RU2803097C2

RU2803097C2 - Терапевтические антитела, связывающиеся с биантеннарными антигенами льюиса b и льюиса y

Info

Publication number: RU2803097C2
Application number: RU2020141986A
Authority: RU
Inventors: Тун-Сюань ЧАН; Мэй-Чунь ЯН; Лиан-Йирн ЛИУ; Джерри ТИН; Шу-Ень ЧАН; Ень-Ин ЧЭНЬ; Юй-Юй ЛИНЬ; Шу-Лунь ТАН
Original assignee: Гликонекс Инк.
Priority date: 2018-05-31
Filing date: 2019-05-30
Publication date: 2023-09-06

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены антитела, их антигенсвязывающие фрагменты и конъюгаты антител, которые способны специфически связываться с определенными биантеннарными антигенами Льюиса, при этом антигены экспрессируются при ряде раковых заболеваний. Раскрываемые в настоящем документе антитела применимы для нацеливания на экспрессирующие антиген клетки с целью лечения или выявления различных раковых заболеваний. Также представлены полинуклеотиды, векторы и клетки-хозяева для получения раскрываемых антител и их антигенсвязывающих фрагментов. Также представлены фармацевтические композиции, способы лечения и выявления, а также применения антител, антигенсвязывающих фрагментов, конъюгатов антител и композиций. Изобретение обеспечивает исключительную специфичность связывания с определенными биантеннарными антигенами Льюиса. 21 н. и 36 з.п. ф-лы, 52 ил., 10 табл., 8 пр.

Description

Ссылка на родственные заявки

Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет согласно 35 U.S.С.§ 119(e) в соответствии с находящейся на рассмотрении заявкой на выдачу патента США с серийным №62/678890, поданной 31 мая 2018 года, при этом данная заявка включена в настоящий документ посредством ссылки в полном своем объеме.

Заявление о перечне последовательностей

Перечень последовательностей, ассоциированный с настоящей заявкой, представлен в текстовом формате, а не в бумажной копии, и тем самым включен посредством ссылки в настоящее описание. Текстовый файла, содержащий перечень последовательностей, называется 400100_401_WO_SEQUENCE_LISTING.txt. Текстовый файл, составляющий 43,3 кбит, был создан 30 мая 2019 года и подан в электронном виде через EFS-Web.

Область техники

Варианты осуществления настоящего раскрытия в целом относятся к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые способны специфически связываться с определенными антигенами Льюиса, а также к способам их получения и применения. Также представлены композиции, полинуклеотиды, векторы, белки слияния и клетки-хозяева, относящиеся к раскрываемым в настоящем документе антителам и антигенсвязывающим фрагментам. Согласно определенным вариантам осуществления раскрываемые в настоящем документе антитела и их антигенсвязывающие фрагменты способны специфически связываться с биантеннарными антигенами Le^B/Le^B, Le^Y/Le^Y, Le^B/Le^Y и Le^Y/Le^B и применимы в лечении или выявлении характеризующихся экспрессией таких антигенов заболеваний, таких как рак.

Уровень техники

Иммунотерапия представляет собой новый метод лечения ряда заболеваний, включая различные раковые заболевания. Например, клиническая эффективность моноклональных антител (mAb) с противоопухолевой активностью была продемонстрирована с конца 1990-х годов (см., например, Topalian et at, J. Clin. Oncol. 29(36):4828-4836 (2011)), и некоторые противораковые лекарственные средства представляют собой mAb (например, ритуксимаб, трастузумаб и бевацизумаб).

Терапевтические средства на основе антител могут специфически нацеливаться на экспрессирующие антиген клетки, такие как опухолевые клетки, и могут, например, оказывать влияние на цитотоксическую активность с помощью ряда средств, в том числе путем индуцирования зависимой от антитела клеточной цитотоксичности (ADCC), опосредованной комплементом цитотоксичности (CDC) и опосредованной Т-клетками цитотоксичности. Другие подходы предусматривают использование антител в качестве носителей для селективной доставки, например, цитотоксических или антипролиферативных средств, для уничтожения целевых клеток и/или для ингибирования роста и метастатического распространения таких клеток.

Соответствующие критерии для терапевтических средств на основе моноклонального антитела включают в себя, например, способность антитела специфически распознавать и связываться с желаемым антигеном, а не беспорядочно связываться с одним или несколькими другими потенциальными эпитопами, например, белками или гликанами, которые экспрессируются на здоровых клетках. Кроме того, антитело не должно быть иммуногенным для больного. В этом отношении антитела, специфические к антигенам заболеваний человека, часто вырабатываются у отличных от человека хозяев, таких как мыши и кролики, и могут обладать, например, аминокислотными последовательностями вида хозяина и/или углеводными мотивами, которые могут быть иммуногенными у больного человека. Соответственно, антитело, предпочтительное для применения в терапии, не обладает или обладает минимальными потенциально иммуногенными свойствами. Также необходимо учитывать особенности целевого антигена. Предпочтительно, антиген селективно экспрессируется или характеризуется высокой над экспрессией при конкретном болезненном состоянии (например, раке), так что опосредованная антителами терапия не будет оказывать нежелательные вредные эффекты «на мишени, вне опухоли» в отношении здоровой ткани.

Аберрантное гликозилирование (например, над экспрессия или неправильная экспрессия гликопротеинов и гликолипидов) является характерной чертой многих раковых заболеваний (см., например, Blanas et al., Front. Oncol. 8:39 (2018). Без ограничения теорией, аберрантное гликозилирование может влиять на ряд клеточных процессов, которые приводят к прогрессированию рака и метастазированию (например, клеточный рост и метаболизм, ангиогенез, межклеточные взаимодействия и межклеточная адгезия). Примеры углеводных антигенов, которые аберрантно экспрессируются при раковых заболеваниях, включают в себя антигены Льюиса типа I и типа II, которые являются концевыми (на невосстанавливающем конце) фукозилированными углеводными эпитопами системы антигенов Льюиса. Антигены Льюиса типа I и типа II включают в себя структурно родственные антигены H1, Н2 и Льюиса А, В, X и Y, все из которых имеют три моносахаридных единицы: (восстанавливающий) концевой ацетилглюкозамин (GlcNac); галактозу (Gal) и фукозу (Fuc). Антигены Льюиса типа I отличаются от антигенов Льюиса типа II в силу природы гликозидной связи в их лактозаминовых коровых цепях (Galβ1→3GlcNac: тип I; Galβ1→4GlcNac: тип II) и существуют в различных структурах (например, линейных или разветвленных, с одной, двумя или более антеннами, содержащими антигенные мотивы). Антигены Льюиса имеют умеренные уровни экспрессии в здоровых тканях взрослого человека (например, в эпителии пищеварительной и репродуктивной систем), но надэкспрессируются на поверхности клеток при ряде солидных раков, включая, например, раковые заболевания легкого, молочной железы, печени, почки, мочевого пузыря, поджелудочной железы и предстательной железы, а также ассоциированы с острым миелоидным лейкозом, острым лимфобластным лейкозом и неходжкинской лимфомой.

Известны некоторые терапевтические средства для лечения рака, нацеленные на антигены Льюиса, в том числе снятый с производства конъюгат антитело-лекарственное средство cBR96-Dox от компании Seattle Genetics/Bristol Meyers Squibb, который доставляет доксорубицин в опухолевые клетки, экспрессирующие антиген Le^Y, с использованием моноклонального антитела BR96 (Hellstrom et at, Cancer Res. 50(7):2183-2190 (1990)) в качестве молекулы носителя. Понятно, что в данной области сохраняется потребность в дополнительных терапевтических средствах лечения раковых заболеваний, таких как раковые заболевания, которые экспрессируют антигены Льюиса в виде опухолеассоциированных антигенов или опухолеспецифических антигенов. Раскрываемые в настоящем документе варианты осуществления удовлетворяют эту потребность и обеспечивают другие связанные с ними преимущества.

Сущность изобретения

Согласно определенным раскрываемым в настоящем документе вариантам осуществления представлено выделенное антитело, включающее в себя тяжелую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 10, и легкую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 11.

Согласно определенным вариантам осуществления представлено выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающие в себя вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая включает в себя аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 35; и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая включает в себя аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 5, при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны специфически связываться

с биантеннарным антигеном Le^B/Le^B, включающим в себя Fuc4(Galβ1→3GlcNAc)2 [I] или [Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc]2 [II],

с биантеннарным антигеном Le^Y/Le^Y, включающим в себя Fuc4(Galβ1→4GlcNAc)2 [III] или [Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc]2 [IV],

с биантеннарным антигеном Le^B/Le^Y, включающим в себя Fuc2(Galβ1→3GlcNAc)[Fuc2(Galβ1→4GlcNAc)] [V] или [Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc] [VI],

и с биантеннарным антигеном Le^Y/Le^B, включающим в себя Fuc2(Galβ1-4GlcNAc)[Fuc2(Galβ1-3GlcNAc)] [VII] или [Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc] [VIII],

и при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не связывается специфически с моноантеннарным антигеном Le^X, который включает в себя Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc [IX], или с биантеннарным антигеном Le^X, который включает в себя [Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X], или с моноантеннарным антигеном Le^A, который включает в себя Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc [XI], или с моноантеннарным антигеном Н типа 2, который включает в себя Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc [XII], или с биантеннарным антигеном Н типа 2, который включает в себя (Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII], или с моноантеннарным антигеном Н типа 1, который включает в себя Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc [XIV].

Согласно определенным вариантам осуществления представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающие в себя (а) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая включает в себя определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (V_H CDR1), включающую в себя аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 2; определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (V_H CDR2), включающую в себя аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 3; определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (V_H CDR3), включающую в себя аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 4; и (b) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая включает в себя определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (V_L CDR1), включающую в себя аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 6; определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (V_L CDR2), включающую в себя аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 7; и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (V_L CDR3), включающую в себя аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 8; при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны специфически связываться:

Согласно определенным из описываемых в настоящем документе вариантов осуществления выделенное антитело может представлять собой моноклональное антитело. Согласно определенным вариантам осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело. Согласно определенным вариантам осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбраны из Fab-фрагмента, Р(ab')2-фрагмента, Fv-фрагмента, одноцепочечного Fv (scFv)-антитела и диатела.

Также в настоящем документе представлены варианты осуществления, в которых выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает в себя вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая включает в себя аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентной идентичностью в отношении аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 35; и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая включает в себя аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентной идентичностью в отношении аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 5, при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны специфически связываться

Согласно определенным вариантам осуществления настоящее раскрытие относится к выделенному антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, включающему в себя

(a) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая включает в себя определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (V_H CDR1), включающую в себя аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 2, или аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентной идентичностью в отношении аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 2; определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (V_H CDR2), включающую в себя аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 3, или аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентной идентичностью в отношении аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3; определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (V_H CDR3), включающую в себя аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 4, или аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентной идентичностью в отношении аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4; и

(b) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая включает в себя определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (V_L CDR1), включающую в себя аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 6, или аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентной идентичностью в отношении аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 6; определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (V_L CDR2), включающую в себя аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 7, или аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентной идентичностью в отношении аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 7; и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (V_L CDR3), включающую в себя аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 8, или аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентной идентичностью в отношении аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 8.

Согласно определенным дополнительным вариантам осуществления представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с настоящим раскрытием, включающие в себя (i), (ii), (iii), (iv), (v) или (vi), как представлено ниже, или любую их комбинацию: (i) V_H CDR1, включающую в себя вариант аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 2, при этом вариация состоит из замены Y→A в положении 33 согласно нумерации по Kabat; (ii) V_H CDR3, включающую в себя вариант аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4, при этом вариация состоит из замены Y→A в положении 104 согласно нумерации по Kabat; (iii) V_H CDR3, включающую в себя вариант аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4, при этом вариация состоит из замены Н→А в положении 106 согласно нумерации по Kabat; (iv) V_L CDR1, включающую в себя вариант аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 6, при этом вариация состоит из замены Y→A в положении 30 согласно нумерации по Kabat; (v) V_L CDR2, включающую в себя вариант аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 7, при этом вариант состоит из замены G→А в положении 50 согласно нумерации по Kabat; или (vi) V_L CDR3, включающую в себя вариант аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 8, при этом вариация состоит из замены T→S в положении 93 согласно нумерации по Kabat.

Согласно определенным дополнительным вариантам осуществления представлены выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые включают в себя определяющие комплементарность области (CDR), описываемые в настоящем документе (т.е. CDR, характеризующиеся по меньшей мере 90% идентичностью в отношении SEQ ID NO: 2, 3, 4, 6, 7 и 8, соответственно, в том числе такие варианты CDR с описываемыми в настоящем документе аминокислотными заменами), и включают в себя вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, включающую в себя или состоящую из аминокислотной последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентной идентичностью в отношении аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 35; и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая включает в себя или состоит из аминокислотной последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентной идентичностью в отношении аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 5.

Согласно любому из описываемых в настоящем документе вариантов осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитело-лекарственное средство, включающий в себя антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с настоящим раскрытием, может демонстрировать пониженное (например, пониженное статистически значимым образом, как определено с использованием принятой в данной области методологии) связывание (в том числе согласно определенным вариантам осуществления отсутствие связывания) с моноантеннарным антигеном Льюиса В или моноантеннарным антигеном Льюиса Y по сравнению с антителом «ВВС», которое, как раскрывается в настоящем документе, включает в себя домен V_L, имеющий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 27, и домен VH, имеющий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 28. Одновалентный антиген Льюиса В представляет собой антиген группы крови, который экспрессируется в нормальных тканях человека; соответственно, раскрываемые в настоящем документе антитела, антигенсвязывающие фрагменты и конъюгаты антитело-лекарственное средство обладают улучшенной специфичностью в отношении ракового антигена и сниженным связыванием с моноантеннарным антигеном Льюиса В, который экспрессируется в нормальных тканях человека, по сравнению с антителом ВВС. Согласно определенным вариантам осуществления раскрываемые в настоящем документе антитело, антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитело-лекарственное средство характеризуются 1-кратным, 2-кратным, 3-кратным, 5-кратным, 6-кратным, 7-кратным, 8-кратным или более усилением связывания с экспрессируемым на клеточной поверхности антигеном согласно любой одной или нескольким из формул [I] - [VIII], приведенных в настоящем документе, по сравнению со связыванием с моноантеннарным антигеном Льюиса В.

Согласно определенным вариантам осуществления антитело, антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитело-лекарственное средство связывается с моноантеннарным антигеном Льюиса В с 1/10, 1/9, 1/8, 1/7, 1/6, 1/5, 1/4, 1/3 или 1/2 аффинности в отношении BR96, например, как измерено в анализе связывания ELISA.

Согласно любому из описываемых в настоящем документе вариантов осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, или конъюгат антитело-лекарственное средство, включающий в себя антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с настоящим раскрытием, связывает антигены, которые отличаются от моноантеннарного антигена Le^Y, распознаваемого антителом BR96, и может в соответствии с неограничивающей теорией обеспечивать более безопасное и более специфическое нацеливание на раковые клетки при терапевтических применениях по сравнению с BR96. Согласно любому из описываемых в настоящем документе вариантов осуществления выделенное антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, или конъюгат антитело-лекарственное средство, включающий в себя антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с настоящим раскрытием, связывается с экспрессирующими антиген раковыми клетками, эффективно и стабильно интернализирует в лизосомы таких клеток и безопасно переносится в терапевтических дозах на модели отличных от человека приматов.

Согласно другому аспекту настоящее раскрытие относится к выделенным полинуклеотидам, которые кодируют раскрываемые в настоящем документе антитела или их антигенсвязывающие фрагменты. Согласно определенным вариантам осуществления полинуклеотид является кодон-оптимизированным для экспрессии в клетке-хозяине. Согласно определенным родственным вариантам осуществления представлены рекомбинантные векторы, которые включают в себя полинуклеотид, кодирующий раскрываемое в настоящем документе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Согласно определенным вариантам осуществления рекомбинантный вектор включает в себя последовательность контроля экспрессии, функционально связанную с полинуклеотидом, кодирующим антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Согласно конкретным вариантам осуществления рекомбинантный вектор представляет собой вектор экспрессии, в котором последовательность контроля экспрессии включает в себя промотор.

Согласно другому варианту осуществления представлены клетки-хозяева, которые включают в себя рекомбинантный вектор и/или вектор экспрессии в соответствии с настоящим раскрытием. Согласно другим определенным вариантам осуществления представлены связанные способы получения раскрываемого в настоящем документе антитела или его антигенсвязывающий фрагмента, которые способны специфически связываться:

и при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не связывается специфически с моноантеннарным антигеном Le^X, который включает в себя Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc [IX], или с биантеннарным антигеном Le^X, который включает в себя [Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X], или с моноантеннарным антигеном Le^A, который включает в себя Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc [XI], или с моноантеннарным антигеном Н типа 2, который включает в себя Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc [XII], или с биантеннарным антигеном Н типа 2, который включает в себя (Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII], или с моноантеннарным антигеном Н типа 1, который включает в себя Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc [XIV], при этом способы предусматривают культивирование клетки-хозяина, описываемой в настоящем документе, при условиях и на протяжении времени, достаточных для экспрессии клеткой-хозяином полинуклеотида, кодирующего антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, с получением тем самым культуры, включающей в себя антитело или его антигенсвязывающий фрагмент; и извлечение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из культуры.

Согласно другому варианту осуществления представлены конъюгаты антитела, которые включают в себя выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с настоящим раскрытием и связанную с ним молекулу нагрузки. Согласно определенным вариантам осуществления молекула нагрузки ковалентно связывается линкером с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. Согласно определенным вариантам осуществления линкер выбран из расщепляемого линкера и нерасщепляемого линкера. Согласно определенным вариантам осуществления расщепляемый линкер представляет собой чувствительный к протеазе линкер, рН-чувствительный линкер или чувствительный к глутатиону линкер. Согласно определенным вариантам осуществления расщепляемого линкер представляет собой чувствительный к протеазе линкер, включающий в себя дипептид валин-цитруллин. Согласно некоторым вариантам осуществления линкер включает в себя малеимидную группу. Согласно определенным вариантам осуществления раскрываемые в настоящем документе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включают в себя восстановленный дисульфидный мостик в шарнирной области, и восстановленный дисульфидный мостик соединяется с малеимидной группой. Также в настоящем документе представлены варианты осуществления, в которых линкер дополнительно включает в себя саморазрушающуюся группу, такую как, например, пара-аминобензиловый спирт (РАВС).

Согласно определенным вариантам осуществления конъюгат антитела включает в себя раскрываемое в настоящем документе антитело или антигенсвязывающий фрагмент и молекулу нагрузки, которая выбрана из терапевтического средства и выявляемого индикатора. Согласно определенным вариантам осуществления молекула нагрузки представляет собой терапевтическое средство, выбранное из нацеливающегося на тубулин противомитотического средства, токсина на основе пептида, димера пирролобензодиазепина (PBD), антибиотика, ингибитора синтеза пиримидина, антиметаболического средства, алкилирующего ДНК средства и ингибитора топоизомеразы. Согласно определенным вариантам осуществления молекула нагрузки выбрана из майтансиноида, ауристатина, доке ору бицина, калихеамицина, димера PBD, монометилауристатина Е (ММАЕ) и монометилауристатина F (MMAF). Согласно другим определенным вариантам осуществления молекула нагрузки представляет собой выявляемый индикатор. Согласно определенным дополнительным вариантам осуществления выявляемый индикатор выбран из радионуклида, красителя, радиометалла, флуоресцентного фрагмента, контрастного средства для МРТ, микропузырька, углеродной нанотрубки, частицы золота, фтордезоксиглюкозы, фермента, хромофора и непрозрачного для рентгеновских лучей маркера. Согласно конкретным вариантам осуществления выявляемый индикатор представляет собой радионуклид, выбранный из ⁶⁸Ga, ⁶⁴Cu, ⁸⁶Y, ⁸⁹Zr, ¹²⁴I, ⁹⁹mTc, ¹²³I, ¹¹¹In, ¹⁷⁷Lu, ¹³¹I, ⁷⁶Br, ⁷⁸Zr, ¹⁸F и ¹²⁴T. Согласно определенным вариантам осуществления конъюгат антитела включает в себя радионуклидный хелатор, выбранный из меченной малеимидом DOTA, N-гидроксисукцинимид-DOTA и дезферриоксамина (DFO).

Также в настоящем документе представлены фармацевтические композиции, которые согласно некоторым вариантам осуществления включают в себя выделенное раскрываемое в настоящем документе антитело, антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела и фармацевтический носитель.

Согласно определенным вариантам осуществления настоящее раскрытие также относится к способам лечения или выявления, предусматривающим применение раскрываемых в настоящем документе антител, антигенсвязывающих фрагментов и/или конъюгатов антитела. Согласно некоторым вариантам осуществления представлены способы лечения или выявления рака, при этом способы предусматривают введение фармацевтической композиции, раскрываемой в настоящем документе, субъекту, нуждающемуся в этом. Согласно определенным вариантам осуществления субъект имеет или подозревается в том, что имеет рак, который выбран из рака желудка, рака толстой кишки, рака молочной железы, рака легкого, лимфатического рака, рака печени, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака матки и плоскоклеточной карциномы. Согласно определенным вариантам осуществления рак выбран из аденокарциномы желудка, муценозной аденокарциномы желудка, недифференцированной аденокарциномы желудка, перстневидноклеточной карциномы желудка, аденокарциномы толстой кишки, инвазивной карциномы протоков молочной железы, печеночноклеточной карциномы, аденокарциномы легкого, плоскоклеточной карциномы, метастатической аденокарциномы лимфатических узлов, муценозной аденокарциномы яичника, аденокарциномы протоков поджелудочной железы, папиллярной аденокарциномы поджелудочной железы, аденокарциномы предстательной железы и карциномы эндометрия. Согласно определенным вариантам осуществления представлен способ, который предусматривает введение субъекту раскрываемой в настоящем документе композиции (например, включающей в себя раскрываемое в настоящем документе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент) путем, который выбран из внутривенного, парентерального, внутрижелудочного, внутриплеврального, внутрилегочного, внутриректального, внутрикожного, внутриперитонеального, внутриопухолевого, подкожного, перорального, местного, чрескожного, интрацистернального, интратекального, интраназального и внутримышечного. Согласно определенным дополнительным вариантам осуществления раскрываемых в настоящем документе способов выявления или лечения рака субъект получает или ранее получал (а) иммуносупрессивную терапию; (b) стимулирующую контрольную точку иммунного ответа молекулу; (с) радиационную терапию; (d) химиотерапию; (е) клеточную иммунотерапию или (f) любую комбинацию (а) - (е).

Эти и другие аспекты и варианты осуществления настоящего раскрытия станут понятными при обращении к следующему подробному описанию и прилагаемым графическим материалам. Все ссылочные материалы, раскрываемые в настоящем документе, тем самым включены посредством ссылки в полном своем объеме, как если бы каждый из них была включен отдельно.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 показаны множественные выравнивания аминокислотных последовательностей раскрываемой в настоящем документе вариабельной области тяжелой цепи антитела «ВВС» (SEQ ID NO: 28) с выбранными кандидатными человеческими акцепторными аминокислотными последовательностями (1-8; соответствующими SEQ ID NO: 44-51, соответственно). В строке 3 (заключена в рамку из пунктирной линии) показана человеческая акцепторная последовательность, выбранная для трансплантации CDR. В средней части фигуры единственная заключенная в рамку аминокислота (V/I/M) представляет собой редкий метионин в человеческой акцепторной последовательности; этот остаток заменяли на более распространенный изолейцин во время гуманизации.

На фиг.2А показаны выравнивания аминокислотных последовательностей вариабельной области легкой цепи (LC) антитела IMH2/BBC (SEQ ID NO: 27) и гуманизированные варианты: hBBC.8 (SEQ ID NO: 31), hBBC.9 и hBBC.9.1 (SEQ ID NO: 33), а также hBBC.10, hBBC.10.1 и hBBC.10.1FQ (SEQ ID NO: 5). Последовательности hBBC CDR показаны в рамках (пунктирные линии), а человеческие акцепторные последовательности CDR подчеркнуты. В нижней части фигуры два отдельных взятых в рамку аминокислотных остатка (R/G и Y/F) показывают отличия в последовательности каркасной области. На фиг.2 В показана относительная активность антител ВВС, hBBC.8, hBBC.8 с мутацией замены R66G, hBBC.9 и hBBC. 10 в анализе связывания с клетками AGS. hBBC-LC с мутацией F71Y представляет hBBC.9. hBBC-LC с мутациями F71Y и R66G представляет hBBC.10. На фиг.2С-2Е показана специфичность связывания дополнительных созданных вариантных антител (2С) с клетками AGS и (2D, 2Е) с клетками AGS по сравнению с синтетическим моноантеннарным антигеном Le^B.

На фиг.3 представлены выравнивания последовательностей антитела hBBC.10.1 (SEQ ID NO: 38), антитела hBBC.10.1FQ (SEQ ID NO: 39) и двух одобренных FDA гуманизированных терапевтических антител (эталон 1 и эталон 2) (SEQ ID NO: 40 и 41, соответственно) в каркасной области 3 тяжелой цепи.

На фиг.4А и 4В показано секвенирование MALDI-MSMS Fuc4(LacNAc)3Lac клеток COLO 205 GSL при масса/заряд 2521 в несвязанных (4А) и BBC-связанных (элюированных) фракциях (4В). На фиг.4А-7В гликаны обозначаются следующим образом: незаштрихованные кружочки = Gal; заштрихованные кружочки = Glc; заштрихованные квадраты = GlcNac; заштрихованные треугольники = Fuc. Те же условные обозначения применяются на фиг.8А-8В с той разницей, что заштрихованные кружочки = Man.

На фиг.5А и 5В показаны, соответственно, профили MALDI-MS ВВС-связывающих (вверху) и несвязывающих (вверху) гликанов клеток (A) NCI-N87 и (В) SW1116 GSL.

На фиг.6А и 6В показано секвенирование MALDI-MSMS Fuc4(LacNAc)3Lac клеток NCI-N87 (6А) и SW1116 GSL (6В) при масса/заряд 2521 в BBC-связанной (элюированной) фракции.

На фиг.7А и 7В представлено секвенирование MALDI-MSMS Fuc4(LacNAc)3Lac и Fuc6(LacNAc)5Lac клеток NCI-N87 GSL при масса/заряд 2970 (7А) и масса/заряд 3767 (7В) в BBC-связанной (элюированной) фракции.

На фиг.8А и 8В показано секвенирование MALDI-Q/TOF MS/MS BBC-обогащенного N-гликана AGS.

На фиг.9А и 9В показаны, соответственно, графики титрования ITC гликановых антигенов (A) Le^Y-пентоза и (В) Le^B-пентоза с антителом hBBC.10.1.

На фиг.10А-10С показаны графики титрования ITC дополнительных гликановых антигенов с антителом hBBC.10.1: (A) Le^Y/Le^Y-ASGA; антиген (В) Le^Y/Le^Y-I; (С) антиген Le^Y/Le^B-I.

На фиг.11А-11F показаны графики титрования ITC других гликановых антигенов с антителом hBBC.10.1: (А) Le^X-тетраоза; (В) Le^A-тетраоза; (С) антиген Н типа I; (D) антиген Н типа II; (Е) H-ASGP; (F) Le^X/Le^X-ASGP.

На фиг.12А-12С представлены графики титрования ITC гликановых антигенов с эталонным антителом «BR96»: (A) Le^Y-пентоза; (В) антиген Le^Y/Le^Y-I и С) Le^Y/Le^Y-ASGP.

На фиг.13А и 13В показаны сенсограммы поверхностного плазмонного резонанса (SPR) hBBC.10.1 и BR96 против указанных гликановых антигенов: (A) Le^Y-Gal и Le^Y/Le^Y-ASGA; (В) Le^B-Gal и Le^B/Le^B-ASGA.

На фиг.14А и 14В показаны результаты непрямого ELISA связывания hBBC.10.1 с покрытыми антигенами Льюиса при указанных концентрациях: (A) Le^Y/Le^Y-ASGA-биотин; (В) Le^Y-Gal-биотин.

На фиг.15 показаны результаты непрямого ELISA связывания hBBC.10.1 с покрытыми антигенами Льюиса (Le^B/Le^B-ASGA по сравнению с Le^Y/Le^Y-ASGA и Le^B-Gal) при указанных концентрациях.

На фиг.16А показаны результаты ELISA связывания антигена для hBBC.10.1 с гликановыми антигенами, в том числе Le^Y-Gal-sp3-биотин (Le^Y-Gal), Le^B-Gal-LC-биотин (Le^B-Gal), Le^Y/Le^Y-ASGA-биотин (Le^Y/Le^Y-ASGA), Le^B/Le^B-ASGA-биотин (Le^B/Le^B-ASGA), 3-Le^Y/6-Le^B-ASGA-биотин (Le^Y/Le^B-ASGA) и 3-Le^B/6-Le^Y-ASGA-биотин (Le^B/Le^Y-ASGA). Количество покрытия всех антигенов было одинаковым (1,87 пмоль)). На фиг.16В и 16С показаны, соответственно, результаты экспериментов с ELISA связывания антигена для сравнения аффинности и селективности (16В) антитело ВВС и (16С) антитело hBBC.10.1 в отношении антигена.

На фиг.17 представлены изображения флуоресцентной микроскопии, демонстрирующие эндоцитоз hBBC.10.1 клетками AGS рака желудка. Левые панели: hBBC.10.1, окрашенное конъюгированным с А1еха488 антителом против IgG человека (зеленый канал). Правые панели: наложение с окрашиванием F-актина, меченным фаллоидином родамином (красный канал). Области, в которых совместно распределены флуоресцеин и родамин, выглядели желтыми под микроскопом и выглядели как совместно локализованный флуоресцентный сигнал на объединенном изображении.

На фиг.18 представлены изображения флуоресцентной микроскопии, демонстрирующие лизосомную локализацию hBBC.10.1 в клетках AGS рака желудка. Левые панели: hBBC.10.1, окрашенное конъюгированным с А1еха488 антителом против IgG человека (зеленый канал). Средние панели: лизосома, меченная антителом против Lamp-1, а затем антителом против IgG кролика (красный канал). Правые панели: объединение.

На фиг.19А и 19В показана противоопухолевая активность hBBC.10.1 в in vivo эксперименте с ксенотрансплантатом, в котором иммунодефицитным мышам SCID вводили (А) человеческие клетки DLD-1 или (В) опухолевые клетки COLO 205, а затем антитело после развития опухолей.

На фиг.20А и 20В показана, соответственно, противоопухолевая активность различных концентраций (A) hBBC.10.1 и (В) BR96 в in vivo экспериментах с ксенотрансплантатом, в которых иммунодефицитным мышам SCID вводили клетки AGS аденокарциномы желудка человека с последующим антителом после развития опухолей. На фиг.20С и 20D показана противоопухолевая активность антител hBBC в соответствии с настоящим раскрытием в in vivo экспериментах с ксенотрансплантатом.

На фиг.21 показано непосредственное уничтожение опухолевых клеток AGS с помощью hBBC.10.1 («hBBC») и BR96 при различных концентрациях антитела. Уничтожение измеряли как процент целевых клеток, окрашенных йодидом пропидия (PI).

На фиг.22 показана противоопухолевая активность hBBC.10.1 («hBBC») и BR96 в in vivo эксперименте с ксенотрансплантатом, в котором иммунодефицитным мышам SCID вводили клетки TSGH 9201 карциномы желудка человека с последующим антителом после развития опухолей.

На фиг.23 показана противоопухолевая активность различных концентраций hBBC.10.1 («hBBC») в in vivo эксперименте с ксенотрансплантатом, в котором иммунодефицитным мышам SCID вводили клетки COLO 201 аденокарциномы толстой и прямой кишки человека с последующим антителом антитело после развития опухолей.

На фиг.24А и 24В показана противоопухолевая активность (A) hBBC.10.1 («hBBC») и (В) BR96 в in vivo эксперименте с ксенотрансплантатом, в котором иммунодефицитным мышам SCID вводили клетки COLO 201 аденокарциномы толстой и прямой кишки человека с последующим антителом после развития опухолей.

Краткое описание последовательностей

SEQ ID NO: 1 представляет собой аминокислотную последовательность вариабельного (V_H) домена тяжелой цепи антитела hBBC.10.1FQ:

SEQ ID NO: 2 представляет собой аминокислотную последовательность определяющей комплементарность области 1 тяжелой цепи (V_H CDR1) антитела IMH2/BBC, антитела hBBC.8, антитела hBBC.9, антитела hBBC.9.1, антитела hBBC.10, антитела hBBC.10.1 и антитела hBBC.10.1FQ:

SGYTWH.

SEQ ID NO: 3 представляет собой аминокислотную последовательность V_H CDR2 антитела hBBC.9.1, антитела hBBC.10.1 и антитела hBBC.10.1FQ:

YIHYTGNTKYSPSLKS.

SEQ ID NO: 4 представляет собой аминокислотную последовательность V_H CDR3 антитела hBBC.10.1 и антитела hBC.10.1FQ:

EALRGYDAGFWFTY.

SEQ ID NO: 5 представляет собой аминокислотную последовательность вариабельного (V_L) домена легкой цепи антитела hBBC.10, антитела hBBC.10.1 и антитела hBBC.10.1FQ:

SEQ ID NO: 6 представляет собой аминокислотную последовательность определяющей комплементарность области 1 легкой цепи (V_L CDR1) антитела IMH2/BBC, антитела hBBC.8, антитела hBBC.9, антитела hBBC.9.1, антитела hBBC.10, антитела hBBC.10.1 и антитела hBBC.10.1FQ:

TASEDIYNRLT.

SEQ ID NO: 7 представляет собой аминокислотную последовательность V_L CDR2 антитела IMH2/BBC, антитела hBBC.8, антитела hBBC.9, антитела hBBC.9.1, антитела hBBC.10, антитела hBBC.10.1 и антитела hBBC.10.1FQ:

GATSLDT.

SEQ ID NO: 8 представляет собой аминокислотную последовательность V_L CDR3 антитела IMH2/BBC, антитела hBBC.8, антитела hBBC.9, антитела hBBC.9.1, антитела hBBC.10, антитела hBBC.10.1 и антитела hBBC.10.1FQ:

QQYWTTPWT.

SEQ ID NO: 9 представляет собой аминокислотную последовательность одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv), происходящую из антитела hBBC.10.1 в ориентации [V_L-V_H]:

TV, при этом «х» может представлять собой 1 или 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10 или больше повторов последовательности GGGGS, показанной в скобках.

SEQ ID NO: 10 представляет собой аминокислотную последовательность полноразмерной тяжелой цепи (НС) антитела hBBC.10.1:

SEQ ID NO: 11 представляет собой аминокислотную последовательность полноразмерной легкой цепи (LC) антитела hBBC. 10, антитела hBBC.10.1 и антитела hBBC.10.lFQ:

SEQ ID NO: 12 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельный (V_H) домен тяжелой цепи антитела hBBC.10.1:

SEQ ID NO: 13 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (V_H CDR1) антитела IMH2/BBC, антитела hBBC.8, антитела hBBC.9, антитела hBBC.9.1, антитела hBBC.10, hBBC.10.1 и антитела hBBC.10.1FQ:

agcggctatacctggcat.

SEQ ID NO: 14 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую V_H CDR2 антитела hBBC.9.1, антитела hBBC. 10 и антитела hBBC.10.1FQ:

SEQ ID NO: 15 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую V_H CDR3 антитела hBBC.10.1 и антитела hBBC.10.1FQ:

SEQ ID NO: 16 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельный (V_L) домен легкой цепи антитела hBBC. 10, антитела hBBC.10.1 и антитела hBBC.10.1FQ:

SEQ ID NO: 17 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (V_L CDR1) антитела IMH2/BBC, антитела hBBC.8, антитела hBBC.9, антитела hBBC.9.1, антитела hBBC.10, антитела hBBC.10.1 и антитела hBBC.10.1FQ:

SEQ ID NO: 18 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую V_L CDR2 антитела IMH2/BBC, антитела hBBC.8, антитела hBBC.9, антитела hBBC.9.1, антитела hBBC. 10, антитела hBBC.10.1 и антитела hBBC.10.1FQ:

SEQ ID NO: 19 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую V_L CDR3 антитела IMH2/BBC, антитела hBBC.8, антитела hBBC.9, антитела hBBC.9.1, антитела hBBC. 10, антитела hBBC.10.1 и антитела hBBC.10.1FQ:

SEQ ID NO: 20 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) в ориентации [V_L-(L)-V_H], происходящий из антитела hBBC.10.1:

может представлять собой 1 или 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше повторов последовательности ggtggaggcggttct, показанной в скобках.

SEQ ID NO: 21 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую полноразмерную тяжелую цепь (НС) антитела hBBC.10.1:

SEQ ID NO: 22 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую полноразмерную легкую цепь (LC) антитела hBBC.10.1 и антитела hBBC.10.1FQ:

SEQ ID NO: 23 представляет собой иллюстративную спейсерную аминокислотную последовательность EGKSSGSGSESKVD.

SEQ ID NO: 24 представляет собой иллюстративную спейсерную аминокислотную последовательность KESGSVSSEQLAQFRSLD.

SEQ ID NO: 25 представляет собой гибкую полилинкерную аминокислотную последовательность

GGGGS.

SEQ ID NO: 26 представляет собой гибкую полилинкерную аминокислотную последовательность

GGGGS GGGGS GGGGS.

SEQ ID NO: 27 представляет собой аминокислотную последовательность домена V_L антитела IMH2/BBC:

SEQ ID NO: 28 представляет собой аминокислотную последовательность домена V_H антитела IMH2/BBC:

SEQ ID NO: 29 представляет собой аминокислотную последовательность домена V_L человеческого акцепторного каркасного AAS01771.1:

SEQ ID NO: 30 представляет собой аминокислотную последовательность домена V_H человеческого акцепторного каркасного CAD89404.1:

SEQ ID NO: 31 представляет собой аминокислотную последовательность домена V_L антитела hBBC.8:

SEQ ID NO: 32 представляет собой аминокислотную последовательность домена V_H антитела hBBC.8, антитела hBBC.9 и антитела hBBC.10:

SEQ ID NO: 33 представляет собой аминокислотную последовательность домена V_L антитела hBBC.9 и антитела hBBC.9.1:

SEQ ID NO: 34 представляет собой аминокислотную последовательность домена V_H антитела hBBC.9.1:

SEQ ID NO: 35 представляет собой аминокислотную последовательность домена V_H антитела hBBC.10.1:

SEQ ID NO: 36 представляет собой аминокислотную последовательность одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv), происходящего из антитела hBBC.10.1 в ориентации [V_H-V_L]:

EIK, при этом «х» может представлять собой 1 или 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше повторов последовательности GGGGS, показанной в скобках.

SEQ ID NO: 37 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) в ориентации [V_H-(L)-V_L], происходящий из антитела hBBC.10.1:

Эти и другие последовательности представлены в прилагаемом перечне последовательностей.

Подробное описание изобретения

Настоящее раскрытие относится к гуманизированным антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, которые способны специфически связываться с определенными антигенами Льюиса, экспрессируемыми при ряде раковых заболеваний. Более конкретно, как описывается в настоящем документе впервые и более подробно представлено ниже, химерные гуманизированные антитела в соответствии с настоящим изобретением неожиданно связываются с исключительной специфичностью с определенными биантеннарными антигенами Льюиса ^B/Y, которые экспрессируются на раковых клетках и обладают сильной противоопухолевой активностью in vivo. Кроме того, раскрываемые в настоящем документе антитела преимущественно обладают неожиданно сниженным (например, сниженным статистически значимым образом) связыванием с моноантеннарным антигеном Льюиса В (который экспрессируется в здоровых тканях) по сравнению с антителом ВВС, которое включает в себя домен V_L, имеющий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 27, и домен V_H, имеющий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 28. Антитела, раскрываемые в настоящем документе, связывают антигены, которые отличаются от моноантеннарного антигена Le^Y, распознаваемого антителом BR96, и, без ограничения теорией, антитела в соответствии с настоящим изобретением могут обеспечивать более безопасное и более специфическое нацеливание на раковые клетки при терапевтических применениях по сравнению с BR96. Кроме того, антитела и антигенсвязывающие фрагменты в соответствии с настоящим изобретением также связываются с экспрессирующими антиген раковыми клетками, эффективно и стабильно интернализируются в лизосомы таких клеток и безопасно переносятся в терапевтических дозах на модели отличных от человека приматов.

Согласно определенным предпочтительным вариантам осуществления и, кроме того, согласно неограничивающей теории, полезные применения раскрываемых в настоящем документе антител и их антигенсвязывающих фрагментов относятся к способам диагностики и/или лечения раковых заболеваний, таких как, например, различные раковые заболевания желудка, рак яичника, рак легкого, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы и другие раковые заболевания. Эти и связанные с ними варианты осуществления раскрываются в настоящем документе более подробно.

Полипептиды и белки

Термины «полипептид», «белок», «пептид» и «гликопротеин» используются взаимозаменяемо и относятся к полимеру аминокислот без ограничения какой-либо конкретной длиной. Термин не исключает модификации, такие как миристиолирование, сульфатирование, гликозилирование, фосфорилирование и добавление или делетирование сигнальных последовательностей. Термины «полипептид» или «белок» могут означать одну или несколько цепей аминокислот, при этом каждая цепь включает в себя аминокислоты, ковалентно связанные пептидными связями, и при этом указанный полипептид или белок может включать в себя множество цепей, нековалентно и/или ковалентно связанных вместе пептидными связями, имеющих последовательность нативных белков, то есть белков, продуцируемых встречающимися в природе, а конкретнее нерекомбинантными клетками или генетически сконструированными или рекомбинантными клетками, и включают в себя молекулы, имеющие аминокислотную последовательность нативного белка, или молекулы, имеющие делеции, добавления и/или замены одной или нескольких аминокислот нативной последовательности. Таким образом, термин «полипептид» или «белок» может включать в себя одну (называется «мономером») или множество (называется «мультимером») аминокислотных цепей. Термины «пептид», «полипептид» и «белок» специально охватывают антитела и антигенсвязывающие фрагменты в соответствии с настоящим раскрытием или последовательности, которые имеют делеции, добавления и/или замены одной или нескольких аминокислот антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

Используемый в настоящем документе термин «аминокислота» относится к встречающимся в природе и синтетическим аминокислотам, а также аминокислотным аналогам и аминокислотным миметикам, которые функционируют подобно встречающимся в природе аминокислотам. Встречающиеся в природе аминокислоты представляют собой аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также такие аминокислоты, которые затем модифицируются, например, гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат и О-фосфосерин. Аминокислотные аналоги относятся к соединениям, которые имеют такую же основную химическую структуру, что и у встречающейся в природе аминокислоты, т.е. а-углерод, который связан с водородом, карбоксильной группой, аминогруппой и группой R, например, гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, метионинметилсульфоний. Такие аналоги имеют модифицированные группы R (например, норлейцин) или модифицированные пептидные остовы, но сохраняют ту же основную химическую структуру, что и у встречающейся в природе аминокислоты. Аминокислотные миметики относятся к химическим соединениям, которые имеют структуру, отличающуюся от общей химической структуры аминокислоты, но которые функционируют подобно встречающейся в природе аминокислоте.

Используемый в настоящем документе термин «мутация» относится к изменению в последовательности молекулы нуклеиновой кислоты или полипептидной молекулы по сравнению с эталоном, или молекулой нуклеиновой кислоты, или полипептидной молекулой дикого типа, соответственно. Мутация может приводить к нескольким различным типам изменения в последовательности, включающим в себя замену, вставку или делецию нуклеотида(ов) или аминокислоты(аминокислот).

Термин «полипептидный фрагмент» относится к полипептиду (который может быть мономерным или мультимерным), который имеет амино-концевую делецию, карбоксил-концевую делецию и/или внутреннюю делецию или замену встречающегося в природе или рекомбинантно полученного полипептида. Используемый в настоящем документе термин «смежные аминокислоты» относится к ковалентно связанным аминокислотам, соответствующим непрерывной линейной части раскрываемой аминокислотной последовательности. Согласно определенным вариантам осуществления полипептидный фрагмент может включать в себя аминокислотную цепь длиной по меньшей мере от 5 до приблизительно 500 аминокислот. Следует учитывать, что согласно определенным вариантам осуществления фрагменты имеют в длину по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 или 450 аминокислот.

Термины «выделенный белок» и «выделенный полипептид», упоминаемые в настоящем документе, означают, что рассматриваемый белок или полипептид (1) не содержит по меньшей мере некоторых других белков или полипептидов, с которыми он обычно встречается в природе, (2) практически не содержит других белков или полипептидов из того же источника, например, из того же вида, (3) экспрессируется клеткой другого вида, (4) был отделен по меньшей мере от приблизительно 50 процентов полинуклеотидов, липидов, углеводов или других материалов, с которыми он связан в природе, (5) не связывается (ковалентным или нековалентным взаимодействием) с частями белка или полипептида, с которыми «выделенный белок» или «выделяемый полипептид» может быть связан в природе, (6) функционально связывается (ковалентным или нековалентным взаимодействием) с полипептидом, с которым он не связан в природе, или (7) не встречается в природе. Такой выделенный белок или полипептид может кодироваться геномной ДНК, кДНК, мРНК или другой РНК или может иметь синтетическое происхождение в соответствии с любым из ряда хорошо известных химических методов синтеза искусственного пептида и белка, или любая их комбинация. Согласно определенным вариантам осуществления выделенный белок или полипептид, по сути, не содержит белков, или полипептидов, или других загрязняющих веществ, обнаруживаемых в его естественной среде, которые могут помешать его применению (терапевтическому, диагностическому, профилактическому, исследовательскому или иному).

Полипептиды могут включать в себя сигнальную (или лидерную) последовательность на N-конце белка, которая сотрансляционно или посттрансляционно управляет переносом белка. Полипептид также может быть слит внутри рамки или конъюгирован с линкером или другой последовательностью для облегчения синтеза, очистки или идентификации полипептида (например, поли-His) или для усиления связывания полипептида с твердой подложкой. Используемый в настоящем документе термин «белок слияния» или «полипептид слияния» относится к белку, который в одной цепи имеет по меньшей мере два разных домена, при этом домены в природе не встречаются в белке вместе. Полинуклеотид, кодирующий белок слияния, может быть построен с использованием ПЦР, рекомбинантно сконструирован или т.п., или такие белки слияния могут быть синтезированы. Белок слияния дополнительно может содержать другие компоненты, такие как метка, линкер или маркер трансдукции. Домены слияния полипептида могут быть присоединены к полипептиду на N-конце и/или на С-конце и могут включать в себя в качестве неограничивающих примеров происходящие из иммуноглобулина последовательности, такие как последовательности константной области Ig или их части, аффинные метки, такие как метка His (например, гексагистидин или другой полигистидин), FLAG™ или туе или другие пептидные аффинные метки, выявляемые полипептидные фрагменты, такие как зеленый флуоресцентный белок (GFP) или его варианты (например, желтый флуоресцентный белок (YFP), синий флуоресцентный белок (BFP), другие экворины или их производные и т.д.), или другие выявляемые домены слияния полипептида, ферменты или их части, такие как глутатион-в-трансфераза (GST) или другие известные ферментативные домены выявления и/или репортерные домены слияния и т.п., известные квалифицированному специалисту. В настоящем документе обсуждаются дополнительные выявляемые фрагменты.

В качестве пептидов слияния могут быть использованы содержащие цистеин пептиды, которые могут быть соединены с N- и/или С-концом полипептида, такого как антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с настоящим раскрытием, чтобы обеспечить удобную сборку таких полипептидов в сшитые дисульфидом димеры, тримеры, тетрамеры или более высокие мультимеры в соответствии с установленными методиками. Например, полипептиды слияния, содержащие полученные из представителя суперсемейства генов иммуноглобулина последовательности, которые включают в себя цистеиновые остатки, способные образовывать межцепочечные дисульфидные мостики, хорошо известны, также как и другие стратегии для конструирования связанных S-S мультимеров (например, Reiter et al., 1994 Prot. Eng. 7:697; Zhu et al., 1997 Prot. Sci. 6:781; Mabry et al., 2010 Mabs 2:20; Gao et al., 1999 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96:6025; Lim et al., 2010 Biotechnol. Bioeng. 106:27) Также рассматриваются альтернативные подходы для трансплантации пептидных последовательностей, которые способствуют сборке мультимеров в виде доменов слияния, на желаемый полипептид, такой как описываемые в настоящем документе антитела и антигенсвязывающие фрагменты (например, Fan et al., 2008 FASEB J. 22:3795).

Модификации полипептидов можно проводить биосинтетически и/или химически в соответствии с широким спектром хорошо известных методик, и они могут также включать в себя конъюгацию с белками-носителями (например, гемоцианином лимфы улитки (KLH), бычьим сывороточным альбумином (BSA), овальбумином (OVA) или другими молекулами), а также ко валентную или нековалентную иммобилизацию на твердых подложках. Согласно определенным вариантам осуществления предполагается химическая или биосинтетическая конъюгация с носителем для создания конъюгатов, которые являются поливалентными по отношению к описываемым в настоящем документе антителам или их антигенсвязывающим фрагментам.

Также предполагается выявляемое мечение выявляемыми индикаторными фрагментами (иногда называемыми репортерными фрагментами), такими как флуорофоры (например, FITC, TRITC, Texas Red и т.д.). Примеры широкого диапазона выявляемых индикаторов (в том числе колориметрических индикаторов), которые могут быть выбраны для конкретных целей, описаны в Haugland, 2005 The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies- Tenth Ed., Invitrogen Corp./ Molecular Probes™, Eugene, OR; в Mohr, 1999 J. Mater. Chem., 9: 2259-2264; в Suslick et al, 2004 Tetrahedron 60:11133-11138; и в патенте США №6323039 (см. также, например, Fluka Laboratory Products Catalog, 2001 Fluka, Milwaukee, WI; и Sigma Life Sciences Research Catalog, 2000, Sigma, St. Louis, МО). Выявляемым индикатором может быть флуоресцентный индикатор, люминесцентный индикатор, фосфоресцентный индикатор, радиометрический индикатор, краситель, фермент, субстрат фермента, молекула переноса энергии или аффинная метка.

Другие выявляемые индикаторы для применения согласно определенным вариантам осуществления, рассматриваемым в настоящем документе, включают в себя аффинные реагенты, такие как антитела, лектины, иммуноглобулиновые Fc-рецепторные белки (например, белок A Staphylococcus aureus, белок G или другие Fc-рецепторы), авидин, биотин, другие лиганды, рецепторы или контррецепторы или их аналоги или миметики и т.п. Для таких методик аффинности могут быть приготовлены реагенты для иммунометрических измерений, такие как подходящим образом меченые антитела или лектины, в том числе, например, те, которые мечены радионуклидами (например, ⁷⁶Br, ⁷⁸Zr, ¹⁸Fl), флуорофорами, аффинными метками, биотином или последовательностями миметиков биотина, или полученные в виде конъюгатов антитело-фермент (см., например, Weir, D.M., Handbook of Experimental Immunology, 1986, Blackwell Scientific, Boston; Scouten, W.H., 1987 Methods in Enzymology 135:30-65; Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 1988 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; Haugland, Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies- Tenth Ed., 2005 hivitrogen Corp./Molecular Probes™, Eugene, OR; Scopes, R.K., Protein Purification: Principles and Practice, 1987, Springer-Verlag, NY; Hermanson, G.T. et al., Immobilized Affinity Ligand Techniques, 1992, Academic Press, Inc., NY; Luo et al., 1998 J. Biotechnol. 65:225, а также цитируемые в них ссылочные материалы).

Пептидная линкерная/спейсерная последовательность также может быть использована для разделения множества полипептидных компонентов на расстояние, достаточное для обеспечения того, чтобы каждый полипептид складывался в свои вторичные и/или третичные структуры, если желательно. Такая пептидная линкерная последовательность может быть включена в полипептид слияния с использованием стандартных методик, хорошо известных в уровне техники.

Некоторые пептидные спейсерные последовательности могут быть выбраны, например, на основании: (1) их способности принимать гибкую расширенную конформацию; (2) их неспособности принимать вторичную структуру, которая могла бы взаимодействовать с функциональными эпитопами на первом и втором полипептидах; и/или (3) отсутствия гидрофобных или заряженных остатков, которые могли бы реагировать с полипептидными функциональными эпитопами. Согласно определенным вариантам осуществления пептидные спейсерные последовательности содержат, например, остатки Gly, Asn и Ser. Другие почти нейтральные аминокислоты, такие как Thr и Ala, также могут быть включены в спейсерную последовательность. Другие аминокислотные последовательности, которые могут быть успешно использованы в качестве спейсеров, включают в себя последовательности, раскрытые в Maratea et al, Gene 40:39 46 (1985); Murphy et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8258 8262 (1986); патенте США №4935233 и патенте США №4751180. Другие иллюстративные и неограничивающие примеры спейсеров могут включать в себя, например, Glu-Gly-Lys-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Glu-Ser-Lys-Val-Asp (SEQ ID NO: 23) (Chaudhary et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1066-1070 (1990)) и Lys-Glu-Ser-Gly-Ser-Val-Ser-Ser-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Phe-Arg-Ser-Leu-Asp (SEQ ID NO: 24) (Bird et al, Science 242:423-426 (1988)).

Согласно некоторым вариантам спейсерные последовательности не требуются, если первый и второй полипептиды имеют несущественные N-концевые аминокислотные области, которые можно использовать для разделения функциональных доменов и предотвращения стерического взаимодействия. Две кодирующие последовательности могут быть слиты напрямую без какого-либо спейсера или с использованием гибкого полилинкера, состоящего, например, из пентамера Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 25), ели он присутствует в одной итерации или повторяется от 1 до 5 или более раз; см., например, SEQ ID NO: 26. Согласно определенным иллюстративным и неограничивающим вариантам осуществления пептидный спейсер может содержать от 1 до 5 аминокислот, от 5 до 10 аминокислот, от 5 до 25 аминокислот, от 5 до 50 аминокислот, от 10 до 25 аминокислот, от 10 до 50 аминокислот, от 10 до 100 аминокислот или любой промежуточный диапазон аминокислот. Согласно другим иллюстративным вариантам осуществления пептидный спейсер включает в себя приблизительно 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более аминокислот в длину.

Модификация(ии) аминокислотной последовательности в антителах или их антигенсвязывающих фрагментах, описываемых в настоящем документе, также охватывается(охватываются) согласно определенным вариантам осуществления. Модификации включают в себя, например, консервативные и неконсервативные аминокислотные замены. Термин «консервативная замена» относится к аминокислотным заменам, которые существенно не влияют на конкретную характеристику или не изменяют ее (например, активность связывания, такую как активность специфического связывания) в конкретном белке. Как правило, консервативные замены являются такими, при которых заменяемый аминокислотный остаток заменяется аминокислотным остатком, имеющим подобную боковую цепь. Консервативные замены включают в себя замену, происходящую в одной из следующих групп: группа 1: аланин (Ala или А), глицин (Gly или G), серии (Ser или S), треонин (Thr или Т); группа 2: аспрагиновая кислота (Asp или D), глутаминовая кислота (Glu или Z); группа 3: аспарагин (Asn или N), глутамин (Gin или Q); группа 4: аргинин (Arg или R), лизин (Lys или K), гистидин (His или Н); группа 5: изолейцин (Ile или I), лейцин (Leu или L), метионин (Met или М), валин (Val или V); и группа 6: фенилаланин (Phe или F), тирозин (Tyr или Y), триптофан (Trp или W). В качестве дополнения или альтернативы, аминокислоты могут быть сгруппированы в группы консервативной замени по подобной функции, химической структуре или композиции (например, кислотные, основные, алифатические, ароматические или содержащие серу). Например, алифатическая группировка может включать в себя для целей замены Gly, Ala, Val, Leu и Ile. Другие группы консервативных замен включают в себя содержащие серу: Met и цистеин (Cys или С); кислотные: Asp, Glu, Asn и Gin; малые алифатические, неполярные или слегка полярные остатки: Ala, Ser, Thr, Pro и Gly; полярные, отрицательно заряженные остатки и их амиды: Asp, Asn, Glu и Gin; полярные, положительно заряженные остатки: His, Arg и Lys; большие алифатические, неполярные остатки: Met, Leu, Ile, Val и Cys; и большие ароматические остатки: Phe, Tyr и Trp. Дополнительную информацию можно найти в Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company.

Например, может быть желательным улучшение связывающей аффинности и/или других биологических свойств антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Варианты аминокислотных последовательностей могут быть получены, например, путем введения подходящих нуклеотидных изменений в полинуклеотиде, который кодирует пептидный синтез. Такие модификации включают в себя, например, делеции, и/или вставки, и/или замены остатков в аминокислотной последовательности антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Может быть выполнена любая комбинация делеции, вставки и замены для получения конечного варианта антитела или антигенсвязывающего фрагмента, при условии, что конечная конструкция обладает желаемыми характеристиками (например, сохраняет специфическое связывание с биантеннарным антигеном Льюиса, описываемым в настоящем документе, при этом не связывается выявляемым образом или демонстрирует статистически значимое снижение связывания с моноантеннарным антигеном Le^X, Le^A или Н, как описывается в другом месте в настоящем документе). Аминокислотные изменения также могут изменять посттрансляционные процессы антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, такие как изменение количества или положения сайтов гликозилирования.

Определение трехмерных структур типичных антител или их антигенсвязывающих фрагментов может быть выполнено с помощью стандартных методов, так что замену, добавление, делецию или вставку одной или нескольких аминокислот с помощью выбранных природных или неприродных аминокислот можно виртуально моделировать для целей определения, сохраняет ли полученный таким образом структурный вариант свойства заполнения пространства раскрываемых в настоящем документе соединений. См., например, Donate et al., 1994 Prot. Sci. 3:2378; Bradley et al., Science 309: 1868-1871 (2005); Schueler-Furman et al., Science 310:638 (2005); Dietz et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:1244 (2006); Dodson et al., Nature 450:176 (2007); Qian et al., Nature 450:259 (2007); Raman et al. Science 327:1014-1018 (2010); Marcos et al., 2017 Science 355:201, и цитируемые в них ссылочные материалы. Некоторые дополнительные неограничивающие примеры компьютерных алгоритмов, которые могут использоваться для этих и связанных с ними вариантов осуществления, например, для рационального конструирования антител и антигенсвязывающих фрагментов, представленных в настоящем документе, включают в себя VMD, которая представляет собой программу молекулярной визуализации для отображения, анимации и анализа больших биомолекулярных систем с использованием 3-D графики и встроенных скриптов (см. веб-сайт Группы теоретической и вычислительной биофизики Иллинойского университета в Урбане-Шампани, по адресу ks.uiuc.edu/Research/vmd/).

Многие другие компьютерные программы известны в уровне техники, доступны квалифицированному специалисту и позволяют определять атомные размеры из моделей заполнения пространства (радиусы Ван-дер-Ваальса) конформаций с минимальной энергией; GRID, которая предназначена для определения областей с высокой аффинностью к различным химическим группам, что тем самым усиливает связывание, поиски методом Монте-Карло, которые вычисляют математическое выравнивание, и CHARMM (Brooks et al. (1983) J. Comput. Chem. 4:187-217) и AMBER (Weiner et al (1981) J. Comput. Chem. 106: 765), которая оценивает расчеты и анализ силового поля (см. также Eisenfield et al. (1991) Am. J. Physiol. 261:C376-386; Lybrand (1991) J. Pharm. Belg. 46:49-54; Froimowitz (1990) Biotechniques 8:640-644; Burbam et al. (1990) Proteins 7:99-111; Pedersen (1985) Environ. Health Perspect. 61:185-190; и Kini et al. (1991) J. Biomol. Struct. Dyn. 9:475-488). Также коммерчески доступен ряд подходящих вычислительных компьютерных программ, например, от компании Schrodinger (Munich, Germany).

Антитела

Определенные предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые специфически связываются

и при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не связывается специфически с моноантеннарным антигеном Le^X, который включает в себя Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc [IX], или с биантеннарным антигеном Le^X, который включает в себя [Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X], или с моноантеннарным антигеном Le^A, который включает в себя Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc [XI], или с моноантеннарным антигеном Н типа 2, который включает в себя Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc [XII], или с биантеннарным антигеном Н типа 2, который включает в себя (Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII], или с моноантеннарным антигеном Н типа 1, который включает в себя Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc [XIV], и которые согласно определенным особенно предпочтительным вариантам осуществления специфически не связываются с определенными другими биантеннарными или моноантеннарными антигенами Льюиса, описываемыми в настоящем документе.

Используемый в настоящем документе термин «антитело» (Ab) включает в себя моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические или триспецифические антитела), гуманизированные антитела, химерные антитела, гетероконъюгатные антитела и фрагменты антител, при условии, что они демонстрируют желаемую биологическую активность, например, сохраняют способность специфически связываться с раскрываемыми в настоящем документе биантеннарными антигенами Льюиса. Термин «иммуноглобулин» (Ig) используют в настоящем документе взаимозаменяемо с термином «антитело».

Базовая единица антитела представляет собой гетеротетрамерный гликопротеин, состоящий из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая L-цепь связана с Н-цепью по меньшей мере одной (и обычно одной) ковалентной дисульфидной связью, в то время как две Н-цепи связаны друг с другом одной или несколькими дисульфидными связями в зависимости от изотипа Н-цепи. Каждая Н- и L-цепь также имеет регулярно расположенные внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая Н-цепь имеет на N-конце вариабельный домен (V_H), за которым следуют три константных домена (C_H) для каждой из α- и γ-цепей и четыре домена С_Н для μ и ε изотипов. Каждая L-цепь имеет на N-конце вариабельный домен (V_L), за которым следует константный домен (C_L) на другом конце. V_L выровнен с V_H, a C_L выровнен с первым константным доменом тяжелой цепи (C_H1). Считают, что определенные аминокислотные остатки образуют границу между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи. Спаривание V_H и V_L вместе образует единый антигенсвязывающий сайт.

L-цепь любого вида позвоночных может быть отнесена к одному из двух четко различающихся типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), на основе аминокислотных последовательностей их константных доменов (C_L). В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей (C_H) иммуноглобулины можно отнести к разным классам или изотипам. Существует пять классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, тяжелые цепи которых обозначены альфа (α), дельта (δ), эпсилон (ε), гамма (γ) и мю (μ), соответственно. Классы γ и α далее делятся на подклассы на основе относительно незначительных различий в последовательности и функции C_H, например, у людей экспрессируются следующие подклассы: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Следует учитывать, что у млекопитающих кодирование нескольких изотипов Ig может подвергаться переключению класса изотипа.

Антитело IgM состоит из пяти основных гетеротетрамерных единиц вместе с дополнительным полипептидом, называемым J-цепью, и, следовательно, содержит десять антигенсвязывающих сайтов, в то время как секретируемые антитела IgA могут полимеризоваться с образованием поливалентных комплексов, включающих в себя от двух до пяти основных четырехцепочечных единиц вдоль J-цепи. В случае IgG общая четырехцепочечная единица имеет молекулярную массу приблизительно 150000 дальтон. Структуру и свойства различных классов антител см., например, в Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, страница 71 и глава 6.

Вариабельный (V) домен опосредует связывание антигена и определяет специфичность конкретного антитела в отношении его конкретного антигена. Последовательность гена, кодирующая домен V_H, имеет несколько копий вариабельного (V), диверсифицированного (D) и соединяющего (J) сегментов. Последовательность гена, кодирующая домен V_L, содержит несколько копий сегментов V и J. Области V_H и V_L подвергаются генной перегруппировке (т.е. соматической рекомбинации) для развития различной антигенной специфичности в антителах. Термин «вариабельный» относится к тому факту, что определенные сегменты V-доменов сильно различаются по последовательности среди антител.

Однако вариабельность неравномерно распределяется по 110-аминокислотному участку вариабельных доменов. Вместе с тем V-области состоят из относительно инвариантных отрезков, называемых каркасными областями (FR), состоящими из 15-30 аминокислот, разделенных короткими областями с крайней вариабельностью, называемыми «гипервариабельными областями». Эти гипервариабельные области являются результатом соматической гипермутации в процессе созревания аффинности, и обычно каждая из них имеет в длину 9-18 аминокислот. Однако было обнаружено, что их длина составляет от 4 до 28 аминокислот в зависимости от конкретного эпитопа. Например, описаны области CDR3 длиной по меньшей мере до 22 или 23 аминокислот. См., например, Morea V, et al., J Mol Biol. 275(2):269-94 (1998) и Kabat, Е.А., et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242 (1991). Аминокислотные положения антител (например, последовательности CDR) можно определить в соответствии с известными схемами нумерации, такими как схемы нумерации Kabat, Chothia, IMGT и/или EU.

Каждый из вариабельных доменов нативных тяжелых и легких цепей содержит четыре каркасных области (FR), в основном имеющих конфигурацию β-листа, соединенных тремя гипервариабельными областями (также известными как определяющие комплементарность области (CDR) и определенными ниже), которые образуют петли, соединяющие, а в некоторых случаях составляющие часть структуры β-листа. Гипервариабельные области в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости с помощью FR и в некоторых случаях с гипервариабельными областями из другой цепи способствуют образованию антигенсвязывающего сайта антител (см. Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Константные домены не участвуют напрямую в связывании антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в зависимой от антитела клеточной цитотоксичности (ADCC) или другие механизмы, которые могут включать в себя взаимодействие домена константной области с Fc-рецепторами (FcR) клеточной поверхности.

Используемый в настоящем документе термин «гипервариабельная область» относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. Гипервариабельная область, как правило, включает в себя аминокислотные остатки из «определяющей комплементарность области» или «CDR» (например, как может быть определено согласно нумерации по Kabat, приблизительно остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в V_L, а также приблизительно 28-36 (H1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в V_H; см. Kabat et at, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); и/или согласно методам, известным в уровне техники для идентификации CDR, как определено Kabat, таким как описанные в Martin, "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains", In Antibody Engineering. R. Kontermann and S. Dubel, 2001, Springer-Verlag, Berlin, Germany, страницы 422-438), и/или такие остатки из «гипервариабельной петли» (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в VL, а также 26-32 (H1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в V_H; Chothia and Lesk, J. Mot Biol. 796:901-917 (1987)).

Термин «выделенное антитело» представляет собой антитело, которое было отделено и/или выделено из компонента его естественной среды. Загрязняющие компоненты его естественной среды представляют собой материалы, которые могут препятствовать диагностическим или терапевтическим применениям антитела и могут включать в себя ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. Согласно предпочтительным вариантам осуществления антитело очищают (1) до более чем 95% по массе антитела, как определено методом Брэдфорда, и наиболее предпочтительно до более чем 99% по массе; (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с использованием секвенатора с вращающейся чашкой; или (3) до гомогенности с помощью SDS-PAGE в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием окрашивания Кумасси синим или серебром. Выделенное антитело включает в себя антитело in situ в рекомбинантных клетках, поскольку по меньшей мере один компонент естественной среды антитела не будет присутствовать. Однако обычно выделенное антитело получают по меньшей мере с помощью одной стадии очистки.

Термин «интактное» антитело представляет собой антитело, которое включает в себя антигенсвязывающий сайт, а также C_L и по меньшей мере константные домены тяжелой цепи C_H1, C_H2 и C_H3. Константные домены могут быть константными доменами нативной последовательности (например, константными доменами нативной последовательности человека) или их вариантами аминокислотной последовательности. Предпочтительно интактное антитело выполняет одну или несколько эффекторных функций.

Термин «фрагмент антитела» представляет собой полипептид, включающий в себя или состоящий из части интактного антитела, предпочтительно антигенсвязывающей или вариабельной области интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают в себя фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; диатела; линейные антитела (см. патент США №5641870; Zapata et al., Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 [1995]); молекулы одноцепочечных антител и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

Расщепление антител папаином дает два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых «Fab»-фрагментами, и остаточный «Fc»-фрагмент, обозначение, отражающее способность легко кристаллизоваться. Fab-фрагмент состоит из полной L-цепи вместе с доменом вариабельной области Н-цепи (V_H) и первым константным доменом одной тяжелой цепи (C_H1). Каждый Fab-фрагмент является одновалентным по отношению к связыванию антигена, т.е. он имеет единственный антигенсвязывающий сайт. Обработка антитела пепсином дает один большой F(ab')2-фрагмент, который примерно соответствует двум дисульфидно связанным Fab-фрагментам, обладающим двухвалентной антигенсвязывающей активностью и все еще способным к перекрестному связыванию антигена. Как Fab, так и F(ab')2 являются примерами «антигенсвязывающих фрагментов». Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов наличием нескольких дополнительных остатков на карбокси-конце домена C_H1, включающих в себя один или несколько цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH является обозначением в настоящем документе для Fab', в котором остаток(остатки) цистеина константных доменов несет(несут) свободную тиольную группу. Р(ab')2-фрагменты антитела первоначально были продуцированы в виде пар Fab'-фрагментов, которые имеют шарнирные цистеины между собой. Также известны другие химические соединения фрагментов антител.

Термин «Fc»-фрагмент включает в себя карбокси-концевые части (т.е. домены C_H2 и C_H3 IgG) обеих Н-цепей, удерживаемых вместе дисульфидами. Эффекторные функции антител определяются последовательностями в Fc-области. Fc-домен является частью антитела, распознаваемой клеточными рецепторами, такими как FcR, и с которыми связывается комплемент-активирующий белок C1q. Как обсуждается в настоящем документе, модификации (например, аминокислотные замены) могут быть выполнены в Fc-домене для модификации (например, улучшения, снижения или удаления) одной или нескольких функциональностей Fc-содержащего полипептида (например, антитела в соответствии с настоящим раскрытием).

Термин «Fv» представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный антигенраспознающий и антигенсвязывающий сайт. Этот фрагмент состоит из димера одного вариабельного домена тяжелой и одного легкой цепи в тесной нековалентной связи. В результате сворачивания этих двух доменов образуются шесть гипервариабельных петель (по три петли от Н- и L-цепей), которые обеспечивают аминокислотные остатки для связывания антигена и придают антителу специфичность связывания антигена. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфических в отношении антигена) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя обычно с более низкой аффинностью, чем весь сайт связывания.

Термин «одноцепочечный Fv», также сокращенно обозначаемый «sFv» или «scFv», представляет собой фрагменты антител, которые содержат домены антитела V_H и V_L, соединенные в единую полипептидную цепь. Предпочтительно, полипептид sFv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами V_H и V_L, который позволяет sFv формировать желаемую структуру для связывания антигена. Для обзора sFv см. Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, infra.

Термин «диатела» относится к малым фрагментам антител, полученным путем конструирования sFv-фрагментов (см. предыдущий абзац) с короткими линкерами (приблизительно 5-10 остатков) между доменами V_H и V_L, так что достигается межцепочечное, но не внутрицепочечное спаривание доменов V, что дает двухвалентный фрагмент, т.е. фрагмент, имеющий два антигенсвязывающих сайта. Биспецифические диатела представляют собой гетеродимеры двух «кроссоверных» sFv-фрагментов, в которых домены V_H и V_L двух антител присутствуют на разных полипептидных цепях. Диатела описаны более полно, например, в ЕР 404097; WO 93/11161 и Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993). Другие фрагменты антител и молекулы, содержащие их, включают в себя, например, линейные антитела, тандемный scFv, scFv-Fc, тандемный scFv-Fc, димер scFv, scFv-«застежка», диатело-Fc, диатело-C_H3, sc-диатела, sc-диатело-Fc, sc-диатело-С_Н3, нанотела, TandAb, минитела, миниантитела, триатела, тетратела, scFab, Fab-scFv, Fab-scFv-Fc, scFv-Ch-Cl-scFv и F(ab')2-scFv2, все из которых также рассматриваются в настоящем документе.

Согласно определенным вариантам осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с настоящим раскрытием представляет собой мультиспецифическое антитело, такое как биспецифическое или триспецифическое антитело. Форматы биспецифических антител раскрываются, например, в Spiess et al., Mol. Immunol. 67(2):95 (2015), и в Brinkmann and Kontermann, mAbs 9(2): 182-212 (2017), при этом биспецифические форматы и способы их получения включены в настоящий документ посредством ссылки и включают в себя, например, биспецифические рекрутеры Т-клеток (BiTE), DART, сборки «выступы-во-впадины» (KIH), сборки scFv-C_H3-KIH, антитела с общей легкой цепью KIH, TandAb, тройные тела, минитела TriBi, Fab-scFv, scFv-Ch-Cl-scFv, F(ab')2-scFv2, четырехвалентные HCab, интратела, CrossMab, Fab двойного действия (DAF) (два-в-одном или четыре-в-одном), DutaMab, DT-IgG, зарядные пары, с обменом Fab-фрагментами, SEEDbodies, Triomabs, сборки LUZ-Y, Fcab, κλ-тела, ортогональные Fab, DVD-IgGs, IgG(H)-scFv, scFv-(H)IgG, IgG(L)-scFv, scFv-(L)IgG, IgG(L,H)-Fv, IgG(H)-V, V(H)-IgG, IgG(L)-V, V(L)-IgG, KIH IgG-scFab, 2scFv-IgG, IgG-2scFv, scFv4-Ig, Zybody и DVI-IgG (четыре в одном).

Используемый в настоящем документе термин «поликлональные антитело» относится к антителу, полученному из популяции антигенспецифических антител, которые распознают более чем один эпитоп специфического антигена. Термин «антиген» или «иммуноген» относится к пептиду, липиду, полисахариду или полинуклеотиду, которые распознаются адаптивной иммунной системой. Антигены могут быть собственными или чужеродными молекулами. Примеры антигенов включают в себя без ограничения компоненты бактериальной клеточной стенки, пыльцу и резус-фактор. Область антигена, которая специфически распознается специфическим антителом представляет собой «эпитоп» или «антигенную детерминанту». Один антиген может иметь несколько эпитопов.

Используемый в настоящем документе термин «моноклональное антитело» (mAb) относится к антителу, полученному из популяции, по сути, гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела высокоспецифичны, они направлены против одного антигенного сайта. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые включают в себя разные антитела, направленные против разных эпитопов, каждое моноклональное антитело направлено против одного эпитопа антигена. Помимо своей специфичности, моноклональные антитела обладают преимуществом в том, что они могут быть синтезированы без загрязнения другими антителами. Модификатор «моноклональный» не следует рассматривать как требующий получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, применимые в настоящем изобретении, могут быть получены гибридомной методикой, впервые описанной Kohler et al, Nature, 256:495 (1975), или могут быть получены с использованием методов рекомбинантной ДНК в бактериальных, эукариотических животных или растительных клетках (см., например, патент США №4816567). «Моноклональные антитела» также могут быть выделены из фаговых библиотек антител с использованием методов, описанных в Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991), и Marks et al.,J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), например.

Моноклональные антитела в настоящем документе включают в себя «химерные антитела», в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, происходящих от определенного вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, в то время как оставшаяся часть цепь(цепей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, происходящих от другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагментам таких антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность (см. патенты США №№4816567; 5530101 и 7498415; и Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6851-6855 (1984)). Например, химерные антитела могут включать в себя человеческие и отличные от человеческих остатки. Кроме того, химерные антитела могут включать в себя остатки, которых нет в антителе-реципиенте или в антителе-доноре. Эти модификации выполнены для дальнейшего улучшения характеристик антител. Дополнительные подробности см. в Jones et al, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Химерные антитела также включают в себя приматизированные и гуманизированные антитела.

«Гуманизированное антитело» обычно считают человеческим антителом, которое имеет один или несколько аминокислотных остатков, введенных в него из источника, отличного от человека. Эти отличные от человеческих аминокислотные остатки обычно берут из вариабельного домена. Гуманизацию традиционно проводят по способу Винтера и соавторов (Jones et al, Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al, Science, 239:1534-1536 (1988)), путем замены отличных от человеческих вариабельных последовательностей на соответствующие последовательности человеческого антитела. Соответственно, такие «гуманизированные» антитела являются химерными антителами (патенты США №№4816567, 5530101 и 7498415), в которых существенно меньше, чем интактный вариабельный домен человека, заменено соответствующей последовательностью из отличного от человека вида. В некоторых случаях «гуманизированное» антитело представляет собой антитело, которое продуцируется отличной от человеческой клеткой или отличным от человека животным и включает в себя человеческие последовательности, например, домены H_C.

Термин «человеческое антитело» представляет собой антитело, содержащее последовательности, присутствующие только в антителе, естественным образом продуцируемом человеком. Однако используемые в настоящем документе человеческие антитела могут включать в себя остатки или модификации, не встречающиеся в природных антителах человека, в том числе те модификации и вариантные последовательности, которые описаны в настоящем документе. Обычно их получают для дальнейшей оптимизации или усиления характеристик антител. В некоторых случаях человеческие антитела продуцируются трансгенными животными. Например, см. патенты США №№5770429, 6596541 и 7049426.

«Эффекторные функции» антитела относятся к тем биологическим активностям, которые приписываются Fc-области (Fc-области с нативной последовательностью или Fc-области с вариантами аминокислотной последовательности) антитела, и варьируют в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают в себя связывание C1q и комплементзависимую цитотоксичность, связывание с Fc-рецептором, зависимую от антитела опосредованную клеткой цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз, подавление рецепторов клеточной поверхности (например, рецептора В-клеток) и активацию В-клеток. Аминокислотные модификации (например, замены) для модификации (например, улучшения, снижения или устранения) функциональностей Fc включают в себя, например, мутации T250Q/M428L, M252Y/S254T/T256E, H433K/N434F, M428L/N434S, E233P/L234V/L235A/G236 + A327G/A330S/P331S, Е333А, S239D/A330L/I332E, P257I/Q311, K326W/E333S, S239D/I332E/G236A, N297Q, K322A, S228P, L235E + Е318А/K320A/K322A, L234A/L235A и L234A/L235A/P329G, которые кратко описаны и аннотированы в работе «Engineered Fc Regions», опубликованной InvivoGen (2011) и доступном в Интернете на сайте www.invivogen.com/PDF/review/review-Engineered-Fc-Regions-invivogen.pdf?utm_source=review&utm_medium=pdf&utm_campaign=review & utm content=Engineered-Fc-Regions, которая включена в настоящий документ посредством ссылки.

Фраза «функциональный фрагмент или аналог» антитела или его антигенсвязывающего фрагмента означает соединение, обладающее качественной биологической активностью, общей с полноразмерным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющий «биологическую характеристику» указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, представляет собой антитело, которое обладает одной или несколькими биологическими характеристиками этого антигенсвязывающего фрагмента этого антитела, которые отличают его от других антител или антигенсвязывающих фрагментов, полученных из антител. Например, согласно некоторым вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент с биологической характеристикой указанного антитела будет связываться с тем же эпитопом, что и эпитоп, связанный с указанным антителом, и/или будет иметь общую эффекторную функцию, что и указанное антитело.

В контексте настоящего описания антитело называют «иммуноспецифическим», «специфическим в отношении» антигена или «специфически связывающим» антиген, если оно реагирует на выявляемом уровне с антигеном, предпочтительно с константой аффинности K_a, большей или равной приблизительно 10⁴ М^-1, или большей или равной приблизительно 10⁵ М^-1, большей или равной приблизительно 10⁶ М^-1, большей или равной приблизительно 10⁷ М^-1, или большей или равной приблизительно 10⁸ М^-1. Аффинность антитела к его когнатному антигену также обычно выражается как константа диссоциации K_D, и согласно некоторым вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с антигеном Льюиса в соответствии с настоящим раскрытием, если оно связывается с K_D, меньшей или равной 10^-4 М, меньшей или равной приблизительно 10^-5 М, меньшей или равной приблизительно 10^-6 М, меньшей или равной 10^-7 М или меньшей или равной 10^-8 М. Аффинности антител и антигенсвязывающих фрагментов можно легко определить с помощью обычных методик, например, описанных в Scatchard et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci. USA 51:660 (1949)), или с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (например, Hearty et al., 2012 Meths. Mol. Biol. 907:411), с помощью изотермической титрационной калориметрии (ITC) (например, Dam et al., 2008 J. Biol. Chem. 283: 31366), с помощью иммуноферментного анализа (ELISA) (например, Bobrovnik, 2003 J. Biochem. Biophys. Meths. 75 (3): 213) или другими методами, известными специалистам в данной области.

Свойства связывания антитела с антигенами, клетками или их тканями, как правило, могут быть определены и оценены с использованием способов иммунодетекции, включающих в себя, например, иммунофлуоресцентные анализы, такие как иммуногистохимия (IHC) и/или сортировка клеток с активацией флуоресценции (FACS). Другие способы определения связывания антитела с антигеном включают в себя, например, методики твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), изотермической титрационной калориметрии (ITC) и поверхностного плазмонного резонанса (SPR).

Используемый в настоящем документе термин «носители» включает в себя фармацевтически приемлемые носители, вспомогательные средства или стабилизаторы, которые нетоксичны для клетки или млекопитающего, подвергающихся воздействию, в используемых дозировках и концентрациях. Часто физиологически приемлемый носитель представляет собой водный рН буферный раствор. Примеры физиологически приемлемых носителей включают в себя буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включающие в себя аскорбиновую кислоту; полипептид с низкой молекулярной массой (менее приблизительно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включающие в себя глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства, такие как EDTA; сахарные спирты, такие как маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионогенные поверхностно-активные средства, такие как полисорбат 20 (TWEEN™), полиэтиленгликоль (PEG) и полоксамеры (PLURONICS™) и т.п.

Полинуклеотиды. векторы и клетки-хозяева

Согласно следующим аспектам настоящее раскрытие согласно определенным вариантам осуществления относится к выделенным полинуклеотидам, которые кодируют антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, описываемые в настоящем документе, а также представляет векторы, включающие их в себя. Нуклеиновые кислоты, включающие в себя полинуклеотиды, могут включать в себя ДНК или РНК и могут быть полностью или частично синтетическими.

Используемый в настоящем документе термин «полинуклеотид» означает однонитевый или двухнитевый полимер нуклеиновой кислоты и, в частности, включает в себя однонитевые и двухнитевые формы ДНК. Полинуклеотиды могут быть получены, например, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или трансляции in vitro, а фрагменты могут быть получены с помощью любого из лигирования, расщепления, действия эндонуклеазы или действия экзонуклеазы. Согласно определенным вариантам осуществления полинуклеотиды в соответствии с настоящим раскрытием получают с помощью ПЦР. Полинуклеотиды могут состоять из мономеров, которые являются встречающимися в природе нуклеотидами (такими как дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды), аналогами встречающихся в природе нуклеотидов (например, α-энантиомерными формами встречающихся в природе нуклеотидов) или их комбинацией. Согласно следующим вариантам осуществления нуклеотиды, содержащие полинуклеотид, могут быть рибонуклеотидами, или дезоксирибонуклеотидами, или модифицированной формой любого типа нуклеотида.

Термин «встречающиеся в природе нуклеотиды» включает в себя дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды. Термин «модифицированные нуклеотиды» включает в себя нуклеотиды с модифицированными или замещенными сахарными группами и т.п.(например, модифицированные бромуридином, арабинозидом или 2'3'-дидезоксирибозой). Термин «олигонуклеотидные связи» включает в себя олигонуклеотидные связи, такие как фосфоротиоатные, фосфородитиоатные, фосфороселеноатные, фосфородиселеноатные, фосфороанилотиоатные, фосфораниладатные, фосфороамидатные и т.п. См., например, LaPlanche et al, 1986, Nucl. Acids Res., 74:9081; Stec et al, 1984, J. Am. Chem. Soc, 106:6011; Stein et al, 1988, Mid. Acids Res., 16:3209; Zon et al, 1991, Anti-Cancer Drug Design, 6:539; Zon et al, 1991, OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH, pp.87-108 (F. Eckstein, Ed.), Oxford University Press, Oxford England; Stec et al., патент США №5151510, Uhlmann and Peyman, 1990, Chemical Reviews, 90:543, раскрытия которых тем самым включены в настоящий документ посредством ссылки для любой цели. Олигонуклеотид может включать в себя выявляемую метку, позволяющую выявление о л иго нуклеотида или его гибридизации.

Используемый в настоящем документе термин «выделенный полинуклеотид» должен означать полинуклеотид геномного, кДНК или синтетического происхождения или некоторую их комбинацию, при этом в силу своего происхождения выделенный полинуклеотид (1) не связан со всем или частью полинуклеотида, с которым выделенный полинуклеотид встречается в природе, (2) связан с полинуклеотидом, с которым он не связан в природе, или (3) не встречается в природе как часть большей последовательности.

Упоминание нуклеотидной последовательности, как изложено в настоящем документе, охватывает молекулу ДНК с указанной последовательностью и охватывает молекулу РНК с указанной последовательностью, в которой U заменен на Т, если контекст не требует иного.

Термин «функционально связанный» означает, что компоненты, к которым применяется этот термин, находятся во взаимосвязи, которая позволяет им выполнять присущие им функции в подходящих условиях. Например, последовательность контроля транскрипции, «функционально связанная» с кодирующей белок последовательностью, лигируется с ней, так что экспрессия кодирующей белок последовательности достигается в условиях, совместимых с транскрипционной активностью контрольных последовательностей.

Используемый в настоящем документе термин «последовательность контроля» относится к полинуклеотидным последовательностям, которые могут влиять на экспрессию, обработку или внутриклеточную локализацию кодирующих последовательностей, с которыми они лигированы или функционально связаны. Природа таких последовательностей контроля может зависеть от организма-хозяина. Согласно конкретным вариантам осуществления последовательности контроля транскрипции для прокариот могут включать в себя промотор, сайт связывания с рибосомой и последовательность терминации транскрипции. Согласно другим конкретным вариантам осуществления последовательности контроля транскрипции для эукариот могут включать в себя промоторы, содержащие один или несколько сайтов распознавания для факторов транскрипции, последовательности энхансеров транскрипции, последовательности терминации транскрипции и последовательности полиаденилирования. Согласно определенным вариантам осуществления «последовательности контроля» могут включать в себя лидерные последовательности и/или последовательности партнеров слияния. Последовательности контроля экспрессии могут включать в себя соответствующие последовательности инициации, терминации транскрипции, промоторные и энхансерные последовательности; эффективные сигналы обработки РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, стабилизирующие цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (т.е. консенсусные последовательности Козака); последовательности, повышающие стабильность белка, и, возможно, последовательности, которые усиливают секрецию белка. Последовательности контроля экспрессии могут быть функционально связаны, если они являются смежными, с представляющим интерес геном и последовательностями контроля экспрессии, которые действуют транс или на расстоянии, чтобы контролировать представляющий интерес ген.

Экспрессия включает в себя без ограничения такие процессы, как транскрипция, трансляция и сплайсинг РНК, если присутствуют интроны.

Как будет понятно специалистам в данной области, полинуклеотиды могут включать в себя геномные последовательности, внегеномные и кодируемые плазмидой последовательности и меньшие сконструированные генные сегменты, которые экспрессируют или могут быть адаптированы для экспрессии белков, полипептидов, пептидов и т.п. Такие сегменты могут быть выделены естественным путем или модифицированы синтетически квалифицированным специалистом.

Как также будет понятно специалисту в данной области, полинуклеотиды могут быть однонитевыми (кодирующими или антисмыеловыми) или двухнитевыми и могут представлять собой молекулы ДНК (геномной, кДНК или синтетической) или РНК. Молекулы РНК могут включать в себя молекулы HnRNA, которые содержат интроны и соответствуют молекуле ДНК взаимно однозначно, и молекулы мРНК, которые не содержат интронов. Дополнительные кодирующие или некодирующие последовательности могут, но не обязательно, присутствовать в полинуклеотиде в соответствии с настоящим раскрытием, и полинуклеотид может, но не обязательно, быть связан с другими молекулами и/или материалами подложки. Полинуклеотиды могут включать в себя нативную последовательность или могут включать в себя последовательность, которая кодирует вариант или производное такой последовательности.

Следовательно, согласно этим и связанным с ними вариантам осуществления настоящее раскрытие также относится к полинуклеотидам, кодирующим антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описываемые в настоящем документе.

Согласно другим связанным с ними вариантам осуществления полинуклеотидные варианты могут характеризоваться существенной идентичностью с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описываемые в настоящем документе. Например, полинуклеотид может представлять собой полинуклеотид, характеризующийся по меньшей мере 70% идентичностью последовательностей, предпочтительно по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или выше идентичностью последовательностей по сравнению с эталонной полинуклеотидной последовательностью, такой как последовательность, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описываемые в настоящем документе, с использованием описываемых в настоящем документе способов (например, анализа BLAST с использованием стандартных параметров, как описано ниже). Специалисту в данной области будет понятно, что эти значения могут быть надлежащим образом скорректированы для определения соответствующей идентичности белков, кодируемых двумя нуклеотидными последовательностями, с учетом вырожденности кодонов, сходства аминокислот, положения рамки считывания и т.п.

Как правило, варианты полинуклеотидов будут содержать одно или несколько из замен, добавлений, делеций и/или вставок, предпочтительно так, чтобы аффинность связывания антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, кодируемого вариантным полинуклеотидом, существенно не снижалась по сравнению с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, кодируемым полинуклеотидной последовательностью, конкретно изложенной в настоящем документе (например, по сравнению с антителом, называемым в настоящем документе hBBC.10.1, которое включает в себя тяжелую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 10, и легкую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 11).

Согласно некоторым другим связанным с ними вариантам осуществления полинуклеотидные фрагменты могут включать в себя или состоять, по сути, из смежных отрезков последовательности разной длины, идентичных или комплементарных последовательности, кодирующей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описываемые в настоящем документе. Например, представлены полинуклеотиды, которые включают в себя или состоят, по сути, из по меньшей мере приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 300, 400, 500 или 1000 или более смежных нуклеотидов последовательностей, которые кодируют антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, или их вариант, раскрываемые в настоящем документе, а также всех промежуточных длин между ними. Следует понимать, что термин «промежуточные длины» в данном контексте означает любую длину между приведенными значениями, например, 50, 51, 52, 53 и т.д.; 100, 101, 102, 103 и т.д.; 150, 151, 152, 153 и т.д.; включая все целые числа от 200 до 500; от 500 до 1000 и т.п. Описываемая в настоящем документе полинуклеотидная последовательность может быть удлинена на одном или обоих концах дополнительными нуклеотидами, не встречающимися в нативной последовательности. Эта дополнительная последовательность может состоять из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов на любом конце полинуклеотид а, кодирующего антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описываемые в настоящем документе, или на обоих концах полинуклеотида, кодирующего антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описываемые в настоящем документе.

Согласно другому варианту осуществления представлены полинуклеотиды, которые способны гибридизироваться в условиях средней и высокой жесткости с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, или его вариант, представленные в настоящем документе, или их фрагмент, или комплементарная им последовательность. Методики гибридизации хорошо известны в области молекулярной биологии. В целях иллюстрации подходящие умеренно жесткие условия для тестирования гибридизации полинуклеотида, представленного в настоящем документе, с другими полинуклеотидами, включают в себя предварительную промывку в растворе 5 × SSC, 0,5% SDS, 1,0 мМ EDTA (рН 8,0); гибридизацию при 50°С - 60°С, 5 × SSC, в течение ночи; с последующей двукратной промывкой при 65°С в течение 20 минут каждым из 2 ×, 0,5 × и 0,2 × SSC, содержащим 0,1% SDS. Специалисту в данной области будет понятно, что жесткостью гибридизации можно легко управлять, например, путем изменения содержания соли в растворе для гибридизации и/или температуры, при которой выполняется гибридизация. Например, согласно другому варианту осуществления подходящие очень жесткие условия гибридизации включают в себя те, которые описаны выше, за исключением того, что температура гибридизации повышается, например, до 60°С - 65°С или 65°С - 70°С.

Согласно определенным вариантам осуществления полинуклеотиды, описанные выше, например, полинуклеотидные варианты, фрагменты и гибридизирующиеся последовательности, кодируют антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с биантеннарным антигеном Льюиса, описываемым в настоящем документе. Согласно другим вариантам осуществления такие полинуклеотиды кодируют антитела, или их антигенсвязывающие фрагменты, или их варианты, которые связываются с раскрываемым в настоящем документе антигеном Льюиса по меньшей мере на приблизительно 50%, по меньшей мере на приблизительно 70%, а согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере на приблизительно 90%, а также антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, конкретно указанные в настоящем документе (например, антитело hBBC.10.1). Согласно следующим вариантам осуществления такие полинуклеотиды кодируют антитела, или их антигенсвязывающие фрагменты, или их варианты, которые связываются с раскрываемым в настоящем документе антигеном Льюиса с большей аффинностью, чем антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, конкретно указанные в настоящем документе, например, которые связываются количественно по меньшей мере на приблизительно 105%, 106%, 107%, 108%, 109% или 110%, а также антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, конкретно указанные в настоящем документе.

Как описано в другом месте в настоящем документе, определение трехмерных структур раскрываемых в настоящем документе антител или их антигенсвязывающих фрагментов может быть выполнено с помощью рутинных методик, таких как замена, добавление, делеция или вставка одной или нескольких аминокислот с выбранными природными или неприродными аминокислотами, может быть виртуально смоделировано для целей определения, сохраняет ли полученный таким образом структурный вариант свойства заполнения пространства раскрываемых в настоящем документе соединений. Специалисту в данной области известны различные компьютерные программы для определения подходящих аминокислотных замен (или соответствующих полинуклеотидов, кодирующих аминокислотную последовательность) в антителе или его антигенсвязывающем фрагменте, так что, например, сохраняется аффинность или достигается лучшая аффинность. См., например, Donate et al., 1994Prot. Sci. 3:2378; Bradley et al., Science 309: 1868-1871 (2005); Schueler-Furman et al., Science 310:638 (2005); Dietz et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:1244 (2006); Dodson et al., Nature 450:176 (2007); Qian et al., Nature 450:259 (2007); Raman et al Science 327:1014-1018 (2010); Marcos et al., 2017 Science 355:201, и цитируемые в них ссылочные материалы.

Полинуклеотиды, описываемые в настоящем документе, или их фрагменты, независимо от длины самой кодирующей последовательности, могут быть объединены с другими последовательностями ДНК, такими как промоторы, сигналы полиаденилирования, дополнительные сайты рестрикционных ферментов, множественные сайты клонирования, другие кодирующие сегменты и т.п., поэтому их общая длина может значительно варьировать. Таким образом, предполагается, что можно использовать фрагмент нуклеиновой кислоты почти любой длины, при этом общая длина предпочтительно ограничивается простотой получения и применения в предполагаемом протоколе рекомбинантной ДНК. Например, применимыми считаются иллюстративные полинуклеотидные сегменты с общей длиной приблизительно 10000, приблизительно 5000, приблизительно 3000, приблизительно 2000, приблизительно 1000, приблизительно 500, приблизительно 200, приблизительно 100, приблизительно 50 пар оснований и т.п. (включая все промежуточные длины).

При сравнении полинуклеотидных последовательностей две последовательности называют «идентичными», если последовательность нуклеотидов в этих двух последовательностях одинакова при выравнивании для максимального соответствия, как описано ниже. Сравнения двух последовательностей обычно выполняют путем сравнения последовательностей в окне сравнения для идентификации и сравнения локальных областей подобия последовательностей. Используемый в настоящем документе термин «окно сравнения» относится к сегменту по меньшей мере из приблизительно 20 смежных положений, обычно от 30 до приблизительно 75, от 40 до приблизительно 50, в котором последовательность можно сравнивать с эталонной последовательностью из того же количества смежных положений, после того, как две последовательности будут оптимально выровнены.

Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть проведено с использованием программы Megalign в наборе программного обеспечения для биоинформатики DNASTAR® Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, WI) с использованием параметров по умолчанию. Эта программа включает в себя несколько схем выравнивания, описанных в следующих ссылочных материалах: Dayhoff, М.О. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol.5, Suppl. 3, pp.345-358; Hein J., Unified Approach to Alignment and Phylogenes, pp.626-645 (1990); Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., CABIOS 5:151-153 (1989); Myers, E.W. and Muller W., CABIOS 4:11-17 (1988); Robinson, E.D., Comb. Theor 77:105 (1971); Santou, N. Nes, M.,Mol. Biol. Evol. 4:406-425 (1987); Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA (1973); Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., Proc. Natl. Acad, Sci. USA 80:726-730 (1983).

В качестве альтернативы, оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть выполнено с помощью алгоритма локальной идентичности Смита и Уотермана, Add. АРЕ Math 2:482 (1981), с помощью алгоритма сопоставления идентичности Нидлмана и Вунша, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), путем поиска для способа определения подобия Пирсона и Липмана, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), с помощью компьютеризированных реализаций этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA и TFASTA в пакете программного обеспечения Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI) или путем просмотра.

Одним из предпочтительных примеров алгоритмов, которые подходят для определения процента идентичности последовательностей и подобия последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2,0, которые описаны в Altschul et al., Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 (1977), и Altschul et al, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), соответственно. BLAST и BLAST 2,0 можно использовать, например, с параметрами, описываемыми в настоящем документе, для определения процентной идентичности последовательностей между двумя или более полинуклеотидами. Программное обеспечение для выполнения анализов BLAST публично доступно через Национальный центр биотехнологической информации. В одном иллюстративном примере совокупные оценки могут быть рассчитаны с использованием для нуклеотидных последовательностей параметров М (поощрительные баллы за пару совпадающих остатков; всегда > 0) и N (штрафной балл за неправильно спаренные остатки; всегда < 0). Расширение совпадений слов в каждом направлении прекращается, когда совокупный балл выравнивания падает на величину X от своего максимального достигнутого значения; совокупный балл становится равным нулю или ниже из-за накопления одного или нескольких выравниваний остатков с отрицательным баллом, или достигается конец любой последовательности. Параметры алгоритма BLAST W, Т и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) используется по умолчанию длина слова (W), равная 11, ожидание (Е), равное 10, и оценочная матрица (см. Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)) выравниваний BLOSUM62, (В) равное 50, ожидание (Е) равное 10, М = 5, N = -4 и сравнение обеих нитей.

Согласно определенным вариантам осуществления «процент идентичности последовательностей» определяют путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения по меньшей мере из 20 положений, при этом часть полинуклеотидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. гэпы), составляющие 20 процентов или меньше, обычно от 5 до 15 процентов или от 10 до 12 процентов, по сравнению с эталонными последовательностями (которые не содержат добавлений или делеции) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процент рассчитывают путем определения количества положений, в которых идентичные основания нуклеиновой кислоты встречаются в обеих последовательностях, чтобы получить количество совпадающих положений, путем деления количества совпадающих положений на общее количество положений в эталонной последовательности (т.е. размер окна) и умножения результатов на 100 с получением процента идентичности последовательностей.

Специалистам в данной области будет понятно, что в результате вырожденности генетического кода существует множество нуклеотидных последовательностей, которые кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описываемые в настоящем документе. Некоторые такие полинуклеотиды несут минимальную идентичность последовательностей в отношении нуклеотидной последовательности нативной или исходной полинуклеотидной последовательности, которая кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описываемые в настоящем документе. Тем не менее, полинуклеотиды, которые различаются из-за различий в частоте использования кодонов, явно предусматриваются настоящим раскрытием. Согласно определенным вариантам осуществления особенно предусматриваются последовательности, которые были оптимизированы по кодонам для экспрессии у млекопитающих. Оптимизация кодонов может быть выполнена с использованием известных методик и инструментов, например, с помощью инструмента GenScript® OptimiumGene™. Последовательности, оптимизированные по кодонам, включают в себя последовательности, которые частично оптимизированы по кодонам (т.е. по меньшей мере один кодон оптимизирован для экспрессии в клетке-хозяине), и последовательности, которые полностью оптимизированы по кодонам.

Следовательно, согласно другому варианту осуществления подход мутагенеза, такой как сайт-специфический мутагенез, может быть использован для получения вариантов и/или производных антител или их антигенсвязывающих фрагментов, описываемых в настоящем документе. При таком подходе конкретные модификации полипептидной последовательности могут быть выполнены посредством мутагенеза лежащих в основе полинуклеотидов, которые их кодируют. Эти методики обеспечивают простой подход к получению и тестированию вариантов последовательности, например, с учетом одного или нескольких из вышеупомянутых соображений, путем введения одного или нескольких изменений нуклеотидной последовательности в полинуклеотид.

Сайт-специфический мутагенез позволяет получать мутанты за счет использования специфических олигонуклеотидных последовательностей, которые кодируют последовательность ДНК с желаемой мутацией, а также достаточного количества соседних нуклеотидов, чтобы обеспечить последовательность праймера достаточного размера и сложности последовательности для образования стабильного дуплекса с обеих сторон соединения делеции, подлежащего прохождению. Мутации могут использоваться в выбранной полинуклеотидной последовательности для улучшения, изменения, уменьшения, модификации или иного изменения свойств самого полинуклеотида и/или изменения свойств, активности, состава, стабильности или первичной последовательности кодируемого полипептида.

Согласно определенным вариантам осуществления авторы настоящего изобретения рассматривают мутагенез полинуклеотидных последовательностей, которые кодируют антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, раскрываемые в настоящем документе, или их вариант, чтобы изменить одно или несколько свойств кодируемого полипептида, такие как аффинность связывания с антигеном Льюиса в соответствии с настоящим раскрытием. Методики сайт-специфического мутагенеза хорошо известны в уровне техники и широко используются для создания вариантов как полипептидов, так и полинуклеотидов. Например, сайт-специфический мутагенез часто используют для изменения определенной части молекулы ДНК. Согласно таким вариантам осуществления используют праймер, содержащий обычно от приблизительно 14 до приблизительно 25 нуклеотидов или около того в длину, с приблизительно 5 - приблизительно 10 остатками по обе стороны от соединения последовательности, подлежащей изменению.

Специалистам в данной области будет понятно, что в методиках сайт-специфического мутагенеза часто используют фаговый вектор, который существует как в однонитевой, так и в двухнитевой форме. Типичные векторы, применимые в сайт-направленном мутагенезе, включают в себя векторы, такие как фаг М13. Эти фаги свободно доступны на рынке. Двухнитевые плазмиды также обычно используют в сайт-направленном мутагенезе, который исключает стадию переноса представляющего интерес гена от плазмиды к фагу.

В общем, сайт-направленный мутагенез в соответствии с настоящим изобретением выполняют сначала путем получения однонитевого вектора или расплавления двух нитей двухнитевого вектора, который включает в свою последовательность ДНК, кодирующую желаемый пептид. Олигонуклеотидный праймер, несущий желаемую мутантную последовательность, получают, как правило, синтетическим путем. Затем этот праймер отжигают с однонитевым вектором и подвергают ферментам полимеризации ДНК, таким как фрагмент Кленова полимеразы IE. coli, чтобы завершить синтез несущей мутации нити. Таким образом, образуется гетер о дуплекс, в котором одна нить кодирует исходную немутантную последовательность, а вторая нить несет желаемую мутацию. Этот гетеродуплексный вектор затем используют для трансформации соответствующих клеток, таких как клетки Е. coli, и отбирают клоны, которые включают в себя рекомбинантные векторы, несущие конфигурацию мутантной последовательности.

Получение вариантов последовательностей выбранных сегментов ДНК, кодирующих пептид, с использованием сайт-направленного мутагенеза обеспечивает средства получения потенциально полезных соединений и не подразумевает ограничения, поскольку существуют другие пути, которыми могут быть получены варианты последовательностей пептидов и последовательности ДНК, кодирующие их. Например, рекомбинантные векторы, кодирующие желаемую пептидную последовательность, можно обрабатывать мутагенными средствами, такими как гидроксиламин, для получения вариантов последовательности. Конкретные подробности, касающиеся этих способов и протоколов, можно найти в работах Maloy et al, 1994; Segal, 1976; Prokop и Bajpai, 1991; Kuby, 1994; и Maniatis et al, 1982, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки для этой цели.

Используемый в настоящем документе термин «процедура олигонуклеотид-направленного мутагенеза» относится к зависимым от матрицы процессам и опосредованному вектором воспроизводству, которые приводят к увеличению концентрации конкретной молекулы нуклеиновой кислоты по сравнению с ее начальной концентрацией или к увеличению концентрации выявляемого сигнала, таким как амплификация. Используемый в настоящем документе термин «процедура олигонуклеотид-направленного мутагенеза» предназначен для обозначения процесса, который включает в себя зависимое от матрицы удлинение молекулы праймера. Термин «зависимый от матрицы процесс» относится к синтезу нуклеиновой кислоты РНК или молекулы ДНК, в котором последовательность вновь синтезированной нити нуклеиновой кислоты определяется хорошо известными правилами комплементарного спаривания оснований (см., например, Watson, 1987). Обычно методы, опосредованные вектором, включают в себя введение фрагмента нуклеиновой кислоты в вектор ДНК или РНК, клональную амплификацию вектора и извлечение амплифицированного фрагмента нуклеиновой кислоты. Примеры таких методов представлены в патенте США №4237224, который специально включен в настоящий документ посредством ссылки в полном своем объеме.

В другом подходе для получения вариантов полипептида может быть использована рекурсивная рекомбинация последовательностей, как описано в патенте США №5837458. В этом подходе итеративные циклы рекомбинации и скрининга или отбора выполняют для «эволюции» индивидуальных полинуклеотидных вариантов, имеющих, например, повышенную аффинность связывания. Определенные варианты осуществления также обеспечивают конструкции в форме плазмид, векторов, кассет транскрипции или экспрессии, которые содержат по меньшей мере один полинуклеотид, описываемый в настоящем документе.

Термин «вектор» используют для обозначения любой молекулы (например, нуклеиновой кислоты, плазмиды или вируса), используемой для передачи кодирующей информации в клетку-хозяина. Термин «вектор экспрессии» относится к вектору, который подходит для трансформации клетки-хозяина и содержит последовательности нуклеиновых кислот, которые направляют и/или контролируют экспрессию встроенных последовательностей гетерологичных нуклеиновых кислот.Векторы экспрессии, которые кодируют антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, включают в себя вирусные векторы, такие как лентивирусные векторы или у-ретровирусные векторы. Вирусные векторы включают в себя ретровирус, аденовирус, парвовирус (например, аденоассоциированные вирусы), коронавирус, вирусы с отрицательной нитью РНК, такие как орто-миксовирус (например, вирус гриппа), рабдовирус (например, вирус бешенства и везикулярного стоматита), парамиксовирус (например, вирус кори и Сендай), вирусы с положительной нитью РНК, такие как пикорнавирус и альфавирус, и вирусов с двухнитевой ДНК, включая аденовирус, вирус герпеса (например, вирус простого герпеса типов 1 и 2, вирус Эпштейна-Барр, цитомегаловирус) и поксвирус (например, вирус осповакцины, оспы птиц и канареек). Другие вирусы включают в себя, например, вирус Норуолк, тогавирус, флавивирус, реовирусы, паповавирус, гепаднавирус и вирус гепатита. Примеры ретровирусов включают в себя вирус лейкоза-cap комы птиц, вирусы типа С, типа В млекопитающих, вирусы типа D, группу HTLV-BLV, лентивирус, спумавирус (Coffin, J. М., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).

Используемый в настоящем документе термин «лентивирусный вектор» означает лентивирусные векторы на основе HIV для доставки генов, которые могут быть интегративными или неинтегративными, обладают относительно большой упаковочной способностью и могут трансдупировать ряд различных типов клеток. Лентивирусные векторы обычно получают после временной трансфекции трех (упаковка, оболочка и перенос) или более плазмид в клетки-продуценты. Подобно HIV, лентивирусные векторы проникают в целевую клетку посредством взаимодействия гликопротеинов вирусной поверхности с рецепторами на поверхности клетки. При входе вирусная РНК подвергается обратной транскрипции, которая опосредуется комплексом обратной транскриптазы вируса. Продукт обратной транскрипции представляет собой двухнитевую линейную вирусную ДНК, которая является субстратом для интеграции вируса в ДНК инфицированных клеток.

Согласно некоторым родственным вариантам осуществления представлена рекомбинантная клетка-хозяин, которая содержит одну или несколько конструкций, описываемых в настоящем документе; нуклеиновая кислота, кодирующая антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, или его вариант; и способ получения кодированного продукта, при этом способ предусматривает экспрессию кодирующей его нуклеиновой кислоты. Экспрессия может быть легко достигнута путем культивирования в соответствующих условиях рекомбинантной клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту (например, в векторе в соответствии с настоящим изобретением). После получения путем экспрессии антитело или его антигенсвязывающий фрагмент можно выделить и/или очистить с использованием любой подходящей методики, а затем использовать по желанию.

Системы для клонирования и экспрессии полипептида в различных клетках-хозяевах хорошо известны. Подходящие клетки-хозяева включают в себя бактерии, клетки млекопитающих, дрожжевые и бакуло вирусные системы. Клеточные линии млекопитающих, доступные в уровне техники для экспрессии гетерологичного полипептида, включают в себя клетки яичников китайского хомячка, клетки HeLa, клетки почек детенышей хомячка (например, клетки НЕК, такие как клетки HEK293-с18), клетки меланомы мыши NSO и многие другие. Обычным предпочтительным бактериальным хозяином является Е. coli.

Экспрессия пептидов в прокариотических клетках, таких как Е. coli, хорошо известна в уровне техники. Для обзора см., например, Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991). Экспрессия в эукариотических клетках в культуре также доступна специалистам в данной области в качестве варианта продуцирования антител или их антигенсвязывающих фрагментов, см. последние обзоры, например, Ref, М. Е. (1993) Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576; Trill J. J. et al. (1995) Curr. Opinion Biotech 6: 553-560.

Можно выбрать или сконструировать подходящие векторы, содержащие подходящие регуляторные последовательности, включающие в себя промоторные последовательности, терминаторные последовательности, последовательности полиаденилирования, энхансерные последовательности, маркерные гены и другие последовательности, если это необходимо. Векторы могут быть плазмидными, вирусными, например, фаг или фагмида, в зависимости от ситуации. Дополнительные подробности см., например, в Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Многие известные методики и протоколы для манипуляции с нуклеиновой кислотой, например, при получении конструкций нуклеиновых кислот, мутагенезе, секвенировании, введении ДНК в клетки и экспрессии генов, а также анализе белков, подробно описаны в Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992, или в последующих их обновлениях.

Термин «клетка-хозяин» используют для обозначения клетки, в которую была введена или в которую можно ввести последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую одно или несколько описанных в настоящем документе антител и их антигенсвязывающих фрагментов, и которая далее экспрессирует или способна экспрессировать отобранный представляющий интерес ген, такой как ген, кодирующий любые описанные в настоящем документе антитело или антигенсвязывающий фрагмент.Термин включает в себя потомство родительской клетки, независимо от того, является ли потомство идентичным по морфологии или генетическому составу исходному родителю, при условии, что присутствует отобранный ген. Соответственно, также рассматривается способ, предусматривающий введение такой нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. При введении можно использовать любую доступную методику. Для эукариотических клеток подходящие методики могут включать в себя трансфекцию фосфатом кальция, DEAE-декстраном, электропорацию, опосредованную липосомами трансфекцию и трансдукцию с использованием ретровируса или другого вируса, например, вируса осповакцины или, в случае клеток насекомых, бакуловируса. Для бактериальных клеток подходящие методики могут включать в себя трансформацию хлоридом кальция, электропорацию и трансфекцию с использованием бактериофага. После введения можно вызвать или обеспечить экспрессию из нуклеиновой кислоты, например, путем культивирования клеток-хозяев в условиях экспрессии гена. Согласно одному варианту осуществления нуклеиновую кислоту интегрируют в геном (например, хромосому) клетки-хозяина. Интеграции может способствовать включение последовательностей, которые способствуют рекомбинации с геномом, в соответствии со стандартными методиками.

Согласно определенным вариантам осуществления настоящее изобретение таже относится к способу, который предусматривает применение конструкции, указанной выше, в системе экспрессии для экспрессии конкретного полипептида, такого как антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описываемые в настоящем документе. Термин «трансдукция» используют в отношении переноса генов из одной бактерии в другую, обычно с помощью фага. Термин «трансдукция» также относится к приобретению и переносу последовательностей эукариотических клеток ретро вирусами. Термин «трансфекция» используют для обозначения поглощения чужеродной или экзогенной ДНК клеткой, и клетка была «трансфицирована», если экзогенная ДНК была введена через клеточную мембрану. Ряд методик трансфекции хорошо известен в уровне техники и раскрывается в настоящем документе. См., например, Graham et al, 1973, Virology 52:456; Sambrook et al, 2001, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories; Davis et al, 1986, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier; и Chu et al, 1981, Gene 13:191. Такие методики можно использовать для введения одного или нескольких фрагментов экзогенной ДНК в подходящие клетки-хозяева.

Используемый в настоящем документе термин «трансформация» относится к изменению генетических характеристик клетки, и клетка была трансформирована, если она была модифицирована с содержанием новой ДНК. Например, клетка трансформируется, если ее генетически модифицируют по сравнению с ее естественным состоянием. После трансфекции или трансдукции трансформирующая ДНК может рекомбинироваться с ДНК клетки путем физической интеграции в хромосому клетки, или может временно сохраняться как эписомальный элемент без репликации, или может реплицироваться независимо в виде плазмиды. Клетка считается стабильно трансформированной, если ДНК реплицируется при делении клетки. Термин «встречающийся в природе» или «нативный» при использовании в отношении биологических материалов, таких как молекулы нуклеиновых кислот, полипептиды, клетки-хозяева и т.п., относится к материалам, которые встречаются в природе и не подвергаются манипуляциям со стороны человека. Аналогичным образом, используемый в настоящем документе термин «невстречающийся в природе» или «ненативный» относится к материалу, который не встречается в природе или который был структурно модифицирован или синтезирован человеком.

Следует учитывать, что при практическом применении некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения будут использоваться, если специально не указано иное, традиционные способы вирусологии, иммунологии, микробиологии, молекулярной биологии и методики рекомбинантной ДНК, которые находятся в пределах компетенции специалистов в данной области, и многие из них описаны ниже в целях иллюстрации. Такие методики полностью объяснены в литературе. См., например, Current Protocols inMolecular Biology or Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.(2009); Ausubel et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons, 1995; Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) и другие подобные ссылки.

Некоторые из раскрываемых в настоящем документе вариантов осуществления относятся к выявлению и характеристике специфической иммунологической связывающей активности (например, связывающей активности антитела), которая направлена на определяемые углеводом антигенные структуры. Специалистам, знакомым с данной областью, будет понятно, что существуют различные методы, с помощью которых можно создавать и тестировать специфические для углеводов иммунологические реагенты, в том числе точную структурную характеристику когнатных углеводных антигенов. Неограничивающие примеры таких технологий описаны в Haji-Ghassemi et al., 2015 Glybiol. 25:920; Dingjan et al., 2015 Mol. Immunol. 67(2 Pt A):75-88; Soliman et al., 2017 Curr. Opin. Struct. Biol. 44:1-8; и Hakomori, 2001 Adv. Exp.Med. Biol. 491:369-402; и цитируемых в них ссылках. Там и в других местах также можно найти описания источников определяемых углеводом антигенов и способов их получения, выделения и структурной характеристики. В настоящем документе раскрываются иллюстративные и неограничивающие применения таких подходов, и настоящее раскрытие не предназначено для ограничения ими, а также предусматривает синтетическое получение структурно определенных углеводных антигенов, в том числе путем использования исключительной специфичности биосинтетических ферментов, известных в уровне техники как гликозилтрансферазы. См., например, Wu et al., Universal phosphatase-coupled glycosyltransferase assay, Glycobiology 21(6): 727-733, 2011; Becker et al., Fucose: biosynthesis and biological function in mammals, Glycobiology 13(7): 41R-53R, 2003; de Vries et al., Fucosyltransferases: structure/function studies, Glycobiology 11(10): 119R-128R, 2001.

Стандартные методики можно использовать для рекомбинантной ДНК, синтеза олигонуклеотидов, а также для культивирования и трансформации тканей (например, электропорацию, липофекцию). Ферментативные реакции и методики очистки можно проводить в соответствии со спецификациями производителя или в соответствии с традиционными способами, применяемыми в уровне техники или описываемыми в настоящем документе.

Эти и связанные с ними методики и процедуры могут обычно выполняться в соответствии с традиционными способами, хорошо известными в уровне техники и описанными в различных общих и более конкретных ссылочных материалах, которые цитируются и обсуждаются в настоящем описании. Если не даны конкретные определения, номенклатура, используемая в связи с лабораторными процедурами и методиками молекулярной биологии, аналитической химии, синтетической органической химии, а также медицинской и фармацевтической химии, описываемыми в настоящем документе, хорошо известна и широко используется в уровне техники. Стандартные методики могут быть использованы для рекомбинантной технологии, молекулярно-биологического, микробиологического, химического синтеза, химических анализов, фармацевтического приготовления, составления и доставки, а также лечения пациентов, как описано далее.

Композиции

Согласно определенным аспектам настоящее раскрытие относится к антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, а также к их вариантам и композициям, включающим их в себя. Согласно определенным вариантам осуществления представлено выделенное антитело, которое включает в себя тяжелую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 10, и легкую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 11.

Согласно определенным вариантам осуществления представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые включают в себя вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая включает в себя аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 35; и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая включает в себя аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 5, при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны специфически связываться:

Согласно другим вариантам осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает в себя: (а) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая включает в себя определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (V_H CDR1), включающую в себя аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 2; определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (V_H CDR2), включающую в себя аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 3; определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (V_H CDR3), включающую в себя аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 4; и (b) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая включает в себя определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (V_L CDR1), включающую в себя аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 6; определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (V_L CDR2), включающую в себя аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 7; и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (V_L CDR3), включающую в себя аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 8; при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны специфически связываться:

Согласно определенным раскрываемым в настоящем документе вариантам осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является моноклональным.

Согласно определенным раскрываемым в настоящем документе вариантам осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является гуманизиро ванным.

Согласно определенным вариантам осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбраны из Fab-фрагмента, Р(ab')2-фрагмента, Fv-фрагмента, одноцепочечного Fv (scFy)-антитела и диатела.

Согласно следующим определенным вариантам осуществления представлены выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающие в себя вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая включает в себя аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентной идентичностью в отношении аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 35; и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая включает в себя аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентной идентичностью в отношении аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 5, при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны специфически связываться:

и при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не связывается специфически с моноантеннарным антигеном Le^X, который включает в себя Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc [IX], или с биантеннарным антигеном Le^X, который включает в себя [Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X], или с моноантеннарным антигеном Le^A, который включает в себя Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc [XI], или с моноантеннарным антигеном Н типа 2, который включает в себя Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc [XII], или с биантеннарным антигеном Н типа 2, который включает в себя (Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII] или с моноантеннарным антигеном Н типа 1, который включает в себя Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc [XIV].

Согласно определенным вариантам осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает в себя: (а) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая включает в себя определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (V_H CDR1), включающую в себя аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 2, или аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентной идентичностью в отношении аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 2; определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (V_H CDR2), включающую в себя аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 3, или аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентной идентичностью в отношении аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 3; определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (V_H CDR3), включающую в себя аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 4, или аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентной идентичностью в отношении аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4; и (b) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая включает в себя определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (V_L CDR1), включающую в себя аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 6, или аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентной идентичностью в отношении аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 6; определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (V_L CDR2), включающую в себя аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 7, или аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентной идентичностью в отношении аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 7; и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (V_L CDR3), включающую в себя аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 8, или аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентной идентичностью в отношении аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 8.

Согласно другим вариантам осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включает в себя (i), (ii), (iii), (iv), (v) или (vi), как представлено ниже, или любую их комбинацию: (i) V_H CDR1, включающую в себя вариант аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 2, при этом вариация состоит из замены Y→A в положении 33 согласно нумерации по Kabat; (ii) V_H CDR3, включающую в себя вариант аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4, при этом вариация состоит из замены Y→А в положении 104 согласно нумерации по Kabat; (iii) V_H CDR3, включающую в себя вариант аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 4, при этом вариация состоит из замены Н→А в положении 106 согласно нумерации по Kabat; (iv) V_L CDR1, включающую в себя вариант аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 6, при этом вариация состоит из замены Y→A в положении 30 согласно нумерации по Kabat; (v) V_L CDR2, включающую в себя вариант аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 7, при этом вариант состоит из замены G→A в положении 50 согласно нумерации по Kabat; или (vi) V_L CDR3, включающую в себя вариант аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 8, при этом вариация состоит из замены T→S в положении 93 согласно нумерации по Kabat.

Согласно любому из описываемых в настоящем документе вариантов осуществления выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может демонстрировать пониженное (например, пониженное статистически значимым образом) связывание с моноантеннарным антигеном Льюиса В или моноантеннарным антигеном Льюиса Y по сравнению с антителом ВВС, которое включает в себя домен V_L, имеющий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 27, и домен V_H, имеющий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 28.

Согласно определенным дополнительным вариантам осуществления представлены выделенное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые включают в себя CDR, описываемые в настоящем документе (т.е. CDR характеризующиеся по меньшей мере 90% идентичностью в отношении SEQ ID NO: 2, 3, 4, 6, 7 и 8, соответственно, в том числе те варианты CDR с описываемыми в настоящем документе аминокислотными заменами), и включают в себя вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, включающую в себя или состоящую из аминокислотной последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентной идентичностью в отношении аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 35; и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая включает в себя или состоит из аминокислотной последовательности, которая характеризуется по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99 процентной идентичностью в отношении аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 5.

Антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, такие как описываемые в настоящем документе, в том числе без ограничения scFv, согласно определенным вариантам осуществления могут быть включены в белок слияния, который способен к специфическому связыванию с антигеном Льюиса, описываемым в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам осуществления белок слияния способен экспрессироваться на поверхности клетки-хозяина, например, Т-клетке, NK-клетке или NK-T-клетке, и включает в себя внеклеточный компонент, включающий в себя антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, раскрываемые в настоящем документе, и внутриклеточный компонент, включающий в себя эффекторный домен, который способен напрямую или опосредованно обеспечивать иммунный ответ в клетке (например, в клетке иммунной системы, такой как Т-клетка) при получении соответствующего сигнала (например, эффекторный домен из CD27, CD28, 4-1ВВ (CD137), ОХ40 (CD134), CD3s, CD35, CD3C, CD25, CD27, CD28, CD79A, CD79B, CARD11, DAP10, FcRa, FcRp, FcRy, Fyn, HVEM, ICOS, Lck, LAG3, LAT, LRP, NKG2D, NOTCH 1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, Wnt, ROR2, Ryk, SLAMF1, Slp76, pTa, TCRa, TCR(3, TRIM, Zap70, PTCH2 или любой их комбинации), при этом внеклеточный компонент и внутриклеточный компонент соединяются трансмембранным доменом (например, транс мембранным доменом CD8, транс мембранным доменом CD4, трансмембранным доменом CD27 или трансмембранным доменом CD28), и внутриклеточный компонент необязательно включает в себя костимуляторный домен или его часть, выбранные из CD27, CD28, 4-1ВВ (CD137), ОХ40 (CD134) или их комбинации. Согласно определенным вариантам осуществления внеклеточный компонент белка слияния, включающего в себя антитело или антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с настоящим раскрытием, включает в себя полипептид, происходящий из белка иммуноглобулина, например, шарнир-C_H2-C_H3 IgG4.

Согласно этим и связанным с ними вариантам осуществления антигенсвязывающий фрагмент может включать в себя описываемый в настоящем документе антигенсвязывающий фрагмент, такой как scFv, и внеклеточный компонент может дополнительно включать в себя соединительную область, включающую в себя шарнир, например, в молекуле химерного антигенного рецептора (CAR), которая может быть экспрессирована на клеточной поверхности клетки-хозяина, такой как Т-клетка, NK-клетка или NK-T-клетка, для применения в клеточной иммунотерапии. Молекулы CAR и принципы их создания описаны, например, в Sadelain et al., Cancer Discov., 5(4):388 (2013); Harris and Kranz, Trends Pharmacol. Sci., 57(3):220 (2016); Stone et al., Cancer Immunol. Immunother., 65(11):1163 (2014); Xu et al., 2018 Oncotarget 9:13991; Androulla et al., 2018 Curr. Pharm. Biotechnol. Volume 19 (April 2018); Wu et al., 2016 Expert Opin. Biol. Ther. 16:1469; Ren et al., 2017 Protein Cell 8:634; молекулы CAR, конструкции CAR и принципы конструирования CAR которых включены в настоящий документ посредством ссылки в полном своем объеме.

В настоящем документе также представлены конъюгаты антител, которые включают в себя антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в соответствии с настоящим раскрытием, и связанная с ними молекула нагрузки. В качестве пояснения, моноклональные антитела, которые специфически нацеливаются на антигены, можно использовать в качестве молекул-носителей для доставки терапевтической или выявляемой молекулы нагрузки к месту экспрессии антигена, например, опухолевой клетке, которая экспрессирует антиген. Связывание конъюгатом антитела с антигеном может обеспечить, например, целевую доставку цитотоксической нагрузки или выявляемого фрагмента к больной клетке или ткани для лечения или выявления, визуализации или мониторинга заболевания, например, рака. Согласно определенным вариантам осуществления конъюгат антитела интернализируется целевой клеткой, которая экспрессирует антиген после связывания или при связывании конъюгатом антитела. Интернализация в цитозоль или лизосомальный компартмент целевой клетки может обеспечивать селективное высвобождение молекулы нагрузки, например, чтобы вызвать цитотоксическое повреждение целевой клетки.

Для соединения молекулы нагрузки с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом с образованием конъюгата антитела в соответствии с настоящим раскрытием могут быть использованы различные методики. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат антитела включает в себя молекулу нагрузки, которая ковалентно связывается линкером с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. Линкеры, используемые в конъюгатах антител, содержащих цитотоксические или противопролиферативные средства (например, конъюгаты антитело-лекарственное средство), обычно представляют собой органические соединения, которые попадают в одну из двух групп, организованных в соответствии с механизмом, с помощью которого молекула нагрузки высвобождается из молекулы-носителя. Расщепляемые линкеры предназначены для селективного разрушения или расщепления в соответствии с присущими целевой клетке свойствами: три типа расщепляемых линкеров представляют собой чувствительные к протеазе линкеры (при расщеплении линкера, например, линкера, содержащего дипептид валин-цитруллин или фенилаланин-лизин, или тетрапептид (например, GFLG или ALAL), протеазами, присутствующими в лизосоме опухолевых клеток, высвобождается молекула нагрузки); рН-чувствительные линкеры, содержащие кислотолабильную группу, которая селективно гидролизуется более низким рН эндосомального и лизосомального компартментов по сравнению с цитозольным рН; и чувствительные к глутатиону линкеры, которые содержат дисульфидный мостик, который восстанавливается внутриклеточным глутатионом. Нерасщепляемые линкеры зависят от неспецифического разложения конъюгата антитела с высвобождением молекулы нагрузки.

Специфические линкеры, нагрузки, линкерная химия и связанными с ними механизмы и способы раскрываются в работе Nareshkumar et al., Pharm. Res. 52:3526-3540 (2015), композиции, способы и методики которой включены в настоящий документ посредством ссылки в полном своем объеме. Согласно определенным вариантам осуществления конъюгат антитела включает в себя линкер, выбранный из расщепляемого линкера и нерасщепляемого линкера. Согласно следующим вариантам осуществления линкер представляет собой расщепляемый линкер, выбранный из чувствительного к протеазе линкера, рН-чувствительного линкера или чувствительного к глутатиону линкера.

Согласно определенным вариантам осуществления расщепляемым линкером является чувствительный к протеазе линкер, включающий в себя дипептид валин-цитруллин.

Линкер может быть соединен или связан с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом с использованием любых подходящих методики или механизма. Согласно некоторым вариантам осуществления линкер включает в себя малеимидную группу, (необязательно пэгилированную), способную вступать в реакцию с восстановленным дисульфидным мостиком в шарнирной области антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Другие сайты на молекуле-носителе (т.е. антителе или его антигенсвязывающем фрагменте), подходящие для конъюгации с линкером, могут быть ведены или сконструированы с использованием рекомбинантных методик, таких как введение цистеиновых остатков или неприродных аминокислот для сайт-специфической конъюгации. Способы введения таких модификаций включают в себя, например, способ, описанный в примерах 6.3-7 РСТ публикации патентного документа № WO 2012/032181.

Согласно некоторым вариантам осуществления линкер дополнительно включает в себя саморазрушающуюся группу, также называемую саморасщепляющейся группой или саморасщепляющимся спейсером, для обеспечения реакции селективного расщепления. Согласно определенным вариантам осуществления саморазрушающаяся группа представляет собой пара-аминобензиловый спирт (РАВС).

Клик-химия, применимая для создания конъюгатов антител, включает в себя описанную в работе Meyer et al, Bioconjug. Chem. 27(12):2791-2807 (2016), которая включена в настоящий документ посредством ссылки в полном своем объеме.

В любом из конъюгатов антител, описываемых в настоящем документе, молекула нагрузки может быть выбрана из терапевтического средства и выявляемого индикатора. Терапевтические средства, подходящие для терапии рака, включают в себя раскрытые в работе Parslow et al., Biomedicines 4:14 (2016), нагрузки и принципы конструирования ADC которой тем самым включены посредством ссылки. Согласно определенным вариантам осуществления молекула нагрузки представляет собой терапевтическое средство, выбранное из нацеливающегося на тубулин противомитотического средства, токсина на основе пептида, димера пирролобензодиазепина (PBD), антибиотика (например, калихеамицина), ингибитора синтеза пиримидина (например, 5-фторурацила), антиметаболического средства (например, метотрексата), алкилирующего ДНК средства и ингибитора топоизомеразы (например, доксорубицина). Согласно следующим вариантам осуществления молекула нагрузки выбрана из майтансиноида, ауристатина, монометилауристатина Е (ММАЕ) и монометилауристатина F (MMAF).

Согласно другим вариантам осуществления молекула нагрузки представляет собой выявляемый индикатор. Выявляемые индикаторы, подходящие для применения в конъюгатах антител, а также связанные с ними стратегии мечения и методики визуализации (например, PET, MRI, NIR) включают в себя раскрытые в работах Friese and Wu, Mol. Immunol. 67(200): 142-152 (2015), и Moek et al, J. Nucl. Med. 5S:83S-90S (2017), обе из которых тем самым включены посредством ссылки. Согласно определенным вариантам осуществления выявляемый индикатор выбран из радионуклида, красителя, радиометалла, флуоресцентного фрагмента, контрастного средства для МРТ, микропузырька, углеродной нанотрубки, частицы золота, фтордезоксиглюкозы, фермента, хромофора и непрозрачного для рентгеновских лучей маркера. Согласно определенным вариантам осуществления выявляемый индикатор представляет собой радионуклид, выбранный из ⁶⁸Ga, ⁶⁴Cu, ⁸⁶Y, ⁸⁹Zr, ¹²⁴I, ⁹⁹mTc, ¹²³I, ¹¹¹In, ¹⁷⁷Lu, ¹³¹I, ⁷⁶Br, ⁷⁸Zr, ¹⁸F и ¹²⁴T. Согласно таким определенным вариантам осуществления конъюгат антитела дополнительно включает в себя радио ну клидный хелатор, выбранный из меченной малеимидом DOTA, N-гидроксисукцинимид-DOTA и дезферриоксамина (DFO).

Также в настоящем документе представлены фармацевтические композиции, которые включают в себя антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела в соответствии с настоящим раскрытием и фармацевтические носитель.

Согласно другому аспекту настоящее раскрытие относится к выделенным полинуклеотидам, которые кодируют антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описываемые в настоящем документе, при этом полинуклеотиды включают в себя варианты последовательности, характеризующиеся по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей по сравнению с определенной нуклеотидной последовательностью, раскрываемой в настоящем документе. Согласно определенным вариантам осуществления полинуклеотид, который кодирует антитело или антигенсвязывающий фрагмент (например, включающие в себя scFv-, Fab-, F(ab'2)-фрагмент, Fv-фрагмент или диатело) в соответствии с настоящим раскрытием или который кодирует часть антитела или антигенсвязывающего фрагмента (например, тяжелую цепь, легкую цепь, V_H, V_L или CDR), характеризуется по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей по сравнению с любым из SEQ ID NO: 12-22 или 37. Согласно определенным вариантам осуществления полинуклеотид является кодон-оптимизированным для экспрессии в клетке-хозяине, например, в клетке млекопитающего. Согласно любому из вышеупомянутых вариантов осуществления полинуклеотид может быть обеспечен в рекомбинантном векторе. Согласно определенным вариантам осуществления вектор включает в себя последовательность контроля экспрессии, функционально связанную с полинуклеотидом, кодирующим антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.Согласно таким определенным вариантам осуществления вектор (например, рекомбинантный вектор) представляет собой вектор экспрессии, в котором последовательность контроля экспрессии включает в себя промотор.

Согласно другому аспекту представлены клетки-хозяева, которые включают в себя рекомбинантный вектор или вектор экспрессии, описываемый в настоящем документе. Согласно родственному аспекту представлены способы получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые способны специфически связываться:

и при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не связывается специфически с моноантеннарным антигеном Le^X, который включает в себя Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc [IX], или с биантеннарным антигеном Le^X, который включает в себя [Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]2 [X], или с моноантеннарным антигеном Le^A, который включает в себя Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc [XI], или с моноантеннарным антигеном Н типа 2, который включает в себя Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc [XII], или с биантеннарным антигеном Н типа 2, который включает в себя (Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII], или с моноантеннарным антигеном Н типа 1, который включает в себя Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc [XIV], при этом способы предусматривают культивирование клетки-хозяина в соответствии с настоящим раскрытием при условиях и на протяжении времени, достаточных для экспрессии клеткой-хозяином полинуклеотида, кодирующего антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, с получением тем самым культуры, включающей в себя антитело или его антигенсвязывающий фрагмент; и извлечение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из культуры.

Способы и применения для выявления и лечения заболевания

Согласно определенным вариантам осуществления раскрываемые в настоящем документе антитела, их антигенсвязывающие фрагменты и конъюгаты антител применимы в способах выявления или лечения заболевания, характеризующегося экспрессией (например, надэкспрессией) антигена Льюиса, описываемого в настоящем документе.

Как будет понятно специалисту в области медицины, термины «лечить» и «лечение» относятся к медицинскому лечению заболевания, нарушения или состояния субъекта (т.е. больного, хозяина, которым может быть человек или отличное от человека животное) (см., например, Stedman's Medical Dictionary). Как правило, подходящая доза и режим лечения обеспечивают одно или несколько антител, его антигенсвязывающих фрагментов или конъюгатов антител в количестве, достаточном для обеспечения терапевтического или профилактического эффекта. Терапевтический или профилактический эффект, являющийся результатом терапевтического лечения или профилактических или превентивных способов, включает в себя, например, улучшение клинического исхода, цель которого состоит в том, чтобы предупредить, замедлить или иным образом уменьшить (например, снизить статистически значимым образом по сравнению с неполучавшим обработку контролем) нежелательное физиологическое изменение или нарушение, или предупредить, замедлить или иным образом уменьшить распространение или тяжесть такого заболевания или нарушения. Благоприятные или желаемые клинические результаты лечения субъекта включают в себя ослабление, уменьшение или облегчение симптомов, которые возникают в результате заболевания или нарушения, или связаны с заболеванием или нарушением, подлежащим лечению; уменьшение появления симптомов; улучшение качества жизни; более длительное состояние отсутствия заболевания (т.е. уменьшение вероятности или предрасположенности к появлению у субъекта симптомов, на основании которых ставится диагноз заболевания); уменьшение степени заболевания; стабилизированное (т.е. не ухудшающееся) состояние заболевания; задержку или замедление прогрессирования заболевания; улучшение или смягчение состояния заболевания и ремиссию (частичную или полную), выявляемую или невыявляемую; или общую выживаемость.

Термин «лечение» также может означать продление выживаемости по сравнению с ожидаемой выживаемостью, если бы субъект не получал лечения. Субъекты, нуждающиеся здесь способах и композициях, описываемых в настоящем документе, включают в себя тех, у кого уже есть заболевание или нарушение, а также субъектов, склонных к заболеванию или риску развития заболевания или нарушения. Субъекты, нуждающиеся в лечении для снижения вероятности возникновения или рецидива заболевания или нарушения или нуждающиеся в профилактическом лечении, могут включать в себя субъектов, у которых заболевание, состояние или нарушение должно быть уменьшено по степени тяжести, или частично, или полностью устранено, или частично, или полностью предупреждено (например, снижение вероятности возникновения или рецидива заболевания или нарушения, что может включать в себя абсолютную профилактику, но не обязательно требует ее). Клиническая польза, обеспечиваемая композициями (и препаратами, содержащими композиции) и способами, описываемыми в настоящем документе, может быть оценена путем разработки и проведения анализов in vitro, доклинических исследований и клинических исследований у субъектов, которым введение композиций должно принести пользу, как описывается в примерах.

Например, согласно определенным вариантам осуществления представлены способы лечения или выявления рака (т.е. рака, экспрессирующего антиген Льюиса, описываемый в настоящем документе), при этом способы предусматривают введение фармацевтической композиции в соответствии с настоящим раскрытием субъекту-а нуждающемуся в этомпрн необходимости этого. Используемый в настоящем документе термин «рак» относится к состоянию, характеризующемуся аберрантной или неконтролируемой пролиферацией (например, гиперпролиферацией) больных клеток, которое может характеризоваться злокачественным распространением из первой ткани или участка в соседние или отдаленные ткань, или ткани, или участки в организме.

Согласно конкретным вариантам осуществления способов субъект имеет или подозревается в том, что имеет рак, который выбран из рака желудка, рака толстой кишки, рака молочной железы, рака легкого, лимфатического рака, рака печени, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака матки и плоскоклеточной карциномы. Согласно следующим вариантам осуществления рак выбран из аденокарциномы желудка, муценозной аденокарциномы желудка, недифференцированной аденокарциномы желудка, перстневидноклеточной карциномы желудка, аденокарциномы толстой кишки, инвазивной карциномы протоков молочной железы, печеночноклеточной карциномы, аденокарциномы легкого, плоскоклеточной карциномы, метастатической аденокарциномы лимфатических узлов, муценозной аденокарциномы яичника, аденокарциномы протоков поджелудочной железы, папиллярной аденокарциномы поджелудочной железы, аденокарциномы предстательной железы и карциномы эндометрия. Введение антител, антигенсвязывающих фрагментов или конъюгатов антител, описываемых в настоящем документе, в чистой форме или в соответствующей фармацевтической композиции может быть выполнено любым из принятых способов введения средств для осуществления подобных целей. Фармацевтические композиции могут быть приготовлены путем объединения антитела, антигенсвязывающего фрагмента или конъюгата антитела с подходящим физиологически приемлемым носителем, разбавителем или вспомогательным средством, и могут быть составлены в виде препаратов в твердой, полутвердой, жидкой или содержащейся в микрочастицах (например, микрокапельках) газообразной формах, таких как таблетки, капсулы, порошки, гранулы, мази, растворы, суппозитории, инъекции, ингаляции, гели, микросферы и аэрозоли. Кроме того, в композиции могут, но не обязательно, присутствовать другие фармацевтически активные ингредиенты (включающие в себя другие иммуносупрессивные средства, описываемые в другом месте в настоящем документе) и/или подходящие вспомогательные средства, такие как соли, буферы и стабилизаторы.

Точная дозировка и продолжительность лечения могут зависеть от состояния или заболевания, подлежащего лечению, и могут быть определены эмпирически с использованием известных протоколов тестирования или путем тестирования композиций в модельных системах, известных в уровне техники, и экстраполяции их. Также могут проводиться контролируемые клинические испытания. Дозировки также могут варьировать в зависимости от тяжести состояния, подлежащего облегчению. Фармацевтическую композицию обычно составляют и вводят для оказания терапевтически полезного эффекта при минимизации нежелательных побочных эффектов. Композицию можно вводить один раз или можно разделить на несколько меньших доз, вводимых через определенные промежутки времени. Для любого конкретного субъекта конкретные режимы дозирования могут корректироваться с течением времени в соответствии с индивидуальными потребностями.

Термин «эффективное количество» композиции относится к количеству, достаточному в дозировках и на протяжении периодов времени, необходимых для достижения желаемых клинических результатов или полезного лечения, описываемых в настоящем документе. Эффективное количество может быть доставлено за одно или несколько введений. Если введение осуществляют субъекту, у которого уже известно или подтверждено наличие заболевания или состояния заболевания, то термин «терапевтическое количество» может использоваться в отношении лечения, тогда как термин «профилактически эффективное количество» может использоваться для описания введения эффективного количества субъекту, который подвержен заболеванию состоянию заболевания или подвержен риску развития заболевания или состояния заболевания (например, рецидива) в качестве полезного и/или защитного курса снижения (например, статистически значимым образом по сравнению с состоянием без лечения) вероятности возникновения и/или тяжести заболевания или состояния заболевания.

Согласно различным вариантам осуществления конъюгат антитела в соответствии с настоящим раскрытием включает в себя выявляемую нагрузку, описываемую в настоящем документе, и может быть применим для выявления заболевания, такого как рак, либо in vivo, in vitro, либо ex vivo. Согласно некоторым из таких и других вариантов осуществления антитела (т.е. одно или несколько антител) или их антигенсвязывающие фрагменты, описываемые в настоящем документе, являются конъюгированными (например, ковалентно) с выявляемой меткой, которая может быть выявлена непосредственно или опосредованно. В соответствии с настоящим раскрытием любые из раскрываемых моноклональных антител, их антигенсвязывающих фрагментов и конъюгатов антител могут быть связаны с выявляемой меткой (например, в дополнение к выявляемой или терапевтической молекуле нагрузки в конъюгате антитела). При «непосредственном выявлении» применяют только одно выявляемое антитело, т.е. первичное выявляемое антитело. Таким образом, непосредственное выявление означает, что антитело, которое является конъюгированным с выявляемой меткой, может быть выявлено как есть, без необходимости добавления второго антитела (вторичного антитела).

Термин «выявляемая метка» представляет собой молекулу или материал, которые могут продуцировать выявляемый (таких как визуально, электронным способом или иным путем) сигнал, который указывает на присутствие и/или концентрацию метки в образце. При конъюгировании с пептидом выявляемая метка может быть применена для установления местонахождения и/или количественного определения мишени, с которой связан определенный пептид. Тем самым присутствие и/или концентрация мишени в образце могут быть выявлены путем выявления сигнала, продуцируемого выявляемой меткой. Выявляемая метка может быть выявлена непосредственно или опосредованно, и несколько разных выявляемых меток, конъюгированных с различными специфическими антителами, могут использоваться в комбинации для выявления одной или нескольких мишеней.

Примеры выявляемых меток, которые могут быть выявлены непосредственно, включают в себя флуоресцентные красители, радиоактивные вещества и металлические частицы. Напротив, непрямое выявление требует применения одного или нескольких дополнительных антител, т.е. вторичных антител, после применения первичного антитела. Таким образом, выявление выполняют путем выявления связывания вторичного антитела или связывающего средства с первичным выявляемым антителом. Примеры первичных выявляемых связывающих средств или антител, требующих добавления вторичного связывающего средства или антитела, включают в себя ферментативно выявляемые связывающие средства и выявляемые с помощью гаптена связывающие средства или антитела.

Согласно некоторым вариантам осуществления выявляемая метка конъюгирована с полимером нуклеиновой кислоты, который включает в себя первое связывающие средство (например, в процессе ISH, WISH или FISH). Согласно другим вариантам осуществления выявляемая метка конъюгирована с антителом, которое содержит первое связывающее средство (например, в процессе IHC).

Примеры выявляемых меток, которые могут быть конъюгированы с антителами, антигенсвязывающими фрагментами и конъюгатами антител, используемыми в способах в соответствии с настоящим раскрытием, включают в себя флуоресцентные метки, ферментные метки, радиоизотопы, хемилюминесцентные метки,

электрохемилюминесцентные метки, биолюминесцентные метки, полимеры, полимерные частицы, металлические частицы, гаптены и красители.

Примеры флуоресцентных меток включают в себя 5-(и 6)-карбоксифлуоресцеин, 5-или 6-карбоксифлуоресцеин, 6-(флуоресцеин)-5-(и 6)-карбоксамидогексановую кислоту, изотиоцианат флуоресцеина, родамин, тетраметилродамин и красители, такие как Су2, Су3 и Су5, необязательно замещенный кумарин, в том числе АМСА, PerCP, фикобилипротеины, в том числе R-фикоэритрин (RPE) и аллофикоэритрин (АРС), Texas Red, Princeton Red, зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его аналоги, а также конъюгаты R-фикоэритрина или аллофикоэритрин, неорганические флуоресцентные метки, такие как частицы на основе полупроводникового материала, такие как нанокристаллиты CdSe с покрытием.

Примеры меток с полимерными частицами включают в себя микрочастицы или латексные частицы полистирола, РММА или диоксида кремния, которые могут быть обеспечены с флуоресцентными красителями, или полимерные мицеллы, или капсулы, которые содержат красители, ферменты или субстраты.

Примеры меток с металлическими частицами включают в себя частицы золота и частицы золота с покрытием, которые могут быть преобразованы пятнами серебра.

Примеры гаптенов включают в себя DNP, изотиоцианат флуоресцеина (FITC), биотин и дигоксигенин. Примеры ферментных меток включают в себя пероксидазу хрена (HRP), щелочную фосфатазу (ALP или АР), β-галактозидазу (GAL), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, β-N-ацетилглюкозамидазу, β-глюкуронидазу, инвертазу, ксантиноксидазу, люциферазу светлячка и глюкозооксидазу (GO). Примеры обычно используемых субстратов для пероксидазы хрена включают в себя 3,3'-диаминобензидин (DAB), диаминобензидин с повышенным содержанием никеля, 3-амино-9-этилкарбазол (АБС), дигидрохлорид бензидина (BDHC), реагент Ханкера-Ятса (HYR), индофановый синий (IB), тетраметилбензидин (ТМВ), 4-хлор-1-нафтол (CN), альфа-нафтолпиронин (альфа-NP), о-дианизидин (OD), 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (BCIP), нитросиний тетразолий (NBT), 2-(п-иодофенил)-3-п-нитрофенил-1-5-фенилтетразолия хлорид (INT), тетранитросиний тетразолий (TNBT), 5-бром-4-хлор-3-индоксил-бета-D-галактозид/ферроферрицианид (BCIG/FF).

Примеры обычно используемых субстратов для щелочной фосфатазы включают в себя нафтол-AS-B-1-фосфат/быстрый красный TR (NABP/FR), нафтол-AS-MX-фосфат/быстрый красный TR (NAMP/FR), нафтол-AS-В1-фосфат/быстрый красный TR (NABP/FR), нафтол-AS-МХ-фосфат/быстрый красный TR (NAMP/FR), нафтол-AS-B1-фосфат/новый фусцин (NABP/NF), бромхлориндолилфосфат/нитросиний тетразолий (BCIP/NBT), 5-бром-4-хлор-3-индолил-b-d-галактопиранозид (BCIG).

Примеры люминесцентных меток включают в себя люминол, изолюминол, сложные эфиры акридиния, 1,2-диоксетаны и пиридопиридазины. Примеры электрохемилюминесцентных меток включают в себя производные рутения. Примеры радиоактивных меток включают в себя радиоактивные изотопы йодида, кобальта, селена, трития, углерода, серы и фосфора.

Выявляемые метки могут быть связаны с антителами, антигенсвязывающими фрагментами и конъюгатами антител, описываемыми в настоящем документе, или с любой другой молекулой, которая специфически связывается с представляющим интерес биологическим маркером, например, с антителом, зондом нуклеиновой кислоты или полимером. Кроме того, специалисту в данной области будет понятно, что выявляемые метки также могут быть конъюгированы со вторым, и/или третьим, и/или четвертым, и/или пятым связывающими средствами или антителами и т.д. Более того, квалифицированному специалисту будет понятно, что каждое дополнительное связывающее средство или антитело, используемые для характеристики представляющего интерес биологического маркера, может служить в качестве стадии амплификации сигнала. Биологический маркер может быть выявлен визуально с использованием, например, световой микроскопии, флуоресцентной микроскопии, электронной микроскопии, где выявляемое вещество представляет собой, например, краситель, частицу коллоидного золота, люминесцентный реагент.Визуально выявляемые вещества, связанные с биологическим маркером, также могут быть выявлены с помощью спектрофотометра. Если выявляемое вещество представляет собой радиоактивный изотоп, то выявление может осуществляться визуально с помощью авторадиографии или не визуально с использованием сцинтилляционного счетчика. См., например, Larsson, 1988, Immunocytochemistry: Theory and Practice, (CRC Press, Boca Raton, Fla.); Methods in Molecular Biology, vol. 80 1998, John D. Pound (ed.) (Humana Press, Totowa, N.J.).

Согласно определенным вариантам осуществления антитело, антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела в соответствии с настоящим раскрытием используют в способе выявления или диагностики заболевания, связанного с экспрессией антигена Льюиса, как описывается в настоящем документе, при этом способ предусматривает введение в контакт антитела, антигенсвязывающего фрагмента или конъюгата антитела с образцом от субъекта, подозреваемого в наличии заболевания или подвергающегося риску заболевания, и выявление образования комплекса антитело:антиген и/или выявление специфического связывания антитела, антигенсвязывающего фрагмента или конъюгата антитела в образце. В соответствии с настоящим раскрытием образец включает в себя кровь (например, периферическую кровь), ткань, опухоль или любую их комбинацию. Согласно определенным вариантам осуществления способ диагностики или выявления выполняют ех vivo или in vitro.

Способы выявления in vivo конъюгатов антител с выявляемыми нагрузками или выявляемыми метками включают в себя способы, которые описаны в работах Friese and Wu, Mol. Immunol. 67(200): 142-152 (2015), и Moek et al, J. Nucl. Med. 58:83S-90S (2017), все из которых тем самым включены посредством ссылки. Согласно определенным вариантам осуществления выявление антитела, антигенсвязывающего фрагмента или конъюгата антитела предусматривает выполнение позитронно-эмиссионной томографии (PET), магнитно-резонансной томографии (MRI), визуализации в ближнем инфракрасном диапазоне (NRI), рентгеновской компьютерной томографии (СТ), однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (SPECT), оптической визуализации, ультрасонографии или любой их комбинации.

Предпочтительные способы введения зависят от природы подлежащего лечению состояния, которое согласно определенным вариантам осуществления будет относиться к пагубному или клинически нежелательному состоянию, степень, тяжесть, вероятность возникновения и/или продолжительность которого могут быть уменьшены (например, уменьшены статистически значимый образом относительно соответствующей контрольной ситуации, такой как контроль без лечения) согласно определенным способам, представленным в настоящем документе. Количество, которое после введения заметно снижает, ингибирует, по меньшей мере частично предотвращает, уменьшает тяжесть или вероятность возникновения или отсрочивает такое состояние, например, частичное или полное уменьшение опухолевой нагрузки или частичное или полное снижение метастатического распространения, считается эффективным. Специалистам в соответствующих областях будет известно любое количество диагностических, хирургических и/или других клинических критериев, которые могут указывать на клиническую целесообразность, и/или к которым можно адаптировать введение описываемых в настоящем документе композиций. См., например, Hanahan and Weinberg, 2011 Cell 144:646; Hanahan and Weinberg 2000 Cell 100:57; Cavallo et al., 2011 Cane. Immunol. Immunother. 60:319; Kyrigideis et al., 2010 J. Carcinog. 9:3; Park et al. 2009 Molec. Therap.17:219; Cheever et al., 2009 Clin Cancer Res 15 (17):5323- 5337; Lu et al., 2013 Curr. Pharm. Biotechnol. 14:714-22; Layke et al., 2004 Am. Fam. Physician 69:1133049; Bunn, 2012 Arch. Pathol. Lab. Med. 136:1478-81; Manne et al., 2005 Drug Discov. Today 10:965; Schmoll et al. (Eds.), 2009 ESMO Handbook of 'Cancer Diagnosis and Treatment Evaluation, CRC Press, Boca Raton, FL; Faix, 2013 Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 50(l):23-36 ("Biomarkers of Sepsis"); Wiersinga et al., 2014 Virulence 5(l):36-44 ("Host innate immune responses to sepsis"); Hotchkiss et al., 2013 Nat. Rev. Immunol. 13:862; Aziz et al., 2013 J. Leukoc. Biol. 93(3):329; Beyrau et al., 2012 Open Biol. 2:120134; Fry, 2012 Amer. Surg. 78:1; Kellum et al., 2007 Arch. Intern. Med. 167(15): 1655; Remick, 2№1 Am. J. Pathol. 170(5): 1435; Hotchkiss et al., 2003 New Engl. J. Med. 348:138-150; Humar et al., Atlas of Organ Transplantation, 2006, Springer; Kuo et al., Comprehensive Atlas of Transplantation, 2004 Lippincott, Williams & Wilkins; Gruessner et al., Living Donor Organ Transplantation, 2007 McGraw-Hill Professional; Antin et al., Manual of Stem Cell and Bone Marrow Transplantation, 2009 Cambridge University Press; Wingard et al. (Ed.), Hematopoietic Stem Cell Transplantation: A Handbook for Clinicians, 2009 American Association of Blood Banks; и цитируемые в них ссылочные материалы.

Таким образом, типичные пути введения этих и родственных фармацевтических композиций включают в себя без ограничения пероральный, местный, чрескожный, ингаляционный, парентеральный, сублингвальный, буккальный, ректальный, вагинальный и интраназальный. Используемый в настоящем документе термин «парентеральный» включает в себя подкожные инъекции, методики внутривенной, внутримышечной, внутригрудинной инъекции или инфузии. Фармацевтические композиции в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения составляют таким образом, чтобы активные ингредиенты, содержащиеся в них, были биодоступными при введении композиции больному. Композиции, которые будут вводиться субъекту или больному, могут иметь форму одной или нескольких дозированных единиц, при этом, например, таблетка может быть однократной дозированной единицей, а контейнер с описываемыми в настоящем документе антителами, их антигенсвязывающими фрагментами или конъюгатами антител в аэрозольной форме может содержать множество единиц дозировки. Фактические способы приготовления таких дозированных форм известны или будут очевидны специалистам в данной области; например, см. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000). Вводимая композиция в любом случае будет содержать терапевтически эффективное количество антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или конъюгата антитела в соответствии с настоящим раскрытием для лечения заболевания или состояния, представляющего интерес, в соответствии с положениями настоящего документа. Согласно определенным вариантам осуществления введение предусматривает введение путем, который выбран из внутривенного, парентерального, внутрижелудочного, внутриплеврального, внутрилегочного, внутриректального, внутрикожного, внутриперитонеального, внутриопухолевого, подкожного, перорального, местного, чрескожного, интрацистернального, интратекального, интраназального и внутримышечного.

Фармацевтическая композиция может быть в твердой или жидкой форме. Согласно одному варианту осуществления носитель(и) представляет(ют) собой частицы, так что композиции имеют, например, форму таблеток или порошка. Носитель(и) может(могут) быть жидким(и), при этом композиции представляют собой, например, пероральное масло, жидкость для инъекций или аэрозоль, который применим, например, для ингаляционного введения. Если фармацевтическая композиция предназначена для перорального введения, то она предпочтительно имеет твердую или жидкую форму, при этом полутвердые, полужидкие, суспензионные и гелевые формы включены в формы, рассматриваемые в настоящем документе как твердые или жидкие.

В качестве твердой композиции для перорального введения фармацевтическая композиция может быть составлена в виде порошка, гранулы, прессованной таблетки, пилюли, капсулы, жевательной резинки, облатки и т.п. Такая твердая композиция, как правило, будет содержать один или несколько инертных разбавителей или съедобных носителей. Кроме того, может присутствовать одно или несколько из следующего: связующие, такие как карбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза, микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая камедь или желатин; вспомогательные средства, такие как крахмал, лактоза или декстрины, дезинтегрирующие средства, такие как альгиновая кислота, альгинат натрия, примогель, кукурузный крахмал и т.п.; лубриканты, такие как стеарат магния или Sterotex; скользящие средства, такие как коллоидный диоксид кремния; подсластители, такие как сахароза или сахарин; ароматизатор, такой как перечная мята, метилсалицилат или апельсиновый ароматизатор; и краситель. Если фармацевтическая композиция имеет форму капсулы, например, желатиновой капсулы, то она может содержать, помимо материалов вышеуказанного типа, жидкий носитель, такой как полиэтиленгликоль или масло.

Фармацевтическая композиция может иметь форму жидкости, например, эликсира, сиропа, раствора, эмульсии или суспензии. Жидкость может быть для перорального введения или для доставки путем инъекции, в качестве двух примеров. Если предназначена для перорального введения, предпочтительная композиция содержит, помимо соединений в соответствии с настоящим изобретением, один или несколько из подсластителя, консервантов, красителя/пигмента и усилителя вкуса. В композицию, предназначенную для введения путем инъекции, могут быть включены одно или несколько из поверхностно-активного средства, консерванта, смачивающего средства, диспергирующего средства, суспендирующего средства, буфера, стабилизатора и изотонического средства.

Жидкие фармацевтические композиции, будь то растворы, суспензии или другие подобные формы, могут включать в себя одно или несколько из следующих вспомогательных веществ: стерильные разбавители, такие как вода для инъекций, солевой раствор, предпочтительно физиологический раствор, раствор Рингера, изотонический хлорид натрия, нелетучие масла, такие как синтетические моно- или диглицериды, которые могут служить растворителем или суспендирующей средой, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие растворители; антибактериальные средства, такие как бензиловый спирт или метилпарабен; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие средства, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и средства для регулирования тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. Препарат для парентерального введения может быть заключен в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы для многократных доз из стекла или пластика. Предпочтительным вспомогательным веществом является физиологический раствор. Фармацевтическая композиция для инъекций предпочтительно является стерильной.

Жидкая фармацевтическая композиция, предназначенная для парентерального или перорального введения, должна содержать определенное количество антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или конъюгата антитела, раскрываемых в настоящем документе, чтобы можно было получить подходящую дозировку. Как правило, это количество составляет по меньшей мере 0,01% антитела или антигенсвязывающего фрагмента в композиции. При назначении для перорального введения это количество может варьировать от 0,1 до приблизительно 70% по массе композиции. Некоторые пероральные фармацевтические композиции содержат от приблизительно 4% до приблизительно 75% антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или конъюгата антитела. Согласно определенным вариантам осуществления фармацевтические композиции и препараты в соответствии с настоящим изобретением готовят таким образом, чтобы парентеральная дозированная единица содержала от 0,01 до 10% по массе антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или конъюгата антитела до разведения.

Фармацевтическая композиция может быть предназначена для местного применения, и в этом случае носитель может подходящим образом включать в себя раствор, эмульсию, мазь или гелевую основу. Основа, например, может включать в себя одно или несколько из следующих: петролатум, ланолин, полиэтиленгликоли, пчелиный воск, минеральное масло, разбавители, такие как вода и спирт, а также эмульгаторы и стабилизаторы. Загустители могут присутствовать в фармацевтической композиции для местного применения. Если композиция предназначена для чрескожного введения, она может включать в себя чрескожный пластырь или устройство для ионтофореза. Фармацевтическая композиция может быть предназначена для ректального введения, например, в форме суппозитория, который плавится в прямой кишке и высвобождает лекарственное средство. Композиция для ректального введения может содержать масляную основу в качестве подходящего невызывающего раздражения вспомогательного средства. Такие основы включают в себя без ограничения ланолин, масло какао и полиэтиленгликоль.

Фармацевтическая композиция может включать в себя различные материалы, которые модифицируют физическую форму твердой или жидкой дозированной единицы. Например, композиция может включать в себя материалы, которые образуют оболочку покрытия вокруг активных ингредиентов. Материалы, которые образуют оболочку покрытия, обычно инертны и могут быть выбраны, например, из сахара, шеллака и других энтеросолюбильных покрытий. В качестве альтернативы, активные ингредиенты могут быть заключены в желатиновую капсулу. Фармацевтическая композиция в твердой или жидкой форме может включать в себя средство, которое связывается с антителом, его антигенсвязывающим фрагментом или конъюгатом антитела в соответствии с настоящим изобретением и тем самым способствует доставке соединения. Подходящие средства, которые могут действовать в этом качестве, включают в себя моноклональные или поликлональные антитела, один или несколько белков или липосому. Фармацевтическая композиция может состоять, по сути, из дозированных единиц, которые можно вводить в виде аэрозоля. Термин «аэрозоль» используется для обозначения множества систем от систем коллоидной природы до систем, состоящих из герметизированных упаковок. Доставка может осуществляться сжиженным или сжатым газом или с помощью подходящей насосной системы, которая дозирует активные ингредиенты. Аэрозоли могут доставляться в однофазных, двухфазных или трехфазных системах для доставки активного(ых) ингредиента(ов). Доставка аэрозоля включает в себя необходимый контейнер, активаторы, клапаны, субконтейнеры и т.п., которые вместе могут составлять набор. Рядовой специалист в данной области без излишнего экспериментирования может определить предпочтительные аэрозоли.

Фармацевтические композиции можно приготовить по методу, хорошо известному в области фармацевтики. Например, фармацевтическая композиция, предназначенная для введения путем инъекции, может быть приготовлена путем объединения композиции, которая содержит антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела, описываемые в настоящем документе, и необязательно одного или нескольких из солей, буферов и/или стабилизаторов со стерильной дистиллированной водой с образованием тем самым раствора. Поверхностно-активное средство может быть добавлено для облегчения составления гомогенного раствора или суспензии. Поверхностно-активные средства представляют собой соединения, которые нековалентно взаимодействуют с пептидной композицией, чтобы способствовать растворению или гомогенной суспензии антитела, его антигенсвязывающего фрагмента или конъюгата антитела в водной системе доставки.

Композиции вводят в терапевтически эффективном количестве, которое будет варьировать в зависимости от ряда факторов, включающих в себя активность определенного используемого соединения; метаболическую стабильность и продолжительность действия соединения; возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и рацион больного; способ и время введения; скорость выведения; комбинацию лекарственного средства; тяжесть конкретного нарушения или состояния и терапию, которую проходит субъект.Как правило, терапевтически эффективная суточная доза составляет (для млекопитающего массой 70 кг) от приблизительно 0,001 мг/кг (т.е. 0,07 мг) до приблизительно 100 мг/кг (т.е. 7,0 г); предпочтительно терапевтически эффективная доза составляет (для млекопитающего массой 70 кг) от приблизительно 0,01 мг/кг (т.е. 0,7 мг) до приблизительно 50 мг/кг (т.е. 3,5 г); более предпочтительно терапевтически эффективная доза составляет (для млекопитающего массой 70 кг) от приблизительно 1 мг/кг (т.е. 70 мг) до приблизительно 25 мг/кг (т.е. 1,75 г).

Композиции, включающие в себя антитела, их антигенсвязывающие фрагменты или конъюгаты антитела в соответствии с настоящим изобретением, также могут быть введены одновременно, до или после введения одного или нескольких других терапевтических средств. Такая комбинированная терапия может предусматривать введение однократного фармацевтического дозированного состава, который содержит соединение в соответствии с настоящим изобретением и одно или несколько дополнительных активных средств, а также введение композиций, включающих в себя антитела, их антигенсвязывающие фрагменты или конъюгаты антител в соответствии с настоящим изобретением, и каждое активное средство в его собственном отдельном фармацевтическом дозированном составе. Например, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела, описываемые в настоящем документе, и другое активное средство могут быть введены больному вместе в одной пероральной дозированной композиции, такой как таблетка или капсула, или каждое средство вводится в отдельных пероральных дозированных составах. Подобным образом, антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела, описываемые в настоящем документе, и другое активное средство могут быть введены больному вместе в одной парентеральной дозированной композиции, например, в солевом растворе или другом физиологически приемлемом растворе, или каждое средство вводят в отдельных парентеральных дозированных составах. При применении отдельных дозированных составов композиции, включающие в себя антитела и одно или несколько дополнительных активных средств, могут быть введены практически в одно и то же время, т.е. одновременно, или в отдельные моменты времени, т.е. последовательно и в любом порядке; предусматривается, что комбинированная терапия включает в себя все эти режимы.

Таким образом, согласно определенным вариантам осуществления также охватывается введение антител, их антигенсвязывающих фрагментов или конъюгатов антител в соответствии с настоящим раскрытием в комбинации с одним или несколькими другими терапевтическими средствами. Такие терапевтические средства могут быть приняты в данной области в качестве стандартного лечения конкретного состояния заболевания, описываемого в настоящем документе, такого как рак. Предполагаемые иллюстративные терапевтические средства включают в себя цитокины, факторы роста, стероиды, NSAID, DMARD, противовоспалительные средства, химиотерапевтические средства, ингибиторы иммунных контрольных точек, интерферирующие РНК, агонисты стимулирующей иммунную контрольную точку молекулы, другое антитело, антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела, нацеленные на рак, или другие активные и вспомогательные средства.

Используемый в настоящем документе термин «средство супрессии иммунного ответа» или «иммуносупрессивное средство» относится к одной или нескольким клеткам, белкам, молекулам, соединениям или комплексам, обеспечивающим ингибиторные сигналы для помощи в контроле или подавлении иммунного ответа. Например, средства супрессии иммунного ответа включают в себя те молекулы, которые частично или полностью блокируют иммунную стимуляцию; уменьшают, предупреждают или откладывают активацию иммунной системы или усиливают, активируют или регулируют супрессию иммунного ответа. Иллюстративные иммуносупрессивные средства для нацеливания (например, с ингибитором контрольной точки иммунного ответа) включают в себя PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG3, CTLA4, В7-Н3, В7-Н4, CD244/2B4, HVEM, BTLA, CD160, TIM3, GAL9, KIR, PVR1G (CD112R), PVRL2, аденозин, A2aR, иммуносупрессивные цитокины (например, IL-10, IL-4, IL-1RA, IL-35), IDO, аргиназу, VISTA, TIGIT, LAIR1, СЕАСАМ-1, СЕАСАМ-3, СЕАСАМ-5, Treg-клетки или любую их комбинацию.

Ингибиторное средство супрессии иммунного ответа (также называемое ингибитором контрольной точки иммунного ответа) может представлять собой соединение, антитело, фрагмент антитела или полипептид слияния (например, слияние Fc, такое как CTLA4-Fc или LAG3-Fc), антисмысловую молекулу, рибозим или молекулу RNAi, или низкомолекулярную органическую молекула. Согласно любому из вариантов осуществления, раскрываемых в настоящем документе, способ может предусматривать введение антитела, антигенсвязывающего фрагмента или конъюгата антитела в соответствии с настоящим раскрытием с одним или несколькими ингибиторами любого из следующих компонентов супрессии иммунного ответа, отдельно или в любой комбинации.

Согласно определенным вариантам осуществления антитело, антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела в соответствии с настоящим раскрытием применяют в комбинации с ингибитором PD-1, например, специфическим в отношении PD-1 антителом, таким как пидилизумаб, ниволумаб, пембролизумаб, MEDI0680 (ранее АМР-514), АМР-224, BMS-936558 или их антигенсвязывающий фрагмент, или любая их комбинация. Согласно следующим вариантам осуществления антитело, антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела в соответствии с настоящим раскрытием применяют в комбинации со специфическим в отношении PD-L1 антителом, таким как BMS-936559, дурвалумаб (MEDI4736), атезолизумаб (RG7446), авелумаб (MSB0010718C), MPDL3280A или его антигенсвязывающий фрагмент, или любая их комбинация.

Согласно определенным вариантам осуществления антитело, антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела в соответствии с настоящим раскрытием применяют в комбинации с ингибитором LAG3, таким как LAG525, IMP321, IMP701, 9Н12, BMS-986016 или любая их комбинация.

Согласно определенным вариантам осуществления антитело, антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела в соответствии с настоящим раскрытием применяют в комбинации с ингибитором CTLA4. Согласно конкретным вариантам осуществления антитело, антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела в соответствии с настоящим раскрытием применяют в комбинации со специфическим в отношении CTLA4 антителом или его связывающим фрагментом, таким как ипилимумаб, тремелимумаб, белки слияния CTLA4-Ig (например, абатацепт, белатацепт) или любая их комбинация.

Согласно определенным вариантам осуществления антитело, антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела в соответствии с настоящим раскрытием применяют в комбинации со специфическим в отношении В7-Н3 антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, таким как эноблитузумаб (MGA271), 376.96, или с обоими. Связывающий В7-Н4 фрагмент антитела может представлять собой scFv или его белок слияния, как описано, например, в Dangaj et al., Cancer Res. 73:4820, 2013, а также описано в патенте США №9574000 и РСТ публикациях патентных документов №№ WO 2016/40724 А1 и WO 2013/025779 А1.

Согласно определенным вариантам осуществления антитело, антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела в соответствии с настоящим раскрытием применяют в комбинации с ингибитором CD244. Согласно определенным вариантам осуществления антитело, антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела в соответствии с настоящим раскрытием применяют в комбинации с ингибитором BLTA, HVEM, CD160 или любой их комбинацией. Антитела против CD160 описаны, например, в РСТ публикации патентного документа № WO 2010/084158.

Согласно определенным вариантам осуществления антитело, антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела в соответствии с настоящим раскрытием применяют в комбинации с ингибитором TIM3. Согласно определенным вариантам осуществления антитело, антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела в соответствии с настоящим раскрытием применяют в комбинации с ингибитором Gal9.

Согласно определенным вариантам осуществления антитело, антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела в соответствии с настоящим раскрытием применяют в комбинации с ингибитором опосредованной аденозином передачи сигнала, таким как аденозиновый рецептор-ловушка. Согласно определенным вариантам осуществления антитело, антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела в соответствии с настоящим раскрытием применяют в комбинации с ингибитором A2aR.

Согласно определенным вариантам осуществления антитело, антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела в соответствии с настоящим раскрытием применяют в комбинации с ингибитором KIR, таким как лирилумаб (BMS-986015). Согласно определенным вариантам осуществления антитело, антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела в соответствии с настоящим раскрытием применяют в комбинации с ингибитором ингибиторного цитокина (как правило, цитокина, отличного от TGFJ3) или развития или активности Treg.

Согласно определенным вариантам осуществления антитело, антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела в соответствии с настоящим раскрытием применяют в комбинации с ингибитором IDO, таким как лево-1-метилтриптофан, эпакадостат (INCB024360; Liu et al, Blood 7i5:3520-30, 2010), эбселен (Terentis et al, Biochem. 49:591-600, 2010), индоксимод, NLG919 (Mautino et al, American Association for Cancer Research 104th Annual Meeting 2013; Apr 6-10, 2013), 1-метил-триптофан (1-МТ)-тира-пазамин или любая их комбинация.

Согласно определенным вариантам осуществления антитело, антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела в соответствии с настоящим раскрытием применяют в комбинации с ингибитором аргиназы, таким как сложный метиловый эфир N-(омега)-нитро-L-аргинина (L-NAME), N-омега-гидрокси-нор-1-аргинин (nor-NOHA), L-NOHA, 2(S)-амино-6-бороногексановая кислота (АВН), S-(2-бороноэтил)-L-цистеин (ВЕС) или любая их комбинация.

Согласно определенным вариантам осуществления антитело, антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела в соответствии с настоящим раскрытием применяют в комбинации с ингибитором VISTA, таким как СА-170 (Curis, Lexington, Mass.).

Согласно определенным вариантам осуществления антитело, антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела в соответствии с настоящим раскрытием применяют в комбинации с ингибитором TIGIT, таким как, например, СОМ902 (Compugen, Toronto, Ontario Canada), ингибитором CD155, таким как, например, СОМ701 (Compugen), или с обоими.

Согласно определенным вариантам осуществления антитело, антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела в соответствии с настоящим раскрытием применяют в комбинации с ингибитором PVRIG, PVRL2 или с обоими. Антитела против PVRIG описаны, например, в РСТ публикации патентного документа № WO 2016/134333. Антитела против PVRL2 описаны, например, в РСТ публикации патентного документа № WO 2017/021526.

Согласно определенным вариантам осуществления антитело, антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела в соответствии с настоящим раскрытием применяют в комбинации с ингибитором LAIR1.

Согласно определенным вариантам осуществления антитело, антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела в соответствии с настоящим раскрытием применяют в комбинации с ингибитором СЕАСАМ-1, СЕАСАМ-3, СЕАСАМ-5 или любой их комбинацией.

Согласно определенным вариантам осуществления антитело, антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела в соответствии с настоящим раскрытием применяют в комбинации со средством, которое усиливает активность (т.е. является агонистом) стимулирующей контрольную точку иммунного ответа молекулы. Например, антитело, антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела в соответствии с настоящим раскрытием могут быть применены в комбинации с агонистом CD137 (4-1ВВ) (таким как, например, урелумаб), агонистом CD134 (ОХ-40) (таким как, например, MEDI6469, MEDI6383 или MEDI0562), леналидомидом, помалидомидом, агонистом CD27 (таким как, например, CDX-1127), агонистом CD28 (таким как, например, TGN1412, CD80 или CD86), агонистом CD40 (таким как, например, СР-870,893, rhuCD40L или SGN-40), агонистом CD122 (таким как, например, IL-2), агонистом GITR (таким как, например, гуманизированные моноклональные антитела, описанные в РСТ публикации патентного документа № WO 2016/054638), агонистом ICOS (CD278) (таким как, например, GSK3359609, mAb 88,2, JTX-2011, Icos 145-1, Icos 314-8 или любая их комбинация). Согласно любому из вариантов осуществления, раскрываемых в настоящем документе, способ может предусматривать введение антитела, антигенсвязывающего фрагмента или конъюгата антитела в соответствии с настоящим раскрытием с одним или несколькими агонистами стимулирующей контрольную точку иммунного ответа молекулы, включающими в себя любые из вышеупомянутых, отдельно или в любой комбинации.

Согласно определенным вариантам осуществления комбинированная терапия включает в себя антитело, антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела в соответствии с настоящим раскрытием и вторичную терапию, включающую в себя одно или несколько из следующих: другое антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела, которые являются специфическими в отношении ракового антигена, экспрессируемого при раке (т.е. одного и того же или другого антигена), радиационное лечение, хирургическое вмешательство, химиотерапевтическое средство, цитокин, RNAi или любая их комбинация.

Согласно определенным вариантам осуществления способ комбинированной терапии предусматривает введение антитела, антигенсвязывающего фрагмента или конъюгата антитела в соответствии с настоящим раскрытием и дополнительное применение радиационного лечения или хирургического вмешательства. Радиационная терапия хорошо известна в уровне техники и включает в себя рентгеновские терапевтические средства, такие как гамма-облучение и радиофармацевтические терапевтические средства. Хирургические вмешательства и хирургические методики, подходящие для лечения данного ракового заболевания у субъекта, хорошо известны специалистам в данной области. Обзор протонной терапии приведен в Thariat et al, Bull. Cancer pii:S0007-4551(1)300001-8 (2018).

Согласно определенным вариантам осуществления способ комбинированной терапии предусматривает введение антитела, антигенсвязывающего фрагмента или конъюгата антитела в соответствии с настоящим раскрытием и дополнительное введение химиотерапевтического средства. Химиотерапевтическое средство включает в себя без ограничения ингибитор функции хроматина, ингибитор топоизомеразы, лекарственное средство, ингибирующее микротрубочки, средство, повреждающее ДНК, антиметаболическое средство (такое как антагонисты фолиевой кислоты, аналоги пиримидина, аналоги пурина и аналоги с модифицированным сахаром), ингибитор синтеза ДНК, взаимодействующее с ДНК средство (такое как интеркалирующее средство) и ингибитор репарации ДНК. Иллюстративные химиотерапевтические средства включают в себя без ограничения следующие группы: антиметаболические средства/противораковые средства, такие как аналоги пиримидина (5-фторурацил, флоксуридин, капецитабин, гемцитабин и цитарабин) и аналоги пурина, антагонисты фолиевой кислоты и родственные ингибиторы (меркаптопурин, тиогуанин, пентостатин и 2-хлордезоксиаденозин (кладрибин); антипролиферативные/антимитотические средства, включающие в себя натуральные продукты, такие как алкалоиды барвинка (винбластин, винкристин и винорелбин), разрушители микротрубочек, такие как таксан (паклитаксел, доцетаксел), винкристин, винбластин, нокодазол, эпотилоны, навельбин, эпидиподофиллотоксины (этопозид, тенипозид), средства, повреждающие ДНК (актиномицин, амсакрин, антрациклины, блеомицин, бусульфан, камптотецин, карбоплатин, хлорамбуцил, цисплатин, циклофосфамид, цитоксан, дактиномицин, даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, гексаметилмеламинооксалиплатин, ифосфамид, мелфалан, мерхлорэтамин, митомицин, митоксантрон, нитрозомочевина, пликамицин, прокарбазин, таксол, таксотер, темозоламид, тенипозинд, триэтилентиофосфорамид и этопозин (VP 16)); антибиотики, такие как дактиномицин (актиномицин D), даунорубицин, доксорубицин (адриамицин), идарубицин, антрациклины, митоксантрон, блеомицины, пликамицин (митрамицин) и митомицин; ферменты (L-аспарагиназа, которая системно метаболизирует L-аспарагин и депривирует клетки, не способные синтезировать собственный аспарагин); антитромбоцитарные средства; антипролиферативные/антимитотические алкилирующие средства, такие как азотистые иприты (мехлорэтамин, циклофосфамид и его аналоги, мелфалан, хлорамбуцил), этиленимины и метилмеламины (гексаметилмеламин и тиотепа), алкилсульфонаты - бусульфан, нитрозомочевины (кармустин (BCNU) и его аналоги, стрептозоцин) тразены - дакарбазин (DTIC); антипролиферативные/антимитотические антиметаболическоие средства, такие как аналоги фолиевой кислоты (метотрексат); координационные комплексы платины (цисплатин, карбоплатин), прокарбазин, гидроксимочевина, митотан, аминоглутетимид; гормоны, аналоги гормонов (эстроген, тамоксифен, гозерелин, бикалутамид, нилутамид) и ингибиторы ароматазы (летрозол, анастрозол); антикоагулянты (гепарин, синтетические соли гепарина и другие ингибиторы тромбина); фибринолитические средства (такие как тканевой активатор плазминогена, стрептокиназа и урокиназа), аспирин, дипиридамол, тиклопидин, клопидогрель, абциксимаб; антимиграционные средства; антисекреторные средства (бревелдин); иммунодепрессанты (циклоспорин, такролимус (FK-506), сиролимус (рапамицин), азатиоприн, микофенолятмофетил); антиангиогенные соединения (TNP470, генистеин) и ингибиторы фактора роста (ингибиторы фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), ингибиторы фактора роста фибробластов (FGF)); блокатор рецепторов ангиотензина; доноры оксида азота; антисмысловые олиго нуклеотиды; антитела (трастузумаб, ритуксимаб); химерные антигенные рецепторы; ингибиторы клеточного цикла и индукторы дифференцировки (третиноин); ингибиторы mTOR, ингибиторы топоизомеразы (доксорубицин (адриамицин), амсакрин, камптотецин, даунорубицин, дактиномицин, энипозид, эпирубицин, этопозид, идарубицин, иринотекан (СРТ-11) и митоксантрон, топотекан, иринотекан), кортикостероиды (кортизон дексаметазон, гидрокортизон, метилпреднизолон, преднизон и пренизолон); ингибиторы киназы передачи сигнала фактора роста; индукторы митохондриальной дисфункции, токсины, такие как токсин холеры, рицин, экзотоксин Pseudomonas, токсин аденилатциклазы Bordetella pertussis или токсин дифтерии и активаторы каспазы; а также разрушители хроматина.

Цитокины можно использовать для управления иммунным ответом хозяина в отношении противораковой активности. См., например, Floros & Tarhini, Semin. Oncol. 42(4):539-548, 2015. Цитокины, применимые для стимуляции иммунного противоракового или противоопухолевого ответа, включают в себя, например, IFN-α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-10, IL-12, IL. -13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21, IL-24 и GM-CSF, отдельно или в любой комбинации с антителом, антигенсвязывающим фрагментом или конъюгатом антитела в соответствии с настоящим раскрытием.

Клеточные иммунотерапевтические средства, в том числе с участием Т-клеток, NK-клеток или NK-T-клеток, экспрессирующих природные или рекомбинантные TCR и CAR, специфические в отношении раковых антигенов и включающие в себя адоптивный перенос таких клеток реципиенту, представляют собой новый терапевтический методом лечения рака (см. например, Bonini and Mondino, Eur. J. Immunol. 45(9):2457-69 (2015), и Metha and Rezvani, Front. Immunol. 9:283 (2018)). Согласно определенным вариантам осуществления субъект, получающий антитело, антигенсвязывающий фрагмент или конъюгат антитела (или фармацевтическую композицию) в соответствии с настоящим раскрытием, получал или получает (т.е. одновременно, параллельно или последовательно) клеточную иммунотерапию, направленную на рак.

Также в настоящем документе представлены любые из раскрываемых в настоящем документе антител, антигенсвязывающих фрагментов, конъюгатов антител, полинуклеотидов, векторов, клеток-хозяев и композиций для применения в лечении, выявлении или диагностике заболевания, характеризующегося экспрессией (например, надэкспрессией) антигена Льюиса, описываемого в настоящем документе. Согласно определенным вариантам осуществления заболевание представляет собой рак, такой как любой рак, раскрываемый в настоящем документе. Согласно определенным вариантам осуществления антитело, антигенсвязывающий фрагмент, конъюгат антитела или композиция применяют в любой комбинированной терапии, описываемой в настоящем документе.

Также в настоящем документе представлены любые из раскрываемых в настоящем документе антител, антигенсвязывающих фрагментов, конъюгатов антител, полинуклеотидов, векторов, клеток-хозяев и композиций для применения в получении медикамента для лечения заболевания, характеризующегося экспрессией (например, надэкспрессией) антигена Льюиса, как описывается в настоящем документе. Согласно определенным вариантам осуществления заболевание представляет собой рак, такой как любой рак, раскрываемый в настоящем документе. Согласно определенным вариантам осуществления медикамент включает в себя любую комбинированную терапию или используется в любой комбинированной терапии, описываемой в настоящем документе.

Используемые в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают в себя упоминаемые объекты во множественном числе, если содержание явно не предписывает иное. Кроме того, использование альтернативы (например, «или») следует понимать как означающее одну, обе или любую комбинацию из этих альтернатив.

По всему настоящему описанию, если контекст не требует иного, слова «включать в себя», «иметь» или варианты, такие как «имеет», «имеющий», «включает в себя» или «включающий в себя», следует понимать как подразумевающие включение заявляемого элемента, или целого числа, или группы элементов или целых чисел, но не исключение любого другого элемента, или целого числа, или группы элементов или целых чисел. В настоящем описании любой диапазон концентраций, процентный диапазон, диапазон отношений или диапазон целых чисел следует понимать как включающий в себя значение любого целого числа в указанном диапазоне и, при необходимости, его доли (например, одна десятая и одна сотая от целого числа), если не указано иное. Кроме того, следует понимать, что любой числовой диапазон, указанный в настоящем документе, относящийся к любой физической характеристике, такой как полимерные субъединицы, размер или толщина, включает в себя любое целое число в указанном диапазоне, если не указано иное.

Используемый в настоящем документе термин «приблизительно» означает ± не более чем 20% указанного диапазона, значения или структуры, если не указано иное, или согласно определенным вариантам осуществления ± не более чем 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 10, 9, 8, 7, 6 или 5% указанного диапазона, значения или структуры, если не указано иное.

Кроме того, следует понимать, что отдельные соединения или группы соединений, полученные из различных комбинаций описываемых в настоящем документе структур и заместителей, раскрываются в настоящей заявке в той же степени, как если бы каждое соединение или группа соединений были изложены индивидуально. Таким образом, выбор конкретных структур или конкретных заместителей находится в пределах объема настоящего раскрытия.

Термин «состоящий, по сути, из» не эквивалентен термину «включающий в себя» и относится к указанным материалам или стадиям в формуле изобретения или к тем, которые не влияют существенно на основные характеристики заявленного предмета изобретения.

Каждый вариант осуществления в настоящем описании должен применяться с соответствующими изменениями к каждому другому варианту осуществления, если специально не указано иное.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Создание химерного антитела ВВС

Выделение кДНК вариабельной области антитела

Гибридомные клетки, экспрессирующие мышиное антитело IMH2/BBC, которое включает в себя домен V_L, имеющий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 27, и домен V_H, имеющий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 28, получали от Dr. S. Hakomori (Cancer Research 52:3739-3745 (1992)). Для получения РНК для синтеза кДНК сначала собирали 9×10⁶ гибридомных клеток с помощью низкоскоростного центрифугирования (300 g в течение 5 минут) с последующим выделением РНК с использованием «Total RNA Miniprep Purification Kit»™ (GeneMark™, GMbiolab Co. Ltd., Taichung City, Taiwan, ROC) в соответствии с протоколом изготовителя. Затем гены антител, кодирующие IMH2, клонировали из очищенной РНК с использованием SMART RACE cDNA Amplification Kit™ (Takara/BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA) с незначительными модификациями относительно рекомендованного изготовителем протокола.

Вкратце, после синтеза первой нити кДНК и dC-хвоста кДНК, специфически кодирующую вариабельные области легкой цепи IMH2, выделяли двумя циклами ПЦР с использованием прилагаемых в набору праймеров и специфических праймеров, разработанных на основе известной мышиной последовательности каппа-цепи в константной области. Первую ПЦР выполняли за 5 циклов по 30 секунд при 94°С и 1 минуту при 72°С; с последующими 5 циклами по 30 секунд при 94°С, 30 секунд при 67°С и 1 минуту при 72°С. Добавляли двадцать семь (27) дополнительных циклов реакции ПЦР, включающих в себя 30 секунд при 94°С, 30 секунд при 62°С и 1 минуту при 72°С для гарантии успешной амплификации. Затем осуществляли вторую вложенную ПЦР, предусматривающую стадию предварительного нагревания при 94°С в течение 5 минут, с последующими 35 циклами по 30 секунд при 94°С, 30 секунд при 54°С и 1 минуту при 72°С и конечную стадию удлинения при 72°С в течение 3 минут, для дальнейшего улучшения точности.

Стратегия клонирования для гена тяжелой цепи слегка отличалась. Сначала получали матрицу однонитевой кДНК, применяемую для реакции ПЦР, из РНК с мышиным IgGS-специфическим праймером в отношении константного домена 1 (С_Н1). Затем выполняли выделение гена с помощью одного цикла ПЦР следующим образом: предварительное нагревание при 94°С в течение 5 минут, 35 циклов реакции ПЦР, включающие в себя 30 секунд при 94°С, 30 секунд при 62°С, 1 минуту при 72°С, с последующей конечной стадией удлинения при 72°С в течение 5 минут в присутствии праймера NUP (SMART™ RACE Amplification Kit, Clontech, Palo Alto, CA) и вложенного праймера для мышиного домена С_Н1. Затем кДНК, кодирующую вариабельную область фрагментов и легкой, и тяжелой цепей, очищали с использованием набора для очистки при ПЦР (GeneMark™ GMbiolab Co. Ltd., ROC) и вводили в клонирующий вектор уТ&А (Yeastern Biotech™, Taipei, Taiwan, ROC) для идентификации положительного клона и определения последовательности.

Конструирование плазмид экспрессии антител

Для построения плазмид экспрессии с целью получения антитела, называемого в настоящем документе антителом «ВВС», использовали ПЦР праймеры и гены антител, клонированные в вектор уТ&А, описываемый выше, для получения только кДНК, кодирующих зрелые (без лидерного пептида) вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи. ПЦР выполняли следующим образом: предварительное нагревание при 94°С в течение 5 минут, 35 циклов реакции ПЦР, включающих в себя 30 секунд при 94°С, 30 секунд при 65°С и 60 секунд при 72°С, и конечная стадия удлинения при 72°С в течение 3 минут.Последовательности распознавания фермента рестрикции встраивали в ходе реакции ПЦР на 5'- (NheI) и 3'- (ApaI) концах кДНК V_H и на 5'- (NheI) и 3'- (BsiWI) концах кДНК V_L для облегчения последующего конструирования плазмид экспрессии. Амплифицированные фрагменты кДНК затем последовательно расщепляли ферментами рестрикции ApaI/NheI для генов тяжелой цепи и NheI/BsiWI для генов легкой цепи. После гелевой очистки извлеченную кДНК V_H и V_L лигировали с вектором pGNX-RhcG1 (V_H) или pGNX-Rhck (V_L) по одним и тем же сайтам клонирования фермента рестрикции с получением векторов экспрессии pGNX-RhcG1-BBC и pGNX-Rhck-BBC, соответственно. Вставленные последовательности кДНК подтверждали с использованием праймера в 3'-5'-направлении сайта множественного клонирования.

Транзиентное продуцирование антитела

Для транзиентного продуцирования химерного антитела ВВС клетки HEK293-с18 совместно трансфицировали кодирующими тяжелую и легкую цепи плазмидами экспрессии pGNX-RhcG1-BBC и pGNX-Rhck-BBC в присутствии полиэтиленимина. Культуральную надосадочную жидкость собирали в конце дня 7 после трансфекции для анализа.

Пример 2

Создание гуманизированных антител ВВС

Для получения гуманизированных форм антитела ВВС (описываемого выше в примере 1) отбирали гомологичные последовательности человеческого антитела (человеческого акцептора) для выполнения трансплантации CDR. Вкратце, потенциальные человеческие акцепторные последовательности идентифицировали путем поиска в базе данных белков NCBI для обнаружения последовательностей, проявляющих наивысшую гомологию с вариабельными областями тяжелой (SEQ ID NO: 28) и легкой (SEQ ID NO: 27) цепей антитела ВВС. Выбирали человеческие акцепторные каркасы CAD89404.1 (V_H) и AAS01771.1 (VI) (фиг.1). Однако прямая вставка отличных от человеческих последовательностей CDR в человеческие акцепторные каркасы может привести к потере аффинности связывания. Аффинность связывания может быть восстановлена после переноса остатков каркаса с человеческого акцептора обратно на отличную от человеческой донорную последовательность. Предпочтительные обратные мутации восстанавливают аффинность связывания за счет сохранения исходных конформаций CDR.

Для восстановления аффинности связывания после трансплантации CDR сначала строили 3-D модель антитела на основе данных о кристаллической структуре ВВС с использованием программного обеспечения Accelrys Discovery Studio™ (BIOVIA, San Diego, CA). Затем предсказывали критические аминокислоты для обратной мутации путем исследования структуры следующим образом.

1. Рассчитывали энергию мутации (для стабильности) измененных остатков на гуманизированном каркасе. Положительные значения энергии мутации соответствовали дестабилизирующему действию мутации и наоборот.

2. Исследовали пространственные расстояния между остатками каркаса и областями CDR. Учитывали остатки, ближайшие к CDR (в пределах 4 Å).

3. Исследовали остатки, расположенные на границе вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи. Эти остатки способствовали сборке тяжелой цепи и легкой цепи и, следовательно, могли оказывать значительное влияние на структуру антитела.

Десять (10) имеющих влияние положений (3 в легкой цепи и 7 в тяжелой цепи) на основании прогностических критериев первоначально отбирали для обратной мутации. Кроме того, остаток метионина (М) в положении 70 (согласно нумерации по Kabat) выбранной матрицы тяжелой цепи человека оказался нечастым мотивом и, следовательно, был заменен на высоко консервативный изолейцин (I) в этом сайте (фиг.1; обратно мутировавшие остатки (человеческий акцептор → hBBC.8) подчеркнуты в приведенной ниже таблице 3; остаток Met → Ile показан подчеркнутым жирным курсивом в таблице 3 и заключен в рамку на фиг.1). Эти превращения аминокислот дали гуманизированное антитело "hBBC.8".

Вводили дополнительные изменения для дальнейшего улучшения антитела. Во-первых, два положения в легкой цепи hBBC.8 (R66 и F71), которые варьируют среди последовательностей мыши и человека, были мутированы с получением «hBBC.9» (содержащего мутацию F71Y) и «hBBC.10» (содержащего мутации F71Y и R66G) (фиг.2 А; остатки выделены жирным шрифтом и курсивом, без подчеркивания, в таблице 3). Связывание ВВС и созданных гуманизированных вариантов hBBC.9 и hBBC. 10 с клетками AGS показано на фиг.2 В. Вкратце, клеточную линию рака желудка человека AGS (АТСС CRL-1739; АТСС, Manassas, VA) регулярно поддерживали в среде F12 и добавляли 10% диализованной эмбриональной телячьей сыворотки. Для проведения исследований клеточного связывания приблизительно 3×10⁵ клеток в 100 мкл PBS смешивали с равным объемом разбавленных антител. После 1 часа инкубации при комнатной температуре к каждому образцу добавляли 2 мл PBS для смывания несвязанного антитела. После центрифугирования извлеченный клеточный осадок повторно суспендировали непосредственно в 200 мкл антитела козы против IgG человека (FITC)-AffiniPure™, специфического в отношении Fcy-фрагмента (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, № по каталогу 109-095-098), разбавленного 1:200 с помощью PBS. После инкубации при комнатной температуре в течение 30 минут промывку PBS повторяли для удаления несвязанного вторичного антитела. Собранные клетки повторно суспендировали в 200 мкл PBS и анализировали в системе проточного цитометра BD FACSCanto™ (BD Biosciences, San Jose, CA). Выполняли дальнейший анализ для выявления потенциально иммуногенных последовательностей.

Дополнительные мутации в тяжелой или легкой цепи давали дополнительные варианты «hBBC.9.1» и «hBBC.10.1» (остатки выделены жирным шрифтом и подчеркнуты, без курсива в приведенной ниже таблице 3). В частности, анализировали кристаллические структуры антител ВВС и hBBC.8, а также смоделированные комплексы антиген/антитело. Несколько остатков в областях CDR легкой и тяжелой цепей (положения, указанные в соответствии с нумерацией по Kabat) идентифицировали для замены аминокислот в одном сайте. Аминокислотное переключение в обозначенном(ых) положении(ях) гена легкой или тяжелой цепи антитела выполняли с помощью двух циклов реакции ПЦР со специально разработанными праймерами. Для облегчения вставки фрагментов кДНК мутированных антител в векторы экспрессии включали сайт рестрикции на каждом конце (5' NheI и 3' ApaI для цепи кДНК, 5' NheI и 3' BsiWI для кДНК легкой цепи) во время реакции ПЦР.

Фрагменты ДНК получали после второй реакции ПЦР, разрезали с помощью NheI/ApaI или NheI/BsiWI и лигировали с теми же сайтами векторов pGNX-RhcG1 и pGNX-Rhck для конструирования гена тяжелой цепи и легкой цепи, соответственно. Мутировавшие сайты и изменения показаны в таблице 1.

Ряд мутантов демонстрировал активность связывания in vitro, равную или превышающую 1/2 активности химерного антитела (ВВС) в анализе связывания с клетками AGS (фиг.2С, см. также таблицу 2). Кроме того, некоторые мутанты также демонстрировали улучшение специфичности за счет снижения перекрестной реактивности с одновалентной структурой Льюиса В (равной или меньшей 1/8 силы по сравнению с ВВС) в анализе ELISA, как показано в таблице 2. Одновалентная структура Льюиса В представляет собой антиген группы крови, который экспрессируется в нормальных тканях человека.

Поскольку hBBC.8 показывал приблизительно 1/3 активности связывания с клетками AGS по сравнению с ВВС (фиг.2В) и демонстрировал очень хорошее ингибирование опухоли на мышиной модели ксенотрансплантата (см. пример 6), эти мутанты антител с заменой одной аминокислоты имеют потенциал для проявления противоопухолевой активности. Положения и аминокислотные замены этих проанализированных клонов кратко описаны в таблице 1. Для дальнейшего подтверждения их способности улучшать аффинность и/или специфичность отбирали всего семь (7) сайтов одиночных мутаций (таблица 2) для оценки в матрице гуманизированного антитела. Они включали в себя пять замен с одним остатком (три в легкой цепи и две в тяжелой цепи), которые тестировали на предмет их влияния на связывание антител с клетками AGS (фиг.2С), две замены с одним остатком в тяжелой цепи, которые тестировали на предмет их влияния на специфичность связывания антител с клетками AGS по сравнению с очищенным Le^B, и две замены двух остатков тяжелой цепи, которые анализировали аналогичным образом (фиг.2D).

Дальнейшее сравнение различных гуманизированных версий ВВС, сконструированных с исходной химерной формой, с точки зрения аффинности (анализ связывания с клетками AGS) и специфичности (анализ ELISA Льюиса В) показано на фиг 2Е.

Анализ эпибазы hBBC.9 (Applied Protein Services, Lonza Biologies, Cambridge, UK) предсказал область в области тяжелой цепи с высоким риском иммуногенности. Чтобы минимизировать потенциальную проблему иммуногенности, включали 6 дополнительных аминокислотных изменений в каркасной области 3 тяжелой цепи (положения 78, 80, 82-84 и 86) для соответствия эталонным гуманизированным антителам в этих локализациях (фиг.3). Эти преобразования давали каркас тяжелой цепи для «hBBC.10.1FQ». Аминокислотные последовательности различных вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, рассматриваемые в данном примере, кратко описаны в таблице 3.

Пример 3

Характеристика эпитопа hBBC

ВВС и описываемые в настоящем документе варианты разрабатывали как моноклональные антитела, связывающие гликаны. На основании опубликованных данных о специфичности исходного антитела IMH2 (ВВС) (Ito et al, Cancer Res. 52: 3739, 1992) была выдвинута гипотеза, что целевой эпитоп созданных антител ВВС связан с антигенами Le^B и Le^Y. Следующие исследования характеристик эпитопа проводили с использованием hBBC.10.1, также называемого в следующих примерах и упоминаемых графических материалах «hBBC».

Иммуноочистка

Гликаны, полученные из GSL, из линии колоректального рака Colo-205 выделяли и очищали иммуноочисткой с использованием ВВС. Гликаны в несвязанных и элюированных фракциях пер метилировали и профилировали с помощью анализа MALDI-MS, как показано на фиг.4А и 4В. Профиль гликанов несвязанной фракции был подобен входному профилю гликанов, что указывает на то, что большинство полученных из GSL гликанов из COLO 205, не связываются с ВВС. Однако в элюированной (связанной ВВС) фракции гликан Fuc4(LacNAc)3Lac очищали исключительно с помощью ВВС. В частности, неожиданно обнаружили, что очищенный с помощью hBBC гликан несет биантеннарный Le^B/Y (т.е. Le^B/Le^B, Le^B/Le^Y или Le^Y/Le^Y, на основании наблюдения фрагментов фингерпринтов как Le^B, так и Le^Y в эксперименте MS/MS с I-ветвящимися антигенами, в то время как гликан в несвязанной фракции имел линейную структуру, потенциально Le^B-Le^A-Le^A-Lac. Этот результат показал, что биантеннарный Le^B/Y на антигенах I является эпитопом ВВС.

Этот результат дополнительно подтверждали иммуноочисткой ВВС-связывающих гликанов из полученных из GSL гликанов клеточных линий NCI-N87 и SW1116, которые отбирали для гликолипидной экспрессии биантеннарного Le^B/Y на антигене I. Как и ожидали, ВВС связывался с тетрафукозилированным полученным из GSL гликаном Fuc4(LacNAc)3Lac, а не с моно-, би- и трифукозилированными гликанами (фиг.5А-5В). Посредством секвенирования с помощью MS/MS подтверждали, что ВВС-связывающий гликан GSL NCI-N87 и SW1116 является несущим антиген I биантеннарным Le^B/Y (фиг.6А и 6В).

Помимо Fuc4(LacNAc)3Lac очищали группу полученных из GSL гликанов из NCI-N87 и SW1116, которые отличались множественным фукозилированием (четыре остатка фукозы являются минимальным требованием для связывания ВВС). Два доминирующих ВВС-связывающих гликана GSL NCI-N87 - Fuc4(LacNAc) 4Lac и Fuc6(LacNAc)4→5Lac -секвенировали с использованием MS-MS и определяли как гликаны, несущие антиген I, с би- или триантеннарным Le^Y (фиг.7А и 7В). Кроме того, когда высвободившиеся N-гликаны, происходящие из линии клеток AGS, подвергали иммуноочистке с помощью ВВС, обнаружили, что обогащенные N-гликаны представляют собой структуры с би- или триантеннарным Le^Y (фиг.8А и 8В). Этот результат согласуется с обогащенным антигеном I.

Эти данные показывают, что Le^B/Y является связывающей единицей ВВС.Однако моноантеннарного антигена Льюиса B/Y недостаточно для обеспечения сильного связывания с ВВС.Уникальные антигены I и N-гликаны с полностью концевым фукозилированием обеспечивали поливалентный Le^B/Y, который, как указано, является эпитопом с сильным связыванием ВВС. Сопоставимые исследования иммуноочистки также выполняли на hBBC и показали аналогичную специфичность обогащения гликанов, что и ВВС (данные не показаны), что указывает на то, что hBBC и ВВС имеют подобные эпитопы.

Изотермическая титрационная калориметрия

Изотермическую титрационную калориметрию (ITC) проводили для анализа аффинности связывания между hBBC и рядом линейных гликанов Le^Y-Gal, Le^B-Gal, Le^A-Gal и Le^X-Gal и разветвленных гликанов Le^Y/Le^Y-ASGP, Le^X/Le^X-ASGP, H-ASGP, антигена Le^Y/Le^Y-I и антигена Le^Y/Le^B-I. Антитело BR96 (описанное в патенте США №5491088 А; варианты, описанные в патенте США №5792456 А) предусматривали в качестве контроля. Поскольку гликаны, охарактеризованные в экспериментах по иммуноочистке hBBC, присутствовали в ограниченных количествах, различные гликаны, связанные с Le^B и Le^Y, получали из коммерческого источника (Elycityl SA, Crolles, France) или ферментативно синтезировали собственными силами согласно установленным в данной области методикам (например, Wu et al., 2011 Glycobiology 21(6): 727-733; Becker et al., 2003 Glycobiology 13(7): 41R-53R; de Vries etal., 2001 Glycobiology 11(10): 119R-128R).

Вкратце, для изотермической титрационной калориметрии (ITC) фильтрованный PBS, рН 7,2, готовили своими силами и такую же партию буфера использовали в течение одного цикла инъекции ITC. mAb предварительно заменяли фильтрованным буфером PBS, рН 7,2, с концентрацией белка 50 мкМ. Количество гликанового антигена определяли с помощью высокоэффективного анионного обмена с импульсным амперометрическим детектированием (HPAEC-PAD, например, Rothenhofer et al., 2015 J. Chromatogr. В Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 988: 106) в рамках моносахаридного анализа с галактозой в качестве стандарта расчета. Определенный количественно гликановый антиген растворяли в отфильтрованном PBS, рН 7,2 (та же партия, что и для приготовления раствора mAb), и 60 мкл раствора использовали для каждой инъекции.

Эксперимент ITC проводили на системе MicroCal iTC200 (Malvern Instruments Ltd, Malvern, UK). После загрузки раствора mAb (50 мкМ) в кювету для образца iTC200 температуру системы устанавливали на 25°С. После того, как температура системы достигла 25°С, в шприц набирали раствор гликанового антигена и медленно выпускали в кювету для образца, заполненную mAb. Параметры эксперимента были следующими: количество инъекций: 20; температура кюветы: 25°С; эталонная мощность: 6 мккал/с; начальная задержка: 60 с; концентрация клеток в образце: 50 мкМ; скорость перемешивания: 750 оборотов в минуту при вводе концентрации шприцом с измеренной концентрацией гликанового антигена. Параметры инъекции были следующими: объем инъекции: 2 мкл; продолжительность: 4 с; интервал: 150 с; период наполнения: 5 с; и объем первой инъекции доводили до 1 мкл. При подтверждении всех настроек эксперимент запускали и полученные данные обрабатывали с помощью Origin для iTC200. Кривую титрования подгоняли с помощью модели подгонки One Set of Sites с повторением 100 итераций для получения наилучшего результата подгонки. В результате чего рассчитывали K и K_D.

Графики титрования ITC различных гликановых антигенов с антителом hBBC показаны на фиг.9А, 9В, 10А-10С и 11A-11F. Графики титрования ITC различных гликановых антигенов с антителом BR96 показаны на фиг.12А-12С. Вкратце, анализ ITC показывал, что hBBC обладает более высокой аффинноствю специфического связывания с Le^B -Gal (KD = 26,2 мкМ), чем Le^Y-Gal (KD = 80, 6 мкМ). Ер оме того, hBB С показывал более высокую аффинность связывания с биантеннарными структурами (Le^Y/Le^Y-ASGP, антигеном Le^Y/Le^Y-I и антигеном Le^Y/Le^B-I), чем с о дн оцеп очечными антигенами Le^Y-Gal. Аффинность связывания hBBC cLe^Y/Le^Y-ASGP, антиген ом Le^Y/Le^Y-I и антигеном Le^Y/Le^Y-I оказалась сходной, что указывает на то, что для эпитопов биантеннарного гликана боковые цепи Le^Y и Le^B вносят сравнимый вклад в специфическое связывание. Кроме того, как показано на фиг.11A-F, гликановые антигены, лишенные тетр а фукозили ров энного (ых) фрагмента (ов) LacNAc, в одн оцеп очечной или биантеннарной форме (Le^X-Gal, Le^A-Gal, антиген Н типа I, антиген Н типа II, H-ASGP и Le^X/Le^X-ASGP) не показывали специфического связывания с hBBC. Эти результаты показывают, что тетрафукозилированный LacNAc со связью типа I или II необходим для специфического связывания hBBC. Таким образом, в соответствии с данными иммун о очистки результаты ITC показали, что hBBC связывает эпитоп, который включает в себя структуры, содержащие Le^Y и/или Le^B (таблица 4, гликаны обозначаются следующим образом: незаштрихованные кружочки = Gal, заштрихованные кружочки = Man; заштрихованные квадраты = GlcNac; заштрихованные треугольники = Fuc). Контроль BR96 продемонстрировал подобную чуть более высокую аффинность связывания с одн оцеп очечным Le^Y-Gal по сравнению с биантеннарным антигеном Le^Y/Le^Y-I и биантеннарным антигеном Le^Y/Le^Y-ASGP(фиг.12А-12С), что позволяет предположить, что BR96 не обладает специфической селективностью между одн оцеп очечным и биантеннарным гликанами Le^Y. Таким образом, hBBC обладает уникальной эпитопной специфичностью по сравнению с BR96.

Эти результаты частично характеризуют эпитопы hBBC. Однако взаимодействие между свободно текущим hBBC и иммобилизованными гликанами дает дополнительную информацию об эпитопе; поэтому hBBC тестировали с серией иммобилизованных гликанов в экспериментах с поверхностным плазмонным резонансом (SPR) и ELISA. Покрытые стрептавидином аналитические поверхности и конъюгированные с биотином гликаны (Le^Y-Gal-биотин, Le^B-Gal-биотин, Le^Y/Le^Y - ASGA-биотин и Le^B/Le^B-ASGA-биотин для SPR; Le^Y-Gal-биотин, Le^B-Gal-биотин, Le^Y/Le^Y-ASGA-биотин, Le^B/Le^B-ASGA-биотин, 3-Le^Y/6-Le^B-ASGA-биотин и 3-Le^B/6-Le^Y-ASGA-биотин для ELISA), как показано в таблице 5 (изображения гликанов такие же, как в таблице 4).

Поверхностный плазмонный резонанс

Аффинность связывания hBBC в отношении LeY-Gal-биотин, LeB - Gal-биотин и Le^Y/Le^Y-ASGA-биотин анализировали с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR)Ha чипах, покрытых стрептавидином. Вкратце, Biacore Т100 использовали с буфером HBS-EP+ (GE Healthcare), используемым в качестве подвижного буфера. Биотинилированный гликан разбавляли до 10 пМ и иммобилизовали на сенсорном чипе SA (GE Healthcare) в соответствии со стандартной процедурой. Гликаны иммобилизовали при скорости потока 10 мкл/минута в течение 60 секунд. Буфер hBBC или BR96 заменяли на буфер HBS-EP+ с помощью обессоливающей спин-колонки Zeba (7K MWCO, 0,5 мл, ThermoFisher) и серийно разбавляли до 480, 240, 120, 60 и 30 нМ буфером HBS-EP+. Проводили одноцикловый кинетический анализ. Антитела связывались с гликанами при скорости потока 30 мкл/минута в течение 150 секунд и диссоциировались в течение 300 секунд. Чип регенерировали с помощью 2 М MgCl₂ при скорости потока 50 мкл/минута в течение 120 с секунд. Данные оценивали с помощью программного обеспечения Biacore Т200 Evaluation (GE Healthcare). Для подгонки кривой использовали реакцию с двумя состояниями и получали наиболее подходящие значения ka, kd и K_D (таблица 6). Сенсограммы SPR, показывающие связывание hBBC и BR96 с различными гликановыми антигенами, представлены на фиг.13А и 13В.

SPR показал, что биантеннарный Le^Y/Le^Y-ASGA-биотин проявлял более высокую аффинность в отношении hBBC по сравнению с одноцепочечный Le^Y-Gal-биотин, что соответствовало результату ITC. Кроме того, биантеннарный Le^B/Le^B-ASGA-биотин показывал более высокую аффинность в отношении hBBC по сравнению с одноцепочечный Le^B-Ga1-биотин, что также согласуется с наблюдаемой тенденцией для антигенов Le^Y. hBBC демонстрирует более высокую аффинность в отношении Le^B-Gal-биотин по сравнению с Le^Y-Gal-биотин, что сопоставимо с результатом ITC. SPR также показывал, что hBBC имеет более высокую аффинность связывания в отношении Le^B/Le^B-ASGA-биотином, чем Le^Y/Le^Y-ASGA-биотин, что согласуется с наблюдением того, что hBBC характеризуется более высокой аффинностью связывания в отношении антигена на основе Le^B, чем антигена на основе Le^Y. Сопоставимые значения K_D для hBBC, полученные от Le^B/Le^B-ASGA и Le^Y/Le^Y-ASGA, дополнительно указывают на то, что hBBC специфически связывается с мультифукозилированными, а именно с двухвалентными структурами Льюиса В или Льюиса Y. Следует отметить, что ответ hBBC на Le^B/Le^B-ASGA был сильнее (сенсограмма), чем ответ на Le^B-Gal, хотя аналогичные значения Kd получали для двух антигенов. Le^B/Le^B-ASGA, по-видимому, представляет собой структуру с наивысшей аффинностью в отношении hBBC.

Для сравнения, BR96 показывал немного более высокую аффинность в отношении Le^Y-Gal-биотин и Le^Y/Le^Y-ASGA-биотин, что сопоставимо с результатом ITC, при рассмотрении структурно аналогичного антигена Le^Y/Le^Y-ASGP. Таким образом, данные SPR полностью соответствовали данным эксперимента ITC.

Непрямой ELISA

Для оценки аффинности связывания антител с помощью ELISA биотинилированные гликановые антигены разбавляли до соответствующей концентрации буфером PBS. 100 мкл разбавленного раствора антигена вносили в покрытый стрептавидином 96-луночный аналитический планшет и инкубировали на шейкере при 37°С в течение 3,5 часа. Планшет промывали с помощью PBST (0,05% Tween-20 в буфере PBS) для удаления избытка гликановых антигенов. Первичные антитела, серийно титрованные в разбавителе (0,1% BSA в буфере PBS), вносили в аналитический планшет и инкубировали на шейкере при 37°С в течение 1 часа. После отмывки с помощью PBST 100 мкл раствора конъюгированных с HRP антител против IgG человека (SouthernBiotech, разбавление 1:15000 в разбавителе) инкубировали в аналитическом планшете на шейкере при 37°С в течение 1 часа. После вымывания избытка вторичного антитела вносили 100 мкл реагента ТМВ и инкубировали при 37°С в течение 15 минут с последующим гашением с помощью 50 мкл 0,5 н. HCl. Значение OD определяли при 450 им и вычитали из значения при 650 им на устройстве для считывания микропланшетов VERSA max (Molecular Devices). Данные обрабатывали в Softmax Pro (Molecular Devices).

Le^Y/Le^Y-ASGA по сравнению с Le^Y-Gal

Связывающие активности hBBC и BR96 тестировали на планшетах для ELISA, покрытых Le^Y-Gal-биотин, покрытых Le^Y/Le^Y-ASGA-биотин и покрытых стрептавидином. Количество покрытого антигена было таким, как показано на фиг.14А и 14В. hBBC демонстрировал гораздо более сильное связывание с Le^Y/Le^Y-ASGA, чем с Le^Y-Gal. BR96 демонстрировал паттерн, противоположный hBBC, в том смысле, что он связывал Le^Y-Gal намного лучше, чем Le^Y/Le^Y-ASGA. В целом, непрямой ELISA дает результаты, аналогичные результатам по аффинности связывания в экспериментах ITC и SPR.

Le^B/Le^B-ASGA по сравнению с Le^Y/Le^Y-ASGA и Le^B-Gal

Затем hBBC тестировали на предмет связывания на планшетах для ELISA, покрытыми Le^B/Le^B-ASGA-биотин, Le^Y/Le^Y-ASGA-биотин, а также покрытых Le^B-Gal-биотин и покрытых стрептавидином. Количество покрывающего антигена было таким, как показано на фиг.15. Результат непрямого ELISA показывал, что hBBC демонстрировал значительно более сильное связывание с Le^B/Le^B-ASGA, чем с Le^Y/Le^Y-Gal и Le^B-Gal.

Антигенсвязывающий ELISA

Антигенсвязывающий ELISA разрабатывали для оценки относительной аффинности связывания hBBC с различными гликановыми антигенами. Вкратце, hBBC последовательно титровали и вносили в 96-луночный аналитический планшет, функционализированный стрептавидином, который был покрыт различными гликановыми антигенами. Связывание hBBC с гликановыми антигенами выявляли с помощью специфического в отношении человеческого IgG антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP), с последующим проявлением окрашивания в реагенте ТМВ. Поглощение при 450 им с использованием устройства для считывания микропланшетов было пропорционально количеству hBBC, связанного с его антигенами. Относительную аффинность определяли путем построения графика для OD как функции концентрации hBBC.

Получение антигена

Биотинилированную пентозу Льюиса Y - Le^Y-Gal-sp3-биотин - приобретали в компании Elicityl (Crolles, France). Пентозу Льюиса В приобретали в компании Elicityl и дополнительно биотинилировали собственными силами (Le^B-Gal-LC-биотин). Четыре других биотинилированных гликана Le^Y/Le^Y-ASGA-биотин, Le^B/Le^B-ASGA-биотин, 3-Le^Y/6-Le^B-ASGA-биотин (Le^Y/Le^B-ASGA-биотин) и 3-Le^B/6-Le^Y-ASGA-биотин (Le^B/Le^Y-ASGA-биотин) синтезировали посредством серии ферментативного гликозилирования с последующим химическим биотинилированием (таблица 5). Биотинилированный гликан анализировали с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) и масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (ESI-MS), чтобы убедиться, что чистота достигает по меньшей мере 95%, и не содержится неконъюгированный биотин. Анализ моносахарида HPAEC-PAD применяли для количественного определения биотинилированного гликана.

Антитело

hBBC применяли в антигенсвязывающем ELISA.

ELISA

Биотинилированные гликановые антигены разбавляли до 18,7 нМ буфером PBS. 100 мкл разбавленного раствора антигена вносили в покрытый стрептавидином 96-луночный аналитический планшет и инкубировали на шейкере при 37°С в течение 3,5 часа. Планшет промывали с помощью PBST (0,05% Tween-20 в буфере PBS) для удаления избытка гликановых антигенов. Первичные антитела, серийно титрованные в разбавителе (0,1% BSA в буфере PBS), вносили в аналитический планшет и инкубировали на шейкере при 37°С в течение 1 часа. После отмывки с помощью PBST 100 мкл раствора конъюгированных с HRP антител против IgG человека (SouthernBiotech, разбавление 1:10000 разбавителем) инкубировали в аналитическом планшете на шейкере при 37°С в течение 1 часа. После вымывания избытка вторичного антитела вносили 100 мкл реагента ТМВ и инкубировали при 37°С в течение 15 минут с последующим гашением с помощью 50 мкл 0,5 н. HCl. Значение OD определяли при 450 нм и вычитали из значения при 650 нм в устройстве для считывания микропланшетов VERSA max (Molecular Devices). Данные обрабатывали в Softmax Pro (Molecular Devices).

Результаты

Данные показаны на фиг.16А. При связывании hBBC с Le^B/Le^B-ASGA, Le^Y/Le^Y-ASGA, 3-Le^Y/6-Le^B-ASGA-биотин и 3-Le^B/6-Le^Y-ASGA-биотин в антигенсвязывающем ELISA, значение OD увеличивалось в узком диапазоне низкой концентрации антител (0,4-4 мкг/мл), тогда как связывание hBBC было явно слабее с Le^Y-Gal и Le^B-Gal, что указывает на то, что двухвалентный Le^Y, Le^B, Le^B/Le^Y или Le^Y/Le^B в одном гликане обеспечивал более высокую аффинность связывания с hBBC, чем в одном фрагменте Льюиса Y/B.

Прямое сравнение аффинности связывания антигена: hBBC.10.1 по сравнению с ВВС

Цель эксперимента состояла в том, чтобы сравнить аффинность антигена hBBC.10.1 с аффинностью родительского антитела ВВС с помощью антигенсвязывающего ELISA. Получение антигена

Биотинилированную пентозу Льюиса Y - Le^Y-Gal-sp3-биотин - приобретали в компании Elicityl (Crolles, France). Пентозу Льюиса В приобретали в компании Elicityl и дополнительно биотинилировали собственными силами (Le^B-Gal-LC-биотин). Четыре других биотинилированных гликана Le^Y/Le^Y-ASGA-биотин, Le^B/Le^B-ASGA-биотин, 3-Le^Y/6-Le^B-ASGA-биотин (Le^Y/Le^B-ASGA-биотин) и 3-Le^B/6-Le^Y-ASGA-биотин (Le^B/Le^Y-ASGA-биотин) синтезировали посредством серии ферментативного гликозилирования с последующим химическим биотинилированием (таблица 5). Биотинилированный гликан анализировали с помощью TLC и ESI-MS, чтобы убедиться, что чистота достигает по меньшей мере 95%, и не содержится неконъюгированный биотин. Анализ моносахарида HPAEC-PAD применяли для количественного определения биотинилированного гликана.

Антитело

ВВС и hBBC.10.1 применяли в антигенсвязывающем ELISA.

Антигенсвязывающий ELISA

96-луночные микропланшеты со стрептавидином EvenCoat™ (R&D Biosystems, MN, №по каталогу СР004) инкубировали с различными биотинилированными гликанами в PBS в количестве 3,73 пмоль/лунка при 4°С в течение ночи. После 3-кратной промывки с помощью PBS/0,05% Tween 20 (Sigma, № по каталогу PI379-500 мл) в лунки, покрытые антигеном, добавляли 100 мкл разбавленных антител ВВС или hBBC.10.1, а затем инкубировали при 37°С в течение 1 часа. Лунки промывали 3 раза с помощью PBS/0,05% Tween 20 с последующей инкубацией со 100 мкл 10000-кратно разбавленного мышиного антитело против IgG человека (Fc)-HRP (Southern Biotech, №on каталогу 9040-05) при 37°С в течение 1 часа. После промывки добавляли 100 мкл SureBlue™ Reverse ТМВ (KPL, № по каталогу 53-00-03) для проявления окрашивания при 37°С в течение 15 минут. Реакцию останавливали добавлением 0,5 н. HCl. Оптическую плотность считывали при длине волны 450 нм с эталоном 650 нм на устройстве для считывания микропланшетов VERSAMAX™ (Molecular Devices, San Jose, CA) и данные обрабатывали с помощью программного обеспечения SoftmaxPro™ (Molecular Devices).

Результаты

Антигенсвязывающий ELISA для ВВС (фиг.16В) и hBBC.10.1 (фиг 16С) демонстрировал, что hBBC.10.1 имел более низкую аффинность в отношении одноцепочечных гликановых антигенов (Le^B-Gal и Le^Y-Gal) по сравнению с ВВС, и оба антитела имели высокую аффинность в отношении биантеннарных гликановых антигенов (Le^B/Le^B-ASGA, Le^Y/Le^Y-ASGA, 3-Le^Y/6-Le^B-ASGA и 3-Le^B/6-Le^Y-ASGA). Эти данные свидетельствуют о том, что hBBC.10.1 имел лучшую селективность связывания между одноцепочечными и биантеннарными антигенами, чем ВВС.

Резюме

Эксперименты по характеристике эпитопа, описанные в данном примере, показали, что hBBC специфически связывается с би- и триантеннарным антигеном Le^Y/BI, полученным из линии раковых клеток; а также с би- и триантеннарными N-гликанами Le^Y. Кроме того, эпитоп, распознаваемый hBBC, включал в себя дифукозилированный(ые) остов(ы) LacNAc. Биантеннарный Le^B/Le^B-ASGA был антигеном с наиболее сильной аффинностью связывания с hBBC. Биантеннарные Le^Y/Le^Y-ASGA, Le^Y/Le^B-ASGA и Le^B/Le^Y- AS G А также показывали высокую аффинность в отношении hBBC по сравнению с одноцепочечными антигенами Le^B-Gal и Le^Y-Gal. Также, независимо от того, были ли антигены в одноцепочечной или биантеннарной структуре, антигены на основе только Le^B проявляли более высокую аффинность в отношении hBBC, чем антигены на основе только Le^Y. Наконец, поведение связывания (кинетические показатели) и эпитопы hBBC отличались от поведения BR96.

Пример 4

Интернализация hBBC в целевых клетках

Антитела можно использовать в качестве носителей для доставки функциональной нагрузки в желаемый участок. Например, в некоторых противораковых терапевтических средствах используются антигенспецифические антитела для доставки цитотоксических лекарственных средств (т.е. конъюгатов антитело-лекарственное средство или ADC) в опухолевые клетки посредством эндоцитоза, также известного как интернализация. Некоторые современные ADC включают в себя расщепляемые линкеры, которые расщепляются в лизосомальном компартменте и, таким образом, селективно высвобождают лекарственное средство после интернализации, при этом дополнительное преимущество заключается в повышении стабильности лекарственного средства в сыворотке.

Затем неспецифически связанное антитело промывали и клетки переводили на 37°С, чтобы обеспечить нормальный эндоцитоз. Через 0 минут и 30 минут клетки фиксировали и hBBC выявляли с использованием конъюгированного с А1еха488 антитела против IgG человека (фиг.17, панели слева). F-актин метили родамином фаллоидина (панели справа; совместное окрашивание проявлялось как желтый флуоресцентный сигнал). Как показано на фиг.17, hBBC окрашивали клеточную мембрану через 0 минут, а затем подвергались интернализации и локализовались в цитозольных везикулах вокруг ядра после инкубации при 37°С (30 минут, проницаемые клетки). Цитозольный сигнал был дополнительно продемонстрирован непроницаемым контролем, в котором могут быть обнаружены только слабые мембранные сигналы (30 минут, клетки с ненарушенной проницаемостью мембраны). Эти данные показывают, что hBBC эффективно интернализируется клетками AGS в течение 30 минут.

Во втором эксперименте изучали внутриклеточную локализацию hBBC в режиме реального времени. Вкратце, антитело hBBC добавляли к клеткам AGS и инкубировали в течение 4 или 8 часов при 37°С для облегчения интернализации. Затем клетки фиксировали и исследовали локализацию hBBC в реальном времени с использованием конъюгированного с А1еха488 антитела против IgG человека (фиг.18, антитело против IgG человека показано на левой панели). Лизосомы метили антителом против Lamp-1, а затем метили антителом против IgG кролика (показано на средних панелях). Как показано на фиг.18, hBBC локализуется совместно с Lamp-1 (Merge; правые панели) после 4 или 8-часовой инкубации, что указывает на то, что интернализированное hBBC локализуется в лизосомальном компартменте. Более того, hBBC может быть стабилизировано в лизосомальном компартменте без видимого разложения в течение по меньшей мере 8 часов. Эти результаты показывают, что hBBC применим для использования в конъюгатах, нацеленных на антиген, таких как ADC.

Пример 5

Иммуноокрашивание с помощью hBBC в образцах тканей человека Получали образцы здоровой и раковой ткани и выполняли иммуноокрашивание с помощью hBBC.10.1 на фиксированных формалином срезах ткани, залитых парафином, в соответствии со стандартным протоколом. Результаты окрашивания здоровых и раковых тканей представлены в таблицах 7 и 8, соответственно.

Кроме того, различные линии раковых клеток человека окрашивали с помощью hBBC.10.1 для определения паттернов экспрессии эпитопов. Результаты приведены в таблице 9.

Пример 6

Противоопухолевая активность hBBC на модели ксенотрансплантата рака толстой кишки

Проводили серию in vivo исследований на животных для оценки ингибирующего опухоль эффекта hBBC в моделях ксенотрансплантата SCID, которые предусматривали введение раковых клеток человека из клеточных линий рака желудка AGS, TSGH9201 и из клеточных линий рака толстой кишки COLO 201, COLO 205, DLD-1. hBBC.10.1 показал уровень связывания от сильного до умеренного со всеми линиями клеток, кроме COLO 205 (таблица 9 примера 5). hBBC.10.1 использовали для всех исследований ксенотрансплантатов, a BR96 использовали в качестве контроля.

In vivo противоопухолевая активность hBBC.10.1 на моделях ксенотрансплантатов DLD-1 и COLO 205

Цель данного исследования заключалась в изучении ингибирующих опухоль эффектов высокой дозы hBBC.10.1 на моделях ксенотрансплантатов DLD-1 и COLO 205. Вкратце, линии клеток рака толстой кишки человека DLD-1 и COLO 205 получали из Американской коллекции типовых культур (АТСС, Manassas, VA, USA). Клетки выращивали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и культуру клеток поддерживали в увлажненном инкубаторе в атмосфере 5% СО₂ при 37°С. Для инокуляции опухоли использовали клетки после 5-8 пересевов.

Самок мышей СВ17 с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), не содержащих специфических патогенов (SPF), приобретали в компании BioLASCO (Taiwan) и обеспечивали их акклиматизацию в течение по меньшей мере одной недели перед какой-либо экспериментальной манипуляцией. Мышей содержали в индивидуально вентилируемых клетках (IVC) в среде с контролируемой температурой (22±2°С) и влажностью 50±10% при цикле свет-темнота 12:12 часов. Все эксперименты проводили в соответствии с правилами и законами о защите животных, утвержденными Советом по сельскому хозяйству Тайваня.

Раковые клетки повторно суспендировали при плотности клеток 5×10⁶/200 мкл в ледяной бессывороточной среде, содержащей 50% BD Matrigel (№по каталогу 354248), и вводили подкожно в боковую область мышей SCID в возрасте 6-8 недель. Размер опухоли измеряли еженедельно штангенциркулем (Laser Tools and Technics (LTT), Hsin Chu City, Taiwan, 150 × 0,05 мм) и массу опухоли оценивали как «масса в мг = (ширина² × длина) мм³/2» (Ito et al. (1992) Cancer Res. 52:3739). Когда масса опухоли достигала 150-200 мг, мышей случайным образом делили на 9 групп (n = 6 на группу), при этом каждая группа имела сопоставимые размеры опухоли, и начинали лечение антителом. Несущим опухоль мышам SCID внутриперитонеально вводили hBBC.10.1 (партия: 17001) один раз в неделю в дозе 50 мг/кг в течение шести недель. Несущие опухоль мыши SCID, которым внутриперитонеально вводили солевой раствор, служили отрицательными контролями.

Результаты экспериментов с ксенотрансплантатами DLD-1 и COLO 205 показаны на фиг.19А и 19В, соответственно. hBBC.10.1 был способен эффективно ингибировать рост опухоли DLD-1, но не рост опухоли COLO 205, по сравнению с контролем. Эти данные согласуются с наблюдаемой способностью hBBC.10.1 связывать клетки DLD-1, но не COLO 205.

Противоопухолевая активность hBBC на модели ксенотрансплантата аденокарциномы желудка

Цель данного исследования заключалась в сравнении противоопухолевой эффективности hBBC.10.1 и BR96 при низких дозах, варьирующих от 0,008 до 1 мг/кг, на модели ксенотрансплантата AGS. Вкратце, линии клеток аденокарциномы желудка человека AGS (CRL-1739) получали из Американской коллекции типовых культур (АТСС, Manassas, VA, USA). Клетки AGS выращивали в среде Хэмса F-12K с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и культуру клеток поддерживали в увлажненном инкубаторе в атмосфере 5% СО₂ при 37°С. Для инокуляции опухоли использовали клетки AGS после 5-8 пересевов.

Клетки AGS повторно суспендировали при плотности клеток 5×10⁶/200 мкл в ледяной бессывороточной среде, содержащей 50% BD Matrigel (№по каталогу 354248), и вводили подкожно в боковую область мышей SCID в возрасте 6-8 недель. Размер опухоли измеряли еженедельно штангенциркулем (Laser Tools and Technics (LTT), Hsin Chu City, Taiwan, 150 × 0,05 мм) и массу опухоли оценивали как «масса в мг = (ширина² × длина) мм³/2» (Ito et al. (1992) Cancer Res. 52:3739). Когда масса опухоли достигала 150-200 мг, мышей случайным образом делили на 9 групп (n = 6 на группу), при этом каждая группа имела сопоставимые размеры опухоли, и начинали лечение антителом. Несущим опухоль мышам SCID внутриперитонеально вводили hBBC.10.1 (партия: 17001) один раз в неделю при 1, 0,2, 0,04 или 0,008 мг/кг в течение шести недель, при этом первая вводима доза в 1,5 раза превышала предварительно определенную дозу. Несущие опухоль мыши SCID, которым внутриперитонеально вводили солевой раствор, служили отрицательными контролями.

Результаты для мышей, получавших hBBC.10.1, и мышей, получавших BR96, показаны на фиг.20А и 20В, соответственно. При введении в еженедельных дозах 1 и 0,2 мг/кг hBBC.10.1 и BR96 значительно ингибировали рост опухоли по сравнению с контролем. Однако оба антитела не проявили ингибиторного действия при более низких дозах (0,04 и 0,008 мг/кг). По этическим соображениям мышей умерщвляли, когда опухолевая нагрузка превышала 10% массы тела. Некоторые мыши, получавшие солевой раствор или более низкие дозы антитела, достигли этой конечной точки через 60 суток после инокуляции; следовательно, статистический анализ проводили только на данных, полученных до дня 60. Напротив, рост опухоли до 10% массы тела эффективно задерживался у мышей, несущих опухоль AGS, которым вводили более высокие дозы (1 и 0,2 мг/кг) hBBC.10.1 или BR96. Это исследование зависимости от дозы показывает, что hBBC.10.1 обладает сопоставимой противоопухолевой эффективностью с BR96 у мышей, несущих опухоль AGS.

Противоопухолевую эффективность hBBC.10.1 сравнивали с таковой других создаваемых антител hBBC в соответствии с настоящим раскрытием. В одном эксперименте собранные клетки AGS дважды промывали с помощью PBS и повторно суспендировали при плотности клеток 5×10⁶/200 мкл в PBS, содержащем 25% BD Matrigel™ (BD Biosciences, № по каталогу 354248). Затем 200 мкл суспензии клеток AGS подкожно вводили инъекцией (5×10⁶ клеток/мышь) самкам мышей SCID (возрастом 6-8 недель) в боковую область. Размер опухоли измеряли еженедельно штангенциркулем (Laser 150 × 0,05 мм) и массу опухоли оценивали как «масса в мг = (ширина² × длина) мм³/2» [Hisashi Ito et al. (1992)]. Когда масса опухоли достигала 150-200 мг, мышей случайным образом делили на 6 групп (n = 6 на группу), при этом каждая группа имела сопоставимые размеры опухоли, и начинали лечение антителом. Несущим опухоль мышам SCID внутриперитонеально вводили hBBC.8 или мутанты (hBBC.9, hBBC.9.1, hBBC.10.1) дважды в неделю в дозе 0,25 мг/кг течение шести недель. Кроме того, hBBC.8 тестировали при более высокой дозе 2 мг/кг. Несущие опухоль мыши SCID, которым внутриперитонеально вводили солевой раствор, служили отрицательными контролями. Данные показаны на фиг.20С. Противоопухолевые эффекты наблюдали с hBBC. 8, hBBC.9 и hBBC.9.1, хотя эффект был несколько слабее, чем с hBBC.10.1. Сопоставимую противоопухолевую активность с hBBC.10.1 (0,25 мг/кг) наблюдали для hBBC.8 при более высокой дозе (2 мг/кг).

Также сравнивали hBBC.10.1 с hBBC.10.1FQ по противоопухолевой активности. Вкратце, собранные клетки AGS дважды промывали с помощью PBS и повторно суспендировали при плотности клеток 5×10⁶/200 мкл в PBS, содержащем 25% BD Matrigel™ (№ по каталогу 354248). Затем 200 мкл суспензии клеток AGS подкожно вводили инъекцией (5×10⁶ клеток/мышь) самкам мышей SCID (возрастом 6-8 недель) в боковую область. Размер опухоли измеряли еженедельно штангенциркулем (Laser 150 × 0,05 мм) и массу опухоли оценивали как «масса в мг = (ширина² × длина) мм³/2» [Hisashi Ito et al. (1992)]. Когда масса опухоли достигала 150-200 мг, мышей случайным образом делили на 3 группы (n = 8 на группу), при этом каждая группа имела сопоставимые размеры опухоли, и начинали лечение антителом. Несущим опухоль мышам SCID внутриперитонеально вводили инъекцию либо hBBC.10.1, либо hBBC.10.1FQ один раз в неделю в дозе 0,25 мг/кг в течение шести недель, при этом первая вводимая доза в 1,5 раза превышала предварительно определенную дозу. Несущие опухоль мыши SCID, которым внутриперитонеально вводили солевой раствор, служили отрицательными контролями. Данные (фиг.20D) показывают, что hBBC.10.1FQ обладал чуть более сильной противоопухолевой активностью.

В последующих экспериментах показывали, что клетки ксенотрансплантата AGS (xAGS), выделенные из опухолей ксенотрансплантата AGS, экспрессируют по меньшей мере 2× эпитоп hBBC по сравнению с клетками линией клеток AGS (данные не показаны). Клетки xAGS также вызывали более сильную активность ADCC и CDC с помощью hBBC по сравнению с родительской линией клеток (данные не показаны). hBBC оказывал несколько более слабый эффект прямого уничтожения целевых клеток xAGS по сравнению с BR96 (окрашивание PI), как показано на фиг.21.

Противоопухолевая активность hBBC на модели ксенотрансплантата карциномы желудка

Цель данного исследования заключалась в сравнении противоопухолевой эффективности hBBC.10.1 и BR96 при низких дозах, варьирующих от 0,04 до 10 мг/кг, на модели ксенотрансплантата TSGH 9201. Вкратце, линию клеток карциномы желудка человека TSGH 9201 (№ по каталогу 60146) получали из Bioresource Collection and Research Center (BCRC) научно-исследовательского института пищевой промышленности (FIRDI, Hsinchu, Taiwan). Клетки TSGH 9201 с более высокой экспрессией эпитопа hBBC обогащали 2 циклами сортинга флуоресцентно активированных клеток (FACS) (устройство для сортинга клеток BD FACSJAZZ™, BD Biosciences, Singapore, №по каталогу 655486) с использованием следующего окрашивания антителом hBBC (партия: В24), а затем 200 кратно разбавленным флуоресцеин (РГТС)-антитело козы против IgG человека AffiniPure™, Fey Fragment Specific (Jackson ImmunoResearch Inc., West Grove, PA, №по каталогу 109-095-098). По сравнению с родительскими клетками TSGH 9201 уровень экспрессии эпитопа hBBC был повышен почти в 4 раза в обогащенных клетках, обозначенных как TSGH 9201 (2s) (не показано). Как родительские, так и обогащенные клетки выращивали в среде RPMI-1640 (Gibco) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 1 мМ пирувата натрия. Культуру клеток поддерживали в увлажненном инкубаторе в атмосфере 5% СО₂ при 37°С. Для инокуляции опухоли использовали клетки TSGH 9201 (2s) после 5-8 пересевов.

Клетки TSGH 9201 (2s) повторно суспендировали при плотности клеток 5×10⁶/200 мкл в ледяной бессывороточной среде, содержащей 25% BD Matrigel (№ по каталогу 354248), и 200 мкл клеточной суспензии вводили подкожно инъекцией мышам SCID возрастом 6-8 недель в боковую область. Размер опухоли измеряли еженедельно штангенциркулем (Laser Tools and Technics (LTT), Hsin Chu City, Taiwan, 150 × 0,05 мм) и массу опухоли оценивали как «масса в мг = (ширина² × длина) мм³/2» (Ito et al. (1992) Cancer Res. 52:3739). Когда масса опухоли достигала 150-200 мг, мышей случайным образом делили на 3 группы (n = 5 на группу), при этом каждая группа имела сопоставимые размеры опухоли, и начинали лечение антителом. Для оценивания in vivo эффективности hBBC.10.1 и BR96 несущим опухоль мышам SCID внутриперитонеально вводили инъекцией либо hBBC.10.1 (партия: В24), либо BR96 (партия: Т05) при 10 мг/кг один раз в неделю в течение шести недель, при этом первая вводима доза в 1,5 раза превышала предварительно определенную дозу. Во втором исследовании для сравнения противоопухолевой активности hBBC.10.1 и BR96 при более низких дозах несущим опухоль мышам SCID внутриперитонеально вводили инъекцией либо hBBC.10.1 (партия: 17001), либо BR96 (партия: 17001) один раз в неделю при 10, 1, 0,2 или 0,04 мг/кг в течение шести недель, при этом первая вводима доза в 1,5 раза превышала предварительно определенную дозу.

Несущие опухоль мыши SCID, которым внутриперитонеально вводили солевой раствор, служили отрицательными контролями.

Результаты показаны на фиг.22. Как hBBC.10.1, так и BR96 значительно ингибировали рост опухоли при еженедельной дозе 10 мг/кг по сравнению с получавшей солевой раствор группой.

Противоопухолевая активность hBBC.10.1 на модели ксенотрансплантата аденокарциномы толстой и прямой кишки

Цель данного исследования заключалась в 1) изучении способности hBBC.10.1 ингибировать рост опухоли ксенотрансплантата COLO 201 и 2) сравнении противоопухолевых активностей hBBC и BR96 при дозах, варьирующих от 0,008 до 1 мг/кг, на модели ксенотрансплантата COLO 201.

Вкратце, полученную из асцитной жидкости линию клеток аденокарциномы толстой и прямой кишки COLO 201 (CCL-224) получали из Американской коллекции типовых культур (АТСС, Manassas, VA, USA). Клетки COLO 201 выращивали в среде RPMI-1640 (Gibco) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 1 мМ пирувата натрия. Культуру клеток поддерживали в увлажненном инкубаторе в атмосфере 5% СО₂ при 37°С. Для инокуляции опухоли использовали клетки COLO 201 после 5-8 пересевов.

Клетки COLO 201 повторно суспендировали при плотности клеток 2×10⁶/200 мкл в ледяной бессывороточной среде и 200 мкл клеточной суспензии вводили подкожно инъекцией мышам SCID возрастом 6-8 недель в боковую область. Размер опухоли измеряли еженедельно штангенциркулем (Laser 150 × 0,05 мм) и массу опухоли оценивали как «масса в мг = (ширина² × длина) мм³/2» (Ito et al. (1992) Cancer Res. 52:3739). Когда масса опухоли достигала 150-200 мг, мышей случайным образом делили на контрольную и получавшую лечение группы (n = 6 на группу), при этом каждая группа имела сопоставимые размеры опухоли, и начинали лечение антителом. Выполняли два исследования для оценки in vivo эффективности hBBC в ингибировании роста опухоли COLO 201.

В первом исследовании несущим опухоль мышам SCID внутриперитонеально вводили инъекцией hBBC.10.1 (партия: В26) дозами, варьирующими от 2 до 50 мг/кг, дважды в неделю в течение шести недель, при этом первая вводима доза в 1,5 раза превышала предварительно определенную дозу. Результаты первого исследования показаны на фиг.23. Лечение с помощью hBBC.10.1 при 2-50 мг/кг значительно ингибировало рост опухоли по сравнению с получавшей солевой раствор группой. Опухоли быстро уменьшались и в конечном итоге исчезли всего через одну неделю после введения hBBC, т.е. через две недели после инокуляции опухоли.

Во втором исследовании проводили дополнительное сравнение противоопухолевой активности hBBC.10.1 и BR96 при более низких дозах. Несущим опухоль мышам SCID внутриперитонеально вводили инъекцией либо hBBC.10.1 (партия: 17001), либо BR96 (партия: 17001) один раз в неделю (начиная с дня 7) при 1, 0,2, 0,04 и 0,008 мг/кг в течение шести недель, при этом первая вводима доза в 1,5 раза превышала предварительно определенную дозу. Несущие опухоль мыши SCID, которым внутриперитонеально вводили солевой раствор, служили отрицательными контролями. Очищенное антитело hTKH2.2 (партия: 1020429) включали в качестве отрицательного контрольного антитела, которое представляет собой гуманизированное антитело против STn, полученное своими силами путем транзиентной экспрессии в клетках НЕК293. Результаты второго исследования показаны на фиг.24А и 24В. Как hBBC.10.1, так и BR96 значительно ингибировали рост опухоли при еженедельной дозе 1 или 0,2 мг/кг по сравнению с получавшей солевой раствор и получавшей hTKH2.2 контрольными группами, тогда как более низкие дозы (0,04 и 0,008 мг/кг hBBC.10.1; 0,04 мг/кг BR96) демонстрировали эффекты, заключающиеся в задержке рота опухоли. По этическим соображениям мышей умерщвляли, когда опухолевая нагрузка превышала 10% массы тела. Некоторые мыши, получавшие солевой раствор или более низкие дозы hBBC.10.1 или BR96, достигали этой конечной точки через 49 суток после инокуляции; следовательно, статистический анализ проводили только на данных, полученных до дня 49.

Это исследование зависимости от дозы показывает, что hBBC.10.1 обладает сопоставимой противоопухолевой эффективностью с BR96 у мышей, несущих опухоль COLO 201.

Пример 7

Иммуноокрашивание с помощью hBBC в тканях примата и человека Выполняли иммуноокрашивание с помощью hBBC.10.1 на соответствующих здоровых тканях от человека и яванского макака (Масаса fascicular!s). Вкратце, окрашивание выполняли с использованием фиксированных формалином срезов ткани, залитых парафином, с 2 мкг/мл hBBC.10.1 в соответствии со стандартным протоколом. Результаты приведены в таблице 10 и показывают подобные паттерны окрашивания между тканями человека и яванского макака.

Пример 8

Исследование по безопасности и переносимости hBBC.10.1 на модели примата

Чтобы оценить переносимость и приемлемый диапазон доз hBBC.10.1 у яванских макаков после однократной внутривенной (iv) болюсной инъекции, проводили исследование переносимости однократной дозы и определение диапазона доз (без glp). Вкратце, самцов и самок яванских макаков (Масаса fascicularis) делили на четыре группы по одному самцу и одной самке в каждой группе. Животные в группах с 1 по 4 получали уровни дозы 0, 50, 200 и 300 мг/кг hBBC.10.1, соответственно. Животным в группах 2 и 3 вводили однократно медленную внутривенную болюсную инъекцию в течение по меньшей мере 5 минут. Животным в группах 1 и 4 вводили дозу однократно с помощью 20-минутной (±1 минута) внутривенной инфузии с использованием помпы и заполненных инфузионных линий. Приблизительно через 24 часа после введения дозы выполняли патологоанатомическое исследование. Во время патологоанатомического исследования регистрировали общие наблюдения и массы органов, а ткани собирали для гистопатологии. Некоторые из собранных тканей обрабатывали как препараты на предметных стеклах и исследовали под микроскопом.

Результаты показали, что hBBC.10.1 хорошо переносится яванскими макаками в диапазоне доз 50-300 мг/кг. Минимальное кровотечение наблюдали в слепой и/или толстой кишке у животных, получавших 200 и 300 мг/кг, и это, вероятно, связано с тестируемым изделием. Другими возможными изменениями, связанными с тестируемым изделием, являются хроническое и острое воспаление в желудке у одного животного, получавшего 200 мг/кг, инфильтрация нейтрофилов в криптах двенадцатиперстной кишки у одного животного, получавшего 200 мг/кг, и атрофия ворсинок подвздошной кишки у одного животного, получавшего 300 мг/кг. У животных, получавших 50 мг/кг (группа 2), никаких отклонений от нормы не наблюдали.

Различные варианты осуществления, описанные выше, могут быть объединены для обеспечения дополнительных вариантов осуществления. Все патенты США, публикации заявок на выдачу патентов США, заявки на выдачу патентов США, иностранные патенты, иностранные заявки на выдачу патентов и непатентные публикации, упомянутые в настоящем описании и/или перечисленные в информационном листке заявки, включены в настоящий документ посредством ссылки в полном своем объеме. Аспекты вариантов осуществления могут быть модифицированы, если необходимо использовать концепции различных патентов, заявок и публикаций для обеспечения дополнительных вариантов осуществления.

Эти и другие изменения могут быть внесены в варианты осуществления в свете приведенного выше подробного описания. В целом, в следующей формуле изобретения используемые термины не должны толковаться как ограничивающие формулу изобретения конкретными вариантами осуществления, раскрытыми в описании и формуле изобретения, но должны толковаться как включающие все возможные варианты осуществления вместе с полным объемом эквивалентов, на которые формула изобретения дает право. Соответственно, формула изобретения не ограничивается настоящим раскрытием.

Claims

1. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99-процентной идентичностью в отношении аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 35; и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99-процентной идентичностью в отношении аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 5, при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны специфически связываться:

с биантеннарным антигеном Le^B/Le^B, содержащим Fuc₄(Galβ1→3GlcNAc)₂ [I] или [Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc]₂ [II],

с биантеннарным антигеном Le^Y/Le^Y, содержащим Fuc₄(Galβ1→4GlcNAc)₂ [III] или [Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc]₂ [IV],

с биантеннарным антигеном Le^B/Le^Y, содержащим Fuc₂(Galβ1→3GlcNAc)[Fuc₂(Galβ1→4GlcNAc)] [V] или [Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc] [VI],

и с биантеннарным антигеном Le^Y/Le^B, содержащим Fuc₂(Galβ1-4GlcNAc)[Fuc₂(Galβ1-3GlcNAc)] [VII] или [Fucα1-2Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc][Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc] [VIII],

и при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не связывается специфически с моноантеннарным антигеном Le^X, который содержит Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc [IX], или с биантеннарным антигеном Le^X, который содержит [Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]₂ [X], или с моноантеннарным антигеном Le^А, который содержит Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc [XI], или с моноантеннарным антигеном Н типа 2, который содержит Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc [XII], или с биантеннарным антигеном Н типа 2, который содержит (Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc)2 [XIII], или с моноантеннарным антигеном Н типа 1, который содержит Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc [XIV].

2. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, содержащее:

(a) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (VH CDR1), содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 2, или аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99-процентной идентичностью в отношении аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2; определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (VH CDR2), содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 3, или аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99-процентной идентичностью в отношении аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 3; и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (VH CDR3), содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 4, или аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99-процентной идентичностью в отношении аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 4; и

(b) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (VL CDR1), содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 6, или аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99-процентной идентичностью в отношении аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 6; определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (VL CDR2), содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 7, или аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99-процентной идентичностью в отношении аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 7; и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (VL CDR3), содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 8, или аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99-процентной идентичностью в отношении аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 8.

3. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2, содержащее (i), (ii), (iii), (iv), (v) или (vi), как представлено ниже, или любую их комбинацию:

(i) VH CDR1, содержащую вариант аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 2, при этом вариант состоит из замены Y→A в положении 33 SEQ ID NO: 35; и/или

(ii) VH CDR3, содержащую вариант аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 4, при этом вариант состоит из замены Y→A в положении 104 SEQ ID NO: 35;

(iii) VH CDR3, содержащую вариант аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 4, при этом вариант состоит из замены A→H в положении 106 SEQ ID NO: 35;

(iv) VL CDR1, содержащую вариант аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 6, при этом вариант состоит из замены Y→A в положении 30 SEQ ID NO: 5;

(v) VL CDR2, содержащую вариант аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 7, при этом вариант состоит из замены G→A в положении 50 SEQ ID NO: 5; или

(vi) VL CDR3, содержащую вариант аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 8, при этом вариант состоит из замены T→S в положении 93 SEQ ID NO: 5.

4. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее: (a) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит определяющую комплементарность область 1 тяжелой цепи (VH CDR1), содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 2; определяющую комплементарность область 2 тяжелой цепи (VH CDR2), содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 3; и определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (VH CDR3), содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 4; и (b) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит определяющую комплементарность область 1 легкой цепи (VL CDR1), содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 6; определяющую комплементарность область 2 легкой цепи (VL CDR2), содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 7; и определяющую комплементарность область 3 легкой цепи (VL CDR3), содержащую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 8; при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны специфически связываться:

и при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не связывается специфически с моноантеннарным антигеном Le^X, который содержит Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc [IX], или с биантеннарным антигеном Le^X, который содержит [Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]₂ [X], или с моноантеннарным антигеном Le^А, который содержит Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc [XI], или с моноантеннарным антигеном Н типа 2, который содержит Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc [XII], или с биантеннарным антигеном Н типа 2, который содержит (Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc)₂ [XIII], или с моноантеннарным антигеном Н типа 1, который содержит Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc [XIV].

5. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 35; и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, которая содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 5, при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способны специфически связываться:

6. Выделенное антитело для связывания с биантеннарным антигеном Льюиса, причем антитело содержит тяжелую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 10, и легкую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 11.

7. Выделенное антитело по п. 6, которое является моноклональным.

8. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-5, где антитело является моноклональным.

9. Выделенное антитело по п. 6 или 7 или выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-5 или 8, где антитело представляет собой гуманизированное антитело.

10. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-5, 8 или 9, которое выбрано из Fab-фрагмента, F(ab’)2-фрагмента, Fv-фрагмента, одноцепочечного Fv (scFv)-антитела и диатела.

11. Выделенный полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-10.

12. Выделенный полинуклеотид по п. 11, при этом полинуклеотид является кодон-оптимизированным для экспрессии в клетке-хозяине.

13. Рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п. 11 или 12.

14. Рекомбинантный вектор экспрессии по п. 13, содержащий последовательность контроля экспрессии, функционально связанную с полинуклеотидом, кодирующим антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

15. Рекомбинантный вектор экспрессии по п. 14, где последовательность контроля экспрессии содержит промотор.

16. Клетка-хозяин для экспрессии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-10, причем клетка-хозяин содержит рекомбинантный вектор экспрессии по п. 13.

17. Клетка-хозяин для экспрессии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-10, причем клетка-хозяин содержит рекомбинантный вектор экспрессии по п. 15.

18. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые способны специфически связываться:

с биантеннарным антигеном Le^B/Le^B, содержащим структуру [I] или структуру [II],

и при этом антитело или его антигенсвязывающий фрагмент не связывается специфически с моноантеннарным антигеном Le^X, который содержит Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc [IX], или с биантеннарным антигеном Le^X, который содержит [Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAc]₂ [X], или с моноантеннарным антигеном Le^А, который содержит Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc [XI], или с моноантеннарным антигеном Н типа 2, который содержит Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc [XII], или с биантеннарным антигеном Н типа 2, который содержит (Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc)₂ [XIII], или с моноантеннарным антигеном Н типа 1, который содержит Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc [XIV],

при этом способ предусматривает:

культивирование клетки-хозяина по п. 16 или 17 при условиях и на протяжении времени, достаточных для экспрессии клеткой-хозяином полинуклеотида, кодирующего антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, с получением тем самым культуры, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент; и

извлечение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из культуры.

19. Конъюгат антитела для целевой доставки молекулы нагрузки, причем конъюгат антитела содержит выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-10 и связанную с ним молекулу нагрузки, причем молекула нагрузки выбрана из терапевтического средства и выявляемого индикатора.

20. Конъюгат антитела по п. 19, в котором молекула нагрузки ковалентно связана линкером с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом.

21. Конъюгат антитела по п. 20, в котором линкер выбран из расщепляемого линкера и нерасщепляемого линкера.

22. Конъюгат антитела по п. 21, в котором расщепляемый линкер представляет собой чувствительный к протеазе линкер, pH-чувствительный линкер или чувствительный к глутатиону линкер.

23. Конъюгат антитела по п. 22, в котором расщепляемый линкер представляет собой чувствительный к протеазе линкер, содержащий дипептид валин-цитруллин.

24. Конъюгат антитела по любому из пп. 21-23, в котором линкер содержит малеимидную группу.

25. Конъюгат антитела по любому из пп. 21-24, в котором антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит восстановленный дисульфидный мостик в шарнирной области и восстановленный дисульфидный мостик соединяется с малеимидной группой.

26. Конъюгат антитела по любому из пп. 21-25, в котором линкер дополнительно содержит саморазрушающуюся группу.

27. Конъюгат антитела по п. 26, в котором саморазрушающаяся группа представляет собой пара-аминобензиловый спирт (PABC).

28. Конъюгат антитела по любому из пп. 19-27, в котором молекула нагрузки выбрана из терапевтического средства и выявляемого индикатора.

29. Конъюгат антитела по п. 28, в котором молекула нагрузки представляет собой терапевтическое средство, выбранное из нацеливающегося на тубулин противомитотического средства, токсина на основе пептида, димера пирролобензодиазепина (PBD), антибиотика, ингибитора синтеза пиримидина, антиметаболического средства, алкилирующего ДНК средства и ингибитора топоизомеразы.

30. Конъюгат антитела по п. 29, в котором молекула нагрузки выбрана из майтансиноида, ауристатина, доксорубицина, калихеамицина, димера PBD, монометилауристатина E (MMAE) и монометилауристатина F (MMAF).

31. Конъюгат антитела по п. 28, в котором молекула нагрузки представляет собой выявляемый индикатор.

32. Конъюгат антитела по п. 31, в котором выявляемый индикатор выбран из радионуклида, красителя, радиометалла, флуоресцентного фрагмента, контрастного средства для МРТ, микропузырька, углеродной нанотрубки, частицы золота, фтордезоксиглюкозы, фермента, хромофора и непрозрачного для рентгеновских лучей маркера.

33. Конъюгат антитела по п. 32, в котором выявляемый индикатор представляет собой радионуклид, выбранный из ⁶⁸Ga, ⁶⁴Cu, ⁸⁶Y, ⁸⁹Zr, ¹²⁴I, ^99mTc, ¹²³I, ¹¹¹In, ¹⁷⁷Lu, ¹³¹I, ⁷⁶Br, ⁷⁸Zr, ¹⁸F и ¹²⁴T.

34. Конъюгат антитела по п. 32 или 33, дополнительно содержащий радионуклидный хелатор, выбранный из меченной малеимидом DOTA, N-гидроксисукцинимид-DOTA и дезферриоксамина (DFO).

35. Фармацевтическая композиция для лечения рака, характеризующегося экспрессией биантеннарного антигена Льюиса, причем фармацевтическая композиция содержит выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-10 или конъюгат антитела по любому из пп. 19-34 и фармацевтический носитель.

36. Фармацевтическая композиция для диагностики рака, характеризующегося экспрессией биантеннарного антигена Льюиса, причем фармацевтическая композиция содержит выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-10 или конъюгат антитела по любому из пп. 19-34 и фармацевтический носитель.

37. Фармацевтическая композиция для выявления рака, характеризующегося экспрессией биантеннарного антигена Льюиса, причем фармацевтическая композиция содержит выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-10 или конъюгат антитела по любому из пп. 19-34 и фармацевтический носитель.

38. Способ лечения рака, характеризующегося экспрессией биантеннарного антигена Льюиса, причем способ предусматривает введение фармацевтической композиции по п. 35 субъекту, нуждающемуся в этом.

39. Способ выявления рака, характеризующегося экспрессией биантеннарного антигена Льюиса, причем способ предусматривает введение фармацевтической композиции по п. 37 субъекту, нуждающемуся в этом.

40. Способ по п. 38 или 39, при котором субъект имеет рак или подозревается в том, что имеет рак, который выбран из рака желудка, рака толстой кишки, рака молочной железы, рака легкого, лимфатического рака, рака печени, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака матки и плоскоклеточной карциномы.

41. Способ по п. 40, при котором рак выбран из аденокарциномы желудка, муценозной аденокарциномы желудка, недифференцированной аденокарциномы желудка, перстневидноклеточной карциномы желудка, аденокарциномы толстой кишки, инвазивной карциномы протоков молочной железы, печеночноклеточной карциномы, аденокарциномы легкого, плоскоклеточной карциномы, метастатической аденокарциномы лимфатических узлов, муценозной аденокарциномы яичника, аденокарциномы протоков поджелудочной железы, папиллярной аденокарциномы поджелудочной железы, аденокарциномы предстательной железы и карциномы эндометрия.

42. Способ по любому из пп. 38-41, при котором введение предусматривает введение путем, выбранным из внутривенного, парентерального, внутрижелудочного, внутриплеврального, внутрилегочного, внутриректального, внутрикожного, внутриперитонеального, внутриопухолевого, подкожного, перорального, местного, чрескожного, интрацистернального, интратекального, интраназального и внутримышечного.

43. Способ по любому из пп. 38-42, при котором субъект получает или ранее получал:

(a) иммуносупрессивную терапию;

(b) стимулирующую контрольную точку иммунного ответа молекулу;

(c) радиационную терапию;

(d) химиотерапию;

(e) клеточную иммунотерапию или

(f) любую комбинацию из (a) - (e).

44. Способ по любому из пп. 38-43, при котором рак представляет собой аденокарциному толстой и прямой кишки.

45. Способ по любому из пп. 38-43, при котором рак представляет собой аденокарциному желудка.

46. Способ по любому из пп. 38-43, при котором рак представляет собой рак легкого.

47. Применение антитела по любому из пп. 1-10, конъюгата антитела по любому из пп. 19-34 или композиции по п. 35 для лечения рака, характеризующегося экспрессией биантеннарного антигена Льюиса.

48. Применение антитела по любому из пп. 1-10, конъюгата антитела по любому из пп. 19-34 или композиции по п. 36 для диагностики рака, характеризующегося экспрессией биантеннарного антигена Льюиса.

49. Применение антитела по любому из пп. 1-10, конъюгата антитела по любому из пп. 19-34 или композиции по п. 37 для выявления рака, характеризующегося экспрессией биантеннарного антигена Льюиса.

50. Применение антитела по любому из пп. 1-10, полинуклеотида по п. 11 или 12, рекомбинантного вектора экспрессии по любому из пп. 13-15, клетки-хозяина по п. 16 или 17, конъюгата антитела по любому из пп. 19-34 или композиции по п. 35 для получения лекарственного средства для лечения рака, характеризующегося экспрессией биантеннарного антигена Льюиса.

51. Применение антитела по любому из пп. 1-10, полинуклеотида по п. 11 или 12, рекомбинантного вектора экспрессии по любому из пп. 13-15, клетки-хозяина по п. 16 или 17, конъюгата антитела по любому из пп. 19-34 или композиции по п. 36 для получения лекарственного средства для диагностики рака, характеризующегося экспрессией биантеннарного антигена Льюиса.

52. Применение антитела по любому из пп. 1-10, полинуклеотида по п. 11 или 12, рекомбинантного вектора экспрессии по любому из пп. 13-15, клетки-хозяина по п. 16 или 17, конъюгата антитела по любому из пп. 19-34 или композиции по п. 37 для получения лекарственного средства для выявления рака, характеризующегося экспрессией биантеннарного антигена Льюиса.

53. Применение по любому из пп. 47-52, при котором рак выбран из рака желудка, рака толстой кишки, рака молочной железы, рака легкого, лимфатического рака, рака печени, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака матки и плоскоклеточной карциномы.

54. Применение по любому из пп. 47-52, при котором рак выбран из аденокарциномы желудка, муценозной аденокарциномы желудка, недифференцированной аденокарциномы желудка, перстневидноклеточной карциномы желудка, аденокарциномы толстой кишки, инвазивной карциномы протоков молочной железы, печеночноклеточной карциномы, аденокарциномы легкого, плоскоклеточной карциномы, метастатической аденокарциномы лимфатических узлов, муценозной аденокарциномы яичника, аденокарциномы протоков поджелудочной железы, папиллярной аденокарциномы поджелудочной железы, аденокарциномы предстательной железы и карциномы эндометрия.

55. Применение по любому из пп. 47-52, при котором рак представляет собой аденокарциному толстой и прямой кишки.

56. Применение по любому из пп. 47-52, при котором рак представляет собой аденокарциному желудка.

57. Применение по любому из пп. 47-52, при котором рак представляет собой рак легкого.