KR20120016050A

KR20120016050A - 프로드러그

Info

Publication number: KR20120016050A
Application number: KR1020117023578A
Authority: KR
Inventors: 페릭스 크라츠; 안드레 와르넥케; 배키트 엘사덱
Original assignee: 케이티비 투머포슝스케쉘샤프트 엠비에이치
Priority date: 2009-03-09
Filing date: 2010-03-09
Publication date: 2012-02-22
Also published as: US8642555B2; KR101472316B1; CA2754846A1; WO2010102788A1; AU2010223565A1; AU2010223565B2; JP5734209B2; BRPI1009521A2; US20120094892A1; CN102413842A; CN102413842B; EP2405944A1; JP2012519720A; EP2405944B1; CA2754846C

Abstract

본 발명은 최소한 한 개의 세포증식 억제제를 포함하며, 그리고 전립선 특이항원(PSA)에 의하여 난할 가능한(cleavable) 프로드러그에 관한 것이며, 그리고 암 치료에 사용될 수 있는 상기 프로드러그 및 약학적으로 유효한 양 만큼 상기 프로드러그를 포함하고 있는 약학적 조성물을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

프로드러그{Prodrugs}

본 발명은 최소한 한 개의 세포증식 억제제를 구비하며, 그리고 전립선 특이항원(PSA)에 의하여 난할 가능한(cleavable) 프로드러그에 관한 것이며, 그리고 암 치료에 사용될 수 있는 상기 프로드러그와 약학적으로 유효한 양 만큼 상기 프로드러그를 포함하는 약학적 조성물을 제조하기 위한 공정에 관한 것이다.

현재 사용되고 있는 일반적인 드러그(drug)들은 저분자를 포함하는 화합물이며, 그리고 환자에게 조직적으로 투여되었을 때 높은 혈장 제거율 또는 높은 전체 바디 제거율(high plasma clearance or total body clearance)을 보여준다. 이와 같은 저분자 화합물은 확산 작용에 의하여 인체에 잘 투입되며, 균일한 생물학적 분포를 보여준다. 이에 따라 다음과 같은 두 가지 중요한 궁금증을 만들어 낸다. 즉, 왜 적은 양의 드러그 만이 작용 부위에 이르고, 그리고 신체의 건강한 조직에도 전달되어 분포됨에 따라, 이와 같은 드러그가 심각한 부작용을 만들어 내게 되는 것인가가 그것이다. 상기와 같은 단점들은 세포증식 억제제와 같은 높은 세포 독성 잠재성을 갖는 드러그에 있어서 큰 문제점이 발생한다.

저분자의 선택성을 개선하고 그리고 소정의 조직에서의 활성제제의 농도를 증가시키고, 부작용을 줄이기 위하여 건강한 조직에서는 활성제제의 농도를 감소시키기 위한 다양한 방법이 연구되고 있다.

알부민과 같은 거대분자 담체 또는 이들 드러그의 켤레(conjugates;콘주게이트)들은 조직적 순환 작용에서 19일까지의 매우 긴 반감기를 보여준다. (cf. Maeda, H., Matsumura, Y., Crit . Rev . Ther . Drug Carrier Sys ., 1989, 6, 193-210). 악성, 감염 또는 염증 조직의 혈관 벽의 증가된 투과도로 인하여, 혈청 알부민과 같은 담체는 목표 조직으로 우선적으로 통과하여, 일명 수동 목표 효과를 얻게 된다. (cf. Maeda, H., Matsumura, Y., Crit . Rev . Ther . Drug Carrier Sys ., 1989, 6, 193-210). 드러그들은 외인성 또는 내인성 알부민이 될 수 있다(DE 103 10 082 A1, DE 10 2005 009 084 A1).

개선된 암 약물 요법에 대한 거대 분자 프로드러그 방법이 최근에 보고되었다. (WO 2006/092229). 이와 같은 방법은 두 가지 특징에 따른다. (i) 정맥 투여 이후에 내인성 알부민의 시스테인-34 위치에 대한 티올-반응성 프로드러그의 빠르고 선택적인 결합과, (ii) 종양 위치에서 알부민 드러그의 효소적 릴리즈이다. 전립선 특이항원(PSA)은 전립선 암종에서 과도하게 나타나는 세린 프로테아제이며, 그리고 프로드러그 제조로부터 항암 제제를 선택적으로 방출하기 위한 분자 타겟을 뜻한다. 펩타이드 시퀀스 Arg-Ser-Ser-Tyr-Tyr-Ser-Arg를 포함하는 독소루비신의 알부민 결합 유도체는 독소루비신-디펩타이드 Ser-Arg-DOXO을 PSA 릴리징하여 효율적으로 난할(cleaved)되며, 그러나 이와 같은 디펩타이드로부터의 자유(free) 독소루비신의 추가 유리(liberation)는 >48시간의 반감기를 천천히 진행하였다. 그리고 프로드러거가 오소토픽(orthotopic) PSA-양성 모델에서 독소루비신에 대하여 우수하였지만, 프로드러그는 종양에 있어 별다른 호전을 보이지 못했다.(Graeser et al., Int . J. Cancer, 2008, 122, 145).

따라서, 상기의 언급한 문제점들을 해결하고 그리고 작용부의 최종 목적지에 세포증식억제제를 보다 빠르게 릴리즈할 수 있는 프로드러그를 제공할 필요가 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 작용부의 원하는 소정 목적지에 효소의 난할(cleavage)에 따른 세포 증식 억제제를 보다 효율적으로 릴리즈할 수 있는 암 치료용의 새로운 프로드러그를 제공하는 것이다.

상기의 목적은 청구항들에 설명되는 실시예들을 통하여 해결될 수 있다. 특히, 본 발명의 일실시예에 따르면, 다음 공식 (I)을 갖는 프로드러그를 제공한다.

R-A_n-Ser-Leu-Y-Z (I)

상기의 식에서,

R은 단백질 결합 반족이며, H는 C₁ _-10 알킬, C₁ _-10알케닐, C₁ _-10알키닐 및 C₁ _-10 아실로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 미치환 또는 치환 잔기를 뜻하며, 상기 잔기는 한 개 또는 그 이상의 헤테로원자를 선택적으로 포함하는 사이클릭, 가지형(branched) 또는 선형이며; 또는 아릴, 아랄킬 및 헤테로아릴로부터 선택되는 미치환 또는 치환된 잔기를 뜻하며,

A는 L- 및/또는 D-아미노산으로 구성되는 펩타이드 시퀀스이며, 상기에서 아미노산 잔기는 동일하거나 서로 다르며,

n은 1에서 10 사이의 정수를 뜻하며, 바람직하게는 1에서 8 사이의 정수를 뜻하며, 보다 바람직하게는 1에서 6 사이의 정수를 뜻하며, 가장 바람직하게는 1에서 4 사이의 정수, 예를 들면 2, 3, 4, 5 또는 6을 뜻하며, 이들 정수는 펩타이드 시퀀스에서 아미노 산의 수를 표시하며,

Y는 링커 반족(linker moiety)을 뜻하며, 그리고

Z는 세포증식억제제를 뜻하며,

여기서, R은 펩타이드 백본(backbone)의 터미널 NH₂ 기를 경유하여 A_n에 링크될 수 있으며, 그리고 Y는 α-C-atom의 COOH-기를 경유하여 Leu에 링크될 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "프로드러그"는 상기에 정의한 공식(I)이 만족하는 한 특별히 한정되지 않는다. 특히, 용어 "프로드러그"는 인간과 같은 생물에 투여될 수 있는 비활성 또는 보다 덜 활성된 형태의 드러그(또는 화합물) 형태를 뜻하며, 신진대사와 같은 것에 의하여 활성 형태로 변환이 된다. 이와 같은 드러그의 활성 상태로의 변환은 특별히 한정되지 않으며, 작용부의 특정 장소에서 프로프로그의 활성부(특히, 세포증식억제제)의 릴리즈를 위하여, 복용 이후에 발생하는 프로드러그의 화학적 및/또는 물리적인 변화를 포함한다.

본 명세서에 사용된 "단백질 결합 반족"이란 표현은 특별히 제한되지 않으며 그리고 외인성 또는 내인성으로 시작하는 화합물의 아미노, 하이드록시 또는 티올기에 결합될 수 있는 기능성 기를 뜻한다. 본 발명에 따른 바람직한 단백질 결합 반족의 바람직한 보기들은 말레이미드 기, 할로겐아세트아미드 기, 할로겐아세트 기, 피리딜티오 기, 비닐카보닐 기, 아지리딘 기, 이황화물 기, 치환 또는 미치환 아세틸린 기, 하이드록시숙신이미드 에스테르 기들이다. 단백질 결합 반족은 디시클로카보디이미드, 산 염화물, 또는 펩타이드 결합 시약(예를 들면, BOP, HATU, PyBOP)와 같은 표준 결합 제제에 의하여 활성화될 수 있는 -COOH 또는 SO₃H와 같은 기능성 기를 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 단백질 결합 반족은 말레이미드 기이다.

한 개 또는 다수의 프로드러그는 펩타이드, 당, 혈청 단백질, 항체 또는 항체 프래그먼트, 성장 인자, 다당류 또는 인조 폴리머들과 같은 소정의 담체에 적용될 수 있다. 일반적으로 담체는 단백질 결합 프로드러그를 결합시키기 위하여 하이드록시, 아미노 또는 티올 기와 같은 소정의 기능성 기를 포함하고 있다. 만약 필요하다면, 당업자에 잘 알려진 공지의 기술을 이용한 화학적 변형을 통하여 담체 분자 내로 적용할 수 있다. (Kratz et al., (2001): Polymeric Biomaterials, second edition, ed. S. Dumitriu, Marcel Dekker, New York, Chapter 32, 851-894에 따르면, 항암제는 거대 분자 담체와 켤레(콘주게이트,conjugate)를 이룬다.

바람직한 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 단백질 결합 반족은 상기의 프로드러그를 주사와 같은 투약 이후에, 제자리에서, 생체 유체의 요소 및/또는 조직 요소에, 바람직하게는 혈청 단백질에 그리고 더 바람직하게는 혈청 알부민에게, 특히 혈청 알부민의 시스테인-34에게로 결합하도록 하며, 그리고 약학적 활성 화합물을 목표 위치로 전달하는 거대 분자 프로드러그로서 존재하게 된다.

본 발명에 따르면, 용어 "제자리에서(in situ)"는 본 발명에 따른 프로드러그가 투역되는 생물 내부에서, 혈청 단백질, 특히 혈청 알부민과 같은 내인성 바이오분자에 프로드러그에 결합되는 것을 뜻한다.

본 발명의 바람직한 실시예는 상기에 정의된 프로드러그에 관한 것이며,예를 들면 카프로산 기, 즉 C₁ _-10아실과 같은 R(단백질 결합 반족 및 H를 포함하지 않음)으로 정의되는 잔기는 말레이미드 기와 같은 상기에 정의된 단백질 결합 반족에 의하여 치환된다. 본 발명의 일실시예에 따른 R에 대한 보기는 ε-말레이미드카프로산(EMC)이다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 카프로산 기, 즉 C₁ _-10아실와 같은 R은 반족으로 치환되며, 상기 반족은 티올 결합 기와 같은 단백질 결합 특성을 결여하고 있거나 또는 말레이미드 기, 즉 티올 결합 기와 같은 단백질 결합 특성을 구비하고 있지만, 상기와 같은 단백질 결합 특성은 시스테인과 같은 치환기에 의하여 차단되거나 유도체 합성된다.

본 발명의 실시예에 따른 R의 보기는 다음과 같다.

본 발명의 바람직한 실시예는 상기에 설명한 바와 같은 프로드러그에 관한 것이며, 펩타이드 시퀀스의 아미노 산은 Arg, Asn, Gln, Gly, Phe, Ser, Val, Ile, Leu, His, Lys, Ala 및 Tyr으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다. 상기에 정의된 프로드러그의 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 펩타이드 시퀀스는 Arg-Ser-Ser-Tyr-Tyr, Arg-Ser-Ser-Tyr-Ser, Arg-Ser-Ser-Tyr-Arg, Ser-Ser-Tyr-Arg, Ser-Ser-Tyr-Tyr, Arg-Arg-Leu-His-Tyr, Arg-Arg-Leu-Asn-Tyr, Ser-Ser-Lys-Leu-Gln 및 Arg-Ala- Ser-Tyr-Gln으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 프로드러그에 정의된 세포증식 억제제 Z는 특별히 한정되지는 않으며, 엔-니트로소레아스(N-nitrosoureas), 엔쓰라시클린(anthracyclines), 알킬화제, 대사길항제, 폴산 경쟁제, 캠프토세신(camptothecins), 빈카 알칼로이드(Vinca alkaloids), 탁산(taxanes), 칼리키아미신(calicheamicins), 메이탄시노이드(maytansinoids), 오리스타틴( auristatins), 에포티론(epothilones), 블레오마이신(bleomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 플라이카마이신(plicamycin), 미토마이신(mitomycin) C 및 cis-구성 플라티늄(II) 합성물(콤플렉스)로 구성되는 그룹으로부터 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 소정의 세포증식 억제제의 보기들은 N-니트로소레아 니무스틴(N-nitrosourea nimustine) 및 그 유도체; 엔쓰라시클린 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미톡산트론 및 아메탄트론 및 그 유도체(anthracyclines doxorubicin, daunorubicin, epirubicin, idarubicin, mitoxantrone and ametantrone, and any derivatives thereof); 알킬화제 클로람부실, 벤다무스틴, 멜팔란 및 옥사자포스포린 및 그 유도체(alkylating agents chlorambucil, bendamustine, melphalan, and oxazaphosphorines, and any derivatives thereof); 퓨린 안타고니스트 또는 피리딘 안타고니스트와 같은 대사길항물질, 5-플루오로우라실, 2'-디옥시-5-플로우로리딘, 시타라빈, 클라드리빈, 플루다라빈, 펜토스타틴, 젬시타빈 및 티오구아닌 및 그 유도체(antimetabolites, for example purine antagonists or pyrimidin antagonists, 5-fluorouracil, 2'-deoxy-5-fluorouridine, cytarabine, cladribine, fludarabine, pentostatine, gemcitabine and thioguanine, and any derivatives thereof); 폴산 안타고니스트 메토트렉세이트 또는 랄티트렉시드, 페미트렉시드, 또는 플레비트렉시드, 탁산 파클리탁셀 및 도세탁셀 및 그 유도체(folic acid antagonists methotrexate, or raltitrexed, pemetrexed or plevitrexed, the taxanes paclitaxel and docetaxel, and any derivatives thereof); 캠프토쎄신 토포테칸, 이리노테칸, 9-아미노캠프토쎄신 및 캠프토쎄신 및 그 유도체(camptothecins topotecan, irinotecan, 9-aminocamptothecin and camptothecin, and any derivatives thereof); 빈카 알칼로이드 빈플라스틴, 빈크리스틴, 빈데신 및 빈오렐빈 및 그 유도체(Vinca alkaloids vinblastine, vincristine, vindesine and vinorelbine, and any derivatives thereof)들을 포함한다.

본 명세서에 사용된 "링커 반족"이라는 표현은 최소한 두 개의 잔기를 결합할 수 있는 소정의 그룹을 표현하며, 상기와 같은 잔기들을 서로 화학적으로 연결한다. 본 발명에 따른 "링커 반족"은 그에 한정되지는 않지만, 상기 공식 (I)에 따른 Leu의 α-C-원자의 터미널 COOH-기 및 세포증식 억제제 Z 둘을 상호 결합하는데 적합한 소정의 화학적 반족이다. 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기에 정의된 프로드러그의 링커 반족 Y는 p-아미노벤질옥시카보닐(PABC), o-아미노벤질옥시카보닐, N-메틸아미노 에틸렌 또는 대칭 N, N'-디메틸디아미노 에틸렌, 트리메틸 락 고리화 링커(trimethyl lock lactonization linker) 및 비닐오로구스 벤질 제거 링커(vinylologous benzyl elimination linker)로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.

난할될 수 있는(cleavable) 링커는 펩타이드 난할(cleavage) 이후에 자발적인 반응으로 교대로 가수분해를 하고 그리고 약학적으로 그리고/또는 진단적으로 활성 상태인 화합물을 방출하는 자기 희생적 스페이서 드러그 유도체를 (안정적으로) 생성하는 한 개 또는 그 이상의 자기 희생적 링커들을 포함한다. 자기 희생적 링커의 한 보기는 p-아미노벤질옥시카보닐(PABC) 스페이서 또는 다음들 중에서 한 개이며, R은 H, Cl, Br, I, F, NO₂, CN, OH 또는 지방족 또는 방향족 반족으로부터 선택되는 기능 기이며, 그리고 트리거는 프로테아제 기판(기질)으로서 작용하는 펩타이드이다. 상기와 같은 링커의 구체적인 예시들은 다음 표 1에 열거되어 있다.

본 발명의 특별한 실시예들에 따른 프로드러그의 실예들이 아래에 나타나 있다.

(=EMC-Arg-Ser-Ser-Tyr-Tyr-Ser-Leu-PABC-독소루비신),

(Cys-EMC-Arg-Ser-Ser-Tyr-Tyr-Ser-Leu-PABC-독소루비신), 또는

(=EMC-Arg-Ser-Ser-Tyr-Tyr-Ser-Leu-PABC-파클리탁셀)

본 발명의 또 다른 양상에 따르면, 상기에 정의한 바와 같은 프로드러그의 제조에 대한 공정이 제공되며, 상기 공정은 다음 공식 II의 화합물

R-A_n (II)

를 다음 공식 III의 화합물로 반응시키는 단계를 포함한다.

Ser-Leu-Y-Z (III)

상기의 공식에서 R, A, n, Y 및 Z는 앞서 정의된 것과 같다.

본 발명에 따른 또 다른 양상은 상기에 정의된 프로드러그를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이며, 선택적으로 약학적으로 수용 가능한 담체 및/또는 희석제 및/또는 보조제에 관한 것이다. 특히, 예를 들면, 약학적 조성물은 염화 나트륨 용액과 같은 용제 및 희석제를 포함하여 또는 소정의 약학적으로 수용 가능한 버퍼를 포함하는 용액이다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 정제 또는 캡슐과 같은 또는 흡입을 위한 조성물과 같은 그리고 예를 들면 주사 가능한 형태로 환자에게 투약 가능한 소정의 형태를 가지므로 편리한 형태로 이용 가능하며, 특히, 본 발명에 의한 약학 조성물은 암 치료용으로 적합한 효과를 가진다.

그리고 본 발명은 프로드러그가 원하는 작용 위치에서 효소적으로 난할될(cleave) 때, 그에 포함된 세포증식 억제제의 빠른 릴리즈를 제공하는 장점적이고 놀랄만한 새로운 프로드러그(prodrugs)를 제공한다. 특히, 본 발명에 의한 프로드러그는 PSA 난할(cleavage;클리비지)에 따라 최적화된 릴리즈 특성을 보여 준다. 일반 공식 R-A_n-Ser-Leu-Y-Z와 같은 예를 들면 EMC-Arg-Ser-Ser-Tyr-Tyr-Ser-Leu- PABC-독소루비신 및 EMC-Arg-Ser-Ser-Tyr-Tyr-Ser-Leu-PABC-파클리텍셀과 같은 프로드러그들은 우수한 물 용해성을 보여주며, 외인성 및 내인성 알부민의 시스테인-34 위치에 빠르게 적용된다. PSA에 의한 난할(cleavage)에 따라, 디펩타이드 Ser-Leu-Y-Z가 릴리즈된다. 놀랍게도, 이와 같은 디펩타이드는 빠르게 열화되어 LNCaP 종양 조직 균질현탁액에서는 수 시간 이내에 독소루비신과 파클리텍셀과 같은 자유(free) 세포증식 억제제 Z를 유리(liberate)시킨다. 따라서, 매우 개선된 릴리즈가 장점적으로 얻어지며, 이에 따라 기술의 진행 상태와 비교하여 세포증식 억제 치료에 있어 놀랄만한 높은 효험을 보여준다.

도1은 PSA(20mg/mL)에 의한 화합물 6의 알부민 형태의 HPLC-모니터링 난할 연구를 도시한다.
도2는 PSA(20mg/mL)에 의한 화합물 10의 알부민 형태의 HPLC-모니터링 난할 연구를 도시한다.
도3은 LNCaP 전립선 종양 조직 균질현탁액(호모제네이트)에 의한 화합물 5의 HPLC-모니터링 난할연구를 도시한다.
도4는 LNCaP 전립선 종양 조직 균질현탁액에 의한 화합물 12의 HPLC-모니터링 난할 연구를 도시한다.

본 발명은 그에 어떠한 한정도 없이 다음과 같은 실시예들에 예시될 수 있다.

실시 예시

HPLC 시스템

방법 A: 별도로 표시되지 않으면, 모든 화합물의 분석적인 역상 HPLC는 용제 전달 시스템(HPLC Pump 422), 가변 파장 UV-VIS 검출기(HPLC 검출기 430) 및 Nucleosil？ C-18 칼럼 (100-5, 250x4 mm, Macherey-Nagel)을 사용하는 용제 전달 시스템을 이용한 콘트론(Kontron) 시스템에서 수행되었다.

피크 일체화를 위해서는, Geminyx 소프트웨어(v 1.91 by Goebel Instrumentelle Analytik, FRG)가 사용되었다. HPLC의 조건은 다음과 같다. : 유속: 1 mL/min, 그레디언트(기울기): 0-5 min 100% 모바일 상 A; 5-35 min에서 100% 모바일 상으로 증가 B; 35-40 min 100% 모바일 상 B; 40-45 min에서 100% 모바일 상으로 감소 A; 45-50 min 100% 모바일 상 A; 모바일 상 A: 30 % CH₃CN, 70% 물 + 0.1 %TFA, 모바일 상 B: 70 % CH₃CN, 30 % 물 + 0.1 % TFA, 주사 용량: 50μL.

방법 B: 난할을 위한 HPLC, 상기 독소루비신 모델의 결합 및 안정성 연구들이 Biorad (Munich, Germany) 사로부터의 BioLogic Duo-Flow System을 사용하여 수행되었으며, 그 회사는 Merck F-1050 형광 분광 광도계 (EX. 490 nm, EM. 540 nm) 및 Bischoff로부터의 Lambda 1000 비저블 모니터 (e= 495 nm); 254 nm의 UV-검출기; 칼럼: 워터, 300 Å, 프리-칼럼을 구비한 Symmetry C18 5㎛ [4.6 ×250mm] 칼럼 ; 크로마토그래픽 조건들: 유속: 1 mL/min, 이동 상 A(30% CH₃CN, 70% 물 + 0.1% TFA), 이동 상 B (50% CH₃CN, 50% 물 + 0.1% TFA), 그래디언트(기울기): 0-5 min 100% 이동 상 A; 100% 이동 상 B로의 증가 5-35 min; 35-40 min 100% 이동 상 B ; 100% 이동 상 A로의 감소 40-45 min ; 45-50 min 100% 이동 상 A; 주사 용량: 50 μＬ.

방법 C: 상기 난할을 위한 HPLC, 상기 파클리탁셀 모델의 결합 및 안정성 연구는 용제 이송 시스템(HPLC 펌프 422), 가변 파장 UV-VIS 검출기(HPLC Detector 430) 및 워터, 300 Å, 프리-칼럼을 구비한 Symmetry C18 5㎛ [4.6 ×250mm] 칼럼을 사용한 Kontron 시스템을 이용하여 수행되었다. 피크 값 적분을 위해, Geminyx 소프트웨어 (v 1.91 by Goebel Instrumentelle Analytik, FRG)가 사용되었다. HPLC 조건들: 유속: 1 mL/min, 그래디언트(기울기): 0-5 min 100% 이동 상 A; 100% 이동 상 B로의 증가 5-35 min; 35-40 min 100% 이동 상 B ; 100% 이동 상 A로의 감소 40-45 min ; 45-50 min 100% 이동 상 A; 이동 상 A: 30% CH₃CN, 70% 물 + 0.1% TFA, 이동 상 B : 70% CH₃CN, 30% 물 + 0.1% TFA,주사 용량: 50 μＬ.

독소루비신 드러그의 화학적 합성

Fmoc - Leu - PABOH 의 합성(1)

Fmoc-Leu-OH (2.50 g, 7.07 mmol) 및 N-에톡시카보닐-2-에톡시-1,2- 디하이드로퀴놀린(EEDQ) (1.90 g, 7.78 mmol)을 무수 디클로로메탄(DCM) (150mL)에 용해시켰다. 실온에서 5분 동안 저은 뒤에, 4-아미노벤질알콜(PABOH) (0.95g, 7.78mmol)이 추가되었으며, 젓기가 24시간 동안 계속되었다. DCM이 감압 상태에서 제거되었으며, 클로로포름/메탄올(50:1)을 이용하여 실리카 겔 칼럼 상에서 정제시켰으며, 이에 따라 흰색 파우더의 1(3.00g, 92%)을 얻었다. APCI-MS (5 uA, MeCN): m/z (%) = 459.0 (100) [M + H]⁺; HPLC (220 nm): > 95%.

H- Leu - PABOH 의 합성(2)

N,N-디메틸폼아마이드(DMF) (5 mL) 내에서, 1 (2.50 g, 5.45 mmol)을 20%의 피페리딘 용액을 이용하여 처리하였으며, 실온에서 10분간 저으면서 반응을 진행하였다. 제품(산출물)은 디에틸 에테르(500mL)로 침전시켰으며, 디에틸 에테르로 3번 세척하였으며, 진공 상태에서 건조하여, 흰색 파우더 형태의 2 (1.00 g, 77%)를 만들었다.. APCI-MS (5 uA, MeCN): m/z (%) = 237.1 (100) [M + H]⁺; HPLC (220 nm): > 95%.

Fmoc - Ser ( Trt )- Leu - PABOH 의 합성(3)

Fmoc-Ser(Trt)-OH (1.69 g, 2.96 mmol) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS) (0.34 g, 2.96 mmol)을 무수 DCM (100 mL)에 용해시키고, 10분간 0℃에서 저었다. 디시클로헥실카보디이미드(DCC) (0.61 g, 2.96 mmol)가 추가되고, 16시간 동안 5℃에서 저으면서 반응을 진행하였다. 얻어진 침전물을 여과하고, 2 (0.70 g, 2.96 mmol) 및 트리에틸아민(TEA) (0.41μL, 0.29 g, 2.96 mmol)을 여과물에 추가하였다. 실온에서 4시간 동안 저은 이후에, 감압 상태에서 휘발 성분을 제거하고, 제품을 에틸 아세테이트/헥산을 이용하여 정제시키고, 흰색 파우더 형태의 3 (1.85 g, 79%)을 만들었다. APCI-MS (5 uA, MeCN): m/z (%) = 788.2 (100) [M + H]⁺; HPLC (220 nm): > 95%.

Fmoc - Ser ( Trt )- Leu - PABC - PNP 의 합성(4)

무수 DCM (50 mL), N,N-디이소프로필에틸아민 (DIEA) (1163 μＬ, 0.88 g, 6.84 mmol)에 3의 용액(1.80 g, 2.28 mmol)과 비스(p-니트로페닐) 카보네이트(2.77 g, 9.12 mmol)를 0 ℃에서 추가하였으며, 48시간 동안 실온에서 휘저어 반응시켰다. 그 결과로서 휘발 성분이 감압하에 제거되었으며, 그리고 잔여물은 백색 파우더인 4를 얻기 위해 클로로포름/메탄올(100 : 1)을 사용하여 실리카 겔 칼럼 상에서 정제되었다. ESI-MS (5 kV, MeOH): m/z (%) = 975.2 (100) [M + Na]⁺; HPLC (220 nm): > 95%.

H- Ser - Leu - PABC - DOXO 의 합성 (5)

무수 DMF (10 mL)에 4의 용액(0.75 g, 0.786 mmol), 독소루비신 염산염(0.43 g, 0.78 mmol) 및 DIEA (134 μＬ, 0.1 g, 0.786 mmol)이 첨가되었으며, 그 반응은 48시간 동안 실온에서 휘저어서 행해졌다. 후에, Fmoc 보호 그룹이 디에틸아민(1.5 mL)에 의해 제거되었으며, 그리고 그 반응은 10분 동안 실온에서 휘저어서 행해졌다. 붉은색의 산출물(제품)이 디에틸 에테르(500 mL)에 의해 침전되었고, 디에틸 에테르에 의해 3번 세척되었으며, 그리고 H-Ser(Trt)-Leu-PABC-DOXO (750 mg, 85%)을 얻기 위해 진공에서 건조되었다. 그 결과로서, Trt 보호 그룹은 H-Ser(Trt)-Leu-PABC-DOXO (0.30 g, 0.26 mmol)를 무수 DCM (15 mL) 속에 용해함으로써 난할되었다. 그리고 DCM (9 mL) 속에 1% TFA 용액이 15분 동안 드롭와이즈 방식에 의해 첨가되었다. 실온에서 1시간 동안 휘저은 후에, 그 형성된 침전물은 붉은색 파우더의 5(190 mg, 80%) 를 얻도록 클로로포름/메탄올(20 : 1)을 사용하여 실리카 겔 칼럼 상에서 정제되었다. . ESI-MS (5 kV, MeCN): m/z (%) = 915.3 (100) [M + Na]⁺; HPLC (495 nm): > 95%.

EMC - Arg - Ser - Ser - Tyr - Tyr - Ser - Leu - PABC - DOXO 의 합성 (6)

무수물 DMF (10 mL) EMC-Arg-Ser-Ser-Tyr-Tyr-OH (107 mg, 0.12 mmol) 내에 5 (100 mg, 0.11 mmol), N-하이드록시벤졸트리아졸 (HOBt) (22 mg, 0.33 mmol) 및 4-메틸모폴린 (48μL, 44 mg, 0.44 mmol)을 용해시켰다. 0℃에서 15분간 저은 이후에, N,N'-디이소프로필카보디이미드 (DIPC) (116μL, 83 mg, 0.66 mmol)을 추가하고, 72시간 동안 5℃에서 저으면서 반응을 진행하였다. 최종 제품을 디에틸 에테르(500 mL)을 이용하여 침전시키고, CH₃CN/물 (40 : 60) + 0.1% TFA을 이용하여 역상 칼럼에서 정제하고, 순수 제품을 포함하는 조합된 프렉션(fractions)들을 감압 상태에서 동결 건조(lyophilizing)하여 적색 파우더 형태의 6 (140 mg, 73%)을 만들었다. ESI-MS (5 kV, MeCN): m/z (%) = 1742.7 (100) [M + H]⁺; HPLC (495 nm): > 95%.

6의 합성

파클리탁셀 프로드러그의 화학적 합성

Fmoc - Leu - PABC - PNP 의 합성(7)

0℃에서 무수 DMF (20 mL) 속에 1 (0.70 g, 1.52 mmol) 의 용액과 비스(p-니트로페닐) 카보네이트(2.32 g, 7.63 mmol), DIEA (779 μＬ, 0.59 g, 4.57 mmol)이 첨가되었으며, 그리고 실온에서 48시간 동안 휘저어 그 반응이 행해졌다. 그 결과, 휘발성분이 감압하에 제거되었으며, 잔여물은 백색 파우더로서의 7 (800 mg, 84%)을 얻도록 클로로포름/메탄올(50 : 1)을 사용하여 실리카 겔에서 정제되었다. ESI-MS (5 kV, MeCN): m/z (%)= 623.9 (100) [M + H]⁺; HPLC (220 nm): > 95%.

Fmoc - Leu - PABC - Paclitaxel 의 합성(8)

파클리탁셀(Paclitaxel: 암의 화학 요법에 사용되는 물질) (0.37 g, 0.44 mmol)과 4-디메틸아미노피리딘(DMAP) (0.05 g, 0.44 mmol)이 무수 DCM (15 mL) 속에서 용액 7(0.27 g, 0.44 mmol)에 첨가되었으며, 그리고 실온하의 어둠 속에서 24시간 동안 휘저어 반응이 행해졌다. 다음에, DCM (20 mL)을 추가하였으며, 그 반응 혼합물이 NaHCO₃, 소금물로 추출되었고, 그리고 나트륨 황산염으로 건조하였다. 잔여물은 백색 파우더인 8 (550 mg, 93%)을 얻도록 에틸 아세테이트/헥산(1 : 1)을 사용하여 실리카 겔 위에서 정제되었다. ESI-MS (5 kV, MeOH): m/z (%)= 1360.1 (100) [M + Na]⁺; HPLC (230 nm): > 95%.

H- Leu - PABC - Paclitaxel 의 합성(9)

상기 물질 8 (0.50 g, 0.37 mmol)이 실온에서 45초 동안 테트라히드로푸란(THF) (10 mL) 속에 1%의 1,8-디아자바이시클로[5.4.0]운데크-7-en (DBU)으로 처리되었다. 그리고 그 산출물은 디에틸 에테르 (500 mL) 속에 1 M HCl에 의해 침전되었다. 그 후, 백색 파우더인 9 (350 mg, 84%)를 얻도록 클로로포름/메탄올 (7 : 1)을 사용하여 실리카 겔 위에서 정제되었다. ESI-MS (5 kV, MeOH): m/z (%)= 1116.1 (100) [M + H]⁺; HPLC (230 nm): > 95%.

EMC - Arg - Ser - Ser - Tyr - Tyr - Ser - Leu - PABC - Paclitaxel 의 합성(10)

EMC-Arg-Ser-Ser-Tyr-Tyr-Ser-OH (84 mg, 88.68 μmol), 9 (90 mg, 80.61 μmol), HOBt (30 mg, 241.83 μmol) 및 4-메틸모르폴린 (35 μＬ, 30 mg, 322.2 μmol)이 무수 DMF (10 mL) 속에서 용해되었다. 0℃에서 15분 동안 휘저은 후에 DIPC (75 μＬ, 60 mg, 483.6 μmol)을 첨가하였으며, 그리고 그 반응은 5℃에서 72시간 동안 저어서 실행되었다. 상기 물질 10은 디에틸 에테르 (100 mL)로 침전되었다. 그리고 그 순수한 산출물을 포함하는 혼합 파편들을 감압동결건조한 후 백색 파우더인 10 (75 mg, 45%)을 얻도록 CH₃CN/물 (40 : 60) + 0.1% TFA을 사용하여 역상 칼럼에서 정제되었다. ESI-MS (3 kV, MeCN): m/z (%)= 1027.2 (100) [M/2 + 2H]²⁺; HPLC (230 nm): > 95%.

Fmoc - Ser - Leu - PABC - Paclitaxel 의 합성(11)

DIEA (15 μＬ, 0.011 g, 0.089 mmol)이 무수 DIEA (15 μＬ, 0.011 g, 0.089 mmol) 속에서 Fmoc-Ser-OH (0.029 g, 0.089 mmol) 및 [2-(1H-9-아조벤조트리아졸-1-yl)-1,1,3,3- 테트라메틸아미니움헥사플루오로 인산염] (HATU) (0.034 g, 0.089 mmol)의 용액에 첨가되었다. 실온에서 그 반응 혼합물을 30분 동안 저은 후, 9 (0.1 g, 0.089 mmol) 및 DIEA (15 μＬ, 0.011 g, 0.089 mmol)을 추가하였으며, 그리고 그 반응은 2시간 동안 저어 행해졌다. 그 결과 휘발성분이 감압하에 제거되었으며, 그 잔여물은 백색 파우더인 11 (115 mg, 90%)을 얻도록 에틸 아세테이트/헥산 (2 : 1)을 사용하여 실리카 겔 칼럼 상에서 정제되었다. ESI-MS (5 kV, MeOH): m/z (%)= 1447.1 (100) [M + Na]⁺; HPLC (230 nm): > 95%.

H- Ser - Leu - PABC - Paclitaxel 의 합성(12)

11 (0.1 g, 0.070 mmol)이 실온에서 45초 동안 THF (3 mL) 속에 1% DBU 로 처리되었으며, 그 산출물은 디에틸 에테르 (200 mL) 속에서 1 M HCl에 의해 침전되었다. 그 후, 백색 파우더인 12 (75 mg, 89%)를 얻도록 클로로포름/메탄올 (7 : 1)을 사용하여 실리카 겔 칼럼에서 정제되었다. ESI-MS (5 kV, MeOH): m/z (%)= 1225.1 (100) [M + Na]⁺; HPLC (230 nm): > 95%.

10의 합성

6과 10의 알부민- 구속 형태의 난할 ( 卵割 , cleavage ) 연구

6의 알부민 켤레(albumin conjugate )의 합성

알부민 켤레가 6 의 용액 [5% 포도당 용액 (300 μＬ)] 속에 2 mg]을 인간 혈청 알부민 (Octapharma로부터의 5% 용액)(1700 μＬ)에 첨가함으로써 제조되었다. 그 혼합물은 37℃에서 1시간 동안 배양되었다. 상기 알부민 켤레는 후속하는 사이즈-제거(size-exclusion) 색층분석(Sephacryl(등록상표명) S-100; 10 mM 나트륨 인산염 버퍼, pH 7.4) 후에 얻어졌다. 상기 샘플에 있어 앤트라시클린(anthracycline)의 용량은 독소루비신 [ε₄₉₅ (pH 7.4) = 10650 M^-1cm^-1]용의 ε-값을 사용하여 결정되었다. 상기 켤레에 있어 6의 농도는 4℃ 및 4500 rpm에서 CENTRIPREP(상표명)-10-농축기 (Amicon, 독일)로 상기 샘플을 농축하는 것에 의해 400±50 μM으로 조정되었다. 샘플들은 -20℃에서 냉동 보존되었으며, 그리고 사용에 앞서 해동되었다.

PSA 에 의한 6의 알부민-구속 형태의 효소적 난할

6(100 μＭ)의 알부민-구속 형태(albumin-bound form)는 37℃에서 효소 활성 PSA (20 ㎍/mL)로 배양되었으며, 그리고 상기 난할은 HPLC (방법 B)을 사용하여 다른 시간대들에서 관찰되었다.

LNCaP 전립선 종양 조직 균질 현탁액에 의한 5의 난할

5(100 μＭ)는 37℃에서 LNCaP 전립선 종양 조직 균질 현탁액으로 배양되었으며, 그리고 그 난할은 다음의 이동 상(mobile phase)을 사용한 HPLC (방법 B) 를 사용하여 다른 시간대들에서 관찰되었다; 이동 상 A (30% CH₃CN, 70% 물과 0.1% TFA), 이동 상 B (70% CH₃CN, 30% 물과 0.1% TFA).

10의 알부민 켤레의 합성

프로드러그의 알부민 켤레가 10의 용액[1 mg의 50 μＬ 폴리(에틸렌글리콜)-400 + 200μＬ의 5% 포도당 용액]을 300 mM의 최종 농도에서 인간 혈청 알부민 (Octapharma 로부터의 5% 용액)에 첨가하여 제조되었으며, 그리고 그 혼합물은 37 ℃에서 1시간 동안 배양되었다. 샘플들은 -20 ℃에서 냉동 보존되었으며, 그리고 사용에 앞서 해동되었다.

PSA 에 의한 10의 알부민-구속 형태의 효소 난할

10 (100 μM)의 알부민-구속 형태는 37℃에서 효소 활성 PSA (20 ㎍/mL) 로 배양되었으며, 그리고 상기 난할은 HPLC(방법 C)를 사용하여 다른 시간대들에서 관찰되었다.

LNCaP 전립선 종양 조직 균질 현탁액에 의한 12의 난할

12 (100 μM)는 37 ℃에서 LNCaP 전립선 종양 조직 균질 현탁액으로 배양되었으며, 그리고 상기 난할은 HPLC(방법 C)를 사용하여 다른 시간대들에서 관찰되었다.

난할(cleavage) 결과

6과 10 양쪽의 알부민- 구속 형태의 PSA-매개 난할은 상기 알부민 켤레들이 도1 및 도2에서 보여지고 있는 것과 같이 독소루비신-디펩티드 (H-Ser-Leu-PABC-DOXO) 또는 파클리탁셀-디펩티드 (H-Ser-Leu-PABC-파클리탁셀)를 유리시키도록 수시간 이내에 효과적으로 난할되었다. 더욱이 이들 드러그-디펩티드들은 도3 및 도4에서 보여지고 있는 것과 같이 자유(free) 세포증식 억제 약(독소루비신 또는 파클리탁셀)을 유리시키고록 3시간 이내에 LNCaP 전립선 종양 조직 균질현탁액 속에서 완전한 난할을 보여주었다. 펩티드 시퀀스 및 활성 드러그 사이에 자가- 제거 링커(self-eliminating linker) (PABC)를 삽입하여 상기 난할 속도를 개선하였다. 상기 난할 공정 속에 포함된 반응들은 다음 도표들 속에 나타나 있다:

Claims

다음 공식 (I)을 갖는 프로드러그:
R-A_n-Ser-Leu-Y-Z (I)
상기의 식에서,
R은 단백질 결합 반족이며, H는 C₁ _-10 알킬, C₁ _-10알케닐, C₁ _-10알키닐 및 C₁ _-10 아실로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 미치환 또는 치환 잔기를 뜻하며, 상기 잔기는 한 개 또는 그 이상의 헤테로원자를 선택적으로 포함하는 사이클릭, 가지형(branched) 또는 선형이며; 또는 아릴, 아랄킬 및 헤테로아릴로부터 선택되는 미치환 또는 치환된 잔기를 뜻하며,
A는 L- 및/또는 D-아미노산으로 구성되는 펩타이드 시퀀스이며, 상기에서 아미노산 잔기는 동일하거나 서로 다르며,
n은 펩타이드 시퀀스에서 아미노 산의 수를 표시하는 1에서 10 사이의 정수이며,
Y는 링커 반족(linker moiety)을 뜻하며, 그리고
Z는 세포증식억제제이다.
제1항에 있어서, R에 대해 정의된 상기 잔기들은 단백질-결합 반족에 의해 치환되는 것을 특징으로 하는 프로드러그.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단백질 결합 기는 말레이미드 기, 할로겐아세트아미드 기, 할로겐아세트 기, 피리딜티오 기, 비닐카보닐 기, 아지리딘 기, 이황화물 기, 치환 또는 미치환 아세틸린 기, 하이드록시숙신이미드 에스테르 기들로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 프로드러그.
제1항 내지 제3항 중 한 항에 있어서, 상기 단백질 결합 기는 말레이미드인 것을 특징으로 하는 프로드러그.
제1항 내지 제4항 중 한 항에 있어서, R은 C₁ _-10아실인 것을 특징으로 하는 프로드러그.
제1항 내지 제5항 중 한 항에 있어서, R은 카프로 산인 것을 특징으로 하는 프로드러그.
제1항 내지 제6항 중 한 항에 있어서, R은 e-말레이미도카프로 산(EMC)인 것을 특징으로 하는 프로드러그.
제1항 내지 제7항 중 한 항에 있어서, 상기 펩타이드 시퀀스에 있는 상기 아미노 산들은 Arg, Asn, Gln, Gly, Phe, Ala, Leu, Ile, Val, His, Lys, Ser, 및 Tyr로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 프로드러그.
제1항 내지 제8항 중 한 항에 있어서, 상기 펩타이드 시퀀스는 Arg-Ser-Ser-Tyr-Tyr, Arg-Ser-Ser-Tyr-Ser, Arg-Ser-Ser-Tyr-Arg, Ser-Ser-Tyr-Arg, Ser-Ser-Tyr- Tyr, Arg-Arg-Leu-His-Tyr, Arg-Arg-Leu-Asn-Tyr, Ser-Ser-Lys-Leu-Gln 및 Arg-Ala-Ser-Tyr-Gln으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 프로드러그.
제1항 내지 제9항 중 한 항에 있어서, 상기 Y는 p-아미노벤질옥시카보닐(PABC), N-메틸아미노 에틸렌 또는 대칭 N, N'-디메틸디아미노 에틸렌, 트리메틸 락 고리화 링커 및 비닐오로구스 벤질 제거 링커로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 프로드러그.
제1항 내지 제10항 중 한 항에 있어서, 상기 세포증식 억제제는 N-니트로소레아, 엔쓰라시클린, 알킬화제, 안티메타볼리트, 엽산 길항제, 캠프토쎄신, 빈카 알칼로이드, 탁산, 칼리케아마이신, 미토마이신 C 및 cis-구성 플라티늄(Ⅱ) 합성물로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 프로드러그.
다음의 공식 중 하나를 가지는 제1항 내지 제10항 중 한 항에 따른 프로드러그:

(=EMC-Arg-Ser-Ser-Tyr-Tyr-Ser-Leu-PABC-독소루비신),

(Cys-EMC-Arg-Ser-Ser-Tyr-Tyr-Ser-Leu-PABC-독소루비신), 또는

(=EMC-Arg-Ser-Ser-Tyr-Tyr-Ser-Leu-PABC-파클리탁셀)
다음 공식 II를 가지는 화합물을 다음 공식 III을 가지는 화합물로 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제12항 중 한 항에 정의된 것과 같은 화합물의 제조방법.
R-A_n (II)
Ser-Leu-Y-Z (III)
상기의 공식에서 R, A, n, Y 및 Z는 제1항 내지 제12항 중 하나에서 정의된 것과 같다.
프로드러그, 및 선택적으로 약학적으로 수용 가능한 담체 및/또는 희석제 및/또는 보조제로서 제1항 내지 제12항 중 한 항의 프로드러그를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제14항에 있어서, 상기 약학 조성물은 암 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.