CN116368151A - 抗-sema3a抗体及其用于治疗视网膜血栓栓塞性疾病的用途 - Google Patents

Abstract

本发明大体上涉及供用于治疗视网膜血栓栓塞性疾病的靶向信号素(semaphorin)3A(Sema3A)的抗体及其片段。

Description

抗-SEMA3A抗体及其用于治疗视网膜血栓栓塞性疾病的用途

发明领域

本发明大体上涉及供用于治疗视网膜血栓栓塞性疾病的靶向信号素(semaphorin)3A(Sema3A)的抗体及其片段。

发明背景

视网膜静脉阻塞(RVO)是限制或阻断血流离开视网膜且是糖尿病性视网膜病变后第二常见的视网膜血管病症。导致不同程度的视力丧失、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)及分支视网膜静脉阻塞(BRVO)可因为可导致全盲的黄斑水肿而变得复杂。

没有治疗可逆转视网膜静脉阻塞。然而，虹膜或视网膜新血管生成或黄斑水肿可利用抗VEGF或类固醇注射液来管理。其他治疗方法包括使用雷射及手术。然而，对于罹患RVO的患者，现有治疗方法无一证明是可靠、安全且成功的结果。因此，对于用于有效治疗视网膜血栓栓塞性疾病的新治疗方法仍有未满足的需求。

发明内容

Sema3A是属3类信号素家族(Sema3)的内源性分泌蛋白，其最初被鉴别为轴突导向分子并涉及血管路径形成及网络形成。神经周期蛋白1及2(Nrp1及Nrp2)及A/D型神经丛蛋白(Plxn)在内皮细胞(EC)表面上用作Sema3受体复合物的配体结合及信号转导亚基。作为Sema3家族的特殊成员，Sema3A首先排他地结合至Nrp1，且然后与神经丛蛋白A1-4组合为复合物(Nrp1/PlexA1-4)。在此受体复合物中，Nrp1用作结合组件，而PlexA1-4用作信号转导组件。

人信号素3A是如SEQ ID NO:22中所公开且可以NCBI参照序列NP_006071.1获得的蛋白质。此外，人Sema3A由基因ID:10371(NCBI)编码。

Sema3A在肿瘤血管生成及转移中已经研究了多年，但其对视网膜新血管形成的效应仍不清楚。本发明者已例证信号素3A由低氧视网膜神经节细胞分泌，并用作血管推斥提示。Sema3A通过诱导该等细胞中的细胞骨架塌陷推斥新血管远离缺血区。不期望受限于理论，本发明者已假设此将解释为何不发生缺血区的血管重建，且相反Sema3A的上调导致病理性新血管形成进入玻璃体区中。

信号素3A由缺血/无血管视网膜中的低氧性神经元分泌，由此抑制视网膜的血管再生且增强病理性视网膜前新血管形成。

本发明人已利用其对Sema3A生物学的理解及对于视网膜的影响开发用于治疗视网膜血栓栓塞性疾病的新治疗策略。因此，在第一方面中，本发明提供一种用于治疗视网膜血栓栓塞性疾病的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，所述抗Sema3A抗体或其抗原结合片段包含：

-重链可变区，其包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:2的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:3的氨基酸序列(H-CDR3)；及

-轻链可变区，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:5的氨基酸序列(L-CDR2)；SEQ ID NO:6的氨基酸序列(L-CDR3)。

在一个实施方案中，所述抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段包含：

-重链可变区，其包含与氨基酸序列SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列；及

-轻链可变区，其包含与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列；

其中：

-该重链可变区包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:2的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:3的氨基酸序列(H-CDR3)；及

-该轻链可变区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:5的氨基酸序列(L-CDR2)；SEQ ID NO:6的氨基酸序列(L-CDR3)。

在另一个实施方案中，所述抗Sema3A抗体或其抗原结合片段包含：

-重链可变区，其包含与氨基酸序列SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列；及

-轻链可变区，其包含与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。

在又另一个实施方案中，所述抗Sema3A抗体或其抗原结合片段包含：

-重链可变区，其包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；及

-轻链可变区，其包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，所述抗Sema3A抗体或其抗原结合片段包含：

a.可变重链和可变轻链，其分别包含SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:11的氨基酸序列；

b.可变重链和可变轻链，其分别包含SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:11的氨基酸序列；

c.可变重链和可变轻链，其分别包含SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:12的氨基酸序列；或

d.可变重链和可变轻链，其分别包含SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:13的氨基酸序列。

在又另一个实施方案中，所述抗Sema3A抗体或其抗原结合片段包含：

-重链，其包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19的氨基酸序列，优选地由其组成；及

-轻链，其包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列，优选地由其组成。

在一个特定实施方案中，所述抗Sema3A抗体或其抗原结合片段包含：

a.包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链；

b.包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链；

c.包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链；或

d.包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链。

在一个优选的实施方案中，所述抗Sema3A抗体为人源化抗Sema3A抗体。

在一个优选的实施方案中，该视网膜血栓栓塞性疾病选自由以下组成的组：视网膜静脉阻塞(RVO)，包括视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、半球视网膜静脉阻塞(HRVO)、分支视网膜静脉阻塞(BRVO)，及视网膜动脉阻塞疾病。在又一个优选的实施方案中，所述视网膜血栓栓塞性疾病选自由以下组成的组：视网膜静脉阻塞(RVO)，包括视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、半球视网膜静脉阻塞(HRVO)及分支视网膜静脉阻塞(BRVO)。

在第二方面中，本发明提供一种用于治疗视网膜血栓栓塞性疾病的抗Sema3A抗体或其抗原结合片段，其结合至如以SEQ ID NO:22所示的人类Sema3A的氨基酸区370至382内的至少一个氨基酸残基。优选地，该视网膜血栓栓塞性疾病选自由以下组成的组：视网膜静脉阻塞(RVO)，包括视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、半球视网膜静脉阻塞(HRVO)、分支视网膜静脉阻塞(BRVO)，及视网膜动脉血栓栓塞性疾病。

在一个实施方案中，所述抗Sema3A抗体或其抗原结合片段结合至如以SEQ ID NO:21(DSTKDLPDDVITF)所示的氨基酸区内的至少一个氨基酸残基。在一个优选的实施方案中，本发明提供一种用于治疗视网膜血栓栓塞性疾病的抗Sema3A抗体或其抗原结合片段，其结合如以SEQ ID NO:21所示的氨基酸区。

在一个实施方案中，本发明提供一种抗Sema3A或抗原结合片段，其用于通过抑制SemaA的血管阻遏效应，通过改善视网膜的血管再生和/或通过降低血液视网膜屏障的渗透性来治疗静脉阻塞疾病。

在一个优选的实施方案中，本发明提供一种抗Sema3A抗体或其抗原结合片段，其用于治疗罹患糖尿病性黄斑缺血的患者中的视网膜血栓栓塞性疾病，优选地通过促进缺血性视网膜内的血管再生(血管重建)和预防眼睛玻璃体区域的病理性新血管形成。

在另一个优选的实施方案中，本发明提供一种抗Sema3A抗体或其抗原结合片段，其用于治疗罹患糖尿病性黄斑水肿的患者中的视网膜血栓栓塞性疾病，优选地通过降低血液视网膜屏障的渗透性。

在另一个优选的实施方案中，本发明提供一种抗Sema3A抗体或其抗原结合片段，其用于通过抑制Sema3A诱导的血液视网膜屏障的渗透性和/或Sema3A诱导的来自缺血区域的血管退化来治疗视网膜血栓栓塞性疾病。

在第四方面中，本发明提供一种药物组合物，其包含抗Sema3A抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载剂，其用于治疗视网膜血栓栓塞性疾病。

附图简述

图1：研究设计

本图描绘使用小鼠的视网膜静脉阻塞模型经由玻璃体内注射在视网膜缺血中使用本发明抗体的研究的方案。治疗方案包括激光照射后的早期阶段施用(研究1)和激光照射后第7天时的后期阶段施用(研究2)。基本上，抗Sema3A抗体和/或抗VEGF陷阱在激光照射后立即(研究1)或在激光照射后7天(研究2)经玻璃体内注射至小鼠眼睛中。

本研究包括如下4个步骤；

步骤1是关于水肿及损伤分析，包括组织学分析(苏木精和伊红染料或H&E)及光学相干断层扫描(OCT))。

步骤2是关于利用激光散斑血流成像的血流研究。

步骤3是关于荧光素-葡萄聚糖注射后平固式视网膜中的视网膜非灌注区域研究。

步骤4是关于蛋白质表达(利用蛋白质印迹(western blot))。

图2：利用激光散斑血流成像的眼部血流

该图例示在激光照射后1天或8天时通过媒介物、本发明的抗Sema3A抗体、VEGF-陷阱

或本发明的抗-Sema3A抗体和VEGF-陷阱/>

的组合经激光散斑血流成像的眼部血流的变化。图2A描绘激光照射后早期阶段施用的结果，图2B描绘激光照射后后期阶段施用的结果。数据显示为平均值±S.E.M(n＝5)。##P<0.01(相对经媒介物处理的组)。

发明详述

定义

抗体或免疫球蛋白的一般结构为本领域技术人员熟知，该等分子是异四聚体糖蛋白，通常约150,000道尔顿，由两条相同的轻(L)链及两条相同的重(H)链构成。每条轻链通过一个二硫键与重链共价连接以形成异二聚体，且异三聚体分子经由异二聚体的两条相同重链之间的共价二硫键形成。尽管轻链及重链通过一个二硫键连接在一起，但两条重链之间的二硫键的数目根据免疫球蛋白同种型而变化。每条重链及轻链亦具有规则间隔的链内二硫键。每条重链在氨基末端具有可变结构域(V_H＝可变重链)，之后是三个或四个恒定结构域(C_H1、C_H2、C_H3及C_H4)，以及C_H1与C_H2之间的铰链区。每条轻链具有两个结构域，即氨基末端可变结构域(VL＝可变轻链)及羧基末端恒定结构域(CL)。VL结构域与VH结构域非共价缔合，而CL结构域通常经由二硫键与CH1结构域共价连接。据信特定氨基酸残基在轻链及重链可变结构域之间形成界面(Chothia等人，1985,J.Mol.Biol.186:651-663)。

可变结构域内的某些结构域在不同抗体之间广泛地不同，即是“超变的”。该等超变结构域含有直接参与每一特定抗体对其特异性抗原决定子的结合及特异性的残基。轻链及重链可变结构域二者中的超变性集中在三个称为互补决定区(CDR)或超变环(HVL)的区段中。CDR是通过Kabat等人，1991于以下中的序列比较来定义：Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.，而HVL是根据如Chothia及Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-917所述的可变结构域的三维结构在结构上定义。在该两种方法导致CDR的鉴别略微不同的情况下，结构定义优选。如Kabat所定义，CDR-L1位于轻链可变结构域中约残基24-34处，CDR-L2位于约残基50-56处，且CDR-L3位于约残基89-97处；CDR-H1位于重链可变结构域中约残基31-35处，CDR-H2位于约残基50-65处，且CDR-H3位于约残基95-102处。因此，重链及轻链的CDR1、CDR2、CDR3定义对给定抗体特异的独特及功能性质。

重链及轻链中的每一者内的三个CDR由框架区(FR)分开，该等框架区含有倾向于较少变化的序列。自重链及轻链可变结构域的氨基末端至羧基末端，FR及CDR按以下顺序布置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。FR的大部分β-片构形使每条链内的CDR彼此紧密接近，以及与来自其他链的CDR紧密接近。所得构形有助于抗原结合位点(参见Kabat等人，1991,NIH Publ.第91-3242号，第I卷，第647-669页)，但并非所有CDR残基皆一定直接参与抗原结合。

FR残基及Ig恒定结构域不直接参与抗原结合，但有助于抗原结合及/或介导抗体效应物功能。一些FR残基被认为以至少三种方式对抗原结合具有显著影响：通过非共价直接结合至表位、通过与一或多个CDR残基相互作用及通过影响重链与轻链之间的界面。恒定结构域不直接参与抗原结合，但介导各种Ig效应物功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)及抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。

基于恒定结构域的氨基酸序列，将脊椎动物免疫球蛋白的轻链分配为两种明显不同的类别卡帕(kappa,κ)及兰姆达(lambda，λ)之一。通过比较，根据恒定结构域的序列，将哺乳动物免疫球蛋白的重链分配为五大类之一：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。IgG及IgA进一步分成亚类(同型)，例如分别为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ及μ。天然免疫球蛋白类别的亚基结构及三维构形是众所周知的。

术语“抗体”、“抗-Sema3A抗体”、“人源化抗-Sema3A抗体”及“变体人源化抗-Sema3A抗体”在本文以最广泛意义使用，且具体而言包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及抗体片段，例如可变结构域及抗体中展现期望生物学活性(例如结合Sema3A)的其他部分。

术语“单克隆抗体”(mAb)是指实质上同源的抗体群体的抗体；即，除了可以微量存在的天然存在的突变外，该群体中的个别抗体相同。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原决定子，即“表位”。因此，修饰语“单克隆”指示针对相同表位的抗体的实质上同源的群体，且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。应理解，单克隆抗体可通过本领域已知的任何技术或方法制得；包括例如杂交瘤方法(Kohler等人，1975,Nature 256:495)、或本领域已知的重组DNA方法(例如，参见美国专利第4,816,567号)、或使用噬菌体抗体文库重组产生的单克隆、使用Clackson等人，1991,Nature 352:624-628及Marks等人，1991,J.Mol.Biol.222:581-597中所述的技术的分离方法。

嵌合抗体由来自一个物种(例如，非人哺乳动物，例如小鼠)的抗体的重链及轻链可变区以及另一物种(例如人)抗体的重链及轻链恒定区组成，且可通过将编码来自第一物种(例如小鼠)的抗体的可变区的DNA序列与来自第二(例如人)物种的抗体的恒定区的DNA序列连接并用含有连接序列的表达载体转变宿主以使其产生嵌合抗体来获得。或者，嵌合抗体还可为其中重链及/或轻链的一或多个区或结构域与来自另一免疫球蛋白类别或同型或来自共有序列或种是序列的单克隆抗体中的相应序列相同、同源或为其变体的抗体。嵌合抗体可包括此类抗体的片段，条件是抗体片段展现其亲代抗体的期望生物学活性，例如结合至相同表位(例如，参见美国专利第4,816,567号；及Morrison等人，1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855)。

术语“抗体片段”、“抗原结合片段”、“抗-Sema3A抗体片段”、“人源化抗-Sema3A抗体片段”、“变体人源化抗-Sema3A抗体片段”是指全长抗-Sema3A抗体的一部分，其中保留可变区或功能能力，例如特异性Sema3A表位结合。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、scFv及scFv-Fc片段、双价抗体、线性抗体、单链抗体、微小抗体、自抗体片段形成的双价抗体及自抗体片段形成的多特异性抗体。

可用诸如木瓜酶或胃蛋白酶等酶处理全长抗体以产生有用的抗体片段。木瓜酶消解用于产生两个相同的抗原结合抗体片段，称为“Fab”片段(各自具有单一抗原结合位点)及残余“Fc”片段。Fab片段还含有轻链的恒定结构域及重链的CH1结构域。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点且仍能交联抗原的F(ab')2片段。

Fab'片段与Fab片段的区别在于存在额外残基，包括CH1结构域的C-末端处抗体铰链区的一或多个半胱氨酸。F(ab')2抗体片段是由铰链区中的半胱氨酸残基连接的Fab'片段对。抗体片段的其他化学偶合也是已知的。

“Fv”片段含有完整的抗原识别及结合位点，其由紧密、非共价缔合的一个重链及一个轻链可变结构域的二聚体组成。在此构形中，每一可变结构域的三个CDR相互作用以界定VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。六个CDR共同赋予抗体抗原结合特异性。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段是包含抗体的VH及VL结构域的单链Fv变体，其中结构域存在于单一多肽链中。单链Fv能够识别及结合抗原。scFv多肽也可任选含有位于VH及VL结构域之间的多肽连接体，以促进形成scFv结合抗原期望的三维结构(参见例如Pluckthun,1994,In The Pharmacology of monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg及Moore编辑,Springer-Verlag,New York,第269-315页)。

其他识别的抗体片段包括包含一对串联Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)以形成一对抗原结合区的那些抗体片段。这些“线性抗体”可为双特异性或单特异性的，例如Zapata等人1995,Protein Eng.8(10):1057-1062中所述。

人源化抗体或人源化抗体片段是一种特定类型的嵌合抗体(其包括免疫球蛋白氨基酸序列变体)或其片段，其能够结合至预定抗原，且其包含一或多个实质上具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的FR及一或多个实质上具有非人免疫球蛋白的氨基酸序列的CDR。此通常称为“输入”序列的非人氨基酸序列通常取自“输入”抗体结构域、特别是可变结构域。一般而言，人源化抗体至少包括非人抗体的CDR或HVL，其插入人重链或轻链可变结构域的FR之间。

本发明描述了特异性人源化抗-Sema3A抗体，其含有源自插入人种系序列重链和轻链可变区FR之间的鼠类或嵌合抗体的CDR。应理解，某些鼠类FR残基对于人源类化抗体的功能可为重要的，且因此某些人种系序列重链及轻链可变结构域残基经修饰为与相应鼠类序列的那些相同。

本文所用的，表述“本发明的抗体”和“本发明的抗-Sema3A抗体”是指本文所述的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段。优选地，该表述是指包含以下的任何抗体：重链可变区，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列(H-CDR1)、SEQ ID NO:2的氨基酸序列(H-CDR2)及SEQ IDNO:3的氨基酸序列(H-CDR3)；及轻链可变区，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(L-CDR1)、SEQ ID NO:5的氨基酸序列(L-CDR2)及SEQ ID NO:6的氨基酸序列(L-CDR3)。

在一方面中，人源化抗-Sema3A抗体包括至少一个、且通常两个可变结构域(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc及Fv片段中所含有的可变结构域)的实质上全部，其中全部或实质上全部CDR对应于非人免疫球蛋白的那些CDR，且在本文中具体地，CDR是鼠类序列，且FR是人免疫球蛋白共有序列或种系序列的那些FR。在另一方面中，人源化抗-Sema3A抗体还包括通常是人免疫球蛋白的免疫球蛋白Fc区的至少一部分。通常，抗体将含有轻链以及至少重链的可变结构域。若适当，抗体还可包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3和/或CH4区中的一或多者。

人源化抗-Sema3A抗体可选自任何类别的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE，以及任何同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。举例而言，恒定结构域可为补体固定恒定结构域，其中期望人源化抗体展现细胞毒性活性，且同种型通常是IgG1。在不期望该细胞毒性活性的情况下，恒定结构域可为另一同种型，例如IgG2。替代人源化抗-Sema3A抗体可包含来自一种以上免疫球蛋白类别或同种型的序列，且选择特定恒定结构域以优化期望效应物功能在本领域常规技术范围内。在具体实施方案中，本发明提供抗体，其为IgG1抗体，更特定而言为特征在于降低的效应物功能的IgG1抗体。

优选地，本发明的抗-Sema3A抗体是格式化为IgG1KO的人源化抗体。

人源化抗-Sema3A抗体的FR及CDR或HVL无需精确对应于亲代序列。举例而言，可通过取代、插入或缺失改变(例如诱变)输入CDR或HVL或共有序列或种系FR序列中的一或多个残基，使得所得氨基酸残基不再与任一亲亲序列中相应位置中的原始残基相同，但抗体仍保留与Sema3A结合的功能。该改变通常并非广泛的，且将为保守改变。通常，至少75％、更通常至少90％、且最经常大于95％、或大于98％或大于99％的人源化抗体残基将对应于亲代共有序列或种系FR及输入CDR序列的那些。

影响重链及轻链可变区之间的界面(“VL-VH界面”)的免疫球蛋白残基是影响两条链相互之间的接近或取向的那些。可参与链间相互作用的某些残基包括VL残基34、36、38、44、46、87、89、91、96及98及VH残基35、37、39、45、47、91、93、95、100及103(利用Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.,1987)中所述的编号系统)。美国专利号6,407,213也论述诸如VL残基43及85及VH残基43及60等残基也可参与此相互作用。尽管这些残基仅适用于人IgG，但其跨物种也适用。选择合理预期参与链间相互作用的重要抗体残基用于取代至共有序列中。

术语“共有序列”及“共有抗体”是指包含在任何特定类别、同种型或亚基结构的所有免疫球蛋白中的每一位置最频繁出现的氨基酸残基的氨基酸序列，例如人免疫球蛋白可变结构域。共有序列可基于特定物种或许多物种的免疫球蛋白。“共有”序列、结构或抗体应理解为涵盖如某些实施方案中所述的共有人序列，且是指包含在任何特定类别、同型或亚基结构的所有人免疫球蛋白中的每一位置最频繁出现的氨基酸残基的氨基酸序列。因此，共有序列含有在每一位置具有存在于一或多种已知免疫球蛋白中的氨基酸的氨基酸序列，但其可不与任何单一免疫球蛋白的整个氨基酸序列完全重复。可变区共有序列并非自任何天然产生的抗体或免疫球蛋白获得。Kabat等人，1991,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版，Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.及其变体。重链及轻链共有序列的FR及其变体提供制备人源化抗-Sema3A抗体的有用序列。参见例如美国专利号6,037,454和6,054,297。

人种系序列天然存在于人群体中。那些种系基因的组合产生抗体多样性。抗体的轻链的种系抗体序列来自保守的人种系κ或λV基因及j基因。类似地，重链序列来自种系v-、d-及j-基因(LeFranc,M-P及LeFranc,G,“The Immunoglobulin Facts Book”AcademicPress,2001)。

“分离的”抗体是已经自其天然环境的组分中鉴别及分离及/或回收的抗体。抗体的天然环境的污染组分是可干扰抗体的诊断或治疗用途的那些物质，且可为酶、激素或其他蛋白质或非蛋白质溶质。在一个方面中，抗体将纯化至按抗体重量计至少大于95％分离。

术语“抗体性能”是指有助于抗体识别抗原或抗体在活体内有效性的因素/性质。在优选的实施方案中，其是指抗体防止视网膜细胞中细胞骨架塌陷的能力。抗体的氨基酸序列的变化可影响抗体性质(例如折叠的)，且可影响物理因素，例如抗体与抗原结合的初始速率(ka)、抗体自抗原的解离常数(kd)、抗体对抗原的亲和常数(Kd)、抗体的构型、蛋白质稳定性及抗体的半衰期。

如本文所用的，在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同的”或“同一性百分比”是指当为了最大对应性进行比较及比对时，相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列。为了确定同一性百分比，将序列比对以用于最佳比较目的(例如，可在第一氨基酸或核酸的序列中引入缺口以用于与第二氨基酸序列或第二核酸序列进行最佳比对)。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比是这些序列所共享的同一位置数的函数(即，同一性％＝同一位置数/总位置数(例如重叠位置)×100)。在一些实施方案中，若适当(例如，排除延伸超出所比较的序列的额外序列)，在序列内引入缺口后，经比较的两个序列具有相同长度。举例而言，当比较可变区序列时，不考虑前导及/或恒定结构域序列。对于两个序列之间的序列比较，“相应”CDR是指两个序列中相同位置中的CDR(例如，每一序列的CDR-H1)。

两个序列之间的同一性百分比或相似性百分比的测定可使用数学算法来完成。用于比较两个序列的数学算法的优选非限制性实例是Karlin及Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-2268的算法，如Karlin及Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877中所修饰。该算法并入Altschul等人，1990,J.Mol.Biol.215:403-410的NBLAST及XBLAST程序中。BLAST核苷酸检索可用NBLAST程序(评分＝100，字长＝12)实施，以获得与编码感兴趣的蛋白质的核酸同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可用XBLAST程序(评分＝50，字长＝3)实施，以获得与感兴趣的蛋白质同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，可如Altschul等人,1997,Nucleic AcidsRes.25:3389-3402中所述的利用缺口BLAST。或者，可使用PSI-Blast以实施检测分子之间的远程关系的迭代检索(同上)。当利用BLAST、缺口BLAST及PSI-Blast程序时，可使用单独程序(例如XBLAST及NBLAST)的缺省参数。用于比较序列的数学算法的另一优选非限制性实例是Myers及Miller，CABIOS(1989)的算法。将该算法并入ALIGN程序(2.0版)，该程序是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可使用PAM120权重残基表、12的空位长度罚分及4的空位罚分。用于序列分析的额外算法为本领域已知且包括如Torellis及Robotti,1994,Comput.Appl.Biosci.10:3-5中所述的ADVANCE及ADAM；及Pearson及Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444-8中所述的FASTA。在FASTA内，ktup是设定检索的灵敏度及速度的控制选项。若ktup＝2，则通过观察比对的残基对发现所比较的两个序列中的相似区；若ktup＝1，则检查单一比对的氨基酸。ktup对于蛋白质序列可设定为2或1，或对于DNA序列可设定为1至6。若ktup未指定，则缺省值对于蛋白质为2且对于DNA为6。或者，可使用如Higgins等人,1996,Methods Enzymol.266:383-402所述的CLUSTAL W算法实施蛋白质序列比对。

如本文所用的，表述“细胞”、“细胞系”及“细胞培养物”可互换使用，且所有此类名称都包括其后代。因此，“转化子”及“转化的细胞”包括原代个体细胞及自其衍生的培养物，而不考虑转移的次数。

出于治疗目的，术语“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家畜及农场动物，以及动物园动物、竞技动物或宠物动物，例如狗、马、猫、牛及诸如此类。优选地，哺乳动物是人。

如本文所用，“血栓栓塞性疾病”是指在血管内部形成血块，阻碍血液流过循环系统。优选地，表述“视网膜血栓栓塞性疾病”是指选自以下的视网膜血栓栓塞性疾病：视网膜静脉阻塞，包括视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、半球视网膜静脉阻塞(HRVO)、分支视网膜静脉阻塞(BRVO)，以及视网膜动脉血栓栓塞性疾病。在一个优选的实施方案中，表述“视网膜血栓栓塞性疾病”是指视网膜静脉阻塞(RVO)。

视网膜静脉阻塞是糖尿病性视网膜病变后最常见的视网膜血管疾病。取决于被有效堵塞的视网膜静脉引流面积，其大致分类为视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、半球视网膜静脉阻塞(HRVO)或分支视网膜静脉阻塞(BRVO)中的任一者。已观察到，这些中每一者具有两个亚型。RVO的呈现一般伴随可变的无痛性视力损失，伴随由视网膜血管曲折、视网膜出血(斑点及发红形成)、棉絮斑、视神经盘肿胀和黄斑水肿组成的眼底发现的任何组合。在CRVO中，视网膜出血会见于眼底的所有四个象限中，而在HRVO中这些受限于上眼底半球或下眼底半球。在BRVO中，出血主要局限于通过堵塞的分支视网膜静脉引流的区域。视力损失继发于黄斑水肿或缺血。

本文所用的“疾病”或“病症”是任何会受益于本文所述人源化抗-Sema3A抗体治疗的病况。此包括慢性及急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所讨论病症的那些病理状况。

术语“玻璃体内注射”具有其在本领域中的正常含义，且是指将抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段引入患者的玻璃体中。

术语“皮下施用”是指通过自药物容器相对缓慢、持续递送，在动物或人患者的皮肤下、优选在皮肤与下层组织之间的囊内引入抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段。将皮肤捏起或拉起并远离下层组织可产生囊。

术语“皮下输注”是指通过自药物容器相对缓慢、持续递送一段时间(包括但不限于30分钟或更短、或90分钟或更短)，在动物或人患者的皮肤下、优选在皮肤与下层组织之间的囊内引入药物。任选，输注可通过皮下植入药物递送泵来进行，该药物递送泵植入动物或人患者的皮肤下，其中泵在预定的时间段(诸如30分钟、90分钟或跨越治疗方案的长度的时间段)内递送预定量的药物。

术语“皮下推注”是指在动物或人患者的皮肤下的药物施用，其中推注药物递送少于大约15分钟，在另一方面中少于5分钟，且在又一方面中少于60秒。在又一方面中，施用是在皮肤与下层组织之间的囊内，其中囊可通过将皮肤捏起或拉起并远离下层组织而产生。

术语“治疗有效量”用于指减轻或改善所治疗病症的一或多种症状的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段的量。在减轻或改善所治疗病症的一或多种症状时，其是具有有益的患者结果的量。根据待治疗的病况，可以以常规方式测量功效。举例而言，在特征在于表达Sema3A的细胞的眼/视网膜疾病或病症中，可通过测定反应率，例如视力恢复或通过评价直至疾病进展的延迟时间来测量功效。

本文所用术语“治疗”及“疗法”及诸如此类意指包括对疾病或病症的治疗性以及预防性或抑制性措施，其导致任何临床上期望或有益的效果，包括但不限于一或多种症状的缓和或缓解、使疾病或病症消退、减缓或停止疾病或病症的进展。因此，例如，术语治疗包括在疾病或病症的症状发作之前或之后施用抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，由此预防或去除疾病或病症的一或多种体征。作为另一实例，该术语包括在疾病临床出现后施用抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段以对抗疾病的症状。此外，在发作后及临床症状已发展后施用抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段包括本文使用的“治疗”或“疗法”，其中无论该治疗是否导致改善疾病，该施用仍会影响疾病或病症的临床参数。此外，与不使用抗-Sema3A抗体组合物或其抗原结合片段时的症状相比，只要本发明的组合物单独或与另一治疗剂的组合可以缓和或改善所治疗病症的至少一种症状，即应认为该结果是有效治疗该潜在病症，不论该病症的所有症状是否缓和。

术语“包装插页”用于指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其含有关于适应症、用法、施用、禁忌症及/或关于使用该等治疗产品的警告的信息。

供用于治疗视网膜血栓栓塞性疾病的本发明的抗体

在第一方面中，本发明涉及一种用于治疗视网膜血栓栓塞性疾病的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段。

在一个优选的实施方案中，所述视网膜血栓栓塞性疾病选自由以下组成的组：视网膜静脉阻塞(RVO)，包括视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、半球视网膜静脉阻塞(HRVO)、分支视网膜静脉阻塞(BRVO)，以及视网膜动脉阻塞疾病。

在另一个优选的实施方案中，所述抗体为人源化抗-Sema3A抗体，更优选为人源化单克隆抗-Sema3A抗体。

在初始表征中，通过将鼠类抗体的CDR放置于人共有重链及轻链可变结构域的FR中且进一步通过工程化具有不同改变的FR，产生靶向Sema3A变体的抗体文库。此导致具有如本文公开的增强性质的针对于Sema3A的人源化抗体。本发明抗体的序列示于下表1中。

表1：

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在一个实施方案中，本发明提供一种用于治疗视网膜血栓栓塞性疾病的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其中所述抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段包含：

-重链可变区，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:2的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:3的氨基酸序列(H-CDR3)；及

-轻链可变区，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:5的氨基酸序列(L-CDR2)；SEQ ID NO:6的氨基酸序列(L-CDR3)。

在另一个实施方案中，本发明提供一种用于治疗视网膜血栓栓塞性疾病的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其中所述抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段包含：

-重链可变区，其包含与氨基酸序列SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列；及

-轻链可变区，其包含与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，本发明提供一种用于治疗视网膜血栓栓塞性疾病的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其中所述抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段包含：

-重链可变区，其包含与氨基酸序列SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列；及

-轻链可变区，其包含与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。

其中：

-该重链可变区包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:2的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:3的氨基酸序列(H-CDR3)；及

-该轻链可变区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:5的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:6的氨基酸序列(L-CDR3)。

在又另一个实施方案中，本发明提供一种用于治疗视网膜血栓栓塞性疾病的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其中所述抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段包含：

-重链可变区，其包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；及

-轻链可变区，其包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。

在一个优选的实施方案中，本发明提供一种用于治疗视网膜血栓栓塞性疾病的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其中该抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段包含：

-可变重链和可变轻链，其分别包含SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:11的氨基酸序列；

-可变重链和可变轻链，其分别包含SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:11的氨基酸序列；

-可变重链和可变轻链，其分别包含SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:12的氨基酸序列；或

-可变重链和可变轻链，其分别包含SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:13的氨基酸序列。

在又另一个实施方案中，本发明提供一种用于治疗视网膜血栓栓塞性疾病的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其中所述抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段包含：

-重链，其包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19的氨基酸序列，优选地由其组成；及

-轻链，其包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列，优选地由其组成。

在一个特定实施方案中，本发明涉及一种用于治疗视网膜血栓栓塞性疾病的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其中所述抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段包含：

a.包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链，该抗体称为“克隆I”；

b.包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链，该抗体称为“克隆II”；

c.包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链，该抗体称为“克隆III”；或

d.包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链，该抗体称为“克隆IV”。

通过在Fc区中引入突变制备IgG1-KO突变体。用以降低或抑制效应物功能的突变为本领域技术人员所熟知，且充分公开于先前技术中，例如于Wang等人，Protein Cell2018,9(1):63-73及Stewart等人Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2014,2:29中。通常，为了降低Fc的效应物功能而在IgG1 Fc区中引入的突变的非限制性清单包含：

-L234A及L235A；

-L234A、L235A及N297Q；

-L234A、L235A及P329G；或

-L234A、L235A及D265A；

其中残基根据Kabat的EU索引编号。

在一个优选的实施方案中，本发明抗体包含位于Fc区中的两个突变L234A及L235A以减少效应物功能。

本文中公开且以SEQ ID NO:1至6绘示的CDR根据Kabat编号呈现，且在下表2中用Kabat位置概述。

表2：

本发明的抗-Sema3A抗体以高亲和性结合至人Sema3A。在关于此方面的实施方案中，本发明的抗-Sema3A抗体以KD<50pM结合至人Sema3A。在另一实施方案中，如实施例2中所示例的，本发明的抗-Sema3A抗体以KD<35pM结合至人Sema3A。在一个优选的实施方案中，本发明的抗-Sema3A抗体以KD<30pM结合至人Sema3A。

本发明的抗-Sema3A抗体还结合至cyno-Sema3A、小鼠Sema3A、大鼠Sema3A及兔Sema3A。

本发明的抗-Sema3A抗体以小于100pM，优选为小于80pM，更优选为小于70pM的功能效价预防视网膜细胞中Sema3A诱导的细胞骨架塌陷。在一个优选的实施方案中，如实施例2中所示例的，本发明的抗-Sema3A抗体以69pM的功能效价预防视网膜细胞中Sema3A诱导的细胞骨架塌陷。

在另一个方面中，如实施例3中所述，证明了本发明的抗-Sema3A抗体具有低免疫原性风险。此依赖于计算机预测抗体的免疫原性。免疫原性风险通常通过各种众所周知的方法来评价，例如通过用于预测T细胞表位的计算机算法，该等T细胞表位是主要的免疫原性影响因素。

实际上已报导，通过使用基于计算矩阵方法(可以名称EpiMatrix(由EpiVax生产)获得)的算法可预测所关注蛋白质中存在的含有T细胞表位的序列。本领域技术人员可参考Van Walle等人，Expert Opin Biol Ther.2007年3月；7(3):405-18及Jawa等人，ClinImmunol.2013年12月；149(3):534-55。

本发明者已显示，本发明的抗体比现有技术中提及及本文阐述的靶向Sema3A的其他抗体或片段显示更有利的性质。

本发明者比较WO2014123186(Chiome Bioscience)中公开的靶向Sema3A的抗体的结合亲和性与本发明的抗体的亲和性。公开WO2014123186的抗体，其用于治疗阿兹海默氏病(Alzheimer's disease)。本申请实施例4显示本发明的抗体证明比Chiome Bioscience公开的现有技术抗体对人Sema3A具有更高的结合亲和性。

本发明者亦比较本发明的抗体的性质与WO2017074013(Samsung)中公开的ScFv片段。公开该等片段，其用于治疗各种癌症。本申请实施例5显示本发明的抗体证明比WO2017074013公开的现有技术抗体片段对人Sema3A具有更高的结合亲和性。

更高的结合亲和性延长玻璃体内注射抗体后Sema3A的中和的时间，且允许降低的注射频率。更高的结合亲和性进一步允许施用更低的剂量，从而限制潜在副作用。因此，本发明的抗体提供优于现有技术抗体的技术优势。改良的结合亲和性及降低的注射频率显著改善有此需要的患者的治疗功效。其也为患者提供有价值的益处，尤其改良的药物依从性及顺从性。

人源化及氨基酸序列变体

基于SEQ ID NO:1至6中绘示的序列下鉴别的CDR组，可改造其他变体抗-Sema3A抗体及抗体片段。应理解，在所述变体抗-Sema3A抗体及抗体片段中，CDR的氨基酸序列保持不变，但周围区域(例如FR区)可经改造。抗-Sema3A抗体的氨基酸序列变体可通过将适当的核苷酸改变引入抗-Sema3A抗体DNA、或通过肽合成来制备。此类变体包括(例如)本文实施例的抗-Sema3A抗体的氨基酸序列内残基的缺失、及/或插入及/或取代。进行缺失、插入及取代的任何组合以获得最终构建体，条件是最终构建体具有期望特征。氨基酸改变也可改变人源化或变体抗-Sema3A抗体的翻译后过程，诸如改变糖基化位点的数目或位置。

抗体的另一类型的氨基酸变体涉及改变抗体的原始糖基化模式。术语“改变”在此上下文中意指缺失抗体中发现的一或多个糖类部分、及/或添加抗体中先前不存在的一或多个糖基化位点。

在一些方面中，本发明包括编码本文所述的抗-Sema3A抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。编码抗-Sema3A抗体的氨基酸序列变体的核酸分子是通过本领域已知的各种方法制备。这些方法包括但不限于自天然来源分离(在天然存在的氨基酸序列变体的情形下)或通过先前制备的抗-Sema3A抗体的变体或非变体形式的寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变及盒式诱变来制备。

在某些实施方案中，抗-Sema3A抗体是抗体片段。已研发用于产生抗体片段的技术。片段可经由完整抗体的蛋白水解消化而衍生得来(参见例如Morimoto等人,1992,Journal of Biochemical and Biophysical Methods24:107-117；及Brennan等人,1985,Science 229:81)。或者，片段可直接在重组宿主细胞中产生。举例而言，Fab'-SH片段可直接自大肠杆菌回收且化学偶合以形成F(ab')2片段(例如，参见Carter等人，1992,Bio/Technology10:163-167)。通过另一种方法，可直接自重组宿主细胞培养物分离F(ab')2片段。用于产生抗体片段的其他技术对于本领域技术人员而言将是显而易见的。

抗-Sema3A抗体及其抗原结合片段可包括修饰。

在某些实施方案中，可期望使用抗-Sema3A抗体片段而非完整抗体。可期望修饰抗体片段以增加其血清半衰期。此可通过(例如)将补救受体结合表位并入抗体片段中来实现。在一种方法中，可改变(例如突变)抗体片段的适当区，或者可将表位并入肽标签中，然后例如通过DNA或肽合成将肽标签在任一末端或中间融合至抗体片段。例如，参见WO 96/32478。

在其他实施方案中，本发明包括抗-Sema3A抗体的共价修饰。共价修饰包括半胱氨酰基残基、组氨酰基残基、赖氨酰基及氨基末端残基、精氨酰基残基、酪氨酰基残基、羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)、谷酰氨酰基及天冬酰氨酰基残基、或丝氨酰基、或苏氨酰基残基的修饰。另一种类型的共价修饰涉及将糖苷化学或酶促偶合至抗体。若适用，可通过化学合成或通过抗体的酶促或化学裂解进行此类修饰。通过使抗体的靶向氨基酸残基与能够与所选侧链或氨基或羧基末端残基反应的有机衍生剂反应，可将抗体的其他类型的共价修饰引入分子中。

可以化学或酶促方式完成抗体上存在的任何糖类部分的去除。化学去糖基化由Hakimuddin等人，1987,Arch.Biochem.Biophys.259:52及Edge等人，1981,Anal.Biochem.,118:131阐述。抗体上糖类部分的酶促裂解可通过使用各种内切及外切糖苷酶来实现，如Thotakura等人，1987,Meth.Enzymol138:350中所述。

另一种类型的有用的共价修饰包含以美国专利号4,640,835、美国专利号4,496,689、美国专利号4,301,144、美国专利号4,670,417、美国专利号4,791,192及美国专利号4,179,337中的一或多者中所述的方式将抗体与多种非蛋白质聚合物(例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯)之一连接。

表位结合

在第二方面中，本发明涉及识别特异性“Sema3A抗原表位”及“Sema3A表位”的抗体。特别地，所述抗体或其片段结合至具有SEQ ID NO:22的人Sema3A的表位。

在一个方面中，本发明涉及一种用于治疗视网膜血栓栓塞性疾病的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其中所述抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段结合至如以SEQ ID NO:22所示的人Sema3A的氨基酸区370至382内的至少一个氨基酸残基。

在另一个方面中，本发明涉及一种用于治疗视网膜血栓栓塞性疾病的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其中所述抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:21。

序列SEQ ID NO:21和22描绘在下表3中。

表3：

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如本文所用的，术语“Sema3A抗原表位”及“Sema3A表位”是指能够结合至抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段的分子(例如肽)或分子的片段。这些术语进一步包括(例如)由本发明的任何抗体或抗体片段识别的Sema3A抗原决定簇，其具有选自SEQ ID NO:1-3的重链CDR及SEQ ID NO:4至6的轻链CDR的轻链及重链CDR组合。

Sema3A抗原表位可包括于蛋白质、蛋白质片段、肽或诸如此类中。表位是最常见的蛋白质、短寡肽、寡肽模拟物(即模拟Sema3A抗原的抗体结合性质的有机化合物)或其组合。

已发现，本发明的抗体或抗体片段结合至人Sema3A的独特表位。优选地，抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段结合至具有SEQ ID NO:22的人Sema3A的细胞外结构域的氨基酸区370-382内的至少一个氨基酸残基。此表位位于Sema3A及神经丛蛋白A受体受体的界面附近。抗体与此表位的结合抑制配体Sema3A、受体神经丛蛋白A及辅助受体Nrp1的信号传导完整全受体(holoreceptor)复合物的形成，导致干扰此类信号传导的生物学效应。

在表位结合的上下文中，词组“在氨基酸区X-Y…内结合”意指抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段结合至序列中指示的氨基酸区内的至少一个、优选所有氨基酸残基。

在另一个方面中，抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段结合至以SEQ ID NO:22绘示的氨基酸序列的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或100％。优选地，抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段结合至SEQ ID NO:22。

治疗用途

在一个实施方案中，本发明提供一种抗-Sema3A或抗原结合片段，其用于通过抑制SemaA的血管阻遏效应，通过改良视网膜的血管再生，和/或通过降低血液视网膜屏障的渗透性来治疗静脉阻塞性疾病。本申请的发明人确实已开发靶向Sema3A的抗体，其对以下方面极为有帮助：

-将血管生成重新定向至缺血性区，以改良视网膜的血管再生；

-预防玻璃体区的病理性新血管生成；及

-防止血液视网膜屏障破坏。

如先前所提及，Sema3A是由低氧视网膜神经节细胞分泌的血管推斥提示。通过结合至神经周期蛋白-1，其活化内皮细胞上神经丛蛋白受体的细胞内信号传导，导致肌动蛋白纤维的解装配。此导致尖端细胞的丝状伪足中的细胞骨架塌陷，该尖端细胞是指导新血管生长并阻止视网膜中缺血性区的血管再生的专门内皮细胞。本申请的发明人已显示，用中和Sema3A-抗体调节血管推斥作用将增加tip细胞的数量，并将血管生成重新定向至缺血性区，例如患有糖尿病黄斑缺血的人中的病理性扩大的中心凹无血管区。

本申请的发明人已在实施例1中显示基于使用本发明的抗-Sema3A抗体的治疗策略的相关性及优越性。他们确实已表明，本发明的抗体在RVO鼠类模型中改善囊状水肿且抑制内核层中的视网膜薄化。本申请的发明人已进一步表明，通过在RVO鼠类模型中施用本发明的抗-Sema3A抗体，改良眼部血流。最后，本申请的发明人已示例，本发明的抗-Sema3A抗体在RVO鼠类模型中减少视网膜非灌注区的大小。

在一个实施方案中，本发明提供一种抗-Sema3A或抗原结合片段，其用于通过抑制SemaA的血管抑制效应，改良视网膜的血管再生和/或通过降低血液视网膜屏障的渗透性来治疗视网膜血栓栓塞性疾病。

在一个优选的实施方案中，本发明提供一种抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其用于治疗罹患糖尿病性黄斑缺血的患者中的视网膜血栓栓塞性疾病，优选地通过促进缺血性视网膜内的血管再生(血管再形成)及预防眼睛的玻璃体区的病理性新血管生成。

在另一个优选的实施方案中，本发明提供一种抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其用于治疗罹患糖尿病性黄斑水肿的患者中的视网膜血栓栓塞性疾病，优选地通过降低血液视网膜屏障的渗透性。

在另一个优选的实施方案中，本发明提供一种抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其用于通过抑制Sema3A诱导的血液视网膜屏障的渗透性和/或Sema3A诱导的缺血区域的血管退化来治疗视网膜血栓栓塞性疾病。

在第四方面中，本发明提供一种药物组合物，其包含抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段及药学上可接受的载剂，其用于治疗视网膜血栓栓塞性疾病。

本发明的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段或药物组合物通过任何适宜方式(包括玻璃体内、口服、肠胃外、皮下、腹膜内、肺内及鼻内)施用。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。另外，通过脉冲输注、具体而言利用降低剂量的抗体适宜地施用抗-Sema3A抗体。在一个方面中，通过注射、最佳静脉内或皮下注射给予剂量，这部分地取决于施用是短暂的还是长期的。优选地，抗-Sema3A抗体是经由玻璃体内注射至眼中来给予。

为了预防或治疗疾病，抗体的适当剂量将取决于多种因素，例如如上文所定义的待治疗的疾病的类型、疾病的严重程度及进程、施用抗体是用于预防目的还是治疗目的、先前疗法、患者的临床史及对抗体的反应、以及主治医师的判断。将抗体适宜地一次性或经一系列治疗施用至患者。

在一个优选的实施方案中，本发明的抗体每次注射可适用的剂量范围通常为1mg/眼至10mg/眼，优选介于1.5mg/眼与5mg/眼之间，更优选介于2mg/眼与3mg/眼之间，且甚至更优选为约2.5mg/眼。

术语“抑制”在本文中与“改善”及“减轻”在相同的上下文中使用，以意指减轻或减少疾病的一或多种特征。

抗体组合物将以与良好医疗实践一致的方式配制、给药及施用。在此上下文中需考虑的因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病因、药剂的递送位点、施用方法、施用时间安排及执业医师所知的其他因素。待施用的抗体的“治疗有效量”将由此类考虑因素决定，且是预防、改善或治疗由本发明的抗体解决的眼或视网膜疾病所必需的最小量。

抗体不必(但任选)与一或多种当前用于预防或治疗视网膜血栓栓塞性疾病的药剂一起调配。此类其他药剂的有效量取决于配制物中所存在抗-Sema3A抗体的量、病症或治疗的类型以及上文所讨论的其他因素。此类其他药剂通常以与上文所用相同的剂量及施用途径来使用或是上文所用剂量的约1％至99％。

各种递送系统是已知的且可用于施用抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段。引入方法包括但不限于玻璃体内、滴眼剂、皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外及口服途径。抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段可例如通过输注、推注或注射施用，且可连同其他生物活性剂一起施用。施用可为全身或局部。在优选的实施方案中，施用是通过玻璃体内注射。例如，可在经预填充的注射器中制备用于此类注射的配制物。

抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段可以作为药物组合物施用，该药物组合物包含治疗有效量的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段及一或多种药学上可兼容的成分。

在典型的实施方案中，根据常规程序将药物组合物配制成适于静脉内或皮下施用至人的药物组合物。通常，用于通过注射施用的组合物是无菌等渗水性缓冲剂中的溶液。若需要，药物组合物还可包括增溶剂及局部麻醉剂(例如利多卡因(lignocaine))以减轻注射位点的疼痛。通常，成分是单独供应或以单位剂型混合在一起，例如，作为于指示活性剂的量的气密性密封容器(例如安瓿或小药囊)中的干燥冻干粉剂或无水浓缩物。在药物组合物待通过输注施用的情况下，其可用含有无菌药用级水或盐水的输注瓶来分配。在药物组合物是通过注射来施用的情况下，可提供注射用无菌水或盐水的安瓿，使得在施用之前混合成分。

此外，药物组合物可以作为药物试剂盒来提供，该药物试剂盒包含(a)容器，其含有呈冻干形式的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段；及(b)第二容器，其含有药学上可接受的注射用稀释剂(例如无菌水)。药学上可接受的稀释剂可用于重构或稀释冻干的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段。任选地，此类容器可附带有监管药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构所规定形式的公告，该公告反映制造、使用或销售机构批准人施用。

有效治疗或预防眼或视网膜疾病的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段的量可通过标准临床技术测定。另外，可任选采用体外测定来帮助鉴别最佳剂量范围。待用于配制物中的精确剂量还将取决于施用途径及病症的阶段，且应根据执业医师的判断及每一患者的情况来决定。可根据自体外或动物模型测试系统衍生的剂量反应曲线来推断有效剂量。

例如，抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段的毒性及治疗功效可通过用于测定ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)的标准药物程序在细胞培养物或实验动物中测定。表现出大的治疗指数的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段是优选的。

可使用自细胞培养测定及动物研究中获得的数据来配制用于人的剂量范围。抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段的剂量通常在循环浓度范围内，其包括ED50，具有很小毒性或无毒性。该剂量可根据所用剂型及所用施用途径在此范围内变化。对于该方法中使用的任何抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，可最初从细胞培养测定中估计治疗有效剂量。可在动物模型中配制剂量以实现循环血浆浓度范围，包括IC50(即实现症状的半数最大抑制的测试化合物的浓度)，如在细胞培养物中所测定的。此类信息可用于更准确地测定人中有用的剂量。可通过(例如)高效液相层析、ELISA及诸如此类测量血浆中的含量。

对于抗-Sema3A抗体的玻璃体内注射，通常治疗之间的较长间隔是优选的。由于其改良的结合亲和性及功效，本发明的抗-Sema3A抗体可以更长的间隔施用。

在一个实施方案中，每6周、优选每7周、优选每8周、优选每9周、优选每10周、优选每11周且更优选每12周施用抗-Sema3A抗体。在又一优选的实施方案中，每3个月一次施用本发明的抗-Sema3A抗体。

由于可施用至眼的体积严格受限，因此抗-Sema3A抗体可配制成高浓度是极为重要的。此外，抗-Sema3A抗体的功效是极为重要的，此乃因强效抗体可在甚至更低的剂量下发挥其效应，且由此延长活性以及治疗之间的间隔。

本发明的抗体可配制成极高剂量，包括但不限于20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml或100mg/ml。优选地，本发明的抗体可配制在约50mg/ml的液体配制物中。

可施用至患者的典型剂量为约2.5mg/眼。可用于此类配制物的典型缓冲剂组分包含(例如)乙酸钠、PS20及海藻糖二水合物。

在一个实施方案中，用10mM组氨酸缓冲剂、240mM蔗糖、0.02w/v％聚山梨醇酯20于pH 5.5下调配抗-Sema3A抗体，最终蛋白质浓度为60mg/mL。

在一些实施方案中，包含抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段的药物组合物可进一步包含缀合或未缀合至结合剂的治疗剂。

关于用于组合施用的治疗方案，在一个特定的实施方案中，抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段与治疗剂同时施用。在另一个特定实施方案中，在施用抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段之前或之后施用治疗剂，在施用抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段之前或之后至少一小时且至多几个月，例如至少一小时、五小时、12小时、一天、一周、一个月或三个月，施用治疗剂。

治疗方法

在另一方面中，本发明还涵盖用于治疗或预防有此需要的患者的视网膜血栓栓塞性疾病的任何方法，其中该抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段包含，该方法包括施用本发明的抗-Sema3A抗体。

优选地，本发明涉及一种用于治疗或预防视网膜血栓栓塞性疾病的方法，该方法包括向有此需要的患者施用药物有效量的根据本发明的抗体。

本文所描述的所有公开的技术特征适合于该治疗方法。

制品

在另一方面中，包括含有可用于治疗上文所描述的病症的材料的制品。制品包括容器及标签。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器及试管。容器可由多种材料诸如玻璃或塑料形成。该容器容容纳有有效治疗病况的组合物且可具有无菌存取口。例如，容器可为静脉溶液袋或具有可通过皮下注射针刺穿的塞子的小瓶。组合物中的活性剂是抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段。容器上或与容器相关的标签指示组合物用于治疗选择的病况。制品可进一步包含第二容器，其包含药物上可接受的缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖苷溶液。其可进一步包括自商业及使用者角度来看合意的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器及带有使用说明书的包装插页。

本发明在以下实施例中进一步描述，这些实施例并不旨在限制本发明的范围。

实施例

实施例1：抗-Sema3A抗体在视网膜静脉阻塞模型小鼠中的效果

在本研究中，使用小鼠的视网膜静脉阻塞模型评估根据本发明的示例性抗-Sema3A抗体对视网膜缺血的玻璃体内抗体疗法。此外，为了区分来自VEGF/Nrp1轴线的Sema3A/Nrp1信号传导轴线的中和，还评估利用抗-Sema3A抗体的单药疗法及其与抗-VEGF抗体的组合。

I.材料

A.研究设计

在图1中说明了本研究设计。本实施例包括如下4个步骤：

·步骤1：水肿及损伤(组织学分析、光学相干断层扫描(OCT))

·步骤2：血流(激光散斑血流成像)

·步骤3：视网膜非灌注区(经荧光素染色的平固式视网膜)

·步骤4：蛋白质表达(WB)

B.测试/参考化合物

本申请的发明人测试根据本发明的示例性抗体：克隆I。所述抗体包含包含SEQ IDNO:14的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链。

本申请的发明人已测试且比较所述抗-Sema3A抗体与市售抗-VEGF陷阱

将这些化合物用安维汀(Avastin)缓冲液(60mg/mlα,α-海藻糖脱水合物、5.8mg/ml磷酸钠(一价，单水合物)、1.2mg/ml磷酸钠(二价，无水)、0.4mg/ml聚山梨醇酯20，pH6.2)稀释至10mg/mL的浓度。

C.组别及方案

下表4概述不同组别及用于各个组别的方案类型。

表4：

RVO，视网膜静脉阻塞；IVT，玻璃体内注射D.试剂

所使用的各种试剂概述于下表5中。

表5：

E.用于蛋白质表达的蛋白质印迹分析的抗体

最后，特定地用于通过蛋白质印迹进行蛋白质表达的体外分析的抗体概述于下表6中。

表6：

II.方法

A.动物及RVO鼠类模型：

根据视力及眼科研究协会(Association for Research in Vision andOphthalmology；ARVO)针对动物在眼科及视力研究中的使用的声明进行所有动物实验，且这些实验已获得岐阜药科大学动物照护及使用委员会机构(Institutional Animal Careand Use Committee of Gifu Pharmaceutical University)的批准及监测。

8周龄ddY雄性小鼠从Japan SLC(Shizuoka，Japan)获得且在23±3℃下在12h明/暗循环(08:00至20:00照明)下圈养。用氯胺酮(120mg/kg)及甲苯噻嗪(6mg/kg)的混合物麻醉小鼠。RVO通过以下发展：在i.v.注射8mg/mL Rose Bengal后，使用附接至Micron IV视网膜成像显微镜(Phoenix Research Laboratories，Inc.)的影像引导的激光系统，对各动物右眼的三个视网膜分支静脉进行激光光凝固(532nm，50mW功率，5000毫秒持续时间，50μm光斑大小)。

本发明的抗–Sema3A抗体和/或抗-VEGF陷阱在激光照射后立即或7天后以10μg/眼睛的剂量及2μL的注射体积经玻璃体内注射至各小鼠右眼中。

B.组织学

进行苏木精及伊红染料(H&E)染色以可视化小鼠眼睛切片的组织学变化。将用于组织学分析的眼睛在4℃下在4％多聚甲醛(PFA)中保持浸渍至少48小时。穿过各眼睛的视盘切割而得到六个石蜡包埋切片(5μm)且用苏木精及伊红染色。用荧光显微镜(BZ-710；Keyence)拍摄影像。利用Image J(国家健康研究院(National Institutes of Health)，Bethesda)测定每240μm从视盘朝向周边的照片上内核层(INL)的厚度。求取各眼睛的随机从六个切片选择的三个切片的数据的平均值。

C.利用激光散斑血流成像测量血流：

使用激光散斑血流成像装置(LSFG；Softcare)在约4秒的时段内以30帧/秒的速率连续采集平均模糊率(MBR)影像(一种相对血流速度的指数)。测得的眼底面积为约3.8×3mm(宽度×高度)，估算的组织穿透为0.5至1mm。图像获取后，通过LSFG Analyzer软件(版本3.1.14.0；Software Co.，Ltd.)，使用所谓的血管提取功能自动检测视神经头部区域上的血管及组织区域。

D.视网膜非灌注区的成像：

在采样之前，小鼠被注射0.5mL的经溶解于PBS中的20mg/mL荧光素结合的聚葡萄糖至尾静脉中。摘除眼睛并在4％PFA中固定7小时，且制备平固式视网膜。用Metamorph(Universal Imaging Corp)拍摄平固式视网膜的图像且使用ImageJ处理软件分析以确定视网膜非灌注区的大小。

E.用于蛋白质表达的蛋白质印迹分析

通过标准方法进行蛋白质印迹分析。通过Immuno

LD使免疫反应条带可见，且用LAS-4000发光影像分析仪(Fuji Film Co.Ltd.)测量其密度。对于定量分析，使用总蛋白质信号作为磷蛋白信号的负载对照。

III.结果

A.本发明的抗-Sema3A抗体改善RVO鼠类模型的内核层中的囊状水肿及视网膜薄 化。

本申请发明人研究了通过RVO诱导的囊状水肿是否可通过施用本发明的抗-Sema3A抗体来改善。

本实验的治疗方案包括激光照射后的早期阶段施用及激光照射后7天时的后期阶段施用。基本上，将抗-Sema3A抗体和/或抗-VEGF陷阱在激光照射后立即或7天时以10μg/眼睛的剂量经玻璃体内注射至各小鼠右眼中。

在激光照射后1天，内核层(INL)的视网膜薄化厚度显著增加，且这种增加通过施用本发明的抗-Sema3A抗体而得到抑制。本发明抗体与抗-VEGF陷阱的组合以及单独抗-VEGF陷阱在RVO诱导后在此早期阶段取得相同效果。

为了检查抗-Sema3A抗体在RVO诱导后在后期阶段对于内核层(INL)的视网膜薄化的效果，将小鼠在激光辐射后7天时经玻璃体内注射本发明的抗-Sema3A抗体和/或抗-VEGF陷阱。

在经媒介物处理组中，在激光照射后8天时，INL的厚度显著减小。施用抗-VEGF陷阱增加视网膜薄化的程度。然而，在激光照射后7天时，通过玻璃体内注射本发明的抗-Sema3A抗体抑制该视网膜薄化。

结果显示，本发明抗体抑制视网膜薄化，证实了其于治疗视网膜血栓栓塞性疾病(诸如RVO)中的有益用途。结果还将本发明抗体与用抗-VEGF陷阱的治疗进行区分，因为后者在RVO诱导后并未在所有阶段中取得有益效果。

B.通过在RVO鼠类模型中施用本发明的抗-Sema3A抗体来改良眼部血流。

本申请的发明人在激光照射后1或8天时利用激光散斑血流成像成像来检查通过本发明的抗-Sema3A抗体对眼部血流的变化。

本实验的治疗方案包括激光照射后的早期阶段施用及激光照射后7天时的后期阶段施用。基本上，将抗-Sema3A抗体和/或抗-VEGF陷阱在激光照射后立即或7天时以10μg/眼睛的剂量经玻璃体内注射至各小鼠右眼中。

本申请的发明人已显示，在经媒介物处理组中，在激光照射后1天时，血流显著减少。

在激光照射后的早期阶段施用下，在施用本发明的抗-Sema3A抗体及施用后1天时，血流的减少是降低的。施用抗-VEGF陷阱取得对于血流的相同效果。激光照射后立即施用本发明的抗-Sema3A抗体及抗-VEGF陷阱的组合导致RVO诱导后此早期阶段中血流减少更显著地降低(图2A)。

本申请的发明人研究在激光照射至各小鼠右眼后7天时利用抗-Sema3A抗体和/或抗-VEGF陷阱以10μg/眼睛的剂量(在激光照射后的后期阶段施用)的眼部血流。在经媒介物处理组中，在激光照射后8天时，血流显著减小。

结果显示，注射抗-VEGF陷阱增加视网膜血流减少的程度。相反地，施用本发明的抗-Sema3A抗体时的血流显著好于经媒介物处理组。在RVO诱导后在此后期阶段时施用本发明的抗-Sema3A抗体与抗-VEGF陷阱的组合中和本发明的抗-Sema3A抗体的有益效果(图2B)。

这些数据显示，本发明抗体在RVO诱导后在所有阶段显著改良血流。其进一步显示，当与基于单独抗-VEGF之治疗策略相比时，本发明抗体于改良血流方面之优越性。

C.本发明的抗-Sema3A抗体减少RVO鼠类模型中视网膜非灌注区的大小。

为了研究抗-Sema3A抗体对于非灌注区的大小方面的效果，发明人在激光照射后立即或7天时经玻璃体内注射根据本发明的抗-Sema3A抗体和/或抗-VEGF陷阱。

在激光照射后立即施用抗-Sema3A抗体导致在激光照射后1天时非灌注区的大小与经媒介物处理组相比显著减少。施用抗-VEGF陷阱、或本发明的抗-Sema3A抗体与抗-VEGF陷阱的组合取得大约相同的效果。

关于激光照射后的后期阶段施用，发明人已证明，通过在激光照射后7天施用抗-VEGF陷阱来增加非灌注区的大小。相反地，发明人已证明，与经媒介物处理组相比，在激光照射后7天时施用本发明的抗-Sema3A抗体导致非灌注区的大小减少。施用本发明的抗-Sema3A抗体与抗-VEGF陷阱的组合中和本发明的抗-Sema3A抗体的有益效果。

这些结果指示，与基于抗-VEGF陷阱的治疗用途的策略相比，本发明的抗-Sema3A抗体在7天后以更佳持续的方式减少非灌注区的大小。这证实本发明抗体在治疗血栓栓塞性疾病(诸如RVO)中的有益用途。

D.RVO鼠类模型中的TNF-α及Sema3A有关受体(神经丛蛋白A1及神经纤毛蛋白1)的 表达通过抗-Sema3A抗体而降低。

研究TNF-α和Sema3A有关受体(神经丛蛋白A1及神经纤毛蛋白1)的蛋白质表达。

在激光照射后立即或7天时经玻璃体内注射本发明的抗-Sema3A抗体和/或抗-VEGF陷阱后测定TNF-α及Sema3A有关受体组分(丛蛋白A1或神经纤毛蛋白1)的表达。

在激光照射后1天时，在媒介物处理组中，TNF-α及神经丛蛋白A1的表达均增加。与媒介物处理组相比，本发明的抗-Sema3A抗体的早期注射强烈降低表达水平。本发明的抗-Sema3A与抗-VEGF陷阱的组合取得相同效果。虽然在RVO诱导后此早期阶段中单独抗-VEGF陷阱也减少TNF-α，但其并不显著影响神经丛蛋白A1的表达。

在激光照射后8天时，在经媒介物处理的组中，TNF-α及神经纤毛蛋白1增加。然而，施用本发明的抗-Sema3A抗体降低了后期阶段中的这些因子。另一方面，在RVO诱导后此后期阶段中抗-VEGF陷阱注射不会影响Nrp1表达且与经媒介物处理组相比增加TNF-α。本发明的抗-Sema3A抗体与抗-VEGF陷阱的组合减弱本发明的抗-Sema3A抗体的效果。

IV.结论

总之，这些数据表明，在患有RVO的眼睛中，Sema3A相关的受体及炎症性因子的表达水平增加。

在RVO诱导后早期阶段中注射根据本发明的抗-Sema3A抗体显著减少视网膜水肿、非灌注区的大小及血流的减少。此外，增加的TNF-α及Sema3A相关的受体(神经丛蛋白A1)的表达降低。

此外，在RVO诱导后后期阶段时注射抗-Sema3A抗体还改良了这些病理症状且增加的TNF-α及Sema3A相关的受体(神经纤毛蛋白1)的表达降低。

TNF-a及Sema3A相关的受体(神经纤毛蛋白1及丛蛋白A1)的下调可促成在施用本发明的抗-Sema3A抗体后RVO鼠类模型中病理症状的改善。

本申请的数据证实，本发明的抗体对于治疗罹患视网膜血栓栓塞性疾病(尤其是RVO)的患者而言是非常有前景的。特别地，本发明的抗-Sema3A抗体在RVO诱导后的所有阶段中显示有益效果，这将其与抗-VEGF陷阱区分开。

实施例2：亲和力及细胞效价

A)亲和力

此实验的运行缓冲液及所有稀释液(除注明情况外)在具有0.01％Tween20的PBS-T-EDTA[将100μl 100％Tween 20添加至2L PBS-T-EDTA以制备0.01％的最终Tween 20浓度]中进行。按照制造商的建议，将GLM感测芯片标准化及预先调整(pre-conditioned)。感测芯片用等量的EDC/s-NHS混合物在水平方向上以30μl/min的流速活化300秒且用人FabBinder(10μg/ml在10mM乙酸盐pH 5.0中)在水平方向上以30μl/min的流速固定300秒而在表面上得到约6739至7414RU的人Fab Binder。感测芯片用1M乙醇胺HCl在水平方向上以30μl/min的流速去活化300秒。感测芯片以100μl/min的流速用18秒10mM甘胺酸pH 2.1稳定水平1次及垂直1次。

本发明者测试根据本发明的示例性抗体(克隆I)。所述抗体(0.5μg/ml)以25μl/min的流速垂直捕获在人Fab Binder表面上300秒而得到约180RU捕获程度。通过以40μl/min的流速经水平注射PBS-T-EDTA60秒来使基线稳定。将分析物以40μl/min的流速经水平注射在所捕获的抗体上600秒且解离7200秒。分析物的浓度为0nM、0.625nM、1.25nM、2.5nM、5nM及10nM。通过以100μl/min的流速经水平一次及经垂直一次注射10mM甘胺酸pH 2.1 18秒来再生表面。以25μl/min的流速经垂直注射PBS-T-EDTA 60秒一次。

从原始数据减去点间(interspot)(与传感器表面相互作用)及空白(具有0.01％Tween 20或0nM分析物的PBS-T-EDTA)。然后将感应图全局拟合至1:1朗谬尔(Langmuir)结合以提供结合速率(ka)、解离速率(kd)及亲和力(KD)值。

B)细胞效价

为了测定细胞骨架塌陷测定中的功能效价，将Sema3A浓度反应曲线与渐增浓度的抗体组合作为IC50位移实验。进行Gaddum Schild图以计算pA2值(位移Sema3A浓度反应曲线2因子所需的抗体浓度的负对数)。以pM计的效价从pA2值计算为＝效价(10；-X)。

结果概述在下表7中。

表7：

实施例3：本发明抗体的免疫原性的评估

发明人已评估根据本发明的示例性抗体克隆I的预测的免疫原性。所述抗体包含分别包含SEQ ID NO:14及SEQ ID NO:15的氨基酸序列的重链及轻链。

出于此目的，发明人已使用计算机模拟工具来预测T细胞表位(由EpiVax开发的EpiMatrix)。

通过筛选许多种人抗体分离物的序列，EpiVax已识别出若干种高度保守的HLA配体，据称其具有调节性潜力。实验证据表明，许多这些肽事实上在大多数个体中具有主动致耐受性。这些高度保守、调节性及混杂的T细胞表位现称为调节性T细胞表位(Tregitopes)(De Groot等人，Blood.2008年10月15日；112(8):3303-11)。包含在人源化抗体中的新抗原(neo-epitope)的免疫原性潜力可在大量的调节性T细胞表位存在下得以有效控制。

出于抗体免疫原性分析的目的，EpiVax已开发出调节性T细胞表位调整的EpiMatrix评分及抗治疗性抗体反应的相应预测。为了计算调节性T细胞表位调整的EpiMatrix评分，从EpiMatrix蛋白质评分推导出调节性T细胞表位的评分。已显示调节性T细胞表位调整的评分与一组23种市售抗体中所观测到的临床免疫反应具良好相关性(DeGroot等人，Clin Immunol.2009年5月；131(2):189-201)。

基于EpiMatrix量表的结果概述于下表8中。

表8：

本发明的抗体的序列基于EpiMatrix量表的低端进行评分，指示本发明抗体具有强烈地受限的免疫原性潜力。该EpiMatrix量表是本领域技术人员所熟知的且可尤其在出版物Mufarrege等人，Clin Immunol.2017年3月；176:31-41的图2中发现。

实施例4：本发明的抗体与Chiome抗体之间的结合亲和力的比较

出于比较目的，发明人已开发出针对于公开在WO2014123186(ChiomeBioscience)中的抗Sema3A的人源化抗体，其具有以下特征：

-重链，其如以WO2014123186中的SEQ ID NO:11所示，及

-轻链，其如以WO2014123186中的SEQ ID NO:12所示。

本发明者已开发出2种形式的此抗体：

-一种基于IgG1KO Fc上格式化，在下文中称为“Chiome抗体A”及

-一种基于IgG1KO-FcRn空上格式化，在下文中称为“Chiome抗体B”。

根据BioRad制造商手册，在GLM芯片(BioRad)之上经由在6个水平通道上的直接胺偶联固定高表面密度的抗人Fab抗体(GE Healthcare)。

在6个垂直通道中的5个上在动力学结合测定的最小表面密度下在抗人类Fab抗体表面上捕获本发明抗体(克隆I)及Chiome抗体。在PBS-T-EDTA缓冲液(BioRad)中以100、50、25、12.5、10、6.25、5、2.5、1.25、0.625及0nM的浓度下制备人Sema3A。PBS-T-EDTA缓冲注射液用作双重参考用于动力学数据分析。将人Sema3A溶液及PBS-T-EDTA缓冲液中的每一者以40μL/min的流速在6个水平通道上同时注射10分钟，随后2小时解离期。通过以100μL/min的流速进行18秒的10mM pH 2.1甘氨酸HCl(GE Healthcare)注射而再生表面随后以25μL/min的流速注射PBS-T-EDTA 60秒。将结合感应图拟合至1:1朗谬尔模型以计算结合速率、解离速率及亲和力。

本发明抗体及Chiome抗体结合至人Sema3A的动力学及亲和力数据列于下表9中。

表9：

结论

结果表明，与在WO2014123186(Chiome Bioscience)中公开的现有技术抗体相比，本发明的抗体经证明对人Sema3A具有优异结合亲和力。

实施例5：本发明的抗体与Samsung scFv之间的结合亲和力的比较

已对如WO2017074013(Samsung)中公开的scFv片段进行比较。

出于比较的目的，发明人已开发3种公开的scFv片段(“Samsung scFv”)，其具有下表10中公开的特征。

表10：

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根据BioRad制造商手册，在GLM芯片(BioRad)上在6个水平通道上经由直接胺偶联固定高表面密度的抗-His抗体(GE Healthcare)。在6个垂直通道中的5个通道上在最小表面密度下在抗-His抗体表面上捕获Samsung scFv抗体用于动力学结合测定。在PBS-T-EDTA缓冲液(BioRad)中以100、50、25、12.5、10、6.25、5、2.5、1.25、0.625及0nM的浓度制备人Sema3A。PBS-T-EDTA缓冲注射液用作双重参考用于动力学数据分析。将人Sema3A溶液中的每一者及PBS-T-EDTA缓冲液以40μL/min的流速在6个水平通道上同时注射10分钟，随后1小时解离期。通过以100μL/min的流速进行18秒的10mM pH 2.1甘氨酸HCl(GE Healthcare)注射而再生表面，随后以25μL/min的流速注射PBS-T-EDTA 60秒。将结合感应图拟合至1:1朗谬尔模型以计算结合速率、解离速率及亲和力。

本发明的抗体对人Sema3A(克隆I)的结合使用类似方法进行，但使用山羊抗-人IgG(Invitrogen)以捕获本发明的抗体。本发明的抗体及Samsung ScFv对食蟹猕猴、小鼠、大鼠或兔Sema3A的结合也使用相同方法进行。

本发明抗体及Samsung scFv的动力学及亲和力数据列于下表11中。

表11：

结论

本发明抗体对人、食蟹猕猴、小鼠或兔Sema3A的结合亲和力高于如WO2017074013中公开的3种Samsung scFv。

序列表

<110> 勃林格殷格翰国际有限公司

<120> 抗-SEMA3A抗体及其用于治疗视网膜血栓栓塞性疾病的用途

<130> 01-3450

<150> EP20203645.5

<151> 2020-10-23

<160> 22

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR1

<400> 1

Ser Tyr Tyr Met Ser

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR2

<400> 2

Thr Ile Ile Lys Ser Gly Gly Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HCDR3

<400> 3

Gly Gly Gln Gly Ala Met Asp Tyr

1 5

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR1

<400> 4

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asp Tyr Leu His

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR2

<400> 5

Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> LCDR3

<400> 6

Gln Gln Gly Tyr Ser Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 7

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH - 变体1

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ile Lys Ser Gly Gly Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gly Gly Gln Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH – 变体2

<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ile Lys Ser Gly Gly Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gly Gly Gln Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH – 变体3

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Leu Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ile Lys Ser Gly Gly Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Gly Gln Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH- 变体4

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Leu Gln Leu Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ile Lys Ser Gly Gly Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Lys Gly Gly Gln Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL - 变体a

<400> 11

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 12

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL – 变体b

<400> 12

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 13

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL- 变体c

<400> 13

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 14

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链- 克隆I

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ile Lys Ser Gly Gly Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gly Gly Gln Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

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Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 15

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链- 克隆I

<400> 15

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 16

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 - 克隆II

<400> 16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ile Lys Ser Gly Gly Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Gly Gly Gln Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

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130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

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Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

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Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

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Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

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<210> 17

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链 - 克隆III

<400> 17

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Leu Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Ser Thr Ile Ile Lys Ser Gly Gly Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Val Lys Gly Gly Gln Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

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Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

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Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

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385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 18

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链– 克隆III

<400> 18

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 19

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重链- 克隆IV

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Leu Gln Leu Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

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Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

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Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 20

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链– 克隆IV

<400> 20

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asp Tyr

20 25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 21

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 表位

<400> 21

Asp Ser Thr Lys Asp Leu Pro Asp Asp Val Ile Thr Phe

1 5 10

<210> 22

<211> 751

<212> PRT

<213> 智人

<400> 22

Asn Tyr Gln Asn Gly Lys Asn Asn Val Pro Arg Leu Lys Leu Ser Tyr

1 5 10 15

Lys Glu Met Leu Glu Ser Asn Asn Val Ile Thr Phe Asn Gly Leu Ala

20 25 30

Asn Ser Ser Ser Tyr His Thr Phe Leu Leu Asp Glu Glu Arg Ser Arg

35 40 45

Leu Tyr Val Gly Ala Lys Asp His Ile Phe Ser Phe Asp Leu Val Asn

50 55 60

Ile Lys Asp Phe Gln Lys Ile Val Trp Pro Val Ser Tyr Thr Arg Arg

65 70 75 80

Asp Glu Cys Lys Trp Ala Gly Lys Asp Ile Leu Lys Glu Cys Ala Asn

85 90 95

Phe Ile Lys Val Leu Lys Ala Tyr Asn Gln Thr His Leu Tyr Ala Cys

100 105 110

Gly Thr Gly Ala Phe His Pro Ile Cys Thr Tyr Ile Glu Ile Gly His

115 120 125

His Pro Glu Asp Asn Ile Phe Lys Leu Glu Asn Ser His Phe Glu Asn

130 135 140

Gly Arg Gly Lys Ser Pro Tyr Asp Pro Lys Leu Leu Thr Ala Ser Leu

145 150 155 160

Leu Ile Asp Gly Glu Leu Tyr Ser Gly Thr Ala Ala Asp Phe Met Gly

165 170 175

Arg Asp Phe Ala Ile Phe Arg Thr Leu Gly His His His Pro Ile Arg

180 185 190

Thr Glu Gln His Asp Ser Arg Trp Leu Asn Asp Pro Lys Phe Ile Ser

195 200 205

Ala His Leu Ile Ser Glu Ser Asp Asn Pro Glu Asp Asp Lys Val Tyr

210 215 220

Phe Phe Phe Arg Glu Asn Ala Ile Asp Gly Glu His Ser Gly Lys Ala

225 230 235 240

Thr His Ala Arg Ile Gly Gln Ile Cys Lys Asn Asp Phe Gly Gly His

245 250 255

Arg Ser Leu Val Asn Lys Trp Thr Thr Phe Leu Lys Ala Arg Leu Ile

260 265 270

Cys Ser Val Pro Gly Pro Asn Gly Ile Asp Thr His Phe Asp Glu Leu

275 280 285

Gln Asp Val Phe Leu Met Asn Phe Lys Asp Pro Lys Asn Pro Val Val

290 295 300

Tyr Gly Val Phe Thr Thr Ser Ser Asn Ile Phe Lys Gly Ser Ala Val

305 310 315 320

Cys Met Tyr Ser Met Ser Asp Val Arg Arg Val Phe Leu Gly Pro Tyr

325 330 335

Ala His Arg Asp Gly Pro Asn Tyr Gln Trp Val Pro Tyr Gln Gly Arg

340 345 350

Val Pro Tyr Pro Arg Pro Gly Thr Cys Pro Ser Lys Thr Phe Gly Gly

355 360 365

Phe Asp Ser Thr Lys Asp Leu Pro Asp Asp Val Ile Thr Phe Ala Arg

370 375 380

Ser His Pro Ala Met Tyr Asn Pro Val Phe Pro Met Asn Asn Arg Pro

385 390 395 400

Ile Val Ile Lys Thr Asp Val Asn Tyr Gln Phe Thr Gln Ile Val Val

405 410 415

Asp Arg Val Asp Ala Glu Asp Gly Gln Tyr Asp Val Met Phe Ile Gly

420 425 430

Thr Asp Val Gly Thr Val Leu Lys Val Val Ser Ile Pro Lys Glu Thr

435 440 445

Trp Tyr Asp Leu Glu Glu Val Leu Leu Glu Glu Met Thr Val Phe Arg

450 455 460

Glu Pro Thr Ala Ile Ser Ala Met Glu Leu Ser Thr Lys Gln Gln Gln

465 470 475 480

Leu Tyr Ile Gly Ser Thr Ala Gly Val Ala Gln Leu Pro Leu His Arg

485 490 495

Cys Asp Ile Tyr Gly Lys Ala Cys Ala Glu Cys Cys Leu Ala Arg Asp

500 505 510

Pro Tyr Cys Ala Trp Asp Gly Ser Ala Cys Ser Arg Tyr Phe Pro Thr

515 520 525

Ala Lys Arg Arg Thr Arg Arg Gln Asp Ile Arg Asn Gly Asp Pro Leu

530 535 540

Thr His Cys Ser Asp Leu His His Asp Asn His His Gly His Ser Pro

545 550 555 560

Glu Glu Arg Ile Ile Tyr Gly Val Glu Asn Ser Ser Thr Phe Leu Glu

565 570 575

Cys Ser Pro Lys Ser Gln Arg Ala Leu Val Tyr Trp Gln Phe Gln Arg

580 585 590

Arg Asn Glu Glu Arg Lys Glu Glu Ile Arg Val Asp Asp His Ile Ile

595 600 605

Arg Thr Asp Gln Gly Leu Leu Leu Arg Ser Leu Gln Gln Lys Asp Ser

610 615 620

Gly Asn Tyr Leu Cys His Ala Val Glu His Gly Phe Ile Gln Thr Leu

625 630 635 640

Leu Lys Val Thr Leu Glu Val Ile Asp Thr Glu His Leu Glu Glu Leu

645 650 655

Leu His Lys Asp Asp Asp Gly Asp Gly Ser Lys Thr Lys Glu Met Ser

660 665 670

Asn Ser Met Thr Pro Ser Gln Lys Val Trp Tyr Arg Asp Phe Met Gln

675 680 685

Leu Ile Asn His Pro Asn Leu Asn Thr Met Asp Glu Phe Cys Glu Gln

690 695 700

Val Trp Lys Arg Asp Arg Lys Gln Arg Arg Gln Arg Pro Gly His Thr

705 710 715 720

Pro Gly Asn Ser Asn Lys Trp Lys His Leu Gln Glu Asn Lys Lys Gly

725 730 735

Arg Asn Arg Arg Thr His Glu Phe Glu Arg Ala Pro Arg Ser Val

740 745 750

Claims (15)

1.一种供使用用于治疗视网膜血栓栓塞性疾病的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段包含：

-重链可变区，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:2的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:3的氨基酸序列(H-CDR3)；及

-轻链可变区，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ ID NO:5的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:6的氨基酸序列(L-CDR3)。

2.如权利要求1的供使用的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

-重链可变区，其包含与氨基酸序列SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:10至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列；及

-轻链可变区，其包含与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:

13的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。

3.如权利要求1的供使用的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

-重链可变区，其包含与氨基酸序列SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ IDNO:10至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列；及

-轻链可变区，其包含与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:

13所示的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列；

其中：

-该重链可变区包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列(H-CDR1)；SEQ ID NO:2的氨基酸序列(H-CDR2)；及SEQ ID NO:3的氨基酸序列(H-CDR3)；及

-该轻链可变区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(L-CDR1)；SEQ IDNO:5的氨基酸序列(L-CDR2)；及SEQ ID NO:6的氨基酸序列(L-CDR3)。

4.如权利要求1的供使用的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

-重链可变区，其包含SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列及

-轻链可变区，其包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的氨基酸序列。

5.如权利要求1的供使用的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

a.可变重链和可变轻链，其分别包含SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:11的氨基酸序列；

b.可变重链和可变轻链，其分别包含SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:11的氨基酸序列；

c.可变重链和可变轻链，其分别包含SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:12的氨基酸序列；或

d.可变重链和可变轻链，其分别包含SEQ ID NO:10及SEQ ID NO:13的氨基酸序列。

6.如权利要求1的供使用的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

-重链，其包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17或SEQID NO:19的氨基酸序列，优选地由其组成；及

-轻链，其包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列，优选地由其组成。

7.如权利要求1的供使用的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：

a.包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链；

b.包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的轻链；

c.包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链；或

d.包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链及包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链。

8.如权利要求1至7中任一项的供使用的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，所述视网膜血栓栓塞性疾病选自由以下组成的组：视网膜静脉阻塞(RVO)，包括视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、半球视网膜静脉阻塞(HRVO)、分支视网膜静脉阻塞(BRVO)，以及视网膜动脉闭塞性疾病。

9.一种供使用用于治疗视网膜血栓栓塞性疾病的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段结合至如以SEQ ID NO:22所示的人Sema3A的氨基酸区370至382内的至少一个氨基酸残基。

10.如权利要求8的供使用的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段结合至SEQ ID NO:21。

11.如权利要求1至10中任一项的供使用的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其供通过促进缺血性视网膜内的血管再生(血管再形成)及通过预防眼睛玻璃体区域的病理性新血管生成在罹患糖尿病性黄斑缺血的患者中使用。

12.如权利要求1至10中任一项的供使用的抗-Sema3A抗体或其抗原结合片段，其供通过减少血液视网膜屏障的渗透性在罹患糖尿病性黄斑水肿的患者中使用。

13.一种药物组合物，其包含如权利要求1至12中任一项的抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载剂，所述药物组合物供使用用于治疗视网膜血栓栓塞性疾病，该视网膜血栓栓塞性疾病选自由视网膜的视网膜中央静脉阻塞(CRVO)、分支视网膜静脉阻塞(BRVO)及动脉阻塞性疾病组成的组。

14.如权利要求1至12中任一项的供使用的抗体或其抗原结合片段或如权利要求13的供使用的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段通过肠胃外途径、静脉内途径、玻璃体内途径或皮下途径施用。

15.如权利要求1至12中任一项的抗体或其抗原结合片段或如权利要求13的供使用的药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合片段通过玻璃体内途径施用。

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