커와 직접 또는 간접 결합되고, (ⅲ) 기능기를 포함하고, 이때 상기 기능기는 표적 세포에서 위치추적, 표적세포에 대한 결합, 종양 조직 내 축적, 컨쥬게이트의 혈장 순환시간 연장으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 기능을 발휘하는 항암제 프로드럭 컨쥬게이트를 제공한다.
다른 구현예에 따르면, 본 발명은 상기 언급한 항암제 프로드럭 컨쥬게이트 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 항암치료용 약학적 조성물을 제공한다. 다른 구현예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 정맥 투여가 가능하도록 제형화된다.
본 발명은 유도형질로 활성화되는 항암제 프로드럭 컨쥬게이트로서, 환자의 신체 내부 또는 외부로부터 인위적 자극을 가하여 상당히 균일하게 유도한 발현형질에 의하여 종양 조직 부근 또는 내부에서 종양세포를 선택적, 효율적으로 사멸할 수 있다.
이러한 항암제 프로드럭 컨쥬게이트는 여러 가지의 기능성 물질들과 카스파제에 의해 가수분해되는 펩타이드 서열, 항암 화학요법제를 하나의 분자로 병합하여 현재 임상적으로 쓰이고 있는 항암 화학요법제들의 문제점을 극복한 신물질에 관한 것으로 본 발명을 이용해 개발된 물질들은 직접적으로 신약으로 사용될 수 있다.
도 1은 말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신의 화학식이다.
도 2는 하나의 말레이미드 기능기, Asp-Glu-Val-Asp sequence (KGDEVD)를 갖는 펩타이드 스페이서, 및 활성 성분으로서 독소루비신을 포함하는 프로드럭의 제조를 보여주는 반응식으로, 독소루비신과 펩타이드 스페이서는 p-아미노벤질카바메이트(PABC)를 통해 말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신과 컨쥬게이트 된다.
도 3은 말레이미드-KGDEVD-PABC-다우노루비신의 화학식이다.
도 4는 말레이미드-KGDEVD-PABC-파클리탁셀의 화학식이다..
도 5는 말레이미드-KGDEVD-PABC-MMAE의 화학식이다.
도 6은 말레이미드-DEVD-PABC-독소루비신의 화학식이다.
도 7은 말레이미드-DEID-PABC-독소루비신의 화학식이다..
도 8은 말레이미드-DLVD-PABC-독소루비신의 화학식이다..
도 9는 말레이미드-DEVD-독소루비신의 화학식이다..
도 10은 말레이미드-DEVD-MMAE의 화학식이다..
도 11은 피리딜디티올-KGDEVD-PABC-독소루비신의 화학식이다.
도 12는 올리에이트-KGDEVD-PABC-독소루비신의 화학식이다.
도 13은 PEG-KGDEVD-PABC-독소루비신의 화학식이다.
도 14는 히알루로난-(KGDEVD-PABC-독소루비신)의 화학식이다.
도 15는 폴레이트-KGDEVD-PABC-독소루비신의 화학식이다.
도 16은 RGDEVD-PABC-독소루비신의 화학식이다..
도 17은 사이클로(CRGDC)GGDEVD-PABC-독소루비신의 화학식이다..
도 18은 CQRPPRDEVD-PABC-독소루비신의 화학식이다..
도 19는 RGDEVD-MBA-독소루비신의 화학식이다..
도 20은 DEVD-다우노루비신-RGDSC의 화학식이다.
도 21은 말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신을 상업적으로 이용가능한 인간 혈청 알부민(HSA)과 반응한 후의 HPLC 분석 결과이다.
도 22는 말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신을 인간 혈청 알부민(HSA)과 반응한 후 HPLC 분석 결과이다.
도 23은 인간 혈청 알부민과 결합된 말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신 (HSA-KGDEVD-PABC-독소루비신)을 재조합된 인간 카스파제-3에 의한 절단 반응과 관련된 HPLC 분석 결과이다.
도 24는 인간 혈청 알부민과 결합된 말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신 (HSA-KGDEVD-PABC-독소루비신)를 재조합 인간 카스파제-3의 사용 여부에 따라 체외(in vitro) 실험을 통한 농도 의존성을 보여주는 그래프이다.
도 25는 말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신 또는 AcKGDEVD-PABC-독소루비신을 스프레그-다우리 랫트에 정맥 투여 후 독소루비신의 시간에 따른 혈장 농도 변화를 보여주는 그래프이다.
도 26은 말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신을 종양이 있는 동물에게 투여 후 초기 방사선 조사의 여부에 따른 종양 성장 프로파일을 보여주는 그래프이다.
도 27은 말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신 또는 독소루비신을 서로 다른 도즈량으로 종양이 있는 동물에게 투여 후, 초기 투여시 방사선을 조사한 후 종양 성장 프로파일을 보여주는 그래프이다.
도 28은 시노몰구스 원숭이에 말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신 또는 AcKGDEVD-PABC-독소루비신을 정맥 투여한 후 독소루비신의 혈장 농도 프로파일을 보여주는 그래프이다.
본 명세서에서 언급하는 '종양 세포(tumor cell)'의 용어는 암 조직, 양성 또는 악성 타입의 세포를 의미한다.
본 명세서에서 언급하는 '암(cancer)' 또는 '종양(tumor)'의 용어는 신체의 일부분 또는 세포로부터 기인하는 암을 의미한다. 이는 상피성암(carcinoma), 육종(sarcoma), 림프종(lymphoma), 생식세포종(germ cell tumors), 및 아세포종(blastoma)을 포함하며, 이에 한정하지 않는다. 몇몇 구현예에 따르면, 암은 신체의 특이 위치 또는 특이 질병과 연관되어 있다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
항암제 프로드럭 컨쥬게이트{Chemotherapeutic Prodrug conjugate}
본 발명에서 제시하는 항암제 프로드럭 컨쥬게이트는 i) 기능기 (ii) 상기 기능기에 직접 또는 링커를 통하여 연결되고, 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커 (iii) 상기 펩타이드 링커에 직접 또는 링커를 통해 연결되는 항암 화학요법제를 포함하고, 이때 상기 기능기는 표적 세포에서 위치추적, 표적세포에 대한 결합, 종양 조직 내 축적, 컨쥬게이트의 혈장 순환시간 연장으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 기능을 발휘한다.
이하 본 발명에서 언급하는 바에 따르면, 본 발명에서 제시하는 컨쥬게이트는 세포사멸유도 방법, 세포사멸 증폭 방법 및 암 치료법 등에 유용하다.
기능기(Functional Moiety)
상기 언급한 바와 같이, 본 발명에서 제시하는 항암제 프로드럭 컨쥬게이트는 기능기를 포함한다. 본 명세서에서 언급하는 '기능기'의 용어는 표적 세포의 위치추적, 표적 세포에 결합, 종양 조직 내 축적, 컨쥬게이트의 혈장 순환시간 연장으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 기능을 발휘하는 기능기(moiety)를 의미한다. 상기 표적과 관련한 구현예에 따르면, 상기 기능기는 표적 세포 옆 또는 부근에 있는 분자와 선택적으로 결합한다. 연장된 혈장 순환시간와 관련한 구현예에 따르면, 상기 기능기는 순환성 혈장 단백질에 대해 결합한다. 일 구현예에 따르면, 상기 기능기는 작용성 화학 관능기, 펩타이드 기능기, 항체 기능기 (항체 단편 및 단쇄 항체 기능기를 포함), 앱타머, 올리고뉴클레오타이드 또는 당류를 하나 또는 그 이상을 포함한다.
바람직한 구현예에 따르면, 상기 기능기는 향상된 투과성 및 정체성(Enhanced Permeability and Retention, EPR) 효과에 의해 수동적으로 종양 조직을 표적지향 할 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 상기 기능기는 알부민(albumin), 트랜스페린(transferrin) 등과 같은 단백질; 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 히알루론산(hyaluronic acid) 등과 같은 고분자 중합체; 말레이미드기(maleimide), 할로겐 아세트아마이드기(halogenacetamide), 할로겐 아세테이트기(halogenacetate), 피리딜티오기(pyridylthio), 비닐카보닐기(vinylcarbonyl), 아지리딘기(aziridine), 디설파이드기(disulfide), 아세틸렌기(acetylene), N-하이드록시숙신이미드 에스테르기(N-hydroxysuccinimide ester)등과 같이 알부민과 결합할 수 있는 작용기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함한다. 다른 구현예에 따르면, 상기 기능기는 RGD(Arg-Gly-Asp) 펩타이드, 사이클릭-RGD, RGD 서열을 하나 이상 포함한 펩타이드, 폴릭산(folic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함한다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 기능기는 말레이미드이다.
몇몇 구현예에 따르면, 상기 기능기는 예를 들면, 종양 조직 또는 종양 세포와 같은 표적 조직이나 표적세포 관련 세포들에 특이적으로 발현되는 단백질과 같은 생체 지표에 강한 친화력을 갖는다. 이러한 구현예와 관련하여, 상기 기능기는 인테그린αvβ3와 선택적 결합이 가능한 한 개 이상의 RGD 또는 RGD를 하나 이상 포함한 펩타이드, 종양세포 세포사멸시에 노출되는 히스톤 H1 펩타이드에 특이적으로 결합한다고 알려져 있는 Cys-Gln-Arg-Pro-Pro-Arg 펩타이드 서열(서열목록 NO:9), 서열목록 NO:9 또는 유사한 기능을 보이는 유사한 서열을 포함하는 펩타이드, 폴릭산 수용체에 결합하는 폴릭산을 포함한다.
카스파제로 절단 가능한 펩타이드 링커 (Caspase cleavable peptide-linker)
상기 언급된 바와 같이, 본 명세서에서 제시한 프로드럭 컨쥬게이트는 카스파제-절단 가능한 펩타이드 링커를 포함한다.
본 명세서에서 언급하는 '카스파제(caspase)'의 용어는 세포사멸의 진행에 의해 활성화되는 (예를 들면, 발현되는) 시스테인-아스파르 프로테아제(cysteine-aspartic proteases), 시스테인 의존성 아스파르테이트-직접 프로테아제(cysteine-dependent aspartate-directed proteases)를 의미한다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 카스파제는 카스파제-3, 카스파제-7 또는 카스파제-9 이다.
본 명세서에서 언급하는 '아미노산' 용어는 천연 발생 아미노산 (천연 아미노산)과 천연 발생 아미노산을 화학적으로 처리한 비천연 발생 아미노산 (합성 아미노산)을 포함하는 아미노산을 의미한다.
글리신을 제외한 천연 아미노산은 킬랄 탄소 원자를 포함한다. 또한, 아미노산은 L 또는 D 이성질체의 형태일 수 있다. 바람직하기로, 상기 아미노산은 β-알라닌(β-alanine, BALA), γ-아미노부티르산(γ-aminobutyric acid , GABA), 5-아미노발레르산(5-aminovaleric acid), 글리신(glycine, Gly 또는 G), 페닐글리신(phenylglycine), 아르기닌(arginine, Arg 또는 R), 호모아르기(homoarginine, Har 또는 hR), 알라닌(alanine, Ala 또는 A), 발린(valine, Val 또는 V), 노르발린(norvaline), 류신(leucine, Leu 또는 L), 노르류신(norleucine, Nle), 이소류신(isoleucine, Ile 또는 I), 세린(serine, Ser 또는 S), 이소세ㄹ리린(isoserin), 호모세린(homoserine, Hse), 트레오닌(threonine, Thr 또는 T), 알로트레오닌(allothreonine), 메티오닌(methionine, Met 또는 M), 에티오닌(ethionine), 글루탐산(glutamic acid, Glu 또는 E), 아스파르트산(aspartic acid, Asp 또는 D), 아스파라긴(asparagine, Asn 또는 N), 시스테인(cysteine, Cys 또는 C), 시스틴(cystine), 페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine, Tyr 또는 Y), 트립토판(tryptophan, Trp 또는 W), 라이신(lysine, Lys 또는 K), 하이드록시라이신(hydroxylysine, Hyl), 히스티딘(histidine, His 또는 H), 오르니틴(ornithine, Orn), 글루타민(glutamine, Gln 또는 Q), 시트룰린(citrulline), 프롤린(proline, Pro 또는 P), 및 4-하이드록시프롤린(4-hydroxyproline, Hyp 또는 O)를 포함한다.
본 명세서에서 언급하는 '펩타이드' 용어는 펩타이드 및 이의 유사체를 의미하고, 이때 상기 펩타이트 유사체는 천연 발생 아미노산과 글리코실화, 개질 R 관능기, 및/또는 개질 펩타이드 주쇄와 같은 개질된 비천연 발생 아미노산을 포함한다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 펩타이드는 킬랄 아미노산의 L-이성질체만을 포함한다. 다른 구현예에 따르면, 상기 펩타이드는 킬랄 아미노산의 D-이성질체만을 포함한다. 또 다른 구현예에 따르면, 상기 펩타이드는 킬랄 아미노산의 하나 또는 그 이상의 L-이성질체 및 D-이성질체 모두를 포함한다.
또한, 본 명세서에서 '펩타이드'의 용어는 펩타이드 또는 천연 발생 아미노산과 유사한 기능을 모방하는 아미노산을 포함하는 펩타이드 유사체를 포함한다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 펩타이드 유사체는 우레탄, 우레아, 에스테르 또는 티오에스테르 결합과 같은 아마이드 결합과 다른 적어도 하나의 결합을 펩타이드 시퀀스 내 포함한다. 본 명세서에서 언급하는 펩타이드 또는 펩타이드 유사체는 선형, 고리형 또는 가지형일 수 있으며, 바람직하기로 선형이다.
본 명세서에서 언급하는 '카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커'의 용어는 카스파제에 의해 절단 가능한 두 개 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드 시퀀스를 의미한다. 몇몇 구현예에 따르면, 상기 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커는 Asp-Xaa-Xaa-Asp (서열번호 1)의 시퀀스를 포함하는 펩타이드와 같은 카스파제-3 또는 카스파제-7에 의해 절단 가능하고, 이때 상기 Xaa는 L- 또는 D-이성질체의 아미노산을 의미한다. 몇몇 구현예에 따르면, 상기 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커는 Leu-Xaa-Xaa-Asp (서열번호 2) 또는 Val-Xaa-Xaa-Asp (서열번호 3)의 아미노산 시퀀스를 포함하는 펩타이드와 같은 카스파제-9에 의해 절단 가능하고, 이때 상기 Xaa는 L- 또는 D-이성질체의 아미노산을 의미한다.
바람직한 구현예에 따르면, 상기 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커는 하기 군으로 이루어진 것 중에서 하나이다:
Asp-Glu-Val-Asp (서열목록:4)
Asp-Leu-Val-Asp (서열목록:5)
Asp-Glu-Ile-Asp (서열목록:6)
Leu-Glu-His-Asp (서열목록:7).
보다 바람직한 구현예에 따르면, 상기 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커는 Lys-Gly-Asp-Glu-Val-Asp (서열목록:8), 또는 언급된 KGDEVD로 구성된다.
몇몇 구현예에 따르면, 상기 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커의 존재는 링커가 잘리기 전까지 프러드럭 컨쥬게이트를 비활성으로 되게 한다. 이 예와 동일하게, 상기 프로드럭 컨쥬게이트는 건강한 세포에 최소한의 해를 가한다. 프로드럭 컨쥬게이트는 오직 카스파제가 있을 때에 활성화가 되기 때문이다. 예를들면 종양세포가 사멸을 하는 것처럼 세포도 사멸을 한다. 따라서, 몇몇 구현예에 따르면, 본 발명에서 설명되는 항암제 프로드럭 컨쥬게이트는 최소의 부작용을 나타낸다.
항암 화학요법제 (Chemotherapeutic agent)
상기 언급된 바와 같이 여기서 설명하는 프로드럭 컨쥬게이트는 항암 화학요법제를 포함한다.
이때 사용된 것처럼 용어 “항암 화학요법제”는 암 치료를 위해 사용되는 저분자 화합물과 같은 암 치료에 유용한 기능기를 의미한다. 바람직한 구현예에 따르면, 항암 화학요법제는 일례로 종양 세포 및 암 조직과 같은 표적 세포 내에 세포사멸을 유도한다. 본 명세서에서 언급한 컨쥬게이트 내 항암 화학요법제로서는 이 분야의 공지된 것이면 어느 것이든 사용 가능하다.
바람직한 구현예에 따르면, 상기 항암 화학요법제는 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 발루비신(valrubicin) 또는 이들의 유도체와 같은 안트라사이클린(anthracycline); 액티노마이신-D(actinomycin-D), 블레오마이신(bleomycin), 미토마이신-C(mitomycin-C), 칼리케아미신(calicheamicin) 또는 이들의 유도체와 같은 항생제(antibiotic) ; 사이클로포스프아마이드(cyclophosphamide), 메콜레타민(mecholrethamine), 우라무스틴(uramustine), 멜파란(melphalan), 클로람부실(chlorambucil), 이포스프아마이드(ifosfamide), 벤다무스틴(bendamustine), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 스트렙토조신(streptozocin), 부설판(busulfan), 다카르바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide), 티오테파(thiotepa), 알트레타민(altretamine), 듀오카르마이신(duocarmycin) 또는 이들의 유도체와 같은 알킬화제(alkylating agent); 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 옥사리플라틴(oxaliplatin), 사트라플라틴(satraplatin), 트리플라틴 테트라나이트레이트(triplatin tetranitrate) 또는 이들의 유도체와 같은 백금계 제제(platinum-based agent); 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 카페시타빈(capecitabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시스타르빈(cystarbine), 플록스우리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 겜시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 메토트레세이트(methotrexate), 페메트렉시드(pemetrexed), 펜토스타틴(pentostatin), 티오구아닌(thioguanine) 또는 이들의 유도체와 같은 대사 길항제(antimetabolite); 캄토테신(camptothecin), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 미토산트론(mitoxantrone) 또는 이들의 유도체와 같은 토포이소머라제 억제제; 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 이자베필론(izabepilone), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 에스트라무스틴(estramustine), 메이탄신(maytansine), DM1 (mertansine), DM4, 돌라스틴(dolastatin), 아우리스타틴 E(auristatin E), 아우리스타틴 F(auristatin F), 모노메틸 아우리스타틴 E(monomethyl auristatin E), 모노메틸 아우리스타틴 F(monomethyl auristatin F) 또는 이들의 유도체와 같은 유사분열 억제제(mitotic inhibitor)를 포함한다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항암 화학요법제는 독소루비신 또는 다노루비신이다.
결합과 링커의 컨쥬게이트 (Linkages and linkers conjugates)
본 발명에서 제시하는 항암제 프로드럭 컨쥬게이트에 있어서, 기능기는 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커와 직접 또는 간접적으로 링커를 통해 결합되고, 상기 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커는 항암 화학요법제와 직접 또는 간접적으로 링커를 통해 결합된다. 이에, 본 발명의 구현예에 따르면, 상기 기능기는 기능기 내의 관능기와 함께 펩타이 링커의 N-말단에서의 관능기 또는 측쇄 간의 공유 결합 등으로 인해 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커와 직접적으로 컨쥬게이트된다. 이와 별도로, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커는 항암 화학요법제의 관능기와 펩타이드 링커의 C-말단에서의 관능기 또는 펩타이드 링커의 측쇄 사이의 공유 결합 등으로 항암 화학요법제와 직접적으로 컨쥬게이트된다.
선택적으로, 일측 또는 양측의 결합은 링커를 통해 이뤄진다. 이러한 링커는 본 발명에서 특별히 한정하지 않으며, 결합을 목적으로 약학적 조성물에 사용되는 것이면 어느 것이든 사용 가능하다. 바람직한 링커는 PABC를 예시로 제시될 수 있다.
전술한 바에 따르면, 기능기는 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커의 N-말단에 결합되고, 동시에 상기 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커의 C-말단은 항암 화학요법제에 결합되는 항암제 프로드럭 컨쥬게이트일 수 있다. 또한, 이와 반대로 기능기가 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커의 C-말단에 결합되고, 동시에 상기 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커의 N-말단이 항암 화학요법제에 결합되는 항암제 프로드럭 컨쥬게이트 일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명에서 제시하는 항암제 프로드럭 컨쥬게이트는 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드가 링커의 직간접적인 결합을 통해 항암 화학요법제에 결합되고, 링커의 직간접적인 결합을 통해 기능기에 결합된다. 예를 들면, 다이노루비신은 항암 효과를 나타내고, 이의 14-CH3 위치에서 선형 또는 고리형 RGD 또는 폴릭산과 같은 기능기와 컨쥬게이트된다. 이에, 카스파제에 의해 유도된 절단을 통해 항암 효과를 나타내며, 자유 다우노루비신의 방출이 요구되지 않는다. 또한, 본 발명의 몇몇 구현예에 따르면, 항암제 프로드럭 컨쥬게이트는 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드가 링커의 직간접적인 결합을 통해 다우노루비신에 대해 결합되고, 이때 상기 다우노루비신의 14-CH3 위치에서 선형 또는 고리형 RGD 또는 폴릭산과 같은 기능기에 대해 링커의 직간접적인 결합을 통해 컨쥬게이트된다. 보다 구체적인 예는 하기하는 실시예 16에서 설명되어 질 수 있다.
본 발명에서 제시하는 바람직한 항암제 프로드럭 컨쥬게이트는 말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신, 말레이미드-KGDEVD-PABC-다우노루비신, 말레이미드-KGDEVD-PABC-파클리탁셀, 말레이미드-KGDEVD-PABC-MMAE, 말레이미드-DEVD-PABC-독소루비신, 말레이미드-DEID-PABC-독소루비신, 말레이미드-DLVD-PABC-독소루비신, 말레이미드-DEVD-독소루비신, 말레이미드-DEVD-MMAE, 피리딜디티올-KGDEVD-PABC-독소루비신, 올리에이트-KGDEVD-PABC-독소루비신, 폴리에틸렌 글라이콜-KGDEVD-PABC-독소루비신, 히알루로난-KGDEVD-PABC-독소루비신, 폴레이트-KGDEVD-PABC-독소루비신, RGDEVD-PABC-독소루비신, CQRPPRDEVD-PABC-독소루비신, RGDEVD-MBA-독소루비신, DEVD-다우노루비신-RGDSC, HSA-말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신을 포함하며, 이든 도면에 자세히 제시되어 있다.
일 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 항암제 프로드럭 컨쥬게이트는 항암제 프로드럭 컨쥬게이트, 약학적으로 허용 가능한 담체, 첨가제 및/또는 희석제를 포함하는 조성물과 같은 약학적 조성물로서 제공될 수 있다. 사용 가능한 담체(carriers), 첨가제, 희석액의 예는 락토스, 덱스트로스, 수쿠로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 녹말, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 인산칼슘, 규산칼슘, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 등을 포함한다,
본 발명에 따른 약학적 조성물은 비경구 또는 국소 투여방식을 포함하는 투여 방식에 의해 제조가 가능하다. 몇몇 구현예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 정맥 주사 또는 투여와 같은 주사 또는 투여가 바람직하고, 주사 또는 투여를 위해 멸균 조성물로서 제조될 수 있다. 다른 구현예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 경구 투여에 적합하도록 분말, 과립, 타블릿, 캡슐, 현탁액, 에멀젼 또는 시럽 제형으로 제조가 가능하다. 다른 구현예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 흡입에 적합하도록 비강 또는 경구 스프레이 또는 에어로졸 제형으로 제조가 가능하다. 다른 구현예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 직장 또는 질내 투여에 적합하도록 좌약 제형으로 제조가 가능하다. 다른 구현예에 따르면, 상기 약학적 조성물은 국소 또는 경피 투여에 적합하도록 용액, 에멀졀 , 젤 또는 패치 제형으로 제조가 가능하다. 이러한 조성에 적합한 조성 및 부형제는 이 분야에서 공지된 바의 것이면 어느 것이든 사용 가능하다.
경구 투여를 위한 고형 제제의 예로는 타블릿, 알약, 분말, 과립, 캡슐 등을 포함한다. 고형 제제는 본 발명에 따른 컨쥬게이트와 적어도 하나의 부형제, 예를 들면, 녹말, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토우즈, 젤라틴 등과의 혼합에 의해 제조될 수 있다. 상기 제제는 단순 부형제에 더하여, 마그네슘 스테아레이트 또는 탈크와 같은 윤활제가 타블렛화 공정 또는 다른 공정 중에 첨가 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 액상 제제의 예로는 용액, 현탁액, 에멀젼 및 시럽을 포함한다. 상기 액상 제제는 일례로, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 다양한 첨가제, 이에 더하여 물, 및 선택적으로 액상 파라핀을 더욱 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제형의 예로는 멸균 수용액, 비수용성 용액, 현탁액, 에멀젼, 동결건조 제제 및 좌약을 포함한다. 비수용성 용액 및 현탁액은, 예를 들면 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 또는 에틸올리에이트와 같은 투여가능한 에스터를 포함한다. 좌약 제형을 위한 기본 조성은 예를 들면, 위텝솔(witepsol), 매크로골(macrogol), 트윈61(tween 61), 카카오 버터, 라우린 버터, 글리세로젤라틴 등을 포함한다.
바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 컨쥬게이트는 물에 용해시키거나 다른 약학적으로 허용 가능한 수용성 담체 내에서 용해시키고, 이때 상기 컨쥬게이트는 선택적으로 다른 약학적으로 허용 가능한 부형제, 보존제 등에 대해 우수한 용해도를 갖게 된다.
프로드러그 컨쥬게이트를 이용한 방법(Method using prodrug conjugates)
전술한 바에 따르면, 본 발명에 따른 항암제 프로드럭 컨쥬게이트는 세포사멸 유도 방법, 세포사멸 증가방법, 및 항암 치료 방법에 유용하다. 일 구현예에 따르면, 상기 항암제 프로드럭 컨쥬게이트는 표적 세포 (일례로, 종양 세포)의 세포사멸 유도, 표적 세포의 세포사멸 증가를 필요로 하는 대상자, 및/또는 암 치료를 필요로 하는 대상자에게 투여가 가능하다.
일부 구현예에 따르면, 상기 컨쥬게이트의 투여 전 또는 이와 동시에 상기 대상자는 표적 세포 내 세포사멸을 유도하는 치료가 적용되고, 이로 인해 카스파제의 발현이 유도된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 세포사멸은 치료적으로 허용 가능한 방법에 의해 유도가 가능하며, 이러한 방법은 방사선 치료, 발열 치료, 레이저 치료, 광역동 치료, 화학요법 치료 및 저온수술, 또는 종양 세포를 표적하는 저분자 티로신 키나아제 억제제(TKI) 또는 모노클로날 항체와 같은 표적 치료로 이루어진 군에서 선택된다. 상기 항암 화학요법제는 상기 언급한 바를 포함하며, 이 분야에서 공지된 항암 화학요법제일 수 있으며, 항암제 프로드러그 컨쥬게이트의 항암 화학요법제와는 같거나 다를 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 종양 또는 암은 전이되거나 또는 특정할 수 없는 위치를 포함하도록, 상기 세포사멸 유도 치료는 TKIs, 항체, 앱타머 또는 표적 나노입자와 같은 종양 세포를 표적하는 표적 치료를 포함한다.
바람직한 구현예에 따르면, 세포사멸은 방사선 치료에 의해 유도된다. 본 명세서에서 언급하는 '방사선 치료'의 용어는 외부방사선치료, 밀봉선원 방사선 치료(sealed source radiation therapy), 시스템적 방사선 동위원소 치료(systemic radioisotope therapy)를 포함하는 모든 방법의 방사선 치료를 의미한다. 몇몇 구현예에 따르면, 상기 방사선 치료는 종양 위치와 같은 표적 위치에 국부적으로 집중된다. 다른 구현예에 따르면, 상기 방사선 치료는 항암제 프로드럭 컨쥬게이트의 투여에 앞서는 것이 효과적이다. 방사선 치료를 이용한 다른 구현예에 따르면, 상기 방사선 치료는 감마나이프 방사, 사이버 나이프 방사 및/또는 고강도 집중 초음파 방사를 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 방사선 치료는 낮은 방사선 도즈량의 치료를 포함한다. 바람직한 구현예에 따르면, 성인 대상자는 1회 약 70Gy의 도즈량의 방사선량으로 치료된다. 다른 구현예에 따르면, 성인 대상자의 경우 약 35 Gy 까지의 단일 도즈량으로 치료된다. 또 다른 구현예에 따르면, 성인 대상자는 1주일 당 약 10Gy의 도즈량으로 치료된다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 항암제 프로드럭 컨쥬게이트는 다양한 루트의 투여로 투여가 가능하다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항암제 프로드럭 컨쥬게이트는 정맥 투여가 가능하다. 이때 항암제 프로드럭 컨쥬게이트의 투여량은 투여되는 대상자 및 상태에 따라 다양하게 변경 가능하고, 이 분야의 통상의 기술을 가진 자에 의해 결정될 수 있다. 몇몇 구현예에 따르면, 대상자에 대한 투여량은 약 1 mg/kg ~ 약 100 mg/kg, 바람직하기로 약 5 mg/kg ~ 약 75 mg/kg, 더욱 바람직하기로 약 10 mg/kg ~ 약 50 mg/kg, 또는 더 많은 양을 포함할 수 있다. 보다 구체적인 구현예에 따르면, 상기 항암제 프로드럭 컨쥬게이트는 항암제의 단독 사용 보다 낮은 독성을 나타내어, 결과적으로 항암제의 단독 사용시 비독성을 나타내는 함량보다 더 높은 양의 투여량을 가질 수 있다.
몇몇 구현예에 따르면, 상기 항암제 프로드럭 컨쥬게이트는 표적 영역에 국소 투여와 같이 종양 위치에 국소적으로 투여된다. 다른 구현예에 따르면, 이러한 표적 영역은 상기 제시한 바와 같은 세포사멸 유도 치료가 이미 치료가 진행된 영역이다.
몇몇 구현예에 따르면, 상기 대상자는 항암제 프로드럭 컨쥬게이트 투여 후추가의 세포사멸 유도 치료를 진행하는 것이 바람직하다. 이러한 구현예에 따르면, 연속하는 세포사멸 유도 치료는 이전의 세포사멸 유도 치료와 비교하여 같거하거나 동일할 수 있다. 선택적으로, 연속하는 세포사멸 유도 치료는 이전의 세포사멸 유도 치료와는 다를 수 있다. 이러한 차이는 본 발명에서 특별히 한정하지 않으며 치료 종류(예, 방사선 치료, 발열 치료법, 레이져 치료, 광역동 치료, 항암화학요법, 저온 수술, 또는 표적 치료), 항암 화학요법제 또는 표적 분자 치료가 가능하다. 바람직하기로 방사선 치료가 가능하며, 이때 치료 시 도즈량, 조사 시간 등은 세포사멸 유도 치료에 따라 변경 가능하다.
바람직한 구현예에 따르면, 본 명세서에서 언급하는 세포사멸 증가 방법은 하기 단계를 따른다: 세포사멸은 상기 언급한 바와 같은 세포사멸 유도 치료에 의해 유도하고, 결과적으로 카스파제를 발현한다. 항암제 프로드럭 컨쥬게이트를 투여하고, 카스파제 절단 가능한 펩타이드 링커는 카스파제에 의해 절단 되고, 항암 화학요법제가 방출된다. 상기 항암 화학요법제는 추가적인 세포의 사멸을 유도하고, 결과적으로 추가적인 카스파제의 발현이 이루어지며, 추가의 프로드럭 컨쥬게이트의 카스파제 유도 절단 활성이 일어나, 결과적으로 세포사멸을 증가시킨다. 이러한 증가는 표적 종양 세포와 같은 표적 세포의 살상에 대한 높은 효율 및 특이성이 있는 방법이라 할 수 있다. 더욱이, 이러한 증가 효과는 세포사멸 유도 치료 및/또는 항암제 프로드럭 컨쥬게이트의 투여량 사이의 시간을 연장하는 효과가 있다. 몇몇 구현예에 따르면, 상기 증가 효과는 다수의 암 세포들을 치료하는데 요구되는 항암 화학요법제의 함량을 저감할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 항암제 프로드럭 컨쥬게이트는 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커의 절단에 앞서 비활성을 갖는다. 이에, 상기 항암제 프로드럭 컨쥬게이트는 건강한 세포에 대해 비독성 (또는 사멸)을 갖는다. 바람직한 구현예에 따르면, 비컨쥬게이트된 형태로 동일 항암 화학 요법제를 투여한 것과 비교하여, 본 발명에서 제시하는 방법은 정상 세포에 대해 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 그 이상의 손상을 저감하는 효과가 있다.
더욱이, 본 발명에 따른 항암제 프로드럭 컨쥬게이트의 세포사멸 효과는 일례로, 세포사멸이 진행되는 세포와 같은 카스파제가 발현하는 세포에 대해 선택성을 갖는다. 이에, 일단 표적 영역 (일례로, 표적 조직) 내에서 세포사멸이 유도되면, 본 발명에 따른 방법은 다른 표적 세포의 세포사멸을 선택적이면서도 효과적으로 유도하여, 이로 인해 일례로 암을 치료한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
< 실시예 1> 말레이미드 - Lys -Asp- Glu -Val-Asp- PABC - 독소루비신 프로드럭의 제조
Asp-Glu-Val-Asp 펩타이드의 N-말단에 티올기와 결합 가능한 말레이미드기가 유도되어있고 C-말단에 항암 화학요법제, 특히 항암제로서의 유효성분인 독소루비신이 화학적으로 결합 되어 있는 프로드럭을 제조하였다(도 1 및 도 2).
본 실시예의 물질은 정맥투여 후 내인성 알부민의 티올기와 결합하는 말레이미드기와 방사선 조사된 종양에서 활성화되는 카스파제 3에 의해 효소적으로 가수분해되는 Asp-Glu-Val-Asp 펩타이드 서열을 가진 링커가 항암 화학요법제인 독소루비신에 결합되어 내인성 알부민에 의해 종양 조직까지 물질이 전달된 후 카스파제 3에 의해 독소루비신이 방출된다.
Ac-Lys(OAloc)-Gly-Asp(OAll)-Glu(OAll)-Val-Asp(OAll)-OH (344 mg, 0.38 mmol)와 4-아미노벤질 알코올(2 eq), EEDQ (2 eq)를 무수 DMF (11 mL)에 녹인 후 아르곤 기체 하에 상온에서 24시간 교반하였다. 용액을 진공농축 후 에테르로 결정시켜 Ac-Lys(OAloc)-Gly-Asp(OAll)-Glu(OAll)-Val-Asp(OAll)-PABOH를 수득하였다.
Ac-Lys(OAloc)-Gly-Asp(OAll)-Glu(OAll)-Val-Asp(OAll)-PABOH (322 mg, 0.318 mmol)과 4-니트로페닐 클로로포르메이트 (1.2 eq) 을 무수 디클로로메탄(10mL)에 녹인 후 2,6-루티딘(3 eq)을 가하여 상온에서 교반하였다. 2시간 후 무수 DMF (2 mL)를 반응물질에 가하고 2,6-루티딘 (2 eq)을 첨가하였다. 24시간과 27시간 그리고 46시간 후 2,6-루티딘 (4.75 eq), 4-니트로페닐 클로로포르메이트 (1 eq)을 각각 가하여 상온에서 교반하고 84시간이 지난 후에 소디엄 바이카보네이트 수용액을 가하여 반응을 종결하였다.
반응물질은 에틸아세테이트로 세 번 추출하고 유기층은 0.5 M 시트르산, 수용성 NaHCO3, 및 브린으로 연속적으로 세척하였다. 얻어진 유기층은 무수 NaSO4를 첨가하여 건조하고, 여과한 후, 감압 농축하였다. 이어서, 농축액은 C18 역상 칼럼(250mmX22mm)을 이용한 세미 예비 HPLC (물/CH3CN, 첨가제로서 0.1% TFA 포함, CH3CN 20-100% over 50 min, 10 ml/min)로 정제하여 Ac-Lys(OAloc)-Gly-Asp(OAll)-Glu(OAll)-Val-Asp(OAll)-PABC 을 얻었다(77 mg, 20.5%). ESI-MS: m/z 1200.54 [M + Na]+.
얻어진 Ac-Lys(OAloc)-Gly-Asp(OAll)-Glu(OAll)-Val-Asp(OAll)-PABC (77 mg, 0.065 mmol)과 독소루비신 염산염 (1.2 eq)을 무수 DMF (8 mL)에 녹인 후 DIEA (5.4 eq)을 가하고 어두운 환경에서 16시간 상온에서 교반하였다. 감압 하에 용매를 제거한 후 예비 HPLC로 Ac-Lys(OAloc)-Gly-Asp(OAll)-Glu(OAll)-Val-Asp(OAll)-PABC-DOX (붉은 비결정형 고체, 76 mg, 74%)을 분리해 얻었다. ESI-MS: m/z 1605.06 [M + Na]+.
Ac-Lys(OAloc)-Gly-Asp(OAll)-Glu(OAll)-Val-Asp(OAll)-PABC-DOX (50mg, 0.032 mmol)과 Pd(PPh3)4 (0.2eq)을 무수 DMF (7.6 mL)에 녹인 후 아세트산 (20 eq)과 트리부틸틴 무수물 (17.3 eq)를 반응물에 첨가하였다. 상온에서 1시간 교반 후 용매를 감압 하에 제거하고 보존제 HPLC로 탈보호화된 Ac-Lys-Gly-Asp-Glu-Val-Asp-PABC-DOX (붉은색 비결정형 고체, 6 mg, 13.6%)을 분리해 얻었다. ESI-MS: m/z 1378.4 [M + H]+.
얻어진 Ac-Lys-Gly-Asp-Glu-Val-Asp-PABC-DOX (20 mg, 0.013 mmol)과 N-(ε-말레이미도카프록실옥시)숙신이미드 에스테르(EMCS; 8.26 mg, 26.8 μmol, 2 eq; Pierce, Rockford, IL)를 무수 DMF (1.5 ml; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)에 녹였다. 그 후 트리에틸아민 (4.64 μl, 2.5 eq; Sigma-Aldrich)을 가하고 상온에서 2시간 교반하였다.
농도구배 시스템 (Water and CH3CN with 0.05% TFA as an additive, CH3CN 20-50% over 50 min, 8 ml/min)에서 ODS-A 5 μm 역상 세미-예비 칼럼 (150 mm x 20 mm)을 사용하는 세미-예비 HPLC (Shimadzu, Kyoto, Japan)로 최종산물이 분리되었으며 Ac-Lys(EMC)-Gly-Asp-Glu-Val-Asp-PABC-doxorubicin (red amorphous solid, 16.7 mg, 73.6%)를 수득하였다.
피크는 290nm 에서 모니터링 하였다. 최종 산물의 분리는 농도구배 시스템 (water and CH3CN with 0.05% TFA as an additive, CH3CN 20-50% over 50 min, 8 ml/min)에서 ODS-A 5μm 분석칼럼(150mm x 3mm; YMC)을 사용하는 분석 HPLC (Agilent 1300 series, Agilent Technologies, Santa Clara, CA)을 통해 확인되었다. 피크는 UV 탐지기 (214 nm) 및 형광 탐지기 (excitation 470nm, emission 580 nm)를 통해 모니터링 하였다. 최종산물의 순조는 95% 이상으로 확인되었다. ESI-MS (m/z): 1593.3 [M + Na]+.
<실시예 2> 말레이미드-KGDEVD-PABC-다우노루비신 프로드럭의 제조
실시예 1과 유사한 펩타이드 프로드럭, 특히 다우노루비신을 항암 화학요법제로 포함하는 프로드럭을 제조하였다(도 3).
<실시예 3> 말레이미드-KGDEVD-PABC-파클리탁셀 프로드럭의 제조
실시예 1과 유사한 펩타이드 프로드럭, 특히 파클리탁셀을 항암 화학요법제로 포함하는 프로드럭을 제조하였다(도 4).
<실시예 4> 말레이미드-KGDEVD-PABC-MMAE 프로드럭의 제조
실시예 1과 유사한 펩타이드 프로드럭, 특히 MMAE (monomethyl auristatin E)를 항암 화학요법제로 포함하는 프로드럭을 제조하였다(도 5).
<실시예 5> 말레이미드-DEVD-PABC-독소루비신 프로드럭의 제조
실시예 1과 유사한 펩타이드 프로드럭, 특히 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커 DEVD를 포함하는 프로드럭을 제조하였다(도 6). DEVD는 카스파제-3,-7,-9에 의해 절단 가능하다.
<실시예 6> 말레이미드-DEID-PABC-독소루비신 프로드럭의 제조
실시예 4와 유사한 펩타이드 프로드럭, 특히 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커 DEID를 포함하는 프로드럭을 제조하였다(도 7). DEID는 카스파제-3,-7,-9에 의해 절단 가능하다.
<실시예 7> 말레이미드-DLVD-PABC-독소루비신 프로드럭의 제조
실시예 4와 유사한 펩타이드 프로드럭, 특히 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커 DLVD를 포함하는 프로드럭을 제조하였다(도 8). DLVD는 카스파제-3,-7,-9에 의해 절단 가능하다.
<실시예 8> 말레이미드-DEVD-독소루비신 (PABC 제외) 프로드럭의 제조
실시예 4와 유사한 프로드럭 펩타이드 프로드럭, 특히 PABC 스페이서(spacer)는 포함하지 않는다. 본 실시예에서 상기 펩타이드 링커를 독소루비신의 3'-NH2에 직접 연결하여 프로드럭 컨쥬게이트 말레이미드-DEVD-독소루비신를 제조 하였다(도 9).
<실시예 9> 말레이미드-DEVD-MMAE (PABC 제외) 프로드럭의 제조
실시예 1와 유사한 펩타이드 프로드럭, 특히 MMAE (monomethyl auristatin E)를 항암 화학요법제로 포함하는 프로드럭을 제조하였다(도 10).
<실시예10> Pyridlydithiol-KGDEVD-PABC-독소루비신 프로드럭의 제조
실시예 1와 유사한 펩타이드 프로드럭, 특히 피리딜디티올기는 기능기로 도입하고, 독소루비신은 항암 화학요법제로 포함하는 프로드럭을 제조하였다(도 11). 피리딜디티올 기능기 결합(bind)은 내인성(endogenous) 알부민과 결합하고 프로드럭 컨쥬게이트 혈장 순환시간을 연장한다. 본 실시예에서 3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트와 독소루비신은 각각 카스파제-3,-7,-9에 의해 절단 가능한 KGDEVD의 N-,C-말단에 결합된다, 상기에 예시된 다른 프로드럭 컨쥬게이트와 마찬가지로, 상기 프로드럭 컨쥬게이트는 순환하는 내인성 알부민에 공유결합하고 종양세포에 축적된다. 세포사멸이 유도되고 카스파제-3,또는 카스파제-7이 활성화 되었을 때, 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커가 절단되어 독소루비신이 방출된다.
< 실시예 11> 올리에이트 - KGDEVD - PABC - 독소루비신 프로드럭의 제조
실시예 9와 유사한 펩타이드 프로드럭, 특히 올리에이트를 기능기로 포함하는 프로드럭을 제조하였다(도 12). 상기 올리에이트 기능기 결합은 내인성 알부민과 결합하고 프로드럭 컨쥬게이트 혈장 순환시간을 연장한다.
<실시예 12> 폴리에틸렌 글리콜-KGDEVD-PABC-독소루비신 프로드럭의 제조
실시예 9와 유사한 펩타이드 프로드럭, 특히 폴리에틸렌글라이콜을 기능기로 포함하는 프로드럭을 제조하였다(도 13). 폴리에틸렌글라이콜 때문에 상기 명시된 것처럼 카스파제 활성화와 독소루비신 방출 전까지 프로드럭 컨쥬게이트는 매우 긴 반감기를 가지고 혈액 내에서 순환하고 종양 내에 축적된다.
<실시예 13> 히알루로난-KGDEVD-PABC-독소루비신 프로드럭의 제조
실시예 8와 유사한 펩타이드 프로드럭, 특히 히알루로난을 기능기로 포함하는 프로드럭을 제조하였다(도 14, 대표구조). 도 14에 도식된 것과 같이, 몇몇 독소루비신 펩타이드 유닛은 히알루론산 단분자에 공유결합하였다. 정맥투여 후 상기 명시된 것처럼 카스파제 활성화와 독소루비신 방출 전까지 프로드럭 컨쥬게이트는 매우 긴 반감기를 가지고 혈중을 순환하고 종양내에 축적한다.
<실시예 14> 폴레이트-KGDEVD-PABC-독소루비신 프로드럭의 제조
실시예 9와 유사한 펩타이드 프로드럭, 폴릭산을 기능기로 포함하는 프로드럭을 제조하였다 (도 15)
<실시예 15> RGDEVD-PABC-독소루비신 프로드럭의 제조
본 실시예에서 기능기와 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커는 함께 RGDEVD 기능기를 포함하는 프로드럭을 제조하였으며 이때 RGD는 인테그린 αvβ3 또는 αvβ5가 결합하는 서열이고 DEVD는 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 서열이다(도 16, 도17). (상기 RGD 기능기는 선형 또는 고리형이다), 정맥투여 후에 프로드럭은 종양 조직 내피세포 및 종양세표에 발현하는 인테그린 αvβ3 또는 αvβ5이 종양에 선택적으로 결합하므로써 축적된다. 세포사멸이 유도될 때, 독소루비신은 DEVD 링커의 절단에 의해 상기에서 말한 것처럼 프로드럭에서 방출된다.
< 실시예 16> CQRPPRDEVD - PABC - 독소루비신 프로드럭의 제조
본 실시예에서 기능기와 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커는 함께 CQRPPRDEV D 기능기를 포함하는 프로드럭을 제조하였으며 히스톤 H1과 결합하는 서열과 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 서열을 포함하고 있다(도 18). 정맥 투여후 세포사멸 세포는 히스톤 H1을 발현하기 때문에 프로드럭은 세포사멸 부위로 향한다. 여기서 세포사멸 세포에 의해 발현되는 카스파제는 프로드럭을 절단하고 독소루비신은 방출된다.
<실시예 17> RGDEVD-MBA-독소루비신 프로드럭의 제조
본 실시예는 실시예 15(도 19)와 유사한 펩타이드 프로드럭을 제조하였다. 구체적으로 RGDEVD 펩타이드는 AcRGDEVD-MBA-독소루비신을 만들기 위해 독소루비신의 14-OH기에 결합하여 프로드럭을 제조하였다.
상기 AcRGDEVD-MBA-독소루비신 제조법은 하기와 같다:
14-독소루비시닐 말레이미도부티레이트 에스테르는 제조된 펩타이드의 컨쥬게이션을 위해 Meyer-Losic 등(Meyer-Losic, F., et al., J. Med. Chem., 2006, 49, 6908-16)에 의거하여 합성하였다. 다우노루비신 하이드로클로라이드(100 mg, 177.3 μmol)는 무수메탄올(3 ml)과 무수 1,4-다이옥세인(2.5 ml) 혼합물에 용해시켰다. 트리메틸 오쏘포메이트 (89.2 μl, 815.6 μmol, 4.6 eq)와 브롬(15.7 μl, 306.8 μmol, 1.73 eq)을 11℃에서 첨가한 후 질소 존재 하에 2시간 동안 반응시켰다. 여기에 프로필렌옥사이드(31.9 μl, 455.7 μmol, 2.57 eq)를 4℃에서 첨가한 후 75분간 반응시켰다. 이어 그 후 아세톤(8.6 ml)과 0.25 M 브롬화수소산(3 ml)를 적가시킨 후 상온에서 48시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후, 반응용액을 증류수(5 mL)로 희석한 후 클로로포름(10 mL)으로 두 번 추출하였다. 이어서, 추출 후 수용성 층에 함수(5 mL)를 가한 후 수용성 층이 투명해질 때까지 n-부탄올로 추출하였다. 유기층을 35℃에서 감압 농축한 후 n-헥산으로 침전시켜 14-할로다우노루비신을 수득하였다(붉은색 고체). m/z (ESIMS): 562.0 [M + H]+(14-클로로다우노루비신), 605.9 [M+H]+(14-브로모다우노루비신).
4-말레이미도부티르산 현탁액을 제조하고, 0.1M의 소디엄 바이카보네이트를 천천히 교반하면서 적가하였다. 20분간 교반 후 30℃에서 진공 농축시켰다. 소디엄 4-말레이미도부티레이트를 얻기 위해 농축액을 동결건조시켰다. 얻어진 소디엄 4-말레이미도부티레이트 (263 mg, 1.28 mmol), 14-할로다우노루비신(138 mg, 237.2 μmol)을 아세톤에 녹인 후 질소 충진 하에 4시간 환류시켰다. 용액을 식힌 후 여과하였다. 남아있는 고체를 아세톤으로 씻은 후 여과액을 감압증류 하였다. 얻어진 붉은색 고체를 0.1% TFA가 첨가된 증류수로 녹인 후 고순도의 14-독소루비시닐 말레이미도부티레이트 에스테르를 얻기 위해 ODS-A 5 μm 세미 예비 칼럼 (150 mm x 20 mm; YMC, Dinslaken, Germany)을 사용하여 예비 역상 HPLC(Shimadzu, Kyoto, Japan)로 정제하였다. 이동상은 증류수와 ACN (0.05% TFA)로 하며 8 mL/min 선형 농도구배로 이동상 조건을 잡는다. 반응의 각 단계는 순상 TLC로 확인하였다(CH2Cl2 : MeOH, 8 : 2). m/z (ESI-MS): 709.0 [M + H]+.
상기 14-독소루비시닐 말레이미도부티레이트 에스테르와 AcRGDEVDC-NH2를 무수 DMF에 용해시킨 후 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 반응 완료 후 반응 용액에 디이소프로필 에테르를 가하여 침전시켰다. 얻어진 침전물을 여과한 후 디이소프로필 에테르로 세 차례 세척하고 건조하였다. 여기서 얻어진 붉은색 고체를 증류수에 녹인 후 상기 실시예에 있었던 준비된 역상 HPLC로 추가 정제를 수행하였다. 여기서 얻어진 것을 감압 농축한 후 감압 동결건조하여 최종 붉은색 고체를 얻었다. 최종 수득물의 순도는 HPLC와 214nm 파장의 UV로 확인한 결과 95% 확인하였다. m/z (ESIMS): 1542.0 [M + H]+
<실시예 18> DEVD-다우노루비신-RGDSC 프로드럭의 제조
본 실시예의 컨쥬게이트에서, 항암 화학요법제는 인테그린 αvβ3 또는 αvβ5가 결합하는 서열 RGD와 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드(도 20)에 공유결합하는 프로드럭을 제조하였다. (RGD는 선형 또는 구형이다). RGDSC 및 DEVD 펩타이드는 각각 다우노루비신의 14-CH3과 3'-NH2 위치에 공유결합 하였다. 정맥 투여 이후에, 이는 카스파제 유도 절단에 의해 약리학적 활성 제형 내 독소루비신을 방출할 때까지 상기 프로드럭 컨쥬게이트는 인테그린 αvβ3 및/또는 αvβ5에 대한 결합에 의해 종양 내에 선택적으로 축적되고, 종양 내피 세포 및 종양 세포 상에 발현된다.
< 실시예 19> HPLC 분석을 통한 말레이미드 - KGDEVD - PABC - 독소루비신 인간혈청 알부민 결합 실험
인간 혈청 알부민(HSA)용액을 PBS에 용해 시켜 농도가 700μM 되도록 하였다. 그 후에 말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신을 넣어 농도가 100μM이 되도록 한 후 상온에서 배양하였다. 시료를 분석 HPLC로 분석하였다(도 21).
말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신과 HSA의 컨쥬게이트 결합은 3분 안에 완료 되었으며 결합하지 않은 소량의 물질이 검출되었다. 그러나 HSA가 말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신과 배양되기 전에 티올 결합 말레이미드 그룹을 가지고 있는 4-말레이미도부티르산과 미리 배양되었을 때, 말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신과 HSA의 결합은 1시간이 지나도 관찰되지 않았다. 이는 말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신의 결합은 특별히 EMC 기능기의 말레이미드 관능기를 통해 행해지는 것을 알 수 있다.
< 실시예 20> HPLC 분석을 통한 말레이미드 - KGDEVD - PABC - 독소루비신의 혈장 내 인간혈청 알부민 결합 실험
인간혈장 시료에 말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신을 넣어 농도가 100 μM이 되도록 하고 상온에서 배양하였다. 시료를 analytical HPLC로 분석하였다(도 22). 말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신과 HSA의 컨쥬게이트 결합은 3분 안에 완료하였다. 그러나 혈장이 말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신과 배양되기 전에 티올 결합 말레이미드 관능기를 갖는 4-말레이미도부티르산과 미리 배양되었을 때, 혈청과의 실험에서처럼 말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신과 혈장의 결합은 1시간이 지나도 관찰되지 않았다. 이는 말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신의 결합은 특별히 EMC 기능기의 말레이미드 관능기를 통해 행해지는 것을 알 수 있다.
< 실시예 21> HPLC 분석을 통한 말레이미드 - KGDEVD - PABC - 독소루비신 ( HSA -KGDEVD- PABC-독소루비신)과 재조합 인간 카스파제-3
HSA-말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신은 정제된 카스파제-3과 배양한 후 HPLC로 분석하였다(도 23). 독소루비신은 HSA-말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신 컨쥬게이트에서 1시간 이내에 절단되어 분리되었다.
< 실시예 22>인간 카스파제 -3 존재 유무 하에서 HSA - KGDEVD - PABC - 독소루비신의 농도에 따른 in vitro 항암 효과
상기 HSA-말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신 컨쥬게이트는 SCC7과 MDA-MB-231세포에서 100μM까지 농도를 높여 MTT 분석으로 검사하였을 때 뚜렷한 독성 효과는 나타내지 않았다. 그러나 HSA-말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신이 세포 첨가 전에 정제된 카스파제-3와 미리 배양되었을 때 공유결합되지 않은 독소루비신이 SCC7과 MDA-MB-231에서 보인 세포독성과 유사한 정도를 나타냈다.
< 실시예 23> 스프레그 - 다우리 랫트에 말레이미드 - KGDEVD - PABC - 독소루비신과 AcKGDEVD-PABC-독소루비신을 투여 한 후 독소루비신의 시간에 따른 혈장농도 곡선
말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신과 AcKGDEVD-PABC-독소루비신 컨쥬게이트의 약물동태학 프로파일(pharmacokinetic profile)은 스프레그-다우리 렛트에 독소루비신 기준으로 1 mg/kg와 동등한 양으로 스프레그-다우리 랫트에 정맥투여 후 분석되었다(도 25). 5, 15, 30, 60, 90분 간격 채혈 후 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 144시간 후에 500 μl씩 컨쥬게이트를 투여하였다. 채혈한 샘플에 시트르산나트륨을 넣어 안정화시킨 뒤 혈장을 얻기 위해 15분 동안 2000xg 조건에서 냉동 원심 분리하였다. 혈장샘플 200μl를 96-웰 블랙 마이크로플레이트에 넣은 뒤 독소루비신의 형광을 485/590 nm에서 측정하였다. 기준점은 깨끗한 혈장으로 준비되었으며 형광은 상기와 동일하게 측정하였다.
말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신은 30분의 최종 반감기를 나타냈으며 혈장농도는 4시간 안에 검출 한계 5 ng/ml 아래로 감소하였다. 반면 말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신은 19시간 이상 증가된 반감기를 나타냈으며 투여 후에 혈장에서 6일 동안 작용하였다.
< 실시예 24> 초기 방사선 노출 유무의 종양을 가진 쥐에게 말레이미드 -KGDEVD-PABC-독소루비신 투여 후 종양 성장 프로파일 검사
말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신에 의한 종양 성장 억제는 쥐평판종양 세포 SCC7을 가지고 있는 C3H/HeN 쥐들을 가지고 평가하였다(도 26). 말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신 또는 AcKGDEVD-PABC-독소루비신을 각각 독소루비신 몰랄농도 기준으로 1 mg/kg와 동등한 양으로 7일간 매일 정맥투여한 후 2주간 관찰하였다. 방사선 치료 그룹의 경우 투여 첫날 쥐의 종양에 4 Gy의 X선을 조사하였다. 상기 말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신 자체만 투여한 것에서 실험군과 비슷한 종양성장 억제 효과를 나타냈다. 상기 말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신이 한번의 방사선 노출과 병행되었을 때 충분한 항암효과가 관찰되었다. 상기 말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신은 AcKGDEVD-PABC-독소루비신보다 우수한 종양 억제 효과를 나타냈다.
< 실시예 25> 종양을 가진 동물에게 다른 양의 말레이미드 - KGDEVD - PABC - 독소루비신 또는 독소루비신을 투여한 후 상기 초기 방선선 양을 조사하였을 때 종양성정 프로파일의 검사
말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신에 의한 종양 성장 억제는 쥐평판종양 세포 SCC7을 가지고 있는 C3H/HeN 쥐들을 가지고 평가하였다(도 27). 말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신(1, 5, 10 mg/kg 독소루비신의 몰랄 당량) 또는 독소루비신(1 mg/kg) 2주 동안 하루걸러 정맥 투여를 하였다. 종양은 첫날 약물 투여와 같이 4 Gy의 X선을 조사하였다. 상기 말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신은 양에 따라 종양 억제 효과(a dose-dependentanti-tumor effect)를 나타냈고 독소루비신만 당량으로 투여한 것보다 우수한 종양억제 효과를 나타냈다.
< 실시예 26> 말레이미드 - KGDEVD - PABC - 독소루비신과 AcKGDEVD - PABC - 독소루비신을 정맥투여한 시노몰구스 원숭이에게서 시간에 따른 혈장 농도변화 곡선
말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신과 AcKGDEVD-PABC-독소루비신 컨쥬게이트의 약물동태학 프로파일(pharmacokinetic profile)은 독소루비신 기준으로 1 mg/kg와 동등한 양으로 시노몰구스 원숭이에게 정맥투여 후 평가하였다(도 28). 15, 30, 45, 60, 90분 간격 채혈 후 2, 3, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168시간 후에 500 μl씩 컨쥬게이트를 투여하였다. 채혈한 샘플에 시트르산나트륨을 넣어 안정화시킨 뒤 혈장을 얻기 위해 15분 동안 2000xg 조건에서 냉동원심 분리하였다. 혈장샘플 200μl를 96-웰 블랙 마이크로플레이트에 넣은 뒤 독소루비신의 형광을 485/590nm에서 측정하였다. 기준점은 깨끗한 혈장에서 준비되었으며 형광은 상기와 동일하게 측정하였다. 상기 AcKGDEVD-PABC-독소루비신은 1시간의 최종 반감기를 나타냈으며 혈장농도는 6시간 안에 검출 한계 5 ng/ml 아래로 감소하였다. 반면 말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신은 106시간 이상 증가된 반감기를 나타냈으며 투여 후에 혈장에서 7일 동안 검출되었다.
<110> University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation SNU R&DB FOUNDATION <120> Multifunctional anticancer prodrugs activated by the induced phenotype, their preparation methods and applications <130> ADP-2014-0520 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 1 Asp Xaa Xaa Asp 1 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 2 Leu Xaa Xaa Asp 1 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 3 Val Xaa Xaa Asp 1 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 4 Asp Glu Val Asp 1 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 5 Asp Leu Val Asp 1 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 6 Asp Glu Ile Asp 1 <210> 7 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 7 Leu Glu His Asp 1 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 8 Lys Gly Asp Glu Val Asp 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 9 Cys Gln Arg Pro Pro Arg 1 5

Claims (18)

  1. (i) 기능기
    (ii) 상기 기능기에 직접 또는 링커를 통하여 연결되고, 카스파제에 의해 절단 가능한 펩타이드 링커 및
    (iii) 상기 펩타이드 링커에 직접 또는 링커를 통해 연결되는 항암 화학요법제를 포함하고
    상기 기능기는 표적 세포에서 위치추적, 표적세포에 대한 결합, 종양 조직 내 축적, 컨쥬게이트의 혈장 순환시간 연장으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 기능을 발휘하는 것인 항암제 프로드럭 컨쥬게이트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 기능기는 말레이미드(maleimide), N-하이드록시숙신이미드 에스테르 (N-hydroxysuccinimide ester), 할로겐 아세트아마이드(halogenacetamide), 할로겐 아세테이트(halogen acetate), 아지리딘(aziridine), 디설파이드(disulfide), 아세틸렌(acetylene), 피리딜티오(pyridylthio), 비닐카보닐(vinylcarbonyl), 알부민(albumin), 트랜스페린(transferrin), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 및 히알루론산(hyaluronic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 항암제 프로드럭 컨쥬게이트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 기능기는 선택적으로 종양세포 또는 종양의 내피세포에 결합하는 항체, 단백질, 앱타머, 올리고뉴클레오타이드 및 당류로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 항암제 프로드럭 컨쥬게이트.
  4. 제1항에 있어서, 상기 기능기는 RGD, 고리형-RGD, 폴릭산 및 Cys-Gln-Arg-Pro-Pro-Arg(서열목록:9) 아미노산 서열을 구성하는 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 항암제 프로드럭 컨쥬게이트.
  5. 제1항에 있어서, 상기 기능기는 말레이미드인 항암제 프로드럭 컨쥬게이트.
  6. 제1항에 있어서, 상기 카스파제에 의해 가수분해되는 펩타이드 링커는 카스파제-3, 카스파제-7 및 카스파제-9로 이루어진 군에서 선택된 카스파제에 의해 가수분해되는 항암제 프로드럭 컨쥬게이트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 카스파제에 의해 효소적으로 가수분해되는 펩타이드 링커의 4개의 C-말단 아미노산 잔기는 Asp-Xaa-Xaa-Asp(서열목록:1), Leu-Xaa-Xaa-Asp(서열목록:2) 및 Val-Xaa-Xaa-Asp(서열목록:3)으로 이루어진 군에서 선택되고, 이때 Xaa는 임의의 아미노산 잔기인 것을 특징으로 하는 항암제 프로드럭 컨쥬게이트.
  8. 제7항에 있어서, 상기 카스파제에 의해 가수분해되는 펩타이드 링커의 4개의C-말단 아미노산 잔기는 Asp-Glu-Val-Asp(서열목록:4), Asp-Leu-Val-Asp(서열목록:5) Asp-Glu-Ile-Asp(서열목록:6) 및 Leu-Glu-His-Asp(서열목록:7)으로 이루어진 군에서 선택된 항암제 프로드럭 컨쥬게이트.
  9. 제8항에 있어서, 상기 카스파제에 의해 가수분해되는 펩타이드 링커의 6개의 C-말단 아미노산 잔기는 Lys-Gly-Asp-Glu-Val-Asp(서열목록:8)를 포함하는 항암제 프로드럭 컨쥬게이트.
  10. 제1항에 있어서, 상기 항암 화학요법제는 종양세포의 세포사멸을 유도하는 항암제 프로드럭 컨쥬게이트.
  11. 제1항에 있어서, 상기 항암 화학요법제는 안트라사이클린, 항생제, 알킬화제, 백금계 제제(platinum-based agents), 대사 길항제, 토포이소머라아제 억제제 및 유사분열 억제제로 이루어진 군에서 선택된 항암제 프로드럭 컨쥬게이트.
  12. 제1항에 있어서, 상기 항암 화학요법제는 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 이다루비신, 발루비신 및 이것들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 화학요법제를 포함하는 항암제 프로드럭 컨쥬게이트.
  13. 제1항에 있어서, 상기 항암 화학요법제는 액티노마이신-D, 블레오마이신, 마이토마이신-C, 칼리키아마이신 및 이것들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 항암 화학요법제를 포함하는 항암제 프로드럭 컨쥬게이트.
  14. 제1항에 있어서, 상기 항암 화학요법제는 사이클로포스파아마이드(cyclophosphamide), 메클로레타민(mecholrethamine), 우라무스틴(uramustine), 멜파란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 이포스파미드(ifosfamide), 벤다무스틴(bendamustine), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 스트렙토조신(streptozocin), 부설판(busulfan), 다카바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide), 티오테파(thiotepa), 알트레타민(altretamine), 듀오카르마이신(duocarmycin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 옥사리플라틴(oxaliplatin), 사트라플라틴(satraplatin), 트리플라틴 테트라나이트레이트(triplatin tetranitrate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 카페시타빈(capecitabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시스타르빈(cystarbine), 플록스유리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 겜시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드(pemetrexed), 펜토스타틴(pentostatin), 티오구아닌(thioguanine), 캠토테신(camptothecin), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 에토포사이드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 미토산트론(mitoxantrone), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 이자베필론(izabepilone), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 에스트라머스틴(estramustine), 메이탄신(maytansine), DM1 (mertansine, 메르탄신), DM4, 돌라스타틴(dolastatin), 아우리스타틴 E(auristatin E), 아우리스타틴 F(auristatin F), 모노메틸 아우리스타틴 E(monomethyl auristatin E), 모노메틸 아우리스타틴 F(monomethyl auristatin F) 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 항암제 프로드럭 컨쥬게이트.
  15. 제1항에 있어서, 상기 기능기는 말레이미드이고, 상기 카스파제에 의해 가수분해되는 펩타이드 링커는 Lys-Gly-Asp-Glu-Val-Asp(서열목록:8) 아미노산 서열을 갖고, 상기 항암 화학요법제는 독소루비신인 항암제 프로드럭 컨쥬게이트.
  16. 제1항에 있어서, 말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신, 말레이미드-KGDEVD-PABC-다우노루비신, 말레이미드-KGDEVD-PABC-파클리탁셀, 말레이미드-KGDEVD-PABC-MMAE, 말레이미드-DEVD-PABC-독소루비신, 말레이미드-DEID-PABC-독소루비신, 말레이미드-DLVD-PABC-독소루비신, 말레이미드-DEVD-독소루비신, 말레이미드-DEVD-MMAE, 피리딜디티올-KGDEVD-PABC-독소루비신, 올리에이트-KGDEVD-PABC-독소루비신, 폴리에틸렌 글리콜-KGDEVD-PABC-독소루비신, 히알루로난-KGDEVD-PABC-독소루비신, 폴레이트-KGDEVD-PABC-독소루비신, RGDEVD-PABC-독소루비신, CQRPPRDEVD-PABC-독소루비신, RGDEVD-MBA-독소루비신, DEVD-다우노루비신-RGDSC, 및 HSA-말레이미드-KGDEVD-PABC-독소루비신으로 이루어진 군에서 선택된 것인 항암제 프로드럭 컨쥬게이트.
  17. 제 1항의 항암제 프로드럭 컨쥬게이트 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암예방 또는 암치료용 약학적 조성물.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 정맥투여, 경구투여, 경피투여, 직장투여를 위한 것인 약학적 조성물.
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