KR20210126638A - 항-trem1 항체 및 관련 방법 - Google Patents

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아리트라 팔
벤카타라만 스리람
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티에프 투 레
린다 리앙
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Abstract

항-TREM1 항체 및 항-TREM1 항체를 제조하고 사용하는 관련된 관련 방법이 본 명세서에 제공된다. 또한 항-TREM1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하여 비-자극성 골수 세포를 사멸시키거나, 무력화하거나 또는 고갈시키는 것을 포함하는, 면역 반응을 증진시키기 위한 및/또는 개체에서 면역-관련 병태, 예를 들어 암의 치료를 위한 방법 및 조성물이 제공된다.

Description

항-TREM1 항체 및 관련 방법
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2019년 2월 6일에 출원된 미국 가출원 번호 62/802,161 및 2019년 8월 21일에 출원된 미국 가출원 번호 62/889,994의 이익을 주장하며, 이는 그 전체로 본 명세서에 참고로 포함된다.
서열 목록
본원은 그 전체가 본원에 참조로 포함된, EFS-Web을 통해 제출된 서열 목록을 포함한다. 20XX년 XX월에 작성된 상기 ASCII 사본의 명칭은 XXXXXUS_sequencelisting.txt이고, 크기는 X,XXX,XXX 바이트이다.
배경
면역은 종양 증식을 방지하는데 있어서 일정 역할을 한다. 복잡한 미세환경이 병변 내에서 발달할 수 있으며, T-세포의 동원에도 불구하고, 종종 덩어리(mass)의 발달을 효과적으로 제어하지 못한다. 종양 제거와 종양 도피 사이의 균형의 이해는 종양 미세환경에서 골수 세포가 작용하는 차별적인 역할의 이해에 의존할 수 있다.
종양 미세환경의 골수 집단은 단핵구 및 호중구 (때때로 골수-유래 억제 세포로 대략적으로 그룹화됨), 대식세포 및 수지상 세포를 현저하게 포함한다. 종양내 골수성 집단이 전체적으로 비-자극성 또는 억제성으로 간주되어 왔지만, 모든 종양-침윤성 골수 세포가 기능적으로 동일하게 만들어지는 것은 아니라는 것이 더욱 최근에 인식되었다.
정상 조직에서, 이들 골수 세포의 다수는 선천성 및 적응성 면역 둘 다의 적절한 기능 및 특히 상처 복구에 필수적이다. 그러나, 암 환경에서는, 현저한 과량의 대식세포 및 이들 및 다른 세포 유형의 기능이상 또는 편향된 집단이 일반적으로 기술된다. CD68 또는 CD163과 같은 단일 마커에 의해 정의된 응집체 집단으로 간주될 때, "대식세포" 침윤은 다수의 종양 유형에 걸쳐 환자에서 더 나쁜 결과와 상관관계가 있다 ((de Visser, Cancer Immunol Immunother, 2008;57:1531-9); (Hanada 등, Int J Urol 2000;7:263-9); (Yao 등 Clin Cancer Res, 520, 2001;7:4021-6); (Ruffell 등, PNAS, 523 2012;109:2796-801)). 그러나, 종양 미세환경으로부터 대식세포의 표현형 및 기능적 하위-설정은 대식세포 및 수지상 세포의 유사성으로 인해 복잡하고, 종양 생물학에서 문제가 된다. 형태학적 기준이 종종 이 문제에 적용되어 왔으며; 수지상 세포를 대식세포로부터 구별하는 한 가지 접근법은 수지상 세포의 경우 더 뾰족하거나 수지상 형태이고 대식세포의 경우에는 더 불분명하거나 구상인 형태에 기초하였다 (Bell 등, J Exp Med 555, 1999;190:1417-26). 다른 그룹은 유전적 및 세포-표면 마커를 기준으로 차별화를 시도하고 있다.
종양 내의 항원-제시 구획에는 다양성이 있으며, T-세포는 항원-제시 세포 (APC)의 특징을 구별할 수 있다. T 세포는 종양 면역의 주요 동인이므로, 동족 APC의 정확한 특징을 이해하는 것이 중요할 것이다. 골수 세포는 T-세포에 종양-유래 항원을 제시하여 이를 활성화 상태로 유지할 수 있는 세포 중에서 현저하다. 항원 제시는 종양 자체에서 발생하며 종양 세포독성 T-림프구 (CTL)의 기능에 영향을 줄 수 있다. 항원 제시 세포 (APC)에 의한 T-세포 활성화는 항원-특이적 면역 반응 및 종양 세포 사멸에서 중요한 요소이다. 이러한 골수성 집단은 들어오는 종양-반응성 세포독성 T 림프구에 대한 주요 T-세포-상호작용 파트너 및 항원-제시 세포를 나타내므로, 이들의 구별을 이해하면 치료 방안을 이끌 수 있다.
골수 세포 상에서 발현된 트리거링 수용체 1 (TREM1, CD354로도 알려짐, HGNC: 17760, Entrez Gene: 54210, UniProtKB: Q9NP99)은 수용체의 Ig 슈퍼패밀리에 속하고 호중구, 단핵구 및 대식세포를 포함한 골수 세포의 하위집합에서 고도로 발현된다. TREM1은 시그널링 모티프를 결하고 대신 수용체 활성화는 염증 반응의 증폭을 초래하는 어댑터 DAP12 (DNAX-활성화 단백질 12)를 통해 매개된다 (Bouchon, 등(2000) J. Immunol.164(10): 4991-4995). 구체적으로, TREM1의 가교는 IL-8, 미엘로페르옥시다아제, TNFα 및 MCP-1의 발현을 유도한다. TREM1 발현은 톨-유사 수용체 자극 (세균 및 진균 자극)에 반응하여 골수 세포에서 상향-조절되고 패혈성 쇼크 및 감염 동안 급성 염증 반응에 기여하고 이를 증폭시키는 것으로 나타났다 (Cohen, (2001) Lancet 358: 776-778). TREM1에 대한 리간드는 파악하기 어려운 상태로 남아 있지만, 최근에는 PGLYRP1 (펩티도글리칸 인식 단백질 1)이 TREM1의 강력한 리간드로 확인되었다 (Read 등, (2015) J of Immunol. 194: 1417-1421). 마우스에는 TREM 1, 2, 3, 4, 및 5를 포함한 TREM 수용체의 5가지 활성화 형태가 있으며 감염 중에 방출되는 가용성 형태의 TREM1 (sTREM1)이 있다. 마우스 TREM1 및 인간 상동체 TREM1은 46%의 비교적 낮은 서열 동일성을 공유한다 (Radaev, 등. (2003) Structure 11: 1527-1535). 구조적으로 TREM1은 약 108개 아미노산의 단일 V-유형 면역글로불린 (Ig)-유사 도메인 (Ig-V)과 이어지는 70개 아미노산 줄기 영역으로 구성된다. 패혈증에서 TREM1이 하는 역할에 부가하여, 그것은 염증성 장 질환과도 관련이 있다. 그러나 종양 미세환경에서 TREM1의 역할에 대해서는 알려진 바가 거의 없다. (Schenk, 등(2007) JCI. 117: 3097-3106).
T-세포 반응을 자극하는데 비효과적인 세포의 양을 선택적으로 감소시키거나 그러한 세포를 재분극시켜, 이에 의해 종양 미세환경 내에서 면역 반응을 증진시키는 것을 포함하는 신규한 암 치료 접근법에 대한 충족되지 않은 요구가 존재한다.
관련된 특허 출원은 2018년 8월 7일에 출원된 PCT/US2018/045680을 포함하며, 이는 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다.
요약
일 양태에서, 인간 TREM1 (서열번호: 1)에 결합하는 단리된 항체가 본 명세서에 제공되며, 여기서 항체는 i) 인간 TREM1 (서열번호: 1)의 잔기 21-34 (서열번호: 42), 103-109 (서열번호: 43) 및 128-136 (서열번호: 44) 내에서 결합하고; ii) 인간 Fc 영역을 포함한다.
일 양태에서, 인간 TREM1 (서열번호: 1)에 결합하는 단리된 인간화된 항체가 본 명세서에 제공되며, 여기서 항체는 i) 인간 TREM1 (서열번호: 1)의 잔기 21-34 (서열번호: 42), 103-109 (서열번호: 43) 및 128-136 (서열번호: 44) 내에서 결합하고; ii) 선택적으로 인간 Fc 영역을 포함한다.
일 양태에서, 3개의 중쇄 CDR 서열, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 서열, 및 3개의 경쇄 CDR 서열, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 서열을 포함하는, 인간 TREM1 (서열번호: 1)에 결합하는 단리된 항체 또는 항체들이 본 명세서에 제공되며, 여기서: CDR-H1은 서열번호: 23에 제시된 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호: 24에 제시된 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호: 29에 제시된 서열을 포함하며, 여기서 X는 류신 (L), 글루타민 (Q), 메티오닌(M), 이소류신(I), 또는 글루탐산(E)이고, CDR-L1은 서열번호: 26에 제시된 서열을 포함하고, CDR-L2는 서열번호: 27에 제시된 서열을 포함하고, CDR-L3은 서열번호: 28에 제시된 서열을 포함한다. 일 양태에서, 3개의 중쇄 CDR 서열, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 서열을 포함하는 중쇄, 및 3개의 경쇄 CDR 서열, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 TREM1 (서열번호: 1)에 결합하는 단리된 항체 또는 항체들이 본 명세서에 제공되며, 여기서: CDR-H1은 서열번호: 23에 제시된 서열을 포함하고, CDR-H2는 서열번호: 24에 제시된 서열을 포함하고, CDR-H3은 서열번호: 29에 제시된 서열을 포함하며, 여기서 X는 류신 (L), 글루타민 (Q), 메티오닌 (M), 이소류신 (I) 또는 글루탐산 (E)이고, CDR-L1은 서열번호: 26에 제시된 서열을 포함하고, CDR-L2는 서열번호: 27에 제시된 서열을 포함하고, CDR-L3은 서열번호: 28에 제시된 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 서열 RXAAMDY (서열번호: 29)를 포함하는 CDR-H3을 포함하며, 여기서 X는 류신 (L), 글루타민 (Q), 메티오닌 (M), 이소류신 (I), 또는 글루탐산 (E)이다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호: 23에 제시된 서열을 포함하는 CDR-H1 및 서열번호: 24에 제시된 서열을 포함하는 CDR-H2를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR-H3은 서열번호: 33에 제시된 서열을 포함하고; 항체는 서열번호: 23에 제시된 서열을 포함하는 CDR-H1 및 서열번호: 24에 제시된 서열을 포함하는 CDR-H2를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 서열번호: 26에 제시된 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 27에 제시된 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 28에 제시된 서열을 포함하는 CDR-L3을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 서열번호: 16, 17, 또는 18에 제시된 서열로부터 선택된 VH 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호: 17에 제시된 VH 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 서열번호: 20, 21, 또는 22에 제시된 서열로부터 선택된 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호: 20에 제시된 VL 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 서열번호: 17에 제시된 VH 서열, 및 서열번호: 20에 제시된 VL 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 scFv이다. 일부 실시형태에서, 항체는 scFv이고 서열번호: 17에 제시된 VH 서열, 및 서열번호: 20에 제시된 VL 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 scFv이고 서열번호: 16, 17 또는 18에 제시된 서열로부터 선택된 VH 서열 및 서열번호: 20, 21, 또는 22에 제시된 서열로부터 선택된 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호: 17에 제시된 VH 서열, 및 서열번호: 20에 제시된 VL 서열을 포함하고; 인간 Fc 영역은 야생형 인간 IgG1 Fc를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 서열번호: 34에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호: 35에 제시된 경쇄 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 서열번호: 4, 5 또는 6에 제시된 서열로부터 선택된 VH 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 서열번호: 20, 21 또는 22에 제시된 서열로부터 선택된 VL 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 서열 8, 9 또는 10에 제시된 서열로부터 선택된 VH 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, CDR-H3은 서열번호: 32에 제시된 서열을 포함하고, 항체는 서열번호: 23에 제시된 서열을 포함하는 CDR-H1 및 서열번호:24에 제시된 서열을 포함하는 CDR-H2를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 서열번호: 12, 13 또는 14에 제시된 서열로부터 선택된 VH 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호: 13에 제시된 VH 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 서열번호: 20, 21, 또는 22에 제시된 서열로부터 선택된 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호: 20에 제시된 VL 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 서열번호: 13에 제시된 VH 서열, 및 서열번호: 20에 제시된 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 scFv이고 서열번호: 13에 제시된 VH 서열, 및 서열번호: 20에 제시된 VL 서열을 포함한다..
일부 실시형태에서, 항체는 scFv이고 서열번호: 112, 13 또는 14에 제시된 서열로부터 선택된 VH 서열 및 서열번호: 20, 21 또는 22에 제시된 서열로부터 선택된 VL 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 서열번호: 13에 제시된 VH 서열, 및 서열번호: 20에 제시된 VL 서열을 포함하고; 인간 Fc 영역은 야생형 인간 IgG1 Fc를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 서열번호: 36에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호: 37에 제시된 경쇄 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 서열번호: 17, 13 또는 9에 제시된 VH 서열; 및 서열번호: 20에 제시된 VL 서열로 구성된다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호: 17에 제시된 VH 서열; 및 서열번호: 20에 제시된 VL 서열로 구성된다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호: 13에 제시된 VH 서열; 및 서열번호: 20에 제시된 VL 서열로 구성된다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호: 9에 제시된 VH 서열; 및 서열번호: 20에 제시된 VL 서열로 구성된다.
일부 실시형태에서, 항체 중쇄는 서열번호: 34에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호: 35에 제시된 경쇄 서열로 구성된다.
일부 실시형태에서, 항체는 서열번호: 36에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호: 37에 제시된 경쇄 서열로 구성된다.
일부 실시형태에서, 항체는 어푸코실화된다.
또 다른 양태에서, 인간 TREM1 (서열번호: 1)에 결합하는 단리된 항체가 본 명세서에 제공되며, 여기서 항체는 어푸코실화되고, 항체는 서열번호: 17, 13 또는 9에 제시된 VH 서열; 및 서열번호: 20에 제시된 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 서열번호: 17에 제시된 VH 서열, 및 서열번호: 20에 제시된 VL 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 서열번호: 34에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호: 35에 제시된 경쇄 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 서열번호: 13에 제시된 VH 서열, 및 서열번호: 20에 제시된 VL 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 어푸코실화되고, 항체는 서열번호: 36에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호: 37에 제시된 경쇄 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 서열번호: 9에 제시된 VH 서열, 및 서열번호: 20에 제시된 VL 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 어푸코실화되고, 항체는 서열번호: 38에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호: 39에 제시된 경쇄 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 인간화된, 인간 또는 키메라 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간화된 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM으로부터 선택된 클래스의 중쇄 인간 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 인간 Fc 영역이다. 일부 실시형태에서, 인간 Fc 영역은 IgG 클래스의 인간 중쇄 불변 영역 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택된 서브클래스를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 Fc 영역은 야생형 인간 IgG1 Fc를 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 서열번호: 17에 제시된 VH 서열, 및 서열번호: 20에 제시된 VL 서열로 구성되고; 인간 Fc 영역은 야생형 인간 IgG1 Fc를 포함한다.
일부 실시형태에서, Fc 영역은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 여기서 하나 이상의 치환은 하나 이상의 치환이 없는 Fc와 비교하여 증가된 항체 반감기, 증가된 ADCC 활성, 증가된 ADCP 활성, 또는 증가된 CDC 활성을 초래한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa 및 FcγRIIIb로 구성된 군으로부터 선택된 Fcγ 수용체에 결합한다.
일부 실시형태에서, 항체는 모노클로날 항체이다.
일부 실시형태에서, 항체는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 검정에 의해 측정될 때 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7x10-9 M 이하의 KD로 인간 TREM1에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 검정에 의해 측정될 때 약 7 nM 이하의 KD로 인간 TREM1에 결합한다.
일부 실시형태에서, 항체는 작용제 항체이다.
일부 실시형태에서, 항체는 이소타입 대조군 항체와 비교하여 세포에서 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인의 증가된 발현을 유도한다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인은 IFN-γ, IL-1α, IL-12, IL-2, TNFSF9, TNFSF10, CXCL9, CXCL10, CCL17, CXCL1, CXCL5, CXCL8, CXCL11, CXCL15, CCL3, CCL4, CCL2, FasL, CD274, CRTAM, 그랜자임 A (GzmA) 또는 그랜자임 B (GzmB)로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 케모카인은 CXCL10 또는 IFN-γ이다.
일부 실시형태에서, 항체는 이소타입 대조군 항체와 비교하여 세포에서 적어도 하나의 골수 공-자극 단백질의 증가된 발현을 유도한다.
일부 실시형태에서, 골수 공-자극 단백질은 세포 내 HLA-DR, CD40, CD80, 또는 CD86이다.
일부 실시형태에서, 항체는 이소타입 대조군 항체와 비교하여 세포에서 ERK 및/또는 STAT3 세포내 시그널링 경로의 증가된 활성화를 유도한다.
일부 실시형태에서, 항체는 이소타입 대조군 항체와 비교하여 항-종양 메모리 반응을 유도한다.
일부 실시형태에서, 항체는 인간 TREM1에 대한 결합에 대해 인간 TREM-26 항체와 경쟁하고; 인간 TREM1에 결합하고; 사이노몰구스 TREM1에 결합하고; TREM1 시그널링을 자극하고; 면역 시그널링 경로를 유도하고; 사이토카인 또는 케모카인 분비를 유도하고; 공-자극 분자 발현을 유도하고; 골수 세포를 사멸하거나, 무력화하거나, 고갈시키고; 또는 a.- h의 임의의 조합이 가능하다.
일부 실시형태에서, 항체는 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 활성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 항체는 항체-매개 세포 포식작용 (ADCP) 활성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 항체는 보체-의존성 세포독성 (CDC) 활성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 세포는 TREM1+ 세포이다.
일부 실시형태에서, TREM1+ 세포는 수지상 세포, 종양 관련 대식세포 (TAM), 골수-유래 억제 세포(MDSC), 호중구, 및 종양 관련 호중구 (TAN)로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, TREM1+ 세포는 골수-유래 억제 세포 또는 종양 관련 호중구이다.
일부 실시형태에서, 항체는 TREM1+ 세포의 세포 표면 상에서 TREM1을 TREM1에 가교시킨다.
일부 실시형태에서, 단리된 항체는 의약으로서 사용하기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 단리된 항체는 암 또는 감염의 치료에 사용하기 위한 것이다. 일부 실시형태에서, 단리된 항체는 암의 치료에 사용하기 위한 것이며, 여기서 암은 고형 종양 및 액체 종양으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체, 이의 VH, 이의 VL, 이의 경쇄, 이의 중쇄, 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 세트; 선택적으로 cDNA가 본 명세서에 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 세트를 포함하는 벡터 또는 벡터의 세트가 본 명세서에 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 세트 또는 벡터 또는 벡터의 세트를 포함하는 숙주 세포가 본 명세서에 제공된다.
또 다른 양태에서, 숙주 세포로 항체를 발현시키는 단계 및 발현된 항체를 단리하는 단계를 포함하는 항체를 생산하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 본 명세서에 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 약학적 조성물 및 사용 설명서를 포함하는 키트가 본 명세서에 제공된다.
또 다른 양태에서, 항-TREM1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 면역 반응을 증가시키는 방법이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 약학적 조성물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 수용체-리간드 차단, 작용제 또는 길항제 활성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 항체는 작용제 활성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 항체는 이소타입 대조군 항체와 비교하여 세포에서 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인의 증가된 발현을 유도한다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인은 IFN-γ, IL-1α, IL-12, IL-2, TNFSF9, TNFSF10, CXCL9, CXCL10, CCL17, CXCL1, CXCL5, CXCL8, CXCL11, CXCL15, CCL3, CCL4, CCL2, FasL, CD274, CRTAM, 그랜자임 A (GzmA) 또는 그랜자임 B (GzmB)로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 케모카인은 CXCL10 또는 IFN-γ이다.
일부 실시형태에서, 항체는 이소타입 대조군 항체와 비교하여 적어도 하나의 골수 공-자극 단백질의 증가된 발현을 유도한다.
일부 실시형태에서, 골수 공-자극 단백질은 세포 내 HLA-DR, CD40, CD80, 또는 CD86이다.
일부 실시형태에서, 항체는 이소타입 대조군 항체와 비교하여 세포에서 ERK 및/또는 STAT3 세포내 시그널링 경로의 증가된 활성화를 유도한다.
일부 실시형태에서, 항체는 메모리 면역 반응을 유도한다.
일부 실시형태에서, 세포는 TREM1+ 세포이다.
일부 실시형태에서, TREM1+ 세포는 수지상 세포, 종양 관련 대식세포 (TAM), 골수-유래 억제 세포 (MDSC), 호중구, 및 종양 관련 호중구 (TAN)로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, TREM1+ 세포는 골수-유래 억제 세포 또는 종양 관련 호중구이다.
일부 실시형태에서, 항체는 TREM1+ 세포의 세포 표면 상에서 TREM1을 TREM1에 가교시킨다.
일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
또 다른 양태에서, 항-TREM1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 또는 약학적 조성물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항체는 수용체-리간드 차단, 작용제 또는 길항제 활성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 항체는 작용제 활성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 항체는 이소타입 대조군 항체와 비교하여 세포에서 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인의 증가된 발현을 유도한다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인은 IFN-γ, IL-1α, IL-12, IL-2, TNFSF9, TNFSF10, CXCL9, CXCL10, CCL17, CXCL1, CXCL5, CXCL8, CXCL11, CXCL15, CCL3, CCL4, CCL2, FasL, CD274, CRTAM, 그랜자임 A (GzmA) 또는 그랜자임 B (GzmB)로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 케모카인은 CXCL10 또는 IFN-γ이다.
일부 실시형태에서, 항체는 이소타입 대조군 항체와 비교하여 적어도 하나의 골수 공-자극 단백질의 증가된 발현을 유도한다.
일부 실시형태에서, 골수 공-자극 단백질은 세포 내 HLA-DR, CD40, CD80, 또는 CD86이다.
일부 실시형태에서, 항체는 이소타입 대조군 항체와 비교하여 세포에서 ERK 및/또는 STAT3 세포내 시그널링 경로의 증가된 활성화를 유도한다.
일부 실시형태에서, 항체는 이소타입 대조군 항체와 비교하여 항-종양 메모리 반응을 유도한다.
일부 실시형태에서, 항체는 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 활성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 항체는 보체-의존성 세포독성 (CDC) 활성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 항체는 항체-매개 식균작용 (ADCP) 활성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 세포는 TREM1+ 세포이다.
일부 실시형태에서, TREM1+ 세포는 수지상 세포, 종양 관련 대식세포 (TAM), 골수-유래 억제 세포 (MDSC), 호중구, 및 종양 관련 호중구 (TAN)로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, TREM1+ 세포는 골수-유래 억제 세포 또는 종양 관련 호중구이다.
일부 실시형태에서, 항체는 TREM1+ 세포의 세포 표면 상에서 TREM1을 TREM1에 가교시킨다.
일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
일부 실시형태에서, 암은 고형암이다.
일부 실시형태에서, 암은 액체암이다.
일부 실시형태에서, 암은 흑색종, 신장암, 간담도암, 두경부 편평 암종 (HNSC), 췌장암, 결장암, 방광암, 요로상피암, 교모세포종, 전립선암, 폐암, 유방암, 난소암, 위암, 식도암, 신장암, 자궁내막암, 자궁경부암, 고환암, 중피종암으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 암은 위암, 난소암, 결장암, 또는 유방암이다.
일부 실시형태에서, 접촉은 대상체에서 면역 반응을 증진시킨다.
일부 실시형태에서, 증진된 면역 반응은 적응성 면역 반응이다.
일부 실시형태에서, 증진된 면역 반응은 선천적 면역 반응이다.
일부 실시형태에서, 대상체는 이전에 면역요법을 받았거나, 동시에 받고 있거나, 또는 후속적으로 받을 것이다.
일부 실시형태에서, 면역요법은 체크포인트 억제제; T 세포의 체크포인트 억제제; 항-PD1 항체; 항-PDL1 항체; 항-CTLA4 항체; 입양 세포 요법; 입양 T 세포 요법; CAR-T 세포 요법; 수지상 세포 백신; STING 작용제; 단핵구 백신; 칼메트-게랭균 백신; T 세포 및 항원 제시 세포 둘 모두에 결합하는 항원 결합 단백질; BiTE 이중 항원 결합 단백질; 톨-유사 수용체 리간드; 사이토카인; 세포독성 요법; 화학요법; 방사선 요법; 소분자 억제제; 소분자 작용제; 면역조절제; 종양용해 바이러스; 및 후성유전적 조절인자 중 적어도 하나이다.
일부 실시형태에서, 면역요법은 항-PD1 항체, 항-PDL1 항체; 또는 항-CTLA4 항체로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 골수 세포를 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체 또는 약학적 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 표면 상의 골수 세포 상에서 발현된 트리거링 수용체 1 (TREM1)을 발현하는 골수 세포를 사멸시키거나, 무력화하거나 또는 고갈시키는 방법이 본 명세서에 제공된다.
일부 실시형태에서, 항체는 ADCC, CDC, 및 ADCP 중 적어도 하나에 의해 골수 세포를 사멸시키거나, 무력화시키거나 또는 고갈시키며, 선택적으로 여기서 항체는 ADCC에 의해 골수 세포를 사멸시키거나, 무력화시키거나 고갈시키고, 선택적으로 여기서 항체는 CDC에 의해 골수 세포를 사멸시키거나, 무력화시키거나 또는 고갈시키고, 그리고 선택적으로 항체는 ADCP에 의해 골수 세포를 사멸시키거나, 무력화시키거나 또는 고갈시킨다.
일부 실시형태에서, 항체는 ADCC, CDC 및 ADCP 중 적어도 하나에 의해 골수 세포를 사멸시킨다.
일부 실시형태에서, 항체는 ADCC, CDC 및 ADCP 중 적어도 하나에 의해 골수 세포를 무력화시킨다.
일부 실시형태에서, 항체는 ADCC, CDC 및 ADCP 중 적어도 하나에 의해 골수 세포를 고갈시킨다.
일부 실시형태에서, 항체는 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 활성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 항체는 보체-의존성 세포독성 (CDC) 활성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 항체는 항체-매개 식세포작용 (ADCP) 활성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 항체는 수용체-리간드 차단, 작용제 또는 길항제 활성을 갖는다.
일부 실시형태에서, 골수 세포는 자극성 골수 세포이다.
일부 실시형태에서, 골수 세포는 비-자극성 골수 세포이다.
일부 실시형태에서, 골수 세포는 수지상 세포, 종양-관련 대식세포 (TAM), 호중구, 단핵구, 또는 골수-유래 억제 세포 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 실시형태에서, 골수 세포는 호중구 또는 종양 관련 호중구이다.
일부 실시형태에서, 골수 세포는 종양 관련 대식세포이다.
일부 실시형태에서, 골수 세포는 단핵구 골수-유래 억제 세포이다.
일부 실시형태에서, 골수 세포는 종양내이다.
일부 실시형태에서, 골수 세포는 자극성 골수 세포 및 비-자극성 골수 세포를 포함하는 면역 세포의 모집단에 있다.
일부 실시형태에서, 접촉은 시험관내 또는 생체내이다.
일부 실시형태에서, 접촉은 대상체에서 생체내에서 발생하며, 선택적으로 대상체는 암을 가지고 있다.
일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
일부 실시형태에서, 암은 고형암이다.
일부 실시형태에서, 암은 액체암이다.
일부 실시형태에서, 암은 흑색종, 신장암, 간담도암, 두경부 편평 암종 (HNSC), 췌장암, 결장암, 방광암, 요로상피암, 교모세포종, 전립선암, 폐암, 유방암, 난소암, 위암, 식도암, 신장암, 자궁내막암, 자궁경부암, 고환암, 중피종암으로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 암은 위암, 난소암, 결장암, 또는 유방암이다.
일부 실시형태에서, 접촉은 대상체에서 면역 반응을 증진시킨다.
일부 실시형태에서, 증진된 면역 반응은 적응성 면역 반응이다.
일부 실시형태에서, 증진된 면역 반응은 선천적 면역 반응이다.
일부 실시형태에서, 증진된 면역 반응은 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인의 발현을 포함한다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인은 IFN-γ, IL-1α, IL-12, IL-2, TNFSF9, TNFSF10, CXCL9, CXCL10, CCL17, CXCL1, CXCL5, CXCL8, CXCL11, CXCL15, CCL3, CCL4, CCL2, FasL, CD274, CRTAM, 그랜자임 A (GzmA) 또는 그랜자임 B (GzmB)로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인은 CXCL10 또는 IFN-γ이다.
일부 실시형태에서, 대상체는 이전에 면역요법을 받았거나, 동시에 받고있거나, 후속적으로 받을 것이다.
일부 실시형태에서, 면역요법은 체크포인트 억제제; T 세포의 체크포인트 억제제; 항-PD1 항체; 항-PDL1 항체; 항-CTLA4 항체; 입양 세포 요법; 입양 T 세포 요법; CAR-T 세포 요법; 수지상 세포 백신; STING 작용제; 단핵구 백신; 칼메트-게랭균 백신; T 세포 및 항원 제시 세포 둘 모두에 결합하는 항원 결합 단백질; BiTE 이중 항원 결합 단백질; 톨-유사 수용체 리간드; 사이토카인; 세포독성 요법; 화학요법; 방사선 요법; 소분자 억제제; 소분자 작용제; 면역조절제; 종양용해 바이러스; 및 후성유전적 조절인자 중 적어도 하나이다.
일부 실시형태에서, 면역요법은 항-PD1 항체, 항-PDL1 항체; 또는 항-CTLA4 항체로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 이들 및 다른 특징, 양태 및 이점은 다음의 설명 및 첨부 도면과 관련하여 더 잘 이해될 것이며, 여기서:
도 1은 PI-4026-5의 SPR 결합 동역학을 도시한다.
도 2a는 HEK293 대조군 세포에 대한 PI-4026-5의 결합을 도시한다. 도 2b는 HEK293 세포를 과-발현하는 인간 TREM1에 대한 PI-4026-5의 결합을 도시한다.
도 3a는 인간 말초 혈액에서 호중구에 대한 PI-4026-5의 결합을 도시한다. 도 3b는 인간 말초 혈액에서 단핵구에 대한 PI-4026-5의 결합을 도시한다.
도 4a는 사이노몰구스 TREM1을 발현하는 세포에 대한 PI-4026-5의 결합을 도시한다. 도 4b는 마우스 TREM1을 발현하는 세포에 대한 PI-4026-5의 무 결합을 도시한다.
도 5a는 hCD16 리포터 검정 시스템을 사용하여 PI-4026-5에 의해 유도된 FcγR 시그널링을 도시한다. 도 5b는 hCD32 리포터 검정 시스템을 사용하여 PI-4026-5에 의해 유도된 FcγR 시그널링을 도시한다.
도 6a는 PI-4026-5가 1차 인간 대식세포에 의한 모 expi293 세포의 ADCP를 유도하지 않음을 도시한다. 도 6b는 PI-4026-5가 1차 인간 대식세포에 의해 hTREM1을 발현하는 expi293 세포의 ADCP를 유도함을 도시한다.
도 7a는 PI-4026 Fab의 CDRH1 및 TREM1 IgV 도메인 내의 잔기의 상호작용을 도시한다. 도 7b는 PI-4026 Fab의 CDRH2 및 TREM1 IgV 도메인 내의 잔기의 상호작용을 도시한다. 도 7c는 PI-4026 Fab의 CDRH3 및 TREM1 IgV 도메인 내의 잔기의 상호작용을 도시한다. 도 7d는 PI-4026 Fab의 CDRL1 및 TREM1 IgV 도메인 내의 잔기의 상호작용을 도시한다. 도 7e는 PI-4026 Fab의 CDRL3 및 TREM1 IgV 도메인 내의 잔기의 상호작용을 도시한다.
도 8은 다양한 농도의 H2O2에 노출 후의 PI-4026-5의 SEC 프로필을 도시한다.
도 9a는 푸코실화된 PI-4026-5 항체가 인간 말초 단핵구에 결합한다는 것을 도시한다. 도 9b는 어푸코실화된 PI-4026-5 항체가 인간 말초 단핵구에 결합한다는 것을 도시한다.
도 10a는 푸코실화된 PI-4026-5 항체가 사이노몰구스 말초 단핵구에 결합한다는 것을 도시한다. 도 10b는 어푸코실화된 PI-4026-5 항체가 사이노몰구스 말초 단핵구에 결합한다는 것을 도시한다.
도 11a는 hCD16 리포터 검정 시스템을 사용하여 푸코실화된 PI-4026-5에 의해 유도된 FcγR 시그널링을 도시한다. 도 11b는 hCD16 리포터 검정 시스템을 사용하여 어푸코실화된 PI-4026-5 항체에 의해 유도된 FcγR 시그널링을 도시한다.
도 12a는 열 스트레스에 대한 반응으로 DLS에 의해 측정된 PI64052 (PI-4026-5-M100L) 및 PI64062 (PI-4026-5-M100Q) 항체의 평균 반경을 도시한다. 도 12b는 열 스트레스에 대한 반응으로 DLS에 의해 측정된 PI64052 및 PI64062 항체의 다분산성 %를 도시한다. 이들은 안정성 동역학 측정이다.
도 13a는 열 스트레스에 대한 반응으로 SEC에 의해 결정된 PI64052 및 PI64062 항체의 단량체 %를 도시한다. 도 13ab는 열 스트레스에 대한 반응으로 SEC에 의해 측정된 PI64052 및 PI64062 항체의 응집체 %를 도시한다. 이들은 안정성 동역학 측정이다.
도 14a는 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 상이한 농도의 H2O2에 노출 후 24시간에서 PI64052 및 PI64062 항체의 주요 종 %를 도시한다. 도 14b는 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 상이한 농도의 H2O2에 노출 후 24시간에서 PI64052 및 PI64062 항체의 친수성 종 %를 도시한다. 이들은 산화 스트레스 민감도 측정이다.
도 15a는 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 상이한 농도의 H2O2에 노출 후 14일에서 PI64052 및 PI64062 항체의 주요 종 %를 도시한다. 도 15b는 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 상이한 농도의 H2O2에 노출 후 14일에서 PI64052 및 PI64062 항체의 친수성 종 %를 도시한다. 이들은 산화 스트레스 민감도 측정이다.
도 16a는 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 상이한 농도의 H2O2에 노출 후 28일에서 PI64052 및 PI64062 항체의 주요 종 %를 도시한다. 도 16b는 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 상이한 농도의 H2O2에 노출 후 28일에서 PI64052 및 PI64062 항체의 친수성 종 %를 도시한다.
도 17a는 PI64052 및 PI64062 항체의 탈아미드화 검정 결과를 도시한다. 도 17b는 PI64052 및 PI64062 항체의 탈아미드화 검정 결과를 도시한다. 도 17c는 PI64052 및 PI64062 항체의 탈아미드화 검정 결과를 도시한다. 도 17d는 PI64052 및 PI64062 항체의 탈아미드화 검정 결과를 도시한다.
도 18a는 HEK293 세포에 대한 PI64052 및 PI64062의 배경 결합이 없음을 도시한다. 도 18b는 HEK293 세포에 대한 PI64052 및 PI64062의 배경 결합이 없음을 도시한다. 도 18c는 HEK293 세포에 대한 PI64052 및 PI64062의 배경 결합이 없음을 도시한다.
도 19a는 림프구 (T 세포)에 대한 PI64052 및 PI64062의 결합이 없음을 도시한다. 도 19b는 림프구 (T 세포)에 대한 PI64052 및 PI64062의 결합이 없음을 도시한다. 도 19c는 림프구 (T 세포)에 대한 PI64052 및 PI64062의 결합이 없음을 도시한다. 도 19d는 림프구 (B 세포)에 대한 PI64052 및 PI64062의 결합이 없음을 도시한다. 도 19e는 림프구 (B 세포)에 대한 PI64052 및 PI64062의 결합이 없음을 도시한다. 도 19f는 림프구 (B 세포)에 대한 PI64052 및 PI64062의 결합이 없음을 도시한다.
도 20a는 인간 TREM1을 과발현하는 HEK293 세포에 대한 PI64052 및 PI64062 항체의 결합을 도시한다. 도 20b는 인간 TREM1을 과발현하는 HEK293 세포에 대한 PI64052 및 PI64062 항체의 결합을 도시한다. 도 20c는 인간 TREM1을 과발현하는 HEK293 세포에 대한 PI64052 및 PI64062 항체의 결합을 도시한다.
도 21a는 사이노몰구스 TREM1을 과발현하는 HEK293 세포에 대한 PI64052 및 PI64062 항체의 결합을 도시한다. 도 21b는 사이노몰구스 TREM1을 과발현하는 HEK293 세포에 대한 PI64052 및 PI64062 항체의 결합을 도시한다. 도 21c는 사이노몰구스 TREM1을 과발현하는 HEK293 세포에 대한 PI64052 및 PI64062 항체의 결합을 도시한다.
도 22a는 인간 단핵구에 대한 PI64052 및 PI64062의 결합을 도시한다. 도 22b는 인간 단핵구에 대한 PI64052 및 PI64062의 결합을 도시한다. 도 22b는 인간 단핵구에 대한 PI64052 및 PI64062의 결합을 도시한다.
도 23a는 사이노몰구스 단핵구에 대한 PI64052 및 PI64062의 결합을 도시한다. 도 23b는 사이노몰구스 단핵구에 대한 PI64052 및 PI64062의 결합을 도시한다.
도 24는 hCD16 리포터 검정 시스템을 사용하여 PI64052 및 PI64062에 의해 유도된 FcγR 시그널링을 도시하고 3개의 별도 실험을 대표한다.
도 25a는 PI64052가 1차 인간 대식세포에 의해 모 expi 세포가 아닌 hTREM1을 발현하는 expi 세포의 ADCP를 유도한다는 것을 도시한다. 도 25b는 PI64062가 1차 인간 대식세포에 의해 모 expi 세포가 아닌 hTREM1을 발현하는 expi 세포의 ADCP를 유도한다는 것을 도시한다. 도 25c는 PI64052가 1차 인간 대식세포에 의해 모 expi 세포가 아닌 hTREM1을 발현하는 expi 세포의 ADCP를 유도한다는 것을 도시한다. 도 25d는 PI64062가 1차 인간 대식세포에 의해 모 expi 세포가 아닌 hTREM1을 발현하는 expi 세포의 ADCP를 유도한다는 것을 도시한다.
도 26a는 hFcγRI에 대한 PI64052 및 PI64062 및 이들의 푸코실화된 모체 (각각 PI-4026-5-M100L 및 PI-4026-5-M100Q)의 결합을 도시한다. 도 26b는 hFcγRIIα에 대한 PI64052 및 PI64062 및 이들의 푸코실화된 모체의 결합을 도시한다. 도 26c는 hFcγRIIβ에 대한 PI64052 및 PI64062 및 이들의 푸코실화된 모체의 결합을 도시한다. 도 26d는 hFcγRIIIα에 대한 PI64052 및 PI64062 및 이들의 푸코실화된 모체의 결합을 도시한다. 도 26e는 hFcγRIIIα에 대한 PI64052 및 PI64062 및 이들의 푸코실화된 모체의 결합을 도시한다. 도 26f는 hFcγRIIIβ에 대한 PI64052 및 PI64062 및 이들의 푸코실화된 모체의 결합을 도시한다.
도 27a는 말초 혈액으로부터의 단핵구에 대한 PI-4026-5-M100Q 및 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q의 용량-의존적 수용체 점유를 도시한다. 도 27b는 말초 혈액으로부터의 호중구에 대한 PI-4026-5-M100Q 및 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q의 용량-의존적 수용체 점유를 도시한다.
도 28a는 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q가 PI-4026-5-M100Q보다 인간 말초 혈액 백혈구로부터 IFN-γ의 더 강력한 용량-의존성 사이토카인 방출을 유도한다는 것을 도시한다. 도 28b는 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q가 PI-4026-5-M100Q보다 인간 말초 혈액 백혈구로부터 IL-8의 더 강력한 용량-의존성 사이토카인 방출을 유도한다는 것을 도시한다. 도 28c는 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q가 PI-4026-5-M100Q보다 인간 말초 혈액 백혈구로부터 IL-2의 더 강력한 용량-의존성 사이토카인 방출을 유도한다는 것을 도시한다. 도 28d는 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q가 PI-4026-5-M100Q보다 인간 말초 혈액 백혈구로부터 IP-10의 더 강력한 용량-의존성 사이토카인 방출을 유도한다는 것을 도시한다.
도 29a는 어푸코실화된 PI-4928 항-TREM1 및 항-PD-1 항체의 조합 요법이 생체내에서 말초 사이토카인 시그니쳐를 유도한다는 것을 도시한다. 도 29b는 어푸코실화된 PI-4928 항-TREM1 및 항-PD-1 항체의 조합 요법이 생체내에서 말초 사이토카인 시그니쳐를 유도한다는 것을 도시한다.
도 30은 어푸코실화된 PI-9067 항-TREM1 항체가 Panc02 종양 모델에서 단일치료 활성을 갖는다는 것을 도시한다.
도 31a는 Panc02 종양 모델에서 이소타입 그룹의 각 마우스로부터의 성장 곡선을 제공한다. 도 31b는 Panc02 종양 모델에서 항-PD-1 그룹의 각 마우스로부터의 성장 곡선을 제공한다. 도 31c는 Panc02 종양 모델에서 항-TREM1 그룹의 각 마우스로부터의 성장 곡선을 제공한다. 도 31d는 Panc02 종양 모델에서 항-TREM1 및 항-PD-1 그룹의 각 마우스로부터의 성장 곡선을 제공한다.
도 32는 Panc02 종양 모델에서 표시된 각 그룹로부터의 각 마우스에 대한 28일차 종양 부피를 제공한다.
도 33은 인간 TREM1이 상이한 종양 징후에 걸쳐 발현되고 골수 세포로 제한된다는 것을 도시한다.
도 34a는 인간 혈액 세포에서 어푸코실화된 PI64062에 의해 유도된 사이토카인에서 배수 변화를 도시한다. 도 34b는 어푸코실화된 PI64062로 치료 후 HLA-DR 표면 발현의 상향조절을 도시한다. 도 34c는 어푸코실화된 PI64062로 치료 후 CD40 표면 발현의 상향조절을 도시한다.
도 35는 세포 유형에 따라 분류된 혈액 샘플 전반에 걸쳐 가장 높은 분산을 갖는 1000개 유전자의 발현 매트릭스를 도시한다. 유전자 발현 클러스터링은 분류된 면역 세포 모집단과 잘 상관되었다.
도 36a는 이소타입 항체 치료 (ISO) 또는 항-TREM1 항체 (어푸코실화된 PI64062) 치료 후 표시된 세포 유형에서 HLA-DR 유전자 발현을 도시한다. 도 36b는 이소타입 항체 치료 (ISO) 또는 항-TREM1 항체 (어푸코실화된 PI64062) 치료 후 표시된 세포 유형에서 CD40 유전자 발현을 도시한다. 도 36c는 이소타입 항체 치료 (ISO) 또는 항-TREM1 항체 (어푸코실화된 PI64062) 치료 후 표시된 세포 유형에서 CD80 유전자 발현을 도시한다. 도 36d는 이소타입 항체 치료 (ISO) 또는 항-TREM1 항체 (어푸코실화된 PI64062) 치료 후 표시된 세포 유형에서 CD86 유전자 발현을 도시한다.
도 37a는 항-TREM1 항체 (어푸코실화된 PI64062) 치료 후 단핵구에서 세포 표면 HLA-DR 발현에 대한 대표적인 히스토그램 오버레이를 도시한다. 도 37b는 항-TREM1 항체 (어푸코실화된 PI64062) 치료 후 단핵구에서 세포 표면 CD40 발현에 대한 대표적인 히스토그램 오버레이를 도시한다. 도 37c는 항-TREM1 항체 (어푸코실화된 PI64062) 치료 후 단핵구에서 세포 표면 CD80 발현에 대한 대표적인 히스토그램 오버레이를 도시한다. 도 37d는 항-TREM1 항체 (어푸코실화된 PI64062) 치료 후 단핵구에서 세포 표면 CD86 발현에 대한 대표적인 히스토그램 오버레이를 도시한다.
도 38a는 이소타입 대조군 또는 어푸코실화된 PI64062 항체로 치료 후 호중구, 단핵구 또는 T 세포에서 pERK 및 pSTAT3의 %를 도시한다. 도 38b (*<0.05, **<0.001)는, ERK 및 STAT 경로의 RNAseq 분석 결과를 도시하며, 이는 호중구 또는 NK 세포가 아닌 단핵구에서 이들 경로와 관련된 유전자의 상당한 농후화를 보여준다.
도 39는 마우스 또는 인간 혈액 세포에서 항-TREM1 항체에 의해 상향조절된 케모카인 및 사이토카인을 도시한다.
도 40은 어푸코실화된 PI-9067L 항-TREM1 항체가 ID8 난소 종양 모델에서 단일치료 활성을 갖는다는 것을 도시한다.
도 41은 어푸코실화된 PI-9067L 항체가 CT26 종양 모델에서 재-챌린지된 마우스에서 면역 메모리를 유도한다는 것을 도시한다.
도 42a는 결장직장암에서 TREM1 발현을 도시한다. 도 42b는 결장직장암 환자의 생존 확률 및 TREM1 발현을 도시한다.
도 43a는 어푸코실화된 PI-4928 항-TREM1 항체가 용량 의존적 약동학을 나타낸다는 것을 도시한다. 도 43b는 어푸코실화된 PI-4928 항-TREM1 항체로 치료 후 혈청 내 가용성 마우스 TREM1을 도시한다.
도 44a는 7일차에서 마우스 혈구 계수를 도시한다. 도 44b는 14일차에서 마우스 혈구 계수를 도시한다. 도 44c는 7일차에서 마우스 적혈구 매개변수를 도시한다. 도 44d는 14일차에서 마우스 적혈구 매개변수 값을 도시한다.
도 45a는 작은 피하 EMT6 종양-담지 암컷 BALB/c 마우스에서 항-TREM1, 항-PD-1, 또는 항-TREM1과 항-PD-1 치료의 조합의 항-종양 효능을 도시한다. 도 45b는 큰 피하 EMT6 종양-담지 암컷 BALB/c 마우스에서 항-TREM1, 항-PD-1, 또는 항-TREM1과 항-PD-1 치료의 조합의 항-종양 효능을 도시한다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어, 표기법 및 기타 과학 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 공통적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명료함 및/또는 용이한 참고를 위해 본 명세서에 정의되며, 본 명세서에 이러한 정의의 함축이 반드시 당업계에서 일반적으로 이해되는 것과의 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 명세서에 기술되거나 참고된 기술 및 절차는 일반적으로 잘 이해되고, 예를 들어 Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th ed. (2012) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY에 기술된 널리 이용되는 분자 클로닝 방법론과 같이, 당업자에 의해 통상적인 방법론을 사용하여 공통적으로 이용된다. 적절한 경우, 상업적으로 이용 가능한 키트 및 시약의 사용을 포함하는 절차는 달리 명시되지 않는 한 일반적으로 제조업체-정의된 프로토콜 및 조건에 따라 수행된다.
본 명세서에 사용된, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 달리 표시되지 않는 한 복수 참조를 포함한다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 측면 및 구현예는 측면 및 구현예를 "포함하는", 이로 "구성되는" 및 "본질적으로 구성되는" 것을 포함하는 것으로 이해된다.
본원에 기재된 모든 조성물, 본원에 기재된 조성물을 사용하는 모든 방법에 대해, 조성물은 열거된 성분 또는 단계를 포함할 수 있거나 열거된 성분 또는 단계로 "본질적으로 구성될" 수 있다. 조성물이 열거된 성분으로 "본질적으로 구성되는" 것으로 기재되는 경우, 조성물은 열거된 성분을 함유하고, 치료되는 병태에 실질적으로 영향을 미치지 않지만, 명백하게 열거된 성분 이외에 치료되는 병태에 실질적으로 영향을 미치는 임의의 다른 성분을 함유하지 않는 다른 성분을 함유할 수 있거나; 또는 조성물이 치료되는 병태에 실질적으로 영향을 미치는 열거된 것들 이외의 추가 성분을 함유한다면, 조성물은 치료되는 병태에 실질적으로 영향을 미치기에 충분한 농도 또는 양의 추가 성분을 함유하지 않는다. 방법이 열거된 단계로 "본질적으로 구성되는" 것으로 기재되는 경우, 상기 방법은 열거된 단계를 함유하며, 치료되는 병태에 실질적으로 영향을 미치지 않는 다른 단계를 함유할 수 있지만, 상기 방법은 명백하게 열거된 단계 이외에 치료되는 병태에 실질적으로 영향을 미치는 임의의 다른 단계를 함유하지 않는다. 비제한적인 구체예로서, 조성물이 성분으로 '본질적으로 구성되는' 것으로 기재되는 경우, 조성물은 임의의 양의 약제학적으로 허용되는 담체, 비히클 또는 희석제 및 치료되는 병태에 실질적으로 영향을 미치지 않는 다른 그와 같은 성분을 추가로 함유할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "벡터"는 그것이 연결된 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 본 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터뿐만 아니라 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈 안으로 통합된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그들이 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본 명세서에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고 외인성 핵산이 도입된 세포 및 이러한 세포의 자손을 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" (또는 "형질전환된 세포") 및 "형질감염체" (또는 "형질감염된 세포")를 포함하며, 각각은 1차 형질전환 또는 형질감염된 세포 및 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 이러한 자손은 핵산 함량이 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있고, 돌연변이를 함유할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "유효량" 또는 "치료적으로 유효량"은, 단독으로 또는 다른 치료 양식과 조합하여 원하는 치료 효과를 생성하거나 기여하는데 효과적인, 단일 용량으로 또는 일련의 용량의 일부로서 개체에게 투여되는 치료 화합물, 예컨대 항-TREM1 항체의 양을 지칭한다. 원하는 치료 효과의 예는 면역 반응을 증진하는 것, 종양 전개를 늦추거나 지연시키는 것; 질환의 안정화; 하나 이상의 증상 개선이다. 유효량은 하나 이상의 복용량으로 주어질 수 있다.
용어 "치료하는" (및 "치료하다" 또는 "치료"와 같은 이의 변형)은 질환 또는 병태의 자연적 경과의 변경을 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태의 자연적 경과를 변경하려는 시도에서 임상적 개입을 지칭한다. 치료는 임상 병리의 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 재발 방지, 증상의 경감, 질환의 임의의 직간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 예방, 질환 진행의 속도 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함한다.
용어 "충분한 양"은 원하는 효과를 생성하기에 충분한 양, 예를 들어 대상체에서 면역 반응을 조절하기에 충분한 양을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "대상체" 또는 "개체"는 포유동물 대상체를 의미한다. 예시적인 대상체는 인간, 원숭이, 개, 고양이, 마우스, 랫트, 소, 말, 낙타, 염소, 토끼 및 양을 포함한다. 특정 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서 대상체는 본 명세서에 제공된 항체로 치료될 수 있는 질환 또는 병태를 갖는다. 일부 양태에서, 질환 또는 병태는 암이다. 일부 양태에서, 질환 또는 병태는 바이러스 감염이다.
용어 "시험관내"는 살아있는 유기체와 분리되어 성장하는, 예를 들어 조직 배양에서 성장하는 살아있는 세포에서 발생하는 과정을 지칭한다.
용어 "생체내"는 살아있는 유기체에서 발생하는 과정을 지칭한다.
용어 "패키지 삽입물"은 적응증에 대한 정보, 용법, 복용량, 투여, 병용 요법, 금기 및/또는 그러한 치료 또는 진단 제품의 사용에 관한 경고를 함유하는 치료 또는 진단 제품 (예를 들어, 키트)의 상업적 패키지에 관행적으로 포함된 설명서를 지칭하기 위해 사용된다.
본 명세서에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물을 지칭한다. 화학요법제는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제하는 작용을 하는 "항-호르몬제" 또는 "내분비 치료제"를 포함한다.
용어 "세포증식억제제"는 시험관내 또는 생체내에서 세포의 성장을 막는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 세포증식억제제는 S 기에서 세포의 백분율을 감소시키는 제제이다. 일부 실시형태에서, 세포증식억제제는 S 기에서 세포의 백분율을 적어도 약 20%, 적어도 약 40%, 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 80% 감소시킨다.
용어 "종양"은 악성이든 양성이든 모든 신생물 세포 성장 및 증식, 및 모든 전-암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. 용어 "암", "암성", "세포 증식성 장애", "증식성 장애" 및 "종양"은 본 명세서에 언급된 바와 같이 상호 배타적이지 않다. 용어 "세포 증식성 장애" 및 "증식성 장애"는 어느 정도의 비정상적인 세포 증식과 관련된 장애를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 세포 증식성 장애는 암이다. 일부 양태에서, 종양은 고형 종양이다. 일부 양태에서, 종양은 혈액학적 악성종양이다.
용어 "약학적 조성물"은 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 대상체를 치료하는데 효과적이도록 허용되는 그러한 형태이고, 약학적 조성물에 제공된 양으로 대상체에게 허용될 수 없을 정도로 독성이 있는 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
용어 "공-투여", "공-투여하다", 및 "와 조합하여"는 특정한 시간 제한 없이 동시에, 함께 또는 순차적으로 2개 이상의 치료제의 투여를 포함한다. 일 실시형태에서, 제제는 동시에 세포 또는 대상체의 신체에 존재하거나 동시에 이의 생물학적 또는 치료적 효과를 발휘한다. 일 실시형태에서, 치료제는 동일한 조성물 또는 단위 복용량 형태에 있다. 다른 실시형태에서, 치료제는 별도의 조성물 또는 단위 복용량 형태에 있다. 특정 실시형태에서, 제1 제제는 제2 치료제의 투여 이전에 투여될 수 있다.
용어 "조절하다" 및 "조절"은 언급된 변수의 감소 또는 억제, 또는 대안적으로 활성화 또는 증가를 지칭한다.
용어 "증가하다" 및 "활성화시키다"는 언급된 변수에서 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배 이상의 증가를 지칭한다.
용어 "감소하다" 및 "억제하다"는 언급된 변수에서 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배 이상의 감소를 지칭한다.
용어 "약"은 표시된 값 및 그 값의 위 및 아래 범위를 나타내고 포괄한다. 특정 실시형태에서, 용어 "약"은 지정된 값 ± 10%, ± 5%, 또는 ± 1%를 나타낸다. 특정 실시형태에서, 적용 가능한 경우, 용어 "약"은 지정된 값(들) ± 그 값(들)의 일 표준 편차를 나타낸다.
용어 "작용화하다(agonize)"는 수용체의 활성화와 관련된 생물학적 반응을 유도하기 위한 수용체 신호 전달의 활성화를 지칭한다. "작용제"는 수용체에 결합하고 이를 작용화시키는 실재물이다.
용어 "길항하다"는 수용체의 활성화와 관련된 생물학적 반응을 억제하기 위한 수용체 신호 전달의 억제를 지칭한다. "길항제"는 수용체에 결합하고 이를 길항하는 실재물이다.
본 명세서에 기재된 임의의 구조적 및 기능적 특징에 대해, 이들 특징을 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
용어 "선택적으로"는 순차적으로 사용될 때 나열된 조합 중 하나에서 모두까지를 포함하고 모든 하위조합을 고려하는 것을 의미한다.
용어 "아미노산"은 20개 공통의 자연적으로 발생하는 아미노산을 지칭한다. 자연적으로 발생하는 아미노산은 알라닌 (Ala; A), 아르기닌 (Arg; R), 아스파라긴 (Asn; N), 아스파르트산 (Asp; D), 시스테인 (Cys; C); 글루탐산 (Glu; E), 글루타민 (Gln; Q), 글리신 (Gly; G); 히스티딘 (His; H), 이소류신 (Ile; I), 류신 (Leu; L), 라이신 (Lys; K), 메티오닌 (Met; M), 페닐알라닌 (Phe; F), 프롤린 (Pro; P), 세린 (Ser; S), 트레오닌 (Thr; T), 트립토판 (Trp; W), 티로신 (Tyr; Y) 및 발린 (Val; V)을 포함한다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서, 용어 퍼센트 "동일성"은 하기에 기술된 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나 (예를 들어, BLAST, BLASTP, BLASTN, BLAST-2, ALIGN, MEGALIGN (DNASTAR), CLUSTALW, CLUSTAL OMEGA 또는 MUSCLE 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어 또는 기타 숙련된 사람이 이용할 수 있는 알고리즘을 사용함) 또는 육안 검사에 의해 측정된, 최대 일치성을 위해 비교 및 정렬 시, 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 특정 백분율을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터 (ncbi.nlm.nih.gov)를 통해 공개적으로 이용 가능하다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열을 정렬하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 적용에 따라, 퍼센트 "동일성"은 비교되는 서열의 영역에 걸쳐, 예를 들어 기능적 도메인에 걸쳐 존재할 수 있거나, 대안적으로 비교되는 2개 서열의 전체 길이에 걸쳐 존재할 수 있다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 참고 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 서열과 참고 서열을 컴퓨터에 입력하고 필요에 따라 하위서열 좌표를 지정하고 서열 알고리즘 프로그램 매개변수를 지정한다. 그런 다음 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 매개변수를 기반으로 참고 서열에 대한 시험 서열(들)의 퍼센트 서열 동일성을 계산한다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어 Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)의 국지 상동 알고리즘에 의해, Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)의 상동 정열 알고리즘에 의해, Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)의 유사성 방법에 대한 조사에 의해, 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 구현 (위스콘신주 매디슨, 575 사이언스 닥터 소재의 Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA)에 의해, 또는 육안 검사 (일반적으로, 아래 Ausubel 등. 참고)에 의해 수행될 수 있다.
본 명세서에 인용된 범위는 인용된 평가변수를 포함하는 범위 내의 모든 값에 대한 약칭인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 및 50으로 구성된 군으로부터 임의의 수, 수의 조합 또는 하위-범위를 포함하는 것으로 이해된다.
TREM1 항체
구조
본 출원은 비-자극성 골수 세포를 무력화시키는 항체를 포함하여 TREM1 단백질에 결합하는 항체를 포함하는 항체 및 조성물을 제공한다.
용어 "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되며, 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항원-결합 도메인을 포함하는 특정 유형의 면역글로불린 분자를 포함한다. 항체는 구체적으로 온전한 항체 (예를 들어, 온전한 면역글로불린), 항체 단편 및 다중-특이적 항체를 포함한다.
인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자뿐만 아니라 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 항체 또는 면역글로불린의 "부류"는 이의 중쇄에 보유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 5가지 주요 부류의 항체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있으며, 이들 중 몇몇은 하위 부류 (이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인을 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라고 한다.
예시적인 면역글로불린 (항체) 구조 단위는 2쌍의 폴리펩티드 쇄로 구성되며, 각각의 쌍은 하나의 "경" (약 25 kD) 및 하나의 "중" 쇄 (약 50-70 kD)를 갖는다. 각각의 쇄의 N-말단 도메인은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 정의한다. 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH)라는 용어는 각각 이들 경쇄 및 중쇄 도메인을 지칭한다. IgG1 중쇄는 N에서 C-말단으로 각각 VH, CH1, CH2 및 CH3 도메인으로 구성된다. 경쇄는 N에서 C-말단으로 VL 및 CL 도메인으로 구성된다. IgG1 중쇄는 CH1 및 CH2 도메인 사이에 힌지를 포함한다. 특정 구현예에서, 면역글로불린 작제물은 치료적 폴리펩타이드에 연결된 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE로부터 적어도 하나의 면역글로불린 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체에서 발견되는 면역글로불린 도메인은 면역글로불린 기반 작제물 예컨대 디아바디 또는 나노바디로부터 기인하거나 이로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 면역글로불린 작제물은 낙타과(camelid) 항체와 같은 중쇄 항체로부터의 적어도 하나의 면역글로불린 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 면역글로불린 작제물은 포유동물 항체 예컨대 소 항체, 인간 항체, 낙타과 항체, 마우스 항체 또는 임의의 키메라 항체로부터의 적어도 하나의 면역글로불린 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 중쇄를 포함한다. 일 구현예에서, 중쇄는 IgA이다. 일 구현예에서, 중쇄는 IgD이다. 일 구현예에서, 중쇄는 IgE이다. 일 구현예에서, 중쇄는 IgG이다. 일 구현예에서, 중쇄는 IgM이다. 일 구현예에서, 중쇄는 IgG1이다. 일 구현예에서, 중쇄는 IgG2이다. 일 구현예에서, 중쇄는 IgG3이다. 일 구현예에서, 중쇄는 IgG4이다. 일 구현예에서, 중쇄는 IgA1이다. 일 구현예에서, 중쇄는 IgA2이다.
일부 구현예에서, 항체는 IgG1 항체이다.
일부 구현예에서, 항체는 IgG3 항체이다.
일부 구현예에서, 항체는 IgG2 항체이다.
일부 구현예에서, 항체는 IgG4 항체이다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열이 초가변성이고/이거나 구조적으로 정의된 루프 ("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 각 영역을 지칭한다. 일반적으로, 천연 4-쇄 항체는 6개의 HVR; VH에 3개 (H1, H2, H3), VL에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프 및/또는 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 후자는 서열 가변성이 가장 높고/높거나 항원 인식에 관여한다. VH 내의 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. 초가변 영역 (HVR)은 "상보성 결정 영역" (CDR)으로도 지칭되며, 이들 용어는 본원에서 항원-결합 영역을 형성하는 가변 영역의 부분과 관련하여 상호교환적으로 사용된다. 이 특정 영역은 Kabat 등, U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983) 및 Chothia 등, J Mol Biol 196:901-917 (1987)에 기재되었으며, 여기서 상기 정의는 서로 비교될 때 아미노산 잔기의 중첩 또는 서브셋을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체의 CDR 또는 이의 변이체를 지칭하기 위한 정의의 적용은 본원에 정의되고 사용된 용어의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 특정 CDR을 포함하는 정확한 잔기 수는 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 당업자는 항체의 가변 영역 아미노산 서열이 주어지면 어떤 잔기가 특정 CDR을 포함하는지를 일상적으로 결정할 수 있다.
CDR의 아미노산 서열 경계는 하기에 기재된 것을 비롯하여 다수의 공지된 넘버링 방식 중 임의의 것을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다: 상기 Kabat 등 ("카밧(Kabat)" 넘버링 방식); Al-Lazikani 등, 1997, J. Mol . Biol ., 273:927-948 ("초티아(Chothia)" 넘버링 방식); MacCallum 등, 1996, J. Mol . Biol . 262:732-745 ("컨택트(Contact)" 넘버링 방식); Lefranc 등, Dev . Comp. Immunol ., 2003, 27:55-77 ("IMGT" 넘버링 방식); 및 Honegge 및
Figure pct00001
, J. Mol . Biol ., 2001, 309:657-70 ("AHo" 넘버링 방식); 이들 각각은 그 전문이 참고로 포함된다.
표 A는 카밧 및 초티아 방식에 의해 확인된 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3의 위치를 제공한다. CDR-H1의 경우, 카밧 및 초티아 넘버링 방식 둘 다를 사용하는 잔기 넘버링이 제공된다.
CDR은, 예를 들어, www.bioinf.org.uk/abs/abnum/에서 이용가능하고 Abhinandan and Martin, Immunology, 2008, 45:3832-3839에 기재된 Abnum과 같은 항체 넘버링 소프트웨어를 사용하여 배정될 수 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 참고로 포함된다.
표 A. 카밧 및 초티아 넘버링 방식에 따른 CDR 내의 잔기 .
Figure pct00002
* CDR-H1의 C-말단은, 카밧 넘버링 관례를 사용하여 넘버링될 때, CDR의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 가변적이다.
"EU 넘버링 방식"은 일반적으로 항체 중쇄 불변 영역에서 잔기를 언급할 때 (예를 들어, 상기 문헌 Kabat 등에 보고된 바와 같이) 사용된다. 달리 언급되지 않는 한, EU 넘버링 방식은 본원에 기재된 항체 중쇄 불변 영역 내 잔기를 지칭하는데 사용된다.
용어 "항원-결합 도메인"은 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 부분을 의미한다. 항원-결합 도메인의 일 예는 항체의 VH-VL 이량체에 의해 형성된 항원-결합 도메인이다. 항원-결합 도메인의 다른 예는 애드넥틴의 10번째 피브로넥틴 유형 III 도메인으로부터의 특정 루프의 다양화에 의해 형성된 항원-결합 도메인이다. 항원-결합 도메인은 중쇄로부터 CDR 1, 2 및 3을 그 순서대로 포함할 수 있고; 경쇄로부터 CDR 1, 2 및 3을 그 순서대로 포함할 수 있다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합하는 항원의 부분을 의미한다. 에피토프는 빈번하게 표면-접근 가능한 아미노산 잔기 및/또는 당 측쇄로 구성되고 특정 3-차원 구조적 특성뿐만 아니라 특정 전하 특성을 가질 수 있다. 구조적 및 비-구조적 에피토프는 변성 용매의 존재에서 전자에 대한 결합은 손실될 수 있지만 후자에 대한 결합은 아닐 수 있다는 점에서 구별된다. 에피토프는 결합에 직접적으로 관여하는 아미노산 잔기, 및 결합에 직접적으로 관여하지 않는 다른 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 항체가 결합하는 에피토프는, 예를 들어, 상이한 점-돌연변이를 갖는 TREM1 변이체, 또는 키메라 TREM1 변이체에 결합하는 항체에 대한 시험과 같은 에피토프 결정을 위한 공지된 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
관심있는 항체 (예를 들어, TREM1)에 의해 결합된 표적 항원 상의 에피토프에 결합하는 항체를 스크리닝하기 위해, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)에 기술된 것과 같은 일상적인 교차-차단 검정이 수행될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 에피토프 맵핑은 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
용어 "키메라 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되는 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나 인간 항체 레퍼토리 또는 인간 항체-인코딩 서열 (예를 들어, 인간 공급원에서 얻거나 새로 설계된 것)을 이용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 인간 항체는 구체적으로 인간화된 항체를 제외한다.
"인간화된 항체"는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 첨가에 의해 비-인간 종으로부터 유래된 항체의 서열과 상이한 서열을 가지므로 인간화된 항체는 인간 대상체에게 투여될 때, 비-인간 종 항체와 비교하여 면역 반응을 유도하기 쉽지 않고 및/또는 덜 심각한 면역 반응을 유도한다. 일 실시형태에서, 비-인간 종 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 프레임워크 및 불변 도메인 내의 특정 아미노산이 돌연변이되어 인간화된 항체를 생성한다. 또 다른 실시형태에서, 인간 항체로부터의 불변 도메인(들)이 비-인간 종의 가변 도메인(들)에 융합된다. 또 다른 실시형태에서, 비-인간 항체의 하나 이상의 CDR 서열 내 하나 이상의 아미노산 잔기는 비-인간 항체가 인간 대상체에게 투여될 때 비-인간 항체의 가능한 면역원성을 감소시키기 위해 변경되며, 여기서 변경된 아미노산 잔기는 그 항원에 대한 항체의 면역특이적 결합에 중요하지 않거나, 생성된 아미노산 서열에 대한 변화가 보존적 변화이므로 항원에 대한 인간화된 항체의 결합이 항원에 대한 비-인간 항체의 결합보다 유의하게 나쁘지 않다. 인간화된 항체를 만드는 방법의 예는 미국 특허 번호 6,054,297, 5,886,152 및 5,877,293에서 찾아볼 수 있다. 더 자세한 내용은 Jones 등., Nature, 1986, 321:522-525; Riechmann 등., Nature, 1988, 332:323-329; 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 1992, 2:593-596을 참고하며, 이들 각각은 그 전체가 참고로 포함된다.
"다중특이적 항체"는 2개 이상의 상이한 에피토프에 집합적으로 특이적으로 결합하는 2개 이상의 상이한 항원-결합 도메인을 포함하는 항체이다. 2개 이상의 상이한 에피토프는 동일한 항원 (예를 들어, 세포에 의해 발현되는 단일 TREM1 분자) 또는 상이한 항원 (예를 들어, 동일한 세포에 의해 발현되는 상이한 TREM1 분자, 또는 TREM1 분자 및 비-TREM1 분자) 상의 에피토프일 수 있다. 일부 양태에서, 다중-특이적 항체는 2개의 상이한 에피토프에 결합한다 (즉, "이중특이적 항체"). 일부 양태에서, 다중-특이적 항체는 3개의 상이한 에피토프에 결합한다 (즉, "삼중특이적 항체").
"단일특이적 항체"는 단일 에피토프에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 포함하는 항체이다. 단일특이성 항체의 예는 2가이지만 (즉, 2개의 항원-결합 도메인을 가짐) 2개의 항원-결합 도메인의 각각에서 동일한 에피토프를 인식하는 자연적으로 발생하는 IgG 분자이다. 결합 특이성은 임의의 적절한 결합가로 제시할 수 있다.
용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 모집단으로부터의 항체를 지칭한다. 실질적으로 균질한 항체의 모집단은 실질적으로 유사하고 동일한 에피토프(들)에 결합하는 항체를 포함하지만, 모노클로날 항체의 생산 동안 정상적으로 발생할 수 있는 변이체를 제외한다. 이러한 변이체는 일반적으로 소량만 존재한다. 모노클로날 항체는 전형적으로 복수의 항체로부터 단일 항체의 선택을 포함하는 과정에 의해 수득된다. 예를 들어, 선택 프로세스는 하이브리도마 클론, 파지 클론, 효모 클론, 박테리아 클론 또는 기타 재조합 DNA 클론의 풀과 같은 복수의 클론으로부터 고유한 클론을 선택일 수 있다. 선택된 항체는, 예를 들어, 표적에 대한 친화도를 개선하기 위해 ("친화도 성숙"), 항체를 인간화하기 위해, 세포 배양에서 이의 생산을 개선하기 위해, 및/또는 대상체에서 이의 면역원성을 감소시키기 위해 추가로 변경될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "단쇄"는 펩티드 결합에 의해 선형으로 연결된 아미노산 단량체를 포함하는 분자를 지칭한다. 그와 같은 특정 구현예에서, Fab 경쇄의 C-말단은 단쇄 Fab 분자에서 Fab 중쇄의 N-말단에 연결된다. 본원에 보다 상세하게 기재된 바와 같이, scFv는 폴리펩티드 사슬에 의해 중쇄의 가변 도메인 (VH)의 C-말단으로부터 N-말단으로 연결된 경쇄의 가변 도메인 (VL)을 갖는다. 대안적으로, scFv는 VH의 C-말단에서 폴리펩티드 사슬에 의해 VL의 N-말단에 연결된 폴리펩티드 사슬로 구성된다.
"Fab 단편" (또한 단편 항원-결합으로도 지칭됨)은 각각 경쇄 및 중쇄 상의 가변 도메인 VL 및 VH와 함께 경쇄의 불변 도메인 (CL) 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. 가변 도메인은 항원-결합에 관여하는 상보성 결정 루프 (CDR, 초가변 영역으로도 지칭됨)를 포함한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하여 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에 약간의 잔기를 추가함으로써 Fab 단편과 상이하다.
"F(ab')2" 단편은 힌지 영역 근처에서 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 Fab' 단편을 함유한다. F(ab')2 단편은, 예를 들어, 재조합 방법에 의해 또는 온전한 항체의 펩신 분해에 의해 생성될 수 있다. F(ab') 단편은, 예를 들어, ß-머캅토에탄올을 사용한 처리에 의해 분리될 수 있다.
"Fv" 단편은 하나의 중쇄 가변 도메인 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 비-공유-결합 이량체를 포함한다.
"단쇄 Fv" 또는 "sFv" 또는 "scFv"는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다. 일 구현예에서, Fv 폴리펩티드는 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하며, 이는 scFv가 항원-결합에 바람직한 구조를 형성할 수 있게 한다. scFv에 대한 검토는 하기를 참고한다: Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 및 Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). HER2 항체 scFv 단편은 WO93/16185; 미국 특허 번호 5,571,894; 및 미국 특허 번호 5,587,458에 기재되어 있다.
"scFv-Fc" 단편은 Fc 도메인에 부착된 scFv를 포함한다. 예를 들어, Fc 도메인은 scFv의 C-말단에 부착될 수 있다. Fc 도메인은 scFv에서 가변 도메인의 배향에 따라 VH 또는 VL을 뒤따를 수 있다(즉, VH-VL 또는 VL-VH). 당 업계에 공지되거나 본원에 기재된 임의의 적합한 Fc 도메인이 사용될 수 있다. 일부 경우에, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인을 포함한다.
용어 "단일 도메인 항체" 또는 "sdAb"는 항체의 하나의 가변 도메인이 다른 가변 도메인의 존재 없이 항원에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 단일 도메인 항체, 및 이의 단편은 하기에 기재되어 있다: Arabi Ghahroudi 등, FEBS Letters, 1998, 414:521-526 및 Muyldermans 등, Trends in Biochem . Sci ., 2001, 26:230-245, 이들 각각은 그 전문이 참고로 포함된다. 단일 도메인 항체는 sdAb 또는 나노바디로도 알려져 있다. Sdab는 상당히 안정적이고 항체의 Fc 사슬과의 융합 파트너로서 발현시키기 쉽다 (Harmsen MM, De Haard HJ (2007). "Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments". Appl. Microbiol Biotechnol. 77(1): 13-22).
용어 "전장 항체", "온전한 항체" 및 "전체 항체"는 자연 발생 항체 구조와 상당히 유사한 구조를 갖고 Fc 영역을 포함하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 본원에 사용된다. 예를 들어, IgG 분자를 지칭하는데 사용될 때, "전장 항체"는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 항체이다.
"항체 단편"은 무손상 항체의 항원-결합 또는 가변 영역과 같은 무손상 항체의 부분을 포함한다. 항체 단편은, 예를 들어, Fv 단편, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, scFv(sFv) 단편, 및 scFv-Fc 단편을 포함한다.
항-TREM1 항체는 표에 제시된 클론과 같은 본 명세서에 기재된 것들을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 대안적 스캐폴드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 대안적 스캐폴드로 구성된다. 일부 실시형태에서, 항체는 본질적으로 대안적 스캐폴드로 구성된다. 일부 실시형태에서, 항체는 항체 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 항체 단편으로 구성된다. 일부 실시형태에서, 항체는 본질적으로 항체 단편으로 구성된다. "TREM1 항체", "항-TREM1 항체" 또는 "TREM1-특이적 항체"는 항원 TREM1에 특이적으로 결합하는 본 명세서에 제공된 바와 같은 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 TREM1의 세포외 도메인에 결합한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 TREM1 항체는 상이한 종으로부터의 TREM1 단백질 사이에 또는 그 중에 보존된 TREM1의 에피토프에 결합한다. 항-TREM1 항체는 TREM-26 클론을 포함할 수 있다 (BioLegend; 카탈로그 번호 314907; Li J,　등.　2011.　Dev. Comp. Immunol.　epub.).
일부 실시형태에서 항체는 모노클로날 항체이다.
일부 실시형태에서 항체는 폴리클로날 항체이다.
일부 실시형태에서 항체는 하이브리도마에 의해 생산된다. 다른 실시형태에서, 항체는 원하는 가변 및 불변 도메인을 발현하도록 조작된 재조합 세포에 의해 생산된다.
일부 실시형태에서, 항체는 항원 특이성 및 하부 힌지 영역을 보유하는 단일 사슬 항체 또는 다른 항체 유도체 또는 이의 변이체일 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체는 다작용성 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체는 모노클로날 항체, 중성 항체, 길항적 항체, 작용제 항체, 폴리클로날 항체, 어푸코실화된 항체, 이중특이적 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 전장 항체, 및 이의 항원 결합 단편이다. 특정 실시형태에서, 항체 단편 또는 이의 유도체는 Fab 단편, Fab'2 단편, CDR, 및 ScFv로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 항체는 이의 항원-결합 단편, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, (scFv)2, 단일 사슬 항체 분자, 이중 가변 도메인 항체, 단일 가변 도메인 항체, 선형 항체, 또는 V 도메인 항체이다.
일부 실시형태에서, 항체는 면역 복합체를 형성할 수 있다. 예를 들어, 면역 복합체는 항체로 덮인 종양 세포일 수 있다.
일부 실시형태에서, TREM1 항체는 인간 TREM1 (서열번호: 1)에 대한 결합에 대해 참고 항체와 경쟁한다.
TREM1 항체의 서열
V H 도메인
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로부터 선택된 VH 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 3의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 4의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 5의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공된 항체는 서열번호: 6의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공된 항체는 서열번호: 7의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공된 항체는 서열번호: 8의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공된 항체는 서열번호: 9의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공된 항체는 서열번호: 10의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 11의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 12의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 13의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 14의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 15의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 16의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 17의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 18의 VH 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열 번호: 4, 5, 6, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 및 18에 제공된 예시적인 VH 서열에 대해 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 4, 5, 6, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 16, 17, 18에 제공된 VH 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시형태에서, 이 단락에 기재된 항체는 본 명세서에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는, 예를 들어, 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본 명세서에 제공된 방법에 따라 새로 단리될 수 있다.
V L 도메인
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 19, 20, 21, 및 22로부터 선택된 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 19의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공된 항체는 서열번호: 20의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공된 항체는 서열번호: 21의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공된 항체는 서열번호: 22의 VL 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공된 항체는 서열번호: 19, 20, 21, 및 22에 제공된 예시적인 VL 서열에 대해 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 19, 20, 21 및 22에 제공된 VL 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시형태에서, 이 단락에 기재된 항체는 본 명세서에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는, 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본 명세서에 제공된 방법에 따라 새로 단리될 수 있다.
VH-VL 조합
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 및 18로부터 선택된 VH 서열; 및 서열번호: 19, 20, 21, 및 22로부터 선택된 VL 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 17의 VH 서열 및 서열번호: 20의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 17의 VH 서열 및 서열번호: 19의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 17의 VH 서열 및 서열번호: 21의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 17의 VH 서열 및 서열번호: 22의 VL 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 16의 VH 서열 및 서열번호: 19의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 16의 VH 서열 및 서열번호: 20의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 16의 VH 서열 및 서열번호: 21의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 16의 VH 서열 및 서열번호: 22의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 18의 VH 서열 및 서열번호: 19의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 18의 VH 서열 및 서열번호: 20의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 18의 VH 서열 및 서열번호: 21의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 18의 VH 서열 및 서열번호: 22의 VL 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 13의 VH 서열 및 서열번호: 20의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 13의 VH 서열 및 서열번호: 19의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 13의 VH 서열 및 서열번호: 21의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 13의 VH 서열 및 서열번호: 22의 VL 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 12의 VH 서열 및 서열번호: 19의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 12의 VH 서열 및 서열번호: 20의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 12의 VH 서열 및 서열번호: 21의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 12의 VH 서열 및 서열번호: 22의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 14의 VH 서열 및 서열번호: 19의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 14의 VH 서열 및 서열번호: 21의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 14의 VH 서열 및 서열번호: 22의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 14의 VH 서열 및 서열번호: 20의 VL 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 9의 VH 서열 및 서열번호: 20의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 9의 VH 서열 및 서열번호: 19의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 9의 VH 서열 및 서열번호: 21의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 9의 VH 서열 및 서열번호: 22의 VL 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 8의 VH 서열 및 서열번호: 19의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 8의 VH 서열 및 서열번호: 20의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 8의 VH 서열 및 서열번호: 21의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 8의 VH 서열 및 서열번호: 22의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 10의 VH 서열 및 서열번호: 19의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 10의 VH 서열 및 서열번호: 21의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 10의 VH 서열 및 서열번호: 22의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 10의 VH 서열 및 서열번호: 20의 VL 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 5의 VH 서열 및 서열번호: 20의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 5의 VH 서열 및 서열번호: 19의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 5의 VH 서열 및 서열번호: 21의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 5의 VH 서열 및 서열번호: 22의 VL 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 4의 VH 서열 및 서열번호: 19의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 4의 VH 서열 및 서열번호: 20의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 4의 VH 서열 및 서열번호: 21의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 4의 VH 서열 및 서열번호: 22의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 6의 VH 서열 및 서열번호: 19의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 6의 VH 서열 및 서열번호: 21의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 6의 VH 서열 및 서열번호: 22의 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 6의 VH 서열 및 서열번호: 20의 VL 서열을 포함한다.
특정 양태에서, 임의의 서열번호: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 및 18은 임의의 서열번호: 19, 20, 21, 및 22와 조합될 수 있다. 예를 들어, 서열번호: 9는 임의의 서열번호: 19, 20, 21, 및 22와 조합될 수 있다. 또 다른 예로서, 서열번호: 17은 임의의 서열번호: 19, 20, 21 및 22와 조합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18에 제공된 예시적인 VH 서열에 대해 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열; 및 서열번호: 19, 20, 21, 및 22에 제공된 예시적인 VL 서열에 대해 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 및 18에 제공된 VH 서열 및, 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 19, 20, 21, 및 22에 제공된 VL 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시형태에서, 이 단락에 기재된 항체는 본 명세서에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는, 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본 명세서에 제공된 방법에 따라 새로 단리될 수 있다.
CDR
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 및 18로부터 선택된 VH 도메인의 1 내지 3개 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로부터 선택된 VH 도메인의 2 내지 3개 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18부터 선택된 VH 도메인의 3개 CDR을 포함한다. 일부 양태에서, CDR은 예시적인 CDR이다. 일부 양태에서, CDR은 카바트 CDR이다. 일부 양태에서, CDR은 초티아 CDR이다. 일부 양태에서, CDR은 AbM CDR이다. 일부 양태에서, CDR은 접촉 CDR이다. 일부 양태에서, CDR은 IMGT CDR이다.
일부 실시형태에서, CDR은 서열번호: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18의 CDR-H1, CDR-H2 또는 CDR-H3과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 CDR이다. 일부 실시형태에서, CDR-H1은 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 및 18로부터 선택된 VH 도메인의 CDR-H1이다. 일부 실시형태에서, CDR-H2는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로부터 선택된 VH 도메인의 CDR-H2이다. 일부 실시형태에서, CDR-H3은 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18로부터 선택된 VH 도메인의 CDR-H3이다. 일부 양태에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시형태에서, 이 단락에 기재된 항체는 본 명세서에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는, 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본 명세서에 제공된 방법에 따라 새로 단리될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 19, 20, 21, 및 22로부터 선택된 VL 도메인의 1 내지 3개 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 19, 20, 21, 및 22로부터 선택된 VL 도메인의 2 내지 3개 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 19, 20, 21, 및 22로부터 선택된 VL 도메인의 3개 CDR을 포함한다. 일부 양태에서, CDR은 예시적인 CDR이다. 일부 양태에서, CDR은 카바트 CDR이다. 일부 양태에서, CDR은 초티아 CDR이다. 일부 양태에서, CDR은 AbM CDR이다. 일부 양태에서, CDR은 접촉 CDR이다. 일부 양태에서, CDR은 IMGT CDR이다.
일부 실시형태에서, CDR은 서열번호: 19, 20, 21, 및 22의 CDR-L1, CDR-L2 또는 CDR-L3과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는 CDR이다. 일부 실시형태에서, CDR-L1은 최대 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 19, 20, 21 및 22로부터 선택되는 VL 도메인의 CDR-L1이다. 일부 실시형태에서, CDR-L2는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 19, 20, 21 및 22로부터 선택되는 VL 도메인의 CDR-L2이다. 일부 실시형태에서, CDR-L3은 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 19, 20, 21 및 22로부터 선택되는 VL 도메인의 CDR-L3이다. 일부 양태에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시형태에서, 이 단락에 기재된 항체는 본 명세서에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는, 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본 명세서에 제공된 방법에 따라 새로 단리될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 및 18로부터 선택된 VH 도메인의 1 내지 3개 CDR 및 서열번호: 19, 20, 21, 및 22로부터 선택된 VL 도메인의 1 내지 3개 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 및 18로부터 선택된 VH 도메인의 2 내지 3개 CDR 및 서열번호: 19, 20, 21, 및 22로부터 선택된 VL 도메인의 2 내지 3개 CDR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 및 18로부터 선택된 VH 도메인의 3개 CDR 및 서열번호: 19, 20, 21, 및 22로부터 선택된 VL 도메인의 3개 CDR을 포함한다. 일부 양태에서, CDR은 예시적인 CDR이다. 일부 양태에서, CDR은 카바트 CDR이다. 일부 양태에서, CDR은 초티아 CDR이다. 일부 양태에서, CDR은 AbM CDR이다. 일부 양태에서, CDR은 접촉 CDR이다. 일부 양태에서, CDR은 IMGT CDR이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 25, 29, 30, 31, 32, 및 33 중에서 선택된 CDR-H3을 포함한다. 일부 양태에서, CDR-H3은 서열번호: 25, 29, 30, 31, 32, 및 33의 CDR-H3과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, CDR-H3은 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 25, 29, 30, 31, 32, 및 33 중에서 선택된 CDR-H3이다. 일부 양태에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시형태에서, 이 단락에 기재된 항체는 본 명세서에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는, 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본 명세서에 제공된 방법에 따라 새로 단리될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 33 중에서 선택된 CDR-H3을 포함한다. 일부 양태에서, CDR-H3은 서열번호: 33의 CDR-H3과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, CDR-H3은 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 33 중에서 선택된 CDR-H3이다. 일부 양태에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시형태에서, 이 단락에 기재된 항체는 본 명세서에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는, 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본 명세서에 제공된 방법에 따라 새로 단리될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 32 중에서 선택된 CDR-H3을 포함한다. 일부 양태에서, CDR-H3은 서열번호: 32의 CDR-H3과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, CDR-H3은 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 32 중에서 선택된 CDR-H3이다. 일부 양태에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시형태에서, 이 단락에 기재된 항체는 본 명세서에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는, 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본 명세서에 제공된 방법에 따라 새로 단리될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 25 중에서 선택된 CDR-H3을 포함한다. 일부 양태에서, CDR-H3은 서열번호: 25의 CDR-H3과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, CDR-H3은 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 25 중에서 선택된 CDR-H3이다. 일부 양태에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시형태에서, 이 단락에 기재된 항체는 본 명세서에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는, 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본 명세서에 제공된 방법에 따라 새로 단리될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 24의 CDR-H2를 포함한다. 일부 양태에서, CDR-H2는 서열번호: 24의 CDR-H2와 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, CDR-H2는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 24의 CDR-H2이다. 일부 양태에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시형태에서, 이 단락에 기재된 항체는 본 명세서에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는, 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본 명세서에 제공된 방법에 따라 새로 단리될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 23의 CDR-H1을 포함한다. 일부 양태에서, CDR-H1은 서열번호: 23의 CDR-H1과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, CDR-H1은 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 23의 CDR-H1이다. 일부 양태에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시형태에서, 이 단락에 기재된 항체는 본 명세서에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는, 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본 명세서에 제공된 방법에 따라 새로 단리될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 29의 CDR-H3 및 서열번호: 24의 CDR-H2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 29의 CDR-H3, 서열번호: 24의 CDR-H2, 및 서열번호: 23의 CDR-H1을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR-H3은 서열번호: 29의 CDR-H3과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖고, CDR-H2는 서열번호: 24의 CDR-H2와 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖고, CDR-H1은 서열번호: 23의 CDR-H1과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, CDR-H3은 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 29의 CDR-H3이고; CDR-H2는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 24의 CDR-H2이고; CDR-H1은 최대 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 23의 CDR-H1이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 25의 CDR-H3 및 서열번호: 24의 CDR-H2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 25의 CDR-H3, 서열번호: 24의 CDR-H2, 및 서열번호: 23의 CDR-H1을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR-H3은 서열번호: 25의 CDR-H3과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖고, CDR-H2는 서열번호: 24의 CDR-H2와 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖고, CDR-H1은 서열번호: 23의 CDR-H1과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, CDR-H3은 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 25의 CDR-H3이고; CDR-H2는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 24의 CDR-H2이고; CDR-H1은 최대 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 23의 CDR-H1이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 33의 CDR-H3 및 서열번호: 24의 CDR-H2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 33의 CDR-H3, 서열번호: 24의 CDR-H2, 및 서열번호: 23의 CDR-H1을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR-H3은 서열번호: 33의 CDR-H3과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖고, CDR-H2는 서열번호: 24의 CDR-H2와 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖고, CDR-H1은 서열번호: 23의 CDR-H1과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, CDR-H3은 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 33의 CDR-H3이고; CDR-H2는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 24의 CDR-H2이고; CDR-H1은 최대 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 23의 CDR-H1이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 32의 CDR-H3 및 서열번호: 24의 CDR-H2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 32의 CDR-H3, 서열번호: 24의 CDR-H2, 및 서열번호: 23의 CDR-H1을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR-H3은 서열번호: 32의 CDR-H3과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖고, CDR-H2는 서열번호: 24의 CDR-H2와 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖고, CDR-H1은 서열번호: 23의 CDR-H1과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, CDR-H3은 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 32의 CDR-H3이고; CDR-H2는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 24의 CDR-H2이고; CDR-H1은 최대 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산 치환을 갖는 서열번호: 23의 CDR-H1이다. 일부 양태에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시형태에서, 이 단락에 기재된 항체는 본 명세서에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는, 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본 명세서에 제공된 방법에 따라 새로 단리될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 30의 CDR-H3 및 서열번호: 24의 CDR-H2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 30의 CDR-H3, 서열번호: 24의 CDR-H2, 및 서열번호: 23의 CDR-H1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 31의 CDR-H3 및 서열번호: 24의 CDR-H2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 31의 CDR-H3, 서열번호: 24의 CDR-H2, 및 서열번호: 23의 CDR-H1을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 28의 CDR-L3을 포함한다. 일부 양태에서, CDR-L3은 서열번호: 28의 CDR-L3과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, CDR-L3은 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 28의 CDR-L3이다. 일부 양태에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시형태에서, 이 단락에 기재된 항체는 본 명세서에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는, 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본 명세서에 제공된 방법에 따라 새로 단리될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 27의 CDR-L2를 포함한다. 일부 양태에서, CDR-L2는 서열번호: 27의 CDR-L2와 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, CDR-L2는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 27의 CDR-L2이다. 일부 양태에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시형태에서, 이 단락에 기재된 항체는 본 명세서에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는, 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본 명세서에 제공된 방법에 따라 새로 단리될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 26의 CDR-L1을 포함한다. 일부 양태에서, CDR-L1은 서열번호: 26의 CDR-L1과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, CDR-L1은 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 26의 CDR-L1이다. 일부 양태에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시형태에서, 이 단락에 기재된 항체는 본 명세서에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는, 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본 명세서에 제공된 방법에 따라 새로 단리될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공된 항체는 서열번호: 28의 CDR-L3 및 서열번호: 27의 CDR-L2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공된 항체는 서열번호: 28의 CDR-L3, 서열번호: 27의 CDR-L2, 및 서열번호: 26의 CDR-L1을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR-L3은 서열번호: 28의 CDR-L3과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 가지고, CDR-L2는 서열번호: 27의 CDR-L2와 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 가지고, CDR-L1은 서열번호: 26의 CDR-L1과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, CDR-L3은 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 28의 CDR-L3이고; CDR-L2는 최대 1, 2, 3 또는 4개 아미노산 치환을 갖는 서열번호: 27의 CDR-L2이고; CDR-L1은 최대 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 아미노산 치환을 갖는 서열번호: 26의 CDR-L1이다. 일부 양태에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시형태에서, 이 단락에 기재된 항체는 본 명세서에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는, 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본 명세서에 제공된 방법에 따라 새로 단리될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 33의 CDR-H3, 서열번호: 24의 CDR-H2, 서열번호: 23의 CDR-H1, 서열번호: 28의 CDR-L3, 서열번호: 27의 CDR-L2, 및 서열번호: 26의 CDR-L1을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR-H3은 서열번호: 33의 CDR-H3과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 가지고, CDR-H2는 서열번호: 24의 CDR-H2와 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 가지고, CDR-H1은 서열번호: 23의 CDR-H1과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 가지고, CDR-L3은 서열번호: 28의 CDR-L3과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 가지고, CDR-L2는 서열번호: 27의 CDR-L2와 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 가지고, CDR-L1은 서열번호: 26의 CDR-L1과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, CDR-H3은 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 33의 CDR-H3이고; CDR-H2는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 24의 CDR-H2이고; CDR-H1은 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 치환을 갖는 서열번호: 23의 CDR-H1이고; CDR-L3은 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 치환을 갖는 서열번호: 28의 CDR-L3이고; CDR-L2는 최대 1, 2, 3, 또는 4개 아미노산 치환을 갖는 서열번호: 27의 CDR-L2이고; CDR-L1은 최대 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 아미노산 치환을 갖는 서열번호: 26의 CDR-L1이다. 일부 양태에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시형태에서, 이 단락에 기재된 항체는 본 명세서에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는, 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본 명세서에 제공된 방법에 따라 새로 단리될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 32의 CDR-H3, 서열번호: 24의 CDR-H2, 서열번호: 23의 CDR-H1, 서열번호: 28의 CDR-L3, 서열번호: 27의 CDR-L2, 및 서열번호: 26의 CDR-L1을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR-H3은 서열번호: 32의 CDR-H3과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 가지고, CDR-H2는 서열번호: 24의 CDR-H2와 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 가지고, CDR-H1은 서열번호: 23의 CDR-H1과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 가지고, CDR-L3은 서열번호: 28의 CDR-L3과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖고, CDR-L2는 서열번호: 27의 CDR-L2와 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 가지고, CDR-L1은 서열번호: 26의 CDR-L1과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 가진다. 일부 실시형태에서, CDR-H3은 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 32의 CDR-H3이고; CDR-H2는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 24의 CDR-H2이고; CDR-H1은 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 23의 CDR-H1이고; CDR-L3은 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 28의 CDR-L3이고; CDR-L2는 최대 1, 2, 3, 또는 4개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 27의 CDR-L2이고; CDR-L1은 최대 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 26의 CDR-L1이다. 일부 양태에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시형태에서, 이 단락에 기재된 항체는 본 명세서에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는, 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본 명세서에 제공된 방법에 따라 새로 단리될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 29의 CDR-H3, 서열번호: 24의 CDR-H2, 서열번호: 23의 CDR-H1, 서열번호: 28의 CDR-L3, 서열번호: 27의 CDR-L2, 및 서열번호: 26의 CDR-L1을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR-H3은 서열번호: 29의 CDR-H3과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 가지고, CDR-H2는 서열번호: 24의 CDR-H2와 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 가지고, CDR-H1은 서열번호: 23의 CDR-H1과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 가지고, CDR-L3은 서열번호: 28의 CDR-L3과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 가지고, CDR-L2는 서열번호: 27의 CDR-L2와 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 가지고, CDR-L1은 서열번호: 26의 CDR-L1과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, CDR-H3은 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 29의 CDR-H3이고; CDR-H2는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 24의 CDR-H2이고; CDR-H1은 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 23의 CDR-H1이고; CDR-L3은 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 28의 CDR-L3이고; CDR-L2는 최대 1, 2, 3, 또는 4개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 27의 CDR-L2이고; CDR-L1은 최대 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 아미노산 치환을 갖는 서열번호: 26의 CDR-L1이다. 일부 양태에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시형태에서, 이 단락에 기재된 항체는 본 명세서에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는, 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본 명세서에 제공된 방법에 따라 새로 단리될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 25의 CDR-H3, 서열번호: 24의 CDR-H2, 서열번호: 23의 CDR-H1, 서열번호: 28의 CDR-L3, 서열번호: 27의 CDR-L2, 및 서열번호: 26의 CDR-L1을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR-H3은 서열번호: 25의 CDR-H3과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 가지고, CDR-H2는 서열번호: 24의 CDR-H2와 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 가지고, CDR-H1은 서열번호: 23의 CDR-H1과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 가지고, CDR-L3은 서열번호: 28의 CDR-L3과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 가지고, CDR-L2는 서열번호: 27의 CDR-L2와 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 가지고, CDR-L1은 서열번호: 26의 CDR-L1과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, CDR-H3은 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 25의 CDR-H3이고; CDR-H2는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 24의 CDR-H2이고; CDR-H1은 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 23의 CDR-H1이고; CDR-L3은 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 28의 CDR-L3이고; CDR-L2는 최대 1, 2, 3, 또는 4개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 27의 CDR-L2이고; CDR-L1은 최대 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 26의 CDR-L1이다. 일부 양태에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시형태에서, 이 단락에 기재된 항체는 본 명세서에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는, 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본 명세서에 제공된 방법에 따라 새로 단리될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 30 또는 31의 CDR-H3, 서열번호: 24의 CDR-H2, 서열번호: 23의 CDR-H1, 서열번호: 28의 CDR-L3, 서열번호: 27의 CDR-L2, 및 서열번호: 26의 CDR-L1을 포함한다. 일부 실시형태에서, CDR-H3은 서열번호: 30 또는 31의 CDR-H3과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성을 가지고, CDR-H2는 서열번호: 24의 CDR-H2와 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 가지고, CDR-H1은 서열번호: 23의 CDR-H1과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 가지고, CDR-L3은 서열번호: 28의 CDR-L3과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 가지고, CDR-L2는 서열번호: 27의 CDR-L2와 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성을 가지고, CDR-L1은 서열번호: 26의 CDR-L1과 적어도 약 50%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, CDR-H3은 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 30 또는 31의 CDR-H3이고; CDR-H2는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 24의 CDR-H2이고; CDR-H1은 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 23의 CDR-H1이고; CDR-L3은 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 28의 CDR-L3이고; CDR-L2는 최대 1, 2, 3, 또는 4개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 27의 CDR-L2이고; CDR-L1은 최대 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 아미노산 치환을 갖는, 서열번호: 26의 CDR-L1이다. 일부 양태에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시형태에서, 이 단락에 기재된 항체는 본 명세서에서 "변이체"로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는, 예를 들어 친화도 성숙, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발, 또는 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법에 의해 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변이체는 본 명세서에 제공된 서열로부터 유래되지 않고, 예를 들어 항체를 수득하기 위해 본 명세서에 제공된 방법에 따라 새로 단리될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 23의 CDR-H1, 서열번호: 24의 CDR-H2, 서열번호: 33의 CDR-H3, 서열번호: 26의 CDR-L1, 서열번호: 27의 CDR-L2, 및 서열번호: 28의 CDR-L3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 23의 CDR-H1, 서열번호: 24의 CDR-H2, 서열번호: 25의 CDR-H3, 서열번호: 26의 CDR-L1, 서열번호: 27의 CDR-L2, 및 서열번호: 28의 CDR-L3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 23의 CDR-H1, 서열번호: 24의 CDR-H2, 서열번호: 29의 CDR-H3, 서열번호: 26의 CDR-L1, 서열번호: 27의 CDR-L2, 및 서열번호: 28의 CDR-L3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 23의 CDR-H1, 서열번호: 24의 CDR-H2, 서열번호: 32의 CDR-H3, 서열번호: 26의 CDR-L1, 서열번호: 27의 CDR-L2, 및 서열번호: 28의 CDR-L3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 23의 CDR-H1, 서열번호: 24의 CDR-H2, 서열번호: 30의 CDR-H3, 서열번호: 26의 CDR-L1, 서열번호: 27의 CDR-L2, 및 서열번호: 28의 CDR-L3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 서열번호: 23의 CDR-H1, 서열번호: 24의 CDR-H2, 서열번호: 31의 CDR-H3, 서열번호: 26의 CDR-L1, 서열번호: 27의 CDR-L2, 및 서열번호: 28의 CDR-L3을 포함한다.
Fc 영역
본 명세서에서 용어 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 본 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 다양한 면역글로불린의 Fc 영역의 구조 및 그곳에 함유된 글리코실화 부위는 당업계에 공지되어 있다. 그 전체가 참고로 포함된, Schroeder and Cavacini, J. Allergy Clin. Immunol., 2010, 125:S41-52를 참고한다. Fc 영역은 자연적으로 발생하는 Fc 영역, 또는 당업계 또는 본 개시내용의 다른 곳에서 기술된 바와 같이 변형된 Fc 영역일 수 있다.
본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내 아미노산 잔기의 넘버링은 하기에 기재된 바와 같이, EU 인덱스라고도 하는 EU 넘버링 시스템을 따른다: Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. 본원에 사용된 이량체 Fc의 "Fc 폴리펩티드"는 이량체 Fc 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩티드 중 하나, 즉 면역글로불린 중쇄의 C-말단 불변 영역을 포함하고, 안정적인 자가-회합 가능한 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, 이량체 IgG Fc의 Fc 폴리펩티드는 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 도메인 서열을 포함한다. Fc는 부류 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 것일 수 있으며, 이들 중 몇몇은 하위 부류 (이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 나뉠 수 있다.
용어 "Fc 수용체" 및 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 설명하기 위해 사용된다. 예를 들어, FcR은 천연 서열 인간 FcR일 수 있다. 일반적으로, FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하고, 대립 유전자 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태의 이들 수용체를 포함하는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위 부류의 수용체를 포함하는 것이다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하는데, 이들은 주로 세포질 도메인이 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 다른 이소형의 면역글로불린은 또한 특정 FcR에 의해 결합될 수 있다 (예를 들어, Janeway 등, Immuno Biology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY) (4th ed., 1999) 참고). 활성화 수용체 FcγRIIA는 이의 세포질 도메인에서 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 이의 세포질 도메인에서 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 (
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, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)에서 검토됨). FcR은 하기에서 검토된다: Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel 등, Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas 등, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). 미래에 확인될 것을 비롯한 다른 FcR은 본원에서 용어 "FcR"에 포함된다. 상기 용어는 또한 모체 IgG를 태아로 옮기는 역할을 하는 신생아 수용체인 FcRn을 포함한다 (Guyer 등, J. Immunol. 117:587 (1976); 및 Kim 등, J. Immunol. 24:249 (1994)).
CH2 도메인 내 변형은 Fc에 대한 FcR의 결합에 영향을 줄 수 있다. 상이한 Fc-감마 수용체에 대한 Fc의 친화도를 선택적으로 변경시키기 위해 Fc 영역 내 수많은 아미노산 변형이 당 업계에 공지되어 있다. 일부 측면에서, Fc는 Fc-감마 수용체의 선택적인 결합을 촉진시키기 위한 하나 이상의 변형을 포함한다.
Fc에 대한 FcR의 결합을 변경시키는 예시적인 돌연변이는 하기 열거되어 있다:
S298A/E333A/K334A,　S298A/E333A/K334A/K326A (Lu Y, Vernes JM, Chiang N, 등 　J Immunol Methods. 2011 Feb 28;365(1-2):132-41);
F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L,　F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L (Stavenhagen JB, Gorlatov S, Tuaillon N, 등 Cancer Res. 2007 Sep 15;67(18):8882-90;　Nordstrom JL, Gorlatov S, Zhang W, 등 Breast Cancer Res. 2011 Nov 30;13(6):R123);
F243L (Stewart R, Thom G, Levens M, 등 Protein Eng Des Sel. 2011 Sep;24(9):671-8.),　S298A/E333A/K334A (Shields RL, Namenuk AK, Hong K, 등 J Biol Chem. 2001 Mar 2;276(9):6591-604);
S239D/I332E/A330L,　S239D/I332E (Lazar GA, Dang W, Karki S, 등 Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Mar 14;103(11):4005-10);
S239D/S267E,　S267E/L328F (Chu SY, Vostiar I, Karki S, 등 Mol Immunol. 2008 Sep;45(15):3926-33);
S239D/D265S/S298A/I332E,　S239E/S298A/K326A/A327H,　G237F/S298A/A330L/I332E,　S239D/I332E/S298A,　S239D/K326E/A330L/I332E/S298A,　G236A/S239D/D270L/I332E,　S239E/S267E/H268D,　L234F/S267E/N325L,　G237F/V266L/S267D 및 본원에 참고로 포함된 WO2011/120134 및 WO2011/120135에 열거된 다른 돌연변이. 치료 항체 조작 (Therapeutic Antibody Engineering)　(William R. Strohl and Lila M. Strohl 저, Woodhead Publishing series in Biomedicine No 11, ISBN 1 907568 37 9, Oct 2012)에서는 페이지 283에서 돌연변이가 열거되어 있다.
일부 구현예에서 본원에 기재된 항체는 효과기 기능을 매개하는 이의 능력을 개선시키기 위한 변형을 포함한다. 그와 같은 변형은 당 업계에 공지되어 있으며, 활성화 수용체, 주로 ADCC의 경우 FCGR3a, CDC의 경우 C1q에 대한 Fc의 친화도의 탈푸코실화 또는 조작을 포함한다. 하기 표 B는 효과기 기능 조작에 대해 문헌에 보고된 다양한 디자인을 요약하고 있다.
아미노산 서열을 변경함이 없이 Fc 글리코실화 부위 (Asn 297 EU 넘버링) 상에 푸코스가 거의 또는 전혀 없는 항체를 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. GlymaX® 기술 (ProBioGen AG)은 푸코스 생합성의 세포 경로를 항체 생산에 사용되는 세포 안으로 편향시키는 효소에 대한 유전자의 도입을 기반으로 한다. 이것은 항체-생산 세포에 의해 N-연결된 항체 탄수화물 부분에 당 "푸코스"의 첨가를 방지한다. (von Horsten 등. (2010) Glycobiology. 2010 Dec; 20(12):1607-18. 푸코실화의 수준이 낮은 항체를 얻기 위한 또 다른 접근법은, 항체 상에 더 낮은 수준의 푸코실화를 생성하는 그 능력에 대해 항체 생산을 위한 세포주 선택을 교시하는, 미국 특허 8,409,572에서 찾아볼 수 있다. 항체는 완전히 어푸코실화되거나 (그것이 검출 가능한 푸코오스를 함유하지 않음을 의미함) 부분적으로 어푸코실화될 수 있으며, 이는 단리된 항체가 포유동물 발현 시스템에 의해 생성된 유사한 항체에 대해 정상적으로 검출되는 푸코스 양의 95% 미만, 85% 미만, 75% 미만, 65% 미만, 55% 미만, 45% 미만, 35% 미만, 25% 미만, 15% 미만 또는 5% 미만을 함유한다는 것을 의미한다.
따라서, 일 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 개선된 효과기 기능을 제공하는 표 B에 언급된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 이량체 Fc를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 항체는 효과기 기능을 개선시키기 위해 탈푸코실화될 수 있다.
표 B: CH2 도메인 및 효과기 기능 조작
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FcγR 및/또는 보체 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 변형이 당 업계에 공지되어 있다. 최근 간행물은 효과기 활성이 감소되거나 침묵된 항체를 조작하는데 사용된 전략을 설명한다 (Strohl, WR (2009), Curr Opin Biotech 20:685-691, 및 Strohl, WR 및 Strohl LM, "Antibody Fc engineering for optimal antibody performance" In Therapeutic Antibody Engineering, Cambridge: Woodhead Publishing (2012), pp 225-249 참고). 이들 전략은 글리코실화의 변형, IgG2/IgG4 스캐폴드의 사용, 또는 Fc의 힌지 또는 CH2 영역에 돌연변이의 도입을 통한 효과기 기능의 감소를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 공보 번호 2011/0212087 (Strohl), 국제 특허 공보 번호 WO 2006/105338 (Xencor), 미국 특허 공보 번호 2012/0225058 (Xencor), 미국 특허 공보 번호 2012/0251531 (Genentech), 및 Strop 등 ((2012) J. Mol. Biol. 420: 204-219)은 Fc에 대한 FcγR 또는 보체 결합을 감소시키기 위한 특정 변형을 기술한다.
Fc에 대한 FcγR 또는 보체 결합을 감소시키기 위해 공지된 아미노산 변형의 구체적인 비제한적인 예는 하기 표 C에서 식별된 것들을 포함한다:
표 C: Fc에 대한 FcγR 또는 보체 결합을 감소시키는 변형
Figure pct00005
아미노산 서열을 변경하지 않고 Fc 글리코실화 부위 (Asn 297 EU 넘버링)에서 푸코스가 거의 또는 전혀 없는 항체를 생산하는 방법이 당 업계에 잘 알려져 있다. GlymaxX®　기술 (ProBioGen AG)은 푸코스 생합성의 세포 경로를 항체 생산에 사용되는 세포로 편향시키는 효소 유전자의 도입을 기반으로 한다. 이는 항체-생산 세포에 의해 당 "푸코스"가 N-연결된 항체 탄수화물 부분에 추가되는 것을 방지한다. (von Horsten 등 (2010) Glycobiology.　2010 Dec; 20 (12):1607-18.) 탈푸코실화된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 박테리아 산화 환원 효소 GDP-6-데옥시-D-릭소-4-헥실로스 환원 효소 (RMD)를 안정적으로 과발현시키는 CHO-DG44 (Henning von Horsten 등, Glycobiol 2010, 20:1607-1618 참고) 또는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (Ripka 등, Arch. Biochem . Biophys ., 1986, 249:533-545; 미국 특허 공보 번호 2003/0157108; WO 2004/056312 참고; 이들 각각은 그 전문이 참고로 포함됨), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자 또는 FUT8 녹아웃 CHO 세포 (Yamane-Ohnuki 등, Biotech. Bioeng ., 2004, 87: 614-622; Kanda 등, Biotechnol . Bioeng ., 2006, 94:680-688; 및 WO 2003/085107 참고; 이들 각각은 그 전문이 참고로 포함됨)를 포함한다. 보다 낮은 수준의 푸코실화를 갖는 항체를 수득하기 위한 또 다른 접근법은 미국 특허 8,409,572에서 확인할 수 있으며, 이는 항체 상에서 더 낮은 푸코실화 수준을 생성하는 능력에 대한 항체 생산용 세포주 선택을 교시한다.
어푸코실화된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 박테리아 산화환원효소 GDP-6-데옥시-D-리크소-4-헥실로오스 환원효소 (RMD)의 안정적인 과발현을 갖는 CHO-DG44 (Henning von Horsten 등, Glycobiol 2010, 20:1607-1618 참고) 또는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (Ripka 등, Arch. Biochem. Biophys., 1986, 249:533-545; 미국 특허 공개 번호 2003/0157108, WO 2004/056312를 참고하며, 이들 각각은 그 전체가 참고로 포함됨), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자 또는 FUT8 녹아웃 CHO 세포 (Yamane-Ohnuki 등, Biotech. Bioeng., 2004, 87: 614-622; Kanda 등., Biotechnol. Bioeng., 2006, 94:680-688; 및 WO 2003/085107을 참고하며, 이들 각각은 그 전체가 참고로 포함됨)를 포함한다.
항체는 완전히 탈푸코실화될 수 있거나 (검출 가능한 푸코스를 함유하지 않음을 의미함) 또는 부분적으로 탈푸코실화될 수 있으며, 이는 단리된 항체가 포유동물 발현 시스템에 의해 생성된 유사한 항체에 대해 정상적으로 검출된 푸코스 양의 95% 미만, 85% 미만, 75% 미만, 65% 미만, 55% 미만, 45% 미만, 35% 미만, 25% 미만, 15% 미만 또는 5% 미만을 함유함을 의미한다.
일부 측면에서, 본원에 제공된 항체는 자연 발생 IgG1 도메인과 비교하여 Asn 297번 위치에서 감소된 푸코스 함량을 갖는 IgG1 도메인을 포함한다. 그와 같은 Fc 도메인은 ADCC를 개선시키는 것으로 알려져 있다. 그 전문이 참고로 포함된 Shields 등, J. Biol . Chem ., 2002, 277:26733-26740을 참고한다. 일부 측면에서, 그와 같은 항체는 Asn 297번 위치에서 어떠한 푸코스도 포함하지 않는다. 푸코스의 양은, 예를 들어, 그 전문이 참고로 포함된, WO 2008/077546에 기재된 바와 같이, 임의의 적합한 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 ADCC를 개선하는 하나 이상의 아미노산 치환, 예컨대 Fc 영역의 위치 298, 333, 및 334 중 하나 이상에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 제공된 항체는 그 전체가 참고로 포함된, Lazar 등., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006,103:4005-4010에서 기술된 바와 같이, 위치 239, 332, 및 330에서 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
본원에 제공된 항체에 포함될 수 있는 다른 예시적인 글리코실화 변이체는 예를 들어 미국 특허 출원 번호 2003/0157108, 2004/0093621, 2003/0157108, 2003/0115614, 2002/0164328, 2004/0093621, 2004/0132140, 2004/0110704, 2004/0110282, 2004/0109865; 국제 특허 출원 번호 2000/61739, 2001/29246, 2003/085119, 2003/084570, 2005/035586, 2005/035778; 2005/053742, 2002/031140; Okazaki 등, J. Mol . Biol ., 2004, 336:1239-1249; 및 Yamane-Ohnuki 등, Biotech. Bioeng., 2004, 87: 614-622에 기재되어 있고; 이들 각각은 그 전문이 참고로 포함되어 있다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 Fc 영역에 부착된 올리고당에서 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 Fc 영역을 포함한다. 그와 같은 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 그와 같은 항체 변이체의 예는 예를 들어 WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764에 기재되어 있고; 이들 각각은 그 전문이 참고로 포함되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 C1q 결합 및/또는 CDC를 개선하거나 감소시키는 하나 이상의 수정을 포함한다. 미국 특허 번호 6,194,551; WO 99/51642; 및 Idusogie 등., J. Immunol., 2000, 164:4178-4184를 참고하며; 이들 각각은 그 전체가 참고로 포함된다.
일부 실시형태에서, 항체는 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM으로부터 선택된 클래스의 중쇄 인간 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, Fc 영역은 인간 Fc 영역이다. 일부 실시형태에서, 인간 Fc 영역은 IgG 클래스 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택된 서브클래스의 인간 중쇄 불변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 Fc 영역은 야생형 인간 IgG1 Fc를 포함한다.
결합
"친화도"는 분자의 단일 결합 부위 (예를 들어, 항체)와 이의 결합 파트너 (예를 들어, 항원 또는 에피토프) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 본원에 사용된 "친화도"는 결합 쌍의 구성원 (예를 들어, 항체 및 항원 또는 에피토프) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 이의 파트너 Y에 대한 친화도는 해리 평형 상수 (KD)로 나타낼 수 있다. 해리 평형 상수에 기여하는 동역학 성분은 하기에 더 자세히 설명되어 있다. 친화도는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술 (예를 들어, BIACORE®) 또는 생물층 간섭계법 (예를 들어, FORTEBIO®)과 같은 본원에 기재된 것을 포함하여, 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다.
표적 분자에 대한 항체의 결합과 관련하여, 용어 특정 항원 (예를 들어, 폴리펩티드 표적) 또는 특정 항원 상의 에피토프에 "결합한다", "특이적 결합", "특이적으로 결합한다", "특이적인", "선택적으로 결합한다" 및 "선택적인"은 (예를 들어, 비-표적 분자와) 비-특이적 또는 비-선택적 상호작용과는 측정 가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어 표적 분자에 대한 결합을 측정하고 이를 비-표적 분자에 대한 결합과 비교함에 의해 측정될 수 있다. 특이적 결합은 또한 표적 분자 상에서 인식되는 에피토프를 모방하는 대조군 분자와의 경쟁에 의해 결정될 수 있다. 그 경우에, 표적 분자에 대한 항체의 결합이 대조군 분자에 의해 경쟁적으로 억제되면 특이적 결합이 표시된다. 일부 실시형태에서, 비-표적 분자에 대한 TREM1 항체의 친화도는 TREM1에 대한 친화도의 약 50% 미만이다. 일부 실시형태에서, 비-표적 분자에 대한 TREM1 항체의 친화도는 TREM1에 대한 친화도의 약 40% 미만이다. 일부 실시형태에서, 비-표적 분자에 대한 TREM1 항체의 친화도는 TREM1에 대한 친화도의 약 30% 미만이다. 일부 실시형태에서, 비-표적 분자에 대한 TREM1 항체의 친화도는 TREM1에 대한 친화도의 약 20% 미만이다. 일부 실시형태에서, 비-표적 분자에 대한 TREM1 항체의 친화도는 TREM1에 대한 친화도의 약 10% 미만이다. 일부 실시형태에서, 비-표적 분자에 대한 TREM1 항체의 친화도는 TREM1에 대한 친화도의 약 1% 미만이다. 일부 실시형태에서, 비-표적 분자에 대한 TREM1 항체의 친화도는 TREM1에 대한 친화도의 약 0.1% 미만이다.
본원에 사용된 용어 "kd" (sec- 1)는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도 상수를 지칭한다. 이 값은 koff 값이라고도 한다.
본원에 사용된 용어 "ka" (M-1×sec- 1)는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 속도 상수를 지칭한다. 이 값은 또한 kon 값이라고도 한다.
본원에 사용된 용어 "KD" (M)는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭한다. KD = kd/ka. 일부 구현예에서, 항체의 친화도는 이러한 항체와 이의 항원 사이의 상호작용에 대한 KD로 기재된다. 명확성을 위해, 당 업계에 공지된 바와 같이, 더 작은 KD 값은 더 높은 친화력 상호작용을 나타내는 반면, 더 큰 KD 값은 더 낮은 친화력 상호작용을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "KA" (M- 1)는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 평형 상수를 지칭한다. KA = ka/kd.
본원에서 2개 이상의 항체와 관련하여 사용될 때, 용어 "와 경쟁하다" 또는 "와 교차-경쟁하다"는 2개 이상의 항체가 항원 (예를 들어, TREM1)과의 결합에 대해 경쟁한다는 것을 나타낸다. 하나의 예시적인 분석에서, TREM1를 표면에 코팅하고 제1 TREM1 항체와 접촉시킨 후 제2 TREM1 항체를 첨가한다. 또 다른 예시적인 분석에서, 제1 TREM1 항체를 표면에 코팅하고 TREM1와 접촉시킨 다음 제2 TREM1 항체를 첨가한다. 제1 TREM1 항체의 존재가 제2 TREM1 항체의 결합을 감소시킨다면, 어느 분석에서든, 항체는 서로 경쟁한다. 용어 "와 경쟁하다"는 또한 하나의 항체가 또 다른 항체의 결합을 감소시키지만, 항체가 역순으로 첨가될 때 경쟁이 관찰되지 않는 항체의 조합을 포함한다. 그러나, 일부 구현예에서, 제1 및 제2 항체는 이들이 첨가되는 순서와 상관없이 서로 결합을 억제한다. 일부 구현예에서, 하나의 항체는 경쟁적 항원 분석에서 측정될 때 이의 항원에 대한 또 다른 항체의 결합을 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 감소시킨다. 숙련가는 TREM1에 대한 항체의 친화도 및 항체의 원자가에 기초하여 경쟁 분석에 사용되는 항체의 농도를 선택할 수 있다. 이 정의에 기술된 분석은 예시적이며, 숙련가는 항체가 서로 경쟁하는지를 결정하기 위해 임의의 적합한 분석을 이용할 수 있다. 적합한 분석은, 예를 들어, Cox 등, "Immunoassay Methods," in Assay Guidance Manual [Internet], Updated December 24, 2014 (ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/; accessed September 29, 2015); Silman 등, Cytometry, 2001, 44:30-37; 및 Finco 등, J. Pharm . Biomed . Anal., 2011, 54:351-358에 기재되어 있고; 이들 각각은 그 전문이 참고로 포함된다.
과량의 시험 항체 (예를 들어, 적어도 2x, 5x, 10x, 20x, 또는 100x)가 경쟁 결합 분석에서 측정될 때 기준 항체의 결합을, 예를 들어, 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 억제 또는 차단한다면 시험 항체는 기준 항체와 경쟁한다. 경쟁 분석에 의해 동정된 항체 (경쟁 항체)는 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 입체 장애가 발생하도록 기준 항체에 의해 결합된 에피토프에 충분히 근접한 인접 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 예를 들어, TREM1에 대한 결합에 대해 본원에 기재된 제1 항체와 경쟁하는 제2의 경쟁 항체가 동정될 수 있다. 특정 예에서, 제2 항체는 경쟁 결합 분석에서 측정될 때 제1 항체의 결합을, 예를 들어, 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 차단 또는 억제할 수 있다. 특정 예에서, 제2 항체는 제1 항체를 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 초과만큼 대체할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항-TREM1 항체는 암 조직의 외부에 존재하는 골수 세포에 실질적으로 결합하지 않는다. 일부 실시형태에서, 항-TREM1 항체는 암 조직에 존재하는 자극성 골수 세포에 실질적으로 결합하지 않는다.
일부 실시형태에서, 항-TREM1 항체는 인간 TREM1의 잔기 21-34 (서열번호: 42), 103-109 (서열번호: 43), 및 128-136 (서열번호: 44)에 결합한다. 결합 에피토프는 수치 범위 내의 잔기 (예를 들어, TREM1의 잔기 22-33), 각 범위의 시작 잔기 (예를 들어, TREM1의 잔기 21-33) 및 각 범위의 말단 잔기 (예를 들어, TREM1의 잔기 22-34), 또는 이의 조합을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM1 항체는 인간 TREM1의 잔기 22-33, 104-108, 및 129-135에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM1 항체는 인간 TREM1의 잔기 21-33, 103-108, 및 128-135에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM1 항체는 인간 TREM1의 잔기 22-34, 104-109, 및 129-136에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항-TREM1 항체는 잔기 21-34, 22-33, 21-33, 또는 22-34; 103-109, 104-108, 103-108 또는 104-109; 및 128-136, 129-135, 128-135, 또는 129-136으로부터 선택된 잔기에 결합한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 Biacore 검정에 의해 측정될 때, 약 0.001, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 1.95, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 8, 9, 또는 10x10-9 M 이하의 KD로 인간 TREM1에 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체의 KD는 Biacore 검정에 의해 측정될 때, 약 0.001-0.01, 0.01-0.1, 0.01-0.05, 0.05-0.1, 0.1-0.5, 0.5-1, 0.25-0.75, 0.25-0.5, 0.5-0.75, 0.75-1, 0.75-2, 1.1-1.2, 1.2-1.3, 1.3-1.4, 1.4-1.5, 1.5-1.6, 1.6-1.7, 1.7-1.8, 1.8-1.9, 1.9-2, 1-2, 1-5, 2-7, 3-8, 3-5, 4-6, 5-6, 5-5.5, 5.5-6, 5-7, 6-7, 6-6.5, 6.5-7, 6-8, 7-9, 7-10, 또는 5-10x10-9 M 사이이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 Biacore 검정에 의해 측정될 때, 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4.5, 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.98, 1.95, 1.9, 1.85, 1.8, 1.75, 1.7, 1.65, 1.6, 1.55, 1.50, 1.45, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1, 0.9, 0.85, 0.8, 0.75, 0.7, 0.65, 0.6, 0.55, 0.5, 0.45, 0.4, 0.35, 0.3, 0.25, 0.2, 0.15, 또는 0.1 x10-9 M, 미만 이하의 KD로 인간 TREM1에 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 Biacore 검정에 의해 측정될 때, 5-3, 4-2, 3-1, 1.9-1.8, 1.8-1.7, 1.7-1.6, 1.6-1.5, 1.9-1.5, 1.5-1, 1-0.8, 1-0.5, 0.9-0.6, 0.7-0.4, 0.6-0.2, 0.5-0.3, 0.3-0.2, 또는 0.2-0.1 x10-9 M 사이의 KD로 인간 TREM1에 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 Biacore 검정에 의해 측정될 때, 약 10, 9.56, 9.5, 9.0, 8.88, 8.84, 8.5, 8, 7.5, 7.32, 7, 6.5, 6, 5.5, 5, 4.5, 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5, 또는 1x10-4 (1/s), 미만 이하의 Kd로 인간 TREM1에 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 Biacore 검정에 의해 측정될 때, 7-10, 7-8, 8-9, 9-10, 7-7.5, 7.5-8, 8.-8.5, 8.5-9, 9-9,5, 또는 9.5-10x10-4 (1/s) 사이의 Kd로 인간 TREM1에 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 Biacore 검정에 의해 측정될 때, 약 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 45, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 7, 8, 9, 또는 10x105 (1/Ms), 또는 초과 이상의 Ka로 인간 TREM1에 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 Biacore 검정에 의해 측정될 때, 4-7, 4-4.5, 4.5-5, 5-5.5, 5.5-6, 6-6.5, 또는 6.5-7, 7-8, 8-9, 또는 9-10x105 (1/Ms) 사이의 Ka로 인간 TREM1에 결합한다.
일부 실시형태에서, 항체는 유세포 분석법에 의해 측정됨에 의해 측정될 때, 약 0.1, 0.15, 0.2, 0.22, 0.25, 0.27, 0.3, 0.32, 0.35, 0.37, 0.4, 0.05, 0.5, 0.55, 0.6, 0.65, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 또는 2 nM의 EC50으로 인간 단핵구에 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 유세포 분석법에 의해 측정됨에 의해 측정될 때, 2, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 또는 0.1 nM 이하의 EC50으로 인간 단핵구에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체는 유세포 분석법에 의해 측정됨에 의해 측정될 때, 약 0.2-1.4, 0.2-0.3, 0.3-0.5, 0.5-0.7, 0.7-1, 1-1.2, 또는 1.2-1.4 nM 사이의 EC50으로 인간 단핵구에 결합한다.
일부 실시형태에서, 항체는 유세포 분석법에 의해 측정됨에 의해 측정될 때, 약 0.1, 0.15, 0.2, 0.22, 0.25, 0.27, 0.3, 0.32, 0.35, 0.37, 0.4, 0.05, 0.5, 0.55, 0.6, 0.65, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 또는 2 nM의 EC50으로 인간 호중구에 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 유세포 분석법에 의해 측정됨에 의해 측정될 때, 약 2, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 또는 0.1 nM 이하의 EC50으로 호중구에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항체는 유세포 분석법에 의해 측정됨에 의해 측정될 때, 약 0.15-1, 0.15-0.3, 0.3-0.5, 0.5-0.7, 0.7-1, 1-1.5, 또는 1.5-2 nM 사이의 EC50으로 인간 호중구에 결합한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 유세포 분석법에 의해 측정됨에 의해 측정될 때, 3 nM 이상의 EC50으로 인간 호중구에 결합하지 않는다.
기능
"이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역에 의해 매개되는 이들 생물학적 활성을 기칭하며, 활성은 항체 이소타입에 따라 달라질 수 있다. 항체 이펙터 기능의 예는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 활성화하기 위한 C1q 결합, 항체-의존성 세포독성 (ADCC)을 활성화하기 위한 Fc 수용체 결합, 및 항체 의존성 세포 식세포작용 (ADCP), 수용체 리간드 차단, 작용화 또는 길항작용을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체는 항체-의존적 세포의 세포독성 (ADCC) 활성을 갖는다. ADCC는 항체가 병원성 또는 종양형성 표적-세포의 표면에서 항원에 결합할 때 발생할 수 있다. 세포독성 T-세포, 자연 살해 (NK) 세포, 대식세포, 호중구, 호산구, 수지상 세포 또는 단핵구를 포함하여 세포 표면에 Fc 감마 수용체 (FcγR 또는 FCGR)를 갖는 효과기 세포는 표적-세포에 결합된 항체의 Fc 영역을 인식하고 이에 결합한다. 그와 같은 결합은 세포 사멸로 이어지는 세포내 신호 전달 경로의 활성화를 유발할 수 있다. 특정 구현예에서, 항체의 면역글로불린 Fc 영역 아형 (이소형)은 인간 IgG1 및 IgG3을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, ADCC는 Fc 수용체 (FcR)를 발현시키는 비특이적 세포독성 세포 (예를 들어, 자연 살해 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상에 결합된 항체를 인식하고 이어서 표적 세포의 용해를 유발하는 세포-매개 반응을 지칭한다. ADCC를 매개하기 위한 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현시키는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현시킨다. 조혈 세포에서의 FcR 발현은 Ravetch 및 Kinet, Annu . Rev. Immunol 9:457-92 (1991)의 페이지 464의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기재된 것과 같은 시험관내 ADCC 분석이 수행될 수 있다. 그와 같은 분석에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 Clynes 등, Proc . Natl . Acad . Sci . (USA) 95:652-656 (1998)에 개시된 것과 같이 생체내, 예를 들어, 동물 모델에서 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, 항체는 보체-의존 세포독성 (CDC) 활성을 갖는다. 항체-유도된 CDC는 고전적 보체 캐스케이드의 단백질을 통해 매개되고, 보체 단백질 Clq가 항체에 결합함으로써 유발된다. Clq에 대한 항체 Fc 영역 결합은 보체 캐스케이드의 활성화를 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 항체의 면역글로불린 Fc 영역 아형 (이소형)은 인간 IgG1 및 IgG3을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, CDC는 보체의 존재 하에서 표적을 용해시키는 분자의 능력을 지칭한다. 보체 활성화 경로는 보체 시스템 (C1q)의 제1 성분이 동족 항원과 복합체를 형성한 분자 (예를 들어, 폴리펩티드 (예를 들어, 항체))에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어, Gazzano-Santoro 등, J. Immunol . Methods 202:163 (1996)에 기재된 바와 같은 CDC 분석을 수행할 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체는 항체-의존성 세포 식세포작용 (ADCP) 활성을 갖는다. ADCP는 항체가 병원성 또는 종양형성 표적-세포의 표면 상의 항원에 결합할 때 발생할 수 있다. 단핵구 및 대식세포를 포함하여, 그 세포 표면 상에 Fc 수용체를 담지하는 식세포는 표적-세포에 결합된 항체의 Fc 영역을 인식하고 결합한다. Fc 수용체가 항체-결합 표적 세포에 결합하면, 표적 세포의 식세포작용이 개시될 수 있다. ADCP는 ADCC의 한 형태로 간주될 수 있다.
일부 실시형태에서, TREM1 항체는 비-자극성 골수 세포의 자극성 골수 세포로의 재프로그래밍을 유도한다. 일부 실시형태에서, TREM1 항체는 염증전 사이토카인 또는 케모카인의 발현, 및/또는 공-자극성 분자의 발현의 유도를 유도한다. 일부 실시형태에서, 공-자극성 분자는 CD40 또는 HLA-DR이다. 일부 실시형태에서, 염증전 사이토카인 또는 케모카인은 IFN-γ, IL-1α, IL-12, IL-2, TNFSF9, TNFSF10, CXCL9, CXCL10, CCL17, CXCL1, CXCL5, CXCL8, CXCL11, CXCL15, CCL3, CCL4, CCL2, FasL, CD274, CRTAM, 그랜자임 A (GzmA) 또는 그랜자임 B (GzmB)이다.
일부 실시형태에서, 항체는 작용제 항체이다. 작용제 항체는 항체가 세포 상에서 발현된 TREM1 단백질에 결합한 후 NSM의 하나 이상의 활성 또는 기능을 유도 (예를 들어, 증가)시킬 수 있다. 작용제 항체는 NSM에 결합하고 이를 활성화하여, 세포의 증식에서 변화를 일으키거나 항원 제시 능력을 변형시킬 수 있다. 작용제 항체는 NSM에 결합하고 이를 활성화하여, 변형된 세포 성장 또는 세포자멸사를 유도하는 세포내 시그널링 경로를 촉발할 수 있다. 작용제 항체는 TREM1에 결합하고 TREM1의 시그널링 다운스트림을 유도할 수 있다. 일부 실시형태에서, TREM1 시그널링은 세포에서 면역 반응을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 활성화, 사이토카인 또는 케모카인 분비, 또는 골수 공-자극성 단백질의 발현이다.
일부 구현예에서, 항체는 길항 항체이다. 길항 항체는 항체가 세포 상에 발현된 TREM1 단백질에 결합한 후 NSM의 하나 이상의 활성 또는 기능을 차단 (예를 들어, 감소)할 수 있다. 예를 들어, 길항 항체는 하나 이상의 NSM 단백질에 결합하는 리간드에 결합하고 이를 차단하여 세포의 분화 및 증식을 방지하거나 항원 제시 능력을 변형시킬 수 있다. 길항 항체는 이의 리간드에 의해 TREM1 단백질에 결합하고 이의 활성화를 방지하여 세포 성장 및 생존에 기여하는 세포내 신호 전달 경로를 변형시킬 수 있다.
일부 구현예에서 항체는 고갈 항체이다. 고갈 항체는 항체가 분자의 다른 면역 세포와의 상호 작용을 통해 접촉할 때 비-자극성 골수 세포를 사멸시킬 수 있는 항체이다. 예를 들어, 항체는, TREM1 단백질을 보유하는 세포에 결합될 때, 보체 단백질과 결합하여 보체-의존적 세포 용해를 유도할 수 있다. 항체는, TREM1 단백질을 보유하는 세포에 결합될 때, 또한, 항체-의존적 세포의 세포독성 (ADCC)에 의해 이를 사멸시키도록 Fc 수용체를 보유하는 인접 세포를 촉발시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 항체는 중화 항체이고, 항체는 NSM의 하나 이상의 생물학적 활성을 중화시킨다. 일부 구현예에서, TREM1 단백질은 비-자극성 골수 세포의 표면에서 발현되고 항체는 TREM1 단백질의 세포외 도메인을 인식한다.
일부 구현예에서 항체는 NSM에 대해 선택적이다 (바람직하게는 TREM1에 결합한다). 특정 구현예에서, NSM에 선택적으로 결합하는 항체는 0.0001nM 내지 1μM 범위의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 특정 구현예에서, 항체는 다른 종의 단백질 중에서 보존된 TREM1 단백질 상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 구현예에서, 선택적 결합은 배타적 결합을 포함하지만, 이를 요구하지는 않는다.
일 구현예에서 이의 표적에 결합된 항-TREM1 항체는 그것이 결합된 비-자극성 골수 세포의 생체내 고갈을 유발하는 역할을 한다. 일부 구현예에서, 클러스터된 항체에 의해 유도된 효과기 단백질은 염증성 사이토카인의 방출, 항원 생산 조절, 세포내이입 또는 세포 사멸을 포함하여, 다양한 반응을 유발할 수 있다. 일 구현예에서 항체는 생체내에서 보체를 동원하고 활성화시키거나 생체내에서 항체-의존적 세포의 세포독성 (ADCC)을 매개하거나 생체내에서 Fc 수용체에 결합함으로써 식균작용을 매개할 수 있다. 항체는 또한, 결합시 비-자극성 골수 세포의 아폽토시스 또는 괴사를 유도함으로써 비-자극성 골수 세포를 고갈시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체는 면역 복합체를 형성할 수 있다. 예를 들어, 면역 복합체는 항체로 덮인 종양 세포일 수 있다.
일부 실시형태에서, 항-TREM1 항체는 암 조직의 외부에 존재하는 골수 세포에 실질적으로 결합하지 않는다. 일부 실시형태에서, 항-TREM1 항체는 암 조직에 존재하는 자극성 골수 세포에 실질적으로 결합하지 않는다.
일부 실시형태에서 비-자극성 골수 세포의 무력화는 시험관내이고 a) 비-자극성 골수 세포의 사멸; b) 비-자극성 골수 세포의 자기 비드 고갈; 또는 c) 비-자극성 골수 세포의 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 분류에 의해 달성된다.
"면역접합체"는 효과기 분자, 또는 치료제 (예를 들어, 사이토카인) 또는 진단제와 같은 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.
특정 구현예에서 항체는 약물, 예를 들어, 독소, 화학요법제, 면역 조절제 또는 방사성동위원소에 접합된다. ADC (항체 약물 접합체)를 제조하는 몇몇 방법이 당 업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 8,624,003 (포트 방법(pot method)), 8,163,888 (한 단계), 및 5,208,020 (두 단계 방법)에 기재되어 있다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 방사성 핵종, 세포독소, 화학요법제, 약물, 전구 약물, 독소, 효소, 면역조절제, 항신생혈관제, 아폽토시스 촉진제, 사이토카인, 호르몬, 올리고뉴클레오티드, 안티센스 분자, siRNA, 제2 항체, 및 항원에 결합하는 제2 항체 단편을 포함하는 적어도 하나의 제제에 접합될 수 있다.
비-자극성 골수 세포 (NSM)
항-TREM1 항체의 사용을 포함하는 비-자극성 골수 세포 (NSM)를 무력화 및/또는 검출하기 위한 방법 및 조성물이 본원에 제공된다. 또한, NSM 단백질을 발현시키는 비-자극성 골수 세포를 표적화 및/또는 검출하기 위한 방법 및 조성물이 본원에 제공된다.
또한, 비인간 개체에서 인간 NSM 단백질의 비인간 상동체로 향하는 항체의 사용을 포함하는 비-자극성 골수 세포를 무력화 및/또는 검출하기 위한 방법 및 조성물이 본원에 제공된다.
본원에 기재된 바와 같이, 비-자극성 골수 세포는 면역 반응을 자극하는데 충분히 효과적이지 않은 (예를 들어 자극성 골수 세포와 비교하여 종양 미세환경에서 항-종양 반응을 자극하는데 효과적이지 않은) 골수 세포이다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 항원 (예를 들어, 종양 항원)을 T-세포에 제시하는데 효과적이지 않거나 자극성 골수 세포와 비교하여 종양 특이적 T-세포 반응을 자극하는데 효과적이지 않다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 자극성 골수 세포와 비교하여 T 세포에 종양-관련 항원을 흡수, 처리 및/또는 제시하는 능력이 감소될 수 있다. 비-자극성 골수 세포는 세포독성 T 림프구를 다시 프라이밍하는 능력이 감소되거나 없을 수 있거나 일부 경우에 효과적인 종양-세포 사멸을 자극할 수 없다. 비-자극성 골수 세포는 자극성 골수 세포와 비교하여, 제한 없이, CD80, CD86, MHCI 및 MHCII를 포함하는 항원 처리, 항원 제시 및/또는 항원 공동-자극에 관여하는 유전자 및 세포-표면 마커의 더 낮은 발현을 나타낼 수 있다.
비-자극성 골수 세포는, 자극성 골수 세포와 비교할 때, TAP1, TAP2, PSMB8, PSMB9, TAPBP, PSME2, CD24a, CD274, BTLA, CD40, CD244, ICOSL, ICAM1, TIM3, PDL2, RANK, FLT3, CSF2RB, CSF2RB2, CSF2RA, IL12b, XCR1, CCR7, CCR2, CCL22, CXCL9, 및 CCL5 중 어느 하나 이상을 비제한적으로 포함하는, 교차-제시, 공동-자극 및/또는 자극성 사이토카인과 관련된 유전자의 보다 낮은 발현, 및 항염증성 사이토카인 IL-10의 발현 증가를 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 분화 및 생존을 위해 전사 인자 IRF4 및 사이토카인 GM-CSF 또는 CSF-1에 의존적이다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 산화질소 합성효소 (NOS)를 분비함으로써 종양 혈관신생에 기여할 수 있고 표피 성장 인자 (EGF)를 분비함으로써 종양 성장을 뒷받침할 수 있다.
일부 실시형태에서, 비-자극성 골수 세포는 종양-관련 대식세포 (TAM) 또는 수지상 세포(DC)이다. 일부 실시형태에서, 비-자극성 골수 세포는 수지상 세포 (DC)가 아니다.
일부 실시형태에서, 비-자극성 골수 세포는 종양-관련 대식세포 (TAM)이다. TAM은 암성 종양 근처 또는 내부에 존재하는 대식세포이고 순환하는 단핵구 또는 상주하는 조직 대식세포로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 비-자극성 골수 세포는 종양-관련 호중구 (TAN)이다. TAN은 암성 종양 근처 또는 내부에 존재하는 호중구이다.
일부 구현예에서 비-자극성 골수 세포 및 자극성 골수 세포는 이들을 발현시키는 마커, 또는 이들을 선택적으로 발현시키는 마커에 기초하여 구별된다. 세포 표면 마커의 발현은 '+' 또는 '양성'으로 기재될 수 있다. 세포 표면 마커의 부재는 '-' 또는 '음성'으로 기재될 수 있다. 세포 표면 마커의 발현은 세포 표면상의 각 마커의 상대적인 발현을 나타내는, '하이' (높은 수준의 마커를 발현시키는 세포) 또는 '로우' (낮은 수준의 마커를 발현시키는 세포)로 추가로 기재될 수 있다. 마커의 수준은 당 업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 면역-염색 및 FACS 분석, 또는 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯팅에 의해 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 수지상 세포 (DC)이다. 일부 구현예에서, 수지상 세포는 뾰족하거나 수지상 형태에 의해 구별될 수 있다. 일 구현예에서, 비-자극성 수지상 세포는 적어도 CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+ 및 BDCA1+ (DC1 세포로도 지칭됨)이다. 일 구현예에서, 비-자극성 수지상 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+ 및 BDCA3+ (DC2 세포로도 지칭됨)가 아니다. 일 구현예에서, CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+ 및 BDCA3+인 수지상 세포는 자극성-골수 세포이다.
일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 종양 관련 대식세포(TAM)이다. 일부 구현예에서, 예를 들어 인간에서, 비-자극성 종양 관련 대식세포는 적어도 CD45+, HLA-DR+, CD14+이다. 일부 구현예에서 비-자극성 종양 관련 대식세포는 적어도 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11b+이다. 일부 구현예에서 비-자극성 종양 관련 대식세포는 적어도 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11c+이다. 일부 구현예에서 비-자극성 종양 관련 대식세포는 적어도 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-이다. 일부 구현예에서 비-자극성 종양 관련 대식세포는 적어도 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-, CD11b+이다. 일부 구현예에서 비-자극성 종양 관련 대식세포는 적어도 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-, CD11c+이다. 일부 구현예에서 비-자극성 종양 관련 대식세포는 적어도 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11b+, 및 CD11c+이다. 일부 구현예에서 비-자극성 종양 관련 대식세포는 적어도 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-, CD11b+, 및 CD11c+이다.
일부 구현예에서 본 발명의 방법 및 조성물은 다른 포유동물, 예를 들어 마우스에서 TAM 및 DC를 표적화하는데 유용하다. 그와 같은 구현예에서, 마우스 TAM 및 DC는 TREM1 항체와 접촉된다. 일 구현예에서, 예를 들어 마우스에서, 종양-관련 대식세포는 적어도 CD45+, I-A/I-E+, CD14+, CD11b하이, 및 CD11c로우 (TAM1로도 지칭됨)이다. 일 구현예에서, 예를 들어 마우스에서, 종양-관련 대식세포는 적어도 CD45+, I-A/I-E+, CD14+, CD11b로우, 및 CD11c하이 (TAM2로도 지칭됨)이다. 본원에 사용된 용어 "CD11b하이 대식세포"는 높은 수준의 CD11b를 발현시키는 대식세포에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "CD11b로우 대식세포"는 이의 표면에서 CD11b하이 대식세포의 수준보다 실질적으로 낮은 CD11b의 수준을 발현시키는 대식세포에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "CD11c하이"는 높은 수준의 CD11c를 발현시키는 대식세포에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "CD11c로우 대식세포"는 이의 표면에서 CD11c하이 대식세포의 수준보다 실질적으로 낮은 CD11c 수준을 발현시키는 대식세포에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 비-자극성 골수 세포는 TAM 및 DC1 세포 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 예를 들어 마우스에서, 본 발명의 비-자극성 골수 세포는 TAM1, TAM2, 및 DC1 세포 중 하나 이상을 포함한다. 그와 같은 구현예에서 본 발명의 비-자극성 골수 세포는 TREM1 항체와 접촉된다.
일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 골수-유래 억제 세포(MDSC)이다, 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 종양 관련 호중구 (TAN)이다.
일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 종양 병변의 가장자리 또는 형질전환된 종양 도관(duct)에 위치하며, 여기서 이들은 동족 T-세포와 접촉한다. 일 구현예에서, 비-자극성 골수 세포의 국재화가 변형되어, 세포가 더 이상 종양 가장자리에서 국재화되지 않거나 더 이상 T-세포와 접촉하지 않게 한다.
일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 자극성 골수 세포 및 비-자극성 골수 세포를 포함하는 면역 세포 집단에 있다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 비-자극성 골수 세포만을 포함하는 면역 세포 집단에 있다. 본 발명의 면역 세포 집단은 순수하고, 균질하고, 불균질하고, 다양한 공급원 (예를 들어, 병든 조직, 종양 조직, 건강한 조직, 세포 은행)으로부터 유래되고, 일차 세포 배양에서 유지되고, 불멸화된 배양에서 유지되고, 및/또는 생체외 배양에서 유지될 수 있다.
일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 종양-관련 대식세포이다.
일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 수지상 세포이다.
일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+ 및 BDCA1+이다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+ 및 BDCA1+인 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+ 및 BDCA1+인 세포로 구성된다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+ 및 BDCA1+인 세포로 본질적으로 구성된다.
일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-이다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-인 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-인 세포로 구성된다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-인 세포로 본질적으로 구성된다.
일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11b+이다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11b+인 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11b+인 세포로 구성된다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11b+인 세포로 본질적으로 구성된다.
일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11c+이다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11c+인 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11c+인 세포로 구성된다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11c+인 세포로 본질적으로 구성된다.
일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3- 및 CD11c+이다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3- 및 CD11c+인 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3- 및 CD11c+인 세포로 구성된다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3- 및 CD11c+인 세포로 본질적으로 구성된다.
일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-, CD11b+이다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-, CD11b+인 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-, CD11b+인 세포로 구성된다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-, CD11b+인 세포로 본질적으로 구성된다.
일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11b+ 및 CD11c+이다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11b+ 및 CD11c+인 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11b+ 및 CD11c+인 세포로 구성된다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11b+ 및 CD11c+인 세포로 본질적으로 구성된다.
일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-, CD11b+ 및 CD11c+이다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-, CD11b+ 및 CD11c+인 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-, CD11b+ 및 CD11c+인 세포로 구성된다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-, CD11b+ 및 CD11c+인 세포로 본질적으로 구성된다.
일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+ 및 BDCA3+가 아니다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+ 및 BDCA3+가 아닌 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 예를 들어 마우스에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, I-A/I-E+, CD14+, CD11b하이, 및 CD11c로우이다. 일부 구현예에서, 예를 들어 마우스에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, I-A/I-E+, CD14+, CD11b하이, 및 CD11c로우인 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 예를 들어 마우스에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, I-A/I-E+, CD14+, CD11b하이, 및 CD11c로우인 세포로 구성된다. 일부 구현예에서, 예를 들어 마우스에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, I-A/I-E+, CD14+, CD11b하이, 및 CD11c로우인 세포로 본질적으로 구성된다. 그와 같은 구현예에서 비-자극성 마우스 골수 세포는 TREM1 항체와 접촉된다.
일부 구현예에서, 예를 들어 마우스에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, I-A/I-E+, CD14+, CD11b하이, 및 CD11c로우이다. 일부 구현예에서, 예를 들어 마우스에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, I-A/I-E+, CD14+, CD11b로우, 및 CD11c하이인 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 예를 들어 마우스에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, I-A/I-E+, CD14+, CD11b로우, 및 CD11c하이인 세포로 이루어진다. 일부 구현예에서, 예를 들어 마우스에서, 비-자극성 골수 세포는 CD45+, I-A/I-E+, CD14+, CD11b로우, 및 CD11c하이인 세포로 본질적으로 이루어진다. 이러한 구현예에서 비-자극성 마우스 골수 세포는 TREM1 항체와 접촉한다.
일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 암 조직에 있다.
일부 구현예에서, 면역 세포 집단은 암 조직에 있다.
일부 구현예에서, 비-자극성 세포 및 자극성 골수 세포는 암 조직에 있다.
일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 비-자극성 골수 세포 및 자극성 골수 세포를 포함하는 면역 세포 집단을 포함한다.
NSM 세포는 종양 조직에 존재하고 NSM 세포 마커의 발현에 의해 다른 세포 유형과 구별될 수 있는 DC1, TAM1 및 TAM2 세포를 통틀어 지칭할 수 있다. 예를 들어, SDC보다 NSM 세포에서 더 풍부하게 발현되거나 번역된 유전자 및 관련 단백질이 NSM 마커로서 작용할 수 있다. 예시적인 NSM 마커는 CD11b이다. 추가의 예시적인 NSM 마커가 표 A에 열거되어 있다. NSM 세포는 이의 세포 표면에서 TREM1, MS4A7, C5AR1, LYVE1, ABCC3, LILRB4, MRC1/CD206, SIGLEC1, STAB1, TMEM37, MERTK 및 TMEM119를 발현시킬 수 있다. 일부 측면에서, NSM 세포는 KIT, CCR7, BATF3, FLT3, ZBTB46, IRF8, BTLA, MYCL1, CLEC9A, BDCA3 및 XCR1 중 적어도 하나를 발현시키지 않는다.
일 구현예에서, NSM 세포는 표 D에 열거된 NSM 마커 유전자 중 하나 이상을 발현시킨다. 또 다른 구현예에서, NSM 세포는 표 A에 열거된 NSM 마커 중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18개 이상을 발현시킨다. 또 다른 구현예에서, NSM 세포는 표 A에 열거된 NSM 마커의 대부분 또는 모두를 발현시킨다. 또 다른 구현예에서, NSM 세포는 MRC1, MS4A7, C1QC, APOE, C1QB, C1QA 및 C5AR1을 발현시키는 것으로 확인된다.
표 D
Figure pct00006
자극성 골수 세포
본원에 사용된 바와 같이, 자극성 골수 세포 (특정 측면에서 SDC라고도 함)는 면역 반응을 자극하는데 효과적인 (예를 들어 비-자극성 골수 세포와 비교하여 종양 미세환경에서 항-종양 반응을 자극하는데 보다 효과적인) 골수 세포이다. 일부 구현예에서, 자극성 골수 세포는 T-세포에 항원 (예를 들어 종양 항원)을 제시하는데 효과적이거나 비-자극성 골수 세포와 비교하여 종양 특이적 T-세포 반응을 자극하는데 효과적이다. 일부 구현예에서, 자극성 골수 세포는 비-자극성 골수 세포와 비교하여 T 세포에 종양-관련 항원을 흡수, 처리 및/또는 제시하는 능력이 증가될 수 있다. 자극성 골수 세포는 세포독성 T 림프구를 다시 프라이밍하는 능력이 증가되거나 일부 경우에 비-자극성 골수 세포에 비해 효과적인 종양-세포 사멸을 자극할 수 있다. 자극성 골수 세포는 비-자극성 골수 세포와 비교하여 CD80, CD86, MHCI, 및 MHCII를 비제한적으로 포함하는 항원 처리, 항원 제시 및/또는 항원 공동-자극에 관련된 유전자 및 세포-표면 마커의 발현을 높일 수 있다.
예시적인 자극성 골수 세포 마커는 표 A에 열거되어 있다. 예를 들어, 인간 SDC에서, Xcr1, Clec9a, 및 BDCA3 (CD141)의 발현은 SDC 동일성의 마커이다. 마우스에서, CD103은 인간 SDC에서 발현되지 않지만 SDC 동일성의 강력한 마커로서 또한 사용될 수 있음에 주목할 것이다.
일 구현예에서, SDC는 수지상 세포 동일성을 가지며 또한 표 A에 열거된 SDC 마커 중 하나 이상을 발현시키는 종양 침윤성 골수 세포이다. 또 다른 구현예에서, SDC는 수지상 세포 동일성을 가지며 또한 표 A에 열거된 SDC 마커 중 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 모두를 발현시키는 종양 침윤성 골수 세포이다. 또 다른 구현예에서, SDC는 BDCA3, KIT, CCR7, BATF3, FLT3, ZBTB46, IRF8, BTLA, MYCL1, XCR1 및 CLEC9A를 발현시키는 종양 침윤성 골수 수지상 세포로 확인된다. SDC 세포는 KIT, CCR7, BATF3, FLT3, ZBTB46, IRF8, BTLA, MYCL1, CLEC9A, BDCA3, 및 XCR1 중 적어도 하나를 발현시킬 수 있다. 일부 구현예에서, SDC는 이의 세포 표면에서 TREM1, MS4A7, C5AR1, LYVE1, ABCC3, LILRB4, MRC1/CD206, SIGLEC1, STAB1, TMEM37, MERTK, 및/또는 TMEM119를 실질적으로 발현시키지 않는다. 일부 구현예에서, SDC는 C5AR1, LYVE1, ABCC3, MRC1, SIGLEC1, STAB1, C1QB, C1QA, TMEM37, MERTK, C1QC, TMEM119, MS4A7, APOE, CYP4F18, TREM1, TLR7, 및/또는 LILRB4를 실질적으로 발현시키지 않는다. 다른 당 업계에서 인정된 분석법 중에서 유세포 분석법 및 PCR이 본원에 개시된 마커의 발현을 평가하는데 사용될 수 있다.
자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+, 및 BDCA3+일 수 있다. 자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, 및 BDCA3+일 수 있다. 자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14-, 및 BDCA3+일 수 있다. 자극성 골수 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD11c+, 및 BDCA3+일 수 있다.
약제학적 조성물
본 출원은 본원에 기재된 항체 중 임의의 하나 이상을 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 포함하는 약제학적 조성물을 포함하여 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서 상기 조성물은 멸균된다. 약제학적 조성물은 일반적으로 유효량의 항체를 포함한다.
이들 조성물은, 본원에 개시된 하나 이상의 항체 이외에, 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체, 완충액, 안정화제 또는 당업자에게 잘 알려진 다른 물질을 포함할 수 있다. 그와 같은 물질은 무독성이어야 하고 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 투여 경로, 예를 들어, 경구, 정맥내, 피부 또는 피하, 코, 근육내, 복강내 경로에 따라 달라질 수 있다.
경구 투여용 약제학적 조성물은 정제, 캡슐, 분말 또는 액체 형태일 수 있다. 정제는 고체 담체 예컨대 젤라틴 또는 보조제를 포함할 수 있다. 액체 약제학적 조성물은 일반적으로 액체 담체 예컨대 물, 석유, 동물성 또는 식물성 오일, 미네랄 오일 또는 합성 오일을 포함한다. 생리 식염수, 덱스트로스 또는 다른 당류 용액 또는 글리콜 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다.
정맥, 피부 또는 피하 주사, 또는 고통 부위에서의 주사의 경우, 활성 성분은 발열원이 없고, 적절한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용되는 수용액 형태일 것이다. 당업자는, 예를 들어, 염화나트륨 주사제(Sodium Chloride Injection), 링거 주사제(Ringer's Injection), 락테이트 링거 주사제(Lactated Ringer's Injection)와 같은 등장성 비히클을 사용하여 적합한 용액을 잘 제조할 수 있다. 필요에 따라, 보존제, 안정제, 완충액, 산화방지제 및/또는 다른 첨가제가 포함될 수 있다.
그것이 개체에게 제공되는 폴리펩티드, 항체 (예를 들어, 항-TREM1 항체), 핵산, 소분자 또는 본 발명에 따른 다른 약제학적으로 유용한 화합물이든 아니든, 투여는 바람직하게는 "치료적 유효량" 또는 "예방적 유효량" (경우에 따라, 예방이 치료로 간주될 수 있더라도)으로의 투여이며, 상기 양은 개체에게 이점을 보여주기에 충분하다. 실제 투여량, 및 투여 속도 및 시간 경과(time-course)는 치료되는 단백질 응집 질환의 성질 및 중증도에 따라 달라질 것이다. 치료 처방, 예를 들어, 복용량 결정 등은 일반의 및 다른 의사의 책임하에 있으며, 전형적으로 치료할 장애, 개별 환자의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 의사에게 알려진 기타 요인을 고려한다. 상기 언급된 기술 및 프로토콜의 예는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed), 1980에서 확인할 수 있다.
조성물은 단독으로 또는 다른 치료제와 함께, 치료될 병태에 따라 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
방법
제조 방법
본원에 기재된 항체는, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 바와 같이 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생성될 수 있다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 항체를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 그와 같은 핵산은 항체 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열 또는 단일 도메인 항체의 VHH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩할 수 있다. 추가의 구현예에서, 그와 같은 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 일 구현예에서, 핵산은 다중시스트론(multicistronic) 벡터로 제공된다. 추가의 구현예에서, 그와 같은 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 하나의 그와 같은 구현예에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항원-결합 폴리펩티드 작제물의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항원-결합 폴리펩티드 작제물의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항원-결합 폴리펩티드 작제물의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다 (예를 들어, 이들로 형질전환되었다). 일 구현예에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 인간 배아 신장 (HEK) 세포, 또는 림프계 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 일 구현예에서, 항체의 제조 방법이 제공되며, 여기서 상기 방법은 상기 제공된 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건하에 배양하고, 선택적으로 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
항체의 재조합 생산을 위해, 예를 들어, 상기 기재된 바와 같은 항체를 인코딩하는 핵산을 단리하고 숙주 세포에서의 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입한다. 그와 같은 핵산은 종래의 절차를 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 용이하게 단리 및 시퀀싱될 수 있다.
용어 "실질적으로 정제된"은 이의 자연 발생 환경에서 발견되는 단백질과 정상적으로 동반되거나 상호작용하는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없을 수 있는 본원에 기재된 작제물, 또는 이의 변이체를 지칭하며, 즉 천연 세포, 또는 특정 구현예에서, 실질적으로 세포 물질이 없는 재조합적으로 생산된 이종다량체(heteromultimer)의 경우에 숙주 세포는 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만 또는 약 1% 미만 (건조 중량으로)의 오염 단백질을 갖는 단백질 제제를 포함한다. 이종다량체 또는 이의 변이체가 숙주 세포에 의해 재조합적으로 생산되는 경우, 특정 구현예에서 단백질은 세포의 건조 중량의 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2% 또는 약 1% 이하로 존재한다. 이종다량체 또는 이의 변이체가 숙주 세포에 의해 재조합적으로 생산되는 경우, 특정 구현예에서 단백질은 세포의 건조 중량의 약 5 g/L, 약 4 g/L, 약 3 g/L, 약 2 g/L, 약 1 g/L, 약 750 mg/L, 약 500 mg/L, 약 250 mg/L, 약 100 mg/L, 약 50 mg/L, 약 10 mg/L 또는 약 1 mg/L 이하로 배양 배지에 존재한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 "실질적으로 정제된" 이종다량체는 SDS/PAGE 분석, RP-HPLC, SEC, 및 모세관 전기영동법과 같은 적절한 방법에 의해 결정될 때 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%의 순도 수준, 구체적으로 적어도 약 75%, 80%, 85%의 순도 수준, 더 구체적으로 적어도 약 90%의 순도 수준, 적어도 약 95%의 순도 수준, 적어도 약 99%의 순도 수준 이상을 갖는다.
항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다.
"재조합 숙주 세포" 또는 "숙주 세포"는 삽입에 사용된 방법, 예를 들어, 직접 흡수, 형질도입, f-메이팅(mating) 또는 재조합 숙주 세포를 생성하기 위해 당 업계에 공지된 다른 방법에 관계없이, 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 지칭한다. 외인성 폴리뉴클레오티드는 비통합 벡터, 예를 들어 플라스미드로 유지될 수 있거나, 대안적으로 숙주 게놈 내로 통합될 수 있다. 숙주 세포는 CHO, CHO의 유도체, NS0, Sp2O, CV-1, VERO-76, HeLa, HepG2, Per.C6, 또는 BHK를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "진핵생물"은 계통발생 도메인 진핵생물계(Eucarya)에 속하는 유기체, 예컨대 동물 (비제한적으로, 포유동물, 곤충, 파충류, 새 등을 포함함), 섬모류, 식물 (비제한적으로, 외떡잎식물, 쌍떡잎식물, 조류 등을 포함함), 진균, 효모, 편모충류, 미포자충류, 원생생물 등을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "원핵생물"은 원핵 생물을 지칭한다. 예를 들어, 비-진핵 생물은 진정세균 (비제한적으로, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 써머스 써모필러스(Thermus thermophilus), 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 등을 포함함) 계통발생 도메인, 또는 고세균 (비제한적으로, 메타노코커스 자나스키(Methanococcus jannaschii), 메타노박테리움 써모오토트로피컴(Methanobacterium thermoautotrophicum), 할로박테리움 예컨대 할로페락스 볼카니(Haloferax volcanii) 및 할로박테리움 종 NRC-1, 아카에오글로버스 풀기더스(Archaeoglobus fulgidus), 피로코커스 푸리오서스(Pyrococcus furiosus), 피로코커스 호리코시(Pyrococcus horikoshii), 아에우로피럼 페르닉스(Aeuropyrum pernix) 등을 포함함) 계통발생 도메인에 속할 수 있다.
예를 들어, 항체는, 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우 박테리아에서 생성될 수 있다. 박테리아 내 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어, 하기를 참고한다: 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199, 및 5,840,523. (또한, 이. 콜라이에서 항체 단편의 발현을 설명하는, Charlton,　Methods in Molecular Biology, Vol.　248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 245-254 참고) 발현 후, 항체는 박테리아 세포 페이스트로부터 가용성 분획으로 단리될 수 있고 추가로 정제될 수 있다.
원핵생물에 더하여, 필라멘트 진균 또는 효모와 같은 진핵생물 미생물은 글리코실화 경로가 "인간화"되어 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생산하는 진균 및 효모 균주를 포함하는, 항체-인코딩 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. Gerngross,　Nat. Biotech.　22:1409-1414 (2004), 및 Li 등,　Nat. Biotech.　24:210-215 (2006)를 참고한다.
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 곤충 세포와 함께, 특히 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염에 사용될 수 있는 다수의 바쿨로바이러스 균주가 확인되었다.
식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 및 6,417,429 (형질전환 식물에서 항체를 생산하기 위한 PLANTIBODIES™ 기술을 설명함)를 참고한다.
척추동물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하도록 적응된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40 (COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통; 인간 배아 신장 계통 (예를 들어, Graham 등,　J. Gen Virol .　36:59 (1977)에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, Mather,　Biol . Reprod .　23:243-251 (1980)에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 그린 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK; 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유선 종양 (MMT 060562); 예를 들어, Mather 등,　Annals N.Y . Acad . Sci .　383:44-68 (1982)에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주로는 DHFR-　CHO 세포를 포함하는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 (Urlaub 등,　Proc . Natl . Acad. Sci . USA　77:4216 (1980)); 및 골수종 세포주 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0이 포함된다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토에 대해서는, 예를 들어, Yazaki 및 Wu,　Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J.), pp. 255-268 (2003)를 참고한다.
일 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 적어도 하나의 안정적인 포유동물 세포를 소정의 비로 항체를 인코딩하는 핵산으로 형질감염시키는 단계; 및 적어도 하나의 포유동물 세포에서 상기 핵산을 발현시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 안정적인 포유동물 세포에서 생산된다. 일부 구현예에서, 소정의 비의 핵산은 발현된 생성물에서 가장 높은 백분율의 항체를 초래하는 입력 핵산의 상대적인 비율을 결정하기 위해 일시적 형질감염 실험에서 결정된다.
일부 구현예에서 본원에 기재된 바와 같이 안정적인 포유동물 세포에서 항체를 생산하는 방법이며, 여기서 적어도 하나의 안정적인 포유동물 세포의 발현 산물은 모노머 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드, 또는 다른 항체와 비교하여 더 큰 비율의 목적하는 글리코실화된 항체를 포함한다.
일부 구현예에서 본원에 기재된 안정적인 포유동물 세포에서 글리코실화된 항체를 생산하는 방법이며, 상기 방법은 목적하는 글리코실화된 항체를 식별하고 정제하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 식별은 액체 크로마토그래피 및 질량 분석법 중 하나 또는 둘 다에 의한 것이다.
필요한 경우, 발현 후 항체를 정제 또는 단리할 수 있다. 단백질은 당업자에게 공지된 다양한 방식으로 단리 또는 정제될 수 있다. 표준 정제 방법에는 FPLC 및 HPLC와 같은 시스템을 사용하여 대기압 또는 고압에서 수행되는, 이온 교환, 소수성 상호작용, 친화성, 사이징 또는 겔 여과 및 역상을 포함한 크로마토그래피 기술이 포함된다. 정제 방법은 또한 전기영동, 면역학적, 침전, 투석 및 크로마토포커싱 기술을 포함한다. 단백질 농축과 함께 한외여과 및 정용여과 기술도 유용하다. 당 업계에 잘 알려진 바와 같이, 다양한 천연 단백질이 Fc 및 항체에 결합하고, 이들 단백질은 항체의 정제를 위해 본 발명에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 박테리아 단백질 A 및 G는 Fc 영역에 결합한다. 마찬가지로, 박테리아 단백질 L은 일부 항체의 Fab 영역에 결합한다. 정제는 종종 특정 융합 파트너에 의해 가능할 수 있다. 예를 들어, 항체는 GST 융합이 사용되는 경우 글루타티온 수지, His-태그가 사용되는 경우 Ni+2 친화성 크로마토그래피, 또는 플래그-태그가 사용되는 경우 고정된 항-플래그 항체를 사용하여 정제될 수 있다. 적합한 정제 기술에 대한 일반적인 지침에 대해서는, 예를 들어, 전체가 참고로 포함된, Protein Purification: Principles and Practice, 3rd　Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994에 의해 전체가 포함된 것을 참고한다. 필요한 정제 정도는 항체의 사용에 따라 달라질 것이다. 일부 경우에는 정제가 필요하지 않다.
특정 구현예에서 항체는, 비제한적으로, Q-세파로오스, DEAE 세파로오스, 포로스(poros) HQ, 포로스 DEAF, 토요펄(Toyopearl) Q, 토요펄 QAE, 토요펄 DEAE, 리소스/소스 Q 및 DEAE, 프랙토겔(Fractogel) Q 및 DEAE 컬럼 상의 크로마토그래피를 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 정제된다.
특정 구현예에서 본원에 기재된 단백질은, 비제한적으로, SP-세파로오스, CM 세파로오스, 포로스 HS, 포로스 CM, 토요펄 SP, 토요펄 CM, 리소스/소스 S 및 CM, 프랙토겔 S 및 CM 컬럼 및 이들의 동등물 및 비교물을 포함하는 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 정제된다.
또한, 본원에 기재된 항체는 당 업계에 공지된 기술을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다 (예를 들어, Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman & Co., N.Y and Hunkapiller 등, Nature, 310:105-111 (1984) 참고). 예를 들어, 폴리펩티드의 단편에 상응하는 폴리펩티드는 펩티드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 또한, 원한다면, 비고전 아미노산 또는 화학적 아미노산 유사체가 폴리펩티드 서열로의 치환 또는 첨가로서 도입될 수 있다. 비-고전 아미노산은, 비제한적으로, 일반적으로 공통 아미노산의 D-이성질체, 2,4디아미노부티르산, 알파-아미노 이소부티르산, 4아미노부티르산, Abu, 2-아미노 부티르산, g-Abu, e-Ahx, 6아미노 헥산산, Aib, 2-아미노 이소부티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 하이드록시프롤린, 사르코신, 시트룰린, 호모시트룰린, 시스테인산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 사이클로헥실알라닌, 알라닌, 플루오로-아미노산, 디자이너 아미노산 예컨대 메틸 아미노산, C-메틸 아미노산, N-메틸 아미노산, 및 아미노산 유사체를 포함한다. 또한, 아미노산은 D (우선성) 또는 L (좌선성)일 수 있다.
골수 세포의 면역 조절 방법
본 명세서에 기재된 TREM1 항체의 투여의 방법은 사이토카인, 케모카인과 같은 염증전 분자의 유도, 또는 골수 세포에 의한 골수 활성화 수용체의 발현을 초래할 수 있다. 일반적으로, 유도된 염증전 분자는 이소타입 대조군으로 달성된 것보다 더 높은 수준으로 존재한다. 일부 실시형태에서, 골수 세포는 비-자극성 골수 세포이다. 일부 실시형태에서, 비-자극성 골수 세포는 TREM1-발현 (TREM1+) 세포이다. 일부 실시형태에서, 골수 세포는 골수-유래 억제 세포 또는 종양 관련 호중구이다. 일부 실시형태에서, TREM1+ 세포는 골수-유래 억제 세포 또는 종양 관련 호중구이다. 이러한 염증전 분자는 차례로 T 세포 활성화, M1-유사 대식세포 활성화 및 NK 세포 활성화를 포함하나 이에 제한되지 않는 항-종양 면역의 활성화를 초래한다. 따라서, 항-TREM1 항체의 투여는 종양 파괴를 유도하는 다중 항-종양 면역 기전을 유도할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-TREM1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 개체에서 면역 반응을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 대상체에서 면역 반응을 증가시키는 방법은 참고 항체와 인간 TREM1 (서열번호: 1)에 대한 결합에 대해 경쟁하는 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체에서 면역 반응을 증가시키는 방법은 인간 TREM1 (서열번호: 1)에 결합하기 위해 경쟁하는 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 것을 포함하며, 여기서 항체는 인간 TREM1 (서열번호: 1)의 잔기 21-34 (서열번호: 42), 103-109 (서열번호: 43), 및 128-136 (서열번호: 44) 내에 결합한다. 일부 실시형태에서, 대상체에서 면역 반응을 증가시키는 방법은 인간 TREM1 (서열번호: 1)에 결합하기 위해 경쟁하는 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 것을 포함하며, 여기서 항체는 i) 인간 TREM1 (서열번호: 1)의 잔기 21-34 (서열번호: 42), 103-109 (서열번호: 43), 및 128-136 (서열번호: 44) 내에 결합하고; ii) 선택적으로 인간 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 약학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함하는 약학적 조성물에 존재한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 면역 반응을 증가시키는 임의의 및 모든 양태에서, 특징(들) 또는 기능(들)의 양태의 임의의 증가 또는 감소 또는 변경은 항-TREM1 항체와 접촉되지 않은 세포와 비교된다.
면역 반응을 증가시키는 것은 면역 반응을 향상시키거나 면역 반응을 유도하는 것 둘 모두일 수 있다. 예를 들어, 면역 반응을 증가시키는 것은 면역 반응의 시작 또는 개시, 또는 진행 중이거나 존재하는 면역 반응을 증가 또는 증폭시키는 것 둘 모두를 포괄한다. 일부 실시형태에서, 치료는 면역 반응을 유도한다. 일부 실시형태에서, 유도된 면역 반응은 적응성 면역 반응이다. 일부 실시형태에서, 유도된 면역 반응은 선천적 면역 반응이다. 일부 실시형태에서, 치료는 면역 반응을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 향상된 면역 반응은 적응성 면역 반응이다. 일부 실시형태에서, 향상된 면역 반응은 선천적 면역 반응이다.
일부 실시형태에서, 치료는 면역 반응을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 증가된 면역 반응은 적응성 면역 반응이다. 일부 실시형태에서, 증가된 면역 반응은 선천적 면역 반응이다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 항-TREM1 항체의 투여에 의해 시작되거나 개시된다. 일부 실시형태에서, 면역 반응은 항-TREM1 항체의 투여에 의해 향상된다.
또 다른 양태에서, 본 출원은 세포를 항-TREM1 항체와 접촉시키는 방법을 제공하며, 이는 세포의 면역 기능의 조절을 초래한다. 조절은 면역 반응을 증가시키거나 비-자극성 골수 세포가 자극성 골수 세포가 되도록 재프로그래밍하는 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, 조절은 면역 기능의 증가이다. 일부 실시형태에서, 조절은 비-자극성 골수 세포가 자극성 골수 세포가 되도록 재프로그래밍하는 것이다. 일부 실시형태에서, 기능의 조절은 비-자극성 골수 세포의 활성화를 유도한다. 일부 실시형태에서, 기능의 조절은 TREM1-발현 골수 세포의 재프로그래밍을 유도한다.
일부 실시형태에서, 세포는 비-자극성 골수 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 TREM1-발현 세포 (TREM1+ 세포)이다. 일부 실시형태에서, 비-자극성 세포는 TREM1+ 세포이다. 일부 실시형태에서, TREM1+ 세포는 DC1 세포, TAM1 세포, TAM2 세포, 골수-유래 억제 세포 (MDSC), 호중구, 및 종양 관련 호중구 (TAN) 중 하나 이상이다. 일부 실시형태에서, TREM1+ 세포는 골수-유래 억제 세포이다. 일부 실시형태에서, TREM1+ 세포는 종양 관련 호중구 (TAN)이다. 일부 실시형태에서, 비-자극성 골수 세포를 TREM1 항체와 접촉시키는 것은 비-자극성 세포가 자극성 골수 세포 (SDC)가 되도록 유도한다.
일부 실시형태에서, 비-자극성 골수 세포 또는 TREM1+ 세포의 기능의 조절은, 예를 들어 MHCII 분자 상의 종양 항원을 나이브 CD8+ T-세포에 교차-제시하는 비-자극성 세포의 능력을 증가시킴에 의해, 또는 비-자극성 골수 세포에 의한 사이토카인 또는 케모카인 분비를 증가시킴에 의해 천연 및 활성화된 CD8+ T-세포 둘 모두를 자극하는 세포의 능력에서 증가를 유도한다. 일부 실시형태에서, 비-자극성 골수 세포 또는 TREM1+ 세포의 기능의 조절은, 예를 들어 MHCI 분자 상의 종양 항원을 나이브 CD4+ T-세포에 교차-제시하는 비-자극성 세포 또는 TREM1+의 능력을 증가시킴에 의해 나이브 및 활성화된 CD4+ T-세포 둘 모두를 자극하는 세포의 능력에서 증가를 유도한다. 일부 실시형태에서, 기능의 조절은 사이토카인, 케모카인, 또는 공자극성 또는 활성화 수용체를 생성하는 세포의 능력을 향상시키거나 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 조절은, 예를 들어 T-세포 수용체 (TCR) 시그널링, T-세포 증식 또는 T-세포 사이토카인 생산을 촉발하는 세포의 능력을 포함하는, 골수 세포 또는 TREM1+ 세포의 T-세포 자극성 기능을 증가시킨다.
일부 실시형태에서, 증가된 면역 반응은 사이토카인 및 케모카인의 분비이다. 일부 실시형태에서, 항체는 작용제 활성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 항체는 이소타입 대조군 항체와 비교하여 세포에서 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인의 증가된 발현을 유도한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인은 IFN-γ, IL-1α, IL-12, IL-2, TNFSF9, TNFSF10, CXCL9, CXCL10, CCL17, CXCL1, CXCL5, CXCL8, CXCL11, CXCL15, CCL3, CCL4, CCL2, CCL8, CCL20, IL-6, CCL2, CCL7, CSF-1, CCL13, CCL19, TNFα, GZMH, PD-L1, MMP7, CCL23, CD70, CD8α, FasL, CD274, CRTAM, 그랜자임 A (GzmA) 또는 그랜자임 B (GzmB)로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 케모카인은 CXCL10이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 케모카인은 IFN-γ이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인 또는 케모카인 분비는 처리되지 않은 세포 또는 이소타입 대조군 항체로 처리된 세포와 비교하여 약 1-100배 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 또는 90-100배 사이로 증가된다. 일부 실시형태에서, 케모카인은 CXCL10이고 분비는 처리되지 않은 세포 또는 이소타입 대조군 항체로 처리된 세포와 비교하여 약 1-100-배, 1-배, 5-배, 10-배, 20-배, 30-배, 40-배, 50-배, 60-배, 70-배, 80-배, 90-배, 100-배, 1-10-배, 10-20-배, 20-30-배, 30-40-배, 40-50-배, 50-60-배, 60-70-배, 70-80-배, 80-90-배, 또는 90-100-배 사이로 증가된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 IFN-γ이고 분비는 처리되지 않은 세포 또는 이소타입 대조군 항체로 처리된 세포와 비교하여 약 1-100-배, 1-배, 5-배, 10-배, 20-배, 30-배, 40-배, 50-배, 60-배, 70-배, 80-배, 90-배, 100-배, 1-10-배, 10-20-배, 20-30-배, 30-40-배, 40-50-배, 50-60-배, 60-70-배, 70-80-배, 80-90-배, 또는 90-100-배 사이로 증가된다.
일부 실시형태에서, 조절은 이소타입 대조군 항체와 비교하여 적어도 하나의 골수 공-자극성 단백질의 발현을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 골수 공-자극성 단백질은 세포에서 HLA-DR, CD40, CD80, 또는 CD86이다. HLA-DR은 면역 반응을 이끌어내기 위해 T 세포에 펩티드 항원을 제시하는 기능을 주로 하는 MHC 클래스 II 세포 표면 수용체이다. HLA-DR은 α 단위와 β 단위의 이종이량체이다. HLA-DR은 대식세포, B 세포 및 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포에 의해 발현된다. CD40은 항원-제시 세포 상에서 발견되는 공-자극성 단백질이고 항원-제시 세포의 활성화에 필요하다. CD80은 수지상 세포, B 세포, 단핵구 및 항원-제시 세포와 같은 면역 세포에 의해 주로 발현된 수용체이고 CD86과 밀접하게 관련된다. CD80은 T 세포 상의 CD28 및 CTLA4와 상호작용하고 CD86과 동시에 작용하여 T 세포를 세포독성 T 세포로 분화시키기 위한 시그널링을 포함하여, T 세포 및 B 세포 활성화, 증식 및 분화를 프라이밍한다. CD80은 또한 수지상 세포를 자극하고 사이토카인 생성을 향상시킬 수 있다. 항원-제시 세포가 1차 항원-특이적 신호와 함께 T 세포를 완전히 활성화하기 위해서는 공-자극성 단백질이 필요하다. T 세포 공-자극은 T 세포 증식, 분화 및 생존에 필요하다. 공-자극 없이 활성화된 T 세포는 T 세포 아네르기 또는 결실을 유발할 수 있다.
일부 실시형태에서, 치료는 HLA-DR 발현을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 치료는 CD40 발현을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 치료는 CD80 발현을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 치료는 CD86 발현을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 공-자극성 분자는 처리되지 않은 세포 또는 이소타입 대조군 항체로 처리된 세포와 비교하여 약 1-100-배, 1-배, 5-배, 10-배, 20-배, 30-배, 40-배, 50-배, 60-배, 70-배, 80-배, 90-배, 100-배, 1-10-배, 10-20-배, 20-30-배, 30-40-배, 40-50-배, 50-60배-배, 60-70-배, 70-80-배, 80-90-배, 또는 90-100-배 또는 그 초과 사이로 증가된다.
일부 실시형태에서, 증진된 면역 반응은 항-종양 면역 세포 동원 및 활성화이다.
일부 실시형태에서, 항체는 이소타입 대조군 항체와 비교하여 세포에서 ERK 및/또는 JAK-STAT 세포내 시그널링 경로의 증가된 활성화를 유도한다. 일부 실시형태에서, 항체는 이소타입 대조군 항체와 비교하여 세포에서 STAT3의 증가된 활성화를 유도한다. 일부 실시형태에서, 항체는 이소타입 대조군 항체와 비교하여 세포에서 ERK 세포내 시그널링 경로의 증가된 활성화를 유도한다. 일부 실시형태에서, 항체는 이소타입 대조군 항체와 비교하여 세포에서 JAK-STAT 세포내 시그널링 경로의 증가된 활성화를 유도한다. ERK 경로는 세포 증식에 관여된다. STAT3는 JAK-STAT 시그널링 경로의 전사 인자 및 구성원이다. STAT3은 세포 성장에 관여하는 유전자의 전사를 매개하고 TH17 헬퍼 T 세포의 분화에 필수적이다. 생체내 STAT3의 손실은 또한 항체 기반 면역을 유지하지 못하는 것과 연루되어 있다.
일부 실시형태에서, 항체는 이소타입 대조군 항체와 비교하여 메모리 면역 반응을 유도한다. 일반적으로, 메모리 면역 반응은 면역 체계가 이전에 직면했던 병원체 또는 항원에 대해 후속 노출시 보호성 면역 반응이다. 예시적인 메모리 면역 반응은 항원으로 감염 또는 백신접종 후의 면역 반응을 포함한다. 일반적으로, 메모리 면역 반응은 T 세포 또는 B 세포와 같은 림프구에 의해 매개된다. 일부 실시형태에서, 메모리 면역 반응은 암 세포 성장, 증식 또는 전이를 포함하는 암에 대한 보호성 면역 반응이다. 일부 실시형태에서, 메모리 면역 반응은 암 세포 성장, 증식 또는 전이를 억제, 예방 또는 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 항체는 TREM1+ 세포의 세포 표면 상에서 TREM1을 TREM1에 가교시킨다. 일부 실시형태에서, 접촉은 시험관내이다. 일부 실시형태에서, 접촉은 생체내이다. 일부 특정 실시형태에서, 접촉은 인간에서 생체내이다. 일부 실시형태에서, 접촉은 항-TREM1 항체를 투여함에 의해 달성된다. 일부 실시형태에서, 항체를 투여받는 개체 (예컨대 인간)는 암을 갖는다.
비-자극성 골수 세포를 무력화, 사멸 또는 고갈시키는 방법
일 양태에서, 본 출원은 비-자극성 골수 세포를 무력화시키는 항-TREM1 항체, 예컨대 인간 또는 인간화된 항체와 비-자극성 골수 세포를 접촉시키는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 출원은 비-자극성 골수 세포를 무력화시키는 항-TREM1 항체와 비-자극성 골수 세포를 접촉시키는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 비-자극성 세포는 DC1 세포 및 TAM 세포 중 하나 이상이다. 일부 실시형태에서, 비-자극성 세포는 TAM 세포, 골수-유래 억제 세포 (MDSC) 및 종양 관련 호중구 (TAN) 중 하나 이상이다.
일부 구현예에서, 본 출원은 비-자극성 골수 세포를 TREM1 항체와 접촉시켜 비-자극성 골수 세포를 사멸시키는 단계를 포함하는, 비-자극성 골수 세포를 무력화하는 방법을 제공한다. 무력화는 세포를 부분적으로 또는 완전히 작동하지 않는 것으로 만드는 것을 나타낸다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포의 무력화는 세포에서 성장 정지를 유도한다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포의 무력화는 세포에서 아폽토시스를 유도한다. 일부 구현예에서, 비-자극성 세포의 무력화는 예를 들어 보체 의존적 세포독성 (CDC) 또는 항체-의존적 세포 세포독성 (ADCC)에 의한 세포의 용해를 유도한다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포의 무력화는 세포에서 괴사를 유도한다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포의 무력화는 세포에서 성장 정지를 유도한다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포의 무력화는 세포를 불활성화시킨다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포의 무력화는 세포 내 TREM1 단백질의 활성을 중화시킨다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포의 무력화는 세포의 증식을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포의 무력화는 세포의 분화를 유도한다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포의 무력화는 억제성 항원 제시 세포로 작용하는 세포의 능력을 감소시키거나 활성화 항원-제시 세포로 작용하는 세포의 능력을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포의 무력화는 종양 조직 또는 종양 미세환경 (TME) 내에서 세포의 잘못된 국재화(mislocalization)를 유도한다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포의 무력화는 종양 조직 또는 종양 미세환경 내에서 세포의 공간 구조를 변화시킨다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포의 무력화는 종양 조직 또는 TME 내에서 세포의 일시적 발현을 변화시킨다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 비-자극성 골수 세포를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이 비-자극성 골수 세포를 무력화시키는 임의의 및 모든 측면에서, 특성(들) 또는 기능(들)의 측면의 임의의 증가 또는 감소 또는 변경은 항-TREM1 항체와 접촉되지 않은 세포와 비교된다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 비-자극성 골수 세포를 항-TREM1 항체와 접촉시켜 비-자극성 골수 세포의 기능을 조절하는 방법을 제공한다. 조절은 하기 중 임의의 하나 이상일 수 있다. 일부 구현예에서 비-자극성 세포는 DC1 세포, TAM1 세포, TAM2 세포, MDSC 및 TAN 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 기능 조절은 비-자극성 골수 세포를 무력화시킨다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포의 기능 조절은, 예를 들어, 비-자극성 세포가 나이브 CD8+ T-세포에 MHCI 분자 상의 종양 항원을 교차-제시하는 능력을 증가시킴으로써 천연 및 활성화된 CD8+ T-세포 둘 다를 자극하는 세포의 능력을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 비-자극성 골수 세포의 기능의 조절은, 예를 들어 MHCII 분자 상의 종양 항원을 나이브 CD4+ T-세포에 교차-제시하는 비-자극성 세포의 능력을 증가시킴에 의해 천연 및 활성화된 CD4+ T-세포 둘 모두를 자극하는 세포의 능력에서 증가를 유도한다. 일부 실시형태에서, 조절은, 예를 들어 T-세포 수용체 (TCR) 시그널링, T-세포 증식 또는 T-세포 사이토카인 생산을 촉발하는 세포의 능력을 포함하는, 골수 세포의 T-세포 자극성 기능을 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 기능의 조절은 사이토카인, 케모카인, 또는 공자극성 또는 활성화 수용체를 생성하는 세포의 능력을 향상시키거나 증가시킨다. 일 실시형태에서, 비-자극성 세포의 생존이 감소되거나 비-자극성 세포의 증식이 감소된다. 일 실시형태에서, 비-자극성 골수 세포에 대한 자극성 골수 세포의 비율이 증가된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 비-자극성 골수 세포의 기능을 감소시키는 임의의 및 모든 양태에서, 특징(들) 또는 기능(들)의 양태의 임의의 증가 또는 감소 또는 변경은 항-TREM1 항체와 접촉되지 않은 세포에 비교된 것이다.
일부 실시형태에서, 본 출원은 비-자극성 골수 세포를 항-TREM1 항체와 접촉시키고, 이에 의해 비-자극성 골수 세포를 사멸시키는 것을 포함하는, 비-자극성 골수 세포를 사멸시키는 (또한 세포 사멸을 유도하는 것으로 지칭됨) 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 사멸은 항-TREM1 항체와 접촉되지 않은 비-자극성 골수 세포에 비해 증가된다. 일부 실시형태에서, 접촉은 비-자극성 골수 세포에서 세포자멸사를 유도한다. 일부 실시형태에서, 비-자극성 골수 세포는 비-자극성 골수 세포 및 자극성 골수 세포를 포함하는 면역 세포의 모집단에 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 비-자극성 골수 세포를 제거하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포의 10%-100%가 사멸된다. 일부 실시형태에서, 세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%가 사멸된다.
일부 구현예에서, 본 출원은 면역 세포 집단을 항-TREM1 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 자극성 골수 세포 및 비-자극성 골수 세포를 포함하는 면역 세포 집단에서 자극성 골수 세포 대 비-자극성 골수 세포의 비를 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서 상기 비는 항-TREM1 항체와 접촉되지 않은 세포 집단에 비해 증가된다. 일부 구현예에서 DC2 세포 대 DC1 세포의 비는 증가된다. 일부 구현예에서 DC2 세포 대 TAM1 세포의 비는 증가된다. 일부 구현예에서 DC2 세포 대 TAM2 세포의 비는 증가된다. 일부 구현예에서 DC2 세포 대 TAM1 + TAM2 세포의 비는 증가된다. 일부 구현예에서 DC2 세포 대 TAM1 + DC1 세포의 비는 증가된다. 일부 구현예에서 DC2 세포 대 DC1 + TAM2 세포의 비는 증가된다. 일부 구현예에서 DC2 세포 대 DC1 + TAM1 + TAM2 세포의 비는 증가된다. 일부 구현예에서, 적어도 상기 비는 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 증가된다.
일부 구현예에서 접촉 전 자극성 골수 세포 대 비-자극성 골수 세포의 비는 0.001:1 내지 0.1:1의 범위이다. 일부 구현예에서 접촉 후 자극성 골수 세포 대 비-자극성 골수 세포의 비는 0.1:1 내지 100:1의 범위이다.
일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 수가 감소한다. 일부 구현예에서 자극성 골수 세포는 DC2 세포이다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는, 예를 들어 괴사 또는 아폽토시스에 의해 사멸된다. 일부 구현예에서, 비-자극성 골수 세포는 성장 정지를 겪도록 유도된다. 일부 구현예에서 비-자극성 골수 세포는 더 이상 증식하지 않는다. 일부 구현예에서 비-자극성 골수 세포의 공간 국재화가 변경되고, 상기 비는 TME의 특정 영역에서 증가된다. 일부 구현예에서 비-자극성 골수 세포의 일시적 발현이 변경되고, 상기 비는 종양 발달 중 특정 시간 동안 증가된다.
일부 구현예에서, 접촉은 시험관내 접촉이다. 일부 구현예에서, 접촉은 생체내 접촉이다. 일부 특정 구현예에서, 접촉은 인간에서 생체내 접촉이다. 일부 구현예에서, 접촉은 항-TREM1 항체를 투여함으로써 수행된다. 일부 구현예에서, 항체를 투여받은 개체 (예컨대 인간)는 암이 있다.
암 치료의 방법
또 다른 양태에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 항-TREM1 항체를 포함하는 조성물을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 개체에서 면역-관련 병태를 치료하는 방법 (예컨대 면역 반응을 증진시키거나 비-자극성 골수 세포의 무력화에 영향을 미치는 방법)을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법은 암의 치료에 유용하고, 그와 같이 항-TREM1 항체 또는 항-TREM1 항체를 투여받는 개체는 암에 걸린다.
임의의 적합한 암은 본 명세서에 제공된 항체로 치료될 수 있다. 암은 임의의 암종, 선암종, 연조직, 육종, 기형종, 흑색종, 백혈병, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종 또는 뇌암, 또는 의료 분야에서 알려진 임의의 다른 암일 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시형태에서, 암은 고형암이다. 일부 실시형태에서, 암은 액체암이다. 일부 실시형태에서, 암은 면역회피성이다. 일부 실시형태에서, 암은 면역반응성이다.
일부 실시형태에서, 암은 흑색종, 신장, 간담도, 두경부 편평 암종 (HNSC), 췌장, 결장, 방광, 요로상피, 교모세포종, 전립선, 폐, 유방(유선), 난소, 위, 식도, 신장, 자궁내막, 자궁경부, 고환, 흑색종, 백혈병, 림프종 또는 중피종이다. 일부 실시형태에서, 암은 결장암, 췌장암 또는 유방암이다.
일부 실시형태에서, 치료는 암 부피 또는 크기에서 감소를 초래한다. 일부 실시형태에서, 치료는 항체의 투여 이전의 암 부피와 비교하여 암 부피를 감소시키는데 효과적이다. 일부 실시형태에서, 치료는 암 성장 속도를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 치료는 항체의 투여 이전의 암 성장 속도와 비교하여 암 성장 속도를 감소시키는데 효과적이다. 일부 실시형태에서, 치료는 암을 제거하는데 효과적이다.
일부 실시형태에서 면역-관련 병태는 (인간에서) 비-자극성 골수 세포 상의 TREM1 단백질의 발현 또는 비-인간 종에서 TREM1 단백질의 상동체의 발현과 연관된 면역-관련 병태이다. 일부 실시형태에서 면역-관련 병태는 자극성 골수-세포와 비교하여 비-자극성 골수 세포 상의 TREM1 단백질의 과발현과 연관된 면역-관련 병태이다. 일부 실시형태에서, TREM1 mRNA 또는 TREM1 단백질의 과발현은 자극성 골수 세포와 비교하여 약 적어도 2배, 5배, 10배, 25배, 50배, 또는 100배 더 높다.
일부 구현예에서 이들 방법은 다른 공동-요법 예컨대 PD-1/PD-L1/PD-L2 차단 요법, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-PD-L2 항체, CTLA-4 차단 요법, 항-CTLA-4 항체, T 세포 상의 억제 분자가 차단되는 전신 체크포인트 차단 요법, 입양 T-세포 요법, CAR T-세포 요법, 수지상 세포 또는 다른 세포 요법, 뿐만 아니라 종래의 화학요법과 함께 추가로 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 개체로부터의 생물학적 샘플에서 TREM1 단백질의 발현 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서 생물학적 샘플은, 비제한적으로, 체액, 조직 샘플, 장기 샘플, 소변, 대변, 혈액, 타액, CSF 및 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서 생물학적 샘플은 종양 조직에서 유래한다. 일부 구현예에서, 발현 수준은 TREM1 단백질을 인코딩하는 mRNA의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 일부 구현예에서, TREM1 단백질의 발현 수준은 NSM의 단백질 발현 수준을 포함한다. 일부 구현예에서 TREM1 단백질의 발현 수준은 FACS, 웨스턴 블랏, ELISA, 면역침전법, 면역조직화학, 면역형광법, 방사면역측정법, 점 블랏팅, 면역검출 방법, HPLC, 표면 플라즈몬 공명, 광 분광법, 질량 분석법, HPLC, qPCR, RT-qPCR, 멀티플렉스 qPCR 또는 RT-qPCR, RNA-seq, 마이크로어레이 분석, SAGE, MassARRAY 기술, 및 FISH, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 사용하여 샘플에서 검출된다.
또 다른 측면에서, 본 출원은 비-자극성 골수 세포를 포함하는 세포 집단을 항-TREM1 항체와 접촉시키는 단계; 및 비-자극성 골수 세포의 수를 정량화하는 단계를 포함하는, 일반적으로 비-자극성 골수 세포의 존재 또는 부재를 결정하거나, 또는 특정 비-자극성 골수 세포 (예를 들어 DC1 세포, TAM1세포 및/또는 TAM2 세포)의 존재 또는 부재를 결정하는 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 출원은 비-자극성 골수 세포 및 자극성 골수 세포를 포함하는 면역 세포 집단을 항-TREM1 항체와 접촉시키는 단계; 세포에 대한 항체의 결합을 나타내는 복합체 또는 모이어티를 검출하는 단계 및 선택적으로 집단 내 비-자극성 골수 세포의 수를 정량화하는 단계를 포함하는 비-자극성 골수 세포의 존재 또는 부재를 결정하는 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 비-자극성 골수 세포 및 자극성 골수 세포를 포함하는 면역 세포 집단을 항-TREM1 항체와 접촉시키는 단계; 자극성 골수 세포 및 비-자극성 골수 세포의 수를 정량화하는 단계; 및 비-자극성 골수 세포 대 자극성 골수 세포의 상대 비를 결정하는 단계를 포함하는, 비-자극성 골수 세포 대 자극성 골수 세포의 상대 비를 결정하는 방법이 제공된다.
검출 및/또는 정량화를 위한 본원에 기재된 구현예에서, 항-TREM1 항체는 TREM1 단백질에 결합하지만, 생물학적 반응에 영향을 미칠 수 있더라도 ADCC와 같은 생물학적 반응에 반드시 영향을 미칠 필요는 없다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 개체로부터의 생물학적 샘플에서 TREM1 단백질의 발현 수준을 검출하는 단계; 및 TREM1 단백질의 발현 수준에 기초하여 개체가 면역요법에 반응할 수 있는지를 결정하는 단계를 포함하는, 면역-관련 상태 (예를 들어, 암)의 치료를 위해 면역 요법에 (예를 들어, 항-TREM1 항체로) 반응할 수 있는 개체를 식별하는 방법을 제공하며, 여기서 건강한 개체의 수준에 비해 상승된 개체의 TREM1 단백질 수준은 개체가 면역요법에 반응할 수 있음을 나타낸다. 일부 구현예에서, 이들 방법은 또한 개체에서 면역-관련 상태 (예를 들어, 암)를 진단하는데 사용될 수 있으며 TREM1 단백질의 발현 수준에 기초하며, 여기서 건강한 개체의 수준에 비해 상승된 개체의 TREM1 단백질 수준은 개체가 암으로 고통받고 있음을 나타낸다. 일부 구현예에서, 발현 수준은 TREM1 단백질을 인코딩하는 mRNA의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 다른 구현예에서, TREM1 단백질의 발현 수준은 TREM1 단백질의 단백질 발현 수준을 포함한다. 일부 구현예에서 TREM1 단백질의 발현 수준은 FACS, 웨스턴 블랏, ELISA, 면역침전법, 면역조직화학, 면역형광법, 방사면역측정법, 점 블랏팅, 면역검출 방법, HPLC, 표면 플라즈몬 공명, 광 분광법, 질량 분석법, HPLC, qPCR, RT-qPCR, 멀티플렉스 qPCR 또는 RT-qPCR, RNA-seq, 마이크로어레이 분석, SAGE, MassARRAY 기술, 및 FISH, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 방법을 사용하여 샘플에서 검출된다. 이들 구현예에서, 항-TREM1 항체는 TREM1 단백질에 결합하지만, ADCC와 같은 생물학적 반응에 반드시 영향을 미칠 필요는 없다. 일부 구현예에서 생물학적 샘플은 종양 조직에서 유래된다. 일부 구현예에서 생물학적 샘플은, 비제한적으로, 체액, 조직 샘플, 장기 샘플, 소변, 대변, 혈액, 타액, CSF 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
또한, 종양에 대한 대상체 면역 반응을 향상시키거나 면역요법 치료의 효능을 향상시키는 방법 본원에 개시된다. 일반적으로, SDC의 존재비를 증가시키는 치료는 재발 없는 생존 시간과 같은 대상체 결과를 개선시킬 것이고, 암 면역요법 치료의 효능을 향상시킬 것이다. 치료는 대상체의 종양에서 SDC 세포의 상대적 또는 절대적 존재비를 증가시킬 수 있다. 치료는 대상체의 종양에서 NSM 세포의 상대적 또는 절대적 존재비를 감소시킬 수 있다.
일반적인 치료 전략의 예시적인 방법은 Flt3L의 전신 도입에 의해 SDC의 수를 증가시키는 것을 포함한다. 또 다른 방법은 CSF1을 동시에 차단하면서 Flt3L로 대상체의 자가 골수 또는 혈액 세포를 치료하는 것이다. 예를 들어 레트로바이러스에 의해 골수 또는 혈액 전구 집단에서 IRF8, Mycl1 또는 BATF3 또는 ZBTB46과 같은 SDC 전사 인자의 발현이 또한 SDC 발달을 유도하는데 사용될 수 있다. 또 다른 치료 전략은 SDC를 선택적으로 절약하면서 NSM 세포의 체계적인 제거를 포함한다. 이것은 이러한 집단의 비의 전반적인 유리한 변화를 초래할 수 있다. NSM 세포의 제거는 TREM1 표면 단백질에 대한 항체의 투여 (전신 또는 종양에 국재화된 투여)를 포함하여, 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, SDC-향상 치료는 대상체의 자연 면역계가 암을 더 잘 제어 또는 근절할 수 있도록 하는 치료적 처치로서 적용된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 SDC-향상 치료는 면역요법 치료와 같은 치료적 처치와 함께 적용되며 (그와 같은 적용은 면역요법 치료 전, 동시 또는 후에 발생함) 여기서 SDC-향상 치료는 치료적 처치의 효능을 증가시키기 위한 부수 또는 보조 치료의 역할을 한다.
투여 방법
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 개체에서 면역-관련 상태의 치료에 유용하다. 일 구현예에서, 개체는 인간이고 항체는 TREM1 항체이다. 또 다른 구현예에서, 개체는 마우스이고 항체는 TREM1 항체이다.
일부 구현예에서, 항체는 정맥내, 근육내, 피하, 국소, 경구, 경피, 복강내, 안와내, 이식에 의해, 흡입에 의해, 경막내, 뇌실내, 또는 비강내로 투여된다. 유효량의 항-TREM1 항체는 암의 치료를 위해 투여될 수 있다. 항-TREM1 항체의 적절한 투여량은 치료될 암의 유형, 항-TREM1 항체의 유형, 암의 중증도 및 경과, 개체의 임상적 상태, 개체의 병력 및 치료에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 기반하여 결정될 수 있다.
병용 요법
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 적어도 하나의 추가 치료제와 함께 투여된다. 임의의 적합한 추가 치료제 또는 면역치료제는 본 명세서에 제공된 항체와 함께 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역요법은 체크포인트 억제제; T 세포의 체크포인트 억제제; 항-PD1 항체; 항-PDL1 항체; 항-CTLA4 항체; 입양 세포 요법; 입양 T 세포 요법; CAR-T 세포 요법; 수지상 세포 백신; STING 작용제; 단핵구 백신; 칼메트-게랭균 백신; T 세포 및 항원 제시 세포 둘 모두에 결합하는 항원 결합 단백질; BiTE 이중 항원 결합 단백질; 톨-유사 수용체 리간드; 사이토카인; 세포독성 요법; 화학요법; 방사선요법; 소분자 억제제; 소분자 작용제; 면역조절제; 종양용해 바이러스; 및 후성유전적 조절인자, 및 이의 조합으로부터 선택되지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 추가 치료제는 항체이다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 종양 세포 표면 상의 단백질 또는 단백질들에 결합하는 항체이다.
암 치료를 위해, 항-TREM1 항체는 면역 체크포인트 단백질을 억제하는 하나 이상의 항체와 조합될 수 있다. 종양 세포의 표면에 표시된 면역 체크포인트 단백질이 특히 관심 대상이다. 임상 암 면역요법, 세포독성 T-림프구-관련 항원 4 (CTLA4; CD152로도 공지됨) 및 프로그램된 세포 사멸 단백질 1 (PD1; CD279로도 공지됨)의 맥락에서 가장 적극적으로 연구된 면역-체크포인트 수용체는 둘 다 억제 수용체이다. 이들 수용체 중 어느 하나를 차단하는 항체의 임상 활성은 항종양 면역이 여러 수준에서 향상될 수 있고, 조합 전략이 기계론적 고려 및 전임상 모델에 의해 가이드되어 지능적으로 설계될 수 있음을 의미한다.
PD-1에 대한 2개의 리간드는 PD-1 리간드 1 (PD-L1; B7-H1 및 CD274로도 공지됨) 및 PD-L2 (B7-DC 및 CD273로도 공지됨)이다. PD-L1은 암 세포 상에서 발현되고, T 세포 상의 이의 수용체 PD-1과의 결합을 통해 T 세포 활성화/기능을 억제한다. PD-1과 암 세포 상의 이의 동족 리간드, PD-L1 및 PD-L2와의 상호작용을 차단하는 억제제는 T 세포 활성화 및 기능을 둘 다 증가시킬 수 있으며, 암 세포가 면역계를 피하는 것을 방지한다.
일부 구현예에서, 면역요법은 PD-1과 PD-L1 또는 PD-L2의 결합을 방해하는 제제이다. 일부 구현예에서, 면역요법은 항-PD1 항체이다. 일부 구현예에서, 면역요법은 항-PD-L1 항체이다. 일부 구현예에서, 면역요법은 항-PD-L2 항체이다.
다양한 PD-1, PD-L1, 및 PD-L2 항체가 당 업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 추가 치료제는 아테졸리주맙 (PD-L1), 아벨루맙 (PD-L1), 더발루맙 (PD-L1), 니볼루맙 (PD-1), 펨브로리주맙 (PD-1), 세미플리맙 (PD-1), 이필리무맙 (CTLA-4), 트레멜리무맙 (CTLA-4), 또는 이들의 임의의 조합 중 적어도 하나이다.
추가 치료제는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체 및 추가 치료제는 동일한 약제학적 조성물에 포함된다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체 및 추가 치료제는 상이한 약제학적 조성물에 포함된다.
본원에 제공된 항체 및 추가 치료제가 상이한 약제학적 조성물에 포함되는 구현예에서, 항체의 투여는 추가 치료제의 투여 전, 동시 및/또는 후에 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체 및 추가 치료제의 투여는 서로 약 1개월 이내에 발생한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체 및 추가 치료제의 투여는 서로 약 1주일 이내에 발생한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체 및 추가 치료제의 투여는 서로 약 1일 이내에 발생한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체 및 추가 치료제의 투여는 서로 약 12시간 이내에 발생한다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 항체 및 추가 치료제의 투여는 서로 약 1시간 이내에 발생한다.
키트 및 제조 물품
본 출원은 본원에 기재된 항체 조성물 중 임의의 하나 이상을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 키트는 임의의 2차 항체, 면역조직화학 분석용 시약, 약제학적으로 허용되는 부형제 및 사용 설명서 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 구성요소를 추가로 함유한다. 하나의 구체적인 구현예에서, 키트는 본원에 기재된 항체 조성물 중 임의의 하나 이상을, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다.
본 출원은 또한 본원에 기재된 항체 조성물 또는 키트 중 어느 하나를 포함하는 제조 물품을 제공한다. 제조 물품의 예로는 바이알 (밀봉된 바이알 포함)을 포함한다..
추가 실시형태
아래는 특정 실시형태를 열거하는 단락들이다.
3개의 중쇄 CDR 서열, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 서열을 포함하는 중쇄, 및 3개의 경쇄 CDR 서열, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 TREM1 (서열번호: 1)에 결합하는 단리된 항체로서, 여기서:
a. CDR-H1은 서열번호: 23에 제시된 서열을 포함하고,
b. CDR-H2는 서열번호: 24에 제시된 서열을 포함하고,
c. CDR-H3은 서열번호: 33에 제시된 서열을 포함하고,
d. CDR-L1은 서열번호: 26에 제시된 서열을 포함하고,
e. CDR-L2는 서열번호: 27에 제시된 서열을 포함하고, 그리고
f. CDR-L3은 서열번호: 28에 제시된 서열을 포함한다.
제1항의 단리된 항체로서, VH 사슬 서열은 서열번호: 17에 제시된 VH 서열을 포함하고, VL 사슬 서열은 서열번호: 20에 제시된 VL 서열을 포함한다.
제1항의 단리된 항체로서, VH 사슬 서열은 서열번호: 16, 17 또는 18에 제시된 서열로부터 선택된 VH 서열을 포함하고; VL 사슬 서열은 서열번호: 20, 21, 또는 22에 제시된 서열로부터 선택된 VL 서열을 포함한다.
제1항의 단리된 항체로서, 항체는 서열번호: 34에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호: 35에 제시된 경쇄 서열을 포함한다.
제1항의 단리된 항체로서, VH 사슬 서열은 서열번호: 17에 제시된 VH 서열로 구성되고; VL 사슬 서열은 서열번호: 20에 제시된 VL 서열로 구성된다.
제1항의 단리된 항체로서, VH 사슬 서열은 서열번호: 16, 17 또는 18에 제시된 서열로부터 선택된 VH 서열로 구성되고; VL 사슬 서열은 서열번호: 20, 21, 또는 22에 제시된 서열로부터 선택된 VL 서열로 구성된다.
제1항의 단리된 항체로서, 상기 항체는 서열번호: 34에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호: 35에 제시된 경쇄 서열로 구성된다.
제1항의 단리된 항체로서, 항체는 어푸코실화되고, VH 사슬 서열은 서열번호: 17에 제시된 VH 서열을 포함하고, VL 사슬 서열은 서열번호: 20에 제시된 VL 서열을 포함한다.
제1항의 단리된 항체로서, 항체는 어푸코실화되고, VH 사슬 서열은 서열번호: 16, 17 또는 18에 제시된 서열로부터 선택된 VH 서열을 포함하고; VL 사슬 서열은 서열번호: 20, 21, 또는 22에 제시된 서열로부터 선택된 VL 서열을 포함한다.
제1항의 단리된 항체로서, 항체는 어푸코실화되고, 항체는 서열번호: 34에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호: 35에 제시된 경쇄 서열을 포함한다.
제1항의 단리된 항체로서, 항체는 어푸코실화되고, VH 사슬 서열은 서열번호: 17에 제시된 VH 서열로 구성되고, VL 사슬 서열은 서열번호: 20에 제시된 VL 서열을 포함한다.
제1항의 단리된 항체로서, 항체는 어푸코실화되고, VH 사슬 서열은 서열번호: 16, 17, 또는 18에 제시된 서열로부터 선택된 VH 서열로 구성되고; VL 사슬 서열은 서열번호: 20, 21, 또는 22에 제시된 서열로부터 선택된 VL 서열을 포함한다.
제1항의 단리된 항체로서, 항체는 어푸코실화되고, 항체는 서열번호: 34에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호: 35에 제시된 경쇄 서열로 구성된다.
제1항의 단리된 항체로서, 항체는 어푸코실화된다.
제1항의 단리된 항체로서, 항체는 활성 인간 Fc를 포함한다.
제15항의 단리된 항체로서, 인간 Fc는 야생형 인간 IgG1 Fc이다.
제1항의 단리된 항체로서, 항체는 어푸코실화되고 야생형 인간 IgG1 Fc를 포함하고, VH 사슬 서열은 서열번호: 17에 제시된 VH 서열을 포함하고, VL 사슬 서열은 서열번호: 20에 제시된 VL 서열을 포함한다.
제1항의 단리된 항체로서, 항체는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 검정에 의해 측정될 때 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7x10-9 M 이하의 KD로 인간 TREM1에 결합한다.
제1항의 단리된 항체로서, 항체는 인간화된다.
숙주 세포로부터 제1항의 항체를 발현시키는 단계 및 발현된 항체를 단리하는 단계를 포함하는 항체를 생산하는 방법.
제1항의 항체 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
제1항의 항체 및 사용 지침서를 포함하는 키트.
3개의 중쇄 CDR 서열, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 서열을 포함하는 중쇄, 및 3개의 경쇄 CDR 서열, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 TREM1 (서열번호: 1)에 결합하는 단리된 항체로서, 여기서:
a. CDR-H1은 서열번호: 23에 제시된 서열을 포함하고,
b. CDR-H2는 서열번호: 24에 제시된 서열을 포함하고,
c. CDR-H3은 서열번호: 32에 제시된 서열을 포함하고,
d. CDR-L1은 서열번호: 26에 제시된 서열을 포함하고,
e. CDR-L2는 서열번호: 27에 제시된 서열을 포함하고, 그리고
f. CDR-L3은 서열번호: 28에 제시된 서열을 포함한다.
제23항의 단리된 항체로서, VH 사슬 서열은 서열번호: 13에 제시된 VH 서열을 포함하고, VL 사슬 서열은 서열번호: 20에 제시된 VL 서열을 포함한다.
제23항의 단리된 항체로서, 항체는 서열번호: 36에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호: 37에 제시된 경쇄 서열을 포함한다.
제23항의 항체 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
3개의 중쇄 CDR 서열, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 서열을 포함하는 중쇄, 및 3개의 경쇄 CDR 서열, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 참고 항체와 인간 TREM1 (서열번호: 1)에 결합에 대해 경쟁하는 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 여기서:
a. CDR-H1은 서열번호: 23에 제시된 서열을 포함하고,
b. CDR-H2는 서열번호: 24에 제시된 서열을 포함하고,
c. CDR-H3은 서열번호: 33에 제시된 서열을 포함하고,
d. CDR-L1은 서열번호: 26에 제시된 서열을 포함하고,
e. CDR-L2는 서열번호: 27에 제시된 서열을 포함하고, 그리고
f. CDR-L3은 서열번호: 28에 제시된 서열을 포함한다.
제27항의 방법로서, 대상체는 이전에 면역요법을 받았거나, 동시에 받고있거나, 또는 후속적으로 받을 것이고, 면역요법은 체크포인트 억제제; T 세포의 체크포인트 억제제; 항-PD1 항체; 항-PDL1 항체; 항-CTLA4 항체; 입양 T 세포 요법; CAR-T 세포 요법; 수지상 세포 백신; 단핵구 백신; T 세포 및 항원 제시 세포 둘 모두에 결합하는 항원 결합 단백질; BiTE 이중 항원 결합 단백질; 톨-유사 수용체 리간드; 사이토카인; 세포독성 요법; 화학요법; 방사선 요법; 소분자 억제제; 소분자 작용제; 면역조절제; 및 후성유전적 조절인자 중 적어도 하나이다.
제28항의 방법으로서, 면역요법은 항-PD1 항체, 항-PDL1 항체; 또는 항-CTLA4 항체이다.
3개의 중쇄 CDR 서열, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 서열을 포함하는 중쇄, 및 3개의 경쇄 CDR 서열, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 참고 항체와 인간 TREM1 (서열번호: 1)에 결합에 대해 경쟁하는 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 증가시키는 방법으로서, 여기서:
a. CDR-H1은 서열번호: 23에 제시된 서열을 포함하고,
b. CDR-H2는 서열번호: 24에 제시된 서열을 포함하고,
c. CDR-H3은 서열번호: 33에 제시된 서열을 포함하고,
d. CDR-L1은 서열번호: 26에 제시된 서열을 포함하고,
e. CDR-L2는 서열번호: 27에 제시된 서열을 포함하고, 그리고
f. CDR-L3은 서열번호: 28에 제시된 서열을 포함한다.
실시예
하기는 본 발명을 수행하기 위한 특정 구현예의 예이다. 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되며, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하려는 것은 아니다. 사용된 수 (예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만, 물론 일부 실험 오차 및 편차가 허용되어야 한다.
달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 실시는 당 업계의 기술 내에서 통상적인 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 약리학 방법을 사용할 것이다. 그와 같은 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 하기를 참고한다: T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick 및 N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3 rd Ed. (Plenum Press) Vols A 및 B(1992).
실시예 1: 항-TREM1 항체의 서열화 및 인간화
인간 TREM1에 특이적인 모노클로날 마우스 IgG1 클론 TREM-26을 수득하여 서열 결정 및 인간화에 사용하였다. 간단히 말해서, 항체에서 디설파이드 결합은 디티오트레이톨 (DTT)로 환원되었고 유리 설프히드릴기는 요오도아세트아미드로 알킬화되었다. 알킬화된 항체를 서열화-등급 엔도프로테이나제로 절단하고, 스핀 컬럼을 사용하여 정제하고, LC-MS/MS 분석에 의해 서열을 결정하였다 (아래 참고).
마우스 항체 VL 및 VH 영역을 인간 IgG1 불변 영역에 그라프팅함에 의해 키메라 항체 (PI-4026)가 작제되었다. 키메라는 항체 CDR을 인간 가변 도메인 프레임워크 내로 클로닝함에 의해 추가로 인간화되고, 상이한 프레임워크 돌연변이인, 4 VH 변이체 및 4 VL 변이체 (PI-4026-1-10)로 10개 추가의 인간화된 변이체가 제조되었다.
VH 및 VL 서열은 NCBI 웹사이트 (ncbi.nlm.nih.gov/igblast/; Ye, J. 등. Nucleic Acids Research 41:W34-W40 (2013)) 상에 공지된 인간 생식계열 서열의 라이브러리와 비교되었다. 사용된 데이터베이스는 IMGT 인간 VH 유전자 (F+ORF, 273 생식계열 서열) 및 IMGT 인간 VL카파 유전자 (F+ORF, 74 생식계열 서열)였다.
인간화된 PI-4026 VH의 경우, 인간 생식계열 IGHV1-46 (대립유전자 1)이 수용체 서열로 선택되었고 인간 중쇄 IGHJ4 (대립유전자 1) 연결 영역 (J 유전자)이 국제 ImMunoGeneTics 정보 시스템® www.imgt.org (설립자 및 이사: Marie-Paule Lefranc, 프랑스 몽펠리에 소재)인 IMGT®에서 편집된 인간 연결 영역 서열로부터 선택되었다.
인간화된 PI-4026 VL의 경우, 인간 생식계열 IGKV1-39 (대립유전자 1)가 수용체 서열로 선택되었고 인간 경쇄 IGKJ2 (대립유전자 1) 연결 영역(J 유전자)이 국제 ImMunoGeneTics 정보 시스템® www.imgt.org (설립자 및 이사: Marie-Paule Lefranc, 프랑스 몽펠리에 소재)인 IMGT®에서 편집된 인간 연결 영역 서열로부터 선택되었다.
CDR은 AbM 정의에 따라 정의되었다 (CDR 정의를 비교하는 표에 대해서는 Dr. Andrew C. R. Martin의 웹사이트 www.bioinf.org.uk/abs/를 참고한다). 예를 들어, 인간화된 항체의 결합을 최적화하기 위해, 상응하는 모 뮤어라인 서열에 대한 인간 생식계열 프레임워크 (즉, VH 및 VL에서 비-CDR 잔기) 위치의 변경이 사용되었다.
표 1A는 생성된 mAb PI-4026의 인간화된 버전의 VH 및 VL 서열을 도시한다. 4026 VH-1 및 4026 VL-1은 다른 인간화된 버전이 추가 프레임워크 돌연변이를 통해 생성된 모 인간화된 VH 및 VL 클론이다. 3개의 인간화된 클론의 VH (4026 VH-2, VH-3, VH-4) 및 VL 영역이 만들어졌다 (4026 VL-2, VL-3, VL-4).
표 1B는 CDR 서열을 도시한다.
Figure pct00007
표 1C - 인간화된 항체의 CDR
Figure pct00008
TREM1 항체의 10개 인간화된 변이체는 다른 프레임워크 돌연변이를 사용하여 만들어졌다. 표 1C는 각 인간화된 변이체에 사용된 프레임워크 돌연변이와 중쇄 및 경쇄 페어링의 수를 도시한다.
Figure pct00009
실시예 2: 항-TREM1 항체의 생산 및 특징규명
항체 생산 및 특징규명
중쇄 및 경쇄 발현 벡터를 표준 방법을 사용하여 expi293 세포 안으로 형질감염시켰다. 세포를 최대 7일 동안 성장시킨 후 상청액을 항체 정제를 위해 수확하였다. expi293에 부가하여, 항체는 또한 CRISPR/Cas9 편집 (Alexander Weiss, 토론토 대학)에 의해 포유류 α1,6-푸코실트랜스퍼라제 (FUT8)가 결핍된 expi293 세포에서 생성되었다. 상청액 pH를 1M HEPES로 pH 7.4로 조정하고, 미생물 성장을 방지하기 위해 아지드화나트륨을 첨가하였다. KanCap A 수지를 사용하여 단백질을 포획하고 항체를 PBS 및 1M NaCl을 함유하는 PBS로 세정한 후 50mM 시트레이트 pH 3.5, 100mM NaCl로 용리시켰다. 용리 직후, 용액을 0.5M 아르기닌을 함유하는 1M 트리스 (pH 8)로 중화시켰다. 표준 기술을 사용하여 PBS로 완충제 교환된 단백질에 대해 생물물리학적 특징규명을 수행했다. 단백질은 OD280에 의해 정량화되었고, 양과 농도는 계산된 흡광 계수를 사용하여 결정되었다. 환원 및 비-환원 SDS-PAGE (Biorad 기준 트리스/글리신/SDS, 4-20%) 또는 Perkin Elmer GXII 모세관 전기영동 시스템을 사용하여 순도 및 대략적인 분자 질량을 결정했다. 응집 상태는 Sepax Zenix-C SEC-300, 3um, 300Å, 4.6*150mm 크기 배제 컬럼 및 PBS 실행 완충액을 사용하여 280nm에서 검출로 UHPLC에 의해 결정되었다.
표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 사용한 인간 아비드 (Avid) K D 측정
PI-4026 변이체에 대한 인간 TREM1 결합의 친화도는 BIAcore T200 (GE Healthcare, 영국 소재) 상에서 SPR에 의해 측정되었다. 모든 데이터는 25℃에서 수집되었다. 10mM HEPES pH 7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% (v/V) 계면활성제 P20을 이동 완충액으로 사용하고 mAb의 모든 희석을 위해 사용했다. 항-마우스 Fc를 아민 커플링 화학을 사용하여 CM4 바이오센서 칩 (GE Healthcare) 상에 고정화시켰다. 인간 키메라 TREM1-mIgG Fc는 하나의 플로우 셀 상에 포획되었고 다른 플로우 셀 (기준 표면으로 사용됨)은 블랭크로 남겨졌다. 다양한 농도의 PI-4026 변이체 (분석물로서, 모든 hIgG1 이소타입)를 두 개의 플로우 셀을 통해 복수의 주기로 주입했다. 각 주기 후, 글리신 HCl 완충액 (10mM, pH 2.0)을 주입함에 의해 표면을 재생시켰다. BIAevaluation 소프트웨어를 사용하여 동역학 평가를 수행했다. 동역학 평가는 1:1 Langmuir 결합 모델에 맞는 센서그램의 생성을 통해 이루어졌다.
표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 사용한 인간 단량체의 K D 측정
PI-4026 변이체에 대한 인간 TREM1 결합의 친화도는 BIAcore T200 (GE Healthcare, 영국 소재) 상에서 SPR에 의해 측정되었다. 모든 데이터는 25℃에서 수집되었다. 10mM HEPES pH 7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% (v/V) 계면활성제 P20을 이동 완충액으로 사용하고 mAb의 모든 희석을 위해 사용했다. 항-인간 Fc를 아민 커플링 화학을 사용하여 CM4 바이오센서 칩 (GE Healthcare) 상에 고정화시켰다. PI-4026 변이체 (모든 hIgG1 이소타입)는 하나의 플로우 셀 상의 항-인간 Fc에 의해 포획되었고 다른 플로우 셀 (참조 표면으로 사용됨)은 블랭크로 남겨졌다. 다양한 농도의 His 태그된-인간 TREM1 (분석물로서)을 포획된 PI-4026 변이체를 갖는 플로우 셀과 참고 셀을 통해 복수의 주기로 주입했다. 각 주기 후, 3M MgCl2를 주입함에 의해 표면을 재생시켰다. BIAevaluation 소프트웨어를 사용하여 동역학 평가를 수행했다. 동역학 평가는 1:1 Langmuir 결합 모델에 맞는 센서그램의 생성을 통해 이루어졌다.
시차 주사 형광측정법
PI-4026 변이체의 용융 온도는 나노 시차 주사 형광측정법 (DSF)에 의해 결정되었다. PI-4026 변이체 샘플은 20℃에서 100℃까지 1.5℃/분의 램프 속도에서 실행되었다. 샘플은 샘플을 안으로 침지함에 의해 nanoDSF 등급 모세관 안으로 장입되었다. 열 스캔 동안 증발을 최소화하기 위해, 모세관의 양쪽 끝을 불활성 오일-기반 액체 고무 밀봉 페이스트로 밀봉했다.
Tm은 트립토판 형광 강도의 변화 또는 350 및 330nm에서 트립토판 방출의 비율로부터 계산되었으며, 이는 온도의 함수로서 단백질의 펼침 동안 형태적 변화를 정확하게 모니터링한다. Tm은 단백질이 50% 펼쳐지는 온도이다.
세포 결합
대수기 성장에서 HEK293 대조군 세포를 배양물로부터 수확하고, 세정하고, 1x105 세포/웰로 96 웰 U 바닥 플레이트에 도말하였다. 표시된 PI-4026 변이체 및 이소타입 대조군의 적정을 세포에 첨가하고 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 1:500으로 희석된 Alexa 647-접합된 항-인간 Fcγ 2차 항체 (Jackson Immunoresearch)를 사용하여 결합된 일차 항체를 검출하였다. 2차 항체를 얼음 위에서 30분 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포를 세정하고 Zombie NIR (Biolegend)로 염색하여 실온에서 15분 동안 세포 생존율을 결정했다. 결합된 항체로부터의 형광 신호는 유세포분석법 (ThermoFisher Attune NxT)에 의해 평가되었다.
결과
표 2는 인간화된 TREM1 항체의 각각에 대한 항체 친화력, 단량체 친화도, 세포 결합 및 DSF 결과를 나타낸다.
Figure pct00010
도시된 결과에 기반하여 PI-4026-5가 추가 특징규명 및 시험을 위해 선택되었다.
다음으로, PI-4026-5에 대한 인간 TREM1 결합의 친화도가 BIAcore T200 (GE Healthcare) 상에서 SPR에 의해 추가로 측정되었다. 모든 데이터는 25℃에서 수집되었다. 10mM HEPES pH 7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% (v/V) 계면활성제 P20을 이동 완충액 및 PI-4026-5의 희석으로 사용했다. 항-마우스 Fc를 아민 커플링 화학을 사용하여 CM4 바이오센서 칩 (GE Healthcare) 상에 고정화시켰다. 인간 키메라 TREM1-mIgG Fc는 하나의 플로우 셀 상에 포획되었고, 참조 표면으로 사용된 다른 플로우 셀은 블랭크로 남겨졌다. 다양한 농도의 PI-4026-5가 양 플로우 셀을 통해 다수의 주기로 주입되었다. 각 주기 후, 글리신 HCl 완충액 (10mM, pH 2.0)을 주입하여 표면을 재생시켰다. BIAevaluation 소프트웨어를 사용하여 동역학 평가를 수행했다. 동역학 평가는 1:1 Langmuir 결합 모델에 맞는 센서그램의 생성을 통해 이루어졌다.
PI-4026-5의 SPR 결합 동역학은 도 1에 도시되어 있다.
실시예 3: 항-TREM1 항체의 세포 결합
인간화된 TREM1 항체의 종 특이성
hTREM1 과발현 세포
대수기 성장에서 HEK293 대조군 또는 인간 TREM1 과-발현 세포를 배양물로부터 수확하고, 세정하고, 1x105 세포/웰로 96 웰 U 바닥 플레이트에 도말하였다. 표시된 농도에서 비접합된 hIgG1 대조군 또는 PI-4026-5 항체의 적정을 세포에 첨가하고 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 1:500으로 희석된 Alexa 647-접합된 항-인간 Fcγ 2차 항체 (Jackson Immunoresearch)를 사용하여 결합된 일차 항체를 검출하였다. 2차 항체를 얼음 위에서 30분 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포를 세정하고 Zombie NIR (Biolegend)로 염색하여 실온에서 15분 동안 세포 생존율을 결정했다. 결합된 항체로부터의 형광 신호는 유세포분석법 (ThermoFisher Attune NxT)에 의해 평가되었다. EC50 값은 Prism 소프트웨어 (Graphpad)에서 계산되었다.
CynoTREM1 및 mTREM1 과발현 세포
대수기 성장에서 HEK293 과-발현 사이노몰구스 또는 마우스 TREM1을 배양물로부터 수확하고, 세정하고, 1x105 세포/웰로 96 웰 U 바닥 플레이트에 도말하였다. 표시된 농도에서 비접합된 hIgG1 대조군 또는 PI-4026-5 항체의 적정을 세포에 첨가하고 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 1:500으로 희석된 Alexa 647-접합된 항-인간 Fcγ 2차 항체 (Jackson Immunoresearch)를 사용하여 결합된 일차 항체를 검출하였다. 2차 항체를 얼음 위에서 30분 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포를 세정하고 Zombie NIR (Biolegend)로 염색하여 실온에서 15분 동안 세포 생존율을 결정했다. 결합된 항체로부터의 형광 신호는 유세포분석법 (ThermoFisher Attune NxT)에 의해 평가되었다. EC50 값은 Prism 소프트웨어 (Graphpad)에서 계산되었다.
세포 결합
인간 공여자로부터의 신선한 혈액 (Stanford Blood Centre)을 적혈구 용해시키고 세정하여 PBMC 및 과립구 함량을 풍부하게 하였다. 세포를 도말하고 Fc 수용체를 인간 혈청 (Jackson Immunoresearch), 인간 FcX (Biolegend) 및 펩티드-기반 FcR 차단 용액 (Innovex Biosciences)의 조합으로 차단하였다. 세포를 또한 Zombie NIR (Biolegend)로 염색하여 세포 생존력을 결정했다. Zombie NIR로 염색한 후, 세포를 인간 IgG1 대조군 또는 PI-4026-5의 적정 및 주요 면역 세브세트에 대한 마커를 포괄하는 유세포분석 칵테일로 염색했다. 사용된 모든 항체는 직접적으로 접합되었다. 데이터는 유세포분석법 (ThermoFisher Attune NxT)에 의해 획득되었다. EC50 값은 Prism 소프트웨어 (Graphpad)에서 계산되었다.
결과
도 2a 및 2b에 도시된 바와 같이, PI-4026-5는 인간 TREM1 과-발현 세포에 높은 특이성으로 결합하지만, 인간 TREM1을 과발현하지 않는 세포에는 결합하지 않는다. 더욱이, PI-4026-5는 인간 말초 혈액에서 호중구 및 단핵구에 결합한다 (도 3a 및 3b).
인간화된 TREM1 항체의 종 특이성을 확인하기 위해, 사이노몰구스 및 마우스 TREM1에 대한 PI-4026-5의 결합을 평가하였다.
도 4a 및 4b에 도시된 바와 같이, PI-4026-5는 사이노몰구스 TREM1에 결합하지만 마우스 TREM1 과-발현 세포에는 결합하지 않는다.
실시예 4: 항-TREM1 항체에 의한 ADCC 및 ADCP의 유도
ADCC 및 ADCP 검정
인간 TREM1을 과-발현하는 HEK293 표적 세포를 평평한 바닥 백색 96 웰 플레이트 (ThermoFisher)에서 표시된 농도에서 PI-4026-5 또는 hIgG1 이소타입 대조군의 적정과 함께 인큐베이션하였다. 실온에서 15분 인큐베이션 후, NFAT-루시페라제 리포터 Jurkat 세포 (Promega, 위스콘신주 메디슨 소재)를 발현하는 hCD16 또는 hCD32를 3:1의 비율로 표적 세포/항체 혼합물에 첨가하였다. 리포터 세포의 첨가 후, 검정을 6시간 동안 5% CO2 분위기에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 루시퍼라제 활성의 양은 루시퍼라제 기질 (Promega, 위스콘신주 메디슨 소재)에 노출시켜 결정하고 발광 판독기 (EnVision, Perkin Elmer)에 의해 검출하였다. EC50 값은 Prism 소프트웨어 (Graphpad)에서 계산되었다.
GFP-양성 expi293 모 또는 인간 TREM1 과-발현 세포를 실온에서 15-30분 동안 비접합된 hIgG1 대조군 또는 PI-4026-5 항체의 적정과 함께 인큐베이션하였다. 세정 없이, Cell Trace Violet (ThermoFisher)으로 표지된 CD14+ 단핵구로부터 분극화된 인간 대식세포를 그 다음 expi293 및 항체 혼합물에 1:1의 비율로 첨가했다. 검정은 5% CO2 분위기에서 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션된 후 검정은 유세포분석법 (ThermoFisher Attune NxT)에 의해 평가되었다. ADCP는 단일항 게이트로부터 GFP 양성 및 Cell Trace Violet 양성 대식세포의 수를 열거함에 의해 측정되었다. EC50 값은 Prism 소프트웨어 (Graphpad)에서 계산되었다.
결과
도 5a 및 5b에 도시된 바와 같이, PI-4026-5는 용량-의존적, TREM1-특이적 방식으로 다운스트림 FcγR-매개 시그널링을 유도한다. 도 5a는 hCD16 리포터 검정 시스템을 사용한 FcγR 시그널링의 유도를 도시하고, 도 5b는 hCD32 리포터 검정 시스템을 사용한 FcγR 시그널링의 유도를 도시한다.
다음으로, 일차 인간 대식세포에 의해 ADCP를 유도하는 인간화된 TREM1 항체의 능력을 평가하였다.
도 6a 및 6b에 도시된 바와 같이, PI-4026-5는 모 expi293 세포 (도 6a)가 아닌 hTREM1을 과-발현하는 expi293 세포 (도 6b)의 일차 인간 대식세포에 의해 ADCP를 유도한다.
실시예 5: 인간 TREM1 IgV로 키메라 PI-4026 Fab의 결정화
단백질 결정화
hTREM1 IgV:키메라 PI-4026 Fab의 SEC 정제된 복합체의 회절 품질 결정은 20℃에서 낙하 증기 확산을 장착함에 의해 얻어졌다. 결정을 동결보호하고 X-선 회절 데이터를 프랑스 그르노블에 있는 유럽 싱크로트론 (ESRF)에서 수집했다. hTREM1 IgV:PI-4026 Fab 복합체의 구조는 CCP4에서 프로그램 MOLREP를 사용하여 분자 대체에 의해 결정되었다. 최종 모델은 1.93Å의 해상도에서 각각 16.4% 및 21.6%의 Rwork 및 Rfree로 정제되었다. 최종 정제된 구조의 분석은 하나의 TREM1 IgV 분자와 상호작용하는 하나의 PI-4026 Fab를 나타냈다.
결과
도 7a-e는 PI-4026 Fab의 각 CDR에서의 특정 잔기와 TREM1 IgV 도메인의 특정 잔기의 상호작용을 도시한다. 각 패널에서 어두운 회색 구조는 표시된 항체 CDR을 나타내고 밝은 회색 구조는 TREM1 IgV 도메인을 나타낸다. 상호작용하는 잔기는 인간 TREM1 서열, 또는 PI-4026 중쇄 또는 경쇄에서 그 위치에 이어지는 단일 문자 아미노산 명명법으로 표시된다. 점선은 CDR 잔기와 TREM1 IgV 잔기 사이의 수소 결합을 나타낸다. 점선과 연관된 숫자는 옹스트롬(Å)으로 측정된 잔기 사이의 거리이다. PI-4026 Fab의 CDRL2는 TREM1 IgV 도메인과의 상호작용에 중요하지 않았다. 모든 도면 및 상호작용은 PyMOL 소프트웨어를 사용하여 생성 및 모델링되었다.
도 7a는 PI-4026 Fab의 CDRH1 및 TREM1 IgV 도메인 내의 잔기의 상호작용을 나타낸다. 도 7b는 PI-4026 Fab의 CDRH2 및 TREM1 IgV 도메인 내의 잔기의 상호작용을 나타낸다. 도 7c는 PI-4026 Fab의 CDRH3 및 TREM1 IgV 도메인 내의 잔기의 상호작용을 나타낸다. 도 7d는 PI-4026 Fab의 CDRL1 및 TREM1 IgV 도메인 내의 잔기의 상호작용을 나타낸다. 도 7e는 PI-4026 Fab의 CDRL3 및 TREM1 IgV 도메인 내의 잔기의 상호작용을 나타낸다.
키메라 PI-4026 항체의 에피토프 서열은 인간 TREM1의 아미노산 21-34 (서열번호: 42), 103-109 (서열번호: 43), 및 128-136 (서열번호: 44)을 포괄하는 비-접촉성 잔기이다.
실시예 6: 변이체 CDRH3 mAb의 산화 위험 및 특징규명을 감소시키기 위한 CDRH3 돌연변이
크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의한 H 2 O 2 산화 평가
산화의 분석은 1mg/mL의 최종 항체 농도에서 40℃에서 1시간 동안 표시된 농도의 H2O2에서 PI-4026-5 및 PI-4026-7 변이체를 인큐베이션함에 의해 달성되었다. 샘플은 Superdex 200 Increase 10/300 GL 컬럼 (GE Healthcare) 상에서 ThermoFisher 분석 UHPLC 시스템을 사용하여 다양한 농도 및 시점에서 SEC에 의해 분석되었다. PBS pH 7.4가 이동상 완충액으로 사용되었고 유속은 0.5mL/분이었다. 데이터를 분석하고 A280에서 피크의 AUC를 Chromeleon 7 기기 소프트웨어 (ThermoFisher)를 사용하여 통합했다.
사이노몰구스 아비드 KD
PI-4026-5 변이체에 결합하는 사이노몰구스 TREM1의 친화도는 BIAcore T200 (GE Healthcare) 상에서 SPR에 의해 측정되었다. 모든 데이터는 25℃에서 수집되었다. 10mM HEPES pH 7.4, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% (v/V) 계면활성제 P20을 이동 완충액으로 사용하고 mAb의 모든 희석을 위해 사용했다. 항-마우스 Fc를 아민 커플링 화학을 사용하여 CM4 바이오센서 칩 (GE Healthcare) 상에 고정화시켰다. 키메라 사이노몰구스 TREM1-mIgG Fc는 하나의 플로우 셀 상에 포획되었고 다른 플로우 셀 (참고 표면으로 사용됨)은 블랭크로 남겨졌다. 다양한 농도의 PI-4026-5 변이체 (분석물로서, hIgG1 이소타입)를 포획된 사이노몰구스 TREM1-mIgG Fc 및 참고 셀을 갖는 플로우 셀을 통해 주입했다. 각 주기 후, 글리신 HCl 완충액 (10mM, pH 2.0)을 주입함에 의해 표면을 재생시켰다. BIAevaluation 소프트웨어를 사용하여 동역학 평가를 수행했다. 동역학 평가는 1:1 Langmuir 결합 모델에 맞는 센서그램의 생성을 통해 이루어졌다.
어푸코실화된 항체 생산
어푸코실화된 항체는 CRISPR/Cas9 편집 (Alexander Weiss, 토론토 대학)에 의해 포유류 α1,6-푸코실트랜스퍼라제 (FUT8)가 결핍된 expi293 세포 안으로 관심 있는 항체 (예를 들어, PI-4026-5)의 중쇄 및 경쇄 플라스미드의 형질감염에 의해 생성되었다. 일단 세포가 형질감염되면, 배지를 수확하고 항체를 일-단계 단백질 A 컬럼 정제 단계 (HiTrap MabSelect SuRe, GE Healthcare)로 정제한 후 최대 7일 동안 팽창시켰다. 항체는 이후 PBS 안으로 완충액 교환되었고 내독소 (LAL 내독소 테스트, Charles River Laboratories), 농도 (Nanodrop, ThermoFisher Scientific) 및 UHPLC (ThermoFisher Scientific)에 의한 임의의 응집에 대해 평가되었다. 항체는 그의 응집 특성에 따라 단량체로 정제된 SEC이다 (단량체도 95% 미만). 어푸코실화는 렌즈콩 응집반응 (Lens Culinaris Agglutination; LCA) 항원 (L-1040-10, Vector Biolabs)에 대한 항체로 웨스턴 블랏 또는 관심 있는 항체의 전체 글리칸 프로필을 평가함 (Bionova Scientific)에 의해 검증된다.
결과
도 8에 도시된 바와 같이, PI-4026-5는 SEC에 의해 평가된 CDRH3 (RMAAMDY)에서의 Met100에서 산화 위험을 갖는다. 항체의 이종성 백분율은 증가하고 단량체 백분율은 H2O2 용량 의존적 방식으로 감소한다. 이것은 0.3%, 0.1% 및 0.01% H2O2로 처리된 샘플의 SEC 프로필에서 관찰된 이중 피크에 의해 표시된다. 표 3은 SEC 결과의 정량화를 제공한다.
Figure pct00011
이를 해결하기 위해, PI-4026-7에서의 잔기 100에서 메티오닌은 이소류신으로 돌연변이되었고 돌연변이체 항체는 상기에 기술된 바와 같이 시험되었다. 표 4에 나타난 바와 같이, 메티오닌 잔기 (RMAAMDY)의 이소류신 (RIAAMDY)으로의 돌연변이는 산화 위험을 제거했다. H2O2와 PI-4026-7M100I 항체의 인큐베이션은 단백질 이종성에서 임의의 증가를 초래하지 않았다.
Figure pct00012
다음으로, 임상적 개발을 위해 이 잔기 위치에서 하나 이상의 바람직한 돌연변이(들)를 결정하기 위해 PI-4026-5에 추가의 돌연변이가 만들어졌다. M100은 이소류신 (M100I), 글루탐산 (M100E), 류신 (M100L) 또는 글루타민 (M100Q)으로 돌연변이되었다. 이들 돌연변이는 PI-4026 Fab와 TREM1 IgV 도메인 사이의 상호작용의 해결된 결정 구조의 분석에 기초하여 합리적으로 선택되었다 (실시예 5). 표 5는 CDR-H3 치환 및 서열의 요약을 나타낸다.
Figure pct00013
각각의 PI-4026-5 CDRH3 돌연변이체는 인간 및 사이노몰구스 TREM1에 대한 결합 친화도, SEC, 인간 단핵구에 대한 세포 결합 및 EC50, DSF, 및 hCD16 리포터 검정 시스템을 사용한 FcγR 시그널링에 대해 실시예 2, 3 및 4에 이미 기술된 바와 같이 특징규명되었다.
부가하여, 사이노몰구스 TREM1을 과발현하는 세포에 대한 항체의 결합을 평가하였다. PI-4026-5 CDRH3 돌연변이체에 대한 결과는 표 6에 요약되어 있다.
Figure pct00014
다음으로, 어푸코실화된 PI-4026-5 CDRH3 돌연변이체 항체는 유사하게 특징규명되었다.
어푸코실화된 PI-4026-5 CDRH3 돌연변이체에 대한 결과는 표 7에 요약되어 있다.
Figure pct00015
PI-4026-5-M100I 및 PI-4026-5-M100E는 비-TREM1 발현 세포에 대해 더 높은 비-특이적 결합을 나타내었고 사이노몰구스 TREM1을 발현하는 세포에 결합하는 능력을 상실하였다. PI-4026-5-M100L 및 PI-4026-5-M100Q는 인간 및 사이노몰구스 TREM1에 대한 결합, 특이성, 생물물리학적 특성 및 기능성과 같은 PI-4026-5-M100 (모 항체)의 품질을 유지했기 때문에 추가 개발을 위해 선택되었다. 중요하게는, 어푸코실화된 PI-4026-5-M100L 및 PI-4026-5-M100Q는 hCD16 리포터 검정에서 유의하게 증진된 FcγR 시그널링을 제외하고는 그 푸코실화된 대응물과 비교하여 유사한 생물물리학 및 결합 특성을 나타냈다.
실시예 7: 푸코실화된 및 어푸코실화된 PI-4026-5 변이체 CDRH3 항체에 의한 ADCC 및 ADCP 시그널링의 세포 결합 및 유도
인간 세포 결합 검정
인간 공여자로부터의 신선한 혈액 (Stanford Blood Centre)을 적혈구 용해시키고 세정하여 PBMC 및 과립구 함량을 풍부하게 하였다. 세포를 도말하고 Fc 수용체를 인간 혈청 (Jackson Immunoresearch), 인간 FcX (Biolegend) 및 펩티드-기반 FcR 차단 용액 (Innovex Biosciences)의 조합으로 차단하였다. 세포를 또한 Zombie NIR (Biolegend)로 염색하여 세포 생존력을 결정했다. Zombie NIR로 염색한 후, 세포를 인간 IgG1 대조군, PI-4170, PI-4026-5 또는 중쇄의 잔기 100에 특정 돌연변이를 함유하는 PI-4026-5 돌연변체의 적정 및 주요 면역 세브세트에 대한 마커를 갖는 유세포분석 칵테일로 염색했다. PI-4026-5 및 PI-4026-5 돌연변이체는 완전히 푸코실화되거나 어푸코실화되었다. 사용된 모든 항체는 직접적으로 접합되었고 데이터는 유세포분석법 (ThermoFisher Attune NxT)에 의해 획득되었다. EC50 값은 Prism 소프트웨어 (Graphpad)에서 계산되었다.
사이노몰구스 세포 결합 검정
신선한 사이노몰구스 원숭이 혈액 (Worldwide Primates Inc)을 적혈구 용해시키고 세정하여 PBMC 및 과립구 함량을 풍부하게 하였다. 세포를 도말하고 Fc 수용체를 인간 혈청 (Jackson Immunoresearch) 및 펩티드-기반 FcR 차단 용액 (Innovex Biosciences)의 조합으로 차단하였다. 세포를 또한 Zombie NIR (Biolegend)로 염색하여 세포 생존력을 결정했다. Zombie NIR 후, 세포를 인간 IgG1 대조군, PI-4170, PI-4026-5 또는 중쇄의 잔기 100에 특정 돌연변이를 함유하는 PI-4026-5 돌연변체의 적정 및 주요 면역 세브세트에 대한 마커를 갖는 유세포분석 칵테일로 염색했다. PI-4026-5 및 PI-4026-5 돌연변이체는 완전히 푸코실화되거나 어푸코실화되었다. 사용된 모든 항체는 직접적으로 접합되었고 데이터는 유세포분석법 (ThermoFisher Attune NxT)에 의해 획득되었다. EC50 값은 Prism 소프트웨어 (Graphpad)에서 계산되었다.
ADCC 및 ADCP 검정
인간 TREM1을 과-발현하는 HEK293 표적 세포를 평평한 바닥 백색 96 웰 플레이트 (ThermoFisher)에서 표시된 농도에서 푸코실화되거나 어푸코실화된 포맷에서 PI-4170, PI-4026-5, PI-4026-5 돌연변이체 또는 hIgG1 이소타입 대조군의 적정과 함께 인큐베이션하였다. 실온에서 15분 인큐베이션 후, NFAT-루시페라제 리포터 Jurkat 세포 (Promega, 위스콘신주 메디슨 소재)를 발현하는 hCD16을 3:1의 비율로 표적 세포/항체 혼합물에 첨가하였다. 리포터 세포의 첨가 후, 검정을 6시간 동안 5% CO2 분위기에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 루시퍼라제 활성의 양은 루시퍼라제 기질 (Promega, 위스콘신주 메디슨 소재)에 노출시켜 결정하고 발광 판독기 (EnVision, Perkin Elmer)에 의해 검출하였다. EC50 값은 Prism 소프트웨어 (Graphpad)에서 계산되었다.
결과
도 9a 및 9b에 도시된 바와 같이 푸코실화된 PI-4026-5 항체 및 어푸코실화된 PI-4026-5 항체는 인간 말초 단핵구에 결합한다. 도 9a는 푸코실화된 항체의 결합을 나타내는 반면, 도 9b는 어푸코실화된 항체의 결합을 나타낸다. 유사하게, 푸코실화된 PI-4026-5 항체 및 어푸코실화된 PI-4026-5 항체는 사이노몰구스 단핵구에 결합한다 (도 10a 및 10b). PI-4026-5-M100L 및 PI-4026-5-M100Q CDRH3 변이체가 사이노몰구스 단핵구에 대한 최상의 결합을 나타내었다.
추가하여, 항체의 어푸코실화는 푸코실화된 항체와 비교하여 hCD16을 통한 증가된 FcγR 시그널링을 초래했다 (도 11a 및 11b). 도 11a는 푸코실화된 항체의 FcγR 시그널링 활성을 나타내는 반면, 도 11b는 어푸코실화된 항체의 FcγR 시그널링 활성을 나타낸다.
실시예 8: PI-4026-5-M100L 및 PI-4026-5-M100Q 항체의 생화학적 특징규명
이전 데이터에 기초하여, 다양한 생화학적 검정을 사용하여 2개의 어푸코실화된 CDRH3 돌연변이체 항체를 추가로 특징규명하였다. 이들은 PI64052로 재명명된, 어푸코실화된 PI-4026-5-M100L 및 PI64062로 재명명된, 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q였다.
인간 및 사이노몰구스 세포에 대한 항체 KD는 이전에 기재된 바와 같이 결정되었다.
응집/안정성 (크기 배제 크로마토그래피/SEC)
어푸코실화된 PI-4026-5 M100L (PI64052) 및 어푸코실화된 PI-4026-5 M100Q (PI64062)는 Superdex 200 Increase 10/300 GL 컬럼 (GE Healthcare) 상에서 ThermoFisher 분석 UHPLC 시스템을 사용하여 다양한 농도 및 시점에서 SEC에 의해 분석되었다. PBS pH 7.4가 이동상 완충액으로 사용되었고 유속은 0.5mL/분이었다. 데이터를 분석하고 A280에서 피크의 AUC를 Chromeleon 7 기기 소프트웨어 (ThermoFisher)를 사용하여 통합했다.
응집/안정성 (동적 광 산란 "DLS")
표시된 농도 및 시점에서 어푸코실화된 PI-4026-5-M100L (PI64052) 및 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q (PI64062)에 대한 데이터는 830nm 레이저가 장착된 온도 제어된 DynaPro 플레이트 리더 (Wyatt)를 사용하여 37℃에서 획득되었다. 자동화된 높은 처리량 데이터 수집을 가능하게 하기 위해 샘플을 384-웰 플레이트 상에 장입했다. 산란광은 169℃에서 모니터링되었다. DYNAMICS 소프트웨어가 유체역학적 직경뿐만 아니라 다분산 지수를 분석하고 계산하는데 사용되었다.
시차 종 및 상대적 소수성 (소수성 상호작용 크로마토그래피/HIC)
어푸코실화된 PI-4026-5-M100L (PI64052) 및 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q (PI64062)를 MAbPac HIC-10, 분석 컬럼, 5μm, 4.6 x 100mm (ThermoFisher) 상의 분석 UHPLC 시스템을 사용하여 HIC에 의해 분석하였다. 0.1M 인산나트륨 pH 6.0, 1M 황산암모늄을 이동상 1로 사용하고 0.1M 인산나트륨 pH 6.0을 이동상 2로 사용하여 1mL/분의 유속으로 구배를 생성했다. 구배에서 용출된 샘플은 A280으로 모니터링했다. Chromeleon 7 기기 소프트웨어 (ThermoFisher) 및 Prism 소프트웨어 (Graphpad)를 사용하여 데이터를 분석하고 피크의 AUC를 통합했다.
열 응력 (동적 광산란 "DLS")
표시된 농도 및 시점에서 어푸코실화된 PI-4026-5-M100L (PI64052) 및 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q (PI64062)에 대한 데이터는 830nm 레이저가 장착된 온도 제어된 DynaPro 플레이트 리더 (Wyatt)를 사용하여 37℃에서 획득되었다. 자동화된 높은 처리량 데이터 수집을 가능하게 하기 위해 샘플을 384-웰 플레이트 상에 장입했다. 산란광은 169℃에서 모니터링되었다. DYNAMICS 소프트웨어가 유체역학적 직경뿐만 아니라 다분산 지수를 분석하고 계산하는데 사용되었다.
열 응력 (시차 주사 형광측정 "DSF")
어푸코실화된 PI-4026-5-M100L (PI64052) 및 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q (PI64062)의 용융 온도는 나노 시차 주사 형광측정법 (DSF)에 의해 결정되었다. 샘플은 20℃에서 100℃까지 1.5℃/분의 램프 속도로 실행되었다. 샘플은 샘플을 안으로 침지함에 의해 nanoDSF 등급 모세관 안으로 장입되었다. 열 스캔 동안 증발을 최소화하기 위해, 모세관의 양쪽 끝을 불활성 오일-기반 액체 고무 밀봉 페이스트로 밀봉했다.
Tm은 트립토판 형광 강도의 변화 또는 350 및 330nm에서 트립토판 방출의 비율로부터 계산되었으며, 이는 온도의 함수로서 단백질의 펼침 동안 형태적 변화를 정확하게 모니터링한다. Tm은 단백질이 50% 펼쳐지는 온도이다.
열 응력 (SEC)
표시된 농도, 온도(37℃) 및 시점에서 어푸코실화된 PI-4026-5-M100L (PI64052) 및 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q (PI64062)에 대한 데이터를 Superdex 200 Increase 10/300 GL 컬럼 (GE Healthcare) 상에서 ThermoFisher 분석 UHPLC 시스템을 사용하여 수집했다. PBS pH 7.4가 이동상 완충액으로 사용되었고 유속은 0.5mL/분이었다. 데이터를 분석하고 A280에서 피크의 AUC를 Chromeleon 7 기기 소프트웨어 (ThermoFisher) 및 Prism 소프트웨어 (Graphpad)를 사용하여 통합했다.
산화적 응력 (HIC)
산화의 분석은 1mg/mL의 최종 항체 농도에서 40℃에서 1시간 동안 표시된 농도의 H2O2에서 어푸코실화된 PI-4026-5-M100L (PI64052) 및 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q (PI64062)를 인큐베이션함에 의하여 달성되었다. 샘플은 MAbPac HIC-10, 분석 컬럼, 5μm, 4.6 x 100mm (ThermoFisher) 상의 ThermoFisher 분석 UHPLC 시스템을 사용하여 표시된 시점에서 HIC에 의해 분석하였다. 0.1M 인산나트륨 pH 6.0, 1M 황산암모늄을 이동상 1로 사용하고 0.1M 인산나트륨 pH 6.0을 이동상 2로 사용하여 1mL/분의 유속으로 구배를 생성했다. 구배에서 용출된 샘플은 A280으로 모니터링했다. Chromeleon 7 기기 소프트웨어 (ThermoFisher) 및 Prism 소프트웨어 (Graphpad)를 사용하여 데이터를 분석하고 피크의 AUC를 통합했다.
산화적 응력 (SEC)
산화의 분석은 1mg/mL의 최종 항체 농도에서 40℃에서 1시간 동안 표시된 농도의 H2O2에서 어푸코실화된 PI-4026-5-M100L (PI64052) 및 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q (PI64062)를 인큐베이션함에 의하여 달성되었다. 샘플은 Superdex 200 Increase 10/300 GL 컬럼 (GE Healthcare) 상에서 ThermoFisher 분석 UHPLC 시스템을 사용하여 표시된 시점에서 SEC에 의해 분석되었다. PBS pH 7.4가 이동상 완충액으로 사용되었고 유속은 0.5mL/분이었다. 데이터를 분석하고 A280에서 피크의 AUC를 Chromeleon 7 기기 소프트웨어 (ThermoFisher)를 사용하여 통합했다.
탈아미드화 위험 (모세관 전기영동-등전압 초점맞추기 "CE-IEF"에 의한 전하 변형 분석)
어푸코실화된 PI-4026-5-M100L (PI64052) 및 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q (PI64062)를 표시된 pH 값과 표시된 온도 (4℃ 또는 40℃)에서 표시된 완충액 (PBS pH 7.4, 트리스 pH 8, 또는 구연산염 pH 4.5)에서 1mg/mL의 최종 항체 농도에서 12시간 동안 인큐베이션했다. 12시간 후, 샘플을 전하 변형 키트 (Perkin Elmer)에 따라 준비하고 샘플을 LabChipII GX 기기 및 LabChip GX 소프트웨어 (Perkin Elmer) 상에서 실행하고 분석했다.
결과
표 8은 인간 및 사이노몰구스 TREM1 단백질에 대한 PI64052 및 PI64062의 결합 특성의 결과를 나타낸다. PI64052는 더 나은 인간 친화력과 단량체 인간 TREM1에 대해 결합을 가졌지만 PI64062는 더 나은 사이노몰구스 친화력을 가졌다.
Figure pct00016
DLS에 의해 결정된 PI64052 및 PI64062 항체의 열적 응력 (37℃)에 반응한 안정성 동역학은 도 12a 및 12b에 도시되어 있다. 도 12a는 시간 경과에 따른 각 항체의 평균 반경 (왼쪽에서 오른쪽으로 막대: 0h, 24h, 48h, 14d, 28d, 및 35d)을 나타내는 반면, 도 12b는 시간 경과에 따른 % 다분산성을 나타낸다 (왼쪽에서 오른쪽으로 막대: 0h, 24h, 48h, 14d, 28d 및 35d). 두 항체 모두 나중 시점에서 증가된 다분산성을 나타내었지만, 산업계에서 인정된 단분산성의 정의보다 훨씬 낮다 (<20% 다분산성). 결과는 하기 표 9에 정량화되어 있다.
Figure pct00017
SEC에 의해 결정된 PI64052 및 PI64062 항체의 안정성 동역학은 도 13a 및 13b에 도시되어 있다. 도 13a는 % 단량체 (왼쪽에서 오른쪽으로 막대: 0h, 24h, 48h, 7d, 14d 및 28d)를 나타내는 반면, 도 13b는 시간 경과에 따른 % 응집 (왼쪽에서 오른쪽으로 막대: 0h, 24h, 48h, 7d, 14d 및 28d)을 나타낸다. 두 항체 모두 시간이 지남에 따라 % 응집에서 매우 최소의 증가를 가졌지만 >98%의 단량체성을 유지했다. 결과는 하기 표 10에 정량화되어 있다.
Figure pct00018
PI64052 및 PI64062 항체의 산화 응력 민감성은 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)에 의해 측정된 바와 같이, 도 14a 및 14b (24h, 왼쪽에서 오른쪽으로 막대 0, 0.3, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001), 도 15a 및 15b (14d, 왼쪽에서 오른쪽으로 막대 0, 0.3, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001), 도 16a 및 16b (28d, 왼쪽에서 오른쪽으로 막대 0, 0.3, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001)에 도시되어 있다. 결과는 또한 하기 표 11, 12 및 13에 정량화되어 있다. H2O2와의 인큐베이션은 H2O2 처리 후 24h 또는 14d에서 어느 하나의 항체의 산화된 종에서도 유의한 증가를 초래하지 않았다. 그러나, H2O2 노출 28d 후, PI64052는 H2O2 농도의 함수로 PI64062보다 더 많은 이종성을 보였다.
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
PI64052 및 PI64062 항체의 탈아미드화 검정의 결과는 도 17a-17d에 도시되어 있다. PI64052 (도 17a 및 17b) 또는 PI64062 (도 17c 및 17d) 어느 것도 CE-IEF 분석에 의해 탈아미드화 위험을 나타내지 않았다. 도 17a 및 17c는 탈아미드화 조건의 함수로서 발생할 수 있는 임의의 단백질 전하 변형을 검출하는 모세관 전기영동 겔이다. 도 17b 및 17d는 검출된 단백질 밴드의 강도로 나타낸 모세관 전기영동 겔로부터의 데이터를 나타낸다.
PI64052 및 PI64062 항체의 생물물리학적 특징규명의 요약이 표 14에 나타나 있다. 각 기준에 대해 하나의 항체의 다른 것보다의 우월성은 (+)에 의해 표시된다. 어느 항체도 다른 항체보다 우월하지 않은 기준은 (-)에 의해 표시된다. 전반적으로, CDR-H3 영역에 M100Q 돌연변이를 함유하는 PI64062는 PI64052보다 더 나은 생물물리학적 특성을 가졌다.
Figure pct00022
실시예 9: PI64052 및 PI64062 항체에 의한 ADCC 및 ADCP 시그널링의 세포 결합 및 유도
다음으로, PI64052 및 PI64062는 ADCC 및 ADCP의 세포 결합 및 유도를 포함한 다양한 기능 검정을 사용하여 특징규명되었다.
배경 결합
대수기 성장에서 HEK293 GFP 대조군 세포를 배양물로부터 수확하고, 세정하고, 1x105 세포/웰로 96 웰 U 바닥 플레이트에 도말하였다. 어푸코실화된 PI-4026-5-M100L (PI64052) 및 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q (PI64062)뿐만 아니라 이소타입 대조군의 적정을 세포에 첨가하고 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 1:500으로 희석된 Alexa 647-접합된 항-인간 Fcγ 2차 항체 (Jackson Immunoresearch)를 사용하여 결합된 일차 항체를 검출하였다. 2차 항체를 얼음 위에서 30분 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포를 세정하고 Zombie NIR (Biolegend)로 염색하여 실온에서 15분 동안 세포 생존율을 결정했다. 결합된 항체로부터의 형광 신호는 유세포분석법 (ThermoFisher Attune NxT)에 의해 평가되었다.
림프구 결합
인간 공여자로부터의 신선한 혈액 (Stanford Blood Centre)을 적혈구 용해시키고 세정하여 PBMC 및 과립구 함량을 풍부하게 하였다. 세포를 도말하고 Fc 수용체를 인간 혈청 (Jackson Immunoresearch), 인간 FcX (Biolegend) 및 펩티드-기반 FcR 차단 용액 (Innovex Biosciences)의 조합으로 차단하였다. 세포를 또한 Zombie NIR (Biolegend)로 염색하여 세포 생존력을 결정했다. Zombie NIR 후, 세포를 인간 IgG1 대조군, 어푸코실화된 PI-4026-5-M100L (PI64052) 또는 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q (PI64062)의 적정 및 주요 면역 세브세트에 대한 마커를 포괄하는 유세포분석 칵테일로 염색했다. 사용된 모든 항체는 직접적으로 접합되었고 데이터는 유세포분석법 (ThermoFisher Attune NxT)에 의해 획득되었다.
hTREM1 과-발현 세포에 대한 결합의 EC50
대수기 성장에서 인간 TREM1을 과-발현하는 HEK293 세포를 배양물로부터 수확하고, 세정하고, 1x105 세포/웰에서 96 웰 U 바닥 플레이트에 도말하였다. 표시된 농도에서 비접합된 hIgG1 대조군, 어푸코실화된 PI-4026-5-M100L (PI64052) 또는 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q (PI64062)의 적정을 세포에 첨가하고 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션했다. 1:500으로 희석된 Alexa 647-접합된 항-인간 Fcγ 2차 항체 (Jackson Immunoresearch)를 사용하여 결합된 일차 항체를 검출하였다. 2차 항체를 얼음 위에서 30분 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포를 세정하고 Zombie NIR (Biolegend)로 염색하여 실온에서 15분 동안 세포 생존율을 결정했다. 결합된 항체로부터의 형광 신호는 유세포분석법 (ThermoFisher Attune NxT)에 의해 평가되었다. EC50 값은 Prism 소프트웨어 (Graphpad)에서 계산되었다.
cynoTREM1 과-발현 세포에 대한 결합의 EC50
대수기 성장에서 사이노몰구스 TREM1을 과-발현하는 HEK293 세포를 배양물로부터 수확하고, 세정하고, 1x105 세포/웰에서 96 웰 U 바닥 플레이트에 도말하였다. 표시된 농도에서 비접합 hIgG1 대조군, 어푸코실화된 PI-4026-5-M100L (PI64052) 또는 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q (PI64062)의 적정을 세포에 첨가하고 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션했다. 1:500으로 희석된 Alexa 647-접합된 항-인간 Fcγ 2차 항체 (Jackson Immunoresearch)를 사용하여 결합된 일차 항체를 검출하였다. 2차 항체를 얼음 위에서 30분 동안 세포와 함께 인큐베이션하였다. 그런 다음 세포를 세정하고 Zombie NIR (Biolegend)로 염색하여 실온에서 15분 동안 세포 생존율을 결정했다. 결합된 항체로부터의 형광 신호는 유세포분석법 (ThermoFisher Attune NxT)에 의해 평가되었다. EC50 값은 Prism 소프트웨어 (Graphpad)에서 계산되었다.
인간 단핵구에 대한 결합의 EC50
인간 공여자로부터의 신선한 혈액 (Stanford Blood Centre)을 적혈구 용해시키고 세정하여 PBMC 및 과립구 함량을 풍부하게 하였다. 세포를 도말하고 Fc 수용체를 인간 혈청 (Jackson Immunoresearch), 인간 FcX (Biolegend) 및 펩티드-기반 FcR 차단 용액 (Innovex Biosciences)의 조합으로 차단하였다. 세포를 또한 Zombie NIR (Biolegend)로 염색하여 세포 생존력을 결정했다. Zombie NIR 후, 세포를 인간 IgG1 대조군, 어푸코실화된 PI-4026-5-M100L (PI64052) 또는 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q (PI64062)의 적정 및 주요 면역 세브세트에 대한 마커를 포괄하는 유세포분석 칵테일로 염색했다. 사용된 모든 항체는 직접적으로 접합되었고 데이터는 유세포분석법 (ThermoFisher Attune NxT)에 의해 획득되었다. EC50 값은 Prism 소프트웨어 (Graphpad)에서 계산되었다.
사이노몰구스 단핵구에 대한 결합의 EC50
신선한 사이노몰구스 원숭이 혈액 (Worldwide Primates Inc)을 적혈구 용해시키고 세정하여 PBMC 및 과립구 함량을 풍부하게 하였다. 세포를 도말하고 Fc 수용체를 인간 혈청 (Jackson Immunoresearch) 및 펩티드-기반 FcR 차단 용액 (Innovex Biosciences)의 조합으로 차단하였다. 세포를 또한 Zombie NIR (Biolegend)로 염색하여 세포 생존력을 결정했다. Zombie NIR 후, 세포를 인간 IgG1 대조군, 어푸코실화된 PI-4026-5-M100L (PI64052) 또는 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q (PI64062)의 적정 및 주요 면역 세브세트에 대한 마커를 포괄하는 유세포분석 칵테일로 염색했다. 사용된 모든 항체는 직접적으로 접합되었고 데이터는 유세포분석법 (ThermoFisher Attune NxT)에 의해 획득되었다. EC50 값은 Prism 소프트웨어 (Graphpad)에서 계산되었다.
hCD16 ADCC 리포터 검정
인간 TREM1을 과-발현하는 HEK293 표적 세포를 평평한 바닥 백색 96 웰 플레이트 (ThermoFisher)에서 표시된 농도에서 어푸코실화된 PI-4026-5-M100L (PI64052), 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q (PI64062), 또는 hIgG1 이소타입 대조군의 적정과 함께 인큐베이션하였다. 실온에서 15분 인큐베이션 후, NFAT-루시페라제 리포터 Jurkat 세포 (Promega, 위스콘신주 메디슨 소재)를 발현하는 hCD16을 3:1의 비율로 표적 세포/항체 혼합물에 첨가하였다. 리포터 세포의 첨가 후, 검정을 6시간 동안 5% CO2 분위기에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 루시퍼라제 활성의 양은 루시퍼라제 기질 (Promega, 위스콘신주 메디슨 소재)에 노출시켜 결정하고 발광 판독기 (EnVision, Perkin Elmer)에 의해 검출하였다. EC50 값은 Prism 소프트웨어 (Graphpad)에서 계산되었다.
일차 대식세포 ADCP 검정
인간 TREM1을 과-발현하는 GFP-양성 expi293 세포를 실온에서 15-30분 동안 비접합된 hIgG1 대조군, 어푸코실화된 PI-4026-5-M100L (PI64052), 또는 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q (PI64062)의 적정과 함께 인큐베이션하였다. 세정 없이, Cell Trace Violet (ThermoFisher)으로 표지된 2 공여자로부터의 CD14+ 단핵구로부터 분극화된 인간 대식세포를 그 다음 expi293 및 항체 혼합물에 1:1의 비율로 첨가했다. 검정은 5% CO2 분위기에서 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션된 후 검정은 유세포분석법 (ThermoFisher Attune NxT)에 의해 평가되었다. ADCP는 단일 세포 상에 게이팅된 GFP 양성 및 Cell Trace Violet 양성 대식세포의 수를 열거함에 의해 측정되었다. EC50 값은 Prism 소프트웨어 (Graphpad)에서 계산되었다.
FcγR 결합
1ug/ml의 표시된 재조합 인간 His-태그된 FcγR 단백질 (Sino Biologicals)을 4℃에서 밤새 MaxiSorp 플레이트 상에 도포하였다. 다음날, 플레이트를 세정하고, 표시된 농도에서 푸코실화된 또는 어푸코실화된 PI-4026-5-M100L 및 PI-4026-5 M100Q, 또는 hIgG4 이소타입 대조군 (Biolegend)의 적정을 코팅된 플레이트에 첨가하였다. 코팅된 FcγR 단백질에 대한 항체의 Fc-매개된 결합은 인간 IgG의 Fab'2 부분에 대한 HRP-접합된 Fab'2 단편 (Jackson Immunoresearch)으로 검출되었다. TMB 기질 (ThermoFisher)을 사용하여 일차 항체에 결합된 HRP-접합된 2차 시약의 양을 정량화하고 H3PO4를 사용하여 반응을 중지시켰다. Spectramax 플레이트 리더 (Life Technologies)를 사용하여 450nm에서의 흡광도를 측정했다.
결과
HEK293 모 세포 결합에 대한 개별 실험의 반복을 도 18a, 18b 및 18c에 나타내었다. 이소타입 대조군에 비해 HEK293 세포에 대한 PI64052 및 PI64062의 검출 가능한 결합은 없었다.
도 19a-f에 도시된 바와 같이, 이소타입 대조군에 비해 인간 림프구 (T 세포 또는 B 세포)에 대한 PI64052 및 PI64062의 검출 가능한 결합이 없었다. 각 검정은 세 번 반복되었고 각 그래프는 개별 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 도 19a, 19b, 및 19c는 T 세포에 게이팅된 개별 실험을 나타내는 반면, 도 19d, 19e 및 19f는 B 세포에 게이팅된 개별 실험을 나타낸다.
인간 TREM1을 과발현하는 세포에 대한 2개의 어푸코실화된 항체의 EC50에도 차이가 없었다 (도 20a, 20b 및 20c). 실험은 세 번 반복되었고 각 그래프는 각 개별 실험의 결과를 나타낸다. 데이터는 하기 표 15에 정량화되어 있다.
Figure pct00023
PI64062는 사이노몰구스 TREM1을 과발현하는 세포에 대해 일관되게 더 나은 결합을 나타내었다 (도 21a, 21b 및 21c). 실험은 세 번 반복되었고 각 그래프는 각 개별 실험의 결과를 나타낸다. 데이터는 하기 표 16에 정량화되어 있다.
Figure pct00024
인간 단핵구에 대한 2개의 어푸코실화된 항체의 EC50에는 차이가 없었다 (도 22a, 22b 및 22c). 실험은 세 번 반복되었고 각 그래프는 각 개별 실험의 결과를 나타낸다. 데이터는 하기 표 17에 정량화되어 있다.
Figure pct00025
사이노몰구스 단핵구에 대한 2개의 어푸코실화된 항체의 EC50에는 차이가 없었다 (도 23a 및 23b). 검정은 두 번 반복되었고 각 그래프는 각 개별 실험의 결과를 나타낸다. 데이터는 하기 표 18에 정량화되어 있다.
Figure pct00026
도 24에 도시된 바와 같이, hCD16 리포터 검정 시스템에서 PI64052 및 PI64062에 의해 매개되는 FcγR 시그널링에는 유의한 차이가 없었다. 검정은 세 번 반복되었고 각 그래프는 각 개별 실험의 결과를 나타낸다. 데이터는 하기 표 19에 정량화되어 있다. 도 24는 세 번째 실험이고 세 개의 개별 실험을 대표한다.
Figure pct00027
도 25a, 25b, 25c 및 25d에 도시된 바와 같이, 일차 인간 대식세포에 의해 hTREM1 발현 세포의 ADCP를 유도하는 PI64052 및 PI64062의 능력에는 유의한 차이가 없었다. 검정은 두 공여자를 사용하여 수행되었다. 도 25a 및 25b는 공여자 1로부터의 결과를 나타내는 반면, 도 25c 및 25d는 공여자 2로부터의 결과를 나타낸다. 데이터는 하기 표 20에 정량화되어 있다.
Figure pct00028
도 26a-f에 도시된 바와 같이, PI64052와 PI64062 사이의 FcγR 결합에는 유의한 차이가 없었다. PI64052 및 PI64062는 각각 그것의 푸코실화된 대응물인, PI-4026-5-M100L 및 PI-4026-5-M100Q에 비해 FcγRIIIa(V), FcγRIIIa(F) 및 FcγRIIIb와 같은 특정 FcγR에 대한 향상된 결합을 보여주었다. 도 26a는 FcγRI에 대한 결합을 나타내고, 도 26b는 FcγRIIa에 대한 결합을 나타내고, 도 26c는 FcγRIIb에 대한 결합을 나타내고, 도 26d는 FcγRIIIa(CD16a-V)에 대한 결합을 나타내고, 도 26e는 FcγRIIIa(CD16a-F)에 대한 결합을 나타내고, 도 26f는 FcγRIIIb에 대한 결합을 나타낸다.
PI64052 및 PI64062 항체의 결합 및 기능적 특징규명의 요약은 표 21에 도시되어 있다. 각 기준에 대해 하나의 항체의 다른 것에 대한 우월성은 (+)에 의해 표시된다. 어느 항체도 다른 항체보다 우월하지 않은 기준은 (-)에 의해 표시된다. 전반적으로, CDRH3 영역에 M100Q 돌연변이를 함유하는 PI64062는 사이노몰구스 TREM1에 대한 PI64052보다 더 나은 결합 특성을 갖는 반면, 다른 특성은 실질적으로 다르지 않았다.
Figure pct00029
실시예 10: PI-4026-5-M100Q 및 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q (PI64062) 항체에 의한 수용체 점유 및 사이토카인 방출
수용체 점유
전혈은 다수의 인간 공여자로부터 공급되었고 (Stanford Blood Centre) 적혈구는 제거되었다. 나머지 백혈구를 96 웰 플레이트에 웰당 5x106 세포로 도말하였다. 일단 도말되면, 세포를 비접합된 hIgG1 아이소타입, 어푸코실화된 hIgG1 아이소타입, PI-4026-5-M100Q, 또는 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q (PI64062)와 함께 적정 의존적 방식으로 24시간 동안 인큐베이션하였다.
24시간 후, 세포를 PBS에서 1회 세정하고 Zombie NIR (Biolegend)로 염색하여 세포 생존율을 결정하였다. Fc 수용체 (FcγR)는 또한 인간 혈청 (Jackson Immunoresearch), 인간 FcX (Biolegend) 및 펩티드-기반 FcγR 차단 용액 (Innovex Biosciences)의 조합으로 차단되었다. FcγR 차단 시약으로 인큐베이션한 후, 관심 있는 표면 수용체를 주요 종양내 면역 서브세트뿐만 아니라 mIgG1 이소타입 또는 마우스 항-인간 TREM1 항체 (클론 TREM26, Biolegend)에 대한 마커를 포괄하는 유세포분석 칵테일로 염색했다. 유세포분석에 의한 표현형분석에 사용된 모든 항체는 직접적으로 접합되었다. Attune NxT 분석기 (ThermoFisher)를 사용하여 데이터를 획득하고 FlowJo (BD Biosciences), Prism (Graphpad) 및 Excel (Microsoft)을 사용하여 분석했다.
수용체 점유는 비접합된 항체의 농도의 함수로서 관련 세포 서브세트 (단핵구 및 호중구)에 대한 접합된 TREM1 항체의 결합으로부터 특이적 신호의 손실을 평가함에 의해 결정되었다.
IC50 값은 Prism (Graphpad)에 플롯팅된 적정 곡선을 기반으로 계산되었고 나노몰의 농도로 정규화되었다.
시험관내 사이토카인 및 케모카인 검출
전혈은 다수의 인간 공여자로부터 공급되었고 (Stanford Blood Centre) 적혈구는 제거되었다. 나머지 백혈구를 96 웰 플레이트에 웰당 5x106 세포로 도말하였다. 일단 도말되면, 세포를 비접합된 hIgG1 아이소타입, 어푸코실화된 hIgG1 아이소타입, PI-4026-5-M100Q, 또는 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q (PI64062)와 함께 적정 의존적 방식으로 24시간 동안 인큐베이션하였다.
24시간 후, 상청액을 수확하고, 인간 향염증 및 케모카인 키트 (패널 1, Meso Scale Diagnostics)를 사용하여 각 조건에서 표시된 사이토카인 및 케모카인의 수준을 평가하였다. 중간 규모 진단 기술을 사용하여 데이터를 수집하고 Excel (Microsoft) 및 Prism (Graphpad)에서 분석했다.
EC50 값은 Prism (Graphpad)에 플롯팅된 적정 곡선을 기반으로 계산되었고 나노몰의 농도로 정규화되었다.
결과
PI-4026-5-M100Q 및 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q (PI64062)는 단핵구(도 27a) 또는 호중구 (도 27b)에서 실질적으로 상이한 용량 의존적 수용체 점유 (RO)를 나타내지 않았다.
표 22는 PI-4026-5-M100Q 및 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q에 대한 단핵구 상 RO IC50의 정량화를 제공한다.
Figure pct00030
표 23은 PI-4026-5-M100Q 및 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q에 대한 호중구 상 RO IC50의 정량화를 제공한다.
Figure pct00031
PI-4026-5-M100Q 및 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q (PI64062)는 또한 인간 백혈구로부터 용량-의존성 사이토카인 시그니쳐를 유도했다. IFN-γ 유도는 도 28a에 도시되고, IL-8 유도는 도 28b에 도시되고, IL-2 유도는 도 28c에 도시되고, IP-10 유도는 도 28d에 도시되어 있다. IL-6, TNFα 및 IL-1β을 포함한 기타 사이토카인은 <10 pg/ml에서 검출되었다. 각 사이토카인 반응의 EC50은 표 24에 나타나 있다.
Figure pct00032
실시예 11: 생체내 항-TREM1 및 항-PD-1 조합 요법 사이토카인 프로필
생체내 사이토카인 검출
Py8119 유방 암종 계통 (ATCC, 버지니아주 머내서스 소재)을 대수기에서 수확하고 동일한 부피의 마트리겔과 혼합된 2x106 세포/마우스의 용량으로 암컷 C57BL/6 마우스 (Jackson Laboratories)의 오른쪽 복부 옆구리 안으로 피하로 주사하였다. 대부분의 마우스에서 종양이 70-130㎣에 도달한 후, 마우스를 무작위화하고 표시된 항체로의 투여를 시작하였다. 항체는 항-TREM1 및 mIgG2a 이소타입에 대해 15mg/kg으로, 그리고 항-PD-1 및 mIgG1 이소타입에 대해 5mg/kg으로 2회 투여 동안 5일 간격의 빈도로 복강내로 투여하였다. 항-TREM1 및 mIgG2a 이소타입은 둘 모두 어푸코실화되었고 사용된 항-TREM1 항체는 PI-4928이었다.
항체의 2차 투여 48시간 후, 마우스로부터의 혈액을 수확하고 혈청 분석을 위해 분획화하였다. IFN-γ 및 TNFα 혈청 사이토카인은 중간 규모 진단 기술 (마우스 향염증성 패널 1)를 사용하여 각 군으로부터 평가되었다. 중간 규모 진단 기술을 사용하여 데이터를 수집하고 Excel (Microsoft) 및 Prism (Graphpad)에서 분석했다. 사용된 통계 테스트는 Tukey의 다중 비교 보정이 있는 통상적인 일원 ANOVA였다.
PI-4928은 본 명세서에 참고로 포함된, PCT/US2018/045680에 이미 기재되어 있고, 호중구 상 마우스 TREM1 (예를 들어, 실시예 10 참고) 및 마우스 TREM1을 과발현하는 세포 (예를 들어, 실시예 11 참고)에 결합하는 것으로 나타났다. 어푸코실화된 PI-4928은 또한 FcγR에 결합하고 FcγR-매개된 시그널링 및 ADCC를 유도하였다 (예를 들어, 실시예 11 참고). 부가하여, 항-PD-1과 조합하여 어푸코실화된 PI-4928의 치료적 효능이 또한 Py8119 마우스 모델에서 평가되었다. 조합 요법은 대조군과 비교하여 감소된 종양 부피 크기를 초래하였으며 (예를 들어, 실시예 15 참고), 이는 ADCC-기반 TREM1+ 세포의 고갈이 항종양 활성을 유발할 수 있음을 나타낸다.
이 실시예에서, PI-4928은 마우스 TREM1에 결합하고, 이는 또한 mFcγRIV를 과-발현하는 Jurkat 리포터 세포에서 FcγR 시그널링을 유도하고, 생체내에서 항-암 치료 효과를 제공하는 것으로 나타났기 때문에, 상기에 기술된 항체에 대한 생체내 대용물로 사용되었다.
결과
항-TREM1 항체 (어푸코실화된-PI-4928) 및 PD-1의 조합은 생체내에서 IFN-γ (도 29a) 및 TNFα (도 29b) 사이토카인 반응 둘 모두를 유도하였다. **는 p<0.01을 나타내고, ****는 p<0.0001을 나타낸다.
실시예 12: 생체내 항-TREM1 및 항-PD-1 조합 요법 효능
Panc02 효능 연구
Panc02 췌관 선암종 세포주 (NCI 세포 저장소)를 대수기에서 수확하고 암컷 C57BL/6 마우스 (Charles River Laboratories)의 오른쪽 옆구리 안으로 2x106 세포/마우스의 용량으로 피하로 주사하였다. 대부분의 마우스에서 종양이 80-100㎣에 도달한 후, 마우스를 무작위화하고 표시된 항체로 투여를 개시하였다. 항체는 항-TREM1 및 mIgG2a 이소타입에 대해 15mg/kg으로, 항-PD-1 및 mIgG1 이소타입에 대해 10mg/kg으로 4회 투여 동안 3일 또는 5일 간격의 빈도로 복강내로 투여하였다. 항-TREM1 및 mIgG2a 이소타입은 둘 모두 푸코실화되었고 사용된 항-TREM1 항체는 PI-9067L이었다. 종양 크기는 식 V(㎣) = (L x W x W) ÷ 2를 사용하여 평가했으며, 여기서 V=부피, L=길이, W=너비이다. 종양은 캘리퍼스를 사용하여 측정하고 종양 부피가 2000㎣에 도달했을 때 마우스를 안락사시켰다.
종양 성장은 시간 경과에 따른 군당 평균, 시간 경과에 따른 군당 개별 마우스 및 28일차에서 군당 종양 부피로 플롯팅되었다. 사용된 통계 테스트는 Holm-Sidak 다중 비교 보정이 있는 통상적인 일원 ANOVA였다.
PI-9067L은 본 명세서에 참고로 포함된, PCT/US2018/045680에 이미 기재되어 있고, 호중구 상 마우스 TREM1 (예를 들어, 실시예 10 참고) 및 마우스 TREM1을 과발현하는 세포 (예를 들어, 실시예 11 참고)에 결합하는 것으로 나타났다. 어푸코실화된 PI-9067L은 또한 FcγR에 결합하고 FcγR-매개된 시그널링 및 ADCC를 유도하였다 (예를 들어, 실시예 11 참고). 부가하여, MC38 및 CT26 마우스 모델에서 푸코실화된 및 어푸코실화 PI-9067L 단독 또는 항-PD-1과 조합한 치료적 효능이 또한 평가되었다. PI-9067L을 사용한 단일- 또는 조합 요법은 각각 MC38 및 CT26 모델에서 대조군과 비교하여 감소된 종양 부피 크기를 초래하였으며 (예를 들어, 실시예 13 및 14 참고), 이는 ADCC-기반 TREM1+ 세포의 고갈이 항종양 활성을 유발할 수 있음을 나타낸다.
이 실시예에서, PI-9067L은 마우스 TREM1에 결합하고, 이는 또한 mFcγRIV를 과-발현하는 Jurkat 리포터 세포에서 FcγR 시그널링을 유도하고, 생체내에서 항-암 치료 효과를 제공하는 것으로 나타났기 때문에, 상기에 기술된 항체에 대한 생체내 대용물로 사용되었다.
결과
부가하여, 항-TREM1 항체 요법은 Panc02 종양 모델에서 단일치료 활성을 갖는다. 어푸코실화된 PI-9067L 항-TREM1 항체 단독의 투여는 생체내 뿐만 아니라 항-PD1 항체와의 조합에서 종양 부피에서의 감소를 초래하였다 (도 30). 개별 처리 군은 도 31a-d에 도시되어 있다. 이소타입 처리는 도 31a에 도시되어 있고, 항-PD-1 단독 처리는 도 31b에 도시되어 있고, 항-TREM1 처리는 도 31c에 도시되어 있고, 조합 항-TREM1 및 항-PD-1 처리는 도 31d에 도시되어 있다. 28일차에서 각각의 처리 군에서 마우스 종양 부피의 정량화는 도 32에 제공되어 있다.
실시예 13: TREM1은 상이한 종양학 징후에 걸쳐 발현된다
재료 및 방법
유세포분석
TREM1 발현은 유세포분석에 의해 다양한 징후로부터 인간 종양의 미세환경에서 평가되었다. 얻은 종양 조직은 신선하게 외과적으로 절제되었거나 (Cooperative Human Tissue Network, CHTN) 이전에 분리되어 급속 동결되었다 (Folio Conversant). 신선한 외과적으로 절제된 종양은 환자로부터 절제된 후 24시간 이내에 분리되었다 (Human Tumor Dissociation Kit, Miltenyi Biotec).
종양이 분리되고 적혈구가 제거되면 단일 세포 현탁액을 PBS (Gibco)에 희석하고 한 번 세정하고 Zombie NIR (Biolegend)로 염색하여 세포 생존력을 결정했다. Fc 수용체는 또한 인간 혈청 (Jackson Immunoresearch), 인간 FcX (Biolegend) 및 펩티드-기반 FcR 차단 용액 (Innovex Biosciences)의 조합으로 차단되었다. FcR 차단 시약으로 인큐베이션한 후, 세포 상의 표면 수용체는 주요 종양내 면역 서브세트뿐만 아니라 mIgG1 이소타입 또는 마우스 항-인간 TREM1 항체 (클론 TREM26, Biolegend)에 대한 마커를 포괄하는 유세포분석 칵테일로 염색했다. 일부 경우에, 세포내 CD68 발현을 결정하기 위해 세포는 또한 고정되고 투과화되었다 (True-Nuclear Transcription Buffer Set, Biolegend). 표현형분석에 사용된 모든 항체는 직접적으로 접합되었다. 데이터는 Attune NxT 분석기 (ThermoFisher)를 사용하여 획득되었고 FlowJo (BD Biosciences), Prism (Graphpad), Excel (Microsoft) 및 R 컴퓨팅 환경을 사용하여 분석되었다.
LUNG = 폐 선암종, OV = 난소 암종, KID = 신세포 암종, PRAD = 전립선 선암종, PAAD = 췌장 선암종, BLAD = 방광 선암종, CRC = 결장직장 선암종, BREAST = 유방 암종, STAD = 위 선암종, SKCM = 피부 흑색종, HNSC = 두경부 암종, TAM = 종양-연관 대식세포, Conv. 단핵구 = 통상적 단핵구.
RNA 제자리 혼성화
RNAscope 실험은 고급 세포 진단 (ACD)에서 수행되었다. 고급 세포 진단 (ACD)는 방광암, 전립선암, 흑색종, 두경부암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 폐암, 난소암, 유방암으로부터의 조직을 함유하는 독점 TMA의 세트에서 TREM1에 대한 RNAscope® 검출을 수행했다. 샘플 품질은 PPIB (하우스키핑 유전자)에 대한 양성 대조군 프로브와 박테리아 유전자 dapB에 대한 음성 대조군 프로브로 섹션을 염색함에 의해 평가되었다. 염색 조건은 양성 대조군 신호를 최대화하고 음성 대조군 신호를 최소화하기 위해 각 프로브에 대해 최적화되었다. TREM1 프로브 서열은 ACD에 의해 선택되어 게놈의 표적 영역을 벗어나는 최소한의 교차-혼성화를 갖는다. TREM1, TREM2, CD163, CD8A 및 NCAM1 mRNA에 대한 RNA 제자리 혼성화는 제조자의 지침에 따라 RNAscope®LS Duplex Reagent Kit (Advanced Cell Diagnostics, Inc., 캘리포니아주 뉴어크 소재)를 사용하여 자동화 플랫폼에서 수행되었다. 5μm 포르말린 고정, 파라핀 포매된 (FFPE) 조직 절편은 표적 올리고 프로브와의 혼성화 이전에 열 및 프로테아제로 전처리되었다. 그런 다음 전증폭기, 증폭기 및 HRP/AP-표지된 올리고가 순차적으로 혼성화되고, 발색성 침전물 전개가 이어졌다. 각 샘플은 PPIB/POLR2A RNA에 특이적인 RNAscope® 프로브로 RNA 완전성에 대해, 그리고 박테리아 dapBRNA에 대해 특이적인 프로브로 배경에 대해 품질 관리되었다. 특정 RNA 염색 신호는 녹색/빨간색의 반점으로 식별되었다. 샘플은 Gill의 헤마톡실린으로 대조염색되었다. 인간 TREM1 (24-1063nt에 대한 cat#431508), 인간 TREM2 (5-1069nt에 대한 cat#420498), 인간 CD163 (210-1565nt에 대한 cat#417068-C2), 인간 NCAM-1 (832-1751nt에 대한 cat# 421468) 및 인간 CD8a (871-2342nt에 대한 cat#560398)에 대한 RNA 프로브가 사용되었다. 각 프로브에 대한 반-정량적 점수 (0-4)는 절편 전반에 걸쳐 세포당 염색된 점의 수를 기반으로 ACD 학자에 의해 모든 샘플에 대해 정의되었다. 점수화 기준은 다음과 같았다: 점수 0: 염색 없음 또는 <1개 점/10 세포; 점수 1: 1-3개 점/세포; 점수 2: 4-9개 점/세포 및 점 클러스터가 없거나 매우 적음; 점수 3: 10-15개 점/세포 및/또는 <10% 점이 클러스터에 있음; 점수 4: >15개 점/세포 및/또는 >10% 점이 클러스터에 있음. 품질 관리를 통과하기 위해, 2-4개 (보통에서 높음) 양성 대조군 신호 및 0개 (검출되지 않음) 음성 대조군 신호가 있는 샘플이 TREM1 정량화를 위해 선택되었다. TREM1 양성 징후는 품질 관리를 통과하고 1 이상의 TREM1 점수를 갖는 것으로 정의되었다.
단일 세포 TREM1 발현
단일 인간 난소 환자로부터의 분리된 종양 세포 (DTC)는 Discovery Life Sciences에서 구입했다. 세포는 면역 세포를 풍부하게 하기 위해 CD45 양성에 대해 유동 세포측정법으로 분류되었고 10X Genomics의 크롬 조절기를 사용하여 단일 세포 RNA 서열화를 위해 캡슐화되었다. 결과적인 원시 데이터는 10X's CellRanger 프로그램과 R 프로그래밍 언어의 Seurat 모듈을 사용하여 순차적으로 처리되었다. 결과적인 t-분산 확률적 네이버 임베딩 (tSNE) 차원 감소에서 세포 모집단은 세포-유형 특이적 마커 유전자를 사용하여 수동으로 주석을 달고 TREM1 발현을 플롯팅했다.
단일 인간 폐 선암종 환자로부터의 단일 세포 서열화 데이터는 NCBI의 유전자 발현 옴니버스 (기탁번호: GSE97168)로부터 다운로드했다. 원시 데이터는 R 프로그래밍 언어의 Seurat 모듈을 사용하여 처리되었다. 결과적인 t-분산 확률적 네이버 임베딩 (tSNE) 차원 감소에서 세포 모집단은 세포-유형 특이적 마커 유전자를 사용하여 수동으로 주석을 달고 TREM1 발현을 플롯팅했다.
결과
TREM1 발현은 폐 선암종, 난소 암종, 신세포 암종, 전립선 선암종, 방광 선암종, 결장직장 선암종, 유방암, 및 위 선암종을 포함한, 다양한 암 징후의 종양 미세환경에서 골수 세포 상에서 배타적으로 발견되었다 (도 33). TREM1 발현은 호중구, TAM 및/또는 통상적인 단핵구 상에 일관되게 발현되었고 CD3+ 세포 상에서 음성이었다.
표 25는 또한 분석된 총 종양의 백분율로서 TREM1+ 종양의 정량화를 제공한다. TREM1은 다수의 종양 유형에 걸쳐 분석된 대부분의 종양에서 발현되었다.
Figure pct00033
유사한 결과가 표 26에 나타낸 RNA 제자리 혼성화 분석에서 관찰되었다. 대부분의 경우, TREM1은 분석된 종양 (예를 들어, CRC, OV, LU, HNSC, SKCM, PAAD 및 PRAD 종양)의 70% 초과에서 발현되었다. TREM1은 또한 분석된 신장, 방광 및 유방 종양의 약 40%에서 발현되었다. 따라서, TREM1은 다수의 종양 유형에서 발현된다.
Figure pct00034
인간 난소 종양 분리된 세포로부터 분류된 CD45+ 면역 침윤물로부터의 단일 세포 서열화 결과에 대한 추가 분석은 TREM1이 면역-억제성인 미성숙 단핵구 골수 세포인, 단핵구 골수-유래된 억제 세포 (mMDSC) 상에 현저하게 발현되는 것을 나타냈다 (데이터 미도시). 대조적으로, TREM2는 종양 연관 대식세포 (TAM) 상에 현저하게 발현된다. 폐 선암종 환자로부터의 단일 세포 서열화 결과 분석은 또한 TREM1이 인간 억제성 골수 모집단에서 발현된다는 것을 나타냈다 (데이터 미도시).
실시예 14: 항-TREM1 항체는 항-암 케모카인 및 세포 표면 수용체의 선택적 세트를 유도한다
재료 및 방법
샘플 준비
전혈은 다수의 인간 공여자로부터 공급되었고 (Stanford Blood Centre) 적혈구는 제거되었다. 나머지 백혈구는 96 웰 플레이트에 웰당 5x106 세포로 도말되었다. 일단 도말되면, 세포를 적정 의존적 방식으로 24시간 동안 어푸코실화된 hIgG1 이소타입 또는 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q (PI64062)로 인큐베이션하였다. 추가의 세포를 CD80 및 CD86 세포 표면 발현을 위해 24시간 동안 단일 농도의 어푸코실화된 hIgG1 이소타입 또는 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q (PI64062)로 처리했다. 24시간 후, 상층액을 수확하였다.
시험관내 사이토카인 및 케모카인 검출
사이토카인 및 케모카인 측정을 위해, 샘플을 인간 향염증 및 케모카인 키트 (패널 1, 중간 규모 진단)를 사용하여 각 조건에서 평가하였다. 데이터는 중간 규모 진단 기술을 사용하여 획득하고 Excel (Microsoft) 및 Prism (Graphpad)에서 분석했다. EC50 값은 Prism (Graphpad)에 플롯팅된 적정 곡선을 기반으로 계산되었고 나노몰의 농도로 정규화되었다.
CD40, HLA-DR, CD80 및 CD86 유세포분석
24시간 후, 세포를 PBS에서 1회 세정하고 Zombie NIR (Biolegend)로 염색하여 세포 생존율을 결정하였다. Fcγ 수용체 (FcγR)는 또한 인간 혈청 (Jackson Immunoresearch), 인간 FcX (Biolegend) 및 펩티드-기반 FcγR 차단 용액 (Innovex Biosciences)의 조합으로 차단되었다. FcγR 차단 시약으로 인큐베이션한 후, 관심 있는 표면 수용체를 종양내 서브세트뿐만 아니라 HLA-DR (클론 L243), CD40 (클론 5C3), CD80 (클론 2D10, Biolegend cat# 306216), 및 CD86 (클론 BU63, Biolegend cat# 374212)에 대한 마커를 포괄하는 유세포분석 칵테일로 염색했다. 유세포분석에 의한 표현형분석에 사용된 모든 항체는 직접적으로 접합되었다. 데이터를 Attune NxT 분석기 (ThermoFisher)를 사용하여 획득하고 FlowJo (BD Biosciences), Prism (Graphpad) 및 Excel (Microsoft)을 사용하여 분석했다. CD14+ 단핵구 상의 세포 표면 HLA-DR, CD40, CD80 및 CD86에 대한 대표적인 히스토그램 오버레이가 도시되어 있다.
세포 분류를 위한 RNAseq
5명의 건강한 인간 공여자로부터의 전 헤파린화된 혈액을 각각 1mg/ml (~7nM)의 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q (PI64062) 또는 이소타입 대조군 항체로 37℃에서 5% CO2에서 16시간 동안 처리했다. 인큐베이션 기간 후, 혈액을 이전하고 모든 후속 단계를 얼음 위에서 수행했다. 혈액은 RBC-용해되었고 백혈구는 그 다음 계통-특이적 마커에 대한 항체로 염색되었다. 항-CD15 (클론 W6D3, Biolegend)는 호중구를 확인하는데 사용되었고, 항-CD14 (클론 M5E2, Biolegend)는 단핵구를 확인하는데 사용되었고, 항-CD3 (클론 UCHT1, Biolegend)은 T 세포를 확인하는데 사용되었고, 항-CD56 (클론 5.1H11, Biolegend)은 NK 세포를 확인하는데 사용되었다. 유세포분석 분류를 위해 염색된 세포를 제출하여 CD15+ 호중구, CD14+ 단핵구, CD3+ T 세포 및 CD56+ NK 세포의 순수한 모집단을 산출했다. 총 RNA는 각 세포의 서브세트-특이적 샘플로부터 단리되었고 고-처리량 RNA 서열화를 위해 제출되었다. 후속 데이터는 인간 게놈 (GRCh38.p12)에 맞춰 정렬되었고 유전자-당 발현 값은 각 샘플에 대해 표로 작성되었다. 결과적인 발현 매트릭스는 R 패키지 DESeq2를 사용하여 로그-정규화되었고 모든 샘플에 걸쳐서 가장 높은 분산을 갖는 1000개 유전자는 유클리드 거리 및 완전한 연결을 사용하여 클러스터링되었다. 초기 세포 분류의 순도는 세포-유형의 깨끗한 분리뿐만 아니라 공여자-특이적 분리에 의해 표시된다. 각 세포 유형에 대한 정규의 마커는 오른쪽에 표시된다.
면역 활성화 마커 HLA-DR, CD40, CD80 및 CD86에 대한 RNAseq
5명의 건강한 인간 공여자로부터의 전 헤파린화된 혈액을 각각 1mg/ml (~7nM)의 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q (PI64062) 또는 이소타입 대조군 항체로 37℃에서 5% CO2에서 16시간 동안 처리했다. 인큐베이션 기간 후, 혈액을 이전하고 모든 후속 단계를 얼음 위에서 수행했다. 혈액은 RBC-용해되었고 백혈구는 그 다음 계통-특이적 마커에 대한 항체로 염색되었고, 유세포측정 분류를 위해 제출되어 CD15+ 호중구, CD14+ 단핵구, CD3+ T 세포 및 CD56+ NK 세포의 순수한 모집단을 산출했다. 총 RNA는 각 세포의 서브세트-특이적 샘플로부터 단리되었고 고-처리량 RNA 서열화를 위해 제출되었다. 후속 데이터는 인간 게놈 (GRCh38.p12)에 맞춰 정렬되었고 유전자-당 발현 값은 각 샘플에 대해 표로 작성되었다. 결과적인 발현 매트릭스는 단핵구 프로필로 감소되었고 백만-당-계수가 정규화되었다. HLA-DR, CD40, CD80 및 CD86에 대한 결과적인 발현 값은 모든 단핵구-유래된 샘플에 걸쳐서 플롯팅되었다. 활성화 마커는 단핵구에서만 특이적으로 발현되고 차등적으로 조절되었다.
결과
어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q는 시험관내에서 케모카인 및 사이토카인의 선택적 세트를 유도하였다. 도 34a는 이소타입 항체 처리와 비교하여 PI-4026-5-M100Q로 처리 후 표시된 케모카인 또는 사이토카인의 상대적 배수 변화를 제공한다. 도 34a에 도시된 사이토카인은 10pg/ml 초과로 검출되었고 다수의 공여자로부터의 실험에 걸쳐서 상향조절되었다.
추가로, 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q로 세포의 처리는 통상적인 단핵구에 대한 HLA-DR 표면 발현 (도 34b) 및 CD40 (도 34c 표면 발현에서 용량 의존적 증가를 초래하였다. HLA-DR 및 CD40은 항원 제시에서 결정적 역할을 하는 항원 제시 세포 상에서 발견된 공-자극성 단백질이다. 어푸코실화된 PI-4026-5M100Q는 항원-제시 및 림프구 활성화에 중요한 세포 표면 분자를 상향조절하고 또한 림프구 활성화 및 모집을 담당하는 사이토카인을 상향조절한다. 이들 결과는 TREM1 항체가 억제성 골수 세포를 항-종양, 염증전 표현형으로 재프로그래밍하거나 활성화할 수 있음을 시사한다.
이들 결과를 확인하기 위해, 어푸코실화된 PI-4026-M100Q 또는 이소타입 대조군으로 처리 후 세포에서 유도된 면역 시그널링 유전자 및 경로를 RNAseq를 통해 조사하였다. 먼저, 항-TREM1 항체 또는 이소타입 대조군으로 처리된 세포에 대해 RNAseq를 수행하고 각 샘플의 유전자 발현을 클러스터링하였다. 도 35에 도시된 바와 같이, RNAseq 데이터에 기반한 T 세포, NK 세포, 단핵구 및 호중구의 클러스터링은 각각 표시된 세포 모집단 정규의 유전자 발현과 잘 상관되었다. 따라서, 면역 세포는 항체 처리에 관계없이 RNAseq 데이터를 사용하여 바르게 클러스터링될 수 있다.
다음으로, 특정 면역 세포 활성화 마커의 항-TREM1 항체 유도를 RNAseq를 사용하여 확인하였다. HLA-DR, CD40, CD80 및 CD86 발현은 RNAseq에 의해 결정되었다. CD80 및 CD86은 항원 제시 세포 상에서 발견된 추가의 공-자극성 단백질이다. 도 36a는 이소타입 항체 처리 (ISO) 또는 항-TREM1 항체 (어푸코실화된 PI64062) 처리 후 표시된 세포 유형에서 HLA-DR 유전자 발현을 도시한다. 도 36b는 이소타입 항체 처리 (ISO) 또는 항-TREM1 항체 (어푸코실화된 PI64062) 처리 후 표시된 세포 유형에서 CD40 유전자 발현을 도시한다. 도 36c는 이소타입 항체 처리 (ISO) 또는 항-TREM1 항체 (어푸코실화된 PI64062) 처리 후 표시된 세포 유형에서 CD80 유전자 발현을 도시한다. 도 36d는 이소타입 항체 처리 (ISO) 또는 항-TREM1 항체 (어푸코실화된 PI64062) 처리 후 표시된 세포 유형에서 CD86 유전자 발현을 도시한다. RNA 분석은 표면 발현 CD80 및 CD86, 뿐만 아니라 반복 샘플로서 HLA-DR 및 CD40에 대한 유세포분석법 분석에 의해 추가로 확인되었다. CD14+ 단핵구 상의 세포 표면 HLA-DR (도 37a), CD40 (도 37b), CD80 (도 37c) 및 CD86 (도 37d)에 대한 대표적인 히스토그램 오버레이가 도시되어 있으며, 이는 RNA 분석에 의해 도시된 항-TREM1 유도된 패턴과 일치한다. 중요하게도, RNAseq 샘플에서 항-TREM1 항체 처리에 의해 유도된 세포 표면 마커는 유세포분석에 의해 초기에 확인된 HLA-DR 및 CD40 발현과 일치했다.
단핵구, 호중구, NK 세포 및 T 세포에서 TREM1 항체 처리에 의해 유도된 유전자 발현에서 추가의 변화가 또한 RNAseq를 통해 평가되었다. IFN 반응, TNFα 시그널링 및 염증 반응과 연관된 유전자는 호중구, 단핵구, NK 세포 및 T 세포에서 TREM1 항체 처리에 의해 유도되었다. TREM1 항체는 주로 호중구, 단핵구 및 NK 세포에서 유전자 발현 변화를 유도한다.
표 27은 상이한 세포 유형에서 TREM1 항체에 의해 유도된 면역 경로의 요약을 제공한다.
Figure pct00035
실시예 15: 항-TREM1 항체는 염증전 반응을 유도한다
재료 및 방법
단백질 인산화 정량화
인산-유동 분석에 사용된 세포는 건강한 인간 공여자로부터 전혈 버피 코트에서 유래되었다. 버피 코트는 각각 15분 동안 37C에서 BD Pharm Lyse 완충액에서 2 라운드의 인큐베이션에 의해 RBC-용해되었다. RBC-용해에 이어서, X-VIVO 15 배지에 생성된 백혈구는 그리고 5x106 백혈구/웰로 96 멀티-웰 딥-웰 플레이트 상에 도말되었다. 세포를 37C, 5% CO2에서 2시간 동안 회복시켜 기초 인산화 수준을 감소시켰다. 회복 기간에 이어서, 세포는 양성 대조군으로 PMA (0.1ug/ml) 및 이오노마이신 (1ug/ml), 또는 0, 2, 10, 30, 60, 및 90분 동안 5ug/ml의 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q 또는 어푸코실화된 hIgG1 이소타입으로 자극되었다. 그런 다음 세포는 37C에서 10분 동안 사전-가온된 BD Cyto Fix 완충액을 사용하여 고정되었다. 고정 후, 샘플을 FACS 완충액 (2% FBS를 갖는 DPBS, 2mM EDTA)로 2회 세정하고 BD Perm Buffer III의 100ul/샘플로 투과화했다. 그런 다음 샘플을 FACS 완충액으로 린스하고, 얼음 위에서 30분 동안 Innovex 및 인간 TrueStain FcX 블록 50ul로 차단하고, FACS 완충액으로 2회 세정했다. 세포 펠렛을 백혈구 계통 마커에 대한 항체의 칵테일에 재현탁하고 인-단백질 염색을 위해 2개 샘플로 분할하였다. 항-포스포-ERK1/2 (Y202/Y204) (Biolegend, 클론 4B11B69) 및 항-포스포-STAT3 (S727) (Biolegend, 클론 A16089B)를 사용했다. 샘플을 항-포스포 항체를 포함하는 항체 칵테일로 RT에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션에 이어서, 샘플을 FACS 완충액으로 2회 세정한 다음 얼음 위에서 10분 동안 2% 파라포름알데히드로 인큐베이션함에 의해 고정하였다. 샘플을 FACS 완충액으로 2회 세정하고, 200ul의 FACS 완충액에 재현탁하고, Attune 유세포분석기에서 획득할 때까지 4C에서 유지했다.
세포 경로 유도
MC38 종양을 담지하는 마우스 (군당 n=10)를 PCT/US2018/045680의 실시예 14에 기재된 바와 같이 어푸코실화된 PI-9067L 또는 mIgG2a 이소타입 대조군으로 처리하였다. 이식 후 19일차 (2차 처리 후 48시간)에 종양을 수확하였다. RNA를 추출하고 서열화했다. 항체 치료와 연관된 차등적으로 유도된 경로를 MSigDB로부터 유전자 세트의 c5 컬렉션을 사용하여 브로드 연구소 (Broad Institute)의 유전자 세트 농후화 분석 (Gene Set Enrichment Analysis; GSEA) 도구를 사용하여 평가했다. 유의하게 상향조절된 경로 (FDR < 0.1)는 기본 매개변수를 사용하여 Cytoscape에서 농후화 맵 (Enrichment Map) 모듈을 사용하여 시각화되었다.
RNAseq 검증
5명의 건강한 인간 공여자로부터 전체 헤파린화된 혈액을 각각 1mg/ml (~7nM)의 PY159 및 이소타입 대조군 항체로 5% CO2에서 섭씨 37도에서 16시간 동안 처리했다. 인큐베이션 기간 후, 혈액을 이동하고 모든 후속 단계를 얼음 위에서 수행했다. 혈액을 RBC-용해하고 백혈구를 계통-특이적 마커에 대한 항체로 염색하고 유세포측정 분류를 위해 제출하여, CD15+ 호중구, CD14+ 단핵구, CD3+ T 세포 및 CD56+ NK 세포의 순수한 모집단을 산출했다. 총 RNA는 각 세포의 서브세트-특이적 샘플로부터 단리되었고 고-처리량 RNA 서열화를 위해 제출되었다. 후속 데이터는 인간 게놈 (GRCh38.p12)에 맞춰 정렬되었고 유전자-당 발현 값은 각 샘플에 대해 표로 작성되었다. PY159와 대조군 처리 샘플 사이의 정규화 및 후속 차등 발현은 R 패키지 DESeq2를 사용하여 각 세포 유형에 대해 수행되었다. 각 세포의 서브세트에 대한 결과적인 데이터는 배수 변경에 의해 정렬되었고, 단백질 코딩 유전자만 포함하도록 서브세트되고, 유전자 세트 농후화 분석 소프트웨어 (v4.0.0) (Broad Institute로부터 이용 가능)로 전달되었다. 사전-순위 분석은 브로드 연구소의 유전자 온톨로지 컬렉션 (MsigDB c5)에 대해 기본 설정을 사용하여 실행되었다.
결과
PI-4026-5-M100Q는 단핵구 및 호중구에서 ERK 및 STAT3의 인산화를 유도했지만 T 세포에서는 유도하지 않았다 (도 38a). ERK의 인산화가 아닌, 호중구 또는 단핵구에서 ERK의 TREM1 항체 유도된 인산화만이 hIgG1 처리된 세포에서 관찰되었다. TREM1 항체는 hIgG1 처리와 비교하여 호중구 및 단핵구에서 더 높은 수준의 인산화된 STAT3을 유도했다. 도 38a의 STAT3 패널에서, TREM1 샘플은 오른쪽 상의 막대로 표시되고 hIgG1 처리된 샘플은 왼쪽 상의 막대에 표시된다.
도 38b (*<0.05, **<0.001)는 ERK 및 STAT 경로의 RNAseq 분석의 결과를 도시하며, 이는 호중구 또는 NK 세포가 아닌 단핵구에서 이들 경로와 연관된 유전자에서의 유의한 농후화를 도시한다.
미토겐-활성화 단백질 키나제 (MAPK)로도 알려진 ERK 활성화는 NF-κB 활성화 및 염증전 반응의 발현을 초래한다. STAT3은 JAK 패밀리 시그널링 단백질에 의해 활성화되고 NF-κB와 상호작용하는 전사 인자이다. STAT3의 활성화는 또한 염증전 반응을 유발한다. 따라서, TREM1 항체 처리 후 ERK 및 STAT3의 인산화는 어푸코실화된 PI-4026-5-M100Q 항체의 작용제 활성의 추가 증거를 제공하며, 이는 항체를 사용한 처리가 TREM1과 TREM1 및 이의 어댑터 단백질 DAP12의 유도된 시그널링 다운스트림을 교차-연결할 수 있음을 입증한다. 이 시그널링은 아마도 TREM1+ 골수 세포를 염증전 세포로 재프로그래밍하는 역할을 수행한다.
마우스 및 인간에서 TREM1 항체 치료에 의해 유도된 염증전 반응을 또한 분석하였다. 마우스에서 TREM1 항체 치료는 면역 반응, 칼슘 이온 수송, 조직 리모델링, 대사 및 RNA 처리와 연관된 경로의 상향조절을 초래했다. 면역 경로 패밀리는 항원 처리 및 제시, T 세포 수용체 시그널링 경로, TNF 반응, TNF 수퍼패밀리 사이토카인 생성, NF-κB 시그널링, IFNγ 생성, IL-6 생성의 조절, T 세포 증식, 적응성 면역 반응, 림프구 매개된 면역, 세포 부착, 케모카인 활성, 케모카인 수용체 결합, 세포 주화성, 림프구 이동, 및 ERK1 및 ERK2 캐스케이드를 포함한다. 더욱이, 마우스 Py8119 모델에서 항-TREM1 항체로 처리는 또한 선천적 면역 반응, 세포 활성화 및 부착, 주성 또는 이동과 같은 면역 반응과 연관된 경로의 상향조절을 보여주었다 (데이터 미도시).
도 39는 인간 혈액 분석물 분석에서 PI-4026-5-M100Q에 의해 유도된 케모카인 및 사이토카인과 비교하여 마우스 MC38 종양 모델에서 상향조절된 유전자의 그래프를 도시한다. 마우스 생체내 및 인간 혈액 시험관내 데이터 둘 모두에서 항-TREM1 항체로 처리는 염증전 T 세포 기반 반응과 연관된 분자의 상향조절을 초래했다.
표 28은 단백질 검정 및 RNAseq 둘 모두에 의해 결정된 바와 같이 TREM1 항체에 의해 다양한 세포 모집단에서 유도된 특정 사이토카인 및 케모카인의 요약을 제공한다.
Figure pct00036
따라서, TREM1 항체 (어푸소일화된 PI-4026-5-M100Q)는 종양 파괴와 연관된 T 세포, NK 세포, M1-유사 대식세포에서 다중 항-종양 면역 기전을 유도했다. 단핵구에서 TREM1 항체 처리는 CXCL10, CXCL9, CCL3, CCL13, IL-6, CSF-1, HLA-DR, CD40, CD86 및 CD80의 유도를 초래한다. NK 세포에서 TREM1 항체 처리는 IFN-γ, CCL3, CCl4, CCl17, 4-1BB, CRTAM 및 CD69의 유도를 초래한다. 호중구에서 TREM1 항체 처리는 CCL3, CCL4, CCL13, CXCL8 및 PD-L1의 유도를 초래한다. TREM1 항체 유도된 인자, 이들 인자의 기능 및 세포 공급원의 요약 표는 표 29에 나타나 있다.
Figure pct00037
실시예 16: 난소 모델에서 생체내 항-TREM1 치료 효능
생체내 사용을 위한 항체는 모두 내독소에 대해 시험되었고 0.2 EU/mg 단백질 이하에서 사용되었다. 항-PD-1 (클론 RMP1-14)은 Absolute Antibody Inc에서 구입되었거나 Pionyr에서 마우스 IgG1 D265A 형식으로 재조합으로 생산되었다. 마우스 IgG1 (클론 MOPC-21) 및 마우스 IgG2a (클론 C1.18.4) 이소타입 대조군은 BioXCell에서 구입되었거나 Pionyr에서 HEK293 세포에서 재조합으로 만들어졌다. 항-TREM1 항체 (PI-9067L)의 키메라 마우스 IgG2a 버전은 Pionyr에서 HEK293 세포에서 생산되었고 SEC 및 CE-SDS뿐만 아니라 테스트된 내독소에 의해 단분산도 및 순도에 대해 평가되었다.
살아있는 동물을 포함하는 모든 실험 절차는 AJES Life Sciences LLC의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었다. 6-8주령 암컷 B6(Cg)-Tyrc-2J/J 또는 B6-알비노 마우스를 Jackson Laboratory에서 구입하여 동물 시설에 1주일 순응시킨 후 사용했다. ID8-Luc (AJES Life Sciences LLC, 뉴욕주 스토니브룩 소재)로 알려진 반딧불이 루시퍼라제를 과발현하는 마우스 난소 표면 상피 세포는 액체 질소 스톡에서 해동한 후 3 내지 7 계대배양 내에서 수확하고 생체-내 실험에 사용했다. 종양 접종일에 세포를 수확하여 45분 이내에 사용하였다. 복강내 종양을 확립하기 위해, 5x106 ID8-Luc 세포를 우측 하부 복벽 안으로 주사하였다. 모든 마우스는 연구를 위한 모집용 주사 이후 20일에 생체-내 루시퍼라제 활성에 대해 이미지화되었다. 40마리 종양-담지 동물이 종양 부담에 대한 대용물로서 평균 발광 판독에 기반하여 연구에 모집되었다. 4개 처리 군은 각 군에 대한 평균 종양 광도 (p/s/cm2/sr)가 4.7x104가 되도록 10마리 동물로 무작위로 할당되었다. 종양-담지 동물은 표시된 항체로 5일마다 복강내로 처리되고 발광 이미지는 매주 캡처되었다. 마우스에 0.2mL의 15mg/mL D-루시페린 (Promega)을 복강내로 주사했다. D-루시페린 주사 10분 후, 마우스는 충전-연결된 장치 카메라 (IVIS, Xenogen, 캘리포니아주 앨러미다 소재)가 장착된 기기에서 이미지화되었다. 데이터는 Living Image 소프트웨어 (Xenogen)로 분석되었고 복막을 덮고 있는 관심 있는 영역에 대한 종양 광도 (p/s/cm2/sr)로 표시되었다.
이 실시예에서, PI-9067L은 마우스 TREM1에 결합하고 PCT/US2018/045680에서 생체내 항-암 치료 효과를 제공하는 것으로 나타났기 때문에 상기에 기재된 항체에 대한 생체내 대용물로 사용되었다.
도 40에 도시된 바와 같이, 항-TREM1 항체 처리는 동소 ID8 난소 종양 모델에서 단일요법 및 조합 요법 효능을 가졌다. 항-TREM1 항체 단독으로 처리된 마우스는 이소타입 대조군 처리된 마우스와 비교하여 종양 발광성에서 감소에 의해 나타난 바와 같이 종양 부담에서 감소를 가졌다. 대조군 항-PD-1 항체 처리는 또한 종양 부담에서 감소를 초래했고, 항-TREM1과 항-PD-1 항체의 조합은 항-TREM1 또는 항-PD-1 항체 처리 단독에 비해 종양 부담에서 훨씬 더 큰 감소를 초래했다.
모든 생체내 효능 연구의 요약에서, 항-TREM1 항체는 MC38 결장 암종 모델에서 단일요법 효능을 가졌으며, 이는 대조군과 비교하여 약 44% 종양 성장 억제; Panc02 췌장 모델에서 단독요법 효능을 초래하였고, 대조군과 비교하여 약 43% 종양 성장 억제; 및 ID8 난소 모델에서 단일요법 효능을 초래하였고, 대조군과 비교하여 약 44% 종양 성장 억제를 초래하였다. 항-TREM1 항체는 CTC26 결장 암종 모델에서 항-PD-1 항체와 조합 효능을 가졌으며, 이는 대조군과 비교하여 약 40-45% 종양 성장 억제 및 20-40% 치료율; Panc02 모델에서 항-PD-1 항체와의 조합 효능을 초래하였고, 대조군과 비교하여 약 56% 종양 성장 억제; ID8 난소 모델에서 항-PD-1 항체와의 조합 효능을 초래하였고, 대조군과 비교하여 약 62% 종양 성장 억제 및 20% 치료율; 및 대조군과 비교하여 약 46% 종양 성장 억제를 초래하는 Py8119 유방 암종 라인에서 항-PD-1 항체와의 조합 효능을 초래하였다.
실시예 17: 항-TREM1 처리는 장-기간, 항-종양 면역 메모리을 초래한다
PCT/US2018/045680의 실시예 13에 기재된 바와 같이 항-TREM1 어푸코실화된 PI-9067L 항체 플러스 항-PD-1 항체 처리 후 이전의 CT26 종양 모델 연구로부터 종양이 없었던 BALB/c 마우스는 3개월 후 1x106 CT26 종양 세포로 재-도전되었다. 종양 부피는 이식 후 25일 동안 측정되었다. 연령-매칭된 처리를 받지 않은 마우스는 동등한 수의 CT26 세포를 수용하였고 연구 기간 동안 종양 성장을 추적했다. 연구 기간 동안 마우스에 추가의 처리는 제공되지 않았다.
항-TREM1 어푸코실화된 PI-9067L 및 항-PD-1 mAb의 조합으로 처리에 이어 그 CT26 종양이 치유된 마우스는 효과적인 항-종양 메모리 반응을 확립하였다 (도 41). 치유된 마우스는 추가의 요법이 없는 경우에도 임의의 새로운 종양 성장을 거부할 수 있었으며, 이는 원래 이식된 종양에 대한 장기 면역 메모리을 나타낸다. 이 형태의 장기 면역 메모리는 활발한 CD8+ 효과기 메모리 반응의 유지를 활용할 수 있다.
실시예 18: TREM1은 다양한 암에서 발현되고 환자 생존과 역으로 상관된다
더 캔서 게놈 아틀라스 (The Cancer Genome Atlas)의 대장암 샘플 코호트로부터의 수준 2, RNAseq 데이터는 firehose_get을 사용하여 브로드 연구소에서 다운로드했다. 종양 (n=282) 및 인접 정상 샘플 (n=41) 둘 모두로부터의 TREM1에 대한 RSEM 값을 백만당 로그 2 계수로 변환하고 R에 플롯팅하였다 (도 42a). 사전정규화된 TREM1 발현 프로필 및 566개 결장직장 종양에 걸쳐 연관된 임상 데이터는 NCBI의 GEO 웹사이트 (수탁 GSE39582)로부터 다운로드되었다. 발현 프로필은 TREM1의 중앙값 수준에 기반하여 2개의 코호트로 분할되었다. 카플란-마이어 생존 곡선을 각 코호트에 대해 플롯팅하고 연관된 로그랭크 테스트를 R에서 생존 및 survminer 패키지를 사용하여 수행했다 (도 42b).
TREM1은 결장직장암에서 고도로 발현된다 (도 42a). 부가하여, 결장직장암에서 TREM1 발현 수준은 환자 생존 확률과 역으로 상관되며, 예를 들어 높은 TREM1 발현을 갖는 환자는 더 낮은 TREM1 발현을 갖는 환자와 비교하여 더 낮은 장기 생존 확률을 가졌다, p=0.0081 (도 42b). TREM1 발현과 환자 생존의 역 상관관계는 유방암 및 췌장암 환자에서도 관찰되었다 (데이터 미도시). 높은 TREM1 mRNA 발현은 또한 NSCLC, HNSCC, 난소암, 위암, 방광암에서도 관찰되었다 (데이터 미도시).
실시예 19: 생체내 약동학 연구
재료 및 방법
암컷 CD-1 마우스에 0.1, 1, 10 및 100mg/kg의 어푸코실화된 PI-4928 항-TREM1 항체의 증가하는 용량으로 정맥내로 투여하였다. 투여 후 0.25, 1, 2, 24, 72, 168 및 336시간에 혈장을 수집하였다. PI-4928 항체 및 가용성 마우스 TREM1의 혈장 농도를 하기에 기재된 바와 같이 결정하였다. 이 실시예에서, PI-4928은 마우스 TREM1에 결합하고 생체내에서 항-암 치료 효과를 제공하는 것으로 나타났기 때문에 상기에 기술된 항체에 대한 생체내 대용물로 사용되었다.
PI-4928 마우스 PK 검정은 리간드 결합 검정 (LBA)이다. 96-웰 고-결합 MSD 플레이트를 Fc-태그된 재조합 마우스 TREM1 (R&D 시스템 #1187-TR)로 코팅했다. 차단 후, 샘플을 TREM1 단백질이 결합된 플레이트에 첨가하였다. 어푸코일화된 PI-4928 항체의 존재는 설포-태그된 항-마우스 IgG2a 2차 항체 (Jackson ImmunoResearch #115-035-206)를 사용하여 검출되었다. ECL 신호는 플레이트가 MSD 플레이트 판독기로부터 전기 신호를 받은 후 2차 항체에 의해 생성되었다. ECL 신호는 플레이트 판독기에 의해 검출되고 정량화되었다.
PK MSD 검정은 300ng/mL 내지 0.41ng/mL의 동적 범위로 큰 민감도를 입증한다. 1:20의 최소 요구 희석 (MRD)이 사용되는 경우, 이 검정의 LLOQ는 8.2ng/mL이고 ULOQ는 6000ng/mL이다. 이 검정은 BALB/c K2EDTA 혈장에서 어푸코실화된 PI-4928 항체를 검출하는데 적합한다.
마우스 가용성 TREM1 (msTREM1)은 MSD 플랫폼 상에 전개된 샌드위치 면역분석을 통해 정량화되었다. 비오티날화된 염소 항-mTREM1 폴리클로날 항체 (R&D 시스템 #AF1187)를 포획제로 사용하고 미리코팅된 스트렙타비딘 플레이트에 결합했다. 세정 후, mTREM1 단백질을 함유하는 샘플을 플레이트에 첨가하였다. 결합된 TREM1 단백질은 mTREM1에 대한 설포-태그된 mIgG2a 항체 (자체 전개된 항체)에 의해 검출되었다.
MSD sTREM1 검정은 10ng/mL 내지 14pg/mL의 동적 범위를 갖는다. 이 검정의 LLOQ 및 LOD는 각각 14pg/mL 및 1pg/mL이다. 이 sTREM1 검정은 BalB/c, C57BL/6 및 CD1 균주로부터 혈장 샘플에서 순환하는 TREM1 단백질을 검출할 수 있다. 부가하여, 이 검정은 항-TREM1 항체 PI-4928의 존재에서 sTREM1 단백질을 검출한다.
혈액 세포 계수는 또한 7 및 14일차에 결정되었다. 혈액을 K2EDTA 튜브에 수집하고 Heska Element HT5 상에서 분석하여 차별적인 백혈구 계수 및 적혈구 매개변수를 결정했다.
결과
어푸코실화된 PI-4928 항체는 마우스에서 용량 의존적 약동학을 가졌다 (도 43a). 도 43b에 도시된 바와 같이, 항-TREM1 항체로 처리는 혈장에서 가용성 마우스 TREM1 단백질의 용량 의존적 축적을 초래하였고, 이는 PI-4928 항체가 또한 가용성 마우스 TREM1 단백질을 안정화시켰음을 나타낸다.
추가로, 어푸코실화된 PI-4928의 투여는 7일차 및 14일차에 시험된 호중구, 단핵구, 호산구 또는 호염기구의 마우스 혈액 세포 계수 (도 44a 및 44b) 또는 혈청 화학 (도 44c 및 44d)에서 임의의 유의한 변화를 야기하지 않았다. 헤모글로빈 (HGB), 헤마토크릿 (HCT), 평균 세포 부피 (MCV), 평균 세포 헤모글로빈 (MCH), 평균 세포 헤모글로빈 농도 (MCHC) 및 적혈구 분포 (RDW-CV)를 포함한 적혈구 매개변수를 측정하였다.
실시예 20: 유방암 모델에서 생체내 항-TREM1 치료 효능
재료 및 방법
약 8주령인 암컷 BALB/c 마우스를 Taconic으로부터 획득했다. 마우스 유선 종양 세포주 EMT6 (CRL-2755)은 American Type Culture Collection으로부터 획득하여 그 가이드라인에 따라 배양했다. 저 계대 세포를 무-혈청 배양 배지에서 1x107 세포/ml로 재현탁시켰다. 종양 세포 현탁액을 BALB/c 마우스의 면도된 오른쪽 복부 옆구리에 피하로 주사하였다. 수직 종양 직경 측정을 통해 종양 부피 성장을 모니터링하고 식 (㎣) = 0.5x(길이)×(폭)2을 사용하여 계산했다. 약물 처리를 위해 마우스에 마우스 항-마우스 이소타입 대조군 IgG2a (15mg/kg에서 클론 C1.18.4), 항-마우스 이소타입 대조군 IgG1 (15mg/kg에서 클론 MOPC-21), 항-마우스 PD-1 (5mg/kg에서 Pionyr Pi-0004-AB), 항-마우스 TREM1 (15mg/kg에서 클론 Pi-9067L), 또는 항-TREM1 항체와 항-PD-1 항체의 조합을 복강내로 투여했다. 항-PD-1 (클론 RMP1-14)은 BioXCell (미국 뉴 햄프셔주 웨스트 레바논 소재)로부터 구입되거나 마우스 IgG1 D265A 형식으로 재조합으로 생산되었다. 처리는 군 평균 종양 부피가 평균 62 입방 mm (도 45a) 또는 평균 173 입방 mm (도 45b)일 때 개시되었다. 수직선은 항체가 복강내로 투여된 날짜를 나타낸다. 모든 연구는 프로토콜 AUP0606 하에서 Explora Biolabs 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 따라 수행되었다. USDA 실험 동물 복지법에 따라 실험 동물의 관리 및 사용을 위한 NIH 가이드에 요약된 조건 하에서 마우스를 수용했다. 동물은 실험식 식이 (Lab Diet) 설치류 먹이와 물에 자유롭게 접근할 수 있었다. 마우스는 안락사가 필요할 수 있는 임상적 이상에 대해 조사자 또는 수의사 직원에 의해 주당 최소 2회 모니터링되었다. 기준선 체중 측정과 비교하여 >20%의 순 체중 손실을 나타내는 마우스를 안락사시켰다.
결과
도 44a 및 44b는 피하 EMT6 종양-담지 암컷 BALB/c 마우스에서 항-TREM1, 항-PD-1, 또는 항-TREM1과 항-PD-1 처리의 조합의 항-종양 효능을 도시한다. 도 44a는 62㎣의 "작은" 종양을 갖는 마우스의 처리 동안 종양 부피를 나타낸다. 도 44b는 173㎣의 "큰" 종양을 갖는 마우스의 처리 동안의 종양 부피를 나타낸다. 작은 종양에서 항-TREM1 항체 처리 단독 또는 항-PD-1 항체와 조합은 항-종양 효능을 나타냈다. 항-TREM1 항체 처리는 47% 종양 성장 억제를 초래했고, 항-PD-1 항체 처리는 65% 종양 성장 억제 및 2 완전한 퇴행을 초래했고, 항-TREM1 항체와 항-PD-1 항체 처리의 조합은 91% 종양 성장 억제 및 3 완전한 퇴행을 초래했다 (도 44a). 큰 종양에서, 항-TREM1 항체 처리는 1 완전한 완화를 초래하였고, 항-PD-1 항체 처리는 10% 종양 성장 억제를 초래하였고, 항-TREM1 항체와 항-PD-1 항체 처리의 조합은 75% 종양 성장 억제를 초래하였다 (도 44a). 따라서, 항-TREM1 항체는 단일치료 및 조합 치료 효능 둘 모두를 나타낸다.
본 명세서의 본문 내에서 인용된 모든 참고문헌, 발행된 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다.
본 발명이 바람직한 실시형태 및 다양한 대안적인 실시형태를 참고하여 특별하게 도시되고 기술되었지만, 관련 기술분야의 통상인은 본 발명의 사상 및 범주에서 벗어남이 없이 그 안에서 형태 및 세부사항의 다양한 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
서열 목록
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
<110> PIONYR IMMUNOTHERAPEUTICS, INC. <120> ANTI-TREM1 ANTIBODIES AND RELATED METHODS <130> PII-010WO <140> PCT/US2020/016949 <141> 2020-02-06 <150> 62/889,994 <151> 2019-08-21 <150> 62/802,161 <151> 2019-02-06 <160> 59 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 234 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Lys Thr Arg Leu Trp Gly Leu Leu Trp Met Leu Phe Val Ser 1 5 10 15 Glu Leu Arg Ala Ala Thr Lys Leu Thr Glu Glu Lys Tyr Glu Leu Lys 20 25 30 Glu Gly Gln Thr Leu Asp Val Lys Cys Asp Tyr Thr Leu Glu Lys Phe 35 40 45 Ala Ser Ser Gln Lys Ala Trp Gln Ile Ile Arg Asp Gly Glu Met Pro 50 55 60 Lys Thr Leu Ala Cys Thr Glu Arg Pro Ser Lys Asn Ser His Pro Val 65 70 75 80 Gln Val Gly Arg Ile Ile Leu Glu Asp Tyr His Asp His Gly Leu Leu 85 90 95 Arg Val Arg Met Val Asn Leu Gln Val Glu Asp Ser Gly Leu Tyr Gln 100 105 110 Cys Val Ile Tyr Gln Pro Pro Lys Glu Pro His Met Leu Phe Asp Arg 115 120 125 Ile Arg Leu Val Val Thr Lys Gly Phe Ser Gly Thr Pro Gly Ser Asn 130 135 140 Glu Asn Ser Thr Gln Asn Val 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 53 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Glu Ile Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Leu Tyr 35 40 45 Thr Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Thr 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Thr Phe 85 90 95 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 54 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 54 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Ile Thr Ser Ser 20 25 30 Asn Val Tyr Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ser Ser Leu Lys 50 55 60 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Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr 275 280 285 Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala 290 295 300 Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro 340 345 350 Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val 355 360 365 Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly 370 375 380 Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp 405 410 415 Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His 420 425 430 Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 55 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 55 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Leu Ser Asn 20 25 30 Val Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Thr Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro 65 70 75 80 Val Gln Ala Asp Asp Ile Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gly Glu 85 90 95 Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys Arg Ala 100 105 110 Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu 115 120 125 Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn 145 150 155 160 Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His 180 185 190 Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile 195 200 205 Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215 <210> 56 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 56 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Val Ala Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser 245 250 255 Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp 260 265 270 Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln 275 280 285 Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser 290 295 300 Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro 340 345 350 Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met 355 360 365 Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn 370 375 380 Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn 405 410 415 Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu 420 425 430 His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 57 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 57 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Val Ser Gly Tyr 85 90 95 Ser Leu Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 58 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 58 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Tyr Pro Ser Tyr Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Val Ala Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp 180 185 190 Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser 245 250 255 Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp 260 265 270 Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln 275 280 285 Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser 290 295 300 Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro 340 345 350 Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met 355 360 365 Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn 370 375 380 Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn 405 410 415 Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu 420 425 430 His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 59 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 59 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Val Ser Gly Tyr 85 90 95 Ser Leu Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala 100 105 110 Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu 115 120 125 Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn 145 150 155 160 Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His 180 185 190 Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile 195 200 205 Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215

Claims (159)

  1. 인간 TREM1 (서열번호: 1)에 결합하는 단리된 항체로서, 상기 항체는
    i) 인간 TREM1 (서열번호: 1)의 잔기 21-34 (서열번호: 42), 103-109 (서열번호: 43) 및 128-136 (서열번호: 44) 내에서 결합하고;
    ii) 선택적으로 인간 Fc 영역을 포함하는, 항체.
  2. 3개의 중쇄 CDR 서열, CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3을 포함하는 가변 중쇄 (VH) 서열을 포함하는 중쇄, 및 3개의 경쇄 CDR 서열, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는 가변 경쇄 (VL) 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 TREM1 (서열번호: 1)에 결합하는 단리된 항체로서,
    a. CDR-H1은 서열번호: 23에 제시된 서열을 포함하고,
    b. CDR-H2는 서열번호: 24에 제시된 서열을 포함하고,
    c. CDR-H3은 서열번호: 29에 제시된 서열을 포함하며, 여기서 X는 류신 (L), 글루타민 (Q), 메티오닌(M), 이소류신 (I) 또는 글루탐산 (E)이고,
    d. CDR-L1은 서열번호: 26에 제시된 서열을 포함하고,
    e. CDR-L2는 서열번호: 27에 제시된 서열을 포함하고, 그리고
    f. CDR-L3은 서열번호: 28에 제시된 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체는 서열 RXAAMDY (서열번호: 29)를 포함하는 CDR-H3을 포함하며, 여기서 X는 류신 (L), 글루타민 (Q), 메티오닌 (M), 이소류신 (I), 또는 글루탐산 (E)인, 단리된 항체.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 23에 제시된 서열을 포함하는 CDR-H1 및 서열번호: 24에 제시된 서열을 포함하는 CDR-H2를 추가로 포함하는, 단리된 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CDR-H3은 서열번호: 33에 제시된 서열을 포함하고; 상기 항체는 서열번호: 23에 제시된 서열을 포함하는 CDR-H1 및 서열번호: 24에 제시된 서열을 포함하는 CDR-H2를 추가로 포함하는, 단리된 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 26에 제시된 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호: 27에 제시된 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호: 28에 제시된 서열을 포함하는 CDR-L3을 추가로 포함하는, 단리된 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 16, 17 또는 18에 제시된 서열로부터 선택된 VH 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 17에 제시된 VH 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 20, 21, 또는 22에 제시된 서열로부터 선택된 VL 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 20에 제시된 VL 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 17에 제시된 VH 서열 및 서열번호: 20에 제시된 VL 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 scFv인, 단리된 항체.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 scFv이고 서열번호: 17에 제시된 VH 서열 및 서열번호: 20에 제시된 VL 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 scFv이고 서열번호: 16, 17 또는 18에 제시된 서열로부터 선택된 VH 서열 및 서열번호: 20, 21, 또는 22에 제시된 서열로부터 선택된 VL 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 17에 제시된 VH 서열, 및 서열번호: 20에 제시된 VL 서열을 포함하고; 인간 Fc 영역은 야생형 인간 IgG1 Fc를 포함하는, 단리된 항체.
  16. 제1항 내지 제11항 또는 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 34에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호: 35에 제시된 경쇄 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  17. 제2항에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 4, 5 또는 6에 제시된 서열로부터 선택된 VH 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 20, 21 또는 22에 제시된 서열로부터 선택된 VL 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 8, 9 또는 10에 제시된 서열로부터 선택된 VH 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  20. 제2항에 있어서, 상기 CDR-H3은 서열번호: 32에 제시된 서열을 포함하고, 상기 항체는 서열번호: 23에 제시된 서열을 포함하는 CDR-H1 및 서열번호: 24에 제시된 서열을 포함하는 CDR-H2를 추가로 포함하는, 단리된 항체.
  21. 제20항에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 12, 13 또는 14에 제시된 서열로부터 선택된 VH 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  22. 제21항에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 13에 제시된 VH 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 20, 21, 또는 22에 제시된 서열로부터 선택된 VL 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  24. 제23항에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 20에 제시된 VL 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 13에 제시된 VH 서열 및 서열번호: 20에 제시된 VL 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 scFv이고 서열번호: 13에 제시된 VH 서열 및 서열번호: 20에 제시된 VL 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  27. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 scFv이고 서열번호: 112, 13 또는 14에 제시된 서열로부터 선택된 VH 서열 및 서열번호: 20, 21 또는 22에 제시된 서열로부터 선택된 VL 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  28. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 13에 제시된 VH 서열, 및 서열번호: 20에 제시된 VL 서열을 포함하고; 인간 Fc 영역은 야생형 인간 IgG1 Fc를 포함하는, 단리된 항체.
  29. 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 36에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호: 37에 제시된 경쇄 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  30. 제1항 내지 제4항 또는 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 17, 13 또는 9에 제시된 VH 서열; 및 서열번호: 20에 제시된 VL 서열로 구성되는, 단리된 항체.
  31. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 17에 제시된 VH 서열; 및 서열번호: 20에 제시된 VL 서열로 구성되는, 단리된 항체.
  32. 제1항 내지 제4항 또는 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 13에 제시된 VH 서열; 및 서열번호: 20에 제시된 VL 서열로 구성되는, 단리된 항체.
  33. 제1항 내지 제4항 또는 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 9에 제시된 VH 서열; 및 서열번호: 20에 제시된 VL 서열로 구성되는, 단리된 항체.
  34. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 중쇄는 서열번호: 34에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호: 35에 제시된 경쇄 서열로 구성되는, 단리된 항체.
  35. 제1항 내지 제4항 또는 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 36에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호: 37에 제시된 경쇄 서열로 구성되는, 단리된 항체.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 어푸코실화되는, 단리된 항체.
  37. 인간 TREM1 (서열번호: 1)에 결합하는 단리된 항체로서, 상기 항체는 어푸코실화되고, 상기 항체는 서열번호: 17, 13 또는 9에 제시된 VH 서열; 및 서열번호: 20에 제시된 VL 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  38. 제37항에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 17에 제시된 VH 서열 및 서열번호: 20에 제시된 VL 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  39. 제38항에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 34에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호: 35에 제시된 경쇄 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  40. 제37항에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 13에 제시된 VH 서열 및 서열번호: 20에 제시된 VL 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  41. 제40항에 있어서, 상기 항체는 푸코실화되고, 상기 항체는 서열번호: 36에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호: 37에 제시된 경쇄 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  42. 제37항에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 9에 제시된 VH 서열 및 서열번호: 20에 제시된 VL 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  43. 제42항에 있어서, 상기 항체는 푸코실화되고, 상기 항체는 서열번호: 38에 제시된 중쇄 서열 및 서열번호: 39에 제시된 경쇄 서열을 포함하는, 단리된 항체.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간화된, 인간 또는 키메라 항체인, 단리된 항체.
  45. 제44항에 있어서, 상기 항체는 인간화된 항체인, 단리된 항체.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM으로부터 선택되는 클래스의 중쇄 인간 불변 영역을 포함하는, 단리된 항체.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 Fc 영역을 포함하는, 단리된 항체.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 영역은 인간 Fc 영역인, 단리된 항체.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 Fc 영역은 클래스 IgG 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택된 서브클래스의 인간 중쇄 불변 영역을 포함하는, 단리된 항체.
  50. 제49항에 있어서, 상기 인간 Fc 영역은 야생형 인간 IgG1 Fc를 포함하는, 단리된 항체.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 서열번호: 17에 제시된 VH 서열, 및 서열번호: 20에 제시된 VL 서열로 구성되고; 상기 인간 Fc 영역은 야생형 인간 IgG1 Fc를 포함하는, 단리된 항체.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 영역은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 상기 하나 이상의 치환은 하나 이상의 치환이 없는 Fc와 비교하여 증가된 항체 반감기, 증가된 ADCC 활성, 증가된 ADCP 활성 또는 증가된 CDC 활성을 초래하는, 단리된 항체.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 영역은 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIc, FcγRIIIa 및 FcγRIIIb로 구성된 군으로부터 선택되는 Fcγ 수용체에 결합하는, 단리된 항체.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체인, 단리된 항체.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 검정에 의해 측정될 때, 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7x10-9 M 이하의 KD로 인간 TREM1에 결합하는, 단리된 항체.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 검정에 의해 측정될 때 약 7nM 이하의 KD로 인간 TREM1에 결합하는, 단리된 항체.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 작용제 항체인, 단리된 항체.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 이소타입 대조군 항체와 비교하여 세포에서 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인의 증가된 발현을 유도하는, 단리된 항체.
  59. 제58항에 있어서, 상기 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인은 IFN-γ, IL-1α, IL-12, IL-2, TNFSF9, TNFSF10, CXCL9, CXCL10, CCL17, CXCL1, CXCL5, CXCL8, CXCL11, CXCL15, CCL3, CCL4, CCL2, FasL, CD274, CRTAM, 그랜자임 A (GzmA) 또는 그랜자임 B (GzmB)로 구성된 군으로부터 선택되는, 단리된 항체.
  60. 제59항에 있어서, 상기 사이토카인 또는 케모카인은 CXCL10 또는 IFN-γ인, 단리된 항체.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 이소타입 대조군 항체와 비교하여 세포에서 적어도 하나의 골수 공-자극 단백질의 증가된 발현을 유도하는, 단리된 항체.
  62. 제61항에 있어서, 상기 골수 공-자극 단백질은 세포에서 HLA-DR, CD40, CD80, 또는 CD86인, 단리된 항체.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 이소타입 대조군 항체와 비교하여 세포에서 ERK 및/또는 STAT3 세포내 시그널링 경로의 증가된 활성화를 유도하는, 단리된 항체.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 이소타입 대조군 항체와 비교하여 항-종양 메모리 반응을 유도하는, 단리된 항체.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는:
    a. 인간 TREM1에 대한 결합에 대해 인간 TREM-26 항체와 경쟁하거나;
    b. 인간 TREM1에 결합하거나;
    c. 사이노몰구스 TREM1에 결합하거나;
    d. TREM1 시그널링을 자극하거나;
    e. 면역 시그널링 경로를 유도하거나;
    f. 사이토카인 또는 케모카인 분비를 유도하거나;
    g. 공-자극 분자 발현을 유도하거나;
    h. 골수 세포를 사멸하거나, 무력화하거나, 고갈시키거나; 또는
    i. a-h의 임의의 조합이 가능한, 단리된 항체.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 활성을 갖는, 단리된 항체.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 항체-매개된 세포 식세포작용 (ADCP) 활성을 갖는, 단리된 항체.
  68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 보체-의존성 세포독성 (CDC) 활성을 갖는, 단리된 항체.
  69. 제58항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 TREM1+ 세포인, 단리된 항체.
  70. 제69항에 있어서, 상기 TREM1+ 세포는 수지상 세포, 종양 관련 대식세포 (TAM), 골수-유래 억제 세포 (MDSC), 호중구, 및 종양 관련 호중구 (TAN)로 구성된 군으로부터 선택되는, 단리된 항체.
  71. 제70항에 있어서, 상기 TREM1+ 세포는 골수-유래 억제 세포 또는 종양 관련 호중구인, 단리된 항체.
  72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 TREM1+ 세포의 세포 표면 상에서 TREM1을 TREM1에 가교결합시키는, 단리된 항체.
  73. 약제로서 사용하기 위한 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항의 단리된 항체.
  74. 암 또는 감염의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항의 단리된 항체.
  75. 암의 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 단리된 항체로서, 상기 암은 고형 종양 및 액체 종양으로부터 선택되는, 단리된 항체.
  76. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항의 항체, 이의 VH, 이의 VL, 이의 경쇄, 이의 중쇄, 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 세트; 선택적으로 cDNA.
  77. 제76항의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 세트를 포함하는 벡터 또는 벡터의 세트.
  78. 제76항의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 세트 또는 제77항의 벡터 또는 벡터의 세트를 포함하는 숙주 세포.
  79. 제78항의 숙주 세포로 항체를 발현시키는 단계 및 발현된 항체를 단리하는 단계를 포함하는 항체를 생산하는 방법.
  80. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항의 항체 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 약학적 조성물.
  81. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항의 항체 또는 제80항의 약학적 조성물 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
  82. 항-TREM1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 면역 반응을 증가시키는 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 조성물은 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항의 항체 또는 제80항의 약학적 조성물을 포함하는, 방법.
  84. 제82항에 있어서, 상기 항체는 수용체-리간드 차단, 작용제 또는 길항제 활성을 갖는, 방법.
  85. 제84항에 있어서, 상기 항체는 작용제 활성을 갖는, 방법.
  86. 제82항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 이소타입 대조군 항체와 비교하여 세포에서 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인의 증가된 발현을 유도하는, 방법.
  87. 제86항에 있어서, 상기 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인은 IFN-γ, IL-1α, IL-12, IL-2, TNFSF9, TNFSF10, CXCL9, CXCL10, CCL17, CXCL1, CXCL5, CXCL8, CXCL11, CXCL15, CCL3, CCL4, CCL2, FasL, CD274, CRTAM, 그랜자임 A (GzmA) 또는 그랜자임 B (GzmB)로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  88. 제87항에 있어서, 상기 사이토카인 또는 케모카인은 CXCL10 또는 IFN-γ인, 방법.
  89. 제82항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 이소타입 대조군 항체와 비교하여 적어도 하나의 골수 공-자극 단백질의 증가된 발현을 유도하는, 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 골수 공-자극 단백질은 세포에서 HLA-DR, CD40, CD80, 또는 CD86인, 방법.
  91. 제82항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 이소타입 대조군 항체와 비교하여 세포에서 ERK 및/또는 STAT3 세포내 시그널링 경로의 증가된 활성화를 유도하는, 방법.
  92. 제82항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 메모리 면역 반응을 유도하는, 방법.
  93. 제82항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 TREM1+ 세포인, 방법.
  94. 제93항에 있어서, 상기 TREM1+ 세포는 수지상 세포, 종양 관련 대식세포 (TAM), 골수-유래 억제 세포 (MDSC), 호중구, 및 종양 관련 호중구 (TAN)로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  95. 제94항에 있어서, 상기 TREM1+ 세포는 골수-유래 억제 세포 또는 종양 관련 호중구인, 방법.
  96. 제82항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 TREM1+ 세포의 세포 표면 상에서 TREM1을 TREM1에 가교결합시키는, 방법.
  97. 제82항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 방법.
  98. 항-TREM1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  99. 제98항에 있어서, 상기 조성물은 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항의 항체 또는 제80항의 약학적 조성물을 포함하는, 방법.
  100. 제98항에 있어서, 상기 항체는 수용체-리간드 차단, 작용제 또는 길항제 활성을 갖는, 방법.
  101. 제98항에 있어서, 상기 항체는 작용제 활성을 갖는, 방법.
  102. 제98항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 이소타입 대조군 항체와 비교하여 세포에서 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인의 증가된 발현을 유도하는, 방법.
  103. 제102항에 있어서, 상기 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인은 IFN-γ, IL-1α, IL-12, IL-2, TNFSF9, TNFSF10, CXCL9, CXCL10, CCL17, CXCL1, CXCL5, CXCL8, CXCL11, CXCL15, CCL3, CCL4, CCL2, FasL, CD274, CRTAM, 그랜자임 A (GzmA) 또는 그랜자임 B (GzmB)로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  104. 제103항에 있어서, 상기 사이토카인 또는 케모카인은 CXCL10 또는 IFN-γ인, 방법.
  105. 제98항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 이소타입 대조군 항체와 비교하여 적어도 하나의 골수 공-자극 단백질의 증가된 발현을 유도하는, 방법.
  106. 제105항에 있어서, 상기 골수 공-자극 단백질은 세포에서 HLA-DR, CD40, CD80, 또는 CD86인, 방법.
  107. 제98항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 이소타입 대조군 항체와 비교하여 세포에서 ERK 및/또는 STAT3 세포내 시그널링 경로의 증가된 활성화를 유도하는, 방법.
  108. 제98항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 이소타입 대조군 항체와 비교하여 항-종양 메모리 반응을 유도하는, 방법.
  109. 제98항에 있어서, 상기 항체는 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 활성을 갖는, 방법.
  110. 제98항에 있어서, 상기 항체는 보체-의존성 세포독성 (CDC) 활성을 갖는, 방법.
  111. 제98항에 있어서, 상기 항체는 항체-매개된 식균작용 (ADCP) 활성을 갖는, 방법.
  112. 제98항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 TREM1+ 세포인, 방법.
  113. 제112항에 있어서, 상기 TREM1+ 세포는 수지상 세포, 종양 관련 대식세포 (TAM), 골수-유래 억제 세포 (MDSC), 호중구, 및 종양 관련 호중구 (TAN)로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  114. 제113항에 있어서, 상기 TREM1+ 세포는 골수-유래 억제 세포 또는 종양 관련 호중구인, 방법.
  115. 제98항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 TREM1+ 세포의 세포 표면 상에서 TREM1을 TREM1에 가교결합시키는, 방법.
  116. 제98항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 방법.
  117. 제98항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 고형암인, 방법.
  118. 제98항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 액체암인, 방법.
  119. 제98항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 흑색종, 신장암, 간담도암, 두경부 편평 암종 (HNSC), 췌장암, 결장암, 방광암, 요로상피암, 교모세포종, 전립선암, 폐암, 유방암, 난소암, 위암, 식도암, 신장암, 자궁내막암, 자궁경부암, 고환암, 중피종암으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  120. 제119항에 있어서, 상기 암은 위암, 난소암, 결장암 또는 유방암인, 방법.
  121. 제98항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉은 대상체에서 면역 반응을 증진시키는, 방법.
  122. 제121항에 있어서, 상기 증진된 면역 반응은 적응성 면역 반응인, 방법.
  123. 제122항에 있어서, 상기 증진된 면역 반응은 선천적 면역 반응인, 방법.
  124. 제98항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 이전에 면역요법을 받았거나, 동시에 받고 있거나, 후속적으로 받을 것인, 방법.
  125. 제124항에 있어서, 상기 면역요법은 체크포인트 억제제; T 세포의 체크포인트 억제제; 항-PD1 항체; 항-PDL1 항체; 항-CTLA4 항체; 입양 세포 요법; 입양 T 세포 요법; CAR-T 세포 요법; 수지상 세포 백신; STING 작용제; 단핵구 백신; 칼메트-게랭균 백신; T 세포 및 항원 제시 세포 둘 모두에 결합하는 항원 결합 단백질; BiTE 이중 항원 결합 단백질; 톨-유사 수용체 리간드; 사이토카인; 세포독성 요법; 화학요법; 방사선요법; 소분자 억제제; 소분자 작용제; 면역조절제; 종양용해 바이러스; 및 후성유전적 조절인자 중 적어도 하나인, 방법.
  126. 제125항에 있어서, 상기 면역요법은 항-PD1 항체, 항-PDL1 항체; 또는 항-CTLA4 항체로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  127. 골수 세포를 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항의 항체 또는 제80항의 약학적 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 표면 상의 골수 세포 1 상에 발현된 트리거링 수용체 1 (TREM1)을 발현하는 골수 세포를 사멸시키거나, 무력화하거나 또는 고갈시키는 방법.
  128. 제127항에 있어서, 상기 항체는 ADCC, CDC, 및 ADCP 중 적어도 하나에 의해 골수 세포를 사멸시키거나, 무력화하거나 또는 고갈시키고, 선택적으로 상기 항체는 ADCC에 의해 골수 세포를 사멸시키거나, 무력화하거나 또는 고갈시키고, 선택적으로 상기 항체는 CDC에 의해 골수 세포를 사멸시키거나, 무력화하거나 또는 고갈시키고, 그리고 선택적으로 상기 항체는 ADCP에 의해 골수 세포를 사멸시키거나, 무력화하거나 또는 고갈시키는, 방법.
  129. 제127항 또는 제128항에 있어서, 상기 항체는 ADCC, CDC, 및 ADCP 중 적어도 하나에 의해 골수 세포를 사멸시키는, 방법.
  130. 제127항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 ADCC, CDC, 및 ADCP 중 적어도 하나에 의해 골수 세포를 무력화시키는, 방법.
  131. 제127항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 ADCC, CDC, 및 ADCP 중 적어도 하나에 의해 골수 세포를 고갈시키는, 방법.
  132. 제127항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 항체-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 활성을 갖는, 방법.
  133. 제127항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 보체-의존성 세포독성 (CDC) 활성을 갖는, 방법.
  134. 제127항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 항체-매개된 식세포작용 (ADCP) 활성을 갖는, 방법.
  135. 제127항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 수용체-리간드 차단, 작용제 또는 길항제 활성을 갖는, 방법.
  136. 제127항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골수 세포는 자극성 골수 세포인, 방법.
  137. 제127항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골수 세포는 비-자극성 골수 세포인, 방법.
  138. 제127항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골수 세포는 수지상 세포, 종양-관련 대식세포 (TAM), 호중구, 단핵구, 또는 골수-유래 억제 세포 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
  139. 제138항에 있어서, 상기 골수 세포는 호중구 또는 종양 관련 호중구인, 방법.
  140. 제139항에 있어서, 상기 골수 세포는 종양 관련 대식세포인, 방법.
  141. 제138항에 있어서, 상기 골수 세포는 단핵구 골수-유래 억제 세포인, 방법.
  142. 제127항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골수 세포는 종양내인, 방법.
  143. 제127항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골수 세포는 자극성 골수 세포 및 비-자극성 골수 세포를 포함하는 면역 세포의 모집단에 있는, 방법.
  144. 제127항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉은 시험관내 또는 생체내인, 방법.
  145. 제127항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉은 대상체에서 생체내에서 발생하고, 선택적으로 상기 대상체는 암을 갖는, 방법.
  146. 제127항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 방법.
  147. 제127항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 고형암인, 방법.
  148. 제127항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 액체암인, 방법.
  149. 제146항에 있어서, 상기 암은 흑색종, 신장암, 간담도암, 두경부 편평 암종 (HNSC), 췌장암, 결장암, 방광암, 요로상피암, 교모세포종, 전립선암, 폐암, 유방암, 난소암, 위암, 식도암, 신장암, 자궁내막암, 자궁경부암, 고환암, 중피종암으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  150. 제149항에 있어서, 상기 암은 위암, 난소암, 결장암 또는 유방암인, 방법.
  151. 제150항에 있어서, 상기 접촉은 대상체에서 면역 반응을 증진시키는, 방법.
  152. 제151항에 있어서, 상기 증진된 면역 반응은 적응성 면역 반응인, 방법.
  153. 제151항에 있어서, 상기 증진된 면역 반응은 선천성 면역 반응인, 방법.
  154. 제151항에 있어서, 상기 증진된 면역 반응은 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인의 발현을 포함하는, 방법.
  155. 제154항에 있어서, 상기 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인은 IFN-γ, IL-1α, IL-12, IL-2, TNFSF9, TNFSF10, CXCL9, CXCL10, CCL17, CXCL1, CXCL5, CXCL8, CXCL11, CXCL15, CCL3, CCL4, CCL2, FasL, CD274, CRTAM, 그랜자임 A (GzmA) 또는 그랜자임 B (GzmB)로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  156. 제155항에 있어서, 상기 적어도 하나의 사이토카인 또는 케모카인은 CXCL10 또는 IFN-γ인, 방법.
  157. 제127항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 이전에 면역요법을 받았거나, 동시에 받고 있거나, 후속적으로 받을 것인, 방법.
  158. 제157항에 있어서, 상기 면역요법은 체크포인트 억제제; T 세포의 체크포인트 억제제; 항-PD1 항체; 항-PDL1 항체; 항-CTLA4 항체; 입양 세포 요법; 입양 T 세포 요법; CAR-T 세포 요법; 수지상 세포 백신; STING 작용제; 단핵구 백신; 칼메트-게랭균 백신; T 세포 및 항원 제시 세포 둘 모두에 결합하는 항원 결합 단백질; BiTE 이중 항원 결합 단백질; 톨-유사 수용체 리간드; 사이토카인; 세포독성 요법; 화학요법; 방사선요법; 소분자 억제제; 소분자 작용제; 면역조절제; 종양용해 바이러스; 및 후성유전적 조절인자 중 적어도 하나인, 방법.
  159. 제158항에 있어서, 상기 면역요법은 항-PD1 항체, 항-PDL1 항체; 또는 항-CTLA4 항체로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
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