JP2023509604A - 設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）で官能化されたナノ粒子を使用した免疫エフェクタ細胞へのインビトロおよびインビボ遺伝子送達 - Google Patents

設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）で官能化されたナノ粒子を使用した免疫エフェクタ細胞へのインビトロおよびインビボ遺伝子送達 Download PDF

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ジェシカ ハートマン，
クリスチャン ブーフホルツ，
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アルネ マーティン ビルマイアー，
ウグル サヒン，
ハンス－ウルリッヒ シュモルト，
フィリップ ヘラー，
ボニー ギャビー ルイ，
アンネ シュレーゲル，
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Abstract

Figure 2023509604000001
本開示は、一般に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの抗原受容体を発現するように操作されたＴ細胞などの免疫エフェクタ細胞を含む療法に関する。本明細書では、そのような抗原受容体操作免疫エフェクタ細胞は、遺伝子改変のための抗原受容体をコードする核酸を、この核酸と免疫エフェクタ細胞を標的化するための標的化分子とを含む粒子を使用して細胞に送達することによって、インビトロ／エクスビボならびにインビトロで生成され得、標的化分子は設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）であることが実証される。特に、ＣＤ８がヒトおよび非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）細胞上のＣＤ８受容体に結合するための高親和性結合剤であるＤＡＲＰｉｎが本明細書に記載されている。ＣＤ８標的化ＤＡＲＰｉｎ（ＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎ）で官能化されたナノ粒子は、インビトロおよびインビボでヒトＣＤ８＋Ｔ細胞に排他的かつ特異的に遺伝子を送達することができる。

Description

本開示は、一般に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの抗原受容体を発現するように操作されたＴ細胞などの免疫エフェクタ細胞を含む療法に関する。一実施形態では、免疫エフェクタ細胞は、抗原受容体を発現するように遺伝子改変される。そのような遺伝子改変は、エクスビボまたはインビトロで行われ、その後免疫エフェクタ細胞が治療を必要とする対象に投与され得るか、または治療を必要とする対象においてインビボで行われ得る。これらの方法は、特に、抗原受容体が向けられる抗原を発現する疾患細胞を特徴とする癌の治療に有用である。本明細書では、そのような抗原受容体操作免疫エフェクタ細胞は、遺伝子改変のための抗原受容体をコードする核酸を、この核酸と免疫エフェクタ細胞を標的化するための標的化分子とを含む粒子を使用して細胞に送達することによって、インビトロ／エクスビボならびにインビトロで生成され得、標的化分子は設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）であることが実証される。特に、ＣＤ８がヒトおよび非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）細胞上のＣＤ８受容体に結合するための高親和性結合剤であるＤＡＲＰｉｎが本明細書に記載されている。ＣＤ８標的化ＤＡＲＰｉｎ（ＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎ）で官能化されたナノ粒子は、インビトロおよびインビボでヒトＣＤ８＋Ｔ細胞に排他的かつ特異的に遺伝子を送達することができる。抗原受容体操作免疫エフェクタ細胞は、抗原受容体操作免疫エフェクタ細胞を投与することによって、または対象において抗原受容体操作免疫エフェクタ細胞を生成することによって、対象に提供され得る。一実施形態では、抗原受容体操作免疫エフェクタ細胞は、治療される対象において生成される。さらに、抗原受容体に対する標的抗原は、抗原受容体によって標的化される抗原、抗原をコードするポリヌクレオチド、または抗原を発現する細胞を対象に投与することによって対象に提供され得る。抗原受容体が標的とする抗原は、天然に存在する抗原もしくはそのバリアント、または天然に存在する抗原もしくはそのバリアントの断片を含み得る。特に好ましい一実施形態では、抗原をコードするポリヌクレオチドはＲＮＡである。本明細書に記載される方法および薬剤は、特に、抗原受容体または抗原受容体操作免疫エフェクタ細胞が向けられる抗原を発現する疾患細胞を特徴とする疾患の治療に有用である。
免疫系は、病原体関連疾患だけでなく癌、自己免疫、アレルギーにおいても重要な役割を果たす。Ｔ細胞およびＮＫ細胞は、抗腫瘍免疫応答の重要なメディエータである。ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞は、腫瘍細胞を直接溶解することができる。一方、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む様々な免疫サブセットの腫瘍への流入を媒介することができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、樹状細胞（ＤＣ）が抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞応答をプライミングするのを許可することができ、ＩＦＮγを介したＭＨＣの上方制御と増殖阻害によって腫瘍細胞に直接作用することができる。ＣＤ８＋およびＣＤ４＋腫瘍特異的Ｔ細胞応答は、Ｔ細胞のワクチン接種または養子移入によって誘導することができる。
養子細胞移入（ＡＣＴ）に基づく免疫療法は、低い前駆体頻度から臨床的に適切な細胞数までエクスビボで拡大させた後に非免疫レシピエントまたは自己宿主に移入される、以前に感作されたＴ細胞による受動免疫の形態として広く定義することができる。ＡＣＴ実験に使用されてきた細胞型は、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞（Ｍｕｌｅ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２５，１４８７－１４８９；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１３，１４８５－１４９２）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８６，１１５９－１１６６）、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）後のドナーリンパ球および腫瘍特異的Ｔ細胞株またはクローン（Ｄｕｄｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２４，３６３－３７３；Ｙｅｅ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ９９，１６１６８－１６１７３）である。代替的なアプローチは、短時間のエクスビボ培養中に定義された特異性の腫瘍反応性免疫受容体を発現するように再プログラム化された自己Ｔ細胞の養子移入とそれに続く患者への再注入である（Ｋｅｒｓｈａｗ Ｍ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ １３（８）：５２５－４１）この戦略は、腫瘍反応性Ｔ細胞が患者に存在しない場合でも、ＡＣＴを様々な一般的悪性疾患に適用可能にする。例えば、キメラ抗原受容体修飾Ｔ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）の養子移入が、世界中の広範な数の臨床試験において検討されている（図１、左側）。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外抗原結合部分、最も一般的にはモノクローナル抗体からの一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に融合した細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインからなる抗原標的受容体の一種である。ＣＡＲは、ＭＨＣ媒介提示とは無関係に、細胞表面抗原を直接認識し、全ての患者において所与の抗原に特異的な単一の受容体構築物の使用を可能にする。一般に、ＣＡＲは、抗原認識ドメインをＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体のＣＤ３ζ活性化鎖に融合し、ＣＤ３ζと並行して、ＣＤ２８または４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）およびＯＸ４０（ＣＤ１３４）などの様々なＴＮＦ受容体ファミリー分子からの細胞内ドメインを含む二次共刺激シグナルを含む。ＣＡＲは抗腫瘍効果を劇的に改善し、特に血液悪性腫瘍に罹患している患者において顕著な臨床的有効性を示した（Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．９，１１８３－１１９７（２０１７））。最近、２つのＣＡＲ－Ｔ細胞療法が、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｋｙｍｒｉａｈ（登録商標））および、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（Ｙｅｓｃａｒｔａ（登録商標））の治療についてＦＤＡおよびＥＭＡによって承認された（Ｚｈｅｎｇ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ ６，１１７５－１１８２（２０１８））。しかしながら、固形腫瘍の場合、Ｔ細胞の養子移入は、これまでのところ限られた有効性を示しており、改善を必要とする（Ｎｅｗｉｃｋ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．６８，１３９－１５２（２０１７））。
最近、受容体標的レンチウイルスベクター（ＬＶ）は、インビボで特定の種類のリンパ球への選択的遺伝子導入を可能にすることが示された。ＬＶは、所望の標的細胞上の受容体に対する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）によって偽型化され、エンベロープタンパク質の別の成分は、結合時に標的細胞との膜融合を媒介する。この技術は、ＣＡＲ Ｔ細胞の生成を単一のインビボ形質導入プロセスに減少させる。残念なことに、そのようなＬＶの産生は、依然として面倒で費用集約的なプロセスであるが、アフェレーシスおよび患者自身のＴ細胞のエクスビボでの取り扱いを回避することができる。別の戦略は、ＬＶ機能を模倣することができる脂質またはポリマーに基づく人工送達システム（非ウイルスベクター）を作製することである（図１、右側）。そのようなナノ粒子（ＮＰ）は、受容体特異的結合を媒介するために、その表面への標的化リガンドの提示／付着によって官能化される必要がある。標的化リガンドは、親抗体、例えばｓｃＦｖに由来し得る。ＬＶとは対照的に、標的化リガンドのその受容体への結合は、ＮＰ取り込みを可能にするために受容体媒介エンドサイトーシスおよび輸送を誘導する必要がある。実際に、受容体標的ＬＶは、エンドソーム輸送および溶解を回避するためにエンドサイトーシスを媒介しないように設計される。一方、エンドソームからの脱出の可能性を有する、いわゆるポリプレックス（ＰＬＸ、図２の上のパネル）または脂質ＮＰ（ＬＮＰ、図２の下のパネル）と呼ばれるＮＰバリアント（主にポリマーまたは脂質ベース）が存在する。レトロウイルスベクターを完全に模倣し、したがってＮＰ媒介遺伝子送達を介したゲノム操作を可能にするために、カーゴは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のような（もしくは関連する）遺伝子編集ツール、またはスリーピングビューティもしくはピギーバッグのようなトランスポゾンシステムからなる必要がある。それにもかかわらず、ｍＲＮＡの送達もまた、ＣＡＲまたはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のような治療用受容体の一過性発現を誘導するための選択肢である。実際に、最初の試験は、最近、ＮＰがインビボでＣＡＲ Ｔ細胞を生成できることを示すことができた。やはり、このプロセスの初期効率は非常に低く、循環Ｂ細胞が少量のインビボで生成されたＣＡＲ Ｔ細胞を刺激および拡大する標的細胞を提示する限り、ＣＤ１９のみを標的とすることができる。また最近、本発明者らは、ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボ拡大を誘導するためのプロフェッショナル抗原提示細胞上でのＣＡＲ抗原のインビボ提示のためのｍＲＮＡのナノ粒子媒介送達に基づくＣＡＲワクチン概念（ＣＡＲＶａｃ）を開発した（図３）。この技術は、ＣＡＲ Ｔ細胞による非血液腫瘍の効率的な治療を可能にするだけでなく、ＣＡＲＶａｃが低いＣＡＲ Ｔ細胞数を治療的に十分なレベルまで拡大することができるので、ＣＡＲ Ｔ細胞のインビボ生成の低い効率という障害も克服するであろう。さらに、概念全体をＴＣＲのような他の免疫受容体に移すことができる。
まとめると、このアプローチは、患者自身のＴ細胞の遺伝子操作の新しい方法を容易にし、将来的に個別化医療から既製の治療へと概念全体を移行させる可能性がある。
Ｍｕｌｅ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２５，１４８７－１４８９；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１３，１４８５－１４９２ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８６，１１５９－１１６６ Ｄｕｄｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２４，３６３－３７３ Ｙｅｅ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ９９，１６１６８－１６１７３ Ｋｅｒｓｈａｗ Ｍ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ １３（８）：５２５－４１ Ｈａｒｔｍａｎｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．９，１１８３－１１９７（２０１７） Ｚｈｅｎｇ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ ６，１１７５－１１８２（２０１８） Ｎｅｗｉｃｋ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．６８，１３９-１５２（２０１７）
その成功にもかかわらず、ＣＤ８特異的ｓｃＦｖ－ＬＶの全体的なインビボ形質導入効率はかなり低かった。したがって、免疫エフェクタ細胞への遺伝子送達、特にインビボでの免疫エフェクタ細胞への遺伝子送達を改善するための戦略が必要である。そのような遺伝子送達は、インビボＣＡＲ Ｔ細胞生成のさらなる開発に関して特に重要となる細胞傷害性Ｔ細胞標的化において有用であり得る。
本発明者らはここで、免疫エフェクタ細胞上の表面抗原を標的とするために設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）ベースの分子である新規高親和性結合剤を説明する。特に、ヒトおよび非ヒト霊長動物（ＮＨＰ）細胞のＣＤ８受容体に結合するように選択されたＤＡＲＰｉｎからなるＣＤ８に対する高親和性結合剤を説明する。これらの結合剤は、組換えヒトＣＤ８を使用したＤＡＲＰｉｎライブラリのリボソームディスプレイスクリーニング、続いて初代リンパ球に関する受容体結合分析によって同定された。次いで、様々なＮＰを、インビトロおよびインビボで遺伝子をヒトＣＤ８＋Ｔ細胞に排他的かつ特異的に送達するＣＤ８標的化ＤＡＲＰｉｎ（ＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎ）との様々なカップリング戦略によって官能化した。本明細書に記載される結合剤による免疫エフェクタ細胞の遺伝子改変のためのカーゴを担持する粒子の官能化は、免疫エフェクタ細胞へのカーゴの特異的送達および免疫エフェクタ細胞の改変をもたらす。
本発明は、一般に、腫瘍抗原などの抗原を発現する疾患細胞などの細胞を標的とすることによる疾患の治療を包含する。標的細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）による認識のために細胞表面上に、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）による認識のためにＭＨＣに関連して、抗原を発現し得る。本方法は、抗原を発現するそのような細胞の選択的根絶を提供し、それによって抗原を発現しない正常細胞への有害作用を最小限に抑える。抗原（またはそのプロセシング産物）への結合を介して細胞を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように遺伝子改変された免疫エフェクタ細胞は、遺伝子改変された免疫エフェクタ細胞の対象への投与または対象における遺伝子改変された免疫エフェクタ細胞の生成などによって、対象に提供される。遺伝子改変は、遺伝子改変のための抗原受容体をコードする核酸と、免疫エフェクタ細胞を標的化するための標的化分子とを含む粒子を使用して達成され、標的化分子は、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）である。粒子は、インビトロ／エクスビボならびにインビボで細胞に核酸を送達し得る。疾患関連抗原またはそのバリアントであり得るワクチン抗原（例えば疾患関連抗原のエピトープを含むペプチドまたはタンパク質）、それをコードする核酸、または抗原を発現する細胞を投与して、免疫エフェクタ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大のための抗原を提供し得る（任意で適切な標的細胞による核酸の発現後に）。患者において刺激、プライミングおよび／または拡大された免疫エフェクタ細胞は、抗原を発現する疾患細胞を認識し、根絶することができる。一実施形態では、免疫エフェクタ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。一実施形態では、本明細書に記載される標的化分子は、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ８受容体に結合する。一実施形態では、免疫エフェクタ細胞は、腫瘍または癌に対するものである。一実施形態では、標的細胞集団または標的組織は、特に固形腫瘍の、腫瘍細胞または腫瘍組織である。一実施形態では、標的抗原は腫瘍抗原である。
本明細書に記載される方法および薬剤は、特に、免疫エフェクタ細胞が向けられる抗原を発現する疾患細胞を特徴とする疾患の治療に有用である。一態様では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）による免疫エフェクタ細胞は、それぞれ抗原提示細胞および疾患細胞上に存在する場合、ワクチン抗原および疾患関連抗原に対する結合特異性を有する。一実施形態では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）による免疫エフェクタ細胞は、それぞれ抗原提示細胞および疾患細胞上に提示された場合、ワクチン抗原および疾患関連抗原のプロセシング産物に対する結合特異性を有する。ＣＡＲは、好ましくは抗体ベースの所望の抗原（例えば腫瘍抗原）に対する特異性とＴ細胞受容体活性化細胞内ドメインとを組み合わせて、特異的細胞性免疫活性（例えば、特異的抗腫瘍細胞性免疫活性）を示すキメラタンパク質を生成する分子である。好ましくは、細胞は、その表面に抗原受容体を安定に発現し、ＭＨＣ非依存性であり得る新規な抗原特異性を付与するように遺伝子改変され得る。一実施形態では、治療される対象または異なる対象のいずれかからの免疫エフェクタ細胞が、治療される対象に投与される。投与される免疫エフェクタ細胞は、投与前にエクスビボで遺伝子改変され得るか、または投与後に本に記載の抗原受容体を発現するように対象においてインビボで遺伝子改変され得る。一実施形態では、免疫エフェクタ細胞は、治療される対象において内因性であり（したがって、治療される対象に投与されない）、本明細書に記載の抗原受容体を発現するように対象においてインビボで遺伝子改変される。したがって、免疫エフェクタ細胞は、抗原受容体を発現するように、エクスビボまたはインビボで遺伝子改変され得る。したがって、抗原受容体を用いたそのような遺伝子改変は、インビトロで行われ、その後免疫エフェクタ細胞が治療を必要とする対象に投与され得るか、または治療を必要とする対象においてインビボで行われ得る。一態様では、本発明は、一般に、疾患細胞、特に腫瘍抗原を発現する癌細胞などの抗原を発現する細胞を標的とすることによる疾患の治療を包含する。標的細胞は、細胞表面に抗原を発現し得るか、または抗原のプロセシング産物を提示し得る。一実施形態では、抗原は腫瘍関連抗原であり、疾患は癌である。そのような治療は、抗原を発現する細胞の選択的根絶を提供し、それによって抗原を発現しない正常細胞への有害作用を最小限に抑える。一実施形態では、ワクチン抗原、それをコードするポリヌクレオチドまたはワクチン抗原を発現する細胞は、抗原受容体を発現するように遺伝子改変された免疫エフェクタ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大のための抗原を提供するために投与され（任意で適切な標的細胞によるポリヌクレオチドの発現後に）、免疫エフェクタ細胞は、抗原またはそのプロセシング産物を標的とし、免疫応答は、抗原を発現する標的細胞集団または標的組織に対する免疫応答である。一実施形態では、ワクチン抗原をコードするポリヌクレオチドはＲＮＡである。患者において刺激、プライミングおよび／または拡大されたＴ細胞などの免疫エフェクタ細胞は、抗原を発現する細胞を認識することができ、疾患細胞の根絶をもたらす。一実施形態では、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、二次リンパ器官を標的とする。
一態様では、本発明は、抗原受容体を発現するように遺伝子改変された免疫エフェクタ細胞を調製する方法であって、免疫エフェクタ細胞を、抗原受容体をコードする核酸と免疫エフェクタ細胞を標的化するための標的化分子とを含む粒子と接触させることを含み、標的化分子がアンキリンリピートタンパク質である、方法に関する。
一実施形態では、免疫エフェクタ細胞を粒子と接触させることが、核酸を免疫エフェクタ細胞に送達する。
一実施形態では、遺伝子改変される免疫エフェクタ細胞は、インビボまたはインビトロで存在する。一実施形態では、遺伝子改変される免疫エフェクタ細胞はインビボで存在する。一実施形態では、遺伝子改変される免疫エフェクタ細胞は対象中にインビボで存在し、方法は粒子を対象に投与することを含む。
さらなる態様では、本発明は、対象を治療するための方法であって、
（ｉ）抗原受容体を発現するように遺伝子改変されたインビトロ免疫エフェクタ細胞を調製する工程であって、免疫エフェクタ細胞を、抗原受容体をコードする核酸と免疫エフェクタ細胞を標的化するための標的化分子とを含む粒子と接触させることを含み、標的化分子がアンキリンリピートタンパク質である方法を使用する、工程、および
（ｉｉ）抗原受容体を発現するように遺伝子改変された免疫エフェクタ細胞を対象に投与する工程
を含む方法に関する。
一実施形態では、免疫エフェクタ細胞を粒子と接触させることが、核酸を免疫エフェクタ細胞に送達する。
さらなる態様では、本発明は、対象を治療するための方法であって、
抗原受容体をコードする核酸と、免疫エフェクタ細胞を標的化するための標的化分子とを含む粒子を対象に投与することを含み、標的化分子がアンキリンリピートタンパク質である、方法に関する。
一実施形態では、粒子は、対象の免疫エフェクタ細胞に核酸を送達する。
一実施形態では、核酸を免疫エフェクタ細胞に送達することにより、対象において抗原受容体を発現するように遺伝子改変された免疫エフェクタ細胞が生成される。
一実施形態では、本明細書に記載される方法は、対象において免疫応答を誘導する方法である。一実施形態では、免疫応答はＴ細胞媒介免疫応答である。一実施形態では、免疫応答は、抗原を発現する標的細胞集団または標的組織に対する免疫応答である。一実施形態では、標的細胞集団または標的組織は、癌細胞または癌組織である。一実施形態では、癌細胞または癌組織は固形癌である。
さらなる態様では、本発明は、抗原の発現または発現上昇に関連する疾患、障害または状態を有する対象を治療するための方法であって、
（ｉ）疾患、障害もしくは状態に関連する抗原または疾患、障害もしくは状態に関連する抗原を発現する細胞を標的化する抗原受容体を発現するように遺伝子改変されたインビトロ免疫エフェクタ細胞を調製する工程であって、免疫エフェクタ細胞を、抗原受容体をコードする核酸と免疫エフェクタ細胞を標的化するための標的化分子とを含む粒子と接触させることを含み、標的化分子がアンキリンリピートタンパク質である方法を使用する、工程、および
（ｉｉ）抗原受容体を発現するように遺伝子改変された免疫エフェクタ細胞を対象に投与する工程
を含む方法に関する。
一実施形態では、免疫エフェクタ細胞を粒子と接触させることが、核酸を免疫エフェクタ細胞に送達する。
さらなる態様では、本発明は、抗原の発現または発現上昇に関連する疾患、障害または状態を有する対象を治療するための方法であって、
疾患、障害もしくは状態に関連する抗原または疾患、障害もしくは状態に関連する抗原を発現する細胞を標的化する抗原受容体をコードする核酸と、免疫エフェクタ細胞を標的化するための標的化分子であって、アンキリンリピートタンパク質である標的化分子とを含む粒子を対象に投与すること
を含む方法に関する。
一実施形態では、粒子は、対象の免疫エフェクタ細胞に核酸を送達する。
一実施形態では、核酸を免疫エフェクタ細胞に送達することにより、対象において抗原受容体を発現するように遺伝子改変された免疫エフェクタ細胞が生成される。
一実施形態では、疾患、障害または状態は癌であり、疾患、障害または状態に関連する抗原は腫瘍抗原である。一実施形態では、疾患、障害または状態は固形癌である。
一実施形態では、本明細書に記載される方法は、対象における癌を治療または予防するための方法である。一実施形態では、癌は固形癌である。一実施形態では、癌は、抗原受容体によって標的化される腫瘍抗原の発現または発現上昇に関連する。
一実施形態では、本明細書に記載される方法は、抗原受容体によって標的化される抗原、抗原をコードするポリヌクレオチド、または抗原を発現するように遺伝子改変された宿主細胞を対象に投与することをさらに含む。一実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。一実施形態では、宿主細胞は、抗原をコードするポリヌクレオチドを含む。
本明細書に記載される全ての態様の一実施形態では、抗原受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である。
本明細書に記載される全ての態様の一実施形態では、核酸はＲＮＡである。
本明細書に記載される全ての態様の一実施形態では、核酸はＤＮＡである。
本明細書に記載される全ての態様の一実施形態では、遺伝子改変は一過性または安定である。
本明細書に記載される全ての態様の一実施形態では、遺伝子改変は、ウイルスベースの方法、トランスポゾンベースの方法、または遺伝子編集ベースの方法によって行われる。一実施形態では、遺伝子編集ベースの方法は、ＣＲＩＳＰＲに基づく遺伝子編集を含む。
本明細書に記載される全ての態様の一実施形態では、粒子は非ウイルス粒子である。本明細書に記載される全ての態様の一実施形態では、粒子は脂質ベースおよび／またはポリマーベースの粒子である。本明細書に記載される全ての態様の一実施形態では、粒子はナノ粒子である。
本明細書に記載される全ての態様の一実施形態では、粒子は、その表面上の標的化分子で官能化されている。本明細書に記載される全ての態様の一実施形態では、粒子は、標的化分子を少なくとも１つの粒子形成成分に連結することによって標的化分子で官能化される。
本明細書に記載される全ての態様の一実施形態では、免疫エフェクタ細胞はＴ細胞である。本明細書に記載される全ての態様の一実施形態では、免疫エフェクタ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。
本明細書に記載される全ての態様の一実施形態では、標的化分子はＣＤ８を標的とする。
本明細書に記載される全ての態様の一実施形態では、標的化分子は、反復コンセンサス配列：
ＮＸ１Ｘ２ＤＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＴＰＸ７ＨＬＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＨＸ１３Ｘ１４ＩＶＸ１５ＶＬＬＫＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＤＸ１９
を含む反復モジュールを含み、
ここで、
Ｘ１は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は任意のアミノ酸であり、
Ｘ３は任意のアミノ酸であり、
Ｘ４は任意のアミノ酸であり、
Ｘ５は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＧであり、
Ｘ６は任意のアミノ酸であり、
Ｘ７は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＬであり、
Ｘ８は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＡまたはＶであり、
Ｘ９は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＡであり、
Ｘ１０は任意のアミノ酸であり、
Ｘ１１は任意のアミノ酸であり、
Ｘ１２は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＧであり、
Ｘ１３は任意のアミノ酸、好ましくはＬであり、
Ｘ１４は、任意のアミノ酸、好ましくはＤ、Ｅ、Ｈ、ＫおよびＲからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＥであり、
Ｘ１５は、任意のアミノ酸、好ましくはＤまたはＥであり、
Ｘ１６は任意のアミノ酸であり、
Ｘ１７は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＡ、ＧおよびＳからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＧであり、
Ｘ１８は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＡであり、
Ｘ１９は、任意のアミノ酸、好ましくはＩ、ＬおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＶである。
本明細書に記載される全ての態様の一実施形態では、標的化分子は、反復コンセンサス配列：
ＮＸ１Ｘ２ＤＸ３Ｘ４ＧＸ６ＴＰＬＨＬＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＧＨＸ１３Ｘ１４ＩＶＸ１５ＶＬＬＫＸ１６ＧＡＤＶ
を含む反復モジュールを含み、
ここで、
Ｘ１は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は任意のアミノ酸であり、
Ｘ３は任意のアミノ酸であり、
Ｘ４は任意のアミノ酸であり、
Ｘ６は任意のアミノ酸であり、
Ｘ８はＡまたはＶであり、
Ｘ９は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＡであり、
Ｘ１０は任意のアミノ酸であり、
Ｘ１１は任意のアミノ酸であり、
Ｘ１３は任意のアミノ酸、好ましくはＬであり、
Ｘ１４は、任意のアミノ酸、好ましくはＤ、Ｅ、Ｈ、ＫおよびＲからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＥであり、
Ｘ１５は、任意のアミノ酸、好ましくはＤまたはＥであり、
Ｘ１６は任意のアミノ酸である。
本明細書に記載される全ての態様の一実施形態では、標的化分子は、反復コンセンサス配列：
ＮＸ１Ｘ２ＤＸ３Ｘ４ＧＸ６ＴＰＬＨＬＸ８ＡＸ１０Ｘ１１ＧＨＬＥＩＶＸ１５ＶＬＬＫＸ１６ＧＡＤＶ
を含む反復モジュールを含み、
ここで、
Ｘ１は、任意のアミノ酸、好ましくは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は任意のアミノ酸であり、
Ｘ３は任意のアミノ酸であり、
Ｘ４は任意のアミノ酸であり、
Ｘ６は任意のアミノ酸であり、
Ｘ８はＡまたはＶであり、
Ｘ１０は任意のアミノ酸であり、
Ｘ１１は任意のアミノ酸であり、
Ｘ１５はＤまたはＥであり、
Ｘ１６は任意のアミノ酸である。
本明細書に記載される全ての態様の一実施形態では、標的化分子は、それぞれが反復コンセンサス配列を含む、同一であっても異なっていてもよい少なくとも２つの反復モジュールを含む。
本明細書に記載される全ての態様の一実施形態では、標的化分子は、それぞれが反復コンセンサス配列を含む、同一であっても異なっていてもよい２～２０個の反復モジュールを含む。
本明細書に記載される全ての態様の一実施形態では、標的化分子は、それぞれが反復コンセンサス配列を含む、同一であっても異なっていてもよい３つの反復モジュールを含む。
本明細書に記載される全ての態様の一実施形態では、標的化分子は３つの反復モジュールを含み、ここで、
標的化分子の第１の反復モジュールは、コンセンサス配列：
ＮＡＸ２ＤＸ３Ｘ４ＧＸ６ＴＰＬＨＬＸ８ＡＷＨＧＨＬＥＩＶＸ１５ＶＬＬＫＸ１６ＧＡＤＶ、
を含み、
標的化分子の第２の反復モジュールは、コンセンサス配列：
ＮＡＸ２ＤＸ３Ｘ４ＧＸ６ＴＰＬＨＬＡＡＸ１０Ｘ１１ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ１６ＧＡＤＶ、
を含み、および
標的化分子の第３の反復モジュールは、コンセンサス配列：
ＮＸ１Ｘ２ＤＸ３Ｘ４ＧＸ６ＴＰＬＨＬＡＡＸ１０Ｘ１１ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ１６ＧＡＤＶ、
を含み、
ここで、
Ｘ１は、任意のアミノ酸、好ましくは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は任意のアミノ酸であり、
Ｘ３は任意のアミノ酸であり、
Ｘ４は任意のアミノ酸であり、
Ｘ６は任意のアミノ酸であり、
Ｘ８はＡまたはＶであり、
Ｘ１０は任意のアミノ酸であり、
Ｘ１１は任意のアミノ酸であり、
Ｘ１５はＤまたはＥであり、
Ｘ１６は、任意のアミノ酸、好ましくはＹ、ＨおよびＮからなる群より選択されるアミノ酸である。
本明細書に記載される全ての態様の一実施形態では、標的化分子は、それぞれが図５に示される配列番号１～２８の反復モジュール１、２および３の群から選択される配列を含む少なくとも１つの反復モジュールを含む。
本明細書に記載される全ての態様の一実施形態では、標的化分子は３つの反復モジュールを含み、ここで、反復モジュール１は、図５に示される配列番号１～２８の反復モジュール１の群から選択され、反復モジュール２は、図５に示される配列番号１～２８の反復モジュール２の群から選択され、反復モジュール３は、図５に示される配列番号１～２８の反復モジュール３の群から選択される。
本明細書に記載される全ての態様の一実施形態では、標的化分子は３つの反復モジュールを含み、ここで、反復モジュール１、反復モジュール２および反復モジュール３は、図５に示される配列番号１～２８からなる群より選択される配列の反復モジュール１、反復モジュール２および反復モジュール３である。
本明細書に記載される全ての態様の一実施形態では、反復モジュールは反復ドメインに存在する。
本明細書に記載される全ての態様の一実施形態では、反復ドメインは、Ｎ末端および／またはＣ末端キャッピングモジュールをさらに含む。
本明細書に記載される全ての態様の一実施形態では、標的化分子は、配列番号１～２８、またはその２９～１２７位からなる群より選択される配列を含む。
さらなる態様では、本発明は、免疫エフェクタ細胞を標的とするアンキリンリピートタンパク質を含む分子に関する。
一実施形態では、免疫エフェクタ細胞はＴ細胞である。一実施形態では、免疫エフェクタ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。
一実施形態では、分子はＣＤ８を標的とする。
一実施形態では、アンキリンリピートタンパク質は、反復コンセンサス配列：
ＮＸ１Ｘ２ＤＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＴＰＸ７ＨＬＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＨＸ１３Ｘ１４ＩＶＸ１５ＶＬＬＫＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＤＸ１９
を含む反復モジュールを含み、
ここで、
Ｘ１は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は任意のアミノ酸であり、
Ｘ３は任意のアミノ酸であり、
Ｘ４は任意のアミノ酸であり、
Ｘ５は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＧであり、
Ｘ６は任意のアミノ酸であり、
Ｘ７は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＬであり、
Ｘ８は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＡまたはＶであり、
Ｘ９は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＡであり、
Ｘ１０は任意のアミノ酸であり、
Ｘ１１は任意のアミノ酸であり、
Ｘ１２は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＧであり、
Ｘ１３は任意のアミノ酸、好ましくはＬであり、
Ｘ１４は、任意のアミノ酸、好ましくはＤ、Ｅ、Ｈ、ＫおよびＲからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＥであり、
Ｘ１５は、任意のアミノ酸、好ましくはＤまたはＥであり、
Ｘ１６は任意のアミノ酸であり、
Ｘ１７は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＡ、ＧおよびＳからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＧであり、
Ｘ１８は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＡであり、
Ｘ１９は、任意のアミノ酸、好ましくはＩ、ＬおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＶである。
一実施形態では、アンキリンリピートタンパク質は、反復コンセンサス配列：
ＮＸ１Ｘ２ＤＸ３Ｘ４ＧＸ６ＴＰＬＨＬＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＧＨＸ１３Ｘ１４ＩＶＸ１５ＶＬＬＫＸ１６ＧＡＤＶ
を含む反復モジュールを含み、
ここで、
Ｘ１は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は任意のアミノ酸であり、
Ｘ３は任意のアミノ酸であり、
Ｘ４は任意のアミノ酸であり、
Ｘ６は任意のアミノ酸であり、
Ｘ８はＡまたはＶであり、
Ｘ９は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＡであり、
Ｘ１０は任意のアミノ酸であり、
Ｘ１１は任意のアミノ酸であり、
Ｘ１３は任意のアミノ酸、好ましくはＬであり、
Ｘ１４は、任意のアミノ酸、好ましくはＤ、Ｅ、Ｈ、ＫおよびＲからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＥであり、
Ｘ１５は、任意のアミノ酸、好ましくはＤまたはＥであり、
Ｘ１６は任意のアミノ酸である。
一実施形態では、アンキリンリピートタンパク質は、反復コンセンサス配列：
ＮＸ１Ｘ２ＤＸ３Ｘ４ＧＸ６ＴＰＬＨＬＸ８ＡＸ１０Ｘ１１ＧＨＬＥＩＶＸ１５ＶＬＬＫＸ１６ＧＡＤＶ
を含む反復モジュールを含み、
ここで、
Ｘ１は、任意のアミノ酸、好ましくは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は任意のアミノ酸であり、
Ｘ３は任意のアミノ酸であり、
Ｘ４は任意のアミノ酸であり、
Ｘ６は任意のアミノ酸であり、
Ｘ８はＡまたはＶであり、
Ｘ１０は任意のアミノ酸であり、
Ｘ１１は任意のアミノ酸であり、
Ｘ１５はＤまたはＥであり、
Ｘ１６は任意のアミノ酸である。
一実施形態では、アンキリンリピートタンパク質は、それぞれが反復コンセンサス配列を含む、同一であっても異なっていてもよい少なくとも２つの反復モジュールを含む。
一実施形態では、アンキリンリピートタンパク質は、それぞれが反復コンセンサス配列を含む、同一であっても異なっていてもよい２～２０個の反復モジュールを含む。
一実施形態では、アンキリンリピートタンパク質は、それぞれが反復コンセンサス配列を含む、同一であっても異なっていてもよい３つの反復モジュールを含む。
一実施形態では、アンキリンリピートタンパク質は３つの反復モジュールを含み、ここで、
標的化分子の第１の反復モジュールは、コンセンサス配列：
ＮＡＸ２ＤＸ３Ｘ４ＧＸ６ＴＰＬＨＬＸ８ＡＷＨＧＨＬＥＩＶＸ１５ＶＬＬＫＸ１６ＧＡＤＶ、
を含み、
標的化分子の第２の反復モジュールは、コンセンサス配列：
ＮＡＸ２ＤＸ３Ｘ４ＧＸ６ＴＰＬＨＬＡＡＸ１０Ｘ１１ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ１６ＧＡＤＶ、
を含み、および
標的化分子の第３の反復モジュールは、コンセンサス配列：
ＮＸ１Ｘ２ＤＸ３Ｘ４ＧＸ６ＴＰＬＨＬＡＡＸ１０Ｘ１１ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ１６ＧＡＤＶ、
を含み、
ここで、
Ｘ１は、任意のアミノ酸、好ましくは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり、
Ｘ２は任意のアミノ酸であり、
Ｘ３は任意のアミノ酸であり、
Ｘ４は任意のアミノ酸であり、
Ｘ６は任意のアミノ酸であり、
Ｘ８はＡまたはＶであり、
Ｘ１０は任意のアミノ酸であり、
Ｘ１１は任意のアミノ酸であり、
Ｘ１５はＤまたはＥであり、
Ｘ１６は、任意のアミノ酸、好ましくはＹ、ＨおよびＮからなる群より選択されるアミノ酸である。
一実施形態では、アンキリンリピートタンパク質は、それぞれが図５に示される配列番号１～２８の反復モジュール１、２および３の群から選択される配列を含む少なくとも１つの反復モジュールを含む。
一実施形態では、アンキリンリピートタンパク質は３つの反復モジュールを含み、ここで、反復モジュール１は、図５に示される配列番号１～２８の反復モジュール１の群から選択され、反復モジュール２は、図５に示される配列番号１～２８の反復モジュール２の群から選択され、反復モジュール３は、図５に示される配列番号１～２８の反復モジュール３の群から選択される。
一実施形態では、アンキリンリピートタンパク質は３つの反復モジュールを含み、反復モジュール１、反復モジュール２および反復モジュール３は、図５に示される配列番号１～２８からなる群より選択される配列の反復モジュール１、反復モジュール２および反復モジュール３である。
一実施形態では、反復モジュールは反復ドメインに存在する。
一実施形態では、反復ドメインは、Ｎ末端および／またはＣ末端キャッピングモジュールをさらに含む。
一実施形態では、アンキリンリピートタンパク質は、配列番号１～２８、またはその２９～１２７位からなる群より選択される配列を含む。
一実施形態では、分子は、任意でアンキリンリピートタンパク質と融合した、別のペプチドまたはタンパク質成分をさらに含む。
一実施形態では、分子はポリペプチド化合物である。
一実施形態では、分子は、脂質もしくは脂質様成分または別の非ペプチド成分をさらに含む。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載される分子をコードする核酸に関する。
さらなる態様では、本発明は、任意で分子を発現する、本明細書に記載される核酸を含む宿主細胞に関する。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載される分子を含む粒子に関する。
一態様では、粒子は、抗原受容体をコードする核酸をさらに含む。一態様では、抗原受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である。一実施形態では、抗原は、疾患、障害または状態に関連する。一実施形態では、抗原は腫瘍関連抗原である。
一実施形態では、核酸はＲＮＡである。一実施形態では、核酸はＤＮＡである。
一実施形態では、粒子は非ウイルス粒子である。一実施形態では、粒子は、脂質ベースおよび／またはポリマーベースの粒子である。一実施形態では、粒子はナノ粒子である。
一実施形態では、粒子は、その表面上のアンキリンリピートタンパク質で官能化されている。一実施形態では、粒子は、アンキリンリピートタンパク質を少なくとも１つの粒子形成成分に連結することによってアンキリンリピートタンパク質で官能化される。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載の分子、本明細書に記載の粒子、またはそれらの複数を含む組成物に関する。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載の分子、本明細書に記載の粒子、またはそれらの複数を含む医薬組成物に関する。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載の分子、本明細書に記載の核酸、本明細書に記載の宿主細胞、本明細書に記載の粒子、本明細書に記載の組成物、または本明細書に記載の医薬組成物を含むキットに関する。
一実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法でキットを使用するための説明書をさらに含む。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載の方法で使用するための本明細書に記載の粒子またはその複数に関する。
さらなる態様では、本発明は、治療的使用のための、特に本明細書に記載の方法で使用するための、本明細書に記載の薬剤および組成物、例えば標的化分子、粒子、抗原受容体をコードする核酸、および／または抗原、抗原をコードするポリヌクレオチド、または抗原を発現するように遺伝子改変された宿主細胞に関する。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
古典的ＣＡＲ Ｔ細胞療法とインビボＣＡＲ Ｔ細胞療法との比較 遺伝子送達デバイス：ＰＬＸおよびＬＮＰ ワクチンの概念（ＣＡＲＶａｃ） ＤＡＲＰｉｎのＣＤ８特異的結合 （Ａ）ＣＤ８に特異的に結合するＤＡＲＰｉｎを同定するために、９４個のＤＡＲＰｉｎクローンの粗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶解物を、ＣＤ８ααを発現するＭｏｌｔ４．８細胞およびＣＤ８αβを発現するＪ６７Ｓ８ａｂ細胞への結合について分析した。（Ｂ、Ｃ）次いで、ＣＤ８ホモ二量体およびヘテロ二量体に等しく結合する３１個のＣＤ８－ｄａｒｐｉｎクローンを、フローサイトメトリによって初代ヒトＰＢＭＣ（Ｂ）およびＮＨＰ ＰＢＭＣ（Ｃ）に関する結合アッセイにおいて試験した。棒グラフは、各ＤＡＲＰｉｎについてのＣＤ８＋およびＣＤ８－ＰＢＭＣへの結合を示す。点線は、ＣＤ８－細胞ではなくＣＤ８＋細胞で観察した場合に、ＤＡＲＰｉｎを特異的結合剤として分類するための閾値として使用したバックグラウンドの２倍の変化を示す。矢印は、さらなる分析のために選択したＤＡＲＰｉｎを示す。（＊）別のＮＨＰドナー由来のＰＢＭＣを使用して、別個の結合アッセイでＤＡＲＰｉｎ ５ＳＥ１１を分析した。 ＤＡＲＰｉｎのＣＤ８特異的結合 （Ａ）ＣＤ８に特異的に結合するＤＡＲＰｉｎを同定するために、９４個のＤＡＲＰｉｎクローンの粗大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶解物を、ＣＤ８ααを発現するＭｏｌｔ４．８細胞およびＣＤ８αβを発現するＪ６７Ｓ８ａｂ細胞への結合について分析した。（Ｂ、Ｃ）次いで、ＣＤ８ホモ二量体およびヘテロ二量体に等しく結合する３１個のＣＤ８－ｄａｒｐｉｎクローンを、フローサイトメトリによって初代ヒトＰＢＭＣ（Ｂ）およびＮＨＰ ＰＢＭＣ（Ｃ）に関する結合アッセイにおいて試験した。棒グラフは、各ＤＡＲＰｉｎについてのＣＤ８＋およびＣＤ８－ＰＢＭＣへの結合を示す。点線は、ＣＤ８－細胞ではなくＣＤ８＋細胞で観察した場合に、ＤＡＲＰｉｎを特異的結合剤として分類するための閾値として使用したバックグラウンドの２倍の変化を示す。矢印は、さらなる分析のために選択したＤＡＲＰｉｎを示す。（＊）別のＮＨＰドナー由来のＰＢＭＣを使用して、別個の結合アッセイでＤＡＲＰｉｎ ５ＳＥ１１を分析した。 ＣＤ８特異的ＤＡＲＰｉｎ配列のアラインメント ２８個のＤＡＲＰｉｎ配列のアラインメントを示す。 ＣＤ８特異的ＤＡＲＰｉｎ配列のアラインメント ２８個のＤＡＲＰｉｎ配列のアラインメントを示す。 生成およびＩＭＡＣ精製後のＨ６－ＨＡ－６３Ｈ６－Ｃｙｓ、Ｈ６－ＨＡ－６３Ｈ６－Ｅ１０およびＨ６－ＨＡ－６３Ｈ６－Ｅ２０ ＤＡＲＰｉｎの分析ＳＤＳ－ＰＡＧＥ。 合計５μｇのタンパク質を、還元（＋β－メルカプトエタノール）および非還元（－β－メルカプトエタノール）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥに適用した。 ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞へのＨ６－ＨＡ－６３Ｈ６－Ｃｙｓ、Ｈ６－ＨＡ－６３Ｈ６－Ｅ１０およびＨ６－ＨＡ－６３Ｈ６－Ｅ２０の特異的結合。 フローサイトメトリ分析のために、３人の異なるドナーのヒトＰＢＭＣを抗ＣＤ３－ＦＩＴＣ抗体（クローンＳＫ－７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）および抗ＣＤ４－ＢＶ４２１抗体（クローンＯｋｔ０４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色した。ＤＡＲＰｉｎのＣＤ８への結合を抗ｈｉｓ－ＡＰＣ抗体で検出した。データ評価のために、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＡＰＣシグナルの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を計算した。 ＤＡＲＰｉｎで官能化されたＬＮＰによるＣＤ８特異的トランスフェクション ＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎのＬＮＰへの結合は、ＰＥＧ－脂質への共有結合を必要とする。クリック化学反応を可能にするために、末端システイン（ＰＥＧ－脂質上の末端基としてのマレイミドの対応物として、ＬＮＰ－Ｍａｌ）を２つの選択したＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎクローン（６３Ｈ６および６３Ａ４）に導入した。次いで、構築物を大腸菌で産生し、精製した。（Ａ）遊離ＤＡＲＰｉｎ、ＬＮＰ－Ｍａｌ単独、ならびにＤＡＲＰｉｎ＋ＬＮＰ－Ｍａｌおよび末端アジドを有するＬＮＰ（ＬＮＰ－Ｎ３、陰性対照）のネイティブＰＡＧＥを適用した。（Ｂ）ＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎに結合したおよび結合していないＬＮＰのＤＬＳデータ（灰色のバーは直径、×印はＰＤＩを示す）。（Ｃ、Ｄ）ルシフェラーゼ－ｍＲＮＡを封入したＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎ修飾ＬＮＰを、ＣＤ８＋およびＣＤ８－Ｊｕｒｋａｔ細胞株（Ｃ）ならびにヒトＰａｎ Ｔ細胞（Ｅ）におけるトランスフェクション効率について試験し、１×１０６細胞あたり３００ｎｇのＬＮＰに製剤化されたＲＮＡの投与の１６時間後にルシフェラーゼ発現について評価した。無関係な末端基（Ｎ３）を有するかまたはＤＡＲＰｉｎに結合していないＬＮＰを対照として使用した。 ＤＡＲＰｉｎで官能化されたＬＮＰによるＣＤ８特異的トランスフェクション ＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎのＬＮＰへの結合は、ＰＥＧ－脂質への共有結合を必要とする。クリック化学反応を可能にするために、末端システイン（ＰＥＧ－脂質上の末端基としてのマレイミドの対応物として、ＬＮＰ－Ｍａｌ）を２つの選択したＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎクローン（６３Ｈ６および６３Ａ４）に導入した。次いで、構築物を大腸菌で産生し、精製した。（Ａ）遊離ＤＡＲＰｉｎ、ＬＮＰ－Ｍａｌ単独、ならびにＤＡＲＰｉｎ＋ＬＮＰ－Ｍａｌおよび末端アジドを有するＬＮＰ（ＬＮＰ－Ｎ３、陰性対照）のネイティブＰＡＧＥを適用した。（Ｂ）ＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎに結合したおよび結合していないＬＮＰのＤＬＳデータ（灰色のバーは直径、×印はＰＤＩを示す）。（Ｃ、Ｄ）ルシフェラーゼ－ｍＲＮＡを封入したＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎ修飾ＬＮＰを、ＣＤ８＋およびＣＤ８－Ｊｕｒｋａｔ細胞株（Ｃ）ならびにヒトＰａｎ Ｔ細胞（Ｅ）におけるトランスフェクション効率について試験し、１×１０６細胞あたり３００ｎｇのＬＮＰに製剤化されたＲＮＡの投与の１６時間後にルシフェラーゼ発現について評価した。無関係な末端基（Ｎ３）を有するかまたはＤＡＲＰｉｎに結合していないＬＮＰを対照として使用した。 ＤＡＲＰｉｎで官能化されたＰＬＸによるＣＤ８特異的トランスフェクション ＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎのＰＬＸへの結合は、カチオン性ＰＬＸコアと標的化リガンドに連結されたアニオン性成分との間の静電引力を必要とする。以前に記載されたような（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１７）反応性エステル化学を介した合成ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）へのカップリングの代替法として、本発明者らは、Ｅ２０タグを有するＣＤ８特異的ＤＡＲＰｉｎクローン６３Ｈ６を組換えによって作製した。（Ａ）異なるｗ／ｗ比での遊離ＤＡＲＰｉｎ－Ｅ２０、ＰＬＸコア単独、ならびにＤＡＲＰｉｎ＋ＰＬＸコアのバンドを示すアガロースゲル電気泳動。（Ｂ）コアＰＬＸおよびＤＡＲＰｉｎ修飾ＰＬＸのＤＬＳデータ（灰色のバーは直径、×印はＰＤＩを示す）。（Ｃ）コアＰＬＸおよびＤＡＲＰｉｎ修飾ＰＬＸのゼータ電位。（Ｄ、Ｅ）ルシフェラーゼ－ｍＲＮＡおよびＴｈｙ１．１－ｍＲＮＡ（５０／５０）を封入したＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎ修飾ＰＬＸのトランスフェクション能をＣＤ８－およびＣＤ８＋Ｊｕｒｋａｔ細胞株で試験した。（Ｆ、Ｇ）ルシフェラーゼ－ｍＲＮＡおよびＴｈｙ１．１－ｍＲＮＡ（５０／５０）を封入したＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎ修飾ＰＬＸを、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の並行評価を含むさらなる生存率検査およびフローサイトメトリ分析を用いてヒトｐａｎ Ｔ細胞で試験した。１×１０６細胞あたり３３０ｎｇ（Ｊｕｒｋａｔ細胞）または５０ｎｇ（初代Ｔ細胞）のＰＬＸに製剤化されたＲＮＡの投与の１６時間後にアッセイを実施した。 ＤＡＲＰｉｎで官能化されたＰＬＸによるＣＤ８特異的トランスフェクション ＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎのＰＬＸへの結合は、カチオン性ＰＬＸコアと標的化リガンドに連結されたアニオン性成分との間の静電引力を必要とする。以前に記載されたような（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１７）反応性エステル化学を介した合成ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）へのカップリングの代替法として、本発明者らは、Ｅ２０タグを有するＣＤ８特異的ＤＡＲＰｉｎクローン６３Ｈ６を組換えによって作製した。（Ａ）異なるｗ／ｗ比での遊離ＤＡＲＰｉｎ－Ｅ２０、ＰＬＸコア単独、ならびにＤＡＲＰｉｎ＋ＰＬＸコアのバンドを示すアガロースゲル電気泳動。（Ｂ）コアＰＬＸおよびＤＡＲＰｉｎ修飾ＰＬＸのＤＬＳデータ（灰色のバーは直径、×印はＰＤＩを示す）。（Ｃ）コアＰＬＸおよびＤＡＲＰｉｎ修飾ＰＬＸのゼータ電位。（Ｄ、Ｅ）ルシフェラーゼ－ｍＲＮＡおよびＴｈｙ１．１－ｍＲＮＡ（５０／５０）を封入したＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎ修飾ＰＬＸのトランスフェクション能をＣＤ８－およびＣＤ８＋Ｊｕｒｋａｔ細胞株で試験した。（Ｆ、Ｇ）ルシフェラーゼ－ｍＲＮＡおよびＴｈｙ１．１－ｍＲＮＡ（５０／５０）を封入したＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎ修飾ＰＬＸを、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の並行評価を含むさらなる生存率検査およびフローサイトメトリ分析を用いてヒトｐａｎ Ｔ細胞で試験した。１×１０６細胞あたり３３０ｎｇ（Ｊｕｒｋａｔ細胞）または５０ｎｇ（初代Ｔ細胞）のＰＬＸに製剤化されたＲＮＡの投与の１６時間後にアッセイを実施した。 ＤＡＲＰｉｎで官能化されたＰＬＸによるＣＤ８特異的トランスフェクション ＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎのＰＬＸへの結合は、カチオン性ＰＬＸコアと標的化リガンドに連結されたアニオン性成分との間の静電引力を必要とする。以前に記載されたような（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１７）反応性エステル化学を介した合成ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）へのカップリングの代替法として、本発明者らは、Ｅ２０タグを有するＣＤ８特異的ＤＡＲＰｉｎクローン６３Ｈ６を組換えによって作製した。（Ａ）異なるｗ／ｗ比での遊離ＤＡＲＰｉｎ－Ｅ２０、ＰＬＸコア単独、ならびにＤＡＲＰｉｎ＋ＰＬＸコアのバンドを示すアガロースゲル電気泳動。（Ｂ）コアＰＬＸおよびＤＡＲＰｉｎ修飾ＰＬＸのＤＬＳデータ（灰色のバーは直径、×印はＰＤＩを示す）。（Ｃ）コアＰＬＸおよびＤＡＲＰｉｎ修飾ＰＬＸのゼータ電位。（Ｄ、Ｅ）ルシフェラーゼ－ｍＲＮＡおよびＴｈｙ１．１－ｍＲＮＡ（５０／５０）を封入したＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎ修飾ＰＬＸのトランスフェクション能をＣＤ８－およびＣＤ８＋Ｊｕｒｋａｔ細胞株で試験した。（Ｆ、Ｇ）ルシフェラーゼ－ｍＲＮＡおよびＴｈｙ１．１－ｍＲＮＡ（５０／５０）を封入したＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎ修飾ＰＬＸを、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の並行評価を含むさらなる生存率検査およびフローサイトメトリ分析を用いてヒトｐａｎ Ｔ細胞で試験した。１×１０６細胞あたり３３０ｎｇ（Ｊｕｒｋａｔ細胞）または５０ｎｇ（初代Ｔ細胞）のＰＬＸに製剤化されたＲＮＡの投与の１６時間後にアッセイを実施した。 ＤＡＲＰｉｎで官能化されたＰＬＸによるＣＤ８特異的トランスフェクション ＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎのＰＬＸへの結合は、カチオン性ＰＬＸコアと標的化リガンドに連結されたアニオン性成分との間の静電引力を必要とする。以前に記載されたような（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１７）反応性エステル化学を介した合成ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）へのカップリングの代替法として、本発明者らは、Ｅ２０タグを有するＣＤ８特異的ＤＡＲＰｉｎクローン６３Ｈ６を組換えによって作製した。（Ａ）異なるｗ／ｗ比での遊離ＤＡＲＰｉｎ－Ｅ２０、ＰＬＸコア単独、ならびにＤＡＲＰｉｎ＋ＰＬＸコアのバンドを示すアガロースゲル電気泳動。（Ｂ）コアＰＬＸおよびＤＡＲＰｉｎ修飾ＰＬＸのＤＬＳデータ（灰色のバーは直径、×印はＰＤＩを示す）。（Ｃ）コアＰＬＸおよびＤＡＲＰｉｎ修飾ＰＬＸのゼータ電位。（Ｄ、Ｅ）ルシフェラーゼ－ｍＲＮＡおよびＴｈｙ１．１－ｍＲＮＡ（５０／５０）を封入したＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎ修飾ＰＬＸのトランスフェクション能をＣＤ８－およびＣＤ８＋Ｊｕｒｋａｔ細胞株で試験した。（Ｆ、Ｇ）ルシフェラーゼ－ｍＲＮＡおよびＴｈｙ１．１－ｍＲＮＡ（５０／５０）を封入したＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎ修飾ＰＬＸを、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の並行評価を含むさらなる生存率検査およびフローサイトメトリ分析を用いてヒトｐａｎ Ｔ細胞で試験した。１×１０６細胞あたり３３０ｎｇ（Ｊｕｒｋａｔ細胞）または５０ｎｇ（初代Ｔ細胞）のＰＬＸに製剤化されたＲＮＡの投与の１６時間後にアッセイを実施した。 ＤＡＲＰｉｎで官能化されたＰＬＸによるＣＤ８特異的トランスフェクション ＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎのＰＬＸへの結合は、カチオン性ＰＬＸコアと標的化リガンドに連結されたアニオン性成分との間の静電引力を必要とする。以前に記載されたような（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１７）反応性エステル化学を介した合成ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）へのカップリングの代替法として、本発明者らは、Ｅ２０タグを有するＣＤ８特異的ＤＡＲＰｉｎクローン６３Ｈ６を組換えによって作製した。（Ａ）異なるｗ／ｗ比での遊離ＤＡＲＰｉｎ－Ｅ２０、ＰＬＸコア単独、ならびにＤＡＲＰｉｎ＋ＰＬＸコアのバンドを示すアガロースゲル電気泳動。（Ｂ）コアＰＬＸおよびＤＡＲＰｉｎ修飾ＰＬＸのＤＬＳデータ（灰色のバーは直径、×印はＰＤＩを示す）。（Ｃ）コアＰＬＸおよびＤＡＲＰｉｎ修飾ＰＬＸのゼータ電位。（Ｄ、Ｅ）ルシフェラーゼ－ｍＲＮＡおよびＴｈｙ１．１－ｍＲＮＡ（５０／５０）を封入したＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎ修飾ＰＬＸのトランスフェクション能をＣＤ８－およびＣＤ８＋Ｊｕｒｋａｔ細胞株で試験した。（Ｆ、Ｇ）ルシフェラーゼ－ｍＲＮＡおよびＴｈｙ１．１－ｍＲＮＡ（５０／５０）を封入したＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎ修飾ＰＬＸを、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の並行評価を含むさらなる生存率検査およびフローサイトメトリ分析を用いてヒトｐａｎ Ｔ細胞で試験した。１×１０６細胞あたり３３０ｎｇ（Ｊｕｒｋａｔ細胞）または５０ｎｇ（初代Ｔ細胞）のＰＬＸに製剤化されたＲＮＡの投与の１６時間後にアッセイを実施した。 ＤＡＲＰｉｎで官能化されたＰＬＸによるＣＤ８特異的トランスフェクション ＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎのＰＬＸへの結合は、カチオン性ＰＬＸコアと標的化リガンドに連結されたアニオン性成分との間の静電引力を必要とする。以前に記載されたような（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１７）反応性エステル化学を介した合成ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）へのカップリングの代替法として、本発明者らは、Ｅ２０タグを有するＣＤ８特異的ＤＡＲＰｉｎクローン６３Ｈ６を組換えによって作製した。（Ａ）異なるｗ／ｗ比での遊離ＤＡＲＰｉｎ－Ｅ２０、ＰＬＸコア単独、ならびにＤＡＲＰｉｎ＋ＰＬＸコアのバンドを示すアガロースゲル電気泳動。（Ｂ）コアＰＬＸおよびＤＡＲＰｉｎ修飾ＰＬＸのＤＬＳデータ（灰色のバーは直径、×印はＰＤＩを示す）。（Ｃ）コアＰＬＸおよびＤＡＲＰｉｎ修飾ＰＬＸのゼータ電位。（Ｄ、Ｅ）ルシフェラーゼ－ｍＲＮＡおよびＴｈｙ１．１－ｍＲＮＡ（５０／５０）を封入したＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎ修飾ＰＬＸのトランスフェクション能をＣＤ８－およびＣＤ８＋Ｊｕｒｋａｔ細胞株で試験した。（Ｆ、Ｇ）ルシフェラーゼ－ｍＲＮＡおよびＴｈｙ１．１－ｍＲＮＡ（５０／５０）を封入したＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎ修飾ＰＬＸを、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の並行評価を含むさらなる生存率検査およびフローサイトメトリ分析を用いてヒトｐａｎ Ｔ細胞で試験した。１×１０６細胞あたり３３０ｎｇ（Ｊｕｒｋａｔ細胞）または５０ｎｇ（初代Ｔ細胞）のＰＬＸに製剤化されたＲＮＡの投与の１６時間後にアッセイを実施した。 インビボでのＤＡＲＰｉｎ修飾ＬＮＰによるＣＤ８特異的トランスフェクション 免疫不全マウスにヒトＰＢＭＣを移植し、２１日後に非官能化またはＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎ修飾ＬＮＰのいずれかに封入された２０μｇのｍＲＮＡ（ルシフェラーゼおよびＴｈｙ１．１、５０／５０）で処置した。ＬＮＰをシステイン／マレイミド反応によって官能化した。ＬＮＰ投与の１日後、ルシフェラーゼシグナルをインサイチュ－での生物発光イメージングによって検出し（Ａ）、Ｔｈｙ１．１発現を末梢血のフローサイトメトリ分析によって評価した（Ｂ）。 混合ＲＮＡ／ＤＮＡカーゴを送達するためのビヒクルとしての官能化ナノ粒子 ＣＤ８＋Ｔ細胞を健常ドナーの末梢血から単離し、１×１０６標的細胞あたり非官能化またはＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎＥ２０修飾ＰＬＸのいずれかに封入された５０ｎｇの混合カーゴ（改良型ＹＦＰをコードするミニサークルＤＮＡおよびＴｈｙ１．１－ｍＲＮＡ、５０／５０）で処理した。ＰＬＸ投与の１日後、目的の遺伝子をフローサイトメトリによって評価し、細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化して増殖を達成した。処理後５日目に、細胞を再びフローサイトメトリによって評価した。
本開示を以下で詳細に説明するが、この開示は本明細書に記載される特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されず、これらは異なり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本開示の範囲を限定することを意図するものではなく、本開示の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
好ましくは、本明細書で使用される用語は、''Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）''，Ｈ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｂ．Ｎａｇｅｌ，ａｎｄ Ｈ．Ｋｏｌｂｌ，Ｅｄｓ．，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，ＣＨ－４０１０ Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，（１９９５）に記載されているように定義される。
本開示の実施は、特に指示されない限り、当技術分野の文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ １９８９を参照）で説明されている化学、生化学、細胞生物学、免疫学、および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を用いる。
以下において、本開示の要素を説明する。これらの要素を具体的な実施形態と共に列挙するが、それらは、さらなる実施形態を創出するために任意の方法および任意の数で組み合わせてもよいことが理解されるべきである。様々に説明される例および実施形態は、本開示を明確に記述される実施形態のみに限定すると解釈されるべきではない。この説明は、明確に記述される実施形態を任意の数の開示される要素と組み合わせた実施形態を開示し、包含すると理解されるべきである。さらに、記述される全ての要素の任意の順列と組合せは、文脈上特に指示されない限り、この説明によって開示されていると見なされるべきである。
「約」という用語は、およそまたはほぼを意味し、本明細書に記載の数値または範囲の文脈において、一実施形態では、列挙または特許請求される数値または範囲の±２０％、±１０％、±５％、または±３％を意味する。
本開示を説明する文脈において（特に特許請求の範囲の文脈において）使用される「１つの」および「その」という用語ならびに同様の言及は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、その範囲内に属する各々別々の値を個別に言及することの簡略方法として機能することが意図されている。本明細書で特に指示されない限り、個々の値は、本明細書で個別に列挙されているかのごとくに本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的言語（例えば、「など」）の使用は、単に本開示をより良く説明することを意図しており、特許請求の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、本開示の実施に必須の特許請求されていない要素を指示すると解釈されるべきではない。
特に明記されない限り、「含む」という用語は、「含む」によって導入されたリストのメンバーに加えて、さらなるメンバーが任意に存在し得ることを示すために本文書の文脈で使用される。しかしながら、「含む」という用語は、さらなるメンバーが存在しない可能性を包含することが本開示の特定の実施形態として企図され、すなわち、この実施形態の目的のためには、「含む」は「からなる」の意味を有すると理解されるべきである。
本明細書の本文全体を通していくつかの資料を引用する。本明細書で引用される各資料（全ての特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書、指示書などを含む）は、上記または下記のいずれでも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本開示がそのような開示に先行する権利を有さなかったことの承認と解釈されるべきではない。
以下において、本開示の全ての態様に適用される定義を提供する。以下の用語は、特に指示されない限り、以下の意味を有する。定義されていない用語は、それらの技術分野で広く認められている意味を有する。
定義
本明細書で使用される「低減する」、「減少させる」「阻害する」または「損なう」などの用語は、レベル、例えば結合レベルの、好ましくは５％以上、１０％以上、２０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％以上の全体的な減少または全体的な減少を生じさせる能力に関する。
「増加させる」、「増強する」または「上回る」などの用語は、好ましくは、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、またはさらにそれ以上の増加または増強に関する。
対象物に関する「複数」という用語は、前記対象物の特定の数の集団を指す。特定の実施形態では、この用語は、１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８、１０１９、１０２０、１０２１、１０２２、または１０２３以上の集団を指す。
アミノ酸は、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を形成するビルディングブロックである。以下は、アミノ酸に使用される略語および１文字コードを示す。
Figure 2023509604000002
本開示によれば、「ペプチド」という用語は、オリゴペプチドおよびポリペプチドを含み、約２個以上、約３個以上、約４個以上、約６個以上、約８個以上、約１０個以上、約１３個以上、約１６個以上、約２０個以上、および最大約５０個、約１００個または約１５０個までの、ペプチド結合によって互いに連結された連続するアミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」または「ポリペプチド」という用語は、大きなペプチド、特に少なくとも約１５１個のアミノ酸を有するペプチドを指すが、「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書では通常同義語として使用される。
「治療用タンパク質」は、治療有効量で対象に提供された場合、対象の状態または病態に対してプラスのまたは有利な効果を及ぼす。一実施形態では、治療用タンパク質は治癒的または緩和的特性を有し、疾患または障害の１つ以上の症状を改善する、緩和する、軽減する、逆転させる、発症を遅延させる、または重症度を軽減するために投与され得る。治療用タンパク質は予防的特性を有し得、疾患の発症を遅延させるため、またはそのような疾患もしくは病的状態の重症度を軽減するために使用され得る。「治療用タンパク質」という用語は、タンパク質またはペプチド全体を含み、それらの治療的に活性な断片も指すことができる。それはまた、タンパク質の治療的に活性なバリアントを含み得る。治療的に活性なタンパク質の例には、ワクチン接種のための抗原およびサイトカインが含まれるが、これらに限定されない。
アミノ酸配列（ペプチドまたはタンパク質）に関して、「断片」は、アミノ酸配列の一部、すなわちＮ末端および／またはＣ末端で短縮されたアミノ酸配列を表す配列に関する。Ｃ末端で短縮された断片（Ｎ末端断片）は、例えばオープンリーディングフレームの３'末端を欠くトランケートされたオープンリーディングフレームの翻訳によって得ることができる。Ｎ末端で短縮された断片（Ｃ末端断片）は、例えば、トランケートされたオープンリーディングフレームが翻訳を開始させるように働く開始コドンを含む限り、オープンリーディングフレームの５'末端を欠くトランケートされたオープンリーディングフレームの翻訳によって得ることができる。アミノ酸配列の断片は、例えばアミノ酸配列からのアミノ酸残基の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％を含む。アミノ酸配列の断片は、好ましくはアミノ酸配列からの少なくとも６個、特に少なくとも８個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、または少なくとも１００個の連続するアミノ酸を含む。
本明細書における「バリアント」または「バリアントタンパク質」または「バリアントポリペプチド」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって野生型タンパク質とは異なるタンパク質を意味する。親ポリペプチドは、天然に存在するもしくは野生型（ＷＴ）ポリペプチドであり得るか、または野生型ポリペプチドの改変型であり得る。好ましくは、バリアントポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾、例えば親ポリペプチドと比較して１～約２０のアミノ酸修飾、好ましくは１～約１０または１～約５のアミノ酸修飾を有する。
本明細書で使用される「親ポリペプチド」、「親タンパク質」、「前駆体ポリペプチド」、または「前駆体タンパク質」とは、その後修飾されてバリアントを生じる未修飾ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、野生型ポリペプチド、または野生型ポリペプチドのバリアントもしくは操作型であり得る。
本明細書における「野生型」または「ＷＴ」または「天然」とは、対立遺伝子変異を含む、自然界に見出されるアミノ酸配列を意味する。野生型タンパク質またはポリペプチドは、意図的に修飾されていないアミノ酸配列を有する。
本開示の目的のために、アミノ酸配列（ペプチド、タンパク質またはポリペプチド）の「バリアント」は、アミノ酸挿入バリアント、アミノ酸付加バリアント、アミノ酸欠失バリアントおよび／またはアミノ酸置換バリアントを含む。「バリアント」という用語は、全てのスプライスバリアント、翻訳後修飾バリアント、配座バリアント、アイソフォームバリアントおよび種ホモログ、特に細胞によって天然に発現されるものを含む。「バリアント」という用語は、特に、アミノ酸配列の断片を含む。
アミノ酸挿入バリアントは、特定のアミノ酸配列中に１個または２個以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列バリアントの場合、１個以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列の特定の部位に挿入されるが、結果として生じる産物の適切なスクリーニングを伴うランダムな挿入も可能である。アミノ酸付加バリアントは、１個以上のアミノ酸、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０個、またはそれ以上のアミノ酸のアミノ末端および／またはカルボキシ末端融合を含む。アミノ酸欠失バリアントは、配列からの１個以上のアミノ酸の除去、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０個、またはそれ以上のアミノ酸の除去を特徴とする。欠失は、タンパク質の任意の位置にあってよい。タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に欠失を含むアミノ酸欠失バリアントは、Ｎ末端および／またはＣ末端切断バリアントとも呼ばれる。アミノ酸置換バリアントは、配列内の少なくとも１個の残基が除去され、別の残基がその位置に挿入されていることを特徴とする。相同なタンパク質もしくはペプチド間で保存されていないアミノ酸配列の位置にある修飾、および／またはアミノ酸を類似の性質を有する他のアミノ酸で置換することが好ましい。好ましくは、ペプチドおよびタンパク質バリアントにおけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に荷電したアミノ酸または非荷電アミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化には、その側鎖が関連するアミノ酸のファミリーの１つの置換が含まれる。天然に存在するアミノ酸は、一般に、酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）アミノ酸の４つのファミリーに分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時に芳香族アミノ酸として一緒に分類されることがある。一実施形態では、保存的アミノ酸置換には、以下の群内の置換が含まれる：
グリシン、アラニン；
バリン、イソロイシン、ロイシン；
アスパラギン酸、グルタミン酸；
アスパラギン、グルタミン；
セリン、トレオニン；
リジン、アルギニン；および
フェニルアラニン、チロシン。
好ましくは、所与のアミノ酸配列と前記所与のアミノ酸配列のバリアントであるアミノ酸配列との間の類似性、好ましくは同一性の程度は、少なくとも約６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。類似性または同一性の程度は、好ましくは、参照アミノ酸配列の全長の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％であるアミノ酸領域について与えられる。例えば、参照アミノ酸配列が２００個のアミノ酸からなる場合、類似性または同一性の程度は、好ましくは少なくとも約２０個、少なくとも約４０個、少なくとも約６０個、少なくとも約８０個、少なくとも約１００個、少なくとも約１２０個、少なくとも約１４０個、少なくとも約１６０個、少なくとも約１８０個、または約２００個のアミノ酸、好ましくは連続アミノ酸について与えられる。好ましい実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照アミノ酸配列の全長について与えられる。配列類似性、好ましくは配列同一性を決定するためのアラインメントは、当技術分野で公知のツールを用いて、好ましくは最適な配列アラインメントを使用して、例えばＡｌｉｇｎを使用して、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ニードル、マトリックス：Ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップオープン１０．０、ギャップ伸長０．５を使用して行うことができる。
「配列類似性」は、同一であるかまたは保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸の割合を示す。２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、これらの配列間で同一であるアミノ酸の割合を示す。
「同一性パーセント」という用語は、最適なアラインメント後に得られる、比較する２つの配列間で同一であるアミノ酸残基の割合を示すことが意図されており、この割合は純粋に統計的であり、２つの配列間の相違はそれらの全長にわたってランダムに分布している。２つのアミノ酸配列間の配列比較は、通常、これらの配列を最適に整列させた後に比較することによって行われ、前記比較は、配列類似性の局所領域を同定し、比較するためにセグメントごとにまたは「比較ウィンドウ」ごとに行われる。比較のための配列の最適なアラインメントは、手作業に加えて、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３の局所相同性アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，２４４４の類似性検索法によって、またはこれらのアルゴリズムを使用したコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）によって作成され得る。
同一性パーセントは、比較する２つの配列間で同一の位置の数を決定し、この数を比較する位置の数で除し、得られた結果に１００を乗じて、これら２つの配列間の同一性パーセントを得ることによって計算される。
相同なアミノ酸配列は、本開示によれば、アミノ酸残基の少なくとも４０％、特に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８、または少なくとも９９％の同一性を示す。
本明細書に記載のアミノ酸配列バリアントは、例えば組換えＤＮＡ操作により、当業者によって容易に調製され得る。置換、付加、挿入または欠失を有するペプチドまたはタンパク質を調製するためのＤＮＡ配列の操作は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）に詳細に記載されている。さらに、本明細書に記載されるペプチドおよびアミノ酸バリアントは、例えば固相合成および類似の方法などによる公知のペプチド合成技術を用いて容易に調製され得る。
一実施形態では、アミノ酸配列（ペプチドまたはタンパク質）の断片またはバリアントは、好ましくは「機能的断片」または「機能的バリアント」である。アミノ酸配列の「機能的断片」または「機能的バリアント」という用語は、それが由来するアミノ酸配列のものと同一または類似の１つ以上の機能特性を示す、すなわち機能的に等価である任意の断片またはバリアントに関する。抗原に関して、１つの特定の機能は、断片もしくはバリアントが由来するアミノ酸配列によって示される１つ以上の免疫刺激活性、および／または断片もしくはバリアントが由来するアミノ酸配列が結合する受容体（１つまたは複数）への結合である。本明細書で使用される「機能的断片」または「機能的バリアント」という用語は、特に、親分子または配列のアミノ酸配列と比較して１つ以上のアミノ酸によって変化しており、親分子または配列の機能の１つ以上を依然として果たす、例えば標的分子に結合することができるアミノ酸配列を含むバリアント分子または配列を指す。一実施形態では、親分子または配列のアミノ酸配列の改変は、分子または配列の結合特性に有意に影響を及ぼさないかまたは変化させない。異なる実施形態では、機能的断片または機能的バリアントの結合は、低減され得るが、依然として有意に存在し得、例えば、機能的バリアントの結合は、親分子または配列の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％であり得る。しかしながら、他の実施形態では、機能的断片または機能的バリアントの結合は、親分子または配列と比較して増強され得る。
指定されたアミノ酸配列（ペプチド、タンパク質またはポリペプチド）に「由来する」アミノ酸配列（ペプチド、タンパク質またはポリペプチド）は、最初のアミノ酸配列の起源を指す。好ましくは、特定のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、その特定の配列またはその断片と同一、本質的に同一または相同であるアミノ酸配列を有する。特定のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、その特定の配列のバリアントまたはその断片であり得る。例えば、本明細書での使用に適した抗原は、天然配列の望ましい活性を保持しながら、それらが由来する天然に存在するまたは天然の配列とは配列が異なるように改変され得ることが当業者に理解されるであろう。
本明細書で使用される場合、「説明資料」または「説明書」は、本発明の組成物および方法の有用性を伝えるために使用することができる刊行物、記録、図、または任意の他の表現媒体を含む。本発明のキットの説明資料は、例えば、本発明の組成物を含む容器に貼付され得るか、または組成物を含む容器と共に出荷され得る。あるいは、説明資料と組成物が受領者によって協働して使用されることを意図して、説明資料は容器とは別に出荷されてもよい。
「単離された」は、天然状態から改変されたまたは取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離されて」いないが、その天然状態の共存物質から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離されて」いる。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在し得るか、または例えば宿主細胞などの非天然環境に存在し得る。
本発明の文脈における「組換え」という用語は、「遺伝子操作を介して作製された」ことを意味する。好ましくは、本発明の文脈における組換え細胞などの「組換え物」は、天然には存在しない。
本明細書で使用される「天然に存在する」という用語は、物体が自然界で見出され得るという事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）中に存在し、自然界の供給源から単離することができ、実験室で人間によって意図的に改変されていないペプチドまたは核酸は、天然に存在する。
本明細書で使用される「レンチウイルス」は、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）の一属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという点でレトロウイルスの中で独特である；それらは、宿主細胞のＤＮＡに有意な量の遺伝情報を送達することができるので、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、およびＦＩＶは全てレンチウイルスの例である。レンチウイルスに由来するベクターは、インビボで有意なレベルの遺伝子導入を達成する手段を提供する。
本明細書で使用される「特異的に結合する」という用語は、特定の抗原を認識するが、試料中または対象中の他の分子を実質的に認識しないまたは結合しない抗体またはＣＡＲなどの分子を意味する。例えば、１つの種由来の抗原に特異的に結合する抗体は、１つ以上の他の種由来のその抗原にも結合し得る。しかし、そのような種交差反応性は、それ自体で特異的としての抗体の分類を変化させることはない。別の例では、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原の異なる対立遺伝子型にも結合し得る。しかしながら、そのような交差反応性は、それ自体で特異的としての抗体の分類を変化させることはない。場合によっては、「特異的結合」または「特異的に結合」という用語は、抗体、タンパク質、またはペプチドと第２の化学種との相互作用に関して、相互作用が化学種における特定の構造（例えば抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味するために使用することができる；例えば、抗体は、一般的にタンパク質ではなく特定のタンパク質構造を認識して結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識された「Ａ」および抗体を含む反応において、エピトープＡを含む分子（または遊離の非標識Ａ）の存在は、抗体に結合する標識されたＡの量を減少させる。
「遺伝子改変」という用語は、核酸による細胞のトランスフェクションを含む。「トランスフェクション」という用語は、細胞への核酸、特にＲＮＡの導入に関する。本発明の目的のために、「トランスフェクション」という用語はまた、細胞への核酸の導入またはそのような細胞による核酸の取り込みを含み、細胞は、対象、例えば患者に存在し得る。したがって、本発明によれば、本明細書に記載の核酸のトランスフェクションのための細胞は、インビトロまたはインビボで存在することができ、例えば細胞は、患者の器官、組織および／または生物の一部を形成することができる。本発明によれば、トランスフェクションは一過性または安定であり得る。トランスフェクションのいくつかの用途では、トランスフェクトされた遺伝物質が一過性にのみ発現されれば十分である。ＲＮＡを細胞にトランスフェクトして、そのコードされたタンパク質を一過性に発現させることができる。トランスフェクションの過程で導入された核酸は、通常、核ゲノムに組み込まれないため、外来核酸は有糸分裂によって希釈されるかまたは分解される。核酸のエピソーム増幅を可能にする細胞は、希釈率を大幅に低下させる。トランスフェクトされた核酸が実際に細胞およびその娘細胞のゲノムに残ることが望ましい場合は、安定なトランスフェクションが起こらなければならない。そのような安定なトランスフェクションは、トランスフェクション過程で導入された核酸が核ゲノムに組み込まれる場合に起こり得、例えば、トランスフェクションのためにウイルスベースのシステムまたはトランスポゾンベースのシステムを使用することによって達成され得る。一般に、抗原受容体を発現するように遺伝子改変された細胞は、抗原受容体をコードする核酸で安定にトランスフェクトされるが、一般に、抗原をコードする核酸は、細胞に一過性にトランスフェクトされる。
免疫エフェクタ細胞
本発明に関連して使用され、抗原受容体をコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が導入され得る細胞は、特に、溶解能を有する細胞、特にリンパ系細胞などの免疫エフェクタ細胞を含み、好ましくはＴ細胞、特に、好ましくは細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞から選択される細胞傷害性リンパ球である。活性化されると、これらの細胞傷害性リンパ球はそれぞれ標的細胞の破壊を引き起こす。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞は、以下の手段のいずれかまたは両方によって標的細胞の破壊を引き起こす。まず、活性化すると、Ｔ細胞は、パーフォリン、グランザイム、およびグラニュライシンなどの細胞毒を放出する。パーフォリンおよびグラニュライシンは標的細胞に細孔を作り、グランザイムは細胞に進入して、細胞のアポトーシス（プログラム細胞死）を誘導する細胞質のカスパーゼカスケードを引き起こす。第二に、アポトーシスは、Ｔ細胞と標的細胞との間のＦａｓ－Ｆａｓリガンド相互作用を介して誘導され得る。本発明に関連して使用される細胞は、好ましくは自己細胞であるが、異種細胞または同種異系細胞を使用することができる。
本発明の文脈においてまたは「エフェクタ機能」という用語は、例えば、腫瘍細胞などの疾患細胞の死滅、または腫瘍の播種および転移の抑制を含む腫瘍増殖の阻害および／もしくは腫瘍発生の阻害をもたらす免疫系の成分によって媒介される任意の機能を含む。好ましくは、本発明の文脈におけるエフェクタ機能は、Ｔ細胞媒介エフェクタ機能である。そのような機能は、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）の場合、サイトカインの放出ならびに／またはＣＤ８＋リンパ球（ＣＴＬ）および／もしくはＢ細胞の活性化を含み、ＣＴＬの場合、例えばアポトーシスまたはパーフォリン媒介細胞溶解を介した、細胞、すなわち抗原の発現を特徴とする細胞の除去、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αなどのサイトカインの産生、ならびに抗原を発現する標的細胞の特異的細胞溶解死滅を含む。
本発明の文脈において「免疫エフェクタ細胞」または「免疫反応性細胞」という用語は、免疫反応中にエフェクタ機能を発揮する細胞に関する。一実施形態における「免疫エフェクタ細胞」は、細胞上のＭＨＣに関連して提示されるか、または細胞の表面上に発現される抗原などの抗原に結合し、免疫応答を媒介することができる。例えば、免疫エフェクタ細胞は、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、腫瘍浸潤Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージ、および樹状細胞を含む。好ましくは、本発明の文脈において、「免疫エフェクタ細胞」は、Ｔ細胞、好ましくはＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞、最も好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞である。本発明によれば、「免疫エフェクタ細胞」という用語はまた、適切な刺激で免疫細胞（Ｔ細胞、特にＴヘルパー細胞、または細胞溶解性Ｔ細胞など）に成熟することができる細胞を含む。免疫エフェクタ細胞は、ＣＤ３４＋造血幹細胞、未成熟および成熟Ｔ細胞ならびに未成熟および成熟Ｂ細胞を含む。Ｔ細胞前駆体の細胞溶解性Ｔ細胞への分化は、抗原に暴露された場合、免疫系のクローン選択に類似する。
好ましくは、「免疫エフェクタ細胞」は、特にＭＨＣに関連して提示されるか、または癌細胞などの疾患細胞の表面に存在する場合、ある程度の特異性で抗原を認識する。好ましくは、前記認識は、抗原を認識する細胞が応答性または反応性であることを可能にする。細胞がヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）である場合、そのような応答性または反応性は、サイトカインの放出ならびに／またはＣＤ８＋リンパ球（ＣＴＬ）および／もしくはＢ細胞の活性化を含み得る。細胞がＣＴＬである場合、そのような応答性または反応性は、例えばアポトーシスまたはパーフォリン媒介細胞溶解を介した、細胞、すなわち抗原の発現を特徴とする細胞の除去を含み得る。本発明によれば、ＣＴＬ応答性には、持続的なカルシウム流動、細胞分裂、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αなどのサイトカインの産生、ＣＤ４４およびＣＤ６９などの活性化マーカの上方制御、ならびに抗原を発現する標的細胞の特異的細胞溶解性死滅が含まれ得る。ＣＴＬ応答性はまた、ＣＴＬ応答性を正確に示す人工レポータを使用して決定し得る。抗原を認識し、応答性または反応性であるそのようなＣＴＬは、本明細書では「抗原応答性ＣＴＬ」とも称される。
一実施形態では、遺伝子改変された免疫エフェクタ細胞は、ＣＡＲを発現する免疫エフェクタ細胞である。一実施形態では、遺伝子改変された免疫エフェクタ細胞は、ＴＣＲを発現する免疫エフェクタ細胞である。
本発明に従って使用される免疫エフェクタ細胞は、Ｔ細胞受容体またはＢ細胞受容体などの内因性抗原受容体を発現してもよく、または内因性抗原受容体の発現を欠いていてもよい。
「リンパ系細胞」は、任意で適切な修飾後、例えばＴＣＲまたはＣＡＲなどの抗原受容体の移入後に、細胞性免疫応答などの免疫応答を生成することができる細胞、またはそのような細胞の前駆細胞であり、リンパ球、好ましくはＴリンパ球、リンパ芽球、および形質細胞を含む。リンパ系細胞は、本明細書に記載されるような免疫エフェクタ細胞であり得る。好ましいリンパ系細胞は、細胞表面に抗原受容体を発現するように改変することができるＴ細胞である。一実施形態では、リンパ系細胞は、Ｔ細胞受容体の内因性発現を欠く。
「Ｔ細胞」および「Ｔリンパ球」という用語は、本明細書では互換的に使用され、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）および細胞溶解性Ｔ細胞を含む細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）を含む。「抗原特異的Ｔ細胞」という用語または同様の用語は、Ｔ細胞が標的とする抗原を認識し、好ましくはＴ細胞のエフェクタ機能を発揮するＴ細胞に関する。Ｔ細胞が抗原を発現する標的細胞を死滅させる場合、Ｔ細胞は抗原に特異的であると見なされる。Ｔ細胞の特異性は、様々な標準的技術のいずれかを使用して、例えばクロム放出アッセイまたは増殖アッセイ内で評価し得る。あるいは、リンホカイン（インターフェロンγなど）の合成を測定することができる。
Ｔ細胞は、リンパ球として公知の白血球の群に属し、細胞性免疫において中心的な役割を果たす。これらは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と呼ばれるこれらの細胞表面上の特別な受容体の存在によって、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞などの他の種類のリンパ球と区別することができる。胸腺は、Ｔ細胞の成熟に関与する主要な器官である。それぞれ別個の機能を有する、Ｔ細胞のいくつかの異なるサブセットが発見されている。
Ｔヘルパー細胞は、数ある機能の中でも特に、Ｂ細胞の形質細胞への成熟ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫学的プロセスにおいて他の白血球を補助する。これらの細胞は、その表面にＣＤ４糖タンパク質を発現するため、ＣＤ４＋Ｔ細胞としても知られる。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原と共に提示された場合に活性化される。ひとたび活性化されると、これらは速やかに分裂し、能動免疫応答を調節または補助するサイトカインと呼ばれる小さなタンパク質を分泌する。
細胞傷害性Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶反応にも関与する。これらの細胞は、その表面にＣＤ８糖タンパク質を発現するため、ＣＤ８＋Ｔ細胞としても知られる。これらの細胞は、身体のほぼあらゆる細胞の表面上に存在する、ＭＨＣクラスＩに関連する抗原に結合することによってそれらの標的を認識する。
「制御性Ｔ細胞」または「Ｔｒｅｇ」は、免疫系を調節し、自己抗原に対する寛容を維持し、自己免疫疾患を予防するＴ細胞の亜集団である。Ｔｒｅｇは免疫抑制性であり、一般にエフェクタＴ細胞の誘導と増殖を抑制または下方制御する。Ｔｒｅｇは、バイオマーカであるＣＤ４、ＦｏｘＰ３、およびＣＤ２５を発現する。
本明細書で使用される場合、「ナイーブＴ細胞」という用語は、活性化またはメモリＴ細胞とは異なり、末梢内でそれらの同族抗原に遭遇したことがない成熟Ｔ細胞を指す。ナイーブＴ細胞は、一般に、Ｌ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）の表面発現、活性化マーカＣＤ２５、ＣＤ４４またはＣＤ６９の非存在、およびメモリＣＤ４５ＲＯアイソフォームの非存在を特徴とする。
本明細書で使用される場合、「メモリＴ細胞」という用語は、以前にそれらの同族抗原に遭遇し、それに応答したＴ細胞のサブグループまたは亜集団を指す。抗原との２回目の遭遇時に、メモリＴ細胞は、免疫系が抗原に応答した最初の時間よりも速く、より強い免疫応答を開始するように再生され得る。メモリＴ細胞はＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得、通常、ＣＤ４５ＲＯを発現する。
本発明によれば、「Ｔ細胞」という用語はまた、適切な刺激でＴ細胞に成熟することができる細胞を含む。
Ｔ細胞の大部分は、いくつかのタンパク質の複合体として存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する。実際のＴ細胞受容体は、独立したＴ細胞受容体アルファおよびベータ（ＴＣＲαおよびＴＣＲβ）遺伝子から産生され、α－およびβ－ＴＣＲ鎖と呼ばれる２つの別個のペプチド鎖で構成される。γδ Ｔ細胞（ガンマデルタＴ細胞）は、その表面に異なるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞の小さなサブセットである。しかし、γδ Ｔ細胞では、ＴＣＲは１本のγ鎖と１本のδ鎖で構成される。このＴ細胞の群は、αβ Ｔ細胞よりもずっと少ない（全Ｔ細胞の２％）。
全てのＴ細胞は、骨髄の造血幹細胞に由来する。造血幹細胞に由来する造血前駆細胞は胸腺に存在し、細胞分裂によって拡大して未成熟な胸腺細胞の大きな集団を生成する。最初期の胸腺細胞はＣＤ４もＣＤ８も発現せず、したがって、二重陰性（ＣＤ４－ＣＤ８－）細胞として分類される。発達が進むにつれて、それらは二重陽性胸腺細胞（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）になり、最終的に単一陽性（ＣＤ４＋ＣＤ８－またはＣＤ４－ＣＤ８＋）胸腺細胞に成熟し、その後胸腺から末梢組織に放出される。
Ｔ細胞は、一般に、標準的な手順を使用して、インビトロまたはエクスビボで調製し得る。例えば、Ｔ細胞は、市販の細胞分離システムを使用して、患者などの哺乳動物の骨髄、末梢血または骨髄もしくは末梢血の画分から単離し得る。あるいは、Ｔ細胞は、関係のあるまたは関係のないヒト、非ヒト動物、細胞株または培養物に由来し得る。Ｔ細胞を含む試料は、例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であり得る。
本明細書で使用される場合、「ＮＫ細胞」または「ナチュラルキラー細胞」という用語は、ＣＤ５６またはＣＤ１６の発現およびＴ細胞受容体の非存在によって定義される末梢血リンパ球のサブセットを指す。本明細書で提供されるように、ＮＫ細胞はまた、幹細胞または前駆細胞から分化させることもできる。
抗原受容体を発現するための遺伝子改変
免疫エフェクタ細胞などの本明細書に記載の細胞は、特に標的細胞、例えば抗原提示細胞または疾患細胞上に存在するかまたはそれによって提示された場合、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）もしくはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）結合抗原などの抗原受容体またはそのプロセシング産物を発現するように、治療されている対象においてエクスビボ／インビトロまたはインビボで遺伝子改変される。一実施形態では、抗原受容体を発現するための改変は、エクスビボ／インビトロで行われる。その後、改変された細胞を患者に投与し得る。一実施形態では、抗原受容体を発現するための改変はインビボで行われる。細胞は、患者の内因性細胞であってもよく、または患者に投与されていてもよい。
キメラ抗原受容体
キメラ抗原受容体を発現するＣＡＲ操作Ｔ細胞を用いた養子細胞移入療法は、ＣＡＲ修飾Ｔ細胞が実質的に任意の腫瘍抗原を標的とするように操作され得るので、有望な抗癌治療法である。例えば、患者のＴ細胞を、患者の腫瘍細胞上の抗原に特異的に向けられるＣＡＲを発現するように遺伝子操作（遺伝子改変）し、その後患者に注入して戻し得る。
本発明によれば、「ＣＡＲ」（または「キメラ抗原受容体」）という用語は、「キメラＴ細胞受容体」および「人工Ｔ細胞受容体」という用語と同義であり、癌細胞などの標的細胞上の標的構造（例えば抗原）を認識し、すなわち結合し（例えば標的細胞の表面に発現された抗原への抗原結合ドメインの結合によって）、細胞表面に前記ＣＡＲを発現するＴ細胞などの免疫エフェクタ細胞に特異性を付与し得る、単一の分子または分子の複合体を含む人工受容体に関する。そのような細胞は、標的細胞の認識のために抗原のプロセシングおよび提示を必ずしも必要とせず、むしろ、標的細胞上に存在する任意の抗原を、好ましくは特異的に認識し得る。好ましくは、ＣＡＲによる標的構造の認識は、前記ＣＡＲを発現する免疫エフェクタ細胞の活性化をもたらす。ＣＡＲは、本明細書に記載の１つ以上のドメインを含む１つ以上のタンパク質ユニットを含み得る。「ＣＡＲ」という用語は、Ｔ細胞受容体を含まない。
ＣＡＲは、一般にＣＡＲの細胞外ドメインの一部である抗原結合部分または抗原結合ドメインとも称される標的特異的結合要素を含む。抗原結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカとして働くリガンドを認識する。具体的には、本発明のＣＡＲは、腫瘍細胞などの疾患細胞上の腫瘍抗原などの抗原を標的とする。
一実施形態では、ＣＡＲの結合ドメインは、抗原に特異的に結合する。一実施形態では、ＣＡＲ中の結合ドメインが結合する抗原は、癌細胞で発現される（腫瘍抗原）。一実施形態では、抗原は癌細胞の表面に発現される。一実施形態では、結合ドメインは、抗原の細胞外ドメインまたは細胞外ドメインのエピトープに結合する。一実施形態では、結合ドメインは、生細胞の表面に存在する抗原の天然のエピトープに結合する。
本発明の一実施形態では、抗原結合ドメインは、抗原に対する特異性を有する免疫グロブリンの重鎖の可変領域（ＶＨ）と、抗原に対する特異性を有する免疫グロブリンの軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む。一実施形態では、免疫グロブリンは抗体である。一実施形態では、前記重鎖可変領域（ＶＨ）と対応する軽鎖可変領域（ＶＬ）とは、ペプチドリンカーによって連結されている。好ましくは、ＣＡＲ中の抗原結合部分の一部はｓｃＦｖである。
ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合された膜貫通ドメインを含むように設計される。一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ中のドメインの１つと天然には会合していない。一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ中のドメインの１つと天然に会合している。一実施形態では、膜貫通ドメインは、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのそのようなドメインの結合を回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、アミノ酸置換によって改変される。膜貫通ドメインは、天然源または合成源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。本発明において特に使用される膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖またはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４に由来し得る（すなわち、少なくともその膜貫通領域（１つまたは複数）を含む）。あるいは、膜貫通ドメインは合成であってもよく、その場合、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含む。好ましくは、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが合成膜貫通ドメインの各末端に見出される。
場合によっては、本発明のＣＡＲは、膜貫通ドメインと細胞外ドメインとの間の結合を形成するヒンジドメインを含む。
ＣＡＲの細胞質ドメインまたはさもなければ細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲが配置されている免疫細胞の正常なエフェクタ機能の少なくとも１つの活性化を担う。「エフェクタ機能」という用語は、細胞の特殊な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクタ機能は、例えば、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクタ機能シグナルを伝達し、特殊な機能を果たすように細胞に指示するタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を使用することができるが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分が使用される範囲で、そのような短縮部分は、それがエフェクタ機能シグナルを伝達する限り、無傷の鎖の代わりに使用され得る。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクタ機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮部分を含むことを意味する。
ＴＣＲのみを介して生成されるシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であり、二次シグナルまたは共刺激シグナルも必要であることが公知である。したがって、Ｔ細胞の活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列：ＴＣＲを介して抗原依存性の一次活性化を開始するもの（一次細胞質シグナル伝達配列）および抗原非依存的に作用して二次シグナルまたは共刺激シグナルを提供するもの（二次細胞質シグナル伝達配列）によって媒介されると言うことができる。
一実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζに由来する一次細胞質シグナル伝達配列を含む。さらに、ＣＡＲの細胞質ドメインは、共刺激シグナル伝達領域と組み合わされたＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み得る。
共刺激ドメインの同一性は、ＣＡＲによる標的部分の結合時に細胞増殖および生存を増強する能力を有するという点のみに限定される。適切な共刺激ドメインには、ＣＤ２８、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーであるＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＴＮＦＲスーパーファミリーの受容体のメンバーであるＣＤ１３４（ＯＸ４０）、および活性化Ｔ細胞上に発現されるＣＤ２８スーパーファミリーの共刺激分子であるＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）が含まれる。当業者は、これらの記載された共刺激ドメインの配列バリアントが、それらがモデルとするドメインと同じまたは類似の活性を有する場合、本発明に悪影響を及ぼすことなく使用できることを理解する。そのようなバリアントは、それらが由来するドメインのアミノ酸配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有する。本発明のいくつかの実施形態では、ＣＡＲ構築物は２つの共刺激ドメインを含む。特定の組合せには４つの記載されたドメインの全ての可能な変形が含まれるが、具体例にはＣＤ２８＋ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）およびＣＤ２８＋ＣＤ１３４（ＯＸ４０）が含まれる。
ＣＡＲの細胞質シグナル伝達部分内の細胞質シグナル伝達配列は、ランダムな順序または指定された順序で互いに連結され得る。任意で、好ましくは２～１０アミノ酸長の短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーが結合を形成し得る。グリシン－セリンダブレットは、特に適切なリンカーを提供する。
一実施形態では、ＣＡＲは、新生タンパク質を小胞体に向かわせるシグナルペプチドを含む。一実施形態では、シグナルペプチドは抗原結合ドメインに先行する。一実施形態では、シグナルペプチドは、ＩｇＧなどの免疫グロブリンに由来する。
ＣＡＲは、融合タンパク質の形態で一緒に上記ドメインを含み得る。そのような融合タンパク質は、一般に、Ｎ末端からＣ末端の方向に連結された抗原結合ドメイン、１つ以上の共刺激ドメイン、および活性化シグナル伝達ドメインを含む。しかし、本発明のＣＡＲはこの配置に限定されず、他の配置も許容され、結合ドメイン、シグナル伝達ドメイン、および１つ以上の共刺激ドメインを含む。結合ドメインは抗原に自由に結合できなければならないため、融合タンパク質中の結合ドメインの配置は、一般に、細胞の外側で領域の表示が達成される配置であることが理解される。同様に、共刺激およびシグナル伝達ドメインは細胞傷害性リンパ球の活性および増殖を誘導する働きをするため、融合タンパク質は、一般に、細胞の内部でこれら２つのドメインを表示する。
一実施形態では、ＣＡＲ分子は、
ｉ）標的抗原（例えばＣＬＤＮ６またはＣＬＤＮ１８．２）結合ドメイン；
ｉｉ）膜貫通ドメイン；ならびに
ｉｉｉ）４－１ＢＢ共刺激ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメイン
を含む。
一実施形態では、抗原結合ドメインはｓｃＦｖを含む。一実施形態では、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖またはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒａ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤｌｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤｌｌａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌｌｃ、ＩＴＧＢｌ、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭｌ（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬｌ、ＣＤＩＯＯ（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、およびＮＫＧ２Ｃ、またはそれらの機能的バリアントからなる群より選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む。一実施形態では、膜貫通ドメインはＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。一実施形態では、抗原結合ドメインは、ヒンジドメインによって膜貫通ドメインに連結されている。一実施形態では、ヒンジドメインはＣＤ８αヒンジドメインである。
一実施形態では、本発明のＣＡＲ分子は、
ｉ）標的抗原結合ドメイン；
ｉｉ）ＣＤ８αヒンジドメイン；
ｉｉｉ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン；ならびに
ｉｖ）４－１ＢＢ共刺激ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメイン
を含む。
「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリンを含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）および重鎖定常領域からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）と軽鎖定常領域からなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が間に組み入れられた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、次の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクタ細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。抗体は抗原に結合し、好ましくは特異的に結合する。抗体は、天然源または組換え源に由来する無傷の免疫グロブリンであり得、無傷の免疫グロブリンの免疫反応性部分または断片であり得る。抗体は、典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。本発明における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ'）２、ならびに一本鎖抗体およびヒト化抗体を含む様々な形態で存在し得る（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｉｎ：Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８９，ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈｏｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６）。
Ｂ細胞によって発現される抗体は、ＢＣＲ（Ｂ細胞受容体）または抗原受容体と呼ばれることがある。このクラスのタンパク質に含まれる５つのメンバーは、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥである。ＩｇＡは、唾液、涙、母乳、胃腸分泌物、ならびに気道および泌尿生殖路の粘液分泌物などの身体分泌物中に存在する一次抗体である。ＩｇＧは最も一般的な循環抗体である。ＩｇＭは、ほとんどの対象において一次免疫応答で産生される主要な免疫グロブリンである。これは、凝集、補体固定、および他の抗体応答における最も効率的な免疫グロブリンであり、細菌およびウイルスに対する防御に重要である。ＩｇＤは、抗体機能が不明であるが、抗原受容体として機能し得る免疫グロブリンである。ＩｇＥは、アレルゲンへの曝露時に肥満細胞および好塩基球からのメディエータの放出を引き起こすことによって即時型過敏症を媒介する免疫グロブリンである。
「抗体断片」という用語は、無傷の抗体の一部を指し、典型的には、無傷の抗体の抗原決定可変領域を含む。
抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、およびＦｖ断片、線状抗体、ｓｃＦｖ抗体、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「抗体重鎖」は、天然の立体配座で抗体分子に存在する２種類のポリペプチド鎖のうちの大きい方を指す。
本明細書で使用される「抗体軽鎖」は、天然の立体配座で抗体分子に存在する２種類のポリペプチド鎖のうちの小さい方を指し、κ軽鎖およびλ軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
本開示によれば、ＣＡＲは、Ｔ細胞上に存在する場合、上記のようにＴ細胞が刺激される、および／または拡大される、またはエフェクタ機能を発揮するように、抗原提示細胞または癌細胞などの疾患細胞の表面上などの抗原を認識する。
免疫エフェクタ細胞の遺伝子改変
免疫エフェクタ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞の特異的標的化のために本明細書に記載のＤＡＲＰｉｎで官能化された本明細書に記載の粒子は、抗原受容体をコードする核酸をＴ細胞などの免疫エフェクタ細胞に送達して、抗原受容体を発現するように遺伝子改変された細胞を産生するために、エクスビボ／インビトロまたはインビボで使用し得る。そのような遺伝子改変には、非ウイルスベースのＤＮＡトランスフェクション、非ウイルスベースのＲＮＡトランスフェクション、例えばｍＲＮＡトランスフェクション、トランスポゾンベースのシステム、およびウイルスベースのシステムが含まれる。非ウイルスベースのＤＮＡトランスフェクションは、挿入突然変異誘発のリスクが低い。トランスポゾンベースのシステムは、組み込み要素を含まないプラスミドよりも効率的に導入遺伝子を組み込むことができる。ウイルスベースのシステムには、γ－レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターの使用が含まれる。γ－レトロウイルスは、比較的容易に産生され、Ｔ細胞を効率的かつ永続的に形質導入し、初代ヒトＴ細胞への組み込みの観点から安全であることが予備的に証明されている。レンチウイルスベクターも、Ｔ細胞を効率的かつ永続的に形質導入するが、製造コストがより高い。それらはまた、潜在的にレトロウイルスベースのシステムよりも安全である。
本発明の全ての態様の一実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体を、抗原受容体をコードする核酸でエクスビボまたはインビボのいずれかでトランスフェクトする。一実施形態では、エクスビボトランスフェクションとインビボトランスフェクションの組合せを使用し得る。本発明の全ての態様の一実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体は、治療される対象に由来する。本発明の全ての態様の一実施形態では、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体は、治療される対象とは異なる対象に由来する。
本発明の一態様では、ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｔ細胞を標的とする本明細書に記載のナノ粒子などの粒子を使用して、インビボで、したがってほぼ瞬時に産生し得る。例えば、脂質および／またはポリマーベースのナノ粒子を、Ｔ細胞上のＣＤ８に結合するためにＣＤ８特異的ＤＡＲＰｉｎにカップリングし得る。Ｔ細胞に結合すると、これらのナノ粒子はエンドサイトーシスされる。それらの内容物、例えば抗原受容体をコードする核酸、例えば抗腫瘍抗原ＣＡＲをコードするプラスミドＤＮＡは、例えば微小管関連配列（ＭＴＡＳ）および核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含有するペプチドを含むため、Ｔ細胞核に向けられ得る。抗原受容体をコードする核酸、例えばＣＡＲ遺伝子発現カセットに隣接するトランスポゾン、および高活性トランスポザーゼをコードする別個の核酸、例えばプラスミドを含めることにより、抗原受容体をコードする核酸、例えばＣＡＲベクターの染色体への効率的な組み込みを可能にし得る。
別の可能性は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法を使用して、ＣＡＲコード配列などの抗原受容体コード配列を特定の遺伝子座に意図的に配置することである。例えば、ＣＡＲをノックインし、それを、さもなければＴＣＲ発現を抑える内因性プロモータの動的調節制御下に置く一方で、既存のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をノックアウトし得る。
したがって、抗原受容体をコードする核酸に加えて、本明細書に記載の粒子はまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のような（もしくは関連する）遺伝子編集ツール、またはスリーピングビューティもしくはピギーバッグのようなトランスポゾンシステムをカーゴとして送達し得る。ゲノム組み込み／編集のためのそのようなツール（例えばトランスポザーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のような遺伝子編集ツール）は、タンパク質またはコード核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）として送達され得る。それにもかかわらず、ｍＲＮＡの送達もまた、ＣＡＲまたはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のような抗原受容体の一過性発現を誘導するための選択肢である。
本発明の全ての態様の一実施形態では、抗原受容体を発現するように遺伝子改変された細胞は、抗原受容体をコードする核酸で安定にまたは一過性にトランスフェクトされる。したがって、抗原受容体をコードする核酸は、細胞のゲノムに組み込まれるか、または組み込まれない。
本発明の全ての態様の一実施形態では、抗原受容体を発現するように遺伝子改変された細胞は、内因性Ｔ細胞受容体および／または内因性ＨＬＡの発現について不活性化されている。
本発明の全ての態様の一実施形態では、本明細書に記載の細胞は、治療される対象に対して自家、同種異系または同系であり得る。一実施形態では、本開示は、患者からの細胞の除去およびその後の患者への細胞の再送達を想定する。一実施形態では、本開示は、患者からの細胞の除去を想定しない。後者の場合、細胞の遺伝子改変の全ての工程はインビボで実施される。
「自家」という用語は、同じ対象に由来するものを表すために使用される。例えば、「自家移植」は、同じ対象に由来する組織または器官の移植を指す。そのような手順は、さもなければ拒絶反応をもたらす免疫学的障壁を克服するので、有利である。
「同種異系」という用語は、同じ種の異なる個体に由来するものを表すために使用される。２つ以上の個体は、１つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でない場合、互いに同種異系であると言われる。
「同系」という用語は、同一の遺伝子型を有する個体または組織、すなわち、一卵性双生児もしくは同じ近交系の動物、またはそれらの組織に由来するものを表すために使用される。
「異種」という用語は、複数の異なる要素からなるものを表すために使用される。一例として、ある個体の骨髄を異なる個体に移入することは、異種移植を構成する。異種遺伝子は、対象以外の供給源に由来する遺伝子である。
核酸含有粒子
本開示の文脈において、「粒子」という用語は、分子または分子複合体によって形成される構造化された実体に関する。一実施形態では、「粒子」という用語は、媒体中に分散したマイクロサイズまたはナノサイズの緻密な構造体などのマイクロサイズまたはナノサイズの構造体に関する。一実施形態では、粒子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはそれらの混合物を含む粒子などの核酸含有粒子である。
ポリマーおよび脂質などの正に帯電した分子と負に帯電した核酸との間の静電相互作用は、粒子形成に関与する。これは、複合体化と核酸粒子の自発的形成をもたらす。一実施形態では、核酸粒子はナノ粒子である。
本開示で使用される場合、「ナノ粒子」は、非経口投与に適した平均直径を有する粒子を指す。
「核酸粒子」を使用して、目的の標的部位（例えば細胞、組織、器官など）に核酸を送達することができる。核酸粒子は、ＤＯＴＡＰなどの少なくとも１つのカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質、プロタミンなどの少なくとも１つのカチオン性ポリマー、またはそれらの混合物および核酸から形成され得る。核酸粒子には、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）ベースおよびリポプレックス（ＬＰＸ）ベースの製剤が含まれる。
いかなる理論にも拘束されることを意図するものではないが、カチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質およびカチオン性ポリマーは、核酸と一緒になって凝集体を形成し、この凝集はコロイド的に安定な粒子をもたらすと考えられる。
一実施形態では、本明細書に記載の粒子は、カチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質以外の少なくとも１つの脂質または脂質様物質、カチオン性ポリマー以外の少なくとも１つのポリマー、またはそれらの混合物をさらに含む。
いくつかの実施形態では、核酸粒子は複数の種類の核酸分子を含み、核酸分子の分子パラメータは、モル質量または分子構造、キャッピング、コード領域もしくは他の特徴などの基本的な構造要素に関してのように、互いに類似し得るかまたは異なり得る。本明細書に記載の核酸粒子は、一実施形態では、約３０ｎｍ～約１０００ｎｍ、約５０ｎｍ～約８００ｎｍ、約７０ｎｍ～約６００ｎｍ、約９０ｎｍ～約４００ｎｍ、または約１００ｎｍ～約３００ｎｍの範囲の平均直径を有し得る。
例えば本明細書に記載の工程によって生成された本明細書に記載の核酸粒子は、約０．５未満、約０．４未満、約０．３未満、または約０．２以下の多分散指数を示す。例として、核酸粒子は、約０．１～約０．３または約０．２～約０．３の範囲の多分散性指数を示し得る。
本明細書に記載の核酸粒子は、少なくとも１つのカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質および／または少なくとも１つのカチオン性ポリマーからコロイドを得ること、ならびにコロイドを核酸と混合して核酸粒子を得ることを含み得る広範囲の方法を使用して調製することができる。
本明細書で使用される「コロイド」という用語は、分散した粒子が沈降しない均一な混合物の一種に関する。混合物中の不溶性粒子は微視的であり、粒径は１～１０００ナノメートルである。混合物は、コロイドまたはコロイド懸濁液と称され得る。「コロイド」という用語は、混合物中の粒子のみを指し、懸濁液全体を指すのではない場合がある。
少なくとも１つのカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質および／または少なくとも１つのカチオン性ポリマーを含むコロイドの調製のために、リポソーム小胞を調製するために従来使用され、適切に適合された方法が本明細書で適用可能である。リポソーム小胞を調製するために最も一般的に使用される方法は、以下の基本的な段階を共有する：（ｉ）有機溶媒中での脂質溶解、（ｉｉ）得られた溶液の乾燥、および（ｉｉｉ）乾燥した脂質の水和（様々な水性媒体を使用して）。
膜水和法では、脂質を最初に適切な有機溶媒に溶解し、乾燥させてフラスコの底部に薄膜を得る。得られた脂質膜を、適切な水性媒体を用いて水和し、リポソーム分散液を得る。さらに、さらなる小型化工程が含まれてもよい。
逆相蒸発は、水相と脂質を含有する有機相との間の油中水型エマルジョンの形成を含む、リポソーム小胞を調製するための膜水和の代替方法である。この混合物の短時間の超音波処理は、系の均質化のために必要である。減圧下での有機相の除去により、その後リポソーム懸濁液に変わる乳白色のゲルが得られる。
有機溶媒を含まない特性を有する他の方法もまた、コロイドを調製するために本開示に従って使用し得る。
ＬＮＰは、典型的には、４つの成分：イオン化可能なカチオン性脂質、リン脂質、コレステロール、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質からなる。各成分はペイロード保護を担い、有効な細胞内送達を可能にする。ＬＮＰは、エタノールに溶解した脂質を水性緩衝液中で核酸と迅速に混合することによって調製し得る。
「平均直径」という用語は、いわゆるキュムラントアルゴリズムを使用したデータ分析を伴う動的レーザー光散乱（ＤＬＳ）によって測定される粒子の平均流体力学的直径を指し、結果として、長さの次元を有するいわゆるＺ平均、および無次元である多分散指数（ＰＩ）を提供する（Ｋｏｐｐｅｌ，Ｄ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．５７，１９７２，ｐｐ４８１４－４８２０，ＩＳＯ１３３２１）。ここで、粒子の「平均直径」、「直径」または「サイズ」は、このＺ平均の値と同義で使用される。
「多分散指数」は、好ましくは、「平均直径」の定義で言及されているように、いわゆるキュムラント解析による動的光散乱測定に基づいて計算される。特定の前提条件の下で、これは、ナノ粒子の集合体のサイズ分布の尺度と見なすことができる。
様々な種類の核酸含有粒子が微粒子形態の核酸の送達に適することが以前に記述されている（例えばＫａｃｚｍａｒｅｋ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９，６０）。非ウイルス核酸送達ビヒクルの場合、核酸のナノ粒子封入は核酸を分解から物理的に保護し、特定の化学的性質に応じて、細胞の取り込みおよびエンドソーム脱出を助けることができる。
本開示は、核酸、少なくとも１つのカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質、および／または核酸と会合して核酸粒子を形成する少なくとも１つのカチオン性ポリマーを含む粒子、ならびにそのような粒子を含む組成物を記載する。核酸粒子は、非共有結合相互作用によって様々な形態で粒子に複合体化される核酸を含み得る。本明細書に記載の粒子は、ウイルス粒子、特に感染性ウイルス粒子ではない、すなわち、それらは細胞にウイルス感染することができない。
適切なカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質およびカチオン性ポリマーは、核酸粒子を形成するものであり、「粒子形成成分」または「粒子形成剤」という用語に含まれる。「粒子形成成分」または「粒子形成剤」という用語は、核酸と会合して核酸粒子を形成する任意の成分に関する。そのような成分には、核酸粒子の一部であり得る任意の成分が含まれる。
カチオン性ポリマー
ポリマーは、それらの高度な化学的柔軟性を考慮して、ナノ粒子ベースの送達のために一般的に使用される材料である。典型的には、カチオン性ポリマーは、負に帯電した核酸をナノ粒子に静電的に凝縮するために使用される。これらの正に帯電した基は、多くの場合、５．５～７．５のｐＨ範囲でプロトン化の状態を変化させるアミンからなり、エンドソーム破裂をもたらすイオンの不均衡につながると考えられている。ポリ－Ｌ－リジン、ポリアミドアミン、プロタミンおよびポリエチレンイミンなどのポリマー、ならびにキトサンなどの天然に存在するポリマーは全て核酸送達に適用されており、本明細書におけるカチオン性ポリマーとして適している。さらに、一部の研究者は、特に核酸送達のためのポリマーを合成した。ポリ（β－アミノエステル）は、特に、その合成の容易さと生分解性のために、核酸送達において広く使用されている。そのような合成ポリマーは、本明細書におけるカチオン性ポリマーとしても適している。
本明細書で使用される「ポリマー」は、その通常の意味、すなわち共有結合によって連結された１つ以上の繰り返し単位（モノマー）を含む分子構造体という意味を与えられる。繰り返し単位は、全て同一であり得るか、または場合によっては、ポリマー内に複数の種類の繰り返し単位が存在し得る。場合によっては、ポリマーは生物学的に誘導される、すなわちタンパク質などの生体高分子である。場合によっては、さらなる部分、例えば本明細書に記載されるような標的化部分もポリマー中に存在し得る。
複数の種類の繰り返し単位がポリマー内に存在する場合、そのポリマーは「コポリマー」であると言われる。本明細書で使用されるポリマーはコポリマーであり得ることが理解されるべきである。コポリマーを形成する繰り返し単位は、任意の方法で配置され得る。例えば、繰り返し単位は、ランダムな順序で、交互の順序で、または「ブロック」コポリマーとして、すなわち、それぞれが第１の繰り返し単位（例えば第１のブロック）を含む１つ以上の領域、およびそれぞれが第２の繰り返し単位（例えば第２のブロック）を含む１つ以上の領域、等を含むコポリマーとして配置され得る。ブロックコポリマーは、２つ（ジブロックコポリマー）、３つ（トリブロックコポリマー）、またはそれ以上の数の別個のブロックを有することができる。
特定の実施形態では、ポリマーは生体適合性である。生体適合性ポリマーは、典型的には、中程度の濃度では有意な細胞死を引き起こさないポリマーである。特定の実施形態では、生体適合性ポリマーは生分解性であり、すなわちポリマーは、体内などの生理学的環境内で、化学的および／または生物学的に分解することができる。
特定の実施形態では、ポリマーは、プロタミンまたはポリアルキレンイミン、特にプロタミンであり得る。
「プロタミン」という用語は、アルギニンに富み、様々な動物（魚類など）の精子細胞中で体細胞ヒストンの代わりに特にＤＮＡと会合して見出される、比較的低分子量の様々な強塩基性タンパク質のいずれかを指す。特に、「プロタミン」という用語は、強塩基性で、水に可溶性であり、熱によって凝固せず、加水分解時に主にアルギニンを生成する、魚類の精子に見出されるタンパク質を指す。精製形態では、それらは、インスリンの長時間作用型製剤において、ヘパリンの抗凝固作用を中和するために使用される。
本開示によれば、本明細書で使用される「プロタミン」という用語は、天然源または生物学的供給源から得られるまたはそれに由来する任意のプロタミンアミノ酸配列およびその断片、および前記アミノ酸配列またはその断片の多量体形態、ならびに人工の、特定の目的のために特別に設計された、天然源または生物学的供給源から単離することができない（合成された）ポリペプチドを含むことが意図されている。
一実施形態では、ポリアルキレンイミンは、ポリエチレンイミンおよび／またはポリプロピレンイミン、好ましくはポリエチレンイミンを含む。好ましいポリアルキレンイミンはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。ＰＥＩの平均分子量は、好ましくは０．７５×１０２～１０７Ｄａ、好ましくは１０００～１０５Ｄａ、より好ましくは１００００～４００００Ｄａ、より好ましくは１５０００～３００００Ｄａ、さらにより好ましくは２００００～２５０００Ｄａである。
本開示によれば、直鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などの直鎖状ポリアルキレンイミンが好ましい。
本明細書での使用が企図されるカチオン性ポリマー（ポリカチオン性ポリマーを含む）には、核酸に静電的に結合することができる任意のカチオン性ポリマーが含まれる。一実施形態では、本明細書での使用が企図されるカチオン性ポリマーは、例えば核酸と複合体を形成することによって、または核酸が封入もしくはカプセル化された小胞を形成することによって、核酸が会合することができる任意のカチオン性ポリマーを含む。
本明細書に記載の粒子はまた、カチオン性ポリマー以外のポリマー、すなわち非カチオン性ポリマーおよび／またはアニオン性ポリマーを含み得る。集合的に、アニオン性および中性ポリマーは、本明細書では非カチオン性ポリマーと称される。
脂質および脂質様物質
「脂質」および「脂質様物質」という用語は、本明細書では、１つ以上の疎水性部分または基、および任意で１つ以上の親水性部分または基も含む分子として広く定義される。疎水性部分と親水性部分を含む分子はまた、しばしば両親媒性物質として示される。脂質は通常、水に難溶性である。水性環境では、両親媒性の性質は、分子が組織化された構造体と様々な相に自己集合することを可能にする。それらの相の１つは、水性環境で小胞、多層／単層リポソーム、または膜に存在するような脂質二重層からなる。疎水性は、長鎖飽和および不飽和脂肪族炭化水素基、ならびに１つ以上の芳香族、脂環式、または複素環式基で置換されたそのような基を含むがこれらに限定されない、無極性基を含むことによって付与され得る。親水性基は、極性および／または荷電基を含み得、炭水化物、リン酸基、カルボン酸基、硫酸基、アミノ基、スルフヒドリル基、ニトロ基、ヒドロキシル基、および他の同様の基を含む。
本明細書で使用される場合、「両親媒性」という用語は、極性部分と非極性部分の両方を有する分子を指す。多くの場合、両親媒性化合物は、長い疎水性尾部に結合した極性頭部を有する。いくつかの実施形態では、極性部分は水に可溶性であるが、非極性部分は水に不溶性である。さらに、極性部分は、形式正電荷または形式負電荷のいずれかを有し得る。あるいは、極性部分は、形式正電荷と形式負電荷の両方を有し得、双性イオンまたは内部塩であり得る。本開示の目的のために、両親媒性化合物は、１つ以上の天然または非天然脂質および脂質様化合物であり得るが、これらに限定されない。
「脂質様物質」、「脂質様化合物」または「脂質様分子」という用語は、構造的および／または機能的に脂質に関連するが、厳密な意味で脂質とは見なされ得ない物質に関する。例えば、この用語には、水性環境で小胞、多層／単層リポソーム、または膜に存在するような両親媒性層を形成することができる化合物が含まれ、界面活性剤、または親水性部分と疎水性部分の両方を有する合成化合物が含まれる。一般的に言えば、この用語は、脂質の構造と類似していても類似していなくてもよい、異なる構造組織を有する親水性部分と疎水性部分を含む分子を指す。本明細書で使用される場合、「脂質」という用語は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、脂質および脂質様物質の両方を包含すると解釈されるべきである。
両親媒性層に含まれ得る両親媒性化合物の具体的な例には、リン脂質、アミノ脂質およびスフィンゴ脂質が含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、両親媒性化合物は脂質である。「脂質」という用語は、水に不溶性であるが、多くの有機溶媒には可溶性であることを特徴とする有機化合物の群を指す。一般に、脂質は、８つのカテゴリ：脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、ポリケチド（ケトアシルサブユニットの縮合に由来する）、ステロール脂質、およびプレノール脂質（イソプレンサブユニットの縮合に由来する）に分けられ得る。「脂質」という用語は時に脂肪の同義語として使用されるが、脂肪はトリグリセリドと呼ばれる脂質のサブグループである。脂質はまた、脂肪酸およびそれらの誘導体（トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、およびリン脂質を含む）などの分子、ならびにコレステロールなどのステロール含有代謝物を包含する。
脂肪酸、または脂肪酸残基は、カルボン酸基で終わる炭化水素鎖でできている分子の多様な群である；この配置は分子に、極性の親水性末端と水に不溶性の非極性の疎水性末端を付与する。典型的には４～２４炭素長である炭素鎖は、飽和または不飽和であり得、酸素、ハロゲン、窒素、および硫黄を含む官能基に結合し得る。脂肪酸が二重結合を含む場合、シスまたはトランス幾何異性の可能性があり、これは分子の立体配置に有意な影響を及ぼす。シス二重結合は、脂肪酸鎖内のより多くの二重結合と複合する影響である、脂肪酸鎖の屈曲を生じさせる。脂肪酸カテゴリの他の主要な脂質クラスは、脂肪酸エステルおよび脂肪酸アミドである。
グリセロ脂質は、一置換、二置換、および三置換グリセロールで構成され、最もよく知られているのは、トリグリセリドと呼ばれるグリセロールの脂肪酸トリエステルである。「トリアシルグリセロール」という語は、時に「トリグリセリド」と同義に使用される。これらの化合物では、グリセロールの３つのヒドロキシル基はそれぞれ、典型的には異なる脂肪酸によって、エステル化されている。グリセロ脂質のさらなるサブクラスは、グリコシド結合を介してグリセロールに結合した１つ以上の糖残基の存在を特徴とする、グリコシルグリセロールによって代表される。
グリセロリン脂質は、エステル結合によって２つの脂肪酸由来の「尾部」に、およびリン酸エステル結合によって１つの「頭部」基に結合したグリセロールコアを含む両親媒性分子（疎水性領域と親水性領域の両方を含む）である。通常はリン脂質と称される（スフィンゴミエリンもリン脂質として分類されるが）グリセロリン脂質の例は、ホスファチジルコリン（ＰＣ、ＧＰＣｈｏまたはレシチンとしても公知）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥまたはＧＰＥｔｎ）、およびホスファチジルセリン（ＰＳまたはＧＰＳｅｒ）である。
スフィンゴ脂質は、共通の構造的特徴であるスフィンゴイド塩基骨格を共有する化合物の複雑なファミリーである。哺乳動物における主要なスフィンゴイド塩基は、一般にスフィンゴシンと称される。セラミド（Ｎ－アシル－スフィンゴイド塩基）は、アミド結合脂肪酸を有するスフィンゴイド塩基誘導体の主要なサブクラスである。脂肪酸は、典型的には飽和または一不飽和で、１６～２６炭素原子の鎖長を有する。哺乳動物の主要なスフィンゴリン脂質はスフィンゴミエリン（セラミドホスホコリン）であるが、昆虫は主にセラミドホスホエタノールアミンを含み、真菌はフィトセラミドホスホイノシトールとマンノース含有頭部基を有する。スフィンゴ糖脂質は、グリコシド結合を介してスフィンゴイド塩基に結合した１つ以上の糖残基で構成される分子の多様なファミリーである。これらの例は、セレブロシドおよびガングリオシドなどの単純なおよび複雑なスフィンゴ糖脂質である。
コレステロールおよびその誘導体、またはトコフェロールおよびその誘導体などのステロール脂質は、グリセロリン脂質およびスフィンゴミエリンと共に膜脂質の重要な成分である。
糖脂質は、脂肪酸が糖骨格に直接結合し、膜二重層と適合性である構造を形成する化合物を表す。糖脂質では、単糖がグリセロ脂質およびグリセロリン脂質に存在するグリセロール骨格の代わりになる。最もよく知られている糖脂質は、グラム陰性菌のリポ多糖のリピドＡ成分のアシル化グルコサミン前駆体である。典型的なリピドＡ分子は、７本もの脂肪アシル鎖で誘導体化されている、グルコサミンの二糖類である。大腸菌での増殖に必要な最小限のリポ多糖は、２つの３－デオキシ－Ｄ－マンノ－オクツロソン酸（Ｋｄｏ）残基でグリコシル化されたグルコサミンのヘキサアシル化二糖である、Ｋｄｏ２－リピドＡである。
ポリケチドは、古典的な酵素、ならびに脂肪酸シンターゼと機構的特徴を共有する反復およびマルチモジュラー酵素によるアセチルおよびプロピオニルサブユニットの重合によって合成される。それらは、動物、植物、細菌、真菌、および海洋源からの多数の二次代謝物および天然産物を含み、大きな構造的多様性を有する。多くのポリケチドは、その骨格がしばしばグリコシル化、メチル化、ヒドロキシル化、酸化、または他の工程によってさらに修飾される環状分子である。
本開示によれば、脂質および脂質様物質は、カチオン性、アニオン性または中性であり得る。中性脂質または脂質様物質は、選択されたｐＨで非荷電または中性の双性イオン形態で存在する。
カチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質
本明細書に記載の核酸粒子は、粒子形成剤として少なくとも１つのカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質を含む。本明細書での使用が企図されるカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質は、核酸に静電的に結合することができる任意のカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質を含む。一実施形態では、本明細書での使用が企図されるカチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質は、例えば核酸と複合体を形成することによって、または核酸が封入もしくはカプセル化された小胞を形成することによって、核酸と会合することができる。
本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」または「カチオン性脂質様物質」は、正味の正電荷を有する脂質または脂質様物質を指す。カチオン性脂質または脂質様物質は、静電相互作用によって負に帯電した核酸に結合する。一般に、カチオン性脂質は、ステロール、アシル鎖、ジアシル鎖またはそれ以上のアシル鎖などの親油性部分を有し、脂質の頭部基は、典型的には正電荷を担持する。
特定の実施形態では、カチオン性脂質または脂質様物質は、特定のｐＨ、特に酸性ｐＨでのみ正味の正電荷を有するが、好ましくは正味の正電荷を有さず、好ましくは電荷を有さず、すなわち、生理的ｐＨなどの異なる、好ましくはより高いｐＨでは中性である。このイオン化可能な挙動は、生理的ｐＨでカチオン性のままである粒子と比較して、エンドソーム脱出を助け、毒性を低減することを介して有効性を高めると考えられる。
本開示の目的のために、そのような「カチオンにイオン化可能な」脂質または脂質様物質は、状況と矛盾しない限り、「カチオン性脂質または脂質様物質」という用語に含まれる。
一実施形態では、カチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質は、正に帯電しているかまたはプロトン化され得る少なくとも１つの窒素原子（Ｎ）を含む頭部基を含む。
カチオン性脂質の例には、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシプロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、３－（Ｎ－（Ｎ'，Ｎ'－ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）；１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）；１，２－ジアシルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン；１，２－ジアルキルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン；ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、２，３－ジ（テトラデコキシ）プロピル－（２－ヒドロキシエチル）ジメチルアザニウム（ＤＭＲＩＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＭＥＰＣ）、ｌ，２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、１，２－ジオレイルオキシプロピル－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、および２，３－ジオレオイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－プロパナミウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、３－ジメチルアミノ－２－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－１－（シス、シス－９，１２－オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２－［５'－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３'－オキサペントキシ）－３－ジメチル－１－（シス、シス－９'，１２'－オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２－Ｎ，Ｎ'－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、２，３－ジリノレオイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロピルアミン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－Ｎ，Ｎ'－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、１，２－ジリノレオイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＣＤＡＰ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、（±）－Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（シス－９－テトラデセニルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（ＧＡＰ－ＤＭＯＲＩＥ）、（±）－Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（ドデシルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（ＧＡＰ－ＤＬＲＩＥ）、（±）－Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（ＧＡＰ－ＤＭＲＩＥ）、Ｎ－（２－アミノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（βＡＥ－ＤＭＲＩＥ）、Ｎ－（４－カルボキシベンジル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（オレオイルオキシ）プロパン－１－アミニウム（ＤＯＢＡＱ）、２－（｛８－［（３β）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル｝オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジミリストイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＤＡＰ）、１，２－ジパルミトイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＤＡＰ）、Ｎ１－［２－（（１Ｓ）－１－［（３－アミノプロピル）アミノ］－４－［ジ（３－アミノ－プロピル）アミノ］ブチルカルボキサミド）エチル］－３，４－ジ［オレイルオキシ］－ベンズアミド（ＭＶＬ５）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、２，３－ビス（ドデシルオキシ）－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロパン－１－アモニウムブロミド（ＤＬＲＩＥ）、Ｎ－（２－アミノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）プロパン－１－アミニウムブロミド（ＤＭＯＲＩＥ）、ジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）８，８'－（（（（２（ジメチルアミノ）エチル）チオ）カルボニル）アザンジイル）ジオクタノエート（ＡＴＸ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（ドデシルオキシ）プロパン－１－アミン（ＤＬＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（テトラデシルオキシ）プロパン－１－アミン（ＤＭＤＭＡ）、ジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）－９－（（４－（ジメチルアミノブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）、Ｎ－ドデシル－３－（（２－ドデシルカルバモイル－エチル）－｛２－［（２－ドデシルカルバモイル－エチル）－２－｛（２－ドデシルカルバモイル－エチル）－［２－（２－ドデシルカルバモイル－エチルアミノ）エチル］－アミノ｝－エチルアミノ）プロピオンアミド（リピドイド９８Ｎ１２－５）、１－［２－［ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ］エチル－［２－［４－［２－［ビス（２ヒドロキシドデシル）アミノ］エチル］ピペラジン－１－イル］エチル］アミノ］ドデカン－２－オール（リピドイドＣ１２－２００）が含まれるが、これらに限定されない。ＤＯＴＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＤＡＣ、およびＤＯＳＰＡが好ましい。特定の実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質はＤＯＴＡＰである。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約１０モル％～約１００モル％、約２０モル％～約１００モル％、約３０モル％～約１００モル％、約４０モル％～約１００モル％、または約５０モル％～約１００モル％を構成し得る。
さらなる脂質または脂質様物質
本明細書に記載の粒子はまた、カチオン性またはカチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質以外の脂質または脂質様物質、すなわち非カチオン性脂質または脂質様物質（非カチオンにイオン化可能な脂質または脂質様物質を含む）を含み得る。集合的に、アニオン性および中性脂質または脂質様物質は、本明細書では非カチオン性脂質または脂質様物質と称される。イオン化可能／カチオン性脂質または脂質様物質に加えて、コレステロールおよび脂質などの他の疎水性部分を添加することによって核酸粒子の製剤を最適化することにより、粒子の安定性および核酸送達の有効性を高め得る。
核酸粒子の全体的な電荷に影響を及ぼしても及ぼさなくてもよいさらなる脂質または脂質様物質を組み込み得る。特定の実施形態では、さらなる脂質または脂質様物質は、非カチオン性脂質または脂質様物質である。非カチオン性脂質は、例えば１つ以上のアニオン性脂質および／または中性脂質を含み得る。本明細書で使用される場合、「中性脂質」は、選択されたｐＨで非荷電または中性の双性イオン形態で存在する多数の脂質種のいずれかを指す。好ましい実施形態では、さらなる脂質は、以下の中性脂質成分：（１）リン脂質、（２）コレステロールもしくはその誘導体、または（３）リン脂質とコレステロールもしくはその誘導体の混合物のうちの１つを含む。コレステロール誘導体の例には、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル－２'－ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル－４'－ヒドロキシブチルエーテル、トコフェロールおよびそれらの誘導体、ならびにそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。
使用できる具体的なリン脂質には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンまたはスフィンゴミエリンが含まれるが、これらに限定されない。そのようなリン脂質には、特に、ジアシルホスファチジルコリン、例えばジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジペンタデカノイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジアラキドイルホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジベヘノイルホスファチジルコリン（ＤＢＰＣ）、ジトリコサノイルホスファチジルコリン（ＤＴＰＣ）、ジリグノセロイルファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）およびホスファチジルエタノールアミン、特にジアシルホスファチジルエタノールアミン、例えばジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジラウロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、ジフィタノイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）、および様々な疎水性鎖を有するさらなるホスファチジルエタノールアミン脂質が含まれる。
特定の好ましい実施形態では、さらなる脂質は、ＤＳＰＣ、またはＤＳＰＣとコレステロールである。
特定の実施形態では、核酸粒子は、カチオン性脂質とさらなる脂質の両方を含む。例示的な実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＴＡＰであり、さらなる脂質はＤＳＰＣまたはＤＳＰＣとコレステロールである。
理論に拘束されることを望むものではないが、少なくとも１つのさらなる脂質の量と比較した少なくとも１つのカチオン性脂質の量は、電荷、粒径、安定性、組織選択性、および核酸の生物活性などの重要な核酸粒子特性に影響を及ぼし得る。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質と少なくとも１つのさらなる脂質とのモル比は、約１０：０～約１：９、約４：１～約１：２、または約３：１～約１：１である。
いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質、特に中性脂質（例えば１つ以上のリン脂質および／またはコレステロール）は、粒子中に存在する総脂質の約０モル％～約９０モル％、約０モル％～約８０モル％、約０モル％～約７０モル％、約０モル％～約６０モル％、または約０モル％～約５０モル％を構成し得る。
標的分子
ポリマー、脂質および／または脂質様物質などの本明細書に記載の粒子形成成分の１つ以上は、粒子を免疫エフェクタ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞などのＴ細胞に向かわせる１つ以上のＤＡＲＰｉｎを含み得るか、またはそれで官能化され得る。ＤＡＲＰｉｎは、脂質、脂質様物質またはポリマーなどの任意の粒子形成成分にコンジュゲートされ得る、特に共有結合もしくは非共有結合され得るか、または連結され得る。
本明細書では、特に、脂質またはタンパク質などの核酸粒子成分に融合された場合、ＣＤ８に特異的に結合し、ＤＡＲＰｉｎで官能化されていない粒子と比較してインビトロおよびインビボでＣＤ８＋Ｔ細胞のトランスフェクションの増加を示すＤＡＲＰｉｎが提供される。
ＣＤ８は、Ｔリンパ球の細胞傷害性サブセットの主要マーカである。ＣＤ８は、免疫細胞の表面上にジスルフィド結合ホモまたはヘテロ二量体分子として発現されるＩ型１回膜貫通タンパク質である。ＣＤ８ヘテロ二量体は、ＣＤ８α鎖およびＣＤ８β鎖からなり、未成熟ＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性胸腺細胞および成熟末梢細胞傷害性αβ Ｔ細胞の表面上にのみ発現される。ホモ二量体は、２つのＣＤ８α鎖からなり、はるかに広範囲の免疫細胞上で発現を示す。古典的な細胞傷害性αβ Ｔ細胞および胸腺細胞に加えて、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）のサブセット、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞亜集団上に見出される。ＣＤ８αβおよびＣＤ８ααの両方がＭＨＣ－Ｉ結合を媒介することができる；それでも、ヘテロ二量体型は、ＭＨＣ－Ｉ拘束性細胞傷害性Ｔ細胞の表面においてより優勢である。注目すべきことに、ＣＤ８ββホモ二量体は天然には存在しない。
「ＤＡＲＰｉｎ」という用語は、設計されたアンキリンリピートタンパク質を指す。ＤＡＲＰｉｎは、天然に存在するアンキリンリピートタンパク質に基づくが、例えば、標的分子に対するそれらの結合親和性、それらの細胞表面発現などに影響を及ぼし得る１つ以上のアミノ酸変異を含む。ＤＡＲＰｉｎは、好ましくは、ＮおよびＣキャッピングリピートに隣接する２～３個のアンキリンリピートモジュールを含む。各アンキリンリピートモジュールは、約３３個のアミノ酸残基を含む。
アンキリンリピートタンパク質は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）およびカエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）における４つのそのようなタンパク質間の配列比較を通して１９８７年に同定された。ＢｒｅｅｄｅｎとＮａｓｍｙｔｈは、ｓｗｉ６ｐ、ｃｄｄＯｐ、ノッチおよびｌｉｎ－１２の配列中の約３３残基の反復単位の複数のコピーを報告した（Ｂｒｅｅｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２９，６５１－６５４（１９８７））。その後アンキリンタンパク質中に２４コピーのこの反復単位が発見されたことにより、この反復単位はアンキリンリピートと命名されることになった（Ｌｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４４，３６－４２（１９９０））。後に、この反復単位は、様々な生物およびウイルスの数百のタンパク質において同定されている（Ｂｏｒｋ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １７（４），３６３－７４（１９９３））。これらのタンパク質は、核、細胞質または細胞外空間に位置する。これは、これらのタンパク質のアンキリンリピートドメインがジスルフィド架橋とは無関係であり、したがって環境の酸化状態とは無関係であるという事実と一致する。タンパク質あたりの反復単位の数は、２から２０超まで様々である。アンキリンリピート単位の三次構造は、βヘアピンとそれに続く２つの逆平行αヘリックスから構成され、反復単位を次の反復単位と連結するループで終わる特徴的な折り畳みを共有する（Ｓｅｄｇｗｉｃｋ ａｎｄ Ｓｍｅｒｄｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．２４（８），３１１－６（１９９９））。アンキリンリピート単位で構築されるドメインは、リピート単位が伸長した湾曲構造に積層されることによって形成される。アンキリンリピートドメインを含むタンパク質は、多くの場合、さらなるドメインを含む。後者のドメインは可変の機能を有するが、アンキリンリピートドメインの機能は、他のタンパク質の結合であることが最も多い。これらのタンパク質の反復単位を分析すると、標的相互作用残基は、主にβヘアピンおよび第１のαヘリックスの露出部分に見出される。したがって、これらの標的相互作用残基は、アンキリンリピートドメイン上に大きな接触面を形成している。この接触面は、αヘリックス１、αヘリックス２およびループの積層ユニットで構築されたフレームワーク上に露出している。
特定の標的に結合するＤＡＲＰｉｎは、ＤＡＲＰｉｎのコンビナトリアルライブラリをスクリーニングし、標的に対する所望の結合特性を有するものを選択することによって同定することができる。そのようなスクリーニング方法は、例えば、Ｍｕｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１６（４），６８６－６９３，２０１１に記載されている。例えば、リボソームディスプレイ法またはファージディスプレイ法を使用して、多様なライブラリから標的特異的ＤＡＲＰｉｎを選択することができる。
「反復タンパク質」という用語は、１つ以上の反復ドメインを含む（ポリ）ペプチド／タンパク質を指す。一実施形態では、反復タンパク質は、最大４つの反復ドメインを含む。一実施形態では、反復タンパク質は、最大３つの反復ドメインを含む。一実施形態では、反復タンパク質は、最大２つの反復ドメインを含む。最も好ましい実施形態では、反復タンパク質は１つの反復ドメインを含む。
反復タンパク質は、（ポリ）ペプチドタグ、反復タンパク質の検出を可能にし得る酵素（例えばアルカリホスファターゼ）、または標的化のために（免疫グロブリンもしくはその断片など）および／またはエフェクタ分子として使用することができる部分などのさらなる非反復タンパク質ドメインを含み得る。
「（ポリ）ペプチドタグ」という用語は、（ポリ）ペプチド／タンパク質に結合したアミノ酸配列を指し、前記アミノ酸配列は、前記（ポリ）ペプチド／タンパク質の精製、検出、または標的化に有用である。そのような（ポリ）ペプチドタグは、小さいポリペプチド配列、例えば、Ｈｉｓｎ、ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、またはＳｔｒｅｐタグであり得る。これらの（ポリ）ペプチドタグは、全て当技術分野で周知である。
反復タンパク質の個々のドメインは、直接または（ポリ）ペプチドリンカーを介して互いに連結され得る。「（ポリ）ペプチドリンカー」という用語は、２つのタンパク質ドメインを連結することができるアミノ酸配列を指す。そのようなリンカーは、例えば、様々な長さのグリシン－セリンリンカーを含み、当業者に公知である。
「反復ドメイン」という用語は、２つ以上の連続する反復単位（モジュール）を含むタンパク質ドメインを指す。一実施形態では、前記反復単位は、同じまたは類似の折り畳み構造を有する構造単位であり、好ましくは密に積み重なって、好ましくは結合疎水性コアを有する超らせん構造を形成する。
「構造単位」という用語は、（ポリ）ペプチド鎖に沿って互いに近接している二次構造の２つ以上のセグメント間の三次元相互作用によって形成される、（ポリ）ペプチドの局所的に秩序化された部分を指す。そのような構造単位は、構造モチーフを含む。
「構造モチーフ」という用語は、少なくとも１つの構造単位に存在する二次構造要素の三次元配置を指す。構造モチーフは当業者に周知である。前記構造単位は、単独では規定の三次元配置を得ることができない場合がある；しかしながら、反復ドメイン内の反復モジュールとしてのそれらの連続配置は、隣接する単位の相互安定化を導き、超らせん構造をもたらし得る。
「反復モジュール」という用語は、天然に存在するタンパク質の反復単位に由来する、反復タンパク質の反復アミノ酸配列を指す。反復ドメインに含まれる各反復モジュールは、天然に存在する反復タンパク質、例えばアンキリンリピートタンパク質のファミリーの１つ以上の反復単位に由来する。
「反復モジュールのセット」という用語は、反復ドメイン中に存在する反復モジュールの総数を指す。反復ドメイン中に存在するそのような「反復モジュールのセット」は、２つ以上の連続する反復モジュールを含み、２つ以上のコピー中の１種のみの反復モジュール、または各々が１つ以上のコピー中に存在する２つ以上の異なる種類のモジュールを含み得る。例えば３個の反復モジュールを含むそのような反復モジュールのセットは、例えば図５に示されるように、連続して、Ｎ末端からＣ末端まで、反復モジュール１、反復モジュール２、および反復モジュール３を含み得る。図５に示される反復モジュール１は、好ましくはアミノ酸２９～６１を含む。図５に示される反復モジュール２は、好ましくはアミノ酸６２～９４を含む。図５に示される反復モジュール３は、好ましくはアミノ酸９５～１２７を含む。
異なる反復ドメインは、反復ドメインあたり同一の数の反復モジュールを有していてもよく、または反復ドメインあたりの反復モジュールの数が異なっていてもよい。
好ましくは、セットに含まれる反復モジュールは、相同な反復モジュールである。本発明の文脈において、「相同な反復モジュール」という用語は、反復モジュールのフレームワーク残基の７０％超が相同である反復モジュールを指す。好ましくは、前記反復モジュールのフレームワーク残基の８０％超が相同である。最も好ましくは、前記反復モジュールのフレームワーク残基の９０％超が相同である。Ｆａｓｔａ、ＢｌａｓｔまたはＧａｐなどのポリペプチド間の相同性の割合を決定するためのコンピュータプログラムは、当業者に公知である。
「反復単位」という用語は、１つ以上の天然に存在するタンパク質の配列モチーフを含むアミノ酸配列を指し、前記「反復単位」は複数のコピーで見出され、タンパク質の折り畳みを決定する前記モチーフ全てに共通の定義された折り畳みトポロジーを示す。そのような反復単位は、フレームワーク残基および相互作用残基を含む。
そのような反復単位の一例は、アンキリンリピート単位である。２つ以上のそのような反復単位を含む天然に存在するタンパク質は、「天然に存在する反復タンパク質」と称される。反復タンパク質の個々の反復単位のアミノ酸配列は、反復単位の一般的なパターンまたはモチーフを依然として実質的に保持しながら、互いに比較した場合、有意な数の突然変異、置換、付加および／または欠失を有し得る。
「反復配列モチーフ」または「反復コンセンサス配列」という用語は、１つ以上の反復単位から推定されるアミノ酸配列を指す。そのような反復配列モチーフは、フレームワーク残基位置および標的相互作用残基位置を含む。前記フレームワーク残基位置は、前記反復単位のフレームワーク残基の位置に対応する。前記標的相互作用残基位置は、前記反復単位の標的相互作用残基の位置に対応する。そのような反復配列モチーフは、固定された位置およびランダム化された位置を含む。「固定された位置」という用語は、反復配列モチーフ内のアミノ酸位置を指し、前記位置は特定のアミノ酸に設定される。多くの場合、そのような固定された位置は、フレームワーク残基の位置に対応する。
「ランダム化された位置」という用語は、２つ以上のアミノ酸が前記アミノ酸位置で許容される、反復配列モチーフ内のアミノ酸位置を指す。多くの場合、そのようなランダム化された位置は、標的標的相互作用残基の位置に対応する。しかしながら、フレームワーク残基のいくつかの位置もランダム化され得る。
「折り畳みトポロジー」という用語は、前記反復単位の三次構造を指す。折り畳みトポロジーは、αヘリックスもしくはβシートの少なくとも一部を形成するアミノ酸のストレッチ、または線状ポリペプチドもしくはループを形成するアミノ酸ストレッチ、またはαヘリックス、βシートおよび／もしくは線状ポリペプチド／ループの任意の組合せによって決定される。
「連続」という用語は、前記モジュールがタンデムに配置される配置を指す。
反復タンパク質には、少なくとも２個、多くの場合６個以上、１０個以上、または２０個以上の反復単位、通常約２～６個の反復単位が存在する。ほとんどの場合に、反復タンパク質は、構造タンパク質および／または接着タンパク質であり、脊椎動物および非脊椎動物を含む原核生物および真核生物に存在する。
ほとんどの場合、前記反復単位は、高度の配列同一性（対応する位置に同じアミノ酸残基）または配列類似性（異なるが、類似の物理化学的特性を有するアミノ酸残基）を示し、アミノ酸残基の一部は、天然に存在するタンパク質に見出される異なる反復単位で強く保存されている重要な残基であり得る。
しかしながら、共通の折り畳みトポロジーが維持される限り、天然に存在するタンパク質に見出される異なる反復単位間のアミノ酸の挿入および／もしくは欠失、ならびに／または置換による高度な配列変動性が可能である。
「フレームワーク残基」という用語は、折り畳みトポロジーに寄与する、すなわち前記反復単位（もしくはモジュール）の折り畳みに寄与するかまたは隣接単位（もしくはモジュール）との相互作用に寄与する、反復単位のアミノ酸残基または反復モジュールの対応するアミノ酸残基に関する。そのような寄与は、反復単位（モジュール）中の他の残基との相互作用、あるいはαヘリックスもしくはβシートに見出されるポリペプチド骨格の立体配座、または線状ポリペプチドもしくはループを形成するアミノ酸ストレッチへの影響であり得る。
「標的相互作用残基」という用語は、標的物質との相互作用に寄与する、反復単位のアミノ酸残基または反復モジュールの対応するアミノ酸残基を指す。そのような寄与は、標的物質との直接相互作用、または、例えば前記反復単位（モジュール）の（ポリ）ペプチドの立体配座を安定化して、前記標的と前記直接相互作用する残基との相互作用を可能にするかもしくは増強することによる、他の直接相互作用する残基への影響であり得る。
「標的」は、核酸分子、（ポリ）ペプチドタンパク質、炭水化物、またはそのような個々の分子の任意の部分を含む任意の他の天然に存在する分子、またはそのような分子の２つ以上の複合体などの個々の分子であり得る。標的は、特に、免疫エフェクタ細胞上の分子、特にＣＤ８であり得る。
一実施形態では、反復モジュールは直接連結される。本発明の文脈において、「直接連結」という用語は、介在アミノ酸配列のない反復タンパク質中に直接反復として配置される反復モジュールを指す。
別の実施形態では、反復モジュールは、（ポリ）ペプチドリンカーによって連結される。したがって、反復モジュールは、個々のモジュールを分離する介在配列としての（ポリ）ペプチドリンカーを介して間接的に連結され得る。「介在配列」は、折り畳みトポロジーまたはモジュールの積層を妨げることなく個々のモジュールを連結することを可能にする任意のアミノ酸配列であり得る。好ましくは、前記介在配列は、１０個未満、さらにより好ましくは５個未満のアミノ酸残基の短い（ポリ）ペプチドリンカーである。
一実施形態では、反復タンパク質は、前記反復モジュールのいずれか１つとは異なるアミノ酸配列を有するＮ末端および／またはＣ末端キャッピングモジュールをさらに含む。「キャッピングモジュール」という用語は、反復ドメインのＮ末端またはＣ末端反復モジュールに融合したポリペプチドを指し、前記キャッピングモジュールは、前記反復モジュールと密接な三次相互作用を形成し、それによって、連続する反復モジュールと接触していない側で前記反復モジュールの疎水性コアを溶媒から遮蔽するキャップを提供する。
前記Ｎ末端および／またはＣ末端キャッピングモジュールは、反復単位に隣接する天然に存在する反復タンパク質に見出されるキャッピング単位または他のドメインであり得るか、またはそれらに由来し得る。
「キャッピング単位」という用語は、天然に存在する折り畳まれた（ポリ）ペプチドを指し、前記（ポリ）ペプチドは、反復単位にＮ末端またはＣ末端融合された特定の構造単位を定義し、前記（ポリ）ペプチドは、前記反復単位と緊密な三次相互作用を形成し、それによって、一方の側で前記反復単位の疎水性コアを溶媒から遮蔽するキャップを提供する。そのようなキャッピング単位は、前記反復配列モチーフと配列類似性を有し得る。
核酸
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換え生産された分子および化学合成された分子などのＤＮＡおよびＲＮＡを含むことを意図している。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。ＲＮＡは、インビトロ転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ ＲＮＡ）または合成ＲＮＡを含む。本発明によれば、ポリヌクレオチドは、好ましくは単離されている。
核酸は、ベクターに含まれ得る。本明細書で使用される「ベクター」という用語は、プラスミドベクター、コスミドベクター、λファージなどのファージベクター、レトロウイルス、アデノウイルスもしくはバキュロウイルスベクターなどのウイルスベクター、または細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）もしくはＰ１人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体ベクターを含む、当業者に公知の任意のベクターを含む。前記ベクターには、発現ベクターおよびクローニングベクターが含まれる。発現ベクターは、プラスミドおよびウイルスベクターを含み、一般に、所望のコード配列および特定の宿主生物（例えば細菌、酵母、植物、昆虫もしくは哺乳動物）またはインビトロ発現系における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な適切なＤＮＡ配列を含む。クローニングベクターは、一般に、特定の所望のＤＮＡ断片を操作および増幅するために使用され、所望のＤＮＡ断片の発現に必要な機能的配列を欠いていてもよい。
本発明の全ての態様の一実施形態では、抗原受容体をコードする核酸またはワクチン抗原をコードする核酸などの核酸は、抗原受容体またはワクチン抗原を提供するために治療される対象の細胞において発現される。本発明の全ての態様の一実施形態では、核酸は、対象の細胞において一過性に発現される。したがって、一実施形態では、核酸は細胞のゲノムに組み込まれない。本発明の全ての態様の一実施形態では、核酸はＲＮＡ、好ましくはインビトロ転写されたＲＮＡである。本発明の全ての態様の一実施形態では、抗原の発現は細胞表面で起こる。本発明の全ての態様の一実施形態では、ワクチン抗原の発現は細胞表面で起こる。本発明の全ての態様の一実施形態では、ワクチン抗原はＭＨＣに関連して発現および提示される。
本発明の全ての態様の一実施形態では、ワクチン抗原をコードする核酸は、抗原受容体を発現するように遺伝子改変された免疫エフェクタ細胞による結合のためのワクチン抗原を提供するために治療される対象の抗原提示細胞などの細胞で発現され、前記結合は、抗原受容体を発現するように遺伝子改変された免疫エフェクタ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大をもたらす。
本明細書に記載の核酸は、組換えおよび／または単離された分子であり得る。
本開示では、「ＲＮＡ」という用語は、リボヌクレオチド残基を含む核酸分子に関する。好ましい実施形態では、ＲＮＡは、リボヌクレオチド残基の全部または大部分を含む。本明細書で使用される場合、「リボヌクレオチド」は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２'位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを指す。ＲＮＡは、限定されることなく、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え生産されたＲＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって天然に存在するＲＮＡとは異なる修飾ＲＮＡを包含する。そのような改変は、内部ＲＮＡヌクレオチドまたはＲＮＡの末端（一方もしくは両方）への非ヌクレオチド物質の付加を指し得る。本明細書では、ＲＮＡ中のヌクレオチドは、化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドであり得ることも企図される。本開示では、これらの改変されたＲＮＡは、天然に存在するＲＮＡの類似体と見なされる。
本開示の特定の実施形態では、ＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ転写物に関するメッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。当技術分野で確立されているように、ｍＲＮＡは一般に、５'非翻訳領域（５'－ＵＴＲ）、ペプチドコード領域および３'非翻訳領域（３'－ＵＴＲ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、インビトロ転写または化学合成によって生成される。一実施形態では、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型を使用するインビトロ転写によって生成され、ここで、ＤＮＡは、デオキシリボヌクレオチドを含む核酸を指す。
一実施形態では、ＲＮＡはインビトロ転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって得られ得る。転写を制御するためのプロモータは、任意のＲＮＡポリメラーゼのための任意のプロモータであり得る。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングし、それをインビトロ転写のための適切なベクターに導入することによって得られ得る。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写によって得られ得る。
一実施形態では、ＲＮＡは修飾リボヌクレオチドを有し得る。修飾リボヌクレオチドの例には、限定されることなく、５－メチルシチジン、プソイドウリジンおよび／または１－メチルプソイドウリジンが含まれる。
いくつかの実施形態では、本開示によるＲＮＡは５'キャップを含む。一実施形態では、本開示のＲＮＡは、キャップされていない５'－三リン酸を有さない。一実施形態では、ＲＮＡは５'キャップ類似体によって修飾され得る。「５'キャップ」という用語は、ｍＲＮＡ分子の５'末端に見出される構造を指し、一般に、５'－５'三リン酸結合によってｍＲＮＡに連結されたグアノシンヌクレオチドからなる。一実施形態では、このグアノシンは７位でメチル化されている。ＲＮＡに５'キャップまたは５'キャップ類似体を提供することは、５'キャップがＲＮＡ鎖に共転写的に発現されるインビトロ転写によって達成され得るか、またはキャッピング酵素を使用して転写後にＲＮＡに結合され得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡのためのビルディングブロックキャップは、ｍ２ ７，３'－ＯＧｐｐｐ（ｍ１ ２'－Ｏ）ＡｐＧ（時にｍ２ ７，３'ＯＧ（５'）ｐｐｐ（５'）ｍ２'－ＯＡｐＧとも称される）であり、これは、以下の構造：
Figure 2023509604000003
を有する。
以下は、ＲＮＡおよびｍ２ ７，３'ＯＧ（５'）ｐｐｐ（５'）ｍ２'－ＯＡｐＧを含む例示的なキャップ１ ＲＮＡである：
Figure 2023509604000004
以下は、別の例示的なキャップ１ ＲＮＡ（キャップ類似体なし）である：
Figure 2023509604000005
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、一実施形態では構造：
Figure 2023509604000006
を有するキャップ類似体の抗逆方向キャップ（ＡＲＣＡキャップ（ｍ２ ７，３'ＯＧ（５'）ｐｐｐ（５'）Ｇ））を使用して、「キャップ０」構造で修飾される。
以下は、ＲＮＡおよびｍ２ ７，３'ＯＧ（５'）ｐｐｐ（５'）Ｇを含む例示的なキャップ０ ＲＮＡである：
Figure 2023509604000007
いくつかの実施形態では、「キャップ０」構造は、構造：
Figure 2023509604000008
を有するキャップ類似体β－Ｓ－ＡＲＣＡ（ｍ２ ７，２'ＯＧ（５'）ｐｐＳｐ（５'）Ｇ）を使用して生成される。
以下は、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（ｍ２ ７，２'ＯＧ（５'）ｐｐＳｐ（５'）Ｇ）およびＲＮＡを含む例示的なキャップ０ ＲＮＡである：
Figure 2023509604000009
特に好ましいキャップは、５'キャップｍ２ ７，２'ＯＧ（５'）ｐｐＳｐ（５'）Ｇを含む。
いくつかの実施形態では、本開示によるＲＮＡは、５'－ＵＴＲおよび／または３'－ＵＴＲを含む。「非翻訳領域」または「ＵＴＲ」という用語は、転写されるがアミノ酸配列に翻訳されないＤＮＡ分子内の領域、またはｍＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子内の対応する領域に関する。非翻訳領域（ＵＴＲ）は、オープンリーディングフレームの５'側（上流）（５'－ＵＴＲ）および／またはオープンリーディングフレームの３'側（下流）（３'－ＵＴＲ）に存在し得る。５'－ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質コード領域の開始コドンの上流の５'末端に位置する。５'－ＵＴＲは５'キャップ（存在する場合）の下流にあり、例えば５'キャップに直接隣接している。３'－ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質コード領域の終止コドンの下流の３'末端に位置するが、「３'－ＵＴＲ」という用語は、好ましくはポリ（Ａ）尾部を含まない。したがって、３'－ＵＴＲはポリ（Ａ）配列（存在する場合）の上流にあり、例えばポリ（Ａ）配列に直接隣接している。
いくつかの実施形態では、本開示によるＲＮＡは３'－ポリ（Ａ）配列を含む。
本発明で使用される場合、「ポリＡ尾部」または「ポリＡ配列」という用語は、典型的にはＲＮＡ分子の３'末端に位置するアデニル酸残基の連続的または断続的な配列を指す。ポリＡ尾部またはポリＡ配列は当業者に公知であり、本明細書に記載のＲＮＡの３'－ＵＴＲに後続し得る。連続的なポリＡ尾部は、連続するアデニル酸残基を特徴とする。自然界では、連続的なポリＡ尾部が典型的である。本明細書に開示されるＲＮＡは、転写後に鋳型非依存性ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡの遊離３'末端に結合したポリＡ尾部、またはＤＮＡによってコードされ、鋳型依存性ＲＮＡポリメラーゼによって転写されたポリＡ尾部を有し得る。
約１２０個のＡヌクレオチドのポリＡ尾部は、トランスフェクトされた真核細胞中のＲＮＡのレベル、およびポリＡ尾部の上流（５'側）に存在するオープンリーディングフレームから翻訳されるタンパク質のレベルに有益な影響を及ぼすことが実証されている（Ｈｏｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．４００９－４０１７）。
ポリＡ尾部は任意の長さであり得る。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個、または少なくとも１００個、および最大５００個、最大４００個、最大３００個、最大２００個、または最大１５０個までのＡヌクレオチド、特に約１２０個のＡヌクレオチドを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。この文脈において、「本質的に～からなる」は、ポリＡ尾部のほとんどのヌクレオチド、典型的にはポリＡ尾部のヌクレオチド数の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％がＡヌクレオチドであることを意味するが、残りのヌクレオチドが、Ｕヌクレオチド（ウリジル酸）、Ｇヌクレオチド（グアニル酸）、またはＣヌクレオチド（シチジル酸）などのＡヌクレオチド以外のヌクレオチドであることを許容する。この文脈において、「からなる」は、ポリＡ尾部の全てのヌクレオチド、すなわちポリＡ尾部のヌクレオチド数の１００％がＡヌクレオチドであることを意味する。「Ａヌクレオチド」または「Ａ」という用語は、アデニル酸を指す。
いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、コード鎖に相補的な鎖内に反復ｄＴヌクレオチド（デオキシチミジル酸）を含むＤＮＡ鋳型に基づいて、ＲＮＡ転写中、例えばインビトロ転写ＲＮＡの調製中に結合される。ポリＡ尾部（コード鎖）をコードするＤＮＡ配列は、ポリ（Ａ）カセットと称される。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡのコード鎖に存在するポリ（Ａ）カセットは、本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、およびｄＴ）のランダムな配列によって中断されている。そのようなランダムな配列は、５～５０、１０～３０、または１０～２０ヌクレオチドの長さであり得る。そのようなカセットは、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１６／００５３２４号に開示されている。国際公開第２０１６／００５３２４号に開示されている任意のポリ（Ａ）カセットを本発明で使用し得る。本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ）が均等に分布し、例えば５～５０ヌクレオチドの長さを有するランダムな配列によって中断されているポリ（Ａ）カセットは、ＤＮＡレベルでは、大腸菌におけるプラスミドＤＮＡの持続的な増殖を示し、ＲＮＡレベルでは、ＲＮＡの安定性と翻訳効率の支持に関する有益な特性と依然として関連している。その結果として、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ分子に含まれるポリＡ尾部は、本質的にＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）のランダムな配列によって中断されている。そのようなランダムな配列は、５～５０、１０～３０、または１０～２０ヌクレオチドの長さであり得る。
いくつかの実施形態では、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドは、その３'末端でポリＡ尾部に隣接しておらず、すなわち、ポリＡ尾部はマスクされていないか、またはその３'末端でＡ以外のヌクレオチドが後続していない。
いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個、または少なくとも１００個、および最大５００個、最大４００個、最大３００個、最大２００個、または最大１５０個までのヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、本質的に、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個、または少なくとも１００個、および最大５００個、最大４００個、最大３００個、最大２００個、または最大１５０個までのヌクレオチドからなり得る。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個、または少なくとも１００個、および最大５００個、最大４００個、最大３００個、最大２００個、または最大１５０個までのヌクレオチドからなり得る。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は少なくとも１００個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は約１５０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は約１２０個のヌクレオチドを含む。
本開示によれば、ワクチン抗原は、好ましくは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）に入るとそれぞれのタンパク質に翻訳される一本鎖５'キャップｍＲＮＡとして投与される。好ましくは、ＲＮＡは、安定性および翻訳効率に関するＲＮＡの最大の有効性のために最適化された構造要素（５'キャップ、５'－ＵＴＲ、３'－ＵＴＲ、ポリ（Ａ）尾部）を含む。
一実施形態では、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ１）をＲＮＡの５'末端の特異的キャッピング構造として利用する。一実施形態では、５'－ＵＴＲ配列は、ヒトα－グロビンｍＲＮＡに由来する。一実施形態では、ヒトβグロビンｍＲＮＡに由来する２つの再反復３'－ＵＴＲをコード配列とポリ（Ａ）尾部との間に配置して、より高い最大タンパク質レベルおよびｍＲＮＡの長期持続性を確実にする。一実施形態では、３０個のアデノシン残基のストレッチと、それに続く１０個のヌクレオチドリンカー配列および別の７０個のアデノシン残基からなる、１１０ヌクレオチド長と測定されるポリ（Ａ）尾部が使用される。このポリ（Ａ）尾部配列は、樹状細胞におけるＲＮＡの安定性と翻訳効率を高めるように設計された。
ＲＮＡは、好ましくは、以下にさらに記載されるように、好ましくはＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを含むリポプレックス粒子として投与される。そのような粒子は、好ましくは全身投与、特に静脈内投与によって投与される。
本開示の文脈において、「転写」という用語は、ＤＮＡ配列中の遺伝暗号がＲＮＡに転写されるプロセスに関する。その後、ＲＮＡはペプチドまたはタンパク質に翻訳され得る。
ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、ｍＲＮＡの鎖が、ペプチドまたはタンパク質を作製するようにアミノ酸の配列のアセンブリを指示する、細胞のリボソームにおけるプロセスに関する。
「コードする」は、定義されたヌクレオチドの配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）または定義されたアミノ酸の配列のいずれかを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として働く、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列の固有の特性、およびそれから生じる生物学的特性を指す。したがって、ある遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生物学的システムにおいてタンパク質を産生する場合、その遺伝子はタンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表に提供されるコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方が、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードすると称され得る。
本開示によれば、「ＲＮＡがコードする」という用語は、ＲＮＡが、標的組織の細胞内などの適切な環境に存在する場合、翻訳プロセス中にそれがコードするペプチドまたはタンパク質を産生するようにアミノ酸のアセンブリを指示できることを意味する。一実施形態では、ＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質の翻訳を可能にする細胞翻訳機構と相互作用することができる。細胞は、コードされたペプチドもしくはタンパク質を細胞内で（例えば細胞質内および／もしくは核内で）産生し得るか、コードされたペプチドもしくはタンパク質を分泌し得るか、またはそれを表面上で産生し得る。
本明細書で使用される場合、「内因性」は、生物、細胞、組織または系からの、またはそれらの内部で産生される任意の物質を指す。
本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、生物、細胞、組織または系から導入されるか、またはそれらの外部で産生される任意の物質を指す。
本明細書で使用される「発現」という用語は、特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳として定義される。発現は一過性または安定であり得る。本発明によれば、発現という用語は、「異所性発現」または「異常発現」も含む。
本明細書で使用される場合、「連結された」、「融合された」、または「融合」という用語は、互換的に使用される。これらの用語は、２つ以上の要素または成分またはドメインの結合を指す。
サイトカイン
本明細書に記載される方法は、例えば、対象に１つ以上のサイトカイン、１つ以上のサイトカインをコードするポリヌクレオチドまたは１つ以上のサイトカインを発現する宿主細胞を投与することによって、１つ以上のサイトカインを対象に提供することを含み得る。
本明細書で使用される「サイトカイン」という用語は、天然に存在するサイトカインおよびその機能的バリアント（天然に存在するサイトカインの断片およびそのバリアントを含む）を含む。１つの特に好ましいサイトカインはＩＬ２である。
サイトカインは、細胞シグナル伝達に重要である小さなタンパク質（約５～２０ｋＤａ）のカテゴリである。サイトカインの放出は、それらの周囲の細胞の挙動に影響を及ぼす。サイトカインは、免疫調節剤として自己分泌シグナル伝達、パラ分泌シグナル伝達および内分泌シグナル伝達に関与する。サイトカインには、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、および腫瘍壊死因子が含まれるが、一般にホルモンまたは成長因子は含まれない（用語が一部重複しているにもかかわらず）。サイトカインは、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球および肥満細胞のような免疫細胞、ならびに内皮細胞、線維芽細胞および様々な間質細胞を含む、幅広い細胞によって産生される。所与のサイトカインは、複数の種類の細胞によって産生され得る。サイトカインは受容体を介して作用し、免疫系において特に重要である；サイトカインは、体液性免疫応答と細胞性免疫応答のバランスを調整し、特定の細胞集団の成熟、成長、および応答性を調節する。一部のサイトカインは、他のサイトカインの作用を複雑な方法で増強または阻害する。
ＩＬ２
インターロイキン２（ＩＬ２）は、抗原活性化Ｔ細胞の増殖を誘導し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を刺激するサイトカインである。ＩＬ２の生物学的活性は、細胞膜にまたがる３つのポリペプチドサブユニット：ｐ５５（ＩＬ２Ｒα、アルファサブユニット、ヒトではＣＤ２５としても知られる）、ｐ７５（ＩＬ２Ｒβ、ベータサブユニット、ヒトではＣＤ１２２としても知られる）およびｐ６４（ＩＬ２Ｒγ、ガンマサブユニット、ヒトではＣＤ１３２としても知られる）のマルチサブユニットＩＬ２受容体複合体（ＩＬ２Ｒ）を介して媒介される。ＩＬ２に対するＴ細胞応答は、（１）ＩＬ２の濃度；（２）細胞表面上のＩＬ２Ｒ分子の数；および（３）ＩＬ２が占有するＩＬ２Ｒの数（すなわち、ＩＬ２とＩＬ２Ｒの間の結合相互作用の親和性）を含む様々な因子に依存する（Ｓｍｉｔｈ，''Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｓ Ｑｕａｎｔａｌ''Ｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，Ｈｏｒｍｏｎｅｓ，ａｎｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ７６６：２６３－２７１，１９９５））。ＩＬ２：ＩＬ２Ｒ複合体はリガンド結合時に内在化され、様々な成分が異なる選別を受ける。静脈内（ｉ．ｖ．）ボーラスとして投与された場合、ＩＬ２は急速な全身クリアランスを有する（半減期が１２．９分の初期クリアランス期、続いて半減期が８５分のより遅いクリアランス期）（Ｋｏｎｒａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：２００９－２０１７，１９９０）。
真核細胞では、ヒトＩＬ２は１５３アミノ酸の前駆体ポリペプチドとして合成され、そこから２０アミノ酸が除去されて成熟した分泌型ＩＬ２が生成される。組換えヒトＩＬ２は、大腸菌、昆虫細胞および哺乳動物ＣＯＳ細胞において産生されている。
本開示によれば、ＩＬ２（任意で延長ＰＫ ＩＬ２の一部として）は、天然に存在するＩＬ２またはその断片もしくはバリアントであり得る。ＩＬ２はヒトＩＬ２であり得、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物に由来し得る。
延長ＰＫ基
本明細書に記載のサイトカインポリペプチドは、サイトカイン部分と異種ポリペプチド（すなわちサイトカインまたはそのバリアントではないポリペプチド）を含む融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドとして調製することができる。以下、「延長薬物動態（ＰＫ）サイトカイン」と称される、得られた分子は、遊離サイトカインと比較して延長された循環半減期を有する。延長ＰＫサイトカインの延長された循環半減期は、インビボでの血清サイトカイン濃度が治療範囲内に維持されることを可能にし、潜在的に、Ｔ細胞を含む多くの種類の免疫細胞の活性化の増強をもたらす。その有利な薬物動態プロファイルのために、非修飾サイトカインと比較した場合、延長ＰＫサイトカインはより少ない頻度でより長期間にわたって投与することができる。
本明細書で使用される場合、「半減期」は、ペプチドまたはタンパク質などの化合物の血清または血漿濃度が、例えば分解および／またはクリアランスもしくは天然の機構による隔離のために、インビボで５０％減少するのに要する時間を指す。本明細書での使用に適した延長ＰＫインターロイキン（ＩＬ）などの延長ＰＫサイトカインは、インビボで安定化されており、その半減期は、例えば、分解および／またはクリアランスもしくは隔離に抵抗する、血清アルブミン（例えばＨＳＡまたはＭＳＡ）への融合によって増加している。半減期は、薬物動態分析などによる、それ自体公知の任意の方法で決定することができる。適切な技術は当業者に明らかであり、例えば一般に、適切な用量のアミノ酸配列または化合物を対象に適切に投与する工程；前記対象から定期的な間隔で血液試料または他の試料を収集する工程；前記血液試料中のアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度を決定する工程；およびこのようにして得られたデータ（のプロット）から、アミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度が投与時の初期レベルと比較して５０％低下するまでの時間を計算する工程を含み得る。さらなる詳細は、例えば、Ｋｅｎｎｅｔｈ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓなどの標準的なハンドブックおよびＰｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９６）に提供されている。Ｇｉｂａｌｄｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，２ｎｄ Ｒｅｖ．Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ（１９８２）も参照されたい。
サイトカインは、循環半減期を増加させる延長ＰＫ基に融合され得る。延長ＰＫ基の非限定的な例を以下で説明する。サイトカインまたはそのバリアントの循環半減期を増加させる他のＰＫ基もまた、本開示に適用可能であることが理解されるべきである。特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、血清アルブミンドメイン（例えばマウス血清アルブミン、ヒト血清アルブミン）である。
本明細書で使用される場合、「ＰＫ」という用語は、「薬物動態」の頭字語であり、例として、対象による吸収、分布、代謝、および排泄を含む化合物の特性を包含する。本明細書で使用される場合、「延長ＰＫ基」は、生物学的に活性な分子に融合されるかまたはそれと一緒に投与された場合、生物学的に活性な分子の循環半減期を増加させるタンパク質、ペプチド、または部分を指す。延長ＰＫ基の例には、血清アルブミン（例えばＨＳＡ）、免疫グロブリンＦｃまたはＦｃ断片およびそのバリアント、トランスフェリンおよびそのバリアント、ならびにヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合剤（米国特許出願公開第２００５／０２８７１５３号および同第２００７／０００３５４９号に開示されている）が含まれる。他の例示的な延長ＰＫ基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ，２０１６ Ｊｕｌ；１６（７）：９０３－１５に開示されている。本明細書で使用される場合、「延長ＰＫサイトカイン」は、延長ＰＫ基と組み合わせたサイトカイン部分を指す。一実施形態では、延長ＰＫサイトカインは、サイトカイン部分が延長ＰＫ基に連結または融合されている融合タンパク質である。本明細書で使用される場合、「延長ＰＫ ＩＬ」は、延長ＰＫ基と組み合わせたインターロイキン（ＩＬ）部分（ＩＬバリアント部分を含む）を指す。一実施形態では、延長ＰＫ ＩＬは、ＩＬ部分が延長ＰＫ基に連結または融合されている融合タンパク質である。例示的な融合タンパク質は、ＩＬ２部分がＨＳＡと融合されているＨＳＡ／ＩＬ２融合物である。
特定の実施形態では、延長ＰＫサイトカインの血清半減期は、サイトカイン単独（すなわち延長ＰＫ基に融合されていないサイトカイン）と比較して増加している。特定の実施形態では、延長ＰＫサイトカインの血清半減期は、サイトカイン単独の血清半減期と比較して少なくとも２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１５０、１８０、２００、４００、６００、８００、または１０００％長い。特定の実施形態では、延長ＰＫサイトカインの血清半減期は、サイトカイン単独の血清半減期より少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、１０倍、１２倍、１３倍、１５倍、１７倍、２０倍、２２倍、２５倍、２７倍、３０倍、３５倍、４０倍、または５０倍長い。特定の実施形態では、延長ＰＫサイトカインの血清半減期は、少なくとも１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、５０時間、６０時間、７０時間、８０時間、９０時間、１００時間、１１０時間、１２０時間、１３０時間、１３５時間、１４０時間、１５０時間、１６０時間、または２００時間である。
特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、血清アルブミンもしくはその断片、または血清アルブミンもしくはその断片のバリアント（本開示の目的のために、それらの全てが「アルブミン」という用語に含まれる）を含む。本明細書に記載されるポリペプチドは、アルブミン（またはその断片もしくはバリアント）に融合されてアルブミン融合タンパク質を形成し得る。そのようなアルブミン融合タンパク質は、米国特許出願公開第２００７００４８２８２号に記載されている。
本明細書で使用される場合、「アルブミン融合タンパク質」は、少なくとも１分子のアルブミン（またはその断片もしくはバリアント）と、治療用タンパク質、特にＩＬ２（またはそのバリアント）などの少なくとも１分子のタンパク質との融合によって形成されるタンパク質を指す。アルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、アルブミンをコードするポリヌクレオチドとインフレームで結合している核酸の翻訳によって生成され得る。治療用タンパク質およびアルブミンは、ひとたびアルブミン融合タンパク質の一部になると、それぞれ、アルブミン融合タンパク質の「一部」、「領域」または「部分」（例えば、「治療用タンパク質部分」または「アルブミンタンパク質部分」）と称され得る。非常に好ましい実施形態では、アルブミン融合タンパク質は、少なくとも１分子の治療用タンパク質（治療用タンパク質の成熟形態を含むがこれに限定されない）および少なくとも１分子のアルブミン（アルブミンの成熟形態を含むがこれに限定されない）を含む。一実施形態では、アルブミン融合タンパク質は、投与されたＲＮＡの標的器官の細胞、例えば肝細胞などの宿主細胞によってプロセシングされ、循環中に分泌される。ＲＮＡの発現に使用される宿主細胞の分泌経路で起こる新生アルブミン融合タンパク質のプロセシングには、シグナルペプチド切断、ジスルフィド結合の形成、適切な折り畳み、炭水化物の付加とプロセシング（例えばＮ－結合型およびＯ－結合型グリコシル化など）、特異的タンパク質分解切断、ならびに／または多量体タンパク質へのアセンブリが含まれ得るが、これらに限定されない。アルブミン融合タンパク質は、好ましくは、特にそのＮ末端にシグナルペプチドを有するプロセシングされていない形態のＲＮＡによってコードされ、細胞による分泌後、好ましくは、特にシグナルペプチドが切断された、プロセシングされた形態で存在する。最も好ましい実施形態では、「アルブミン融合タンパク質のプロセシングされた形態」は、本明細書では「成熟アルブミン融合タンパク質」とも称される、Ｎ末端シグナルペプチド切断を受けたアルブミン融合タンパク質産物を指す。
好ましい実施形態では、治療用タンパク質を含むアルブミン融合タンパク質は、アルブミンに融合されていない場合の同じ治療用タンパク質の血漿安定性と比較して、より高い血漿安定性を有する。血漿安定性は、典型的には、治療用タンパク質がインビボで投与され、血流に運ばれたときから、治療用タンパク質が分解され、血流から腎臓または肝臓などの器官へと除去され、最終的に治療用タンパク質が体内から除去されるときまでの期間を指す。血漿安定性は、血流中の治療用タンパク質の半減期に関して計算される。血流中の治療用タンパク質の半減期は、当技術分野で公知の一般的なアッセイによって容易に決定することができる。
本明細書で使用される場合、「アルブミン」は、アルブミンの１つ以上の機能的活性（例えば生物学的活性）を有する、アルブミンタンパク質もしくはアミノ酸配列、またはアルブミン断片もしくはバリアントを集合的に指す。特に、「アルブミン」は、ヒトアルブミンまたはその断片もしくはバリアント、特にヒトアルブミンの成熟形態、または他の脊椎動物由来のアルブミンもしくはその断片、またはこれらの分子のバリアントを指す。アルブミンは、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物、例えばヒト、マウス、ウシ、ヒツジ、またはブタに由来し得る。非哺乳動物アルブミンには、雌鶏およびサケが含まれるが、これらに限定されない。アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、治療用タンパク質部分とは異なる動物に由来し得る。
特定の実施形態では、アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはその断片もしくはバリアント、例えば米国特許第５，８７６，９６９号、国際公開第２０１１／１２４７１８号、国際公開第２０１３／０７５０６６号、および国際公開第２０１１／０５１４７８９号に開示されているものである。
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびヒトアルブミン（ＨＡ）という用語は、本明細書では互換的に使用される。「アルブミンおよび「血清アルブミン」という用語はより広範であり、ヒト血清アルブミン（およびその断片とバリアント）ならびに他の種由来のアルブミン（およびその断片とバリアント）を包含する。
本明細書で使用される場合、治療用タンパク質の治療活性または血漿安定性を延長するのに十分なアルブミンの断片は、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分の血漿安定性が非融合状態での血漿安定性と比較して延長または拡大されるように、タンパク質の治療活性または血漿安定性を安定化または延長するのに十分な長さまたは構造のアルブミン断片を指す。
アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、アルブミン配列の全長を含み得るか、または治療活性もしくは血漿安定性を安定化もしくは延長することができるその１つ以上の断片を含み得る。そのような断片は、１０個以上のアミノ酸の長さであり得るか、またはアルブミン配列からの約１５、２０、２５、３０、５０個もしくはそれ以上の連続するアミノ酸を含み得るか、またはアルブミンの特定のドメインの一部もしくは全部を含み得る。例えば、最初の２つの免疫グロブリン様ドメインにまたがるＨＳＡの１つ以上の断片を使用し得る。好ましい実施形態では、ＨＳＡ断片は、ＨＳＡの成熟形態である。
一般的に言えば、アルブミン断片またはバリアントは、少なくとも１００アミノ酸長、好ましくは少なくとも１５０アミノ酸長である。
本開示によれば、アルブミンは、天然に存在するアルブミンまたはその断片もしくはバリアントであり得る。アルブミンは、ヒトアルブミンであり得、任意の脊椎動物、特に任意の哺乳動物に由来し得る。
好ましくは、アルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端部分としてアルブミンを含み、Ｃ末端部分として治療用タンパク質を含む。あるいは、Ｃ末端部分としてアルブミンを含み、Ｎ末端部分として治療用タンパク質を含むアルブミン融合タンパク質も使用し得る。
一実施形態では、治療用タンパク質（１つまたは複数）は、ペプチドリンカー（１つまたは複数）を介してアルブミンに結合されている。融合部分の間のリンカーペプチドは、部分間のより大きな物理的分離を提供し、したがって、例えばその同族受容体に結合するための治療用タンパク質部分のアクセス可能性を最大化し得る。リンカーペプチドは、それが柔軟であるかまたはより剛性であるようにアミノ酸で構成され得る。リンカー配列は、プロテアーゼによってまたは化学的に切断可能であり得る。
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域」という用語は、天然免疫グロブリンの２本の重鎖のそれぞれのＦｃドメイン（またはＦｃ部分）によって形成される天然免疫グロブリンの部分を指す。本明細書で使用される場合、「Ｆｃドメイン」という用語は、ＦｃドメインがＦｖドメインを含まない単一の免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖の一部または断片を指す。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、パパイン切断部位のすぐ上流のヒンジ領域で始まり、抗体のＣ末端で終わる。したがって、完全なＦｃドメインは、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジ（例えば上部、中間および／もしくは下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、またはそのバリアント、部分もしくは断片の少なくとも１つを含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、完全なＦｃドメイン（すなわち、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン）を含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメイン（またはその一部）に融合したヒンジドメイン（またはその一部）を含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメイン（またはその一部）に融合したＣＨ２ドメイン（またはその一部）を含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメインまたはその一部からなる。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン（またはその一部）およびＣＨ３ドメイン（またはその一部）からなる。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメイン（またはその一部）およびＣＨ３ドメインからなる。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン（またはその一部）およびＣＨ２ドメイン（またはその一部）からなる。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部）を欠く。本明細書におけるＦｃドメインは、一般に、免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインの全部または一部を含むポリペプチドを指す。これには、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、および／またはＣＨ３ドメイン全体を含むポリペプチド、ならびに、例えばヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインのみを含むそのようなペプチドの断片が含まれるが、これらに限定されない。Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体を含むがこれらに限定されない、任意の種および／または任意のサブタイプの免疫グロブリンに由来し得る。Ｆｃドメインは、天然のＦｃおよびＦｃバリアント分子を包含する。本明細書に記載されるように、任意のＦｃドメインを、アミノ酸配列が天然に存在する免疫グロブリン分子の天然Ｆｃドメインとは異なるように修飾し得ることは、当業者に理解されるであろう。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、エフェクタ機能（例えばＦｃγＲ結合）が低下している。
本明細書に記載されるポリペプチドのＦｃドメインは、異なる免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドのＦｃドメインは、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン、ならびにＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含み得る。別の例では、Ｆｃドメインは、一部はＩｇＧ１分子に由来し、一部はＩｇＧ３分子に由来するキメラヒンジ領域を含むことができる。別の例では、Ｆｃドメインは、一部はＩｇＧ１分子に由来し、一部はＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジを含むことができる。
特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、Ｆｃドメインもしくはその断片、またはＦｃドメインもしくはその断片のバリアント（本開示の目的のために、その全てが「Ｆｃドメイン」という用語に含まれる）を含む。Ｆｃドメインは、抗原に結合する可変領域を含まない。本開示での使用に適したＦｃドメインは、いくつかの異なる供給源から得られ得る。特定の実施形態では、Ｆｃドメインはヒト免疫グロブリンに由来する。特定の実施形態では、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１定常領域に由来する。しかしながら、Ｆｃドメインは、例えばげっ歯動物種（例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット）または非ヒト霊長動物種（例えばチンパンジー、マカク）を含む別の哺乳動物種の免疫グロブリンに由来し得ることが理解される。
さらに、Ｆｃドメイン（またはその断片もしくはバリアント）は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥを含む任意の免疫グロブリンクラス、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む任意の免疫グロブリンアイソタイプに由来し得る。
様々なＦｃドメイン遺伝子配列（例えばマウスおよびヒト定常領域遺伝子配列）は、公的にアクセス可能な寄託物の形で入手可能である。特定のエフェクタ機能を欠く、および／または免疫原性を低下させる特定の修飾を有するＦｃドメイン配列を含む定常領域ドメインを選択することができる。抗体および抗体をコードする遺伝子の多くの配列が公開されており、適切なＦｃドメイン配列（例えばヒンジ、ＣＨ２、および／もしくはＣＨ３配列、またはその断片もしくはバリアント）は、当技術分野で広く認められている技術を使用してこれらの配列から導くことができる。
特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００５／０２８７１５３号、米国特許出願第２００７／０００３５４９号、米国特許出願第２００７／０１７８０８２号、米国特許出願第２００７／０２６９４２２号、米国特許出願第２０１０／０１１３３３９号、国際公開第２００９／０８３８０４号、および国際公開第２００９／１３３２０８号に記載されているものなどの血清アルブミン結合タンパク質である。特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，１７６，２７８号および米国特許第８，１５８，５７９号に開示されているように、トランスフェリンである。特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００７／０１７８０８２号、米国特許出願第２０１４／０２２００１７号、および米国特許出願第２０１７／０１４５０６２号に開示されているものなどの血清免疫グロブリン結合タンパク質である。特定の実施形態では、延長ＰＫ基は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２０１２／００９４９０９号に開示されているものなどの、血清アルブミンに結合するフィブロネクチン（Ｆｎ）ベースの足場ドメインタンパク質である。フィブロネクチンベースの足場ドメインタンパク質を作製する方法もまた、米国特許出願第２０１２／００９４９０９号に開示されている。Ｆｎ３ベースの延長ＰＫ基の非限定的な例は、Ｆｎ３（ＨＳＡ）、すなわち、ヒト血清アルブミンに結合するＦｎ３タンパク質である。
特定の態様では、本開示による使用に適した延長ＰＫサイトカインは、１つ以上のペプチドリンカーを使用することができる。本明細書で使用される場合、「ペプチドリンカー」という用語は、ポリペプチド鎖の直鎖状アミノ酸配列中の２つ以上のドメイン（例えば、延長ＰＫ部分およびＩＬ２などのＩＬ部分）を連結するペプチドまたはポリペプチド配列を指す。例えば、ペプチドリンカーを使用して、サイトカイン部分をＨＳＡドメインに連結し得る。
例えばＩＬ２に延長ＰＫ基を融合するのに適したリンカーは、当技術分野で周知である。例示的なリンカーには、グリシン－セリンポリペプチドリンカー、グリシン－プロリンポリペプチドリンカー、およびプロリン－アラニンポリペプチドリンカーが含まれる。特定の実施形態では、リンカーは、グリシン－セリンポリペプチドリンカー、すなわち、グリシンおよびセリン残基からなるペプチドである。
上記の異種ポリペプチドに加えて、またはその代わりに、本明細書に記載のサイトカインバリアントポリペプチドは、「マーカ」または「レポータ」をコードする配列を含むことができる。マーカまたはレポータ遺伝子の例には、β－ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、β－ガラクトシダーゼ、およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が含まれる。
抗原
本明細書に記載の方法は、免疫エフェクタ細胞、特に抗原受容体を発現する免疫エフェクタ細胞、例えば抗原受容体を発現するように遺伝子操作された免疫エフェクタ細胞を、治療される対象において、同族抗原分子（本明細書では「抗原受容体によって標的化される抗原」、「ワクチン抗原」または単に「抗原」とも称される）と接触させる工程をさらに含み得、抗原分子またはそのプロセシング産物、例えばその断片は、免疫エフェクタ細胞によって担持されるＴＣＲまたはＣＡＲなどの抗原受容体に結合する。一実施形態では、同族抗原分子は、免疫エフェクタ細胞が標的とする標的細胞によって発現される抗原もしくはその断片、または前記抗原もしくは断片のバリアントを含む。
したがって、本明細書に記載の方法は、同族抗原分子、それをコードする核酸または同族抗原分子を発現する細胞を対象に投与する工程を含む。一実施形態では、同族抗原分子をコードする核酸は、対象の細胞で発現されて同族抗原分子を提供する。一実施形態では、同族抗原分子の発現は細胞表面で起こる。一実施形態では、同族抗原分子をコードする核酸は、対象の細胞において一過性に発現される。一実施形態では、同族抗原分子をコードする核酸はＲＮＡである。一実施形態では、同族抗原分子またはそれをコードする核酸は全身投与される。一実施形態では、同族抗原分子をコードする核酸の全身投与後、脾臓における同族抗原分子をコードする核酸の発現が起こる。一実施形態では、同族抗原分子をコードする核酸の全身投与後、抗原提示細胞、好ましくはプロフェッショナル抗原提示細胞における同族抗原分子をコードする核酸の発現が起こる。一実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞、マクロファージおよびＢ細胞からなる群より選択される。一実施形態では、同族抗原分子をコードする核酸の全身投与後、肺および／または肝臓における同族抗原分子をコードする核酸の発現は起こらないか、または本質的に起こらない。一実施形態では、同族抗原分子をコードする核酸の全身投与後、脾臓における同族抗原分子をコードする核酸の発現は、肺における発現量の少なくとも５倍である。
本発明に従って対象に提供されるペプチドおよびタンパク質抗原（ペプチドおよびタンパク質抗原、またはペプチドおよびタンパク質抗原をコードする核酸、特にＲＮＡ、またはペプチドおよびタンパク質抗原を発現する細胞のいずれかを投与することによって）、すなわちワクチン抗原は、好ましくは、ペプチドもしくはタンパク質抗原、核酸または細胞を投与されている対象において免疫エフェクタ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大をもたらす。前記刺激された、プライミングされたおよび／または拡大された免疫エフェクタ細胞は、好ましくは標的抗原、特に疾患細胞、組織および／または器官によって発現される標的抗原、すなわち疾患関連抗原に対して向けられる。したがって、ワクチン抗原は、疾患関連抗原、またはその断片もしくはバリアントを含み得る。一実施形態では、そのような断片またはバリアントは、疾患関連抗原と免疫学的に等価である。本開示の文脈において、「抗原の断片」または「抗原のバリアント」という用語は、免疫エフェクタ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大をもたらす薬剤を意味し、刺激、プライミングおよび／または拡大された免疫エフェクタ細胞は、特に疾患細胞、組織および／または器官によって提示された場合、抗原、すなわち疾患関連抗原を標的とする。したがって、ワクチン抗原は、疾患関連抗原に対応し得るかもしくはそれを含み得るか、疾患関連抗原の断片に対応し得るかもしくはそれを含み得るか、または疾患関連抗原もしくはその断片に相同な抗原に対応し得るかもしくはそれを含み得る。ワクチン抗原が、疾患関連抗原の断片または疾患関連抗原の断片に相同なアミノ酸配列を含む場合、前記断片またはアミノ酸配列は、免疫エフェクタ細胞の抗原受容体が標的とする疾患関連抗原のエピトープまたは疾患関連抗原のエピトープに相同な配列を含み得る。したがって、本開示によれば、ワクチン抗原は、疾患関連抗原の免疫原性断片または疾患関連抗原の免疫原性断片に相同なアミノ酸配列を含み得る。本開示による「抗原の免疫原性断片」は、好ましくは、抗原に結合する抗原受容体を担持する免疫エフェクタ細胞または抗原を発現する細胞を刺激、プライミングおよび／または拡大することができる抗原の断片に関する。ワクチン抗原（疾患関連抗原に類似）は、免疫エフェクタ細胞に存在する抗原結合ドメインによる結合のための関連エピトープを提供することが好ましい。一実施形態では、ワクチン抗原（疾患関連抗原に類似）は、免疫エフェクタ細胞による結合のための関連エピトープを提供するために、抗原提示細胞などの細胞の表面に発現される。一実施形態では、ワクチン抗原（疾患関連抗原に類似）は、免疫エフェクタ細胞による結合のための関連エピトープを提供するために、ＭＨＣに関連して抗原提示細胞などの細胞の表面に発現される。ワクチン抗原は組換え抗原であり得る。
本発明の全ての態様の一実施形態では、ワクチン抗原をコードする核酸は、対象の細胞で発現されて、免疫エフェクタ細胞によって発現される抗原受容体による結合のための抗原またはそのプロセシング産物を提供し、前記結合は免疫エフェクタ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大をもたらす。
「免疫学的に等価」という用語は、免疫学的に等価なアミノ酸配列などの免疫学的に等価な分子が、同じもしくは本質的に同じ免疫学的特性を示し、および／または、例えば免疫学的作用の種類に関して、同じもしくは本質的に同じ免疫学的効果を発揮することを意味する。本開示の文脈において、「免疫学的に等価」という用語は、好ましくは、免疫化のために使用される抗原または抗原バリアントの免疫学的効果または特性に関して使用される。例えば、アミノ酸配列が、参照アミノ酸配列に結合するＴ細胞または参照アミノ酸配列を発現する細胞などの対象の免疫系に暴露されたときに、参照アミノ酸配列と反応する特異性を有する免疫反応を誘導する場合、前記アミノ酸配列は参照アミノ酸配列と免疫学的に等価である。したがって、抗原と免疫学的に等価である分子は、Ｔ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大に関して、Ｔ細胞が標的とする抗原と同じもしくは本質的に同じ特性を示し、および／または同じもしくは本質的に同じ効果を発揮する。
本明細書で使用される「活性化」または「刺激」は、検出可能な細胞増殖を誘導するのに十分に刺激されたＴ細胞などの免疫エフェクタ細胞の状態を指す。活性化はまた、シグナル伝達経路の開始、サイトカイン産生の誘導、および検出可能なエフェクタ機能に関連し得る。「活性化免疫エフェクタ細胞」という用語は、とりわけ、細胞分裂を受けている免疫エフェクタ細胞を指す。
「プライミング」という用語は、Ｔ細胞などの免疫エフェクタ細胞がその特異的抗原と最初に接触し、エフェクタＴ細胞などのエフェクタ細胞への分化を引き起こす過程を指す。
「クローン拡大」または「拡大」という用語は、特定の実体が増加するプロセスを指す。本開示の文脈において、この用語は、好ましくは、リンパ球が抗原によって刺激され、増殖し、前記抗原を認識する特定のリンパ球が増幅される免疫学的応答の文脈で使用される。好ましくは、クローン拡大はリンパ球の分化をもたらす。
「抗原」という用語は、免疫応答を生じさせることができるエピトープを含む薬剤に関する。「抗原」という用語は、特にタンパク質およびペプチドを含む。一実施形態では、抗原は、樹状細胞またはマクロファージのような抗原提示細胞などの免疫系の細胞の表面に提示されるかまたは存在する。Ｔ細胞エピトープなどの抗原またはそのプロセシング産物は、一実施形態では、抗原受容体によって結合される。したがって、抗原またはそのプロセシング産物は、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）などの免疫エフェクタ細胞と特異的に反応し得る。一実施形態では、抗原は、腫瘍抗原、ウイルス抗原、または細菌抗原などの疾患関連抗原であり、エピトープはそのような抗原に由来する。
「疾患関連抗原」という用語は、疾患に関連する任意の抗原を指すためにその最も広い意味で使用される。疾患関連抗原は、宿主の免疫系を刺激して疾患に対する細胞性抗原特異的免疫応答および／または体液性抗体応答を生じさせるエピトープを含む分子である。したがって、疾患関連抗原またはそのエピトープは、治療目的に使用され得る。疾患関連抗原は、微生物、典型的には微生物抗原による感染に関連し得るか、または癌、典型的には腫瘍に関連し得る。
「腫瘍抗原」または「腫瘍関連抗原」という用語は、細胞質、細胞表面および細胞核に由来し得る癌細胞の成分を指す。特に、この用語は、細胞内でまたは腫瘍細胞上の表面抗原として産生される抗原を指す。腫瘍抗原は、典型的には癌細胞によって選択的に発現され（例えば、非癌細胞よりも癌細胞においてより高いレベルで発現される）、場合によっては、癌細胞によってのみ発現される。腫瘍抗原の例には、限定されることなく、ｐ５３、ＡＲＴ－４、ＢＡＧＥ、β－カテニン／ｍ、Ｂｃｒ－ａｂＬ ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ－１、ＣＡＳＰ－８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、クローディン６、クローディン１８．２およびクローディン１２などのクローディンファミリーの細胞表面タンパク質、ｃ－ＭＹＣ、ＣＴ、Ｃｙｐ－Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ－Ｖ、Ｇａｐ １００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＰＶ－Ｅ７、ＨＰＶ－Ｅ６、ＨＡＳＴ－２、ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ）、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ－Ａ、好ましくはＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ７、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１、またはＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ｂ、ＭＡＧＥ－Ｃ、ＭＡＲＴ－１／メランＡ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、ＮＡ８８－Ａ、ＮＦ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＢＲ－１、ｐｌ９０マイナーＢＣＲ－ａｂＬ、Ｐｍｌ／ＲＡＲａ、ＰＲＡＭＥ、プロテイナーゼ３、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１またはＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ－１またはＳＡＲＴ－３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＳＣＰ１、ＳＣＰ２、ＳＣＰ３、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、ＴＰＴＥ、ＷＴ、およびＷＴ－１が含まれる。特に、好ましい腫瘍抗原は、ＣＬＡＵＤＩＮ－６またはＣＬＡＵＤＩＮ－１８．２などのクローディンファミリーのタンパク質である。
「ウイルス抗原」という用語は、抗原特性を有する、すなわち個体において免疫応答を誘発することができる任意のウイルス成分を指す。ウイルス抗原は、ウイルスリボ核タンパク質またはエンベロープタンパク質であり得る。
「細菌抗原」という用語は、抗原特性を有する、すなわち個体において免疫応答を誘発することができる任意の細菌成分を指す。細菌抗原は、細菌の細胞壁または細胞質膜に由来し得る。
「細胞表面に発現された」または「細胞表面と会合した」という用語は、受容体または抗原などの分子が細胞の形質膜と会合して位置し、分子の少なくとも一部が前記細胞の細胞外空間に面しており、例えば細胞の外側に位置する抗体によって前記細胞の外側からアクセス可能であることを意味する。これに関連して、一部とは、好ましくは少なくとも４個、好ましくは少なくとも８個、好ましくは少なくとも１２個、より好ましくは少なくとも２０個のアミノ酸である。会合は、直接的または間接的であり得る。例えば、会合は、１つ以上の膜貫通ドメイン、１つ以上の脂質アンカーによるものであり得るか、または他の任意のタンパク質、脂質、サッカリド、もしくは細胞の形質膜の外葉に見出され得る他の構造との相互作用によるものであり得る。例えば、細胞の表面と会合する分子は、細胞外部分を有する膜貫通タンパク質であり得るか、または膜貫通タンパク質である別のタンパク質と相互作用することによって細胞の表面と会合するタンパク質であり得る。
「細胞表面」または「細胞の表面」は、当技術分野におけるその通常の意味に従って使用され、したがって、タンパク質および他の分子による結合にアクセス可能な細胞の外側を含む。抗原は、それが前記細胞の表面に位置し、例えば細胞に加えられた抗原特異的抗体による結合にアクセス可能である場合、細胞の表面に発現される。一実施形態では、細胞の表面に発現される抗原は、ＣＡＲによって認識される細胞外部分を有する内在性膜タンパク質である。
本発明の文脈における「細胞外部分」または「エキソドメイン」という用語は、細胞の細胞外空間に面しており、好ましくは、例えば細胞の外側に位置する抗体などの分子に結合することによって、前記細胞の外側からアクセス可能であるタンパク質などの分子の一部を指す。好ましくは、この用語は、１つ以上の細胞外ループもしくはドメインまたはその断片を指す。
「エピトープ」という用語は、免疫系によって認識される抗原などの分子の一部または断片を指す。例えば、エピトープは、Ｔ細胞、Ｂ細胞または抗体によって認識され得る。抗原のエピトープは、抗原の連続部分または不連続部分を含み得、約５～約１００、例えば約５～約５０、より好ましくは約８～約３０、最も好ましくは約１０～約２５アミノ酸の長さであり得、例えば、エピトープは、好ましくは９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸の長さであり得る。一実施形態では、エピトープは、約１０～約２５アミノ酸の長さである。「エピトープ」という用語は、Ｔ細胞エピトープを含む。
「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、ＭＨＣ分子に関連して提示された場合にＴ細胞によって認識されるタンパク質の一部または断片を指す。「主要組織適合遺伝子複合体」という用語および「ＭＨＣ」という略語は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子を含み、全ての脊椎動物に存在する遺伝子の複合体に関する。ＭＨＣタンパク質または分子は、免疫反応におけるリンパ球と抗原提示細胞または疾患細胞との間のシグナル伝達に重要であり、ＭＨＣタンパク質または分子はペプチドエピトープに結合し、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体による認識のためにそれらを提示する。ＭＨＣによってコードされるタンパク質は、細胞の表面に発現され、自己抗原（細胞自体からのペプチド断片）および非自己抗原（例えば侵入微生物の断片）の両方をＴ細胞に表示する。クラスＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には約８～約１０アミノ酸長であるが、より長いまたはより短いペプチドも有効であり得る。クラスＩＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは、典型的には約１０～約２５アミノ酸長であり、特に約１３～約１８アミノ酸長であるが、より長いおよびより短いペプチドも有効であり得る。
一実施形態では、標的抗原は腫瘍抗原であり、ワクチン抗原またはその断片（例えばエピトープ）は腫瘍抗原に由来する。腫瘍抗原は、様々な癌で発現されることが一般的に公知の「標準」抗原であり得る。腫瘍抗原はまた、個体の腫瘍に特異的であり、免疫系によってそれまでに認識されていない「ネオ抗原」であり得る。ネオ抗原またはネオエピトープは、アミノ酸変化をもたらす癌細胞のゲノムにおける１つ以上の癌特異的変異から生じ得る。腫瘍抗原がネオ抗原である場合、ワクチン抗原は、好ましくは、１つ以上のアミノ酸変化を含む前記ネオ抗原のエピトープまたは断片を含む。
癌の変異は各個体によって異なる。したがって、新規エピトープ（ネオエピトープ）をコードする癌変異は、ワクチン組成物および免疫療法の開発における魅力的な標的である。腫瘍免疫療法の有効性は、宿主内で強力な免疫応答を誘導することができる癌特異的抗原およびエピトープの選択に依存する。ＲＮＡは、患者特異的腫瘍エピトープを患者に送達するために使用することができる。脾臓に存在する樹状細胞（ＤＣ）は、腫瘍エピトープなどの免疫原性エピトープまたは抗原のＲＮＡ発現のための特に興味深い抗原提示細胞である。複数のエピトープの使用は、腫瘍ワクチン組成物における治療効果を促進することが示されている。腫瘍ミュータノームの迅速な配列決定は、本明細書に記載のＲＮＡによってコードされ得る個別化ワクチンのための複数のエピトープを、例えば、エピトープが任意でリンカーによって分離されている単一のポリペプチドとして提供し得る。本開示の特定の実施形態では、ＲＮＡは、少なくとも１つのエピトープ、少なくとも２つのエピトープ、少なくとも３つのエピトープ、少なくとも４つのエピトープ、少なくとも５つのエピトープ、少なくとも６つのエピトープ、少なくとも７つのエピトープ、少なくとも８つのエピトープ、少なくとも９つのエピトープ、または少なくとも１０のエピトープをコードする。例示的な実施形態は、少なくとも５つのエピトープ（「ペンタトープ」と称される）をコードするＲＮＡおよび少なくとも１０のエピトープ（「デカトープ」と称される）をコードするＲＮＡを含む。
本発明の様々な態様によれば、目的は、好ましくは、ＣＬＤＮ６またはＣＬＤＮ１８．２などの腫瘍抗原を発現する癌細胞に対する免疫応答を提供すること、およびＣＬＤＮ６またはＣＬＤＮ１８．２などの腫瘍抗原を発現する細胞が関与する癌疾患を治療することである。好ましくは、本発明は、ＣＬＤＮ６またはＣＬＤＮ１８．２などの腫瘍抗原を発現する癌細胞に対して標的化されたＴ細胞などの抗原受容体操作免疫エフェクタ細胞の投与を含む。
ペプチドおよびタンパク質抗原は、例えば、５アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸、３０アミノ酸、３５アミノ酸、４０アミノ酸、４５アミノ酸、または５０アミノ酸を含む、２～１００アミノ酸の長さであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、５０個を超えるアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、１００個を超えるアミノ酸であり得る。
本発明によれば、ワクチン抗原は免疫エフェクタ細胞によって認識可能でなければならない。好ましくは、抗原は、免疫エフェクタ細胞によって認識される場合、適切な共刺激シグナルの存在下で、抗原を認識する抗原受容体を担持する免疫エフェクタ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大を誘導することができる。本発明の実施形態の文脈において、抗原は、好ましくは細胞の表面、好ましくは抗原提示細胞の表面に存在する。疾患細胞の表面上の抗原の認識は、抗原（または抗原を発現する細胞）に対する免疫反応をもたらし得る。
本発明の全ての態様の一実施形態では、抗原は、癌細胞などの疾患細胞で発現される。一実施形態では、抗原は、癌細胞などの疾患細胞の表面に発現される。一実施形態では、抗原受容体は、抗原の細胞外ドメインまたは細胞外ドメインのエピトープに結合するＣＡＲである。一実施形態では、ＣＡＲは、生細胞の表面に存在する抗原の天然エピトープに結合する。一実施形態では、Ｔ細胞によって発現された場合および／またはＴ細胞上に存在する場合のＣＡＲの、抗原提示細胞などの細胞上に存在する抗原への結合は、前記Ｔ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大をもたらす。一実施形態では、Ｔ細胞によって発現された場合および／またはＴ細胞上に存在する場合のＣＡＲの、癌細胞などの疾患細胞上に存在する抗原への結合は、疾患細胞の細胞溶解および／またはアポトーシスをもたらし、前記Ｔ細胞は、好ましくは細胞傷害性因子、例えばパーフォリンおよびグランザイムを放出する。
化学療法
特定の実施形態では、本明細書に記載の治療と組み合わせて、さらなる治療を患者に投与し得る。そのようなさらなる治療には、古典的な癌治療、例えば、放射線療法、手術、温熱療法および／または化学療法が含まれる。
化学療法は、通常、標準化された化学療法レジメンの一部として、１つ以上の抗癌剤（化学療法剤）を使用する癌治療の一種である。化学療法という用語は、有糸分裂を阻害するための細胞内毒の非特異的使用を含意するようになった。この含意は、細胞外シグナル（シグナル伝達）を遮断する、より選択的な薬剤を除外する。古典的な内分泌ホルモン（主に、乳癌のためのエストロゲンおよび前立腺癌のためのアンドロゲン）からの成長促進シグナルを阻害する特定の分子または遺伝子標的による治療法の開発は、現在ホルモン療法と呼ばれている。対照的に、受容体チロシンキナーゼに関連するもののような成長シグナルの他の阻害は、標的療法と称される。
重要なことに、薬物の使用（化学療法、ホルモン療法または標的療法にかかわらず）は、血流に導入され、したがって原則として体内の任意の解剖学的位置で癌に対処することができるという点で、癌の全身療法を構成する。全身療法は、放射線療法、手術または温熱療法などの癌の局所療法（すなわち、その有効性が適用される解剖学的領域に限定される治療）を構成する他のモダリティと組み合わせて使用されることが多い。
伝統的な化学療法剤は、細胞分裂（有糸分裂）を妨げることによって細胞傷害性であるが、癌細胞はこれらの薬剤に対する感受性が大きく異なる。大部分において、化学療法は、細胞を損傷するまたは細胞にストレスを加える方法と考えることができ、アポトーシスが開始された場合、細胞死をもたらし得る。
化学療法剤には、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害剤、および細胞傷害性抗生物質が含まれる。
アルキル化剤は、タンパク質、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む多くの分子をアルキル化する能力を有する。アルキル化剤のサブタイプは、ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、テトラジン、アジリジン、シスプラチンおよび誘導体、ならびに非古典的アルキル化剤である。ナイトロジェンマスタードには、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミドおよびブスルファンが含まれる。ニトロソ尿素には、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－メチル尿素（ＭＮＵ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）およびセムスチン（ＭｅＣＣＮＵ）、フォテムスチンおよびストレプトゾトシンが含まれる。テトラジンには、ダカルバジン、ミトゾロミドおよびテモゾロミドが含まれる。アジリジンには、チオテパ、マイトマイシンおよびジアジコン（ＡＺＱ）が含まれる。シスプラチンおよび誘導体には、シスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチンが含まれる。これらは、生物学的に重要な分子中のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基およびリン酸基と共有結合を形成することによって細胞機能を損なう。非古典的なアルキル化剤には、プロカルバジンおよびヘキサメチルメラミンが含まれる。特に好ましい一実施形態では、アルキル化剤はシクロホスファミドである。
代謝拮抗剤は、ＤＮＡおよびＲＮＡの合成を妨げる分子の群である。それらの多くは、ＤＮＡおよびＲＮＡのビルディングブロックと類似の構造を有する。代謝拮抗剤は、核酸塩基またはヌクレオシドのいずれかに類似するが、変化した化学基を有する。これらの薬物は、ＤＮＡ合成に必要な酵素を遮断するか、またはＤＮＡもしくはＲＮＡに組み込まれることによって効果を発揮する。代謝拮抗剤のサブタイプは、葉酸拮抗剤、フルオロピリミジン、デオキシヌクレオシド類似体およびチオプリンである。葉酸拮抗剤には、メトトレキサートおよびペメトレキセドが含まれる。フルオロピリミジンには、フルオロウラシルおよびカペシタビンが含まれる。デオキシヌクレオシド類似体には、シタラビン、ゲムシタビン、デシタビン、アザシチジン、フルダラビン、ネララビン、クラドリビン、クロファラビン、およびペントスタチンが含まれる。チオプリンには、チオグアニンおよびメルカプトプリンが含まれる。
抗微小管剤は、微小管機能を妨げることによって細胞分裂を阻止する。ビンカアルカロイドは微小管の形成を妨げ、タキサンは微小管の分解を防止する。ビンカアルカロイドには、ビノレルビン、ビンデシン、およびビンフルニンが含まれる。タキサンには、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）およびパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）が含まれる。
トポイソメラーゼ阻害剤は、２つの酵素：トポイソメラーゼＩおよびトポイソメラーゼＩＩの活性に影響を及ぼす薬物であり、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、エトポシド、ドキソルビシン、ミトキサントロン、テニポシド、ノボビオシン、メルバロン、およびアクラルビシンが含まれる。
細胞傷害性抗生物質は、様々な作用機序を有する薬物の多様な群である。それらが化学療法の指標において共有する共通の主題は、細胞分裂を中断することである。最も重要なサブグループは、アントラサイクリン（例えばドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシンピラルビシンおよびアクラルビシン）ならびにブレオマイシンである；他の顕著な例には、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、およびアクチノマイシンが含まれる。
一実施形態では、免疫エフェクタ細胞の投与の前に、例えばシクロホスファミドおよびフルダラビンを投与することによって、リンパ球枯渇治療を適用し得る。そのような治療は、細胞持続性ならびに臨床応答の発生率および持続時間を増加させ得る。
免疫チェックポイント阻害剤
特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤が、本明細書に記載される他の治療薬と組み合わせて使用される。
本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイント」は、抗原のＴ細胞受容体認識の大きさおよび質を調節する共刺激および阻害シグナルを指す。特定の実施形態では、免疫チェックポイントは阻害シグナルである。特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用である。特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＣＤ２８結合を置き換えるＣＴＬＡ－４とＣＤ８０またはＣＤ８６との間の相互作用である。特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＬＡＧ３とＭＨＣクラスＩＩ分子との間の相互作用である。特定の実施形態では、阻害シグナルは、ＴＩＭ３とガレクチン９との間の相互作用である。
本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイント阻害剤」は、１つ以上のチェックポイントタンパク質を完全にまたは部分的に低減する、阻害する、妨げるまたは調節する分子を指す。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントに関連する阻害シグナルを防止する。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントに関連する阻害シグナル伝達を妨害する抗体またはその断片である。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、阻害シグナル伝達を妨害する小分子である。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、チェックポイント遮断タンパク質間の相互作用を妨げる抗体、その断片、または抗体模倣物、例えば、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を妨げる抗体またはその断片である。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４とＣＤ８０またはＣＤ８６との間の相互作用を妨げる抗体またはその断片である。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＬＡＧ３とそのリガンド、またはＴＩＭ－３とそのリガンドとの間の相互作用を妨げる抗体またはその断片である。チェックポイント阻害剤はまた、分子（またはそのバリアント）自体の可溶性形態、例えば可溶性ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ１融合物の形態であり得る。
「プログラム死１（ＰＤ－１）」受容体は、ＣＤ２８ファミリーに属する免疫抑制受容体を指す。ＰＤ－１は、インビボで以前に活性化されたＴ細胞上で主に発現され、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ２の２つのリガンドに結合する。本明細書で使用される「ＰＤ－１」という用語は、ヒトＰＤ－１（ｈＰＤ－１）、ｈＰＤ－１のバリアント、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＰＤ－１と少なくとも１つの共通のエピトープを有する類似体を含む。
「プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）」は、ＰＤ－１に結合するとＴ細胞の活性化およびサイトカイン分泌を下方制御する、ＰＤ－１の２つの細胞表面糖タンパク質リガンドの１つ（もう１つはＰＤ－Ｌ２）である。本明細書で使用される「ＰＤ－Ｌ１」という用語は、ヒトＰＤ－Ｌ１（ｈＰＤ－Ｌ１）、ｈＰＤ－Ｌ１のバリアント、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＰＤ－Ｌ１と少なくとも１つの共通のエピトープを有する類似体を含む。
「細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ－４）」は、Ｔ細胞表面分子であり、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。このタンパク質は、ＣＤ８０およびＣＤ８６に結合することによって免疫系を下方制御する。本明細書で使用される「ＣＴＬＡ－４」という用語は、ヒトＣＴＬＡ－４（ｈＣＴＬＡ－４）、ｈＣＴＬＡ－４のバリアント、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびにｈＣＴＬＡ－４と少なくとも１つの共通のエピトープを有する類似体を含む。
「リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）」は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することによるリンパ球活性の阻害に関連する阻害性受容体である。この受容体は、Ｔｒｅｇ細胞の機能を増強し、ＣＤ８＋エフェクタＴ細胞の機能を阻害する。本明細書で使用される「ＬＡＧ３」という用語は、ヒトＬＡＧ３（ｈＬＡＧ３）、ｈＬＡＧ３のバリアント、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびに少なくとも１つの共通のエピトープを有する類似体を含む。
「Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）」は、ＴＨ１細胞応答の阻害によるリンパ球活性の阻害に関与する阻害性受容体である。そのリガンドは、様々な種類の癌で上方制御されるガレクチン９である。本明細書で使用される「ＴＩＭ３」という用語は、ヒトＴＩＭ３（ｈＴＩＭ３）、ｈＴＩＭ３のバリアント、アイソフォーム、および種ホモログ、ならびに少なくとも１つの共通のエピトープを有する類似体を含む。
「Ｂ７ファミリー」は、未定義の受容体との阻害性リガンドを指す。Ｂ７ファミリーはＢ７－Ｈ３およびＢ７－Ｈ４を包含し、どちらも腫瘍細胞および腫瘍浸潤細胞で上方制御される。
特定の実施形態では、本明細書に開示される方法での使用に適した免疫チェックポイント阻害剤は、阻害シグナルのアンタゴニスト、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、またはＴＩＭ３を標的とする抗体である。これらのリガンドおよび受容体は、Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．，Ｎａｔｕｒｅ．１２：２５２－２６４，２０１２に総説されている。
特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抑制性免疫調節因子からのシグナル伝達を妨害または阻害する抗体またはその抗原結合部分である。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抑制性免疫調節因子からのシグナル伝達を妨害または阻害する小分子である。
特定の実施形態では、抑制性免疫調節因子は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１シグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、ＰＤ－１受容体とそのリガンドであるＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を妨害する抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを提供する。ＰＤ－１に結合し、ＰＤ－１とそのリガンドであるＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を妨害する抗体は、当技術分野で公知である。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＰＤ－１に特異的に結合する。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、ＰＤ－１とのその相互作用を阻害し、それによって免疫活性を増加させる。
特定の実施形態では、抑制性免疫調節因子は、ＣＴＬＡ４シグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、ＣＴＬＡ４を標的とし、ＣＤ８０およびＣＤ８６とのその相互作用を妨害する抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを提供する。
特定の実施形態では、抑制性免疫調節因子は、ＬＡＧ３（リンパ球活性化遺伝子３）シグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、ＬＡＧ３を標的とし、ＭＨＣクラスＩＩ分子とのその相互作用を妨害する抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを提供する。
特定の実施形態では、抑制性免疫調節因子は、Ｂ７ファミリーシグナル伝達経路の成分である。特定の実施形態では、Ｂ７ファミリーメンバーは、Ｂ７－Ｈ３およびＢ７－Ｈ４である。したがって、本開示の特定の実施形態は、Ｂ７－Ｈ３またはＢ７－Ｈ４を標的とする抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを提供する。Ｂ７ファミリーは定義された受容体を有さないが、これらのリガンドは腫瘍細胞または腫瘍浸潤細胞で上方制御される。前臨床マウスモデルは、これらのリガンドの遮断が抗腫瘍免疫を増強し得ることを示している。
特定の実施形態では、抑制性免疫調節因子は、ＴＩＭ３（Ｔ細胞膜タンパク質３）シグナル伝達経路の成分である。したがって、本開示の特定の実施形態は、ＴＩＭ３を標的とし、ガレクチン９とのその相互作用を妨害する抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを提供する。
標的化が、例えばＴ細胞増殖の増加、Ｔ細胞活性化の増強、および／またはサイトカイン産生の増加（例えばＩＦＮ－γ、ＩＬ２）に反映されるような抗腫瘍免疫応答などの免疫応答の刺激をもたらすことを条件として、他の免疫チェックポイント標的もまた、アンタゴニストまたは抗体によって標的化され得ることが当業者に理解されるであろう。
ＲＮＡ標的化
本発明によれば、本明細書に記載のペプチド、タンパク質またはポリペプチド、特にワクチン抗原は、本明細書に記載のペプチド、タンパク質またはポリペプチドをコードするＲＮＡの形態で投与されることが特に好ましい。一実施形態では、本明細書に記載の異なるペプチド、タンパク質またはポリペプチドは、異なるＲＮＡ分子によってコードされる。
一実施形態では、ＲＮＡは送達ビヒクルに製剤化される。一実施形態では、送達ビヒクルは粒子を含む。一実施形態では、送達ビヒクルは少なくとも１つの脂質を含む。一実施形態では、少なくとも１つの脂質は、少なくとも１つのカチオン性脂質を含む。一実施形態では、脂質は、ＲＮＡと複合体を形成し、および／またはＲＮＡを封入する。一実施形態では、脂質は、ＲＮＡを封入する小胞に含まれる。一実施形態では、ＲＮＡはリポソームに製剤化される。
本開示によれば、本明細書に記載のＲＮＡの投与後、ＲＮＡの少なくとも一部が標的細胞に送達される。一実施形態では、ＲＮＡの少なくとも一部は、標的細胞のサイトゾルに送達される。一実施形態では、ＲＮＡは、標的細胞によって翻訳されて、コードされたペプチドまたはタンパク質を産生する。
本開示のいくつかの態様は、本明細書に開示されるＲＮＡ（例えばワクチン抗原をコードするＲＮＡ）の標的化送達を含む。
一実施形態では、本開示は、リンパ系、特に二次リンパ器官、より具体的には脾臓を標的とすることを含む。投与されるＲＮＡがワクチン抗原をコードするＲＮＡである場合、リンパ系、特に二次リンパ器官、より具体的には脾臓を標的とすることが特に好ましい。
一実施形態では、標的細胞は脾臓細胞である。一実施形態では、標的細胞は、脾臓におけるプロフェッショナル抗原提示細胞などの抗原提示細胞である。一実施形態では、標的細胞は、脾臓における樹状細胞である。
「リンパ系」は循環系の一部であり、リンパを運ぶリンパ管のネットワークを含む免疫系の重要な部分である。リンパ系は、リンパ器官、リンパ管の伝導ネットワーク、および循環リンパからなる。一次または中枢リンパ器官は、未成熟な前駆細胞からリンパ球を生成する。胸腺および骨髄は、一次リンパ器官を構成する。リンパ節および脾臓を含む二次または末梢リンパ器官は、成熟したナイーブリンパ球を維持し、適応免疫応答を開始する。
ＲＮＡは、ＲＮＡがカチオン性脂質および任意でさらなる脂質またはヘルパー脂質を含むリポソームに結合して、注射可能なナノ粒子製剤を形成する、いわゆるリポプレックス製剤によって脾臓に送達され得る。リポソームは、エタノール中の脂質の溶液を水または適切な水相に注入することによって得られ得る。ＲＮＡリポプレックス粒子は、リポソームをＲＮＡと混合することによって調製され得る。脾臓を標的とするＲＮＡリポプレックス粒子は、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１３／１４３６８３号に記載されている。正味の負電荷を有するＲＮＡリポプレックス粒子は、脾臓組織または脾臓細胞、例えば抗原提示細胞、特に樹状細胞を選択的に標的とするために使用し得ることが見出された。したがって、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、脾臓におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が起こる。したがって、本開示のＲＮＡリポプレックス粒子は、脾臓においてＲＮＡを発現させるために使用され得る。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、肺および／または肝臓におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現は、全く起こらないかまたは本質的に起こらない。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子の投与後、脾臓内のプロフェッショナル抗原提示細胞などの抗原提示細胞におけるＲＮＡ蓄積および／またはＲＮＡ発現が起こる。したがって、本開示のＲＮＡリポプレックス粒子は、そのような抗原提示細胞においてＲＮＡを発現させるために使用され得る。一実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞および／またはマクロファージである。
本開示の文脈において、「ＲＮＡリポプレックス粒子」という用語は、脂質、特にカチオン性脂質、およびＲＮＡを含む粒子に関する。そのようなカチオン性脂質は上に記載されている。正に帯電したリポソームと負に帯電したＲＮＡとの間の静電相互作用は、複合体化とＲＮＡリポプレックス粒子の自発的形成をもたらす。正に帯電したリポソームは、一般に、ＤＯＴＭＡなどのカチオン性脂質、およびＤＯＰＥなどのさらなる脂質を使用して合成され得る。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子はナノ粒子である。
ＲＮＡリポプレックス粒子の全体的な正電荷対負電荷の比率および物理的安定性を調整するためにさらなる脂質を組み込んでもよい。そのようなさらなる脂質は上に記載されている。特定の実施形態では、さらなる脂質は中性脂質である。本明細書で使用される場合、「中性脂質」は、ゼロの正味電荷を有する脂質を指す。中性脂質の例には、１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、およびセレブロシドが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、さらなる脂質は、ＤＯＰＥ、コレステロール、および／またはＤＯＰＣである。
特定の実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、カチオン性脂質およびさらなる脂質の両方を含む。例示的な実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＴＭＡであり、さらなる脂質はＤＯＰＥである。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質対少なくとも１つのさらなる脂質のモル比は、約１０：０～約１：９、約４：１～約１：２、または約３：１～約１：１である。特定の実施形態では、モル比は、約３：１、約２．７５：１、約２．５：１、約２．２５：１、約２：１、約１．７５：１、約１．５：１、約１．２５：１、または約１：１であり得る。例示的な実施形態では、少なくとも１つのカチオン性脂質対少なくとも１つのさらなる脂質のモル比は、約２：１である。
本明細書に記載のＲＮＡリポプレックス粒子は、一実施形態では、約２００ｎｍ～約１０００ｎｍ、約２００ｎｍ～約８００ｎｍ、約２５０ｎｍ～約７００ｎｍ、約４００ｎｍ～約６００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５００ｎｍ、または約３５０ｎｍ～約４００ｎｍの範囲の平均直径を有する。特定の実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約２００ｎｍ、約２２５ｎｍ、約２５０ｎｍ、約２７５ｎｍ、約３００ｎｍ、約３２５ｎｍ、約３５０ｎｍ、約３７５ｎｍ、約４００ｎｍ、約４２５ｎｍ、約４５０ｎｍ、約４７５ｎｍ、約５００ｎｍ、約５２５ｎｍ、約５５０ｎｍ、約５７５ｎｍ、約６００ｎｍ、約６２５ｎｍ、約６５０ｎｍ、約７００ｎｍ、約７２５ｎｍ、約７５０ｎｍ、約７７５ｎｍ、約８００ｎｍ、約８２５ｎｍ、約８５０ｎｍ、約８７５ｎｍ、約９００ｎｍ、約９２５ｎｍ、約９５０ｎｍ、約９７５ｎｍ、または約１０００ｎｍの平均直径を有する。一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約２５０ｎｍ～約７００ｎｍの範囲の平均直径を有する。別の実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約３００ｎｍ～約５００ｎｍの範囲の平均直径を有する。例示的な実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子は、約４００ｎｍの平均直径を有する。
本開示のＲＮＡリポプレックス粒子の電荷は、少なくとも１つのカチオン性脂質中に存在する電荷とＲＮＡ中に存在する電荷との合計である。電荷比は、少なくとも１つのカチオン性脂質中に存在する正電荷とＲＮＡ中に存在する負電荷の比である。少なくとも１つのカチオン性脂質中に存在する正電荷とＲＮＡ中に存在する負電荷の電荷比は、以下の式によって計算される：電荷比＝［（カチオン性脂質濃度（ｍｏｌ））＊（カチオン性脂質中の正電荷の総数）］／［（ＲＮＡ濃度（ｍｏｌ））＊（ＲＮＡ中の負電荷の総数）］。
生理的ｐＨでの本明細書に記載の脾臓を標的とするＲＮＡリポプレックス粒子は、好ましくは、約１．９：２～約１：２の正電荷対負電荷の電荷比などの正味負電荷を有する。特定の実施形態では、生理的ｐＨでのＲＮＡリポプレックス粒子における正電荷対負電荷の電荷比は、約１．９：２．０、約１．８：２．０、約１．７：２．０、約１．６：２．０、約１．５：２．０、約１．４：２．０、約１．３：２．０、約１．２：２．０、約１．１：２．０、または約１：２．０である。
ＲＮＡ送達システムは、肝臓に対する固有の選択性を有する。これは、脂質ベースの粒子、カチオン性および中性ナノ粒子、特にリポソーム、ナノミセルおよびバイオコンジュゲート中の親油性リガンドなどの脂質ナノ粒子に関連する。肝臓蓄積は、肝血管系の不連続な性質または脂質代謝（リポソームおよび脂質もしくはコレステロールコンジュゲート）によって引き起こされる。
ＩＬ２などのサイトカインの標的化送達の一実施形態では、標的器官は肝臓であり、標的組織は肝臓組織である。そのような標的組織への送達は、特に、この器官もしくは組織におけるサイトカインの存在が望ましい場合、および／または大量のサイトカインを発現することが望ましい場合、および／またはサイトカインの全身的な存在、特に有意の量での存在が望ましいかもしくは必要とされる場合に好ましい。
一実施形態では、サイトカインをコードするＲＮＡは、肝臓を標的とするための製剤中で投与される。そのような製剤は、本明細書で上記に記載されている。
肝臓へのＲＮＡのインビボ送達のために、薬物送達システムを使用して、その分解を防止することによってＲＮＡを肝臓に輸送し得る。例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）被覆表面とｍＲＮＡ含有コアからなるポリプレックスナノミセルは、ナノミセルが生理的条件下でＲＮＡの優れたインビボ安定性を提供するので、有用な系である。さらに、密なＰＥＧパリセードで構成されるポリプレックスナノミセル表面によって提供されるステルス特性は、宿主の免疫防御を有効に回避する。
医薬組成物
本明細書に記載される核酸、核酸粒子、ペプチド、タンパク質、ポリペプチド、ＲＮＡ、ＲＮＡ粒子、免疫エフェクタ細胞およびさらなる薬剤、例えば免疫チェックポイント阻害剤は、治療的または予防的処置のための医薬組成物または医薬品中で投与され得、薬学的に許容される担体を含み得、任意で１つ以上のアジュバント、安定剤などを含み得る任意の適切な医薬組成物の形態で投与され得る。一実施形態では、医薬組成物は、治療的または予防的処置、例えば本明細書に記載されるような癌疾患などの抗原が関与する疾患の治療または予防に使用するためのものである。
「医薬組成物」という用語は、治療上有効な薬剤を、好ましくは薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤と共に含む製剤に関する。前記医薬組成物は、前記医薬組成物を対象に投与することによって疾患または障害を治療する、予防する、またはその重症度を軽減するのに有用である。医薬組成物は、当技術分野では医薬製剤としても公知である。本開示の文脈において、医薬組成物は、本明細書に記載される核酸、核酸粒子、ペプチド、タンパク質、ポリペプチド、ＲＮＡ、ＲＮＡ粒子、免疫エフェクタ細胞および／またはさらなる薬剤を含む。
本開示の医薬組成物は、１つ以上のアジュバントを含み得るか、または１つ以上のアジュバントと共に投与され得る。「アジュバント」という用語は、免疫応答を延長、増強または加速する化合物に関する。アジュバントは、油エマルジョン（例えばフロイントアジュバント）、無機化合物（ミョウバンなど）、細菌産物（百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）毒素など）、または免疫刺激複合体などの不均一な化合物の群を含む。アジュバントの例には、限定されることなく、ＬＰＳ、ＧＰ９６、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、成長因子、およびモノカイン、リンホカイン、インターロイキン、ケモカインなどのサイトカインが含まれる。サイトカインは、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＬＴ－ａであり得る。さらなる公知のアジュバントは、水酸化アルミニウム、フロイントアジュバント、またはＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＳＡ５１などの油である。本開示で使用するための他の適切なアジュバントには、Ｐａｍ３Ｃｙｓなどのリポペプチドが含まれる。
本開示による医薬組成物は、一般に、「薬学的有効量」および「薬学的に許容される製剤」で適用される。
「薬学的に許容される」という用語は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない物質の非毒性を指す。
「薬学的有効量」または「治療有効量」という用語は、単独でまたはさらなる用量と共に所望の反応または所望の効果を達成する量を指す。特定の疾患の治療の場合、所望の反応は、好ましくは疾患の経過の阻害に関する。これは、疾患の進行を遅らせること、特に疾患の進行を中断するまたは逆転させることを含む。疾患の治療における所望の反応はまた、前記疾患または前記状態の発症の遅延または発症の予防であり得る。本明細書に記載の組成物の有効量は、治療される状態、疾患の重症度、年齢、生理学的状態、サイズおよび体重を含む患者の個々のパラメータ、治療の期間、付随する治療の種類（存在する場合）、特定の投与経路ならびに同様の因子に依存する。したがって、本明細書に記載の組成物の投与量は、そのような様々なパラメータに依存し得る。患者の反応が初期用量では不十分である場合、より高い用量（または異なる、より限局された投与経路によって達成される効果的により高い用量）を使用し得る。
本開示の医薬組成物は、塩、緩衝剤、防腐剤、および任意で他の治療薬を含み得る。一実施形態では、本開示の医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤を含む。
本開示の医薬組成物で使用するための適切な防腐剤には、限定されることなく、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールが含まれる。
本明細書で使用される「賦形剤」という用語は、本開示の医薬組成物中に存在し得るが、活性成分ではない物質を指す。賦形剤の例には、限定されることなく、担体、結合剤、希釈剤、潤滑剤、増粘剤、界面活性剤、防腐剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤、香味剤、または着色剤が含まれる。
「希釈剤」という用語は、希釈するおよび／または希薄にする薬剤に関する。さらに、「希釈剤」という用語は、流体、液体または固体の懸濁液および／または混合媒体のいずれか１つ以上を含む。適切な希釈剤の例には、エタノール、グリセロールおよび水が含まれる。
「担体」という用語は、医薬組成物の投与を容易にする、増強するまたは可能にするために活性成分が組み合わされる、天然、合成、有機、無機であり得る成分を指す。本明細書で使用される担体は、対象への投与に適した、１つ以上の適合性の固体または液体充填剤、希釈剤または封入物質であり得る。適切な担体には、限定されることなく、滅菌水、リンゲル液、乳酸リンゲル液、滅菌塩化ナトリウム溶液、等張食塩水、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレンおよび、特に生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーが含まれる。一実施形態では、本開示の医薬組成物は等張食塩水を含む。
治療的使用のための薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤は、製薬分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｉｔ．１９８５）に記載されている。
医薬担体、賦形剤または希釈剤は、意図される投与経路および標準的な製薬慣行に関して選択することができる。
一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、静脈内、動脈内、皮下、皮内または筋肉内に投与され得る。特定の実施形態では、医薬組成物は、局所投与または全身投与用に製剤化される。全身投与には、消化管を介した吸収を含む経腸投与、または非経口投与が含まれ得る。本明細書で使用される場合、「非経口投与」は、静脈内注射などによる、消化管を介する以外の任意の方法での投与を指す。好ましい実施形態では、医薬組成物は全身投与用に製剤化される。別の好ましい実施形態では、全身投与は静脈内投与によるものである。本発明の全ての態様の一実施形態では、抗原をコードするＲＮＡを全身投与する。
本明細書で使用される「同時投与」という用語は、異なる化合物または組成物（例えば、免疫エフェクタ細胞（対象におけるインビボ生成によって「投与」され得る）、および抗原、抗原をコードするポリヌクレオチド、または抗原を発現するように遺伝子改変された宿主細胞）を同じ患者に投与するプロセスを意味する。異なる化合物または組成物は、同時に、本質的に同時に、または連続的に投与され得る。一実施形態では、抗原、抗原をコードするポリヌクレオチド、または抗原を発現するように遺伝子改変された宿主細胞は、抗原受容体を発現するように遺伝子改変された免疫エフェクタ細胞の投与または生成後に、例えば、抗原受容体を発現するように遺伝子改変された免疫エフェクタ細胞の投与または生成後少なくとも１日、例えば１～１０日または１～５日で投与される。抗原、抗原をコードするポリヌクレオチド、または抗原を発現するように遺伝子改変された宿主細胞は、一定のまたは異なる時間間隔で、例えば、抗原受容体を発現するように遺伝子改変された免疫エフェクタ細胞の投与または生成後、例えば１０～４０日の時間間隔で、経時的に数回投与され得、抗原、抗原をコードするポリヌクレオチド、または抗原を発現するように遺伝子改変された宿主細胞の初回投与は、抗原受容体を発現するように遺伝子改変された免疫エフェクタ細胞の投与または生成後少なくとも１日、例えば１～１０日または１～５日であり得る。
治療
本明細書に記載の薬剤、組成物および方法は、疾患、例えば抗原を発現する疾患細胞の存在を特徴とする疾患を有する対象を治療するために使用することができる。特に好ましい疾患は癌疾患である。例えば、抗原がウイルスに由来する場合、薬剤、組成物および方法は、前記ウイルスによって引き起こされるウイルス性疾患の治療に有用であり得る。抗原が腫瘍抗原である場合、薬剤、組成物および方法は、癌細胞が前記腫瘍抗原を発現する癌疾患の治療に有用であり得る。
本明細書に記載の薬剤、組成物および方法は、様々な疾患の治療的または予防的処置に使用することができ、本明細書に記載の免疫エフェクタ細胞の提供および／または免疫エフェクタ細胞の活性は、癌および感染症などの患者に有益である。一実施形態では、本明細書に記載の薬剤、組成物および方法は、抗原が関与する疾患の予防的および／または治療的処置に有用である。
「疾患」という用語は、個体の身体に影響を及ぼす異常な状態を指す。疾患はしばしば、特定の症状および徴候に関連する医学的状態として解釈される。疾患は、感染症などの外部源に由来する因子によって引き起こされ得るか、または自己免疫疾患などの内部機能不全によって引き起こされ得る。ヒトでは、「疾患」はしばしば、罹患した個体に疼痛、機能障害、苦痛、社会的問題、もしくは死亡を引き起こす、または個体と接触するものに対して同様の問題を引き起こす状態を指すためにより広く使用される。このより広い意味では、疾患は時に、損傷、無力、障害、症候群、感染、単発症状、逸脱した挙動、および構造と機能の非定型の変化を含むが、他の状況および他の目的では、これらは区別可能なカテゴリと見なされ得る。多くの疾患を患い、それらと共に生活することは、人生観および人格を変える可能性があるため、疾患は通常、身体的だけでなく感情的にも個体に影響を及ぼす。
本文脈において、「治療」、「治療する」または「治療的介入」という用語は、疾患または障害などの状態と闘うことを目的とした対象の管理およびケアに関する。この用語は、症状もしくは合併症を緩和するため、疾患、障害もしくは状態の進行を遅らせるため、症状および合併症を緩和もしくは軽減するため、ならびに／または疾患、障害もしくは状態を治癒もしくは排除するため、ならびに状態を予防するための治療上有効な化合物の投与などの、対象が罹患している所与の状態に対するあらゆる範囲の治療を含むことを意図しており、ここで、予防は、疾患、状態または障害と闘うことを目的とした個体の管理およびケアとして理解されるべきであり、症状または合併症の発症を防止するための活性化合物の投与を含む。
「治療的処置」という用語は、個体の健康状態を改善する、および／または寿命を延長する（増加させる）任意の治療に関する。前記治療は、個体における疾患を排除し、個体における疾患の発症を停止もしくは遅延させ、個体における疾患の発症を阻害もしくは遅延させ、個体における症状の頻度もしくは重症度を低下させ、および／または現在疾患を有しているかもしくは以前に有していたことがある個体における再発を減少させ得る。
「予防的処置」または「防止的処置」という用語は、個体において疾患が発生するのを防ぐことを意図した任意の治療に関する。「予防的処置」または「防止的処置」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
「個体」および「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらは、疾患または障害（例えば癌）に罹患し得るかまたは罹患しやすいが、疾患または障害を有していても有していなくてもよいヒトまたは別の哺乳動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマもしくは霊長動物）を指す。多くの実施形態では、個体はヒトである。特に明記されない限り、「個体」および「対象」という用語は特定の年齢を示すものではなく、したがって、成人、高齢者、小児、および新生児を包含する。本開示の実施形態では、「個体」または「対象」は「患者」である。
「患者」という用語は、治療のための個体または対象、特に罹患した個体または対象を意味する。
本開示の一実施形態では、目的は、腫瘍抗原を発現する癌細胞などの抗原を発現する疾患細胞に対する免疫応答を提供し、腫瘍抗原などの抗原を発現する細胞が関与する癌疾患などの疾患を治療することである。
治療的または部分的もしくは完全に保護的であり得る、抗原に対する免疫応答が誘発され得る。したがって、本明細書に記載の医薬組成物は、免疫応答を誘導または増強するために適用可能である。したがって、本明細書に記載の医薬組成物は、抗原が関与する疾患の予防的および／または治療的処置に有用である。
本明細書で使用される場合、「免疫応答」は、抗原または抗原を発現する細胞に対する統合された身体応答を指し、細胞性免疫応答および／または体液性免疫応答を指す。
「細胞媒介性免疫」、「細胞性免疫」、「細胞性免疫応答」、または同様の用語は、抗原の発現を特徴とする、特にクラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣによる抗原の提示を特徴とする細胞に向けられる細胞応答を含むことを意図している。細胞応答は、「ヘルパー」または「キラー」のいずれかとして働くＴ細胞またはＴリンパ球と呼ばれる細胞に関する。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞とも称される）は、免疫応答を調節することによって中心的な役割を果たし、キラー細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＴＬとも称される）は、癌細胞などの疾患細胞を死滅させ、さらなる疾患細胞の産生を防止する。
本開示は、保護的、防止的、予防的および／または治療的であり得る免疫応答を企図する。本明細書で使用される場合、「免疫応答を誘導する（または誘導すること）」は、特定の抗原に対する免疫応答が誘導前に存在しなかったことを示し得るか、または誘導前に特定の抗原に対する基礎レベルの免疫応答があり、これが誘導後に増強されたことを示し得る。したがって、「免疫応答を誘導する（または誘導すること）」には、「免疫応答を増強する（または増強すること）」が含まれる。
「免疫療法」という用語は、免疫応答を誘導または増強することによる疾患または状態の治療に関する。「免疫療法」という用語は、抗原免疫または抗原ワクチン接種を含む。
「免疫」または「ワクチン接種」という用語は、例えば治療上または予防上の理由により、免疫応答を誘導する目的で個体に抗原を投与するプロセスを表す。
「マクロファージ」という用語は、単球の分化によって産生される食細胞のサブグループを指す。炎症、免疫サイトカインまたは微生物産物によって活性化されるマクロファージは、マクロファージ内に外来病原体を非特異的に貪食し、病原体の分解をもたらす加水分解および酸化攻撃によってそれらを死滅させる。分解されたタンパク質からのペプチドは、Ｔ細胞によって認識され得るマクロファージ細胞表面に表示され、Ｂ細胞表面の抗体と直接相互作用して、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化ならびに免疫応答のさらなる刺激をもたらすことができる。マクロファージは抗原提示細胞のクラスに属する。一実施形態では、マクロファージは脾臓マクロファージである。
「樹状細胞」（ＤＣ）という用語は、抗原提示細胞のクラスに属する食細胞の別のサブタイプを指す。一実施形態では、樹状細胞は造血骨髄前駆細胞に由来する。これらの前駆細胞は、最初に未成熟な樹状細胞に変化する。これらの未成熟細胞は、高い食作用活性と低いＴ細胞活性化能を特徴とする。未成熟な樹状細胞は、ウイルスおよび細菌などの病原体について周囲環境を絶えずサンプリングする。それらは、提示可能な抗原と接触すると、活性化されて成熟樹状細胞になり、脾臓またはリンパ節に移動し始める。未成熟樹状細胞は病原体を貪食し、それらのタンパク質を小さな断片に分解し、成熟すると、ＭＨＣ分子を使用してそれらの細胞表面にそれらの断片を提示する。同時に、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ４０などのＴ細胞活性化における共受容体として働く細胞表面受容体を上方制御し、Ｔ細胞を活性化するそれらの能力を大幅に増強する。それらはまた、樹状細胞が血流を通って脾臓に、またはリンパ系を通ってリンパ節に移動するように誘導する走化性受容体であるＣＣＲ７を上方制御する。ここで、それらは抗原提示細胞として働き、非抗原特異的共刺激シグナルと共に抗原を提示することによってヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞ならびにＢ細胞を活性化する。したがって、樹状細胞は、Ｔ細胞またはＢ細胞に関連する免疫応答を能動的に誘導することができる。一実施形態では、樹状細胞は脾臓樹状細胞である。
「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）という用語は、その細胞表面上に（またはその細胞表面において）少なくとも１つの抗原または抗原断片を表示、獲得、および／または提示することができる様々な細胞の１つである。抗原提示細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞と非プロフェッショナル抗原提示細胞とに区別することができる。
「プロフェッショナル抗原提示細胞」という用語は、ナイーブＴ細胞との相互作用に必要な主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）分子を構成的に発現する抗原提示細胞に関する。Ｔ細胞が抗原提示細胞の膜上のＭＨＣクラスＩＩ分子複合体と相互作用する場合、抗原提示細胞は、Ｔ細胞の活性化を誘導する共刺激分子を産生する。プロフェッショナル抗原提示細胞は、樹状細胞およびマクロファージを含む。
「非プロフェッショナル抗原提示細胞」という用語は、ＭＨＣクラスＩＩ分子を構成的に発現しないが、インターフェロンγなどの特定のサイトカインによる刺激を受けると発現する抗原提示細胞に関する。例示的な非プロフェッショナル抗原提示細胞には、線維芽細胞、胸腺上皮細胞、甲状腺上皮細胞、グリア細胞、膵臓ベータ細胞または血管内皮細胞が含まれる。
「抗原プロセシング」は、抗原の断片であるプロセシング産物への前記抗原の分解（例えばタンパク質のペプチドへの分解）、および抗原提示細胞などの細胞による特定のＴ細胞への提示のためのＭＨＣ分子とこれらの断片の１つ以上との会合（例えば結合による）を指す。
「抗原が関与する疾患」、「抗原を発現する細胞が関与する疾患」という用語または同様の用語は、抗原に関係する任意の疾患、例えば抗原の存在を特徴とする疾患を指す。抗原が関与する疾患は、感染症、または癌疾患もしくは単に癌であり得る。上記のように、抗原は、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、または細菌抗原などの疾患関連抗原であり得る。一実施形態では、抗原が関与する疾患は、好ましくは細胞表面に抗原を発現する細胞が関与する疾患である。
「感染症」という用語は、個体から個体へ、または生体から生体へと伝染する可能性があり、微生物因子によって引き起こされる任意の疾患（例えば普通の風邪）を指す。感染症は当技術分野で公知であり、例えば、ウイルス性疾患、細菌性疾患、または寄生虫性疾患が含まれ、これらの疾患は、それぞれウイルス、細菌、および寄生虫によって引き起こされる。これに関して、感染症は、例えば、肝炎、性感染症（例えばクラミジアまたは淋病）、結核、ＨＩＶ／後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ジフテリア、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、コレラ、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、鳥インフルエンザ、およびインフルエンザであり得る。
「癌疾患」または「癌」という用語は、典型的には無秩序な細胞増殖を特徴とする個体の生理学的状態を指すかまたは表す。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が含まれるが、これらに限定されない。より具体的には、そのような癌の例には、骨癌、血液癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、性器および生殖器の癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、膀胱癌、腎臓癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、神経外胚葉癌、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、および下垂体腺腫が含まれる。本開示による「癌」という用語は、癌転移も含む。
本明細書で使用される「固形腫瘍」または「固形癌」という用語は、例えばＨａｒｒｉｓｏｎ'ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎにおいて当技術分野で周知のように、癌性腫瘤の発現を指す。好ましくは、この用語は、血液以外の、好ましくは血液、骨髄およびリンパ系以外の体組織の癌または癌腫を指す。例えば、限定としてではないが、固形腫瘍には、前立腺の癌、肺癌、結腸直腸組織、膀胱、中咽頭／喉頭組織、腎臓、乳房、子宮内膜、卵巣、子宮頸部、胃、膵臓、脳および中枢神経系の癌が含まれる。
癌治療における併用戦略は、結果として生じる相乗効果のために望ましい場合があり、これは単剤療法アプローチの影響よりもかなり強力であり得る。一実施形態では、医薬組成物は免疫療法剤と共に投与される。本明細書で使用される場合、「免疫療法剤」は、特定の免疫応答および／または免疫エフェクタ機能（１つまたは複数）の活性化に関与し得る任意の薬剤に関する。本開示は、免疫療法剤としての抗体の使用を企図する。理論に拘束されることを望むものではないが、抗体は、アポトーシスを誘導する、シグナル伝達経路の成分を遮断する、または腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む、様々な機構を介して癌細胞に対する治療効果を達成することができる。特定の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介して細胞死を誘導し得るか、または補体タンパク質に結合して、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）として知られる直接的な細胞傷害性をもたらし得る。本開示と組み合わせて使用し得る抗癌抗体および潜在的な抗体標的（括弧内）の非限定的な例には、アバゴボマブ（ＣＡ－１２５）、アブシキシマブ（ＣＤ４１）、アデカツムマブ（ＥｐＣＡＭ）、アフツズマブ（ＣＤ２０）、アラシズマブペゴル（ＶＥＧＦＲ２）、アルツモマブペンテテート（ＣＥＡ）、アマツキシマブ（ＭＯＲＡｂ－００９）、アナツモマブマフェナトクス（ＴＡＧ－７２）、アポリズマブ（ＨＬＡ－ＤＲ）、アルシツモマブ（ＣＥＡ）、アテゾリズマブ（ＰＤ－Ｌ１）、バビツキシマブ（ホスファチジルセリン）、ベクツモマブ（ＣＤ２２）、ベリムマブ（ＢＡＦＦ）、ベバシズマブ（ＶＥＧＦ－Ａ）、ビバツズマブメルタンシン（ＣＤ４４ ｖ６）、ブリナツモマブ（ＣＤ１９）、ブレンツキシマブベドチン（ＣＤ３０ ＴＮＦＲＳＦ８）、カンツズマブメルタンシン（ムチンＣａｎＡｇ）、カンツズマブラブタンシン（ＭＵＣ１）、カプロマブペンデチド（前立腺癌細胞）、カルルマブ（ＣＮＴ０８８８）、カツマキソマブ（ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３）、セツキシマブ（ＥＧＦＲ）、シタツズマブボガトクス（ＥｐＣＡＭ）、シクスツムマブ（ＩＧＦ－１受容体）、クローディキシマブ（クローディン）、クリバツズマブテトラキセタン（ＭＵＣ１）、コナツムマブ（ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）、ダセツズマブ（ＣＤ４０）、ダロツズマブ（インスリン様増殖因子Ｉ受容体）、デノスマブ（ＲＡＮＫＬ）、デツモマブ（Ｂリンパ腫細胞）、ドロジツマブ（ＤＲ５）、エクロメキシマブ（ＧＤ３ガングリオシド）、エドレコロマブ（ＥｐＣＡＭ）、エロツズマブ（ＳＬＡＭＦ７）、エナバツズマブ（ＰＤＬ１９２）、エンシツキシマブ（ＮＰＣ－１Ｃ）、エプラツズマブ（ＣＤ２２）、エルツマキソマブ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＤ３）、エタラシズマブ（インテグリンανβ３）、ファルレツズマブ（葉酸受容体１）、ＦＢＴＡ０５（ＣＤ２０）、フィクラツズマブ（ＳＣＨ ９００１０５）、フィギツムマブ（ＩＧＦ－１受容体）、フランボツマブ（糖タンパク質７５）、フレソリムマブ（ＴＧＦ－β）、ガリキシマブ（ＣＤ８０）、ガニツマブ（ＩＧＦ－Ｉ）、ゲムツズマブオゾガマイシン（ＣＤ３３）、ゲボキズマブ（ＩＬΙβ）、ギレンツキシマブ（炭酸脱水酵素９（ＣＡ－ＩＸ））、グレムバツムマブベドチン（ＧＰＮＭＢ）、イブリツモマブチウキセタン（ＣＤ２０）、イクルクマブ（ＶＥＧＦＲ－１）、イゴボマ（ＣＡ－１２５）、インダツキシマブラブタンシン（ＳＤＣ１）、インテツムマブ（ＣＤ５１）、イノツズマブオゾガマイシン（ＣＤ２２）、イピリムマブ（ＣＤ１５２）、イラツムマブ（ＣＤ３０）、ラベツズマブ（ＣＥＡ）、レクサツムマブ（ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）、リビビルマブ（Ｂ型肝炎表面抗原）、リンツズマブ（ＣＤ３３）、ロルボツズマブメルタンシン（ＣＤ５６）、ルカツムマブ（ＣＤ４０）、ルミリキシマブ（ＣＤ２３）、マパツムマブ（ＴＲＡＩＬ－Ｒ１）、マツズマブ（ＥＧＦＲ）、メポリズマブ（ＩＬ５）、ミラツズマブ（ＣＤ７４）、ミツモマブ（ＧＤ３ガングリオシド）、モガムリズマブ（ＣＣＲ４）、モキセツモマブパスドトクス（ＣＤ２２）、ナコロマブタフェナトクス（Ｃ２４２抗原）、ナプツモマブエスタフェナトクス（５Ｔ４）、ナマツマブ（ＲＯＮ）、ネシツムマブ（ＥＧＦＲ）、ニモツズマブ（ＥＧＦＲ）、ニボルマブ（ＩｇＧ４）、オファツムマブ（ＣＤ２０）、オララツマブ（ＰＤＧＦ－Ｒ ａ）、オナルツズマブ（ヒト散乱因子受容体キナーゼ）、オポルツズマブモナトクス（ＥｐＣＡＭ）、オレゴボマブ（ＣＡ－１２５）、オキセルマブ（ＯＸ－４０）、パニツムマブ（ＥＧＦＲ）、パトリツマブ（ＨＥＲ３）、ペムツモマ（ＭＵＣ１）、ペルツズマ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ピンツモマブ（腺癌抗原）、プリツムマブ（ビメンチン）、ラコツモマブ（Ｎ－グリコリルノイラミン酸）、ラドレツマブ（フィブロネクチンエクストラドメインＢ）、ラフィビルマブ（狂犬病ウイルス糖タンパク質）、ラムシルマブ（ＶＥＧＦＲ２）、リロツムマブ（ＨＧＦ）、リツキシマブ（ＣＤ２０）、ロバツムマブ（ＩＧＦ－１受容体）、サマリズマブ（ＣＤ２００）、シブロツズマブ（ＦＡＰ）、シルツキシマブ（ＩＬ６）、タバルマブ（ＢＡＦＦ）、タカツズマブテトラキセタン（α－フェトプロテイン）、タプリツモマブパプトクス（ＣＤ１９）、テナツモマブ（テネイシンＣ）、テプロツムマブ（ＣＤ２２１）、チシリムマブ（ＣＴＬＡ－４）、ティガツズマブ（ＴＲＡＩＬ－Ｒ２）、ＴＮＸ－６５０（ＩＬ１３）、トシツモマブ（ＣＤ２０）、トラスツズマブ（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＴＲＢＳ０７（ＧＤ２）、トレメリムマブ（ＣＴＬＡ－４）、ツコツズマブセルモロイキン（ＥｐＣＡＭ）、ウブリツキシマブ（ＭＳ４Ａ１）、ウレルマブ（４－１ＢＢ）、ボロキシマブ（インテグリンα５β１）、ボツムマブ（腫瘍抗原ＣＴＡＡ １６．８８）、ザルツムマブ（ＥＧＦＲ）、およびザノリムマブ（ＣＤ４）が含まれる。
本明細書で参照される文書および試験の引用は、前述のいずれかが関連する先行技術であることの承認として意図されていない。これらの文書の内容に関する全ての記述は、出願人が入手可能な情報に基づいており、これらの文書の内容の正確さに関するいかなる承認も構成しない。
以下の説明は、当業者が様々な実施形態を作成および使用することを可能にするために提示される。具体的な装置、技術、および用途の説明は、例としてのみ提供される。本明細書に記載される例に対する様々な変更は、当業者には容易に明らかであり、本明細書で定義される一般的な原理は、様々な実施形態の精神および範囲から逸脱することなく他の例および用途に適用され得る。したがって、様々な実施形態は、本明細書に記載され、示される例に限定されることを意図するものではなく、特許請求の範囲と一致する範囲を与えられるべきである。
（実施例１）
ＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎの同定
リボソームディスプレイ
リボソームディスプレイ選択を、Ｈａｒｔｍａｎｎと同僚らによって記載されているように行った（Ｈａｒｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．２０１８）。手短に言えば、最初の３回の選択ラウンドについて、翻訳されたＶＶ－Ｎ３Ｃ ＤＡＲＰｉｎライブラリを、固定化したニュートラアビジンまたはストレプトアビジン（両方とも２０μＭ）を用いたプレパニング工程に供した。オンターゲット選択のために、ライブラリを固定化ｈＣＤ８αβ－Ｆｃ（５０ｎｍ）と共にインキュベートした。得られたＤＡＲＰｉｎライブラリを増幅し、次の選択ラウンドの鋳型として使用した。固定化した標的タンパク質による３回のラウンド後、溶液中の標的を用いた４回目の選択ラウンドを行った。オンターゲット選択の前に、０．９ｐｍｏｌの非ビオチン化ｈＣＤ８αα－Ｆｃを使用した事前選択工程を実施した。次いで、ライブラリを、ビオチン化ｈＣＤ８αβＦｃ標的タンパク質（０．６５ｐｍｏｌ）および１００倍モル過剰（６５ｐｍｏｌ）の非ビオチン化ｈＣＤ８ααＦｃに曝露した。５回目の選択ラウンドを、固定化タンパク質を使用して再度実施し、これは、ｈＣＤ８αβ－Ｆｃとのインキュベーションの前に、固定化ＣＤ８αα－Ｆｃ（２０ｎＭ）による事前選択工程を含んだ。最後に、溶液中で６回目の選択を以下のように行った：０．９ｐｍｏｌの可溶性ＣＤ８αα－Ｆｃとのプレインキュベーションの後に、オフレートおよび対抗選択の組合せ工程を行い、ライブラリをビオチン化標的タンパク質（０．６５ｐｍｏｌ）、過剰の非ビオチン化ｈＣＤ８αα－Ｆｃおよび非ビオチン化ｈＣＤ８αβ－Ｆｃ（両方とも６５ｐｍｏｌ）と共インキュベートした。５回目および６回目の選択ラウンド後、ＤＡＲＰｉｎをコードするＤＮＡ断片を、単一クローン分析によってＣＤ８結合について分析した。
ＤＡＲＰｉｎ発現および粗溶解物の調製
５回目および６回目の選択ラウンド後に、選択したＤＡＲＰｉｎをＣＤ８への特異的結合について試験するために、ＤＮＡ断片を細菌発現ベクターｐＱＥ－ＨｉｓＨＡにクローニングし、前述のように大腸菌ＸＬ１－ｂｌｕｅに形質転換した（Ｈａｒｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．２０１８）。単一クローンを採取し、３７℃で６００μｌの２ＹＴ培地（２ＹＴ、１％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）中で一晩培養した後、培養物を０．１のＯＤ６００に希釈し、２ＹＴ培地に１００ｍＬの５．５ｍＭイソプロピル－ｂ－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによってＤＡＲＰｉｎの発現を誘導した。３７℃で５時間培養した後、細菌を遠心分離によって回収し、ペレットを－８０℃で一晩保存した。翌日、ペレットを氷上で解凍し、Ｂ＿ＰＥＲ溶液の添加およびその後の室温で２時間のインキュベーションによって溶解した。溶解物をペレット化して細胞残屑を除去し、粗ＤＡＲＰｉｎを含有する上清をアリコートに分け、細胞結合アッセイで使用するまで－８０℃で保存した。タンパク質含有量をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって決定した。粗溶解物調製物を常に氷上で取り扱い、タンパク質品質の損失を回避するために最大３回の凍結融解サイクルに供した。ＤＡＲＰｉｎクローンを、標準的な配列決定技術を使用して配列決定して、ＤＮＡおよびタンパク質配列を得た。
細胞結合アッセイ
ヒトおよびＮＨＰ ＣＤ８へのＤＡＲＰｉｎの特異的結合を分析するために、Ｍｏｌｔ４．８およびＪ７６Ｓ８ａｂ細胞ならびに初代ヒトおよびＮＨＰ ＰＢＭＣ（上記のように単離および活性化した）を使用した細胞結合アッセイを行った。手短に言えば、１×１０５個の細胞を洗浄緩衝液（ＰＢＳ、２％ＦＣＳ、０．１％ＮａＮ３）で１回洗浄し、総体積２００μｌで１０μｌの粗ＤＡＲＰｉｎ抽出物と共に４℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄緩衝液で２回洗浄し、蛍光標識抗体で染色し、以下に記載されるようにフローサイトメトリによって分析した。細胞株を使用した細胞結合アッセイによるＣＤ８結合のスクリーニングならびにヒトおよびＮＨＰ ＰＢＭＣへの結合による検証をｎ＝１で行った。
（実施例２）
ＤＡＲＰｉｎのＣＤ８特異的結合
以前に記載されたコンビナトリアルＤＡＲＰｉｎライブラリＶＶ－Ｎ３Ｃ（Ｈａｒｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．２０１８）を、生成された組換えＣＤ８タンパク質をベイトとして使用して、リボソームディスプレイによってＣＤ８特異的ＤＡＲＰｉｎについてスクリーニングした。合計で、最大６回までの選択ラウンドを行った。最初の３回および５回目のラウンドは、望ましくない特異性を有するＤＡＲＰｉｎの選択を排除するために、ニュートラアビジン、ストレプトアビジンおよび固定化Ｆｃタンパク質に対する事前選択工程を含むベイトタンパク質として固定化ＣＤ８αβ－Ｆｃを用いて実施した。４回目および６回目のラウンドは溶液中で行い、ＣＤ８αβに対して高い親和性を有する結合剤を選択するために、ビオチン化されていないＣＤ８αβ－ＦｃおよびＣＤ８αα－Ｆｃによる対抗選択を含めた。標的遺伝子導入のための最良のＣＤ８特異的ＤＡＲＰｉｎを同定するために、出力レパートリを２段階手順でスクリーニングした。最初に、ＣＤ８結合を細胞ベースのアッセイで評価した。第２段階では、１０個のクローンの遺伝子導入活性を評価した。合計で、５回目および６回目の選択ラウンドから得られた９４個のＤＡＲＰｉｎクローンを大腸菌で発現させ、Ｍｏｌｔ４．８細胞（ＣＤ８ααを発現する）およびＪ６７Ｓ８ａｂ細胞（ＣＤ８αβを発現する）への結合について試験した。これらのうち、両方の細胞株に等しく良好に結合する３１個の個々のＤＡＲＰｉｎクローンを選択し（図４Ａ）、初代ヒトおよびＮＨＰ Ｔ細胞への結合についてさらに分析した。全ての候補物がヒトＣＤ８＋細胞に特異的に結合したが、ＣＤ８－細胞はバックグラウンド以上には修飾されなかった（図４Ｂ）。特に、ＤＡＲＰｉｎ候補物全体にわたる細胞染色強度の変動が観察された（図４Ｂ）。次の段階では、マカクＰＢＭＣに対するこれらのＤＡＰＲｉｎの交差反応性を評価した。同定された全てのヒトＣＤ８特異的ＤＡＲＰｉｎは、ＮＨＰ ＰＢＭＣ上のＣＤ８にも結合した（図４Ｃ）。同定されたＣＤ８結合剤のうち、中間ＭＦＩでヒトＣＤ８に結合する５つのＤＡＲＰｉｎおよび高ＭＦＩで結合する５つの候補物を、さらなる特徴付けのために選択した。候補物のうちの２８個が成功裏に特徴づけられ、配列決定により、これらの候補物の各々（表１）が固有のアミノ酸配列を有することが明らかにされた。
Figure 2023509604000010
Figure 2023509604000011
Figure 2023509604000012
（実施例３）
ナノ粒子の官能化のためのタグ付きＤＡＲＰｉｎの生成
Ｎ末端Ｈ６およびＨＡタグ（精製および検出用）ならびにＣ末端システインまたはポリグルタミン酸タグ（Ｅ１０、Ｅ２０）を有する６３Ｈ６ ＤＡＲＰｉｎを、ＬＮＰおよびポリプレックスのコンジュゲーションのために生成した：
＞Ｈ６－ＨＡ－６３Ｈ６－Ｃｙｓ
ＭＲＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＹＰＹＤＶＰＤＹＡＡＡＱＰＡＤＬＧＫＫＬＬＥＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶＲＩＬＭＡＮＧＡＤＶＮＡＳＤＳＶＧＮＴＰＬＨＬＡＡＷＨＧＨＬＥＩＶＤＶＬＬＫＹＧＡＤＶＮＡＳＤＶＳＧＱＴＰＭＨＬＡＡＬＱＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＹＧＡＤＶＮＴＨＤＲＷＧＬＴＰＬＨＬＡＡＨＱＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＨＧＡＤＶＮＡＱＤＫＦＧＫＴＰＦＤＬＡＩＤＮＧＮＥＤＩＡＥＶＬＱＫＡＡＧＧＣ
＞Ｈ６－ＨＡ－６３Ｈ６－Ｅ１０
ＭＲＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＹＰＹＤＶＰＤＹＡＡＡＱＰＡＤＬＧＫＫＬＬＥＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶＲＩＬＭＡＮＧＡＤＶＮＡＳＤＳＶＧＮＴＰＬＨＬＡＡＷＨＧＨＬＥＩＶＤＶＬＬＫＹＧＡＤＶＮＡＳＤＶＳＧＱＴＰＭＨＬＡＡＬＱＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＹＧＡＤＶＮＴＨＤＲＷＧＬＴＰＬＨＬＡＡＨＱＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＨＧＡＤＶＮＡＱＤＫＦＧＫＴＰＦＤＬＡＩＤＮＧＮＥＤＩＡＥＶＬＱＫＡＡＧＧＳＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥ
＞Ｈ６－ＨＡ－６３Ｈ６－Ｅ２０
ＭＲＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＹＰＹＤＶＰＤＹＡＡＡＱＰＡＤＬＧＫＫＬＬＥＡＡＲＡＧＱＤＤＥＶＲＩＬＭＡＮＧＡＤＶＮＡＳＤＳＶＧＮＴＰＬＨＬＡＡＷＨＧＨＬＥＩＶＤＶＬＬＫＹＧＡＤＶＮＡＳＤＶＳＧＱＴＰＭＨＬＡＡＬＱＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＹＧＡＤＶＮＴＨＤＲＷＧＬＴＰＬＨＬＡＡＨＱＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＨＧＡＤＶＮＡＱＤＫＦＧＫＴＰＦＤＬＡＩＤＮＧＮＥＤＩＡＥＶＬＱＫＡＡＧＧＳＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥ
この目的のために、対応する遺伝子融合物をｐＥＴ－２１ａ発現ベクターにクローニングした。それぞれのタグ付きＤＡＲＰｉｎバリアントをコードするｐＥＴ－２１ａベクターを担持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を１Ｌスケールで使用して、３７℃、１２０ｒｐｍで組換えタンパク質の産生を行った。培養物が約０．５～０．７のＯＤ６００に達した後、１ｍＬの１Ｍ ＩＰＴＧを添加し、３７℃、１２０ｒｐｍでさらに３時間インキュベートすることによってタンパク質発現を誘導した。その後、遠心分離によって大腸菌細胞を回収し、２５ｍＬのＩＭＡＣ平衡緩衝液に再懸濁し、５回の連続する超音波処理サイクルによって溶解した。細胞残屑の遠心分離後（１５．０００×ｇで３０分間、４℃）、上清を、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ（商標）ｐｌｕｓシステムおよび２０分で１０～５００ｍＭイミダゾールの直線勾配を使用する１ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐカラムを用いてＩＭＡＣによって精製した。ＤＡＲＰｉｎタンパク質含有画分を収集し、ＰＢＳまたは２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０％トレハロースに対して透析した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって判断した場合、全てのタグ付きＤＡＲＰｉｎタンパク質の純度は＞９０％であった（図６）。非還元Ｈ６－ＨＡ－６３Ｈ６－Ｃｙｓ試料では、Ｓ－Ｓ架橋した二量体種に対応するさらなるバンドが可視である。官能化工程では、これらの二量体をＴＣＥＰインキュベーションによって除去する。
タグ付き６３Ｈ６ ＤＡＲＰｉｎバリアントの保持された機能特性およびＣＤ８への結合を評価するために、ヒトＰＢＭＣを使用した細胞結合分析を実施した。３×１０６個のヒトＰＢＭＣを洗浄緩衝液（ＤＰＢＳ、５％ＦＣＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）で１回洗浄し、３００×ｇで５分間の遠心分離によって回収し、１００μＬ中の２μＭまたは１μＭのＤＡＲＰｉｎと共に４℃で１時間インキュベートした。その後、細胞を洗浄緩衝液で２回洗浄し、遠心分離し（３００×ｇで５分間）、１００μＬの蛍光標識した抗体混合物（抗ＣＤ４－ＢＶ４２１、抗ＣＤ３－ＦＩＴＣ、抗ｈｉｓ－ＡＰＣ）中で、４℃で１時間染色した。細胞を洗浄緩衝液で２回およびＤＰＢＳで１回洗浄した。死細胞の染色は、ＤＰＢＳで１：７５０に希釈した１００μＬの固定可能な色素ｅＦｌｕｏｒ７８０（商標）中で、４℃で２０分間実施した。その後、細胞を洗浄緩衝液で２回洗浄し、フローサイトメトリ分析のために１００μＬの洗浄緩衝液に再懸濁した。ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩで測定を実施し、ＦｌｏｗＪｏ Ｘを使用してデータを分析した。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞集団に対するＨ６－ＨＡ－６３Ｈ６－Ｃｙｓ、Ｈ６－ＨＡ－６３Ｈ６－Ｅ１０およびＨ６－ＨＡ－６３Ｈ６－Ｅ２０の特異的結合は、３人の独立したＰＢＭＣドナーで実証された（図７）。
（実施例４）
ＤＡＲＰｉｎで官能化されたＬＮＰによるＣＤ８特異的トランスフェクション
ＬＮＰは、直径約５０～１５０ｎｍのＮＰに自己集合することができる種々の脂質からなる。遺伝子送達目的のためのＲＮＡまたはＤＮＡとしてのカーゴは、自己集合過程の間に脂質混合物と混合することによってこれらのＮＰに封入され得る。いわゆるＰＥＧ－脂質は、安定化機能を有し、ＬＮＰの外側に露出している。したがって、ＬＮＰの官能化を得るためのＤＡＲＰｉｎのような標的化リガンドの結合のための最適な候補物である。結合を達成するために、クリックケミストリは有望なアプローチを示す。システイン／マレイミド反応は、臨床で既に適用されている抗体－薬物コンジュゲーションから周知である。したがって、末端システインを有するＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎ構築物（ＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎＳＨ）を大腸菌で産生し、末端マレイミド基を有するＰＥＧ－脂質も合成した。次に、露出したマレイミドを有するＬＮＰを生成し（ＬＮＰ－Ｍａｌ）、ＣＤ８特異的ＤＡＲＰｉｎＳＨ（クローン６３Ｈ６および６３Ａ４）の添加によって第２の工程で官能化した。遊離ＤＡＲＰｉｎ、ＬＮＰ－Ｍａｌ単独、ならびにＤＡＲＰｉｎプラスＬＮＰ－Ｍａｌまたは対照として露出したアジドを有するＬＮＰ（ＬＮＰ－Ｎ３）のゲル電気泳動を実施した（図８Ａ）。遊離ＤＡＲＰｉｎは、不適合反応性基（ＬＮＰ－Ｎ３）の場合にのみ検出することができ、全てのＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎがＬＮＰ上のマレイミド基に結合したと仮定することができる。ＤＡＲＰｉｎによる官能化は、ＬＮＰのコヒーレンスまたは多分散指数によって測定される粒径分布に影響を及ぼすことなく、ＬＮＰの直径をわずかに増加させる（図８Ｂ）。続いて、それらのＤＡＲＰｉｎ官能化ＬＮＰを、ルシフェラーゼ－ｍＲＮＡの送達についてＣＤ８＋およびＣＤ８－Ｊｕｒｋａｔ細胞株で試験した（図８Ｃ、Ｄ）。実際に、ＣＤ８＋Ｊｕｒｋａｔ細胞においてのみ、非官能化ＬＮＰまたはＬＮＰ－Ｎ３対照と比較して、ＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎ官能化ＬＮＰで１０～１００倍高いシグナルを検出することができた。ＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎＳＨによるＬＮＰの官能化も、同様に、初代ヒトＴ細胞のトランスフェクションの改善を示した（図８Ｅ）。
（実施例５）
ＤＡＲＰｉｎで官能化されたＰＬＸによるＣＤ８特異的トランスフェクション
ＰＬＸは、核酸カーゴを封入するカチオン性コアポリマーからなる。このコア複合体は安定であり、ＬＮＰに匹敵するトランスフェクション能力を有する。正電荷を遮蔽するコア複合体にアニオン性ポリマーを添加することにより、トランスフェクションの可能性を低下させることができる。標的化リガンドによるＰＬＸの官能化は、トランスフェクションの可能性を回復させ、その特異性を改善することができる。ＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎのような標的化リガンドのＰＬＸへの結合は、カチオン性コアポリマーと標的化リガンドに連結されたアニオン性ポリマーとの間の静電引力によって達成することができる。反応性エステル化学を介したポリグルタミン酸（ＰＧＡ）への標的化リガンドのカップリングは、実行可能なアプローチを示すことが以前に記載された（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。リガンドのさらなる化学修飾を避けるために、本発明者らは、２０回のグルタミン酸反復からなるタグを有するＣＤ８特異的ＤＡＲＰｉｎ（ＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎＥ２０）（クローン６３Ｈ６）を作製した。ＰＬＸを異なる量のＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎＥ２０（ｗ／ｗ比として示す）と共にインキュベートして、ＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎＥ２０修飾に応じた物理化学的特性の変化を追跡した。ゲル電気泳動により、試験したｗ／ｗ比のいずれにおいてもコアＰＬＸの存在下で遊離ＤＡＲＰｉｎＥ２０は検出できないことが明らかになり、全てのＥ２０タグ付きＤＡＲＰｉｎがコア粒子に結合していることが実証された（図９Ａ）。ＤＬＳ測定により、ＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎＥ２０によるコアＰＬＸの修飾は、より高いｗ／ｗ比でより顕著な、粒子の有意なサイズ増加を伴うことが明らかになった（図９Ｂ）。さらに、粒子表面電荷（ゼータ電位として表される）の付随する低下を観察することができた（図９Ｃ）。これらの結果は、粒子表面上のＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎＥ２０の吸収がサイズ増加およびコア粒子の正電荷のスクリーニングをもたらすはずであるという予想と一致する。続いて、ＤＡＲＰｉｎで修飾されたＰＬＸをヒトＴ細胞でも試験したが、ここでは同じＰＬＸに封入されたルシフェラーゼ－ｍＲＮＡおよびＴｈｙ１．１－ｍＲＮＡ（５０／５０の比率で混合）の送達について試験した。ここでは、ルシフェラーゼシグナルだけでなく、フローサイトメトリによって検出されたマウスマーカＴｈｙ１．１の表面発現も、Ｔ細胞トランスフェクションの成功の決定を可能にした。ＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎＥ２０修飾ＰＬＸは、両方のＲＮＡカーゴのＣＤ８＋への送達増強を示したが、ＣＤ８－Ｊｕｒｋａｔ細胞への送達増強は示さなかった（図９Ｄ、Ｅ）。重要なことに、全ての対照ＰＬＸ（非官能化、無関係なＤＡＲＰｉｎ修飾、ＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎ結合なし）について、トランスフェクションの増加は観察されなかった。ＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎＥ２０によるＰＬＸの官能化は、同様に、生存率に影響を及ぼすことなく初代ヒトＴ細胞のトランスフェクションの改善を示した（図９Ｆ）。トランスフェクションのフローサイトメトリ分析はまた、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との識別を可能にし、ＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎＥ２０修飾ＰＬＸがＣＤ８＋Ｔ細胞のみを特異的にトランスフェクトすることをさらに示した（図９Ｇ）。
（実施例６）
インビボでのＤＡＲＰｉｎ修飾ＬＮＰのＣＤ８特異的トランスフェクション
次の工程として、本発明者らは、インビボでヒトＴ細胞を標的とする、システイン／マレイミド反応によって官能化されたＬＮＰの可能性を評価した。したがって、免疫不全マウスにヒトＰＢＭＣを移植し、２１日後、非官能化またはＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎ官能化ＬＮＰのいずれかに封入された２０μｇのｍＲＮＡ（ルシフェラーゼおよびＴｈｙ１．１、５０／５０）で処置した。ＬＮＰ投与の１日後、インサイチュでの生物発光イメージングによってルシフェラーゼシグナルが検出され、ＬＮＰが、官能化に起因する肝細胞の標的化に続いて脾臓常在細胞のトランスフェクションを獲得したことが示された（図１０Ａ）。これらのデータは、ＬＮＰが再標的化されて、Ｔ細胞が位置する二次リンパ組織をトランスフェクトすることができることを示す。末梢血のフローサイトメトリ分析によるＴｈｙ１．１発現の分析により、ヒト（ＣＤ４５＋）ＣＤ８＋Ｔ細胞はトランスフェクトされたが、ＣＤ４＋Ｔ細胞はトランスフェクトされなかったことがさらに明らかになった（図１０Ｂ）。
（実施例７）
インビボでのＤＡＲＰｉｎ修飾ＰＬＸのＣＤ８特異的トランスフェクション
さらに、本発明者らは、インビボでヒトＴ細胞を標的とするＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎＥ２０修飾ＰＬＸの可能性を評価した。したがって、免疫不全マウスにヒトＰＢＭＣを移植し、２１日後、非官能化またはＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎＥ２０修飾ＰＬＸのいずれかに封入された２０μｇのｍＲＮＡ（ルシフェラーゼおよびＴｈｙ１．１、５０／５０）で処置した。ＰＬＸ投与の１日後、インサイチュでの生物発光イメージングによってルシフェラーゼシグナルが検出され、ＰＬＸが官能化に起因する脾臓常在細胞のトランスフェクションを獲得したことが示された。これは、ＰＬＸもまた、再標的化されて、Ｔ細胞が位置する二次リンパ組織をトランスフェクトすることができることを示している。末梢血のフローサイトメトリ分析によるＴｈｙ１．１発現の分析により、ヒト（ＣＤ４５＋）ＣＤ８＋Ｔ細胞はトランスフェクトされたが、ＣＤ４＋Ｔ細胞はトランスフェクトされなかったことがさらに明らかになった。
（実施例８）
混合ＲＮＡ／ＤＮＡカーゴを送達するためのビヒクルとしての官能化ナノ粒子
上述のように、インビボゲノム操作には遺伝子編集ツールの送達が必要である。しかしながら、これまでのそのようなツールはＤＮＡ鋳型に依存しており、酵素はｍＲＮＡとしてコードされ得る。本発明者らは、本発明者らの社内で開発された官能化戦略によってＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎで修飾された本発明者らのＮＰが、インビトロおよびインビボでヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を標的とすることができることを明確に示すことができた。ゲノム操作を可能にするために、本発明者らは、ＤＮＡとＲＮＡとの混合カーゴが十分に封入され、Ｔ細胞に送達されるかどうかを試験した。したがって、本発明者らは、以前と同様に健常ドナーの末梢血からＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、非官能化またはＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎＥ２０修飾ＰＬＸのいずれかに封入された５０ｎｇの混合カーゴ（アエクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来の黄色蛍光タンパク質の改良型であるＶｅｎｕｓをコードするミニサークルＤＮＡ、およびＴｈｙ１．１－ｍＲＮＡ、５０／５０）で１×１０６個の標的細胞を処理した。ＰＬＸ投与の１日後、ＲＮＡ発現をフローサイトメトリによって検出した（図１１）。ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ刺激後、増殖中のヒトＴ細胞は、ミニサークルＤＮＡにコードされた目的の遺伝子の強い発現を示した。これらの所見は、単一のＣＤ８－ＤＡＲＰｉｎ官能化ＮＰバッチがＤＮＡおよびＲＮＡを同時に送達することができることを示している。

Claims (94)

  1. 抗原受容体を発現するように遺伝子改変された免疫エフェクタ細胞を調製する方法であって、前記免疫エフェクタ細胞を、前記抗原受容体をコードする核酸と前記免疫エフェクタ細胞を標的化するための標的化分子とを含む粒子と接触させることを含み、前記標的化分子がアンキリンリピートタンパク質である、方法。
  2. 前記免疫エフェクタ細胞を前記粒子と接触させることが、前記核酸を前記免疫エフェクタ細胞に送達する、請求項１に記載の方法。
  3. 遺伝子改変される前記免疫エフェクタ細胞がインビボまたはインビトロで存在する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 遺伝子改変される前記免疫エフェクタ細胞がインビボで存在する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 遺伝子改変される前記免疫エフェクタ細胞が対象中にインビボで存在し、前記方法が前記粒子を前記対象に投与することを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 対象を治療するための方法であって、
    （ｉ）抗原受容体を発現するように遺伝子改変されたインビトロ免疫エフェクタ細胞を調製する工程であって、前記免疫エフェクタ細胞を、前記抗原受容体をコードする核酸と前記免疫エフェクタ細胞を標的化するための標的化分子とを含む粒子と接触させることを含み、前記標的化分子がアンキリンリピートタンパク質である方法を使用する、工程、および
    （ｉｉ）抗原受容体を発現するように遺伝子改変された前記免疫エフェクタ細胞を前記対象に投与する工程
    を含む方法。
  7. 前記免疫エフェクタ細胞を前記粒子と接触させることが、前記核酸を前記免疫エフェクタ細胞に送達する、請求項６に記載の方法。
  8. 対象を治療するための方法であって、
    抗原受容体をコードする核酸と、免疫エフェクタ細胞を標的化するための標的化分子とを含む粒子を前記対象に投与することを含み、前記標的化分子がアンキリンリピートタンパク質である、方法。
  9. 前記粒子が、前記対象の免疫エフェクタ細胞に前記核酸を送達する、請求項８に記載の方法。
  10. 前記核酸を免疫エフェクタ細胞に送達することにより、前記対象において抗原受容体を発現するように遺伝子改変された免疫エフェクタ細胞が生成される、請求項８に記載の方法。
  11. 前記対象において免疫応答を誘導する方法である、請求項５～９のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記免疫応答がＴ細胞媒介性免疫応答である、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記免疫応答が、抗原を発現する標的細胞集団または標的組織に対する免疫応答である、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. 前記標的細胞集団または標的組織が癌細胞または癌組織である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記癌細胞または癌組織が固形癌である、請求項１４に記載の方法。
  16. 抗原の発現または発現上昇に関連する疾患、障害または状態を有する対象を治療するための方法であって、
    （ｉ）前記疾患、障害もしくは状態に関連する前記抗原を標的化する抗原受容体を発現するように遺伝子改変されたインビトロ免疫エフェクタ細胞、または前記疾患、障害もしくは状態に関連する前記抗原を発現する細胞を調製する工程であって、前記免疫エフェクタ細胞を、前記抗原受容体をコードする核酸と前記免疫エフェクタ細胞を標的化するための標的化分子とを含む粒子と接触させることを含み、前記標的化分子がアンキリンリピートタンパク質である方法を使用する、工程、および
    （ｉｉ）抗原受容体を発現するように遺伝子改変された前記免疫エフェクタ細胞を前記対象に投与する工程
    を含む方法。
  17. 前記免疫エフェクタ細胞を前記粒子と接触させることが、前記核酸を前記免疫エフェクタ細胞に送達する、請求項１６に記載の方法。
  18. 抗原の発現または発現上昇に関連する疾患、障害または状態を有する対象を治療するための方法であって、
    前記疾患、障害もしくは状態に関連する前記抗原または前記疾患、障害もしくは状態に関連する前記抗原を発現する細胞を標的化する抗原受容体をコードする核酸と、前記免疫エフェクタ細胞を標的化するための標的化分子であって、アンキリンリピートタンパク質である標的化分子とを含む粒子を前記対象に投与すること
    を含む方法。
  19. 前記粒子が、前記対象の免疫エフェクタ細胞に前記核酸を送達する、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記核酸を免疫エフェクタ細胞に送達することにより、前記対象において抗原受容体を発現するように遺伝子改変された免疫エフェクタ細胞が生成される、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記疾患、障害または状態が癌であり、前記疾患、障害または状態に関連する前記抗原が腫瘍抗原である、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記疾患、障害または状態が固形癌である、請求項１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 対象における癌を治療または予防するための方法である、請求項６～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記癌が固形癌である、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記癌が、前記抗原受容体によって標的化される腫瘍抗原の発現または発現上昇に関連する、請求項２３または２４に記載の方法。
  26. 前記抗原受容体によって標的化される抗原、前記抗原をコードするポリヌクレオチド、または前記抗原を発現するように遺伝子改変された宿主細胞を前記対象に投与することをさらに含む、請求項５～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記宿主細胞が、前記抗原をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項２６に記載の方法。
  29. 前記抗原受容体がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記核酸がＲＮＡである、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記核酸がＤＮＡである、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記遺伝子改変が一過性または安定である、請求項１～７、１０～１７および２０～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記遺伝子改変が、ウイルスベースの方法、トランスポゾンベースの方法、または遺伝子編集ベースの方法によって行われる、請求項１～７、１０～１７および２０～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記遺伝子編集ベースの方法が、ＣＲＩＳＰＲに基づく遺伝子編集を含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記粒子が非ウイルス粒子である、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記粒子が脂質ベースおよび／またはポリマーベースの粒子である、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記粒子がナノ粒子である、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記粒子が、その表面上の前記標的化分子で官能化されている、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記粒子が、前記標的化分子を少なくとも１つの粒子形成成分に連結することによって前記標的化分子で官能化される、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記免疫エフェクタ細胞がＴ細胞である、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記免疫エフェクタ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記標的化分子がＣＤ８を標的とする、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記標的化分子が、反復コンセンサス配列：
    ＮＸ１Ｘ２ＤＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＴＰＸ７ＨＬＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＨＸ１３Ｘ１４ＩＶＸ１５ＶＬＬＫＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＤＸ１９
    を含む反復モジュールを含み、
    ここで、
    Ｘ１は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり、
    Ｘ２は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ３は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ４は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ５は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＧであり、
    Ｘ６は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ７は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＬであり、
    Ｘ８は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＡまたはＶであり、
    Ｘ９は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＡであり、
    Ｘ１０は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ１１は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ１２は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＧであり、
    Ｘ１３は任意のアミノ酸、好ましくはＬであり、
    Ｘ１４は、任意のアミノ酸、好ましくはＤ、Ｅ、Ｈ、ＫおよびＲからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＥであり、
    Ｘ１５は、任意のアミノ酸、好ましくはＤまたはＥであり、
    Ｘ１６は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ１７は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＡ、ＧおよびＳからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＧであり、
    Ｘ１８は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＡであり、
    Ｘ１９は、任意のアミノ酸、好ましくはＩ、ＬおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＶである、
    請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記標的化分子が、反復コンセンサス配列：
    ＮＸ１Ｘ２ＤＸ３Ｘ４ＧＸ６ＴＰＬＨＬＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＧＨＸ１３Ｘ１４ＩＶＸ１５ＶＬＬＫＸ１６ＧＡＤＶ
    を含む反復モジュールを含み、
    ここで、
    Ｘ１は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり、
    Ｘ２は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ３は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ４は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ６は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ８はＡまたはＶであり、
    Ｘ９は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＡであり、
    Ｘ１０は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ１１は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ１３は任意のアミノ酸、好ましくはＬであり、
    Ｘ１４は、任意のアミノ酸、好ましくはＤ、Ｅ、Ｈ、ＫおよびＲからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＥであり、
    Ｘ１５は、任意のアミノ酸、好ましくはＤまたはＥであり、
    Ｘ１６は任意のアミノ酸である、
    請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記標的化分子が、反復コンセンサス配列：
    ＮＸ１Ｘ２ＤＸ３Ｘ４ＧＸ６ＴＰＬＨＬＸ８ＡＸ１０Ｘ１１ＧＨＬＥＩＶＸ１５ＶＬＬＫＸ１６ＧＡＤＶ
    を含む反復モジュールを含み、
    ここで、
    Ｘ１は、任意のアミノ酸、好ましくは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり、
    Ｘ２は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ３は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ４は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ６は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ８はＡまたはＶであり、
    Ｘ１０は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ１１は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ１５はＤまたはＥであり、
    Ｘ１６は任意のアミノ酸である、
    請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記標的化分子が、それぞれが前記反復コンセンサス配列を含む、同一であっても異なっていてもよい少なくとも２つの反復モジュールを含む、請求項４３～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記標的化分子が、それぞれが前記反復コンセンサス配列を含む、同一であっても異なっていてもよい２～２０個の反復モジュールを含む、請求項４３～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記標的化分子が、それぞれが前記反復コンセンサス配列を含む、同一であっても異なっていてもよい３つの反復モジュールを含む、請求項４３～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記標的化分子が３つの反復モジュールを含み、ここで、
    前記標的化分子の第１の反復モジュールが、コンセンサス配列：
    ＮＡＸ２ＤＸ３Ｘ４ＧＸ６ＴＰＬＨＬＸ８ＡＷＨＧＨＬＥＩＶＸ１５ＶＬＬＫＸ１６ＧＡＤＶ、
    を含み、
    前記標的化分子の第２の反復モジュールが、コンセンサス配列：
    ＮＡＸ２ＤＸ３Ｘ４ＧＸ６ＴＰＬＨＬＡＡＸ１０Ｘ１１ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ１６ＧＡＤＶ、
    を含み、および
    前記標的化分子の第３の反復モジュールが、コンセンサス配列：
    ＮＸ１Ｘ２ＤＸ３Ｘ４ＧＸ６ＴＰＬＨＬＡＡＸ１０Ｘ１１ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ１６ＧＡＤＶ、
    を含み、
    ここで、
    Ｘ１は、任意のアミノ酸、好ましくは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり、
    Ｘ２は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ３は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ４は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ６は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ８はＡまたはＶであり、
    Ｘ１０は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ１１は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ１５はＤまたはＥであり、
    Ｘ１６は、任意のアミノ酸、好ましくはＹ、ＨおよびＮからなる群より選択されるアミノ酸である、
    請求項１～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記標的化分子が、それぞれが図５に示される配列番号１～２８の反復モジュール１、２および３の群から選択される配列を含む少なくとも１つの反復モジュールを含む、請求項１～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記標的化分子が３つの反復モジュールを含み、反復モジュール１が、図５に示される配列番号１～２８の反復モジュール１の群から選択され、反復モジュール２が、図５に示される配列番号１～２８の反復モジュール２の群から選択され、反復モジュール３が、図５に示される配列番号１～２８の反復モジュール３の群から選択される、請求項１～５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記標的化分子が３つの反復モジュールを含み、反復モジュール１、反復モジュール２および反復モジュール３が、図５に示される配列番号１～２８からなる群より選択される配列の反復モジュール１、反復モジュール２および反復モジュール３である、請求項１～５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記反復モジュールが反復ドメイン中に存在する、請求項４３～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記反復ドメインが、Ｎ末端および／またはＣ末端キャッピングモジュールをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記標的化分子が、配列番号１～２８からなる群より選択される配列を含む、請求項１～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 免疫エフェクタ細胞を標的とするアンキリンリピートタンパク質を含む分子。
  57. 前記免疫エフェクタ細胞がＴ細胞である、請求項５６に記載の分子。
  58. 前記免疫エフェクタ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項５６または５７に記載の分子。
  59. ＣＤ８を標的とする、請求項５６～５８のいずれか一項に記載の分子。
  60. 前記アンキリンリピートタンパク質が、反復コンセンサス配列：
    ＮＸ１Ｘ２ＤＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＴＰＸ７ＨＬＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＨＸ１３Ｘ１４ＩＶＸ１５ＶＬＬＫＸ１６Ｘ１７Ｘ１８ＤＸ１９
    を含む反復モジュールを含み、
    ここで、
    Ｘ１は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり、
    Ｘ２は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ３は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ４は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ５は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＧであり、
    Ｘ６は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ７は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、Ｙからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＬであり、
    Ｘ８は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＡまたはＶであり、
    Ｘ９は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＡであり、
    Ｘ１０は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ１１は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ１２は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＧであり、
    Ｘ１３は任意のアミノ酸、好ましくはＬであり、
    Ｘ１４は、任意のアミノ酸、好ましくはＤ、Ｅ、Ｈ、ＫおよびＲからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＥであり、
    Ｘ１５は、任意のアミノ酸、好ましくはＤまたはＥであり、
    Ｘ１６は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ１７は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＡ、ＧおよびＳからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＧであり、
    Ｘ１８は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＡであり、
    Ｘ１９は、任意のアミノ酸、好ましくはＩ、ＬおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＶである、
    請求項５６～５９のいずれか一項に記載の分子。
  61. 前記アンキリンリピートタンパク質が、反復コンセンサス配列：
    ＮＸ１Ｘ２ＤＸ３Ｘ４ＧＸ６ＴＰＬＨＬＸ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１ＧＨＸ１３Ｘ１４ＩＶＸ１５ＶＬＬＫＸ１６ＧＡＤＶ
    を含む反復モジュールを含み、
    ここで、
    Ｘ１は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり、
    Ｘ２は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ３は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ４は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ６は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ８はＡまたはＶであり、
    Ｘ９は、任意のアミノ酸、好ましくはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＡであり、
    Ｘ１０は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ１１は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ１３は任意のアミノ酸、好ましくはＬであり、
    Ｘ１４は、任意のアミノ酸、好ましくはＤ、Ｅ、Ｈ、ＫおよびＲからなる群より選択されるアミノ酸、より好ましくはＥであり、
    Ｘ１５は、任意のアミノ酸、好ましくはＤまたはＥであり、
    Ｘ１６は任意のアミノ酸である、
    請求項５６～６０のいずれか一項に記載の分子。
  62. 前記アンキリンリピートタンパク質が、反復コンセンサス配列：
    ＮＸ１Ｘ２ＤＸ３Ｘ４ＧＸ６ＴＰＬＨＬＸ８ＡＸ１０Ｘ１１ＧＨＬＥＩＶＸ１５ＶＬＬＫＸ１６ＧＡＤＶ
    を含む反復モジュールを含み、
    ここで、
    Ｘ１は、任意のアミノ酸、好ましくは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり、
    Ｘ２は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ３は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ４は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ６は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ８はＡまたはＶであり、
    Ｘ１０は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ１１は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ１５はＤまたはＥであり、
    Ｘ１６は任意のアミノ酸である、
    請求項５６～６１のいずれか一項に記載の分子。
  63. 前記アンキリンリピートタンパク質が、それぞれが前記反復コンセンサス配列を含む、同一であっても異なっていてもよい少なくとも２つの反復モジュールを含む、請求項６０～６２のいずれか一項に記載の分子。
  64. 前記アンキリンリピートタンパク質が、それぞれが前記反復コンセンサス配列を含む、同一であっても異なっていてもよい２～２０個の反復モジュールを含む、請求項６０～６３のいずれか一項に記載の分子。
  65. 前記アンキリンリピートタンパク質が、それぞれが前記反復コンセンサス配列を含む、同一であっても異なっていてもよい３つの反復モジュールを含む、請求項６０～６４のいずれか一項に記載の分子。
  66. 前記アンキリンリピートタンパク質が３つの反復モジュールを含み、ここで、
    前記標的化分子の第１の反復モジュールが、コンセンサス配列：
    ＮＡＸ２ＤＸ３Ｘ４ＧＸ６ＴＰＬＨＬＸ８ＡＷＨＧＨＬＥＩＶＸ１５ＶＬＬＫＸ１６ＧＡＤＶ、
    を含み、
    前記標的化分子の第２の反復モジュールが、コンセンサス配列：
    ＮＡＸ２ＤＸ３Ｘ４ＧＸ６ＴＰＬＨＬＡＡＸ１０Ｘ１１ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ１６ＧＡＤＶ、
    を含み、および
    前記標的化分子の第３の反復モジュールが、コンセンサス配列：
    ＮＸ１Ｘ２ＤＸ３Ｘ４ＧＸ６ＴＰＬＨＬＡＡＸ１０Ｘ１１ＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＸ１６ＧＡＤＶ、
    を含み、
    ここで、
    Ｘ１は、任意のアミノ酸、好ましくは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、ＴおよびＶからなる群より選択されるアミノ酸であり、
    Ｘ２は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ３は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ４は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ６は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ８はＡまたはＶであり、
    Ｘ１０は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ１１は任意のアミノ酸であり、
    Ｘ１５はＤまたはＥであり、
    Ｘ１６は、任意のアミノ酸、好ましくはＹ、ＨおよびＮからなる群より選択されるアミノ酸である、
    請求項５６～６５のいずれか一項に記載の分子。
  67. 前記アンキリンリピートタンパク質が、それぞれが図５に示される配列番号１～２８の反復モジュール１、２および３の群から選択される配列を含む少なくとも１つの反復モジュールを含む、請求項５６～６６のいずれか一項に記載の分子。
  68. 前記アンキリンリピートタンパク質が３つの反復モジュールを含み、反復モジュール１が、図５に示される配列番号１～２８の反復モジュール１の群から選択され、反復モジュール２が、図５に示される配列番号１～２８の反復モジュール２の群から選択され、反復モジュール３が、図５に示される配列番号１～２８の反復モジュール３の群から選択される、請求項５６～６７のいずれか一項に記載の分子。
  69. 前記アンキリンリピートタンパク質が３つの反復モジュールを含み、反復モジュール１、反復モジュール２および反復モジュール３が、図５に示される配列番号１～２８からなる群より選択される配列の反復モジュール１、反復モジュール２および反復モジュール３である、請求項５６～６８のいずれか一項に記載の分子。
  70. 前記反復モジュールが反復ドメイン中に存在する、請求項６０～６９のいずれか一項に記載の分子。
  71. 前記反復ドメインが、Ｎ末端および／またはＣ末端キャッピングモジュールをさらに含む、請求項７０に記載の分子。
  72. 前記アンキリンリピートタンパク質が、配列番号１～２８からなる群より選択される配列を含む、請求項５６～７１のいずれか一項に記載の分子。
  73. 任意で前記アンキリンリピートタンパク質と融合した、別のペプチドまたはタンパク質成分をさらに含む、請求項５６～７２のいずれか一項に記載の分子。
  74. ポリペプチド化合物である、請求項５６～７３のいずれか一項に記載の分子。
  75. 脂質もしくは脂質様成分または別の非ペプチド成分をさらに含む、請求項５６～７３のいずれか一項に記載の分子。
  76. 請求項５６～７４のいずれか一項に記載の分子をコードする核酸。
  77. 任意で前記分子を発現する、請求項７６に記載の核酸を含む宿主細胞。
  78. 請求項５６～７５のいずれか一項に記載の分子を含む粒子。
  79. 抗原受容体をコードする核酸をさらに含む、請求項７８に記載の粒子。
  80. 前記抗原受容体がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、請求項７９に記載の粒子。
  81. 前記抗原が、疾患、障害または状態に関連する、請求項７９または８０に記載の粒子。
  82. 前記抗原が腫瘍関連抗原である、請求項７９～８１のいずれか一項に記載の粒子。
  83. 前記核酸がＲＮＡである、請求項７９～８２のいずれか一項に記載の粒子。
  84. 前記核酸がＤＮＡである、請求項７９～８２のいずれか一項に記載の粒子。
  85. 非ウイルス粒子である、請求項７８～８４のいずれか一項に記載の粒子。
  86. 脂質ベースおよび／またはポリマーベースの粒子である、請求項７８～８５のいずれか一項に記載の粒子。
  87. ナノ粒子である、請求項７８～８６のいずれか一項に記載の粒子。
  88. 前記粒子が、その表面上の前記アンキリンリピートタンパク質で官能化されている、請求項７８～８７のいずれか一項に記載の粒子。
  89. 前記粒子が、前記アンキリンリピートタンパク質を少なくとも１つの粒子形成成分に連結することによって前記アンキリンリピートタンパク質で官能化される、請求項７８～８８のいずれか一項に記載の粒子。
  90. 請求項５６～７５のいずれか一項に記載の分子、請求項７８～８９のいずれか一項に記載の粒子、またはそれらの複数を含む組成物。
  91. 請求項５６～７５のいずれか一項に記載の分子、請求項７８～８９のいずれか一項に記載の粒子、またはそれらの複数を含む医薬組成物。
  92. 請求項５６～７５のいずれか一項に記載の分子、請求項７６に記載の核酸、請求項７７に記載の宿主細胞、請求項７８～８９のいずれか一項に記載の粒子、請求項９０に記載の組成物、または請求項９１に記載の医薬組成物を含むキット。
  93. 請求項１～５５のいずれか一項に記載の方法において前記キットを使用するための説明書をさらに含む、請求項９２に記載のキット。
  94. 請求項１～５５のいずれか一項に記載の方法において使用するための、請求項７８～８９のいずれか一項に記載の粒子またはその複数。
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