JP7492522B2 - 抗ｔｒｅｍ１抗体及び関連方法 - Google Patents

抗ｔｒｅｍ１抗体及び関連方法 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年２月６日に出願された米国仮特許出願第６２／８０２，１６１号及び２０１９年８月２１日に出願された米国仮出願第６２／８８９，９９４号の利益を主張し、これらは、全体が本明細書で参照により組み込まれる。
配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して送信されている配列表を含有し、全体が本明細書で参照により組み込まれる。２０２０年２月１７日に作成された該ＡＳＣＩＩコピーは、PII-010WO_SL.txtという名称であり、サイズが９２，２５６バイトである。
背景
免疫は、腫瘍増生を防止する役割を果たす。複雑な微小環境が病変内で発生し得、Ｔ細胞の動員にも関わらず、多くの場合、発生する腫瘤の効果的な制御はない。腫瘍排除及び腫瘍エスケープ間のバランスの理解は、骨髄細胞が腫瘍の微小環境で果たす異なる役割の理解に依存し得る。
腫瘍微小環境の骨髄集団は、単球及び好中球（骨髄由来抑制細胞として大まかに分類される場合がある）、マクロファージ、及び樹状細胞を顕著に含む。腫瘍内骨髄集団は、全体として、非刺激性または抑制性であると長らく考えられているが、さらに最近では、全ての腫瘍浸潤性骨髄細胞が機能的に同等になるとは限らないことが認められている。
正常組織では、これらの骨髄細胞の多くは、自然免疫及び獲得免疫の両方が適切に機能するために、特に、傷の修復のために不可欠である。しかし、がんのセッティングでは、かなり過剰なマクロファージならびにこれらの細胞型及び他の細胞型の機能不全の集団または歪んだ集団が一般に説明される。「マクロファージ」浸潤は、ＣＤ６８またはＣＤ１６３などの単一のマーカーにより定義される凝集集団と考えられる時、複数の腫瘍タイプに対する、患者のより悪い転帰と相関する（（ｄｅ Ｖｉｓｓｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２００８；５７：１５３１－９）（非特許文献１）；（Ｈａｎａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｕｒｏｌ ２０００；７：２６３－９）（非特許文献２）；（Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５２０，２００１；７：４０２１－６）（非特許文献３）；（Ｒｕｆｆｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，５２３ ２０１２；１０９：２７９６－８０１）（非特許文献４））。しかし、腫瘍微小環境のマクロファージの表現型及び機能的サブセッティングは、マクロファージ及び樹状細胞の類似性により複雑化され、腫瘍生物学の問題である。形態学的基準が多くの場合、問題に適用されており、樹状細胞をマクロファージと識別しようとする１つのアプローチは、前者の場合、より突起または樹状突起のモルホロジーに基づき、後者の場合、よりベールまたは球根状のモルホロジーに基づいていた（Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ５５５，１９９９；１９０：１４１７－２６（非特許文献５））。他の群は、遺伝的及び細胞表面マーカーに基づいて識別しようとする。
腫瘍内の抗原提示区画には多様性があり、Ｔ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の特徴を識別し得る。Ｔ細胞が腫瘍免疫の主要な駆動体であるので、同種ＡＰＣの正確な特徴を理解することが重要であろう。骨髄細胞は、腫瘍由来抗原をＴ細胞に提示し、それにより、後者を活性化状態に維持することが可能な細胞の中で顕著である。抗原提示は、腫瘍自体内で生じ、腫瘍細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の機能に影響を及ぼす可能性がある。抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＴ細胞の活性化は、抗原特異的な免疫応答及び腫瘍細胞の殺傷における重要な構成成分である。これらの骨髄集団は、後続の腫瘍反応性細胞傷害性Ｔリンパ球に対する主要なＴ細胞相互作用パートナー及び抗原提示細胞を表すので、それらの識別を理解すると、治療方法が導かれ得る。
骨髄細胞上に発現する誘発性受容体１（ＴＲＥＭ１、ＣＤ３５４、ＨＧＮＣ：１７７６０、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：５４２１０、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ９ＮＰ９９としても既知）は、受容体のＩｇスーパーファミリーに属し、好中球、単球、及びマクロファージを含む骨髄細胞のサブセット上に高度に発現する。ＴＲＥＭ１は、シグナル伝達モチーフを欠き、代わりに、受容体の活性化は、アダプターＤＡＰ１２（ＤＮＡＸ活性化タンパク質１２）を介して媒介され、炎症性応答の増幅をもたらす（Ｂｏｕｃｈｏｎ，ｅｔ ａｌ（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（１０）：４９９１－４９９５（非特許文献６））。具体的には、ＴＲＥＭ１の架橋は、ＩＬ－８、ミエロペルオキシダーゼ、ＴＮＦα、及びＭＣＰ－１の発現を誘導する。ＴＲＥＭ１発現は、Ｔｏｌｌ様受容体刺激（細菌及び真菌刺激）に応答して骨髄細胞上で上方制御され、敗血症性ショック及び感染中の急性の炎症性応答の原因となり、それを増幅することが明らかになっている（Ｃｏｈｅｎ，（２００１）Ｌａｎｃｅｔ．３５８：７７６－７７８（非特許文献７））。ＴＲＥＭ１のリガンドは確認されていないままであるが、最近、ＰＧＬＹＲＰ１（ペプチドグリカン認識タンパク質１）がＴＲＥＭ１の強力なリガンドとして同定されている（Ｒｅａｄ ｅｔ ａｌ，（２０１５）Ｊ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９４：１４１７－１４２１（非特許文献８））。マウスには、ＴＲＥＭ１、２、３、４、及び５を含む５つの活性化型ＴＲＥＭ受容体があり、可溶性ＴＲＥＭ１（ｓＴＲＥＭ１）は感染中に放出される。マウスＴＲＥＭ１及びヒトホモログＴＲＥＭ１は、４６％という比較的低い配列同一性を共有する（Ｒａｄａｅｖ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １１：１５２７－１５３５（非特許文献９））。構造上、ＴＲＥＭ１は、約１０８アミノ酸の単一のＶ型免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン（Ｉｇ－Ｖ）、それに続く、７０アミノ酸の茎領域で構成される。ＴＲＥＭ１が敗血症で果たす役割に加えて、ＴＲＥＭ１は、炎症性腸疾患にも関連づけられている。しかし、腫瘍微小環境におけるＴＲＥＭ１の役割についてはほとんど知られていない（Ｓｃｈｅｎｋ，ｅｔ ａｌ（２００７）ＪＣＩ．１１７：３０９７－３１０６（非特許文献１０））。
Ｔ細胞応答の刺激またはそのような細胞の再分極に効果のない細胞の量を選択的に減少させ、それにより、腫瘍微小環境内の免疫応答を増強することを含む、新規のがん治療アプローチに対する満たされていないニーズが存在する。
関連特許出願は、２０１８年８月７日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４５６８０（特許文献１）を含み、これは、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４５６８０
ｄｅ Ｖｉｓｓｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２００８；５７：１５３１－９ Ｈａｎａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｕｒｏｌ ２０００；７：２６３－９ Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，５２０，２００１；７：４０２１－６ Ｒｕｆｆｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，５２３ ２０１２；１０９：２７９６－８０１ Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ５５５，１９９９；１９０：１４１７－２６ Ｂｏｕｃｈｏｎ，ｅｔ ａｌ（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（１０）：４９９１－４９９５ Ｃｏｈｅｎ，（２００１）Ｌａｎｃｅｔ．３５８：７７６－７７８ Ｒｅａｄ ｅｔ ａｌ，（２０１５）Ｊ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９４：１４１７－１４２１ Ｒａｄａｅｖ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １１：１５２７－１５３５ Ｓｃｈｅｎｋ，ｅｔ ａｌ（２００７）ＪＣＩ．１１７：３０９７－３１０６
概要
一態様では、ヒトＴＲＥＭ１（配列番号１）に結合する単離抗体が本明細書で提供され、抗体は、ｉ）ヒトＴＲＥＭ１（配列番号１）の残基２１～３４（配列番号４２）、１０３～１０９（配列番号４３）、及び１２８～１３６（配列番号４４）内で結合し、ヒトＦｃ領域を含む。
一態様では、ヒトＴＲＥＭ１（配列番号１）に結合する単離ヒト化抗体が本明細書で提供され、抗体は、ｉ）ヒトＴＲＥＭ１（配列番号１）の残基２１～３４（配列番号４２）、１０３～１０９（配列番号４３）、及び１２８～１３６（配列番号４４）内で結合し、ｉｉ）任意にヒトＦｃ領域を含む。
一態様では、ヒトＴＲＥＭ１（配列番号１）に結合する単離抗体（複数可）が本明細書で提供され、単離抗体は、３つの重鎖ＣＤＲ配列、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３を含む可変重（ＶＨ）鎖配列、ならびに、３つの軽鎖ＣＤＲ配列、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号２３に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号２４に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号２９に記載の配列を含み、Ｘは、ロイシン（Ｌ）、グルタミン（Ｑ）、メチオニン（Ｍ）、イソロイシン（Ｉ）、またはグルタミン酸（Ｅ）であり、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号２６に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号２７に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号２８に記載の配列を含む。一態様では、ヒトＴＲＥＭ１（配列番号１）に結合する単離抗体（複数可）が本明細書で提供され、単離抗体は、３つの重鎖ＣＤＲ配列、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含む重鎖、ならびに、３つの軽鎖ＣＤＲ配列、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含む軽鎖を含み、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号２３に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号２４に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号２９に記載の配列を含み、Ｘは、ロイシン（Ｌ）、グルタミン（Ｑ）、メチオニン（Ｍ）、イソロイシン（Ｉ）、またはグルタミン酸（Ｅ）であり、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号２６に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号２７に記載の配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号２８に記載の配列を含む。
一部の実施形態では、抗体は、配列ＲＸＡＡＭＤＹ（配列番号２９）を含むＣＤＲ－Ｈ３を含み、Ｘは、ロイシン（Ｌ）、グルタミン（Ｑ）、メチオニン（Ｍ）、イソロイシン（Ｉ）、またはグルタミン酸（Ｅ）である。一部の実施形態では、抗体は、配列番号２３に記載の配列を含むＣＤＲ－Ｈ１及び配列番号２４に記載の配列を含むＣＤＲ－Ｈ２をさらに含む。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号３３に記載の配列を含み、抗体は、配列番号２３に記載の配列を含むＣＤＲ－Ｈ１及び配列番号２４に記載の配列を含むＣＤＲ－Ｈ２をさらに含む。
一部の実施形態では、抗体は、配列番号２６に記載の配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２７に記載の配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２８に記載の配列を含むＣＤＲ－Ｌ３をさらに含む。
一部の実施形態では、抗体は、配列番号１６、１７、または１８に記載の配列から選択されるＶＨ配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号１７に記載のＶＨ配列を含む。
一部の実施形態では、抗体は、配列番号２０、２１、または２２に記載の配列から選択されるＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号２０に記載のＶＬ配列を含む。
一部の実施形態では、抗体は、配列番号１７に記載のＶＨ配列及び配列番号２０に記載のＶＬ配列を含む。
一部の実施形態では、抗体は、ｓｃＦｖである。一部の実施形態では、抗体は、ｓｃＦｖであり、且つ配列番号１７に記載のＶＨ配列及び配列番号２０に記載のＶＬ配列を含む。
一部の実施形態では、抗体は、ｓｃＦｖであり、且つ配列番号１６、１７、または１８に記載の配列から選択されるＶＨ配列及び配列番号２０、２１、または２２に記載の配列から選択されるＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号１７に記載のＶＨ配列及び配列番号２０に記載のＶＬ配列を含み、ヒトＦｃ領域は、野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃを含む。
一部の実施形態では、抗体は、配列番号３４に記載の重鎖配列及び配列番号３５に記載の軽鎖配列を含む。
一部の実施形態では、抗体は、配列番号４、５、または６に記載の配列から選択されるＶＨ配列を含む。
一部の実施形態では、抗体は、配列番号２０、２１、または２２に記載の配列から選択されるＶＬ配列を含む。
一部の実施形態では、抗体は、配列番号８、９、または１０に記載の配列から選択されるＶＨ配列を含む。
一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号３２に記載の配列含み、抗体は、配列番号２３に記載の配列を含むＣＤＲ－Ｈ１及び配列番号２４に記載の配列を含むＣＤＲ－Ｈ２をさらに含む。
一部の実施形態では、抗体は、配列番号１２、１３、または１４に記載の配列から選択されるＶＨ配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号１３に記載のＶＨ配列を含む。
一部の実施形態では、抗体は、配列番号２０、２１、または２２に記載の配列から選択されるＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号２０に記載のＶＬ配列を含む。
一部の実施形態では、抗体は、配列番号１３に記載のＶＨ配列及び配列番号２０に記載のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、ｓｃＦｖであり、配列番号１３に記載のＶＨ配列及び配列番号２０に記載のＶＬ配列を含む。
一部の実施形態では、抗体は、ｓｃＦｖであり、且つ配列番号１１２、１３、または１４に記載の配列から選択されるＶＨ配列及び配列番号２０、２１、または２２に記載の配列から選択されるＶＬ配列を含む。
一部の実施形態では、抗体は、配列番号１３に記載のＶＨ配列及び配列番号２０に記載のＶＬ配列を含み、ヒトＦｃ領域は、野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃを含む。
一部の実施形態では、抗体は、配列番号３６に記載の重鎖配列及び配列番号３７に記載の軽鎖配列を含む。
一部の実施形態では、抗体は、配列番号１７、１３、または９に記載のＶＨ配列、及び配列番号２０に記載のＶＬ配列からなる。一部の実施形態では、抗体は、配列番号１７に記載のＶＨ配列、及び配列番号２０に記載のＶＬ配列からなる。一部の実施形態では、抗体は、配列番号１３に記載のＶＨ配列、及び配列番号２０に記載のＶＬ配列からなる。一部の実施形態では、抗体は、配列番号９に記載のＶＨ配列及び配列番号２０に記載のＶＬ配列からなる。
一部の実施形態では、抗体は、配列番号３４に記載の重鎖配列及び配列番号３５に記載の軽鎖配列からなる。
一部の実施形態では、抗体は、配列番号３６に記載の重鎖配列及び配列番号３７に記載の軽鎖配列からなる。
一部の実施形態では、抗体は、アフコシル化されている。
別の態様では、ヒトＴＲＥＭ１（配列番号１）に結合する単離抗体が本明細書で提供され、抗体は、アフコシル化されており、抗体は、配列番号１７、１３、または９に記載のＶＨ配列、及び配列番号２０に記載のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号１７に記載のＶＨ配列及び配列番号２０に記載のＶＬ配列を含む。
一部の実施形態では、抗体は、配列番号３４に記載の重鎖配列及び配列番号３５に記載の軽鎖配列を含む。
一部の実施形態では、抗体は、配列番号１３に記載のＶＨ配列及び配列番号２０に記載のＶＬ配列を含む。
一部の実施形態では、抗体は、アフコシル化されており、抗体は、配列番号３６に記載の重鎖配列及び配列番号３７に記載の軽鎖配列を含む。
一部の実施形態では、抗体は、配列番号９に記載のＶＨ配列及び配列番号２０に記載のＶＬ配列を含む。
一部の実施形態では、抗体は、アフコシル化されており、抗体は、配列番号３８に記載の重鎖配列及び配列番号３９に記載の軽鎖配列を含む。
一部の実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、ヒト抗体、またはキメラ抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びＩｇＭから選択されるクラスの重鎖ヒト定常領域を含む。一部の実施形態では、抗体は、Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域である。一部の実施形態では、ヒトＦｃ領域は、クラスＩｇＧの、且つＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４から選択されるサブクラスの、ヒト重鎖定常領域を含む。一部の実施形態では、ヒトＦｃ領域は、野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃを含む。
一部の実施形態では、抗体は、配列番号１７に記載のＶＨ配列及び配列番号２０に記載のＶＬ配列からなり、ヒトＦｃ領域は、野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃを含む。
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、１つ以上のアミノ酸置換を含み、１つ以上の置換は、１つ以上の置換のないＦｃと比較して、抗体半減期の増加、ＡＤＣＣ活性の増加、ＡＤＣＰ活性の増加、またはＣＤＣ活性の増加をもたらす。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、及びＦｃγＲＩＩＩｂからなる群より選択されるＦｃγ受容体と結合する。
一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。
一部の実施形態では、抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイで測定した際に、約０．５、１、２、３、４、５、６、または７×１０－９Ｍまたはそれ以下のＫＤでヒトＴＲＥＭ１に結合する。一部の実施形態では、抗体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイで測定した際に、約７ｎＭまたはそれ以下のＫＤでヒトＴＲＥＭ１に結合する。
一部の実施形態では、抗体は、アゴニスト抗体である。
一部の実施形態では、抗体は、アイソタイプ対照抗体と比較して、細胞における少なくとも１つのサイトカインまたはケモカインの発現の増加を誘導する。
一部の実施形態では、少なくとも１つのサイトカインまたはケモカインは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＴＮＦＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１５、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２、ＦａｓＬ、ＣＤ２７４、ＣＲＴＡＭ、グランザイムＡ（ＧｚｍＡ）、またはグランザイムＢ（ＧｚｍＢ）からなる群より選択される。一部の実施形態では、サイトカインまたはケモカインは、ＣＸＣＬ１０またはＩＦＮ－γである。
一部の実施形態では、抗体は、アイソタイプ対照抗体と比較して、細胞における少なくとも１つの骨髄性共刺激タンパク質の発現の増加を誘導する。
一部の実施形態では、骨髄性共刺激タンパク質は、細胞におけるＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、またはＣＤ８６である。
一部の実施形態では、抗体は、アイソタイプ対照抗体と比較して、細胞におけるＥＲＫ及び／またはＳＴＡＴ３細胞内シグナル伝達経路の活性化の増加を誘導する。
一部の実施形態では、抗体は、アイソタイプ対照抗体と比較して、抗腫瘍記憶応答を誘導する。
一部の実施形態では、抗体は、ヒトＴＲＥＭ１への結合について、ヒトＴＲＥＭ－２６抗体と競合する、ヒトＴＲＥＭ１に結合する、カニクイザルＴＲＥＭ１に結合する、ＴＲＥＭ１シグナル伝達を刺激する、免疫シグナル伝達経路を誘導する、サイトカインもしくはケモカインの分泌を誘導する、共刺激分子の発現を誘導する、骨髄細胞を殺傷する、無効化する、もしくは枯渇させる、またはａ～ｈの任意の組み合わせの能力がある。
一部の実施形態では、抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する。一部の実施形態では、抗体は、抗体媒介性貪食（ＡＤＣＰ）活性を有する。一部の実施形態では、抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する。
一部の実施形態では、細胞は、ＴＲＥＭ１＋細胞である。
一部の実施形態では、ＴＲＥＭ１＋細胞は、樹状細胞、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）、好中球、及び腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＴＲＥＭ１＋細胞は、骨髄由来抑制細胞または腫瘍関連好中球である。
一部の実施形態では、抗体は、ＴＲＥＭ１＋細胞の細胞表面上でＴＲＥＭ１をＴＲＥＭ１に架橋する。
一部の実施形態では、単離抗体は、医薬として使用するためのものである。一部の実施形態では、単離抗体は、がんまたは感染症の処置に使用するためのものである。一部の実施形態では、単離抗体は、がんの処置に使用するためのものであり、がんは、固形腫瘍及び液体腫瘍から選択される。
別の態様では、本明細書に記載の抗体、そのＶＨ、そのＶＬ、その軽鎖、その重鎖、またはその抗原結合部分、任意にｃＤＮＡをコードする、単離ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットが本明細書で提供される。
別の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットを含むベクターまたはベクターのセットが本明細書で提供される。
別の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセットまたはベクターもしくはベクターのセットを含む宿主細胞が本明細書で提供される。
別の態様では、宿主細胞で抗体を発現させること、及び発現された抗体を単離することを含む、抗体を産生する方法が本明細書で提供される。
別の態様では、本明細書に記載の抗体及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が本明細書で提供される。
別の態様では、本明細書に記載の抗体または医薬組成物、及び使用説明書を含むキットが本明細書で提供される。
別の態様では、抗ＴＲＥＭ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物を対象に投与することを含む、免疫応答を増加させる方法が本明細書で提供される。
一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載の抗体または医薬組成物を含む。
一部の実施形態では、抗体は、受容体－リガンド遮断活性、アゴニスト活性、またはアンタゴニスト活性を有する。
一部の実施形態では、抗体は、アゴニスト活性を有する。
一部の実施形態では、抗体は、アイソタイプ対照抗体と比較して、細胞における少なくとも１つのサイトカインまたはケモカインの発現の増加を誘導する。
一部の実施形態では、少なくとも１つのサイトカインまたはケモカインは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＴＮＦＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１５、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２、ＦａｓＬ、ＣＤ２７４、ＣＲＴＡＭ、グランザイムＡ（ＧｚｍＡ）、またはグランザイムＢ（ＧｚｍＢ）からなる群から選択される。
一部の実施形態では、サイトカインまたはケモカインは、ＣＸＣＬ１０またはＩＦＮ－γである。
一部の実施形態では、抗体は、アイソタイプ対照抗体と比較して、少なくとも１つの骨髄性共刺激タンパク質の発現の増加を誘導する。
一部の実施形態では、骨髄性共刺激タンパク質は、細胞におけるＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、またはＣＤ８６である。
一部の実施形態では、抗体は、アイソタイプ対照抗体と比較して、細胞におけるＥＲＫ及び／またはＳＴＡＴ３細胞内シグナル伝達経路の活性化の増加を誘導する。
一部の実施形態では、抗体は、記憶免疫応答を誘導する。
一部の実施形態では、細胞は、ＴＲＥＭ１＋細胞である。
一部の実施形態では、ＴＲＥＭ１＋細胞は、樹状細胞、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）、好中球、及び腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）からなる群から選択される。
一部の実施形態では、ＴＲＥＭ１＋細胞は、骨髄由来抑制細胞または腫瘍関連好中球である。
一部の実施形態では、抗体は、ＴＲＥＭ１＋細胞の細胞表面上でＴＲＥＭ１をＴＲＥＭ１に架橋する。
一部の実施形態では、対象は、ヒトである。
別の態様では、抗ＴＲＥＭ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物を対象に投与することを含む、がんを処置する方法が本明細書で提供される。
一部の実施形態では、組成物は、本明細書で記載の抗体または医薬組成物を含む。
一部の実施形態では、抗体は、受容体－リガンド遮断活性、アゴニスト活性、またはアンタゴニスト活性を有する。
一部の実施形態では、抗体は、アゴニスト活性を有する。
一部の実施形態では、抗体は、アイソタイプ対照抗体と比較して、細胞における少なくとも１つのサイトカインまたはケモカインの発現の増加を誘導する。
一部の実施形態では、少なくとも１つのサイトカインまたはケモカインは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＴＮＦＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１５、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２、ＦａｓＬ、ＣＤ２７４、ＣＲＴＡＭ、グランザイムＡ（ＧｚｍＡ）、またはグランザイムＢ（ＧｚｍＢ）からなる群から選択される。
一部の実施形態では、サイトカインまたはケモカインは、ＣＸＣＬ１０またはＩＦＮ－γである。
一部の実施形態では、抗体は、アイソタイプ対照抗体と比較して、少なくとも１つの骨髄性共刺激タンパク質の発現の増加を誘導する。
一部の実施形態では、骨髄性共刺激タンパク質は、細胞におけるＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、またはＣＤ８６である。
一部の実施形態では、抗体は、アイソタイプ対照抗体と比較して、細胞におけるＥＲＫ及び／またはＳＴＡＴ３細胞内シグナル伝達経路の活性化の増加を誘導する。
一部の実施形態では、抗体は、アイソタイプ対照抗体と比較して、抗腫瘍記憶応答を誘導する。
一部の実施形態では、抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する。
一部の実施形態では、抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する。
一部の実施形態では、抗体は、抗体媒介性貪食（ＡＤＣＰ）活性を有する。
一部の実施形態では、細胞は、ＴＲＥＭ１＋細胞である。
一部の実施形態では、ＴＲＥＭ１＋細胞は、樹状細胞、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）、好中球、及び腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）からなる群から選択される。
一部の実施形態では、ＴＲＥＭ１＋細胞は、骨髄由来抑制細胞または腫瘍関連好中球である。
一部の実施形態では、抗体は、ＴＲＥＭ１＋細胞の細胞表面上でＴＲＥＭ１をＴＲＥＭ１に架橋する。
一部の実施形態では、対象は、ヒトである。
一部の実施形態では、がんは、固形がんである。
一部の実施形態では、がんは、液体がんである。
一部の実施形態では、がんは、黒色腫、腎臓癌、肝胆道癌、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）、膵臓癌、結腸癌、膀胱癌、尿路上皮癌、膠芽腫、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、食道癌、腎臓癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、精巣癌、及び中皮腫からなる群より選択される。
一部の実施形態では、がんは、胃癌、卵巣癌、結腸癌、または乳癌である。
一部の実施形態では、接触は、対象の免疫応答を増強する。
一部の実施形態では、増強された免疫応答は、適応免疫応答である。
一部の実施形態では、増強された免疫応答は、自然免疫応答である。
一部の実施形態では、対象は、免疫療法を以前に受けたことがあるか、同時に受けているか、または後に受けることになる。
一部の実施形態では、免疫療法は、チェックポイント阻害薬；Ｔ細胞のチェックポイント阻害薬；抗ＰＤ１抗体；抗ＰＤＬ１抗体；抗ＣＴＬＡ４抗体；養子細胞療法；養子Ｔ細胞療法；ＣＡＲ－Ｔ細胞療法；樹状細胞ワクチン；ＳＴＩＮＧアゴニスト；単球ワクチン；カルメット－ゲラン菌ワクチン；Ｔ細胞及び抗原提示細胞の両方に結合する抗原結合タンパク質；ＢｉＴＥ二重抗原結合タンパク質；Ｔｏｌｌ様受容体リガンド；サイトカイン；細胞傷害療法；化学療法；放射線療法；小分子阻害薬；小分子アゴニスト；免疫調節薬；腫瘍溶解性ウイルス；ならびにエピジェネティック調節薬のうちの少なくとも１つである。
一部の実施形態では、免疫療法は、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、または抗ＣＴＬＡ４抗体からなる群から選択される。
別の態様では、骨髄細胞を本明細書に記載の抗体または医薬組成物と接触させることを含む、細胞表面上に、骨髄細胞上に発現する誘発性受容体１（ＴＲＥＭ１）を発現する骨髄細胞を殺傷する、無効化する、または枯渇させる方法が本明細書で提供される。
一部の実施形態では、抗体は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、及びＡＤＣＰのうちの少なくとも１つで骨髄細胞を殺傷し、無効化し、または枯渇させ、任意に、抗体は、ＡＤＣＣで骨髄細胞を殺傷し、無効化し、または枯渇させ、任意に、抗体は、ＣＤＣで骨髄細胞を殺傷し、無効化し、または枯渇させ、任意に、抗体は、ＡＤＣＰで骨髄細胞を殺傷し、無効化し、または枯渇させる。
一部の実施形態では、抗体は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、及びＡＤＣＰのうちの少なくとも１つで骨髄細胞を殺傷する。
一部の実施形態では、抗体は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、及びＡＤＣＰのうちの少なくとも１つで骨髄細胞を無効化する。
一部の実施形態では、抗体は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、及びＡＤＣＰのうちの少なくとも１つで骨髄細胞を枯渇させる。
一部の実施形態では、抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する。
一部の実施形態では、抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する。
一部の実施形態では、抗体は、抗体媒介性貪食（ＡＤＣＰ）活性を有する。
一部の実施形態では、抗体は、受容体－リガンド遮断活性、アゴニスト活性、またはアンタゴニスト活性を有する。
一部の実施形態では、骨髄細胞は、刺激性骨髄細胞である。
一部の実施形態では、骨髄細胞は、非刺激性骨髄細胞である。
一部の実施形態では、骨髄細胞は、樹状細胞、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、好中球、単球、または骨髄由来抑制細胞のうちの少なくとも１つを含む。
一部の実施形態では、骨髄細胞は、好中球または腫瘍関連好中球である。
一部の実施形態では、骨髄細胞は、腫瘍関連マクロファージである。
一部の実施形態では、骨髄細胞は、単球性骨髄由来抑制細胞である。
一部の実施形態では、骨髄細胞は、腫瘍内である。
一部の実施形態では、骨髄細胞は、刺激性骨髄細胞及び非刺激性骨髄細胞を含む免疫細胞の集団中にある。
一部の実施形態では、接触は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏである。
一部の実施形態では、接触は、対象においてｉｎ ｖｉｖｏで生じ、任意に、対象はがんを有する。
一部の実施形態では、対象は、ヒトである。
一部の実施形態では、がんは、固形がんである。
一部の実施形態では、がんは、液体がんである。
一部の実施形態では、がんは、黒色腫、腎臓癌、肝胆道癌、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）、膵臓癌、結腸癌、膀胱癌、尿路上皮癌、膠芽腫、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、食道癌、腎臓癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、精巣癌、及び中皮腫からなる群より選択される。
一部の実施形態では、がんは、胃癌、卵巣癌、結腸癌、または乳癌である。
一部の実施形態では、接触は、対象の免疫応答を増強する。
一部の実施形態では、増強された免疫応答は、適応免疫応答である。
一部の実施形態では、増強された免疫応答は、自然免疫応答である。
一部の実施形態では、増強された免疫応答は、少なくとも１つのサイトカインまたはケモカインの発現を含む。
一部の実施形態では、少なくとも１つのサイトカインまたはケモカインは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＴＮＦＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１５、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２、ＦａｓＬ、ＣＤ２７４、ＣＲＴＡＭ、グランザイムＡ（ＧｚｍＡ）、またはグランザイムＢ（ＧｚｍＢ）からなる群から選択される。
一部の実施形態では、少なくとも１つのサイトカインまたはケモカインは、ＣＸＣＬ１０またはＩＦＮ－γである。
一部の実施形態では、対象は、免疫療法を以前に受けたことがあるか、同時に受けているか、または後に受けることになる。
一部の実施形態では、免疫療法は、チェックポイント阻害薬；Ｔ細胞のチェックポイント阻害薬；抗ＰＤ１抗体；抗ＰＤＬ１抗体；抗ＣＴＬＡ４抗体；養子細胞療法；養子Ｔ細胞療法；ＣＡＲ－Ｔ細胞療法；樹状細胞ワクチン；ＳＴＩＮＧアゴニスト；単球ワクチン；カルメット－ゲラン菌ワクチン；Ｔ細胞及び抗原提示細胞の両方に結合する抗原結合タンパク質；ＢｉＴＥ二重抗原結合タンパク質；Ｔｏｌｌ様受容体リガンド；サイトカイン；細胞傷害療法；化学療法；放射線療法；小分子阻害薬；小分子アゴニスト；免疫調節薬；腫瘍溶解性ウイルス；ならびにエピジェネティック調節薬のうちの少なくとも１つである。
一部の実施形態では、免疫療法は、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、または抗ＣＴＬＡ４抗体からなる群から選択される。
[本発明1001]
ヒトＴＲＥＭ1（配列番号1）に結合する単離抗体であって、前記抗体が、
ｉ）ヒトＴＲＥＭ1（配列番号1）の残基21～34（配列番号42）、103～109（配列番号43）、及び128～136（配列番号44）内で結合し、
ｉｉ）任意に、ヒトＦｃ領域を含む、
前記単離抗体。
[本発明1002]
ヒトＴＲＥＭ1（配列番号1）に結合する単離抗体であって、3つの重鎖ＣＤＲ配列であるＣＤＲ－Ｈ1、ＣＤＲ－Ｈ2、及びＣＤＲ－Ｈ3を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含む重鎖、ならびに3つの軽鎖ＣＤＲ配列であるＣＤＲ－Ｌ1、ＣＤＲ－Ｌ2、及びＣＤＲ－Ｌ3を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含む軽鎖を含み、
ａ．ＣＤＲ－Ｈ1が、配列番号23に記載の配列を含み、
ｂ．ＣＤＲ－Ｈ2が、配列番号24に記載の配列を含み、
ｃ．ＣＤＲ－Ｈ3が、配列番号29に記載の配列を含み、Ｘが、ロイシン（Ｌ）、グルタミン（Ｑ）、メチオニン（Ｍ）、イソロイシン（Ｉ）、またはグルタミン酸（Ｅ）であり、
ｄ．ＣＤＲ－Ｌ1が、配列番号26に記載の配列を含み、
ｅ．ＣＤＲ－Ｌ2が、配列番号27に記載の配列を含み、
ｆ．ＣＤＲ－Ｌ3が、配列番号28に記載の配列を含む、
前記単離抗体。
[本発明1003]
前記抗体が、配列ＲＸＡＡＭＤＹ（配列番号29）を含むＣＤＲ－Ｈ3を含み、Ｘが、ロイシン（Ｌ）、グルタミン（Ｑ）、メチオニン（Ｍ）、イソロイシン（Ｉ）、またはグルタミン酸（Ｅ）である、本発明1001の単離抗体。
[本発明1004]
配列番号23に記載の配列を含むＣＤＲ－Ｈ1及び配列番号24に記載の配列を含むＣＤＲ－Ｈ2をさらに含む、本発明1001または1003の単離抗体。
[本発明1005]
前記ＣＤＲ－Ｈ3が、配列番号33に記載の配列を含み、前記抗体が、配列番号23に記載の配列を含むＣＤＲ－Ｈ1及び配列番号24に記載の配列を含むＣＤＲ－Ｈ2をさらに含む、先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1006]
配列番号26に記載の配列を含むＣＤＲ－Ｌ1、配列番号27に記載の配列を含むＣＤＲ－Ｌ2、及び配列番号28に記載の配列を含むＣＤＲ－Ｌ3をさらに含む、先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1007]
配列番号16、17、または18に記載の配列から選択されるＶＨ配列を含む、先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1008]
配列番号17に記載のＶＨ配列を含む、本発明1007の単離抗体。
[本発明1009]
配列番号20、21、または22に記載の配列から選択されるＶＬ配列を含む、先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1010]
配列番号20に記載のＶＬ配列を含む、先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1011]
配列番号17に記載のＶＨ配列及び配列番号20に記載のＶＬ配列を含む、先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1012]
ｓｃＦｖである、先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1013]
ｓｃＦｖであり、且つ配列番号17に記載のＶＨ配列及び配列番号20に記載のＶＬ配列を含む、本発明1001～1011のいずれかの単離抗体。
[本発明1014]
ｓｃＦｖであり、且つ配列番号16、17、または18に記載の配列から選択されるＶＨ配列及び配列番号20、21、または22に記載の配列から選択されるＶＬ配列を含む、本発明1001～1011のいずれかの単離抗体。
[本発明1015]
前記抗体が、配列番号17に記載のＶＨ配列及び配列番号20に記載のＶＬ配列を含み、前記ヒトＦｃ領域が、野生型ヒトＩｇＧ1 Ｆｃを含む、本発明1001～1011のいずれかの単離抗体。
[本発明1016]
配列番号34に記載の重鎖配列及び配列番号35に記載の軽鎖配列を含む、本発明1001～1011または1015のいずれかの単離抗体。
[本発明1017]
配列番号4、5、または6に記載の配列から選択されるＶＨ配列を含む、本発明1002の単離抗体。
[本発明1018]
配列番号20、21、または22に記載の配列から選択されるＶＬ配列を含む、本発明1017の単離抗体。
[本発明1019]
配列番号8、9、または10に記載の配列から選択されるＶＨ配列を含む、本発明1017または1018の単離抗体。
[本発明1020]
前記ＣＤＲ－Ｈ3が、配列番号32に記載の配列を含み、前記抗体が、配列番号23に記載の配列を含むＣＤＲ－Ｈ1及び配列番号24に記載の配列を含むＣＤＲ－Ｈ2をさらに含む、本発明1002の単離抗体。
[本発明1021]
配列番号12、13、または14に記載の配列から選択されるＶＨ配列を含む、本発明1020の単離抗体。
[本発明1022]
配列番号13に記載のＶＨ配列を含む、本発明1021の単離抗体。
[本発明1023]
配列番号20、21、または22に記載の配列から選択されるＶＬ配列を含む、本発明1020～1022のいずれかの単離抗体。
[本発明1024]
配列番号20に記載のＶＬ配列を含む、本発明1023の単離抗体。
[本発明1025]
配列番号13に記載のＶＨ配列及び配列番号20に記載のＶＬ配列を含む、本発明1001～1024のいずれかの単離抗体。
[本発明1026]
ｓｃＦｖであり、且つ配列番号13に記載のＶＨ配列及び配列番号20に記載のＶＬ配列を含む、本発明1020～1025のいずれかの単離抗体。
[本発明1027]
ｓｃＦｖであり、且つ配列番号112、13、または14に記載の配列から選択されるＶＨ配列及び配列番号20、21、または22に記載の配列から選択されるＶＬ配列を含む、本発明1001～1011のいずれかの単離抗体。
[本発明1028]
前記抗体が、配列番号13に記載のＶＨ配列及び配列番号20に記載のＶＬ配列を含み、前記ヒトＦｃ領域が、野生型ヒトＩｇＧ1 Ｆｃを含む、本発明1020～1025のいずれかの単離抗体。
[本発明1029]
配列番号36に記載の重鎖配列及び配列番号37に記載の軽鎖配列を含む、本発明1020～1028のいずれかの単離抗体。
[本発明1030]
配列番号17、13、または9に記載のＶＨ配列及び配列番号20に記載のＶＬ配列からなる、本発明1001～1004または1006のいずれかの単離抗体。
[本発明1031]
配列番号17に記載のＶＨ配列及び配列番号20に記載のＶＬ配列からなる、本発明1001～1006のいずれかの単離抗体。
[本発明1032]
配列番号13に記載のＶＨ配列及び配列番号20に記載のＶＬ配列からなる、本発明1001～1004または1006のいずれかの単離抗体。
[本発明1033]
配列番号9に記載のＶＨ配列及び配列番号20に記載のＶＬ配列からなる、本発明1001～1004または1006のいずれかの単離抗体。
[本発明1034]
配列番号34に記載の重鎖配列及び配列番号35に記載の軽鎖配列からなる、本発明1001～1006のいずれかの単離抗体。
[本発明1035]
配列番号36に記載の重鎖配列及び配列番号37に記載の軽鎖配列からなる、本発明1001～1004または1006のいずれかの単離抗体。
[本発明1036]
アフコシル化されている、先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1037]
ヒトＴＲＥＭ1（配列番号1）に結合する単離抗体であって、アフコシル化されており、且つ配列番号17、13、または9に記載のＶＨ配列及び配列番号20に記載のＶＬ配列を含む、前記単離抗体。
[本発明1038]
配列番号17に記載のＶＨ配列及び配列番号20に記載のＶＬ配列を含む、本発明1037の単離抗体。
[本発明1039]
配列番号34に記載の重鎖配列及び配列番号35に記載の軽鎖配列を含む、本発明1038の単離抗体。
[本発明1040]
配列番号13に記載のＶＨ配列及び配列番号20に記載のＶＬ配列を含む、本発明1037の単離抗体。
[本発明1041]
アフコシル化されており、且つ配列番号36に記載の重鎖配列及び配列番号37に記載の軽鎖配列を含む、本発明1040の単離抗体。
[本発明1042]
配列番号9に記載のＶＨ配列及び配列番号20に記載のＶＬ配列を含む、本発明1037の単離抗体。
[本発明1043]
アフコシル化されており、且つ配列番号38に記載の重鎖配列及び配列番号39に記載の軽鎖配列を含む、本発明1042の単離抗体。
[本発明1044]
ヒト化抗体、ヒト抗体、またはキメラ抗体である、先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1045]
ヒト化抗体である、本発明1044の単離抗体。
[本発明1046]
ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びＩｇＭから選択されるクラスの重鎖ヒト定常領域を含む、先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1047]
Ｆｃ領域を含む、先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1048]
前記Ｆｃ領域が、ヒトＦｃ領域である、先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1049]
前記ヒトＦｃ領域が、クラスＩｇＧの、且つＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、及びＩｇＧ4から選択されるサブクラスの、ヒト重鎖定常領域を含む、先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1050]
前記ヒトＦｃ領域が、野生型ヒトＩｇＧ1 Ｆｃを含む、本発明1049の単離抗体。
[本発明1051]
前記抗体が、配列番号17に記載のＶＨ配列及び配列番号20に記載のＶＬ配列からなり、前記ヒトＦｃ領域が、野生型ヒトＩｇＧ1 Ｆｃを含む、先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1052]
前記Ｆｃ領域が、1つ以上のアミノ酸置換を含み、前記1つ以上の置換が、前記1つ以上の置換のないＦｃと比較して、抗体半減期の増加、ＡＤＣＣ活性の増加、ＡＤＣＰ活性の増加、またはＣＤＣ活性の増加をもたらす、先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1053]
前記Ｆｃ領域が、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａ、及びＦｃγＲＩＩＩｂからなる群より選択されるＦｃγ受容体と結合する、先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1054]
モノクローナル抗体である、先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1055]
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイで測定した際に、約0．5、1、2、3、4、5、6、または7×10 －9 Ｍまたはそれ以下のＫ Ｄ でヒトＴＲＥＭ1に結合する、先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1056]
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイで測定した際に、約7ｎＭまたはそれ以下のＫ Ｄ でヒトＴＲＥＭ1に結合する、先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1057]
アゴニスト抗体である、先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1058]
アイソタイプ対照抗体と比較して、細胞における少なくとも1つのサイトカインまたはケモカインの発現の増加を誘導する、先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1059]
前記少なくとも1つのサイトカインまたはケモカインが、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－1α、ＩＬ－12、ＩＬ－2、ＴＮＦＳＦ9、ＴＮＦＳＦ10、ＣＸＣＬ9、ＣＸＣＬ10、ＣＣＬ17、ＣＸＣＬ1、ＣＸＣＬ5、ＣＸＣＬ8、ＣＸＣＬ11、ＣＸＣＬ15、ＣＣＬ3、ＣＣＬ4、ＣＣＬ2、ＦａｓＬ、ＣＤ274、ＣＲＴＡＭ、グランザイムＡ（ＧｚｍＡ）、またはグランザイムＢ（ＧｚｍＢ）からなる群より選択される、本発明1058の単離抗体。
[本発明1060]
前記サイトカインまたはケモカインが、ＣＸＣＬ10またはＩＦＮ－γである、本発明1059の単離抗体。
[本発明1061]
アイソタイプ対照抗体と比較して、細胞における少なくとも1つの骨髄共刺激タンパク質の発現の増加を誘導する、先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1062]
前記骨髄共刺激タンパク質が、細胞におけるＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ40、ＣＤ80、またはＣＤ86である、本発明1061の単離抗体。
[本発明1063]
アイソタイプ対照抗体と比較して、細胞におけるＥＲＫ及び／またはＳＴＡＴ3細胞内シグナル伝達経路の活性化の増加を誘導する、先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1064]
アイソタイプ対照抗体と比較して、抗腫瘍記憶応答を誘導する、先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1065]
前記抗体が、
ａ．ヒトＴＲＥＭ1への結合についてヒトＴＲＥＭ－26抗体と競合する、
ｂ．ヒトＴＲＥＭ1に結合する、
ｃ．カニクイザルＴＲＥＭ1に結合する、
ｄ．ＴＲＥＭ1シグナル伝達を刺激する、
ｅ．免疫シグナル伝達経路を誘導する、
ｆ．サイトカインまたはケモカインの分泌を誘導する、
ｇ．共刺激分子の発現を誘導する、
ｈ．骨髄細胞を殺傷する、無効化する、もしくは枯渇させる、または
ｉ．ａ～ｈの任意の組み合わせの能力を有する、
先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1066]
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する、先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1067]
抗体媒介性細胞貪食（ＡＤＣＰ）活性を有する、先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1068]
補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する、先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1069]
前記細胞が、ＴＲＥＭ1＋細胞である、本発明1058～1068のいずれかの単離抗体。
[本発明1070]
前記ＴＲＥＭ1＋細胞が、樹状細胞、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）、好中球、及び腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）からなる群より選択される、本発明1069の単離抗体。
[本発明1071]
前記ＴＲＥＭ1＋細胞が、骨髄由来抑制細胞または腫瘍関連好中球である、本発明1070の単離抗体。
[本発明1072]
前記抗体が、ＴＲＥＭ1＋細胞の細胞表面上でＴＲＥＭ1をＴＲＥＭ1に架橋する、本発明1001～1071のいずれかの単離抗体。
[本発明1073]
医薬として使用される、先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1074]
がんまたは感染症の処置に使用される、先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1075]
固形腫瘍及び液体腫瘍から選択されるがんの処置に使用される、先行本発明のいずれかの単離抗体。
[本発明1076]
先行本発明のいずれかの抗体、そのＶＨ、そのＶＬ、その軽鎖、その重鎖、またはその抗原結合部分、任意にｃＤＮＡをコードする、単離ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセット。
[本発明1077]
本発明1076のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットを含む、ベクターまたはベクターのセット。
[本発明1078]
本発明1076のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセット、または本発明1077のベクターもしくはベクターのセットを含む、宿主細胞。
[本発明1079]
本発明1078の宿主細胞で抗体を発現させること、及び発現された抗体を単離することを含む、抗体の製造方法。
[本発明1080]
本発明1001～1075のいずれかの抗体及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
[本発明1081]
本発明1001～1075のいずれかの抗体または本発明1080の医薬組成物及び使用説明書を含む、キット。
[本発明1082]
抗ＴＲＥＭ1抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物を対象に投与することを含む、免疫応答を増加させる方法。
[本発明1083]
前記組成物が、本発明1001～1075のいずれかの抗体または本発明1080の医薬組成物を含む、本発明1082の方法。
[本発明1084]
前記抗体が、受容体－リガンド遮断活性、アゴニスト活性、またはアンタゴニスト活性を有する、本発明1082の方法。
[本発明1085]
前記抗体が、アゴニスト活性を有する、本発明1084の方法。
[本発明1086]
前記抗体が、アイソタイプ対照抗体と比較して、細胞における少なくとも1つのサイトカインまたはケモカインの発現の増加を誘導する、本発明1082～1085のいずれかの方法。
[本発明1087]
前記少なくとも1つのサイトカインまたはケモカインが、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－1α、ＩＬ－12、ＩＬ－2、ＴＮＦＳＦ9、ＴＮＦＳＦ10、ＣＸＣＬ9、ＣＸＣＬ10、ＣＣＬ17、ＣＸＣＬ1、ＣＸＣＬ5、ＣＸＣＬ8、ＣＸＣＬ11、ＣＸＣＬ15、ＣＣＬ3、ＣＣＬ4、ＣＣＬ2、ＦａｓＬ、ＣＤ274、ＣＲＴＡＭ、グランザイムＡ（ＧｚｍＡ）、またはグランザイムＢ（ＧｚｍＢ）からなる群より選択される、本発明1086の方法。
[本発明1088]
前記サイトカインまたはケモカインが、ＣＸＣＬ10またはＩＦＮ－γである、本発明1087の方法。
[本発明1089]
前記抗体が、アイソタイプ対照抗体と比較して、少なくとも1つの骨髄性共刺激タンパク質の発現の増加を誘導する、本発明1082～1088のいずれかの方法。
[本発明1090]
前記骨髄共刺激タンパク質が、細胞におけるＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ40、ＣＤ80、またはＣＤ86である、本発明1089の方法。
[本発明1091]
前記抗体が、アイソタイプ対照抗体と比較して、細胞におけるＥＲＫ及び／またはＳＴＡＴ3細胞内シグナル伝達経路の活性化の増加を誘導する、本発明1082～1090のいずれかの方法。
[本発明1092]
前記抗体が、記憶免疫応答を誘導する、本発明1082～1091のいずれかの方法。
[本発明1093]
前記細胞が、ＴＲＥＭ1＋細胞である、本発明1082～1092のいずれかの方法。
[本発明1094]
前記ＴＲＥＭ1＋細胞が、樹状細胞、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）、好中球、及び腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）からなる群から選択される、本発明1093の方法。
[本発明1095]
前記ＴＲＥＭ1＋細胞が、骨髄由来抑制細胞または腫瘍関連好中球である、本発明1094の方法。
[本発明1096]
前記抗体が、ＴＲＥＭ1＋細胞の細胞表面上でＴＲＥＭ1をＴＲＥＭ1に架橋する、本発明1082～1095のいずれかの方法。
[本発明1097]
前記対象が、ヒトである、本発明1082～1096のいずれかの方法。
[本発明1098]
抗ＴＲＥＭ1抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物を対象に投与することを含む、がんを処置する方法。
[本発明1099]
前記組成物が、本発明1001～1075のいずれかの抗体または本発明1080の医薬組成物を含む、本発明1098の方法。
[本発明1100]
前記抗体が、受容体－リガンド遮断活性、アゴニスト活性、またはアンタゴニスト活性を有する、本発明1098の方法。
[本発明1101]
前記抗体が、アゴニスト活性を有する、本発明1098の方法。
[本発明1102]
前記抗体が、アイソタイプ対照抗体と比較して、細胞における少なくとも1つのサイトカインまたはケモカインの発現の増加を誘導する、本発明1098～1101のいずれかの方法。
[本発明1103]
前記少なくとも1つのサイトカインまたはケモカインが、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－1α、ＩＬ－12、ＩＬ－2、ＴＮＦＳＦ9、ＴＮＦＳＦ10、ＣＸＣＬ9、ＣＸＣＬ10、ＣＣＬ17、ＣＸＣＬ1、ＣＸＣＬ5、ＣＸＣＬ8、ＣＸＣＬ11、ＣＸＣＬ15、ＣＣＬ3、ＣＣＬ4、ＣＣＬ2、ＦａｓＬ、ＣＤ274、ＣＲＴＡＭ、グランザイムＡ（ＧｚｍＡ）、またはグランザイムＢ（ＧｚｍＢ）からなる群より選択される、本発明1102の方法。
[本発明1104]
前記サイトカインまたはケモカインが、ＣＸＣＬ10またはＩＦＮ－γである、本発明1103の方法。
[本発明1105]
前記抗体が、アイソタイプ対照抗体と比較して、少なくとも1つの骨髄性共刺激タンパク質の発現の増加を誘導する、本発明1098～1104のいずれかの方法。
[本発明1106]
前記骨髄共刺激タンパク質が、細胞におけるＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ40、ＣＤ80、またはＣＤ86である、本発明1105の方法。
[本発明1107]
前記抗体が、アイソタイプ対照抗体と比較して、細胞におけるＥＲＫ及び／またはＳＴＡＴ3細胞内シグナル伝達経路の活性化の増加を誘導する、本発明1098～1106のいずれかの方法。
[本発明1108]
前記抗体が、アイソタイプ対照抗体と比較して、抗腫瘍記憶応答を誘導する、本発明1098～1107のいずれかの方法。
[本発明1109]
前記抗体が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する、本発明1098の方法。
[本発明1110]
前記抗体が、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する、本発明1098の方法。
[本発明1111]
前記抗体が、抗体媒介性貪食（ＡＤＣＰ）活性を有する、本発明1098の方法。
[本発明1112]
前記細胞が、ＴＲＥＭ1＋細胞である、本発明1098～1108のいずれかの方法。
[本発明1113]
前記ＴＲＥＭ1＋細胞が、樹状細胞、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）、好中球、及び腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）からなる群から選択される、本発明1112の方法。
[本発明1114]
前記ＴＲＥＭ1＋細胞が、骨髄由来抑制細胞または腫瘍関連好中球である、本発明1113の方法。
[本発明1115]
前記抗体が、ＴＲＥＭ1＋細胞の細胞表面上でＴＲＥＭ1をＴＲＥＭ1に架橋する、本発明1098～1114のいずれかの方法。
[本発明1116]
前記対象が、ヒトである、本発明1098～1115のいずれかの方法。
[本発明1117]
前記がんが、固形がんである、本発明1098～1116のいずれかの方法。
[本発明1118]
前記がんが、液体がんである、本発明1098～1117のいずれかの方法。
[本発明1119]
前記がんが、黒色腫、腎臓癌、肝胆道癌、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）、膵臓癌、結腸癌、膀胱癌、尿路上皮癌、膠芽腫、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、食道癌、腎臓癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、精巣癌、及び中皮腫からなる群から選択される、本発明1098～1118のいずれかの方法。
[本発明1120]
前記がんが、胃癌、卵巣癌、結腸癌、または乳癌である、本発明1119の方法。
[本発明1121]
前記接触が、前記対象の免疫応答を増強する、本発明1098～1120のいずれかの方法。
[本発明1122]
増強された免疫応答が、適応免疫応答である、本発明1121の方法。
[本発明1123]
増強された免疫応答が、自然免疫応答である、本発明1122の方法。
[本発明1124]
前記対象が、免疫療法を以前に受けているか、同時に受けているか、または後に受けることになる、本発明1098～1123のいずれかの方法。
[本発明1125]
前記免疫療法が、チェックポイント阻害薬；Ｔ細胞のチェックポイント阻害薬；抗ＰＤ1抗体；抗ＰＤＬ1抗体；抗ＣＴＬＡ4抗体；養子細胞療法；養子Ｔ細胞療法；ＣＡＲ－Ｔ細胞療法；樹状細胞ワクチン；ＳＴＩＮＧアゴニスト；単球ワクチン；カルメット－ゲラン菌ワクチン；Ｔ細胞及び抗原提示細胞の両方と結合する抗原結合タンパク質；ＢｉＴＥ二重抗原結合タンパク質；Ｔｏｌｌ様受容体リガンド；サイトカイン；細胞傷害療法；化学療法；放射線療法；小分子阻害薬；小分子アゴニスト；免疫調節薬；腫瘍溶解性ウイルス；ならびにエピジェネティック調節薬のうちの少なくとも1つである、本発明1124の方法。
[本発明1126]
前記免疫療法が、抗ＰＤ1抗体、抗ＰＤＬ1抗体、または抗ＣＴＬＡ4抗体からなる群から選択される、本発明1125の方法。
[本発明1127]
骨髄細胞上に発現する誘発性受容体1（ＴＲＥＭ1）を細胞表面上に発現する骨髄細胞を、殺傷する、無効化する、または枯渇させる方法であって、前記骨髄細胞を、本発明1001～1075のいずれかの抗体または本発明1080の医薬組成物と接触させることを含む、前記方法。
[本発明1128]
前記抗体が、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、及びＡＤＣＰのうちの少なくとも1つで前記骨髄細胞を殺傷し、無効化し、または枯渇させ、任意に、前記抗体が、ＡＤＣＣで前記骨髄細胞を殺傷し、無効化し、または枯渇させ、任意に、前記抗体が、ＣＤＣで前記骨髄細胞を殺傷し、無効化し、または枯渇させ、任意に、前記抗体が、ＡＤＣＰで前記骨髄細胞を殺傷し、無効化し、または枯渇させる、本発明1127の方法。
[本発明1129]
前記抗体が、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、及びＡＤＣＰのうちの少なくとも1つで、前記骨髄細胞を殺傷する、本発明1127または1128の方法。
[本発明1130]
前記抗体が、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、及びＡＤＣＰのうちの少なくとも1つで、前記骨髄細胞を無効化する、本発明1127～1129のいずれかの方法。
[本発明1131]
前記抗体が、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、及びＡＤＣＰのうちの少なくとも1つで、前記骨髄細胞を枯渇させる、本発明1127～1129のいずれかの方法。
[本発明1132]
前記抗体が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する、本発明1127～1131のいずれかの方法。
[本発明1133]
前記抗体が、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する、本発明1127～1131のいずれかの方法。
[本発明1134]
前記抗体が、抗体媒介性貪食（ＡＤＣＰ）活性を有する、本発明1127～1131のいずれかの方法。
[本発明1135]
前記抗体が、受容体－リガンド遮断活性、アゴニスト活性、またはアンタゴニスト活性を有する、本発明1127～1134のいずれかの方法。
[本発明1136]
前記骨髄細胞が、刺激性骨髄細胞である、本発明1127～1135のいずれかの方法。
[本発明1137]
前記骨髄細胞が、非刺激性骨髄細胞である、本発明1127～1135のいずれかの方法。
[本発明1138]
前記骨髄細胞が、樹状細胞、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、好中球、単球、または骨髄由来抑制細胞の少なくとも1つを含む、本発明1127～1137のいずれかの方法。
[本発明1139]
前記骨髄細胞が、好中球または腫瘍関連好中球である、本発明1138の方法。
[本発明1140]
前記骨髄細胞が、腫瘍関連マクロファージである、本発明1139の方法。
[本発明1141]
前記骨髄細胞が、単球性骨髄由来抑制細胞である、本発明1138の方法。
[本発明1142]
前記骨髄細胞が、腫瘍内にある、本発明1127～1141のいずれかの方法。
[本発明1143]
前記骨髄細胞が、刺激性骨髄細胞及び非刺激性骨髄細胞を含む免疫細胞の集団中にある、本発明1127～1142のいずれかの方法。
[本発明1144]
前記接触が、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏである、本発明1127～1143のいずれかの方法。
[本発明1145]
前記接触が、対象においてｉｎ ｖｉｖｏで生じ、任意に、前記対象が、がんを有する、本発明1127～1144のいずれかの方法。
[本発明1146]
前記対象が、ヒトである、本発明1127～1145のいずれかの方法。
[本発明1147]
前記がんが、固形がんである、本発明1127～1146のいずれかの方法。
[本発明1148]
前記がんが、液体がんである、本発明1127～1146のいずれかの方法。
[本発明1149]
前記がんが、黒色腫、腎臓癌、肝胆道癌、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）、膵臓癌、結腸癌、膀胱癌、尿路上皮癌、膠芽腫、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、食道癌、腎臓癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、精巣癌、及び中皮腫からなる群より選択される、本発明1146の方法。
[本発明1150]
前記がんが、胃癌、卵巣癌、結腸癌、または乳癌である、本発明1149の方法。
[本発明1151]
前記接触が、前記対象の免疫応答を増強する、本発明1150の方法。
[本発明1152]
増強された免疫応答が、適応免疫応答である、本発明1151の方法。
[本発明1153]
増強された免疫応答が、自然免疫応答である、本発明1151の方法。
[本発明1154]
増強された免疫応答が、少なくとも1つのサイトカインまたはケモカインの発現を含む、本発明1151の方法。
[本発明1155]
前記少なくとも1つのサイトカインまたはケモカインが、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－1α、ＩＬ－12、ＩＬ－2、ＴＮＦＳＦ9、ＴＮＦＳＦ10、ＣＸＣＬ9、ＣＸＣＬ10、ＣＣＬ17、ＣＸＣＬ1、ＣＸＣＬ5、ＣＸＣＬ8、ＣＸＣＬ11、ＣＸＣＬ15、ＣＣＬ3、ＣＣＬ4、ＣＣＬ2、ＦａｓＬ、ＣＤ274、ＣＲＴＡＭ、グランザイムＡ（ＧｚｍＡ）、またはグランザイムＢ（ＧｚｍＢ）からなる群より選択される、本発明1154の方法。
[本発明1156]
前記少なくとも1つのサイトカインまたはケモカインが、ＣＸＣＬ10またはＩＦＮ－γである、本発明1155の方法。
[本発明1157]
前記対象が、免疫療法を以前に受けているか、同時に受けているか、または後に受けることになる、本発明1127～1156のいずれかの方法。
[本発明1158]
前記免疫療法が、チェックポイント阻害薬；Ｔ細胞のチェックポイント阻害薬；抗ＰＤ1抗体；抗ＰＤＬ1抗体；抗ＣＴＬＡ4抗体；養子細胞療法；養子Ｔ細胞療法；ＣＡＲ－Ｔ細胞療法；樹状細胞ワクチン；ＳＴＩＮＧアゴニスト；単球ワクチン；カルメット－ゲラン菌ワクチン；Ｔ細胞及び抗原提示細胞の両方に結合する抗原結合タンパク質；ＢｉＴＥ二重抗原結合タンパク質；Ｔｏｌｌ様受容体リガンド；サイトカイン；細胞傷害療法；化学療法；放射線療法；小分子阻害薬；小分子アゴニスト；免疫調節薬；腫瘍溶解性ウイルス；ならびにエピジェネティック調節薬のうちの少なくとも1つである、本発明1157の方法。
[本発明1159]
前記免疫療法が、抗ＰＤ1抗体、抗ＰＤＬ1抗体、または抗ＣＴＬＡ4抗体からなる群から選択される、本発明1158の方法。
本発明のこれら及び他の特徴、態様、及び利点は、以下の説明及び添付図面に関して、よりよく理解されるようになるであろう。
ＰＩ－４０２６－５のＳＰＲ結合動態を示す。 Ａは、ＨＥＫ２９３対照細胞へのＰＩ－４０２６－５の結合を示す。Ｂは、ヒトＴＲＥＭ１を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞へのＰＩ－４０２６－５の結合を示す。 Ａは、ヒト末梢血中の好中球へのＰＩ－４０２６－５の結合を示す。Ｂは、ヒト末梢血中の単球へのＰＩ－４０２６－５の結合を示す。 Ａは、カニクイザルＴＲＥＭ１を発現する細胞へのＰＩ－４０２６－５の結合を示す。Ｂは、マウスＴＲＥＭ１を発現する細胞へのＰＩ－４０２６－５の結合がないことを示す。 Ａは、ＰＩ－４０２６－５により誘導されたＦｃγＲシグナル伝達（ｈＣＤ１６レポーターアッセイシステムを使用）を示す。Ｂは、ＰＩ－４０２６－５により誘導されたＦｃγＲシグナル伝達（ｈＣＤ３２レポーターアッセイシステムを使用）を示す。 Ａは、ＰＩ－４０２６－５が初代ヒトマクロファージによる親ｅｘｐｉ２９３細胞のＡＤＣＰを誘導しないことを示す。Ｂは、ＰＩ－４０２６－５が初代ヒトマクロファージによるｈＴＲＥＭ１を発現するｅｘｐｉ２９３細胞のＡＤＣＰを誘導することを示す。 ＰＩ－４０２６ ＦａｂのＣＤＲＨ１内の残基及びＴＲＥＭ１ ＩｇＶドメインの相互作用を示す。 ＰＩ－４０２６ ＦａｂのＣＤＲＨ２内の残基及びＴＲＥＭ１ ＩｇＶドメインの相互作用を示す。 ＰＩ－４０２６ ＦａｂのＣＤＲＨ３内の残基及びＴＲＥＭ１ ＩｇＶドメインの相互作用を示す。 ＰＩ－４０２６ ＦａｂのＣＤＲＬ１内の残基及びＴＲＥＭ１ ＩｇＶドメインの相互作用を示す。 ＰＩ－４０２６ ＦａｂのＣＤＲＬ３内の残基及びＴＲＥＭ１ ＩｇＶドメインの相互作用を示す。 異なる濃度のＨ２Ｏ２への曝露後のＰＩ－４０２６－５のＳＥＣプロファイルを示す。 Ａは、フコシル化ＰＩ－４０２６－５抗体がヒト末梢単球に結合することを示す。Ｂは、アフコシル化ＰＩ－４０２６－５抗体がヒト末梢単球に結合することを示す。 Ａは、フコシル化ＰＩ－４０２６－５抗体がカニクイザル末梢単球に結合することを示す。Ｂは、アフコシル化ＰＩ－４０２６－５抗体がカニクイザル末梢単球に結合することを示す。 Ａは、フコシル化ＰＩ－４０２６－５により誘導されたＦｃγＲシグナル伝達（ｈＣＤ１６レポーターアッセイシステムを使用）を示す。Ｂは、アフコシル化ＰＩ－４０２６－５抗体により誘導されるＦｃγＲシグナル伝達（ｈＣＤ１６レポーターアッセイシステムを使用）を示す。 Ａは、熱ストレスに応答した、ＰＩ６４０５２（ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｌ）及びＰＩ６４０６２（ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ）抗体の平均半径（ＤＬＳにより決定）を示す。Ｂは、熱ストレスに応答した、ＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２抗体の多分散度％（ＤＬＳにより決定）を示す。これらは、安定性動態測定値である。 Ａは、熱ストレスに応答した、ＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２抗体の単量体％（ＳＥＣにより決定）を示す。Ｂは、熱ストレスに応答した、ＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２抗体の凝集体％（ＳＥＣにより決定）を示す。これらは、安定性動態測定値である。 Ａは、疎水性相互作用クロマトグラフィーによる、異なる濃度のＨ２Ｏ２への曝露の２４時間後のＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２抗体の主要種％を示す。Ｂは、疎水性相互作用クロマトグラフィーによる、異なる濃度のＨ２Ｏ２への曝露の２４時間後のＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２抗体の親水性種％を示す。これらは、酸化ストレス感受性の測定値である。 Ａは、疎水性相互作用クロマトグラフィーによる、異なる濃度のＨ２Ｏ２への曝露の１４日後のＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２抗体の主要種％を示す。Ｂは、疎水性相互作用クロマトグラフィーによる、異なる濃度のＨ２Ｏ２への曝露の１４日後のＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２抗体の親水性種％を示す。これらは、酸化ストレス感受性の測定値である。 Ａは、疎水性相互作用クロマトグラフィーによる、異なる濃度のＨ２Ｏ２への曝露の２８日後のＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２抗体の主要種％を示す。Ｂは、疎水性相互作用クロマトグラフィーによる、異なる濃度のＨ２Ｏ２への曝露の２８日後のＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２抗体の親水性種％を示す。 Ａは、ＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２抗体の脱アミド化アッセイの結果を示す。Ｂは、ＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２抗体の脱アミド化アッセイの結果を示す。Ｃは、ＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２抗体の脱アミド化アッセイの結果を示す。Ｄは、ＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２抗体の脱アミド化アッセイの結果を示す。 ＡはＨＥＫ２９３細胞へのＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２のバックグラウンド結合がないことを示す。Ｂは、ＨＥＫ２９３細胞へのＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２のバックグラウンド結合がないことを示す。Ｃは、ＨＥＫ２９３細胞へのＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２のバックグラウンド結合がないことを示す。 Ａは、リンパ球（Ｔ細胞）へのＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２の結合がないことを示す。Ｂは、リンパ球（Ｔ細胞）へのＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２の結合がないことを示す。Ｃは、リンパ球（Ｔ細胞）へのＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２の結合がないことを示す。Ｄは、リンパ球（Ｂ細胞）へのＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２がないことを示す。Ｅは、リンパ球（Ｂ細胞）へのＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２がないことを示す。Ｆは、リンパ球（Ｂ細胞）へのＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２がないことを示す。 Ａは、ヒトＴＲＥＭ１を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞へのＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２抗体の結合を示す。Ｂは、ヒトＴＲＥＭ１を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞へのＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２抗体の結合を示す。Ｃは、ヒトＴＲＥＭ１を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞へのＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２抗体の結合を示す。 Ａは、カニクイザルＴＲＥＭ１を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞へのＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２抗体の結合を示す。Ｂは、カニクイザルＴＲＥＭ１を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞へのＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２抗体の結合を示す。Ｃは、カニクイザルＴＲＥＭ１を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞へのＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２抗体の結合を示す。 Ａは、ヒト単球へのＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２の結合を示す。Ｂは、ヒト単球へのＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２の結合を示す。Ｃは、ヒト単球へのＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２の結合を示す。 Ａは、カニクイザル単球へのＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２の結合を示す。Ｂは、カニクイザル単球へのＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２の結合を示す。 ＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２により誘導されたＦｃγＲシグナル伝達（ｈＣＤ１６レポーターアッセイシステムを使用）を示し、３回の別々の実験を表す。 Ａは、ＰＩ６４０５２が、初代ヒトマクロファージにより、ｈＴＲＥＭ１を発現するｅｘｐｉ細胞のＡＤＣＰを誘導するが、親ｅｘｐｉ細胞では誘導しないことを示す。Ｂは、ＰＩ６４０６２が、初代ヒトマクロファージにより、ｈＴＲＥＭ１を発現するｅｘｐｉ細胞のＡＤＣＰを誘導するが、親ｅｘｐｉ細胞では誘導しないことを示す。Ｃは、ＰＩ６４０５２が、初代ヒトマクロファージにより、ｈＴＲＥＭ１を発現するｅｘｐｉ細胞のＡＤＣＰを誘導するが、親ｅｘｐｉ細胞では誘導しないことを示す。Ｄは、ＰＩ６４０６２が、初代ヒトマクロファージにより、ｈＴＲＥＭ１を発現するｅｘｐｉ細胞のＡＤＣＰを誘導するが、親ｅｘｐｉ細胞では誘導しないことを示す。 Ａは、ＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２ならびにそれらのフコシル化親（それぞれ、ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｌ及びＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ）のｈＦｃγＲＩへの結合を示す。Ｂは、ＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２ならびにそれらのフコシル化親のｈＦｃγＲＩＩαへの結合を示す。Ｃは、ＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２ならびにそれらのフコシル化親のｈＦｃγＲＩＩβへの結合を示す。Ｄは、ＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２ならびにそれらのフコシル化親のｈＦｃγＲＩＩＩαへの結合を示す。Ｅは、ＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２ならびにそれらのフコシル化親のｈＦｃγＲＩＩＩαへの結合を示す。Ｆは、ＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２ならびにそれらのフコシル化親のｈＦｃγＲＩＩＩβへの結合を示す。 図２６－１の説明を参照。 Ａは、末梢血由来の単球上のＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ及びアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑの用量依存的な受容体占有率を示す。Ｂは、末梢血由来の好中球上のＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ及びアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑの用量依存的な受容体占有率を示す。 Ａは、アフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑが、ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑよりも、ヒト末梢血白血球からのＩＦＮ－γのより強力な用量依存性サイトカイン放出を誘導することを示す。Ｂは、アフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑが、ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑよりも、ヒト末梢血白血球からのＩＬ－８のより強力な用量依存性サイトカイン放出を誘導することを示す。Ｃは、アフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑが、ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑよりも、ヒト末梢血白血球からのＩＬ－２のより強力な用量依存性サイトカイン放出を誘導することを示す。Ｄは、アフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑが、ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑよりも、ヒト末梢血白血球からのＩＰ－１０のより強力な用量依存性サイトカイン放出を誘導することを示す。 Ａは、アフコシル化ＰＩ－４９２８抗ＴＲＥＭ１及び抗ＰＤ－１抗体の併用療法が、ｉｎ ｖｉｖｏで末梢サイトカインシグネチャーを誘導することを示す。Ｂは、アフコシル化ＰＩ－４９２８抗ＴＲＥＭ１及び抗ＰＤ－１抗体の併用療法が、ｉｎ ｖｉｖｏで末梢サイトカインシグネチャーを誘導することを示す。 アフコシル化ＰＩ－９０６７抗ＴＲＥＭ１抗体が、Ｐａｎｃ０２腫瘍モデルにおいて単剤療法活性を有することを示す。 Ａは、Ｐａｎｃ０２腫瘍モデルのアイソタイプ群由来の各マウスの成長曲線を提供する。Ｂは、Ｐａｎｃ０２腫瘍モデルの抗ＰＤ－１群由来の各マウスの成長曲線を提供する。Ｃは、Ｐａｎｃ０２腫瘍モデルの抗ＴＲＥＭ１群由来の各マウスの成長曲線を提供する。Ｄは、Ｐａｎｃ０２腫瘍モデルの抗ＴＲＥＭ１及び抗ＰＤ－１群の各マウス由来の成長曲線を提供する。 Ｐａｎｃ０２腫瘍モデルの示された各群由来の各マウスの２８日目の腫瘍体積を提供する。 ヒトＴＲＥＭ１が種々の腫瘍適応症全体で発現し且つ骨髄細胞に限定されることを示す。 Ａは、ヒト血球中のアフコシル化ＰＩ６４０６２により誘導されるサイトカインの変化倍率を示す。Ｂは、アフコシル化ＰＩ６４０６２で処理した後のＨＬＡ－ＤＲ表面発現の上方制御を示す。Ｃは、アフコシル化ＰＩ６４０６２で処理した後のＣＤ４０表面発現の上方制御を示す。 細胞型に従って選別された、血液試料全体で最も高い分散を有する１０００の遺伝子の発現マトリックスを示す。遺伝子発現クラスタリングは、選別された免疫細胞集団とよく相関していた。 Ａは、アイソタイプ抗体処置（ＩＳＯ）または抗ＴＲＥＭ１抗体（アフコシル化ＰＩ６４０６２）処置後の示された細胞型におけるＨＬＡ－ＤＲ遺伝子発現を示す。Ｂは、アイソタイプ抗体処置（ＩＳＯ）または抗ＴＲＥＭ１抗体（アフコシル化ＰＩ６４０６２）処置後の示された細胞型におけるＣＤ４０遺伝子発現を示す。Ｃは、アイソタイプ抗体処理（ＩＳＯ）または抗ＴＲＥＭ１抗体（アフコシル化ＰＩ６４０６２）処置後の示された細胞型におけるＣＤ８０遺伝子発現を示す。Ｄは、アイソタイプ抗体処理（ＩＳＯ）または抗ＴＲＥＭ１抗体（アフコシル化ＰＩ６４０６２）処置後の示された細胞型におけるＣＤ８６遺伝子発現を示す。 Ａは、抗ＴＲＥＭ１抗体（アフコシル化ＰＩ６４０６２）処置後の単球における細胞表面ＨＬＡ－ＤＲ発現の代表的なヒストグラムオーバーレイを示す。Ｂは、抗ＴＲＥＭ１抗体（アフコシル化ＰＩ６４０６２）処置後の単球における細胞表面ＣＤ４０発現の代表的なヒストグラムオーバーレイを示す。Ｃは、抗ＴＲＥＭ１抗体（アフコシル化ＰＩ６４０６２）処置後の単球における細胞表面ＣＤ８０発現の代表的なヒストグラムオーバーレイを示す。Ｄは、抗ＴＲＥＭ１抗体（アフコシル化ＰＩ６４０６２）処置後の単球における細胞表面ＣＤ８６発現の代表的なヒストグラムオーバーレイを示す。 アイソタイプ対照またはアフコシル化ＰＩ６４０６２抗体で処置された後の好中球、単球、またはＴ細胞におけるｐＥＲＫ及びｐＳＴＡＴ３の％を示す。 （＊＜０．０５、＊＊＜０．００１）ＥＲＫ及びＳＴＡＴ経路のＲＮＡｓｅｑ解析の結果を示し、これは、単球において経路と関連する遺伝子が大幅に濃縮されているが好中球またはＮＫ細胞においてはそうではないことを示す。 マウスまたはヒト血球において抗ＴＲＥＭ１抗体により上方制御されたケモカイン及びサイトカインを示す。 アフコシル化ＰＩ－９０６７Ｌ抗ＴＲＥＭ１抗体が、ＩＤ８卵巣腫瘍モデルにおいて単剤療法活性を有することを示す。 アフコシル化ＰＩ－９０６７Ｌ抗体が、ＣＴ２６腫瘍モデルにおいて再負荷されたマウスにおいて免疫記憶を誘導することを示す。 Ａは、結腸直腸癌におけるＴＲＥＭ１発現を示す。Ｂは、結腸直腸癌患者の生存確率及びＴＲＥＭ１発現を示す。 Ａは、アフコシル化ＰＩ－４９２８抗ＴＲＥＭ１抗体が、用量依存的な薬物動態を示すことを示す。Ｂは、アフコシル化ＰＩ－４９２８抗ＴＲＥＭ１抗体で処置された後の血清中の可溶性マウスＴＲＥＭ１を示す。 Ａは、７日目のマウス血球数を示す。Ｂは、１４日目のマウス血球数を示す。Ｃは、７日目のマウス赤血球パラメーターを示す。Ｄは、１４日目のマウス赤血球パラメーター値を示す。 Ａは、小さな皮下ＥＭＴ６担腫瘍雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗ＴＲＥＭ１、抗ＰＤ－１、または抗ＴＲＥＭ１及び抗ＰＤ－１処置の組み合わせの抗腫瘍有効性を示す。Ｂは、大きい皮下ＥＭＴ６担腫瘍雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗ＴＲＥＭ１、抗ＰＤ－１、または抗ＴＲＥＭ１及び抗ＰＤ－１処置の組み合わせの抗腫瘍有効性を示す。
詳細な説明
定義
別途定義のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語、表記法、及び他の科学用語は、当業者らが一般的に理解する意味を有することが意図される。ある場合では、通常理解される意味を有する用語が、明確にするために及び／またはすぐに参照のために本明細書で定義され、そのような定義の包含は、本明細書では、当該技術分野において一般に理解されるものを超える差を表すように解釈されるべきではない。本明細書に記載または参照される手法及び手順は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ４ｔｈ ｅｄ．（２０１２）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載の広く利用されている分子クローニング法などの、当業者らにより従来の手法を使用して、一般に十分に理解され、通常利用される。必要に応じて、市販のキット及び試薬の使用を含む手順は、別途記載のない限り、一般に、製造者が規定されるプロトコール及び条件に従って実行される。
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、別途指示のない限り複数の指示対象を含む。
本明細書に記載の本発明の態様及び実施形態は、態様及び実施形態「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」、及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を含むと理解される。
本明細書に記載の全ての組成物及び本明細書に記載の組成物を使用する全ての方法では、組成物は、いずれかの列挙された構成成分もしくはステップを含み得るか、または列挙された構成成分もしくはステップ「から本質的になり」得る。組成物が列挙された構成成分「から本質的になる」と記載される時、組成物は、列挙された構成成分を含有し、明示的に列挙される構成成分以外の、処置される状態に実質的に影響を及ぼさないが、処置される状態に実質的に影響を及ぼす任意の他の構成成分を含有しない他の構成成分を含有し得るか、または組成物が処置される状態に実質的に影響を与える列挙された構成成分以外の追加の構成成分を含有する場合、組成物は、処置される状態に実質的に影響するのに十分な濃度または量の追加の構成成分を含有しない。方法が列挙されるステップ「から本質的になる」と記載される時、方法は、列挙されるステップを含有し、処置される状態に実質的に影響を与えない他のステップを含有してもよいが、方法が、明示的に列挙されるそれらのステップ以外の処置される状態に実質的に影響を与える任意の他のステップを含有しない。特定の非限定例として、組成物が構成成分「から本質的になる」と記載される場合、組成物はさらに、任意の量の薬学的に許容される担体、ビヒクル、または希釈剤、及び処置される状態に実質的に影響を及ぼさない、そのような他の構成成分を含有し得る。
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが結合する別の核酸を伝播することが可能な核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及びそれが導入されている宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターを含む。特定のベクターは、それらが作動可能に結合する核酸の発現を導くことが可能である。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」という用語は、互換的に使用され、外因性核酸が導入されている細胞、及びそのような細胞の子孫を指す。宿主細胞は、「形質転換体」（または「形質転換細胞」）及び「トランスフェクタント」（または「トランスフェクト細胞」）を含み、これらは、それぞれ、一次形質転換またはトランスフェクト細胞及びそれらに由来する子孫を含む。そのような子孫は、親細胞への核酸含有量に完全に同一でなくてもよく、変異を含有してもよい。
本明細書で使用される「有効量」または「治療有効量」は、単回投与として、または一連の投与の一部として、個体に投与された抗ＴＲＥＭ１抗体などの治療化合物の量を指し、これは、単独かまたは別の治療モダリティとの組み合わせのいずれかで、所望の治療効果を生成または寄与するのに効果的である。所望の治療効果の例は、免疫応答の増強；腫瘍の発達の減速または遅延；疾患の安定；１つ以上の症状の改善である。有効量は、１回以上の投薬で与えられてもよい。
「処置すること」という用語（及び「処置する」または「処置」などのその変形形態）は、それを必要とする対象における疾患または状態の自然経過を変化させようとして臨床的介入を指す。処置は、臨床病状の過程で行うことができる。処置の望ましい効果は、疾患の再発の予防、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移の予防、疾患増悪の速度の低下、疾患状態の改善または緩和、及び寛解または予後の改善を含む。
「十分な量」という用語は、所望の効果を生じさせるのに十分な量、例えば、対象の免疫応答を調節するのに十分な量、を意味する。
本明細書で使用される場合、「対象」または「個体」という用語は、哺乳動物対象を意味する。例示的な対象は、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ラクダ、ヤギ、ウサギ、及びヒツジを含む。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。一部の実施形態では、対象は、本明細書で提供される抗体で処置することができる疾患または状態を有する。一部の態様では、疾患または状態は、がんである。一部の態様では、疾患または状態は、ウイルス感染である。
「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という用語は、生体から分離して成長する生細胞で生じるプロセス、例えば、組織培養における成長、を指す。
「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語は、生体内で生じるプロセスを指す。
「添付文書」という用語は、治療または診断製品（例えば、キット）の市販パッケージに通例含まれ、そのような治療または診断製品の使用に関する適応症、使用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌、及び／または警告に関する情報を含有する使用説明書を指すために使用される。
本明細書で使用される「細胞傷害薬」という用語は、細胞機能を阻害もしくは防止する、及び／または細胞死もしくは破壊を引き起こす物質を指す。
「化学療法薬」は、がんの処置に有用な化合物を指す。化学療法薬は、がんの成長を促進し得るホルモンの効果を制御、低減、遮断、または阻害するように作用する「抗ホルモン薬」または「内分泌療法薬」を含む。
「細胞増殖抑制薬」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで細胞の成長を阻止する化合物または組成物を指す。一部の実施形態では、細胞増殖抑制薬は、Ｓ期の細胞のパーセンテージを低減させる薬剤である。一部の実施形態では、細胞増殖抑制薬は、Ｓ期の細胞のパーセンテージを、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、または少なくとも約８０％低減させる。
「腫瘍」という用語は、悪性または良性かに関わらず全ての腫瘍性細胞成長及び増殖、ならびに全ての前がん性及びがん性細胞及び組織を指す。「がん」、「がん性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」、及び「腫瘍」という用語は、本明細書で言及される場合、相互に排他的ではない。「細胞増殖性障害」及び「増殖性障害」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖に関連する障害を指す。一部の実施形態では、細胞増殖性障害は、がんである。一部の態様では、腫瘍は、固形腫瘍である。一部の態様では、腫瘍は、血液学的悪性腫瘍である。
「医薬組成物」という用語は、活性成分の生物学的活性が、その中に含有される活性成分の生物活性が、対象を処置するのに有効であることを可能にするような形態である調製物を指し、これは、医薬組成物で提供される量で対象に対して容認できないほど毒性がある追加構成成分を含有しない。
「同時投与」、「同時投与する」、及び「と組み合わされ」という用語は、特定の時間制限なしで、同時に、並行して、または連続して、２つ以上の治療薬の投与を含む。一実施形態では、薬剤は、細胞もしくは対象の体内に同時に存在するか、またはそれらの生物学的もしくは治療効果を同時に発揮する。一実施形態では、治療薬は、同じ組成物または単位剤形である。他の実施形態では、治療薬は、別個の組成物または単位剤形である。特定の実施形態では、第１の薬剤は、第２の治療薬の投与前に投与することができる。
「調節する」及び「調節」という用語は、列挙された可変要素を低減もしくは阻害、または、代わりとして活性化もしくは増加させることを指す。
「増加させる」及び「活性化する」という用語は、列挙された可変要素の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上の増加を指す。
「低減させる」及び「阻害する」という用語は、列挙された可変要素の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上の減少を指す。
「約」という用語は、示された値及びその値の上下範囲を示し、包含する。特定の実施形態では、「約」という用語は、所定値±１０％、±５％、または±１％を示す。特定の実施形態では、適用可能な場合、「約」という用語は、所与値（複数可）±その値（複数可）の１標準偏差を示す。
「刺激する」という用語は、受容体の活性化に関連する生物学的応答を誘導するための受容体シグナル伝達の活性化を指す。「アゴニスト」は、受容体に結合して、刺激する実体である。
「拮抗する」という用語は、受容体の活性化に関連する生物学的応答を阻害するための受容体シグナル伝達の阻害を指す。「アンタゴニスト」は、受容体に結合して拮抗する実体である。
本明細書に記載の構造的及び機能的特性のいずれかでは、これらの特性を決定する方法が当該技術分野で既知である。
「任意に」という用語は、逐次的に使用される時、列挙された組み合わせの１つから全てまでを含むことを意味し、全ての副組み合わせを検討する。
「アミノ酸」という用語は、２０の一般的な天然に存在するアミノ酸を指す。天然に存在するアミノ酸は、アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、及びバリン（Ｖａｌ；Ｖ）を含む。
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈でパーセント「同一性」という用語は、以下に記載された配列比較アルゴリズム（例えば、公開されたコンピューターソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＭＥＧＡＬＩＧＮ（ＤＮＡＳＴＡＲ）、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＣＬＵＳＴＡＬ ＯＭＥＧＡ、もしくはＭＵＳＣＬＥソフトウェア、または当業者らが利用可能な他のアルゴリズムを使用する）のうちの１つを使用して測定された、あるいは目視検査により、最大の対応について比較及びアラインされた場合、同一である特定のパーセンテージのヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を通じて公開されている。当業者らは、比較されている配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメーターを決定し得る。用途に応じて、パーセント「同一性」は、比較される配列の領域、例えば、機能ドメイン、にわたって存在するか、または、別の方法として、比較されるべき２つの配列の全長にわたって存在し得る。
配列比較のために、通常、試験配列が比較される１つの配列が、参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する時、試験配列及び参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じて、部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次に、配列比較アルゴリズムは、設計されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較した試験配列（複数可）についてのパーセント配列同一性を計算する。
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性の検索方法、これらのアルゴリズムのコンピューター実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査（一般に、以下のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌを参照のこと）により実施することができる。
本明細書で列挙される範囲は、列挙される端点を含む、範囲内の値の全てに対する短縮形であると理解される。例えば、１～５０の範囲は、任意の数、数の組み合わせ、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、及び５０からなる群の部分範囲を含むと理解される。
ＴＲＥＭ１抗体
構造
本出願は、非刺激性骨髄細胞を無効化する抗体を含む、ＴＲＥＭ１タンパク質に結合する抗体を含む抗体及び組成物を提供する。
「抗体」という用語は、最も広い意味で、本明細書で使用され、抗原またはエピトープに特異的に結合する１つ以上の抗原結合ドメインを含む免疫グロブリン分子の特定のタイプを含む。抗体は、具体的には、インタクト抗体（例えば、インタクト免疫グロブリン）、抗体フラグメント、及び多重特異性抗体を含む。
認識される免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、及びミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。抗体または免疫グロブリンの「クラス」は、重鎖が保有する定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、ならびに、これらのうちのいくつかはさらに、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２、に分けられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、２対のポリペプチド鎖からなり、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）及び１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端ドメインは、主に抗原認識に関与する約１００～１１０以上のアミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれこれらの軽鎖及び重鎖ドメインを指す。ＩｇＧ１重鎖は、Ｎ末端からＣ末端への、それぞれ、ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインで構成される。軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端へのＶＬ及びＣＬドメインで構成される。ＩｇＧ１重鎖は、ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン間にヒンジを含む。特定の実施形態では、免疫グロブリン構築物は、治療用ポリペプチドに連結されているＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥ由来の少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体に見られる免疫グロブリンドメインは、ダイアボディまたはナノボディなどの免疫グロブリンベースの構築物に由来の、または由来する。特定の実施形態では、本明細書に記載の免疫グロブリン構築物は、ラクダ科動物抗体などの重鎖抗体由来の少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む。特定の実施形態では、本明細書で提供される免疫グロブリン構築物は、ウシ抗体、ヒト抗体、ラクダ抗体、マウス抗体、または任意のキメラ抗体などの哺乳動物抗体由来の少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、重鎖を含む。一実施形態では、重鎖は、ＩｇＡである。一実施形態では、重鎖は、ＩｇＤである。一実施形態では、重鎖は、ＩｇＥである。一実施形態では、重鎖は、ＩｇＧである。一実施形態では、重鎖は、ＩｇＭである。一実施形態では、重鎖は、ＩｇＧ１である。一実施形態では、重鎖は、ＩｇＧ２である。一実施形態では、重鎖は、ＩｇＧ３である。一実施形態では、重鎖は、ＩｇＧ４である。一実施形態では、重鎖は、ＩｇＡ１である。一実施形態では、重鎖は、ＩｇＡ２である。
一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体である。
一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ３抗体である。
一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２抗体である。
一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４抗体である。
本明細書で使用される「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変であり、及び／または構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの領域のそれぞれを指す。一般に、天然４本鎖抗体は、６つのＨＶＲ：ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）の３つ及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の３つを含む。ＨＶＲは一般に、超可変ループ及び／または相補性決定領域（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最も高い配列可変性であり、及び／または抗原認識に関与する。ＶＨのＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域（ＨＶＲ）は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して本明細書では互換的に使用される。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８３）及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－９１７（１９８７）により記載されており、定義は、互いに比較した時、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。それにも関わらず、抗体またはそのバリアントのＣＤＲを指すいずれかの定義の適用は、本明細書で定義及び使用される用語の範囲内であることが意図される。特定のＣＤＲを包含する正確な残基番号は、ＣＤＲの配列及びサイズにより変動するであろう。当業者らは、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮すると、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを規定通りに判定し得る。
ＣＤＲのアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、上掲（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３：９２７－９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）；ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（「Ｃｏｎｔａｃｔ」番号付けスキーム）；Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３，２７：５５－７７（「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）；及びＨｏｎｅｇｇｅ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００１，３０９：６５７－７０（「ＡＨｏ」番号付けスキーム）（これらのそれぞれは、全体が参照により組み込まれる）により記載されるものを含む、多数の既知の番号付けスキームのいずれかを使用して、当業者により決定することができる。
表Ａは、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａスキームで同定されたＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３の位置を提供する。ＣＤＲ－Ｈ１では、残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの両方の番号付けスキームを使用して提供される。
ＣＤＲは、例えば、ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／ａｂｎｕｍ／で入手可能な且つ全体が参照により組み込まれるＡｂｈｉｎａｎｄａｎ ａｎｄ Ｍａｒｔｉｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００８，４５：３８３２－３８３９に記載される、Ａｂｎｕｍなどの抗体番号付けソフトウェアを使用して、割り当てられてもよい。
（表Ａ）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームによるＣＤＲの残基
Figure 0007492522000001
＊ＣＤＲ－Ｈ１のＣ末端は、Ｋａｂａｔ番号付け規則を使用して番号付けされる場合、ＣＤＲの長さに応じてＨ３２及びＨ３４間で変動する。
「ＥＵ番号付けスキーム」は一般に、抗体重鎖定常領域内の残基に言及する時に使用される（例えば、上掲のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．で報告されるように）。別途記載のない限り、ＥＵ番号付けスキームは、本明細書に記載の抗体重鎖定常領域の残基を指すために使用される。
「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原またはエピトープに特異的に結合することが可能な抗体の部分を意味する。抗原結合ドメインの一例は、抗体のＶＨ－ＶＬ二量体により形成される抗原結合ドメインである。抗原結合ドメインの別の例は、アドネクチンの１０番目のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン由来の特定のループの多様化により形成される抗原結合ドメインである。抗原結合ドメインは、重鎖由来のＣＤＲ１、２、及び３をその順序で、ならびに軽鎖由来のＣＤＲ１、２、及び３をその順序で含み得る。
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合する抗原の一部を意味する。エピトープは多くの場合、表面にアクセス可能なアミノ酸残基及び／または糖側鎖からなり、特定の３次元構造特性及び特定の電荷特性を有してもよい。立体配座及び非立体配座エピトープは、後者ではなく前者への結合が変性溶媒の存在下で失われ得るという点で区別される。エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基、及び結合に直接関与しない他のアミノ酸残基を含んでもよい。抗体が結合するエピトープは、例えば、異なる点変異を有するＴＲＥＭ１バリアントまたはキメラＴＲＥＭ１バリアントへの抗体結合の試験などの、エピトープ決定のための既知の手法を使用して決定することができる。
目的の抗体（例えば、ＴＲＥＭ１）が結合している標的抗原上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されるような所定の交差遮断アッセイを実施することができる。代替的または追加的に、エピトープマッピングは、当該分野で既知の方法により実施することができる。
「キメラ抗体」という用語は、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の供給源または種に由来するが、重鎖及び／または軽鎖の残りが異なる供給源または種に由来する抗体を指す。
「ヒト抗体」は、ヒトまたはヒト細胞により産生されるか、または、ヒト抗体レパートリーまたはヒト抗体コード配列（例えば、ヒト供給源から得られるか、またはｄｅ ｎｏｖｏで設計される）を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体は、特に、ヒト化抗体を除外する。
「ヒト化抗体」は、それがヒト対象に投与される場合、非ヒト種抗体と比較して、ヒト化抗体が免疫応答を誘導する可能性が低いように、及び／または、比較的軽度の免疫応答を誘導するように、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、及び／または付加により非ヒト種に由来する抗体の配列とは異なる配列を有する。一実施形態では、非ヒト種抗体の重鎖及び／または軽鎖のフレームワーク及び定常ドメイン内の特定のアミノ酸が、ヒト化抗体を産生するように変異する。別の実施形態では、ヒト抗体由来の定常ドメイン（複数可）は、非ヒト種の可変ドメイン（複数可）に融合される。別の実施形態では、非ヒト抗体の１つ以上のＣＤＲ配列中の１つ以上のアミノ酸残基は、それがヒト対象に投与された時、非ヒト抗体の免疫原性の可能性を低減させるように変化し、変化したアミノ酸残基はいずれも、抗体の抗原への免疫特異的結合について重要でないか、または、行われたアミノ酸配列への変化が保存的な変化であり、その結果、ヒト化抗体の抗原への結合が、非ヒト抗体の抗原への結合よりも著しく低い。ヒト化抗体を作製する方法の例は、米国特許第６，０５４，２９７号、同第５，８８６，１５２号、及び同第５，８７７，２９３号に見出すことができる。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８６，３２１：５２２－５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３２：３２３－３２９；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１９９２，２：５９３－５９６（これらのそれぞれは、全体が参照により組み込まれる）を参照のこと。
「多重特異性抗体」は、２つ以上の異なるエピトープに集合的に特異的に結合する２つ以上の異なる抗原結合ドメインを含む抗体である。２つ以上の異なるエピトープは、同じ抗原（例えば、細胞により発現される単一のＴＲＥＭ１分子）または異なる抗原（例えば、同じ細胞により発現される異なるＴＲＥＭ１分子、もしくはＴＲＥＭ１分子及び非ＴＲＥＭ１分子）上のエピトープであってよい。一部の態様では、多重特異性抗体は、２つの異なるエピトープに結合する（すなわち、「二重特異性抗体」）。一部の態様では、多重特異性抗体は、３つの異なるエピトープに結合する（すなわち、「三重特異性抗体」）。
「単一特異性抗体」は、単一のエピトープに特異的に結合する１つ以上の結合部位を含む抗体である。単一特異性抗体の例は、二価（すなわち、２つの抗原結合ドメインを有する）であるが、２つの抗原結合ドメインのそれぞれで同じエピトープを認識する、天然に存在するＩｇＧ分子である。結合特異性は、任意の好適な原子価で存在してもよい。
「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団由来の抗体を指す。実質的に均一な抗体の集団は、モノクローナル抗体の産生中に通常生じ得るバリアントを除いて、実質的に類似し且つ同じエピトープ（複数可）に結合する抗体を含む。そのようなバリアントは一般に、少量でのみ存在する。モノクローナル抗体は通常、複数の抗体から単一の抗体を選択することを含むプロセスにより得られる。例えば、選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、酵母クローン、細菌クローン、または他の組み換えＤＮＡクローンのプールなど、複数のクローン由来のユニークなクローンの選択であり得る。選択された抗体はさらに、例えば、標的に対する親和性（「親和性成熟」）を改善するため、抗体をヒト化するため、細胞培養における産生を改善するため、及び／または対象における免疫原性を低減させるために、改変することができる。
「一本鎖」という用語は、ペプチド結合により直線的に結合しているアミノ酸単量体を含む分子を指す。そのような特定の実施形態では、Ｆａｂ軽鎖のＣ末端は、一本鎖Ｆａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に連結されている。本明細書でより詳細に記載されるように、ｓｃＦｖは、ポリペプチド鎖により、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）のＣ末端からＮ末端に連結されている軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）を有する。あるいは、ｓｃＦｖは、ＶＨのＣ末端がポリペプチド鎖によりＶＬのＮ末端に連結されているポリペプチド鎖で構成される。
「Ｆａｂフラグメント」（フラグメント抗原結合とも呼ばれる）は、軽鎖及び重鎖上のそれぞれ可変ドメインＶＬ及びＶＨを伴う軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。可変ドメインは、抗原結合に関与する相補性決定ループ（ＣＤＲ、超可変領域とも呼ばれる）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基の付加により、Ｆａｂフラグメントとは異なる。
「Ｆ（ａｂ’）２」フラグメントは、ジスルフィド結合によりヒンジ領域の近くで結合されている２つのＦａｂ’フラグメントを含有する。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、例えば、組み換え法またはインタクト抗体のペプシン消化により生成されてもよい。Ｆ（ａｂ’）フラグメントは、例えば、β－メルカプトエタノールで処理することにより解離させることができる。
「Ｆｖ」フラグメントは、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの非共有結合で連結された二量体を含む。
「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一実施形態では、Ｆｖポリペプチドはさらに、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするＶＨドメイン及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを含む。ｓｃＦｖのレビューについては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照のこと。ＨＥＲ２抗体ｓｃＦｖフラグメントは、ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；及び米国特許第５，５８７，４５８号に記載される。
「ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フラグメントは、Ｆｃドメインに結合しているｓｃＦｖを含む。例えば、Ｆｃドメインは、ｓｃＦｖのＣ末端に結合していてもよい。Ｆｃドメインは、ｓｃＦｖ内の可変ドメインの方向に応じて、ＶＨまたはＶＬの後に続いてもよい（すなわち、ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨ）。当該技術分野で既知の、または本明細書に記載の任意の好適なＦｃドメインが使用されてもよい。いくつかの場合では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインを含む。
「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」という用語は、抗体の１つの可変ドメインが他の可変ドメインの存在なしに抗原に特異的に結合する分子を指す。単一ドメイン抗体及びそのフラグメントは、Ａｒａｂｉ Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９８，４１４：５２１－５２６及びＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２００１，２６：２３０－２４５に記載され、これらのそれぞれは、全体が参照により組み込まれる。単一ドメイン抗体は、ｓｄＡｂまたはナノボディとしても知られる。ｓｄＡｂは、かなり安定しており、抗体のＦｃ鎖との融合パートナーとして発現しやすい（Ｈａｒｍｓｅｎ ＭＭ，Ｄｅ Ｈａａｒｄ ＨＪ（２００７）．“Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃａｍｅｌｉｄ ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ”．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７（１）：１３－２２）。
天然に存在する抗体構造と実質的に類似する構造を有し且つＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す「全長抗体」、「インタクト抗体」、及び「全抗体」という用語が本明細書において互換的に使用される。例えば、ＩｇＧ分子を指すために使用される時、「全長抗体」は、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む抗体である。
「抗体フラグメント」は、インタクト抗体の抗原結合領域または可変領域などのインタクト抗体の一部を含む。抗体フラグメントは、例えば、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、ｓｃＦｖ（ｓＦｖ）フラグメント、及びｓｃＦｖ－Ｆｃフラグメントを含む。
抗ＴＲＥＭ１抗体は、表に記載されるクローンなどの、本明細書に記載されるものを含み得る。一部の実施形態では、抗体は、代替足場を含む。一部の実施形態では、抗体は、代替足場からなる。一部の実施形態では、抗体は、代替足場から本質的になる。一部の実施形態では、抗体は、抗体フラグメントを含む。一部の実施形態では、抗体は、抗体フラグメントからなる。一部の実施形態では、抗体は、抗体フラグメントから本質的になる。「ＴＲＥＭ１抗体」、「抗ＴＲＥＭ１抗体」、または「ＴＲＥＭ１特異的抗体」は、抗原ＴＲＥＭ１に特異的に結合する、本明細書で提供されるような抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ＴＲＥＭ１の細胞外ドメインと結合する。特定の実施形態では、本明細書で提供されるＴＲＥＭ１抗体は、異なる種由来のＴＲＥＭ１タンパク質間でまたはそれらの間で保存されるＴＲＥＭ１のエピトープに結合する。抗ＴＲＥＭ１抗体は、ＴＲＥＭ－２６クローンを含み得る（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ；カタログ番号３１４９０７；Ｌｉ Ｊ，ｅｔ ａｌ．２０１１．Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．ｅｐｕｂ．）。
一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。
一部の実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体である。
一部の実施形態では、抗体は、ハイブリドーマにより産生される。他の実施形態では、抗体は、所望の可変ドメイン及び定常ドメインを発現するように操作された組み換え細胞により産生される。
一部の実施形態では、抗体は、抗原特異性及びより低いヒンジ領域またはそのバリアントを保持する一本鎖抗体または他の抗体誘導体であり得る。
一部の実施形態では、抗体は、多機能抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、フラグメント、またはそのバリアントであってよい。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、中性抗体、アンタゴニスト抗体、アゴニスト抗体、ポリクローナル抗体、アフコシル化抗体、二重特異性抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、全長抗体、及びその抗原結合フラグメントである。特定の実施形態では、抗体フラグメントまたはその誘導体は、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’２フラグメント、ＣＤＲ、及びＳｃＦｖから選択される。一部の実施形態では、抗体は、その抗原結合フラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、一本鎖抗体分子、二重可変ドメイン抗体、単一可変ドメイン抗体、線形抗体、またはＶドメイン抗体である。
一部の実施形態では、抗体は、免疫複合体を形成することが可能である。例えば、免疫複合体は、抗体で覆われた腫瘍細胞であり得る。
一部の実施形態では、ＴＲＥＭ１抗体は、参照抗体とのヒトＴＲＥＭ１（配列番号１）への結合について競合する。
ＴＲＥＭ１抗体の配列
ＶＨドメイン
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、及び１８から選択されるＶＨ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号３のＶＨ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号４のＶＨ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号５のＶＨ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号６のＶＨ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号７のＶＨ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号８のＶＨ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号９のＶＨ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１０のＶＨ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１１のＶＨ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１２のＶＨ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１３のＶＨ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１４のＶＨ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１５のＶＨ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１６のＶＨ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１７のＶＨ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１８のＶＨ配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、配列番号４、５、６、８、９、１０、１２、１３、１４、１６、１７、及び１８に提供されるＶＨ配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有するＶＨ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５のアミノ酸置換を有する配列番号４、５、６、８、９、１０、１２、１３、１４、１６、１７、及び１８で提供されるＶＨ配列を含む。一部の態様では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態では、本段落で記載される抗体は、本明細書では「バリアント」と呼ばれる。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、例えば、親和性成熟、部位特異的変異導入、ランダム変異導入、または当該技術分野で既知のもしくは本明細書に記載の他の任意の方法により、本明細書で提供される配列に由来する。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、本明細書で提供される配列に由来せず、例えば、抗体を得るための本明細書で提供される方法に従ってｄｅ ｎｏｖｏで単離されてもよい。
ＶＬドメイン
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１９、２０、２１、及び２２から選択されるＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１９のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号２０のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号２１のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号２２のＶＬ配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１９、２０、２１、及び２２で提供される例示のＶＬ配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有するＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、最大１、１９、３、２０、５、２１、７、２２、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５のアミノ酸置換を有する配列番号２、４、６、及び８で提供されるＶＬ配列を含む。一部の態様では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態では、本段落で記載される抗体は、本明細書では「バリアント」と呼ばれる。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、例えば、親和性成熟、部位特異的変異導入、ランダム変異導入、または当該技術分野で既知のもしくは本明細書に記載の他の任意の方法により、本明細書で提供される配列に由来する。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、本明細書で提供される配列に由来せず、例えば、抗体を得るための本明細書で提供される方法に従ってｄｅ ｎｏｖｏで単離されてもよい。
ＶＨ－ＶＬの組み合わせ
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、及び１８から選択されるＶＨ配列、ならびに、配列番号１９、２０、２１、及び２２から選択されるＶＬ配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１７のＶＨ配列及び配列番号２０のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１７のＶＨ配列及び配列番号１９のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１７のＶＨ配列及び配列番号２１のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１７のＶＨ配列及び配列番号２２のＶＬ配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１６のＶＨ配列及び配列番号１９のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１６のＶＨ配列及び配列番号２０のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１６のＶＨ配列及び配列番号２１のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１６のＶＨ配列及び配列番号２２のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１８のＶＨ配列及び配列番号１９のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１８のＶＨ配列及び配列番号２０のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１８のＶＨ配列及び配列番号２１のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１８のＶＨ配列及び配列番号２２のＶＬ配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１３のＶＨ配列及び配列番号２０のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１３のＶＨ配列及び配列番号１９のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１３のＶＨ配列及び配列番号２１のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１３のＶＨ配列及び配列番号２２のＶＬ配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１２のＶＨ配列及び配列番号１９のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１２のＶＨ配列及び配列番号２０のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１２のＶＨ配列及び配列番号２１のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１２のＶＨ配列及び配列番号２２のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１４のＶＨ配列及び配列番号１９のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１４のＶＨ配列及び配列番号２１のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１４のＶＨ配列及び配列番号２２のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１４のＶＨ配列及び配列番号２０のＶＬ配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号９のＶＨ配列及び配列番号２０のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号９のＶＨ配列及び配列番号１９のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号９のＶＨ配列及び配列番号２１のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号９のＶＨ配列及び配列番号２２のＶＬ配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号８のＶＨ配列及び配列番号１９のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号８のＶＨ配列及び配列番号２０のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号８のＶＨ配列及び配列番号２１のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号８のＶＨ配列及び配列番号２２のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１０のＶＨ配列及び配列番号１９のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１０のＶＨ配列及び配列番号２１のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１０のＶＨ配列及び配列番号２２のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１０のＶＨ配列及び配列番号２０のＶＬ配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号５のＶＨ配列及び配列番号２０のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号５のＶＨ配列及び配列番号１９のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号５のＶＨ配列及び配列番号２１のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号５のＶＨ配列及び配列番号２２のＶＬ配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号４のＶＨ配列及び配列番号１９のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号４のＶＨ配列及び配列番号２０のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号４のＶＨ配列及び配列番号２１のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号４のＶＨ配列及び配列番号２２のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号６のＶＨ配列及び配列番号１９のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号６のＶＨ配列及び配列番号２１のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号６のＶＨ配列及び配列番号２２のＶＬ配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号６のＶＨ配列及び配列番号２０のＶＬ配列を含む。
特定の態様では、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、及び１８のいずれかは、配列番号１９、２０、２１、及び２２のいずれかと組み合わせることができる。例えば、配列番号９は、配列番号１９、２０、２１、及び２２のいずれかと組み合わせることができる。別の例として、配列番号１７は、配列番号１９、２０、２１、及び２２のいずれかと組み合わせることができる。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、及び１８で提供される例示のＶＨ配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有するＶＨ配列、ならびに、配列番号１９、２０、２１、及び２２で提供される例示のＶＬ配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有するＶＬ配列、を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５のアミノ酸置換を有する配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、及び１８で提供されるＶＨ配列、ならびに、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５のアミノ酸置換を有する配列番号１９、２０、２１、及び２２で提供されるＶＬ配列、を含む。一部の態様では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態では、本段落で記載される抗体は、本明細書では「バリアント」と呼ばれる。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、例えば、親和性成熟、部位特異的変異導入、ランダム変異導入、または当該技術分野で既知のもしくは本明細書に記載の他の任意の方法により、本明細書で提供される配列に由来する。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、本明細書で提供される配列に由来せず、例えば、抗体を得るための本明細書で提供される方法に従ってｄｅ ｎｏｖｏで単離されてもよい。
ＣＤＲ
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、及び１８から選択されるＶＨドメインの１～３つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、及び１８から選択されるＶＨドメインの２～３つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、及び１８から選択されるＶＨドメインの３つのＣＤＲを含む。一部の態様では、ＣＤＲは、例示的なＣＤＲである。一部の態様では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲである。一部の態様では、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲである。一部の態様では、ＣＤＲは、ＡｂＭ ＣＤＲである。一部の態様では、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔ ＣＤＲである。一部の態様では、ＣＤＲは、ＩＭＧＴ ＣＤＲである。
一部の実施形態では、ＣＤＲは、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、及び１８のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、またはＣＤＲ－Ｈ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するＣＤＲである。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ１は、最大１、２、３、４、または５つのアミノ酸置換を有する配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、及び１８から選択されるＶＨドメインのＣＤＲ－Ｈ１である。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ２は、最大１、２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸置換を有する配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、及び１８から選択されるＶＨドメインのＣＤＲ－Ｈ２である。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ３は、最大１、２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸置換を有する配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、及び１８から選択されるＶＨドメインのＣＤＲ－Ｈ３である。一部の態様では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態では、本段落で記載される抗体は、本明細書では「バリアント」と呼ばれる。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、例えば、親和性成熟、部位特異的変異導入、ランダム変異導入、または当該技術分野で既知のもしくは本明細書に記載の他の任意の方法により、本明細書で提供される配列に由来する。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、本明細書で提供される配列に由来せず、例えば、抗体を得るための本明細書で提供される方法に従ってｄｅ ｎｏｖｏで単離されてもよい。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１９、２０、２１、及び２２から選択されるＶＬドメインの１～３つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１９、２０、２１、及び２２から選択されるＶＬドメインの２～３つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号１９、２０、２１、及び２２から選択されるＶＬドメインの３つのＣＤＲを含む。一部の態様では、ＣＤＲは、例示的なＣＤＲである。一部の態様では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲである。一部の態様では、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲである。一部の態様では、ＣＤＲは、ＡｂＭ ＣＤＲである。一部の態様では、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔ ＣＤＲである。一部の態様では、ＣＤＲは、ＩＭＧＴ ＣＤＲである。
一部の実施形態では、ＣＤＲは、配列番号１９、２０、２１、及び２２のＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、またはＣＤＲ－Ｌ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有するＣＤＲである。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｌ１は、最大１、１９、３、２０、または５つのアミノ酸置換を有する配列番号２、４、２１、及び２２から選択されるＶＬドメインのＣＤＲ－Ｌ１である。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｌ１９は、最大１、２、３、２０、５、２１、７、または２２つのアミノ酸置換を有する配列番号２、４、６、及び８から選択されるＶＬドメインのＣＤＲ－Ｌ２である。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｌ３は、最大１、１９、３、２０、５、２１、７、または２２つのアミノ酸置換を有する配列番号２、４、６、及び８から選択されるＶＬドメインのＣＤＲ－Ｌ３である。一部の態様では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態では、本段落で記載される抗体は、本明細書では「バリアント」と呼ばれる。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、例えば、親和性成熟、部位特異的変異導入、ランダム変異導入、または当該技術分野で既知のもしくは本明細書に記載の他の任意の方法により、本明細書で提供される配列に由来する。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、本明細書で提供される配列に由来せず、例えば、抗体を得るための本明細書で提供される方法に従ってｄｅ ｎｏｖｏで単離されてもよい。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、及び１８から選択されるＶＨドメインの１～３つのＣＤＲ、ならびに、配列番号１９、２０、２１、及び２２から選択されるＶＬドメイン１～３つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、及び１８から選択されるＶＨドメインの２～３つのＣＤＲ、ならびに、配列番号１９、２０、２１、及び２２から選択されるＶＬドメイン２～３つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、及び１８から選択されるＶＨドメインの３つのＣＤＲ、ならびに、配列番号１９、２０、２１、及び２２から選択されるＶＬドメイン３つのＣＤＲを含む。一部の態様では、ＣＤＲは、例示的なＣＤＲである。一部の態様では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲである。一部の態様では、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲである。一部の態様では、ＣＤＲは、ＡｂＭ ＣＤＲである。一部の態様では、ＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔ ＣＤＲである。一部の態様では、ＣＤＲは、ＩＭＧＴ ＣＤＲである。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号２５、２９、３０、３１、３２、及び３３から選択されるＣＤＲ－Ｈ３を含む。一部の態様では、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号２５、２９、３０、３１、３２、及び３３のＣＤＲ－Ｈ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ３は、最大１、２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸置換を有する、配列番号２５、２９、３０、３１、３２、及び３３から選択されるＣＤＲ－Ｈ３である。一部の態様では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態では、本段落で記載される抗体は、本明細書では「バリアント」と呼ばれる。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、例えば、親和性成熟、部位特異的変異導入、ランダム変異導入、または当該技術分野で既知のもしくは本明細書に記載の他の任意の方法により、本明細書で提供される配列に由来する。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、本明細書で提供される配列に由来せず、例えば、抗体を得るための本明細書で提供される方法に従ってｄｅ ｎｏｖｏで単離されてもよい。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号３３から選択されるＣＤＲ－Ｈ３を含む。一部の態様では、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号３３のＣＤＲ－Ｈ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ３は、最大１、２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸置換を有する配列番号３３から選択されるＣＤＲ－Ｈ３である。一部の態様では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態では、本段落で記載される抗体は、本明細書では「バリアント」と呼ばれる。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、例えば、親和性成熟、部位特異的変異導入、ランダム変異導入、または当該技術分野で既知のもしくは本明細書に記載の他の任意の方法により、本明細書で提供される配列に由来する。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、本明細書で提供される配列に由来せず、例えば、抗体を得るための本明細書で提供される方法に従ってｄｅ ｎｏｖｏで単離されてもよい。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号３２から選択されるＣＤＲ－Ｈ３を含む。一部の態様では、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号３２のＣＤＲ－Ｈ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ３は、最大１、２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸置換を有する配列番号３２から選択されるＣＤＲ－Ｈ３である。一部の態様では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態では、本段落で記載される抗体は、本明細書では「バリアント」と呼ばれる。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、例えば、親和性成熟、部位特異的変異導入、ランダム変異導入、または当該技術分野で既知のもしくは本明細書に記載の他の任意の方法により、本明細書で提供される配列に由来する。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、本明細書で提供される配列に由来せず、例えば、抗体を得るための本明細書で提供される方法に従ってｄｅ ｎｏｖｏで単離されてもよい。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号２５から選択されるＣＤＲ－Ｈ３を含む。一部の態様では、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号２５のＣＤＲ－Ｈ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ３は、最大１、２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸置換を有する配列番号２５から選択されるＣＤＲ－Ｈ３である。一部の態様では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態では、本段落で記載される抗体は、本明細書では「バリアント」と呼ばれる。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、例えば、親和性成熟、部位特異的変異導入、ランダム変異導入、または当該技術分野で既知のもしくは本明細書に記載の他の任意の方法により、本明細書で提供される配列に由来する。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、本明細書で提供される配列に由来せず、例えば、抗体を得るための本明細書で提供される方法に従ってｄｅ ｎｏｖｏで単離されてもよい。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２を含む。一部の態様では、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ２は、最大１、２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸置換を有する配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２である。一部の態様では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態では、本段落で記載される抗体は、本明細書では「バリアント」と呼ばれる。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、例えば、親和性成熟、部位特異的変異導入、ランダム変異導入、または当該技術分野で既知のもしくは本明細書に記載の他の任意の方法により、本明細書で提供される配列に由来する。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、本明細書で提供される配列に由来せず、例えば、抗体を得るための本明細書で提供される方法に従ってｄｅ ｎｏｖｏで単離されてもよい。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１を含む。一部の態様では、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ１は、最大１、２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸置換を有する配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１である。一部の態様では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態では、本段落で記載される抗体は、本明細書では「バリアント」と呼ばれる。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、例えば、親和性成熟、部位特異的変異導入、ランダム変異導入、または当該技術分野で既知のもしくは本明細書に記載の他の任意の方法により、本明細書で提供される配列に由来する。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、本明細書で提供される配列に由来せず、例えば、抗体を得るための本明細書で提供される方法に従ってｄｅ ｎｏｖｏで単離されてもよい。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号２９のＣＤＲ－Ｈ３及び配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号２９のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１を含む。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号２９のＣＤＲ－Ｈ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ３は、最大１、２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸置換を有する配列番号２９のＣＤＲ－Ｈ３であり；ＣＤＲ－Ｈ２は、最大１、２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸置換を有する配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２であり；ＣＤＲ－Ｈ１は、最大１、２、３、４、または５つのアミノ酸置換を有する配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１である。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号２５のＣＤＲ－Ｈ３及び配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号２５のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１を含む。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号２５のＣＤＲ－Ｈ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ３は、最大１、２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸置換を有する配列番号２５のＣＤＲ－Ｈ３であり；ＣＤＲ－Ｈ２は、最大１、２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸置換を有する配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２であり；ＣＤＲ－Ｈ１は、最大１、２、３、４、または５つのアミノ酸置換を有する配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１である。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号３３のＣＤＲ－Ｈ３及び配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号３３のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１を含む。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号３３のＣＤＲ－Ｈ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ３は、最大１、２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸置換を有する配列番号３３のＣＤＲ－Ｈ３であり；ＣＤＲ－Ｈ２は、最大１、２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸置換を有する配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２であり；ＣＤＲ－Ｈ１は、最大１、２、３、４、または５つのアミノ酸置換を有する配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１である。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号３２のＣＤＲ－Ｈ３及び配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号３２のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１を含む。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号３２のＣＤＲ－Ｈ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ３は、最大１、２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸置換を有する配列番号３２のＣＤＲ－Ｈ３であり；ＣＤＲ－Ｈ２は、最大１、２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸置換を有する配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２であり；ＣＤＲ－Ｈ１は、最大１、２、３、４、または５つのアミノ酸置換を有する配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１である。一部の態様では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態では、本段落で記載される抗体は、本明細書では「バリアント」と呼ばれる。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、例えば、親和性成熟、部位特異的変異導入、ランダム変異導入、または当該技術分野で既知のもしくは本明細書に記載の他の任意の方法により、本明細書で提供される配列に由来する。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、本明細書で提供される配列に由来せず、例えば、抗体を得るための本明細書で提供される方法に従ってｄｅ ｎｏｖｏで単離されてもよい。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号３０のＣＤＲ－Ｈ３及び配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号３０のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号３１のＣＤＲ－Ｈ３及び配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号３１のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号２８のＣＤＲ－Ｌ３を含む。一部の態様では、ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号２８のＣＤＲ－Ｌ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｌ３は、最大１、２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸置換を有する配列番号２８のＣＤＲ－Ｌ３である。一部の態様では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態では、本段落で記載される抗体は、本明細書では「バリアント」と呼ばれる。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、例えば、親和性成熟、部位特異的変異導入、ランダム変異導入、または当該技術分野で既知のもしくは本明細書に記載の他の任意の方法により、本明細書で提供される配列に由来する。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、本明細書で提供される配列に由来せず、例えば、抗体を得るための本明細書で提供される方法に従ってｄｅ ｎｏｖｏで単離されてもよい。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号２７のＣＤＲ－Ｌ２を含む。一部の態様では、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号２７のＣＤＲ－Ｌ２と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｌ２は、最大１、２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸置換を有する配列番号２７のＣＤＲ－Ｌ２である。一部の態様では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態では、本段落で記載される抗体は、本明細書では「バリアント」と呼ばれる。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、例えば、親和性成熟、部位特異的変異導入、ランダム変異導入、または当該技術分野で既知のもしくは本明細書に記載の他の任意の方法により、本明細書で提供される配列に由来する。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、本明細書で提供される配列に由来せず、例えば、抗体を得るための本明細書で提供される方法に従ってｄｅ ｎｏｖｏで単離されてもよい。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号２６のＣＤＲ－Ｌ１を含む。一部の態様では、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号２６のＣＤＲ－Ｌ１と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｌ１は、最大１、２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸置換を有する配列番号２６のＣＤＲ－Ｌ１である。一部の態様では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態では、本段落で記載される抗体は、本明細書では「バリアント」と呼ばれる。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、例えば、親和性成熟、部位特異的変異導入、ランダム変異導入、または当該技術分野で既知のもしくは本明細書に記載の他の任意の方法により、本明細書で提供される配列に由来する。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、本明細書で提供される配列に由来せず、例えば、抗体を得るための本明細書で提供される方法に従ってｄｅ ｎｏｖｏで単離されてもよい。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号２８のＣＤＲ－Ｌ３及び配列番号２７のＣＤＲ－Ｌ２を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号２８のＣＤＲ－Ｌ３、配列番号２７のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２６のＣＤＲ－Ｌ１を含む。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号２８のＣＤＲ－Ｌ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号２７のＣＤＲ－Ｌ２と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号２６のＣＤＲ－Ｌ１と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｌ３は、最大１、２、３、４、または５つのアミノ酸置換を有する配列番号２８のＣＤＲ－Ｌ３であり；ＣＤＲ－Ｌ２は、最大１、２、３、または４つのアミノ酸置換を有する配列番号２７のＣＤＲ－Ｌ２であり；ＣＤＲ－Ｌ１は、最大１、２、３、４、５、または６つのアミノ酸置換を有する配列番号２６のＣＤＲ－Ｌ１である。一部の態様では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態では、本段落で記載される抗体は、本明細書では「バリアント」と呼ばれる。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、例えば、親和性成熟、部位特異的変異導入、ランダム変異導入、または当該技術分野で既知のもしくは本明細書に記載の他の任意の方法により、本明細書で提供される配列に由来する。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、本明細書で提供される配列に由来せず、例えば、抗体を得るための本明細書で提供される方法に従ってｄｅ ｎｏｖｏで単離されてもよい。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号３３のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２８のＣＤＲ－Ｌ３、配列番号２７のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２６のＣＤＲ－Ｌ１を含む。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号３３のＣＤＲ－Ｈ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号２８のＣＤＲ－Ｌ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号２７のＣＤＲ－Ｌ２と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号２６のＣＤＲ－Ｌ１と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ３は、最大１、２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸置換を有する配列番号３３のＣＤＲ－Ｈ３であり；ＣＤＲ－Ｈ２は、最大１、２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸置換を有する配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２であり；ＣＤＲ－Ｈ１は、最大１、２、３、４、または５つのアミノ酸置換を有する配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１であり；ＣＤＲ－Ｌ３は、最大１、２、３、４、または５つのアミノ酸置換を有する配列番号２８のＣＤＲ－Ｌ３であり；ＣＤＲ－Ｌ２は、最大１、２、３、または４つのアミノ酸置換を有する配列番号２７のＣＤＲ－Ｌ２であり；ＣＤＲ－Ｌ１は、最大１、２、３、４、５、または６つのアミノ酸置換を有する配列番号２６のＣＤＲ－Ｌ１である。一部の態様では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態では、本段落で記載される抗体は、本明細書では「バリアント」と呼ばれる。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、例えば、親和性成熟、部位特異的変異導入、ランダム変異導入、または当該技術分野で既知のもしくは本明細書に記載の他の任意の方法により、本明細書で提供される配列に由来する。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、本明細書で提供される配列に由来せず、例えば、抗体を得るための本明細書で提供される方法に従ってｄｅ ｎｏｖｏで単離されてもよい。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号３２のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２８のＣＤＲ－Ｌ３、配列番号２７のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２６のＣＤＲ－Ｌ１を含む。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号３２のＣＤＲ－Ｈ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号２８のＣＤＲ－Ｌ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号２７のＣＤＲ－Ｌ２と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号２６のＣＤＲ－Ｌ１と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ３は、最大１、２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸置換を有する配列番号３２のＣＤＲ－Ｈ３であり；ＣＤＲ－Ｈ２は、最大１、２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸置換を有する配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２であり；ＣＤＲ－Ｈ１は、最大１、２、３、４、または５つのアミノ酸置換を有する配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１であり；ＣＤＲ－Ｌ３は、最大１、２、３、４、または５つのアミノ酸置換を有する配列番号２８のＣＤＲ－Ｌ３であり；ＣＤＲ－Ｌ２は、最大１、２、３、または４つのアミノ酸置換を有する配列番号２７のＣＤＲ－Ｌ２であり；ＣＤＲ－Ｌ１は、最大１、２、３、４、５、または６つのアミノ酸置換を有する配列番号２６のＣＤＲ－Ｌ１である。一部の態様では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態では、本段落で記載される抗体は、本明細書では「バリアント」と呼ばれる。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、例えば、親和性成熟、部位特異的変異導入、ランダム変異導入、または当該技術分野で既知のもしくは本明細書に記載の他の任意の方法により、本明細書で提供される配列に由来する。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、本明細書で提供される配列に由来せず、例えば、抗体を得るための本明細書で提供される方法に従ってｄｅ ｎｏｖｏで単離されてもよい。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号２９のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２８のＣＤＲ－Ｌ３、配列番号２７のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２６のＣＤＲ－Ｌ１を含む。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号２９のＣＤＲ－Ｈ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号２８のＣＤＲ－Ｌ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号２７のＣＤＲ－Ｌ２と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号２６のＣＤＲ－Ｌ１と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ３は、最大１、２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸置換を有する配列番号２９のＣＤＲ－Ｈ３であり；ＣＤＲ－Ｈ２は、最大１、２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸置換を有する配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２であり；ＣＤＲ－Ｈ１は、最大１、２、３、４、または５つのアミノ酸置換を有する配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１であり；ＣＤＲ－Ｌ３は、最大１、２、３、４、または５つのアミノ酸置換を有する配列番号２８のＣＤＲ－Ｌ３であり；ＣＤＲ－Ｌ２は、最大１、２、３、または４つのアミノ酸置換を有する配列番号２７のＣＤＲ－Ｌ２であり；ＣＤＲ－Ｌ１は、最大１、２、３、４、５、または６つのアミノ酸置換を有する配列番号２６のＣＤＲ－Ｌ１である。一部の態様では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態では、本段落で記載される抗体は、本明細書では「バリアント」と呼ばれる。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、例えば、親和性成熟、部位特異的変異導入、ランダム変異導入、または当該技術分野で既知のもしくは本明細書に記載の他の任意の方法により、本明細書で提供される配列に由来する。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、本明細書で提供される配列に由来せず、例えば、抗体を得るための本明細書で提供される方法に従ってｄｅ ｎｏｖｏで単離されてもよい。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号２５のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２８のＣＤＲ－Ｌ３、配列番号２７のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２６のＣＤＲ－Ｌ１を含む。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号２５のＣＤＲ－Ｈ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号２８のＣＤＲ－Ｌ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号２７のＣＤＲ－Ｌ２と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号２６のＣＤＲ－Ｌ１と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ３は、最大１、２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸置換を有する配列番号２５のＣＤＲ－Ｈ３であり；ＣＤＲ－Ｈ２は、最大１、２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸置換を有する配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２であり；ＣＤＲ－Ｈ１は、最大１、２、３、４、または５つのアミノ酸置換を有する配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１であり；ＣＤＲ－Ｌ３は、最大１、２、３、４、または５つのアミノ酸置換を有する配列番号２８のＣＤＲ－Ｌ３であり；ＣＤＲ－Ｌ２は、最大１、２、３、または４つのアミノ酸置換を有する配列番号２７のＣＤＲ－Ｌ２であり；ＣＤＲ－Ｌ１は、最大１、２、３、４、５、または６つのアミノ酸置換を有する配列番号２６のＣＤＲ－Ｌ１である。一部の態様では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態では、本段落で記載される抗体は、本明細書では「バリアント」と呼ばれる。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、例えば、親和性成熟、部位特異的変異導入、ランダム変異導入、または当該技術分野で既知のもしくは本明細書に記載の他の任意の方法により、本明細書で提供される配列に由来する。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、本明細書で提供される配列に由来せず、例えば、抗体を得るための本明細書で提供される方法に従ってｄｅ ｎｏｖｏで単離されてもよい。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号３０または３１のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２８のＣＤＲ－Ｌ３、配列番号２７のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２６のＣＤＲ－Ｌ１を含む。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号３０または３１のＣＤＲ－Ｈ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号２８のＣＤＲ－Ｌ３と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号２７のＣＤＲ－Ｌ２と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号２６のＣＤＲ－Ｌ１と少なくとも約５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。一部の実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ３は、最大１、２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸置換を有する配列番号３０または３１のＣＤＲ－Ｈ３であり；ＣＤＲ－Ｈ２は、最大１、２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸置換を有する配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２であり；ＣＤＲ－Ｈ１は、最大１、２、３、４、または５つのアミノ酸置換を有する配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１であり；ＣＤＲ－Ｌ３は、最大１、２、３、４、または５つのアミノ酸置換を有する配列番号２８のＣＤＲ－Ｌ３であり；ＣＤＲ－Ｌ２は、最大１、２、３、または４つのアミノ酸置換を有する配列番号２７のＣＤＲ－Ｌ２であり；ＣＤＲ－Ｌ１は、最大１、２、３、４、５、または６つのアミノ酸置換を有する配列番号２６のＣＤＲ－Ｌ１である。一部の態様では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。一部の実施形態では、本段落で記載される抗体は、本明細書では「バリアント」と呼ばれる。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、例えば、親和性成熟、部位特異的変異導入、ランダム変異導入、または当該技術分野で既知のもしくは本明細書に記載の他の任意の方法により、本明細書で提供される配列に由来する。一部の実施形態では、そのようなバリアントは、本明細書で提供される配列に由来せず、例えば、抗体を得るための本明細書で提供される方法に従ってｄｅ ｎｏｖｏで単離されてもよい。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号３３のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号２６のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２７のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２８のＣＤＲ－Ｌ３を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号２５のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号２６のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２７のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２８のＣＤＲ－Ｌ３を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号２９のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号２６のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２７のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２８のＣＤＲ－Ｌ３を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号３２のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号２６のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２７のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２８のＣＤＲ－Ｌ３を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号３０のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号２６のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２７のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２８のＣＤＲ－Ｌ３を含む。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、配列番号２３のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２４のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号３１のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号２６のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号２７のＣＤＲ－Ｌ２、及び配列番号２８のＣＤＲ－Ｌ３を含む。
Ｆｃ領域
本明細書の「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。用語は、天然配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む。種々の免疫グロブリンのＦｃ領域の構造、及びそこに含有されるグリコシル化部位は、当該技術分野で既知である。全体が参照により組み込まれるＳｃｈｒｏｅｄｅｒ ａｎｄ Ｃａｖａｃｉｎｉ，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１０，１２５：Ｓ４１－５２を参照のこと。Ｆｃ領域は、天然に存在するＦｃ領域、または当該技術分野または本開示の他の箇所に記載されるように改変されたＦｃ領域であってよい。
本明細書で別途指定のない限り、Ｆｃ領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムによるものである。本明細書で使用される二量体Ｆｃの「Ｆｃポリペプチド」は、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドのうちの１つ、すなわち、安定した自己会合が可能な免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、二量体ＩｇＧＦｃのＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメイン配列を含む。Ｆｃは、クラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭのものであり得、これらのいくつかはさらに、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に分けられてもよい。
「Ｆｃ受容体」及び「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体について説明するために使用される。例えば、ＦｃＲは、天然配列のヒトＦｃＲであり得る。一般に、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）と結合するものであり、対立遺伝子バリアント及びこれらの受容体の選択的スプライシング型を含むＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、主に細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有するＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含む。他のアイソタイプの免疫グロブリンは、特定のＦｃＲに結合することもできる（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，ＮＹ）（４ｔｈ ｅｄ．，１９９９）を参照のこと）。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインに免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインに免疫受容体チロシン系阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３～２３４（１９９７）で概説される）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７－９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５－３４（１９９４）、及びｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０－４１（１９９５）で概説される。将来的に同定されるべきものを含む他のＦｃＲは、本明細書では「ＦｃＲ」という用語に包含される。用語は、母系ＩｇＧの胎児への移入に関与する、新生児受容体ＦｃＲｎも含む（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）；及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。
ＣＨ２ドメインの修飾は、ＦｃへのＦｃＲの結合に影響を与え得る。Ｆｃ領域における多数のアミノ酸改変は、異なるＦｃガンマ受容体に対するＦｃの親和性を選択的に変更するために当該技術分野で既知である。一部の態様では、Ｆｃは、Ｆｃ－ガンマ受容体の選択的結合を促進する１つ以上の改変を含む。
ＦｃＲのＦｃへの結合を変化させる例示的な変異が以下に列挙される：
Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ／Ｋ３２６Ａ（Ｌｕ Ｙ，Ｖｅｒｎｅｓ ＪＭ，Ｃｈｉａｎｇ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１１ Ｆｅｂ ２８；３６５（１－２）：１３２－４１）；
Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｌ２３５Ｖ／Ｐ３９６Ｌ（Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ ＪＢ，Ｇｏｒｌａｔｏｖ Ｓ，Ｔｕａｉｌｌｏｎ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７ Ｓｅｐ １５；６７（１８）：８８８２－９０；Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ ＪＬ，Ｇｏｒｌａｔｏｖ Ｓ，Ｚｈａｎｇ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１１ Ｎｏｖ ３０；１３（６）：Ｒ１２３）；
Ｆ２４３Ｌ（Ｓｔｅｗａｒｔ Ｒ，Ｔｈｏｍ Ｇ，Ｌｅｖｅｎｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２０１１ Ｓｅｐ；２４（９）：６７１－８．），Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ（Ｓｈｉｅｌｄｓ ＲＬ，Ｎａｍｅｎｕｋ ＡＫ，Ｈｏｎｇ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００１ Ｍａｒ ２；２７６（９）：６５９１－６０４）；
Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（Ｌａｚａｒ ＧＡ，Ｄａｎｇ Ｗ，Ｋａｒｋｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００６ Ｍａｒ １４；１０３（１１）：４００５－１０）；
Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２６７Ｅ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ（Ｃｈｕ ＳＹ，Ｖｏｓｔｉａｒ Ｉ，Ｋａｒｋｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８ Ｓｅｐ；４５（１５）：３９２６－３３）；
Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｓ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｓ２９８Ａ／Ｋ３２６Ａ／Ａ３２７Ｈ、Ｇ２３７Ｆ／Ｓ２９８Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｅ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２９８Ａ、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２７０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｄ、Ｌ２３４Ｆ／Ｓ２６７Ｅ／Ｎ３２５Ｌ、Ｇ２３７Ｆ／Ｖ２６６Ｌ／Ｓ２６７ＤならびにＷＯ２０１１／１２０１３４及びＷＯ２０１１／１２０１３５（参照により本明細書に組み込まれる）に列挙される他の変異。Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｗｉｌｌｉａｍ Ｒ．Ｓｔｒｏｈｌ ａｎｄ Ｌｉｌａ Ｍ．Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｎｏ １１，ＩＳＢＮ １ ９０７５６８ ３７ ９，Ｏｃｔ ２０１２）は、２８３頁に変異を列挙する。
一部の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、エフェクター機能を媒介する能力を改善する修飾を含む。そのような修飾は、当該技術分野で既知であり、アフコシル化、または活性化受容体に対するＦｃの親和性の操作、主に、ＡＤＣＣの場合ＦＣＧＲ３ａ、及びＣＤＣの場合Ｃ１ｑを含む。次の表Ｂは、エフェクター機能工学に関する文献で報告される種々の設計をまとめたものである。
アミノ酸配列を改変することなく、Ｆｃグリコシル化部位（Ａｓｎ２９７ＥＵ番号付け）にフコースをほとんどまたは全く有さない抗体を産生する方法は、当該技術分野で周知である。ＧｌｙｍａｘＸ（登録商標）テクノロジー（ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ ＡＧ）は、抗体産生に使用される細胞へのフコース生合成の細胞経路を偏向させる酵素の遺伝子の導入に基づく。これは、抗体産生細胞によるＮ結合型抗体炭水化物部分への糖「フコース」の付加を防止する（ｖｏｎ Ｈｏｒｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０ Ｄｅｃ；２０（１２）：１６０７－１８）。フコシル化のレベルが低下した抗体を得るための別のアプローチは、米国特許第８，４０９，５７２号に見出すことができ、これは、抗体のフコシル化のレベルの低下を生じる能力について抗体産生のための細胞株を選択することを教示する。抗体は、完全にアフコシル化することができ（それらが、検出可能なフコースを含有しないことを意味する）、または、それらは、部分的にアフコシル化することができ、このことは、単離抗体が、哺乳動物発現系により産生された類似の抗体について通常検出されるフコースの量の９５％未満、８５％未満、７５％未満、６５％未満、５５％未満、４５％未満、３５％未満、２５％未満、１５％未満、または５％未満を含有することを意味する。
従って、一実施形態では、本明細書に記載の抗体は、改善されたエフェクター機能を与える、表Ｂに記載されるような１つ以上のアミノ酸修飾を含む二量体Ｆｃを含み得る。別の実施形態では、抗体は、エフェクター機能を改善するようにアフコシル化することができる。
（表Ｂ）ＣＨ２ドメイン及びエフェクター機能の操作
Figure 0007492522000002
ＦｃγＲ及び／または補体結合及び／またはエフェクター機能を低減させるＦｃ改変は、当該技術分野で既知である。近年の刊行物は、エフェクター活性が低減またはサイレンシングされた抗体を操作するために使用されている方策について説明する（Ｓｔｒｏｈｌ，ＷＲ（２００９），Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０：６８５－６９１，ａｎｄ Ｓｔｒｏｈｌ，ＷＲ ａｎｄ Ｓｔｒｏｈｌ ＬＭ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ”Ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０１２），ｐｐ ２２５－２４９を参照のこと）。これらの方策は、グリコシル化の修飾によるエフェクター機能の低減、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４足場の使用、またはヒンジもしくはＦｃのＣＨ２領域への変異の導入を含む。例えば、米国特許公開第２０１１／０２１２０８７号（Ｓｔｒｏｈｌ）、国際特許公開第ＷＯ２００６／１０５３３８号（Ｘｅｎｃｏｒ）、米国特許公開第２０１２／０２２５０５８号（Ｘｅｎｃｏｒ）、米国特許公開第２０１２／０２５１５３１号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、及びＳｔｒｏｐ ｅｔ ａｌ（（２０１２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２０：２０４－２１９）は、Ｆｃに結合するＦｃγＲまたは補体を低減させる特定の修飾について説明する。
ＦｃへのＦｃγＲまたは補体の結合を低減させる既知のアミノ酸修飾の特定の非限定例としては、以下の表Ｃで同定されるものを含む。
（表Ｃ）ＦｃへのＦｃγＲまたは補体の結合を低減させる改変
Figure 0007492522000003
アミノ酸配列を改変することなく、Ｆｃグリコシル化部位（Ａｓｎ２９７ＥＵ番号付け）にフコースをほとんどまたは全く有さない抗体を産生する方法は、当該技術分野で周知である。ＧｌｙｍａｘＸ（登録商標）テクノロジー（ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ ＡＧ）は、抗体産生に使用される細胞へのフコース生合成の細胞経路を偏向させる酵素の遺伝子の導入に基づく。これは、抗体産生細胞によるＮ結合型抗体炭水化物部分への糖「フコース」の付加を防止する（ｖｏｎ Ｈｏｒｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０ Ｄｅｃ；２０（１２）：１６０７－１８）。脱フコシル化抗体を産生可能な細胞株の例は、細菌オキシドレダクターゼＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキシロースレダクターゼ（ＲＭＤ）の安定した過剰発現を伴うＣＨＯ－ＤＧ４４（Ｈｅｎｎｉｎｇ ｖｏｎ Ｈｏｒｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ ２０１０，２０：１６０７－１６１８を参照のこと）またはＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞を含み、これは、タンパク質のフコシル化（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１９８６，２４９：５３３－５４５；米国特許公報第２００３／０１５７１０８号；ＷＯ２００４／０５６３１２（これらのそれぞれは、全体が参照により組み込まれる）を参照のこと）ならびにノックアウト細胞株、例えば、アルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子またはＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞（Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００４，８７：６１４－６２２；Ｋａｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００６，９４：６８０－６８８；及びＷＯ２００３／０８５１０７（これらのそれぞれは、全体が参照により組み込まれる）を参照のこと）を欠損している。フコシル化のレベルが低下した抗体を得るための別のアプローチは、米国特許第８，４０９，５７２号に見出すことができ、これは、抗体のフコシル化のレベルの低下を生じる能力について抗体産生のための細胞株を選択することを教示する。
脱フコシル化抗体を産生することが可能な細胞株の例としては、タンパク質フコシル化が欠損している、細菌性酸化還元酵素であるＧＤＰ－６－デオキシ－Ｄ－リキソ－４－ヘキシロースレダクターゼ（ＲＭＤ）の安定した過剰発現を有するＣＨＯ－ＤＧ４４（Ｈｅｎｎｉｎｇ ｖｏｎ Ｈｏｒｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ ２０１０，２０：１６０７－１６１８を参照のこと）またはＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１９８６，２４９：５３３－５４５；米国特許公開第２００３／０１５７１０８号；ＷＯ２００４／０５６３１２（これらのそれぞれは、全体が参照により組み込まれる）を参照のこと）、ならびにアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子などのノックアウト細胞株またはＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞（Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００４，８７：６１４－６２２；Ｋａｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００６，９４：６８０－６８８；及びＷＯ ２００３／０８５１０７（これらのそれぞれは、全体が参照により組み込まれる）を参照のこと）が挙げられる。
抗体は、完全にアフコシル化することができ（それらが、検出可能なフコースを含有しないことを意味する）、または、それらは、部分的にアフコシル化することができ、このことは、単離抗体が、哺乳動物発現系により産生された類似の抗体について通常検出されるフコースの量の９５％未満、８５％未満、７５％未満、６５％未満、５５％未満、４５％未満、３５％未満、２５％未満、１５％未満、または５％未満を含有することを意味する。
一部の態様では、本明細書で提供される抗体は、天然に存在するＩｇＧ１ドメインと比較して、Ａｓｎ２９７位でフコース含有量が低減したＩｇＧ１ドメインを含む。そのようなＦｃドメインは、改善されたＡＤＣＣを有することが既知である。全体が参照により組み込まれるＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００２，２７７：２６７３３－２６７４０を参照のこと。一部の態様では、そのような抗体は、Ａｓｎ２９７位に任意のフコースを含まない。フコースの量は、例えば、全体が参照により組み込まれるＷＯ２００８／０７７５４６に記載されるような任意の好適な方法を使用して決定されてもよい。
特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、及び３３４位のうちの１つ以上での置換、を有するＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、全体が参照により組み込まれるＬａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００６，１０３：４００５－４０１０で記載されるような２３９、３３２、及び３３０位での１つ以上のアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。
本明細書で提供される抗体に組み込まれ得る他の例示のグリコシル化バリアントは、例えば、米国特許公開第２００３／０１５７１０８号、同第２００４／００９３６２１号、同第２００３／０１５７１０８号、同第２００３／０１１５６１４号、同第２００２／０１６４３２８号、同第２００４／００９３６２１号、同第２００４／０１３２１４０号、同第２００４／０１１０７０４号、同第２００４／０１１０２８２号、同第２００４／０１０９８６５号；国際特許公開第２０００／６１７３９号、同第２００１／２９２４６号、同第２００３／０８５１１９号、同第２００３／０８４５７０号、同第２００５／０３５５８６号、同第２００５／０３５７７８号、同第２００５／０５３７４２号、同第２００２／０３１１４０号、Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００４，３３６：１２３９－１２４９、及びＹａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００４，８７：６１４－６２２に記載され、これらのそれぞれは、全体が参照により組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、Ｆｃ領域に結合しているオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を有するＦｃ領域を含む。そのような抗体バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。そのような抗体バリアントの例は、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７；ＷＯ１９９８／５８９６４；及びＷＯ１９９９／２２７６４に記載され、これらのそれぞれは、全体が参照により組み込まれる。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、Ｃ１ｑ結合及び／またはＣＤＣを改善または減少させる１つ以上の改変を含む。米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０００，１６４：４１７８－４１８４（これらのそれぞれは、全体が参照により組み込まれる）を参照のこと。
一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びＩｇＭから選択されるクラスの重鎖ヒト定常領域を含む。一部の実施形態では、抗体は、Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域である。一部の実施形態では、ヒトＦｃ領域は、クラスＩｇＧの、且つＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４から選択されるサブクラスの、ヒト重鎖定常領域を含む。一部の実施形態では、ヒトＦｃ領域は、野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃを含む。
結合
「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位及びその結合パートナー（例えば、抗原またはエピトープ）間の非共有相互作用の合計の強さを指す。別途明記のない限り、本明細書で使用される場合、「親和性」は、結合ペアのメンバー（例えば、抗体及び抗原またはエピトープ）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。パートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、解離平衡定数（ＫＤ）で表すことができる。解離平衡定数に寄与する速度論的成分は、以下でより詳細に説明される。親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標））またはバイオレイヤー干渉法（例えば、ＦＯＲＴＥＢＩＯ（登録商標））などの本明細書に記載のものを含む、当該技術分野で既知の一般的な方法により測定することができる。
標的分子への抗体の結合に関して、特定の抗原（例えば、ポリペプチド標的）または特定の抗原上のエピトープ「と結合する」、「と特異的結合すること」、「に特異的に結合する」、「に特異的である」、「と選択的に結合する」、及び「に選択的である」という用語は、（例えば、非標的分子との）非特異的または非選択的相互作用とは測定可能に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、標的分子への結合を測定し、それを非標的分子への結合と比較することにより測定することができる。特異的結合は、標的分子上で認識されるエピトープを模倣する対照分子との競合により決定することもできる。その場合、標的分子への抗体の結合が対照分子により競合的に阻害される場合、特異的結合が示される。一部の実施形態では、非標的分子に対するＴＲＥＭ１抗体の親和性は、ＴＲＥＭ１に対する親和性の約５０％未満である。一部の実施形態では、非標的分子に対するＴＲＥＭ１抗体の親和性は、ＴＲＥＭ１に対する親和性の約４０％未満である。一部の実施形態では、非標的分子に対するＴＲＥＭ１抗体の親和性は、ＴＲＥＭ１に対する親和性の約３０％未満である。一部の実施形態では、非標的分子に対するＴＲＥＭ１抗体の親和性は、ＴＲＥＭ１に対する親和性の約２０％未満である。一部の実施形態では、非標的分子に対するＴＲＥＭ１抗体の親和性は、ＴＲＥＭ１に対する親和性の約１０％未満である。一部の実施形態では、非標的分子に対するＴＲＥＭ１抗体の親和性は、ＴＲＥＭ１に対する親和性の約１％未満である。一部の実施形態では、非標的分子に対するＴＲＥＭ１抗体の親和性は、ＴＲＥＭ１に対する親和性の約０．１％未満である。
本明細書で使用される「ｋｄ」（ｓｅｃ－１）という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度定数を指す。この値は、ｋｏｆｆ値とも呼ばれる。
本明細書で使用される「ｋａ」（Ｍ－１×ｓｅｃ－１）という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度定数を指す。この値は、ｋｏｎ値とも呼ばれる。
本明細書で使用される「ＫＤ」（Ｍ）という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数を指す。ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ。一部の実施形態では、抗体の親和性は、そのような抗体及びその抗原間の相互作用についてのＫＤに関して説明される。明確にするために、当該技術分野で知られる通り、より小さいＫＤ値は、高い親和性相互作用を示すが、大きいＫＤ値は、低い親和性相互作用を示す。
本明細書で使用される「ＫＡ」（Ｍ－１）という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の会合平衡定数を指す。ＫＡ＝ｋａ／ｋｄ。
本明細書で２つ以上の抗体との関連で使用される場合、「と競合する」または「と交差競合する」という用語は、２つ以上の抗体が抗原（例えば、ＴＲＥＭ１）への結合について競合することを示す。１つの例示的なアッセイでは、ＴＲＥＭ１は、表面上にコーティングされ、第１のＴＲＥＭ１抗体と接触させ、その後、第２のＴＲＥＭ１抗体が加えられる。別の例示的なアッセイでは、第１のＴＲＥＭ１抗体が表面にコーティングされ、ＴＲＥＭ１と接触させ、次に、第２のＴＲＥＭ１抗体が加えられる。いずれのアッセイでも、第１のＴＲＥＭ１抗体の存在が第２のＴＲＥＭ１抗体の結合を低減させる場合、抗体は、互いに競合する。「と競合する」という用語は、１つの抗体が別の抗体の結合を低減させるが、抗体が逆の順序で加える時、競合が観察されない抗体の組み合わせも含む。しかし、一部の実施形態では、第１及び第２の抗体は、それらが加えられる順序に関係なく、互いの結合を阻害する。一部の実施形態では、１つの抗体は、抗原への別の抗体の結合を、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％（競合的結合アッセイで測定）低減させる。当業者は、ＴＲＥＭ１に対する抗体の親和性及び抗体の価数に基づいて、競合アッセイで使用される抗体の濃度を選択することができる。この定義に記載されるアッセイは、例示であり、当業者は、抗体が互いに競合するかどうかを決定するために任意の好適なアッセイを利用することができる。好適なアッセイは、例えば、Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，”ｉｎ Ａｓｓａｙ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］，Ｕｐｄａｔｅｄ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２４，２０１４（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｏｏｋｓ／ＮＢＫ９２４３４／；ａｃｃｅｓｓｅｄ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２９，２０１５）；Ｓｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２００１，４４：３０－３７；及びＦｉｎｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．，２０１１，５４：３５１－３５８に記載され、これらのそれぞれは、全体が参照により組み込まれる。
過剰な試験抗体（例えば、少なくとも２ｘ、５ｘ、１０ｘ、２０ｘ、または１００ｘ）が参照抗体の結合を、例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％阻害または遮断する（競合結合アッセイで測定）場合、試験抗体は、参照抗体と競合する。競合アッセイ（競合抗体）により同定される抗体は、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体、及び立体障害が発生するために参照抗体が結合しているエピトープに十分に近い隣接エピトープに結合する抗体を含む。例えば、ＴＲＥＭ１への結合について本明細書に記載の第１の抗体と競合する第２の競合抗体は、同定することができる。特定の場合では、第２の抗体は、第１の抗体の結合を、例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％遮断または阻害し得る（競合結合アッセイで測定）。特定の場合では、第２の抗体は、第１の抗体を５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％超、置換することができる。
一部の実施形態では、抗ＴＲＥＭ１抗体は、がん組織の外側に存在する骨髄細胞に実質的に結合しない。一部の実施形態では、抗ＴＲＥＭ１抗体は、がん組織に存在する刺激性骨髄細胞に実質的に結合しない。
一部の実施形態では、抗ＴＲＥＭ１抗体は、ヒトＴＲＥＭ１の残基２１～３４（配列番号４２）、１０３～１０９（配列番号４３）、及び１２８～１３６（配列番号４４）に結合する。結合エピトープは、数値範囲内の残基（例えば、ＴＲＥＭ１の残基２２～３３）、各範囲の開始残基（例えば、ＴＲＥＭ１の残基２１～３３）、及び各範囲の終了残基（例えば、ＴＲＥＭ１の残基２２～３４）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一部の実施形態では、抗ＴＲＥＭ１抗体は、ヒトＴＲＥＭ１の残基２２～３３、１０４～１０８、及び１２９～１３５に結合する。一部の実施形態では、抗ＴＲＥＭ１抗体は、ヒトＴＲＥＭ１の残基２１～３３、１０３～１０８、及び１２８～１３５に結合する。一部の実施形態では、抗ＴＲＥＭ１抗体は、ヒトＴＲＥＭ１の残基２２～３４、１０４～１０９、及び１２９～１３６に結合する。一部の実施形態では、抗ＴＲＥＭ１抗体は、残基２１～３４、２２～３３、２１～３３、または２２～３４；１０３～１０９、１０４～１０８、１０３～１０８、または１０４～１０９；及び１２８～１３６、１２９～１３５、１２８～１３５、または１２９～１３６から選択される残基に結合する。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、約０．００１、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、１．９５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、８、９、または１０×１０－９Ｍ以下のＫＤ（Ｂｉａｃｏｒｅアッセイで測定）でヒトＴＲＥＭ１と結合する。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体のＫＤは、約０．００１～０．０１、０．０１～０．１、０．０１～０．０５、０．０５～０．１、０．１～０．５、０．５～１、０．２５～０．７５、０．２５～０．５、０．５～０．７５、０．７５～１、０．７５～２、１．１～１．２、１．２～１．３、１．３～１．４、１．４～１．５、１．５～１．６、１．６～１．７、１．７～１．８、１．８～１．９、１．９～２、１～２、１～５、２～７、３～８、３～５、４～６、５～６、５～５．５、５．５～６、５～７、６～７、６～６．５、６．５～７、６～８、７～９、７～１０、または５～１０×１０－９Ｍ（Ｂｉａｃｏｒｅアッセイで測定）である。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、約１０、９、８、７、６、５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．９８、１．９５、１．９、１．８５、１．８、１．７５、１．７、１．６５、１．６、１．５５、１．５０、１．４５、１．４、１．３、１．２、１．１、１、０．９、０．８５、０．８、０．７５、０．７、０．６５、０．６、０．５５、０．５、０．４５、０．４、０．３５、０．３、０．２５、０．２、０．１５、もしくは０．１×１０－９Ｍ以下、またはそれ以下のＫＤ（Ｂｉａｃｏｒｅアッセイで測定）でヒトＴＲＥＭ１と結合する。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、５～３、４～２、３～１、１．９～１．８、１．８～１．７、１．７～１．６、１．６～１．５、１．９～１．５、１．５～１、１～０．８、１～０．５、０．９～０．６、０．７～０．４、０．６～０．２、０．５～０．３、０．３～０．２、または０．２～０．１×１０－９ＭのＫＤ（Ｂｉａｃｏｒｅアッセイで測定）でヒトＴＲＥＭ１と結合する。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、約１０、９．５６、９．５、９．０、８．８８、８．８４、８．５、８、７．５、７．３２、７、６．５、６、５．５、５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５、もしくは１×１０－４（１／ｓ）以下のＫｄ（Ｂｉａｃｏｒｅアッセイで測定）でヒトＴＲＥＭ１に結合する。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、７～１０、７～８、８～９、９～１０、７～７．５、７．５～８、８～８．５、８．５～９、９～９．５、または９．５～１０×１０－４（１／ｓ）のＫｄ（Ｂｉａｃｏｒｅアッセイで測定）でヒトＴＲＥＭ１と結合する。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、約４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、４５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、７、８、９、もしくは１０×１０５（１／Ｍｓ）以上のＫａ（Ｂｉａｃｏｒｅアッセイで測定）でヒトＴＲＥＭ１に結合する。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、４～７、４～４．５、４．５～５、５～５．５、５．５～６、６～６．５、もしくは６．５～７、７～８、８～９、または９～１０×１０５（１／Ｍｓ）のＫａ（Ｂｉａｃｏｒｅアッセイで測定）でヒトＴＲＥＭ１と結合する。
一部の実施形態では、抗体は、約０．１、０．１５、０．２、０．２２、０．２５、０．２７、０．３、０．３２、０．３５、０．３７、０．４、０．０５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２ｎＭのＥＣ５０（フローサイトメトリーで測定）でヒト単球と結合する。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、２、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１ｎＭ以下のＥＣ５０（フローサイトメトリーで測定）でヒト単球と結合する。一部の実施形態では、抗体は、約０．２～１．４、０．２～０．３、０．３～０．５、０．５～０．７、０．７～１、１～１．２、または１．２～１．４ｎＭのＥＣ５０（フローサイトメトリーで測定）でヒト単球と結合する。
一部の実施形態では、抗体は、約０．１、０．１５、０．２、０．２２、０．２５、０．２７、０．３、０．３２、０．３５、０．３７、０．４、０．０５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２ｎＭのＥＣ５０（フローサイトメトリーで測定）でヒト好中球と結合する。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、約２、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１ｎＭ以下のＥＣ５０（フローサイトメトリーで測定）で好中球と結合する。一部の実施形態では、抗体は、約０．１５～１、０．１５～０．３、０．３～０．５、０．５～０．７、０．７～１、１～１．５、または１．５～２ｎＭのＥＣ５０（フローサイトメトリーで測定）で、ヒト好中球と結合する。
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、３ｎＭ以上のＥＣ５０（フローサイトメトリーで測定）でヒト好中球と結合しない。
機能
「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域により媒介される生物活性を指し、この活性は、抗体アイソタイプに応じて変動し得る。抗体エフェクター機能の例としては、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を活性化するＣ１ｑ結合、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を活性化するＦｃ受容体結合、及び抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、受容体リガンド遮断、アゴニズム、またはアンタゴニズムが挙げられる。
一部の実施形態では、抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を有する。ＡＤＣＣは、抗体が病原性または腫瘍形成性の標的細胞の表面の抗原に結合する時に生じ得る。細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、樹状細胞、または単球を含む、細胞表面上にＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲまたはＦＣＧＲ）を有するエフェクター細胞は、標的細胞に結合している抗体のＦｃ領域を認識して結合する。そのような結合は、細胞死につながる細胞内シグナル伝達経路の活性化を引き起こし得る。特定の実施形態では、抗体の免疫グロブリンＦｃ領域サブタイプ（アイソタイプ）は、ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３を含む。本明細書で使用される場合、ＡＤＣＣは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が標的細胞の結合している抗体を認識し、続いて、標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応を指す。ＡＤＣＣを媒介する初代細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７－９２（１９９１）の４６４頁の表３にまとめられる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されるようなｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイが実施されてもよい。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。代替的または追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏで評価されてもよい。
一部の実施形態では、抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を有する。抗体誘導性ＣＤＣは、典型的な補体カスケードのタンパク質により媒介され、抗体への補体タンパク質Ｃ１ｑの結合により引き起こされる。Ｃｌｑに結合する抗体Ｆｃ領域は、補体カスケードの活性化を誘導し得る。特定の実施形態では、抗体の免疫グロブリンＦｃ領域サブタイプ（アイソタイプ）は、ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３を含む。本明細書で使用される場合、ＣＤＣは、補体の存在下で、分子が標的を溶解させる能力を指す。補体活性化経路は、同種抗原と複合化された分子（例えば、ポリペプチド（例えば、抗体））への補体系（Ｃ１ｑ）の最初の成分の結合により開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）に記載されるような、ＣＤＣアッセイが実施されてもよい。
一部の実施形態では、抗体は、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）活性を有する。ＡＤＣＰは、病原性または腫瘍形成性の標的細胞の表面の抗原に抗体が結合する時生じ得る。単球及びマクロファージを含む、細胞表面にＦｃ受容体を保有する食細胞は、標的細胞に結合している抗体のＦｃ領域を認識して結合する。Ｆｃ受容体が抗体結合標的細胞に結合すると、標的細胞の貪食を開始することができる。ＡＤＣＰは、ＡＤＣＣの一形態と考えることができる。
一部の実施形態では、ＴＲＥＭ１抗体は、非刺激性骨髄性細胞の刺激性骨髄性細胞へのリプログラミングを誘導する。一部の実施形態では、ＴＲＥＭ１抗体は、前炎症性サイトカインもしくはケモカインの発現、及び／または共刺激分子の発現の誘導を誘導する。一部の実施形態では、共刺激分子は、ＣＤ４０またはＨＬＡ－ＤＲである。一部の実施形態では、前炎症性サイトカインまたはケモカインは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＴＮＦＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１５、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２、ＦａｓＬ、ＣＤ２７４、ＣＲＴＡＭ、グランザイムＡ（ＧｚｍＡ）、またはグランザイムＢ（ＧｚｍＢ）である。
一部の実施形態では、抗体は、アゴニスト抗体である。アゴニスト抗体は、抗体が細胞上に発現されたＴＲＥＭ１タンパク質と結合した後、ＮＳＭの１つ以上の活性または機能を誘導し（例えば、増加させ）得る。アゴニスト抗体は、ＮＳＭに結合して活性化して、細胞の増殖に変化を引き起こすか、または抗原提示能を修飾し得る。アゴニスト抗体は、ＮＳＭに結合して活性化し、細胞成長またはアポトーシスの修飾につながる細胞内シグナル伝達経路を誘発し得る。アゴニスト抗体は、ＴＲＥＭ１に結合し、ＴＲＥＭ１の下流でシグナル伝達を誘導し得る。一部の実施形態では、ＴＲＥＭ１シグナル伝達は、細胞における免疫応答を増加させる。一部の実施形態では、免疫応答は、活性化、サイトカインもしくはケモカイン分泌、または骨髄性共刺激タンパク質の発現である。
一部の実施形態では、抗体は、アンタゴニスト抗体である。アンタゴニスト抗体は、抗体が細胞上で発現されたＴＲＥＭ１タンパク質に結合した後、ＮＳＭの１つ以上の活性または機能を遮断（例えば、減少）させ得る。例えば、アンタゴニスト抗体は、１つ以上のＮＳＭのタンパク質に結合するリガンドに結合して遮断し、細胞の分化及び増殖を防止するか、または抗原提示能を修飾し得る。アンタゴニスト抗体は、リガンドによるＴＲＥＭ１タンパク質に結合して活性化を防止し、結合及び活性化を妨げ、細胞成長及び生存に寄与する細胞内シグナル伝達経路を修飾し得る。
一部の実施形態では、抗体は、枯渇抗体である。枯渇抗体は、分子の他の免疫細胞との抗体の相互作用を介した接触時に、非刺激性骨髄細胞を殺傷するものである。例えば、抗体は、ＴＲＥＭ１タンパク質を有する細胞に結合する時、補体タンパク質を捉え、補体依存性細胞溶解を誘導し得る。抗体は、ＴＲＥＭ１タンパク質を有する細胞に結合する時、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によりそれらを殺傷するために、Ｆｃ受容体を持つ近隣の細胞も誘発し得る。
一部の実施形態では、抗体は、中和抗体であり、抗体は、ＮＳＭの１つ以上の生物学的活性を中和する。一部の実施形態では、ＴＲＥＭ１タンパク質は、非刺激性骨髄細胞の表面に発現され、抗体は、ＴＲＥＭ１タンパク質の細胞外ドメインを認識する。
一部の実施形態では、抗体は、ＮＳＭに選択的である（ＴＲＥＭ１に優先的に結合する）。特定の実施形態では、ＮＳＭに選択的に結合する抗体は、０．０００１ｎＭ～１μＭの範囲の解離定数（Ｋｄ）を有する。特定の実施形態では、抗体は、異なる種由来のタンパク質間で保存されるＴＲＥＭ１タンパク質上のエピトープに特異的に結合する。別の実施形態では、選択的結合は、排他的結合を含むが、これを必要としない。
一実施形態では、標的に結合している抗ＴＲＥＭ１抗体は、それが結合している非刺激性骨髄細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの枯渇を引き起こす原因となる。一部の実施形態では、クラスター化抗体により誘導されるエフェクタータンパク質は、炎症性サイトカインの放出、抗原産生の制御、エンドサイトーシス、または細胞殺傷を含む、様々な応答を誘発し得る。一実施形態では、抗体は、補体を動員及び活性化するか、または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）をｉｎ ｖｉｖｏで媒介するか、またはＦｃ受容体をｉｎ ｖｉｖｏで結合することにより貪食を媒介することが可能である。抗体はまた、結合時に非刺激性骨髄細胞のアポトーシスまたは壊死を誘導することにより、非刺激性骨髄細胞を枯渇させ得る。
一部の実施形態では、抗体は、免疫複合体を形成することが可能である。例えば、免疫複合体は、抗体で覆われた腫瘍細胞であり得る。
一部の実施形態では、抗ＴＲＥＭ１抗体は、がん組織の外側に存在する骨髄細胞と実質的に結合しない。一部の実施形態では、抗ＴＲＥＭ１抗体は、がん組織に存在する刺激性骨髄細胞と実質的に結合しない。
一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞の無効化は、ｉｎ ｖｉｔｒｏであり、ａ）非刺激性骨髄細胞を殺傷すること、ｂ）非刺激性骨髄細胞の磁気ビーズ枯渇；またはｃ）非刺激性骨髄細胞の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）選別により達成される。
「免疫複合体」は、エフェクター分子などの１つ以上の異種分子（複数可）、または治療薬（例えば、サイトカイン）もしくは診断薬にコンジュゲートされた抗体である。
特定の実施形態では、抗体は、薬物、例えば、毒素、化学療法薬、免疫調節薬、または放射性同位元素にコンジュゲートされる。調製ＡＤＣ（抗体薬物コンジュゲート）のいくつかの方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、米国特許第８，６２４，００３号（ｐｏｔ法）、同第８，１６３，８８８号（１段階）、及び５，２０８，０２０（２段階法）に記載される。抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗原結合性である放射性核種、細胞毒素、化学療法薬、薬物、プロドラッグ、毒素、酵素、免疫調節薬、抗血管新生薬、プロアポトーシス薬、サイトカイン、ホルモン、オリゴヌクレオチド、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、第２の抗体、及び第２の抗体フラグメントを含む少なくとも１つの薬剤にコンジュゲートすることができる。
非刺激性骨髄細胞（ＮＳＭ）
抗ＴＲＥＭ１抗体の使用を含む、非刺激性骨髄細胞（ＮＳＭ）を無効化及び／または検出するための方法及び組成物が本明細書に記載される。ＮＳＭタンパク質を発現する非刺激性骨髄細胞を標的及び／または検出するための方法及び組成物もまた本明細書で提供される。
その非ヒト個体においてヒトＮＳＭタンパク質の非ヒトホモログに向けられた抗体の使用を含む、非刺激性骨髄細胞を無効化及び／または検出するための方法及び組成物もまた本明細書で提供される。
本明細書で使用される場合、非刺激性骨髄細胞は、免疫応答を刺激するのに十分に効果的ではない（例えば、刺激性骨髄細胞と比較して腫瘍微小環境における抗腫瘍応答を刺激するのに効果的ではない）骨髄細胞である。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、刺激性骨髄細胞と比較して、抗原（例えば、腫瘍抗原）のＴ細胞への提示に効果的ではないか、または腫瘍特異的Ｔ細胞応答の刺激に効果的ではない。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、刺激性骨髄細胞と比較して、腫瘍関連抗原のＴ細胞への取り込み、プロセッシング、及び／または提示能力の減少を示し得る。非刺激性骨髄細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球をリプライミングする低減した能力を含有しても、能力を全く含有しなくてもよく、または一部の場合では、効果的な腫瘍細胞の殺傷を刺激する可能性がない。非刺激性骨髄細胞は、刺激性骨髄細胞と比較して、限定されないが、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣＩ、及びＭＨＣＩＩを含む、抗原プロセッシング、抗原提示、及び／または抗原共刺激に関与する遺伝子及び細胞表面マーカーの発現の低下を示し得る。
非刺激性骨髄細胞は、刺激性骨髄細胞と比較した時、限定されないが、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＰＳＭＢ８、ＰＳＭＢ９、ＴＡＰＢＰ、ＰＳＭＥ２、ＣＤ２４ａ、ＣＤ２７４、ＢＴＬＡ、ＣＤ４０、ＣＤ２４４、ＩＣＯＳＬ、ＩＣＡＭ１、ＴＩＭ３、ＰＤＬ２、ＲＡＮＫ、ＦＬＴ３、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＳＦ２ＲＢ２、ＣＳＦ２ＲＡ、ＩＬ１２ｂ、ＸＣＲ１、ＣＣＲ７、ＣＣＲ２、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ９、及びＣＣＬ５のうちのいずれか１つ以上を含む、交差提示、共刺激、及び／または刺激性サイトカインに関連する遺伝子の発現の低下、ならびに抗炎症性サイトカインＩＬ－１０の発現の増加を示し得る。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、分化及び生存のための転写因子ＩＲＦ４及びサイトカインＧＭ－ＣＳＦまたはＣＳＦ－１によって決まる。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）及び一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）を分泌することにより腫瘍血管新生に寄与して、上皮成長因子（ＥＧＦ）を分泌することにより腫瘍成長を支持し得る。
一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）または樹状細胞（ＤＣ）である。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、樹状細胞（ＤＣ）ではない。
一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）である。ＴＡＭは、がん性腫瘍の近くまたは内部に存在するマクロファージであり、循環単球または常在組織マクロファージに由来する。
一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）である。ＴＡＮは、がん性腫瘍の付近または内部に存在する好中球である。
一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞及び刺激性骨髄細胞は、それらが発現するマーカーまたはそれらが選択的に発現するマーカーに基づいて区別される。細胞表面マーカーの発現は、「＋」または「陽性」と記載することができる。細胞表面マーカーの不存在は、「－」または「陰性」と記載することができる。細胞表面マーカーの発現はさらに、「ｈｉｇｈ」（高レベルのマーカーを発現する細胞）または「ｌｏｗ」（低レベルのマーカーを発現する細胞）として記載することができ、これは、細胞表面上の各マーカーの相対的発現を示す。マーカーのレベルは、当該技術分野で既知の種々の方法、例えば、免疫染色及びＦＡＣＳ解析、またはゲル電気泳動及びウェスタンブロッティングにより決定されてもよい。
一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、樹状細胞（ＤＣ）である。一部の実施形態では、樹状細胞は、突起または樹状突起のモルホロジーにより区別することができる。一実施形態では、非刺激性樹状細胞は、少なくともＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４－、ＣＤ１１ｃ＋、及びＢＤＣＡ１＋（ＤＣ１細胞とも呼ばれる）である。一実施形態では、非刺激性樹状細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４－、ＣＤ１１ｃ＋、及びＢＤＣＡ３＋（ＤＣ２細胞とも呼ばれる）ではない。一実施形態では、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４－、ＣＤ１１ｃ＋、及びＢＤＣＡ３＋である樹状細胞は、刺激性骨髄細胞である。
一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）である。一部の実施形態では、例えば、ヒトでは、非刺激性腫瘍関連マクロファージは、少なくともＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋である。一部の実施形態では、非刺激性腫瘍関連マクロファージは、少なくともＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂ＋である。一部の実施形態では、非刺激性腫瘍関連マクロファージは、少なくともＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｃ＋である。一部の実施形態では、非刺激性腫瘍関連マクロファージは、少なくともＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＢＤＣＡ３－である。一部の実施形態では、非刺激性腫瘍関連マクロファージは、少なくともＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＢＤＣＡ３－、ＣＤ１１ｂ＋である。一部の実施形態では、非刺激性腫瘍関連マクロファージは、少なくともＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＢＤＣＡ３－、ＣＤ１１ｃ＋である。一部の実施形態では、非刺激性腫瘍関連マクロファージは、少なくともＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂ＋、及びＣＤ１１ｃ＋である。一部の実施形態では、非刺激性腫瘍関連マクロファージは、少なくともＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＢＤＣＡ３－、ＣＤ１１ｂ＋、及びＣＤ１１ｃ＋である。
一部の実施形態では、本発明の方法及び組成物は、他の哺乳動物、例えば、マウスに、おけるＴＡＭ及びＤＣを標的化するのに有用である。そのような実施形態では、マウスのＴＡＭ及びＤＣは、ＴＲＥＭ１抗体と接触させる。一実施形態では、例えば、マウスでは、腫瘍関連マクロファージは、少なくともＣＤ４５＋、Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂｈｉｇｈ、及びＣＤ１１ｃｌｏｗ（ＴＡＭ１とも呼ばれる）である。一実施形態では、例えば、マウスでは、腫瘍関連マクロファージは、少なくともＣＤ４５＋、Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂｌｏｗ、及びＣＤ１１ｃｈｉｇｈ（ＴＡＭ２とも呼ばれる）である。本明細書で使用される「ＣＤ１１ｂｈｉｇｈマクロファージ」という用語は、高レベルのＣＤ１１ｂを発現するマクロファージに関する。本明細書で使用される「ＣＤ１１ｂｌｏｗマクロファージ」という用語は、ＣＤ１１ｂｈｉｇｈマクロファージのレベルよりも実質的に低いレベルのＣＤ１１ｂを表面上に発現するマクロファージに関する。本明細書で使用される「ＣＤ１１ｃｈｉｇｈ」という用語は、高レベルのＣＤ１１ｃを発現するマクロファージに関する。本明細書で使用される「ＣＤ１１ｃｌｏｗマクロファージ」という用語は、ＣＤ１１ｃｈｉｇｈマクロファージのレベルよりも実質的に低いレベルのＣＤ１１ｃを表面上に発現するマクロファージに関する。
一部の実施形態では、本発明の非刺激性骨髄細胞は、ＴＡＭ及びＤＣ１細胞のうちの１つ以上を含む。
一部の実施形態では、例えば、マウスにおいて、本発明の非刺激性骨髄細胞は、ＴＡＭ１、ＴＡＭ２、及びＤＣ１細胞のうちの１つ以上を含む。そのような実施形態では、本発明の非刺激性骨髄細胞を、ＴＲＥＭ１抗体と接触させる。
一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）である。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）である。
一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、腫瘍病変の周縁内または形質転換された腫瘍管内に局在し、それらは、同種のＴ細胞と接触する。一実施形態では、非刺激性骨髄細胞の局在化が修飾され、その結果、細胞は、もはや腫瘍の縁には局在化しないか、またはもはやＴ細胞と接触していない。
一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、刺激性骨髄細胞及び非刺激性骨髄細胞を含む免疫細胞の集団にある。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、非刺激性骨髄細胞のみを含む免疫細胞の集団にある。本発明の免疫細胞の集団は、純粋であり、均一であり、不均一であり、様々な供給源に由来し（例えば、病変組織、腫瘍組織、健康な組織、細胞バンク）、初代細胞培養物中で維持され、及び／またはｅｘ ｖｉｖｏ培養で維持されてもよい。
一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、腫瘍関連マクロファージである。
一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、樹状細胞である。
一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４－、ＣＤ１１ｃ＋、及びＢＤＣＡ１＋である。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４－、ＣＤ１１ｃ＋、及びＢＤＣＡ１＋である細胞を含む。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４－、ＣＤ１１ｃ＋、及びＢＤＣＡ１＋である細胞からなる。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４－、ＣＤ１１ｃ＋、及びＢＤＣＡ１＋である細胞から本質的になる。
一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＢＤＣＡ３－である。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＢＤＣＡ３－である細胞を含む。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＢＤＣＡ３－である細胞からなる。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＢＤＣＡ３－である細胞から本質的になる。
一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂ＋である。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂ＋である細胞を含む。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂ＋である細胞からなる。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂ＋である細胞から本質的になる。
一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｃ＋である。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｃ＋である細胞を含む。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｃ＋である細胞からなる。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｃ＋である細胞から本質的になる。
一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＢＤＣＡ３－、及びＣＤ１１ｃ＋である。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＢＤＣＡ３－、及びＣＤ１１ｃ＋である細胞を含む。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＢＤＣＡ３－、及びＣＤ１１ｃ＋である細胞からなる。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＢＤＣＡ３－、及びＣＤ１１ｃ＋である細胞から本質的になる。
一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＢＤＣＡ３－、ＣＤ１１ｂ＋である。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＢＤＣＡ３－、ＣＤ１１ｂ＋である細胞を含む。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＢＤＣＡ３－、ＣＤ１１ｂ＋である細胞からなる。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＢＤＣＡ３－、ＣＤ１１ｂ＋である細胞から本質的になる。
一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂ＋、及びＣＤ１１ｃ＋である。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂ＋、及びＣＤ１１ｃ＋である細胞を含む。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂ＋、及びＣＤ１１ｃ＋である細胞からなる。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂ＋、及びＣＤ１１ｃ＋である細胞から本質的になる。
一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＢＤＣＡ３－、ＣＤ１１ｂ＋、及びＣＤ１１ｃ＋である。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＢＤＣＡ３－、ＣＤ１１ｂ＋、及びＣＤ１１ｃ＋である細胞を含む。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＢＤＣＡ３－、ＣＤ１１ｂ＋、及びＣＤ１１ｃ＋である細胞からなる。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４＋、ＢＤＣＡ３－、ＣＤ１１ｂ＋、及びＣＤ１１ｃ＋である細胞から本質的になる。
一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４－、ＣＤ１１ｃ＋、及びＢＤＣＡ３＋ではない。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４－、ＣＤ１１ｃ＋、及びＢＤＣＡ３＋でない細胞を含む。
一部の実施形態では、例えば、マウスにおいて、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂｈｉｇｈ、及びＣＤ１１ｃｌｏｗである。一部の実施形態では、例えば、マウスにおいて、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂｈｉｇｈ、及びＣＤ１１ｃｌｏｗである細胞を含む。一部の実施形態では、例えば、マウスにおいて、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂｈｉｇｈ、及びＣＤ１１ｃｌｏｗである細胞からなる。一部の実施形態では、例えば、マウスにおいて、非刺激性骨髄細胞は、本質的に、ＣＤ４５＋、Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂｈｉｇｈ、及びＣＤ１１ｃｌｏｗである細胞から本質的になる。そのような実施形態では、非刺激性マウス骨髄細胞を、ＴＲＥＭ１抗体と接触させる。
一部の実施形態では、例えば、マウスにおいて、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂｌｏｗ、及びＣＤ１１ｃｈｉｇｈである。一部の実施形態では、例えば、マウスにおいて、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂｌｏｗ、及びＣＤ１１ｃｈｉｇｈである細胞を含む。一部の実施形態では、例えば、マウスにおいて、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂｌｏｗ、及びＣＤ１１ｃｈｉｇｈである細胞からなる。一部の実施形態では、例えば、マウスにおいて、非刺激性骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１１ｂｌｏｗ、及びＣＤ１１ｃｈｉｇｈである細胞から本質的になる。そのような実施形態では、非刺激性マウス骨髄細胞を、ＴＲＥＭ１抗体と接触させる。
一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、がん組織にある。
一部の実施形態では、免疫細胞の集団は、がん組織にある。
一部の実施形態では、非刺激性細胞及び刺激性骨髄細胞は、がん組織にある。
一部の実施形態では、生体試料は、非刺激性骨髄細胞及び刺激性骨髄細胞を含む免疫細胞の集団を含む。
ＮＳＭ細胞は、腫瘍組織に存在し且つＮＳＭ細胞マーカーの発現により他の細胞型と区別され得るＤＣ１、ＴＡＭ１、及びＴＡＭ２細胞を総称的に指し得る。例えば、ＳＤＣよりもＮＳＭ細胞において豊富に発現または翻訳される遺伝子及び関連タンパク質は、ＮＳＭマーカーとして作用し得る。例示的なＮＳＭマーカーは、ＣＤ１１ｂである。追加の例示的なＮＳＭマーカーを、表Ａに示す。ＮＳＭ細胞は、ＴＲＥＭ１、ＭＳ４Ａ７、Ｃ５ＡＲ１、ＬＹＶＥ１、ＡＢＣＣ３、ＬＩＬＲＢ４、ＭＲＣ１／ＣＤ２０６、ＳＩＧＬＥＣ１、ＳＴＡＢ１、ＴＭＥＭ３７、ＭＥＲＴＫ、及びＴＭＥＭ１１９を細胞表面上に発現し得る。一部の態様では、ＮＳＭ細胞は、ＫＩＴ、ＣＣＲ７、ＢＡＴＦ３、ＦＬＴ３、ＺＢＴＢ４６、ＩＲＦ８、ＢＴＬＡ、ＭＹＣＬ１、ＣＬＥＣ９Ａ、ＢＤＣＡ３、及びＸＣＲ１のうちの少なくとも１つを発現しない。
一実施形態では、ＮＳＭ細胞は、表Ｄに列挙されるＮＳＭマーカー遺伝子のうちの１つ以上を発現する。別の実施形態では、ＮＳＭ細胞は、表Ａに列挙されたＮＳＭマーカーのうちの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、またはそれ以上を発現する。別の実施形態では、ＮＳＭ細胞は、表Ａに列挙されたＮＳＭマーカーのうちのほとんどまたは全てを発現する。別の実施形態では、ＮＳＭ細胞は、ＭＲＣ１、ＭＳ４Ａ７、Ｃ１ＱＣ、ＡＰＯＥ、Ｃ１ＱＢ、Ｃ１ＱＡ、及びＣ５ＡＲ１を発現するものとして同定される。
（表Ｄ）
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刺激性骨髄細胞
本明細書で使用される場合、刺激性骨髄細胞（特定の態様ではＳＤＣとも呼ばれる）は、免疫応答を刺激するのに有効な骨髄細胞である（例えば、非刺激性骨髄細胞と比較して、腫瘍微小環境で抗腫瘍応答を刺激するのにより効果的である）。一部の実施形態では、刺激性骨髄細胞は、非刺激性骨髄細胞と比較して、抗原（例えば、腫瘍抗原）をＴ細胞に提示するのに有効であるか、または腫瘍特異的Ｔ細胞応答を刺激するのに有効である。一部の実施形態では、刺激性骨髄細胞は、非刺激性骨髄細胞と比較して、腫瘍関連抗原のＴ細胞への取り込み、プロセッシング、及び／または提示能力の増加を示し得る。刺激性骨髄細胞は、非刺激性骨髄細胞と比較して、細胞傷害性Ｔリンパ球をリプライミングする低減した能力を有するか、または、一部の場合では、効果的な腫瘍細胞殺傷を刺激し得る。刺激性骨髄細胞は、非刺激性骨髄細胞と比較して、限定されないが、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣＩ、及びＭＨＣＩＩを含む、抗原プロセッシング、抗原提示、及び／または抗原共刺激に関与する遺伝子及び細胞表面マーカーのより高い発現を示し得る。
例示的な刺激性骨髄細胞マーカーを、表Ａに列挙する。例えば、ヒトＳＤＣでは、Ｘｃｒ１、Ｃｌｅｃ９ａ、及びＢＤＣＡ３（ＣＤ１４１）の発現が、ＳＤＣ同定のマーカーである。マウスでは、ＣＤ１０３は、ＳＤＣ同一性の強力なマーカーとして使用することもできるが、ヒトＳＤＣでは発現されないことに留意されるであろう。
一実施形態では、ＳＤＣは、樹状細胞同一性を有し且つ表Ａに列挙されるＳＤＣマーカーのうちの１つ以上も発現する腫瘍浸潤性骨髄細胞である。別の実施形態では、ＳＤＣは、樹状細胞の同一性を有し且つ表Ａに列挙されるＳＤＣマーカーの２、３、４、５、６、７、８、９、または全てをも発現する腫瘍浸潤性骨髄細胞である。別の実施形態では、ＳＤＣは、ＢＤＣＡ３、ＫＩＴ、ＣＣＲ７、ＢＡＴＦ３、ＦＬＴ３、ＺＢＴＢ４６、ＩＲＦ８、ＢＴＬＡ、ＭＹＣＬ１、ＸＣＲ１、及びＣＬＥＣ９Ａを発現する腫瘍浸潤性骨髄樹状細胞として同定される。ＳＤＣの細胞は、ＫＩＴ、ＣＣＲ７、ＢＡＴＦ３、ＦＬＴ３、ＺＢＴＢ４６、ＩＲＦ８、ＢＴＬＡ、ＭＹＣＬ１、ＣＬＥＣ９Ａ、ＢＤＣＡ３、及びＸＣＲ１のうちの少なくとも１つを発現し得る。一部の実施形態では、ＳＤＣは、ＴＲＥＭ１、ＭＳ４Ａ７、Ｃ５ＡＲ１、ＬＹＶＥ１、ＡＢＣＣ３、ＬＩＬＲＢ４、ＭＲＣ１／ＣＤ２０６、ＳＩＧＬＥＣ１、ＳＴＡＢ１、ＴＭＥＭ３７、ＭＥＲＴＫ、及び／またはＴＭＥＭ１１９を細胞表面上に実質的に発現しない。一部の実施形態では、ＳＤＣは、Ｃ５ＡＲ１、ＬＹＶＥ１、ＡＢＣＣ３、ＭＲＣ１、ＳＩＧＬＥＣ１、ＳＴＡＢ１、Ｃ１ＱＢ、Ｃ１ＱＡ、ＴＭＥＭ３７、ＭＥＲＴＫ、Ｃ１ＱＣ、ＴＭＥＭ１１９、ＭＳ４Ａ７、ＡＰＯＥ、ＣＹＰ４Ｆ１８、ＴＲＥＭ１、ＴＬＲ７、及び／またはＬＩＬＲＢ４を実質的に発現しない。フローサイトメトリー及びＰＣＲは、他の技術的に認められているアッセイの中で、本明細書に開示のマーカーの発現を評価するために使用することができる。
刺激骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４－、ＣＤ１１ｃ＋、及びＢＤＣＡ３＋であり得る。刺激骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、及びＢＤＣＡ３＋であり得る。刺激骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１４－、及びＢＤＣＡ３＋であり得る。刺激骨髄細胞は、ＣＤ４５＋、ＨＬＡ－ＤＲ＋、ＣＤ１１ｃ＋、及びＢＤＣＡ３＋であり得る。
医薬組成物
本出願は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とともに、本明細書に記載の抗体のうちのいずれか１つ以上を含む医薬組成物を含む、抗体を含む組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、無菌である。医薬組成物は一般に、有効量の抗体を含む。
これらの組成物は、本明細書に開示の抗体のうちの１つ以上に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、または当業者らに周知の他の物質を含み得る。そのような物質は、無毒であるべきであり、有効成分の有効性を妨げてはならない。担体または他の物質の正確な性質は、投与経路、例えば、経口、静脈内、皮膚または皮下、鼻腔、筋肉内、腹腔内経路に依存し得る。
経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、または液体形態であり得る。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバントなどの固体担体を含み得る。液体医薬組成物は一般に、水、石油、動物もしくは植物油、鉱油、または合成油などの液体担体を含む。生理食塩水、デキストロースもしくは他の糖類溶液、またはグリコール、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールを含むことができる。
静脈内、皮膚もしくは皮下注射、または罹患部位での注射のために、活性成分は、発熱性物質不含であり、好適なｐＨ、等張性、及び安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態であろう。当業者らは、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、乳酸加リンガー注射液などの等張性ビヒクルを使用して、好適な溶液を十分に調製することができる。必要に応じて、保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤、及び／または他の添加剤を含むことができる。
それが、個体に与えられるべき本発明によるポリペプチド、抗体（例えば、抗ＴＲＥＭ１抗体）、核酸、小分子、または他の薬学的に有用な化合物であるかどうかに関わらず、投与は、「治療的有効量」または「予防的有効量」（場合によっては、治療であり得るが、予防は、治療と考えることができる）であることが好ましく、これは、個体に有益性を示すのに十分である。投与される実際の量、ならびに投与の速度及び経過は、処置されるタンパク質凝集疾患の性質及び重症度に依存するであろう。処置の製剤化、例えば、投薬量の決定などは、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内であり、通常、処置されるべき障害、個々の患者の状態、分娩部位、投与方法、及び開業医に既知の他の要因を考慮に入れる。上述の手法及びプロトコールの例としては、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．（ｅｄ），１９８０に見出され得る。
組成物は、処置されるべき状態に応じて、単独でまたは他の処置と組み合わせて、同時にまたは連続的に投与することができる。
方法
調製方法
本明細書に記載の抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるような、組み換え方法及び組成物を使用して産生され得る。
一実施形態では、本明細書に記載の抗体をコードする単離核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／またはＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／または重鎖）または単一ドメイン抗体のＶＨＨを含むアミノ酸配列をコードしてもよい。さらなる実施形態では、そのような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。一実施形態では、核酸は、マルチシストロニックベクターで提供される。さらなる実施形態では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような一実施形態では、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗原結合ポリペプチド構築物のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または、（２）抗原結合ポリペプチド構築物のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター及び抗原結合ポリペプチド構築物のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクター、を含む（例えば、形質転換されている）。一実施形態では、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞、またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態では、抗体を作製する方法が提供され、方法は、抗体の発現に適する条件下で、上で提供されるように、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養する、及び、任意に、宿主細胞（または宿主細胞培地）から抗体を回収することを含む。
抗体の組み換え産生の場合、例えば、上述されるような抗体をコードする核酸は、単離され、宿主細胞におけるさらなるクローニング及び／または発現のための１つ以上のベクターに挿入される。そのような核酸は、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離及び配列決定されてもよい。
「実質的に精製された」という用語は、天然に存在する環境に見られるようなタンパク質に通常付随するか、またはそれと相互作用する構成成分が実質的または本質的に不含であり得る本明細書に記載の構築物、またはそのバリアントを指し、すなわち、天然の細胞または特定の実施形態では、細胞外物質に実質的に含まない組み換え産生されたヘテロマルチマーの場合の宿主細胞は、混入タンパク質の約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満（乾燥重量で）を有するタンパク質の調製を含む。ヘテロマルチマーまたはそのバリアントが宿主細胞により組み換え産生される時、特定の実施形態におけるタンパク質は、細胞の乾燥重量の約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％以下で存在する。ヘテロマルチマーまたはそのバリアントが宿主細胞により組み換え産生される時、タンパク質は、特定の実施形態では、細胞の乾燥重量の約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ、または約１ｍｇ／Ｌ以下で、培地中に存在する。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法により生成される「実質的に精製された」ヘテロマルチマーは、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ解析、ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、及びキャピラリー電気泳動などの適切な方法により決定された、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％の精製レベル、具体的には、少なくとも約７５％、８０％、８５％の精製レベル、より具体的には、少なくとも約９０％の精製レベル、少なくとも約９５％の精製レベル、少なくとも約９９％の精製レベル、またはそれ以上を有する。
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に適する宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞を含む。
「組み換え宿主細胞」または「宿主細胞」は、挿入、例えば、直接的な取り込み、形質導入、ｆ－交配、または組み換え宿主細胞を作製するための当該技術分野で既知の他の方法、に使用される方法に関係なく、外因性ポリヌクレオチドを含む細胞を指す。外因性ポリヌクレオチドは、非統合ベクター、例えば、プラスミドとして維持されても、あるいは、宿主ゲノムに組み込まれてもよい。宿主細胞は、ＣＨＯ、ＣＨＯの誘導体、ＮＳ０、Ｓｐ２Ｏ、ＣＶ－１、ＶＥＲＯ－７６、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、Ｐｅｒ．Ｃ６、またはＢＨＫを含み得る。
本明細書で使用される場合、「真核生物（ｅｕｋａｒｙｏｔｅ）」という用語は、系統発生ドメイン真核生物（Ｅｕｃａｒｙａ）、例えば、動物（限定されないが、哺乳動物、昆虫、爬虫類、鳥などを含む）、繊毛虫、植物（限定されないが、単子葉植物、双子葉植物、藻類などを含む）、菌類、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物などに属する生物を指す。
本明細書で使用される場合、「原核生物（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅ）」という用語は、原核生物（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）を指す。例えば、非真核生物は、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａ（限定されないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａなどを含む）系統発生ドメイン、または古細菌（限定されないが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、例えば、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ－１、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘなどを含む）系統発生ドメインに属し得る。
例えば、抗体は、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合に、細菌で産生されてもよい。細菌における抗体フラグメント及びポリペプチドの発現では、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、及び同第５，８４０，５２３号、（Ｅ．ｃｏｌｉ．における抗体フラグメントの発現について記載するＣｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３），ｐｐ．２４５－２５４も参照のこと）を参照のこと。発現後、抗体は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離されてもよく、さらに精製することができる。
原核生物に加えて、糸状菌または酵母菌などの真核微生物は、真菌及び酵母菌系統を含む抗体をコードするベクターのための好適なクローニングまたは発現宿主であり、このグリコシル化経路は、「ヒト化」されており、ヒトグリコシル化パターンを部分的または完全に含む抗体の産生をもたらす。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９－１４１４（２００４）、及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０－２１５（２００６）を参照のこと。
グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞、特に、トランスフェクションの場合、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞、とともに使用され得る多数のバキュロウイルス系統が同定されている。
植物細胞培養は、宿主として利用することもできる。例えば、（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術について説明する）米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号を参照のこと。
脊椎動物細胞はまた、宿主として使用されてもよい。例えば、懸濁液中で成長するように適合される哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胎児腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載の２９３または２９３細胞）；乳児ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０）に記載のＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）；例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２）に記載のＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６（１９８０））；ならびにＹ０、ＮＳ０、及びＳＰ２／０などの骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体産生に適する特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．），ｐｐ．２５５－２６８（２００３）を参照のこと。
一実施形態では、本明細書に記載の抗体は、所定の比で、抗体をコードする核酸で少なくとも１つの安定した哺乳動物細胞をトランスフェクトすること及び少なくとも１つの哺乳動物細胞において核酸を発現させることを含む方法により、安定した哺乳動物細胞で産生される。一部の実施形態では、核酸の所定の比は、発現産物中の抗体の最高の割合をもたらす投入核酸の相対的な比を決定するために、一過性トランスフェクション実験で決定される。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるような安定した哺乳動物細胞で抗体を産生する方法があり、少なくとも１つの安定した哺乳動物細胞の発現産物は、単量体の重鎖もしくは軽鎖ポリペプチドまたは他の抗体と比較して、より大きな割合の所望のグリコシル化抗体を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の安定な哺乳動物細胞においてグリコシル化抗体を産生する方法があり、該方法は、所望のグリコシル化抗体を同定及び精製することを含む。一部の実施形態では、該同定は、液体クロマトグラフィー及び質量分析の一方または両方によるものである。
必要に応じて、抗体は、発現後に精製または単離することができる。タンパク質は、当業者らに既知の様々な方法で単離または精製されてもよい。標準的な精製方法は、ＦＰＬＣ及びＨＰＬＣなどのシステムを使用して、大気圧または高圧で実施される、イオン交換、疎水性相互作用、親和性、サイズまたはゲル濾過、ならびに逆相を含むクロマトグラフィー手法を含む。精製方法はまた、電気泳動手法、免疫学手法、沈殿手法、透析手法、及びクロマトフォーカシング手法を含む。タンパク質濃縮と組み合わせた限外濾過及びダイアフィルトレーション手法も有用である。当該技術分野で周知の通り、様々な天然タンパク質がＦｃ及び抗体に結合し、これらのタンパク質は、抗体の精製のために本発明において使用を見出し得る。例えば、細菌のタンパク質Ａ及びＧは、Ｆｃ領域に結合する。同様に、細菌のプロテインＬは、一部の抗体のＦａｂ領域に結合する。精製は多くの場合、特定の融合パートナーにより使用可能にすることができる。例えば、抗体は、ＧＳＴ融合が用いられる場合、グルタチオン樹脂、Ｈｉｓタグが用いられるかまたは固定化される場合、Ｎｉ＋２アフィニティークロマトグラフィー、フラグタグが使用される場合、抗フラグ抗体を使用して精製されてもよい。好適な精製手法における一般的なガイダンスについては、例えば、全体が参照により組み込まれるＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｓｃｏｐｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ，１９９４を参照のこと。必要な精製度は、抗体の使用に応じて変動するであろう。一部の場合では、精製は、必要ない。
特定の実施形態では、抗体は、限定されないが、Ｑ－セファロース、ＤＥＡＥセファロース、ポロスＨＱ、ポロスＤＥＡＦ、トヨパールＱ、トヨパールＱＡＥ、トヨパールＤＥＡＥ、リソース／ソースＱ及びＤＥＡＥ、フラクトゲルＱ及びＤＥＡＥカラムでのクロマトグラフィーを含む陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して精製される。
特定の実施形態では、本明細書に記載のタンパク質は、限定されないが、ＳＰ－セファロース、ＣＭセファロース、ポロスＨＳ、ポロスＣＭ、トヨパールＳＰ、トヨパールＣＭ、リソース／ソースＳ及びＣＭ、フラクトゲルＳ及びＣＭカラム、ならびにその等価物及び同等物を含む陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して精製される。
加えて、本明細書に記載の抗体は、当該技術分野で既知の手法を使用して化学的に合成することができる（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ及びＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１０：１０５－１１１（１９８４）を参照のこと）。例えば、ポリペプチドのフラグメントに対応するポリペプチドは、ペプチド合成機の使用により合成することができる。さらに、必要に応じて、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸アナログを、ポリペプチド配列への置換または付加として導入することができる。非古典的アミノ酸は一般に、一般的なアミノ酸のＤ異性体である２，４ジアミノ酪酸、α－アミノイソ酪酸、４アミノ酪酸、Ａｂｕ、２－アミノ酪酸、ｇ－Ａｂｕ、ｅ－Ａｈｘ、６アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２－アミノイソ酪酸、３－アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、アラニン、フルオロアミノ酸、メチルアミノ酸などのデザイナーアミノ酸、Ｃ－メチルアミノ酸、Ｎ－メチルアミノ酸、及びアミノ酸アナログを含むが、これらに限定されない。さらに、アミノ酸は、Ｄ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。
骨髄細胞の免疫調節の方法
本明細書に記載のＴＲＥＭ１抗体の投与方法は、サイトカイン、ケモカインなどの前炎症性分子の誘導、または骨髄細胞による骨髄活性化受容体の発現をもたらし得る。一般に、誘発された前炎症性分子は、アイソタイプ対照で達成されるレベルよりも高いレベルで存在する。一部の実施形態では、骨髄細胞は、非刺激性骨髄細胞である。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、ＴＲＥＭ１発現（ＴＲＥＭ１＋）細胞である。一部の実施形態では、骨髄細胞は、骨髄由来抑制細胞または腫瘍関連好中球である。一部の実施形態では、ＴＲＥＭ１＋細胞は、骨髄由来抑制細胞または腫瘍関連好中球である。そのような前炎症性分子は、次いで、限定されないが、Ｔ細胞活性化、Ｍ１様マクロファージ活性化、及びＮＫ細胞活性化を含む抗腫瘍免疫の活性化をもたらす。従って、抗ＴＲＥＭ１抗体の投与は、腫瘍破壊につながる複数の抗腫瘍免疫機構を誘発し得る。
別の態様では、本発明は、抗ＴＲＥＭ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含む有効量の組成物を個体に投与することを含む、個体において免疫応答を増加させる方法を提供する。一部の実施形態では、対象において免疫応答を増加させる方法は、ヒトＴＲＥＭ１（配列番号１）への結合について参照抗体と競合する抗体を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、対象の免疫応答を増加させる方法は、ヒトＴＲＥＭ１（配列番号１）への結合について競合する抗体を対象に投与することを含み、抗体は、ヒトＴＲＥＭ１（配列番号１）の残基２１～３４（配列番号４２）、１０３～１０９（配列番号４３）、及び１２８～１３６（配列番号４４）内で結合する。一部の実施形態では、対象の免疫応答を増加させる方法は、ヒトＴＲＥＭ１（配列番号１）への結合について競合する抗体を対象に投与することを含み、抗体は、ｉ）ヒトＴＲＥＭ１（配列番号１）の残基２１～３４（配列番号４２）、１０３～１０９（配列番号４３）、及び１２８～１３６（配列番号４４）内に結合し、ｉｉ）任意にヒトＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、抗体は、さらに、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物中に存在する。
本明細書に記載の免疫応答を増加させる任意及び全ての態様では、特性（複数可）または機能（複数可）の側面の任意の増加または減少または変化は、抗ＴＲＥＭ１抗体と接触していない細胞と比較したものである。
免疫応答を増加させると、免疫応答を増強すること、または免疫応答を誘導することの両方であり得る。例えば、免疫応答を増加することは、免疫応答の始動または開始、あるいは進行中または既存の免疫応答の増加または増幅の両方を含む。一部の実施形態では、処置は、免疫応答を誘導する。一部の実施形態では、誘導された免疫応答は、適応免疫応答である。一部の実施形態では、誘導された免疫応答は、自然免疫応答である。一部の実施形態では、処置は、免疫応答を増強する。一部の実施形態では、増強された免疫応答は、適応免疫応答である。一部の実施形態では、増強された免疫応答は、自然免疫応答である。一部の実施形態では、処置は、免疫応答を増加させる。一部の実施形態では、増加した免疫応答は、適応免疫応答である。一部の実施形態では、増加した免疫応答は、自然免疫応答である。一部の実施形態では、免疫応答は、抗ＴＲＥＭ１抗体の投与により始動または開始される。一部の実施形態では、免疫応答は、抗ＴＲＥＭ１抗体の投与により増強される。
別の態様では、本出願は、細胞を抗ＴＲＥＭ１抗体と接触させる方法を提供し、これは、細胞の免疫機能の調節をもたらす。調節は、免疫応答を増加させることか、または刺激性骨髄細胞になるように、非刺激性骨髄細胞をリプログラミングすることであり得る。一部の実施形態では、調節は、免疫機能の増加である。一部の実施形態では、調節は、刺激性骨髄細胞になるように、非刺激性骨髄細胞をリプログラミングすることである。一部の実施形態では、機能の調節は、非刺激性骨髄細胞の活性化をもたらす。一部の実施形態では、機能の調節は、ＴＲＥＭ１発現骨髄細胞のリプログラミングをもたらす。
一部の実施形態では、細胞は、非刺激性骨髄細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＴＲＥＭ１発現細胞（ＴＲＥＭ１＋細胞）である。一部の実施形態では、非刺激性細胞は、ＴＲＥＭ１＋細胞である。一部の実施形態では、ＴＲＥＭ１＋細胞は、ＤＣ１細胞、ＴＡＭ１細胞、ＴＡＭ２細胞、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）、好中球、及び腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）のうちの１つ以上である。一部の実施形態では、ＴＲＥＭ１＋細胞は、骨髄由来抑制細胞である。一部の実施形態では、ＴＲＥＭ１＋細胞は、腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）である。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞をＴＲＥＭ１抗体と接触させることにより、刺激性骨髄細胞（ＳＤＣ）になるように、非刺激性細胞が誘導される。
一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞またはＴＲＥＭ１＋細胞の機能の調節は、例えば、非刺激性細胞がＭＨＣＩ分子上の腫瘍抗原をナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞に交差提示する能力を増加させることにより、または、非刺激性骨髄細胞によるサイトカインもしくはケモカイン分泌を増加させることにより、天然ＣＤ８＋Ｔ細胞及び活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を刺激する細胞の能力の増加をもたらす。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞またはＴＲＥＭ１＋細胞の機能の調節は、例えば、非刺激性細胞またはＴＲＥＭ１＋がＭＨＣＩＩ分子上の腫瘍抗原をナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞に交差提示する能力を増加させることにより、天然ＣＤ４＋Ｔ細胞及び活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の両方を刺激する細胞の能力の増加をもたらす。一部の実施形態では、機能の調節は、サイトカイン、ケモカイン、または共刺激または活性化受容体を産生する細胞の能力を増強または増加させる。一部の実施形態では、調節は、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達、Ｔ細胞増殖、またはＴ細胞サイトカイン産生を誘発する細胞の能力を含む、骨髄細胞またはＴＲＥＭ１＋細胞のＴ細胞刺激性機能を増加させる。
一部の実施形態では、免疫応答の増加は、サイトカイン及びケモカインの分泌である。一部の実施形態では、抗体は、アゴニスト活性を有する。一部の実施形態では、抗体は、アイソタイプ対照抗体と比較して、細胞における少なくとも１つのサイトカインまたはケモカインの発現の増加を誘導する。一部の実施形態では、少なくとも１つのサイトカインまたはケモカインは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＴＮＦＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１５、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ２、ＣＣＬ８、ＣＣＬ２０、ＩＬ－６、ＣＣＬ２、ＣＣＬ７、ＣＳＦ－１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１９、ＴＮＦα、ＧＺＭＨ、ＰＤ－Ｌ１、ＭＭＰ７、ＣＣＬ２３、ＣＤ７０、ＣＤ８α、ＦａｓＬ、ＣＤ２７４、ＣＲＴＡＭ、グランザイムＡ（ＧｚｍＡ）、またはグランザイムＢ（ＧｚｍＢ）からなる群から選択される。一部の実施形態では、サイトカインまたはケモカインは、ＣＸＣＬ１０である。一部の実施形態では、サイトカインまたはケモカインは、ＩＦＮ－γである。一部の実施形態では、サイトカインまたはケモカイン分泌は、未処置細胞またはアイソタイプ対照抗体で処置された細胞と比較して、約１～１００倍（１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、または９０～１００倍）増加する。一部の実施形態では、ケモカインは、ＣＸＣＬ１０であり、分泌は、未処置細胞またはアイソタイプ対照抗体で処置された細胞と比較して、約１～１００倍（１倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１～１０倍、１０～２０倍、２０～３０倍、３０～４０倍、４０～５０倍、５０～６０倍、６０～７０倍、７０～８０倍、８０～９０倍、または９０～１００倍）増加する。一部の実施形態では、サイトカインは、ＩＦＮ－γであり、分泌は、未処置細胞またはアイソタイプ対照抗体で処置された細胞と比較して、約１～１００倍（１倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１～１０倍、１０～２０倍、２０～３０倍、３０～４０倍、４０～５０倍、５０～６０倍、６０～７０倍、７０～８０倍、８０～９０倍、または９０～１００倍）増加する。
一部の実施形態では、調節は、アイソタイプ対照抗体と比較して、少なくとも１つの骨髄性共刺激タンパク質の発現を増加させる。一部の実施形態では、骨髄性共刺激タンパク質は、細胞におけるＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、またはＣＤ８６である。ＨＬＡ－ＤＲは、主に、免疫応答を誘発するためにペプチド抗原をＴ細胞に提示するように機能するＭＨＣクラスＩＩ細胞表面受容体である。ＨＬＡ－ＤＲは、αユニット及びβユニットのヘテロダイマーである。ＨＬＡ－ＤＲは、マクロファージ、Ｂ細胞、及び樹状細胞などの抗原提示細胞により発現される。ＣＤ４０は、抗原提示細胞上に見い出され、抗原提示細胞の活性化のために必要とされる共刺激タンパク質である。ＣＤ８０は、主に、樹状細胞、Ｂ細胞、単球、及び抗原提示細胞などの免疫細胞により発現される受容体であり、ＣＤ８６に密接に関連する。ＣＤ８０は、Ｔ細胞上のＣＤ２８及びＣＴＬＡ４と相互作用し、ＣＤ８６と協調して、Ｔ細胞及びＢ細胞の活性化、増殖、及び細胞傷害性Ｔ細胞に分化するＴ細胞のシグナル伝達を含む分化をプライミングするために作用する。ＣＤ８０は、また、樹状細胞を刺激し、サイトカイン産生を増強し得る。刺激タンパク質は、一次抗原特異的シグナルとともに、抗原提示細胞がＴ細胞を完全に活性化するために必要とされる。Ｔ細胞の共刺激は、Ｔ細胞の増殖、分化、及び生存に必要とされる。共刺激なしで活性化されたＴ細胞は、Ｔ細胞の不応答または欠失をもたらし得る。
一部の実施形態では、処置は、ＨＬＡ－ＤＲ発現を増加させる。一部の実施形態では、処置は、ＣＤ４０発現を増加させる。一部の実施形態では、処置は、ＣＤ８０発現を増加させる。一部の実施形態では、処置は、ＣＤ８６発現を増加させる。一部の実施形態では、共刺激分子は、未処置細胞またはアイソタイプ対照抗体で処置された細胞と比較して、約１～１００倍（１倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１～１０倍、１０～２０倍、２０～３０倍、３０～４０倍、４０～５０倍、５０～６０倍、６０～７０倍、７０～８０倍、８０～９０倍、または９０～１００倍）またはそれ以上増加する。
一部の実施形態では、増強された免疫応答は、抗腫瘍免疫細胞の動員及び活性化である。
一部の実施形態では、抗体は、アイソタイプ対照抗体と比較して、細胞におけるＥＲＫ及び／またはＪＡＫ－ＳＴＡＴ細胞内シグナル伝達経路の活性化の増加を誘導する。一部の実施形態では、抗体は、アイソタイプ対照抗体と比較して、細胞におけるＳＴＡＴ３の活性化の増加を誘導する。一部の実施形態では、抗体は、アイソタイプ対照抗体と比較して、細胞におけるＥＲＫ細胞内シグナル伝達経路の活性化の増加を誘導する。一部の実施形態では、抗体は、アイソタイプ対照抗体と比較して、細胞におけるＪＡＫ－ＳＴＡＴ細胞内シグナル伝達経路の活性化の増加を誘導する。ＥＲＫ経路は、細胞増殖に関与する。ＳＴＡＴ３は、転写因子であり、ＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達経路のメンバーである。ＳＴＡＴ３は、細胞成長に関与する遺伝子の転写を媒介し、ＴＨ１７ヘルパーＴ細胞の分化に必須である。ｉｎ ｖｉｖｏでのＳＴＡＴ３の喪失は、抗体ベースの免疫を維持できないことにも関与している。
一部の実施形態では、抗体は、アイソタイプ対照抗体と比較して、記憶免疫応答を誘導する。一般に、記憶免疫応答は、免疫系が以前に遭遇した病原体または抗原に、その後に曝露する時の防御免疫応答である。例示的な記憶免疫応答は、抗原による感染またはワクチン接種後の免疫応答を含む。一般に、記憶免疫応答は、Ｔ細胞またはＢ細胞などのリンパ球により媒介される。一部の実施形態では、記憶免疫応答は、がん細胞の成長、増殖、または転移を含む、がんに対する防御免疫応答である。一部の実施形態では、記憶免疫応答は、がん細胞の成長、増殖、または転移を阻害、予防、または低減する。
一部の実施形態では、抗体は、ＴＲＥＭ１＋細胞の細胞表面上でＴＲＥＭ１をＴＲＥＭ１に架橋する。一部の実施形態では、接触は、ｉｎ ｖｉｔｒｏである。一部の実施形態では、接触は、ｉｎ ｖｉｖｏである。一部の特定の実施形態では、接触は、ヒトのｉｎ ｖｉｖｏである。一部の実施形態では、接触は、抗ＴＲＥＭ１抗体を投与することにより生じる。一部の実施形態では、抗体（例えば、ヒト）を投与される個体は、がんを有する。
非刺激性骨髄細胞を、無効化する、殺傷する、または枯渇させる方法
一態様では、本出願は、非刺激性骨髄細胞を、ヒトまたはヒト化抗体などの抗ＴＲＥＭ１抗体と接触させる方法を提供し、これにより、非刺激性骨髄細胞の無効化がもたらされる。
別の態様では、本出願は、非刺激性骨髄細胞を、抗ＴＲＥＭ１抗体と接触させる方法を提供し、これにより、非刺激性骨髄細胞の無効化がもたらされる。
一部の実施形態では、非刺激性細胞は、ＤＣ１細胞及びＴＡＭ細胞のうちの１つ以上である。一部の実施形態では、非刺激細胞は、ＴＡＭ細胞、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）、及び腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）のうちの１つ以上である。
一部の実施形態では、本出願は、非刺激性骨髄細胞をＴＲＥＭ１抗体と接触させ、それにより、非刺激性骨髄細胞を殺傷することを含む、非刺激性骨髄細胞を無効化する方法を提供する。無効化は、細胞を、部分的または完全に機能しないようにすることを指す。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞の無効化は、細胞において成長停止を誘導することをもたらす。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞の無効化は、細胞のアポトーシスをもたらす。一部の実施形態では、非刺激性細胞の無効化は、例えば、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）により、細胞の溶解をもたらす。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞の無効化は、細胞の壊死をもたらす。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞の無効化は、細胞において成長停止を誘導することをもたらす。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞の無効化は、細胞の不活化もたらす。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞の無効化は、細胞におけるＴＲＥＭ１タンパク質の活性の中和をもたらす。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞の無効化は、細胞の増殖の低減をもたらす。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞の無効化は、細胞の分化をもたらす。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞の無効化は、阻害性抗原提示細胞として作用する細胞の能力の減少をもたらすか、または活性化抗原提示細胞として作用する細胞の能力の増加をもたらす。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞の無効化は、腫瘍組織または腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内の細胞の局在異常をもたらす。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞の無効化は、腫瘍組織または腫瘍微小環境内の細胞の空間構成の改変をもたらす。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞の無効化は、腫瘍組織またはＴＭＥ内の細胞の時間的発現の改変をもたらす。一部の実施形態では、方法は、さらに、非刺激性骨髄細胞を除去することを含む。
本明細書に記載される非刺激性骨髄細胞を無効化する任意の及び全ての態様では、特性（複数可）または機能（複数可）の態様の任意の増加または減少または変化は、抗ＴＲＥＭ１抗体と接触していない細胞と比較される通りである。
別の態様では、本出願は、非刺激性骨髄細胞を抗ＴＲＥＭ１抗体と接触させる方法を提供し、これは、非刺激性骨髄細胞の機能の調節をもたらす。調節は、以下のうちのいずれか１つ以上であり得る。一部の実施形態では、非刺激細胞は、ＤＣ１細胞、ＴＡＭ１細胞、ＴＡＭ２細胞、ＭＤＳＣ、及びＴＡＮのうちの１つ以上である。一部の実施形態では、機能の調節は、非刺激性骨髄細胞の無効化をもたらす。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞の機能の調節は、例えば、非刺激性細胞がＭＨＣＩ分子上の腫瘍抗原をナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞に交差提示する能力を増加させることにより、天然及び活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の両方を刺激する細胞の能力の増加をもたらす。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞の機能の調節は、例えば、非刺激性細胞がＭＨＣＩＩ分子上の腫瘍抗原をナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞に交差提示する能力を増加させることにより、天然及び活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の両方を刺激する細胞の能力の増加をもたらす。一部の実施形態では、調節は、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達、Ｔ細胞増殖、またはＴ細胞サイトカイン産生を誘発させる細胞の能力を含む、骨髄細胞のＴ細胞刺激機能を増加させる。一部の実施形態では、機能の調節は、サイトカイン、ケモカイン、または共刺激または活性化受容体を産生する細胞の能力を増強または増加させる。一実施形態では、非刺激性細胞の生存が減少するか、または非刺激性細胞の増殖が減少する。一実施形態では、刺激性骨髄細胞対非刺激性骨髄細胞の比が増加する。
本明細書に記載される非刺激性骨髄細胞の機能を減少させる任意の及び全ての態様では、特性（複数可）または機能（複数可）の態様の任意の増加または減少または変化は、ＴＲＥＭ１抗体と接触していない細胞と比較される通りである。
一部の実施形態では、本出願は、非刺激性骨髄細胞を抗ＴＲＥＭ１抗体と接触させ、それにより、非刺激性骨髄細胞を殺傷することを含む、非刺激性骨髄細胞を殺傷する（細胞死の誘導とも呼ばれる）方法を提供する。一部の実施形態では、殺傷は、抗ＴＲＥＭ１抗体と接触されていない非刺激性骨髄細胞と比較して増加している。一部の実施形態では、接触は、非刺激性骨髄細胞のアポトーシスを誘導する。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、非刺激性骨髄細胞及び刺激性骨髄細胞を含む免疫細胞の集団にある。一部の実施形態では、方法は、さらに、非刺激性骨髄細胞を除去することを含む。一部の実施形態では、細胞の１０％～１００％が殺傷される。一部の実施形態では、細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％が殺傷される。
一部の実施形態では、本出願は、免疫細胞の集団を抗ＴＲＥＭ１抗体と接触させることを含む、刺激性骨髄細胞及び非刺激性骨髄細胞を含む免疫細胞の集団において、刺激性骨髄細胞対非刺激性骨髄細胞の比を増加させる方法を提供する。一部の実施形態では、比は、抗ＴＲＥＭ１抗体と接触されていない細胞の集団と比較して増加する。一部の実施形態では、ＤＣ２細胞対ＤＣ１細胞の比が増加する。一部の実施形態では、ＤＣ２細胞対ＴＡＭ１細胞の比が増加する。一部の実施形態では、ＤＣ２細胞対ＴＡＭ２細胞の比が増加する。一部の実施形態では、ＤＣ２細胞対ＴＡＭ１＋ＴＡＭ２細胞の比が増加する。一部の実施形態では、ＤＣ２細胞対ＴＡＭ１＋ＤＣ１細胞の比が増加する。一部の実施形態では、ＤＣ２細胞対ＤＣ１＋ＴＡＭ２細胞の比が増加する。一部の実施形態では、ＤＣ２細胞対ＤＣ１＋ＴＡＭ１＋ＴＡＭ２細胞の比が増加する。一部の実施形態では、少なくとも比は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％増加する。
一部の実施形態では、接触前の刺激性骨髄細胞対非刺激性骨髄細胞の比は、０．００１：１～０．１：１の範囲である。一部の実施形態では、接触後の刺激性骨髄細胞対非刺激性骨髄細胞の比は、０．１：１～１００：１の範囲である。
一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞の数が低減する。一部の実施形態では、刺激性骨髄細胞は、ＤＣ２細胞である。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、例えば、壊死またはアポトーシスにより殺傷する。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、成長停止を引き起こすように誘導される。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞は、もはや増殖しない。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞の空間的局在化が改変され、比は、ＴＭＥの特定の領域で増加する。一部の実施形態では、非刺激性骨髄細胞の一時的発現が改変され、比は、腫瘍の発達中の特定の時間の間に増加する。
一部の実施形態では、接触は、ｉｎ ｖｉｔｒｏである。一部の実施形態では、接触は、ｉｎ ｖｉｖｏである。一部の特定の実施形態では、接触は、ヒトのｉｎ ｖｉｖｏである。一部の実施形態では、接触は、抗ＴＲＥＭ１抗体を投与することにより生じる。一部の実施形態では、抗体（例えば、ヒト）を投与される個体は、がんを有する。
がん処置の方法
別の態様では、本発明は、抗ＴＲＥＭ１抗体を含む有効量の組成物を個体に投与することを含む、個体において免疫関連状態を処置する方法（例えば、免疫応答を増強する方法または非刺激性骨髄細胞の無効化をもたらす方法）を提供する。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、がんの処置に有用であり、したがって、抗ＴＲＥＭ１抗体または抗ＴＲＥＭ１抗体を投与されている個体は、がんを有する。
任意の好適ながんが、本明細書で提供される抗体で処置され得る。がんは、任意のがん腫、腺癌、軟部組織、肉腫、奇形腫、黒色腫、白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、もしくは脳癌、または医療分野で既知の任意の他のがんであり得るが、これらに限定されない。一部の実施形態では、がんは、固形がんである。一部の実施形態では、がんは、液体がんである。一部の実施形態では、がんは、免疫回避性である。一部の実施形態では、がんは、免疫応答性である。
一部の実施形態では、がんは、黒色腫、腎臓癌、肝胆道癌、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）、膵臓癌、結腸癌、膀胱癌、尿路上皮癌、膠芽腫、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、食道癌、腎臓癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、精巣癌、黒色腫、白血病、リンパ腫、または中皮腫である。一部の実施形態では、がんは、結腸癌、膵癌、または乳癌である。
一部の実施形態では、処置は、がんの体積またはサイズの減少をもたらす。一部の実施形態では、処置は、抗体の投与前のがんの体積と比較して、がんの体積を低減させるのに効果的である。一部の実施形態では、処置は、がん成長速度の減少をもたらす。一部の実施形態では、処置は、抗体の投与前のがん成長速度と比較して、がん成長速度を低減させるのに効果的である。一部の実施形態では、処置は、がんを排除するのに効果的である。
一部の実施形態では、免疫関連状態は、（ヒトの）非刺激性骨髄細胞上のＴＲＥＭ１タンパク質の発現または非ヒト種におけるＴＲＥＭ１タンパク質のホモログの発現に関連する免疫関連状態である。一部の実施形態では、免疫関連状態は、刺激性骨髄細胞と比較して、非刺激性骨髄細胞におけるＴＲＥＭ１タンパク質の過剰発現に関連する免疫関連状態である。一部の実施形態では、ＴＲＥＭ１ ｍＲＮＡまたはＴＲＥＭ１タンパク質の過剰発現は、刺激性骨髄細胞と比較して、少なくとも約２倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、または１００倍高い。
一部の実施形態では、これらの方法は、さらに、他の併用療法、例えば、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２遮断療法、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、ＣＴＬＡ４遮断療法、抗ＣＴＬＡ－４抗体、Ｔ細胞の阻害分子が遮断される全身性チェックポイント遮断療法、養子Ｔ細胞療法、ＣＡＲ Ｔ細胞療法、樹状細胞、または他の細胞療法、及び従来の化学療法と組み合わせて提供される。
一部の実施形態では、方法は、さらに、個体由来の生体試料中のＴＲＥＭ１タンパク質の発現レベルを決定することを含む。一部の実施形態では、生体試料は、体液、組織試料、器官試料、尿、糞便、血液、唾液、ＣＳＦ、及びそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、生体試料は、腫瘍組織に由来する。一部の実施形態では、発現レベルは、ＴＲＥＭ１タンパク質をコードするｍＲＮＡのｍＲＮＡ発現レベルを含む。一部の実施形態では、ＴＲＥＭ１タンパク質の発現レベルは、ＮＳＭのタンパク質発現レベルを含む。一部の実施形態では、ＴＲＥＭ１タンパク質の発現レベルは、ＦＡＣＳ、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、免疫組織化学、免疫蛍光、ラジオイムノアッセイ、ドットブロッティング、免疫検出法、ＨＰＬＣ、表面プラズモン共鳴、光学分光法、質量分析、ＨＰＬＣ、ｑＰＣＲ、ＲＴ－ｑＰＣＲ、多重ｑＰＣＲまたはＲＴ－ｑＰＣＲ、ＲＮＡ－ｓｅｑ、マイクロアレイ解析、ＳＡＧＥ、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ手法、及びＦＩＳＨ、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される方法を使用して、試料において検出される。
別の態様では、本出願は、非刺激性骨髄細胞を含む細胞の集団を抗ＴＲＥＭ１抗体と接触させること、及び非刺激性骨髄細胞の数を定量化することを含む、一般的な非刺激性骨髄細胞の有無を判定するための方法、または特定の非刺激性骨髄細胞（例えば、ＤＣ１細胞、ＴＡＭ１細胞、及び／もしくはＴＡＭ２細胞）の有無を判定するための方法を提供する。別の態様では、本出願は、非刺激性骨髄細胞及び刺激性骨髄細胞を含む免疫細胞の集団を、抗ＴＲＥＭ１抗体と接触させること、細胞への抗体の結合を示す複合体または部分を検出すること、ならびに任意に、集団中の非刺激性骨髄細胞の数を定量化することを含む非刺激性骨髄細胞の有無を判定するための方法を提供する。別の態様では、非刺激性骨髄細胞及び刺激性骨髄細胞を含む免疫細胞の集団を抗ＴＲＥＭ１抗体と接触させること；刺激性骨髄細胞及び非刺激性骨髄細胞の数を定量化すること；ならびに非刺激性骨髄細胞対刺激性骨髄細胞の相対比を決定することを含む、非刺激性骨髄細胞対刺激性骨髄細胞の相対比を決定する方法が提供される。
検出及び／または定量化のために本明細書に記載される実施形態では、抗ＴＲＥＭ１抗体は、ＴＲＥＭ１タンパク質に結合するが、必ずしもＡＤＣＣなどの生物学的応答に影響を及ぼす必要がないが、それは、生物学的応答に影響を有してもよい。
別の態様では、本発明は、個体由来の生体試料におけるＴＲＥＭ１タンパク質の発現レベルを検出すること、及びＴＲＥＭ１タンパク質の発現レベルに基づいて、個体が免疫療法に応答し得るかどうかを判定することを含む、免疫関連状態（例えば、がん）の処置のための免疫療法（例えば、抗ＴＲＥＭ１抗体を用いる）に応答し得る個体を同定するための方法を提供し、健康な個体のものと比較して上昇した個体のＴＲＥＭ１タンパク質のレベルは、個体が免疫療法に応答し得ることを示す。一部の実施形態では、これらの方法はまた、個体における免疫関連状態（例えば、がん）を診断するために使用されてもよく、ＴＲＥＭ１タンパク質の発現レベルに基づき、健康な個体のものと比較して上昇した個体のＴＲＥＭ１タンパク質のレベルは、個体ががんを患うことを示す。一部の実施形態では、発現レベルは、ＴＲＥＭ１タンパク質をコードするｍＲＮＡのｍＲＮＡ発現レベルを含む。他の実施形態では、ＴＲＥＭ１タンパク質の発現レベルは、ＴＲＥＭ１タンパク質のタンパク質発現レベルを含む。一部の実施形態では、ＴＲＥＭ１タンパク質の発現レベルは、ＦＡＣＳ、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、免疫組織化学、免疫蛍光、ラジオイムノアッセイ、ドットブロッティング、免疫検出法、ＨＰＬＣ、表面プラズモン共鳴、光学分光法、質量分析、ＨＰＬＣ、ｑＰＣＲ、ＲＴ－ｑＰＣＲ、多重ｑＰＣＲまたはＲＴ－ｑＰＣＲ、ＲＮＡ－ｓｅｑ、マイクロアレイ解析、ＳＡＧＥ、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ手法、及びＦＩＳＨ、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される方法を使用して、試料において検出される。これらの実施形態では、抗ＴＲＥＭ１抗体は、ＴＲＥＭ１タンパク質に結合するが、必ずしもＡＤＣＣなどの生物学的応答に影響を与える必要はない。一部の実施形態では、生体試料は、腫瘍組織に由来する。一部の実施形態では、生体試料は、体液、組織試料、器官試料、尿、糞便、血液、唾液、ＣＳＦ、及びそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。
腫瘍に対する対象の免疫応答を増強する方法、または免疫療法処置の有効性を増強する方法も本明細書で開示される。一般に、ＳＤＣの存在量を増加させる処置は、無再発生存期間などの対象の転帰を改善することになり、がん免疫療法処置の有効性を増強させることになる。処置は、対象の腫瘍における、ＳＤＣ細胞の相対的または絶対的な存在量を増加させ得る。処置は、対象の腫瘍における、ＮＳＭ細胞の相対的または絶対的な存在量を減少させ得る。
一般的な処置方策の例示的な方法は、Ｆｌｔ３Ｌの全身導入によりＳＤＣの数を増加することを含む。別の方法は、ＣＳＦ１を同時に遮断しながら、Ｆｌｔ３Ｌを用いる、対象の自己骨髄または血液細胞の処置である。例えば、レトロウイルスにより、骨髄または血液前駆細胞集団における、ＩＲＦ８、Ｍｙｃｌ１またはＢＡＴＦ３またはＺＢＴＢ４６などのＳＤＣ転写因子の発現はまた、ＳＤＣの出現を促進するために使用されてもよい。別の処置方策は、ＳＤＣを選択的に控えながら、ＮＳＭ細胞を系統的に排除することを含む。これは、これらの集団の比の全体的に好ましい変化を生じ得る。ＮＳＭ細胞の排除は、ＴＲＥＭ１表面タンパク質に対する抗体の投与（腫瘍に全身または限局）を含む任意の手段で達成され得る。
一部の実施形態では、ＳＤＣ増強処置は、がんを制御または根絶することにおいて対象の天然の免疫系をより可能にする治療的処置として適用される。別の実施形態では、本発明のＳＤＣ増強処置は、免疫療法処置などの治療的処置と組み合わせて適用され（そのような適用は、免疫療法処置の前に、同時に、または後に行われる）、ＳＤＣ増強処置は、治療的処置の有効性を増加させるための補助またはアジュバント処置として作用する。
投与方法
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、個体において、免疫関連状態の処置に有用である。一実施形態では、個体は、ヒトであり、抗体は、ＴＲＥＭ１抗体である。別の実施形態では、個体は、マウスであり、抗体は、ＴＲＥＭ１抗体である。
一部の実施形態では、抗体は、静脈内、筋肉内、皮下、局所、経口、経皮、腹腔内、眼窩内、移植により、吸入により、くも膜下腔内に、脳室内に、または鼻腔内に投与される。有効量の抗ＴＲＥＭ１抗体は、がんの処置のために投与されてもよい。抗ＴＲＥＭ１抗体の適切な投薬量は、処置されるべきがんのタイプ、抗ＴＲＥＭ１抗体のタイプ、がんの重症度及び経過、個体の臨床状態、個体の臨床歴、及び処置に対する応答、ならびに主治医の判断に基づいて決定されてもよい。
併用療法
一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、少なくとも１つの追加の治療薬とともに投与される。任意の好適な追加の治療薬または免疫療法薬は、本明細書で提供される抗体とともに投与されてもよい。一部の実施形態では、免疫療法は、チェックポイント阻害薬；Ｔ細胞のチェックポイント阻害薬；抗ＰＤ１抗体；抗ＰＤＬ１抗体；抗ＣＴＬＡ４抗体；養子細胞療法；養子Ｔ細胞療法；ＣＡＲ－Ｔ細胞療法；樹状細胞ワクチン；ＳＴＩＮＧアゴニスト；単球ワクチン；カルメット－ゲラン菌ワクチン；Ｔ細胞及び抗原提示細胞の両方に結合する抗原結合タンパク質；ＢｉＴＥ二重抗原結合タンパク質；Ｔｏｌｌ様受容体リガンド；サイトカイン；細胞傷害療法；化学療法；放射線療法；小分子阻害薬；小分子アゴニスト；免疫調節薬；腫瘍溶解性ウイルス；ならびにエピジェネティック調節薬、ならびにそれらの組み合わせが選択されるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、追加の治療薬は、抗体である。一部の実施形態では、追加の治療薬は、腫瘍細胞表面上のタンパク質（複数可）に結合する抗体である。
がんの処置のために、抗ＴＲＥＭ１抗体は、免疫チェックポイントタンパク質を阻害する１つ以上の抗体と組み合わされてもよい。腫瘍細胞の表面に表示される免疫チェックポイントタンパク質が特に興味深い。臨床がん免疫療法、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４、ＣＤ１５２としても知られる）、及びプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１、ＣＤ２７９としても知られる）との関連で最も活発に研究されている免疫チェックポイント受容体は双方ともに阻害受容体である。これらの受容体のいずれかを遮断する抗体の臨床活性は、抗腫瘍免疫を複数のレベルで増強させ得ること、ならびに機械論的考察及び前臨床モデルにより導かれる組み合わせの方策を理性的に設計することができることを意味する。
ＰＤ－１の２つのリガンドは、ＰＤ－１リガンド１（ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ１及びＣＤ２７４としても知られる）ならびにＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣ及びＣＤ２７３としても知られる）である。ＰＤ－Ｌ１は、がん細胞上に発現され、Ｔ細胞上の受容体ＰＤ－１への結合を介して、それがＴ細胞の活性化／機能を阻害する。がん細胞上のその同種リガンドであるＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２と、ＰＤ－１の相互作用を遮断する阻害薬は、Ｔ細胞の活性化及び機能の両方の増加をもたらし、がん細胞が免疫系を回避することを防止し得る。
一部の実施形態では、免疫療法は、ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２の結合を妨害する薬剤である。一部の実施形態では、免疫療法は、抗ＰＤ１抗体である。一部の実施形態では、免疫療法は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。一部の実施形態では、免疫療法は、抗ＰＤ－Ｌ２抗体である。
種々のＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、及びＰＤ－Ｌ２抗体は、当該技術分野で既知である。一部の実施形態では、追加の治療薬は、アテゾリズマブ（ＰＤ－Ｌ１）、アベルマブ（ＰＤ－Ｌ１）、デュルバルマブ（ＰＤ－Ｌ１）、ニボルマブ（ＰＤ－１）、ペンブロリズマブ（ＰＤ－１）、セミプリマブ（ＰＤ－１）、イピリムマブ（ＣＴＬＡ－４）、トレメリムマブ（ＣＴＬＡ－４）、またはそれらの任意の組み合わせのうちの少なくとも１つである。
追加の治療薬は、任意の好適な手段で投与することができる。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体及び追加の治療薬は、同じ医薬組成物に含まれる。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体及び追加の治療薬は、異なる医薬組成物に含まれる。
本明細書で提供される抗体及び追加の治療薬が異なる医薬組成物中に含まれる実施形態では、抗体の投与は、追加の治療薬の投与の前に、同時に、及び／または後に行われ得る。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体及び追加の治療薬の投与は、互いに約１ヶ月以内に行われる。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体及び追加の治療薬の投与は、互いに約１週間以内に行われる。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体及び追加の治療薬の投与は、互いに約１日以内に行われる。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体及び追加の治療薬の投与は、互いに約１２時間以内に行われる。一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体及び追加の治療薬の投与は、互いに約１時間以内に行われる。
キット及び製造物品
本出願は、本明細書に記載の抗体組成物のうちのいずれか１つ以上を含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットはさらに、二次抗体、免疫組織化学分析用試薬、薬学的に許容される賦形剤、及び取扱説明書、ならびにそれらの任意の組み合わせのいずれかから選択される構成成分を含有する。特定の一実施形態では、キットは、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とともに、本明細書に記載の抗体組成物のうちのいずれか１つ以上を含む医薬組成物を含む。
本出願はまた、本明細書に記載の抗体組成物またはキットのうちのいずれか１つを含む製造物品を提供する。製造物品の例としては、バイアル（密封バイアルを含む）を含む。
追加の実施形態
以下は、特定の実施形態を列挙する段落である。
ヒトＴＲＥＭ１（配列番号１）に結合する単離抗体であって、３つの重鎖ＣＤＲ配列、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含む重鎖、ならびに３つの軽鎖ＣＤＲ配列、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含む軽鎖を含み、
ａ．ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号２３に記載の配列を含み、
ｂ．ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号２４に記載の配列を含み、
ｃ．ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号３３に記載の配列を含み、
ｄ．ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号２６に記載の配列を含み、
ｅ．ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号２７に記載の配列を含み、
ｆ．ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号２８に記載の配列を含む、
前記単離抗体。
前記ＶＨ鎖配列が、配列番号１７に記載のＶＨ配列のセットを含み、前記ＶＬ鎖配列が、配列番号２０に記載のＶＬ配列のセットを含む、請求項１に記載の単離抗体。
前記ＶＨ鎖配列が、配列番号１６、１７、または１８に記載の配列から選択されるＶＨ配列を含み、前記ＶＬ鎖配列が、配列番号２０、２１、または２２に記載の配列から選択されるＶＬ配列を含む、請求項１に記載の単離抗体。
前記抗体が、配列番号３４に記載の重鎖配列及び配列番号３５に記載の軽鎖配列を含む、請求項１に記載の単離抗体。
前記ＶＨ鎖配列が、配列番号１７に記載のＶＨ配列のセットからなり、前記ＶＬ鎖配列が、配列番号２０に記載のＶＬ配列のセットからなる、請求項１に記載の単離抗体。
前記ＶＨ鎖配列が、配列番号１６、１７、または１８に記載の配列から選択されるＶＨ配列からなり、前記ＶＬ鎖配列が、配列番号２０、２１、または２２に記載の配列から選択されるＶＬ配列からなる、請求項１に記載の単離抗体。
前記抗体が、配列番号３４に記載の重鎖配列及び配列番号３５に記載の軽鎖配列からなる、請求項１に記載の単離抗体。
前記抗体が、アフコシル化されており、ＶＨ鎖配列が、配列番号１７に記載のＶＨ配列を含み、ＶＬ鎖が、配列番号２０に記載のＶＬ配列を含む、請求項１に記載の単離抗体。
前記抗体が、アフコシル化されており、ＶＨ鎖配列が、配列番号１６、１７、または１８に記載の配列から選択されるＶＨ配列を含み、ＶＬ鎖配列が、配列番号２０、２１、または２２に記載の配列から選択されるＶＬ配列を含む、請求項１に記載の単離抗体。
前記抗体が、アフコシル化されており、前記抗体が、配列番号３４に記載の重鎖配列及び配列番号３５に記載の軽鎖配列を含む、請求項１に記載の単離抗体。
前記抗体が、アフコシル化されており、ＶＨ鎖配列が、配列番号１７に記載のＶＨ配列を含み、ＶＬ鎖配列が、配列番号２０に記載のＶＬ配列からなる、請求項１に記載の単離抗体。
前記抗体が、アフコシル化されており、ＶＨ鎖配列が、配列番号１６、１７、または１８に記載の配列から選択されるＶＨ配列からなり、ＶＬ鎖配列が、配列番号２０、２１、または２２に記載の配列から選択されるＶＬ配列を含む、請求項１に記載の単離抗体。
前記抗体が、アフコシル化されており、前記抗体が、配列番号３４に記載の重鎖配列及び配列番号３５に記載の軽鎖配列からなる、請求項１に記載の単離抗体。
前記抗体が、アフコシル化されている、請求項１に記載の単離抗体。
前記抗体が、活性ヒトＦｃを含む、請求項１に記載の単離抗体。
前記ヒトＦｃが、野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃである、請求項１５に記載の単離抗体。
前記抗体が、アフコシル化されており、野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃを含み、ＶＨ鎖配列が、配列番号１７に記載のＶＨ配列を含み、ＶＬ鎖配列が、配列番号２０に記載のＶＬ配列を含む、請求項１に記載の単離抗体。
前記抗体が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイで測定した際に、約０．５、１、２、３、４、５、６、または７×１０－９Ｍまたはそれ以下のＫＤでヒトＴＲＥＭ１に結合する、請求項１に記載の単離抗体。
前記抗体が、ヒト化されている、請求項１に記載の単離抗体。
宿主細胞から請求項１に記載の抗体を発現させること、及び発現された抗体を単離することを含む、抗体の製造方法。
請求項１に記載の抗体及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
請求項１に記載の抗体及び使用説明書を含む、キット。
ヒトＴＲＥＭ１（配列番号１）に結合する単離抗体であって、３つの重鎖ＣＤＲ配列、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含む重鎖、ならびに３つの軽鎖ＣＤＲ配列、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含む軽鎖を含み、
ａ．ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号２３に記載の配列を含み、
ｂ．ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号２４に記載の配列を含み、
ｃ．ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号３２に記載の配列を含み、
ｄ．ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号２６に記載の配列を含み、
ｅ．ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号２７に記載の配列を含み、
ｆ．ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号２８に記載の配列を含む、
前記単離抗体。
前記ＶＨ鎖配列が、配列番号１３に記載のＶＨ配列のセットを含み、前記ＶＬ鎖配列が、配列番号２０に記載のＶＬ配列のセットを含む、請求項２３に記載の単離抗体。
前記抗体が、配列番号３６に記載の重鎖配列及び配列番号３７に記載の軽鎖配列を含む、請求項２３に記載の単離抗体。
請求項２３に記載の抗体及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
対象のがんを処置する方法であって、ヒトＴＲＥＭ１（配列番号１）への結合について参照抗体と競合し、３つの重鎖ＣＤＲ配列、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含む重鎖、ならびに、３つの軽鎖ＣＤＲ配列、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含む軽鎖を含む、抗体を前記対象に投与することを含み、
ａ．ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号２３に記載の配列を含み、
ｂ．ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号２４に記載の配列を含み、
ｃ．ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号３３に記載の配列を含み、
ｄ．ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号２６に記載の配列を含み、
ｅ．ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号２７に記載の配列を含み、
ｆ．ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号２８に記載の配列を含む、
前記方法。
前記対象が、免疫療法を以前に受けたことがあるか、同時に受けているか、または後に受けることになり、前記免疫療法が、チェックポイント阻害薬；Ｔ細胞のチェックポイント阻害薬；抗ＰＤ１抗体；抗ＰＤＬ１抗体；抗ＣＴＬＡ４抗体；養子Ｔ細胞療法；ＣＡＲ－Ｔ細胞療法；樹状細胞ワクチン；単球ワクチン；Ｔ細胞及び抗原提示細胞の両方に結合する抗原結合タンパク質；ＢｉＴＥ二重抗原結合タンパク質；Ｔｏｌｌ様受容体リガンド；サイトカイン；細胞傷害療法；化学療法；放射線療法；小分子阻害薬；小分子アゴニスト；免疫調節薬；ならびにエピジェネティック調節薬のうちの少なくとも１つである、請求項２７に記載の方法。
前記免疫療法が、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、または抗ＣＴＬＡ４抗体である、請求項２８に記載の方法。
対象の免疫応答を増加させる方法であって、ヒトＴＲＥＭ１（配列番号１）への結合について参照抗体と競合し、３つの重鎖ＣＤＲ配列、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含む重鎖、ならびに、３つの軽鎖ＣＤＲ配列、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含む軽鎖を含む、抗体を前記対象に投与することを含み、
ａ．ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号２３に記載の配列を含み、
ｂ．ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号２４に記載の配列を含み、
ｃ．ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号３３に記載の配列を含み、
ｄ．ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号２６に記載の配列を含み、
ｅ．ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号２７に記載の配列を含み、
ｆ．ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号２８に記載の配列を含む、
前記方法。
以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の例である。実施例は、例示のみを目的として提供されており、決して本発明の範囲を制限することを意図していない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保する取り組みがなされているが、一部の実験誤差及び偏差は当然許容されるべきである。
本発明の実施は、別途指示のない限り、当業者の範囲内で、タンパク質化学、生化学、組み換えＤＮＡ手法、及び薬理学の従来の方法を用いるであろう。そのような手法は、文献で完全に説明される。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照のこと。
実施例１：抗ＴＲＥＭ１抗体の配列決定及びヒト化
ヒトＴＲＥＭ１に特異的なモノクローナルマウスＩｇＧ１クローンＴＲＥＭ－２６を入手し、配列決定及びヒト化に使用した。簡単に言うと、抗体のジスルフィド結合をジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元し、遊離のスルフヒドリル基をヨードアセトアミドでアルキル化した。アルキル化抗体を配列決定グレードのエンドプロテイナーゼで消化し、スピンカラムを使用して精製し、配列をＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析で決定した（以下を参照のこと）。
マウス抗体のＶＬ及びＶＨ領域をヒトＩｇＧ１定常領域に移植することによって、キメラ抗体（ＰＩ－４０２６）を構築した。抗体ＣＤＲをヒト可変ドメインフレームワークにクローニングすることによって、キメラをさらにヒト化し、１０の追加のヒト化バリアントを異なるフレームワーク変異、４つのＶＨバリアント、及び４つのＶＬバリアント（ＰＩ－４０２６－１－１０）で作成した。
ＶＨ及びＶＬ配列を、ＮＣＢＩ Ｗｅｂサイト（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／；Ｙｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４１：Ｗ３４－Ｗ４０（２０１３））の既知のヒト生殖系列配列のライブラリーと比較した。使用されたデータベースは、ＩＭＧＴヒトＶＨ遺伝子（Ｆ＋ＯＲＦ、２７３生殖系列配列）及びＩＭＧＴヒトＶＬカッパ遺伝子（Ｆ＋ＯＲＦ、７４生殖系列配列）であった。
ヒト化ＰＩ－４０２６ＶＨでは、ヒト生殖細胞系ＩＧＨＶ１－４６（対立遺伝子１）を、アクセプター配列として選択し、ヒト重鎖ＩＧＨＪ４（対立遺伝子１）結合領域（Ｊ遺伝子）を、ＩＭＧＴ（登録商標）ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ（創設者及びディレクター：Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ、仏国モンペリエ）で編集されたヒト結合領域配列から選択した。
ヒト化ＰＩ－４０２６ＶＬでは、ヒト生殖細胞系ＩＧＫＶ１－３９（対立遺伝子１）を、アクセプター配列として選択し、ヒト軽鎖ＩＧＫＪ２（対立遺伝子１）結合領域（Ｊ遺伝子）を、ＩＭＧＴ（登録商標）ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ（創設者及びディレクター：Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ、仏国モンペリエ）で編集されたヒト結合領域配列から選択した。
ＣＤＲをＡｂＭ定義に従って定義した（ＣＤＲ定義を比較する表については、Ｄｒ．Ａｎｄｒｅｗ Ｃ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／を参照のこと）。例えば、ヒト化抗体の結合を最適化するために、対応する親マウス配列へのヒト生殖系列フレームワーク（すなわち、ＶＨ及びＶＬの非ＣＤＲ残基）位置の変更を使用した。
表１Ａは、作成されたｍＡｂ ＰＩ－４０２６のヒト化バージョンのＶＨ及びＶＬ配列を示す。４０２６ＶＨ－１及び４０２６ＶＬ－１は、親ヒト化ＶＨ及びＶＬクローンであり、これから、追加のフレームワーク変異により他のヒト化バージョンを作成した。ＶＨ領域の３つのヒト化クローン（４０２６ＶＨ－２、ＶＨ－３、ＶＨ－４）及びＶＬ領域の３つのヒト化クローン（４０２６ＶＬ－２、ＶＬ－３、ＶＬ－４）を作成した。表１Ｂは、ＣＤＲ配列を示す。
（表１Ａ）
Figure 0007492522000005
（表１Ｂ）ヒト化抗体のＣＤＲ
Figure 0007492522000006
異なるフレームワーク変異を使用して、ＴＲＥＭ１抗体の１０のヒト化バリアントを作製した。表１Ｃは、各ヒト化バリアントに使用されるフレームワーク変異の数ならびに重鎖及び軽鎖のペアリングを示す。
（表１Ｃ）
Figure 0007492522000007
実施例２：抗ＴＲＥＭ１抗体の産生及び特性決定
抗体の産生及び特性決定
標準的な方法を使用して、重鎖及び軽鎖発現ベクターをｅｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクトした。細胞を最大７日間成長させ、その後、上清を抗体精製のために採取した。ｅｘｐｉ２９３に加えて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｗｅｉｓｓ、トロント大学）により、哺乳動物のα１，６フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）を欠損させたｅｘｐｉ２９３細胞においても、抗体を産生した。上清のｐＨを、１ＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４で調整し、微生物の成長を防止するために、アジ化ナトリウムを加えた。ＫａｎＣａｐ Ａ樹脂を使用して、タンパク質を捕捉し、１ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳ及びＰＢＳで抗体を洗浄した後に、５０ｍＭのクエン酸 ｐＨ３．５、１００ｍＭのＮａＣｌで溶出させた。溶出後直ちに、０．５Ｍのアルギニンを含有する１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）で溶液を中和した。標準的手法を使用して、ＰＢＳに緩衝液交換されたタンパク質に対する生物物理学的特性決定を行った。タンパク質をＯＤ２８０で定量化し、計算された吸光係数を使用して、量及び濃度を決定した。還元及び非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｂｉｏｒａｄ基準トリス／グリシン／ＳＤＳ、４～２０％）またはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＧＸＩＩキャピラリー電気泳動システムを使用して、純度及びおおよその分子量を決定した。Ｓｅｐａｘ Ｚｅｎｉｘ－Ｃ ＳＥＣ－３００、３ｕｍ、３００Å、４．６＊１５０ｍｍサイズ排除カラム及びＰＢＳランニング緩衝液を使用する、２８０ｎｍでの検出を用いるＵＨＰＬＣで、凝集状態を決定した。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用したヒト結合力ＫＤ測定
ＰＩ－４０２６バリアントへのヒトＴＲＥＭ１結合の親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国）でＳＰＲにより測定した。全てのデータを２５℃で収集した。１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／Ｖ）の界面活性剤Ｐ２０を移動緩衝液として及びｍＡｂの全ての希釈のために使用した。アミンカップリング化学を使用して、抗マウスＦｃをＣＭ４バイオセンサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に固定化した。ヒトキメラＴＲＥＭ１－ｍＩｇＧ Ｆｃを１つのフローセルに捕捉し、別のフローセル（基準面として使用）をブランクのままにした。複数サイクルで、両方のフローセルを通して、様々な濃度のＰＩ－４０２６バリアント（分析物としての全てのｈＩｇＧ１アイソタイプ）を注入した。各サイクルの後、グリシンＨＣｌ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ２．０）を注入することによって、表面を再生した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、速度論的評価を実施した。速度論的評価は、１：１ラングミュア結合モデルに適合させたセンサーグラムの生成によるものであった。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用したヒト単量体ＫＤ測定
ＰＩ－４０２６バリアントへのヒトＴＲＥＭ１結合の親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国）でＳＰＲにより測定した。全てのデータを２５℃で収集した。１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／Ｖ）の界面活性剤Ｐ２０を移動緩衝液として及びｍＡｂの全ての希釈のために使用した。アミンカップリング化学を使用して、抗ヒトＦｃをＣＭ４バイオセンサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に固定化した。ＰＩ－４０２６バリアント（全てｈＩｇＧ１アイソタイプ）を１つのフローセルの抗ヒトＦｃで捕捉し、別のフローセル（基準面として使用）をブランクのままにした。複数のサイクルで、捕捉されたＰＩ－４０２６バリアント及び参照セルを含むフローセルを通して、様々な濃度のＨｉｓタグ化ヒトＴＲＥＭ１（分析物として）を注入した。各サイクルの後、３ＭのＭｇＣｌ２を注入することによって、表面を再生した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、速度論的評価を実施した。速度論的評価は、１：１ラングミュア結合モデルに適合させたセンサーグラムの生成によるものであった。
示差走査蛍光測定
ＰＩ－４０２６バリアントの融解温度をナノ示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）で決定した。ＰＩ－４０２６バリアント試料を、２０℃～１００℃、１．５℃／分のランプ速度で実行した。試料に浸すことにより、試料をｎａｎｏＤＳＦグレードのキャピラリーに充填した。サーマルスキャン中の蒸発を最小限にするために、キャピラリーの両端を不活性オイルベースの液体ゴムシーリングペーストで密閉した。
３５０及び３３０ｎｍでのトリプトファン蛍光強度またはトリプトファン発光の比の変化からＴｍを計算した。これにより、温度の関数としてタンパク質のアンフォールディング中の立体配座の変化が正確に調べられる。Ｔｍは、タンパク質が５０％アンフォールディングされている温度である。
細胞結合
対数成長期のＨＥＫ２９３対照細胞を培養物から採取し、洗浄し、１×１０５細胞／ウェルで９６ウェルＵ底プレートにプレーティングした。指示されたＰＩ－４０２６バリアント及びアイソタイプ対照の滴定を細胞に加え、氷上で３０分間インキュベートした。１：５００に希釈したＡｌｅｘａ ６４７コンジュゲート抗ヒトＦｃγ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、結合した一次抗体を検出した。二次抗体を細胞とともに氷上で３０分間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色して、室温で１５分間細胞生存率を決定した。結合した抗体の蛍光シグナルをフローサイトメトリー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）で評価した。
結果
表２は、ヒト化ＴＲＥＭ１抗体のそれぞれについて、抗体結合力、単量体の親和性、細胞結合、及びＤＳＦの結果を示す。
（表２）
Figure 0007492522000008
示された結果に基づいて、ＰＩ－４０２６－５をさらなる特性評価及び試験のために選択した。
次に、ＰＩ－４０２６－５に結合するヒトＴＲＥＭ１の親和性を、さらに、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＳＰＲにより測定した。全てのデータを２５℃で収集した。１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／Ｖ）の界面活性剤Ｐ２０を移動緩衝液及びＰＩ－４０２６－５の希釈液として使用した。アミンカップリング化学を使用して、抗マウスＦｃをＣＭ４バイオセンサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に固定化した。ヒトキメラＴＲＥＭ１－ｍＩｇＧ Ｆｃを１つのフローセルに捕捉し、基準面として使用される別のフローセルをブランクのままにした。複数のサイクルで、両方のフローセルを通して、様々な濃度のＰＩ－４０２６－５を注入した。各サイクルの後、グリシンＨＣｌ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ２．０）を注入することによって、表面を再生した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、速度論的評価を実施した。速度論的評価は、１：１ラングミュア結合モデルに適合させたセンサーグラムの生成によるものであった。
ＰＩ－４０２６－５のＳＰＲ結合動態が図１に示される。
実施例３：抗ＴＲＥＭ１抗体の細胞結合
ヒト化ＴＲＥＭ１抗体の種特異性
ｈＴＲＥＭ１過剰発現細胞
対数成長期のＨＥＫ２９３対照またはヒトＴＲＥＭ１過剰発現細胞を培養物から採取し、洗浄し、１×１０５細胞／ウェルで９６ウェルＵ底プレートにプレーティングした。示された濃度の非コンジュゲートｈＩｇＧ１対照またはＰＩ－４０２６－５抗体の滴定を細胞に加え、氷上で３０分間インキュベートした。１：５００に希釈したＡｌｅｘａ ６４７コンジュゲート抗ヒトＦｃγ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、結合した一次抗体を検出した。二次抗体を細胞とともに氷上で３０分間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色して、室温で１５分間細胞生存率を決定した。結合した抗体の蛍光シグナルをフローサイトメトリー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）で評価した。ＥＣ５０値をＰｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）で計算した。
カニクイザルＴＲＥＭ１及びｍＴＲＥＭ１過剰発現細胞
対数成長期のＨＥＫ２９３過剰発現カニクイザルまたはマウスＴＲＥＭ１を培養物から採取し、洗浄し、１×１０５細胞／ウェルで９６ウェルＵ底プレートにプレーティングした。示された濃度の非コンジュゲートｈＩｇＧ１対照またはＰＩ－４０２６－５抗体の滴定を細胞に加え、氷上で３０分間インキュベートした。１：５００に希釈したＡｌｅｘａ ６４７コンジュゲート抗ヒトＦｃγ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、結合した一次抗体を検出した。二次抗体を細胞とともに氷上で３０分間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色して、室温で１５分間細胞生存率を決定した。結合した抗体の蛍光シグナルをフローサイトメトリー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）で評価した。ＥＣ５０値をＰｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）で計算した。
細胞結合
ヒトドナー由来の新しい血液（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｒｅ）の赤血球を溶解させ、洗浄して、ＰＢＭＣ及び顆粒球の含有量を富化した。細胞をプレーティングし、Ｆｃ受容体をヒト血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、ヒトＦｃＸ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、及びペプチドベースのＦｃＲブロック溶液（Ｉｎｎｏｖｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の組み合わせでブロックした。また、細胞生存率を決定するために、細胞をＺｏｍｂｉｅ ＮＩＲ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲで染色した後、主要な免疫サブセットのマーカー及びヒトＩｇＧ１対照またはＰＩ－４０２６－５の滴定を含むフローサイトメトリーカクテルで細胞を染色した。使用された全ての抗体は直接コンジュゲートされていた。データをフローサイトメトリー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）で取得した。ＥＣ５０値をＰｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）で計算した。
結果
図２Ａ及び２Ｂで示されるように、ＰＩ－４０２６－５は、高い特異性でヒトＴＲＥＭ１過剰発現細胞に結合するが、ヒトＴＲＥＭ１を過剰発現しない細胞には結合しない。さらに、ＰＩ－４０２６－５は、ヒト末梢血中の好中球及び単球に結合する（図３Ａ及び３Ｂ）。
ヒト化ＴＲＥＭ１抗体の種特異性を確認するために、カニクイザル及びマウスＴＲＥＭ１へのＰＩ－４０２６－５の結合を評価した。
図４Ａ及び４Ｂに示されるように、ＰＩ－４０２６－５は、カニクイザルＴＲＥＭ１過剰発現細胞に結合するが、マウスＴＲＥＭ１過剰発現細胞には結合しない。
実施例４：抗ＴＲＥＭ１抗体によるＡＤＣＣ及びＡＤＣＰの誘導
ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰアッセイ
平底白色９６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中、示された濃度で、ＰＩ－４０２６－５またはｈＩｇＧ１アイソタイプ対照の滴定とともに、ヒトＴＲＥＭ１を過剰発現するＨＥＫ２９３標的細胞をインキュベートした。室温で１５分間インキュベートした後、ｈＣＤ１６またはｈＣＤ３２発現ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーターＪｕｒｋａｔ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を、３：１の比の標的細胞／抗体混合物に加えた。レポーター細胞を加えた後、アッセイを５％のＣＯ２雰囲気中、３７℃で６時間インキュベートした。ルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）に曝露することによって、ルシフェラーゼ活性の量を決定し、発光リーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で検出した。ＥＣ５０値をＰｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）で計算した。
コンジュゲートしていないｈＩｇＧ１対照またはＰＩ－４０２６－５抗体の滴定とともに、ＧＦＰ陽性ｅｘｐｉ２９３親細またはヒトＴＲＥＭ１過剰発現細胞を室温で１５～３０分間インキュベートした。次に、洗浄せずに、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で標識されたＣＤ１４＋単球から分極したヒトマクロファージを、１：１の比のｅｘｐｉ２９３及び抗体の混合物に加えた。アッセイを５％のＣＯ２雰囲気中、３７℃で６時間インキュベートし、その後、アッセイをフローサイトメトリー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）で評価した。一重項ゲートからＧＦＰ陽性及びＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ陽性マクロファージの数を数えることによって、ＡＤＣＰを測定した。ＥＣ５０値をＰｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）で計算した。
結果
図５Ａ及び５Ｂに示されるように、ＰＩ－４０２６－５は、用量依存的なＴＲＥＭ１特異的な方法で、下流のＦｃγＲ媒介性シグナル伝達を誘導する。図５Ａは、ＦｃγＲシグナル伝達の誘導（ｈＣＤ１６レポーターアッセイシステムを使用）を示し、図５Ｂは、ＦｃγＲシグナル伝達の誘導（ｈＣＤ３２レポーターアッセイシステムを使用）を示す。
次に、ヒト化ＴＲＥＭ１抗体がＡＤＣＰを誘導する能力を、初代ヒトマクロファージで評価した。
図６Ａ及び６Ｂに示されるように、ＰＩ－４０２６－５は、初代ヒトマクロファージにより、ｈＴＲＥＭ１を過剰発現するｅｘｐｉ２９３細胞（図６Ｂ）のＡＤＣＰを誘導するが、親ｅｘｐｉ２９３細胞（図６Ａ）では誘導しない。
実施例５：ヒトＴＲＥＭ１ ＩｇＶを用いたキメラＰＩ－４０２６ Ｆａｂの結晶化
タンパク質の結晶化
ｈＴＲＥＭ１ ＩｇＶ：キメラＰＩ－４０２６ ＦａｂのＳＥＣ精製複合体の回折品質の結晶を、２０℃でシッティングドロップ蒸気拡散法により得た。結晶を凍結防止し、Ｘ線回折データをＥｕｒｏｐｅａｎ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ（ＥＳＲＦ）（フランス・グルノーブル）で収集した。ＣＣＰ４のプログラムＭＯＬＲＥＰを使用する分子置換により、ｈＴＲＥＭ１ ＩｇＶ：ＰＩ－４０２６ Ｆａｂ複合体の構造を決定した。１．９３Åの解像度で、最終モデルを１６．４％のＲｗｏｒｋ及び２１．６％のＲｆｒｅｅに改良した。最終的な改良された構造の解析は、１つのＰＩ－４０２６ Ｆａｂが１つのＴＲＥＭ１ ＩｇＶ分子と相互作用することを示していた。
結果
図７Ａ～Ｅは、ＴＲＥＭ１ ＩｇＶドメインの特定の残基とのＰＩ－４０２６Ｆａｂの各ＣＤＲの特定の残基の相互作用を示す。各パネルでは、濃灰色の構造は、示された抗体ＣＤＲを表し、淡灰色の構造は、ＴＲＥＭ１ ＩｇＶドメインを表す。相互作用する残基は、一文字アミノ酸名称、それに続く、ヒトＴＲＥＭ１配列、またはＰＩ－４０２６重鎖もしくは軽鎖におけるそれらの位置で表される。点線は、ＣＤＲ残基及びＴＲＥＭ１ ＩｇＶ 残基間の水素結合を示す。点線に付属する数値は、オングストローム（Å）で測定された残基間の距離である。ＰＩ－４０２６ ＦａｂのＣＤＲＬ２は、ＴＲＥＭ１ ＩｇＶドメインとの相互作用にとって重要ではなかった。ＰｙＭＯＬソフトウェアを使用して、全ての図及び相互作用を生成及びモデル化した。
図７Ａは、ＰＩ－４０２６ ＦａｂのＣＤＲＨ１内の残基及びＴＲＥＭ１ ＩｇＶドメインの相互作用を示す。図７Ｂは、ＰＩ－４０２６ ＦａｂのＣＤＲＨ２内の残基及びＴＲＥＭ１ ＩｇＶドメインの相互作用を示す。図７Ｃは、ＰＩ－４０２６ ＦａｂのＣＤＲＨ３内の残基及びＴＲＥＭ１ ＩｇＶドメインの相互作用を示す。図７Ｄは、ＰＩ－４０２６ ＦａｂのＣＤＲＬ１内の残基及びＴＲＥＭ１ ＩｇＶドメインの相互作用を示す。図７Ｅは、ＰＩ－４０２６ ＦａｂのＣＤＲＬ３内の残基及びＴＲＥＭ１ ＩｇＶドメインの相互作用を示す。
キメラＰＩ－４０２６抗体のエピトープ配列は、ヒトＴＲＥＭ１のアミノ酸２１～３４（配列番号４２）、１０３～１０９（配列番号４３）、及び１２８～１３６（配列番号：４４）を含む非連続残基である。
実施例６：バリアントＣＤＲＨ３ ｍＡｂの酸化リスクの低減及び特性評価のためのＣＤＲＨ３変異
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によるＨ２Ｏ２酸化評価
最終抗体濃度１ｍｇ／ｍＬで、ＰＩ－４０２６－５及びＰＩ－４０２６－７バリアントを示された濃度のＨ２Ｏ２中、４０℃で１時間インキュベートすることによって、酸化の分析を達成した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ分析ＵＨＰＬＣシステムを使用して、種々の濃度及び時点のＳＥＣで、試料を分析した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を移動相緩衝液として使用し、流速は０．５ｍＬ／分であった。データを解析し、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ７機器ソフトウェア（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、Ａ２８０のピークのＡＵＣを積分した。
カニクイザル結合力ＫＤ
ＰＩ－４０２６－５バリアントへのカニクイザルＴＲＥＭ１結合の親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＳＰＲにより測定した。全てのデータを２５℃で収集した。１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／Ｖ）の界面活性剤Ｐ２０を移動緩衝液として及びｍＡｂの全ての希釈のために使用した。アミンカップリング化学を使用して、抗マウスＦｃをＣＭ４バイオセンサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に固定化した。キメラカニクイザルＴＲＥＭ１－ｍＩｇＧ Ｆｃを１つのフローセルに捕捉し、基準面として使用される別のフローセルをブランクのままにした。補足されたカニクイザルＴＲＥＭ１－ｍＩｇＧ Ｆｃを含むフローセル及び参照セルを通して、様々な濃度のＰＩ－４０２６－５バリアント（分析物として、ｈＩｇＧ１アイソタイプ）を注入した。各サイクルの後、グリシンＨＣｌ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ２．０）を注入することによって、表面を再生した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、速度論的評価を実施した。速度論的評価は、１：１ラングミュア結合モデルに適合させたセンサーグラムの生成によるものであった。
アフコシル化抗体産生
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｗｅｉｓｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｒｏｎｔｏ）により哺乳類のα１，６－フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）を欠損させたｅｘｐｉ２９３細胞に目的の抗体の重鎖及び軽鎖プラスミド（例えば、ＰＩ－４０２６－５）をトランスフェクトすることによって、アフコシル化抗体を産生した。細胞をトランスフェクトした時点で、それらを最大７日間膨張させ、その後、培地を回収し、一段階プロテインＡカラム精製ステップ（ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、抗体を精製した。その後、抗体をＰＢＳに緩衝液交換し、エンドトキシン（ＬＡＬ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ試験、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、濃度（ＮａｎｏＤｒｏｐ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及びＵＨＰＬＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による任意の凝集について評価した。凝集特性に応じて抗体を単量体にＳＥＣ精製した（９５％未満の単量体性）。アフコシル化は、Ｌｅｎｓ Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ凝集（ＬＣＡ）抗原（Ｌ－１０４０－１０、Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ）に対する抗体を用いるウェスタンブロット、または目的の抗体の完全なグリカンプロファイルの評価（Ｂｉｏｎｏｖａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で検証される。
結果
図８に示されるように、ＰＩ－４０２６－５は、ＳＥＣで評価されたＣＤＲＨ３（ＲＭＡＡＭＤＹ（配列番号２５））のＭｅｔ１００で酸化リスクを有する。Ｈ２Ｏ２用量依存的に、抗体のパーセント不均一性が増加し、単量体のパーセントが減少する。これは、０．３％、０．１％、及び０．０１％のＨ２Ｏ２で処置された試料のＳＥＣプロファイルで観察された二重ピークで示される。表３は、ＳＥＣの結果の定量化を提供する。
（表３）
Figure 0007492522000009
これに対処するために、ＰＩ－４０２６－７における残基１００のメチオニンをイソロイシンに変異させ、変異型抗体を上述のように試験した。表４に示されるように、メチオニン残基（ＲＭＡＡＭＤＹ（配列番号２５））からイソロイシン（ＲＩＡＡＭＤＹ（配列番号３０））への変異により、酸化のリスクが排除された。Ｈ２Ｏ２とともにＰＩ－４０２６－７Ｍ１００Ｉ抗体をインキュベートすると、タンパク質の不均一性にいかなる増加ももたらされなかった。
（表４）
Figure 0007492522000010
次に、ＰＩ－４０２６－５に追加の変異を生じさせて、臨床開発のためにこの残基位置で１つ以上の好ましい変異（複数可）を決定した。Ｍ１００を、イソロイシン（Ｍ１００Ｉ）、グルタミン酸（Ｍ１００Ｅ）、ロイシン（Ｍ１００Ｌ）、またはグルタミン（Ｍ１００Ｑ）に変異させた。これらの変異は、ＰＩ－４０２６ Ｆａｂ及びＴＲＥＭ１ ＩｇＶドメイン間の相互作用の解明された結晶構造の解析に基づいて合理的に選択された（実施例５）。表５は、ＣＤＲ－Ｈ３の置換及び配列の概要を示す。
（表５）
Figure 0007492522000011
ｈＣＤ１６レポーターアッセイシステムを使用して、ヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ１への結合親和性、ＳＥＣ、ヒト単球への結合親和性及びＥＣ５０、ＤＳＦ、ならびにＦｃγＲシグナル伝達について、実施例２、３、及び４で前述のように、各ＰＩ－４０２６－５ ＣＤＲＨ３変異体を特性決定した。
さらに、カニクイザルＴＲＥＭ１を過剰発現する細胞への抗体の結合を評価した。ＰＩ－４０２６－５ ＣＤＲＨ３変異体の結果が表６にまとめられる。
（表６）
Figure 0007492522000012
次に、アフコシル化ＰＩ－４０２６－５ ＣＤＲＨ３変異型抗体を同様に特性決定した。
アフコシル化ＰＩ－４０２６－５ ＣＤＲＨ３変異体の結果が表７にまとめられる。
（表７）
Figure 0007492522000013
ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｉ及びＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｅは、非ＴＲＥＭ１発現細胞に対して、より高い非特異的結合を示し、カニクイザルＴＲＥＭ１を発現する細胞に結合する能力を喪失した。ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｌ及びＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑが、ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００（親抗体）の品質、例えば、ヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ１への結合、特異性、生物物理学的特性、ならびに機能性を保持したので、さらなる開発のために選択された。重要なことに、アフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｌ及びＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑは、ｈＣＤ１６レポーターアッセイにおいて有意に増強されたＦｃγＲシグナル伝達を除いて、フコシル化対応物と比較して同様の生物物理学的及び結合特性を示していた。
実施例７：フコシル化及びアフコシル化ＰＩ－４０２６－５バリアントＣＤＲＨ３抗体による細胞結合ならびにＡＤＣＣ及びＡＤＣＰシグナル伝達の誘導
ヒト細胞結合アッセイ
ヒトドナー由来の新しい血液（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｒｅ）の赤血球を溶解させ、洗浄して、ＰＢＭＣ及び顆粒球の含有量を富化した。細胞をプレーティングし、Ｆｃ受容体をヒト血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、ヒトＦｃＸ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、及びペプチドベースのＦｃＲブロック溶液（Ｉｎｎｏｖｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の組み合わせでブロックした。細胞を、また、Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色して、細胞生存率を決定した。Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲの後、主要な免疫サブセットのマーカーを用いるフローサイトメトリーカクテル、及び重鎖の残基１００に特定の変異を含有するヒトＩｇＧ１対照、ＰＩ－４１７０、ＰＩ－４０２６－５、またはＰＩ－４０２６－５変異体のいずれかの滴定で、細胞を染色した。ＰＩ－４０２６－５及びＰＩ－４０２６－５変異体は、完全にフコシル化またはアフコシル化されていた。使用された全ての抗体は、直接コンジュゲートされており、データをフローサイトメトリー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）で取得した。ＥＣ５０値をＰｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）で計算した。
カニクイザル細胞結合アッセイ
新しいカニクイザルの血液（Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ Ｐｒｉｍａｔｅｓ Ｉｎｃ）の赤血球を溶解させ、洗浄して、ＰＢＭＣ及び顆粒球含有量を富化した。細胞をプレーティングし、Ｆｃ受容体をヒト血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）及びペプチドベースのＦｃＲブロック溶液（Ｉｎｎｏｖｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の組み合わせでブロックした。細胞を、また、Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色して、細胞生存率を決定した。Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲの後、主要な免疫サブセットのマーカーを用いるフローサイトメトリーカクテル、及び重鎖の残基１００に特定の変異を含有するヒトＩｇＧ１対照、ＰＩ－４１７０、ＰＩ－４０２６－５、またはＰＩ－４０２６－５変異体のいずれかの滴定で、細胞を染色した。ＰＩ－４０２６－５及びＰＩ－４０２６－５変異体は、完全にフコシル化またはアフコシル化されていた。使用された全ての抗体は、直接コンジュゲートされており、データをフローサイトメトリー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）で取得した。ＥＣ５０値をＰｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）で計算した。
ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰアッセイ
平底白色９６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中、示された濃度で、フコシル化またはアフコシル化型のＰＩ－４１７０、ＰＩ－４０２６－５、ＰＩ－４０２６－５変異体、またはｈＩｇＧ１アイソタイプ対照の滴定とともに、ヒトＴＲＥＭ１を過剰発現するＨＥＫ２９３標的細胞をインキュベートした。室温で１５分間インキュベートした後、ｈＣＤ１６発現ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーターＪｕｒｋａｔ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を、３：１の比の標的細胞／抗体混合物に加えた。レポーター細胞の添加後、アッセイを５％のＣＯ２雰囲気中、３７℃で６時間インキュベートした。ルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）に曝露することによって、ルシフェラーゼ活性の量を決定し、発光リーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で検出した。ＥＣ５０値をＰｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）で計算した。
結果
図９Ａ及び９Ｂに示されるように、フコシル化ＰＩ－４０２６－５抗体及びアフコシル化ＰＩ－４０２６－５抗体は、ヒト末梢単球に結合する。図９Ａは、フコシル化抗体の結合を示し、図９Ｂは、アフコシル化抗体の結合を示す。同様に、フコシル化ＰＩ－４０２６－５抗体及びアフコシル化ＰＩ－４０２６－５抗体は、カニクイザル単球に結合する（図１０Ａ及び１０Ｂ）。ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｌ及びＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ ＣＤＲＨ３バリアントが、カニクイザル単球への最良の結合を示した。
さらに、抗体のアフコシル化は、フコシル化抗体と比較して、ｈＣＤ１６を介したＦｃγＲシグナル伝達の増加をもたらした（図１１Ａ及び１１Ｂ）。図１１Ａは、フコシル化抗体のＦｃγＲシグナル伝達活性を示し、図１１Ｂは、アフコシル化抗体のＦｃγＲシグナル伝達活性を示す。
実施例８：ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｌ及びＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ抗体の生化学的特性決定
以前のデータに基づき、種々の生化学的アッセイを使用して、２つのアフコシル化ＣＤＲＨ３変異型抗体をさらに特性決定した。これらは、アフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｌ（新たにＰＩ６４０５２と命名）、及びアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ（新たにＰＩ６４０６２と命名）であった。
前述のように、ヒト及びカニクイザル細胞に対する抗体ＫＤを決定した。
凝集／安定性（サイズ排除クロマトグラフィー／ＳＥＣ）
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上のＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ分析ＵＨＰＬＣシステムを使用する種々の濃度及び時点のＳＥＣで、アフコシル化ＰＩ－４０２６－５Ｍ１００Ｌ（ＰＩ６４０５２）及びアフコシル化ＰＩ－４０２６－５ Ｍ１００Ｑ（ＰＩ６４０６２）を分析した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を移動相緩衝液として使用し、流速は０．５ｍＬ／分であった。データを解析し、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ７機器ソフトウェア（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、Ａ２８０のピークのＡＵＣを積分した。
凝集／安定性（動的光散乱法「ＤＬＳ」）
８３０ｎｍレーザーを備えた温度制御ＤｙｎａＰｒｏプレートリーダー（Ｗｙａｔｔ）を使用して、示された濃度及び時点のアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｌ（ＰＩ６４０５２）及びアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ（ＰＩ６４０６２）のデータを３７℃で取得した。自動化されたハイスループットデータ収集を可能にするために、試料を３８４ウェルプレートに充填した。散乱光を１６９℃で監視した。ＤＹＮＡＭＩＣＳソフトウェアを使用して、流体力学的直径及び多分散度指数を解析及び計算した。
判別種及び相対的疎水性（疎水性相互作用クロマトグラフィー／ＨＩＣ）
ＭＡｂＰａｃ ＨＩＣ－１０、分析用カラム、５μｍ、４．６×１００ｍｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）の分析用ＵＨＰＬＣシステムを使用するＨＩＣで、アフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｌ（ＰＩ６４０５２）及びアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ（ＰＩ６４０６２）を分析した。０．１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、１Ｍの硫酸アンモニウムを移動相１として使用し、０．１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）を移動相２として使用して、１ｍＬ／分の流速の勾配を生じた。勾配で溶出させた試料をＡ２８０で監視した。データを解析し、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ ７機器ソフトウェア（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びＰｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用して、ピークのＡＵＣを積分した。
熱ストレス（動的光散乱「ＤＬＳ」）
８３０ｎｍレーザーを備えた温度制御ＤｙｎａＰｒｏプレートリーダー（Ｗｙａｔｔ）を使用して、示された濃度及び時点のアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｌ（ＰＩ６４０５２）及びアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ（ＰＩ６４０６２）のデータを３７℃で取得した。自動化されたハイスループットデータ収集を可能にするために、試料を３８４ウェルプレートに充填した。散乱光を１６９℃で監視した。ＤＹＮＡＭＩＣＳソフトウェアを使用して、流体力学的直径及び多分散度指数を解析及び計算した。
熱ストレス（示差走査蛍光測定「ＤＳＦ」）
アフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｌ（ＰＩ６４０５２）及びアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ（ＰＩ６４０６２）の融解温度をナノ示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）で決定した。試料を、２０℃～１００℃、１．５℃／分のランプ速度で実行した。試料に浸すことにより、試料をｎａｎｏＤＳＦグレードのキャピラリーに充填した。サーマルスキャン中の蒸発を最小限にするために、キャピラリーの両端を不活性オイルベースの液体ゴムシーリングペーストで密閉した。
３５０及び３３０ｎｍでのトリプトファン蛍光強度またはトリプトファン発光の比の変化からＴｍを計算した。これにより、温度の関数としてタンパク質のアンフォールディング中の立体配座の変化が正確に調べられる。Ｔｍは、タンパク質が５０％アンフォールディングされている温度である。
熱ストレス（ＳＥＣ）
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ分析ＵＨＰＬＣシステムを使用して、示された濃度、温度（３７℃）、及び時点のアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｌ（ＰＩ６４０５２）及びアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ（ＰＩ６４０６２）のデータを収集した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を移動相緩衝液として使用し、流速は０．５ｍＬ／分であった。データを解析し、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ ７機器ソフトウェア（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びＰｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用して、Ａ２８０のピークのＡＵＣを積分した。
酸化ストレス（ＨＩＣ）
１ｍｇ／ｍＬの最終抗体濃度で、アフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｌ（ＰＩ６４０５２）及びアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ（ＰＩ６４０６２）を示された濃度のＨ２Ｏ２中、４０℃で１時間インキュベートすることによって、酸化の分析を達成した。ＭＡｂＰａｃ ＨＩＣ－１０、分析カラム、５μｍ、４．６×１００ｍｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）上、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ分析ＵＨＰＬＣシステムを使用する指定された時点のＨＩＣで、試料を分析した。０．１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、１Ｍの硫酸アンモニウムを移動相１として使用し、０．１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）を移動相２として使用して、１ｍＬ／分の流速の勾配を生じた。勾配で溶出させた試料をＡ２８０で監視した。データを解析し、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ ７機器ソフトウェア（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びＰｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を使用して、ピークのＡＵＣを積分した。
酸化ストレス（ＳＥＣ）
１ｍｇ／ｍＬの最終抗体濃度で、アフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｌ（ＰＩ６４０５２）及びアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ（ＰＩ６４０６２）を示された濃度のＨ２Ｏ２中、４０℃で１時間インキュベートすることによって、酸化の分析を達成した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｇａｉｎ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ分析ＵＨＰＬＣシステムを使用した、示された時点でのＳＥＣにより、試料を分析した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を移動相緩衝液として使用し、流速は０．５ｍＬ／分であった。データを解析し、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ７機器ソフトウェア（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、Ａ２８０のピークのＡＵＣを積分した。
脱アミド化リスク（キャピラリー電気泳動－等電点電気泳動「ＣＥ－ＩＥＦ」によるチャージバリアント分析）
アフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｌ（ＰＩ６４０５２）及びアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ（ＰＩ６４０６２）を、示されたｐＨ値及び示された温度（４℃または４０℃）で、示された緩衝液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、トリス（ｐＨ８）、またはクエン酸塩（ｐＨ４．５））中１ｍｇ／ｍＬの最終抗体濃度で１２時間インキュベートした。１２時間後、試料をチャージバリアントキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）に従って調製し、試料をＬａｂＣｈｉｐＩＩ ＧＸ機器及びＬａｂＣｈｉｐ ＧＸソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で実行して解析した。
結果
表８は、ヒト及びカニクイザルＴＲＥＭ１タンパク質へのＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２の結合特性の結果を示す。ＰＩ６４０５２は、単量体ヒトＴＲＥＭ１への、より良いヒト結合力及び結合を有していたが、ＰＩ６４０６２は、より良いカニクイザル結合力を有していた。
（表８）
Figure 0007492522000014
ＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２抗体の熱ストレス（３７℃）に応答した安定性動態（ＤＬＳにより決定）が図１２Ａ及び１２Ｂに示される。図１２Ａは、経時的な各抗体の平均半径（バー（左から右へ）：０時間、２４時間、４８時間、１４日、２８日、及び３５日）を示し、図１２Ｂは、経時的な％多分散度（バー（左から右へ）：０時間、２４時間、４８時間、１４日、２８日、及び３５日）を示す。両方の抗体は、後の時点で多分散度の増加を示していたが、業界で認められている単分散の定義（２０％未満の多分散度）をはるかに下回っている。結果は、以下の表９に定量化される。
（表９）
Figure 0007492522000015
ＳＥＣで決定されたＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２抗体の速度論的安定性が図１３Ａ及び１３Ｂに示される。図１３Ａは、％単量体（バー（左から右へ）：０時間、２４時間、４８時間、７日、１４日、及び２８日）を示し、図１３Ｂは、経時的な％凝集（バー（左から右へ）：０時間、２４時間、４８時間、７日、１４日、及び２８日）を示す。両方の抗体は、経時的な％凝集の増加がごくわずかであったが、９８％を超える単量体を維持した。結果は、以下の表１０に定量化される。
（表１０）
Figure 0007492522000016
ＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２抗体の酸化ストレス感受性が、図１４Ａ及び１４Ｂ（２４時間、バー（右から左へ）０、０．３、０．１、０．０１、０．００１、０．０００１）、図１５Ａ及び１５Ｂ（１４日、バー（右から左へ）０、０．３、０．１、０．０１、０．００１、０．０００１）、ならびに１６Ａ及び１６Ｂ（２８日、バー（右から左へ）０、０．３、０．１、０．０１、０．００１、０．０００１）（疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）で測定）に示される。結果は、また、以下の表１１、１２、及び１３に定量化される。Ｈ２Ｏ２とともにインキュベートすると、Ｈ２Ｏ２処理の２４時間後または１４日後のいずれの抗体の酸化種の有意な増加ももたらされなかった。しかし、Ｈ２Ｏ２曝露の２８日後、ＰＩ６４０５２は、Ｈ２Ｏ２濃度の関数としてＰＩ６４０６２よりも高い不均一性を示した。
（表１１）
Figure 0007492522000017
（表１２）
Figure 0007492522000018
（表１３）
Figure 0007492522000019
ＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２抗体の脱アミド化アッセイの結果が、図１７Ａ～１７Ｄに示される。ＰＩ６４０５２（図１７Ａ及び１７Ｂ）とＰＩ６４０６２（図１７Ｃ及び１７Ｄ）のいずれも、ＣＥ－ＩＥＦ分析によって脱アミド化リスクを示さなかった。図１７Ａ及び１７Ｃは、脱アミド化条件の関数として生じ得るタンパク質チャージバリアントを検出するキャピラリー電気泳動ゲルである。図１７Ｂ及び１７Ｄは、検出されたタンパク質バンドの強度として表されるキャピラリー電気泳動ゲルのデータを示す。
ＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２抗体の生物物理学的特性の概要が表１４に示される。各基準に対する一方の抗体の他方に対する優位性は、（＋）で示される。いずれの抗体も他方より優れているものではない基準は、（－）で示される。全体として、ＣＤＲ－Ｈ３領域にＭ１００Ｑ変異を含有するＰＩ６４０６２は、ＰＩ６４０５２よりも優れた生物物理学的特性を有していた。
（表１４）
Figure 0007492522000020
実施例９：細胞結合ならびにＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２抗体によるＡＤＣＣ及びＡＤＣＰシグナル伝達の誘導
次に、細胞結合ならびにＡＤＣＣ及びＡＤＣＰの誘導を含む種々の機能アッセイを使用して、ＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２を特性決定した。
バックグラウンド結合
対数成長期のＨＥＫ２９３ ＧＦＰ対照細胞を培養物から採取し、洗浄し、１×１０５細胞／ウェルで９６ウェルＵ底プレートにプレーティングした。アフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｌ（ＰＩ６４０５２）及びアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ（ＰＩ６４０６２）、ならびにアイソタイプ対照の滴定を細胞に加え、氷上で３０分間インキュベートした。１：５００に希釈したＡｌｅｘａ ６４７コンジュゲート抗ヒトＦｃγ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、結合した一次抗体を検出した。二次抗体を細胞とともに氷上で３０分間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色して、室温で１５分間細胞生存率を決定した。結合した抗体の蛍光シグナルをフローサイトメトリー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）で評価した。
リンパ球結合
ヒトドナー由来の新しい血液（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｒｅ）の赤血球を溶解させ、洗浄して、ＰＢＭＣ及び顆粒球の含有量を富化した。細胞をプレーティングし、Ｆｃ受容体をヒト血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、ヒトＦｃＸ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、及びペプチドベースのＦｃＲブロック溶液（Ｉｎｎｏｖｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の組み合わせでブロックした。細胞を、また、Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色して、細胞生存率を決定した。Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲの後、主要な免疫サブセットのマーカーを含むフローサイトメトリーカクテル、及びヒトＩｇＧ１対照、アフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｌ（ＰＩ６４０５２）、またはアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ（ＰＩ６４０６２）のいずれかの滴定で、細胞を染色した。使用された全ての抗体は、直接コンジュゲートされており、データをフローサイトメトリー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）で取得した。
ｈＴＲＥＭ１過剰発現細胞への結合のＥＣ５０
対数成長期のＨＥＫ２９３細胞過剰発現ヒトＴＲＥＭ１を培養物から採取し、洗浄し、１×１０５細胞／ウェルで９６ウェルＵ底プレートにプレーティングした。示された濃度の非コンジュゲートｈＩｇＧ１対照、アフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｌ（ＰＩ６４０５２）、またはアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ（ＰＩ６４０６２）の滴定を細胞に加え、氷上で３０分間インキュベートした。１：５００に希釈したＡｌｅｘａ ６４７コンジュゲート抗ヒトＦｃγ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、結合した一次抗体を検出した。二次抗体を細胞とともに氷上で３０分間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色して、室温で１５分間細胞生存率を決定した。結合した抗体の蛍光シグナルをフローサイトメトリー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）で評価した。ＥＣ５０値をＰｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）で計算した。
カニクイザルＴＲＥＭ１過剰発現細胞への結合のＥＣ５０
対数成長期のＨＥＫ２９３細胞過剰発現カニクイザルＴＲＥＭ１を培養物から採取し、洗浄し、１×１０５細胞／ウェルで９６ウェルＵ底プレートにプレーティングした。示された濃度の非コンジュゲートｈＩｇＧ１対照、アフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｌ（ＰＩ６４０５２）、またはアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ（ＰＩ６４０６２）の滴定を細胞に加え、氷上で３０分間インキュベートした。１：５００に希釈したＡｌｅｘａ ６４７コンジュゲート抗ヒトＦｃγ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、結合した一次抗体を検出した。二次抗体を細胞とともに氷上で３０分間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色して、室温で１５分間細胞生存率を決定した。結合した抗体の蛍光シグナルをフローサイトメトリー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）で評価した。ＥＣ５０値をＰｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）で計算した。
ヒト単球への結合のＥＣ５０
ヒトドナー由来の新しい血液（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｒｅ）の赤血球を溶解させ、洗浄して、ＰＢＭＣ及び顆粒球の含有量を濃縮した。細胞をプレーティングし、Ｆｃ受容体をヒト血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、ヒトＦｃＸ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、及びペプチドベースのＦｃＲブロック溶液（Ｉｎｎｏｖｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の組み合わせでブロックした。細胞を、また、Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色して、細胞生存率を決定した。Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲの後、主要な免疫サブセットのマーカーを含むフローサイトメトリーカクテル、及びヒトＩｇＧ１対照、アフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｌ（ＰＩ６４０５２）、またはアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ（ＰＩ６４０６２）のいずれかの滴定で、細胞を染色した。使用された全ての抗体は、直接コンジュゲートされており、データをフローサイトメトリー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）で取得した。ＥＣ５０値をＰｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）で計算した。
カニクイザル単球への結合のＥＣ５０
新しいカニクイザルの血液（Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ Ｐｒｉｍａｔｅｓ Ｉｎｃ）の赤血球を溶解させ、洗浄して、ＰＢＭＣ及び顆粒球含有量を富化した。細胞をプレーティングし、Ｆｃ受容体をヒト血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）及びペプチドベースのＦｃＲブロック溶液（Ｉｎｎｏｖｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の組み合わせでブロックした。細胞を、また、Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色して、細胞生存率を決定した。Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲの後、主要な免疫サブセットのマーカーを含むフローサイトメトリーカクテル、及びヒトＩｇＧ１対照、アフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｌ（ＰＩ６４０５２）、またはアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ（ＰＩ６４０６２）のいずれかの滴定で、細胞を染色した。使用された全ての抗体を、直接コンジュゲートされており、データをフローサイトメトリー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）で取得した。ＥＣ５０値をＰｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）で計算した。
ｈＣＤ１６ ＡＤＣＣレポーターアッセイ
ヒトＴＲＥＭ１を過剰発現するＨＥＫ２９３標的細胞を、アフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｌ（ＰＩ６４０５２）、アフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ（ＰＩ６４０６２）、またはｈＩｇＧ１アイソタイプ対照の滴定とともに、平底白色９６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中、示された濃度でインキュベートした。室温で１５分間インキュベートした後、ｈＣＤ１６発現ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーターＪｕｒｋａｔ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を、３：１の比の標的細胞／抗体混合物に加えた。レポーター細胞を加えた後、アッセイを５％のＣＯ２雰囲気中、３７℃で６時間インキュベートした。ルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）に曝露することによって、ルシフェラーゼ活性の量を決定し、発光リーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で検出した。ＥＣ５０値をＰｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）で計算した。
初代マクロファージＡＤＣＰアッセイ
コンジュゲートされていないｈＩｇＧ１対照、アフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｌ（ＰＩ６４０５２）、またはアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ（ＰＩ６４０６２）の滴定とともに、ヒトＴＲＥＭ１を過剰発現するＧＦＰ陽性ｅｘｐｉ２９３細胞を室温で１５～３０分間インキュベートした。次に、洗浄せずに、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で標識された、２人のドナー由来のＣＤ１４＋単球から分極したヒトマクロファージを、１：１の比のｅｘｐｉ２９３及び抗体の混合物に加えた。アッセイを５％のＣＯ２雰囲気中、３７℃で６時間インキュベートし、その後、アッセイをフローサイトメトリー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）で評価した。１細胞でゲーティングされたＧＦＰ陽性及びＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ陽性マクロファージの数を列挙することによって、ＡＤＣＰを測定した。ＥＣ５０値をＰｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）で計算した。
ＦｃγＲ結合
１μｇ／ｍｌの示された組み換えヒトＨｉｓタグ化ＦｃγＲタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）をＭａｘｉｓｏｒｐプレート上に４℃で一晩コーティングした。翌日、プレートを洗浄し、示された濃度のフコシル化またはアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｌ及びＰＩ－４０２６－５ Ｍ１００Ｑ、またはｈＩｇＧ４アイソタイプ対照（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）の滴定をコーティングされたプレートに加えた。コーティングされたＦｃγＲタンパク質への抗体のＦｃ媒介性結合は、ヒトＩｇＧのＦａｂ’２部分に対するＨＲＰコンジュゲートＦａｂ’２フラグメントを用いて検出された（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）。ＴＭＢ基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、一次抗体に結合しているＨＲＰコンジュゲート二次試薬の量を定量し、Ｈ３ＰＯ４を使用して反応を停止させた。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
結果
ＨＥＫ２９３親細胞結合の個々の実験的複製が、図１８Ａ、１８Ｂ、及び１８Ｃに示される。アイソタイプ対照と比較して、ＨＥＫ２９３細胞へのＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２の検出可能な結合はなかった。
図１９Ａ～Ｆに示されるように、アイソタイプ対照と比較して、ヒトリンパ球（Ｔ細胞またはＢ細胞）へのＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２の検出可能な結合はなかった。各アッセイを３回繰り返した。各グラフは、個々の実験の結果を示す。図１９Ａ、１９Ｂ、及び１９Ｃは、Ｔ細胞でゲーティングされた個々の実験を示すが、図１９Ｄ、１９Ｅ、及び１９Ｆは、Ｂ細胞でゲーティングされた個々の実験を示す。
ヒトＴＲＥＭ１を過剰発現する細胞に対する２つのアフコシル化抗体のＥＣ５０にも差異はなかった（図２０Ａ、２０Ｂ、及び２０Ｃ）。実験を３回繰り返した。各グラフは、個々の実験の結果を示す。データは、以下の表１５に定量される。
（表１５）
Figure 0007492522000021
ＰＩ６４０６２は、カニクイザルＴＲＥＭ１を過剰発現する細胞への一貫したより良好な結合を示した（図２１Ａ、２１Ｂ、２１Ｃ）。実験を３回繰り返した。各グラフは、個々の実験の結果を示す。データが、以下の表１６に定量される。
（表１６）
Figure 0007492522000022
ヒト単球に対する２つのアフコシル化抗体のＥＣ５０に差異はなかった（図２２Ａ、２２Ｂ、及び２２Ｃ）。実験を３回繰り返した。各グラフは、個々の実験の結果を示す。データが、以下の表１７に定量される。
（表１７）
Figure 0007492522000023
カニクイザル単球に対する２つのアフコシル化抗体のＥＣ５０に差異はなかった（図２３Ａ及び２３Ｂ）。アッセイを２回繰り返した。各グラフは、個々の実験の結果を示す。データが、以下の表１８に定量される。
（表１８）
Figure 0007492522000024
図２４に示されるように、ｈＣＤ１６レポーターアッセイシステムでは、ＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２により媒介されたＦｃγＲシグナル伝達に有意差はなかった。アッセイを３回繰り返した。各グラフは、個々の実験の結果を示す。データが、以下の表１９に定量される。図２４は、第３の実験であり、３回の別々の実験を表す。
（表１９）
Figure 0007492522000025
図２５Ａ、２５Ｂ、２５Ｃ、及び２５Ｄに示されるように、ＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２が初代ヒトマクロファージによりｈＴＲＥＭ１発現細胞のＡＤＣＰを誘導する能力に有意差はなかった。２人のドナーを使用して、アッセイを実施した。図２５Ａ及び２５Ｂは、ドナー１の結果を示すが、２５Ｃ及び２５Ｄは、ドナー２の結果を示す。データが、以下の表２０に定量される。
（表２０）
Figure 0007492522000026
図２６Ａ～Ｆに示されるように、ＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２間で、ＦｃγＲ結合に有意差はなかった。ＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２は、フコシル化された対応物（それぞれ、ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｌ及びＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ）と比較して、特定のＦｃγＲ、例えば、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）、ＦｃγＲＩＩＩａ（Ｆ）、及びＦｃγＲＩＩＩｂ、への結合の増強を示した。図２６Ａは、ＦｃγＲＩへの結合を示し、図２６Ｂは、ＦｃγＲＩＩａへの結合を示し、図２６Ｃは、ＦｃγＲＩＩｂへの結合を示し、図２６Ｄは、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ－Ｖ）への結合を示し、図２６Ｅは、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ－Ｆ）への結合を示し、図２６Ｆは、ＦｃγＲＩＩＩｂへの結合を示す。
ＰＩ６４０５２及びＰＩ６４０６２抗体の結合及び機能特性の概要が表２１に示される。各基準に対する一方の抗体の他方に対する優位性は、（＋）で示される。いずれの抗体も他方より優れているものではない基準は、（－）で示される。全体として、ＣＤＲＨ３領域にＭ１００Ｑ変異を含有するＰＩ６４０６２は、カニクイザルＴＲＥＭ１に対してＰＩ６４０５２よりも良好な結合特性を示したが、他の特性は実質的に異ならなかった。
（表２１）
Figure 0007492522000027
実施例１０：ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ及びアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ（ＰＩ６４０６２）抗体による受容体占有率及びサイトカイン放出
受容体の占有
全血が複数のヒトドナーから供給され（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｒｅ）、赤血球を除去した。残りの白血球を、９６ウェルプレートに１ウェル当たり５×１０６の細胞でプレーティングした。プレーティングした後、細胞を非コンジュゲートｈＩｇＧ１アイソタイプ、アフコシル化ｈＩｇＧ１アイソタイプ、ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ、またはアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ（ＰＩ６４０６２）とともに滴定依存的に２４時間インキュベートした。
２４時間後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色して、細胞生存率を決定した。Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）もまた、ヒト血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、ヒトＦｃＸ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、及びペプチドベースのＦｃγＲブロック溶液（Ｉｎｎｏｖｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の組み合わせでブロックした。ＦｃγＲブロッキング試薬とともにインキュベートした後、主要な腫瘍内免疫サブセットのマーカー及びｍＩｇＧ１アイソタイプまたはマウス抗ヒトＴＲＥＭ１抗体（クローンＴＲＥＭ２６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を含むフローサイトメトリーカクテルで、目的の表面受容体を染色した。フローサイトメトリーによる表現型解析に使用された全ての抗体は直接コンジュゲートされていた。Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ解析装置（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ）、及びＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を使用して解析した。
非コンジュゲート抗体の濃度の関数として、関連細胞サブセット（単球及び好中球）へのコンジュゲートＴＲＥＭ１抗体の結合からの特定のシグナル伝達の喪失を評価することによって、受容体占有率を決定した。
Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ）でプロットされた滴定曲線に基づいて、ＩＣ５０値を計算し、ナノモル濃度に対して正規化した。
Ｉｎ Ｖｉｔｒｏサイトカイン及びケモカイン検出
全血が、複数のヒトドナーから供給され（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｒｅ）、赤血球を除去した。残りの白血球を、９６ウェルプレートに１ウェル当たり５×１０６の細胞でプレーティングした。プレーティングした後、細胞を非コンジュゲートｈＩｇＧ１アイソタイプ、アフコシル化ｈＩｇＧ１アイソタイプ、ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ、またはアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ（ＰＩ６４０６２）とともに滴定依存的に２４時間インキュベートした。
２４時間後、上清を採取し、ヒト前炎症性及びケモカインキット（パネル１、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用した各条件で、示されたサイトカイン及びケモカインのレベルを評価した。Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ診断技術を使用してデータを取得し、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）及びＰｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ）で解析した。
Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ）でプロットされた滴定曲線に基づいて、ＥＣ５０値を計算し、ナノモル濃度に対して正規化した。
結果
ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ及びアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ（ＰＩ６４０６２）は、単球（図２７Ａ）と好中球（図２７Ｂ）において実質的に異なる用量依存的な受容体占有率（ＲＯ）を示さなかった。
表２２は、ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ及びアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑの単球上のＲＯ ＩＣ５０の定量化を示す。
（表２２）
Figure 0007492522000028
表２３は、ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ及びアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑの好中球上のＲＯ ＩＣ５０の定量化を示す。
（表２３）
Figure 0007492522000029
ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ及びアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ（ＰＩ６４０６２）は、ヒト白血球からの用量依存的なサイトカインシグネチャーも誘導した。ＩＦＮ－γ誘導が図２８Ａに示され、ＩＬ－８誘導が図２８Ｂに示され、ＩＬ－２誘導が図２８Ｃに示され、ＩＰ－１０誘導が図２８Ｄに示される。ＩＬ－６、ＴＮＦα、及びＩＬ－１βを含む他のサイトカインは、１０ｐｇ／ｍｌ未満で検出された。各サイトカイン応答のＥＣ５０が、表２４に示される。
（表２４）
Figure 0007492522000030
実施例１１：Ｉｎ Ｖｉｖｏ抗ＴＲＥＭ１及び抗ＰＤ－１併用療法サイトカインプロファイル
Ｉｎ Ｖｉｖｏサイトカイン検出
対数期のＰｙ８１１９乳癌株（ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）を採取し、等量のマトリゲルと混合された２×１０６細胞／マウスの用量で、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右腹側腹部に皮下注射した。マウスの大多数の腫瘍が７０～１３０ｍｍ３に達した後、マウスを無作為割り当てし、示された抗体の投与を開始した。２用量に対し５日毎の頻度で、抗ＴＲＥＭ１及びｍＩｇＧ２ａアイソタイプに対して１５ｍｇ／ｋｇ、抗ＰＤ－１及びｍＩｇＧ１アイソタイプに対して５ｍｇ／ｋｇの抗体を腹腔内投与した。抗ＴＲＥＭ１及びｍＩｇＧ２ａアイソタイプは、両方ともアフコシル化されており、使用された抗ＴＲＥＭ１抗体は、ＰＩ－４９２８であった。
抗体の２回目の投与の４８時間後、マウスから血液を採取し、血清解析のために分画した。Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（マウス前炎症性パネル１）を使用して、各群由来のＩＦＮ－γ及びＴＮＦα血清サイトカインを評価した。Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ診断技術を使用してデータを取得し、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）及びＰｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ）で解析した。使用された統計的検定は、Ｔｕｋｅｙの多重比較補正を伴う通常の一元配置ＡＮＯＶＡであった。
ＰＩ－４９２８は、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４５６８０に以前に記載され、好中球（例えば、実施例１０を参照のこと）及びマウスＴＲＥＭ１を過剰発現する細胞（例えば、実施例１１を参照のこと）上のマウスＴＲＥＭ１に結合することが示された。アフコシル化ＰＩ－４９２８は、ＦｃγＲとも結合し、ＦｃγＲ媒介性シグナル伝達及びＡＤＣＣを誘導した（例えば、実施例１１を参照のこと）。さらに、抗ＰＤ－１と組み合わせたアフコシル化ＰＩ－４９２８の治療有効性もＰｙ８１１９マウスモデルで評価した。併用療法は、対照群と比較して腫瘍体積サイズの減少をもたらし（例えば、実施例１５を参照のこと）、これにより、ＴＲＥＭ１＋細胞のＡＤＣＣベースの枯渇が抗腫瘍活性をもたらし得ることが示される。
本実施例では、ＰＩ－４９２８は、マウスＴＲＥＭ１に結合するので、上述の抗体に対するｉｎ ｖｉｖｏ代用物として使用され、ｍＦｃγＲＩＶを過剰発現するＪｕｒｋａｔレポーター細胞においてＦｃγＲシグナル伝達も誘導し、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗がん治療効果を提供することが示されている。
結果
抗ＴＲＥＭ１抗体（アフコシル化ＰＩ－４９２８）及びＰＤ－１の組み合わせは、ｉｎ ｖｉｖｏでＩＦＮ－γ（図２９Ａ）及びＴＮＦα（図２９Ｂ）の両方のサイトカイン応答を誘導した。＊＊は、ｐ＜０．０１を示し、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１を示す。
実施例１２：Ｉｎ Ｖｉｖｏ抗ＴＲＥＭ１及び抗ＰＤ－１併用療法の有効性
Ｐａｎｃ０２有効性実験
対数期のＰａｎｃ０２膵管腺癌細胞株（ＮＣＩ細胞リポジトリー）を採取し、２×１０６細胞／マウスの用量で、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右脇腹に皮下注射した。マウスの大多数の腫瘍が８０～１００ｍｍ３に達した後、マウスを無作為割り当てし、示された抗体の投与を開始した。４用量に対し３または５日毎の頻度で、抗ＴＲＥＭ１及びｍＩｇＧ２ａアイソタイプに対して１５ｍｇ／ｋｇ、抗ＰＤ－１及びｍＩｇＧ１アイソタイプに対して１０ｍｇ／ｋｇの抗体を腹腔内投与した。抗ＴＲＥＭ１及びｍＩｇＧ２ａアイソタイプは、両方とも、アフコシル化されており、使用された抗ＴＲＥＭ１抗体は、ＰＩ－９０６７Ｌであった。式Ｖ（ｍｍ３）＝（Ｌ×Ｗ×Ｗ）÷２（式中、Ｖ＝体積、Ｌ＝長さ、及びＷ＝幅）を使用して、腫瘍サイズを評価した。ノギスを使用して、腫瘍を測定し、体積が２０００ｍｍ３に達した時、マウスを安楽死させた。
経時的に１群当たりの平均、経時的な１群当たりの個々のマウス、及び２８日目の１群当たり腫瘍体積として、腫瘍成長をプロットした。使用された統計的検定は、Ｈｏｌｍ－Ｓｉｄａｋ多重比較補正を伴う通常の一元配置ＡＮＯＶＡであった。
ＰＩ－９０６７Ｌは、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４５６８０に以前に記載され、好中球（例えば、実施例１０を参照のこと）及びマウスＴＲＥＭ１を過剰発現する細胞（例えば、実施例１１を参照のこと）上のマウスＴＲＥＭ１に結合することが示された。アフコシル化ＰＩ－９０６７Ｌは、ＦｃγＲとも結合し、ＦｃγＲ媒介性シグナル伝達及びＡＤＣＣを誘導した（例えば、実施例１１を参照のこと）。加えて、単独の、またはＭＣ３８及びＣＴ２６マウスモデルにおける抗ＰＤ－１と組み合わせたフコシル化及びアフコシル化ＰＩ－９０６７Ｌの治療有効性も評価した。ＰＩ－９０６７Ｌとの単剤療法または併用療法は、それぞれ、ＭＣ３８及びＣＴ２６モデルにおいて対照群と比較して、腫瘍体積サイズの減少をもたらした（例えば、実施例１３及び１４を参照のこと）。これにより、ＴＲＥＭ１＋細胞のＡＤＣＣベースの枯渇が抗腫瘍活性をもたらし得ることが示される。
本実施例では、ＰＩ－９０６７Ｌが、マウスＴＲＥＭ１に結合するので、上述の抗体に対するｉｎ ｖｉｖｏ代用物として使用され、ｍＦｃγＲＩＶを過剰発現するＪｕｒｋａｔレポーター細胞においてＦｃγＲシグナル伝達も誘導し、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗がん治療効果を提供することが示されている。
結果
加えて、抗ＴＲＥＭ１抗体療法は、Ｐａｎｃ０２腫瘍モデルにおいて単剤療法活性を有している。単独のアフコシル化ＰＩ－９０６７Ｌ抗ＴＲＥＭ１抗体の投与は、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍体積の減少をもたらし、抗ＰＤ１抗体との組み合わせも同様であった（図３０）。個々の処置群が、図３１Ａ～Ｄに示される。アイソタイプ処置が図３１Ａに示され、抗ＰＤ－１単独処置が図３１Ｂに示され、抗ＴＲＥＭ１処置が図３１Ｃに示され、抗ＴＲＥＭ１及び抗ＰＤ－１処置の組み合わせが３１Ｄに示される。２８日目の各処置群におけるマウス腫瘍体積の定量化が、図３２に提供される。
実施例１３：ＴＲＥＭ１は、種々の腫瘍適応症にわたって発現される
材料及び方法
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーにより、種々の適応症由来のヒト腫瘍の微小環境において、ＴＲＥＭ１発現を評価した。得られた腫瘍組織は、新たに外科的に切除した（Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｈｕｍａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ、ＣＨＴＮ）か、または以前に解離して急速凍結した（Ｆｏｌｉｏ Ｃｏｎｖｅｒｓａｎｔ）ものであった。患者から切除されてから２４時間以内に、新たに外科的に切除された腫瘍を解離した（Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）。
腫瘍を解離して赤血球を除去した時点で、単一細胞懸濁液をＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で希釈し、１回洗浄し、Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色して、細胞生存率を決定した。Ｆｃ受容体もまた、ヒト血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、ヒトＦｃＸ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、及びペプチドベースのＦｃＲブロック溶液（Ｉｎｎｏｖｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の組み合わせでブロックした。ＦｃＲブロッキング試薬とともにインキュベートした後、主要な腫瘍内免疫サブセットのマーカー及びｍＩｇＧ１アイソタイプまたはマウス抗ヒトＴＲＥＭ１抗体（クローンＴＲＥＭ２６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を含むフローサイトメトリーカクテルで、細胞上の表面受容体を染色した。一部の場合では、細胞内ＣＤ６８発現を決定するために、細胞をまた、固定して透過処理した（Ｔｒｕｅ－Ｎｕｃｌｅａｒ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。表現型解析に使用された全ての抗体は直接コンジュゲートされていた。Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ解析装置（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ）、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）、及びＲコンピューティング環境を使用して解析した。
ＬＵＮＧ＝肺腺癌、ＯＶ＝卵巣癌、ＫＩＤ＝腎細胞癌、ＰＲＡＤ＝前立腺腺癌、ＰＡＡＤ＝膵臓腺癌、ＢＬＡＤ＝膀胱腺癌、ＣＲＣ＝結腸直腸腺癌、ＢＲＥＡＳＴ＝乳癌、ＳＴＡＤ＝胃腺癌、ＳＫＣＭ＝皮膚黒色腫、ＨＮＳＣ＝頭頸部癌、ＴＡＭ＝腫瘍関連マクロファージ、Ｃｏｎｖ．単球＝従来の単球。
ＲＮＡ Ｉｎ Ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
ＲＮＡｓｃｏｐｅ実験が、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＡＣＤ）で実施された。Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＡＣＤ）により、膀胱癌、前立腺癌、黒色腫、頭頸部癌、膵臓癌、直腸癌、腎臓癌、肺癌、卵巣癌、及び乳癌由来の組織を含有する専用のＴＭＡのセットにおいて、ＴＲＥＭ１に対するＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）検出が実施された。ＰＰＩＢに対する陽性対照プローブ（ハウスキーピング遺伝子）及び細菌遺伝子ｄａｐＢに対する陰性対照プローブで切片を染色することによって、試料品質を評価した。陽性対照シグナルを最大化し、陰性対照シグナルを最小化するように、各プローブに対する染色条件を最適化した。ゲノムのオフターゲット領域への最小のクロスハイブリダイゼーションを有するように、ＡＣＤにより、ＴＲＥＭ１プローブ配列を選択した。製造者の使用説明書に従い、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＬＳ Ｄｕｐｌｅｘ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ニューアーク）を使用して、自動化プラットフォームで、ＴＲＥＭ１、ＴＲＥＭ２、ＣＤ１６３、ＣＤ８Ａ、及びＮＣＡＭ１ ｍＲＮＡのＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施した。５μｍのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片を、標的オリゴプローブとのハイブリダイゼーションの前に、熱及びプロテアーゼで前処理した。次に、プリアンプ、アンプ、及びＨＲＰ／ＡＰ標識オリゴをハイブリダイズさせ、それに続いて、発色性沈殿物を発生させた。各試料は、ＰＰＩＢ／ＰＯＬＲ２Ａ ＲＮＡに特異的なＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）プローブでＲＮＡの完全性について品質管理され、細菌ｄａｐＢＲＮＡに特異的なプローブでバックグラウンドについて品質管理された。特定のＲＮＡ染色シグナルが、緑／赤の点状のドットとして特定された。試料は、Ｇｉｌｌのヘマトキシリンで対比染色された。ヒトＴＲＥＭ１（カタログ番号４３１５０８、２４－１０６３ｎｔに対するもの）、ヒトＴＲＥＭ２（カタログ番号４２０４９８、５－１０６９ｎｔに対するもの）、ヒトＣＤ１６３（カタログ番号４１７０６８－Ｃ２、２１０－１５６５ｎｔに対するもの）、ヒトＮＣＡＭ－１（カタログ番号４２１４６８、８３２－１７５１ｎｔに対するもの）、及びヒトＣＤ８ａ（カタログ番号５６０３９８、８７１－２３４２ｎｔに対するもの）に対するＲＮＡプローブが使用された。各プローブの半定量的スコア（０～４）が、セクション全体の１細胞当たりの染色ドットの数に基づいて、ＡＣＤの科学者により全ての試料に対して定義された。スコアリング基準は、次の通りであった：スコア０：染色なしもしくは１ドット／１０細胞未満；スコア１：１～３ドット／細胞；スコア２：４～９ドット／細胞及びドットクラスターがないか非常に少ない；スコア３：１０～１５ドット／細胞及び／または１０％ドット未満がクラスター内にある；スコア４：１５ドット／細胞超及び／または１０％ドット超がクラスター内にある。品質管理に合格するために、ＴＲＥＭ１の定量化のために、２～４（中程度～高い）陽性対照シグナル及び０（検出されない）陰性対照シグナルを有する試料を選択した。ＴＲＥＭ１陽性適応症が、品質管理に合格し、１以上のＴＲＥＭ１スコアを有していたものと定義された。
単一細胞ＴＲＥＭ１発現
単一のヒト卵巣患者の解離腫瘍細胞（ＤＴＣ）を、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。細胞は、免疫細胞を富化するためにＣＤ４５陽性についてフローサイトメトリーで選別し、１０Ｘゲノミクスクロムコントローラを使用して、単一細胞ＲＮＡ配列決定のためにカプセル化した。１０ＸのＣｅｌｌＲａｎｇｅｒプログラム及びＲプログラミング言語のＳｅｕｒａｔモジュールを使用して、得られた生データを順次処理した。細胞型特異的マーカー遺伝子を使用して、得られたｔ分布型確率的近傍埋め込み法（ｔＳＮＥ）の次元削減の細胞集団に手作業で注釈を付け、ＴＲＥＭ１発現をプロットした。
単一のヒト肺腺癌患者由来の単一細胞配列決定データを、ＮＣＢＩの遺伝子発現オムニバス（アクセッション：ＧＳＥ９７１６８）からダウンロードした。Ｒプログラミング言語のＳｅｕｒａｔモジュールを使用して、生データを処理した。細胞型特異的マーカー遺伝子を使用して、得られたｔ分布型確率的近傍埋め込み法（ｔＳＮＥ）の次元削減の細胞集団に手動で注釈を付け、ＴＲＥＭ１発現をプロットした。
結果
ＴＲＥＭ１の発現は、肺腺癌、卵巣癌、腎細胞癌、前立腺腺癌、膀胱腺癌、結腸直腸腺癌、乳癌、及び胃腺癌を含む、様々ながんの適応症の腫瘍微小環境における骨髄細胞上にだけ見られた（図３３）。ＴＲＥＭ１発現は、好中球、ＴＡＭ、及び／または従来の単球上に一貫して発現し、ＣＤ３＋細胞上では陰性である。
表２５は、解析された全腫瘍のパーセンテージとしてＴＲＥＭ１＋腫瘍の定量化も提供する。ＴＲＥＭ１は、複数の腫瘍タイプにわたって解析された腫瘍の大部分において発現した。
（表２５）
Figure 0007492522000031
表２６に示される、ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析で、同様の結果が見られた。ほとんどの場合、ＴＲＥＭ１は、解析された腫瘍の７０％超で発現した（例えば、ＣＲＣ、ＯＶ、ＬＵ、ＨＮＳＣ、ＳＫＣＭ、ＰＡＡＤ、及びＰＲＡＤ腫瘍を参照のこと）。ＴＲＥＭ１は、また、解析された腎臓、膀胱、及び乳房腫瘍の約４０％で発現した。従って、ＴＲＥＭ１は、複数の腫瘍タイプで発現される。
（表２６）
Figure 0007492522000032
ヒト卵巣腫瘍解離細胞から選別されたＣＤ４５＋免疫浸潤からもたらされた単一細胞配列決定のさらなる解析は、ＴＲＥＭ１が主に単球骨髄由来抑制細胞（ｍＭＤＳＣ）、すなわち免疫抑制性である未成熟単球骨髄細胞で発現されることを示した（データは示さず）。対照的に、ＴＲＥＭ２は、主に、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）で発現される。肺腺癌患者由来の単一細胞配列決定結果の解析は、また、ＴＲＥＭ１がヒト抑制性骨髄性集団で発現されることを示した（データは示されず）。
実施例１４：抗ＴＲＥＭ１抗体は、抗がんケモカイン及び細胞表面受容体の選択的セットを誘導する
材料及び方法
試料調製
全血が、複数のヒトドナーから供給され（Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｒｅ）、赤血球を除去した。残りの白血球を、９６ウェルプレートに１ウェル当たり５×１０６の細胞でプレーティングした。プレーティングした後、細胞を、アフコシル化ｈＩｇＧ１アイソタイプ、またはアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ（ＰＩ６４０６２）とともに滴定依存的に２４時間インキュベートした。ＣＤ８０及びＣＤ８６細胞表面発現のために、単一濃度のアフコシル化ｈＩｇＧ１アイソタイプまたはアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ（ＰＩ６４０６２）で、追加の細胞を２４時間処置した。２４時間後、上清を採取した。
Ｉｎ Ｖｉｔｒｏサイトカイン及びケモカイン検出
サイトカイン及びケモカインの測定では、ヒト前炎症性及びケモカインキット（パネル１、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、各条件で試料を評価した。Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ診断技術を使用してデータを取得し、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）及びＰｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ）で解析した。Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ）でプロットされた滴定曲線に基づいて、ＥＣ５０値を計算し、ナノモル濃度に対して正規化した。
ＣＤ４０、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ８０、及びＣＤ８６フローサイトメトリー
２４時間後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色して、細胞生存率を決定した。ヒト血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、ヒトＦｃＸ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、及びペプチドベースのＦｃγＲブロック溶液（Ｉｎｎｏｖｅｘ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の組み合わせで、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）もブロックした。ＦｃγＲをブロッキング試薬とともにインキュベートした後、腫瘍内サブセットのマーカー、ならびにＨＬＡ－ＤＲ（クローンＬ２４３）、ＣＤ４０（クローン５Ｃ３）、ＣＤ８０（クローン２Ｄ１０、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３０６２１６）、及びＣＤ８６（クローンＢＵ６３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄカタログ番号３７４２１２）を含むフローサイトメトリーカクテルで、目的の表面受容体を染色した。フローサイトメトリーによる表現型解析に使用された全ての抗体は直接コンジュゲートされていた。Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ解析装置（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ）、及びＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を使用して解析した。ＣＤ１４＋単球上の細胞表面ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、及びＣＤ８６のための代表的なヒストグラムオーバーレイが示される。
細胞選別用のＲＮＡｓｅｑ
５人の健常なヒトドナー由来の全ヘパリン加血を、それぞれ、１ｍｇ／ｍｌ（約７ｎＭ）のアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ（ＰＩ６４０６２）またはアイソタイプ対照抗体で、３７℃、５％のＣＯ２で１６時間処置した。インキュベーション期間の後、血液を移し、その後の全てのステップを氷上で実施した。次に、血液を赤血球溶解し、白血球を系統特異的マーカーに対する抗体で染色した。抗ＣＤ１５（クローンＷ６Ｄ３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して、好中球を同定し、抗ＣＤ１４（クローンＭ５Ｅ２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して、単球を同定し、抗ＣＤ３（クローンＵＣＨＴ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して、Ｔ細胞を同定し、抗ＣＤ５６（クローン５．１Ｈ１１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して、ＮＫ細胞を同定した。染色された細胞をフローサイトメトリーソーティングに供し、ＣＤ１５＋好中球、ＣＤ１４＋単球、ＣＤ３＋Ｔ細胞、及びＣＤ５６＋ＮＫ細胞の純粋な集団が得られる。全ＲＮＡを各細胞サブセット特異的試料から単離し、ハイスループットＲＮＡ配列決定に供した。後続データを、ヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８．ｐ１２）にアラインさせ、遺伝子毎の発現値を各試料について作表した。ＲパッケージＤＥＳｅｑ２を使用して、得られた発現マトリックスを対数正規化し、ユークリッド距離及び最遠隣法を使用して、全ての試料にわたって最高分散の１０００の遺伝子をクラスタリングした。最初の細胞選別の純度は、細胞型の完全な分離、及びドナー特異的分離により示される。各細胞型の標準的なマーカーが右側に示される。
免疫活性化マーカーＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、及びＣＤ８６のＲＮＡｓｅｑ
５人の健常なヒトドナー由来の全ヘパリン加血を、それぞれ、１ｍｇ／ｍｌ（約７ｎＭ）のアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ（ＰＩ６４０６２）またはアイソタイプ対照抗体で、３７℃、５％のＣＯ２で１６時間処置した。インキュベーション期間の後、血液を移し、その後の全てのステップを氷上で実施した。次に、血液を赤血球溶解し、白血球を系統特異的マーカーに対する抗体で染色し、フローサイトメトリーソーティングに供して、ＣＤ１５＋好中球、ＣＤ１４＋単球、ＣＤ３＋Ｔ細胞、及びＣＤ５６＋ＮＫ細胞の純粋な集団が得られた。全ＲＮＡを各細胞サブセット特異的試料から単離し、ハイスループットＲＮＡ配列決定に供した。後続データを、ヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８．ｐ１２）にアラインさせ、遺伝子毎の発現値を各試料について作表した。得られた発現マトリックスは、単球プロファイル及び正規化された百万当たりの数に低減した。ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、及びＣＤ８６の得られた発現値を、全ての単球由来試料にわたってプロットした。活性化マーカーは、単球のみで特異的に発現され、差次的に制御された。
結果
アフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでケモカイン及びサイトカインの選択的なセットを誘導した。図３４Ａは、アイソタイプ抗体処置と比較した、ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑでの処置後の示されたケモカインまたはサイトカインの相対的な変化倍率を提供する。図３４Ａに示されるサイトカインが１０ｐｇ／ｍｌ超で検出され、複数のドナーの実験全体で上方制御された。
加えて、アフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑで細胞を処置すると、従来の単球上でのＨＬＡ－ＤＲ表面発現（図３４Ｂ）及びＣＤ４０表面発現（図３４）の用量依存的増加がもたらされた。ＨＬＡ－ＤＲ及びＣＤ４０は、抗原提示において重要な役割を果たす抗原提示細胞に見られる共刺激タンパク質である。アフコシル化ＰＩ－４０２６－５Ｍ１００Ｑは、抗原提示及びリンパ球の活性化にとって重要である細胞表面分子を上方制御し、リンパ球の活性化及び動員をもたらすサイトカインも上方制御する。これらの結果は、ＴＲＥＭ１抗体が、抑制性骨髄細胞を抗腫瘍前炎症性表現型にリプログラムまたは活性化し得ることを示唆する。
これらの結果を確認するために、アフコシル化ＰＩ－４０２６－Ｍ１００Ｑまたはアイソタイプ対照で処置した後の細胞に誘導された免疫シグナル伝達遺伝子及び経路をＲＮＡｓｅｑにより調査した。最初に、抗ＴＲＥＭ１抗体またはアイソタイプ対照で処置された細胞にＲＮＡｓｅｑを実施し、各試料の遺伝子発現をクラスタリングした。図３５に示されるように、標準的な遺伝子発現とよく相関するＲＮＡｓｅｑデータに基づくＴ細胞、ＮＫ細胞、単球、及び好中球のクラスタリングは、それぞれ、細胞集団を示した。従って、抗体処置に関わらず、ＲＮＡｓｅｑデータを使用して、免疫細胞を正確にクラスタリングすることができる。
次に、特定の免疫細胞活性化マーカーの抗ＴＲＥＭ１抗体誘導が、ＲＮＡｓｅｑを使用して確認された。ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、及びＣＤ８６の発現を、ＲＮＡｓｅｑで決定した。ＣＤ８０及びＣＤ８６は、抗原提示細胞に見られる追加の共刺激タンパク質である。図３６Ａは、アイソタイプ抗体処置（ＩＳＯ）または抗ＴＲＥＭ１抗体（アフコシル化ＰＩ６４０６２）処置後の示された細胞型におけるＨＬＡ－ＤＲ遺伝子発現を示す。図３６Ｂは、アイソタイプ抗体処置（ＩＳＯ）または抗ＴＲＥＭ１抗体（アフコシル化ＰＩ６４０６２）処置後の示された細胞型におけるＣＤ４０遺伝子発現を示す。図３６Ｃは、アイソタイプ抗体処理（ＩＳＯ）または抗ＴＲＥＭ１抗体（アフコシル化ＰＩ６４０６２）処置後の示された細胞型におけるＣＤ８０遺伝子発現を示す。図３６Ｄは、アイソタイプ抗体処理（ＩＳＯ）または抗ＴＲＥＭ１抗体（アフコシル化ＰＩ６４０６２）処置後の示された細胞型におけるＣＤ８６遺伝子発現を示す。さらに、表面発現ＣＤ８０及びＣＤ８６、ならびに反復試料としてのＨＬＡ－ＤＲ及びＣＤ４０のフローサイトメトリー解析で、ＲＮＡ解析を確認した。ＣＤ１４＋単球上の細胞表面ＨＬＡ－ＤＲ（図３７Ａ）、ＣＤ４０（図３７Ｂ）、ＣＤ８０（図３７Ｃ）、及びＣＤ８６（図３７Ｄ）の代表的なヒストグラムオーバーレイが示され、ＲＮＡ解析で示された抗ＴＲＥＭ１誘導パターンと一致する。重要なことに、ＲＮＡｓｅｑ試料において抗ＴＲＥＭ１抗体処置により誘導された細胞表面マーカーは、フローサイトメトリーで最初に同定されたＨＬＡ－ＤＲ及びＣＤ４０発現と一致した。
単球、好中球、ＮＫ細胞、及びＴ細胞においてＴＲＥＭ１抗体処置により誘導される遺伝子発現のさらなる変化もＲＮＡｓｅｑにより評価した。好中球、単球、ＮＫ細胞、及びＴ細胞におけるＴＲＥＭ１抗体処置により、ＩＦＮ応答、ＴＮＦαシグナル伝達、及び炎症性応答と関連する遺伝子を誘導した。ＴＲＥＭ１抗体は、主に、好中球、単球、及びＮＫ細胞において、遺伝子発現の変化を誘導した。
表２７は、種々の細胞型のＴＲＥＭ１抗体により誘導された免疫経路の概要を提供する。
（表２７）
Figure 0007492522000033
実施例１５：抗ＴＲＥＭ１抗体は、前炎症性応答を誘導する
材料及び方法
タンパク質リン酸化の定量化
ホスホ－フロー解析に使用される細胞を、健常なヒトドナー由来の全血軟膜から得た。ＢＤ Ｐｈａｒｍ Ｌｙｓｅ緩衝液中、３７Ｃで、２ラウンド、それぞれ１５分間インキュベートすることにより、軟膜を赤血球溶解させた。赤血球溶解後に、Ｘ－ＶＩＶＯ １５培地中の得られた白血球を、５×１０６白血球／ウェルで、９６マルチウェルディープウェルプレートにプレーティングした。細胞を３７℃、５％のＣＯ２で２時間回復させて、基礎リン酸化レベルを減少させた。回復期間後、細胞を、陽性対照としてのＰＭＡ（０．１μｇ／ｍｌ）及びイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）で、または、５μｇ／ｍｌのアフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑもしくはアフコシル化ｈＩｇＧ１アイソタイプで、０、２、１０、３０、６０、及び９０分間刺激した。次に、予熱されたＢＤ ＣｙｔｏＦｉｘ緩衝液を使用して、細胞を３７℃で１０分間固定した。固定後、試料をＦＡＣＳ緩衝液（２％のＦＢＳ、２ｍＭのＥＤＴＡを含むＤＰＢＳ）で２回洗浄し、１００μｌ／試料のＢＤ Ｐｅｒｍ緩衝液ＩＩＩで透過処理した。次に、試料をＦＡＣＳ緩衝液ですすぎ、５０μｌのＩｎｎｏｖｅｘ及びヒトＴｒｕｅＳｔａｉｎ ＦＣＸブロックで氷上で３０分間ブロックし、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞ペレットを、白血球系統マーカーに対する抗体のカクテル中に再懸濁し、ホスホ－タンパク質染色のために２つの試料に分けた。抗ホスホ－ＥＲＫ１／２（Ｙ２０２／Ｙ２０４）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローン４Ｂ１１Ｂ６９）及び抗ホスホ－ＳＴＡＴ３（Ｓ７２７）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＡ１６０８９Ｂ）を使用した。試料を、抗ホスホ抗体を含む抗体カクテルとともに、室温で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、試料を、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、次に、２％のパラホルムアルデヒドとともにインキュベートすることによって、氷上で１０分間固定した。試料をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、Ａｔｔｕｎｅフローサイトメーターで取得するまで４℃で保存した。
細胞経路の誘導
ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４５６８０の実施例１４に記載されるように、ＭＣ３８腫瘍を有するマウス（１群当たりｎ＝１０）をアフコシル化ＰＩ－９０６７ＬまたはｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照で処置した。移植後１９日目（２回目の処置の４８時間後）に腫瘍を採取した。ＲＮＡが抽出し、配列決定した。ＭＳｉｇＤＢ由来の遺伝子セットのｃ５コレクションを使用したＢｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）ツールを使用して、抗体処置と関連する差次的に誘導された経路を評価した。デフォルトのパラメーターを使用したＣｙｔｏｓｃａｐｅのエンリッチメントマップモジュールを使用して、著しく上方制御された経路（ＦＤＲ＜０．１）を可視化した。
ＲＮＡｓｅｑの検証
５人の健常なヒトドナー由来の全ヘパリン加血を、それぞれ、１ｍｇ／ｍｌ（約７ｎｍ）のＰＹ１５９及びアイソタイプ対照抗体で５％のＣＯ２、３７℃で１６時間処置した。インキュベーション期間の後、血液を移し、その後の全てのステップを氷上で実施した。次に、血液を赤血球溶解し、白血球を系統特異的マーカーに対する抗体で染色し、フローサイトメトリーソーティングに供して、ＣＤ１５＋好中球、ＣＤ１４＋単球、ＣＤ３＋Ｔ細胞、及びＣＤ５６＋ＮＫ細胞の純粋な集団が得られた。全ＲＮＡを各細胞サブセット特異的試料から単離し、ハイスループットＲＮＡ配列決定に供した。後続データを、ヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８．ｐ１２）にアラインさせ、遺伝子毎の発現値を各試料について作表した。ＲパッケージＤＥＳｅｑ２を使用して、各細胞型に対して、ＰＹ１５９及び対照処理試料間の正規化及びその後の差次的発現を実施した。各細胞サブセットの得られたデータを、変化倍率により順序付け、遺伝子をコードするタンパク質のみを含むようにサブセッティングし、遺伝子セットエンリッチメント解析ソフトウェア（ｖ４．０．０）（Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手可能）に渡した。Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの遺伝子オントロジーコレクション（ＭｓｉｇＤＢ ｃ５）に対するデフォルト設定を使用して、事前にランク付けされた解析を実行した。
結果
ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑは、単球及び好中球においてＥＲＫ及びＳＴＡＴ３のリン酸化を誘導したが、Ｔ細胞では誘導しなかった（図３８Ａ）。ＴＲＥＭ１抗体のみが、好中球または単球においてＥＲＫのリン酸化を誘導し、ＥＲＫのリン酸化は、ｈＩｇＧ１処置細胞において観察されなかった。ＴＲＥＭ１抗体は、ｈＩｇＧ１処置と比較して、好中球及び単球で高レベルのリン酸化ＳＴＡＴ３を誘導した。図３８ＡのＳＴＡＴ３パネルでは、ＴＲＥＭ１試料が右側のバーとして示され、ｈＩｇＧ１処置試料が左側のバーで示される。
図３８Ｂ（＊＜０．０５、＊＊＜０．００１）は、ＥＲＫ及びＳＴＡＴ経路のＲＮＡｓｅｑ解析の結果を示し、これは、単球におけるそれらの経路と関連する遺伝子が大幅に濃縮されているが、好中球またはＮＫ細胞ではそうではないことを示す。
マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）としても既知のＥＲＫの活性化により、ＮＦ－κＢ活性化及び前炎症性応答の発現がもたらされる。ＳＴＡＴ３は、ＪＡＫファミリーのシグナル伝達タンパク質で活性化され、ＮＦ－κＢと相互作用する転写因子である。ＳＴＡＴ３の活性化は、また、前炎症性応答をもたらす。それ故、ＴＲＥＭ１抗体処置後のＥＲＫ及びＳＴＡＴ３のリン酸化は、アフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ抗体のアゴニスト活性のさらなる証拠を提供し、抗体を用いる処置が、ＴＲＥＭ１を架橋し得、ＴＲＥＭ１及びそのアダプタータンパク質ＤＡＰ１２の下流でシグナル伝達を誘導したことが実証される。このシグナル伝達は、ＴＲＥＭ１＋骨髄細胞を前炎症性細胞にリプログラミングする役割を果たす可能性がある。
マウス及びヒトにおけるＴＲＥＭ１抗体処置により誘発された前炎症性応答も解析した。マウスにおけるＴＲＥＭ１抗体処置は、免疫応答、カルシウムイオン輸送、組織リモデリング、代謝、及びＲＮＡプロセッシングと関連する経路の上方制御をもたらした。免疫経路ファミリーは、抗原プロセッシング及び提示、Ｔ細胞受容体シグナル伝達経路、ＴＮＦ応答、ＴＮＦスーパーファミリーサイトカイン産生、ＮＦ－κＢシグナル伝達、ＩＦＮγ産生、ＩＬ－６産生の制御、Ｔ細胞増殖、適応免疫応答、リンパ球媒介性免疫、細胞接着、ケモカイン活性、ケモカイン受容体結合、細胞の走化性、リンパ球遊走、ならびにＥＲＫ１及びＥＲＫ２カスケードを含む。さらに、マウスＰｙ８１１９モデルにおける抗ＴＲＥＭ１抗体を用いる処置は、また、自然免疫応答、細胞活性化及び付着、ならびに走性または運動などの免疫応答（データは示さず）と関連する経路の上方制御を示した。
図３９は、ヒト血液分析物分析においてＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑにより誘導されたケモカイン及びサイトカインと比較した、マウスＭＣ３８腫瘍モデルにおいて上方制御された遺伝子のグラフを示す。ｉｎ ｖｉｖｏでのマウス血液データ及びｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト血液データの療法では、抗ＴＲＥＭ１抗体を用いる処置は、前炎症性Ｔ細胞ベースの応答と関連する分子の上方制御をもたらした。
表２８は、ＴＲＥＭ１抗体により種々の細胞集団に誘導された特定のサイトカイン及びケモカインの概要（タンパク質アッセイ及びＲＮＡｓｅｑの両方で測定）を提供する。
（表２８）
Figure 0007492522000034
従って、ＴＲＥＭ１抗体（アフコシル化ＰＩ－４０２６－５－Ｍ１００Ｑ）は、腫瘍破壊に関連するＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｍ１様マクロファージに複数の抗腫瘍免疫機構を誘導した。単球では、ＴＲＥＭ１抗体処置は、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ３、ＣＣＬ１３、ＩＬ－６、ＣＳＦ－１、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８６、及びＣＤ８０の誘導をもたらす。ＮＫ細胞では、ＴＲＥＭ１抗体処置は、ＩＦＮ－γ、ＣＣＬ３、ＣＣｌ４、ＣＣｌ１７、４－１ＢＢ、ＣＲＴＡＭ、及びＣＤ６９の誘導をもたらす。好中球では、ＴＲＥＭ１抗体処置は、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１３、ＣＸＣＬ８、及びＰＤ－Ｌ１の誘導をもたらす。ＴＲＥＭ１抗体の誘導因子、それらの因子の機能、及び細胞源の要約表が表２９に示される。
（表２９）
Figure 0007492522000035
実施例１６：卵巣モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏの抗ＴＲＥＭ１の治療有効性
ｉｎ ｖｉｖｏでの使用のための抗体を全て、エンドトキシンについて試験し、０．２ＥＵ／ｍｇ以下のタンパク質を使用した。抗ＰＤ－１（クローンＲＭＰ１－１４）をＡｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎｃから購入するか、または、ＰｉｏｎｙｒのマウスＩｇＧ１ Ｄ２６５Ａフォーマットとして組み換え産生した。マウスＩｇＧ１（クローンＭＯＰＣ－２１）及びマウスＩｇＧ２ａ（クローンＣ１．１８．４）アイソタイプ対照を、ＢｉｏＸＣｅｌｌから購入するか、または、ＰｉｏｎｙｒのＨＥＫ２９３細胞で組み換え産生した。抗ＴＲＥＭ１抗体のキメラマウスＩｇＧ２ａバージョン（ＰＩ－９０６７Ｌ）を、ＰｉｏｎｙｒのＨＥＫ２９３細胞で産生し、ＳＥＣ及びＣＥ－ＳＤＳならびにエンドトキシン試験で単分散及び純度について評価した。
生きている動物を含む全ての実験手順は、ＡＪＥＳ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣのｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓにより承認された。６～８週齢の雌Ｂ６（Ｃｇ）－Ｔｙｒｃ－２Ｊ／ＪまたはＢ６－ａｌｂｉｎｏマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ研究室から購入し、動物施設に１週間順化させた後に使用した。液体窒素ストックから解凍した後、ＩＤ８－Ｌｕｃ（ＡＪＥＳ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣ、ニューヨーク州ストーニーブルック）として既知のホタルルシフェラーゼを過剰発現するマウスの卵巣表面上皮細胞を３～７継代培養中に採取し、ｉｎ－ｖｉｖｏ実験に使用した。腫瘍接種当日、細胞を採取し、４５分以内に使用した。腹腔内腫瘍を確立するために、５×１０６のＩＤ８－Ｌｕｃ細胞を、右下腹壁に注射した。研究への採用のための注射の２０日後に、全てのマウスを、ｉｎ－ｖｉｖｏルシフェラーゼ活性についてイメージングした。腫瘍量の代用物として平均発光読み値に基づいて、４０匹の担腫瘍動物を研究に採用した。各群の平均腫瘍放射輝度（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）が、４．７×１０４になるように、４つの処置群に、１０匹の動物をランダムに割り当てた。担腫瘍動物の腹腔内を、示された抗体で５日毎に処置し、発光画像を毎週取り込んだ。マウスに、１５ｍｇ／ｍＬのＤ－ルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ）０．２ｍＬを腹腔内注射した。Ｄ－ルシフェリン注射の１０分後、電荷結合素子カメラ（ＩＶＩＳ、Ｘｅｎｏｇｅｎ、カリフォルニア州アラメダ）が装着された機器で、マウスをイメージングした。データを、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ）で解析し、腹膜を覆う目的の領域に対する腫瘍放射輝度（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）として提示した。
本実施例では、マウスＴＲＥＭ１に結合し、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４５６８０でｉｎ ｖｉｖｏでの抗がん治療効果を提供することが示されていることから、ＰＩ－９０６７Ｌを、上述の抗体のｉｎ ｖｉｖｏ代用物として使用した。
図４０に示されるように、抗ＴＲＥＭ１抗体処置は、同所性ＩＤ８卵巣腫瘍モデルにおいて単剤療法及び併用療法の有効性を有した。抗ＴＲＥＭ１抗体のみで処置されたマウスは、アイソタイプ対照処置マウスと比較して腫瘍発光の減少により示されるように、腫瘍量の減少を有した。対照抗ＰＤ－１抗体処置は、また、腫瘍量の減少をもたらし、抗ＴＲＥＭ１及び抗ＰＤ－１抗体の組み合わせは、抗ＴＲＥＭ１または抗ＰＤ－１抗体処置単独と比較して腫瘍量のより大きな低減をもたらした。
全てのｉｎ ｖｉｖｏ有効性研究を要約すれば、抗ＴＲＥＭ１抗体は、ＭＣ３８結腸癌モデルにおける単剤療法の有効性（対照と比較して約４４％の腫瘍成長阻害をもたらした）、Ｐａｎｃ０２膵臓モデルにおける単剤療法の有効性（対照と比較して約４３％の腫瘍成長阻害をもたらした）、及びＩＤ８卵巣癌モデルにおける単剤療法の有効性（対照と比較して約４４％の腫瘍成長阻害をもたらした）を有していた。抗ＴＲＥＭ１抗体は、ＣＴＣ２６結腸癌モデルにおける抗ＰＤ－１抗体との併用有効性（対照と比較して約４０～４５％の腫瘍成長阻害及び２０～４０％の治癒率をもたらした）、Ｐａｎｃ０２モデルにおける抗ＰＤ－１抗体との併用有効性（対照と比較して約５６％の腫瘍成長阻害をもたらした）、ＩＤ８卵巣モデルにおける抗ＰＤ－１抗体との併用有効性（対照と比較して約６２％の腫瘍成長阻害及び２０％の治癒率をもたらした）、ならびにＰｙ８１１９乳癌株における抗ＰＤ－１抗体との併用有効性（対照と比較して約４６％の腫瘍成長阻害をもたらした）を有していた。
実施例１７：抗ＴＲＥＭ１処置は、長期の抗腫瘍免疫記憶をもたらす
ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４５６８０の実施例１３に記載の抗ＴＲＥＭ１アフコルシル化ＰＩ－９０６７Ｌ抗体及び抗ＰＤ－１抗体処置後の以前のＣＴ２６腫瘍モデル試験の腫瘍不含のＢＡＬＢ／ｃマウスを、１×１０６のＣＴ２６腫瘍細胞で３ヶ月再負荷した。腫瘍体積を、移植後２５日間測定した。同齢の処置ナイーブマウスに、同等数のＣＴ２６細胞を投与し、試験期間中に腫瘍の成長について追跡した。試験期間中、マウスに追加の処置を提供しなかった。
抗ＴＲＥＭ１アフコルシル化ＰＩ－９０６７Ｌ及び抗ＰＤ－１ ｍＡｂの組み合わせを用いた処置後にＣＴ２６腫瘍が治癒したマウスは、効果的な抗腫瘍記憶応答を確立した（図４１）。治癒したマウスは、追加の治療がなくても、新しい腫瘍の成長を拒絶することができ、これは、元の移植された腫瘍に対する長期的な免疫記憶を示す。この形態の長期免疫記憶は、活発なＣＤ８＋エフェクター記憶応答の維持を利用し得る。
実施例１８：ＴＲＥＭ１は、種々のがんで発現し、患者の生存率と逆相関する
レベル２、ｆｉｒｅｈｏｓｅ＿ｇｅｔを使用して、大腸癌試料のＴｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ ＡｔｌａｓのコホートのＲＮＡｓｅｑデータを、Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅからダウンロードした。腫瘍（ｎ＝２８２）及び隣接する正常試料（ｎ＝４１）の両方由来のＴＲＥＭ１に対するＲＳＥＭ値を、ｌｏｇ２（百万当たりの数）に変換し、Ｒでプロットした（図４２Ａ）。５６６の大腸腫瘍にわたる事前正規化されたＴＲＥＭ１発現プロファイル及び関連臨床データは、ＮＣＢＩのＧＥＯ Ｗｅｂサイト（アクセッションＧＳＥ３９５８２）からダウンロードした。発現プロファイルを、ＴＲＥＭ１の中央値レベルに基づいて２つのコホートに分けた。Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存曲線を、各コホートについてプロットし、Ｒの生存及びｓｕｒｖｍｉｎｅｒパッケージを使用して、関連するログランク検定を実行した（図４２Ｂ）。
ＴＲＥＭ１は、大腸癌で高度に発現される（図４２Ａ）。加えて、大腸癌におけるＴＲＥＭ１発現レベルは、患者の生存確率と逆相関し、例えば、ＴＲＥＭ１発現が高い患者は、ＴＲＥＭ１発現が低い患者と比較して、より低い長期生存確率を有していた（ｐ＝０．００８１）（図４２Ｂ）。ＴＲＥＭ１発現及び患者の生存率の逆相関は、乳癌及び膵臓がんの患者でも観察された（データは示さず）。高いＴＲＥＭ１ｍＲＮＡ発現は、ＮＳＣＬＣ、ＨＮＳＣＣ、卵巣癌、胃癌、及び膀胱癌でも観察された（データは示さず）。
実施例１９：ｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態研究
材料及び方法
雌ＣＤ－１マウスに、０．１、１、１０、及び１００ｍｇ／ｋｇの漸増用量のアフコシル化ＰＩ－４９２８抗ＴＲＥＭ１抗体を静脈内投与した。血漿を、投与の０．２５、１、２、２４、７２、１６８、及び３３６時間に収集した。ＰＩ－４９２８抗体及び可溶性マウスＴＲＥＭ１の血漿濃度を、以下に記載されるように決定した。本実施例では、ＰＩ－４９２８が、マウスＴＲＥＭ１に結合し、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗がん治療効果を提供することが示されているので、上述の抗体をｉｎ ｖｉｖｏ代用物として使用された。
ＰＩ－４９２８マウスＰＫアッセイは、リガンド結合アッセイ（ＬＢＡ）である。９６ウェル高結合ＭＳＤプレートを、Ｆｃタグ付き組み換えマウスＴＲＥＭ１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ番号１１８７－ＴＲ）でコーティングした。ブロッキング後、ＴＲＥＭ１タンパク質を結合させたプレートに試料を加えた。スルホタグ付き抗マウスＩｇＧ２ａ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ番号１１５－０３５－２０６）を使用して、アフコシル化ＰＩ－４９２８抗体の存在を検出した。ＥＣＬシグナルは、プレートがＭＳＤプレートリーダーから電気シグナルを受信した後、二次抗体により生成された。ＥＣＬ信号を、プレートリーダーにより検出及び定量した。
ＰＫ ＭＳＤアッセイは、３００ｎｇ／ｍＬ～０．４１ｎｇ／ｍＬのダイナミックレンジで優れた感度を示す。１：２０の最小必要希釈率（ＭＲＤ）が使用される場合、このアッセイのＬＬＯＱは、８．２ｎｇ／ｍＬであり、ＵＬＯＱは、６０００ｎｇ／ｍＬである。このアッセイは、ＢＡＬＢ／ｃ Ｋ２ＥＤＴＡ血漿においてアフコシル化ＰＩ－４９２８抗体を検出するのに適切である。
ＭＳＤプラットフォームで開発されたサンドイッチイムノアッセイを介して、マウス可溶性ＴＲＥＭ１（ｍｓＴＲＥＭ１）を定量した。ビオチン化ヤギ抗ｍＴＲＥＭ１ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ番号ＡＦ１１８７）を捕捉剤として使用し、プレコートストレプトアビジンプレートに結合させた。洗浄後、ｍＴＲＥＭ１タンパク質を含有する試料をプレートに加えた。ｍＴＲＥＭ１（社内で開発された抗体）に対するスルホタグ付きｍＩｇＧ２ａ抗体で、結合ＴＲＥＭ１タンパク質を検出した。
ＭＳＤ ｓＴＲＥＭ１アッセイは、１０ｎｇ／ｍＬ～１４ｐｇ／ｍＬのダイナミックレンジを有する。このアッセイのＬＬＯＱ及びＬＯＤは、それぞれ、１４ｐｇ／ｍＬ及び１ｐｇ／ｍＬである。このｓＴＲＥＭ１アッセイは、ＢａｌＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、及びＣＤ１株由来の血漿試料中の循環ＴＲＥＭ１タンパク質を検出することができる。加えて、このアッセイは、抗ＴＲＥＭ１抗体ＰＩ－４９２８の存在下でｓＴＲＥＭ１タンパク質を検出する。
血球数も７日目及び１４日目に決定した。血液をＫ２ＥＤＴＡチューブに収集し、Ｈｅｓｋａ要素ＨＴ５で解析して、差次的白血球数及び赤血球パラメーターを決定した。
結果
アフコシル化ＰＩ－４９２８抗体は、マウスにおいて用量依存的薬物動態を有していた（図４３Ａ）。図４３Ｂに示されるように、抗ＴＲＥＭ１抗体による処置は、血漿中に可溶性マウスＴＲＥＭ１タンパク質の用量依存的蓄積をもたらし、ＰＩ－４９２８抗体もまた可溶性マウスＴＲＥＭ１タンパク質を安定化したことが示された。
加えて、アフコルシル化ＰＩ－４９２８の投与は、７日目及び１４日目に試験された好中球、単球、好酸球、もしくは好塩基球のマウス血球数（図４４Ａ及び４４Ｂ）または血清要素（図４４Ｃ及び４４Ｄ）にいかなる有意な変化を引き起こさなかった。ヘモグロビン（ＨＧＢ）、ヘマトクリット（ＨＣＴ）、平均細胞体積（ＭＣＶ）、平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、及び赤血球分布（ＲＤＷ－ＣＶ）を含む赤血球パラメーターを測定した。
実施例２０：乳癌モデルにおけるｉｎ Ｖｉｖｏ抗ＴＲＥＭ１療法の有効性
材料及び方法
約８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスをＴａｃｏｎｉｃから入手した。マウス乳腺腫瘍細胞株ＥＭＴ６（ＣＲＬ－２７５５）をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、ガイドラインに従って培養した。低継代の細胞を無血清培地中の１×１０７細胞／ｍｌで再懸濁した。腫瘍細胞懸濁液を、ＢＡＬＢ／ｃマウスの剃毛された右腹側腹部に皮下注射した。腫瘍体積成長を、垂直腫瘍直径の測定で監視し、式（ｍｍ３）＝０．５ｘ（長さ）×（幅）２を使用して計算した。薬物処置のために、マウスに、マウス抗マウスアイソタイプ対照ＩｇＧ２ａ（１５ｍｇ／ｋｇのクローンＣ１．１８．４）、抗マウスアイソタイプ対照ＩｇＧ１（１５ｍｇ／ｋｇのクローンＭＯＰＣ－２１）、抗マウスＰＤ－１（５ｍｇ／ｋｇのＰｉｏｎｙｒ Ｐｉ－０００４－ＡＢ）、抗マウスＴＲＥＭ１（１５ｍｇ／ｋｇのクローンＰｉ－９０６７Ｌ）、または抗ＴＲＥＭ１抗体及び抗ＰＤ－１抗体の組み合わせを腹腔内投与した。抗ＰＤ－１（クローンＲＭＰ１－１４）を、ＢｉｏＸＣｅｌｌ（Ｗｅｓｔ Ｌｅｂａｎｏｎ、米国ニューハンプシャー州）から購入するか、または、マウスＩｇＧ１ Ｄ２６５Ａフォーマットとして組み換え技術で生成した。群の平均腫瘍体積が６２ｍｍ３の平均値（図４５Ａ）または／及び１７３ｍｍ３の平均値（図４５Ｂ）であった場合、処置を開始した。縦線は、抗体を腹腔内投与した日を示す。プロトコールＡＵＰ０６０６で、Ｅｘｐｌｏｒａ Ｂｉｏｌａｂｓ施設内動物管理及び使用委員会に従って、全ての試験を実施した。ＵＳＤＡ実験動物福祉法に準拠した実験動物管理及び使用に関するＮＩＨガイドに概説される条件下で、マウスを飼育した。動物を実験食の齧歯動物固形飼料及び水に自由に摂取させた。安楽死を必要とし得る臨床的異常について、研究者または獣医スタッフが、マウスを少なくとも週に２回監視した。ベースライン体重測定と比較して２０％を超える正味の体重減少を示すマウスを安楽死させた。
結果
図４４Ａ及び４４Ｂは、皮下ＥＭＴ６担腫瘍雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗ＴＲＥＭ１、抗ＰＤ－１、または抗ＴＲＥＭ１及び抗ＰＤ－１処置の組み合わせの抗腫瘍有効性を示す。図４４Ａは、６２ｍｍ３の「小さな」腫瘍を有するマウスの処置中の腫瘍体積を示す。図４４Ｂは、１７３ｍｍ３の「大きな」腫瘍を有するマウスの処置中の腫瘍体積を示す。小さな腫瘍では、単独の、または抗ＰＤ－１抗体と組み合わせた抗ＴＲＥＭ１抗体処置は、抗腫瘍有効性を示した。抗ＴＲＥＭ１抗体処置は、４７％の腫瘍成長阻害をもたらし、抗ＰＤ－１抗体処置は、６５％の腫瘍成長阻害及び２つの完全退縮をもたらし、抗ＴＲＥＭ１抗体及び抗ＰＤ－１抗体処置の組み合わせは、９１％の腫瘍成長阻害及び３つの完全退縮をもたらした（図４４Ａ）。大きな腫瘍において、抗ＴＲＥＭ１抗体処置は、１つの完全寛解をもたらし、抗ＰＤ－１抗体処置は、１０％の腫瘍成長阻害をもたらし、抗ＴＲＥＭ１抗体及び抗ＰＤ－１抗体処置の組み合わせは、７５％の腫瘍成長阻害をもたらした（図４４Ａ）。従って、抗ＴＲＥＭ１抗体は、単剤療法及び併用療法の両方の有効性を示す。
本明細書の本文内で引用される全ての参考文献、発行された特許、及び特許出願は、あらゆる目的のために、本明細書で全体が参照により組み込まれる。
本発明は特に、好ましい実施形態及び種々の代替実施形態に関して示され、記載されているが、形態及び詳細の種々の変更が、本明細書では、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく行うことができることを、当業者らは理解するであろう。
配列表
Figure 0007492522000036
Figure 0007492522000037
Figure 0007492522000038
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Claims (30)

  1. ヒトＴＲＥＭ１（配列番号１）に結合する単離抗体であって、３つの重鎖ＣＤＲ配列、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含む重鎖、ならびに３つの軽鎖ＣＤＲ配列、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含む軽鎖を含み、
    ａ．ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号２３に記載の配列を含み、
    ｂ．ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号２４に記載の配列を含み、
    ｃ．ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号３３に記載の配列を含み、
    ｄ．ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号２６に記載の配列を含み、
    ｅ．ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号２７に記載の配列を含み、
    ｆ．ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号２８に記載の配列を含む、
    前記単離抗体。
  2. 前記ＶＨ鎖配列が、配列番号１７に記載のＶＨ配列を含み、前記ＶＬ鎖配列が、配列番号２０に記載のＶＬ配列を含む、請求項１に記載の単離抗体。
  3. 前記ＶＨ鎖配列が、配列番号１６、１７、または１８に記載の配列から選択されるＶＨ配列を含み、前記ＶＬ鎖配列が、配列番号２０、２１、または２２に記載の配列から選択されるＶＬ配列を含む、請求項１に記載の単離抗体。
  4. 配列番号３４に記載の重鎖配列及び配列番号３５に記載の軽鎖配列を含む、請求項１に記載の単離抗体。
  5. 前記ＶＨ鎖配列が、配列番号１７に記載のＶＨ配列からなり、前記ＶＬ鎖配列が、配列番号２０に記載のＶＬ配列からなる、請求項１に記載の単離抗体。
  6. 前記ＶＨ鎖配列が、配列番号１６、１７、または１８に記載の配列から選択されるＶＨ配列からなり、前記ＶＬ鎖配列が、配列番号２０、２１、または２２に記載の配列から選択されるＶＬ配列からなる、請求項１に記載の単離抗体。
  7. 配列番号３４に記載の重鎖配列及び配列番号３５に記載の軽鎖配列からなる、請求項１に記載の単離抗体。
  8. 前記抗体が、アフコシル化されており、前記ＶＨ鎖配列が、配列番号１７に記載のＶＨ配列を含み、前記ＶＬ鎖配列が、配列番号２０に記載のＶＬ配列を含む、請求項１に記載の単離抗体。
  9. 前記抗体が、アフコシル化されており、前記ＶＨ鎖配列が、配列番号１６、１７、または１８に記載の配列から選択されるＶＨ配列を含み、前記ＶＬ鎖配列が、配列番号２０、２１、または２２に記載の配列から選択されるＶＬ配列を含む、請求項１に記載の単離抗体。
  10. アフコシル化されており、配列番号３４に記載の重鎖配列及び配列番号３５に記載の軽鎖配列を含む、請求項１に記載の単離抗体。
  11. 前記抗体が、アフコシル化されており、前記ＶＨ鎖配列が、配列番号１７に記載のＶＨ配列からなり、前記ＶＬ鎖配列が、配列番号２０に記載のＶＬ配列を含む、請求項１に記載の単離抗体。
  12. 前記抗体が、アフコシル化されており、前記ＶＨ鎖配列が、配列番号１６、１７、または１８に記載の配列から選択されるＶＨ配列からなり、前記ＶＬ鎖配列が、配列番号２０、２１、または２２に記載の配列から選択されるＶＬ配列を含む、請求項１に記載の単離抗体。
  13. アフコシル化されており、配列番号３４に記載の重鎖配列及び配列番号３５に記載の軽鎖配列からなる、請求項１に記載の単離抗体。
  14. アフコシル化されている、請求項１に記載の単離抗体。
  15. ヒトＦｃを含む、請求項１に記載の単離抗体。
  16. 前記ヒトＦｃが、野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃである、請求項１５に記載の単離抗体。
  17. 前記抗体が、アフコシル化されており、かつ野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃを含み、前記ＶＨ鎖配列が、配列番号１７に記載のＶＨ配列を含み、前記ＶＬ鎖配列が、配列番号２０に記載のＶＬ配列を含む、請求項１に記載の単離抗体。
  18. 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイで測定した際に、約０．５、１、２、３、４、５、６、または７×１０－９Ｍまたはそれ以下のＫＤでヒトＴＲＥＭ１に結合する、請求項１に記載の単離抗体。
  19. ヒト化されている、請求項１に記載の単離抗体。
  20. 宿主細胞から請求項１に記載の抗体を発現させること、及び発現された抗体を単離することを含む、抗体の製造方法。
  21. 請求項１に記載の抗体及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
  22. 請求項１に記載の抗体及び使用説明書を含む、キット。
  23. ヒトＴＲＥＭ１（配列番号１）に結合する単離抗体であって、３つの重鎖ＣＤＲ配列、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含む重鎖、ならびに３つの軽鎖ＣＤＲ配列、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含む軽鎖を含み、
    ａ．ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号２３に記載の配列を含み、
    ｂ．ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号２４に記載の配列を含み、
    ｃ．ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号３２に記載の配列を含み、
    ｄ．ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号２６に記載の配列を含み、
    ｅ．ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号２７に記載の配列を含み、
    ｆ．ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号２８に記載の配列を含む、
    前記単離抗体。
  24. 前記ＶＨ鎖配列が、配列番号１３に記載のＶＨ配列を含み、前記ＶＬ鎖配列が、配列番号２０に記載のＶＬ配列を含む、請求項２３に記載の単離抗体。
  25. 配列番号３６に記載の重鎖配列及び配列番号３７に記載の軽鎖配列を含む、請求項２３に記載の単離抗体。
  26. 請求項２３に記載の抗体及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
  27. 対象のがんを処置するための医薬組成物であって、ヒトＴＲＥＭ１（配列番号１）への結合について参照抗体と競合し、３つの重鎖ＣＤＲ配列、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含む重鎖、ならびに、３つの軽鎖ＣＤＲ配列、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含む軽鎖を含む、抗体を含み、
    ａ．ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号２３に記載の配列を含み、
    ｂ．ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号２４に記載の配列を含み、
    ｃ．ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号３３に記載の配列を含み、
    ｄ．ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号２６に記載の配列を含み、
    ｅ．ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号２７に記載の配列を含み、
    ｆ．ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号２８に記載の配列を含む、
    前記医薬組成物。
  28. 免疫療法薬の前に、同時に、及び／または後に対象に投与されるための、請求項２７に記載の医薬組成物であって、前記免疫療法薬が、チェックポイント阻害薬；Ｔ細胞のチェックポイント阻害薬；抗ＰＤ１抗体；抗ＰＤＬ１抗体；抗ＣＴＬＡ４抗体；養子Ｔ細胞療法；ＣＡＲ－Ｔ細胞療法；樹状細胞ワクチン；単球ワクチン；Ｔ細胞及び抗原提示細胞の両方に結合する抗原結合タンパク質；ＢｉＴＥ二重抗原結合タンパク質；Ｔｏｌｌ様受容体リガンド；サイトカイン；細胞傷害療法；化学療法；放射線療法；小分子阻害薬；小分子アゴニスト；免疫調節薬；ならびにエピジェネティック調節薬のうちの少なくとも１つである、医薬組成物。
  29. 前記免疫療法薬が、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、または抗ＣＴＬＡ４抗体である、請求項２８に記載の医薬組成物。
  30. 対象の免疫応答を増加させるための医薬組成物であって、ヒトＴＲＥＭ１（配列番号１）への結合について参照抗体と競合し、３つの重鎖ＣＤＲ配列、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、及びＣＤＲ－Ｈ３を含む可変重（ＶＨ）鎖配列を含む重鎖、ならびに、３つの軽鎖ＣＤＲ配列、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３を含む可変軽（ＶＬ）鎖配列を含む軽鎖を含む、抗体を含み、
    ａ．ＣＤＲ－Ｈ１が、配列番号２３に記載の配列を含み、
    ｂ．ＣＤＲ－Ｈ２が、配列番号２４に記載の配列を含み、
    ｃ．ＣＤＲ－Ｈ３が、配列番号３３に記載の配列を含み、
    ｄ．ＣＤＲ－Ｌ１が、配列番号２６に記載の配列を含み、
    ｅ．ＣＤＲ－Ｌ２が、配列番号２７に記載の配列を含み、
    ｆ．ＣＤＲ－Ｌ３が、配列番号２８に記載の配列を含む、
    前記医薬組成物。
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