CN110709104A - 用aplnr拮抗剂和vegf抑制剂治疗眼部病症的方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了用于治疗、预防眼部疾病或减轻其严重性的方法。本公开的方法包括：向有需要的受试者施用治疗性组合物，所述治疗性组合物包括APLNR拮抗剂，如抗APLNR抗体，与血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂(例如，阿柏西普)的组合。
Description
序列表
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技术领域
本公开涉及治疗血管性眼部疾病的方法，具体地，所述方法通过向有需要的受试者施用apelin受体拮抗剂和血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂来进行。
背景技术
血管性眼部疾病是当今老龄化人口中视力丧失的主要原因。这些疾病的特征可能是异常的“渗漏”血管生长到视网膜中。糖尿病性视网膜病变和渗出性年龄相关性黄斑变性是造成此受试者人群的最大的两个原因。
在美国，糖尿病性视网膜病变(DR)是视力障碍的主要原因(Klein等人，1984，《眼科学(Ophthalmology)》91:1464-1474；Moss等人，1998，《眼科学(Ophthalmology)》105:998-1003)。糖尿病性视网膜病变起因于以基底膜增厚为开端的微血管代偿失调(Ruggiero等人，1997，《糖尿病和新陈代谢(Diabetes Metab.)》23:30-42)，并且最终导致血管阻塞和新血管形成(Porta等人，2002，《糖尿病学(Diabetologia)》45:1617-1634)。据估计，在40岁及以上的糖尿病受试者中，约28％患有DR，并且4.4％患有视力威胁性DR(Zhang等人，2010，《美国医学会杂志(JAMA)》304:649-656)。糖尿病性黄斑水肿(DME)是DR的一种表现，并且是年轻人和中年人失明的最常见的原因(Klein等人，1984，《眼科学(Ophthalmology)》91:1464-1474；Moss等人，1998，《眼科学(Ophthalmology)》105:998-1003)。
年龄相关性黄斑变性(AMD)是发达国家中年龄为50岁或以上的人中严重视力丧失的主要原因。近年来，随着抗血管生成剂的引入，在治疗AMD方面已经取得了重大进展，这为患有新生血管AMD的受试者提供了明显视力恢复的希望(Keane等人，2012，《眼科学综览(Surv Ophthalmol.)》57:389-414)。
apelin原前体是在人类CNS和周围组织，例如肺、心脏和乳腺中表达的77个氨基酸蛋白质。已经示出包括大小不同的apelin肽的C末端片段的肽激活G蛋白偶联受体，APJ受体(现称为APLNR)(Habata等人，1999，《生化与生物物理学报(Biochem Biophys Acta)》1452:25-35；Hosoya等人，2000，《生物化学杂志(JBC)》275(28):21061-67；Lee等人，2000，《神经化学杂志(J Neurochem)》74:34-41；Medhurst等人，2003，《神经化学杂志(J Neurochem)》84:1162-1172)。许多研究表明，apelin肽和类似物通过其与APJ受体(APLNR)的相互作用传递心血管和血管生成作用，如内皮依赖性血管舒张作用(Tatemoto等人，2001，《调节肽(Regul Pept)》99:87-92)。
apelin系统似乎在病理生理血管生成中起作用。研究已经表明，apelin可能参与了低氧诱导的视网膜血管生成(Kasai等人，2010，《动脉硬化、血栓形成与血管生物学(Arterioscler Thromb Vasc Bioi)》30:2182-2187)。在一些报道中，某些组合物可以通过抑制apelin/APJ途径来抑制血管生成(参见，例如，美国专利第7,736,646号)，如能够阻断病理性血管生成并因此可用于抑制视网膜中血管生成的APLNR抑制剂(Kojima,Y.和Quertermous,T.，2008，《动脉硬化、血栓形成与血管生物学(Arterioscler Thromb VascBiol)》28:1687-1688)。因此，对apelin介导的信号传导的干扰也可能有利于早期预防增生性糖尿病性视网膜病变(Tao等人，2010，《眼科研究与视觉科学(Invest Opthamol VisualScience)》51:4237-4242；Du,JH等人，《国际眼科杂志(Int J Ophthalmol.)》2014年12月18日；7(6):968-73；Lu,Q.等人，2013，《公共科学图书馆期刊(PLoS One)》8(7):e69703。最近，apelin被认为与早产儿视网膜病变的机制有关(Ali YF等人，《临床眼科学(ClinOphthalmol.)》2017年2月21日；11:387-392)。
抗血管内皮生长因子(VEGF)治疗(例如阿柏西普)是用于新血管性AMD和DME治疗的护理标准。阿柏西普在这些受试者人群中的功效和安全性得到很好的表征(Dixon等人，2009；(《研究药物的专家意见(Expert Opin.Investig.Drugs)》18:1573-80)。然而，在AMD中，尽管大约95％的受试者保持了视力，但只有大约30％的受试者在1年时获得了15个或更多个字母的最佳矫正视敏度(BCVA)的改善。在DME中，也有可能改善治疗结果。如使用阿柏西普和兰尼单抗所见，在1年和2年内，不到50％的因DME而导致视力丧失的受试者获得了15个或更多个字母的改善。另外，在使用兰尼单抗的研究中，在多达7.2％的已经接受了3年兰尼单抗的月度治疗的受试者中出现了增殖性视网膜病变的临床证据，其中多达3.2％的受试者需要全视网膜光凝，一种可能视觉上致残的治疗方式(Brown等人，2013，《眼科学(Ophthalmology)》10:2013-22)。
尽管已知apelin/APLNR和VEGF两者都是促血管生成和血管发育的因素，但是尚不完全了解两种信号传导路径在促血管生成中相互作用的机理。具体地，已知这些路径涉及视网膜血管的形成，并且各种研究已经报道了apelin和VEGF具有正反馈和负反馈作用，其中一种表达的增加可以促进另一种的表达，或一种的拮抗作用抑制另一种的表达(Lu等人，2014，《分子视觉(Molecular Vision)》，20:1122-1131)。
已经证明玻璃体内(IVT)递送如兰尼单抗和阿柏西普等抗VEGF疗法对脉络膜视网膜疾病具有功效和安全性。然而，还有许多额外因素导致血管渗透性、新生血管和其它血管功能障碍。
发明内容
一方面，本发明提供了用于治疗、预防或改善受试者的血管性眼部疾病或病症中的至少一种症状或适应症的方法。所述方法包含向有需要的受试者施用治疗有效量的包括APLNR拮抗剂的药物组合物。在某些实施例中，所述APLNR拮抗剂与血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂组合施用，例如通过施用治疗有效量的包括VEGF拮抗剂的药物组合物。
在某些实施例中，所述眼部疾病或病症选自由以下组成的组：糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、视网膜新生血管、中央视网膜静脉阻塞、分支视网膜静脉阻塞、息肉状脉络膜血管病变、脉络膜新生血管(CNV)、变性近视(近视性CNV)、新生血管性青光眼和早产儿视网膜病变。
另一方面，本发明提供了用于抑制受试者的视网膜血管生成的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括APLNR拮抗剂与VEGF拮抗剂的组合。在一些实施例中，视网膜血管生成与血管性眼部疾病或病症有关。
另一方面，本发明提供了用于抑制视网膜新生血管的方法(例如，在患有与血管生成有关的眼部疾病或病症的受试者中)。所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括APLNR拮抗剂与VEGF拮抗剂的组合。
另一方面，本发明提供了用于抑制受试者的脉络膜新生血管的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括APLNR拮抗剂与VEGF拮抗剂的组合。
另一方面，本发明提供了用于改善受试者的血管再生和减少异常新生血管的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括APLNR拮抗剂与VEGF拮抗剂的组合。
另一方面，本发明提供了用于促进有需要的受试者的视网膜血运重建的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的APLNR拮抗剂；以及向所述受试者施用治疗有效量的血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂。
另一方面，本发明提供了用于促进有需要的受试者的视网膜血管均匀再生的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的APLNR拮抗剂；以及向所述受试者施用治疗有效量的血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂。
另一方面，本发明提供了改善有需要的受试者的视网膜血管向外生长的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的APLNR拮抗剂；以及向所述受试者施用治疗有效量的血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂。
另一方面，本发明提供了用于促进有需要的受试者的视网膜中血管均匀生长的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的APLNR拮抗剂；以及向所述受试者施用治疗有效量的血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂。
另一方面，本发明提供了用于改善有需要的受试者的视网膜的血管组织的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的APLNR拮抗剂；以及向所述受试者施用治疗有效量的血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂。
在以上或本文讨论的任何方法中，受试者可以是已经被诊断患有眼部疾病或病症的个体。在一些情况下，所述眼部疾病或病症选自由以下组成的组：糖尿病性视网膜病变、增生性糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、视网膜新生血管、中央视网膜静脉阻塞、分支视网膜静脉阻塞、息肉状脉络膜血管病变、脉络膜新生血管(CNV)、变性近视(近视性CNV)、新生血管性青光眼和早产儿视网膜病变。在一些情况下，所述眼部疾病或病症是年龄相关性黄斑变性。在一些情况下，所述眼部疾病或病症是糖尿病性黄斑水肿。在一些情况下，所述眼部疾病或病症是早产儿视网膜病变。在一些情况下，所述眼部疾病或病症是增生性糖尿病性视网膜病变。
可以用于本公开的方法或组合物的上下文的示例性APLNR拮抗剂包含APLNR的小分子化学抑制剂，或靶向APLNR的生物制剂，如肽、肽模拟物和抗体。在某些实施例中，APLNR拮抗剂阻断APLNR和apelin的相互作用。
根据某些实施例，APLNR拮抗剂是结合APLNR拮抗剂和抑制APLNR信号传导的抗体或抗原结合蛋白。在某些实施例中，抗APLNR抗体或抗原结合蛋白包括重链可变区(HCVR)的包括SEQ ID NO:2或13的氨基酸序列的重链互补决定区(HCDR)和轻链可变区(LCVR)的包括SEQ ID NO:7或18的氨基酸序列的轻链CDR。在某些实施例中，抗APLNR抗体或抗原结合蛋白包括选自由以下组成的组的抗APLNR抗体的重链可变区(HCVR)的互补决定区(CDR)：H2aM9232N(或H4H9232N)和H1M9207N。
在以上或本文讨论的任何方法或组合物中，所述APLNR拮抗剂可以包括抗APLNR抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合人APLNR。在一些情况下，所述抗体或其抗原结合片段与参考抗体竞争结合人apelin受体(APLNR)，所述参考抗体包括选自由SEQ ID NO:2/7和13/18组成的组的HCVR/LCVR序列对，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合人APLNR。在一些情况下，所述抗体或其抗原结合片段与参考抗体结合APLNR上的相同表位，所述参考抗体包括选自由SEQ ID NO:2/7和13/18组成的组的HCVR/LCVR序列对，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合人APLNR。在一些情况下，所述抗体或抗原结合片段包括：(a)重链可变区(HCVR)的互补性决定区(CDR)，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2和13；以及(b)轻链可变区(LCVR)的CDR，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:7和18。在一些情况下，所述抗体或抗原结合片段包括HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3结构域，其分别选自由以下组成的组：SEQID NO:3-4-5-8-9-10和14-15-16-19-20-21。在一些情况下，所述抗体或抗原结合片段包括：(a)重链可变区(HCVR)，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2和13；以及(b)轻链可变区(LCVR)，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:7和18。在一些情况下，所述抗体或抗原结合片段包括选自由SEQ ID NO:2/7和13/18组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的所述重链和轻链CDR。在一些情况下，所述抗体或抗原结合片段包括选自由SEQ ID NO:2/7和13/18组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
在以上或本文讨论的方法或组合物中的任一个的一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:2/7的所述HCVR/LCVR氨基酸序列对。
在以上或本文讨论的方法或组合物中的任一个的一个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:13/18的所述HCVR/LCVR氨基酸序列对。
在以上或本文讨论的方法或组合物中的任一个中，所述抗体或抗原结合片段可以是具有IgG1或IgG4重链恒定区的人抗体。在一个实施例中，所述重链恒定区是人IgG1。在一个实施例中，所述重链恒定区是人IgG4。
在上文或本文讨论的任何一种或方法或组合物的各个实施例中，所述抗体或其抗原结合片段阻断APLNR和apelin的相互作用。在一些情况下，所述抗体或其抗原结合片段阻断APLNR和apelin的相互作用，在竞争性结合测定中表现出至少50％的结合抑制。在一些情况下，所述抗体或其抗原结合片段不阻断或仅部分阻断APLNR和apelin的相互作用。
在本公开的组合物和方法中可以与APLNR拮抗剂组合使用的VEGF拮抗剂包含抗VEGF抗体(例如兰尼单抗)、小分子VEGF抑制剂(例如舒尼替尼)和VEGF抑制性融合蛋白(“VEGF捕获剂”)。在本公开的治疗方法中可以与APLNR拮抗剂组合使用的VEGF拮抗剂的实例是阿柏西普，一种VEGF抑制性融合蛋白(参见例如US 7,087,411)。
在上文或本文讨论的方法或组合物的任一个中，所述VEGF拮抗剂包括基于VEGF受体的嵌合分子(VEGF捕获剂)。在一些情况下，所述VEGF捕获剂包括VEGFR1的一个或多个免疫球蛋白(Ig)样结构域、VEGFR2的一个或多个Ig样结构域以及多聚结构域。在一些情况下，所述VEGF捕获剂包括VEGFR1的Ig样结构域2、VEGFR2的Ig样结构域3和多聚结构域。在一些情况下，所述VEGF捕获剂是阿柏西普或其生物类似物分子。在一些情况下，所述VEGF拮抗剂由两个多肽的二聚体组成，所述二聚体由SEQ ID NO:23的氨基酸27-457组成。
另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包括治疗有效量的APLNR拮抗剂和药学上可接受的载剂或稀释剂。在某些实施例中，所述药物组合物进一步包括VEGF拮抗剂。
在各个实施例中，本公开提供了APLNR拮抗剂与VEGF拮抗剂结合在制造药物中的用途，以治疗包含人类等受试者的眼部疾病或病症或执行上文或本文讨论的任何方法的其它目的。上文或本文讨论的所有方法可以体现为APLNR拮抗剂和VEGF拮抗剂在治疗眼部疾病或病症或所述方法的其它目的中的一种或多种用途。其它实施例包含用于上文或本文讨论的方法的APLNR拮抗剂和VEGF拮抗剂。
另一方面，本发明提供了一种用于治疗血管性眼部疾病或病症的组合物，其中所述组合物包括治疗有效量的APLNR拮抗剂、治疗有效量的血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂和合适的载剂、赋形剂或稀释剂。在组合物的各种实施例中，APLNR拮抗剂或VEGF拮抗剂可以如上文或本文所讨论。
通过阅读随后的具体实施方式，其它实施例将变得显而易见。
附图说明
图1A和1B是在P2到P5时经过全身(IP)治疗的小鼠视网膜的代表性显微照片和计算出的血管面积图。与未经治疗的视网膜相比，经过αApelinR(抗APLNR抗体H2aM9232N)治疗的视网膜的残余血管面积明显较小(25mg/kg时为23％，p<0.05)。用GS凝集素I对视网膜内皮细胞进行染色。以20x(用于定量)和40x拍摄图像。使用学生T测试进行统计分析。通过全身注射的ApelinR选择性抑制延缓P5幼崽正在发育的视网膜中正常的血管向外生长。在25mg/kg剂量时，阻断ApelinR会轻微抑制血管向外生长。
图2A和2B是在P2到P5时经过全身(IP)治疗的小鼠视网膜的代表性显微照片和计算出的血管面积图。与未经治疗的视网膜相比，经过αApelinR治疗的视网膜的残余血管面积明显较小(50mg/kg时为35％，p<0.005)。用GS凝集素I对视网膜内皮细胞进行染色。以20x(用于定量)和40x拍摄图像。使用学生T测试进行统计分析。通过全身注射的ApelinR选择性抑制延缓P5幼崽正在发育的视网膜中正常的血管向外生长。通过将剂量增加到50mg/kg剂量，靶向ApelinR进一步延缓视网膜血管向外生长。
图3A和3B是在P2到P5时经过全身(IP)治疗的小鼠视网膜的代表性显微照片和计算出的血管面积图。在这项单盲研究中，与经过Fc处理的对照相比，50mg/kg的αApelinR使血管生长减少了29.8％(p<0.0001)。用GS凝集素I对视网膜内皮细胞进行染色。以20x(用于定量)和40x拍摄图像。使用学生T测试进行统计分析。通过全身注射的ApelinR选择性抑制延缓P5幼崽正在发育的视网膜中正常的血管向外生长。
图4A和4B是在P2到P5时经过全身(IP)治疗的小鼠视网膜的代表性显微照片和计算出的血管面积图。与单一试剂，单独αApelinR(50mg/kg时31％，p<0.001)或阿柏西普(50mg/kg时43％，p<0.005)相比，组合(aApelinR+阿柏西普)的残余血管面积显著较小(50mg/kg时62％，p<0.0001)。用GS凝集素I对视网膜内皮细胞进行染色。注意对剂量和相关血管化面积的影响。以20x(用于定量)和40x拍摄图像。使用单因素方差分析和事后Tukey测试进行统计分析。在全身和玻璃体内施用两者(参见图5A和5B)中，αApelinR和阿柏西普组合疗法导致正常发育的视网膜脉管系统退化。与单独阻断ApelinR或阻断VEGFA相比，通过全身注射阻断ApelinR和VEGFA两者更有效地阻止血管向外生长。在此模型中，与αApelinR相比，组合治疗使血管面积进一步减小了46％(p<0.0005)，并且与阿柏西普相比，则减少了32％(p<0.001)。
图5A和5B是在P4到P6时通过玻璃体内(IVT)注射治疗的小鼠视网膜的代表性显微照片和计算出的血管面积图。与单一试剂，单独αApelinR(5μg时43％，p<0.0001)或阿柏西普(5μg时65％，p<0.0001)相比，组合(aApelinR+阿柏西普)的残余血管面积显著较小(5μg时68％，p<0.0001)。用GS凝集素I对视网膜内皮细胞进行染色。注意对剂量和相关血管化面积的影响。以20x(用于定量)和40x拍摄图像。使用单因素方差分析和事后Tukey测试进行统计分析。在全身和玻璃体内施用两者中，αApelinR和阿柏西普组合疗法导致正常发育的视网膜脉管系统退化。与单独阻断ApelinR和VEGFA相比，通过玻璃体内注射阻断ApelinR和VEGFA两者甚至更有效地阻止血管向外生长。与αApelinR相比，IVT组合治疗使血管面积进一步减小了50％(p<0.0005)，并且与阿柏西普相比，则减少了34％(p<0.001)。
图6A和6B是在P12到P16时经过全身(IP)治疗的OIR小鼠视网膜的代表性显微照片和计算出的血管面积图。与Fc(对照)视网膜相比，αApelinR(29％，p<0.05)和阿柏西普(27.5％，p<0.01)视网膜中的残余无血管面积明显较小。注意，与Fc相比，经过αApelinR(67％，p<0.0001)和阿柏西普(94％，p<0.0005)处理的样品中的新生血管簇明显减少。用GS凝集素I对视网膜内皮细胞进行染色。以20x(无血管面积定量)和40x(异常新生血管面积定量)拍摄图像。使用学生T测试进行统计分析。通过全身注射的ApelinR和VEGFA抑制两者都促进视网膜血管再生，并且减少异常的新生血管。
图7A和7B是在P12到P16时经过玻璃体内治疗的氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠视网膜的代表性显微照片和计算出的血管面积图。与Fc对照相比，αApelinR(27.5％，p<0.05)中的残余无血管面积显著减小，并且阿柏西普(32％，p<0.0001)条件中的残余无血管面积显著增大。注意，αApelinR中的新生血管簇明显减少(60％，p<0.0001)，并且阿柏西普样品中的簇完全消失。用GS凝集素I对视网膜内皮细胞进行染色。注意对剂量和相关血管化面积的影响。以20x(无血管面积定量)和40x(异常新生血管面积定量)拍摄图像。使用单因素方差分析和事后Tukey测试进行统计分析。在全身(参见图6A和6B)和玻璃体内施用两者中，ApelinR的选择性抑制都会促进OIR小鼠的视网膜血管再生，并且减少新生血管。通过玻璃体内注射的ApelinR抑制改善血管再生，并且减少异常的新生血管，而VEGFA抑制阻止血管再生，并且完全阻止任何新生血管。
图8A和8B是在P12到P16时经过全身治疗的OIR小鼠视网膜的代表性显微照片(20x)和计算出的血管面积图。组合治疗的再生速率与单独的每种试剂类似，与经过hFc治疗的对照视网膜相比，血管再生得到改善，并且治疗组之间的无血管面积有显著变化(p<0.0005)。
图9A和9B是在P12到P16时经过全身治疗的OIR小鼠视网膜的代表性显微照片(40x)和计算出的异常血管面积图。与阿柏西普相比，组合治疗示出更少的修剪血管，并且与抗APLNR和Fc对照相比，更少的异常新生血管(图9A)。图9B示出了治疗组之间的异常血管面积有显著变化(p<0.0005)。与Fc对照相比，使用抗APLNR(***，p<0.0005)、使用阿柏西普(***，p<0.005)和使用组合(***，p<0.0005)显著减小了异常血管面积，与抗APLNR治疗组相比，组合治疗组的异常血管面积也显著减小(*，p<0.05)。
图10表示用于计算实例7中的血管面积和血管长度的图像处理和测量技术。“原始图像”是图9A中所示的40x显微照片。
图11A和11B是代表性的处理后图像，示出了在P12到P16时经过全身处理的OIR小鼠视网膜的显微照片(40x)和计算出的血管面积图的血管的组织和均匀性。如图11A所示，与单独的抗APLNR相比，抗APLNR抗体和阿柏西普的组合产生的视网膜血管更有组织和均匀，并且与单独的阿柏西普相比，则较稀疏(较少的修剪血管)。图11B示出了治疗组之间的血管面积有显著变化(p<0.0005)。与Fc对照相比，使用抗APLNR的血管面积显著增大(***，p<0.0005)，而使用阿柏西普(***，p<0.005)和组合治疗的血管面积减小(*，p<0.05)。与抗APLNR相比，使用阿柏西普(####，p<0.0005)和使用组合(####，p<0.0005)的血管面积显著减小。相反，与阿柏西普相比，使用组合治疗显著增加了血管面积(&&&，p<0.005)。
图12A和12B是代表性的处理后图像，示出了在P12到P16时经过全身处理的OIR小鼠视网膜的显微照片(40x)和计算出的血管长度图的血管的密度。如图12A所示，与单独的抗APLNR(更大密度)或阿柏西普(更低密度)相比，抗APLNR抗体和阿柏西普的组合产生了中等密度的视网膜血管。图12B示出了治疗组之间的血管长度有显著变化(p<0.0005)。与抗APLNR相比，使用阿柏西普(####，p<0.0005)和使用组合(####，p<0.0005)的血管长度显著减小。相反，与阿柏西普相比，使用组合治疗显著增加了血管长度(&&&，p<0.005)。
具体实施方式
在描述本公开之前，应当理解本公开不限于所描述的具体方法和实验条件，因为此类方法和条件可以变化。还应当理解，本文所使用的术语仅是为了描述具体实施例的目的，而不旨在是限制性的，因为本公开的范围将仅由所附权利要求限定。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。如本文所用，当用于提及具体所列举的数值时，术语“约”意指数值可以与所引用的值相差不超过1％。例如，如本文所用，表述“约100”包含99和101以及其之间的所有值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然本公开的实践或测试中可以使用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料的任何方法和材料，但现在描述了优选的方法和材料。本说明书中提及的所有专利、申请和非专利出版物均通过引用整体并入本文。
本发明和公开部分地基于令人惊讶的发现，即与单独使用APLNR拮抗剂或VEGF拮抗剂所观察到的相比，APLNR拮抗剂和VEGF拮抗剂(例如抗APLNR抗体和VEGF捕获剂)的组合可以在受试者的视网膜中产生更有组织和有序的中间密度的血运重建(具有更少的修剪血管)。
定义
如本文所用，表述“apelin受体”、“APLNR”、“apelinR”、“APJ受体”等是指具有阐述为以下的氨基酸序列：MEEGGDFDNYYGADNQSECEYTDWKSSGALIPAIYMLVFLLGTTGNGLVLWTVFRSSREKRRSADIFIASLAVADLTFVVTLPLWATYTYRDYDWPFGTFFCKLSSYLIFVNMYASVFCLTGLSFDRYLAIVRPVANARLRLRVSGAVATAVLWVLAALLAMPVMVLRTTGDLENTTKVQCYMDYSMVATVSSEWAWEVGLGVSSTTVGFVVPFTIMLTCYFFIAQTIAGHFRKERIEGLRKRRRLLSIIVVLVVTFALCWMPYHLVKTLYMLGSLLHWPCDFDLFLMNIFPYCTCISYVNSCLNPFLYAFFDPRFRQACTSMLCCGQSRCAGTSHSSSGEKSASYSSGHSQGPGPNMGKGGEQMHEKSIPYSQETLVVD(SEQ ID NO:22)，或与SEQ ID NO:22基本上类似的氨基酸序列的人APLNR蛋白。本文对蛋白质、多肽和蛋白质片段的所有提及旨在指代相应蛋白质、多肽或蛋白质片段的人类形式，除非明确指出其来自非人类物种(例如，“小鼠APLNR”、“猴APLNR”等)。
如本文所用，“结合APLNR的抗体或抗原结合片段”或“抗APLNR抗体”包含结合APLNR蛋白质的片段的免疫球蛋白分子、抗体和其抗原结合片段。APLNR分子包含天然APLNR蛋白质以及重组APLLR蛋白质变体，如例如单体和二聚APLLR构建体。在实施例中，结合APLNR或其抗原结合片段的抗体是APLNR拮抗剂。
如本文所用，术语“拮抗剂”部分地是指在与激动剂(例如，内源性配体)相同的位点或在相同位点附近结合受体，但是不活化通常通过受体的活性形式引发的细胞内应答，并且从而通过激动剂或部分激动剂抑制或中和细胞内应答的部分。术语拮抗剂还可以部分地指结合受体激动剂，从而将激动剂与其同源受体的相互作用隔离的部分。结合激动剂的拮抗剂的实例是配体捕获剂，如VEGF捕获剂。在一些情况下，在不存在激动剂或部分激动剂的情况下，拮抗剂不会减弱基线细胞内反应。拮抗剂不一定必须起竞争性结合抑制剂的作用，但是可以通过隔离激动剂或间接地调节下游作用来发挥作用。
如本文所用，术语APLNR拮抗剂可以指在与激动剂(例如，apelin)相同的位点或在相同位点附近结合APLNR受体，但是不活化通常通过受体的活性形式引发的细胞内应答，并且从而抑制或中和APLNR的细胞内应答的部分。在实施例中，APLNR拮抗剂是结合APLNR的抗体或其抗原结合片段。APLNR拮抗剂的实例可以在于2015年5月28日公开的国际专利公开第WO2015077491号中找到，其通过引用以其整体具体并入本文。其它APLNR拮抗剂可以包含小分子和其它生物实体，如肽。
术语“免疫球蛋白”(Ig)是指一类结构相关的糖蛋白，其由两对多肽链、一对轻(L)链和一对重(H)链组成，可以通过二硫键使全部四对相互连接。免疫球蛋白的结构已经被很好地表征。例如，参见《基础免疫学(Fundamental Immunology)第7章(Paul,W.编辑，第2版，Raven Press，N.Y.(1989))。
如本文所用，术语“抗体”意指包括与特定抗原(例如APLNR)特异性结合或相互作用的至少一个互补性决定区(CDR)的任何抗原结合分子或分子复合物。术语“抗体”包含免疫球蛋白分子，其包括通过二硫键相互连接的四个多肽链、两个重(H)链和两个轻(L)链，以及其多聚体(例如，IgM)，以及包含如本文所述的一个或多个重链的片段或一个或多个轻链的片段(例如Fab、F(ab')2或scFv片段)的免疫球蛋白分子。每个重链包括重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域CH1、CH2和CH3。每个轻链包括轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域(CL1)。可以将VH区和VL区进一步细分为称作互补性决定区(CDR)的高变区，其散布着更保守的称作构架区(FR)的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本公开的不同实施例中，抗APLNR抗体(或其抗原结合部分)的FR可以与人种系序列相同，或者可以是经过天然或人工修饰的。可以基于两个或更多个CDR的并列分析来定义氨基酸共有序列。
如本文所用，术语“抗体”还包含完整抗体分子的抗原结合片段。如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包含任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或基因工程化的多肽或糖蛋白，其特异性结合抗原以形成复合物。抗体的抗原结合片段可以例如使用任何合适的标准技术衍生自完整抗体分子，如蛋白水解消化或涉及操纵和表达编码抗体可变以及任选地恒定结构域的DNA的重组基因工程技术。此类DNA是已知的和/或易于从例如，商业来源、DNA库(包含例如，噬菌体-抗体库)获得，或可以合成。DNA可以通过化学方法或通过使用分子生物学技术进行测序和操作，例如，将一个或多个可变和/或恒定结构域排列成合适的构型，或引入密码子，产生半胱氨酸残基，修饰、添加或缺失氨基酸等。此类技术也可以用于合成任何含有衍生自完整抗体分子的抗原结合片段的抗体融合分子。
抗原结合片段的非限制性实例包含：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；以及(vii)由模拟抗体的高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位(例如，分离的互补性决定区(CDR)，如CDR3肽)或受约束的FR3-CDR3-FR4肽。其它工程化的分子，如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR嫁接抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小型模块化免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域也涵盖在如本文所用的表述“抗原结合片段”内。
抗体的抗原结合片段通常包括至少一个可变结构域。可变结构域可以具有任何大小或氨基酸组成，并且通常包括与一个或多个框架序列相邻或在框架内的至少一个CDR。在具有与VL结构域相关联的VH结构域的抗原结合片段中，VH结构域和VL结构域可以以任何合适的布置相对于彼此定位。例如，可变区可以是二聚体，并且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。替代性地，抗体的抗原结合片段可以含有单体VH或VL结构域。
在某些实施例中，抗体的抗原结合片段可以含有至少一个与至少一个恒定结构域共价连接的可变结构域。可以在本公开的抗体的抗原结合片段内发现的可变结构域和恒定结构域的非限制性示例性构型包含：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；以及(xiv)VL-CL。在可变结构域和恒定结构域的任何构型中，包含上文所列出的任何示例性构型，可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接或可以通过完整或部分铰链或连接子区域连接。铰链区可以由至少2个(例如，5个、10个、15个、20个、40个、60个或更多个)氨基酸组成，其导致单个多肽分子中相邻可变结构域和/或恒定结构域之间的柔性或半柔性连接。此外，本公开的抗体的抗原结合片段可以包括上文所列出的任何可变结构域和恒定结构域构型的同二聚体或异二聚体(或其它多聚体)，其彼此和/或与一个或多个单体VH或VL结构域非共价缔合(例如，通过一个或多个二硫键)。
与完整抗体分子一样，抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性的(例如，双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段通常包括至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够特异性结合到单独的抗原或同一抗原上的不同表位。可以使用本领域可用的常规技术，使包含本文公开的示例性双特异性抗体形式的任何多特异性抗体形式适用于本公开的抗体的抗原结合片段的上下文中。
短语“抗体融合蛋白”包含重组多肽和衍生自本公开的抗体的蛋白，其已经被工程化为含有如本文所述的抗体或抗原结合片段。肽组分可以在具有或不具有肽连接子的抗体轻链或重链的N末端或C末端融合到抗APLNR抗体或抗原结合片段。如本文所用，短语“融合到”是指(但不限于)通过嵌合基因的表达而形成的多肽，所述嵌合基因是通过组合多于一个序列而制备的，通常是通过将一个基因克隆到第二个基因的表达载体框中而形成的，使得两个基因编码一个连续多肽。如聚合酶链反应(PCR)和限制性核酸内切酶克隆等重组克隆技术，是本领域众所周知的。除了通过重组技术制备外，还可以通过化学反应或本领域已知的用于制备定制多肽的其它手段将多肽的部分彼此“融合”。
在一些实施例中，抗体融合蛋白的组分或氨基酸被连接子(或“间隔子”)肽隔开。此类肽连接子是本领域众所周知的(例如，聚甘氨酸或Gly-Ser连接子)，并且通常允许抗体融合蛋白的一种或两种组分的适当折叠。连接子提供融合蛋白组分的柔性连接区，允许分子的两个端部独立移动，并且可以在保持两个部分的适当功能中的每一个中起重要作用。因此，在一些情况下，连接区既充当连接子，又充当间隔子，所述连接子将两个部分组合在一起，所述间隔子使两个部分中的每一个形成其自身的生物结构而不干扰其它部分。更进一步，连接区应当产生表位，所述表位将不被受试者的免疫系统识别为异源，换句话说，将不被视为具有免疫原性。连接子选择也可能影响融合蛋白的结合活性，并且从而影响其生物活性。(参见Huston等人，1988，《美国国家科学院院刊(PNAS)》85:16:5879-83；Robinson和Bates，1998，《美国国家科学院院刊(PNAS)》95(11):5929-34；以及Arai等人，2001，《蛋白质工程设计与选择(PEDS)》14(8):529-32；Chen,X.等人，2013，《先进药物输送评论(Advanced Drug Delivery Reviews)》65:1357–1369。)在一个实施例中，apelin肽通过一个或多个肽连接子连接到抗体或其抗原结合片段的轻链或重链的C末端或N末端。
本公开的抗体可以通过补体依赖性细胞毒性反应(CDC)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性反应(ADCC)起作用。“补体依赖性细胞毒性反应”(CDC)是指在补体的存在下，通过本公开的抗体对表达抗原的细胞的裂解。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性反应”(ADCC)是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体，并且从而导致靶细胞的裂解。可以使用本领域熟知和可用的测定法来测量CDC和ADCC。(参见例如，美国专利第5,500,362号和第5,821,337号以及Clynes等人，1998，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))》95:652-656)。抗体的恒定区对于抗体固定补体和介导细胞依赖性细胞毒性的能力是重要的。因此，可以基于抗体是否需要介导细胞毒性来选择抗体的同种型。
另一方面，可以在其Fc结构域处使抗体工程化，以激活全部、部分或不激活正常的Fc效应子功能，而不影响抗体的所需药代动力学特性。因此，具有已经改变的Fc受体结合的工程化Fc结构域的抗体可能具有减少的副作用。因此，在一个实施例中，蛋白质包括嵌合或以其它方式修饰的Fc结构域。对于嵌合Fc结构域的实例，参见于2014年8月7日公布的国际公开第WO 2014/121087A1号，其通过引入以其整体并入本文。
如本文所用，术语“EC50”或“EC50”是指半数最大有效浓度，其包含在指定的暴露时间之后，介于基线与最大值之间半路诱导反应，例如细胞反应的配体的浓度。EC50基本上代表配体的浓度，其中观察到其最大效应的50％。因此，关于细胞信号传导，观察到受体活性增加，EC50值降低，即最大有效浓度值的一半(产生更大反应所需的配体越少)。
如本文所用，术语“IC50”或“IC50”是指细胞反应的最大抑制浓度的一半。换句话说，对特定部分(例如蛋白质、化合物或分子)抑制生物学或生物化学受体功能的有效性的量度，其中测定定量了抑制给定生物学过程所需的此类部分的量。因此，关于细胞信号传导，观察到抑制活性越大，IC50值降低。
用于治疗或改善血管性眼部疾病或病症的方法
本公开包含用于治疗、预防或改善受试者的血管性眼部疾病或病症中的至少一种症状或适应症的方法。根据本公开的此方面的方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的包括APLNR拮抗剂的药物组合物。在一些实施例中，APLNR拮抗剂是皮下、静脉内或玻璃体内施用的。在实施例中，APLNR拮抗剂与VEGF拮抗剂组合施用。在一些实施例中，APLNR拮抗剂与VEGF拮抗剂玻璃体内组合施用。在一些实施例中，APLNR拮抗剂与VEGF拮抗剂作为单一组合剂量调配物施用。在一些实施例中，APLNR拮抗剂与VEGF拮抗剂组合施用，其中APLNR拮抗剂静脉内施用，并且VEGF拮抗剂玻璃体内施用。VEGF拮抗剂可以在APLNR拮抗剂之前、之后或同时施用。
本发明部分地基于申请人的发现，即针对VEGF和apelin/APLNR途径两者的拮抗作用的组合可以有利地影响眼睛的有害病理性血管形成。具体地，申请人已经发现此类组合可以用于治疗或预防如糖尿病性视网膜病变等病状，包含增生性糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变和年龄相关性黄斑变性。在VEGF途径的拮抗作用已经饱和时，添加APLNR的拮抗剂可以改善VEGF拮抗作用的抗血管生成作用。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”等意指缓解症状、暂时或永久消除症状的原因、或预防或减慢新生血管性眼部疾病或病症症状的出现。在某些实施例中，本方法可用于治疗或改善至少一种症状或适应症，包含但不限于视网膜血管生成、新生血管、血管渗漏、中央凹中心500μm内的视网膜增厚、邻近视网膜增厚的中央凹中心500μm内的坚硬黄色渗出液、以及至少1个椎间盘区域的视网膜增厚，其中任何部分均位于中央凹中心的1个椎间盘直径范围内，视力模糊、漂浮物、对比度损失、双重视野以及最终视力丧失。在用于治疗如AMD或DME等血管性眼部疾病的方法的上下文中，术语是指从治疗开始，受试者表现出对早期治疗糖尿病性视网膜病变研究(EDTRS)视力表上的一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个)字母的获得。在某些实施例中，术语意指从治疗开始就预防了受试者中大于或等于15个字母的视力丧失。
如本文所用，术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”等意指预防血管性眼部疾病的症状、适应症或并发症的发展。在用于治疗如AMD或DME等血管性眼部疾病的方法的上下文中，术语意指从治疗开始就预防了受试者的中度或重度视力丧失。
如本文所用，“血管性眼部疾病或病症”是指影响眼睛的血管的眼部疾病或病症。疾病可能是由于异常的血管生成(新血管的形成)或血管的阻塞或阻断引起的。如本文所用，术语包含与血管生成有关的眼部疾病或病症。术语包含但不限于选自由以下组成的组的眼部疾病或病症：糖尿病性视网膜病变(包含增生性糖尿病性视网膜病变)、糖尿病性黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、视网膜新生血管、中央视网膜静脉阻塞、分支视网膜静脉阻塞、息肉状脉络膜血管病变、脉络膜新生血管(CNV)、变性近视(近视性CNV)、新生血管性青光眼和早产儿视网膜病变。在某些实施例中，术语“新生血管性眼部疾病或病症”可以与术语“与血管生成有关的眼部疾病或病症”互换使用。
在某些实施例中，本公开包含用于治疗、预防或改善受试者中与血管生成有关的眼部疾病或病症的至少一种症状或适应症的方法，其中所述疾病或病症选自由以下组成的组：病理性新生血管形成、糖尿病性视网膜病变(包含增生性糖尿病性视网膜病变)、糖尿病性黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、视网膜新生血管、息肉状脉络膜血管病变、脉络膜新生血管(CNV)、变性近视(近视性CNV)、新生血管性青光眼和早产儿视网膜病变。在某些实施例中，例如在氧诱导视网膜病变(OIR)中，APLNR拮抗剂的施用还促进了视网膜的正常血管再生。
如本文所用，“糖尿病性黄斑水肿”(DME)是指影响患有糖尿病的人(1型或2型)的严重眼部病状。当视网膜中的血管泄漏到黄斑中时，会发生黄斑水肿，并且积聚在眼部的黄斑(视网膜的黄色中央区域)上或其下的流体和蛋白质沉积物导致其增厚和肿胀(水肿)。由于黄斑位于眼球后部视网膜中央附近，因此肿胀可能会扭曲人的中央视力。DME的主要症状包含但不限于视力模糊、漂浮物、对比度损失、双重视野和最终视力丧失。DME的病理学特征在于血视网膜屏障的破坏，通常阻止水在视网膜中的移动，从而使流体在视网膜组织中积聚，并且存在视网膜增厚。DME目前是在由以下组成的眼部检查期间诊断出来的：视敏度测试，其确定一个人可以在标准图表上阅读的最小字母；散瞳眼部检查，其检查疾病的征兆；影像学测试，如光学相干断层扫描(OCT)或荧光素血管造影(FA)；以及眼压计，一种测量眼内压力的仪器。还进行了以下研究以确定治疗方法：光学相干断层扫描(OCT)、荧光素血管造影和彩色立体眼底照相。DME可以大致分为两个主要类别-局灶性和弥漫性。局灶性DME的特征在于有足够的黄斑血液流动的黄斑中分离和明显渗漏的特定区域。弥漫性DME是由黄斑周围的整个毛细血管床渗漏引起的，而渗漏是由于眼睛的内部血液-视网膜屏障破裂而引起的。除了局灶性和弥漫性，DME还根据临床检查结果归类为具有临床意义的黄斑水肿(CSME)、非CSME和具有中央累及的CSME(CSME-CI)，其涉及中央凹。本公开包含用于治疗DME的上述类别的方法。
如本文所用，年龄相关性黄斑变性(AMD)是指当视网膜的小中央部分，称为黄斑，恶化时的严重眼部病状。AMD的湿润形式的特征在于来自黄斑下方脉络膜的异常血管的生长。这称为脉络膜新生血管(CNV)。这些血管使血液和流体渗漏到视网膜中，导致视力失真，使直线看起来呈波浪形，以及盲点和中央视力丧失。这些异常的血管最终会结疤，导致永久性中央视力丧失。AMD的症状包含视觉中心的黑暗、模糊区域；并且减少或改变了颜色感知。可以通过常规眼科检查来检测AMD。黄斑变性的最常见早期迹象之一是玻璃疣-视网膜下微小的黄色沉积物-或色素结块的存在。
如本文所用，“早产儿视网膜病变”(ROP)，也称为迟发性纤维化和特里综合征，是指影响低出生体重和年轻胎龄的早产儿的病状。当正常视网膜血管的发育在完全妊娠之前被出生中断时，就会发生早产儿视网膜病变，从而导致视网膜血管的异常发育。如果病状发展，疤痕组织的生长可以导致视网膜脱离和视力障碍或视力丧失。ROP的发病机制涉及两个离散的阶段：血管舒缩阶段和血管增生阶段。正常的视网膜血管生长由于暴露于高氧环境而在第一阶段受阻，而第二阶段包含新生血管的快速增加，随后是视网膜脱离。通过细胞疗法或激光光凝术消融血管视网膜已经被认为是ROP的主要治疗方法，并且正在研究抗VEGF疗法(例如，抗VEGF抗体)。尽管有这些治疗选择，病状仍然是终生视力障碍的主要原因，其发病率在二十多年来一直保持相对恒定。
如本文所用，糖尿病性视网膜病变(DR)是与长期高血糖症相关的视网膜微脉管系统的慢性进行性疾病。DR是糖尿病中最常见的微脉管并发症，并且随着全球糖尿病患病率的持续上升，它是一个新兴的全球性问题。如本文所用，增生性DR(PDR)是DR的视觉威胁性并发症，并且其特征在于视网膜、视神经乳头或眼前节中异常新血管的发育。PDR是DR的晚期，其由缺氧和促血管新生的生长因子的表达驱动，其刺激视网膜中伸入到视网膜前间隙的新的血管异常形成。当视网膜新生血管导致玻璃体出血或牵引性视网膜脱离，从而可以导致严重视力丧失。激光光凝术多年来一直是治疗PDR的标准，最近的疗法包含用抗VEGF(例如，抗VEGF抗体)和类固醇药物进行眼内治疗以及玻璃体视网膜外科手术。尽管有这些治疗上的进步，但仍然存在未满足的治疗需求，尤其是无创、无损和更长疗程的治疗选择。
如本文所用，表述“有需要的受试者”意指表现出与血管生成有关的眼部疾病或病症中的一种或多种症状或适应症和/或已经被诊断出患有与血管生成有关的眼部疾病或病症的人或非人哺乳动物。术语“有需要的受试者”还可以包含例如在治疗之前表现出(或已经表现出)新血管性眼部疾病中的一种或多种适应症的受试者，如例如视网膜血管生成、新生血管、血管渗漏、中央凹中心500μm内的视网膜增厚、邻近视网膜增厚的中央凹中心500μm内的坚硬黄色渗出液、以及至少1个椎间盘区域的视网膜增厚，其中任何部分均位于中央凹中心的1个椎间盘直径范围内，视力模糊、漂浮物、对比度损失、双重视野以及最终视力丧失。
在本公开的上下文中，“有需要的受试者”还包含患有选自由以下组成的组的血管性眼部疾病或病症的人或非人哺乳动物：糖尿病性视网膜病变(包含增生性糖尿病性视网膜病变)、糖尿病性黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、视网膜新生血管、中央视网膜静脉阻塞、分支视网膜静脉阻塞、息肉状脉络膜血管病变、脉络膜新生血管(CNV)、变性近视(近视性CNV)、新生血管性青光眼和早产儿视网膜病变。
在本公开的上下文中，“有需要的受试者”可以包含对DME或AMD更敏感或可以示出升高水平的DME相关或AMD相关生物标志物或与ROP或PDR相关的生物标志物的人群的子集。例如，“有需要的受试者”可以包含患有糖尿病超过10年的受试者，或者具有频繁的高血糖水平或高空腹血糖水平的受试者。在某些实施例中，术语“有需要的受试者”包含在施用APLNR拮抗剂和/或VEGF拮抗剂之前或之时，已经或被诊断患有糖尿病的受试者。在某些实施例中，术语“有需要的受试者”包含在施用APLNR拮抗剂和/或VEGF拮抗剂之前或之时，大于50岁的受试者。在一些实施例中，术语“有需要的受试者”包含是吸烟者的受试者或患有高血压或高胆固醇的受试者。
本公开包含用于治疗、预防血管性眼部疾病或减轻其严重性的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括APLNR拮抗剂与VEGF拮抗剂的组合，其中以多种剂量向受试者施用药物组合物，例如，作为具体治疗给药方案的一部分。例如，治疗给药方案可以包括以约每天一次、每两天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次或较不频繁的频率向受试者施用多剂量的药物组合物。在某些实施例中，治疗给药方案可以包括以每天一次或每天2次或多次的频率向受试者施用多剂量的药物组合物。
本公开还包含用于抑制或减少或压制受试者的血管渗漏的方法。在某些实施例中，根据本公开的此方面的方法包括向受试者施用一种或多种剂量的包括APLNR拮抗剂与VEGF拮抗剂的组合的药物组合物，以减少或抑制受试者的眼部血管渗漏。在某些实施例中，与已经单独施用VEGF拮抗剂的受试者相比，血管渗漏被抑制超过3周、超过4周、超过8周或超过10周。
根据某些实施例，本公开的方法包括向受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括APLNR拮抗剂与VEGF拮抗剂的组合。在某些实施例中，可以将APLNR拮抗剂与包含激光治疗的疗法组合施用，以阻止渗入到黄斑中。如本文所用，短语“与……组合”意指仅在施用VEGF拮抗剂之前或之后，向受试者同时施用包括APLNR拮抗剂的药物组合物。如本文所用，短语“与……组合”意指仅在施用VEGF拮抗剂之前或之后，向受试者同时施用包括APLNR拮抗剂的药物组合物。在某些实施例中，将VEGF拮抗剂与APLNR拮抗剂作为共调配物施用。在相关实施例中，本公开包含包括以下的方法：向受试者施用治疗有效量的包括APLNR拮抗剂的药物组合物，以与单独施用VEGF拮抗剂相比，提供更大的治疗作用或协同作用。受试者可以接受玻璃体内施用的VEGF拮抗剂的治疗方案。在一些实施例中，将APLNR拮抗剂添加到此治疗方案中，其中可以减少VEGF拮抗剂的一次或多次玻璃体内注射或可以增加连续玻璃体内注射之间的持续时间。
本公开的方法可用于治疗或预防已经被诊断患有血管性眼部病症或有患血管性眼部病症的风险的受试者的血管性眼部病症。一般而言，本公开的方法在开始治疗方案的36周内(在“第0周”施用初始剂量)表现出功效，例如，在第6周结束时、在第12周结束时、在第18周结束时、在第24周结束时等。在用于治疗如AMD和DME等血管发生性眼部病症的方法的上下文中，“功效”意指从治疗开始，受试者表现出丧失早期治疗糖尿病性视网膜病变研究(ETDRS)视力表上的10个或更少字母。在某些实施例中，“功效”意指从治疗时间开始，对ETDRS表上的一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或更多个)字母的获得。
例如，治疗给药方案可以包括以约每天一次、每两天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次或较不频繁的频率向受试者施用多剂量的药物组合物。在某些实施例中，治疗给药方案可以包括以每天一次或每天2次或多次的频率向受试者施用多剂量的药物组合物。
APLNR拮抗剂
本公开包含用于治疗、预防或改善受试者的血管性眼部疾病或病症中的至少一种症状或适应症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的包括APLNR拮抗剂的药物组合物。APLNR拮抗剂包含抗体或其抗原结合片段、apelin受体信号传导途径的小分子抑制剂和apelin受体信号传导途径的肽抑制剂。可以在美国专利公开第US2014000518号和第US20150125459号以及国际专利公开第WO2004081198号和第WO2015140296号中找到APLNR的示例性小分子抑制剂或拮抗剂。可以在美国专利第9,593,153号和第7,736,646号以及国际专利公开WO 2004081198中找到APLNR的示例性肽抑制剂或拮抗剂。其它APLNR拮抗剂包含MM54、MM07、N-α-乙酰基-壬-D-精氨酸酰胺乙酸(ALX40-4C)、ML221、突变体apelin-13(F13A)、4-氧代-6-((嘧啶-2-基硫代)甲基)-4H-吡喃-3-基-4-硝基苯甲酸盐(Ml221)和E339-3D6。
APLNR拮抗剂包含选自于2015年5月5日公开的国际专利公开第WO2015077491号和美国专利第9,493,554号中公开的抗体的组的抗体或其抗原结合片段，所述国际专利公开具体地以其整体并入本文。在一些实施例中，抗体是H2aM9232N、H4H9232N或H1M9207N。在一个实施例中，抗APLNR抗体是H4H9232N。
APLNR拮抗剂包含选自包括重链可变区(HCVR)的组的抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2和13，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似的序列。
APLNR拮抗剂包含包括轻链可变区(LCVR)的抗体或其抗原结合片段，所述轻链可变区具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:7和18，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似的序列。
根据某些实施例，抗体或其抗原结合片段包括由SEQ ID NO:1和6(例如，H1M9207N)以及SEQ ID NO:12和17(例如，H2aM9232N或H4H9232N)的核酸序列编码的重链和轻链CDR序列。
本公开的某些非限制性示例性抗体和抗原结合片段分别包括HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3结构域，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:3-4-5-8-9-10(例如，H1M9207N)；和SEQ ID NO:14-15-16-19-20-21(例如，H2aM9232N或H4H9232N)。命名为H2aM9232N和H4H9232N的抗体共享同一人可变区(HCVR和LCVR)。H2aM9232N包括鼠IgG2a重链恒定区，而H4H9232N包括人IgG4重链恒定区。
APLNR拮抗剂包含抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括选自由SEQ ID NO:2/7和13/18组成的组的HCVR和LCVR(HCVR/LCVR)序列对。
APLNR拮抗剂包含包括重链CDR3(HCDR3)结构域和轻链CDR3(LCDR3)结构域的抗体或其抗原结合片段，所述重链CDR3(HCDR3)结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:5和16，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似的序列；所述轻链CDR3(LCDR3)结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQID NO:10和21，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似的序列。
在某些实施例中，APLNR拮抗剂包含抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括选自由SEQ ID NO:5/10和16/21组成的组的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对。
APLNR拮抗剂包含包括重链CDR1(HCDR1)结构域、重链CDR2(HCDR2)结构域、轻链CDR1(LCDR1)结构域和轻链CDR2(LCDR2)结构域的抗体或其抗原结合片段，所述重链CDR1(HCDR1)结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:3和14，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似的序列；所述重链CDR2(HCDR2)结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:4和15，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似的序列；所述轻链CDR1(LCDR1)结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:8和19，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似的序列；所述轻链CDR2(LCDR2)结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:9和20，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似的序列。
某些非限制性示例性抗APLNR抗体包含特异性结合APLNR的抗体或抗体的抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包括选自由以下组成的组的重链和轻链可变区(HCVR/LCVR)序列内含有的重链和轻链CDR结构域：SEQ ID NO:2/7和13/18。
用于识别HCVR和LCVR氨基酸序列内的CDR的方法和技术是本领域熟知的，并且可以用于识别本文公开的特定HCVR和/或LCVR氨基酸序列内的CDR。可以用于识别CDR的边界的示例性规约包含例如，Kabat定义、Chothia定义和AbM定义。一般而言，Kabat定义基于序列可变性，Chothia定义基于结构环区域的位置，并且AbM定义是Kabat方式与Chothia方式之间的折衷。参见例如，Kabat，“具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteinsof Immunological Interest)”，国立卫生研究院，贝塞斯达(Bethesda)，马里兰州，(1991)；Al-Lazikani等人，1997，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》273:927-948；以及Martin等人，1989，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)86:9268-9272。公共数据库也可用于识别抗体内的CDR序列。
本公开提供了包括重链(HCVR)的抗体或其抗原结合片段，所述重链(HCVR)具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2和13，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似的序列。
本公开还提供了包括轻链(LCVR)的抗体或抗体的抗原结合片段，所述轻链(LCVR)具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:7和18，或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列同一性的其基本上类似的序列。
本公开还提供了包括HC和LC(HC/LC)氨基酸序列对的抗体或其抗原结合片段。
根据某些实施例，抗体或其抗原结合片段包括由抗体H1M9207N或H2aM9232N(或H4H9232N)的核酸序列编码的重链和轻链CDR序列。
本公开包含具有经过修饰的糖基化模式的抗APLNR抗体。在一些应用中，例如，用于去除不期望的糖基化位点的修饰是有用的，或者在寡糖链上存在缺乏岩藻糖部分的抗体，以增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等人，2002，《生物化学杂志(JBC)》277:26733)。在其它应用中，可以进行半乳糖基化的修饰，以修饰补体依赖性细胞毒性(CDC)。
例如，本公开包含阻断或抑制表达人APLNR的细胞中apelin介导的信号传导的其APLNR拮抗剂，IC50小于约20nM、小于约10nM、小于约2nM、小于约1nM、小于约900pM、小于约800pM、小于约700pM、小于约600pM、小于约500pM、小于约400pM、小于约350pM、小于约300pM、小于约250pM、小于约200pM、小于约150pM、小于约100pM、小于约90pM、小于约80pM、小于约70pM、小于约60pM、小于约50pM、小于约40pM、小于约30pM、小于约20pM、或小于约10pM，如基于细胞的阻断或抑制生物测定中所测量，例如使用如WO2015/077491的实例5、8、9或11中限定的测定格式，或实质上类似的测定。
本公开包含在apelin的存在下，抑制APLNR介导的pERK比率的APRNR拮抗剂，IC50小于约50nM、小于约25nM、小于约20nM、小于约15nM、小于约10nM、小于约5nM、小于约1nM、小于约900pM、小于约800pM、小于约700pM、小于约600pM、小于约500pM、小于约400pM、或小于约300pM，如在APLNR诱导的pERK测定中所测量。
然而，在其它实施例中，本公开的某些APLNR拮抗剂尽管具有抑制或减弱APLNR介导的信号传导的能力，但是不阻断或仅部分地阻断APLNR与apelin的相互作用。此类抗体和其抗原结合片段在本文中可以称为“间接阻断剂”。不受理论的束缚，据信本公开的间接阻断剂通过以下起作用：在不与APLNR的N末端配体结合结构域重叠或仅部分重叠的表位处结合APLNR，但是在不直接阻断APLNR/apelin相互作用的情况下干扰APLNR介导的信号传导。
本公开包含以高亲和力和/或特异性结合可溶性APLNR分子的APLNR拮抗剂。例如，本公开包含以大于约20的结合率结合APLNR的抗体和抗体的抗原结合片段，如通过荧光激活细胞分选(FACS)测定所测量，例如，使用如WO2015/077491的实例4中限定的测定格式。在某些实施例中，本公开的抗体或抗原结合片段以大于约15、大于约20、大于约100、大于约200、大于约300、大于约400、大于约500、大于约1000、大于约1500、或大于约2000的结合率结合APLNR，如通过例如FACS或基本上类似的测定所测量。
本公开还包含抗APLNR抗体和其抗原结合片段，其以大于约10分钟的游离半衰期(t1/2)特异性结合APLNR，如通过25℃或37℃下的表面等离子体共振所测量，例如使用众所周知的BIAcoreTM测定格式，或基本上类似的测定。
本公开的抗体可以具有前述生物学特性或其任何组合中的一种或多种。通过阅读本公开，包含本文的工作实例，本公开的抗体的其它生物学特性对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。
如与衍生出抗体的对应种系序列相比，抗APLNR抗体可以在重链和轻链可变结构域的框架和/或CDR区中包括一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。通过将本文公开的氨基酸序列与可从例如，公共抗体序列数据库获得的种系序列进行比较，可以容易地确定此类突变。本公开包含抗体和其抗原结合片段，其衍生自本文公开的任何氨基酸序列，其中一个或多个框架和/或CDR区内的一个或多个氨基酸突变为衍生出抗体的种系序列的一个或多个对应的残基、或突变为另一种人种系序列的一个或多个对应的残基、或突变为一个或多个对应的种系残基的保守氨基酸取代(此类序列变化在本文中统称为“种系突变”)。从本文公开的重链和轻链可变区序列开始，本领域普通技术人员可以容易地生产包括一个或多个个别种系突变或其组合的许多抗体和抗原结合片段。在某些实施例中，VH结构域和/或VL结构域内的全部框架和/或CDR残基突变回在衍生出抗体的原始种系序列中所发现的残基。在其它实施例中，仅将某些残基突变回原始种系序列，例如，仅在FR1的前8个氨基酸内或在FR4的最后8个氨基酸内所发现的突变后的残基，或仅在CDR1、CDR2或CDR3中发现的突变后的残基。在其它实施例中，一个或多个框架和/或CDR残基中的一个或多个突变为不同种系序列(即，与最初衍生出抗体的种系序列不同的种系序列)的一个或多个对应的残基。更进一步，本公开的抗体可以含有框架和/或CDR区内的两个或更多个种系突变的任何组合，例如，其中某些个别残基突变为特定种系序列的对应残基，而与原始种系序列不同的某些其它残基可以维持或突变为不同种系序列的对应残基。一旦获得，可以容易地测试含有一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段的一种或多种所期望的特性，如改善的结合特异性、增加的结合亲和力、改善或增强的拮抗或激动的生物学特性(视情况而定)、降低的免疫原性等。以此通用方式获得的抗体和抗原结合片段涵盖在本公开内。
本公开还包含抗APLNR抗体，其包括具有一个或多个保守取代的本文公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一个的变体。例如，本公开包含具有HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗APLNR抗体，相对于本文公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一个，所述HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列具有例如，10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等的保守氨基酸取代。
术语“表位”是指与称为互补位的抗体分子的可变区中的特定抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单个抗原可以具有多于一个表位。因此，不同的抗体可以结合抗原上的不同区域，并且可以具有不同的生物效应。表位可以是构象的或线性的。通过来自线性多肽链的不同区段的空间并列的氨基酸产生构象表位。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。在某些情况下，表位可以包含抗原上的糖、磷酰基或磺酰基的部分。
当提及核酸或其片段时，术语“基本同一性”或“基本上相同”表示当通过适当的核苷酸插入或缺失与另一种核酸(或其互补链)最佳对齐时，核苷酸序列同一性为核苷酸碱基的至少约95％，并且更优选地，至少约96％、97％、98％或99％，如通过如FASTA、BLAST或Gap等任何众所周知的序列同一性算法所测量，如以下所讨论的。在某些情况下，具有与参考核酸分子基本同一性的核酸分子可以编码具有与由参考核酸分子编码的多肽相同或基本上类似的氨基酸序列的多肽。
当应用于多肽时，术语“基本相似性”或“基本上相似”意指当如通过程序GAP或BESTFIT，使用默认间隙权重最佳对齐时，两个肽序列共享至少95％的序列同一性，甚至更优选地至少98％或99％的序列同一性。优选地，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是一个氨基酸取代，其中氨基酸残基被具有具有类似的化学特性(例如，电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一个氨基酸残基取代。总体而言，保守氨基酸取代不会实质上改变蛋白质的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，序列同一性百分比或相似性程度可以向上调整，以校正取代的保守性质。用于作出此调整的方法是本领域技术人员所熟知的。参见，例如，Pearson，1994，《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)24:307-331，通过引用并入本文。具有具有类似化学性质的侧链的氨基酸基团的实例包含(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂肪族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，以及(7)含硫侧链是半胱氨酸和蛋氨酸。优选的保守氨基酸取代基是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。替代性地，保守替代是在通过引用并入本文的Gonnet等人，1992，《科学(Science)》，256:1443-1445中公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何变化。“适度保守”替代是PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
通常使用序列分析软件测量也称为序列同一性的多肽的序列相似性。蛋白质分析软件使用分配给各种取代、缺失和其它修饰，包含保守氨基酸取代的相似性的测量来匹配类似的序列。例如，GCG软件含有如Gap和Bestfit等程序，所述程序可以与默认参数一起使用，以确定紧密相关的多肽，如来自不同生物体物种的同源多肽之间或野生型蛋白质与其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见例如，6.1版GCG。还可以使用使用默认或推荐的参数的FASTA来比较多肽序列，所述FASTA为6.1版GCG中的程序。FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)提供了询问序列与搜索序列之间的最佳重叠区域的对齐和序列一致性百分比(Pearson，1994，同上文)。当比较本公开的序列与含有大量来自不同生物体的序列的数据库时，另一个优选的算法是使用默认参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。参见例如，Altschul等人，1990，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》215:403-410和Altschul等人，1997，《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》25:3389-402，各自通过引用并入本文。
本公开进一步包含结合与本文所述的任何具体示例性抗体相同的表位的抗APLNR抗体(例如，H1M9207N和H2aM9232N和H4H9232N)。同样，本公开还包含抗APLNR抗体，其与本文所述的任何具体示例性抗体竞争结合APLNR(例如H1M9207N和H2aM9232N和H4H9232N)。
通过使用本领域已知的和本文举例说明的常规方法，可以容易地确定抗体是否结合与参考抗APLNR抗体相同的表位或竞争结合所述参考抗APLNR抗体。例如，为了确定测试抗体是否结合与本公开的参考抗APLNR抗体相同的表位，允许参考抗体结合APLNR蛋白质。接下来，评估测试抗体结合到APLNR分子的能力。如果测试抗体能够在与参考抗APLNR抗体饱和结合后结合APLNR，则可以得出结论，测试抗体结合与参考抗APLNR抗体不同的表位。另一方面，如果测试抗体在与参考抗APLNR抗体饱和结合后不能够结合抗APLNR分子，然后测试抗体可以结合与由本公开的参考抗APLNR抗体限定的表位相同的表位。然后可以进行另外的常规实验(例如，肽突变和结合分析)，以确认所观察到的测试抗体的结合缺乏是否实际上是由于结合与参考抗体相同的表位或者是否是空间阻断(或其它现象)导致所观察到的结合缺乏。可以使用ELISA、RIA、BIAcoreTM、流式细胞术或本领域可获得的任何其它定量或定性抗体结合测定来进行这种实验。根据本公开的某些实施例，如果例如，一个抗体的1倍、5倍、10倍、20倍或100倍过量将另一种的结合抑制至少50％，但是优选地75％、90％或甚至99％，则两个抗体结合到同一(或重叠)表位，如在竞争性结合测定中所测量(参见例如，Junghans等人，1990，《癌症研究(Cancer Res.)50:1495-1502)。替代性地，如果抗原中基本上所有减少或消除一种抗体的结合的氨基酸突变减少或消除另一种的结合，则认为两种抗体结合到同一表位。如果仅减少或消除一种抗体的结合的氨基酸突变的子集减少或消除另一种的结合，则认为两种抗体具有“重叠表位”。
为了确定抗体是否与参考抗APLNR抗体竞争结合(或交叉竞争结合)，上述结合方法是在两个朝向上进行的：在第一朝向上，允许参考抗体在饱和条件下结合APLNR蛋白质，随后评估测试抗体与APLNR分子的结合。在第二朝向上，允许测试抗体在饱和条件下结合APLNR分子，随后评估参考抗体与APLNR分子的结合。如果在两个朝向上只有第一(饱和的)抗体能够结合到APLNR分子，然后得出结论，测试抗体和参考抗体竞争结合APLNR。如本领域普通技术人员所理解的，竞争结合参考抗体的抗体可能不一定结合与参考抗体相同的表位，但是可以通过结合重叠或相邻表位来空间阻断参考抗体的结合。
在本公开的某些实施例中，本公开的抗APLNR抗体是人抗体。如本文所用，术语“人抗体”旨在包含具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本公开的人抗体可以包含并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中，并且具体地CDR3。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包含其中衍生自如小鼠等另一种哺乳动物物种的种系的CDR序列已经移植到人框架序列上的抗体。在各种实施例中，本文讨论的抗体是具有IgG重链恒定区的人抗体。在一些情况下，抗体具有人IgG1或IgG4同种型的重链恒定区。
在一些实施例中，本公开的抗体可以是重组人抗体。如本文所用，术语“重组人抗体”旨在包含通过重组方式制备、表达、产生或分离的其所有人抗体，如使用转染到宿主细胞内的重组表达载体表达的抗体(以下进一步描述)、从重组组合人抗体库中分离的抗体(以下进一步描述)、从对于人类免疫球蛋白基因而言为转基因的动物(例如，小鼠)中分离的抗体(参见例如，Taylor等人，1992，《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》20:6287-6295)，或通过任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体，所述方式涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列上。此类重组人抗体具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施例中，此类重组人抗体经历体外诱变(或，当使用转基因人Ig序列的动物时，经历体内体细胞诱变)，并且因此重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列是如下序列：虽然衍生自人种系VH序列和VL序列并与之相关，但可能并非天然体内存在于人抗体种系库中。
人抗体可以以与铰链异质性相关的两种形式存在。在一种形式中，免疫球蛋白分子包括约150-160kDa的稳定四链构建体，其中二聚体通过链间重链二硫键保持在一起。在第二种形式中，二聚体不通过链间二硫键连接，并且形成约75-80kDa的分子，其由共价偶联的轻链和重链(半抗体)构成。即使在亲和纯化之后，这些形式也极难分离。
在各种完整IgG同种型中出现第二种形式的频率是基于但不限于与抗体的铰链区同种型相关的结构差异。人IgG4铰链的铰链区中的单个氨基酸取代可以将第二种形式的出现显著地降低(Angal等人，1993，《分子免疫学(Molecular Immunology)》，30:105)到通常使用人IgG1铰链所观察到的水平。本公开涵盖在铰链区、CH2区或CH3区中具有一个或多个突变的抗体，其可能是例如，在生产中所期望的，以提升所期望的抗体形式的产量。
本公开的抗体可以是分离的抗体。如本文所用，“分离的抗体”意指已经从其天然环境的至少一种组分中识别和分离和/或回收的抗体。例如，已经从生物体的至少一种组分，或从抗体天然存在或天然产生的组织或细胞中分离或除去的抗体是用于本公开的目的的“分离的抗体”。分离的抗体还包含重组细胞内的原位抗体。分离的抗体是已经经历至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施例，分离的抗体可以基本上不含其它细胞物质和/或化学品。
本公开包含中和和/或阻断抗APLNR抗体。如本文所用，“中和”或“阻断”抗体是指其结合APLNR的抗体：(i)干扰APLNR或APLNR片段与APLNR受体组分之间的相互作用(例如，apelin肽等)；和/或(ii)导致抑制APLNR的至少一种生物学功能。由APLNR中和或阻断抗体引起的抑制不需要是完全的，只要可使用适当的测定检测即可。
VEGF拮抗剂
如本文所用，“VEGF拮抗剂”是与VEGF结合或相互作用，抑制VEGF与其受体(VEGFR1和VEGFR2)结合和/或抑制VEGF的生物学信号传导和活性的任何试剂。VEGF拮抗剂包含干扰VEGF与天然VEGF受体之间的相互作用的分子，例如，与VEGF或VEGF受体结合并阻止或以其它方式阻碍VEGF与VEGF受体之间的相互作用的分子。特定的示例性VEGF拮抗剂包含抗VEGF抗体(例如兰尼单抗
)、抗VEGF受体抗体(例如抗VEGFR1抗体、抗VEGFR2抗体等)、VEGF的小分子抑制剂(例如舒尼替尼)，以及基于VEGF受体的嵌合分子或抑制VEGF的融合蛋白(在本文中也称为“VEGF捕获剂”)，如阿柏西普和雷莫芦单抗。VEGF捕获剂的其它实例是ALT-L9、M710、FYB203和CHS-2020。VEGF捕获剂的其它实例可以在美国专利第7,070,959号、第7,306,799号、第7,374,757号、第7,374,758号、第7,531,173号、第7,608,261号、第5,952,199号、第6,100,071号、第6,383,486号、第6,897,294号和第7,771,721号中找到，其通过引用具体地并入本文。额外的VEGF抑制剂和/或拮抗剂包含小分子抑制剂：帕唑帕尼、索拉非尼、阿西替尼、帕纳替尼、瑞格拉非尼、卡博替尼、凡德他尼、卡博替尼和联凹替尼(lenvatinib)；和VEGF抑制抗体：贝伐单抗和雷莫昔单抗或其生物类似物分子。
基于VEGF受体的嵌合分子包含包括两个或更多个VEGF受体的免疫球蛋白(Ig)样结构域的嵌合多肽，如VEGFR1(也称为Flt1)和/或VEGFR2(也称为Flk1或KDR)，并且还可以含有多聚结构域(例如，促进两个或更多个嵌合多肽的多聚[例如二聚化]的Fc结构域)。示例性的基于VEGF受体的嵌合分子是称为VEGFR1R2-FcΔC1(a)的分子(也称为阿柏西普；以商品名称
出售)。在某些实施例中，阿柏西普包括如以下所阐释的氨基酸序列：MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:23)。
本公开的药物调配物内含有的VEGF拮抗剂的量可以根据调配物所需的具体性质以及旨在使用调配物的特定情况和目的而变化。在某些实施例中，药物调配物是液体调配物，其可以含有5±0.75mg/mL到150±22.5mg/mL的VEGF拮抗剂；10±1.5mg/mL到100±15.0mg/mL的VEGF拮抗剂；20±3mg/mL到80±12mg/mL的VEGF拮抗剂；30±4.5mg/mL到70±10.5mg/mL的VEGF拮抗剂或40±6.0mg/mL的VEGF拮抗剂。例如，本公开的调配物可以包括约20mg/mL；约30mg/mL；约40mg/mL；约50mg/mL；或约60mg/mL的VEGF拮抗剂。
本公开的方法包括向有需要的受试者施用包括VEGF拮抗剂的治疗组合物。
治疗调配物和施用
本公开提供了药物调配物，其包括特异性结合人APLNR的至少一种APLNR拮抗剂，如抗APLNR抗体或其抗原结合片段。根据某些其它实施例，本公开提供了包括另外的治疗剂的药物调配物。本公开进一步提供了包括至少一种VEGF拮抗剂的药物调配物，例如，其与包括至少一种APLNR拮抗剂的药物调配物一起使用。
本公开的药物组合物与合适的载剂、赋形剂和提供改善的转移、递送、耐受性等其它试剂一起调配。在所有药物化学家已知的处方集中可以找到许多合适的调配物：《雷明顿氏药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》，(马克出版公司(MackPublishing Company)，伊斯顿，宾夕法尼亚州。这些调配物包含例如，粉末、糊剂、软膏、凝胶、蜡、油、脂质、含有囊泡的脂质(阳离子或阴离子)(如LIPOFECTINTM，生命科技(LifeTechnologies)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、DNA缀合物、无水吸收膏、水包油和油包水乳液、乳液聚乙二醇(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有聚乙二醇的半固体混合物。参见例如Powell等人，“用于肠胃外调配物的赋形剂的汇编(Compendium of excipientsfor parenteral formulations)”，PDA，1998，《药物科学与技术杂志(J Pharm SciTechnol)》52:238-311。
向受试者施用的特异性结合人APLNR的APLNR拮抗剂，如抗APLNR抗体或其抗原结合片段的剂量可以根据受试者的年龄和体型、目标疾病、病状、施用途径等而变化。优选的剂量通常根据体重或体表面积计算。当APLNR拮抗剂用于治疗病状或疾病时，通常以约0.01mg/kg到约50mg/kg体重的单剂量静脉内施用本公开的抗体可能是有利的。在其它情况下，玻璃体内施用APLNR拮抗剂可能是有利的，例如以约0.01mg/kg到约50mg/kg体重的浓度。根据病状的严重程度，可以调整治疗的频率和持续时间。用于施用如抗APLNR抗体等APLNR拮抗剂的有效剂量和时间表可以凭经验确定；例如，可以通过定期评估来监测受试者进展，并且相应地调整剂量。此外，剂量的种间缩放可以使用本领域熟知的方法进行(例如，Mordenti等人，1991，《药学研究(Pharmaceut.Res.)》8:1351)。
VEGF拮抗剂的剂量可以根据受试者的年龄和体型、目标疾病、病状、施用途径等而变化。优选的剂量通常根据体重或体表面积计算。当VEGF拮抗剂用于治疗病状或疾病时，通常以约0.01mg/kg到约50mg/kg体重的单剂量静脉内施用本公开的抗体可能是有利的。在其它情况下，玻璃体内施用VEGF拮抗剂可能是有利的，例如以约0.01mg/kg到约50mg/kg体重的浓度。根据病状的严重程度，可以调整治疗的频率和持续时间。用于施用VEGF拮抗剂的有效剂量和时间表可以凭经验确定；例如，可以通过定期评估来监测受试者进展，并且相应地调整剂量。各种递送系统是已知的，并且可以用于施用本公开的药物组合物，例如，包封在脂质体、微颗粒、微胶囊、能够表达突变体病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用内(参见例如，Wu等人，1987，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》262:4429-4432)。引入的方法包含但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、玻璃体内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。可以通过任何方便的途径施用组合物，例如通过输注或快速浓注、通过上皮或皮肤粘膜内层(例如，口腔粘膜、直肠和肠道粘膜等)吸收，并且可以与其它生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。
本公开包含方法，所述方法包括向受试者施用APLNR拮抗剂，其中APLNR拮抗剂包含在药物组合物内。在某些实施例中，所述药物组合物进一步包括VEGF拮抗剂。在替代性实施例中，APLNR拮抗剂和VEGF拮抗剂可以各自呈其自己单独的药物剂量调配物。本公开的药物组合物可以与合适的载剂、赋形剂和提供合适的转移、递送、耐受性等其它试剂一起调配。在所有药物化学家已知的处方集中可以找到许多合适的调配物：《雷明顿氏药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》，(马克出版公司(Mack PublishingCompany)，伊斯顿，宾夕法尼亚州。这些调配物包含例如，粉末、糊剂、软膏、凝胶、蜡、油、脂质、含有囊泡的脂质(阳离子或阴离子)(如LIPOFECTINTM)、DNA缀合物、无水吸收膏、水包油和油包水乳液、乳液聚乙二醇(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有聚乙二醇的半固体混合物。参见例如Powell等人，“用于肠胃外调配物的赋形剂的汇编(Compendium ofexcipients for parenteral formulations)”，PDA(1998)《药物科学与技术杂志(J PharmSci Technol)》52:238-311。
如本文所用，表述“药物调配物”是指至少一种活性成分(例如，小分子、大分子、化合物等，其能够在人或非人动物中发挥生物学作用)和至少一种非活性成分的组合，当与活性成分或一种或多种另外的非活性成分组合时，其适合于对人或非人动物进行治疗性施用。除非另外特别指出，否则如本文所用，术语“调配物”是指“药物调配物”。
本公开的药物调配物内含有的APLNR拮抗剂，如抗APLNR抗体或其抗原结合片段的量可以根据调配物所需的具体性质以及旨在使用调配物的特定情况和目的而变化。在某些实施例中，药物调配物是液体调配物，其可以含有5±0.75mg/mL到150±22.5mg/mL的抗体；7.5±1.125mg/mL到140±21mg/mL的抗体；10±1.5mg/mL到130±19.5mg/mL的抗体；10±1.5mg/mL的抗体；20±3mg/mL的抗体；60±9mg/mL的抗体；或120±18mg/mL的抗体。例如，本公开的调配物可以包括约10mg/mL；约20mg/mL；约40mg/mL；约60mg/mL；约80mg/mL；约100mg/mL；约120mg/mL；或约140mg/mL的特异性结合人APLNR的抗体或其抗原结合片段。
在某些实施例中，药物调配物是液体调配物，其可以含有5±0.75mg/mL到100±15mg/mL的VEGF拮抗剂。例如，本公开的调配物可以包括约5mg/mL；约10mg/mL；约15mg/mL；约20mg/mL；约25mg/mL；约30mg/mL；约35mg/mL；约40mg/mL；约50mg/mL；约60mg/mL；约70mg/mL；约80mg/mL；约90mg/mL；或约100mg/mL的VEGF拮抗剂，如阿柏西普。
在某些实施例中，药物调配物是稳定的液体共调配物，其包括约5mg/mL到约150mg/mL的APLNR拮抗剂和约5mg/mL到100mg/mL的VEGF拮抗剂。
本公开的药物调配物包括一种或多种赋形剂。如本文所用，术语“赋形剂”意指添加到调配物中以提供期望的稠度、粘度或稳定作用的任何非治疗剂。
可以在本公开的上下文中使用的包括VEGF拮抗剂的示例性调配物公开于例如美国专利第7,531,173号和第7,608,261号中。可以在本公开的上下文中使用的包括APLNR拮抗剂的示例性药物组合物公开于例如美国专利申请公开第20130186797号中。可以在本公开的上下文中使用的包括APLNR拮抗剂的示例性药物组合物公开于例如国际专利公开第WO2016085750号和美国专利申请公开第US20110027286号中。
组合疗法
根据某些实施例，本公开的方法包括向受试者施用APLNR拮抗剂与VEGF拮抗剂的组合。如本文所用，表述“与……组合”意指在包括APLNR拮抗剂的药物组合物之前、之后或同时施用VEGF拮抗剂。术语“与……组合”还包含APLNR拮抗剂与VEGF拮抗剂的顺序或同时施用。例如，当在“之前”施用时，包括APLNR拮抗剂的药物组合物可以在施用包括VEGF拮抗剂的药物组合物之前超过72小时、约72小时、约60小时、约48小时、约36小时、约24小时、约12小时、约10小时、约8小时、约6小时、约4小时、约2小时、约1小时、约30分钟、约15分钟或约10分钟施用。当在“之后”施用时，包括APLNR拮抗剂的药物组合物可以在施用包括VEGF拮抗剂的药物组合物之后约10分钟、约15分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时、约72小时或超过72小时施用。与包括APLNR拮抗剂的药物组合物“同时”施用意指在施用包括APLNR拮抗剂的药物组合物不到5分钟内(在之前、之后或同时)以单独的剂型向受试者施用VEGF拮抗剂，或向受试者施用作为包括APLNR拮抗剂和VEGF拮抗剂的单一组合剂量调配物。
组合疗法可以包含APLNR拮抗剂和VEGF拮抗剂(例如，阿柏西普、VEGF捕获剂，参见例如美国专利第7,087,411号(在本文中也称为“VEGF抑制融合蛋白”)、抗VEGF抗体(例如，兰尼单抗等)、VEGF受体的小分子激酶抑制剂(例如舒尼替尼、索拉非尼或帕唑帕尼)等。
本公开的方法包括将APLNR拮抗剂与VEGF拮抗剂组合施用，用于相加或协同活性，用于治疗或改善选自由以下组成的组的眼部疾病或病症的至少一种症状或适应症：糖尿病性视网膜病变(包含增生性糖尿病性视网膜病变)、糖尿病性黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、视网膜新生血管、中央视网膜静脉阻塞、分支视网膜静脉阻塞、息肉状脉络膜血管病变、脉络膜新生血管(CNV)、变性近视(近视性CNV)、新生血管性青光眼和早产儿视网膜病变。
容器和施用方法
各种递送系统是已知的，并且可以用于施用本公开的药物组合物，例如，包封在脂质体、微颗粒、微胶囊、能够表达突变体病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用内(参见例如，Wu等人，1987，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》262:4429-4432)。施用的方法包含但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、玻璃体内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。可以通过任何方便的途径施用组合物，例如通过输注或快速浓注、通过上皮或皮肤粘膜内层(例如，口腔粘膜、直肠和肠道粘膜等)吸收，并且可以与其它生物活性剂一起施用。
为了治疗眼部病症，本公开的药物调配物可以例如通过滴眼剂、结膜下注射、结膜下植入、玻璃体内注射、玻璃体内植入、sub-Tenon's注射或sub-Tenon's植入来施用。
可以用标准针头和注射器皮下或静脉内递送本公开的药物组合物。另外，关于皮下递送，笔递送装置易于应用于递送本公开的药物组合物。此类笔递送装置可以是可重复使用的或一次性的。可重复使用的笔递送装置通常利用含有药物组合物的可更换药筒。一旦已经施用了药筒内的全部药物组合物，并且药筒是空的，就可以轻易地丢弃空药筒，并且用含有药物组合物的新药筒更换。然后可以重复使用笔递送装置。在一次性笔递送装置中，没有可更换的药筒。相反，一次性笔递送装置预装有固持在装置内的贮存器中的药物组合物。一旦贮存器中的药物组合物清空，就丢弃整个装置。
在某些情况下，药物组合物可以在受控释放系统中递送。在一个实施例中，可以使用泵。在另一个实施例中，可以使用聚合物材料；参见，《受控释放的医学应用(MedicalApplications of Controlled Release)》，Langer和Wise(编辑)，1974，CRC出版社，波卡拉顿，佛罗里达州。在又另一个实施例中，受控释放系统可以放置在组合物的靶标附近，因此仅需要全身剂量的一小部分(参见例如，Goodson，1984，《受控释放的医学应用(MedicalApplications of Controlled Release)》，同上，第2卷，第115-138页)。其它受控释放系统在Langer，1990，《科学(Science)》249:1527-1533的评论中讨论。
可注射制剂可以包含用于静脉内、皮下、皮内和肌肉内注射、滴注等剂型。这些可注射制剂可以通过已知的方法制备。例如，可注射制剂可以通过例如，将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在无菌水性介质或常规用于注射的油性介质中来制备。作为用于注射的水性介质，例如，有生理盐水、含有葡萄糖的等渗溶液以及其它助剂等，其可以与适当的增溶剂，如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如，聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等组合使用。作为油性介质，可以采用例如，芝麻油、大豆油等，其可以与如苯甲酸苄酯、苯甲醇等增溶剂组合使用。如此制备的注射剂优选地填充在适当的安瓿中。
有利地是，将上述用于口服或肠胃外使用的药物组合物制备成适于配合一定剂量的活性成分的单位剂量的剂型。此类单位剂量的剂型包含例如片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等。
本公开的药物调配物可以容纳在适合于储存或施用药物和其它治疗组合物的任何容器内。例如，药物调配物可以容纳在具有限定体积的密封和灭菌的塑料或玻璃容器内，如小瓶、安瓿、注射器、药筒、瓶或IV袋。可以使用不同类型的小瓶来容纳本公开的调配物，包含例如透明和不透明(例如琥珀色)的玻璃或塑料小瓶。同样，可以使用任何类型的注射器来容纳或施用本公开的药物调配物。
本公开的药物调配物可以容纳在“正常钨”注射器或“低钨”注射器内。如本领域普通技术人员将理解的，制造玻璃注射器的过程通常涉及使用热钨棒，所述热钨棒用于刺穿玻璃，从而形成孔，从中可以抽出液体，并且将其从注射器中排出。此过程导致微量的钨沉积在注射器的内表面上。随后的洗涤和其它处理步骤可以用于减少注射器中的钨含量。如本文所用，术语“正常钨”意指注射器含有大于或等于十亿分之500(ppb)的钨。术语“低钨”意指注射器含有小于500ppb的钨。例如，根据本公开，低钨注射器可以含有小于约490ppb、480ppb、470ppb、460ppb、450ppb、440ppb、430ppb、420ppb、410ppb、390ppb、350ppb、300ppb、250ppb、200ppb、150ppb、100，90ppb、80ppb、70ppb、60ppb、50ppb、40ppb、30ppb、20ppb、10ppb或更少的钨。
可以对注射器中使用的橡胶柱塞和用于封闭小瓶开口的橡胶塞进行涂覆，以防止污染注射器或小瓶的药物成分或保持其稳定性。因此，根据某些实施例，本公开的药物调配物可以容纳在包括涂覆的柱塞的注射器中，或在用涂覆的橡胶塞密封的小瓶中。例如，柱塞或塞子可以涂覆有碳氟化合物膜。适用于与容纳本公开的药物调配物的小瓶和注射器一起使用的涂覆的塞子或柱塞的实例在例如美国专利第4,997,423号；第5,908,686号；第6,286,699号；第6,645,635号；和第7,226,554号中提及，所述专利的内容通过引用以其整体并入本文。可以在本公开的上下文中使用的特定示例性涂覆的橡胶塞子和柱塞可以商品名称
商购获得，可从西部制药服务有限公司(West PharmaceuticalServices,Inc.)(Lionville，宾夕法尼亚州)获得。
是氟碳涂覆的实例，用于最小化或防止药物产品粘附到橡胶表面。
根据本公开的某些实施例，药物调配物可以被容纳在低钨注射器内，所述低钨注射器包括碳氟化合物涂覆的柱塞。
可以通过肠胃外途径，如注射(例如皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内等)或经皮、粘膜、鼻、肺或口服施用，向受试者施用药物调配物。多种可重复使用的笔或自动注射器递送装置可以用于皮下递送本公开的药物调配物。实例包含但不限于AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.，伍德斯托克，英国)、DISETRONICTM笔(Disetronic Medical Systems，波道夫，瑞士)、HUMALOG MIX75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(礼来公司(Eli Lilly and Co.)，印第安纳波利斯，印第安纳州)、NOVOPENTMI、II和III(诺和诺德(Novo Nordisk)，哥本哈根，丹麦)、NOVOPEN JUNIORTM(诺和诺德，哥本哈根，丹麦)、BDTM笔(贝迪医疗(BectonDickinson)，富兰克林湖，新泽西州)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM以及OPTICLIKTM(赛诺菲(sanofi-aventis)，法兰克福市，德国)。应用于皮下递送本公开的药物组合物的一次性笔或自动注射器递送装置的实例包含但不限于SOLOSTARTM笔(赛诺菲)、FLEXPENTM(诺和诺德)以及KWIKPENTM(礼来)、SURECLICKTM自动注射器(安进(Amgen)，千橡市，加利福尼亚州)、PENLETTM(Haselmeier，斯图加特，德国)、EPIPEN(Dey，L.P.)以及HUMIRATM笔(雅培实验室(Abbott Labs)，雅培科技园，伊利诺伊州)。
本文还设想了使用微量输注器来递送本公开的药物调配物。如本文所用，术语“微量输注器”意指皮下递送装置，其被设计成在延长的时间段(例如，约10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟或更多分钟)内缓慢施用大体积(例如，高达约2.5mL或更多)的治疗调配物。参见例如美国专利第6,629,949号；美国专利第6,659,982号；以及Meehan等人，《控释期刊(J.Controlled Release)》46:107-116(1996)。微量输注器对于递送高浓度(例如约100mg/mL、125mg/mL、150mg/mL、175mg/mL、200mg/mL或更高mg/mL)或粘性溶液内含有的大剂量治疗性蛋白质特别有用。
在一个实施例中，药物调配物通过IV滴注施用，使得调配物在含有生理上可接受的溶液的IV袋中稀释。在一个实施例中，药物组合物是静脉输液袋中的复合无菌制剂，使得将单剂量的药物产品稀释到100mL、250mL(或其它适合于静脉内滴注递送的相似量)的生理缓冲液(例如，0.9％盐水)。在一些实施例中，输液袋由聚氯乙烯制成(例如，VIAFLEX，巴克斯特(Baxter)，鹿野，伊利诺伊州)。在一些实施例中，输液袋由聚烯烃制成(EXCEL IVBags，Braun Medical Inc.，伯利恒，宾夕法尼亚州)。
施用方案
本公开包含方法，所述方法包括以约每周四次、每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每八周一次、每十二周一次、或者只要达到治疗反应的较低频率的给药频率向受试者施用包括APLNR拮抗剂，如抗APLNR抗体或其抗原结合片段的药物组合物。在某些实施例中，方法涉及以约每周四次、每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每八周一次、每九周一次、每十二周一次、或者只要达到治疗反应的较低频率的给药频率施用包括APLNR拮抗剂，如抗APLNR抗体或其抗原结合片段，和VEGF拮抗剂的药物组合物。
根据本公开的某些实施例，多剂量的APLNR拮抗剂，如抗APLNR抗体或其抗原结合片段，和VEGF拮抗剂可以在限定的时间过程中施用于受试者。根据本公开的此方面的方法包括向受试者依次施用多剂量的APLNR拮抗剂，如抗APLNR抗体或其抗原结合片段，和VEGF拮抗剂。如本文所用，“依次施用”意指在不同的时间点，例如，在由预定间隔(例如，数小时、数天、数周或数月)隔开的不同日期，向受试者施用每个剂量的APLNR拮抗剂，如抗APLNR抗体或其抗原结合片段，和VEGF拮抗剂。本公开包含方法，其包括向受试者依次施用单一初始剂量的APLNR拮抗剂，如抗APLNR抗体或其抗原结合片段，和VEGF拮抗剂，随后是一个或多个第二剂量的APLNR拮抗剂，如抗APLNR抗体或其抗原结合片段，和VEGF拮抗剂，并且任选地随后是一个或多个第三剂量的APLNR拮抗剂，如抗APLNR抗体或其抗原结合片段，和VEGF拮抗剂。
根据本公开的某些实施例，多剂量的包括APLNR拮抗剂，如抗APLNR抗体或其抗原结合片段，和VEGF拮抗剂的共调配物可以在限定的时间过程中施用于受试者。根据本公开的此方面的方法包括向受试者依次施用多剂量的包括APLNR拮抗剂，如抗APLNR抗体或其抗原结合片段，和VEGF拮抗剂的共调配物。如本文所用，“依次施用”意指在不同的时间点，例如，在由预定间隔(例如，数小时、数天、数周或数月)隔开的不同日期，向受试者施用每个剂量的APLNR拮抗剂与VEGF拮抗剂的组合。本公开包含方法，所述方法包括向受试者依次施用单一初始剂量的包括APLNR拮抗剂和VEGF拮抗剂的共调配物，随后是一个或多个第二剂量的共同调配的APLNR拮抗剂和VEGF拮抗剂，并且任选地随后是一个或多个第三剂量的共同调配的APLNR拮抗剂和VEGF拮抗剂。
术语“初始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”是指施用的时间顺序。因此，“初始剂量”是在治疗方案开始时施用的剂量(也称为“基线剂量”)；“第二剂量”是初始剂量之后施用的剂量；并且“第三剂量”是第二剂量之后施用的剂量。初始剂量、第二剂量和第三剂量可以全部含有相同量的APLNR拮抗剂(或包括APLNR拮抗剂和VEGF拮抗剂的共调配物)，但是在施用频率方面通常可以彼此不同。然而，在某些实施例中，在治疗过程期间，初始剂量、第二剂量和/或第三剂量中含有的量彼此不同(例如，适当地调高或降低)。在某些实施例中，在治疗方案开始时施用一个或更多个(例如，1个、2个、3个、4个或5个)剂量作为“负荷剂量”，随后在较不频繁的基础上施用后续剂量(例如，“维持剂量”)。例如，可以以约6mg的负荷剂量向患有眼部疾病或病症的受试者施用APLNR拮抗剂(或包括APLNR拮抗剂和VEGF拮抗剂的共调配物)，随后施用一个或多个维持剂量。
在本公开的一个示例性实施例中，每个第二剂量和/或第三剂量在前一剂量之后1周到14周(例如，1周、1 1/2周、2周、2 1/2周、3周、3 1/2周、4周、4 1/2周、5周、5 1/2周、6周、6 1/2周、7周、7 1/2周、8周、8 1/2周、9周、9 1/2周、10周、10 1/2周、11周、11 1/2周、12周、12 1/2周、13周、13 1/2周、14周、14 1/2周或更多周)施用。如本文所用，短语“前一剂量”意指在没有干预剂量的顺序中施用下一剂量之前，在多次施用的顺序中，向受试者施用的APLNR拮抗剂(或包括APLNR拮抗剂和VEGF拮抗剂的共调配物)的剂量。
根据本公开的此方面的方法可以包括向受试者施用任何数量的第二和/或第三剂量的抗APLNR拮抗剂(或包括APLNR拮抗剂和VEGF拮抗剂的共调配物)。例如，在某些实施例中，仅向患者施用单个第二剂量。在其它实施例中，向患者施用两个或更多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个)第二剂量。同样地，在某些实施例中，仅向患者施用单个第三剂量。在其它实施例中，向患者施用两个或更多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个)第三剂量。
在涉及多个第二剂量的实施例中，每个第二剂量可以以与其它第二剂量相同的频率施用。例如，可以在前一剂量之后1周到2周，向患者施用每个第二剂量。类似地，在涉及多个第三剂量的实施例中，每个第三剂量可以以与其它第三剂量相同的频率施用。例如，可以在前一剂量之后2周到4周，向患者施用每个第三剂量。替代性地，向患者施用第二剂量和/或第三剂量的频率可以在治疗方案的过程中变化。施用频率也可以在医师的治疗过程期间根据临床检查后个别受试者的需要进行调整。
本公开包含方法，所述方法包括向受试者依次施用APLNR拮抗剂和VEGF拮抗剂，用于治疗DME、AMD、ROP或PDR。在一些实施例中，本方法包括施用一个或多个剂量的APLNR拮抗剂，随后施用一个或多个剂量的VEGF拮抗剂。在某些实施例中，本方法包括施用单剂量的VEGF拮抗剂，随后施用一个或多个剂量的APLNR拮抗剂。
实例
提出以下实例，以向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本公开的方法和组合物的完整公开和描述，并且不旨在限制发明人认为是其公开的范围。已经努力确保关于所使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应该考虑一些实验误差和偏差。除非另外指明，否则份数是重量份，分子量是平均分子量，温度是摄氏度，并且压力是或接近大气压。
实例1
为了评估本公开的选择抗APLNR抗体的体内特性，测量了它们在眼部脉管系统中阻断APLNR介导的血管生成的能力。
视网膜血管发育(RVD)模型用于评估拮抗抗APLNR抗体对混合背景品系(75％C57BL6和25％Sv129)的小鼠幼崽正常发育的视网膜中血管向外生长的影响，并且用于表达人APLNR的纯合子代替小鼠APLNR(人源化APLNR小鼠)。
在出生后(P)第2天，给人源化(Hu)ApelinR小鼠全身(IP)注射25mg/kg和50mg/kg抗Apelin受体抗体(αAR；H2aM9232N)。使试剂单盲，并且标记为溶液A和溶液B，以防止实验人员偏见。在出生后第5天，收集组织样品，并且然后在含有4％多聚甲醛的PBS中固定。用PBS洗涤经过固定的组织样品(视网膜内皮细胞)，并且随后用以1:200稀释在含有1％BSA/0.25％Triton-X 100的1x PBS中的GS凝集素I(Vector Laboratories，#FL-1101)染色，在25℃下过夜，以使视网膜脉管系统可视化。第二天，将染色的样品用PBS冲洗几次，将其平坦地安装在载玻片上，并且随后使用Prolong Gold(Invitrogen，#P36930)来安装盖玻片。使用落射荧光显微镜(Nikon Eclipse 80)以20倍放大率拍摄图像。使用扩展的AdobePhotoshop CS6，从由此测定获得的图像中测量视网膜中的血管化面积。只有在视网膜血管面积测量和统计分析完成之后，样品身份才被揭露。
图1A和1B是在P2到P5时经过全身治疗的小鼠视网膜的代表性显微照片和计算出的血管面积图(20x的图像用于定量以及40x的图像；使用学生T测试进行统计分析)。
与未经治疗的视网膜相比，αApelinR视网膜的残余血管面积明显较小(25mg/kg时为23％，p<0.05)。通过全身注射的ApelinR选择性抑制延缓P5幼崽正在发育的视网膜中正常的血管向外生长。在25mg/kg剂量时，阻断ApelinR会轻微抑制血管向外生长。
实例2
与实例1类似，以最高剂量在RVD模型中进行随后的实验，并且通过单盲分级机进行分析。简而言之，给幼崽IP注射50mg/kg Fc(对照)或αAR。图2A和2B是在P2到P5时经过全身治疗的小鼠视网膜的代表性显微照片和计算出的血管面积图。与未经治疗的视网膜相比，αApelinR视网膜的残余血管面积明显较小(50mg/kg时为35％，p<0.005)。用GS凝集素I对视网膜内皮细胞进行染色。以20x(用于定量)和40x拍摄图像。使用学生T测试进行统计分析。通过全身注射的ApelinR选择性抑制延缓P5幼崽正在发育的视网膜中正常的血管向外生长。通过将剂量增加到50mg/kg剂量，靶向ApelinR进一步延缓视网膜血管向外生长。
实例3
在RVD模型的后续实验中(与实例1类似进行)，给P2 Hu幼崽IP注射50mg/kg Fc、αAR或阿柏西普或组合(αAR和阿柏西普)，并且在P5时收集。图3A和3B是在P2到P5时经过全身治疗的小鼠视网膜的代表性显微照片和计算出的血管面积图。在这项单盲研究中，与经过Fc处理的对照相比，50mg/kg的αApelinR使血管生长减少了29.8％(p<0.0001)。用GS凝集素I对视网膜内皮细胞进行染色。以20x(用于定量)和40x拍摄图像。使用学生T测试进行统计分析。通过全身注射的ApelinR选择性抑制延缓P5幼崽正在发育的视网膜中正常的血管向外生长。
实例4
在RVD模型的另一个实验中(与实例1类似进行)，给P4 Hu幼崽玻璃体内(IVT)注射5μg Fc、αAR或阿柏西普或组合(αAR和阿柏西普)，并且在P6时收集。图4A和4B是在P2到P5时经过全身治疗的小鼠视网膜的代表性显微照片和计算出的血管面积图。与单一试剂，单独αApelinR(50mg/kg时31％，p<0.001)或阿柏西普(50mg/kg时43％，p<0.005)相比，组合(aApelinR+阿柏西普)的残余血管面积显著较小(50mg/kg时62％，p<0.0001)。用GS凝集素I对视网膜内皮细胞进行染色。注意对剂量和相关血管化面积的影响。以20x(用于定量)和40x拍摄图像。使用单因素方差分析和事后Tukey测试进行统计分析。在全身和玻璃体内施用两者(参见以下实例5)中，αApelinR和阿柏西普组合疗法导致正常发育的视网膜脉管系统退化。与单独阻断ApelinR或单独阻断VEGFA相比，通过全身注射阻断ApelinR和VEGFA两者更有效地阻止血管向外生长。
通过在P2时注射αAR，在25mg/kg时血管向外生长减少了23％(n＝6只眼/组，p<0.05)，并且在P5时，在50mg/kg时减少了35％(n＝6只眼/组，p<0.005)。在我们的单盲研究中，与Fc对照相比，血管向外生长减少了29％(n＝每组5只眼，p<0.0001)，从而证实了我们的观察结果。
IP和IVT注射后ApelinR和VEGFA的组合抑制显著地限制了50mg/kg(每组n＝4只眼，p<0.0001)时62％的血管向外生长，以及5μg(n＝4只眼/组，p<0.0001)时68％的血管向外生长。单独的阿柏西普在50mg/kg(n＝4只眼/组，p<0.001)时产生43％的血管向外生长减少，以及5μg(n＝3只眼/组，p<0.005)时产生65％的血管向外生长减少。并且，单独的αAR在50mg/kg(n＝4只眼/组，p<0.001)时产生31％的血管向外生长减少，以及5μg(n＝4只眼/组，p<0.005)时产生43％的血管向外生长减少。
实例5
在另一项RVD实验中，用αApelinR(H2aM9232N)(5μg)、阿柏西普(5μg)或αApelinR和阿柏西普的组合(混合物)对小鼠进行IVT治疗。图5A和5B是在P4到P6时经过玻璃体内注射治疗的小鼠视网膜的代表性显微照片和计算出的血管面积图。与单一试剂，单独αApelinR(5μg时43％，p<0.0001)或阿柏西普(5μg时65％，p<0.0001)相比，组合(aApelinR+阿柏西普)的残余血管面积显著较小(5μg时68％，p<0.0001)。注意对剂量和相关血管化面积的影响。以20x(用于定量)和40x拍摄图像。使用单因素方差分析和事后Tukey测试进行统计分析。在全身和玻璃体内施用两者中，αApelinR和阿柏西普组合疗法导致正常发育的视网膜脉管系统退化。与单独阻断ApelinR和VEGFA相比，通过玻璃体内注射阻断ApelinR和VEGFA两者甚至更有效地阻止血管向外生长。
实例6
氧诱导的缺血性视网膜病变(OIR)的鼠模型是病理性新生血管的良好表征的模型，其与必需的促血管生成因子VEGF的升高表达有关(Smith等人，1994《眼科研究与视觉科学(Invest Ophthalmol Vis Sci)》35:101-111；Neely等人，1998《美国病理学期刊(AmJ.Pathol)》153:665-670；Saint-Geniez等人，2004《国际发育生物学杂志(Int J DevBiol)》48:1045-1058)，并且因此与与多种疾病状况相关的病理性血管生成有关(Ferrarra等人，2005《自然(Nature)》438:967-974)。
进行了一项研究，以确定抗APLNR抗体对氧诱导的缺血性视网膜病变(OIR)的视网膜血管生长、血管异常形成和视网膜灌注的影响。
为了确定apelin/APLNR信号传导在病理性血管生成中以及在正常发育期间是否起作用，使用了OIR模型。在OIR模型中，小鼠幼崽在P6处暴露于高氧状态导致中央视网膜中的毛细血管迅速消失。在P11处返回室内空气后，无血管区变得严重缺氧，进而引起广泛的异常新生血管，其特征在于血管异位生长进入到玻璃体中(视网膜血管“簇”)，并且形成异常的动静脉分流；视网膜的中央部分长时间保持大部分无血管。
C57/Bl6小鼠(Taconic)用于研究VEGF捕获剂或中和的APLNR抗体对OIR中的视网膜新生血管的影响。OIR是根据Smith等人，1994(同上)开发的方法生产的。简而言之，将人源化的小鼠幼崽置于P6处的高氧环境(75％O2)中，并且在P11处返回室内空气中。暴露于高氧环境引起视网膜中央的快速血管闭塞。当小鼠回到室内空气(P11)时，视网膜中央血管的丢失导致严重的缺氧/局部缺血，这进而刺激病理性血管变化。在P12时，给幼崽全身注射50mg/kg Fc(对照)、αApelinR或阿柏西普，并且在P16时收集。用GS凝集素I对视网膜内皮细胞进行染色。
图6A和6B是在P12到P16时经过全身治疗的小鼠视网膜的代表性显微照片和计算出的血管面积图。与Fc(对照)视网膜相比，αApelinR(29％，p<0.05)和阿柏西普(27.5％，p<0.01)视网膜中的残余无血管面积明显较小。注意，与Fc相比，经过αApelinR(67％，p<0.0001)和阿柏西普(94％，p<0.0005)处理的样品中的新生血管簇明显减少。用GS凝集素I对视网膜内皮细胞进行染色。以20x(无血管面积定量)和40x(异常新生血管面积定量)拍摄图像。使用单因素方差分析和事后Tukey测试进行统计分析。在全身和玻璃体内施用两者中，ApelinR的选择性抑制都会促进OIR小鼠的视网膜血管再生，并且减少新生血管。通过全身注射的ApelinR和VEGFA抑制促进视网膜血管再生，并且减少异常的新生血管。
与上述研究类似地治疗OIR小鼠，不同的是，在P12时向OIR小鼠IVT注射5μg Fc、αAR或阿柏西普，并且在P16时收集。图7A和7B是在P12到P16时经过玻璃体内治疗的OIR小鼠视网膜的代表性显微照片和计算出的血管面积图。与Fc对照相比，αApelinR(27.5％，p<0.05)中的无血管面积显著减小，并且阿柏西普(32％，p<0.0001)条件中的无血管面积显著增大。注意，αApelinR中的新生血管簇明显减少(60％，p<0.0001)，并且阿柏西普样品中的簇完全消失。用GS凝集素I对视网膜内皮细胞进行染色。以20x(无血管面积定量)和40x(异常新生血管面积定量)拍摄图像。使用单因素方差分析和事后Tukey测试进行统计分析。在全身和玻璃体内施用两者中，ApelinR的选择性抑制都会促进OIR小鼠的视网膜血管再生，并且减少新生血管。通过玻璃体内注射的ApelinR抑制改善血管再生，并且减少异常的新生血管，而VEGFA抑制阻止血管再生，并且完全阻止任何新生血管。
在OIR模型中，αAR和阿柏西普能够促进血管再生。当在OIR P12时对幼崽进行IP注射时，αAR和阿柏西普在P16时分别使无血管面积显著减少了29％和27％(n＝6只眼/组，p<0.05)，以及使新生血管减少了69％和94％(n＝6只眼/组，p<0.0001)。IVT施用时，阿柏西普使血管再生减少了30％(n＝4只眼/组，p<0.0001)，并且消除了所有新生血管，而αAR能够使血管再生提升30％(n＝4只眼/组，p<0.05)，并且使新生血管减少了60％(n＝4只眼/组，p<0.0001)。
APLNR拮抗剂和VEGF捕获剂的组合，例如阿柏西普还使OIR模型中的病理性血管生成退化，并且促进正常的血管再生，如实例7中所述。因此，如在各种眼部疾病，包含早产儿视网膜病变中所见，这种组合有望治疗病理性血管生成。
实例7
在进一步的体内实验中，如上文实例6中所述的OIR模型用于评估血运重建的组织和密度。简而言之，将人源化的小鼠幼崽置于P6处的高氧环境(75％O2)中，并且在P11处返回室内空气中。暴露于高氧环境引起视网膜中央的快速血管闭塞。当小鼠回到室内空气(P11)时，视网膜中央血管的丢失导致严重的缺氧/局部缺血，这进而刺激病理性血管变化。在P12时，向幼崽全身注射50mg/kg Fc(对照)、αAPLNR(H4H9232N)或阿柏西普(VEGF捕获剂)或25mg/kg的αAPLNR和阿柏西普的组合，并且在P16时收集。用GS凝集素I对视网膜内皮细胞进行染色。
图8A和8B是在P12到P16时经过全身治疗的OIR小鼠视网膜的代表性显微照片(20x)和计算出的血管面积图。组合治疗的再生速率与单独的每种试剂类似，因此，与经过hFc治疗的对照视网膜相比，在所有治疗条件下，血管再生均得到改善，组合治疗示出平均无血管面积略微减小。图8B示出了治疗组之间的无血管面积有显著变化(p<0.0005)。与Fc对照相比，使用抗APLNR抗体(**，p<0.05)、使用VEGF捕获剂(***，p<0.005)和使用组合(***，p<0.05)显著减小了血管面积。使用单因素方差分析和事后Tukey测试进行统计分析。
图9A和9B是在P12到P16时经过全身治疗的OIR小鼠视网膜的代表性显微照片(40x)和计算出的异常血管面积图。与VEGF捕获剂相比，组合治疗示出更少的修剪血管，并且与抗APLNR和Fc对照相比，更少的异常新生血管(图9A)。图9B示出了治疗组之间的异常血管面积有显著变化(p<0.0005)。与Fc对照相比，使用抗APLNR(***，p<0.0005)、使用VEGF捕获剂(***，p<0.005)和使用组合(***，p<0.0005)显著减小了异常血管面积。与抗APLNR治疗组相比，组合治疗组的异常血管面积也显著减小(*，p<0.05)。使用单因素方差分析和事后Tukey测试进行统计分析。
图10表示用于计算血管面积和血管长度的图像处理和测量技术。“原始图像”是图9A中所示的40x显微照片。下面结合图11A、11B、12A和12B，更具体地讨论“阈值图像”和“二进制图像”。
图11A和11B是代表性的处理后图像，示出了在P12到P16时经过全身处理的OIR小鼠视网膜的显微照片(40x)和计算出的血管面积图的血管的组织和均匀性。如图11A所示，与单独的抗APLNR相比，抗APLNR抗体和VEGF捕获剂的组合产生的视网膜血管更有组织和均匀，并且与单独的VEGF捕获剂相比，则较稀疏(较少的修剪血管)。图11B示出了治疗组之间的血管面积有显著变化(p<0.0005)。与Fc对照相比，使用抗APLNR的血管面积显著增大(***，p<0.0005)，而使用VEGF捕获剂(***，p<0.005)和组合治疗的血管面积减小(*，p<0.05)。与抗APLNR相比，使用VEGF捕获剂(####，p<0.0005)和使用组合(####，p<0.0005)的血管面积显著减小。相反，与VEGF捕获剂相比，使用组合治疗显著增加了血管面积(&&&，p<0.005)。使用单因素方差分析和事后Tukey测试进行统计分析。
图12A和12B是代表性的处理后图像，示出了在P12到P16时经过全身处理的OIR小鼠视网膜的显微照片(40x)和计算出的血管长度图的血管的密度。如图12A所示，与单独的抗APLNR(更大密度)或VEGF捕获剂(更低密度)相比，抗APLNR抗体和VEGF捕获剂的组合产生了中等密度的视网膜血管。图12B示出了治疗组之间的血管长度有显著变化(p<0.0005)。与抗APLNR相比，使用VEGF捕获剂(####，p<0.0005)和使用组合(####，p<0.0005)的血管长度显著减小。相反，与VEGF捕获剂相比，使用组合治疗显著增加了血管长度(&&&，p<0.005)。使用单因素方差分析和事后Tukey测试进行统计分析。
如图8A-12B所示，并且如上所述，与Fc对照相比，抗APLNR抗体和VEGF捕获剂的组合促进血运重建，这导致无血管面积减少。此外，与单独的抗APLNR抗体或VEGF捕获剂治疗相比，组合治疗抑制病理性新生血管，并且对血管面积和血管长度产生中间作用。具体地，与VEGF捕获剂治疗相比，组合治疗促进主要血管之间的微血管生长，并且与抗APLNR抗体治疗相比，改善血管组织和均匀性。
本公开的范围不受本文所描述的具体实施例限制。实际上，根据前述描述和附图，除了本文所描述的那些修改之外，本公开的各种修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求书的范围内。
Claims (53)
1.一种用于治疗血管性眼部疾病或病症的方法，其包括：
向有需要的受试者施用治疗有效量的APLNR拮抗剂；以及
向所述受试者施用治疗有效量的血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述眼部疾病或病症选自由以下组成的组：糖尿病性视网膜病变、增生性糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、视网膜新生血管、中央视网膜静脉阻塞、分支视网膜静脉阻塞、息肉状脉络膜血管病变、脉络膜新生血管(CNV)、变性近视(近视性CNV)、新生血管性青光眼和早产儿视网膜病变。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述眼部疾病或病症是年龄相关性黄斑变性。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述眼部疾病或病症是糖尿病性黄斑水肿。
5.一种用于抑制视网膜血管生成的方法，其包括：
向有需要的受试者施用治疗有效量的APLNR拮抗剂；以及
向所述受试者施用治疗有效量的血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂。
6.一种抑制视网膜新生血管的方法，其包括
向有需要的受试者施用治疗有效量的APLNR拮抗剂；以及
向所述受试者施用治疗有效量的血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂。
7.一种用于抑制脉络膜新生血管的方法，其包括：向有需要的受试者施用治疗有效量的APLNR拮抗剂；以及
向所述受试者施用治疗有效量的血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂。
8.一种用于改善血管再生和减少异常新生血管的方法，其包括：
向有需要的受试者施用治疗有效量的APLNR拮抗剂；以及
向所述受试者施用治疗有效量的血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂。
9.一种用于促进视网膜血运重建的方法，其包括：
向有需要的受试者施用治疗有效量的APLNR拮抗剂；以及
向所述受试者施用治疗有效量的血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂。
10.一种用于促进视网膜血管均匀再生的方法，其包括：
向有需要的受试者施用治疗有效量的APLNR拮抗剂；以及
向所述受试者施用治疗有效量的血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂。
11.一种改善视网膜血管向外生长的方法，其包括：
向有需要的受试者施用治疗有效量的APLNR拮抗剂；以及
向所述受试者施用治疗有效量的血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂。
12.一种用于促进视网膜中血管均匀生长的方法，其包括：
向有需要的受试者施用治疗有效量的APLNR拮抗剂；以及
向所述受试者施用治疗有效量的血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂。
13.一种用于改善视网膜的血管组织的方法，其包括：
向有需要的受试者施用治疗有效量的APLNR拮抗剂；以及
向所述受试者施用治疗有效量的血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂。
14.根据权利要求5到13中任一项所述的方法，其中所述受试者已经被诊断患有选自由以下组成的组的眼部疾病或病症：糖尿病性视网膜病变、增生性糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、视网膜新生血管、中央视网膜静脉阻塞、分支视网膜静脉阻塞、息肉状脉络膜血管病变、脉络膜新生血管(CNV)、变性近视(近视性CNV)、新生血管性青光眼和早产儿视网膜病变。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述眼部疾病或病症是年龄相关性黄斑变性。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述眼部疾病或病症是糖尿病性黄斑水肿。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述APLNR拮抗剂包括抗APLNR抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合人APLNR。
18.根据权利要求2所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段与参考抗体竞争结合人apelin受体(APLNR)，所述参考抗体包括选自由SEQ ID NO:2/7和13/18组成的组的HCVR/LCVR序列对，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合人APLNR。
19.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段与参考抗体结合APLNR上的相同表位，所述参考抗体包括选自由SEQ ID NO:2/7和13/18组成的组的HCVR/LCVR序列对，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合人APLNR。
20.根据权利要求2到4中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包括：(a)重链可变区(HCVR)的互补性决定区(CDR)，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQID NO:2和13；以及(b)轻链可变区(LCVR)的CDR，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:7和18。
21.根据权利要求2到5中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包括HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3结构域，其分别选自由以下组成的组：SEQ ID NO:3-4-5-8-9-10和14-15-16-19-20-21。
22.根据权利要求2到6中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包括：(a)重链可变区(HCVR)，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2和13；以及(b)轻链可变区(LCVR)，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:7和18。
23.根据权利要求2到7中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包括选自由SEQ ID NO:2/7和13/18组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的所述重链和轻链CDR。
24.根据权利要求2到8中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包括选自由SEQ ID NO:2/7和13/18组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
25.根据权利要求9所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:2/7的所述HCVR/LCVR氨基酸序列对。
26.根据权利要求9所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:13/18的所述HCVR/LCVR氨基酸序列对。
27.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段是具有IgG1或IgG4重链恒定区的人抗体。
28.根据权利要求2到12中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段阻断APLNR和apelin的相互作用。
29.根据权利要求2到13中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段阻断APLNR和apelin的相互作用，在竞争性结合测定中表现出至少50％的结合抑制。
30.根据权利要求2到14中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段不阻断或仅部分阻断APLNR和apelin的相互作用。
31.根据权利要求1到15中任一项所述的方法，其中所述VEGF拮抗剂包括基于VEGF受体的嵌合分子(VEGF捕获剂)。
32.根据权利要求16所述的方法，其中所述VEGF捕获剂包括VEGFR1的一个或多个免疫球蛋白(Ig)样结构域、VEGFR2的一个或多个Ig样结构域以及多聚结构域。
33.根据权利要求17所述的方法，其中所述VEGF捕获剂包括VEGFR1的Ig样结构域2、VEGFR2的Ig样结构域3和多聚结构域。
34.根据权利要求18所述的方法，其中所述VEGF捕获剂是阿柏西普。
35.根据权利要求1到19中任一项所述的方法，其中所述VEGF拮抗剂由两个多肽的二聚体组成，所述二聚体由SEQ ID NO:23的氨基酸27-457组成。
36.一种用于治疗血管性眼部疾病或病症的组合物，其包括：
治疗有效量的APLNR拮抗剂；
治疗有效量的血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂；以及
合适的载剂、赋形剂或稀释剂。
37.根据权利要求74所述的组合物，其中所述APLNR拮抗剂包括抗APLNR抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合人APLNR。
38.根据权利要求75所述的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段与参考抗体竞争结合人apelin受体(APLNR)，所述参考抗体包括选自由SEQ ID NO:2/7和13/18组成的组的HCVR/LCVR序列对，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合人APLNR。
39.根据权利要求75或76所述的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段与参考抗体结合APLNR上的相同表位，所述参考抗体包括选自由SEQ ID NO:2/7和13/18组成的组的HCVR/LCVR序列对，其中所述抗体或其抗原结合片段特异性结合人APLNR。
40.根据权利要求75到77中任一项所述的组合物，其中所述抗体或抗原结合片段包括：(a)重链可变区(HCVR)的互补性决定区(CDR)，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2和13；以及(b)轻链可变区(LCVR)的CDR，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:7和18。
41.根据权利要求75到78中任一项所述的组合物，其中所述抗体或抗原结合片段包括HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3结构域，其分别选自由以下组成的组：SEQ ID NO:3-4-5-8-9-10和14-15-16-19-20-21。
42.根据权利要求75到79中任一项所述的组合物，其中所述抗体或抗原结合片段包括：(a)重链可变区(HCVR)，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2和13；以及(b)轻链可变区(LCVR)，其具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:7和18。
43.根据权利要求75到80中任一项所述的组合物，其中所述抗体或抗原结合片段包括选自由SEQ ID NO:2/7和13/18组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对的所述重链和轻链CDR。
44.根据权利要求75到81中任一项所述的组合物，其中所述抗体或抗原结合片段包括选自由SEQ ID NO:2/7和13/18组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
45.根据权利要求82所述的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:2/7的所述HCVR/LCVR氨基酸序列对。
46.根据权利要求82所述的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:13/18的所述HCVR/LCVR氨基酸序列对。
47.根据权利要求83或84所述的组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段是具有IgG1或IgG4重链恒定区的人抗体。
48.根据权利要求74到85中任一项所述的组合物，其中所述VEGF拮抗剂包括基于VEGF受体的嵌合分子(VEGF捕获剂)。
49.根据权利要求86所述的组合物，其中所述VEGF捕获剂包括VEGFR1的一个或多个免疫球蛋白(Ig)样结构域、VEGFR2的一个或多个Ig样结构域以及多聚结构域。
50.根据权利要求87所述的组合物，其中所述VEGF捕获剂包括VEGFR1的Ig样结构域2、VEGFR2的Ig样结构域3和多聚结构域。
51.根据权利要求88所述的组合物，其中所述VEGF捕获剂是阿柏西普。
52.根据权利要求74到89中任一项所述的组合物，其中所述VEGF拮抗剂包括两个多肽的二聚体，所述二聚体由SEQ ID NO:23的氨基酸27-457组成。
53.根据权利要求74到90中任一项所述的组合物，其中所述眼部疾病或病症选自由以下组成的组：糖尿病性视网膜病变、增生性糖尿病性视网膜病变、糖尿病性黄斑水肿、年龄相关性黄斑变性、视网膜新生血管、中央视网膜静脉阻塞、分支视网膜静脉阻塞、息肉状脉络膜血管病变、脉络膜新生血管(CNV)、变性近视(近视性CNV)、新生血管性青光眼和早产儿视网膜病变。
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