TW202016137A - 治療性抗體 - Google Patents

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TW202016137A
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antibody
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amino acid
acid sequence
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張東玄
楊玫君
劉亮吟
丁志岳
張淑燕
陳彥穎
林俞妤
唐述綸
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台灣醣聯生技醫藥股份有限公司
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Abstract

於此係揭示一種人源化抗體、其抗原結合片段，以及抗體共軛物，其可特異性地結合至某些雙觸角Lewis抗原，該抗原係於多種癌症中表現。本發明揭示可用於靶向抗原-表現細胞之抗體，用於治療或偵測疾病，包括各種癌症。亦提供用於製造所揭示之抗體與其抗原結合片段之聚核苷酸、載體與宿主細胞。亦提供該醫藥組成物、治療與偵測方法，以及該抗體、抗原結合片段、抗體共軛物與組成物之用途。

Description

治療性抗體 序列表之相關敘述
與本申請案相關之序列表係以紙本之文件形式提供，在此併入本案以作為參考資料。包含序列表的檔案名稱為400100_401TW_SEQUENCE_LISTING.txt。該檔案為43.3KB，建立於2019年5月29日，並正以電子檔方式提申。
發明領域
本發明實施例係相關於抗體，以及其抗原結合片段，其可特異性地結合至某些Lewis抗原，並相關於製造與使用其之方法。亦提供與本文揭示之抗體，其抗原結合片段相關之組成物、聚核苷酸、載體、融合蛋白與宿主細胞。在某些實施例中，本發明抗體及其抗原結合片段可特異性地結合至雙觸角(biantennary)LeB/LeB、LeY/LeY、LeB/LeY與LeY/LeB抗原，並可用於治療或偵測特徵為表現此類抗原的疾病，如癌症。
發明背景
免疫療法為目前治療各種疾病如各種癌症 之新興模式。例如，自1990年代晚期便開始證實具抗腫瘤活性之單株抗體(mAbs)的臨床療效(請見如Topalian et al.,J.Clin.Oncol.29(36)：4828-4836(2011))，且有數種重要癌症藥物為單株抗體(如利妥昔單抗(rituximab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)與貝伐單抗(bevacizumab))。
以抗體為基礎的療法可特異性地靶向表現抗原的細胞，如腫瘤細胞，並可經由數種方式發揮細胞毒殺活性，包括藉由引發抗體-依賴性細胞毒性(ADCC)、補體介導的細胞毒性(CDC)，以及T-細胞介導的細胞毒性。其他方法涉及使用抗體做為載體，以選擇性傳遞如細胞毒性或為抗細胞增生試劑，以殺死標靶細胞，及/或抑制此類細胞的生長或轉移擴散。
單株抗體療法的相關標準包括如抗體特異性辨識與結合至希望抗原之能力，而非混雜地結合至一或多個其他潛在的表位，如健康細胞所表現的蛋白質或聚醣。此外，該抗體不應對患者具免疫原性。在此方面，特異於人類疾病抗原的抗體通常產生於非人類宿主中，如小鼠與兔子，且可能具有如宿主物種之胺基酸序列及/或醣類模體，其可能對於人類患者具免疫原性。因此，使用於治療之較佳抗體應缺乏或具有最小潛在免疫原特性。亦必須考慮到標靶抗原的特徵。較佳地，該抗原係於特定疾病狀態下(如癌症)有選擇性表現或高度過度表現，使得該抗體-介導療法不會對於健康組織有不希望有害的"在標靶上但在腫瘤外(on-target,off-tumor)"作用。
異常醣化現象(如醣蛋白與醣脂質之過度表現或錯誤表現)為數種癌症的共有特徵(請見如Blanas et al.,Front.Oncol.8：39(2018))。不希望受到理論束縛，異常醣化現象可影響多種導致癌症進展與轉移之細胞過程(如細胞生長與代謝、血管生成、細胞-基質交互作用與細胞-細胞附著現象)。在癌症中異常表現的示範性醣類抗原包括第I型與第II型Lewis抗原，其為Lewis抗原系統中的末端(於非還原端)海藻醣化(fucosylated)之醣類表位。第I型與第II型Lewis抗原包括結構上相關之H1、H2，以及Lewis A、B、X與Y抗原，所有皆共享三個單醣單元：一(還原)末端乙醯基醣胺(GlcNac)；半乳醣(Gal)；以及海藻醣(Fuc)。第I型Lewis抗原與第II型不同之處在於其乳醣胺核心鏈之醣鍵特性(Galβ1→3GlcNac：第I型；Galβ1→4GlcNac：第II型)，並存在各種結構(如直線或分支，具有一個、二個或更多個包含抗原模體的觸角)。Lewis抗原在健康成人組織(如消化和生殖上皮細胞)中具有中度表現位準，但在數種實體癌的細胞表面上會過度表現，如肺癌、乳癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、胰臟癌和前列腺癌，也與急性脊髓白血病、急性淋巴細胞白血病和非霍奇金淋巴瘤。
目前已知一些靶向Lewis抗原以治療癌症的療法，包括不連續的Seattle Genetics/Bristol Meyers Squibb抗體-藥物共軛物“cBR96-Dox”，其傳遞多柔比星(doxorubicin)至表現LeY抗原的腫瘤細胞，使用BR96 單株抗體(Hellstrom et al.,Cancer Res.50(7)：2183-2190(1990))作為載體分子。清楚地，目前技術上仍需要其他治療癌症(如表現Lewis抗原作為腫瘤相關抗原或腫瘤特異性抗原的癌症)的療法。本發明實施例可解決此種需求，並提供其他相關優點。
發明概要
依據本發明之某些實施例，係提供一種經分離之抗體，其包含一免疫球蛋白重鏈，具有如SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列，以及一免疫球蛋白輕鏈，具有如SEQ ID NO：11所示之胺基酸序列。
依據本發明之某些實施例，係提供一種經分離之抗體或其抗原結合片段，包含：一免疫球蛋白重鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：35所示之胺基酸序列；以及一免疫球蛋白輕鏈可變區其包含如SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列，其中該抗體或其抗原結合片段可特異性地結合： 至一雙觸角LeB/LeB抗原，其包含Fuc4(Galβ1→3GlcNAc)2 [I]或[Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc]2 [II]，至一雙觸角LeY/LeY抗原，其包含Fuc4(Galβ1→4GlcNAc)2 [III]或[Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc]2 [IV]， 至一雙觸角LeB/LeY抗原，其包含Fuc2(Galβ1→3GlcNAc)[Fuc2(Galβ1→4GlcNAc)] [V]，或[Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc] [VI]，以及至一雙觸角LeY/LeB抗原，其包含Fuc2(Galβ1-4GlcNAc)[Fuc2(Galβ1-3GlcNAc)] [VII]或[Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc] [VIII]，以及其中該抗體或其抗原結合片段並未特異性地結合至一單觸角Lex抗原，其包含Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc[IX]，或至一雙觸角Lex抗原，其包含[Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X]，或至一單觸角LeA抗原，其包含Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc[XI]，或至一單觸角第2型H抗原，其包含Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc[XII]，或至一雙觸角第2型H抗原，其包含(Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII]，或至一單觸角第1型H抗原，其包含Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc[XIV]。
在某些實施例中，係提供一種經分離抗體或其抗原結合片段，包含：(a)一免疫球蛋白重鏈可變區，其包含一重鏈互補決定區1(VH CDR1)，其包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列；一重鏈互補決定區2(VH CDR2)，其包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列；一重鏈互補決定區3(VH CDR3)，其包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列；以及 (b)一免疫球蛋白輕鏈可變區，其包含一輕鏈互補決定區1(VL CDR1)，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；一輕鏈互補決定區2(VL CDR2)，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列；以及一輕鏈互補決定區3(VL CDR3)，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；其中該抗體或其抗原結合片段可特異性地結合：至一雙觸角LeB/LeB抗原，其包含Fuc4(Galβ1→3GlcNAc)2 [I]或[Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc]2 [II]，至一雙觸角LeY/LeY抗原，其包含Fuc4(Galβ1→4GlcNAc)2 [III]或[Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc]2 [IV]，至一雙觸角LeB/LeY抗原，其包含Fuc2(Galβ1→3GlcNAc)[Fuc2(Galβ1→4GlcNAc)] [V]，或[Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc] [VI]，以及至一雙觸角LeY/LeB抗原，其包含Fuc2(Galβ1-4GlcNAc)[Fuc2(Galβ1-3GlcNAc)] [VII]或[Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc] [VIII]，以及其中該抗體或其抗原結合片段並未特異性地結合至一單觸角Lex抗原，其包含Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc[IX]，或至一雙觸角Lex 抗原，其包含[Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X]，或至一單觸角LeA抗原，其包含Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc[XI]，或至一單觸角第2型H抗原，其包含Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc[XII]，或至一雙觸角第2型H抗原，其包含(Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII]，或至一單觸角第1型H抗原，其包含Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc[XIV]。
在此述某些實施例中，經分離抗體為一單株抗體。在某些實施例中，經分離抗體或其抗原結合片段為一人源化抗體。在某些實施例中，經分離之抗體或其抗原結合片段選自於一Fab片段、一F(ab’)2片段、一Fv片段、一單鏈Fv(ScFv)抗體，以及一雙抗體(diabody)。
於此亦提供實施例，其中經分離的抗體或其抗原結合片段，包含一免疫球蛋白重鏈可變區，其包含具有與胺基酸序列SEQ ID NO：35至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%等同度之一胺基酸序列；以及一免疫球蛋白輕鏈可變區，其包含具有與胺基酸序列SEQ ID NO：5至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%等同度之一胺基酸序列，其中該抗體或其抗原結合片段可特異性地結合：至一雙觸角LeB/LeB抗原，其包含Fuc4(Galβ1→3GlcNAc)2 [I]或[Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc]2 [II]， 至一雙觸角LeY/LeY抗原，其包含Fuc4(Galβ1→4GlcNAc)2 [III]或[Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc]2 [IV]，至一雙觸角LeB/LeY抗原，其包含Fuc2(Galβ1→3GlcNAc)[Fuc2(Galβ1→4GlcNAc)] [V]，或[Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc] [VI]，以及至一雙觸角LeY/LeB抗原，其包含Fuc2(Galβ1-4GlcNAc)[Fuc2(Galβ1-3GlcNAc)] [VII]或[Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc] [VIII]，以及其中該抗體或其抗原結合片段並未特異性地結合至一單觸角Lex抗原，其包含Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc[IX]，或至一雙觸角Lex抗原，其包含[Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X]，或至一單觸角LeA抗原，其包含Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc[XI]，或至一單觸角第2型H抗原，其包含Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc[XII]，或至一雙觸角第2型H抗原，其包含(Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII]，或至一單觸角第1型H抗原，其包含Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc[XIV]。
在某些實施例中，本發明提供一種經分離抗體或其抗原結合片段，包含(a)一免疫球蛋白重鏈可變區，其包含一重鏈互補決定區1(VH CDR1)，其包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列，或具有與胺基酸序列SEQ ID NO：2至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%等同度之一胺基酸序列；一重鏈互補決定區2(VH CDR2)，其包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列，或具有與胺基酸序列SEQ ID NO：3至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%等同度之一胺基酸序列；一重鏈互補決定區3(VH CDR3)，其包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列，或具有與胺基酸序列SEQ ID NO：4至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%等同度之一胺基酸序列；以及(b)一免疫球蛋白輕鏈可變區，其包含一輕鏈互補決定區1(VL CDR1)，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列，或具有與胺基酸序列SEQ ID NO：6至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%等同度之一胺基酸序列；一輕鏈互補決定區2(VL CDR2)，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列，或具有與胺基酸序列SEQ ID NO：7至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%等同度之一胺基酸序列；以及一輕鏈互補決定區3(VL CDR3)，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列，或具有與胺基酸序列SEQ ID NO：8至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%等同度之一胺基酸序列。
在其他實施例中，係提供一種經分離抗體或其抗原結合片段，包含以下之(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)，或(vi)或其任一組合：(i)一VH CDR1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：2之一變異物，其中該變異物係由位置33 之Y→A取代所組成，依據Kabat編號法；(ii)一VH CDR3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：4之一變異物，其中該變異物係由位置104之Y→A取代所組成，依據Kabat編號法；(iii)一VH CDR3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：4之一變異物，其中該變異物係由位置106之H→A取代所組成，依據Kabat編號法；(iv)一VL CDR1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：6之一變異物，其中該變異物係由位置30之Y→A取代所組成，依據Kabat編號法；(v)一VL CDR2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：7之一變異物，其中該變異物係由位置50之G→A取代所組成，依據Kabat編號法；或(vi)一VL CDR3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：8之一變異物，其中該變異物係由位置93之T→S取代所組成，依據Kabat編號法。
在某些其他實施例中，係提供一種經分離的抗體或其抗原結合片段，其包含一如此述之互補決定區(CDRs)(即分別與SEQ ID NOs：2、3、4、6、7與8具有至少90%等同度之CDRs，包括具有此述胺基酸取代之CDR變異物)，並包含一免疫球蛋白重鏈可變區，包含或由具有與胺基酸序列SEQ ID NO：35至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%等同度之一胺基酸序列組成；以及一免疫球蛋白輕鏈可變區，其包含或由具有與胺基酸序列SEQ ID NO：5至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%等同度之一胺基酸序列。
在此述之任一實施例中，經分離之抗體或其 抗原結合片段，或抗體-藥物共軛物包含本發明之一抗體或其抗原結合片段，可具有降低(例如，使用本領域公認的方法確定的統計學顯著性降低)與單觸角Lewis B或單觸角Lewis Y抗原之結合(包括，在某些實施例中，無結合)，與本文之“BBC”抗體相較，包含一具有如SEQ ID NO：27之胺基酸序列之VL結構域，以及一具有如SEQ ID NO：28之胺基酸序列之VH結構域。單價Lewis B為血型組抗原，其於正常人類組織中表現；因此，本發明之抗體、其抗原結合片段與抗體藥物共軛物具有增進之癌症抗原特異性，並降低與正常人類組織中表現之單觸角Lewis B抗原之結合，與BBC抗體相較。在某些實施例中，本文之抗體、其抗原結合片段或抗體藥物共軛物，在與此述式[I]-[VIII]細胞表面表現抗原之一或多者的結合上，具有1-倍、2-倍、3-倍、5-倍、6-倍、7-倍、8-倍或更大幅度的增加，與單觸角Lewis B抗原之結合相較。
在某些實施例中，一抗體、其抗原結合片段或抗體藥物共軛物係結合至一單觸角Lewis B抗原，具有BR96之親和力的1/10、1/9、1/8、1/7、1/6、1/5、1/4、1/3或1/2，如ELISA結合試驗中所測量的。
在本文描述的任何實施例中，本發明之經分離抗體或其抗原結合片段，或包含抗體或其抗原結合片段的抗體-藥物共軛物，係結合至不同於抗體BR96辨識出之單觸角LeY抗原的抗原，且相較於BR96，可根據非限制性理論允許在治療應用中更安全和更具特異性地靶向癌細 胞。在本文描述的任何實施例中，本發明之經分離抗體或其抗原結合片段，或包含抗體或其抗原結合片段的抗體-藥物共軛物，係結合至表現抗原的癌細胞，有效且穩定地內化到此類細胞的溶酶體中，在非人類靈長類動物模型中，在治療劑量下呈現安全耐受。
在另一態樣中，本發明係提供經分離之聚核苷酸，其編碼抗體或其抗原結合片段。在某些實施例中，該聚核苷酸經密碼子最佳化，用於宿主細胞表現。在某些實施例中，係提供重組載體，其包含編碼本發明抗體或其抗原結合片段之聚核苷酸。在某些實施例中，一重組載體包含一表現控制序列，其操作性地連結至編碼該抗體或其抗原結合片段之聚核苷酸。在一特定實施例中，一重組載體為一表現載體，其中該表現控制序列包含一啟動子。
在另一實施例中，係提供一種宿主細胞，包含本發明之重組即/或表現載體。在其他實施例中，係提供一種製造一抗體或其抗原結合片段之方法，該抗體或其抗原結合片段可特異性地結合：至一雙觸角LeB/LeB抗原，其包含Fuc4(Galβ1→3GlcNAc)2 [I]或[Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc]2 [II]，至一雙觸角LeY/LeY抗原，其包含Fuc4(Galβ1→4GlcNAc)2 [III]或[Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc]2 [IV]， 至一雙觸角LeB/LeY抗原，其包含Fuc2(Galβ1→3GlcNAc)[Fuc2(Galβ1→4GlcNAc)] [V]，或[Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc] [VI]，以及至一雙觸角LeY/LeB抗原，其包含Fuc2(Galβ1-4GlcNAc)[Fuc2(Galβ1-3GlcNAc)] [VII]或[Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc] [VIII]，以及其中該抗體或其抗原結合片段並未特異性地結合至一單觸角Lex抗原，其包含Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc[IX]，或結合至一雙觸角Lex抗原，其包含[Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X]，或結合至一單觸角LeA抗原，其包含Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc[XI]，或結合至一單觸角第2型H抗原，其包含Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc[XII]，或結合至一雙觸角第2型H抗原，其包含(Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII]，或結合至一單觸角第1型H抗原，其包含Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc[XIV]，其中該方法包含：培養此述之宿主細胞，在足以使宿主細胞表現編碼該抗體或其抗原結合片段的聚核苷酸的條件與時間下，因而得到一包含該抗體或其抗原結合片段之培養物；以及自該培養物回收該抗體或其抗原結合片段。
在另一實施例中，係提供一種抗體共軛物， 包含本發明之經分離抗體或其抗原結合片段；以及連結於其上的有效載入(payload)分子。在某些實施例中，該有效載入分子係共價性地以一聯結子與該抗體或其抗原結合片段連結。在某些實施例中，該聯結子係選自於一可切割聯結子與一不可切割聯結子。在某些實施例中，該可切割聯結子為一蛋白酶-敏感型聯結子、pH-敏感型聯結子，或穀胱甘肽-敏感型聯結子。在某些實施例中，該可切割聯結子為包含纈胺酸-瓜胺酸二胜肽的蛋白酶-敏感性聯結子。在一些實施例中，該聯結子包含一馬來醯亞胺基團。在某些實施例中，本發明之抗體或抗其原結合片段包含在鉸鏈區之一還原之雙硫橋聯，且該還原之雙硫橋聯係共軛至馬來醯亞胺基上。本發明亦提供實施例，其中該聯結子更包含一自拆分基團，例如對胺基苯甲醇(PABC)。在某些實施例中，抗體共軛物包含本發明之抗體或抗原結合片段，以及一有效載入分子，其選自於一治療試劑與一可偵測指示劑。在某些實施例中，該有效載入分子為一治療試劑，選自於微管蛋白靶向之抗有絲分裂劑、胜肽-基礎毒素、吡咯並苯並二氮雜(PBD)二聚體、抗生素、嘧啶合成抑制劑、抗代謝物、DNA烷化劑，以及拓撲異構酶抑制劑。在某些實施例中，該有效載入分子選自於美登醇(mayntansinoid)、奧瑞史他汀(auristatin)、多柔比星(doxorubicin)、卡奇黴素(calicheamicin)、PBD二聚體、單甲基奧瑞史他汀E(monomethylauristatin E，MMAE)，以及單甲基奧瑞史他汀F(monomethylauristatin F， MMAF)。在某些其他實施例中，該有效載入分子為可偵測之指示劑。在其他實施例中，該可偵測指示劑選自於放射性核素、染料、放射性金屬、螢光部分、MRI對比劑、微泡、碳奈米管、金顆粒、氟去氧葡萄醣、酵素、發色團，以及不透放射線的標記物。在特定實施例中，該可偵測指示劑為放射性核素，選自於68Ga、64Cu、86Y、89Zr、124I、99mTc、123I、111In、177Lu、131I、76Br、78Zr、18F與124T。在某些實施例中，該抗體共軛物包含一放射性核素螯合劑，選自於經馬來醯亞胺標記的DOTA、N-羥基琥珀醯亞胺-DOTA，以及去鐵胺(DFO)。
於此亦提供一種醫藥組成物，在一些實施例中，包含此述之經分離抗體、抗原結合片段或抗體共軛物；以及一醫藥載體。
在某些實施例中，本發明亦提供治療或偵測方法，其包含使用本發明抗體、抗原結合片段，即/或抗體共軛物。在一些實施例中，係提供治療或偵測癌症之方法，其中該方法包含投予此述之醫藥組成物至有需要之個體。在某些實施例中，該個體具有或懷疑患有癌症，該癌症選自於胃癌、結腸癌、乳癌、肺癌、淋巴癌、肝癌、卵巢癌、胰臟前列腺癌、子宮癌，以及鱗狀細胞癌。在某些實施例中，該癌症選自於胃腺癌、黏液性胃腺癌、未分化的胃腺癌、戒環細胞胃癌、結腸腺癌、侵襲性乳導管癌、肝細胞癌、肺腺癌、鱗狀細胞癌、轉移性淋巴結腺癌、黏液性卵巢腺癌、胰導管腺癌、胰乳頭狀腺癌、前列腺腺癌和子宮 內膜樣癌。在某些實施例中，係提供一種方法，其包含投予本發明之組成物(如包含此述之抗體或其抗原結合片段)至一個體中，藉由途徑選自於靜脈注射、腸胃外、胃內、胸膜內、肺內、直腸內、皮內、腹膜內、腫瘤內、皮下、口服、局部、經皮、腦池內、鞘內、鼻內和肌肉注射。在本發明其他實施例中，該方法係用於偵測或治療癌症，該個體正在接受或已接受：(a)免疫抑制療法；(b)刺激性免疫檢查點分子；(c)放射治療；(d)化療；(e)細胞免疫療法；或(f)(a)-(e)的任一組合。
請參考以下詳細描述和附圖，本發明的這些和其他態樣與實施例將更臻清楚。本文揭示的所有參考文獻在此完整併入本案以作為參考資料，如同每一參考文獻單獨地併入。
圖1顯示本發明"BBC"抗體重鏈可變區(SEQ ID NO：28)之複數個胺基酸序列比對(1-8；分別對應於SEQ ID NOs：44-51)。第3行(用虛線框出)顯示人類接受子序列，其選出用於CDR嫁接。在該圖的中央部分，單框出的胺基酸(V/I/M)為人類受器序列中罕見的甲硫胺酸；此殘基在人源化的過程中經更常見的異白胺酸取代。
圖2A顯示IMH2/BBC抗體的輕鏈(LC)可變區序列(SEQ ID NO：27)與人源化變異物：hBBC.8(SEQ ID NO：31)；hBBC.9與hBBC.9.1(SEQ ID NO：33)；以及hBBC.10、hBBC.10.1與hBBC.10.1FQ(SEQ ID NO： 5)之胺基酸序列比對。hBBC CDR序列以框線標出(虛線)，人類接受子CDR序列則畫底線標出。在該圖之底部，該二單獨框出的胺基酸殘基(R/G與Y/F)顯示讀框區域序列的不同處。圖2B顯示BBC、hBBC.8、具R66G取代突變的hBBC.8、hBBC.9，與hBBC.10抗體的相對活性，在AGS細胞結合試驗中。具F71Y突變之hBBC-LC代表hBBC.9。具F71Y與R66G之hBBC-LC代表hBBC.10。圖2C-2E顯示進一步於AGS細胞中產生的變異抗體(2C)，以及於AGS細胞中產生的(2D、2E)之結合特異性，與合成性單觸角LeB抗原相較。
圖3提供hBBC.10.1抗體(SEQ ID NO：38)、hBBC.10.1FQ抗體(SEQ ID NO：39)，以及兩個FDA-核准之人源化治療性抗體(參考物1與參考物2)(分別為SEQ ID NOs：40與41)與重鏈框架3區域的序列比對。
圖4A與4B顯示COLO 205 GSL細胞之Fuc4(LacNAc)3Lac，於m/z 2521之未結合(4A)及與BBC-結合(沖提出)分液(4B)的MALDI-MSMS定序。在圖4A-7B中，聚醣如下所述：空心圓=Gal；實心圓=Glc；實心方塊=GlcNac；封閉三角形=Fuc。同樣標示用於圖8A-8B，不同處在於實心圓=Man。
圖5A與5B分別顯示(A)NCI-N87與(B)SW1116 GSL細胞之BBC-結合(底部)與未結合(上部)聚醣之MALDI-MS圖。
圖6A與6B顯示NCI-N87(6A)與SW1116 GSL細胞(6B)之Fuc4(LacNAc)3Lac，於m/z 2521之BBC-結合(沖提出)分液之MALDI-MSMS定序。
圖7A與7B提供NCI-N87 GSL之Fuc4(LacNAc)3Lac與Fuc6(LacNAc)5Lac，於m/z 2970(7A)與m/z 3767(7B)處的BBC-結合(沖提出)的分液之MALDI-MSMS定序。
圖8A與8B顯示BBC-富集之AGS N-聚醣之MALDI-Q/TOF MS/MS定序。
圖9A與9B分別顯示聚醣抗原(A)LeY-五碳醣與(B)LeB-五碳醣與hBBC.10.1抗體之ITC滴定圖。
圖10A-10C顯示額外聚醣抗原：(A)LeY/LeY-ASGA；(B)LeY/LeY-I抗原；(C)LeY/LeB-I抗原，與hBBC.10.1抗體之ITC滴定圖。
圖11A-11F顯示其他聚醣抗原：(A)LeX-四醣；(B)LeA-四醣；(C)第I型H-抗原；(D)第II型H-抗原；(E)H-ASGP；(F)Lex/Lex-ASGP，與hBBC.10.1抗體之ITC滴定圖。
圖12A-12C提供聚醣抗原：(A)LeY-五碳醣；(B)LeY/LeY-I抗原，以及(C)LeY/LeY-ASGP，與參考抗體"BR96"之ITC滴定圖。
圖13A與13B顯示hBBC.10.1與BR96對抗下列聚醣抗原之表面等離子體共振(SPR)感測圖：(A)LeY-Gal與LeY/LeY-ASGA；(B)LeB-Gal與LeB/LeB-ASGA。
圖14A與14B顯示於指定濃度下，hBBC.10.1結合至經包覆之Lewis抗原：(A)LeY/LeY-ASGA-生物素；(B)LeY-Gal-生物素之間接ELISA結果。
圖15顯示於指定濃度下，hBBC.10.1結合至經包覆之Lewis抗原：(LeB/LeB-ASGA vs LeY/LeY-ASGA and LeB-Gal)之間接ELISA結果。
圖16A顯示hBBC.10.1結合至聚醣抗原，包括LeY-Gal-sp3-生物素(LeY-Gal)、LeB-Gal-LC-生物素(LeB-Gal)、LeY/LeY-ASGA-生物素(LeY/LeY-ASGA)、LeB/LeB-ASGA-生物素(LeB/LeB-ASGA)、3-LeY/6-LeB-ASGA-生物素(LeY/LeB-ASGA)，以及3-LeB/6-LeY-ASGA-生物素(LeB/LeY-ASGA)之抗原-結合ELISA結果。所有抗原的包覆量皆相同(1.87pmole))。圖16B與16C分別顯示抗原-結合ELISA實驗之結果，與(16B)BBC抗體與(16C)hBBC.10.1抗體與抗原之親和性與選擇性相較。
圖17提供螢光顯微鏡圖像，顯示AGS胃癌細胞對於hBBC.10.1的內吞作用。左圖：藉由與Alexa488共軛的抗人類IgG(綠色通道)染色的hBBC.10.1。右圖：以環肽羅丹明(phalloidin rhodamine)(紅色通道)標記的F-肌動蛋白染色覆蓋。螢光素和羅丹明共分佈的區域在顯微鏡下顯示為黃色，並且在合併圖像中顯示為共定位螢光信號。
圖18提供了螢光顯微鏡圖像，其顯示在AGS胃癌細胞中hBBC.10.1的溶酶體定位。左圖：藉由Alexa488共軛的抗人類IgG(綠色通道)染色的hBBC.10.1。中圖：以抗Lamp-1抗體標記，之後以抗兔IgG標記(紅色通道)的溶酶體。右圖：合併影像。
圖19A與19B顯示hBBC.10.1之抗腫瘤活性，於體內異種移植實驗中，其中免疫缺陷SCID小鼠投予(A)人類DLD-1或(B)COLO 205腫瘤細胞，之後一旦發展出腫瘤便投予抗體。
圖20A與20B分別顯示於體內異種移植實驗中，各種濃度之(A)hBBC.10.1與(B)BR96之抗腫瘤活性，其中免疫缺陷SCID小鼠投予人類AGS胃癌腺癌細胞，之後一旦發展出腫瘤便投予抗體。圖20C與20D顯示於體內異種移植實驗中，本發明Hbbc抗體之抗腫瘤活性。
圖21顯示AGS腫瘤直接被hBBC.10.1("hBBC")與BR96毒殺，在各種抗體濃度下。該毒殺係以標靶細胞被碘化丙啶(PI)染色的百分比測量。
圖22顯示於體內異種移植實驗中，hBBC.10.1("hBBC")與BR96的抗腫瘤活性，其中免疫缺陷SCID小鼠係投予人類TSGH 9201胃癌細胞，之後一旦發展出腫瘤便投予抗體。
圖23顯示於體內異種移植實驗中，各種濃度之hBBC.10.1("hBBC")之抗腫瘤活性，其中免疫缺陷SCID小鼠係投予人類COLO 201結腸直腸腺癌細胞，之後 一旦發展出腫瘤便投予抗體。
圖24A與24B顯示於體內異種移植實驗中，(A)hBBC.10.1("hBBC")與(B)BR96之抗腫瘤活性，其中免疫缺陷SCID小鼠係投予人類COLO 201結腸直腸腺癌細胞，之後一旦發展出腫瘤便投予抗體。
序列簡要描述
SEQ ID NO：1為抗體hBBC.10.1FQ之重鏈可變(VH)結構域之胺基酸序列：
Figure 108119035-A0202-12-0021-53
SEQ ID NO：2為抗體IMH2/BBC、抗體hBBC.8、抗體hBBC.9、抗體hBBC.9.1、抗體hBBC.10、抗體hBBC.10.1，與抗體hBBC.10.1FQ之重鏈互補決定區1(VH CDR1)之胺基酸序列：SGYTWH。
SEQ ID NO：3為抗體hBBC.9.1、抗體hBBC.10.1，與抗體hBBC.10.1FQ之VH CDR2之胺基酸序列：YIHYTGNTKYSPSLKS。
SEQ ID NO：4為抗體hBBC.10.1，與抗體hBBC.10.1FQ之VH CDR3之胺基酸序列： EALRGYDAGFWFTY。
SEQ ID NO：5為抗體hBBC.10、抗體hBBC.10.1，與抗體hBBC.10.1FQ之輕鏈可變(VL)結構域之胺基酸序列：
Figure 108119035-A0202-12-0022-54
SEQ ID NO：6為抗體IMH2/BBC、抗體hBBC.8、抗體hBBC.9、抗體hBBC.9.1、抗體hBBC.10、抗體hBBC.10.1，與抗體hBBC.10.1FQ之輕鏈互補決定區1(VL CDR1)之胺基酸序列：TASEDIYNRLT。
SEQ ID NO：7為抗體IMH2/BBC、抗體hBBC.8、抗體hBBC.9、抗體hBBC.9.1、抗體hBBC.10、抗體hBBC.10.1,and抗體hBBC.10.1FQ之VL CDR2之胺基酸序列：GATSLDT。
SEQ ID NO：8為抗體IMH2/BBC、抗體hBBC.8、抗體hBBC.9、抗體hBBC.9.1、抗體hBBC.10、抗體hBBC.10.1，與抗體hBBC.10.1FQ之VL CDR3之胺基酸序列：QQYWTTPWT。
SEQ ID NO：9為衍生自抗體hBBC.10.1之 單鏈片段可變區(scFv)，為[VL-VH]方向，之胺基酸序列：
Figure 108119035-A0202-12-0023-55
Figure 108119035-A0202-12-0023-56
，其中"x"可為序列GGGGS之1或2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多重複，於括號中顯示。
SEQ ID NO：10為抗體hBBC.10.1之全長重鏈(HC)之胺基酸序列：
Figure 108119035-A0202-12-0023-57
Figure 108119035-A0202-12-0024-58
SEQ ID NO：11為抗體hBBC.10、抗體hBBC.10.1，與抗體hBBC.10.1FQ之全長輕鏈(LC)之胺基酸序列：
Figure 108119035-A0202-12-0024-168
SEQ ID NO：12為編碼抗體hBBC.10.1之重鏈可變區(VH)結構域之核苷酸序列：
Figure 108119035-A0202-12-0024-60
SEQ ID NO：13為編碼抗體IMH2/BBC、抗體hBBC.8、抗體hBBC.9、抗體hBBC.9.1、抗體 hBBC.10、hBBC.10.1，與抗體hBBC.10.1FQ之重鏈互補決定區1(VH CDR1)之核苷酸序列：agcggctatacctggcat。
SEQ ID NO：14為編碼抗體hBBC.9.1、抗體hBBC.10，與抗體hBBC.10.1FQ之VH CDR2之核苷酸序列：tatattcattataccggcaacaccaaatatagcccgagcctgaaaagc。
SEQ ID NO：15為編碼抗體hBBC.10.1與抗體hBBC.10.1FQ之VH CDR3之核苷酸序列：gaagcgctgcgcggctatgatgctggcttctggtttacctat。
SEQ ID NO：16編碼抗體hBBC.10、抗體hBBC.10.1，與抗體hBBC.10.1FQ之輕鏈可變區(VL)結構域之核苷酸序列：
Figure 108119035-A0202-12-0025-61
SEQ ID NO：17為編碼抗體IMH2/BBC、抗體hBBC.8、抗體hBBC.9、抗體hBBC.9.1、抗體hBBC.10、抗體hBBC.10.1，與抗體hBBC.10.1FQ之輕鏈 互補決定區1(VL CDR1)之核苷酸序列：accgcgagcgaagatatttataaccgcctgacc。
SEQ ID NO：18為編碼抗體IMH2/BBC、抗體hBBC.8、抗體hBBC.9、抗體hBBC.9.1、抗體hBBC.10、抗體hBBC.10.1，與抗體hBBC.10.1FQ之VL CDR2之核苷酸序列：ggcgcgaccagcctggatacc。
SEQ ID NO：19為編碼抗體IMH2/BBC、抗體hBBC.8、抗體hBBC.9、抗體hBBC.9.1、抗體hBBC.10、抗體hBBC.10.1，與抗體hBBC.10.1FQ之VL CDR3之核苷酸序列：cagcagtattggaccaccccgtggacc。
SEQ ID NO：20為編碼衍生自抗體hBBC.10.1之[VL-(L)-VH]方向之單鏈片段可變區(scFv)的核苷酸序列：
Figure 108119035-A0202-12-0026-62
Figure 108119035-A0202-12-0027-63
其中"x"可為序列ggtggaggcggttct之1或2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多重複，於括號中顯示。
SEQ ID NO：21為編碼抗體hBBC.10.1之全長重鏈(HC)之核苷酸序列：
Figure 108119035-A0202-12-0027-64
Figure 108119035-A0202-12-0028-65
SEQ ID NO：22為編碼抗體hBBC.10.1與抗體hBBC.10.1FQ之全長輕鏈(LC)之核苷酸序列：
Figure 108119035-A0202-12-0028-66
Figure 108119035-A0202-12-0029-67
SEQ ID NO：23為示範性間隔子(spacer)之胺基酸序列EGKSSGSGSESKVD。
SEQ ID NO：24為示範性間隔子(spacer)之胺基酸序列KESGSVSSEQLAQFRSLD。
SEQ ID NO：25為彈性聚聯結子(polylinker)之胺基酸序列GGGGS。
SEQ ID NO：26為彈性聚聯結子(polylinker)之胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS。
SEQ ID NO：27為抗體IMH2/BBC之VL結構域之胺基酸序列：
Figure 108119035-A0202-12-0029-68
SEQ ID NO：28為抗體IMH2/BBC之VH結構域之胺基酸序列：
Figure 108119035-A0202-12-0030-69
SEQ ID NO：29為人類接受子(acceptor)框架AAS01771.1之VL結構域之胺基酸序列：
Figure 108119035-A0202-12-0030-70
SEQ ID NO：30為人類接受子(acceptor)框架CAD89404.1之VH結構域之胺基酸序列：
Figure 108119035-A0202-12-0030-71
SEQ ID NO：31為抗體hBBC.8之VL結構域之胺基酸序列：
Figure 108119035-A0202-12-0030-72
SEQ ID NO：32為抗體hBBC.8、抗體hBBC.9，與抗體hBBC.10之VH結構域之胺基酸序列：
Figure 108119035-A0202-12-0031-73
SEQ ID NO：33為抗體hBBC.9與抗體hBBC.9.1之VL結構域之胺基酸序列：
Figure 108119035-A0202-12-0031-74
SEQ ID NO：34為抗體hBBC.9.1之VH結構域之胺基酸序列：
Figure 108119035-A0202-12-0031-75
SEQ ID NO：35為抗體hBBC.10.1之VH結構域之胺基酸序列：
Figure 108119035-A0202-12-0031-76
SEQ ID NO：36為衍生自抗體hBBC.10.1之[VH-VL]方向之單鏈片段可變區(scFv)之胺基酸序列：
Figure 108119035-A0202-12-0032-77
Figure 108119035-A0202-12-0032-78
，其中"x"可為序列GGGGS之1或2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多重複，於括號中顯示。
SEQ ID NO：37為編碼衍生自抗體hBBC.10.1之[VH-(L)-VL]方向之單鏈片段可變區(scFv)之核苷酸序列：
Figure 108119035-A0202-12-0032-79
Figure 108119035-A0202-12-0033-80
其中"x"可為序列ggtggaggcggttct之1或2、3、4、5、6、7、8、9、10次或更多重複，於括號中顯示。
這些與其他序列係提供於後附之序列表中。
發明詳述
本發明係相關於人源化抗體及其抗原結合片段，其能夠特異性結合在表現於多種癌症上的某些Lewis抗原。更具體地，如本文首度描述並在下面更詳細地呈現，本發明的嵌合性、人源化抗體，意外地與在癌細胞上表現的某些雙觸角LewisB/Y抗原精確地特異性結合，並具有強大的體內抗腫瘤活性。此外，本發明揭示之抗體與單觸角Lewis B抗原(其表現於健康組織上)的結合，具優勢地呈現令人驚訝地降低(如，以統計學上顯著的方式降低)，與包含具有如SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列之VL結構域，和具有如SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列之VH結構域的BBC抗體相較。於此揭示的抗體可結合至不同於抗體BR96識別出的單觸角LeY抗原之抗原，且不希望受理論束縛，本發明抗體可允許在治療應用中更安全和更特異性地靶向癌細胞，與BR96相較。此外，本發明的抗體和抗原結合片段亦與表現抗原的癌細胞結合，有效且穩定地內化至此類細胞的溶酶體中，且在非人類之靈長類動物模型中，於治療劑量下具安全耐受性。
根據某些較佳實施例並進一步根據非限制性理論，本發明揭示的抗體及其抗原結合片段之有益用途，係相關於一種診斷及/或治療癌症的方法，例如各種胃癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、胰臟癌和其他癌症。在此更詳細地揭示此類和相關的實施例。
多胜肽與蛋白質
術語“多胜肽”、“蛋白質”和“胜肽”和“醣蛋白”可互換使用，並指胺基酸的聚合物，不限於任一特定長度。該術語不排除修飾如荳蔻酸化(myristylation)、硫酸化、醣基化、磷酸化和信號序列的加入或刪去。術語“多胜肽”或“蛋白質”可指一條或多條胺基酸鏈，其中每條鏈包含經由胜肽鍵共價連接的胺基酸，且其中該多胜肽或蛋白質可包含複數個非共價性地及/或共價性地經由胜肽鍵連接在一起的鏈，具有天然蛋白質序列，即由天然存在且特別為非重組細胞，或經基因工程或重組細胞產生的蛋白質，並包含具有天然蛋白質的胺基酸序列的分子，或自天然序列中刪去、加入，及/或取代一或多個胺基酸的分子。因此，“多胜肽”或“蛋白質”可包含一個(稱為“單體”)或複數個(稱為“多聚體”)胺基酸鏈。術語“胜肽”、“多胜肽”和“蛋白質”特別涵蓋本發明抗體和其抗原結合片段，或自該抗體和其抗原結合片段刪去、加入，及/或取代一或多個胺基酸的序列。
使用於此，“胺基酸”是指天然存在的和合 成的胺基酸，以及以與天然存在的胺基酸類似方式作用的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸是由基因密碼子編碼的胺基酸，以及之後經修飾的胺基酸，例如羥脯胺酸、γ-羧基麩胺酸和O-磷酸絲胺酸。胺基酸類似物是指具有與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構的化合物，即與氫、羧基、胺基和R基團結合的α-碳，例如高絲胺酸、正亮胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。此類類似物具有經修飾的R基團(例如正亮胺酸)或經修飾的胜肽主鏈，但保留與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構。胺基酸模擬物是指具有與胺基酸的一般化學結構不同的結構，但其功能類似於天然存在的胺基酸之化學化合物。
如本文所用，“突變”是指分別與參考或野生型核酸分子或多胜肽分子相較，核酸分子或多胜肽分子序列中的變化。突變可導致序列中幾種不同類型的變化，包括核苷酸或胺基酸的取代、插入或刪去。
術語“多胜肽片段”是指一多胜肽(可以是單體或多聚體)，其具有天然存在或重組產生的多胜肽的胺基末端缺失、羧基末端缺失，及/或內部缺失或取代。如此所使用，“連續胺基酸”是指共價連接的胺基酸，其對應於揭示胺基酸序列的不間斷直線部分。在某些實施例中，多胜肽片段可包含至少5至約500個胺基酸長度的胺基酸鏈。應理解，在某些實施例中，該片段為至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350、400，或450個胺基酸長。
本文提及的術語“經分離的蛋白質”和“經分離的多胜肽”是指目標蛋白質或多胜肽(1)不含至少一些通常在自然界中發現的其他蛋白質或多胜肽，(2)基本上不含來自相同物種的其他蛋白質或多胜肽，例如來自相同物種的其他蛋白質或多胜肽，(3)由來自不同物種的細胞表現，(4)已與其天然結合的至少約50%的聚核苷酸、脂質、醣類或其他物質分離，(5)不與該“經分離的蛋白質”或“經分離的多胜肽”可能天然結合的蛋白質或多胜肽之一部分結合(經由共價或非共價相互作用)，(6)操作性地結合至(藉由共價或非共價性作用)在自然界中不與其結合之多胜肽，或(7)在自然界中不存在。此種經分離的蛋白質或多胜肽可由基因組DNA、cDNA、mRNA或其他RNA編碼，其可為合成來源的，根據數種用於人工胜肽和蛋白質合成的化學方法中的任一種，或其任一組合。在某些實施例中，該經分離的蛋白質或多胜肽實質上不含在其天然環境中發現、會干擾其使用(治療、診斷、預防、研究或其他)的蛋白質或多胜肽或其他污染物。
多胜肽可在蛋白質的N-末端包含一信號(或前導)序列，其共轉譯地或轉譯後引導蛋白質的轉移。多胜肽亦可框內融合或與共軛至一聯結子或其他序列，以便於 合成、純化或辨識出該多胜肽(例如，聚-His)，或增強該多胜肽與固體支持物的結合。如本文所用，“融合蛋白”或“融合多胜肽”是指在單鏈中具有至少兩個不同結構域的蛋白質，其中該結構域在天然蛋白質中並非結合在一起。編碼一融合蛋白的聚核苷酸可使用PCR、重組工程或類似技術構建，或者此類融合蛋白可經合成。融合蛋白可進一步含有其他成分，例如標籤、聯結子或轉導標記物。融合結構域多胜肽可在N-末端及/或C-末端與一多胜肽連接，並可包括作為非限制性範例的免疫球蛋白衍生的序列，例如Ig恆定區序列或其部分、親和標籤如His標籤(例如，六組胺酸或其他多組胺酸)、FLAGTM或myc或其他胜肽親和標籤，可偵測的多胜肽部分如綠色螢光蛋白(GFP)或其變異物(例如，黃色螢光蛋白(YFP)、藍色螢光蛋白(BFP)，其他水母發光蛋白或其衍生物等)，或其他可偵測多胜肽融合結構域、酵素或其部分，如穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)或其他已知的酵素偵測及/或報導子融合結構域，以及類似物，如本領域技術人員所熟知者。於此討論額外的可偵測部分(moieties)。
含半胱胺酸的胜肽可使用作為融合胜肽，其可連接到多胜肽的N-及/或C-端，例如本揭示的抗體或抗原結合片段，以允許這些多胜肽可立即組裝成二硫化物-交聯的二聚體、三聚體、四聚體或更高的多聚體，根據已建立的方法。例如，含有免疫球蛋白基因超級家族成員衍生序列的融合多胜肽，其包括能夠形成鏈間雙硫鍵橋的半 胱胺酸殘基，為眾所周知，也是用於改造S-S連接多聚體的其他策略(e.g.,Reiter et al.,1994 Prot.Eng.7：697；Zhu et al.,1997 Prot.Sci.6：781；Mabry et al.,2010 Mabs 2：20；Gao et al.,1999 Proc.Nat.Acad.Sci.USA 96：6025；Lim et al.,2010 Biotechnol.Bioeng.106：27)。亦考慮用於嫁接(grafting)胜肽序列的替代方法，該胜肽序列促進多聚體組裝成融合結構域，融合至期望的多胜肽上，如本文所述的抗體和抗原結合片段(如Fan et al.,2008 FASEB J.22：3795)。
多胜肽修飾可根據多種已知的方法，以生物合成及/或化學方式達成，且亦可包括共軛至載體蛋白(例如，鑰匙孔血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)或其他分子)，以及共價或非共價性地固定至固體支撐物上。根據某些實施例，考慮以化學或生物合成共軛至載體上，用於產生相對於本文所述抗體或其抗原結合片段的多價共軛物。
亦考慮具有可偵測指示劑部分(有時稱為報告子部分)例如螢光團(例如FITC、TRITC、Texas Red等)之可偵測標記。廣範圍之可偵測指示劑(包括比色指示劑)可依據特定目的選出，如Haugland,2005 The Handbook：A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies-Tenth Ed.,Invitrogen Corp./Molecular ProbesTM,Eugene,OR；in Mohr,1999 J.Mater.Chem.,9：2259-2264；in Suslick et al.,2004 Tetrahedron 60：11133-11138；以及美國專利號6,323,039中所述。(亦請見如Fluka Laboratory Products Catalog,2001 Fluka,Milwaukee,WI；and Sigma Life Sciences Research Catalog,2000,Sigma,St.Louis,MO)。可偵測指示劑可以是螢光指示劑、發光指示劑、磷光指示劑、放射線指示劑、染料、酵素、酵素受質、能量轉移分子或親和標記。
其他可用於本文考慮的某些實施例的可偵測指示劑包括親和試劑如抗體、凝集素、免疫球蛋白Fc受器蛋白(例如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A、蛋白G或其他Fc受器)、抗生物素蛋白(avidin)、生物素、其他配體、受器或反受器(counterreceptors)，或其類似物或模擬物，以及類似物質。對於此種親和方法學，用於免疫測量的試劑，例如經適當標記的抗體或凝集素，包括如具有放射性核素標記(例如，76Br、78Zr、18Fl)、具有螢光團、具有親和標記、具有生物素或生物素模擬序列，或製備為抗體-酵素共軛物者(請見如Weir,D.M.,Handbook of Experimental Immunology,1986,Blackwell Scientific,Boston；Scouten,W.H.,1987 Methods in Enzymology 135：30-65；Harlow and Lane,Antibodies：A Laboratory Manual,1988 Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY；Haugland,Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies-Tenth Ed.,2005 Invitrogen Corp./Molecular ProbesTM,Eugene,OR；Scopes,R.K., Protein Purification：Principles and Practice,1987,Springer-Verlag,NY；Hermanson,G.T.et al.,Immobilized Affinity Ligand Techniques,1992,Academic Press,Inc.,NY；Luo et al.,1998 J.Biotechnol.65：225，以及其中引用的參考文獻)。
胜肽聯結子/間隔子序列亦可用於將多個多胜肽成分隔開足夠的距離，以確保每個多胜肽可視需要折疊成其二級及/或三級結構。可使用本領域已知的標準技術將此種胜肽聯結子序列加入一融合多胜肽中。
可選擇某些胜肽間隔子序列，例如，基於：(1)其產生彈性延伸構形的能力；(2)其無法產生二級結構的能力，該二級結構可與該第一和第二多胜肽上的功能性表位相互作用；及/或(3)缺乏可能與該多胜肽功能性表位反應的疏水性或帶電殘基。在某些實施例中，該胜肽空間子序列含有如Gly、Asn和Ser殘基。其他近中性胺基酸，例如Thr和Ala，亦可包括在一間隔子序列中。其他可使用作為間隔子之胺基酸序列包括描述於Maratea et al.,Gene 40：39 46(1985)；Murphy et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：8258 8262(1986)；美國專利號4,935,233與美國專利號4,751,180者。其他間隔子之示範性與非限制性範例可包括，例如，Glu-Gly-Lys-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Glu-Ser-Lys-Val-Asp(SEQ ID NO：23)(Chaudhary et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1066-1070(1990))，以及 Lys-Glu-Ser-Gly-Ser-Val-Ser-Ser-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Phe-Arg-Ser-Leu-Asp(SEQ ID NO：24)(Bird et al.,Science 242：423-426(1988))。
在一些實施例中，當第一和第二多胜肽具有可用於分離功能性結構域並防止空間干擾的非必需N-端胺基酸區域時，便不需要間隔子序列。兩個編碼序列可直接融合，不需任一間隔子，或藉由使用由例如五聚體Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO：25)組成的彈性多聯結子，當存在於單次重複或重複1至5次和更多次時；請見如SEQ ID NO：26。在某些說明性和非限制性實施例中，胜肽間隔子可為1至5個胺基酸、5至10個胺基酸、5至25個胺基酸、5至50個胺基酸、10至25個胺基酸、10至50個胺基酸、10至100個胺基酸，或任一中間範圍的胺基酸。在其他說明性實施例中，一胜肽間隔子包含長度為約1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多個胺基酸。
根據某些實施例，亦涵蓋於此所述的抗體或其抗原結合片段的胺基酸序列修飾。該修飾包括例如保守和非保守性胺基酸取代。“保守性取代”是指不顯著影響或改變一特定蛋白質的特定特徵(例如結合活性，如特異性結合活性)的胺基酸取代。通常，保守性取代是其中經取代的胺基酸殘基被具有相似側鏈的胺基酸殘基取代。保守性取代包括在下列群組之一發現的取代：第1組：丙胺酸(Ala或A)、甘胺酸(Gly或G)、絲胺酸(Ser或S)、蘇胺酸(Thr 或T)；第2組：天冬胺酸(Asp或D)、麩胺酸(Glu或Z)；第3組：天冬醯胺(Asn或N)、麩胺醯胺(Gln或Q)；第4組：精胺酸(Arg或R)、離胺酸(Lys或K)、組胺酸(His或H)；第5組：異亮胺酸(Ile或I)、亮胺酸(Leu或L)、甲硫胺酸(Met或M)、纈胺酸(Val或V)；以及第6組：苯丙胺酸(Phe或F)、酪胺酸(Tyr或Y)、色胺酸(Trp或W)。此外或替代地，胺基酸可藉由相似的功能、化學結構或組成(例如，酸性、鹼性、脂族、芳族或含硫)而分組成保守性取代基。例如，出於取代目的，脂族基團可包括Gly、Ala、Val、Leu和Ile。其他保守性取代群組包括：含硫組：Met和半胱胺酸(Cys或C)；酸性組：Asp、Glu、Asn和Gln；小脂肪族、非極性或微極性殘基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；極性，帶負電荷的殘基及其醯胺：Asp、Asn、Glu和Gln；極性、帶正電荷的殘基：His、Arg和Lys；大脂肪族、非極性殘基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；以及大芳香族殘基：Phe、Tyr和Trp。其他資訊可見於Creighton(1984)Proteins,W.H.Freeman and Company。
例如，可能希望改善抗體或其抗原結合片段的結合親和力及/或其他生物學特性。例如，可藉由將合適的核苷酸改變引入編碼該胜肽合成的聚核苷酸中，而製備胺基酸序列變異物。這些修飾包括，例如，該抗體或其抗原結合片段的胺基酸序列內殘基的刪去及/或插入及/或取代。可進行任一刪去、插入和取代的組合，以獲得最終的抗體或其抗原結合片段變異物，條件是最終構建體具有所 希望之特徵(例如，保留與此述的雙觸角Lewis抗原的特異性結合，同時不與本文他處所述之單觸角LeX或LeA或H抗原呈可偵測地結合，或顯示出統計學上顯著降低的結合)。該胺基酸改變亦可改變該抗體或其抗原結合片段的轉譯後過程，例如改變醣基化位點的數量或位置。
可經由常規方法確定代表性抗體或其抗原結合片段的三維結構，使其可虛擬地模擬被選出的天然或非天然胺基酸之一或多種胺基酸取代、加入、刪去或插入，用於確定如此衍生的結構變異物是否保留本發明物質之空間填充性質。請見例如，Donate et al.,1994 Prot.Sci.3：2378；Bradley et al.,Science 309：1868-1871(2005)；Schueler-Furman et al.,Science 310：638(2005)；Dietz et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 103：1244(2006)；Dodson et al.,Nature 450：176(2007)；Qian et al.,Nature 450：259(2007)；Raman et al.Science 327：1014-1018(2010)；Marcos et al.,2017 Science 355：201，以及其中引用的參考文獻。可用於這些和相關實施例的電腦演算法的一些額外非限制性範例，例如用於本文提供的抗體和其抗原結合片段的合理設計，包括VMD，其為一種可視化程式，用於顯示、動畫化和分析大型生物分子系統，使用三維圖形和內建草稿分析(請參見伊利諾伊大學厄巴納香檳校區之理論與計算生物物理學小組網站，ks.uiuc.edu/Research/vmd/)。
許多其他電腦程式在本領域中是已知的，且 是技術人員可獲得的，並允許從能量最小化構形的空間填充模型(凡德瓦耳半徑)確定原子尺寸；GRID，其旨在搜尋對不同化學基團具有高親和力的區域，因而增強結合；蒙特卡羅(Monte Carlo)搜尋，其計算數學比對，以及CHARMM(Brooks et al.(1983)J.Comput.Chem.4：187-217)和AMBER(Weiner et al(1981)J.Comput.Chem.106：765)，其評估力場計算和分析(亦請見Eisenfield et al.(1991)Am.J.Physiol.261：C376-386；Lybrand(1991)J.Pharm.Belg.46：49-54；Froimowitz(1990)Biotechniques 8：640-644；Burbam et al.(1990)Proteins 7：99-111；Pedersen(1985)Environ.Health Perspect.61：185-190；and Kini et al.(1991)J.Biomol.Struct.Dyn.9：475-488)。各種適當的電腦程式也可商購，例如來自Schrödinger(慕尼黑，德國)。
抗體
本發明之某些較佳實施例係相關於一種抗體或其抗原結合片段，其特異性地結合：至一雙觸角Leb/Leb抗原，其包含Fuc4(Galβ1→3GlcNAc)2 [I]或[Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc]2 [II]，至一雙觸角LeY/LeY抗原，其包含Fuc4(Galβ1→4GlcNAc)2 [III]或[Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc]2 [IV]， 至一雙觸角LeB/LeY抗原，其包含Fuc2(Galβ1→3GlcNAc)[Fuc2(Galβ1→4GlcNAc)] [V]，或[Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc] [VI]，以及至一雙觸角LeY/LeB抗原，其包含Fuc2(Galβ1-4GlcNAc)[Fuc2(Galβ1-3GlcNAc)] [VII]或[Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc] [VIII]，以及其中該抗體或其抗原結合片段並未特異性地結合至一單觸角Lex抗原，其包含Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc[IX]，或至一雙觸角Lex抗原，其包含[Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X]，或至一單觸角LeA抗原，其包含Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc[XI]，或至一單觸角H抗原第2型，其包含Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc[XII]，或至一雙觸角H抗原第2型，其包含(Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII]，或至一單觸角H抗原第1型，其包含Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc[XIV]，以及在一更佳實施例中，其並非特異性地結合至某些其他雙觸角或單觸角Lewis抗原，如此所述。
於此所使用的術語“抗體”(Ab)包括單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性或三特異性抗體)、人源化抗體、嵌合抗體、異型共軛抗體和抗體片段，只要它們具有希望的生物活性，例如，保留可特異性結合至本發明之雙觸角Lewis抗原的能力。術語“免疫球 蛋白”(Ig)於此可與“抗體”互換使用。
基本抗體單元為異型四聚體醣蛋白，由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重鏈(H)組成。每一L鏈藉由至少一(通常是一個)共價雙硫鍵與H鏈連接，而兩個H鏈藉由一或多個雙硫鍵相互連接，取決於H鏈的同種型。每一H和L鏈亦具有規則間隔的鏈內雙硫鍵。每一H鏈在N端具有一可變結構域(VH)，隨後是α和γ鏈中的每一者的三個恆定結構域(CH)，以及μ和ε同種型的四個CH結構域。每一L鏈在N端具有一可變結構域(VL)，隨後在其另一端具有恆定結構域(CL)。VL與VH對齊，CL與重鏈的第一恆定結構域(CH1)對齊。特定的胺基酸殘基被認為在輕鏈和重鏈可變結構域之間形成界面。VH和VL的配對共同形成單一抗原結合位點。
來自任一脊椎動物物種的L鏈可基於其恆定結構域(CL)的胺基酸序列，分配為兩種明顯不同的類型(稱為kappa(κ)和lambda(λ))之一者。根據其重鏈(CH)的恆定結構域胺基酸序列，可將免疫球蛋白分為不同的類別或同種型。免疫球蛋白有五類：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，具有重鏈分別名為alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma(γ)和mu(μ)。基於CH序列和功能的相對次要差異，將γ與α類型進一步分為亞群，例如，人類表現以下亞群：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1與IgA2。應當理解，編碼多種Ig同種型的哺乳動物能夠進行同種型切換。
IgM抗體由五個基本異型四聚體單元和另一 個稱為J鏈的多胜肽組成，因此含有十個抗原結合位點，而分泌型IgA抗體可聚合形成多價組裝物，包含兩到五個基本的四鏈單元，並帶有J鏈。在IgG的情況下，該四鏈單元通常具有約150,000道耳吞的分子量。關於不同類別抗體的結構和性質，請見例如Basic and Clinical Immunology，第8版，Daniel P.Stites,Abba I.Terr and Tristram G.Parslow(eds.),Appleton & Lange,Norwalk,Conn.,1994，第6章，第71頁。
可變區(V)結構域會介導抗原結合，並定義出特定抗體對其特定抗原的特異性。編碼VH結構域的基因序列具有複數個可變區(V)、多樣區(D)和連接區(J)區段複本。編碼VH結構域的基因序列含複數個V和J區段複本。VH和VL區進行基因重排(即體細胞性重組)，以在抗體中產生分歧抗原特異性。術語“可變”是指V結構域的某些區段在抗體之間的序列差異性很大。
然而，可變性並非均勻分佈在可變結構域的110個胺基酸跨度上。相反地，V區由相對不變的延伸組成，稱為15-30個胺基酸的框架區(FR)，被稱為“超可變區”的極端變異的短區域隔開。這些超可變區是體細胞在親和性成熟過程中發生超突變的結果，它們通常每個長度為9-18個胺基酸。然而，根據特定表位，已發現它們的長度範圍為4-28個胺基酸。例如，目前已描述長度至多22或23個胺基酸的CDR3區。請見如Morea V,et al.,J Mol Biol.275(2)：269-94(1998)and Kabat,E.A.,et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition.NIH Publication No.91-3242(1991)。抗體胺基酸位置(例如，CDR序列)可根據已知的編號流程確定，例如Kabat、Chothia、IMGT，及/或EU編號流程。
原始重鏈和輕鏈的可變結構域每一者皆包含四個框架區(FR)，主要採用β-板構形，經由三個超可變區連接(也稱為互補決定區(CDR)，並在下面進一步定義)形成環連接，並在某些情況下形成β-板結構的一部分。每條鏈中的超可變區由FR緊密地維持在一起，並在某些情況下與來自另一條鏈的超可變區結合，有助於形成抗體的抗原結合位點(請見Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。恆定結構域不直接參與抗體與抗原的結合，但表現出各種效應子功能，例如抗體參與抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或其他可能涉及恆定區結構域與細胞表面Fc受器(FcR)交互作用的機制。
術語“超可變區”使用於此係指抗體的負責抗原結合的胺基酸殘基。超可變區通常包含來自“互補決定區”或“CDR”的胺基酸殘基(例如，可根據Kabat編號決定，約為VL之殘基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，以及約為VH之28-36(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；請見Kabta et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；及/或根據本領域已知的用於辨識CDR的方法，如Kabat所定義，如描述於Martin,“Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains”,In Antibody Engineering,R.Kontermann and S.Dubel,2001,Springer-Verlag,Berlin,Germany，第422-438頁)，及/或來自“超可變環”的殘基(如VL之殘基26-32(L1)、50-52(L2)與91-96(L3)，VH之殘基26-32(H1)、53-55(H2)與96-101(H3)；Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。
“經分離的抗體”是已由其天然環境的成分中分離及/或回收的抗體。其天然環境的污染成分是會干擾抗體的診斷或治療用途的材料，並可包括酵素、激素和其他蛋白質或非蛋白質溶質。在較佳實施例中，抗體係純化至：(1)大於95%重的抗體，以Bradford方法測定，最佳大於99%重；(2)足以獲得至少15個殘基的N-端或內部胺基酸序列的程度，使用旋轉杯定序儀測定；或(3)在還原或非還原條件下，在SDS-PAGE上呈單一性，使用考馬斯藍(Coomassie blue)或銀色斑點測定。經分離的抗體包括重組細胞內的原位抗體，因為抗體的天然環境之至少一種成分將不存在。然而，經分離的抗體通常藉由至少一個純化步驟而製備。
“完整的”抗體是包含一抗原結合位點以及一CL和至少一重鏈恆定結構域CH 1、CH 2與CH 3的抗 體。恆定結構域可為天然序列恆定結構域(例如，人類天然序列恆定結構域)，或其胺基酸序列變異物。較佳地，該完整抗體具有一或多種效應子功能。
“抗體片段”為包含或由完整抗體的一部分組成的多胜肽，較佳為完整抗體的抗原結合或可變區。抗體片段的範例包括Fab、Fab'、F(ab')2與Fv片段；雙抗體；直線形抗體(請見美國專利號5,641,870；Zapata et al.,Protein Eng.8(10)：1057-1062[1995])；單鏈抗體分子；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。
木瓜蛋白酶消化抗體產生兩個相同的抗原結合片段，稱為“Fab”片段，以及一剩餘的“Fc”片段，這一名稱反映其容易結晶的能力。Fab片段由完整L鏈以及H鏈的可變區結構域(VH)，以及和一重鏈的第一恆定結構域(CH 1)組成。就抗原結合而言，每個Fab片段為單價，即它具有單一抗原結合位點。胃蛋白酶處理抗體會產生單一大的F(ab')2片段，其大致對應於具有二價抗原結合活性的兩個雙硫鍵連接的Fab片段，且仍能夠交聯抗原。Fab和F(ab’)2都是“抗原結合片段”的範例。Fab'片段與Fab片段的不同之處在於在CH1結構域的羧基末端具有額外的少數殘基，包括來自抗體鉸鏈區的一或多個半胱胺酸。Fab'-SH是本文中Fab'的名稱，其中恆定結構域的半胱胺酸殘基帶有游離巰基。F(ab')2抗體片段最初是產生為Fab'片段對，它們之間具有鉸鏈半胱胺酸。抗體片段的其他化學共軛亦為已知。
“Fc”片段包含藉由雙硫鍵維持在一起的兩條H鏈的羧基端部分(即IgG的CH2和CH3結構域)。抗體的效應子功能由Fc區中的序列確定。Fc結構域是被細胞受器如FcR識別出的抗體之一部分，且補體活化蛋白C1q會與之結合。如本文所討論的，可對Fc結構域進行修飾(例如，胺基酸取代)，以修飾(例如，增進、減少或消除)含Fc的多胜肽(例如，本發明的抗體)之一或多種功能。
“Fv”是含有完整抗原辨識和抗原結合位點的最小抗體片段。該片段由緊密、非共價結合的一個重鏈和一個輕鏈可變區結構域的二聚體組成。從這兩個結構域的折疊中產生出六個超可變環(來自每一H和L鏈的三個環)，其提供抗原結合的胺基酸殘基並賦予抗體抗原結合特異性。然而，即使單一可變結構域(或僅包含對特異於一抗原的三個CDR的Fv的一半)亦具有辨識和結合抗原的能力，儘管通常具有比完整結合位點更低的親和力。
“單鏈Fv”亦縮寫為“sFv”或“scFv”，是包含連接成單一多胜肽鏈的VH和VL抗體結構域的抗體片段。較佳地，sFv多胜肽更包含位於VH和VL結構域之間的多胜肽聯結子，其使sFv能形成抗原結合的希望結構。關於sFv的綜述，請見Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)；Borrebaeck 1995,infra。
術語“雙抗體”是指一小型抗體片段，其經 由構建在VH和VL結構域之間具有短聯結子(約5-10個殘基)的sFv片段(請見前段所述)而製備，使得V結構域配對可達成鏈之間而非鏈之內配對，而產生二價片段，即具有兩個抗原結合位點的片段。雙特異性雙抗體是兩個“交叉”sFv片段的異二聚體，其中兩種抗體的VH和VL結構域存在於不同的多胜肽鏈上。雙抗體更完整地描述於例如EP 404,097；WO 93/11161；以及Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993)。包含該雙抗體的其他抗體片段和分子包括例如直線抗體、串聯scFv、scFv-Fc、串聯scFv-Fc、scFv二聚體、scFv-拉鏈構形(zipper)、雙抗體-Fc、雙抗體-CH3、sc雙抗體(scDiabodies)、sc雙抗體-Fc、sc雙抗體-CH3、奈米抗體、TandAb、微抗體、微型抗體、三抗體、四抗體、scFab、Fab-scFv、Fab-scFv-Fc、scFv-CH-CL-scFv，以及F(ab’)2-scFv2，所有這些都是本文所考慮的。
在某些實施例中，本發明的抗體或其抗原結合片段為多特異性抗體，例如雙特異性或三特異性抗體。雙特異性抗體的形式揭示於例如Spiess et al.,Mol.Immunol.67(2)：95(2015)，以及Brinkmann and Kontermann,mAbs 9(2)：182-212(2017)，其中雙特異性形式和製備它們的方法，在此併入本案以作為參考資料，並包括例如雙特異性T細胞接合器(Engagers)(BiTEs)、DART、Knobs-Into-Holes(KIH)組裝、scFv-CH3-KIH組裝、KIH普通輕鏈抗體、TandAbs、三抗體、TriBi微型 抗體、Fab-scFv、scFv-CH-CL-scFv、F(ab’)2-scFv2、四價Hcabs、胞內抗體、CrossMabs、雙重作用Fabs(DAFs)(二合一或四合一)、DutaMabs、DT-IgG、電荷對、Fab-臂交換、SEEDbodies、Triomabs、LUZ-Y組裝、Fcabs、κλ-體、正交型Fabs、DVD-IgGs、IgG(H)-scFv、scFv-(H)IgG、IgG(L)-scFv、scFv-(L)IgG、IgG(L,H)-Fv、IgG(H)-V、V(H)-IgG、IgG(L)-V、V(L)-IgG、KIH IgG-scFab、2scFv-IgG、IgG-2scFv、scFv4-Ig，Zybody和DVI-IgG(四合一)。
使用於此，術語“多株抗體”是指從一群抗原特異性抗體中獲得的抗體，其辨識該特定抗原的一個以上表位。“抗原”或“免疫原”是指被適應性免疫系統辨別出的胜肽、脂質、多醣或聚核苷酸。抗原可為自體或非自體分子。抗原的範例包括但不限於細菌細胞壁成分、花粉和rh因子。由特定抗體特異性辨識出的抗原區域為一“表位”或“抗原性決定簇”。單一抗原可具有多個表位。
術語“單株抗體”(mAb)使用於此，是指由基本上同質的抗體群獲得的抗體，即該群體包含的各個抗體是相同的，除了可能以少量存在的可能天然發生的突變。單株抗體為高度特異性的，針對單一抗原位點。此外，與包含針對不同表位的不同抗體的多株抗體製劑相反，每一單株抗體係針對抗原的單一表位。除了它們的特異性之外，單株抗體的優點還在於它們可以不被其他抗體污染而合成。經修飾“單株”不應解釋為需要以任一特定方法產 生抗體。例如，可用於本發明的單株抗體可以首度描述於Kohler et al.,Nature,256：495(1975)的融合瘤方法製備，或者可使用細菌、真核動物或植物細胞的重組DNA方法製備(請見如美國專利號4,816,567)。亦可使用如Clackson et al.,Nature,352：624-628(1991)與Marks et al.,J.Mol.Biol.,222：581-597(1991)中描述的技術，從噬菌體抗體庫中分離出“單株抗體”。
本文的單株抗體包括“嵌合性抗體”，其中重鏈及/或輕鏈的一部分，與衍生自特定物種或屬於特定抗體類型或亞群的抗體中的相對應序列相同或同源，而該鏈的其餘部分與衍生自另一物種或屬於另一抗體類型或亞群的抗體以及這些抗體的片段之相對應序列相同或同源，只要它們表現出希望的生物活性即可(請見美國專利號4,816,567；5,530,101與7,498,415；以及Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984))。例如，嵌合性抗體可包含人類和非人類殘基。此外，嵌合性抗體可包含在接受者抗體或供應者抗體中未發現的殘基。可進行這些修飾以進一步增進抗體表現度。有關進一步的細節，請見Jones et al.,Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature 332：323-329(1988)；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。嵌合性抗體亦包括靈長類化和人源化抗體。
“人源化抗體”通常被認為是人類抗體，其具有從非人源引入的一或多個胺基酸殘基。這些非人類胺 基酸殘基通常取自可變結構域。傳統上依照Winter與同事(Jones et al.,Nature,321：522-525(1986)；Reichmann et al.,Nature,332：323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science,239：1534-1536(1988))所述之方法進行人源化，藉由使用非人類可變序列取代人類抗體的相對應序列。因此，此種“人源化”抗體是嵌合性抗體(美國專利號4,816,567；5,530,101和7,498,415)，其中實質上少於完整人類可變結構域已被來自非人類物種的相對應序列取代。在一些情況下，“人源化”抗體是由非人類細胞或動物產生的抗體，並包含人類序列如HC結構域。
“人類抗體”是指一抗體，其僅含有存在於人類天然產生的抗體中的序列。然而，使用於此，人類抗體可包含在天然存在的人類抗體中未發現的殘基或修飾，包括本文所述的那些修飾和變異物序列。這些通常用於進一步改善或增強抗體表現度。在某些情況下，人類抗體由基因轉殖動物產生。例如，請見美國專利號5,770,429；6,596,541與7,049,426。
抗體“效應子功能”是指來自抗體的Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變異物Fc區)之生物活性，且其會隨抗體同種型而變化。抗體效應子功能的範例包括：C1q結合和補體依賴性細胞毒性；Fc受器結合；抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)；吞噬；下調細胞表面受器(例如B細胞受器)；以及B細胞活化。用於修飾(例如，增進、降低或消除)Fc功能的胺基酸修飾(例如，取代)包括例如T250Q/M428L、 M252Y/S254T/T256E、H433K/N434F、M428L/N434S、E233P/L234V/L235A/G236+A327G/A330S/P331S、E333A、S239D/A330L/I332E、P257I/Q311、K326W/E333S、S239D/I332E/G236A、N297Q、K322A、S228P、L235E+E318A/K320A/K322A、L234A/L235A，以及L234A/L235A/P329G突變，該突變摘錄並注釋於"Engineered Fc Regions"，InvivoGen出版(2011)，並可於線上www.invivogen.com/PDF/review/review-Engineered-Fc-Regions-invivogen.pdf？utm_source=review&utm_medium=pdf&utm_campaign=review&utm_content=Engineered-Fc-Regions取得，在此併入本案以作為參考資料。
抗體或其抗原結合片段的“功能片段或類似物”一詞是具有與其全長抗體或抗原結合片段相同的定性生物活性之化合物。
具有指定的抗體或其抗原結合片段的“生物學特徵”的抗體或其抗原結合片段，為具有該抗體或其抗原結合片段的一或多種生物學特徵者，其不同於其它抗體或抗體衍生結合片段。例如，在某些實施例中，具有指定抗體的生物學特徵之抗體或其抗原結合片段，當與指定抗體結合時，將結合至相同表位，及/或具有與指定抗體共同的效應子功能。
如本文所用，抗體被稱為“免疫特異於”、“特異於”或“特異性結合”至一抗原，若其以可偵測位 準與抗原反應，較佳具有親和常數Ka大於或等於約104M-1，或大於或等於約105M-1，大於或等於約106M-1，大於或等於約107M-1，或大於或等於108M-1。抗體對於其同源抗原的親和力，通常也以解離常數KD表示，在某些實施例中，若抗體或其抗原結合片段與本發明的Lewis抗原呈特異性結合，若其KD小於或等於10-4M，小於或等於約10-5M，小於或等於約10-6M，小於或等於10-7M，或小於或等於10-8M。可使用常規技術，例如，Scatchard et al.(Ann.N.Y.Acad.Sci.USA 51：660(1949))所述者，或經由表面等離子共振(SPR)(如Hearty et al.,2012 Meths.Mol.Biol.907：411)、經由等溫滴定量熱法(ITC)(如Dam et al.,2008 J.Biol.Chem.283：31366)、經由酵素聯結免疫吸附測定(ELISA)(如Bobrovnik,2003 J.Biochem.Biophys.Meths.75(3)：213),，或者經由本領域技術人員熟悉的其他方法，容易地確定抗體和抗原結合片段的親和力。
抗體與抗原、細胞或其組織的結合特性，通常可使用免疫偵測方法決定和評估，包括例如基於免疫螢光的試驗，例如免疫組織化學(IHC)，及/或螢光活化細胞分選(FACS)。其他決定抗體與抗原結合的方法包括，例如，酵素聯結免疫吸附測定(ELISA)、等溫滴定量熱法(ITC)和表面等離子體共振(SPR)技術。
“載體”使用於此，包括醫藥上可接受的載體、賦形劑或穩定劑，其在所使用的劑量和濃度下，對暴 露於其中的細胞或哺乳動物無毒。生理學上可接受的載體通常是水性pH緩衝溶液。生理學上可接受的載體的範例包括緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量(小於約10個殘基)多胜肽；蛋白質如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸如甘胺酸、麩胺醯胺、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣和其他碳水化合物，包括葡萄醣、甘露醣或糊精；螯合劑如EDTA；醣醇如甘露醇或山梨醣醇；成鹽相對離子如鈉；及/或非離子界面活性劑，如聚山梨醇酯20(TWEENTM)聚乙二醇(PEG)和泊洛沙姆(PLURONICSTM)，及類似物。
聚核苷酸、載體，以及宿主細胞
在其他態樣中，本發明在某些實施例中提供經分離的聚核苷酸，其編碼如此所述的抗體和抗原結合片段，亦提供包含其之載體(vector)。包含聚核苷酸的核酸可包含DNA或RNA，且可為完全或部分合成。
術語“聚核苷酸”於此提及是指單股或雙股核酸聚合物，並特別包括單股和雙股形式的DNA。聚核苷酸可如經由聚合酶連鎖反應(PCR)或經由體外轉譯產生，並經由任一接和、斷裂、核酸內切酶作用或核酸外切酶作用而產生的片段。在某些實施例中，本發明的聚核苷酸係以PCR產生。聚核苷酸可由天然發生的核苷酸單體(例如去氧核醣核苷酸和核醣核苷酸)、天然發生的核苷酸類似物(例如天然發生的核苷酸之α-對映體形式)或兩者的組 合組成。在進一步的實施例中，包含聚核苷酸的核苷酸可為核醣核苷酸或去氧核醣核苷酸，或任一類型核苷酸的修飾形式。
術語“天然發生的核苷酸”包括去氧核醣核苷酸和核醣核苷酸。術語“經修飾的核苷酸”包括具有修飾的或取代的醣基及類似物的核苷酸(例如，經溴尿苷、阿拉伯醣苷或2'3'-雙去氧核醣修飾)。術語“寡核苷酸連接”包括寡核苷酸連接，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酸醯胺酯、胺基磷酸酯等。請參見，例如，LaPlanche et al.,1986,Nucl.Acids Res.,14：9081；Stec et al.,1984,J.Am.Chem.Soc.,106：6077；Stein et al.,1988,Nucl.Acids Res.,16：3209；Zon et al.,1991,Anti-Cancer Drug Design,6：539；Zon et al.,1991,OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES：A PRACTICAL APPROACH,pp.87-108(F.Eckstein,Ed.),Oxford University Press,Oxford England；Stec et al.,U.S.Pat.No.5,151,510；Uhlmann and Peyman,1990,Chemical Reviews,90：543，其公開內容係以任一目的經由引用結合到本文中。寡核苷酸可包括一可偵測標記，以使其能夠偵測寡核苷酸或其雜合。
術語“經分離的聚核苷酸”使用於此應意指一基因組、cDNA或合成來源的聚核苷酸或其某些組合，其中由於其來源，該經分離的聚核苷酸(1)與聚核苷酸 的全部或一部分未結合，其中該經分離的聚核苷酸係於自然界中發現，(2)與在天然狀態下不連接的聚核苷酸連接，或(3)在自然界中不會以較大序列的一部分發生。
除非上下文另有要求，否則提及此述的核苷酸序列涵蓋具有特定序列的DNA分子，並包括具有特定序列的RNA分子，其中U取代T。
術語“可操作地連接”是指應用該術語的成分處於允許它們在合適條件下實現其固有功能的關係。例如，一轉錄控制序列“可操作地連接”至一蛋白質編碼序列，以在與該控制序列的轉錄活性相容的條件下，達成蛋白質編碼序列的表現。
術語“控制序列”使用於此是指聚核苷酸序列，其可影響與其接合或可操作地連接的編碼序列的表現、加工或細胞內定位。此種控制序列的性質可取決於宿主生物。在特定實施例中，原核生物的轉錄控制序列可包括一啟動子、核醣體結合位點和轉錄終止序列。在其他特定實施例中，真核生物的轉錄控制序列可包括含有一或複數個轉錄因子、轉錄增強子序列、轉錄終止序列和聚腺苷酸化序列的識別位點的啟動子。在某些實施例中，“控制序列”可包括前導序列及/或融合夥伴序列。表現控制序列可包括合適的轉錄起始、終止、啟動子和增強子序列；有效的RNA加工信號，如剪接和聚腺苷酸化信號；穩定細胞質mRNA的序列；提高轉譯效率的序列(即Kozak共有序列)；增強蛋白質穩定性的序列；以及增強蛋白質分泌的可 能序列。表現控制序列可有效連接，如果其與有興趣基因，以及反式或遠距離作用以控制有興趣基因表現的控制序列鄰接。
表現包括但不限於如轉錄、轉譯和RNA剪接的過程，若內含子存在。
如本領域技術人員所理解的，聚核苷酸可包括基因組序列、基因組外和質體-編碼的序列和較小的改造基因區段，其表現或可適於表現蛋白質、多胜肽、胜肽，及類似物。這些片段可由技術人員天然分離或合成修飾。
如本領域技術人員將認知到的，聚核苷酸可為單股(編碼或反義)或雙股，並可為DNA(基因組、cDNA或合成)或RNA分子。RNA分子可包括HnRNA分子(含有內含子並且以一對一的方式對應於一DNA分子)，以及mRNA分子(不含內含子)。額外的編碼或非編碼序列可以但非必須存在於根據本發明的聚核苷酸內，且一聚核苷酸可以但非必須與其他分子及/或支撐材料連接。聚核苷酸可包含一天然序列，其編碼此一序列之變異物或衍生物。
因此，根據這些和相關的實施例，本發明亦提供編碼一抗體或其抗原結合片段的聚核苷酸，如本文所述。
在其他相關實施例中，聚核苷酸變異物可與編碼本文所述抗體或其抗原結合片段的聚核苷酸序列具有實質上等同性。例如，聚核苷酸可為一包含至少70%序列等同性的聚核苷酸，較佳至少75%、80%、85%、90%、 95%、96%、97%、98%或99%或更高，與參考聚核苷酸序列(例如編碼本文所述的抗體或其抗原結合片段之一序列)之等同性比較係使用本文描述的方法(例如，使用標準參數之BLAST分析，如下所述)。本領域技術人員將認知到，可適當地調整這些數值，以決定由兩個核苷酸序列編碼的蛋白質之對應等同性，藉由考慮密碼子簡併性、胺基酸相似性、讀框定位，及類似性質。
通常，聚核苷酸變異物將包含一或多個取代、加入、刪去及/或插入，較佳使得由該變異物聚核苷酸編碼的抗體或其抗原結合片段之結合親和力，相較於由本文特別列出的聚核苷酸序列編碼之抗體或其抗原結合片段(例如，相對於本文中稱為hBBC.10.1的抗體，其包含具有SEQ ID NO：10所示胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈，以及具有SEQ ID NO：11所示胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈)，並未有實質上降低之情況。
在某些其他相關的實施例中，聚核苷酸片段可包含或基本上由各種長度的連續序列段組成，該序列段等同於或互補於編碼此述抗體或其抗原結合片段的序列。例如，係提供聚核苷酸，其包含或基本上由至少約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、200、300、400、500或1000或更多個 連續核苷酸組成，該核苷酸編碼一抗體或其抗原結合片段或其變異物，如本發明所揭示，以及它們之間的所有中間長度。可立即理解的是，在本文中，“中間長度”是指引用值之間的任一長度，例如50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括200-500；500-1,000及類似範圍間的所有整數。如本文所述的聚核苷酸序列可在一端或兩端，經由天然序列中未發現的額外核苷酸延伸。此額外序列可由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個核苷酸組成，其位於編碼此述之抗體或其抗原結合片段的聚核苷酸任一端，或編碼此述之抗體或其抗原結合片段的聚核苷酸之二端。
在另一實施例中，係提供能夠與編碼本文提供的抗體或其抗原結合片段或其變異物的聚核苷酸序列或其片段或其互補序列，在中度至高度嚴格條件下進行雜合的聚核苷酸。雜合技術在分子生物學領域中是眾所周知的。出於說明的目的，用於測試本文提供的聚核苷酸與其他聚核苷酸雜合的適當中等嚴格條件，包括在5 X SSC、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)的溶液中預洗滌；在50℃-60℃、5 X SSC下進行雜合整夜；然後在65℃下洗滌兩次，每次以含有0.1% SDS的2X、0.5X和0.2X之SSC洗滌20分鐘。本領域技術人員將理解，可容易地操縱雜合的嚴格性，例如經由改變雜合溶液的鹽類含量及/或進行雜合的溫度。例如，在另一實施例中，合適的高度嚴格雜合 條件包括上述那些，除了雜合溫度增加，例如升高到60℃-65℃或65℃-70℃。
在某些實施例中，上述聚核苷酸，例如聚核苷酸變異物、片段和雜合序列，係編碼與本文所述的雙觸角Lewis抗原結合的抗體或其抗原結合片段。在其他實施例中，此聚核苷酸編碼抗體或其抗原結合片段或其變異物，其與本發明公開的Lewis抗原具有至少約50%、至少約70%，並在某些實施例中，至少約90%的結合，以及特定列出的抗體或其抗原結合片段(例如，抗體hBBC.10.1)亦如是。在其他實施例中，此類聚核苷酸編碼抗體或其抗原結合片段或其變異物，其與本發明揭示的Lewis抗原結合的親和力，高於本文特定闡述的抗體或其抗原結合片段，例如，其定量結合至少約105%、106%、107%、108%、109%或110%，以及本文特定列出的抗體或其抗原結合片段亦如是。
如本文他處所述，可經由常規方法決定本發明揭示的抗體或其抗原結合片段的三維結構，使其可以選定之天然或非天然胺基酸進行取代、加入、刪去或插入一個或多個胺基酸，可經由虛擬地模擬模式，用於決定如此衍生的結構變異物是否保留了本發明物質的空間填充性質。本領域技術人員已知多種電腦程序，可用於決定抗體或其抗原結合片段內的適當胺基酸取代(或編碼該胺基酸序列的適當聚核苷酸)，使其可例如保持親和力或達到更好的親和力。請參見，例如，Donate et al.,1994 Prot.Sci. 3：2378；Bradley et al.,Science 309：1868-1871(2005)；Schueler-Furman et al.,Science 310：638(2005)；Dietz et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 103：1244(2006)；Dodson et al.,Nature 450：176(2007)；Qian et al.,Nature 450：259(2007)；Raman et al.Science 327：1014-1018(2010)；Marcos et al.,2017 Science 355：201，以及其中引用的參考文獻。
無論編碼序列本身的長度如何，本文所述的聚核苷酸或其片段可以與其他DNA序列組合，例如啟動子、聚腺苷酸化信號、額外的限制酶位點、多重選殖位點、其他編碼區段，及類似序列，如此其總長度可能會有很大差異。因此預期可使用幾乎任一長度的核酸片段，其總長度較佳受製備容易度和在預期的重組DNA流程中使用的容易性之限制。例如，總長度為約10,000、約5000、約3000、約2,000、約1,000、約500、約200、約100、約50個鹼基對，以及類似長度(包括所有中間長度)的示範性聚核苷酸區段，預期可用。
當比較聚核苷酸序列時，若兩個序列中的核苷酸序列在最大對應性比對時是相同的，則稱兩個序列是“相等的”，如下所述。兩個序列之間的比較通常經由在比較窗口中比較該序列，以辨識和比較序列相似性的局部區域而進行。如本文所用的“比較窗口”是指至少約20個，通常為30至約75個、40至約50個連續位置的片段，其中一序列可與相同數量連續位置的參考序列進行比較，在 兩個序列進行最佳比對後。
用於比較的序列最佳比對可使用DNASTAR® Lasergene生物資訊學軟體套組(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)之Megalign程序，使用預設參數進行。該程序具體化以下參考文獻中描述的幾種比對流程：Dayhoff,M.O.(1978)A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships.In Dayhoff,M.O.(ed.)Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,Washington DC Vol.5,Suppl.3,pp.345-358；Hein J.,Unified Approach to Alignment and Phylogenes,pp.626-645(1990)；Methods in Enzymology vol.183,Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.and Sharp,P.M.,CABIOS 5：151-153(1989)；Myers,E.W.and Muller W.,CABIOS 4：11-17(1988)；Robinson,E.D.,Comb.Theor 11：105(1971)；Santou,N.Nes,M.,Mol.Biol.Evol.4：406-425(1987)；Sneath,P.H.A.and Sokal,R.R.,Numerical Taxonomy-the Principles and Practice of Numerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA(1973)；Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.,Proc.Natl.Acad.,Sci.USA 80：726-730(1983)。
或者，用於比較的序列最佳比對可以Smith and Waterman,Add.APL.Math 2：482(1981)的局部等 同性演算法進行、以Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48：443(1970)之等同性比對演算法、以Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)之搜尋相似性的方法、以這些演算法的電腦化(GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA與TFASTA，於Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group(GCG),575 Science Dr.,Madison,WI)，或藉由人工檢查而達成。
適用於決定序列等同性百分比和序列相似性的演算法之一較佳範例為BLAST和BLAST 2.0演算法，其分別描述於Altschul et al.,Nucl.Acids Res.25：3389-3402(1977)，以及Altschul et al.,J.Mol.Biol.215：403-410(1990)。可以使用BLAST和BLAST 2.0，例如具有本文所述的參數，以決定二或更多個聚核苷酸之間的序列等同性百分比。用於進行BLAST分析的軟體可經由過國家生物技術資訊中心公開獲得。在一說明性範例中，針對核苷酸序列，可使用參數M(一對匹配殘基的獎勵得分；總是>0)和N(錯配殘基的罰分；總是<0)來計算累積得分。在以下情況下，停止每個方向上的字元命中的延伸，當：累積對齊分數從其最大達成值的數量X下降；由於一或多個負得分殘基比對的累積，累積分數變為零或以下；或者達到任一序列的終點。BLAST演算法參數W、T和X決定比對的靈敏度和速度。BLASTN程式(針對核苷酸序列)使用字元長度(W)為11、期望值(E)為10和 BLOSUM62評分矩陣作為預設值(請見Henikoff and Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))比對、(B)為50、期望值(E)為10、M=5、N=-4，且兩股皆進行比較。
在某些實施例中，“序列等同性百分比”係藉由在至少20個位置的比較窗口上，比較兩個最佳比對的序列而決定，其中該比較窗口中的聚核苷酸序列部分，與參考序列(不包含加入或刪去)相較，可包含20%或更少，通常5%至15%，或10%至12%之加入或刪去(即，缺口)，以達到兩個序列的最佳比對。百分比係經由決定兩個序列中相同核酸鹼基出現的位置數來計算，以產生匹配位置的數量，將匹配位置的數量除以參考序列中的位置總數(即，窗口大小)，並將結果乘以100，以得到序列等同性的百分比。
本領域普通技術人員將理解，由於遺傳密碼的簡併性，存在許多編碼如本文所述的抗體或其抗原結合片段的核苷酸序列。一些此種聚核苷酸與天然或原始聚核苷酸序列的核苷酸序列具有最小的序列等同性，該聚核苷酸序列編碼本文所述的抗體或其抗原結合片段。儘管如此，本發明內容明確考慮到由於密碼子使用的差異而變化的聚核苷酸。在某些實施例中，特別考慮到針對哺乳動物的表現進行密碼子最佳化的序列。可使用已知技術和工具來執行密碼子最佳化，例如，使用GenScript® OptimiumGeneTM工具。密碼子最佳化的序列包括部分密 碼子最佳化的序列(即，至少一個密碼子被最佳化，以於宿主細胞中表現)和全部密碼子最佳化的序列。
因此，在另一實施例中，可採用突變方法，例如位點特異性突變，來製備本文所述的抗體或其其抗原結合片段的變異物及/或衍生物。藉由這種方法，多胜肽序列的特定修飾可經由突變編碼它們的潛在聚核苷酸而達成。這些技術提供一種直接的方法來製備和測試序列變異物，例如，藉由將一或多個核苷酸序列變化引入聚核苷酸中，結合一或多個前述考慮因素。
位點特異性突變允許通過使用編碼所需突變的DNA序列的特定寡核苷酸序列，以及足夠數量的相鄰核苷酸，來產生突變物，以提供足夠大小和序列複雜性的引子序列，以在跨越該刪除連結的兩側形成穩定的雙鏈體。可於選定的聚核苷酸序列中使用突變，以改善、改變、降低、修飾或改變聚核苷酸本身的性質，及/或改變編碼的多胜肽的性質、活性、組成、穩定性或一級序列。
在某些實施例中，本發明人考慮編碼本文揭示的抗體或其抗原結合片段的聚核苷酸序列或其變異物之突變，以改變編碼的多胜肽的一或多種性質，例如對本發明Lewis抗原的結合親和力。位點特異性突變技術在本領域中已知，且廣泛用於創造多胜肽和聚核苷酸的變異物。例如，位點特異性突變通常用於改變一DNA分子的特定部分。在此類實施例中，引子通常包含約14至約25個核苷酸，或使用長度約5至約10個殘基於待改變的序列連接的 兩側。
如本領域技術人員所理解的，位點特異性突變技術通常使用噬菌體載體，其以單股和雙股形式存在。用於定點突變的典型載體包括載體如M13噬菌體。這些噬菌體很容易由商業上購得。雙股質體亦常規用於定點突變，其減少將有興趣基因從質體轉移至噬菌體的步驟。
一般而言，本發明的定點突變首先係以獲得單股載體或將雙股載體的兩股升溫分開而進行的，該雙股載體在其序列中包括編碼有興趣胜肽的DNA序列。帶有希望突變序列的寡核苷酸引子通常經合成製備。之後將該引子與單股載體黏合，並置於DNA聚合酶如大腸桿菌聚合酶I Klenow片段下，以完成帶有突變的鏈之合成。因此，形成異源雙鏈體，其中一條鏈編碼原始的未突變序列，第二條鏈攜帶希望的突變。之後將該異源雙鏈體載體用於轉型適當的細胞，例如大腸桿菌細胞，並選出包括帶有突變序列排列的重組載體之植株。
使用定點突變製備所選出的胜肽-編碼DNA片段的序列變異物，提供一種產生潛在有用物質的方法，並不意味著限制，因為胜肽的序列變異物和編碼它們的DNA序列存在有可獲得它們的其他方式。例如，編碼希望胜肽序列的重組載體，可以致突變劑如羥基胺處理，以獲得序列變異物。關於這些方法和流程的具體細節可見於Maloy et al.,1994；Segal,1976；Prokop and Bajpai,1991；Kuby,1994；以及Maniatis et al.,1982，為了該 目的，每一者皆經由引用併入本文。
如本文所用，術語“寡核苷酸定向突變程序”是指模板-依賴型過程和載體介導的增殖，其導致特定核酸分子的濃度增加，相對於其初始濃度，或者一可偵測信號的濃度增加，例如放大。如本文所用，術語“寡核苷酸定向突變程序”意指涉及引子分子的模板依賴型延伸的過程。術語模板依賴型過程是指RNA或DNA分子的核酸合成，其中新合成的核酸鏈的序列，係由眾所周知的互補鹼基配對規則決定(請見如，Watson，1987)。通常，載體介導的方法學涉及將核酸片段引入DNA或RNA載體中，載體的選殖倍增，以及倍增的核酸片段的回收。這些方法的範例係提供於美國專利No.4,237,224，其在此完整併入本案以作為參考資料。
在另一種產生多胜肽變體的方法中，可使用如美國專利No.5,837,458中所述的遞歸序列重組。在此方法中，進行重組和篩選或選擇的迭代循環，以“演化出”具有例如增加的結合親和力之各聚核苷酸變異物。某些實施例亦提供質體、載體、轉錄或表現卡匣形式的構建體，其包含至少一如本文所述的聚核苷酸。
術語“載體”係指用於將編碼信息轉移至宿主細胞的任一分子(例如，核酸、質體或病毒)。術語“表現載體”係指適用於轉型宿主細胞，並含有指導及/或控制插入的異源核酸序列表現之核酸序列的載體。編碼抗體或其抗原結合片段的表現載體，包括病毒載體，例如慢病毒 載體或γ-逆轉錄病毒載體。病毒載體包括逆轉錄病毒、腺病毒、小病毒(例如腺-相關病毒)、冠狀病毒、負鏈RNA病毒如正-黏病毒(例如流感病毒)、棒狀病毒(例如狂犬病和水皰性口炎病毒)、副黏病毒(例如，麻疹和仙台病毒)、正鏈RNA病毒如小核醣核酸病毒和α病毒，以及雙股DNA病毒，包括腺病毒、皰疹病毒(如第1型和第2型單純皰疹病毒、Epstein-Barr病毒、巨細胞病毒)，以及痘病毒(如牛痘病毒、禽痘病毒和金絲雀痘病毒)。其他病毒包括諾沃克(Norwalk)病毒、披衣病毒、黃病毒、呼腸孤病毒、乳多泡病毒、嗜肝DNA病毒和肝炎病毒，舉例而言。逆轉錄病毒的範例包括禽白血病-肉瘤性病毒、哺乳動物C型、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV群、慢病毒、泡沫反轉錄病毒(Coffin,J.M.,Retroviridae：The viruses and their replication,In Fundamental Virology,Third Edition,B.N.Fields et al.,Eds.,Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,1996)。
“慢病毒載體”使用於此是指用於基因傳送的HIV-基礎慢病毒載體，其可為整合性或非整合性，具有相對大的組裝能力，並可轉導一系列不同的細胞類型。慢病毒載體通常在將三種(組裝、包膜和轉移)或更多質體短暫轉染到生產細胞中後產生。與HIV一樣，慢病毒載體通過病毒表面醣蛋白與細胞表面受器的交互作用進入標靶細胞。進入時，病毒RNA經歷逆轉錄，其由病毒逆轉錄酶複合物介導。逆轉錄產物是雙股直線型病毒DNA，其為病 毒整合至經感染細胞DNA中的受質。
根據某些相關的實施例，係提供一種重組宿主細胞，其包含一或多種如本文所述的構建體；編碼一抗體或其抗原結合片段的核酸或其變異物；以及一種製備該編碼產物的方法，該方法包括表現編碼其之核酸。藉由在合適的條件下培養含有該核酸(如位於本發明的載體中)的重組宿主細胞，可方便地達成表現。表現製造後，一抗體或其抗原結合片段可使用任一適當技術分離及/或純化，之後根據需要使用。
用於在多種不同宿主細胞中選殖和表現多胜肽的系統為已知。適當的宿主細胞包括細菌、哺乳動物細胞、酵母菌和桿狀病毒系統。本領域可用於表現異源多胜肽的哺乳動物細胞株，包括中國倉鼠卵巢細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎細胞(例如HEK細胞，例如HEK293-c18細胞)、NSO小鼠黑素瘤細胞和許多其他細胞。常見的較佳細菌宿主為大腸桿菌。
在原核細胞如大腸桿菌中的胜肽表現技術在本領域中已良好建立。有關綜述，請參見例如Pluckthun,A.Bio/Technology 9：545-551(1991)。本領域技術人員亦可在培養的真核細胞中表現，作為產生抗體或其抗原結合片段之一選擇，請見最近的綜述，例如Ref,M.E.(1993)Curr.Opinion Biotech.4：573-576；Trill J.J.et al.(1995)Curr.Opinion Biotech 6：553-560。
適當載體可經選擇或構建，其含有適當的調 節序列，包括啟動子序列、終止子序列、聚腺苷酸化序列、增強子序列、標記基因和適當的其他序列。載體可為質體，例如病毒、噬菌體或噬菌粒(phagemid)，視情況而定。進一步的細節請見，例如，Molecular Cloning：a Laboratory Manual：2nd edition,Sambrook et al.,1989,Cold Spring Harbor Laboratory Press。用於操作核酸的許多已知技術和流程，例如製備核酸構建體、突變、定序、將DNA引入細胞和基因表現，以及蛋白質分析，如Current Protocols in Molecular Biology,Second Edition,Ausubel et al.eds.,John Wiley & Sons,1992或其隨後的更新中所述。
術語“宿主細胞”係指一細胞，其中已或可引入編碼一或多種本文所述抗體及其抗原結合片段的核酸序列，以及該細胞可進一步表現或能夠表現所選擇有興趣基因，例如編碼本文所述抗體或其抗原結合片段的基因。該術語包括親代細胞的後代，無論後代是否與原始親代的形態或基因構成相同，只要選擇的基因存在即可。因此，亦考慮一種包含將此種核酸引入宿主細胞的方法。該引入可採用任一可獲得的技術。對於真核細胞，適當技術可包括磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚醣、電穿孔、脂質體介導的轉染和使用逆轉錄病毒或其他病毒的轉導，例如牛痘病毒，或針對昆蟲細胞之桿狀病毒。對於細菌細胞，適當技術可包括氯化鈣轉型、電穿孔和使用噬菌體之轉染。該引入之後可導致或允許從核酸表現，例如藉由在表現基因的條件 下培養宿主細胞。在一實施例中，該核酸係整合至宿主細胞的基因組(例如染色體)中。根據標準技術，整合可藉由包含可驅動與基因組重組的序列來驅動。
在某些實施例中，本發明亦提供一種方法，其包括在表現系統中使用如上所述的構建體，以表現如本文所述的特定多胜肽，例如一抗體或其抗原結合片段。術語“轉導”係指將基因從一細菌轉移到另一細菌，通常經由噬菌體。“轉導”亦指經由逆轉錄病毒獲得和轉移真核細胞序列。術語“轉染”係指細胞攝入外來或外源性DNA，當外源性DNA已被引入細胞膜內時，該細胞便被“轉染”。許多轉染技術是本領域熟知的並在本文中揭示。請見如，Graham et al.,1973,Virology 52：456；Sambrook et al.,2001,MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratories；Davis et al.,1986,BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Elsevier；and Chu et al.,1981,Gene 13：197。這些技術可用於將一或多個外源性DNA部分引入適當宿主細胞中。
如本文所用的術語“轉型”是指細胞基因特徵的變化，當一細胞經修飾為含有新DNA時，便為已經轉型。例如，細胞在其天然狀態下經基因修飾而轉型。如同轉染或轉導，轉型用DNA可物理性整合至細胞染色體中，而與細胞的DNA重組，或者可作為附加型元件暫時維持而不複製，或者可作為質體獨立地複製。當DNA隨著細 胞分裂而複製時，視為細胞已被穩定轉型。術語“天然存在的”或“天然的”，當與生物材料如核酸分子、多胜肽、宿主細胞及類似物結合使用時，係指在自然界中發現且非人為操作的物質。類似地，如本文所用的“非天然存在的”或“非天然的”是指在自然界中未發現或已人為進行結構修飾或合成的材料。
應當理解，除非特別相反地指出，否則本發明的數個實施例的實踐，將採用本領域技術範圍內的病毒學、免疫學、微生物學、分子生物學和重組DNA技術中的常規方法，以及為了說明目的，下列的許多範例。這些技術在文獻中有充分說明。請見例如，Current Protocols in Molecular Biology或Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons,New York,N.Y.(2009)；Ausubel et al.,Short Protocols in Molecular Biology,3rd ed.,Wiley & Sons,1995；Sambrook and Russell,Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3rd Edition,2001)；Maniatis et al.Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1982)；DNA Cloning：A Practical Approach,vol.I & II(D.Glover,ed.)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait,ed.,1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames & S.Higgins,eds.,1985)；Transcription and Translation(B.Hames & S.Higgins,eds.,1984)；Animal Cell Culture(R.Freshney,ed.,1986)；Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)，和其他 類似參考文獻。
某些目前揭示的實施例涉及偵測與鑑定特異性免疫結合活性(例如，抗體結合活性)，其靶向碳水化合物定義的抗原結構。熟悉本領域的人員將理解，存在各種方法學來產生和測試碳水化合物特異性免疫試劑，包括同源性碳水化合物抗原的精細結構鑑定。此類技術的非限制性範例描述於Haji-Ghassemi et al.,2015 Glybiol.25：920；Dingjan et al.,2015 Mol.Immunol.67(2 Pt A)：75-88；Soliman et al.,2017 Curr.Opin.Struct.Biol.44：1-8；and Hakomori,2001 Adv.Exp.Med.Biol.491：369-402；以及其中引用的參考文獻。在這些文獻和其他地方亦可找到有關烴類定義的抗原來源的描述及其製備、分離和結構鑑定的方法。本文揭示這些方法的示範性和非限制性應用，且本揭示內容並非旨在限制，並亦考慮到結構定義的烴類抗原的合成製備，包括利用其中技術上已知的生物合成酶作為醣基轉移酶的精確特異性。請見如，Wu et al.,Universal phosphatase-coupled glycosyltransferase assay,Glycobiology 21(6)：727-733,2011；Becker et al.,Fucose：biosynthesis and biological function in mammals,Glycobiology 13(7)：41R-53R,2003；de Vries et al.,Fucosyltransferases：structure/function studies,Glycobiology 11(10)：119R-128R,2001。
標準技術可用於重組DNA、寡核苷酸合成和 組織培養與轉型(例如，電穿孔、脂質轉染)。酵素反應和純化技術可根據製造商的說明書進行，或者如本領域通常實現的或如本文所述進行。
這些和相關的技術和程序通常可根據本領域已知的常規方法進行，並如在本說明書整篇引用和討論的各種一般和更特定的參考文獻中所述。除非提供特定的定義，否則本文所述的分子生物學、分析化學、合成有機化學以及藥物和藥物化學中使用的命名法和實驗室程序和技術，為本領域已知和常用者。標準技術可用重組技術、分子生物學、微生物學、化學合成、化學分析、藥物製劑、配方和傳送，以及患者的治療，於本文進一步描述。
組成物
在某些態樣中，本發明提供抗體和其抗原結合片段，以及其變異物，以及包含其之組成物。在某些實施例中，係提供一種經分離的抗體，其包含具有SEQ ID NO：10所示胺基酸序列之免疫球蛋白重鍊，以及具有SEQ ID NO：11所示胺基酸序列之免疫球蛋白輕鏈。
在某些實施例中，係提供一種經分離的抗體或其抗原結合片段，其包含：一免疫球蛋白重鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：35所示之胺基酸；以及一免疫球蛋白輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：5之胺基酸序列，其中該抗體或其抗原結合片段可特異性結合： 至一雙觸角LeB/LeB抗原，其包含Fuc4(Galβ1→3GlcNAc)2 [I]或[Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc]2 [II]，至一雙觸角LeY/LeY抗原，其包含Fuc4(Galβ1→4GlcNAc)2 [III]或[Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc]2 [IV]，至一雙觸角LeB/LeY抗原，其包含Fuc2(Galβ1→3GlcNAc)[Fuc2(Galβ1→4GlcNAc)] [V]，或[Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc] [VI]，至一雙觸角LeY/LeB抗原，其包含Fuc2(Galβ1-4GlcNAc)[Fuc2(Galβ1-3GlcNAc)] [VII]或[Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc] [VIII]，以及其中該抗體或其抗原結合片段未特異性結合至一單觸角Lex抗原，其包含Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc[IX]，或至一雙觸角Lex抗原，其包含[Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X]，或至一單觸角LeA抗原，其包含Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc[XI]，或至一單觸角H抗原第2型，其包含Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc[XII]，或至一雙觸角H抗原第2型，其包含(Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII]，或至一單觸角H抗原第1型，其包含Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc[XIV]。
在其他實施例中，經分離之抗體或其抗原結合片段包含：(a)一免疫球蛋白重鏈可變區，其包含一重鏈互補決定區1(VH CDR1)，包含如SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列；一重鏈互補決定區2(VH CDR2)，其包含如SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列；一重鏈互補決定區3(VH CDR3)，其包含如SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列；以及(b)一免疫球蛋白輕鏈可變區，其包含一輕鏈互補決定區1(VL CDR1)，包含如SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列；一輕鏈互補決定區2(VL CDR2)，其包含如SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列；以及一輕鏈互補決定區3(VL CDR3)，其包含如SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列；其中該抗體或其抗原結合片段可特異性結合：至一雙觸角LeB/LeB抗原，其包含Fuc4(Galβ1→3GlcNAc)2 [I]或[Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc]2 [II]，至一雙觸角LeY/LeY抗原，其包含Fuc4(Galβ1→4GlcNAc)2 [III]或[Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc]2 [IV]，至一雙觸角LeB/LeY抗原，包含Fuc2(Galβ1→3GlcNAc)[Fuc2(Galβ1→4GlcNAc)] [V]，或[Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc] [VI]，以及至一雙觸角LeY/LeB抗原，其包含Fuc2(Galβ1-4GlcNAc)[Fuc2(Galβ1-3GlcNAc)] [VII]，或 [Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc] [VIII]，以及其中該抗體或其抗原結合片段並未特異性結合至一單觸角Lex抗原，其包含Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc[IX]，或至一雙觸角Lex抗原，其包含[Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X]，或至一單觸角LeA抗原，其包含Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc[XI]，或至一單觸角H抗原第2型，其包含Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc[XII]，或至一雙觸角H抗原第2型，其包含(Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII]，或至一單觸角H抗原第1型，其包含Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc[XIV]。
在某些本發明揭示的實施例中，該經分離的抗體或其抗原結合片段為單株。
在某些本發明揭示的實施例中，該經分離的抗體或其抗原結合片段為人源化。
在某些實施例中，一經分離之抗體或其抗原結合片段係選自於一Fab片段、一F(ab’)2片段、一Fv片段、一單鏈Fv(ScFv)抗體，以及一雙抗體。
在其他實施例中，係提供一種經分離的抗體或其一抗原結合片段，包含一免疫球蛋白重鏈可變區，其包含具有與胺基酸序列SEQ ID NO：35至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%等同度之一胺基酸序列；以及一免疫球蛋白輕鏈可變區，其包含具有與胺基酸序列 SEQ ID NO：5至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%等同度之一胺基酸序列，其中該抗體或其抗原結合片段可特異性地結合至：至一觸角LeB/LeB抗原，其包含Fuc4(Galβ1→3GlcNAc)2 [I]或[Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc]2 [II]，至一雙觸角LeY/LeY抗原，其包含Fuc4(Galβ1→4GlcNAc)2 [III]或[Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc]2 [IV]，至一雙觸角LeB/LeY抗原，其包含Fuc2(Galβ1→3GlcNAc)[Fuc2(Galβ1→4GlcNAc)] [V]，或[Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc] [VI]，以及至一雙觸角LeY/LeB抗原，其包含Fuc2(Galβ1-4GlcNAc)[Fuc2(Galβ1-3GlcNAc)] [VII]或[Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc] [VIII]，以及其中該抗體或其抗原結合片段並未特異性結合至一單觸角Lex抗原，其包含Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc[IX]，或至一雙觸角Lex抗原，其包含[Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X]，或至一單觸角LeA抗原，其包含Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc[XI]，或至一單觸角H抗原第2型，其包含Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc[XII]，或至一雙觸角H抗原第 2型，其包含(Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII]，或至一單觸角H抗原第1型，其包含Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc[XIV]。
在某些實施例中，一經分離抗體或其抗原結合片段，包含：(a)一免疫球蛋白重鏈可變區，其包含一重鏈互補決定區1(VH CDR1)，其包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列，或具有與胺基酸序列SEQ ID NO：2至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%等同度之一胺基酸序列；一重鏈互補決定區2(VH CDR2)，其包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列，或具有與胺基酸序列SEQ ID NO：3至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%等同度之一胺基酸序列；一重鏈互補決定區3(VH CDR3)，其包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列，或具有與胺基酸序列SEQ ID NO：4至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%等同度之一胺基酸序列；以及(b)一免疫球蛋白輕鏈可變區，其包含一輕鏈互補決定區1(VL CDR1)，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列，或具有與胺基酸序列SEQ ID NO：6至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%等同度之一胺基酸序列；一輕鏈互補決定區2(VL CDR2)，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列，或具有與胺基酸序列SEQ ID NO：7至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%等同度之一胺基酸序列；以及一輕鏈互補決定區3(VL CDR3)其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列，或具有與胺基酸序列SEQ ID NO：8至少90、91、92、 93、94、95、96、97、98或99%等同度之一胺基酸序列。
在其他實施例中，一種經分離抗體或其抗原結合片段，包含如下之(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)，或(vi)或其任一組合：(i)一VH CDR1，其包含胺基酸序列EQ ID NO：2之一變異物，其中該變異物係由位置33之Y→A取代，依據Kabat編號法，所組成；(ii)一VH CDR3，其包含胺基酸序列EQ ID NO：4之一變異物，其中該變異物係由位置104之Y→A取代，依據Kabat編號法，所組成；(iii)一VH CDR3，其包含胺基酸序列EQ ID NO：4之一變異物，其中該變異物係由位置106之H→A取代，依據Kabat編號法，所組成；(iv)一VL CDR1，其包含胺基酸序列EQ ID NO：6之一變異物，其中該變異物係由位置30之Y→A取代，依據Kabat編號法，所組成；(v)一VL CDR2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：7之一變異物，其中該變異物係由位置50之G→A取代，依據Kabat編號法，所組成；或(vi)一VL CDR3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：8之一變異物，其中該變異物係由位置93之T→S取代，依據Kabat編號法，所組成。
在本文所述之任一實施例中，一經分離之抗體或其抗原結合片段與一單觸角Lewis B抗原或一單觸角Lewis Y之結合力可能降低(如在統計學上明顯降低)，與結合至BBC抗體相較，該抗體包含一VL結構域，其具有如SEQ ID NO：27所示之胺基酸序列，以及一VH結構域，其具有如SEQ ID NO：28所示之胺基酸序列。
在其他實施例，係提供一種經分離之抗體或抗原結合片段，其包含本文所述之CDRs(即分別具有與胺基酸序列SEQ ID NO：2、3、4、6、7與8至少90%序列等同度之CDRs，包括具有此述胺基酸取代之CDR變異物)，並包含一免疫球蛋白重鏈可變區，其包含或由具有與胺基酸序列SEQ ID NO：35至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%等同度之一胺基酸序列組成；以及一免疫球蛋白輕鏈可變區，其包含或由具有與胺基酸序列SEQ ID NO：5至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%等同度之一胺基酸序列組成。
在某些實施例中，此述的抗體或其抗原結合片段，包括但不限於scFv，可包含於一融合蛋白中，該融合蛋白可特異性結合至此述之Lewis抗原中。在一些實施例中，融合蛋白可於宿主細胞(例如T細胞、NK細胞或NK-T細胞)的表面表現，並包含一細胞外成分，其包含如本文所揭示的抗體或其抗原結合片段，以及一細胞內成分，其包含一效應子結構域，其可在接收適當信號(如來自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、CD3ε、CD3δ、CD3ζ、CD25、CD27、CD28、CD79A、CD79B、CARD11、DAP10、FcRα、FcRβ、FcRγ、Fyn、HVEM、ICOS、Lck、LAG3、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、Wnt、ROR2、Ryk、SLAMF1、Slp76、pTα、TCRα、TCRβ、TRIM、Zap70、PTCH2之效應子結構域，或其任一組合)時，能夠直接或 間接地促進細胞(例如，免疫系統細胞，例如T細胞)中的免疫反應，其中該細胞外成分和細胞內成分，係經由跨膜結構域連接(例如，CD8跨膜結構域、CD4跨膜結構域、CD27跨模結構域，或CD28跨膜結構域)，且該細胞內成分任擇地包含選自CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)或其組合的共刺激結構域或其部分。在某些實施例中，包含本發明抗體或其抗原結合片段的融合蛋白之細胞外成分，包含衍生自免疫球蛋白如IgG4鉸鏈-CH2-CH3之多胜肽。
在這些和相關的實施例中，一抗原結合片段可包含此述之抗原結合片段如scFv，且該細胞外成分可進一步包含一聯結子區域，其含有鉸鏈如在嵌合性抗原受器分子(CAR)中，其可於宿主細胞如T細胞、NK細胞或NK-T細胞的細胞表面上表現，用於細胞免疫療法。CAR分子和設計原理描述於例如：Sadelain et al.,Cancer Discov.,3(4)：388(2013)；Harris and Kranz,Trends Pharmacol.Sci.,37(3)：220(2016)；Stone et al.,Cancer Immunol.Immunother.,63(11)：1163(2014)；Xu et al.,2018 Oncotarget 9：13991；Androulla et al.,2018 Curr.Pharm.Biotechnol.Volume 19(April 2018)；Wu et al.,2016 Expert Opin.Biol.Ther.16：1469；Ren et al.,2017 Protein Cell 8：634；CAR分子、CAR設計和CAR設計原理，在此併入本案以作為參考資料。
本文亦提供包含本發明抗體或其抗原結合 片段之抗體共軛物；以及與之相連的有效載入分子。作為背景，可使用特異性靶向抗原的單株抗體作為載體分子，以將治療性或可偵測之有效載入分子傳送至抗原表現的位置，例如表現抗原的腫瘤細胞。藉由抗體共軛物與抗原的結合，可允許如將具細胞毒性有效載入或可偵測部分靶向傳送至患病細胞或組織，用於治療、偵測、成像或監測疾病，例如癌症。在某些實施例中，抗體共軛物被標靶細胞攝入，該標靶細胞會在抗體共軛物結合之後或當時表現抗原。攝入至標靶細胞的細胞質或溶酶體區室，可允許有效載入分子的選擇性釋放，例如，導致對標靶細胞的細胞毒性損傷。
可使用各種技術將有效載入分子與一抗體或其抗原結合片段共軛，以形成本發明的抗體共軛物。在一些實施例中，抗體共軛物包含有效載入分子，其藉由一聯結子共價性連結至該抗體或其抗原結合片段。用於抗體共軛物中的聯結子，其包含細胞毒性或抗增殖劑(例如，抗體藥物共軛物)，通常是屬於兩組之一的有機化合物，該組別是根據有效載入分子從載體分子釋放的機制而分組。可切割聯結子設計為根據標靶細胞的固有特性進行選擇性降解或切割：三種類型的可切割聯結子分別為蛋白酶敏感聯結子(其中聯結子的切割，例如包含纈胺酸-瓜胺酸或苯丙胺酸-離胺酸的聯結子二胜肽或四胜肽(例如，GFLG或ALAL)，藉由存在於腫瘤細胞溶酶體中的蛋白酶釋放出該有效載入分子)；pH敏感性聯結子，含有酸不穩定基團， 其藉由胞內體和溶酶體區室的較低pH值(相對於細胞質pH值)而進行選擇性水解；以及穀胱甘肽-敏感性聯結子，其包含被細胞內穀胱甘肽還原的雙硫鍵。不可切割的聯結子依賴於抗體共軛物的非特異性降解，以釋放該有效載入分子。
特定的聯結子、有效載入、聯結子化學和相關的機制和方法，係揭示於Nareshkumar et al.,Pharm.Res.32：3526-3540(2015)，其組成物、方法和技術在此併入本案以作為參考資料。在某些實施例中，抗體共軛物包含一聯結子，選自於可切割聯結子和不可切割聯結子。在進一步實施例中，該聯結子為可切割的聯結子，其選自蛋白酶敏感性聯結子、pH敏感性聯結子，或穀胱甘肽敏感性聯結子。在特定實施例中，該可切割的聯結子為包含纈胺酸-瓜胺酸二胜肽的蛋白酶-敏感性二胜肽。
可使用任一適當的技術或機制將聯結子連接或共軛至該抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，聯結子包含一馬來醯亞胺基(任擇地PEG化)，其能夠與該抗體或其抗原結合片段鉸鏈區中的已還原雙硫鍵反應。載體分子上(即，其抗體或抗原結合片段)適於與聯結子共軛的其他位點，可使用重組技術引入或改造，例如引入半胱胺酸殘基或用於位點特異性共軛的非天然胺基酸。引入此類修飾的方法包括例如PCT公開號WO 2012/032181的範例6.3-7中描述的方法。
在一些實施例中，聯結子更包含一自拆分基 團，也稱為自消耗基團或自消耗間隔基團，以幫助選擇性切割反應。在某些實施例中，該自拆分基團為對胺基苯甲醇(PABC)。
用於產生抗體共軛物的點擊化學物質(Click chemistries)包括描述於Meyer et al.,Bioconjug.Chem.27(12)：2791-2807(2016)中者，其在此併入本案以作為參考資料。
在本文所述的任一抗體共軛物中，該有效載入分子可選自治療劑和可偵測指示劑。適用於癌症治療的治療劑包括揭示於Parslow et al.,Biomedicines 4：14(2016)中者，其中有效載入和ADC設計原理在此併入本案以作為參考資料。在某些實施例中，有效載入分子為選自於微管蛋白-靶向抗-有絲分裂劑、胜肽-基礎毒素、吡咯並苯並二氮雜(PBD)二聚體、抗生素(例如加利車黴素(calicheamicin))、嘧啶合成抑制劑(例如，5-氟尿嘧啶)、抗代謝物(例如甲胺蝶呤)，DNA烷化劑和拓撲異構酶抑制劑(例如多柔比星(doxorubicin))。在進一步實施例中，該有效載入分子選自於美登醇(mayntansinoid)、奧瑞史他汀(auristatin)、單甲基奧瑞史他汀E(monomethylauristatin E，MMAE)，以及單甲基奧瑞史他汀F(monomethylauristatin F，MMAF)。
在其他實施例中，該有效載入分子為可偵測指示劑。適用於抗體共軛物的可偵測指示劑，以及相關的標記策略和成像技術(例如PET、MRI、NIR)，包括揭示 於Friese and Wu,Mol.Immunol.67(200)：142-152(2015)and Moek et al.,J.Nucl.Med.58：83S-90S(2017)，在此完整併入本案以作為參考資料。在某些實施例中，該可偵測指示劑選自於放射性核素、染料、放射性金屬、螢光部分、MRI對比劑、微泡、碳奈米管、金顆粒、氟去氧葡萄醣、酵素、發色團，以及不透放射線的標記物。在一特定實施例中，該可偵測指示劑為放射性核素，選自於68Ga、64Cu、86Y、89Zr、124I、99mTc、123I、111In、177Lu、131I、76Br、78Zr、18F，以及124T。在某些此類實施例中，該抗體共軛物更包含一放射性核素螯合劑，選自於經馬來醯亞胺標記的DOTA、N-羥基琥珀醯亞胺-DOTA，以及去鐵胺(DFO)。
本文亦提供一種醫藥組成物，其包含本發明之抗體、抗原結合片段或抗體共軛物；以及一醫藥載體。
另一態樣中，本發明提供編碼此述抗體或其抗原結合片段的經分離聚核苷酸，與本文揭示之一特定核苷酸序列相較，該聚核苷酸包括至少具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%，或至少99%序列等同性。在某些實施例中，編碼本發明揭示之抗體或其抗原結合片段(例如包括scFv、Fab、F(ab’2)片段、Fv片段或雙抗體)，或編碼一抗體或其抗原結合片段的一部分(例如，重鏈、輕鏈、VH、VL或CDR)的聚核苷酸，與SEQ ID NO：12-22或37之任一者相較， 具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%之序列等同性。在某些實施例中，對聚核苷酸進行密碼子最佳化，以在宿主細胞(例如哺乳動物細胞)中表現。在任一上述實施例中，可以重組載體形式提供聚核苷酸。在某些實施例中，一載體包含一表現控制序列，其操作性地連結至編碼該抗體或其抗原結合片段的聚核苷酸。在某些此類實施例中，載體(例如重組載體)為表現載體，其中表現控制序列包含一啟動子。
在另一態樣中，係提供宿主細胞，其包含一重組載體或此述之表現載體。在一相關觀點中，係提供製造一抗體或其抗原結合片段之方法，該抗體或其抗原結合片段可特異性結合：至一雙觸角LeB/LeB抗原，其包含Fuc4(Galβ1→3GlcNAc)2 [I]或[Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc]2 [II]，至一雙觸角LeY/LeY抗原，其包含Fuc4(Galβ1→4GlcNAc)2 [III]或[Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc]2 [IV]，至一雙觸角LeB/LeY抗原，其包含Fuc2(Galβ1→3GlcNAc)[Fuc2(Galβ1→4GlcNAc)] [V]，或[Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc] [VI]， 以及至一雙觸角LeY/LeB抗原，其包含Fuc2(Galβ1-4GlcNAc)[Fuc2(Galβ1-3GlcNAc)] [VII]或[Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc] [VIII]，以及其中該抗體或其抗原結合片段並未特異性結合至一單觸角Lex抗原，其包含Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc[IX]，或至一雙觸角Lex抗原，其包含[Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X]，或至一單觸角LeA抗原，其包含Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc[XI]，或至一單觸角H抗原第2型，其包含Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc[XII]，或至一雙觸角H抗原第2型，其包含(Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII]，或至一單觸角H抗原第1型，其包含Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc[XIV]，其中該方法包含培養本發明之宿主細胞，在足以使宿主細胞表現編碼該抗體或其抗原結合片段的聚核苷酸之條件與時間下，因而得到包含該抗體或其抗原結合片段之培養物；以及自該培養物回收該抗體或其抗原結合片段。
用於偵測和治療疾病之方法與用途
在某些實施例中，本發明揭示的抗體、其抗原結合片段和抗體共軛物，可用於偵測或治療特徵為表現(例如過度表現)有此述Lewis抗原之疾病的方法中。
如醫學領域的技術人員所理解的，術語“治療(treat)”和“治療(treatment)”是指一個體(即患者、宿 主，可以是人類或非人類動物)的疾病、病症或症狀的醫學管理(請見如Stedman’s Medical Dictionary)。通常，適當的劑量和治療處方係提供一抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物之一或多者，其量足以提供治療或預防益處。由治療性治療或預防性(prophylactic)或預防性(preventative)方法產生的治療或預防益處，包括例如增進的臨床結果，其中該目的是預防或延緩或降低(例如，相對於未治療的對照組，係以統計學上顯著的方式降低)不希望的生理學改變或紊亂，或預防、延緩或降低此種疾病或病症的擴張或嚴重程度。治療個體的有益或期望臨床結果包括緩和、減輕或減緩由待治療的疾病或病症引起或與之相關的症狀；症狀發生率下降；生活品質增進；更長的無病狀態(即，降低個體出現症狀的可能性或傾向，在已進行疾病診斷的基礎上)；降低疾病程度；穩定(即無惡化)疾病狀態；延緩或減緩疾病進展；改善或緩解疾病狀態；以及緩解(無論是部分還是全部)，無論是可偵測的還是不可偵測；或總存活期。
如果個體未接受治療，“治療”亦可指與預期存活相較，延長的存活。需要此述方法和組成物的個體包括已患有疾病或病症的個體，以及傾向於患有或有發展疾病或病症風險的個體。需要治療以降低疾病或病症發生或復發，或需要預防性治療的個體，可包括待降低疾病嚴重度，或部分或完全避免，或不完全或完全預防(例如，降低疾病或病症的發生或復發的可能性，其可包括但不一定 需要絕對預防)該疾病或病症。由此述組成物(以及包含該組成物的製劑)和方法提供的臨床益處，可經由設計和執行體外試驗、臨床前研究和臨床研究來評估，投予該組成物至該個體預計有益，如在範例中描述的。
例如，在某些實施例中，提供了用於治療或偵測癌症的方法(即，此述表現有Lewis抗原的癌症)，其中該方法包含投予有需要個體本發明之醫藥組成物。使用於此，“癌症”是指特徵為患病細胞的異常或不受控制的增殖(例如過度增殖)之病症，其特徵在於體內從第一組織或部位惡性擴散至相鄰或遠處組織或組織群或部位。
在該方法的特定實施例中，該個體患有或懷疑患有癌症，選自於胃癌、結腸癌、乳癌、肺癌、淋巴癌、肝癌、卵巢癌、胰臟前列腺癌、子宮癌，以及鱗狀細胞癌。在進一步實施例中，癌症選自於胃腺癌、黏液性胃腺癌、未分化的胃腺癌、戒環細胞胃癌、結腸腺癌、侵襲性乳導管癌、肝細胞癌、肺腺癌、鱗狀細胞癌、轉移性淋巴結腺癌、黏液性卵巢腺癌、胰導管腺癌、胰乳頭狀腺癌、前列腺腺癌和子宮內膜樣癌。投予本文所述的抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物(以純形式或在適當醫藥組成物中)，可以任一可接受的投藥方式進行，以用於類似的用途。醫藥組成物可藉由將抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物，與適當的生理學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑組合而製備，並可配製成固體、半固體、液體或含氣體之微粒形式(例如，微滴)之製劑，如藥錠、膠囊、粉末、顆粒、軟 膏、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠、微球和氣溶膠。此外，其他醫藥活性成分(包括本文其他地方描述的其他免疫抑制劑)及/或適當賦形劑如鹽類、緩衝劑和穩定劑可，但非必須，存在於該組成物中。
治療的精確劑量和持續時間可為所治療的症狀或疾病的函數，並可使用已知的測試流程憑經驗決定，或經由本領域已知的模型系統中測試組合物，並由其推斷。亦可進行經控制的臨床試驗。劑量亦可隨著待緩解的病症嚴重度而變化。醫藥組成物通常經配製和投予，以發揮治療上有用的效果，同時使不希望的副作用最小化。該組成物可一次投予，或可分成許多較小的劑量，每隔一段時間投予。對於任一特定個體，可根據個體需要隨時間調整特定劑量處方。
組成物的“有效量”是指在所需的劑量和時間段內，足以實現此述的所需臨床結果或有益治療的量。有效量可以一或多次投予傳送。若投予至已知或確認患有疾病或疾病狀態的個體，則術語“治療量”可用於治療，而“預防有效量”則可用於描述投予有效量至易患或有發展該疾病或疾病狀態(例如復發)風險的個體，作為減少(例如，相對於未治療狀態的統計學顯著方式)發生可能性及/或疾病或疾病狀態的嚴重程度的有益及/或保護過程。
在各種實施例中，本發明的抗體共軛物包含如此述的可偵測有效載入，並可用於在體內、體外或離體 偵測如癌症的疾病。在這些和其他實施例中的某些實施例，此述的抗體(即，一或多個抗體)或其抗原結合片段，係與可直接或間接偵測的可能偵測標記共軛(例如，共價性)。在本發明中，任一揭示的單株抗體、其抗原結合片段和抗體共軛物，可與可偵測標記連接(例如，除了抗體共軛物的可偵測或治療性有效載入分子之外)。在“直接偵測”中，僅使用一種可偵測抗體，即一級可偵測抗體。因此，直接偵測表示與可偵測標記共軛的抗體本身即可被偵測，而不需要加入第二抗體(二級抗體)。
“可偵測標記”為可產生可偵測(例如目視、電子或其他方式)信號的分子或材料，其指出樣本中標記物的存在及/或濃度。當與胜肽共軛時，該可偵測標記可用於定位及/或定量特異性胜肽結合的靶標。因此，可藉由偵測由可偵測標記產生的信號，來檢測樣本中標靶的存在及/或濃度。該可偵測標記可直接或間接偵測，且數種共軛至不同特異性抗體之不同可偵測標記，可組合使用，以偵測一或多種標靶。
可直接偵測的可偵測標記範例，包括螢光染料和放射活性物質和金屬顆粒。相反地，間接偵測需要在施加一級抗體後，施加一種多種額外的抗體，即二級抗體。因此，藉由偵測二級抗體或可偵測初級抗體的結合試劑之間的結合，來進行偵測。初級可偵測結合劑或需要加入二級結合劑或抗體的抗體範例，包括酵素可偵測結合劑，以及半抗原可偵測結合劑或抗體。
在一些實施例中，該可偵測標記係共軛至一核酸聚合物，其包含第一結合劑(例如，於ISH、WISH或FISH流程中)。在其他實施例中，該可偵測標記係共軛至一抗體，其包含第一結合劑(例如於IHC流程中)。
可與本發明方法中使用的抗體、其抗原結合片段和抗體共軛物共軛的可偵測標記範例，包括螢光標記、酵素標記、放射性同位素、化學發光標記、電化學發光標記、生物發光標記、聚合物、聚合物顆粒、金屬顆粒、半抗原和染料。
螢光標記的範例包括5-(和6)-羧基螢光素、5-或6-羧基螢光素、6-(螢光素)-5-(和6)-甲醯胺基己酸、異硫氰酸螢光素、羅丹明(rhodamine)、四甲基羅丹明和染料如Cy2、Cy3和Cy5，任擇地經取代的香豆素(coumarin)，包括AMCA、PerCP、藻膽蛋白包括R-藻紅蛋白(RPE)和異硫氰菊酯(APC)、德克薩斯紅(Texas Red)、普林斯頓紅(Princeton Red)、綠色螢光蛋白(GFP)及其類似物，以及R-藻紅蛋白或全藻紅蛋白的共軛物，無機螢光標記，例如半導體系材料顆粒，如經塗覆的CdSe奈米微晶。
聚合物顆粒標記範例包括聚苯乙烯、PMMA或二氧化矽的微粒或膠乳顆粒，其可埋入螢光染料，或含有染料、酵素或受質的聚合物微胞或膠囊。
金屬顆粒標記範例包括金顆粒和經塗覆的金顆粒，其可經由銀染料轉化。半抗原(hapten)的範例包 括DNP、異硫氰酸螢光素(FITC)、生物素和洋地黃毒苷(digoxigenin)。酵素標記的範例包括辣根過氧化物酶(HRP)、鹼性磷酸酶(ALP或AP)、β-半乳醣苷酶(GAL)、葡萄醣-6-磷酸脫氫酶、β-N-乙醯葡醣胺酶、β-葡醣醛酸酶、轉化酶、黃嘌呤氧化酶、螢火蟲螢光素酶，以及葡萄醣氧化酶(GO)。一般使用的辣根過氧化物酶受質範例包括3,3'-二胺基聯苯胺(DAB)、具有鎳增強的二胺基聯苯胺、3-胺基-9-乙基咔唑(AEC)、聯苯胺二氯化氫(BDHC)、Hanker-Yates試劑(HYR)、靛酚藍(Indophane blue)(IB)、四甲基聯苯胺(TMB)、4-氯-1-萘酚(CN)、α-萘酚吡喃酮(α-NP)、鄰-聯茴香胺(OD)、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽(BCIP)、硝基藍四唑(NBT)、2-(對-碘苯基)-3-對-硝基苯基-5-苯基四唑氯化物(INT)、四硝基藍四唑(TNBT)、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-半乳醣苷/鐵-鐵氰化物(BCIG/FF)。
一般使用的鹼性磷酸酶受質範例包括萘酚-AS-B1-磷酸/快紅TR(NABP/FR)、萘酚-AS-MX-磷酸鹽/快紅TR(NAMP/FR)、萘酚-AS-B1-磷酸鹽/-快紅TR(NABP/FR)、萘酚-AS-MX-磷酸鹽/快紅TR(NAMP/FR)、萘酚-AS-B1-磷酸鹽/新洋紅(NABP/NF)、溴氯吲哚磷酸鹽/硝基藍四唑(BCIP/NBT)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-二吡喃半乳醣苷(BCIG)。
發光標記的範例包括發光胺、異發光胺、吖啶酯、1,2-二氧雜環丁烷和吡啶並噠嗪。電化學發光標記 範例包括釕衍生物。放射性標記的範例包括碘化物、鈷、硒、氚、碳、硫和磷的放射性同位素。
可偵測標記可與抗體、其抗原結合片段和此述抗體共軛物，或特異性結合至有興趣生物學標記物的任一其他分子(例如抗體、核酸探針或聚合物)連接。此外，本領域普通技術人員將理解，可偵測標記亦可共軛至第二及/或第三及/或第四及/或第五結合劑或抗體等。此外，技術人員應理解，用於鑑定有興趣生物標記的每一額外結合劑或抗體，可使用作為信號放大步驟。可使用例如光學顯微鏡、螢光顯微鏡、電子顯微鏡，視覺偵測生物標記物，其中該可偵測物質為例如染料、膠體金顆粒、發光試劑。結合至生物標記之視覺可偵測物質，亦可使用分光光度計偵測。當可偵測物質為放射性同位素偵測時，可經由放射自顯影視覺偵測，或者使用閃爍計數器進行非視覺偵測。請見如Larsson,1988,Immunocytochemistry：Theory and Practice,(CRC Press,Boca Raton,Fla.)；Methods in Molecular Biology,vol.80 1998,John D.Pound(ed.)(Humana Press,Totowa,N.J.)。
在某些實施例中，本發明的抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物，係用於偵測或診斷與此述Lewis抗原表現相關的疾病之方法中，其中該方法包含將該抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物，與來自懷疑患有該疾病或有患病風險的個體之樣本接觸，並偵測樣本中抗體：抗原複合物的形成，及/或偵測抗體、抗原結合片段或抗體共軛 物的特異性結合。在某些實施例中，該樣本包含血液(例如周邊血液)、組織、腫瘤或其任一組合。在某些實施例中，該診斷或偵測方法係離體或在體外進行。
體內偵測具有可偵測有效載入或可偵測標記的抗體共軛物之方法包括描述於Friese and Wu,Mol.Immunol.67(200)：142-152(2015)and Moek et al.,J.Nucl.Med.58：83S-90S(2017)，在此併入本案以作為參考資料。在某些實施例中，抗體、抗原結合片段或抗體共軛物的偵測包含進行正電子發射斷層掃描(PET)、磁共振成像(MRI)、近紅外成像(NRI)、X-射線電腦斷層掃描(CT)、單光子發射電腦斷層掃描(SPECT)、光學成像、超音波檢查或其任一組合。
較佳的投藥模式取決於待治療病症的性質，在某些實施例中，其意指可降低(例如，相對於如未處理對照組的適當控制情況下，統計學上顯著的降低)有害或臨床上不希望的症狀，其程度、嚴重程度、發生可能性及/或持續時間，根據本文提供的某些方法。在投予後，可偵測地減少、抑制、至少部分地預防、降低嚴重度或發生機率，或延遲此症狀，例如部分或完全減少腫瘤負荷，或部分或完全降低轉移擴散，視為有效。相關領域的技術人員將熟悉任何診斷、手術及/或其他臨床標準，其可指示投予本文所述組成物的臨床適用性及/或可採用性，請見如，Hanahan and Weinberg,2011 Cell 144：646；Hanahan and Weinberg 2000 Cell 100：57；Cavallo et al.,2011 Canc.Immunol.Immunother.60：319；Kyrigideis et al.,2010 J.Carcinog.9：3；Park et al.2009 Molec.Therap.17：219；Cheever et al.,2009 Clin Cancer Res 15(17)：5323-5337；Lu et al.,2013 Curr.Pharm.Biotechnol.14：714-22；Layke et al.,2004 Am.Fam.Physician 69：1133049；Bunn,2012 Arch.Pathol.Lab.Med.136：1478-81；Manne et al.,2005 Drug Discov.Today 10：965；Schmoll et al.(Eds.),2009 ESMO Handbook of Cancer Diagnosis and Treatment Evaluation,CRC Press,Boca Raton,FL；Faix,2013 Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.50(1)：23-36(“Biomarkers of Sepsis”)；Wiersinga et al.,2014 Virulence 5(1)：36-44(“Host innate immune responses to sepsis”)；Hotchkiss et al.,2013 Nat.Rev.Immunol.13：862；Aziz et al.,2013 J.Leukoc.Biol.93(3)：329；Beyrau et al.,2012 Open Biol.2：120134；Fry,2012 Amer.Surg.78：1；Kellum et al.,2007 Arch.Intern.Med.167(15)：1655；Remick,2007 Am.J.Pathol.170(5)：1435；Hotchkiss et al.,2003 New Engl.J.Med.348：138-150；Humar et al.,Atlas of Organ Transplantation,2006,Springer；Kuo et al.,Comprehensive Atlas of Transplantation,2004 Lippincott,Williams & Wilkins；Gruessner et al.,Living Donor Organ Transplantation,2007 McGraw-Hill Professional；Antin et al.,Manual of Stem Cell and Bone Marrow Transplantation,2009 Cambridge University Press；Wingard et al.(Ed.),Hematopoietic Stem Cell Transplantation：A Handbook for Clinicians,2009 American Association of Blood Banks；以及其中引用的參考文獻。
因此，投予這些與相關的醫藥組成物之典型途徑包括但不限於口服、局部、經皮、吸入、腸胃外、舌下、口腔、直腸、陰道和鼻內。本文所用的術語“腸胃外”包括皮下注射、靜脈內、肌肉內、胸骨內注射或輸注技術。本發明某些實施例的醫藥組成物係經配製，以使其中包含的活性成分，在投予組成物至個體後，為生物可利用的。將投予至個體或患者的組成物，可採取一或多種劑量單位形式，其中例如，藥錠可為單一劑量單位，且此述氣溶膠形式之抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物的容器，可保存複數個劑量單位。製備這種劑型的實際方法對於本領域技術人員來說是已知的，或者是顯而易見的。請見如Remington：The Science and Practice of Pharmacy,20th Edition(Philadelphia College of Pharmacy and Science,2000)。在任一情況下，待投予的組成物將含有治療有效量的本發明抗體、其抗原結合片段，或抗體共軛物，用於依據本文揭示治療感興趣的疾病或病症。在某些實施例中，該投藥包含經由選自於靜脈內、腸胃外、胃內、胸膜內、肺內、直腸內、皮內、腹膜內、瘤內、皮下、口服、局部、經皮、腦池內、鞘內、鼻內和肌肉內的途徑投 予。
醫藥組成物可為固體或液體形式。在一實施例中，該載體為顆粒，使得組成物可為如藥錠或粉末形式。該載體可為液體，組成物為例如口服油、注射液或氣溶膠，其可用於如吸入投予。當用於口服投予時，醫藥組成物較佳為固體或液體形式，其中半固體、半液體、懸浮液和凝膠形式包括在本文考慮的固體或液體形式中。
作為用於口服投予的固體組成物，可將醫藥組成物配製成粉末、顆粒、壓縮藥錠、丸劑、膠囊、口香糖、薄片或類似物。此種固體組成物通常含有一或多種惰性稀釋劑或可食用載體。此外，可存在下列之一或多者：黏合劑如羧甲基纖維素、乙基纖維素、微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑如澱粉、乳醣或糊精，崩解劑如海藻酸、海藻酸鈉、Primogel、玉米澱粉及類似物；潤滑劑如硬脂酸鎂或Sterotex；助流劑如膠體二氧化矽；甜味劑如蔗醣或糖精；調味劑如薄荷、水楊酸甲酯或橘子調味料；以及著色劑。當醫藥組成物為膠囊形式時，例如明膠膠囊，除了上述類型物質外，亦可含有液體載體如聚乙二醇或油。
醫藥組成物可為液體形式，例如酏劑、糖漿、溶液、乳液或懸浮液。作為兩個範例，液體可用於口服投藥或經由注射傳送。當用於口服投藥時，較佳的組合物，除本發明化合物外，尚含有一或多種甜味劑、防腐劑、染料/著色劑和增味劑。在經由注射投藥的組成物中，可包括一或多種界面活性劑、防腐劑、潤濕劑、分散劑、懸浮 劑、緩衝劑、穩定劑和等張劑。
液體醫藥組成物，無論是溶液、懸浮液或其他類似形式，可包括一或多種以下佐劑：無菌稀釋劑，例如注射用水、生理食鹽水溶液，較佳為生理食鹽水、林格氏溶液、等滲氯化鈉、固定用油如可作為溶劑或懸浮介質的合成單甘油酯或甘油二酯，聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶劑；抗菌劑如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩衝劑如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，以及用於調節滲透壓的試劑如氯化鈉或右旋醣。腸胃外製劑可封裝在安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料製成的多劑量小瓶中。生理食鹽水為較佳的佐劑。可注射醫藥組成物較佳為無菌。
用於腸胃外或口服投藥的液體醫藥組成物應含有一定量的本發明之抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物，以獲得適當劑量。通常，此量為組成物中抗體或抗原結合片段的至少0.01%。當用於口服投藥時，該量可於組成物重量之0.1至約70%之間變化。某些口服醫藥組成物含有約4%至約75%的抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物。在某些實施例中，本發明之醫藥組成物和製劑係製備為可使腸胃外劑量單位在稀釋前含有0.01至10%重的抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物。
該醫藥組成物可用於局部投藥，在此種情況下，載體可適當地包含一溶液、乳液、軟膏或凝膠基底。基底可包含如下列之一或多者：凡士林、羊毛脂、聚乙二 醇、蜂蠟、礦物油、稀釋劑如水和醇，以及乳化劑和穩定劑。增稠劑可存在於局部投藥的醫藥組成物中。若用於經皮投藥，該組成物可包括經皮貼劑或離子電滲療法裝置。該醫藥組成物可用於直腸投藥，例如栓劑形式，其將在直腸中融化並釋放藥物。用於直腸投藥的組成物可含有油性基底作為適當之非刺激性賦形劑。這些基底包括但不限於羊毛脂、可可脂和聚乙二醇。
該醫藥組成物可包括各種材料，其修飾固體或液體劑量單位的物理形式。例如，該組成物可包括在活性成分周圍形成塗層殼的材料。形成塗層殼的材料通常為惰性，並可選自例如蔗糖、蟲膠和其他腸溶包衣劑。或者，可將活性成分包裹在明膠膠囊中。固體或液體形式的醫藥組成物可包括與本發明之抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物結合的試劑，因而有助於化合物的傳送。可以此種能力發揮作用的適當試劑包括單株或多株抗體、一或多種蛋白質或脂質體。醫藥組成物基本上可由劑量單位組成，其可以作為氣溶膠投藥。術語氣溶膠用於指稱多種系統，從具膠體特性者到由加壓包裝組成的系統。可經由液化或壓縮氣體或適當泵系統進行輸送，分配活性成分。氣溶膠可以單相、雙相或三相系統傳送，以傳遞送活性成分。氣溶膠的傳送包括必要的容器、活化器、閥門、子容器及類似物，它們可一起形成套組。本領域一般技術人員無需過多實驗即可確定較佳的氣溶膠。
該醫藥組成物可經由醫藥領域熟知的方法 製備。例如，經由注射投藥的醫藥組成物，可經由組合一組成物，其包含此述抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物，以及任擇地一或多種鹽類、緩衝劑及/或穩定劑，加入無菌蒸餾水，以形成溶液而製備。可加入界面活性劑以促進均相溶液或懸浮液的形成。界面活性劑是與胜肽組成物進行非共價交互作用的化合物，以促進該抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物在水性傳送系統中的溶解或均勻懸浮。
該組成物係以治療有效量投藥，其將根據多種因素而變化，包括所用特定化合物的活性；該化合物的代謝穩定性和作用時間長度；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；投藥的模式和時間；排泄率；藥物組合；特定疾病或症狀的嚴重程度；以及正在接受治療之個體。通常，治療有效每日劑量(對於70kg哺乳動物)為約0.001mg/kg(即0.07mg)至約100mg/kg(即7.0g)；較佳治療有效劑量(對於70kg哺乳動物)為約0.01mg/kg(即0.7mg)至約50mg/kg(即3.5g)；更佳地，治療有效劑量(對於70kg哺乳動物)為約1mg/kg(即70mg)至約25mg/kg(即1.75g)。
包含本發明抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物之組成物，亦可在一或多種其他治療劑的同時、之前或之後投藥。此種組合療法可包括投予含有本發明化合物和一或多種其他活性劑的單一藥物劑量製劑，以及投予包含本發明抗體、抗原結合片段或抗體共軛物的組成物，且每一活性劑各自位於獨立的藥物劑型中。例如，此述之抗 體、其抗原結合片段或抗體共軛物和其它活性劑，可以單一口服劑量組成物形式，例如藥錠或膠囊，一起投予患者，或者每一藥劑可以單獨的口服劑量配方投予。類似地，本發明之抗體、抗原結合片段或抗體共軛物和其它活性劑，可位於單一腸胃外劑量組成物中，一起投予患者，例如位於生理食鹽水溶液或其他生理學上可接受的溶液中，或每一藥劑可以單獨的腸胃外劑量配方投予。當使用單獨的劑量配方時，該包含抗體與一或多種其他活性劑之組成物，可基本上在同一時間，即同時，或在分開的交錯時間，即依序地和以任一順序投藥；合併治療應理解為包括所有這些處方。
因此，在某些實施例中，亦考慮包含本發明抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物，與一或多種其他治療劑組合投藥。本領域可接受此類治療劑作為此述的特定疾病狀態的標準治療，例如癌症。預期的示範性治療劑包括細胞因子、生長因子、類固醇、NSAID、DMARD、抗發炎藥、化學治療劑、免疫檢查點抑制劑、干擾RNA、刺激性免疫檢查點分子的協同劑、另一靶向癌症的抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物，或其他活性和輔助試劑。
如本文所用，術語“免疫抑制劑(immune suppression agent)”或“免疫抑制劑(immunosuppression agent)”是指一或多種細胞、蛋白質、分子、化合物或複合物，其提供抑制信號以幫助控制或抑制免疫應答。例如，免疫抑制劑包括那些部分或完全 阻斷免疫刺激；降低、預防或延遲免疫活化；或增加、活化或上調免疫抑制的分子。用於靶向(例如，使用免疫檢查點抑制劑)的示範性免疫抑制劑包括PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、CTLA4、B7-H3、B7-H4、CD244/2B4、HVEM、BTLA、CD160、TIM3、GAL9、KIR、PVR1G(CD112R)、PVRL2、腺苷、A2aR、免疫抑制細胞介質(如IL-10、IL-4、IL-1RA、IL-35)、IDO、精胺酸脢、VISTA、TIGIT、LAIR1、CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5、Treg細胞，或其任一組合。
免疫抑制劑(也稱為免疫檢查點抑制劑)可為一化合物、抗體、抗體片段或融合多肽(例如，Fc融合物，例如CTLA4-Fc或LAG3-Fc)、反義分子、核酶或RNAi分子，或低分子量有機分子。在本文揭示的任一實施例中，一方法可包含投予本發明抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物，與任一種下列免疫抑制成分的一或多種抑制劑，以單獨或以任一組合形式。
在某些實施例中，本發明之抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物，係與PD-1抑制劑組合使用，例如PD-1特異性抗體，例如匹迪組單抗(pidilizumab)、保疾伏(nivolumab)、吉舒達(pembrolizumab)、MEDI0680(以前的AMP-514)、AMP-224、BMS-936558，或其抗原結合片段，或其任一組合。在進一步的實施例中，本發明的抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物，係與PD-L1特異性抗體組合使用，例如BMS-936559、度伐魯單抗 (durvalumab，MEDI4736)、阿替左單抗(atezolizumab，RG7446)、阿維魯單抗(avelumab，MSB0010718C、MPDL3280A，或其抗原結合片段，或其任一組合。
在某些實施例中，本發明的抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物，係與LAG3抑制劑組合使用，例如LAG525、IMP321、IMP701、9H12、BMS-986016或其任一組合。
在某些實施例中，本發明的抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物，係與CTLA4抑制劑組合使用。在特定實施例中，本發明的抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物，係與CTLA4特異性抗體或其結合片段組合使用，例如依匹立姆單抗(ipilimumab)、曲米立姆單抗(tremelimumab)、CTLA4-Ig融合蛋白(例如，阿巴塔西(abatacept)、畢拉塔西(belatacept))，或其任一組合。
在某些實施例中，本發明的抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物，係與B7-H3特異性抗體或抗原結合片段，例如依諾立茲單抗(enoblituzumab，MGA271)、376.96或兩者，組合使用。B7-H4抗體結合片段可為一scFv或其融合蛋白，如描述於Dangaj et al.,Cancer Res.73：4820,2013，以及描述於美國專利號9,574,000和PCT專利公開號WO 2016/40724A1與WO 2013/025779A1。
在某些實施例中，本發明的抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物，係與CD244的抑制劑組合使用。在某些實施例中，本發明的抗體、其抗原結合片段或抗體共 軛物，係與BLTA、HVEM、CD160或其任一組合的抑制劑組合使用。抗-CD160抗體描述於如PCT公開號WO2010/084158中。
在某些實施例中，本發明的抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物，係與TIM3的抑制劑組合使用。在某些實施例中，本發明的抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物，係與Gal9的抑制劑組合使用。
在某些實施例中，本發明的抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物，係與腺苷訊息傳遞的抑制劑(例如誘餌腺苷受器)組合使用。在某些實施例中，本發明的抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物，係與A2aR的抑制劑組合使用。
在某些實施例中，本發明的抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物，係與KIR的抑制劑，例如依立路單抗(lirilumab，BMS-986015)組合使用。在某些實施例中，本發明的抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物，係與抑制性細胞因子(通常，除TGF β之外的細胞因子)或Treg發育或活性的抑制劑組合使用。
在某些實施例中，本發明的抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物，係與IDO抑制劑組合使用，例如左旋-1-甲基色胺酸、依巴卡斯代(epacadostat)(INCB024360；Liu et al.,Blood 115：3520-30,2010)、依比西崙(ebselen)(Terentis et al.,Biochem.49：591-600,2010)、引度西默(indoximod)、NLG919(Mautino et al.,American Association for Cancer Research 104th Annual Meeting 2013；Apr 6-10,2013)、1-甲基-色胺酸(1-MT)-札拉明(tira-pazamine)，或其任一組合。
在某些實施例中，本發明的抗體、抗原結合片段或抗體共軛物係與精胺酸酶抑制劑組合使用，例如N(ω)-硝基-L-精胺酸甲酯(L-NAME)、N-ω-羥基-正-L-精胺酸(正-NOHA)、L-NOHA、2(S)-胺基-6-硼己酸(ABH)、S-(2-硼乙基)-L-半胱胺酸(BEC)，或其任一組合。
在某些實施例中，本發明的抗體、抗原結合片段或抗體共軛物係與VISTA抑制劑組合使用，例如CA-170(Curis，Lexington，MA)。
在某些實施例中，本發明的抗體、抗原結合片段或抗體共軛物係與TIGIT抑制劑組合使用，例如COM902(Compugen，Toronto，Ontario Canada)、CD155抑制劑例如COM701(Compugen)，或兩者兼而有之。
在某些實施例中，本發明的抗體、抗原結合片段或抗體共軛物係與PVRIG、PVRL2或兩者的抑制劑組合使用。抗-PVRIG抗體描述於例如PCT公開號WO 2016/134333中。抗-PVRL2抗體描述於例如PCT公開號WO 2017/021526中。
在某些實施例中，本發明的抗體、抗原結合片段或抗體共軛物係與LAIR1抑制劑組合使用。
在某些實施例中，本發明的抗體、抗原結合片段或抗體共軛物係與CEACAM-1、CEACAM-3、 CEACAM-5抑制劑或其任一組合組合使用。
在某些實施例中，本發明的抗體、抗原結合片段或抗體共軛物係與可增加刺激性免疫檢查點分子活性的藥劑(即協同劑)組合使用。例如，本發明的抗體、抗原結合片段或抗體共軛物可與CD137(4-1BB)協同劑(例如，尤瑞魯單抗(urelumab))、CD134(OX-40)協同劑(例如MEDI6469、MEDI6383或MEDI0562)、來那度胺(lenalidomide)、博瑪度胺(pomalidomide)、CD27協同劑(例如CDX-1127)、CD28協同劑(例如、TGN1412、CD80或CD86)、CD40協同劑(例如CP-870,893、rhuCD40L或SGN-40)、CD122協同劑(例如IL-2)、GITR的協同劑(例如PCT專利公開號WO 2016/054638中描述的人源化單株抗體)、ICOS協同劑(CD278)(例如，GSK3359609、mAb 88.2、JTX-2011、Icos 145-1、Icos 314-8，或其任一組合)。在本文揭示的任一實施例中，該方法可包含將本發明的抗體、抗原結合片段或抗體共軛物與刺激性免疫檢查點分子(包括任一前述之分子)的一或多種協同劑單獨或以任一組合投予。
在某些實施例中，組合療法包含本發明的抗體、抗原結合片段或抗體共軛物，並包含以下一或多種的第二療法：特異於癌症表現之抗原(即相同或不同的抗原)的另一種抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物、放射治療、手術、化學治療劑、細胞因子、RNAi或其任一組合。
在某些實施例中，組合治療方法包含投予本 發明的抗體、抗原結合片段或抗體共軛物，並進一步施用放射治療或手術。放射療法在本領域中是眾所周知的，包括X射線療法，例如γ-照射和放射性藥物療法。適於治療個體中特定癌症的手術和手術技術是本領域一般技術人員所熟知的。正子療法綜述於Thariat et al.,Bull.Cancer pii：S0007-4551(1)300001-8(2018)。
在某些實施例中，組合治療方法包含投予本發明的抗體、抗原結合片段或抗體共軛物，並進一步投予化學治療劑。化學治療劑包括但不限於染色質功能抑制劑、拓撲異構酶抑制劑、微管抑制藥物、DNA損傷劑、抗代謝物(如葉酸拮抗劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物和醣修飾類似物)、DNA合成抑制劑、DNA交互作用劑(如嵌入劑)和DNA修復抑制劑。示範性化學治療劑包括但不限於以下群組：抗代謝物/抗癌劑，例如嘧啶類似物(5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、卡培他濱(capecitabine)、吉西他濱(gemcitabine)和阿醣胞苷(cytarabine))和嘌呤類似物、葉酸拮抗劑和相關抑制劑(巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、噴司他丁(pentostatin)和2-氯去氧腺苷(克拉屈濱(cladribine))；抗增殖/抗有絲分裂劑，包括天然產物如長春花生物鹼(長春鹼、長春新鹼和長春瑞濱)等、微管破壞劑如紫杉烷(紫杉醇、多西紫杉醇)、長春新鹼、長春花鹼、諾考達唑(nocodazole)、埃博黴素(epothilones)與諾維本(navelbine)、表鬼臼毒素(epidipodophyllotoxins)(依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide))、DNA損傷劑(放 線菌素、安吖嗪(amsacrine)、蒽環黴素、博來黴素(bleomycin)、白消煙(busulfan)、喜樹鹼(camptothecin)、卡鉑、苯丁酸氮芥、順鉑、環磷醯胺、環磷醯胺(Cytoxan)、放線菌素(dactinomycin)、柔紅黴素(dactinomycin)、多柔比星(doxorubicin)、表阿黴素(epirubicin)、六甲基美沙芬(hexamethylmelamineoxaliplatin)、異環磷醯胺(iphosphamide)、美法崙(melphalan)、甲基丙烯醯胺、絲裂黴素、米托蒽醌(mitoxantrone)、亞硝基脲、普利卡黴素(plicamycin)、丙卡巴肼(procarbazine)、紫杉醇(taxol)、剋癌易(taxotere)、帝盟多(temozolamide)、替尼泊苷(teniposide)、三亞乙基硫代磷醯胺和滅必治(etoposide)(VP 16)；抗生素如放線菌素(放線菌素D)、柔紅黴素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)(阿黴素(adriamycin))、伊達比星(idarubicin)、蒽環黴素(anthracyclines)、米托蒽醌(mitoxantrone)、博來黴素(bleomycins)、普魯黴素(plicamycin)(光神黴素(mithramycin))和絲裂黴素；酵素(L-天冬醯胺酶，其系統性地代謝L-天冬醯胺並剝奪不具有合成自身天冬醯胺能力的細胞)；抗血小板試劑；抗增殖/抗有絲分裂烷化劑、如氮芥(甲基二氯乙基胺、環磷醯胺和類似物、美法崙(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil))、乙烯亞胺和甲基三聚氰胺(六甲基三聚氰胺和噻替哌(thiotepa))、烷基磺酸鹽-泛硫酸鹽、亞硝基脲類(卡莫司汀(carmustine)(BCNU)和類似物、鏈脲佐菌素(streptozocin))、三肼-達卡苯肼 (trazenes-dacarbazinine)(DTIC)；抗增殖/抗有絲分裂抗代謝物如葉酸類似物(甲胺蝶呤)；鉑配位配合物(順鉑、卡鉑)、丙卡巴肼(procarbazine)、羥基脲、米托坦(mitotane)、胺基戊二醯亞胺；賀爾蒙、賀爾蒙類似物(雌激素、他莫昔芬(tamoxifen)、戈舍瑞林(goserelin)、比卡魯胺(bicalutamide)、尼魯米特(nilutamide))和芳香酶抑制劑(來曲唑(letrozole)、阿那曲唑(anastrozole))；抗凝血劑(肝素、合成肝素鹽和其他凝血酶抑制劑)；纖維蛋白溶解劑(如組織纖溶酶原激活劑、鏈激酶和尿激酶)、阿司匹林(aspirin)、雙嘧達莫(dipyridamole)、噻氯匹定(ticlopidine)、氯吡格雷(clopidogrel)、阿昔單抗(abciximab)；抗遷移劑；抗分泌劑(布雷菲爾德菌素(breveldin))；免疫抑制劑(環孢菌素、他克莫司(tacrolimus)(FK-506)、西羅莫司(sirolimus)(雷帕黴素(rapamycin))、硫唑嘌呤、黴酚酸酯、睦體康(mofetil))；抗血管生成化合物(TNP470、金雀異黃酮苷素(genistein))，和生長因子抑制劑(血管內皮生長因子(VEGF)抑制劑、成纖維細胞生長因子(FGF)抑制劑)；血管收縮素受器阻斷劑；一氧化氮供體；反義寡核苷酸；抗體(曲妥珠單抗(trastuzumab)、利妥昔單抗(rituximab))；嵌合抗原受器；細胞週期抑制劑和分化誘導劑(維甲酸(tretinoin))；mTOR抑制劑、拓撲異構酶抑制劑(多柔比星(doxorubicin)(阿黴素(adriamycin))、安吖啶(amsacrine)、喜樹鹼(camptothecin)、柔紅黴素 (daunorubicin)、放線菌素(dactinomycin)、恩尼泊苷(eniposide)、表柔比星(epirubicin)、依托泊苷(etoposide)、伊達比星(idarubicin)、伊立替康(irinotecan)(CPT-11)和米托蒽醌(mitoxantrone)、托泊替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan))、皮質類固醇(可的松(cortisone)、地塞米松(dexamethasone)、氫化可的松(hydrocortisone)、甲基強的松龍(hydrocortisone)、潑尼松(prednisone)和潑尼松龍(prenisolone))；生長因子信號轉導激酶抑制劑；粒腺體功能障礙誘導劑、毒素如霍亂毒素(Cholera toxin)、蓖麻毒素(ricin,)、假單胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)腺苷酸環化酶毒素或白喉毒素，和半胱胺酸蛋白酶(caspase)激活劑；以及染色質破壞劑。
細胞因子可用於操縱宿主對抗癌活性的免疫反應。請見如，Floros & Tarhini,Semin.Oncol.42(4)：539-548,2015。用於促進免疫抗癌或抗腫瘤反應的細胞因子包括例如IFN-α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-24與GM-CSF，單獨或與本發明的抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物之任一組合。
細胞免疫療法，包括涉及表現天然或重組癌症抗原特異性TCR和CAR的T細胞、NK細胞或NK-T細胞者，以及將這些細胞過繼轉移至接受者的細胞免疫療法，是一種新興的癌症治療方式(請見例如，Bonini and Mondino,Eur.J.Immunol.45(9)：2457-69(2015)和Metha and Rezvani,Front.Immunol.9：283(2018))。在某些實施例中，接受本發明的抗體、其抗原結合片段或抗體共軛物(或醫藥組成物)的個體已或正在(即，並行、同時或依次)接受靶向癌症的細胞免疫療法。
本文亦提供本發明的抗體、其抗原結合片段、抗體共軛物、多核苷酸、載體、宿主細胞和組成物之任一者，用於治療、檢測或診斷以Lewis抗原的表現(例如，過度表現)為特徵的疾病。在某些實施例中，該疾病是癌症，例如本文揭示的任一癌症。在某些實施例中，抗體、其抗原結合片段、抗體共軛物或組成物係用於本文所述的任一組合療法中。
本文亦提供本發明的抗體、其抗原結合片段、抗體共軛物、聚核苷酸、載體、宿主細胞和組成物之任一者，用於製備藥物，以治療以Lewis抗原的表現(例如，過度表現)為特徵的疾病。在某些實施例中，該疾病是癌症，例如本文揭示的任一癌症。在某些實施例中，該藥物包含或用於本文所述的任一組合療法中。
如在本說明書和所附申請專利範圍中所使用的，單數形式“一(a)”、“一個(an)”和“該(the)”包括複數指代，除非內容另有明確說明。此外，替代詞(例如，“或”)的使用，應理解為意指替代詞中的一個、兩個或其任一組合。
在整份說明書中，除非上下文另有要求，否 則詞語“包含(comprise)”、“具有(have)”，或變化如“具有(has)”、“具有(having)”、“包含(comprises)”或“包含(comprising)”，將被理解為暗示包含所陳述的元素或整數或元素或整數群，但不排除任一其他元素或整數或元素或整數群。在本說明書中，任一濃度範圍、百分比範圍、比例範圍或整數範圍，應理解為包括所述範圍內的任一整數值，並在適當時，包括其分數(例如，某一整數之十分之一和百分之一)，除非另有說明。此外，除非另有說明，否則本文所述相關於任一物理特徵，例如聚合物次單、尺寸或厚度，的任一數字範圍，應理解為包括所述範圍內的任一整數。
如本文所用，術語“約”是指不超過指定範圍、數值或結構的±20%，除非另有說明，或在某些實施例中不超過指定範圍、數值或結構的±50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、10、9、8、7、6或5%，除非另有說明。
此外，應當理解，本申請案揭示衍生自本文所述結構和取代基的各種組合的各化合物或化合物群組，其內容如每種化合物或化合物群組之各自設定。因此，特定結構或特定取代基的選擇亦落於本發明範圍內。
術語“基本上由......組成”不等同於“包含”，並且是指申請專利範圍中的特定材料或步驟，或者對實質上不影響所申明主旨的基本特徵者。
除非另外明確說明，否則本說明書中的每個 實施例應比照適用於每一其他實施例。
範例 範例1 嵌合性BBC抗體之產生 抗體可變區cDNA之分離
表現鼠類IMH2/BBC抗體的融合瘤細胞，其包含具有如SEQ ID NO：27所示胺基酸序列的VL結構域，以及具有如SEQ ID NO：28所示胺基酸序列的VH結構域，得自Dr.S.Hakomori(Cancer Research 52：3739-3745(1992))。為了製備用於cDNA合成的RNA，首先經由低速離心(300g，5分鐘)收穫9×106個融合瘤細胞，然後使用“總RNA小量製備純化套組”TM(GeneMarkTM,GMbiolab Co.Ltd.,Taichung City,Taiwan,ROC)，根據製造商的流程進行RNA分離。然後使用SMART RACE cDNA Amplification KitTM(Takara/BD Biosciences-Clontech,Palo Alto,CA)，從純化的RNA選殖出編碼IMH2的抗體基因，將供應商建議的流程稍作修改。
簡言之，在第一股cDNA合成和dC-加尾後，使用套組供應的引子和基於已知小鼠κ鏈序列設計的特異性引子，經由兩輪PCR分離出特異性編碼IMH2的輕鏈可變區之cDNA。第一次PCR，在94℃下30秒，在72℃下1分鐘，進行5個循環；然後在94℃下30秒，在67℃下30秒 和在72℃下1分鐘，進行5個循環。進行二十七(27)個額外的PCR反應循環，包含在94℃下30秒，在62℃下30秒，和在72℃下1分鐘，以確保成功倍增。第二次巢式PCR，包括94℃預熱5分鐘，之後進行94℃ 30秒、54℃ 30秒和72℃ 1分鐘，進行35個循環，最後進行72℃ 3分鐘之延伸步驟，以進一步提高忠實度。
重鏈基因的選殖策略稍有不同。首先，單鏈cDNA模板係以恆定結構域1(CH1)的小鼠IgG3特異性引子，以PCR反應自RNA製備。之後以單一回合的PCR反應進行基因分離，如下：在94℃預熱5分鐘，35個循環的PCR反應，包括94℃，30秒、62℃，30秒、72℃，1分鐘，隨後在NUP引子((SMARTTM RACE倍增套組，Clontech,Palo Alto,CA)和小鼠CH1結構域的巢式引子存在下，進行最終延伸步驟，於72℃下保持5分鐘。之後使用PCR純化套組(GeneMarkTM GMbiolab Co.Ltd.,ROC)純化編碼輕鏈和重鏈片段的可變區cDNA，並導入yT & A選殖載體(Yeastern BiotechTM,Taipei,Taiwan,ROC)用於陽性植株識別和決定序列。
抗體表現質體之建構
為了構建用於產生本文稱為“BBC”抗體的抗體之表現質體，係使用PCR引子和選殖於上述yT & A載體中的抗體基因，僅製備編碼成熟(無前導胜肽)重鏈和輕鏈可變區的cDNA。PCR如下進行：在94℃預熱5分鐘，35個循環的PCR反應，其包含94℃，30秒、65℃，30秒和72 ℃，60秒，最後進行延伸步驟72℃，3分鐘。限制酶識別序列在PCR反應期間，在VH cDNA的5'(NheI)和3'(ApaI)末端，以及VL cDNA的5'(NheI)和3'(BsiWI)末端加入，以幫助之後的表現質體改造。經倍增的cDNA片段之後以限制酶切割，依序使用用於重鏈基因之ApaI/NheI，以及用於輕鏈基因之NheI/BsiWI。凝膠純化後，將回收的VH和VL cDNA於相同的限制酶選殖位點上連接到pGNX-RhcG1(VH)或pGNX-Rhck載體(VL)上，分別得到表現載體pGNX-RhcG1-BBC和pGNX-Rhck-BBC。使用多重選殖位點上游的引子確認插入的cDNA序列。
短暫製造抗體
對於嵌合BBC抗體的暫時產生，在聚乙烯亞胺存在下，係以編碼重鏈和輕鏈之pGNX-RhcG1-BBC和pGNX-Rhck-BBC表現質體共轉染HEK293-c18細胞。在轉染後第7天結束時收穫培養物上清液用於分析。
範例2 產生人源化BBC抗體
為了產生人源化形式的BBC抗體(如上文範例1中所述)，選擇同源人類抗體序列(人類接受子)進行CDR嫁接。簡而言之，經由搜索NCBI蛋白質數據庫來辨識出潛在的人類接受子序列，以定位與BBC抗體的重鏈(SEQ ID NO：28)和輕鏈(SEQ ID NO：27)具有最高同源性的序列。選擇人類接受子框架CAD89404.1(Vh)和 AAS01771.1(V1)(圖1)。然而，將非人類CDR序列直接插入人類接受子框架，可能導致結合親和力的喪失。來自人類接受子的框架殘基轉移回非人類供體序列後，可恢復結合親和力。較佳的恢復突變係藉由維持原始CDR構形來恢復結合親和力。
為了恢復CDR嫁接後的結合親和力，首先使用Accelrys Discovery StudioTM(BIOVIA,San Diego,CA)軟體，以BBC晶體結構數據為基礎構建抗體的3-D模型。之後如下檢查結構以預測關鍵胺基酸的恢復突變：
1.計算人源化框架上變化殘基的突變能量(穩定性)。突變能量的正值對應於突變的不穩定效應，反之亦然。
2.檢查框架殘基和CDR區之間的空間距離。最接近CDR的殘基(4Å以內)被考慮在內。
3.檢查位於重鏈可變區和輕鏈可變區界面的殘基。這些殘基有助於重鏈和輕鏈的組裝，因此可能對抗體結構產生顯著影響。
最初選出基於預測標準的十(10)個影響位置(輕鏈中3個和重鏈中7個)用於恢復突變。此外，所選出之人類重鏈模板的位置70(根據Kabat編號)的甲硫胺酸(M)殘基似乎是不常見的模體，因此在該位點以具高度保守性的異亮胺酸(I)取代(圖1；恢復突變殘基(人類接受子→hBBC.8)，在下面的表3中以下標線表示；Met→Ile殘基在表3中以粗斜體下標線表示，並在圖1中加框表示)。這 些胺基酸轉化產生“hBBC.8”人源化抗體。
引入其他變化以進一步改善抗體。首先，hBBC.8輕鏈中兩個在小鼠和人類序列之間不同的位置(R66和F71)被突變，以產生“hBBC.9”(含有F71Y突變)和“hBBC.10”(含有F71Y和R66G突變)(圖2A；表3中加粗和斜體但沒有下標線的殘基)。BBC和所產生的人源化變異物hBBC.9，以及hBBC.10與AGS細胞的結合，顯示在圖2B中。簡言之，將AGS人胃癌細胞株(ATCC CRL-1739；ATCC，Manassas，VA)定期維持在F12培養基中，並補充10%經透析的胎牛血清。為了進行細胞結合研究，將100μl PBS中的大約3 x 105個細胞與等體積的稀釋抗體混合。在室溫下靜置1小時後，向每個樣本中加入2ml PBS以沖洗掉未結合的抗體。離心後，將回收的細胞沉澱物直接重新懸浮於200μl螢光素(FITC)-AffiniPureTM山羊抗人類IgG，Fc γ片段特異性(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA,Cat.109-095-098)，其稀釋於1：200之PBS中。室溫靜置30分鐘後，重複PBS洗滌步驟以除去未結合的第二抗體。將收集的細胞重新懸浮於200μl PBS中，並在BD FACSCantoTM流式細胞儀系統(BD Biosciences,San Jose,CA)上分析。進行進一步分析以辨識出潛在的免疫原性序列。
重鏈或輕鏈的其他突變產生了其他的變異物“hBBC.9.1”和“hBBC.10.1”(殘基用粗體加下標 線，沒有斜體，示於下表3中)。具體地，分析BBC和hBBC.8抗體並模擬抗原/抗體複合物的晶體結構。辨識出輕鏈和重鏈CDR區中的數個殘基(根據Kabat編號指定的位置)用於單點胺基酸置換。經由以特別設計的引子進行兩輪PCR反應，在抗體輕鏈或重鏈基因的指定位置進行胺基酸轉換。為了便於將突變的抗體cDNA片段插入表現載體中，在PCR反應過程中在每個末端加入限制性位點(cDNA鏈的5'NheI和3'ApaI，輕鏈cDNA的5'NheI和3'BsiWI)。在第二次PCR反應後產生的DNA片段，以NheI/ApaI或NheI/BsiWI切割，並分別接合至pGNX-RhcG1和pGNX-Rhck載體的相同位點，分別用於重鏈和輕鏈基因構建。突變位點和變化如表1所示。
Figure 108119035-A0202-12-0124-81
Figure 108119035-A0202-12-0125-82
在AGS細胞結合試驗中，許多突變物表現出體外結合活性等於或大於嵌合抗體(BBC)的1/2活性(圖2C，亦請見表2)。此外，一些突變物亦展現出特異性增進，經由在ELISA測定中與單價Lewis B結構的交叉反應性降低(等於或小於1/8強度，與BBC相較)而得知，如表2所示。單價Lewis B是在正常人類組織中表現的血型抗原。
Figure 108119035-A0202-12-0125-83
(=)結合活性無改變，相對於BBC
(-)結合活性降低，相對於BBC
(+)結合活性增加，相對於BBC
由於hBBC.8與BBC相較顯示出約1/3的AGS細胞結合活性(圖2B)，並在異種移植小鼠模型中顯示出非常好的腫瘤抑制(請見範例6)，這些單一胺基酸取代的抗體突變物具有潛力顯示抗腫瘤活性。這些分析植株的位置和胺基酸取代總結在表1中。為了進一步證實它們對親和力及/或特異性改善的能力，選擇總共七(7)個單一突變位點(表2)，以在人源化抗體模板中進行評估。這些包括五個單一殘基取代(輕鏈三個和重鏈兩個)，測試它們對於抗體與AGS細胞結合的影響(圖2C)，兩個重鏈單一殘基取代，測試它們對於抗體結合特異性(特異於AGS細胞，與純化的LeB相較，以及類似分析的兩個重鏈雙殘基取代)的影響(圖2D)。
在親和力(AGS細胞結合測定)和特異性(Lewis b ELISA測定)方面，構建成原始嵌合形式的各種人源化BBC形式的進一步比較顯示在圖2E中。
hBBC.9的Epibase分析(Applied Protein Services,Lonza Biologics,Cambridge,UK)預測重鏈區域中具有強免疫原性風險的區域。為了使潛在的免疫原性問題最小化，包括重鏈框架3區域中的另外6個胺基酸變化(位置78、80、82-84和86)，以與這些位置的參考人源化抗體匹配(圖3)。這些轉換為“hBBC.10.1FQ”提供了重 鏈框架。本範例中描述的各種重鏈和輕鏈可變區的胺基酸序列總結在表3中。
Figure 108119035-A0202-12-0127-84
Figure 108119035-A0202-12-0128-85
Figure 108119035-A0202-12-0129-86
範例3 HBBC表位之鑑定
將BBC和本文描述的變異物設計為聚醣結合單株抗體。基於親代IMH2(BBC)抗體公開的特異性數據(Ito et al.,Cancer Res.52：3739,1992)，產生的BBC抗體的標靶表位假設與LeB和LeY抗原相關。使用hBBC.10.1進行以下表位鑑定研究，hBBC.10.1也在以下範例和參考圖中稱為“hBBC”。
免疫純化
分離出衍生自結腸直腸細胞癌細胞株Colo-205的GSL-衍生聚醣，並使用BBC進行免疫純化。將未結合和沖提分液中的聚醣進行全甲基化，並以MALDI-MS分析進行分析，如圖4A和4B所示。未結合分液的聚醣譜與輸入的聚醣譜相似，表明來自COLO 205的GSL-衍生聚醣大部分不與BBC結合。然而，在沖提出的(BBC結合的)分液中，Fuc4(LacNAc)3Lac聚醣僅經BBC純化。具體地，令人驚訝地發現，經hBBC純化的聚醣攜 帶雙觸角LeB/Y(即LeB/LeB,LeB/LeY，或LeY/LeY)，基於對MS中LeB和LeY指紋片段的觀察，針對I-分支抗原的MS/MS實驗，而未結合部分的聚醣為直線形結構，可能是LeB-LeA-LeA-Lac。這一結果表明I抗原上的雙觸角LeB/Y是BBC的表位。
由細胞株NCI-N87和SW1116的GSL衍生聚醣中免疫純化出與BBC結合之聚醣，進一步支持此結果，係選擇該等細胞用於I抗原上的雙觸角LeB/Y的醣脂表現。如所預期的，BBC與四-海藻醣基化的GSL衍生聚醣Fuc4(LacNAc)3Lac結合，而不是與單-、雙-和三-海藻醣基化的聚醣結合(圖5A-5B)。通過MSMS定序，證實NCI-N87和SW1116 GSL的BBC結合聚醣是攜帶I抗原的雙觸角LeB/Y(圖6A和6B)。
除了Fuc4(LacNAc)3Lac之外，亦純化來自NCI-N87和SW1116的一組GSL衍生聚醣，其特徵為具有多個海藻醣基化(四個海藻醣殘基是與BBC結合的最低要求)。NCI-N87 GSLs、Fuc4(LacNAc)4Lac與Fuc6(LacNAc)4→5Lac的二個主要BBC結合聚醣，係使用MSMS進行定序，並確定為具有雙觸角或三觸角LeY的I抗原-攜帶聚醣(圖7A和7B)。此外，當釋放的來自AGS細胞株的N-聚醣以BBC免疫純化時，發現富集的N-聚醣是具有雙觸角或三觸角LeY的結構(圖8A和8B)。此結果與富集的I抗原一致。
這些數據顯示LeB/Y是BBC的結合單元。然 而，單觸角Lewis B/Y不足以提供與BBC的強結合。具有完全末端海藻醣基化的獨特I抗原和N-聚醣提供多價LeB/Y，其被指示為BBC的強結合表位。亦針對hBBC進行可比較的免疫純化研究，顯示出與BBC相似的聚醣富集特異性(數據未顯示)，這表明hBBC和BBC具有相似的表位。
等溫滴定量熱法
進行等溫滴定量熱法(ITC)以分析hBBC與LeY-Gal、LeB-Gal、LeA-Gal與LeX-Gal的一組直線形聚醣，以及LeY/LeY-ASGP、LeX/LeX-ASGP、H-ASGP、LeY/LeY-I抗原與LeY/LeB-I抗原的一組分支聚醣，之間的結合親和力。BR96抗體(描述於美國專利號5,491,088 A者；描述於美國專利號5,792,456 A之變異物)包括於內作為對照組。因為由hBBC免疫純化實驗鑑定出的聚醣係以有限量存在，所以各種LeB與LeY-相關聚醣係從商業來源(Elycityl SA,Crolles,France)獲得，或者根據本領域以建立的方法學於實驗室合成(例如，Wu et al.,2011 Glycobiology 21(6)：727-733；Becker et al.,2003 Glycobiology 13(7)：41R-53R；de Vries et al.,2001 Glycobiology 11(10)：119R-128R)。
簡而言之，對於等溫滴定量熱法(ITC)，在於實驗室製備經過濾的PBS pH 7.2，並在一個ITC注射回合中使用相同批次的緩衝液。將mAb預交換至經過濾的PBS pH 7.2緩衝液中，蛋白質濃度為50μM。聚醣抗原的含量係經由搭配脈衝安培偵測的高效陰離子交換 (HPAEC-PAD,e.g.,Rothenhofer et al.,2015 J.Chromatogr.B Analyt.Technol.Biomed.Life Sci.988：106)單醣分析而定量，其使用半乳糖作為計算標準。經定量的聚醣抗原溶解在經過濾的PBS pH 7.2中(與用於製備mAb溶液的批次相同的批次)，且每次注射使用60μL溶液。
ITC實驗在MicroCal iTC200系統(Malvern Instruments Ltd,Malvern,UK)上進行。將mAb溶液(50μM)加載到iTC200的樣本槽中後，將系統溫度設定為25℃。在系統溫度達到25℃後，注射器載入聚醣抗原溶液並緩慢下降至裝有mAb的樣本槽中。實驗參數如下：注射次數：20次；槽溫度：25℃；參考功率：6μcal/s；初始延遲：60秒；樣本槽濃度：50μM；攪拌速度：750rpm，其中注射器濃度輸入具測定濃度之聚醣抗原。注射參數如下：注射體積：2μL；持續時間：4秒；間距：150秒；填充期：5秒；並將第一次注射體積調整至1μL。確認所有設定後，開始實驗，結果數據由Origin for iTC200處理。滴定曲線擬合單組位點擬合模式(One Set of Sites fitting model)，重複100次迭代，以獲得最佳擬合結果。由此計算K和KD。
具有hBBC抗體的各種聚醣抗原的ITC滴定圖，顯示在圖9A、9B、10A-10C和11A-11F中。具有BR96抗體的各種聚醣抗原的ITC滴定圖顯示在圖12A-12C中。簡而言之，ITC分析顯示hBBC對LeB-Gal(KD=26.2μM) 的特異性結合親和力高於LeY-Gal(KD=80.6μM)。此外，與單鏈LeY-Gal抗原相較，hBBC對雙觸角結構(LeY/LeY-ASGP、LeY/LeY-I抗原與LeY/LeB-I抗原)顯示出更強的結合親和力。hBBC對LeY/LeY-ASGP、LeY/LeY-I抗原與LeB/LeY-I抗原的結合親和力似乎相似，說明對於雙觸角聚醣表位，LeY和LeB側鏈具有與特異性結合可比擬的貢獻。此外，如圖11A-F所示，聚醣抗原缺乏四-海藻醣基化的LacNAc部分，無論是單鏈還是雙觸角形式(LeX-Gal、LeA-Gal、H-抗原第I型、H抗原第II型、H-ASGP，以及LeX/LeX-ASGP)，皆顯示與hBBC無特異性結合。這些結果顯示，具有第I型或第II型聯結的四-海藻醣基化的LacNAc，對於hBBC的特異性結合是必需的。總言之，與免疫純化數據一致，ITC結果顯示hBBC結合至一表位，其包括含有LeY及/或LeB結構(表4；聚醣描述如下：空心圓=Gal；實心圓=Man；實心方塊=GlcNac；閉合三角形=Fuc)。與雙觸角LeY/LeY-I抗原和雙觸角LeY/LeY-ASGP相較，BR96對照組顯示出對於單鏈LeY-Gal的結合親和力相似至稍高(圖12A-12C)，顯示BR96在單鏈和雙觸角LeY聚醣之間並無特異性選擇性。因此，與BR96相較，hBBC具有獨特的表位特異性。
Figure 108119035-A0202-12-0133-87
Figure 108119035-A0202-12-0134-88
Figure 108119035-A0202-12-0134-170
=Gal
Figure 108119035-A0202-12-0134-171
=GlcNAc
Figure 108119035-A0202-12-0134-172
=Fuc
Figure 108119035-A0202-12-0134-173
=Man
這些結果部分地鑑定出hBBC表位。然而，自由流動的hBBC和固定的聚醣之間的相互作用提供關於表位的額外資訊；因此，hBBC係在表面等離子體共振(SPR)和ELISA實驗中，以一系列固定化的聚醣測試。係使用經鏈親和素塗佈之分析表面和生物素共軛聚醣(LeY-Gal-生物素、LeB-Gal-生物素、LeY/LeY-ASGA-生物素與LeB/LeB-ASGA-生物素用於SPR；LeY-Gal-生物素、LeB-Gal-生物素、LeY/LeY-ASGA-生物素、LeB/LeB-ASGA-生物素、3-LeY/6-LeB-ASGA-生物素，以及3-LeB/6-LeY-ASGA-生物素用於ELISA)，如表5所示(與表4中相同的聚醣描述)。
Figure 108119035-A0202-12-0135-89
Figure 108119035-A0202-12-0136-90
Figure 108119035-A0202-12-0136-174
=Gal
Figure 108119035-A0202-12-0136-175
=GlcNAc
Figure 108119035-A0202-12-0136-176
=Fuc
Figure 108119035-A0202-12-0136-177
=Man
表面等離子體共振
經由表面等離子體共振(SPR)在經鏈親和素塗佈之晶片上分析hBBC對LeY-Gal-生物素、LeB-Gal-生物素和LeY/LeY-ASGA-生物素的結合親和力。簡而言之，Biacore T100與作為運行緩衝液的HBS-EP+緩衝液(GE Healthcare)一起使用。將生物素化的聚醣稀釋至10pM，並根據標準程序固定至感測晶片SA(GE Healthcare)。將 聚醣係於10μL/min的流速下固定60秒。以Zeba脫鹽旋轉管柱(7K MWCO,0.5mL,ThermoFisher)將hBBC或BR96緩衝液交換至HBS-EP+緩衝液中，並以HBS-EP+緩衝液連續稀釋至480、240、120、60和30nM。進行單一回合動力學分析。抗體以30μL/min的流速與聚醣結合150秒並解離300秒。晶片使用2M MgCl2再生，於50μL/min流速下達120秒。以Biacore T200評估軟體(GE Healthcare)評估數據。使用雙態反應進行曲線擬合，得到ka、kd與KD的最佳擬合值(表6)。圖13A和13B中提供顯示hBBC和BR96與各種聚醣抗原結合的SPR偵測圖。
Figure 108119035-A0202-12-0137-91
SPR顯示，與單鏈LeY-Gal-生物素相較，雙觸角LeY/LeY-ASGA-生物素對hBBC表現出更高的親和力，這與ITC結果一致。此外，與單鏈LeB-Gal-生物素相較，雙觸角LeB/LeB-ASGA-生物素對hBBC具有更高的親和力，這也與LeY抗原觀察到的趨勢一致。hBBC對LeB-Gal-生物素的親和力較高，與LeY-Gal-生物素相較，與ITC結果相當。SPR亦顯示hBBC對LeB/LeB-ASGA-生物素的結合親和力高於LeY/LeY-ASGA-生物素，這與 hBBC對LeB-基礎抗原的親和力高於LeY-基礎抗原的觀察結果一致。從LeB/LeB-ASGA和LeY/LeY-ASGA獲得的hBBC可比較KD值，進一步指出hBBC特異性結合至多岩藻糖基化，即二價Lewis B或Lewis Y結構。值得注意的是，hBBC對LeB/LeB-ASGA的反應，比對LeB-Gal的反應更強(偵測圖)，儘管從兩個抗原得到類似的KD值。LeB/LeB-ASGA似乎是對hBBC具有最高親和力的結構。
相較之下，BR96對LeY-Gal-生物素和LeY/LeY-ASGA-生物素的親和力略高，這與結構相似的抗原LeY/LeY-ASGP的ITC結果相當。總之，SPR數據與ITC實驗的數據高度一致。
間接ELISA
為了經由ELISA評估抗體結合親和力，將生物素化的聚醣抗原在PBS緩衝液中稀釋至適當濃度。將100μL稀釋的抗原溶液加至經鏈黴親和素塗佈的96孔測定盤中，並在搖晃器中於37℃靜置3.5小時。以PBST(0.05% Tween-20的PBS緩衝液)洗滌該盤以移除過量的聚醣抗原。一級抗體係於稀釋劑中一系列滴定(含0.1%BSA之PBS緩衝液)，加至測定盤中，並在搖晃器中於37℃靜置1小時。之後進行PBST洗滌，將100μL HRP-共軛的抗人類IgG抗體溶液(SouthernBiotech，在稀釋液中以1：15,000稀釋)置於測試盤中，於37℃搖晃器中靜置1小時。洗去過量的二級抗體後，施加100μL TMB試劑，並於37℃下靜置15分鐘，然後以50μL之0.5N HCl終止反 應。在VERSA max微盤讀取儀(Molecular Devices)中，於450nm處偵測的OD值減去650nm處的OD值。數據在Softmax Pro(Molecular Devices)中處理。
LeY/LeY-ASGA vs LeY-Gal
hBBC和BR96的結合活性係於經LeY-Gal-生物素和LeY/LeY-ASGA-生物素塗覆的ELISA盤上測試。經塗覆的抗原量如圖14A和14B所示。hBBC對LeY/LeY-ASGA的結合強於LeY-Gal。BR96顯示出與hBBC相反的模式，因為它比LeY/LeY-ASGA更好地結合至LeY-Gal。總之，間接ELISA提供了與ITC和SPR實驗相似的結合親和力結果。
LeB/LeB-ASGA vs LeY/LeY-ASGA與LeB-Gal
接下來，hBBC係於經LeB/LeB-ASGA-生物素、LeY/LeY-ASGA-生物素和LeB-Gal-生物素-塗覆之鏈黴親和素塗覆的ELISA盤上之結合情況。塗覆的抗原量如圖15所示。間接ELISA的結果微hBBC顯示出與LeB/LeB-ASGA的結合顯著強於對LeY/LeY-Gal和LeB-Gal的結合。
抗原-結合ELISA
建立抗原結合ELISA以評估hBBC對不同聚醣抗原的相對結合親和力。簡言之，將hBBC一系列滴定並施加至鏈黴親和素功能化的96孔測定盤中，其已經不同的聚醣抗原塗覆。以共軛有辣根過氧化物酶(HRP)的人類 IgG特異性抗體偵測hBBC與聚醣抗原的結合，然後在TMB試劑中顯色。使用微盤讀取儀在450nm處偵測的吸光值，係與hBBC結合至其抗原之量成正比。藉由將OD作為hBBC濃度的函數作圖來決定相對親和力。
抗原製備
生物素化的Lewis Y五碳糖、LeY-Gal-sp3-生物素，購自Elicityl(Crolles，France)。Lewis B五碳糖購自Elicityl並進一步於實驗室進行生物素化(LeB-Gal-LC-生物素)。其他四種生物素化聚醣：LeY/LeY-ASGA-生物素、LeB/LeB-ASGA-生物素3-LeY/6-LeB-ASGA-生物素(LeY/LeB-ASGA-生物素)，和3-LeB/6-LeY-ASGA-生物素(LeB/LeY-ASGA-生物素)經由一系列酵素糖基化之後為化學生物素化合成(表5)。生物素化聚醣經由薄層色層分析(TLC)和電噴霧電離子化-質譜(ESI-MS)分析，以確保其純度達到至少95%，且不含未結合的生物素。HPAEC-PAD單醣分析用於定量生物素化聚醣。
抗體
hBBC用於抗原-結合ELISA中。
ELISA
將生物素化的聚醣抗原在PBS緩衝液中稀釋至18.7nM。將100μL稀釋的抗原溶液施加至經鏈黴親和素塗覆的96孔測定盤中，並在搖晃器中於37℃靜置3.5小 時。以PBST(0.05% Tween-20的PBS緩衝液)洗滌該盤以移除過量的聚醣抗原。一級抗體係於稀釋劑中一系列滴定(含0.1%BSA之PBS緩衝液)，加至測定盤中，並在搖晃器中於37℃靜置1小時。之後進行PBST洗滌，將100μL HRP-共軛的抗人類IgG抗體溶液(SouthernBiotech，在稀釋液中以1：10,000稀釋)置於測試盤中，於37℃搖晃器中靜置1小時。洗去過量的二級抗體後，加入100μL TMB試劑，並於37℃下靜置15分鐘，然後以50μL之0.5N HCl終止反應。在VERSA max微盤讀取儀(Molecular Devices)中，於450nm處偵測的OD值減去650nm處的OD值。數據在Softmax Pro(Molecular Devices)中處理。
結果
數據顯示在圖16A中。當抗原結合ELISA中hBBC與LeB/LeB-ASGA、LeY/LeY-ASGA、3-LeY/6-LeB-ASGA-生物素與3-LeB/6-LeY-ASGA-生物素結合時，OD值在低抗體濃度(0.4-4μg/mL)的窄範圍內增加，而hBBC的結合明顯弱於LeY-Gal和LeB-Gal，指出一聚醣中的二價LeY、LeB、LeB/LeY或LeY/LeB提供對hBBC的更高結合親和力，與單一Lewis Y/B部分相較。
抗原-結合親和力之直接比較：hBBC.10.1 vs.BBC
該實驗的目的是藉由抗原結合ELISA比較hBBC.10.1的抗原親和力與祖先BBC抗體的抗原親和力。
抗原製備
生物素化的Lewis Y五碳糖、LeY-Gal-sp3-生物素購自Elicityl。Lewis B五碳糖購自Elicityl，並進一步於實驗室進行生物素化(LeB-Gal-LC-生物素)。其他四種生物素化聚醣：LeY/LeY-ASGA-生物素、LeB/LeB-ASGA-生物素3-LeY/6-LeB-ASGA-生物素(LeY/LeB-ASGA-生物素)，與3-LeB/6-LeY-ASGA-生物素(LeB/LeY-ASGA-生物素)，經由一系列酵素糖基化之後為化學生物素化合成(表5)。生物素化聚醣經TLC和ESI-MS分析，以確保其純度達到至少95%，且不含未結合的生物素。HPAEC-PAD單醣分析用於定量生物素化聚醣。
抗體
BBC和hBBC.10.1用於抗原-結合ELISA中。
抗原結合ELISA
96-孔EvenCoatTM鏈黴親和素微盤(R&D Biosystems,MN,Cat No.CP004)係與各種生物素化聚醣PBS溶液靜置，含量為3.73pmol/孔，於4℃下整夜。以PBS/0.05% Tween 20(Sigma,Cat No.P1379-500mL)洗滌3次後，加入100μL稀釋的BBC或hBBC.10.1抗體置經抗原塗佈之孔中，之後於37℃靜置1小時。各孔以PBS/0.05% Tween 20洗滌3次，之後與100μL之10000倍稀釋之小鼠抗入類IgG(Fc)-HRP(Southern Biotech,Cat No.9040-05)，於37℃靜置1小時。清洗後，加入100μl之SureBlueTM Reverse TMB(KPL,Cat No. 53-00-03)，以於37℃下顯色15分鐘。反應以加入0.5N HCl終止。讀取於波長450nm下之吸光值，以650nm之吸光值為參考，於VERSAMAXTM微盤讀取儀上(Molecular Devices,San Jose,CA)，之後數據以SoftmaxProTM軟體(Molecular Devices)處理。
結果：
BBC(圖16B)和hBBC.10.1(圖16C)的抗原結合ELISA顯示，與BBC相較，hBBC.10.1對單鏈聚醣抗原(LeB-Gal和LeY-Gal)具有較低的親和力，且二抗體對於雙觸角聚醣抗原(LeB/LeB-ASGA、LeY/LeY-ASGA、3-LeY/6-LeB-ASGA與3-LeB/6-LeY-ASGA)皆具有高親和力。這些數據顯示hBBC.10.1在單鏈和雙觸角抗原之間的結合選擇性優於BBC。
摘要
此範例中描述的表位鑑定實驗指出hBBC特異性結合至癌細胞株衍生的雙和三觸角LeY/B I抗原；以及雙觸角和三觸角LeY N-聚醣。此外，hBBC辨識出的表位包含二-岩藻糖基化的LacNAc骨架。雙觸角LeB/LeB-ASGA是與hBBC具有最強結合親和力的抗原。與單鏈LeB-Gal和LeY-Gal抗原相較，雙觸角LeY/LeY-ASGA、LeY/LeB-ASGA和LeB/LeY-ASGA也顯示出對hBBC的高親和力。此外，無論抗原是單鏈還是雙觸角結構，僅有LeB-基礎抗原對於hBBC顯示出較高親和 力，與僅有LeY-基礎抗原相較。最後，hBBC的結合行為(動力學)和表位不同於BR96。
範例4 目標細胞中HBBC的內化
抗體可使用作為載體，以將功能性有效載入遞送至所需位點。例如，某些癌症療法使用抗原特異性抗體，經由胞吞作用(也稱為內化)將細胞毒性藥物(即抗體-藥物共軛物或ADC)傳送到腫瘤細胞中。目前一些ADC包括可切割的聯結子，其在溶酶體區室中被切割，從而在內化後選擇性地釋放藥物，具有增加藥物在血清中的穩定性的額外益處。
為了測試hBBC是否有效內化到癌細胞中，進行以下實驗。首先，在常規內化試驗中，將hBBC抗體加至培養的AGS胃癌細胞中，並在4℃下進行結合1小時，以允許特異性抗體/受器相互作用，但停止內吞作用。然後，洗去非特異性結合的抗體，將細胞轉移至37℃以允許正常的胞吞作用進行。在0分鐘和30分鐘時，固定細胞並使用Alexa488-共軛的抗人類IgG抗體偵測hBBC(圖17，左圖)。使用鬼筆環肽羅丹明(phalloidin rhodamine)標記F-肌動蛋白(右圖；共分佈染色顯示為黃色螢光信號)。如圖17所示，hBBC在0分鐘時染色細胞膜，然後在37℃靜置(30分鐘，使細胞通透化)後進行內化並定位於細胞核周圍的細胞質囊泡。藉由非通透化對照組進一步證實細胞質信號，其中僅可偵測到微弱的膜信號(30分鐘，非通透化細 胞)。這些數據顯示hBBC在30分鐘內可有效內化至AGS細胞中。
在第二個實驗中，檢驗hBBC的即時細胞內定位。簡言之，將hBBC抗體加入AGS細胞中，並在37℃下培養4或8小時以促進內化。然後固定細胞，並使用Alexa488-共軛的抗人類IgG抗體檢驗hBBC的即時定位(圖18，左圖中顯示的抗人類IgG)。溶酶體以抗Lamp-1抗體標記，然後用標記的抗兔IgG抗體標記(如中圖所示)。如圖18所示，在靜置4或8小時後，hBBC與Lamp-1(合併；右圖)共定位，說明內化的hBBC定位於溶酶體區室。此外，hBBC可在溶酶體區室中穩定，至少8小時沒有明顯降解。這些結果顯示hBBC可用於抗原靶向共軛物，例如ADC。
範例5 人體組織樣本中HBBC的免疫染色
獲得健康和癌性組織樣本，並根據標準流程在甲醛固定的石蠟包埋組織切片上，進行hBBC 10.1的免疫染色。健康和癌組織的染色結果分別摘錄在表7和8中。
Figure 108119035-A0202-12-0145-92
Figure 108119035-A0202-12-0146-93
Figure 108119035-A0202-12-0146-94
Figure 108119035-A0202-12-0147-95
此外，各種人癌細胞係以hBBC.10.1染色，以決定表位表現模式。結果摘錄於表9中。
Figure 108119035-A0202-12-0147-96
Figure 108119035-A0202-12-0148-98
範例6 在直腸癌之異種移植模式中之HBBC抗腫瘤活性
係進行一系列體內動物研究以評估hBBC在異種移植SCID模型中的腫瘤抑制作用，其中包括引入來自胃癌細胞株AGS、TSGH9201，以及來自結腸癌細胞系COLO 201、COLO 205、DLD-1，除了COLO 205之外，hBBC.10.1顯示出對所有細胞株的強至中等結合位準(範例5的表9)。hBBC.10.1用於所有異種移植研究，BR96用作對照組。
在DLD-1和COLO 205異種移植模型中hBBC.10.1的體內抗腫瘤活性
此研究目的是檢查高劑量hBBC.10.1在DLD-1和COLO 205異種移植模型中的腫瘤抑制作用。簡而言之，人類結腸癌細胞株DLD-1和COLO 205得自美國 典型培養物保藏中心(ATCC,Manassas,VA,USA)。細胞在補充有10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養液中生長，並將細胞培養物保持在37℃的5% CO2大氣下的潮濕培養箱中。第5-8代的細胞用於腫瘤接種。
從BioLASCO(台灣)購買無特定病原體(SPF)的雌性CB17嚴重聯合免疫缺陷(SCID)小鼠，並在任一實驗操作之前使其適應至少一周。將小鼠置於溫度受控的環境(22±2℃)中的單獨通風籠(IVC)中，在12：12小時光-暗循環下，具有50±10%濕度。所有實驗均按照台灣農業委員會規定的法規和動物保護法進行。
在含有50%BD Matrigel(Cat.354248)的冰冷無血清培養液中，以5 x 106/200μL的細胞密度重新懸浮細胞，並皮下注射到6-8週齡的SCID小鼠的脅腹區域。以用游標卡尺(Laser Tools and Technics(LTT),Hsin Chu City,Taiwan,150 x 0.05mm)每週測量腫瘤尺寸，且腫瘤重量以“重量mg=(寬度2×長度)mm3/2”估計(Ito et al.(1992)Cancer Res.52：3739)。當腫瘤重量達到150-200mg時，將小鼠隨機分成9組(每組n=6)，每組具有相當的腫瘤大小，並開始抗體治療。攜帶腫瘤的SCID小鼠每週一次以50mg/kg腹膜內注射hBBC.10.1(批次：17001)六週。腹膜內注射生理食鹽水之攜帶腫瘤的SCID小鼠作為陰性對照組。
DLD-1和COLO 205異種移植實驗的結果分別顯示在圖19A和19B中。相對於對照，hBBC.10.1能夠 有效抑制DLD-1腫瘤生長，但不能抑制COLO 205腫瘤生長。這些數據與觀察到的hBBC.10.1結合至DLD-1細胞但不結合至COLO 205的能力一致。
胃腺癌異種移植模型中hBBC的抗腫瘤活性
本研究目的是比較hBBC.10.1和BR96在AGS異種移植模型中低劑量範圍0.008至1mg/kg的抗腫瘤功效。簡而言之，人類胃腺癌細胞株AGS(CRL-1739)獲自美國典型培養物保藏中心(ATCC,Manassas,VA,USA)。AGS細胞在補充有10%胎牛血清(FBS)的Ham's F-12K培養基中生長，細胞培養物在5% CO2大氣下，在37℃下保持在潮濕的培養箱中。第5-8代的AGS細胞係用於腫瘤接種。
從BioLASCO(台灣)購買無特定病原體(SPF)的雌性CB17嚴重聯合免疫缺陷(SCID)小鼠，並在任一實驗操作之前使其適應至少一周。將小鼠置於溫度受控的環境(22±2℃)中的單獨通風籠(IVC)中，在12：12小時光-暗循環下具有50±10%濕度。所有實驗均按照台灣農業委員會規定的法規和動物保護法進行。
將AGS細胞以5 x 106/200μL的細胞密度在含有50%BD Matrigel(Cat.354248)的冰冷無血清培養液中重新懸浮，並皮下注射到6-8週的SCID小鼠的脅腹區域。以游標卡尺(Laser Tools and Technics(LTT),Hsin Chu City,Taiwan,150 x 0.05mm)每週測量腫瘤尺寸，且腫瘤重量以“重量mg=(寬度2×長度)mm3/2”估計(Ito et al.(1992)Cancer Res.52：3739)。當腫瘤重量達到150-200mg時，將小鼠隨機分成9組(每組n=6)，每組具有相當的腫瘤大小，並開始抗體治療，並開始抗體治療。攜帶腫瘤的SCID小鼠腹膜內注射hBBC.10.1(批次：17001)或BR96(批次：17001)，每週一次，劑量為1、0.2、0.04或0.008mg/kg，持續6週，第一次投予預定劑量的1.5倍。腹膜內注射生理食鹽水之攜帶腫瘤的SCID小鼠作為陰性對照組。
經hBBC.10.1處理和經BR96處理的小鼠結果分別顯示在圖20A和20B中。當以1和0.2mg/kg的每週劑量投予時，與對照相較，hBBC.10.1和BR96均顯著抑制腫瘤生長。然而，兩種抗體均無法在較低劑量(0.04和0.008mg/kg)下顯示出抑制作用。出於倫理考慮，當腫瘤負荷大於體重的10%時，犧牲小鼠。一些接受鹽水或較低劑量抗體的小鼠在接種後60天達到此終點；因此，僅對直至第60天產生的數據進行統計分析。相較之下，在投予更高劑量(1和0.2mg/kg)hBBC 10.1或BR96的AGS攜帶腫瘤小鼠中，腫瘤生長至10%體重被有效延遲。此劑量反應研究說明在攜帶AGS腫瘤的小鼠中，hBBC.10.1具有與BR96相當的抗腫瘤效力。
將hBBC.10.1的抗腫瘤功效與本發明其他產生hBBC抗體者進行比較。在一實驗中，以PBS洗滌收穫的AGS細胞兩次，並在含有25% BD MatrigelTM(BD Biosciences，Cat.354248)的PBS中，以5 x 106/200μL 的細胞密度重新懸浮。此後，將200μL之AGS細胞懸浮液皮下注射(5 x 106個細胞/小鼠)到雌性SCID小鼠(6-8週齡)的側腹區域中。以游標卡尺(Laser 150 x 0.05mm)每週測量腫瘤尺寸，且腫瘤重量以“重量mg=(寬度2×長度)mm3/2”估計(Hisashi Ito et al.(1992))。當腫瘤重量達到150-200mg時，將小鼠隨機分成6組(每組n=6)，每組具有相當的腫瘤大小，並開始抗體治療。攜帶腫瘤的SCID小鼠每週兩次以0.25mg/kg的劑量腹膜內注射hBBC.8或突變物(hBBC.9、hBBC.9.1、hBBC.10.1)六週。此外，以2mg/kg的較高劑量測試hBBC.8。用鹽水腹膜內注射腫瘤的SCID小鼠作為陰性對照組。數據顯示在圖20C中。在hBBC.8、hBBC.9和hBBC.9.1觀察到抗腫瘤作用，儘管效果稍微弱於hBBC.10.1。對於hBBC.8，在較高劑量(2mg/kg)下觀察到有與hBBC.10.1(0.25mg/kg)可比擬的抗腫瘤活性。
亦將hBBC.10.1與hBBC.10.1FQ進行抗腫瘤活性比較。簡言之，將收穫的AGS細胞用PBS洗滌兩次，並在含有25% BD MatrigelTM(Cat.354248)的PBS中，以5 x 106/200μL的細胞密度重新懸浮。此後，將200μL之AGS細胞懸浮液皮下注射(5 x 106個細胞/小鼠)到雌性SCID小鼠(6-8週齡)的側腹區域中。以游標卡尺(Laser 150 x 0.05mm)每週測量腫瘤尺寸，且腫瘤重量以“重量mg=(寬度2×長度)mm3/2”估計(Hisashi Ito et al.(1992))。當腫瘤重量達到150-200mg時，將小鼠隨機分 成3組(每組n=8)，每組具有相當的腫瘤大小，並開始抗體治療。攜帶腫瘤的SCID小鼠每週一次以0.25mg/kg的劑量腹膜內注射hBBC.10.1或hBBC.10.1FQ六週，第一劑量以預定劑量的1.5倍投予。腹膜內注射生理食鹽水之攜帶腫瘤的SCID小鼠作為陰性對照組。數據(圖20D)顯示hBBC.10.1FQ具有稍強的抗腫瘤活性。
在後續實驗中，與AGS細胞株細胞相較，顯示從AGS異種移植腫瘤分離的異種移植物AGS(xAGS)細胞表現至少2x個hBBC表位(數據未顯示)。與親代細胞株相較，xAGS細胞亦經由hBBC引發更有效的ADCC和CDC活性(數據未顯示)。hBBC對於標靶xAGS細胞的直接殺傷作用稍弱於BR96(PI染色)，如圖21所示。
hBBC在胃癌異種移植模型中的抗腫瘤活性
該研究的目的是比較在TSGH 9201異種移植模型中，低劑量範圍0.04至10mg/kg的hBBC.10.1和BR96的抗腫瘤功效。簡而言之，人類胃癌細胞株TSGH 9201(Cat.60146)得自食品工業發展研究所(FIRDI，Hsinchu，Taiwan)的生物資源保存及研究中心(BCRC)。具有更高hBBC表位表現的TSGH 9201細胞經過2輪螢光激活細胞分選(FACS)(BD FACSJAZZTM細胞分選儀，BD Biosciences，Singapore，Cat.655486)富集，使用抗hBBC染色(批次：B24)，之後是200倍稀釋的螢光素(FITC)-AffiniPureTM山羊抗人類IgG，Fc γ片段特異性(Jackson ImmunoResearch Inc.,West Grove,PA,Cat. 109-095-098)。與親代TSGH 9201細胞相較，hBBC表位的表現位準在富集細胞中增強了近4倍，命名為TSGH 9201(2s)(未顯示)。親代和富集細胞均在補充有10%胎牛血清(FBS)和1mM丙酮酸鈉的RPMI-1640培養基(Gibco)中生長。將細胞培養物保持在37℃的5% CO2大氣下的潮濕培養箱中。第5-8代的TSGH 9201(2s)細胞用於腫瘤接種。
從BioLASCO(台灣)購買無特定病原體(SPF)的雌性CB17嚴重聯合免疫缺陷(SCID)小鼠，並在任一實驗操作之前使其適應至少一周。將小鼠置於溫度受控的環境(22±2℃)中的單獨通風籠(IVC)中，在12：12小時光-暗循環下具有50±10%濕度。所有實驗均按照台灣農業委員會規定的法規和動物保護法進行。
在含有25%BD Matrigel(Cat.354248)的冰冷無血清培養液中，以5 x 106/200μL的細胞密度重新懸浮TSGH 9201(2s)細胞，並將200μL的細胞皮下注射到6-8週齡的SCID小鼠的側腹區域。以游標卡尺(Laser Tools and Technics(LTT),Hsin Chu City,Taiwan,150 x 0.05mm)每週測量腫瘤尺寸，且腫瘤重量以“重量mg=(寬度2×長度)mm3/2”估計(Ito et al.(1992)Cancer Res.52：3739)。當腫瘤重量達到150-200mg時，將小鼠隨機分成3組(每組n=5)，每組具有相當的腫瘤大小，並開始抗體治療。為了評估hBBC.10.1和BR96的體內功效，攜帶腫瘤的SCID小鼠腹膜內注射hBBC.10.1(批次：B24) 或BR96(批次：T05)，每週一次，劑量為10mg/kg，持續6週，第一劑投予1.5倍指定劑量。在第二項比較低劑量hBBC.10.1和BR96的抗腫瘤活性的研究中，攜帶腫瘤的SCID小鼠每週一次腹膜內注射hBBC.10.1(批號：17001)或BR96(批號：17001)，劑量為10、1、0.2或0.04mg/kg，持續6週，第一劑量為指定劑量的1.5倍。腹膜內注射生理食鹽水之攜帶腫瘤的SCID小鼠作為陰性對照組。
結果顯示在圖22中。與生理食鹽水組相較，hBBC.10.1和BR96二者在10mg/kg的每週劑量下，皆顯著抑制腫瘤生長。
hBBC.10.1在大腸直腸腺癌的異種移植模型中的抗腫瘤活性
本研究目的是：1)檢測hBBC.10.1抑制COLO 201異種移植腫瘤生長的能力；以及2)在COLO 201異種移植模型中，比較劑量範圍為0.008至1mg/kg的hBBC和BR96的抗腫瘤活性。
簡而言之，衍生自腹水的人類結腸直腸腺癌細胞株COLO 201(CCL-224)獲自美國典型培養物保藏中心(ATCC,Manassas,VA,USA)。使COLO 201細胞在補充有10%胎牛血清(FBS)和1mM丙酮酸鈉的RPMI-1640培養基(Gibco)中生長。將細胞培養物保持在37℃的5%CO2大氣下的潮濕培養箱中。第5-8代的COLO 201細胞係用於腫瘤接種。
從BioLASCO(台灣)購買無特定病原體 (SPF)的雌性CB17嚴重聯合免疫缺陷(SCID)小鼠，並在任一實驗操作之前使其適應至少一周。將小鼠置於溫度受控的環境(22±2℃)中的單獨通風籠(IVC)中，在12：12小時光-暗循環下具有50±10%濕度。所有實驗均按照台灣農業委員會規定的法規和動物保護法進行。
將COLO 201細胞在冰冷的無血清培養基中以2 x 106/200μL的細胞密度重新懸浮，並在6-8週齡時將200μL細胞懸浮液皮下注射到SCID小鼠的側腹區域。以游標卡尺(Laser Tools and Technics(LTT),Hsin Chu City,Taiwan,150 x 0.05mm)每週測量腫瘤尺寸，且腫瘤重量以“重量mg=(寬度2×長度)mm3/2”估計(Ito et al.(1992)Cancer Res.52：3739)。當腫瘤重量達到150-200mg時，將小鼠隨機分成對照組和治療組(每組n=6)，每組具有相當的腫瘤大小，並開始抗體治療。進行兩項研究以評估hBBC對抑制COLO 201腫瘤生長的體內功效。
在第一項研究中，攜帶腫瘤的SCID小鼠腹腔注射hBBC.10.1(批次：B26)，劑量範圍為2至50mg/kg，每週兩次，共6週，第一次投予1.5倍指示劑量。第一項研究的結果顯示在圖23中。與生理食鹽水組相較，hBBC.10.1之2-50mg/kg治療顯著抑制腫瘤的生長。腫瘤迅速萎縮，並最終在hBBC投予後一周，即腫瘤接種後兩週消失。
在第二項研究中，進一步比較了較低劑量的 hBBC.10.1和BR96的抗腫瘤活性。攜帶腫瘤的SCID小鼠腹膜內注射hBBC.10.1(批次：17001)或BR96(批次：17001)，每週一次(開始於第7天)，分別為1、0.2、0.04與0.008mg/kg，持續6週，第一劑量以指定劑量的1.5倍投予。腹膜內注射生理食鹽水之攜帶腫瘤的SCID小鼠作為陰性對照組。經純化的抗體hTKH2.2(批號：1020429)亦包括於內作為陰性對照抗體，其為在HEK293細胞中暫時表現而在實驗室內產生的人源化抗-STn抗體。第二項研究的結果顯示在圖24A和24B中。與生理食鹽水和hTKH2.2對照組相較，每週劑量為1或0.2mg/kg的hBBC.10.1和BR96均顯著抑制腫瘤生長，而較低劑量(0.04和0.008mg/kg之hBBC.10.1；0.04mg/kg之BR96)顯示對延遲腫瘤生長的影響。出於倫理考慮，當腫瘤負荷大於體重的10%時，犧牲小鼠。一些接受生理食鹽水或較低劑量hBBC.10.1或BR96的小鼠在接種後49天達到該終點；因此，僅對直到第49天獲得的數據進行統計分析。
此劑量-反應研究顯示，在COLO 201攜帶腫瘤小鼠中，hBBC.10.1具有與BR96相當的抗腫瘤功效。
範例7 在靈長類和人類組織中的HBBC免疫染色
對來自人類和食蟹猴(Macaca fascicularis)的相對應健康組織進行hBBC.10.1免疫染色。簡言之，根據標準方案，使用甲醛固定的石蠟包埋組織切片，係以2μg/ml hBBC.10.1進行染色。結果摘錄 在表10中，並顯示人和食蟹組織之間的相似染色模式。
Figure 108119035-A0202-12-0158-99
Figure 108119035-A0202-12-0159-100
範例8 HBBC.10.1在靈長類模型中的安全性和耐受性研究
為了評估單次靜脈內(iv)推注後，食蟹猴中hbbc.10.1的耐受性和可接受劑量範圍，係進行單劑量耐受性和劑量範圍發現研究(非glp)。簡而言之，將雄性和雌性食蟹猴(macaca fascicularis)分成四組，每組一隻雄性和一隻雌性。第1組至第4組的動物分別接受0、50、200與300mg/kg hbbc.10.1的劑量位準。第2組和第3組中的動物經由慢速靜脈內投藥一次。推注持續至少5分鐘。第1組和第4組中的動物靜脈內投藥一次，20分鐘(±1分鐘)。輸液係使用泵和引導輸液管。投藥後約24小時，進行解剖。在解剖期間，記錄大體觀察和器官重量，並收集組織用於組織病理學。將一些收集的組織加工成載玻片，並用顯微鏡檢查。
結果顯示，hBBC.10.1劑量範圍為50-300mg/kg的食蟹猴具有良好的耐受性。在接受200和300mg/kg的動物中，在盲腸及/或結腸中觀察到最小的出血，並可能與測試物相關。其他可能與測試物相關的變化為，接受200mg/kg之一動物出現胃部慢性和急性發炎，接受200mg/kg之一動物出現十二指腸隱窩中的中性粒細胞浸 潤，以及接受300mg/kg之一動物出現迴腸絨毛萎縮。在接受50mg/kg的動物中沒有觀察到異常發現(第2組)。
可組合上述各種實施例以提供進一步的實施例。本說明書中提及及/或在申請數據表中列出的所有美國專利、美國專利申請公開案、美國專利申請案、外國專利、外國專利申請案和非專利文獻，均在此併入本案以作為參考資料。如果需要，可修改實施例的各態樣以運用各種專利、申請案和文獻的概念來提供進一步的實施例。
根據以上詳細描述，可以對實施例進行這些和其他改變。通常，在以下申請專利範圍中，所使用的術語不應被解釋為將申請專利範圍限制於說明書和申請專利範圍中公開的特定實施例，而是應該被解釋為包括所有可能的實施例以及這樣的等效物的全部範圍。因此，本申請專利範圍不受本揭示的限制。
<110> 台灣醣聯生技醫藥股份有限公司
<120> 治療性抗體
<140> TW 108119035
<141> 2019-05-31
<150> US 62/678,890
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<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
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Figure 108119035-A0202-12-0161-101
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Figure 108119035-A0202-12-0161-102
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<223> 合成序列-抗體IMH2/BBC、抗體hBBC.8、抗體hBBC.9之輕鏈互補決定區1(VL CDR1)
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-抗體IMH2/BBC、抗體hBBC.8、抗體hBBC.9、抗體hBBC.9.1、抗體hBBC.10、抗 體hBBC.10.1與抗體hBBC.10.1FQ之VL CDR2
<400> 7
Figure 108119035-A0202-12-0163-107
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-抗體IMH2/BBC、抗體hBBC.8、抗體hBBC.9、抗體hBBC.9.1、抗體hBBC.10、抗 體hBBC.10.1與抗體hBBC.10.1FQ之VL CDR3
<400> 8
Figure 108119035-A0202-12-0163-108
<210> 9
<211> 278
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-衍生自抗體hBBC.10.1之[VL-VH]方向之單鏈片段可變區(scFv)
<220>
<221> 可變區
<222> (113)...(157)
<223> 胺基酸113-157之任一者或全部可存在或不存在
<400> 9
Figure 108119035-A0202-12-0163-109
Figure 108119035-A0202-12-0164-110
<210> 10
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-抗體hBBC.10.1之全長重鏈(HC)
<400> 10
Figure 108119035-A0202-12-0164-111
Figure 108119035-A0202-12-0165-112
<210> 11
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列- 抗體hBBC.10、抗體hBBC.10.1與抗體hBBC.10.1FQ之全長輕鏈(LC)
<400> 11
Figure 108119035-A0202-12-0165-113
<210> 12
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-抗體hBBC.10.1之重鏈可變(VH)結構域
<400> 12
Figure 108119035-A0202-12-0165-114
Figure 108119035-A0202-12-0166-115
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-抗體IMH2/BBC、抗體hBBC.8、抗體hBBC.9之重鏈互補決定區1(VH CDR1)
<400> 13
Figure 108119035-A0202-12-0166-116
<210> 14
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-抗體hBBC.9.1、抗體hBBC.10與抗體hBBC.10.1FQ之VH CDR2
<400> 14
Figure 108119035-A0202-12-0166-117
<210> 15
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-抗體hBBC.10.1與抗體hBBC.10.1FQ之VH CDR3
<400> 15
Figure 108119035-A0202-12-0166-120
<210> 16
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-抗體hBBC.10、抗體hBBC.10.1和抗體hBBC.10.1FQ之輕鏈可變(VL)結構域
<400> 16
Figure 108119035-A0202-12-0166-119
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-抗體IMH2/BBC、抗體hBBC.8、抗體hBBC.9之輕鏈互補決定區(VL CDR1)
<400> 17
Figure 108119035-A0202-12-0167-121
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-抗體IMH2/BBC、抗體hBBC.8、抗體hBBC.9、抗體hBBC.9.1、抗體hBBC.10、抗 體hBBC.10.1和抗體hBBC.10.1FQ之VL CDR2
<400> 18
Figure 108119035-A0202-12-0167-122
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-抗體 IMH2/BBC、抗體hBBC.8、抗體hBBC.9、 抗體hBBC.9.1、抗體hBBC.10、抗體 hBBC.10.1和抗體hBBC.10.1FQ之VL CDR3
<400> 19
Figure 108119035-A0202-12-0167-123
<210> 20
<211> 834
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-衍生自抗體hBBC.10.1之[VL-(L)-VH]方向之單鏈片段可變區(scFv)
<220>
<221> misc_feature
<222> (337)...(471)
<223> 核苷酸337-471之任一者或所有可存在或不存在
<400> 20
Figure 108119035-A0202-12-0167-125
<210> 21
<211> 1362
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-抗體hBBC.10.1之全長重鏈(HC)
<400> 21
Figure 108119035-A0202-12-0168-126
<210> 22
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-抗體hBBC.10.1與抗體hBBC.10.1FQ之全長輕鏈(LC)
<400> 22
Figure 108119035-A0202-12-0168-127
<210> 23
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-示範性間隔子胺基酸序列
<400> 23
Figure 108119035-A0202-12-0168-129
<210> 24
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-示範性間隔子胺基酸序列
<400> 24
Figure 108119035-A0202-12-0169-131
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-彈性聯結子胺基酸序列
<400> 25
Figure 108119035-A0202-12-0169-132
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-彈性聯結子胺基酸序列
<400> 26
Figure 108119035-A0202-12-0169-133
<210> 27
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-抗體IMH2/BBC之VL結構域
<400> 27
Figure 108119035-A0202-12-0169-134
<210> 28
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-抗體IMH2/BBC之VH結構域
<400> 28
Figure 108119035-A0202-12-0170-135
<210> 29
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-人類接受子框架AAS01771.1之VL結構域
<400> 29
Figure 108119035-A0202-12-0170-136
<210> 30
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-人類接受子框架CAD89404.1之VH結構域
<400> 30
Figure 108119035-A0202-12-0170-137
Figure 108119035-A0202-12-0171-138
<210> 31
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-抗體hBBC.8之VL結構域
<400> 31
Figure 108119035-A0202-12-0171-139
<210> 32
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-抗體hBBC.8、抗體hBBC.9與抗體hBBC.10之VH結構域
<400> 32
Figure 108119035-A0202-12-0171-140
<210> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-抗體hBBC.9與抗體hBBC.9.1之VL結構域
<400> 33
Figure 108119035-A0202-12-0172-141
<210> 34
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-抗體hBBC.9.1之VH結構域
<400> 34
Figure 108119035-A0202-12-0172-142
<210> 35
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-抗體hBBC.10.1之VH結構域
<400> 35
Figure 108119035-A0202-12-0172-143
Figure 108119035-A0202-12-0173-144
<210> 36
<211> 278
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-衍生自抗體hBBC.10.1之[VH-VL]方向之單鏈片段可變區(scFv)
<220>
<221> VARIANT
<222> (127)...(171)
<223> 胺基酸127-171之任一者或所有可存在或不存在
<400> 36
Figure 108119035-A0202-12-0173-169
<210> 37
<211> 834
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-衍生自抗體hBBC.10.1之[VH-(L)-VL]方向之單鏈片段可變區(scFv)
<220>
<221> misc_feature
<222> (393)...(513)
<223> 核苷酸393-513之任一者或所有可存在或不存在
<400> 37
Figure 108119035-A0202-12-0174-146
<210> 38
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-hBBC.10.1之重鏈框架區3
<400> 38
Figure 108119035-A0202-12-0174-148
<210> 39
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-hBBC.10.1FQ之重鏈框架區3
<400> 39
Figure 108119035-A0202-12-0174-149
<210> 40
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-參考物1之重鏈框架區3
<400> 40
Figure 108119035-A0202-12-0175-151
<210> 41
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-參考物2之重鏈框架區3
<400> 41
Figure 108119035-A0202-12-0175-153
<210> 42
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-IMH2/hBBC之CDRH2
<400> 42
Figure 108119035-A0202-12-0175-154
<210> 43
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-IMH2/hBBC之CDRH2
<400> 43
Figure 108119035-A0202-12-0175-155
<210> 44
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-人類接受子VH1
<400> 44
Figure 108119035-A0202-12-0175-157
Figure 108119035-A0202-12-0176-158
<210> 45
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-人類接受子VH2
<400> 45
Figure 108119035-A0202-12-0176-160
<210> 46
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-人類接受子VH3
<400> 46
Figure 108119035-A0202-12-0176-161
<210> 47
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-人類接受子VH4
<400> 47
Figure 108119035-A0202-12-0177-162
<210> 48
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-人類接受子VH5
<400> 48
Figure 108119035-A0202-12-0177-163
<210> 49
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-人類接受子VH6
<400> 49
Figure 108119035-A0202-12-0177-164
Figure 108119035-A0202-12-0178-165
<210> 50
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-人類接受子VH7
<400> 50
Figure 108119035-A0202-12-0178-166
<210> 51
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列-人類接受子VH8
<400> 51
Figure 108119035-A0202-12-0178-167

Claims (32)

  1. 一種經分離的抗體或其抗原結合片段，包含一免疫球蛋白重鏈可變區，其包含具有與胺基酸序列SEQ ID NO：35至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%等同度之一胺基酸序列；以及一免疫球蛋白輕鏈可變區，其包含具有與胺基酸序列SEQ ID NO：5至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%等同度之一胺基酸序列，其中該抗體或其抗原結合片段可特異性地結合：至一雙觸角(biantennary)LeB/LeB抗原，其包含Fuc4(Galβ1→3GlcNAc)2 [I]或[Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc]2 [II]，至一雙觸角LeY/LeY抗原，其包含Fuc4(Galβ1→4GlcNAc)2 [III]或[Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc]2 [IV]，至一雙觸角LeB/LeY抗原，其包含Fuc2(Galβ1→3GlcNAc)[Fuc2(Galβ1→4GlcNAc)] [V]，或[Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc] [VI]，以及至一雙觸角LeY/LeB抗原，其包含Fuc2(Galβ1-4GlcNAc)[Fuc2(Galβ1-3GlcNAc)] [VII]或[Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc] [VIII]，以及其中該抗體或其抗原結合片段並未特異性地結合至一單觸角Lex抗原，其包含 Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc[IX]，或至一雙觸角Lex抗原，其包含[Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X]，或至一單觸角LeA抗原，其包含Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc[XI]，或至一單觸角第2型H抗原，其包含Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc[XII]，或至一雙觸角第2型H抗原，其包含(Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII]，或至一單觸角第1型H抗原，其包含Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc[XIV]。
  2. 如請求項1之經分離抗體或其抗原結合片段，包含：(a)一免疫球蛋白重鏈可變區，其包含一重鏈互補決定區1(VH CDR1)，其包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列，或具有與胺基酸序列SEQ ID NO：2至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%等同度之一胺基酸序列；一重鏈互補決定區2(VH CDR2)，其包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列，或具有與胺基酸序列SEQ ID NO：3至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%等同度之一胺基酸序列；一重鏈互補決定區3(VH CDR3)，其包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列，或具有與胺基酸序列SEQ ID NO：4至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%等同度之一胺基酸序列；以及(b)一免疫球蛋白輕鏈可變區，其包含一輕鏈互補決定區1(VL CDR1)，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列，或具有與胺基酸序列SEQ ID NO：6至少90、91、92、93、 94、95、96、97、98或99%等同度之一胺基酸序列；一輕鏈互補決定區2(VL CDR2)，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列，或具有與胺基酸序列SEQ ID NO：7至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%等同度之一胺基酸序列；以及一輕鏈互補決定區3(VL CDR3)，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列，或具有與胺基酸序列SEQ ID NO：8至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%等同度之一胺基酸序列。
  3. 如請求項1之經分離抗體或其抗原結合片段，包含以下之(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)，或(vi)或其任一組合：(i)一VH CDR1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：2之一變異物，其中該變異物係由位置33之Y→A取代所組成，依據Kabat編號法；及/或(ii)一VH CDR3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：4之一變異物，其中該變異物係由位置104之Y→A取代所組成，依據Kabat編號法；(iii)一VH CDR3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：4之一變異物，其中該變異物係由位置106之H→A取代所組成，依據Kabat編號法；(iv)一VL CDR1，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：6之一變異物，其中該變異物係由位置30之Y→A取代所組成，依據Kabat編號法； (v)一VL CDR2，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：7之一變異物，其中該變異物係由位置50之G→A取代所組成，依據Kabat編號法；(vi)一VL CDR3，其包含胺基酸序列SEQ ID NO：8之一變異物，其中該變異物係由位置93之T→S取代所組成，依據Kabat編號法。
  4. 一種經分離之抗體或其抗原結合片段，包含：(a)一免疫球蛋白重鏈可變區，其包含一重鏈互補決定區1(VH CDR1)，其包含如SEQ ID NO：2之胺基酸序列；一重鏈互補決定區2(VH CDR2)，其包含如SEQ ID NO：3之胺基酸序列；一重鏈互補決定區3(VH CDR3)，其包含如SEQ ID NO：4之胺基酸序列；以及(b)一免疫球蛋白輕鏈可變區，其包含一輕鏈互補決定區1(VL CDR1)，其包含如SEQ ID NO：6之胺基酸序列；一輕鏈互補決定區2(VL CDR2)，其包含如SEQ ID NO：7之胺基酸序列；以及一輕鏈互補決定區3(VL CDR3)，其包含如SEQ ID NO：8之胺基酸序列；其中該抗體或其抗原結合片段可特異性地結合：至一雙觸角LeB/LeB抗原，其包含Fuc4(Galβ1→3GlcNAc)2 [I]或[Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc]2 [II]，至一雙觸角LeY/LeY抗原，其包含Fuc4(Galβ1→4GlcNAc)2 [III]或[Fucα1-2Galβ1-4(Eucα1-3)GlcNAc]2 [IV]， 至一雙觸角LeB/LeY抗原，其包含Fuc2(Galβ1→3GlcNAc)[Fuc2(Galβ1→4GlcNAc)] [V]，或[Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc] [VI]，以及至一雙觸角LeY/LeB抗原，其包含Fuc2(Galβ1-4GlcNAc)[Fuc2(Galβ1-3GlcNAc)] [VII]或[Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc] [VIII]，以及其中該抗體或其抗原結合片段並未特異性地結合至一單觸角Lex抗原，其包含Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc[IX]，或結合至一雙觸角Lex抗原，其包含[Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X]，或結合至一單觸角LeA抗原，其包含Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc[XI]，或結合至一單觸角第2型H抗原，其包含Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc[XII]，或結合至一雙觸角第2型H抗原，其包含(Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII]，或結合至一單觸角第1型H抗原，其包含Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc[XIV]。
  5. 一經分離之抗體或其抗原結合片段，包含：一免疫球蛋白重鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：35之胺基酸序列；以及一免疫球蛋白輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：5之胺基酸序列，其中該抗體或其抗原結合片段可特異性地結合： 至一雙觸角LeB/LeB抗原，其包含Fuc4(Galβ1→3GlcNAc)2 [I]或[Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc]2 [II]，至一雙觸角LeY/LeY抗原，其包含Fuc4(Galβ1→4GlcNAc)2 [III]或[Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc]2 [IV]，至一雙觸角LeB/LeY抗原，其包含Fuc2(Galβ1→3GlcNAc)[Fuc2(Galβ1→4GlcNAc)] [V]，或[Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc] [VI]，以及至一雙觸角LeY/LeB抗原，其包含Fuc2(Galβ1-4GlcNAc)[Fuc2(Galβ1-3GlcNAc)] [VII]，或[Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc] [VIII]，以及其中該抗體或其抗原結合片段並未特異性地結合至一單觸角Lex抗原，其包含Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc[IX]，或結合至一雙觸角Lex抗原，其包含[Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X]，或結合至一單觸角LeA抗原，其包含Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc[XI]，或結合至一單觸角第2型H抗原，其包含Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc[XII]，或結合至一雙觸角第2型H抗原，其包含(Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII]，或結合至一單觸角第1型H抗原，其包含Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc[XIV]。
  6. 如請求項5之經分離抗體，包含一具有如SEQ ID NO：10之胺基酸序列的免疫球蛋白重鏈，以及一具有如SEQ ID NO：11之胺基酸序列的免疫球蛋白輕鏈。
  7. 如請求項6之經分離抗體，其為單株。
  8. 如請求項1之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為單株。
  9. 如請求項1之經分離抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為人源化抗體。
  10. 如請求項1之經分離抗體或其抗原結合片段，其選自於一Fab片段、一F(ab’)2片段、一Fv片段、一單鏈Fv(ScFv)抗體，以及一雙抗體(diabody)。
  11. 一種經分離之聚核苷酸，編碼如請求項1至10任一項所述之抗體或其抗原結合片段。
  12. 如請求項11之經分離聚核苷酸，其中該聚核苷酸經密碼子最佳化，用於宿主細胞表現。
  13. 一種重組載體，包含如請求項11之聚核苷酸。
  14. 如請求項13所述之重組載體，包含一表現控制序列，其操作性地連結至編碼該抗體或其抗原結合片段之聚核苷酸。
  15. 如請求項14所述之重組載體，其為一表現載體，其中該表現控制序列包含一啟動子。
  16. 一種宿主細胞，包含如請求項13所述之重組載體。
  17. 一種製造一抗體或其抗原結合片段之方法，該抗體或其抗原結合片段可特異性地結合：至一雙觸角LeB/LeB抗原，其包含結構[I]或結構[II]，至一雙觸角LeY/LeY抗原，其包含Fuc4(Galβ1→4GlcNAc)2 [III]或[Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc]2 [IV]，至一雙觸角LeB/LeY抗原，其包含Fuc2(Galβ1→3GlcNAc)[Fuc2(Galβ1→4GlcNAc)] [V]，或[Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc] [VI]，以及至一雙觸角LeY/LeB抗原，其包含Fuc2(Galβ1-4GlcNAc)[Fuc2(Galβ1-3GlcNAc)] [VII]，或[Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc] [VIII]，以及其中該抗體或其抗原結合片段並未特異性地結合至一單觸角Lex抗原，其包含Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc[IX]，或結合至一雙觸角Lex抗原，其包含[Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X]，或結合至一單觸角LeA抗原，其包含Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc[XI]，或結合至一單觸角第2型H抗原，其包含Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc[XII]，或結合至一雙觸角第2型H抗原，其包含 (Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII]，或結合至一單觸角第1型H抗原，其包含Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc[XIV]，該方法包含：培養如請求項16所述之宿主細胞，在足以使該宿主細胞表現編碼該抗體或其抗原結合片段的聚核苷酸的條件與時間下，因而得到一包含該抗體或其抗原結合片段之培養物；以及自該培養物回收該抗體或其抗原結合片段。
  18. 一種抗體共軛物，包含如請求項1之經分離抗體或其抗原結合片段；以及連結於其上的有效載入(payload)分子。
  19. 一種醫藥組成物，包含：如請求項1至10任一項所述之經分離抗體或其抗原結合片段，或如請求項18、20或21所述之抗體共軛物；以及一醫藥載體。
  20. 如請求項18所述之抗體共軛物，其中該有效載入分子係共價性地以一聯結子與該抗體或其抗原結合片段連結。
  21. 如請求項20所述之抗體共軛物，其中該聯結子係選自於一可切割聯結子與一不可切割聯結子，其中該可切割聯結子係任擇性地為一蛋白酶-敏感型聯結子、pH-敏感型聯結子，或穀胱甘肽-敏感型聯結子。
  22. 如請求項18、20或21任一項所述之抗體共軛物，其中該有效載入分子選自於一治療試劑與一可偵測指示劑。
  23. 如請求項22所述之抗體共軛物，其中該有效載入分子為一治療試劑，其選自於微管蛋白靶向之抗有絲分裂劑、胜肽-基礎毒素、吡咯並苯並二氮雜(PBD)二聚體、抗生素、嘧啶合成抑制劑、抗代謝物、DNA烷化劑，以及拓撲異構酶抑制劑。
  24. 如請求項23所述之抗體共軛物，其中該有效載入分子選自於美登醇(mayntansinoid)、奧瑞史他汀(auristatin)、多柔比星(doxorubicin)、卡奇黴素(calicheamicin)、PBD二聚體、單甲基奧瑞史他汀E(monomethylauristatin E，MMAE)，以及單甲基奧瑞史他汀F(monomethylauristatin F，MMAF)。
  25. 如請求項22所述之抗體共軛物，其中該有效載入分子為可偵測之指示劑。
  26. 如請求項25所述之抗體共軛物，其中該可偵測指示劑選自於放射性核素、染料、放射性金屬、螢光部分、MRI對比劑、微泡、碳奈米管、金顆粒、氟去氧葡萄醣、酵素、發色團，以及不透放射線的標記物。
  27. 如請求項26所述之抗體共軛物，其中該可偵測指示劑為放射性核素，選自於68Ga、64Cu、86Y、89Zr、124I、99mTc、123I、111In、177Lu、131I、76Br、78Zr、18F，以及124T。
  28. 如請求項26所述之抗體共軛物，更包含一放射性核素螯合劑，選自於經馬來醯亞胺標記的DOTA、N-羥基琥珀醯亞胺-DOTA，以及去鐵胺(DFO)。
  29. 如請求項19所述之醫藥組成物，用於治療、診斷或偵測癌症。
  30. 如請求項29所述之供用於治療、診斷或偵測癌症的醫藥組成物，其中該癌症選自於胃癌、結腸癌、乳癌、肺癌、淋巴癌、肝癌、卵巢癌、胰臟前列腺癌、子宮癌，以及鱗狀細胞癌。
  31. 如請求項30所述之供用於治療、診斷或偵測癌症的醫藥組成物，其中該癌症選自於胃腺癌、黏液性胃腺癌、未分化的胃腺癌、戒環細胞胃癌、結腸腺癌、侵襲性乳導管癌、肝細胞癌、肺腺癌、鱗狀細胞癌、轉移性淋巴結腺癌、黏液性卵巢腺癌、胰導管腺癌、胰乳頭狀腺癌、前列腺腺癌和子宮內膜樣癌。
  32. 如請求項19所述之醫藥組成物，其供用於製備治療癌症之藥物。
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