CN106170303A - 通过半胱天冬酶激活的前体药物 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了在通过半胱天冬酶激活后释放化疗剂的前体药物缀合物，以及使用这类前体药物缀合物来诱导细胞凋亡、增强细胞凋亡和治疗癌症的方法。

Description

通过半胱天冬酶激活的前体药物
技术领域
本发明描述了能够在通过半胱天冬酶激活后释放药物的前体药物缀合物，诱导细胞凋亡、增强细胞凋亡以及治疗癌症的相关方法。
背景技术
化疗由于其强大的抗癌效果，是最常用的抗癌疗法。然而，化疗的使用常常由于严重的副作用和毒性而受到限制。对于研发靶向肿瘤而非健康组织的选择性化疗的努力，聚焦于化疗药剂向肿瘤细胞的靶向递送，例如通过使用抗体或肽，所述抗体或肽识别并结合在肿瘤细胞而非正常细胞中优先表达的分子。然而，由于这类药物只能施用于肿瘤细胞表达靶分子的患者，使这类药物的广泛使用受到限制。此外，近期研究表明即使在给定的患者肿瘤细胞内可能显示出瘤内异质性，在单个肿瘤组织内的癌细胞中的基因表型不同。这意味着即使活组织检查确认了给定药物的靶分子表达，但并非所有的肿瘤细胞均表达靶标，因此限制了药物的治疗效果。此外，即使当大部分肿瘤组织表达靶分子，药物仍可能影响与肿瘤组织接近或接触的其它细胞，引起副作用或毒性。
为进一步解决这些问题，研发了能够在肿瘤细胞和肿瘤组织中被特异性激活的前体药物。例如，美国专利号7,445,764描述了可裂解基质金属蛋白酶(MMP)、可裂解肽与抗癌药物阿霉素(doxorubicin，多柔比星)的缀合物。美国专利申请公开号2010/0111866公开了与马来酰亚胺缀合的前体药物的可能的变体。美国专利申请公开号2010/0111866公开了以马来酰亚胺-腙-阿霉素形式前体药物缀合物。美国专利申请公开号2013/0338422公开了以肽序列–DEVD–和阿霉素的前体药物缀合物。然而，这些缀合物遭受疗效不佳和选择性不佳的一种或多种，和/或需要频繁给药。
因此，仍然需要在肿瘤细胞中选择性地作用并且不会损害正常组织的化学疗法，例如在最小副作用下显示良好功效的前体药物。
附图简要说明
图1描绘了马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素的化学结构。
图2描绘了获得包含一个马来酰亚胺官能团、含有Asp-Glu-Val-Asp序列(KGDEVD)的肽间隔基以及作为活性成分的阿霉素的前体药物的合成示意图。特别地，阿霉素和肽间隔基通过对氨基苄基氨基甲酸酯(PABC)而缀合以制得马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素。
图3描绘了马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-道诺霉素的化学结构。
图4描绘了马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-紫杉醇的化学结构。
图5描绘了马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-MMAE的化学结构。
图6描绘了马来酰亚胺-DEVD-PABC-阿霉素的化学结构。
图7描绘了马来酰亚胺-DEID-PABC-阿霉素的化学结构。
图8描绘了马来酰亚胺-DLVD-PABC-阿霉素的化学结构。
图9描绘了马来酰亚胺-DEVD-阿霉素的化学结构。
图10描绘了马来酰亚胺-DEVD-MMAE的化学结构。
图11描绘了吡啶二巯基-KGDEVD-PABC-阿霉素的化学结构。
图12描绘了油酸盐-KGDEVD-PABC-阿霉素的化学结构。
图13描绘了PEG-KGDEVD-PABC-阿霉素的代表性化学结构。
图14描绘了透明质酸-(KGDEVD-PABC-阿霉素)n的代表性化学结构。
图15描绘了叶酸盐-KGDEVD-PABC-阿霉素的化学结构。
图16描绘了RGDEVD-PABC-阿霉素的化学结构。
图17描绘了环(CRGDC)GGDEVD-PABC-阿霉素的化学结构。
图18描绘了CQRPPRDEVD-PABC-阿霉素的化学结构。
图19描绘了RGDEVD-MBA-阿霉素的化学结构。
图20描绘了DEVD-道诺霉素-RGDSC的化学结构。
图21示出了HPLC监测的马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素在市售的人血清白蛋白(HSA)上的结合研究。
图22示出了HPLC监测的马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素在人血浆中的人血清白蛋白上的结合研究。
图23示出了HPLC监测的通过重组人半胱天冬酶-3使人血清白蛋白结合的马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素(HSA-KGDEVD-PABC-阿霉素)裂解的研究。
图24示出了在存在或不存在重组人半胱天冬酶-3的条件下，人血清白蛋白结合的马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素(HSA-KGDEVD-PABC-阿霉素)的浓度依赖型体外抗癌效果。
图25示出了通过静脉注射被投予马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素或AcKGDEVD-PABC-阿霉素的斯普拉格-杜勒鼠中阿霉素的血浆浓度-时间曲线。
图26示出了被投予马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素的荷瘤动物在经过或没有经过初期辐射暴露的情况下的肿瘤生长曲线。
图27示出了被投予不同剂量的马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素或阿霉素，并在初期给药时暴露于辐射的荷瘤动物的肿瘤生长曲线。
图28示出了通过静脉注射被投予马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素或AcKGDEVD-PABC-阿霉素的食蟹猴中阿霉素的血浆浓度曲线。
发明内容
在一些实施方案中，提供了一种前体药物缀合物，其包括：(i)功能部分，(ii)半胱天冬酶-可裂解肽接头，以及(iii)化疗剂，其中所述功能部分显示选自下组的一个或多个功能：在靶细胞处定位、结合靶细胞、在肿瘤组织中积聚以及延长缀合物的血浆循环。在一些实施方案中，提供了使用本文所述的缀合物诱导细胞凋亡的方法和/或增强细胞凋亡的方法。在一些实施方案中，提供了使用本文所述的缀合物来治疗癌症的方法。
在具体的实施方案中，提供了一种化疗前体药物缀合物，其包括：(i)功能部分，直接或通过接头连接至(ii)半胱天冬酶-可裂解肽接头，直接或通过接头连接至(iii)化疗剂，其中所述功能部分显示选自下组的一个或多个功能：在靶细胞中定位、结合靶细胞、在肿瘤组织中积聚以及延长缀合物的血浆循环。
在某些实施方案中，所述功能部分选自下组：马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺酯、卤代乙酰胺、卤代乙酸酯、氮丙啶、二硫化物、乙炔、吡啶基疏基(pyridylthio)、乙烯基羰基、白蛋白、转铁蛋白、聚乙二醇以及透明质酸。在其他实施方案中，所述功能部分选自下组：与肿瘤细胞或肿瘤内皮细胞选择性结合的抗体、蛋白质、适体、寡核苷酸以及糖类。在其他实施方案中，所述功能部分选自下组：RGD、环状RGD、叶酸以及包含氨基酸序列Cys-Gln-Arg-Pro-Pro-Arg(SEQ ID NO:9)的肽。在具体的实施方案中，所述功能部分为马来酰亚胺。
在某些实施方案中，所述半胱天冬酶-可裂解肽接头通过选自下组的半胱天冬酶可被裂解：半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-7以及半胱天冬酶-9。在某些实施方案中，所述半胱天冬酶-可裂解肽接头的四个C-末端氨基酸残基选自下组：Asp-Xaa-Xaa-Asp(SEQ ID NO:1)、Leu-Xaa-Xaa-Asp(SEQ ID NO:2)以及Val-Xaa-Xaa-Asp(SEQ ID NO:3)，其中Xaa表示任何氨基酸残基。在其他实施方案中，所述半胱天冬酶-可裂解肽接头的四个C-末端氨基酸残基选自下组：Asp-Glu-Val-Asp(SEQ ID NO:4)、Asp-Leu-Val-Asp(SEQ ID NO:5)、Asp-Glu-Ile-Asp(SEQ ID NO:6)以及Leu-Glu-His-Asp(SEQ ID NO:7)。在具体的实施方案中，所述半胱天冬酶-可裂解肽接头的六个C-末端氨基酸残基由Lys-Gly-Asp-Glu-Val-Asp(SEQ IDNO:8)组成。
在某些实施方案中，所述化疗剂诱导肿瘤细胞的细胞凋亡。在某些实施方案中，所述化疗剂选自下组：蒽环霉素、抗生素、烷化剂、铂基试剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂以及有丝分裂抑制剂。在一些实施方案中，所述化疗剂选自下组：阿霉素、道诺霉素、表阿霉素、伊达比星、戊柔比星，及其衍生物。在其他实施方案中，所述化疗剂选自下组：放线菌素-D、博莱霉素、丝裂霉素-C、卡里奇霉素，及其衍生物。在其他实施方案中，所述化疗剂选自下组：环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、尿嘧啶氮芥、左旋苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、苯达莫司汀、卡莫司汀、环己亚硝脲、链脲菌素、白消安、氮烯唑胺、替莫唑胺、噻替派、六甲蜜胺、倍癌霉素、顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、赛特铂、四硝酸三铂、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、卡培他滨、克拉屈滨、氯法拉滨、cystarbine、氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、培美曲塞、喷司他丁、硫鸟嘌呤、喜树碱、拓扑替康、伊立替康、依托泊苷、替尼泊苷、米托蒽醌、紫杉醇、多西他赛、伊沙匹隆、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、雌莫司汀、美登素、DM1(mertansine)、DM4、尾海兔素、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、单甲基澳瑞他汀E、单甲基澳瑞他汀F，及其衍生物。
在具体的实施方案中，所述功能部分为马来酰亚胺，所述半胱天冬酶-可裂解肽接头具有由Lys-Gly-Asp-Glu-Val-Asp(SEQ ID NO:8)组成的氨基酸序列，所述化疗剂为阿霉素。
在某些实施方案中，所述缀合物选自下组：马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素、马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-道诺霉素、马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-紫杉醇、马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-MMAE、马来酰亚胺-DEVD-PABC-阿霉素、马来酰亚胺-DEID-PABC-阿霉素、马来酰亚胺-DLVD-PABC-阿霉素、马来酰亚胺-DEVD-阿霉素、吡啶二巯基-KGDEVD-PABC-阿霉素、油酸盐-KGDEVD-PABC-阿霉素、聚乙二醇-KGDEVD-PABC-阿霉素、透明质酸-KGDEVD-PABC-阿霉素、叶酸盐-KGDEVD-PABC-阿霉素、RGDEVD-PABC-阿霉素、CQRPPRDEVD-PABC-阿霉素、RGDEVD-MBA-阿霉素、DEVD-道诺霉素-RGDSC以及HSA-马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素。
在具体的实施方案中，提供了一种化疗前体药物缀合物，其包括：(i)半胱天冬酶-可裂解肽，直接或通过接头连接至(ii)道诺霉素，在其14-CH3直接或通过接头连接至(iii)功能部分，其中所述功能部分显示选自下组的一个或多个功能：在靶细胞处定位、结合靶细胞、在肿瘤组织中积聚以及延长缀合物的血浆循环。
在一些实施方案中，提供了包含上述前体药物缀合物和药学上可接受的载体的组合物。在进一步的实施方案中，所述组合物配制用于静脉给药。
在具体的实施方案中，提供了在个体的肿瘤细胞中增强细胞凋亡的方法，其包括在肿瘤细胞中诱导细胞凋亡，从而诱导半胱天冬酶的表达，并且对所述个体投予本文所述的前体药物缀合物。
在具体的实施方案中，提供了治疗有需要的个体的癌症的方法，包括用有效诱导半胱天冬酶的表达的细胞凋亡诱导治疗来处理所述个体，并对个体投予根据前述任一权利要求的缀合物。在一些实施方案中，在投予所述缀合物之前诱导细胞凋亡。在一些实施方案中，也可以在投予所述缀合物之后诱导细胞凋亡。
在具体的实施方案中，提供了在个体的肿瘤细胞中增强细胞凋亡的方法，包括：对有需要的个体投予本文所述的缀合物，所述有需要的个体已经过有效诱导半胱天冬酶的表达的第一次细胞凋亡诱导治疗处理。在一些实施方案中，所述方法进一步包括用有效诱导半胱天冬酶的表达的第二次细胞凋亡诱导治疗对个体进行处理。
在第一次和第二次细胞凋亡诱导治疗的任意实施方案中，第二次细胞凋亡诱导治疗可以与第一次细胞凋亡诱导治疗相同或不同。
在某些实施方案中，所述细胞凋亡通过选自下组的处理来诱导：辐射、热疗、激光疗法、光能疗法、化学疗法以及冷冻疗法。在进一步的实施方案中，所述细胞凋亡通过使用靶向肿瘤细胞的试剂的靶向治疗处理来诱导。在其他实施方案中，所述细胞凋亡通过选自下组的化疗剂处理来诱导：蒽环霉素、抗生素、烷化剂、铂基试剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂以及有丝分裂抑制剂。
在具体的实施方案中，所述细胞凋亡通过放射治疗诱导。在进一步的实施方案中，所述放射治疗选自下组：γ-刀放射、射波刀放射以及高强度聚焦超声放射。在一些实施方案中，以多达约70Gy的剂量应用辐射。在一些实施方案中，按多达约35Gy的单剂量或以多达约10Gy的周剂量应用辐射。
在某些实施方案中，所述缀合物通过静脉给药。
上述发明内容仅用于说明，并不旨在作为任何方式的限制。除了上文所述的说明性的方面、实施方案和特征以外，其他方面、实施方案和特征将通过参考本文下面的详细描述和实施例来清楚显现。
除非另有限定，本文使用的技术术语和科学术语具有本发明所述领域的普通技术人员常规理解的含义。本文参考了本领域普通技术人员已知的各种方法。阐述所参考的这些已知的方法的出版物和其他材料通过全文引用的方式并入本文。本领域普通技术人员已知的任何合适的材料和/或方法可以用于实施本发明。然而，具体的材料和方法仅以说明的目的而描述。除非另有说明，以下描述和实施例中所提及的材料、试剂等可获自商业来源。
如本文所用，单数形式，在一些实施方案中，提供了一种前体药物缀合物，其包括：(i)功能部分，(ii)半胱天冬酶-可裂解肽接头，以及(iii)化疗剂，其中所述功能部分显示选自下组的一个或多个功能：在靶细胞处定位、结合靶细胞、在肿瘤组织中积聚以及延长缀合物的血浆循环。在一些实施方案中，提供了使用本文所述的缀合物诱导细胞凋亡的方法和/或增强细胞凋亡的方法。在一些实施方案中，提供了使用本文所述的缀合物来治疗癌症的方法。
在具体的实施方案中，提供了一种化疗前体药物缀合物，其包括：(i)功能部分，直接或通过接头连接至(ii)半胱天冬酶-可裂解肽接头，直接或通过接头连接至(iii)化疗剂，其中所述功能部分显示选自下组的一个或多个功能：在靶细胞中定位、结合靶细胞、在肿瘤组织中积聚以及延长缀合物的血浆循环。
在某些实施方案中，所述功能部分选自下组：马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺酯、卤代乙酰胺、卤代乙酸酯、氮丙啶、二硫化物、乙炔、吡啶基疏基、乙烯基羰基、白蛋白、转铁蛋白、聚乙二醇以及透明质酸。在其他实施方案中，所述功能部分选自下组：与肿瘤细胞或肿瘤内皮细胞选择性结合的抗体、蛋白质、适体、寡核苷酸以及糖类。在其他实施方案中，所述功能部分选自下组：RGD、环状RGD、叶酸以及包含氨基酸序列Cys-Gln-Arg-Pro-Pro-Arg(SEQ ID NO:9)的肽。在具体的实施方案中，所述功能部分为马来酰亚胺。
在某些实施方案中，所述半胱天冬酶-可裂解肽接头通过选自下组的半胱天冬酶可被裂解：半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-7以及半胱天冬酶-9。在某些实施方案中，所述半胱天冬酶-可裂解肽接头的四个C-末端氨基酸残基选自下组：Asp-Xaa-Xaa-Asp(SEQ ID NO:1)、Leu-Xaa-Xaa-Asp(SEQ ID NO:2)以及Val-Xaa-Xaa-Asp(SEQ ID NO:3)，其中Xaa表示任何氨基酸残基。在其他实施方案中，所述半胱天冬酶-可裂解肽接头的四个C-末端氨基酸残基选自下组：Asp-Glu-Val-Asp(SEQ ID NO:4)、Asp-Leu-Val-Asp(SEQ ID NO:5)、Asp-Glu-Ile-Asp(SEQ ID NO:6)以及Leu-Glu-His-Asp(SEQ ID NO:7)。在具体的实施方案中，所述半胱天冬酶-可裂解肽接头的六个C-末端氨基酸残基由Lys-Gly-Asp-Glu-Val-Asp(SEQ IDNO:8)组成。
在某些实施方案中，所述化疗剂诱导肿瘤细胞的细胞凋亡。在某些实施方案中，所述化疗剂选自下组：蒽环霉素、抗生素、烷化剂、铂基试剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂以及有丝分裂抑制剂。在一些实施方案中，所述化疗剂选自下组：阿霉素、道诺霉素、表阿霉素、伊达比星、戊柔比星，及其衍生物。在其他实施方案中，所述化疗剂选自下组：放线菌素-D、博莱霉素、丝裂霉素-C、卡里奇霉素，及其衍生物。在其他实施方案中，所述化疗剂选自下组：环磷酰胺、氮芥、尿嘧啶氮芥、左旋苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、苯达莫司汀、卡莫司汀、环己亚硝脲、链脲菌素、白消安、氮烯唑胺、替莫唑胺、噻替派、六甲蜜胺、倍癌霉素、顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、赛特铂、四硝酸三铂、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、卡培他滨、克拉屈滨、氯法拉滨、cystarbine、氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、培美曲塞、喷司他丁、硫鸟嘌呤、喜树碱、拓扑替康、伊立替康、依托泊苷、替尼泊苷、米托蒽醌、紫杉醇、多西他赛、伊沙匹隆、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、雌莫司汀、美登素、DM1(mertansine)、DM4、尾海兔素、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、单甲基澳瑞他汀E、单甲基澳瑞他汀F，及其衍生物。
在具体的实施方案中，所述功能部分为马来酰亚胺，所述半胱天冬酶-可裂解肽接头具有由Lys-Gly-Asp-Glu-Val-Asp(SEQ ID NO:8)组成的氨基酸序列，且所述化疗剂为阿霉素。
在某些实施方案中，所述缀合物选自下组：马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素、马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-道诺霉素、马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-紫杉醇、马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-MMAE、马来酰亚胺-DEVD-PABC-阿霉素、马来酰亚胺-DEID-PABC-阿霉素、马来酰亚胺-DLVD-PABC-阿霉素、马来酰亚胺-DEVD-阿霉素、吡啶二巯基-KGDEVD-PABC-阿霉素、油酸盐-KGDEVD-PABC-阿霉素、聚乙二醇-KGDEVD-PABC-阿霉素、透明质酸-KGDEVD-PABC-阿霉素、叶酸盐-KGDEVD-PABC-阿霉素、RGDEVD-PABC-阿霉素、CQRPPRDEVD-PABC-阿霉素、RGDEVD-MBA-阿霉素、DEVD-道诺霉素-RGDSC以及HSA-马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素。
在具体的实施方案中，提供了一种化疗前体药物缀合物，其包括：(i)半胱天冬酶-可裂解肽接头，直接或通过接头连接至(ii)道诺霉素，在其14-CH3直接或通过接头连接至(iii)功能部分，其中所述功能部分显示选自下组的一个或多个功能：在靶细胞处定位、结合靶细胞、在肿瘤组织中积聚以及延长缀合物的血浆循环。
在一些实施方案中，提供了包含上述前体药物缀合物和药学上可接受的载体的组合物。在进一步的实施方案中，所述组合物配制用于静脉给药。
在具体的实施方案中，提供了在个体的肿瘤细胞中增强细胞凋亡的方法，包括在肿瘤细胞中诱导细胞凋亡，从而诱导半胱天冬酶的表达，并且对所述个体投予本文所述的前体药物缀合物。
在具体的实施方案中，提供了治疗有需要的个体的癌症的方法，包括用有效诱导半胱天冬酶的表达的细胞凋亡诱导治疗来处理所述个体，并对个体投予根据前述任一权利要求的缀合物。在一些实施方案中，在投予所述缀合物之前诱导细胞凋亡。在一些实施方案中，也可以在投予所述缀合物之后诱导细胞凋亡。
在具体的实施方案中，提供了在个体的肿瘤细胞中增强细胞凋亡的方法，包括：对有需要的个体投予本文所述的缀合物，所述有需要的个体已经进行过有效诱导半胱天冬酶的表达的第一次细胞凋亡诱导治疗。在一些实施方案中，所述方法进一步包括用有效诱导半胱天冬酶的表达的第二次细胞凋亡诱导治疗对个体进行处理。
在第一次和第二次细胞凋亡诱导治疗的任意实施方案中，第二次细胞凋亡诱导治疗可以与第一次细胞凋亡诱导治疗相同或不同。
在某些实施方案中，所述细胞凋亡通过选自下组的处理来诱导：辐射、热疗、激光疗法、光能疗法、化学疗法以及冷冻疗法。在进一步的实施方案中，所述细胞凋亡通过使用靶向肿瘤细胞的试剂的靶向治疗处理来诱导。在其他实施方案中，所述细胞凋亡通过选自下组的化疗剂处理来诱导：蒽环霉素、抗生素、烷化剂、铂基试剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂以及有丝分裂抑制剂。
在具体的实施方案中，所述细胞凋亡通过放射治疗诱导。在进一步的实施方案中，所述放射治疗选自下组：γ-刀放射、射波刀放射以及高强度聚焦超声放射。在一些实施方案中，以多达约70Gy的剂量应用辐射。在一些实施方案中，按多达约35Gy的单剂量或以多达约10Gy的周剂量应用辐射。
在某些实施方案中，所述缀合物通过静脉给药。
上述内容仅用于说明，并不旨在作为任何方式的限制。除了上文所述的说明性的方面、实施方案和特征以外，其他方面、实施方案和特征将通过参考本文下面的详细描述和实施例来清楚显现。
除非特别声明仅指定为单数，“一种”、“一个”和“该”指定为单数和复数二者。
术语“约”表示该数值应被理解为不限于此处陈述的确切的数值，而是意指在不背离本发明的范围的情况下，大体上在该数值附近的范围。如本文所用，“约”应为本领域普通技术人员所理解，并可以在使用其的上下文中以某种程度变化。若对本领域普通技术人员而言不清楚的术语在使用其的上下文给出时，“约”将表示直至该特定数值的正负10％。
如本文所用，术语“肿瘤细胞”是指任何类型的肿瘤组织的细胞，其是良性的或恶性的。
如本文所用，术语“癌症”是指来源于体内任何部位或任何细胞类型的癌症。这包括，但不仅限于，恶性上皮肿瘤、肉瘤、淋巴瘤、生殖细胞肿瘤和胚细胞瘤。在一些实施方案中，癌症与身体中的特定位置或特定疾病相关。
如本文所用，术语“个体”是指需要本文所述的任何一种或多种方法来治疗的任何动物，包括人类和其他哺乳动物，例如犬、猫、兔、马和牛。例如，所述个体可能罹患或有风险发展可用细胞凋亡诱导治疗来治疗或预防的病症。在具体实施方案中，所述个体为带有肿瘤的人。在进一步的具体实施方案中，所述肿瘤是恶性的。在进一步的具体实施方案中，所述个体为诊断有癌症的人。
前体药物缀合物
本文描述了一种前体药物缀合物，其包括：(i)功能部分，(ii)半胱天冬酶-可裂解肽接头，以及(iii)化疗剂，其中所述功能部分显示选自下组的一个或多个功能：在靶细胞处定位、结合靶细胞、在肿瘤组织中积聚以及延长缀合物的血浆循环。如下面更详细讨论的，所述缀合物可用于例如诱导细胞凋亡的方法、增强细胞凋亡的方法以及治疗癌症的方法中。
功能部分
如上文记载，本文所述的前体药物缀合物包括功能部分。如本文所用，术语“功能部分”是指显示选自下组的一个或多个功能的任何部分：在靶细胞处定位、结合靶细胞、在肿瘤组织中积聚，以及延长缀合物的血浆循环。在与寻靶有关的一些实施方案中，功能部分与靶细胞表达的或靠近靶细胞的分子选择性地结合。在与延长血浆循环有关的一些实施方案中，功能部分与循环血浆蛋白结合。在任意实施方案中，功能部分可以包括一个或多个化学官能团、肽部分、抗体部分(包括抗体片段和单链抗体部分)、适体、寡核苷酸或糖类。在一些实施方案中，功能部分可以是聚合物。
在一些实施方案中，功能部分通过高通透性和滞留(EPR)效应使缀合物主动靶向至肿瘤组织。
在具体的实施方案中，功能部分选自以下的一种或多种：蛋白，如白蛋白和转铁蛋白；聚合物，如聚乙二醇、透明质酸；与白蛋白结合的官能团，如马来酰亚胺基团、卤代乙酰胺、卤代乙酸酯、吡啶基疏基、乙烯基羰基、氮丙啶、二硫化物、乙炔以及N-羟基琥珀酰亚胺酯。在其他实施方案中，功能部分选自以下的一种或多种：Arg-Gly-Asp(“RGD”)肽、环状RGD、含有一个或多个RGD序列的肽以及叶酸。在具体的实施方案中，功能部分为马来酰亚胺。
在一些实施方案中，功能部分对内生的物质如靶组织或靶细胞(例如肿瘤组织或肿瘤细胞)中选择性找到的蛋白质具有强亲和性。根据这些实施方案，功能部分可以选自以下的一种或多种：RGD(与整合素αvβ3选择性结合)或含有RGD序列的肽、肽序列Cys-Gln-Arg-Pro-Pro-Arg(SEQ ID NO:9)(与从经历细胞凋亡的肿瘤细胞的核中释放的组蛋白H1选择性结合)、包含SEQ ID NO:9或显示类似功能的类似序列的肽，以及叶酸(与叶酸受体结合)。
半胱天冬酶可裂解肽接头
如上文记载，本文所述的前体药物缀合物包括半胱天冬酶可裂解肽接头。
如本文所用，术语“半胱天冬酶”是指被经历过细胞凋亡的细胞激活(例如表达)的半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶和半胱氨酸依赖型天冬氨酸定向蛋白酶(cysteine-dependentaspartate-directed proteases)。在具体的实施方案中，半胱天冬酶为半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-7和/或半胱天冬酶-9。
如本文所用，术语“氨基酸”是指任何氨基酸，包括天然产生的氨基酸和非天然产生的氨基酸，包括合成制备的天然产生的氨基酸。天然氨基酸，除甘氨酸外，包含手性碳原子。因此，氨基酸可以是L或D型异构体的形式。氨基酸的具体示例包括：β-丙氨酸(BALA)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-氨基戊酸、甘氨酸(Gly或G)、苯基甘氨酸、精氨酸(Arg或R)、高精氨酸(Har或hR)、丙氨酸(Ala或A)、缬氨酸(Val或V)、戊氨酸、亮氨酸(Leu或L)、正亮氨酸(Nle)、异亮氨酸(Ile或I)、丝氨酸(Ser或S)、异丝氨酸、高丝氨酸(Hse)、苏氨酸(Thr或T)、别苏氨酸、蛋氨酸(Met或M)、乙硫氨基酪酸、谷氨基酸(Glu或E)、天冬氨酸(Asp或D)、天冬酰胺(Asn或N)、半胱氨酸(Cys或C)、胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸(Tyr或Y)、色氨酸(Trp或W)、赖氨酸(Lys或K)、羟赖氨酸(Hyl)、组氨酸(His或H)、鸟氨酸(Orn)、谷氨酰胺(Gln或Q)、瓜氨酸、脯氨酸(Pro或P)以及4-羟脯氨酸(Hyp或O)。
如本文所用，术语“肽”是指肽和肽类似物，其中肽类似物可以包括天然产生的氨基酸和非天然产生的氨基酸、诸如糖基化的修饰、修饰的R基团和/或修饰的肽骨架。在一些实施方案中，肽仅包括其手性氨基酸的L型异构体。在其他实施方案中，肽仅包括其手性氨基酸的D型异构体。在其他实施方案中，肽包括其手性氨基酸的一种或多种的L型异构体和D型异构体二者。术语“肽”还包括这样的肽或肽类似物，其包括与天然产生的氨基酸以相似方式其作用的氨基酸模拟物。在具体的实施方案中，肽类似物在肽序列中包括至少一个与酰胺键不同的键，如尿烷、脲、酯或硫酯键。如本文所用的肽或肽类似物可以是线型的、环型的或分枝型的，但通常是线型的。
如本文所用，术语“半胱天冬酶可裂解肽接头”是指能够被半胱天冬酶裂解的两个或更多个氨基酸残基的肽序列。在一些实施方案中，半胱天冬酶可裂解肽接头可通过半胱天冬酶-3或半胱天冬酶-7裂解，诸如包含序列Asp-Xaa-Xaa-Asp(SEQ ID NO:1)(其中“Xaa”代表L-或D-异构形式的任何氨基酸)的肽。在一些实施方案中，半胱天冬酶可裂解肽接头可通过半胱天冬酶-9裂解，诸如包含氨基酸序列Leu-Xaa-Xaa-Asp(SEQ ID NO:2)或Val-Xaa-Xaa-Asp(SEQ ID NO:3)(其中“Xaa”代表L-或D-异构形式的任何氨基酸)的肽。
在具体的实施方案中，半胱天冬酶可裂解肽接头包含以下序列中的一个：
Asp-Glu-Val-Asp(SEQ ID NO:4)
Asp-Leu-Val-Asp(SEQ ID NO:5)
Asp-Glu-Ile-Asp(SEQ ID NO:6)，或
Leu-Glu-His-Asp(SEQ ID NO:7)。
在具体的实施方案中，半胱天冬酶可裂解肽接头包含序列Lys-Gly-Asp-Glu-Val-Asp(SEQ ID NO:8)，也用KGDEVD来表示。
在某些实施方案中，半胱天冬酶可裂解接头的存在使前体药物缀合物直至该接头被裂解时才激活。根据这些实施方案，前体药物缀合物对健康细胞造成最小的损害，这是因为它仅在存在半胱天冬酶(例如存在经历细胞凋亡的细胞，如经历细胞凋亡的肿瘤细胞)的情况下被激活。因此，在某些实施方案中，本文所述的前体药物缀合物显示了最小的副作用。
化疗剂
如上文记载，本文所述的前体药物缀合物包括化疗剂。
如本文所用，术语“化疗剂”是指对治疗癌症有用的部分，如用于治疗癌症的小分子化合物。在具体的实施方案中，化疗剂在靶细胞例如肿瘤细胞中和在肿瘤组织中诱导细胞凋亡。本领域中已知的任何化疗剂均可以被用作本文所述的缀合物中的化疗剂。
在一些实施方案中，化疗剂为蒽环霉素，如阿霉素、道诺霉素、表柔比星、伊达比星、戊柔比星，或其衍生物；抗生素，如放线菌素-D、博来霉素、丝裂霉素-C、卡里奇霉素，或其衍生物；烷化剂，如环磷酰胺、氮芥、尿嘧啶氮芥、左旋苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、苯达莫司汀、卡莫司汀、环己亚硝脲、链脲菌素、白消安、氮烯唑胺、替莫唑胺、噻替派、六甲蜜胺、倍癌霉素，或其衍生物；铂基试剂，如顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、赛特铂、四硝酸三铂，或其衍生物；抗代谢物，如5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、卡培他滨、克拉屈滨、氯法拉滨、cystarbine、氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、培美曲塞、喷司他丁、硫鸟嘌呤，或其衍生物；拓扑异构酶抑制剂，如喜树碱、拓扑替康、伊立替康、依托泊苷、替尼泊苷、米托蒽醌，或其衍生物；有丝分裂抑制剂，如紫杉醇、多西他赛、伊沙匹隆、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、雌莫司汀、美登素、DM1(mertansine)、DM4、尾海兔素、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F，或其衍生物。在具体的实施方案中，化疗剂是阿霉素或道诺霉素。
连接与接头缀合物
在本文所述的前体药物缀合物的一些实施方案中，功能部分可以直接或通过接头连接至半胱天冬酶-可裂解肽接头，半胱天冬酶-可裂解肽接头可以直接或通过接头连接至化疗剂。因此，在某些实施方案中，功能部分诸如通过功能部分上的部分与肽接头的N-末端或肽接头的侧链上的N-末端的部分之间的共价键而直接缀合至半胱天冬酶-可裂解肽接头。独立地，在一些实施方案中，半胱天冬酶-可裂解肽接头诸如通过肽接头的C-末端或肽接头的侧链上的C-末端的部分与化疗剂上的部分之间的共价键而直接缀合至化疗剂。
或者，连接中一个或两个可以通过接头进行。适用于药物化合物的任何接头均可被用于此目的。合适的接头在实施例中进行说明，包括PABC。
尽管上面的描述假定功能部分与半胱天冬酶-可裂解肽接头的N-末端连接，而化疗剂与半胱天冬酶-可裂解肽接头的C-末端连接，但也可以预期的是下述前体药物缀合物，其中化疗剂与半胱天冬酶-可裂解肽接头的N-末端连接，而功能部分与半胱天冬酶-可裂解肽接头的C-末端连接。
在其他实施方案中，本文所述的前体药物缀合物包括直接或通过接头与化疗剂连接的半胱天冬酶-可裂解肽，化疗剂直接或通过接头与功能部分连接。例如，道诺霉素当在它的14-CH3位置与如线型或环型RGD或叶酸盐的功能部分缀合时显示出其化疗效果。因此，为了提供化疗效果，半胱天冬酶诱导的裂解不需要释放游离的道诺霉素。因此，在一些实施方案中，前体药物缀合物包括直接或通过接头与道诺霉素连接的半胱天冬酶-可裂解肽，道诺霉素在它的14-CH3位置直接或通过接头与如线型或环型RGD或叶酸盐的功能部分连接。这些实施方案中的一个实例在下面的实施例16中予以说明。
前体药物缀合物的具体实例如下文的实施例和附图中所示，包括：马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素、马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-道诺霉素、马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-紫杉醇、马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-MMAE、马来酰亚胺-DEVD-PABC-阿霉素、马来酰亚胺-DEID-PABC-阿霉素、马来酰亚胺-DLVD-PABC-阿霉素、马来酰亚胺-DEVD-阿霉素、马来酰亚胺-DEVD-MMAE、吡啶二巯基-KGDEVD-PABC-阿霉素、油酸盐-KGDEVD-PABC-阿霉素、聚乙二醇-KGDEVD-PABC-阿霉素、透明质酸-KGDEVD-PABC-阿霉素、叶酸盐-KGDEVD-PABC-阿霉素、RGDEVD-PABC-阿霉素、CQRPPRDEVD-PABC-阿霉素、RGDEVD-MBA-阿霉素、DEVD-道诺霉素-RGDSC以及HSA-马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素。
在一些实施方案中，前体药物缀合物在药物组合物中被提供，如包含前体药物缀合物和药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂的组合物。合适的载体、赋形剂和稀释剂的实例包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、金合欢胶、藻朊酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物质等。
药物组合物可以制备用于任何给药途径，包括任何肠胃外或局部给药途径。在一些实施方案中，药物组合物适用于注射或输注，如静脉注射或输注，诸如制成用于注射或输注的无菌组合物。在其他实施方案中，药物组合物适用于口服给药，诸如制成粉末、颗粒、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂或糖浆形式。在其他实施方案中，药物组合物适用于吸入给药，诸如以鼻或口腔喷雾或喷罐的形式。在其他实施方案中，药物组合物适用于直肠或阴道给药，诸如以栓剂制剂。在其他实施方案中，药物组合物适用于局部或经皮给药，诸如制成溶液剂、乳剂、凝胶剂或贴剂。用于这些组合物的合适的组分和赋形剂是本领域中已知的。
用于口服给药的固体制剂的实例包括片剂、药丸、粉末、颗粒、胶囊剂或类似物。固体制剂可以通过将缀合物与至少一种赋形剂混合来制备，赋形剂例如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖、明胶或类似物。除了简单的赋形剂，例如硬脂酸镁或滑石的润滑剂可以用于协助制锭或其他加工。
用于口服给药的液体制剂的实例包括溶液剂、混悬剂、乳剂和糖浆剂。液体制剂除了水和可选的液体石蜡，还可以包括各种赋形剂，例如，润湿剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂或类似物。
肠胃外给药的其他制剂的实例包括无菌的水溶液、水难溶性溶液、混悬剂、乳剂、冻干制剂和栓剂。非水溶液和混悬剂可以包括，例如，丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、可注射酯如油酸乙酯。用于栓剂制剂的基质可以包括，例如，witepsol、聚乙二醇(macrogol)、吐温61、可可脂、甘油三月桂酸酯(laurin butter)、甘油胶冻或类似物。
在具体的实施方案中，缀合物在水中或在另一药学上可接受的水性载体中溶解，在该水性载体中缀合物显示良好的溶解性，任选地可以加入或不加其他药学上可接受的赋形剂、防腐剂和类似物。
使用前体药物缀合物的方法
如上文记载，本文所述的前体药物缀合物在诱导细胞凋亡的方法、增强细胞凋亡的方法以及治疗癌症的方法中起作用。在一些实施方案中，前体药物缀合物被投予给需要诱导靶细胞(例如肿瘤细胞)的细胞凋亡、增强靶细胞的细胞凋亡、和/或需要癌症治疗的个体。
在一些实施方案中，个体经过诱导靶细胞中的细胞凋亡的治疗，从而诱导半胱天冬酶表达，该治疗先于缀合物的给药或与其同时进行。根据这些实施方案，细胞凋亡可以通过任何治疗上可接受的方式来诱导，例如选自下组的处理：放射治疗、热疗、激光疗法、光能疗法、化学疗法以及冷冻疗法，或靶向治疗，如靶向肿瘤细胞的小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)或单克隆抗体。化疗剂可以是本领域中公知的任何化疗剂，包括上文公开的那些，并且可以与前体药物缀合物的化疗剂相同或不同。在具体实施方案中，包括肿瘤或癌症已经转移和/或不可识别，细胞凋亡诱导治疗可以包括靶向治疗，如靶向肿瘤细胞的TKI、抗体、适体或靶向的纳米颗粒。
在具体实施方案中，细胞凋亡通过放射治疗诱导。如本文所用，术语“放射治疗”是指放射治疗的所有方法，包括体外放射治疗、密封源放射治疗以及全身放射性同位素治疗。在一些实施方案中，辐射局部地集中在靶位点，如肿瘤位点。在一些实施方案中，放射治疗先于前体药物缀合物的给药进行。在使用放射治疗的任意实施方案中，所述辐射治疗可以包括：γ-刀放射、射波刀放射和/或高强度聚焦超声放射。
在一些实施方案中，放射治疗涉及低剂量的辐射处理。在具体实施方案中，成人个体以至多约70Gy的剂量进行辐射处理。在其他实施方案中，成人个体以单剂量为至多约35Gy的辐射进行处理。在其他实施方案中，成人个体以周剂量为至多约10Gy的辐射进行处理。
如上文记载，前体药物缀合物可以通过任何给药途径来给药。在具体实施方案中，前体药物缀合物通过静脉给药。前体药物缀合物的给药量将根据施药的个体和病症而变化，并可以由本领域的技术人员确定。在一些实施方案中，个体的给药量可以在约1mg/kg至约100mg/kg之间，包括从约5mg/kg至约75mg/kg之间，如从约10mg/kg至约50mg/kg之间，或更大。在具体实施方案中，前体药物缀合物相比单独的化疗剂显示更低的毒性，使得给药量可能比对于单独的化疗剂可能无毒的给药量高。
在一些实施方案中，前体药物缀合物局部施用至靶区域，如通过局部注射进肿瘤位点。在某些实施方案中，如前所述，该靶区域已经经过细胞凋亡诱导治疗处理。
在一些实施方案中，在缀合物给药之后，个体进行进一步细胞凋亡诱导治疗处理。在这些实施方案中，后来的细胞凋亡诱导治疗可以与先前的细胞凋亡诱导治疗一致或相同。可选地，后来的细胞凋亡诱导治疗可以与先前的细胞凋亡诱导不同。可能的不同之处包括，但不仅限于：治疗类型(例如辐射治疗、热疗、激光疗法、光能疗法、化学疗法、冷冻疗法或靶向治疗)，用于靶向治疗的化疗剂或分子；使用的辐射治疗，和/或治疗的剂量或持续时间，以及细胞凋亡诱导治疗的任何其他变量。
在具体的实施方案中，本文所述的方法通过以下过程来增强细胞凋亡：通过如上文公开的细胞凋亡诱导治疗来诱导细胞凋亡，导致半胱天冬酶的表达。施用前体药物缀合物，并且半胱天冬酶-可裂解肽接头通过半胱天冬酶裂解，释放化疗剂。化疗剂诱导另外的细胞的细胞凋亡，导致附加的半胱天冬酶表达，使得半胱天冬酶诱导的另外的前体药物缀合物裂解/激活，使得细胞凋亡增强。这种增强产生了对杀死靶细胞如肿瘤靶细胞具有高效率和高特异性的方法。此外，该增强效果能够延长细胞凋亡诱导治疗之间和/或前体药物缀合物剂量的给药之间的时间间隔。因此，在一些实施方案中，该增强效果可以减少治疗特定数量的癌细胞所需的化疗剂的量。
如上文记载，前体药物缀合物在半胱天冬酶-可裂解肽接头裂解之前是未激活的。因此，前体药物缀合物对健康细胞没有毒性(或无细胞凋亡)。在具体的实施方案中，本文所述的方法与非缀合形式的同样的化疗剂的给药相比，对正常细胞的损害减少约10％,20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％或更多。
此外，前体药物缀合物的细胞凋亡效果对表达半胱天冬酶的细胞如经历过细胞凋亡的细胞是选择性。因此，一旦细胞凋亡在靶细胞区域(如靶组织中)被诱导，则本文所述的方法选择性地并有效地诱导其它靶细胞的细胞凋亡，由此例如治疗癌症。
实施例
实施例1-制备前体药物马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素
马来酰亚胺是与内源性白蛋白结合的官能团，并延长本文所述的前体药物缀合物的血浆循环。肽接头KGDEVD通过半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-7或半胱天冬酶-9特异性地裂解。
在本实施例中，ε-马来酰亚胺基己酰酯(ε-maleimidocaproylate)和阿霉素分别与Lys侧链的氨基和AcKGDEVD肽的C-末端结合，阿霉素通过间隔基分子对氨基苄基氨基甲酸酯(PABC)缀合，产生前体药物缀合物马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素(见图1)。静脉给药之后，前体药物与循环的内源性白蛋白共价结合并在肿瘤组织中积聚。当给予放射治疗，肿瘤细胞表达半胱天冬酶-3和/或半胱天冬酶-7，它们裂解KGDEVD接头并释放阿霉素。
马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素可以根据图2中所示的过程来合成，描述如下：
将Ac-Lys(OAloc)-Gly-Asp(OAll)-Glu(OAll)-Val-Asp(OAll)-OH(344mg,0.38mmol)、4-氨基苯甲醇(2eq)和EEDQ(2eq)溶于无水DMF(11ml)，反应混合物在室温下惰性气氛中搅拌24小时。溶液在减压下浓缩，并加入10体积乙醚。通过过滤收集沉淀物并在真空下干燥，得到Ac-Lys(OAloc)-Gly-Asp(OAll)-Glu(OAll)-Val-Asp(OAll)-PABOH(322mg,84％)。ESI-MS(m/z):1035.7[M+Na]+。
将Ac-Lys(OAloc)-Gly-Asp(OAll)-Glu(OAll)-Val-Asp(OAll)-PABOH(322mg,0.318mmol)和4-硝基苯基氯甲酸酯(1.2eq)在惰性气氛中溶于无水CH2Cl2(10ml)。然后将2,6-二甲基砒啶(3eq)加入反应混合物中并在室温下搅拌2小时。将无水DMF(2ml)和另外的2,6-二甲基砒啶(2eq)加入到反应混合物中。在24、27和46小时之后，将2,6-二甲基砒啶(4.75eq)和4-硝基苯基氯甲酸酯(1eq)分别加入反应混合物中。在84小时之后，NaHCO3水溶液加入反应混合物中并用乙酸乙酯(100ml x3)萃取。有机层依次用0.5M柠檬酸、NaHCO3水溶液和盐水洗涤。所得有机层通过加入无水NaSO4干燥、过滤并在真空中浓缩。浓缩物通过半制备型HPLC使用C18反相柱(250mm×22mm)在梯度系统(以0.1％TFA作为添加剂的水和CH3CN，CH3CN 20-53％，超过30min，10ml/min)中进一步纯化，获得Ac-Lys(OAloc)-Gly-Asp(OAll)-Glu(OAll)-Val-Asp(OAll)-PABC(77mg,20.5％)。ESI-MS(m/z):1200.54[M+Na]+。
将Ac-Lys(OAloc)-Gly-Asp(OAll)-Glu(OAll)-Val-Asp(OAll)-PABC(77mg,0.065mmol)和阿霉素HCl(1.2eq)溶于无水DMF(8ml)。将DIEA(5.4eq)加入反应混合物并在室温下惰性气氛中搅拌16小时。溶液在真空下浓缩并通过半制备型HPLC使用C18反相柱(250mm×22mm)在梯度系统(以0.1％TFA作为添加剂的水和CH3CN，CH3CN20-100％超过50min,10ml/min)中进一步纯化，获得Ac-Lys(OAloc)-Gly-Asp(OAll)-Glu(OAll)-Val-Asp(OAll)-PABC-阿霉素(红色无定形固体,50mg,50％)。ESI-MS(m/z):1605.06[M+Na]+。
将Ac-Lys(OAloc)-Gly-Asp(OAll)-Glu(OAll)-Val-Asp(OAll)-PABC-阿霉素(50mg,0.032mmol)和Pd(PPh3)4(0.2eq)在惰性气体中溶于无水DMF(4ml)，并脱气超过5分钟。然后将三丁基氢化锡(17.3eq)和醋酸(20eq)加入反应混合物中，并在室温下搅拌1小时。产物通过半制备型HPLC使用C18反相柱(250mm×22mm)在梯度系统(以0.1％TFA作为添加剂的水和CH3CN，CH3CN 20-41％超过41min，10ml/min)中进一步纯化，获得去保护的Ac-Lys-Gly-Asp-Glu-Val-Asp-PABC-阿霉素(红色无定形固体，6mg,13.6％)。ESI-MS(m/z):1378.4[M+Na]+。
将Ac-Lys-Gly-Asp-Glu-Val-Asp-PABC-阿霉素(20mg,0.013mmol)和N-(ε-马来酰亚胺己酰基氧基)琥珀酰亚胺酯(EMCS；8.26mg,26.8μmol,2eq；Pierce,Rockford,IL)在惰性气体中溶于无水DMF(1.5ml；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。然后将Et3N(4.64μl,2.5eq；Sigma-Aldrich)加入到反应混合物中，并在室温下搅拌2小时。最终产物通过半制备型HPLC(Shimadzu,Kyoto,Japan)使用ODS-A 5μm反相半制备色谱柱(150mm×20mm)在梯度系统(以0.05％TFA作为添加剂的水和CH3CN，CH3CN 20-50％超过50min，8ml/min)中进一步纯化，获得Ac-Lys(EMC)-Gly-Asp-Glu-Val-Asp-PABC-阿霉素(红色无定形固体,16.7mg,73.6％)。在280nm处检测到峰。最终产物的纯度通过分析型HPLC(Agilent 1300系列,AgilentTechnologies,Santa Clara,CA)使用ODS-A 5μm分析柱(150mm×3mm；YMC)在梯度系统(以0.1％TFA作为添加剂的水和CH3CN，CH3CN 5-95％/5-30min，1ml/min)中确定。通过UV检测器(214nm)和荧光检测器(激发波长470nm，发射波长580nm)检测到峰。最终产物的纯度确定为≥95％。ESI-MS(m/z):1593.3[M+Na]+。
实施例2-制备前体药物马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-道诺霉素
本实施例的肽前体药物与实施例1相似，但具有道诺霉素作为化疗剂(见图3)。
实施例3-制备前体药物马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-紫杉醇
本实施例的肽前体药物与实施例1相似，但具有紫杉醇作为化疗剂(见图4)。
实施例4-制备前体药物马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-MMAE
本实施例的肽前体药物与实施例1相似，但具有MMAE(单甲基澳瑞他汀E)作为化疗剂(见图5)。
实施例5-制备前体药物马来酰亚胺-DEVD-PABC-阿霉素
本实施例的肽前体药物与实施例1相似，但具有DEVD作为半胱天冬酶-可裂解肽接头(见图6)。DEVD通过半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-7或半胱天冬酶-9裂解。
实施例6-制备前体药物马来酰亚胺-DEID-PABC-阿霉素
本实施例的肽前体药物与实施例4相似，但具有DEID作为半胱天冬酶-可裂解肽接头(见图7)。DEID通过半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-7或半胱天冬酶-9裂解。
实施例7-制备前体药物马来酰亚胺-DLVD-PABC-阿霉素
本实施例的肽前体药物与实施例4相似，但具有DLVD作为半胱天冬酶-可裂解肽接头(见图8)。DLVD通过半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-7或半胱天冬酶-9裂解。
实施例8-制备前体药物马来酰亚胺-DEVD-阿霉素(没有PABC)
本实施例的肽前体药物与实施例4相似，但不包含PABC间隔基。在本实施例中，肽接头与阿霉素的3’-NH2直接缀合，产生前体药物缀合物马来酰亚胺-DEVD-阿霉素(见图9)。
实施例9-制备前体药物马来酰亚胺-DEVD-MMAE(没有PABC)
本实施例的肽前体药物与实施例1相似，但具有MMAE(单甲基澳瑞他汀E)作为化疗剂(见图10)。
实施例10-制备前体药物：吡啶二巯基-KGDEVD-PABC-阿霉素
本实施例的肽前体药物与实施例1相似，但包括吡啶二巯基作为功能部分以及阿霉素作为化疗剂(见图11)。吡啶二巯基部分与内源性白蛋白结合，并延长前体药物缀合物的血浆循环。在本实施例中，3-(2-吡啶二巯基)丙酸盐和阿霉素分别与KGDEVD肽的N-末端和C-末端结合，所述KGDEVD肽被半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-7或半胱天冬酶-9裂解。与上述列举的其他前体药物缀合物一样，前体药物缀合物与循环的内源性白蛋白共价结合并在肿瘤位点积聚。当细胞凋亡被诱导并且半胱天冬酶-3和/或半胱天冬酶-7被表达时，半胱天冬酶可裂解肽接头被裂解，释放阿霉素。
实施例11-制备前体药物油酸盐-KGDEVD-PABC-阿霉素
本实施例的肽前体药物与实施例9相似，但包括油酸盐作为功能部分(见图12)。油酸盐部分与内源性白蛋白结合，并且延长前体药物缀合物的血浆循环。
实施例12-制备前体药物聚乙二醇-KGDEVD-PABC-阿霉素
本实施例的肽前体药物与实施例9相似，但包括聚乙二醇作为功能部分(见图13的代表性结构)。由于聚乙二醇部分，前体药物缀合物以很长的半衰期在血液中循环，并在肿瘤中积聚，直至如上所述地激活半胱天冬酶并释放阿霉素。
实施例13-制备前体药物透明质酸-KGDEVD-PABC-阿霉素
本实施例的肽前体药物与实施例8相似，但包括透明质酸作为功能部分(见图14的代表性结构)。如图14所示，数个阿霉素-肽单元可以与透明质酸的单个分子缀合。静脉给药之后，前体药物缀合物以很长的半衰期在血液中循环，并在肿瘤中积聚，直至如上所述地激活半胱天冬酶并释放阿霉素。
实施例14-制备前体药物叶酸盐-KGDEVD-PABC-阿霉素
本实施例的肽前体药物与实施例9相似，但包括叶酸盐作为功能部分(见图15)。叶酸盐与叶酸盐受体以高亲和力结合，因此起到将前体药物缀合物靶向至存在于肿瘤细胞上的叶酸盐受体的功能，这使叶酸盐受体过表达，因此导致前体药物缀合物在肿瘤位点的选择性积聚。当细胞凋亡被诱导，如上文所述阿霉素从前体药物缀合物中释放。
实施例15-制备前体药物RGDEVD-PABC-阿霉素
在本实施例中，功能部分和半胱天冬酶-可裂解肽接头共同包含在RGDEVD部分中，其中的RGD是整合素αvβ3和/或αvβ5导向序列，而DEVD是半胱天冬酶-可裂解肽序列(见图16和图17)。(RGD部分可以是线型或环型)。在静脉给药后，前体药物通过与在肿瘤内皮和肿瘤细胞上表达的整合素αvβ3和/或αvβ5结合，而选择性地在肿瘤中积聚。当细胞凋亡被诱导，如上文所述，阿霉素通过DEVD接头的裂解从前体药物缀合物中释放。
实施例16-制备前体药物CQRPPRDEVD-PABC-阿霉素
在本实施例中，功能部分和半胱天冬酶-可裂解肽接头共同包含在CQRPPRDEVD部分中，CQRPPRDEVD部分包括组蛋白H1导向肽序列以及半胱天冬酶-可裂解肽序列(见图18的代表性结构)。静脉给药后，由于凋亡细胞表达组蛋白H1，使前体药物导向细胞凋亡位点，其中也由凋亡细胞表达的半胱天冬酶将前体药物裂解并释放阿霉素。
实施例17-制备前体药物RGDEVD-MBA-阿霉素
本实施例的肽前体药物与实施例15相似(见图19)。特别地，RGDEVD肽与阿霉素的14-OH位置连接，产生AcRGDEVD-MBA-阿霉素。
AcRGDEVD-MBA-阿霉素可以合成如下：
根据Meyer-Losic et al.合成14-阿霉素基马来酰亚胺基丁酸酯(14-Doxorubicinyl maleimidobutyrate ester)以与制备好的肽缀合(Meyer-Losic,F.,etal.,J.Med.Chem.,2006,49,6908-16)。将道诺霉素盐酸盐(100mg,177.3μmol)在无水甲醇(3ml)和无水1,4-二氧己环(2.5ml)的混合液中溶解。在11℃加入原甲酸三甲酯(89.2μl,815.6μmol,4.6eq)，随后加入溴(15.7μl,306.8μmol,1.73eq)，并在氮气下反应2小时。在4℃加入氧化丙烯(31.9μl,455.7μmol,2.57eq)并反应75分钟。然后加入丙酮(8.6ml)和0.25M氢溴酸(3ml)的混合物，并在室温下反应48小时。当反应完成，溶液用蒸馏水(5ml)稀释并用氯仿(10ml×2)萃取。将饱和盐水(5ml)加入水层中，产物用正丁醇萃取直至水层为无色。收集到的正丁醇层在35℃真空中浓缩，并在10体积正己烷中沉淀以获得红色固体14-卤代道诺霉素(14-halodaunorubicin)。14-氯代道诺霉素：m/z(ESI-MS):562.0[M+H]+,14-溴代道诺霉素：605.9[M+H]+。
边搅拌边缓慢加入制备好的4-马来酰亚胺基丁酸和0.1M碳酸氢钠的悬浮液。将所得溶液搅拌20分钟并在30℃真空中浓缩。冻干浓缩液获得4-马来酰亚胺基丁酸钠。将4-马来酰亚胺基丁酸钠(263mg,1.28mmol)和14-卤代道诺霉素(138mg,237.2μmol)溶于丙酮中，并在氮气下回流4小时。冷却溶液并过滤。剩余的固体用丙酮洗涤，滤液在真空下蒸发。将红色残余物溶于0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液，并经过半制备型反相HPLC(Shimadzu,Kyoto,Japan)，使用ODS-A 5μm半制备型色谱柱(150mm×20mm；YMC,Dinslaken,Germany)，作进一步纯化，以获得高纯度14-阿霉素基马来酰亚胺基丁酸酯。使用梯度系统(0.05％TFA作为添加剂的水和乙腈)，流速为8mL/min。每一步反应都使用正相TLC(CH2Cl2:MeOH,8:2)监控。m/z(ESI-MS):709.0[M+H]+。
将14-阿霉素基马来酰亚胺基丁酸酯和AcRGDEVDC-NH2溶于无水DMF中，并在4℃反应过夜。溶液在二异丙醚中沉淀，沉淀物通过过滤收集。沉淀物用二异丙醚洗涤三次并在真空中干燥。将红色固体再溶于水，并经过上述的半制备型反相HPLC作进一步纯化。收集到的级分在减压下浓缩并冷冻干燥，得到呈红色粉末的最终产物。最终产物的纯度通过分析型HPLC(UV检测波长214nm)确认，并确定为≥95％。m/z(ESI-MS):1542.0[M+H]+。
实施例18-制备前体药物DEVD-道诺霉素-RGDSC
在该缀合物中，化疗剂与整合素αvβ3和/或αvβ5导向肽序列(RGD)和半胱天冬酶-可裂解肽缀合(见图20)。(RGD可以是线型或环型)。RGDSC和DEVD肽分别与道诺霉素的14-CH3和3’-NH2位置缀合。在静脉给药后，前体药物缀合物通过与在肿瘤内皮和肿瘤细胞上表达的整合素αvβ3和/或αvβ5结合，而选择性地在肿瘤中积聚，直至半胱天冬酶诱导的裂解，释放药物活性形式的阿霉素。
实施例19-HPLC监测的马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素在市售的人血清白蛋白上的结合研究。
在PBS中制备人血清白蛋白(HSA)溶液，最终浓度为700μM。向HSA溶液中，加入马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素至100μM终浓度，并在室温下培养。样品经分析型HPLC分析(见图21)。
马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素缀合物对HSA的结合在3分钟内完成，并且仅检测到痕量的未结合物质。然而，在用马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素培养前，当HSA用4-马来酰亚胺基丁酸(其是含有巯基结合的马来酰亚胺基团的小分子)预培养时，即使经过1小时培养后，也没有观察到马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素与HSA的结合，表明马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素的结合是由EMC部分的马来酰亚胺基团特异性介导的。
实施例20-HPLC监测的马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素在人血浆中的人血清白蛋白上的结合研究。
在人血浆样本中，加入马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素至终浓度100μM，并在室温下培养。样品经分析型HPLC分析(见图22)。
马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素与血清白蛋白的结合在3分钟内完成。然而，在用马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素培养前，当血浆用4-马来酰亚胺基丁酸(其是含有巯基结合的马来酰亚胺基团的小分子)预培养，即使经过1小时培养后，也没有观察到马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素与血清白蛋白结合的证据，表明马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素的结合是由EMC部分的马来酰亚胺基团特异性介导的。
实施例21-HPLC监测的人血清白蛋白结合的马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素(HSA-KGDEVD-PABC-阿霉素)通过重组人半胱天冬酶-3裂解的研究。
HSA-马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素用纯化的半胱天冬酶-3培养并经HPLC分析(见图23)。游离的阿霉素在1小时内从HSA-马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素缀合物中完全释放。
实施例22-在存在或不存在重组人半胱天冬酶-3的条件下，HSA-KGDEVD-PABC-阿霉素的浓度依赖型体外抗癌效果。
当用MTT试验评价时，HSA-马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素缀合物在SCC7和MDA-MB-231细胞中直到100μM均没有显示出任何明显的细胞毒性作用(见图24)。然而，当HSA-马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素在加入细胞之前用纯化的半胱天冬酶-3预培养时，显示了与(未缀合的)阿霉素对SCC7和MDA-MB-231的相似程度的细胞毒性。
实施例23-通过静脉注射被投予马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素或AcKGDEVD-PABC-阿霉素的斯普拉格-杜勒鼠中阿霉素的血浆浓度-时间曲线。
在给斯普拉格-杜勒鼠静脉施用剂量为1mg/kg摩尔当量的阿霉素之后，测定马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素缀合物和AcKGDEVD-PABC-阿霉素缀合物的药代动力学曲线(见图25)。在注射后5、15、30、60、90分钟，然后在注射后2、4、8、12、24、48、72、96、144小时采集血液样本(每次500μl)。采集到的血液样本立刻用柠檬酸钠稳定，并在冷冻离心机中以2000×g离心15分钟以分离血浆。将血浆样本(200μl)转移到96孔黑色微板，并在Ex 485nm/Em 590nm下读取阿霉素的固有荧光值。在新鲜血浆中制得标样并如上所述读取荧光值。AcKGDEVD-PABC-阿霉素显示终末半衰期为30分钟，并且血浆浓度在4小时内降低至低于检出限(5ng/ml)。另一方面，马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素显示出显著延长的超过19小时的终末半衰期，并且在给药后在血浆中持续超过6天。
实施例24-被投予马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素的荷瘤动物在经过或没有经过初期辐射暴露的情况下的肿瘤生长曲线。
在负载SCC7的C3H/HeN小鼠上评价马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素的肿瘤生长抑制(见图26)。每天静脉施用剂量为1mg/kg摩尔当量的阿霉素的马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素或者AcKGDEVD-PABC-阿霉素，施用七天并观察两周。对于辐射治疗组，在给药的第一天用单剂量4Gy的线性X射线处理肿瘤。通过与对照组相比相似的肿瘤生长所显示的，马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素本身显示出肿瘤抑制作用。当马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素与单剂量的辐射结合，观察到充分的抗癌效果。马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素比AcKGDEVD-PABC-阿霉素显示出更优越的肿瘤抑制作用。
实施例25-被投予不同剂量马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素或阿霉素并在初期给药时暴露于辐射的荷瘤动物的肿瘤生长曲线。
在负载SCC7的C3H/HeN小鼠上评价马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素的肿瘤生长抑制(见图27)。将马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素(1mg/kg、5mg/kg或10mg/kg摩尔当量阿霉素)或阿霉素(1mg/kg)每隔一天静脉给药，进行两周。在给药的第一天用单剂量4Gy的线性X射线处理肿瘤。马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素显示出剂量依赖的抗肿瘤作用，并且与施用相当剂量的游离阿霉素相比显示出优越的肿瘤抑制作用。
实施例26-通过静脉注射被投予马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素或AcKGDEVD-PABC-阿霉素的食蟹猴中阿霉素含量的血浆浓度-时间曲线。
在给食蟹猴静脉施用剂量为1mg/kg摩尔当量的阿霉素之后，测定马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素缀合物和AcKGDEVD-PABC-阿霉素缀合物的药代动力学曲线(见图28)。在注射后15、30、45、60、90分钟，然后在注射后2、3、4、6、8、12、24、48、72、96、120、144、168小时采集血液样本(每次500μl)。采集到的血液样本立刻用柠檬酸钠稳定，并在冷冻离心机中以2000×g离心15分钟以分离血浆。血浆样本(200μl)转移到96孔黑色微板，并在Ex 485nm/Em 590nm读取阿霉素的固有荧光值。在新鲜血浆中制得标样并如上所述读取荧光值。AcKGDEVD-PABC-阿霉素显示出终末半衰期为1小时，并且血浆浓度在6小时内降低至低于检出限(5ng/ml)。另一方面，马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素显示出显著延长的超过106小时的终末半衰期，并且血浆浓度在给药后超过7天能被检测到。

Claims (53)

1.一种化疗前体药物缀合物，其包括：
(i)功能部分，直接或通过接头连接至
(ii)半胱天冬酶-可裂解肽接头，直接或通过接头连接至
(iii)化疗剂，
其中所述功能部分显示选自下组的一个或多个功能：在靶细胞处定位、结合靶细胞、在肿瘤组织中积聚，以及延长缀合物的血浆循环。
2.如权利要求1所述的缀合物，其中所述功能部分选自下组：马来酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺酯、卤代乙酰胺、卤代乙酸酯、氮丙啶、二硫化物、乙炔、吡啶基疏基、乙烯基羰基、白蛋白、转铁蛋白、聚乙二醇以及透明质酸。
3.如权利要求1所述的缀合物，其中所述功能部分选自下组：与肿瘤细胞或肿瘤内皮细胞选择性结合的抗体、蛋白质、适体、寡核苷酸以及糖类。
4.如权利要求1所述的缀合物，其中所述功能部分选自下组：RGD、环状RGD、叶酸以及包含氨基酸序列Cys-Gln-Arg-Pro-Pro-Arg(SEQ ID NO:9)的肽。
5.如权利要求1所述的缀合物，其中所述功能部分为马来酰亚胺。
6.如权利要求1所述的缀合物，其中所述半胱天冬酶-可裂解肽接头通过选自下组的半胱天冬酶可被裂解：半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-7以及半胱天冬酶-9。
7.如权利要求6所述的缀合物，其中所述半胱天冬酶-可裂解肽接头的四个C-末端氨基酸残基选自下组：Asp-Xaa-Xaa-Asp(SEQ ID NO:1)、Leu-Xaa-Xaa-Asp(SEQ ID NO:2)以及Val-Xaa-Xaa-Asp(SEQ ID NO:3)，其中Xaa表示任何氨基酸残基。
8.如权利要求7所述的缀合物，其中所述半胱天冬酶-可裂解肽接头的四个C-末端氨基酸残基选自下组：Asp-Glu-Val-Asp(SEQ ID NO:4)、Asp-Leu-Val-Asp(SEQ ID NO:5)、Asp-Glu-Ile-Asp(SEQ ID NO:6)以及Leu-Glu-His-Asp(SEQ ID NO:7)。
9.如权利要求8所述的缀合物，其中所述半胱天冬酶-可裂解肽接头的六个C-末端氨基酸残基由Lys-Gly-Asp-Glu-Val-Asp(SEQ ID NO:8)组成。
10.如权利要求1所述的缀合物，其中所述化疗剂诱导肿瘤细胞的细胞凋亡。
11.如权利要求1所述的缀合物，其中所述化疗剂选自下组：蒽环霉素、抗生素、烷化剂、铂基试剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂以及有丝分裂抑制剂。
12.如权利要求1所述的缀合物，其中所述化疗剂选自下组：阿霉素、道诺霉素、表阿霉素、伊达比星、戊柔比星，及其衍生物。
13.如权利要求1所述的缀合物，其中所述化疗剂选自下组：放线菌素-D、博莱霉素、丝裂霉素-C、卡里奇霉素，及其衍生物。
14.如权利要求1所述的缀合物，其中所述化疗剂选自下组：环磷酰胺、氮芥、尿嘧啶氮芥、左旋苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、苯达莫司汀、卡莫司汀、环己亚硝脲、链脲菌素、白消安、氮烯唑胺、替莫唑胺、噻替派、六甲蜜胺、倍癌霉素、顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、赛特铂、四硝酸三铂、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、卡培他滨、克拉屈滨、氯法拉滨、cystarbine、氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、培美曲塞、喷司他丁、硫鸟嘌呤、喜树碱、拓扑替康、伊立替康、依托泊苷、替尼泊苷、米托蒽醌、紫杉醇、多西他赛、伊沙匹隆、长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、雌莫司汀、美登素、DM1(mertansine)、DM4、尾海兔素、澳瑞他汀E、澳瑞他汀F、单甲基澳瑞他汀E、单甲基澳瑞他汀F，及其衍生物。
15.如权利要求1所述的缀合物，其中所述功能部分为马来酰亚胺，所述半胱天冬酶-可裂解肽接头具有由Lys-Gly-Asp-Glu-Val-Asp(SEQ ID NO:8)组成的氨基酸序列，且所述化疗剂为阿霉素。
16.如权利要求1所述的缀合物，选自下组：马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素、马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-道诺霉素、马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-紫杉醇、马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-MMAE、马来酰亚胺-DEVD-PABC-阿霉素、马来酰亚胺-DEID-PABC-阿霉素、马来酰亚胺-DLVD-PABC-阿霉素、马来酰亚胺-DEVD-阿霉素、马来酰亚胺-DEVD-MMAE、吡啶二巯基-KGDEVD-PABC-阿霉素、油酸盐-KGDEVD-PABC-阿霉素、聚乙二醇-KGDEVD-PABC-阿霉素、透明质酸-KGDEVD-PABC-阿霉素、叶酸盐-KGDEVD-PABC-阿霉素、RGDEVD-PABC-阿霉素、CQRPPRDEVD-PABC-阿霉素、RGDEVD-MBA-阿霉素、DEVD-道诺霉素-RGDSC，以及HSA-马来酰亚胺-KGDEVD-PABC-阿霉素。
17.一种化疗前体药物缀合物，其包括：
(i)半胱天冬酶-可裂解肽，直接或通过接头连接至
(ii)道诺霉素，在其14-CH3直接或通过接头连接至
(iii)功能部分，
其中所述功能部分显示选自下组的一个或多个功能：在靶细胞处定位、结合靶细胞、在肿瘤组织中积聚，以及延长缀合物的血浆循环。
18.一种组合物，其包含权利要求1或17所述的缀合物和药学上可接受的载体。
19.如权利要求1或17所述的组合物，配制用于静脉给药。
20.在个体的肿瘤细胞中增强细胞凋亡的方法，其包括：
在肿瘤细胞中诱导细胞凋亡，从而诱导半胱天冬酶的表达；和
对所述个体投予如权利要求1或17所述的缀合物。
21.如权利要求20所述的方法，其中在所述缀合物给药之前诱导细胞凋亡，并且任选地，在所述缀合物给药之后诱导细胞凋亡。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述细胞凋亡通过选自下组的处理来诱导：辐射、热疗、激光疗法、光能疗法、化学疗法以及冷冻疗法。
23.如权利要求20所述的方法，其中所述细胞凋亡通过使用靶向肿瘤细胞的试剂的靶向治疗处理来诱导。
24.如权利要求20所述的方法，其中所述细胞凋亡通过选自下组的化疗剂处理来诱导：蒽环霉素、抗生素、烷化剂、铂基试剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂以及有丝分裂抑制剂。
25.如权利要求20所述的方法，其中所述细胞凋亡通过放射治疗诱导。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述放射治疗在所述缀合物给药之前进行。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述放射治疗选自下组：γ-刀放射、射波刀放射以及高强度聚焦超声放射。
28.如权利要求25所述的方法，其中所述辐射以多达约70Gy的剂量应用。
29.如权利要求25所述的方法，其中所述辐射按多达约35Gy的单剂量应用。
30.如权利要求25所述的方法，其中所述放射治疗以多达约10Gy的周剂量应用。
31.如权利要求20所述的方法，其中所述缀合物通过静脉给药。
32.在个体的肿瘤细胞中增强细胞凋亡的方法，其包括：对有需要的个体投予如前述任一项权利要求所述的缀合物，所述有需要的个体已经过有效诱导半胱天冬酶的表达的第一次细胞凋亡诱导治疗处理。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述细胞凋亡诱导治疗选自下组：辐射、热疗、激光疗法、光能疗法、化学疗法以及冷冻疗法。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述细胞凋亡诱导治疗为使用靶向肿瘤细胞的试剂的靶向疗法。
35.如权利要求32所述的方法，其中所述细胞凋亡通过选自下组的化疗剂处理来诱导：蒽环霉素、抗生素、烷化剂、铂基试剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂以及有丝分裂抑制剂。
36.如权利要求33所述的方法，其中所述细胞凋亡诱导治疗为放射治疗。
37.如权利要求32所述的方法，进一步包括，在投予所述缀合物之后，用有效诱导半胱天冬酶的表达的第二次细胞凋亡诱导治疗对所述个体进行处理。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述第二次细胞凋亡诱导治疗与所述第一次细胞凋亡诱导治疗相同。
39.如权利要求37所述的方法，其中所述第二次细胞凋亡诱导治疗与所述第一次细胞凋亡诱导治疗不同。
40.治疗有需要的个体的癌症的方法，其包括：
用有效诱导半胱天冬酶的表达的细胞凋亡诱导治疗对所述个体进行处理；以及
对所述个体投予前述任一项权利要求所述的缀合物。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述细胞凋亡诱导治疗在所述缀合物给药之前进行。
42.如权利要求40所述的方法，其中所述细胞凋亡诱导治疗选自下组：辐射、热疗、激光疗法、光能疗法、化学疗法以及冷冻疗法。
43.如权利要求40所述的方法，其中所述细胞凋亡诱导治疗为使用靶向癌症的试剂的靶向治疗。
44.如权利要求40所述的方法，其中所述细胞凋亡通过选自下组的化疗剂处理来诱导：蒽环霉素、抗生素、烷化剂、铂基试剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂以及有丝分裂抑制剂。
45.如权利要求40所述的方法，其中所述细胞凋亡诱导治疗为放射治疗。
46.治疗癌症的方法，其包括：对有需要的个体投予如前述任一项权利要求所述的缀合物，所述有需要的个体已经过有效诱导半胱天冬酶的表达的第一次细胞凋亡诱导治疗处理。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述细胞凋亡诱导治疗选自下组：辐射、热疗、激光疗法、光能疗法、化学疗法以及冷冻疗法。
48.如权利要求46所述的方法，其中所述细胞凋亡诱导治疗为使用靶向癌症的试剂的靶向治疗。
49.如权利要求46所述的方法，其中所述细胞凋亡通过选自下组的化疗剂处理来诱导：蒽环霉素、抗生素、烷化剂、铂基试剂、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂以及有丝分裂抑制剂。
50.如权利要求46所述的方法，其中所述细胞凋亡诱导治疗为放射治疗。
51.如权利要求46所述的方法，进一步包括，在投予所述缀合物之后，用有效诱导半胱天冬酶的表达的第二次细胞凋亡诱导治疗对所述个体进行处理。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述第二次细胞凋亡诱导治疗与所述第一次细胞凋亡诱导治疗相同。
53.如权利要求51所述的方法，其中所述第二次细胞凋亡诱导治疗与所述第一次细胞凋亡诱导治疗不同。
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