CN116964088A - 用于治疗肺动脉高压（pah）的抗pdgf-b抗体和使用方法 - Google Patents

用于治疗肺动脉高压（pah）的抗pdgf-b抗体和使用方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供了抗血小板衍生生长因子亚基B(PDGF‑B)抗体以及其抗原结合片段，以及使用此类抗体或其抗原结合片段治疗患有肺动脉高压(PAH)的受试者的方法。

Description

用于治疗肺动脉高压(PAH)的抗PDGF-B抗体和使用方法
相关申请
本申请要求于2021年1月25日提交的美国临时申请第63/141,030号的优先权，所述美国临时申请的全部内容通过引用整体明确并入本文。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且特此通过引用整体并入。创建于2022年1月20日的所述ASCII副本命名为118003-00720_SL.txt并且大小为33,624字节。
技术领域
本发明涉及与血小板衍生生长因子亚基B(PDGF-B)特异性结合的人抗体以及其抗原结合片段，并且涉及使用此类抗体和片段的治疗性和诊断性方法。
背景技术
血小板衍生生长因子(PDGF)是以五种不同二聚构型存在的有效丝裂原，所述五种不同二聚构型由四种不同同种型亚基构成：A、B、C和D。PDGF的五种二聚形式是AA、BB、AB、CC和DD，所述二聚形式通过对应单个PDGF单体的二硫连接而形成。PDGF配体通过与PDGF受体(PDGFR)的相互作用而发挥其生物效应。PDGFR是由α(a)受体链(PDGFR-α)和/或β(beta)受体链(PDGF-B)的异源二聚体或同源二聚体缔合构成的单程跨膜酪氨酸激酶受体。因此，活性PDGFR可以由αα、ββ或αβ受体链对组成。PDGFR共享共同的结构域结构，包含五个胞外免疫球蛋白(Ig)环、跨膜结构域和分裂的胞内酪氨酸激酶(TK)结构域。二聚PDGF配体与PDGFR之间的相互作用导致受体链二聚化、受体自磷酸化以及胞内信号转导。已证实在体外，ββ受体由PDGF-BB和-DD活化，而αβ受体由PDGF-BB、-CC、-DD和-AB活化，并且αα受体由PDGF-AA、-BB、-CC和-AB活化(参见Andrae等人(2008)《基因与发育(Genes Dev)》22(10):1276-1312)。
PDGF信号传导已涉及各种人疾病，包含肺动脉高压(PAH)。肺动脉高压(PAH)是以肺动脉压的持续升高为特征的进行性病症，这损伤大肺动脉和小肺动脉两者。PAH在血液动力学上定义为肺动脉收缩压大于30mm Hg，或评估平均肺动脉压大于25mm Hg，并且肺毛细血管或左心房压等于或小于15mm Hg。参见例如Zaiman等人,《美国呼吸细胞分子生物学杂志(Am.J.Respir.Cell MoI.Biol.)》33:425-31(2005)。PAH中的持续性血管收缩导致结构重塑，在此期间，肺血管平滑肌细胞和内皮细胞经历从收缩性正常表型到合成表型的表型转换，从而导致细胞生长和基质沉积。随着最小血管壁增厚，其在血液和肺部之间正常转移氧气和二氧化碳的能力降低，并且一段时间后，肺高压导致肺动脉增厚以及血液流经的通路变窄。最终，血管平滑肌和内皮细胞的增殖导致血管重塑，并且肺血管的管腔闭塞。来自肺高压患者的组织样品的组织学检查显示内膜增厚，以及平滑肌细胞肥大，特别是那些直径<100μm的血管。这导致肺压逐渐升高，因为血液通过减少的管腔区域进行泵送。因此，心脏的右侧更努力地运行以代偿，并且增加的努力导致右心室增大并增厚。增大的右心室使人处于肺栓塞的风险，因为血液往往会聚集在心室中和腿部中。如果在汇集的血液中形成血块，那么所述血块最终可能会移动并停留在肺部。最终，在右心室上施加的另外的工作量导致心脏衰竭并导致这些患者过早死亡。
用于治疗患有PAH的受试者的标准疗法主要是影响血管张力的血液动力学，并且包含例如，前列环素类似物、内皮素受体拮抗剂、磷酸二酯酶抑制剂和可溶性鸟苷酸环化酶活化剂/刺激剂，这提供症状缓解并改善预后。然而，这些疗法未能达到预期并且不能重建肺脉管系统的结构和功能完整性，以向患有PAH的患者提供无残疾的长期生存期。
尽管PAH的疗法取得了进展，但尚未达到治愈这种致命疾病的前景，并且大多数患者继续进展为右心室衰竭。因此，本领域需要新型、高度特异性并且有效的PDGF信号传导的抑制剂。
发明内容
本公开提供了与血小板衍生生长因子亚基B(PDGF-B)特异性结合的全人单克隆抗体(mAb)及其抗原结合片段。此类抗体可用于治疗患有肺动脉高压(PAH)的受试者。
在显示特发性PAH的患者和缺氧/sugen PAH小鼠模型两者中，PDGF-B，即肺平滑肌细胞和成纤维细胞的有效丝裂原的循环和肺部表达均增加。PDGF-B与PDGFRββ、PDGFRαβ和PDGFRαα的相互作用已涉及促进病理血管形成和肺血管重塑。因此，靶向PDGF-B可以由通过被协调以促进异常血管重塑的PDGFRαα、PDGFRαβ和PDGFRββ靶向信号传导来提供超越PDGFRβ的增强功效。
因此，一方面，本公开提供了一种分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段与人血小板衍生生长因子亚基B(PDGF-B)特异性结合。
在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段表现出一种或多种选自由以下组成的组的特性：(a)在37℃下以小于约1.84pM的结合解离平衡常数(KD)与人PDGF亚基B同源二聚体(PDGF-BB)结合，如通过表面等离子体共振所测量的；(b)在37℃下以小于约1.36pM的KD与人PDGF-BB结合，如通过表面等离子体共振所测量的；(c)在37℃下以大于或等于约1155分钟的t1/2与人PDGF-BB结合，如通过表面等离子体共振所测量的；(d)在25℃下以小于约2.79pM的KD与人PDGF-BB结合，如通过表面等离子体共振所测量的；(e)在25℃下以大于或等于约1155分钟的t1/2与人PDGF-BB结合，如通过表面等离子体共振所测量的；(f)在25℃下以小于约1.9nM的IC50抑制PDGF-B对人PDGF-BB的活化，如在竞争ELISA测定中所测量的；(g)在25℃下以小于约8.8nM的IC50抑制PDGF-B对人PDGF亚基A和亚基B异源二聚体(PDGF-AB)的活化，如在竞争ELISA测定中所测量的；以及(h)阻断人PDGF-BB与人PDGFR-αα、PDGFR-αβ和PDGFR-ββ中的一种或多种之间的相互作用。
在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段包括：在选自由以下组成的组的重链可变区(HCVR)序列中的任一个内包含的三个重链互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)：SEQ ID NO:2和22；以及在选自由以下组成的组的轻链可变区(LCVR)序列中的任一个内包含的三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)：SEQ ID NO:10和30。
在一些实施例中，所述分离的人抗体或其抗原结合片段包括HCVR，所述HCVR包括与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:22的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段包括LCVR，所述LCVR包括与SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:30的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段包括：(a)HCVR，所述HCVR包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2和22；以及(b)LCVR，所述LCVR包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:10和30。
在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段包括：(a)HCDR1结构域，所述HCDR1结构域包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:4和24；(b)HCDR2结构域，所述HCDR2结构域包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6和26；(c)HCDR3结构域，所述HCDR3结构域包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:8和28；(d)LCDR1结构域，所述LCDR1结构域包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:12和32；(e)LCDR2结构域，所述LCDR2结构域包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:14和34；和/或(f)LCDR3结构域，所述LCDR3结构域包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQID NO:16和36。
在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段包括选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO:2/10和22/30。
在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段包括：(i)包括SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列的轻链免疫球蛋白，以及包括SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列的重链免疫球蛋白；和/或(ii)包括SEQ ID NO:40中所示的氨基酸序列的轻链免疫球蛋白，以及包括SEQID NO:38中所示的氨基酸序列的重链免疫球蛋白。
在一些实施例中，所述抗原结合片段是Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、单链Fv(scFv)分子或dAb片段。
另一方面，本公开提供了与包括以下的抗体或抗原结合片段结合人PDGF-B上的同一表位的分离的抗体或其抗原结合片段：在选自由以下组成的组的重链可变区(HCVR)序列中的任一个内包含的三个重链互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)：SEQ ID NO:2和22；以及在选自由以下组成的组的轻链可变区(LCVR)序列中的任一个内包含的三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)：SEQ ID NO:10和30。
另一方面，本公开提供了与包括以下的抗体或抗原结合片段竞争与人PDGF-B结合的分离的抗体或其抗原结合片段：在选自由以下组成的组的重链可变区(HCVR)序列中的任一个内包含的三个重链互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)：SEQ ID NO:2和22；以及在选自由以下组成的组的轻链可变区(LCVR)序列中的任一个内包含的三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)：SEQ ID NO:10和30。
另一方面，本发明提供了编码抗PDGF抗体或其片段的核酸分子。携带本发明的核酸的重组表达载体和引入了此类载体的宿主细胞也涵盖在本发明中，通过在允许产生抗体的条件下培养宿主细胞并回收产生的抗体来产生抗体的方法也是如此。
另一方面，本公开提供了一种用于制备本文所公开的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括：(i)将一个或多个编码所述抗体或片段的轻免疫球蛋白链和所述抗体或片段的重免疫球蛋白链的多核苷酸引入到宿主细胞中；(ii)在有利于表达所述多核苷酸的条件下在生长培养基中培养所述宿主细胞；以及(iii)任选地从所述宿主细胞和/或所述宿主细胞生长的培养基中分离所述抗体或片段。
另一方面，本公开提供了一种通过所述方法产生的抗体或抗原结合片段，所述方法包括：(i)将一个或多个编码所述抗体或片段的轻免疫球蛋白链和所述抗体或片段的重免疫球蛋白链的多核苷酸引入到宿主细胞中；(ii)在有利于表达所述多核苷酸的条件下在生长培养基中培养所述宿主细胞；以及(iii)任选地从所述宿主细胞和/或所述宿主细胞生长的培养基中分离所述抗体或片段。
在一些实施例中，所述抗体或抗原结合片段包括：在选自由以下组成的组的重链可变区(HCVR)序列中的任一个内包含的三个重链互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)：SEQ ID NO:2和22；以及在选自由以下组成的组的轻链可变区(LCVR)序列中的任一个内包含的三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)：SEQ ID NO:10和30。
另一方面，本公开提供了一种注射装置或容器，其包括本文所公开的抗体或抗原结合片段。
另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包括：与人PDGF-B结合的如上所述或本文所公开的分离的人抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体或稀释剂；以及任选地一种或多种另外的治疗剂。
在一些实施例中，所述一种或多种另外的治疗剂包括铁补充剂。
另一方面，本公开提供了一种用于预防或治疗有需要的患者的肺动脉高压(PAH)的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的与人PDGF-B结合的如本文所公开的抗体或其抗原结合片段；或包括与人PDGF-B结合的如本文所公开的分离的人抗体或其抗原结合片段的药物组合物。
在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段皮下、静脉内、皮内、口服或肌内施用。
在一些实施例中，所述PAH产生选自由以下组成的组的病状：受试者的肺动脉增厚；受试者的每搏输出量减少；受试者的右心室心输出量减少；以及受试者的生存时间减少；并且所述抗体或抗原结合片段的施用治疗所述病状或减轻所述病状的一种或多种症状的严重程度。
另一方面，本公开提供了一种与人PDGF-B结合的如本文所公开的抗体或其抗原结合片段，其用于治疗患有PAH的患者。
另一方面，本公开提供了一种用于治疗PAH的组合物，所述组合物包括一种或多种与人PDGF-B结合的如本文所公开的抗体或抗原结合片段。
另一方面，本公开提供了一种与人PDGF-B结合的如本文所公开的分离的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗患有PAH的患者的药物中的用途。
在一些实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合片段能够中和PDGF-BB、PDGF-AB和/或PDGF-AB/BB，并防止细胞中的PDGF驱动的钙通量。在一些实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合片段能够中和PDGF-BB，并防止细胞中的PDGF驱动的钙通量。在一些实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合片段能够中和PDGF-AB，并防止细胞中的PDGF驱动的钙通量。在一些实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合片段能够中和PDGF-AB/BB，并防止细胞中的PDGF驱动的钙通量。
在一些实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合片段能够中和PDGF-BB、PDGF-AB和/或PDGF-AB/BB，并防止PDGF驱动的细胞增殖。在一些实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合片段能够中和PDGF-BB，并防止PDGF驱动的细胞增殖。在一些实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合片段能够中和PDGF-AB，并防止PDGF驱动的细胞增殖。在一些实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合片段能够中和PDGF-AB/BB，并防止PDGF驱动的细胞增殖。
在一些实施例中，所述细胞是人细胞。在一些实施例中，所述细胞选自由肺动脉平滑肌细胞和原代人肺成纤维细胞组成的组。
在一些实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合片段与PDGF-BB的β片区的外边缘结合。在一些实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合片段与PDGF-BB的链间环结合。在一些实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合片段与PDGF-BB的β片区的外边缘和链间环结合。在一些实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合片段与选自由W40、R73、K80、K81、P82、F84、K86和R56组成的组的PDGF-BB的一个或多个残基结合。在一些实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合片段与PDGF-BB的W40残基结合。在一些实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合片段与PDGF-BB的R73残基结合。在一些实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合片段与PDGF-BB的K80残基结合。在一些实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合片段与PDGF-BB的K81残基结合。在一些实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合片段与PDGF-BB的P82残基结合。在一些实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合片段与PDGF-BB的F84残基结合。在一些实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合片段与PDGF-BB的K86残基结合。在一些实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合片段与PDGF-BB的R56残基结合。
在一些实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合片段通过PDGF受体以配体依赖性方式内化到细胞中。在一些实施例中，所述细胞是人细胞。在一些实施例中，所述细胞选自由肺动脉平滑肌细胞和原代人肺成纤维细胞组成的组。
在一些实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合片段能够降低有需要的受试者的右心室收缩压。在一些实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合片段能够降低有需要的受试者的右心室肥大。在一些实施例中，本文所述的抗体或其抗原结合片段能够降低有需要的受试者的右心室收缩压和右心室肥大。
通过阅读随后的具体实施方式，其它实施例将变得显而易见。
附图说明
图1是描绘来自VI-3小鼠的单克隆抗PDGF抗体的筛选结果的图表。
图2是描绘用于在25℃和37℃下确定17种抗PDGF-B抗体的结合动力学而执行的研究的示意图。
图3A是描绘纯化的抗PDGF-BB单克隆抗体之间的交叉竞争研究的示意图。
图3B是显示抗体交叉竞争测定的结果的矩阵，其中将第一个抗PDGF-B抗体(mAb-1)施加到人PDGF-BB涂覆的传感器尖端，然后用第二个抗PDGF-B抗体(mAb-2)进行处理。描绘了所测试的每种抗体组合的结合应答。
图4A-4B是描绘被鉴定出阻断了>70％的5种强抗PDGF-B抗体的图表；3种抗PDGF-B抗体阻断了PDGF-BB和PDGF-AB两者，并且用于PDGF-BB的IC50值的范围为0.23-1.8nM；2种抗PDGF-B抗体仅阻断了PDGF-BB，并且IC50值的范围为0.55-0.64nM；6种中度抗PDGF-B抗体阻断了>45％；2种抗PDGF-B抗体阻断了PDGF-BB和PDGF-AB两者，并且用于PDGF-BB的IC50值的范围为2.8-13nM；4种抗PDGF-B抗体仅阻断了PDGF-BB，并且IC50值的范围为0.64-2.8nM；并且6种抗PDGF-B抗体为非阻断剂。图4C是汇总了抗PDGF-B抗体在阻断具有可溶性PDGF-BB和PDGF-AB以及板捕获PDGFR-β的ELISA中的特征的表格。
图5A是描绘了17种抗hPDGF-B抗体中有13种以88pM–7.2nM的IC50值和42–99％的最大抑制率抑制500pM的hPDGF BB的图表。此外，如图5B中所描绘的是描绘了被人PDGF-BB活化的两种抗PDGF-B抗体的图表。图5C是描绘了17种抗hPDGF-B抗体中有8种以99pM–>50nM的IC50值和32–99％的最大抑制率抑制5nM的人PDGF-AB的图表。H4H13132P和H4H13145P以8.8和2.6nM的IC50值阻断到基线。最后，图5D是描绘了17种抗hPDGF-B抗体中有10种以450pM–6.4nM的IC50值和39–98％的最大抑制率抑制600pM的小鼠PDGF-BB的图表。
图6A、6B和6C是描绘来自形成最明显的2:2mAb:人-PDGF-BB物种的样品的色谱图的图表，未观察到可检测到的高阶复合物。
图7是描绘了H4H13145P比H4H13132P对人和食蟹猴PDGF-BB蛋白更有效的图表。
图8是描绘商业性猴PDGF-BB显示出与抗PDGF-B mAbs H4H13132P和H4H13145P的特异性结合的表格。
图9描绘了抗体结合表位的蛋白质印迹分析，所述分析证实了H4H13145P与人rPDGF-BB的线性表位结合。
图10是描绘了与抗PDGFR-β相比，抗PDGF-B在PAH的两个临床相关终点(右心室压和肥大)中具有较优的功效的一组图表。
图11是描绘了用抗PDGF-B进行预防性治疗降低了PAH的此大鼠模型中的血液动力学终点(RVSP)和右心室肥大两者的一组图表。
图12是描绘了抗PDGF-B稳健地改善了PAH的严重MCT大鼠模型中的生存时间的一组图表。
图13A是描绘了以1mg/kg皮下的低剂量的抗PDGF-B对PAH的临床相关终点(右心室压)具有功效的一组图表。
图13B是描绘了抗PDGF-B抗体施用后第42天Hy/Su小鼠中循环的PDGF-B水平和抗PDGF-B浓度的一组图表。
图14是描绘了虽然抗PDGF-Rβ抗体(2C5，REGN764)的全身递送有效地耗尽了周细胞，但抗PDGF-BB抗体在以3mg/kg的视网膜血管发育(RVD)模型中没有明显的影响的周细胞的一组图像。
图15是描绘了较高剂量(25mg/kg)的H4H13145P对RVD模型中的周细胞耗竭具有中等影响的周细胞的一组图像。
图16是描绘了抗PDFG-B抗体在以0.1、1或10mg/kg的三次单个皮下剂量的C57BL/6野生型小鼠中的药代动力学特征的一组图表以及表格。
图17是描绘了评价用高剂量的抗PDGF-B抗体长期处理健康C57BL成年小鼠对胃肠道(GI)、肺或脑血管高通透性的影响的研究设计的示意图。
图18是描绘了抗PDGF-B和抗PDGFRβ抗体的给药没有显著干扰动物体重增加的一组图表。
图19是描绘了在健康小鼠中用同种型对照IgG、抗PDGF-B和抗PDGFRβ抗体处理后，小肠中的胃肠道(GI)体液潴留/水肿没有明显变化的图表。
图20是描绘了通过在小鼠中抗PDGF-B和抗PDGFRβ抗体的处理，小肠中的血管通透性没有明显变化的一组图表和图像。
图21是描绘了通过在健康和用卡托普利(Captopril)处理的小鼠中抗PDGF-B和抗PDGFRβ抗体的处理，胃中的GI体液潴留/水肿没有明显变化的图表。
图22是描绘了通过在小鼠中抗PDGF-B和抗PDGFRβ抗体的处理，胃中的血管通透性没有明显变化的一组图表和图像。
图23是描绘了通过在健康和用卡托普利处理的小鼠中抗PDGF-B和抗PDGFRβ抗体的处理，肺中的GI体液潴留/水肿没有明显变化的图表。
图24是描绘了通过在健康和用卡托普利处理的小鼠中抗PDGF-B和抗PDGFRβ抗体的处理，肺中的血管通透性没有明显变化的一组图表和图像。
图25是描绘了通过在健康和用卡托普利处理的小鼠中抗PDGF-B和抗PDGFRβ抗体的处理，脑中的GI体液潴留/水肿没有明显变化的图表。
图26是描绘了通过在健康和用卡托普利处理的小鼠中抗PDGF-B和抗PDGFRβ抗体的处理，脑中的血管通透性没有明显变化的一组图表和图像。
图27是描绘了通过抗PDGF-B抗体对人肺动脉平滑肌细胞(HPASMC)中PDGF诱导的钙通量的抑制的一组图表。
图28是描绘了通过抗PDGF-B抗体对人肺动脉平滑肌细胞(HPASMC)中PDGF诱导的细胞增殖的抑制的一组图表。
图29是描绘了用抗PDGF-B抗体-配体复合物预处理的肺动脉平滑肌细胞(PASMC)中的荧光成像读板器(FLIPR)受体内化测定的一组图表。
图30是描绘了在用野百合碱进行处理的大鼠中进行的心脏右心室压的基于导管的评估的研究的图表，所述研究证实与同种型对照处理的大鼠相比，抗PDGF-B抗体处理降低了右心室收缩压。
图31是描绘了与同种型对照处理的大鼠相比，用抗PDGF-B抗体进行预防性治疗减少右心室肥大的图表。
图32是描绘了与用抗PDGF-B抗体进行的单一疗法相比，内皮素受体拮抗剂马西替坦(Macitentan)与抗PDGF-B处理的组合没有显示出另外的存活益处的图表。
具体实施方式
在描述本发明的方法之前，应当理解本发明不限于所描述的具体方法和实验条件，因为此类方法和条件可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述具体实施例的目的，而不旨在是限制性的，因为本发明的范围仅受所附权利要求限制。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用类似于或等同于本文所描述的方法和材料的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。本文所提到的所有出版物通过引用整体并入本文。
定义
术语“PDGF-B”、“PDGFB”和“血小板衍生生长因子B”可互换地指代具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的人PDGF-B蛋白(还参见UniProt登录号P01127)。本文对蛋白质、多肽和蛋白质片段的所有提及旨在指代相应蛋白质、多肽或蛋白质片段的人形式，除非明确指出其来自非人物种(例如，“小鼠PDGF-B”、“猴PDGF-B”等)。在显示特发性PAH的患者和缺氧/sugen PAH小鼠模型两者中，PDGF-B，即肺平滑肌细胞和成纤维细胞的有效丝裂原的循环和肺部表达均增加。PDGF-B与PDGFRββ、PDGFRαβ和PDGFRαα的相互作用已涉及促进病理血管形成和肺血管重塑。机械地，靶向PDGF-B可以由通过协调以促进异常血管重塑的PDGFRαα、PDGFRαβ和PDGFRββ靶向信号传导来提供超越PDGFRβ的增强功效。
如本文所使用的，术语“抗体”旨在指免疫球蛋白分子，其包含四个多肽链、通过二硫键互连的两个重(H)链和两个轻(L)链(即，“全抗体分子”)以及其多聚体(例如，IgM)或其抗原结合片段。每个重链包含重链可变区(“HCVR”或“VH”)和重链恒定区(包含结构域CH1、CH2和CH3)。每个轻链包含轻链可变区(“LCVR”或“VL”)和轻链恒定区(CL)。VH和VL区可以被进一步细分成高变区，被称为互补决定区(CDR)，散布着更为保守的区，被称为框架区(FR)。每个VH和VL由按以下顺序从氨基末端到羧基末端布置的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在某些实施例中，抗体(或其抗原结合片段)的FR可以与人种系序列相同，或者可以是天然的或经人工修饰的。可以基于两个或更多个CDR的并列分析来定义氨基酸共有序列。
一个或多个CDR残基的取代或一个或多个CDR的省略也是可能的。在科学文献中已经描述了抗体，其中可以省去一个或两个CDR来进行结合。Padlan等人(《美国实验生物学联合会会刊(FASEB J.)》1995,9:133-139)基于已发表的晶体结构分析了抗体与其抗原之间的接触区域，并得出结论，只有大约五分之一到三分之一的CDR残基实际上与抗原接触。Padlan还发现了许多抗体，其中一个或两个CDR没有与抗原接触的氨基酸(还参见Vajdos等人2002《分子生物学杂志(J Mol Biol)》320:415-428)。
不接触抗原的CDR残基可以根据先前的研究通过分子建模和/或经验鉴定。如果省略CDR或其残基，则通常用占据另一个人抗体序列或此类序列的共识中的对应位置的氨基酸进行取代。也可以凭经验选择CDR内的取代位置和要取代的氨基酸。凭经验的取代可以是保守的或非保守的取代。
与对应的种系序列相比，本文公开的全人PDGF-B单克隆抗体可以在重链和轻链可变结构域的框架和/或CDR区中包括一种或多种氨基酸取代、插入和/或缺失。通过将本文公开的氨基酸序列与可从例如公共抗体序列数据库获得的种系序列进行比较，可以容易地确定此类突变。本公开包含源自本文所公开的任何氨基酸序列的抗体以及其抗原结合片段，其中一种或多种框架和/或CDR区内的一种或多种氨基酸突变成衍生抗体的种系序列的对应的残基、或突变成另一种人种系序列的对应的残基、或突变成对应的种系残基的保守氨基酸取代(此类序列变化在本文中统称为“种系突变”)。从本文所公开的重链和轻链可变区序列开始，本领域普通技术人员可以容易地产生包括一种或多种单个种系突变或其组合的许多抗体和抗原结合片段。在某些实施例中，VH和/或VL结构域内的全部框架和/或CDR残基突变回成在衍生抗体的原始种系序列中所发现的残基。在其它实施例中，仅将某些残基突变回成原始种系序列，例如，仅在FR1的前8个氨基酸内或在FR4的最后8个氨基酸内所发现的突变后的残基，或仅在CDR1、CDR2或CDR3中发现的突变后的残基。在其它实施例中，框架和/或CDR残基中的一种或多种突变成不同种系序列(即，与最初衍生抗体的种系序列不同的种系序列)的对应的残基。更进一步，本公开的抗体可以含有框架和/或CDR区内的两个或更多个种系突变的任何组合，例如，其中某些个别残基突变成特定种系序列的对应残基，而与原始种系序列不同的某些其它残基被维持或突变成不同种系序列的对应残基。一旦获得，就可以容易地测试含有一种或多种种系突变的抗体和抗原结合片段的一种或多种期望的特性，如改善的结合特异性、增加的结合亲和力、改善或增强的拮抗或激动生物学特性(视情况而定)、降低的免疫原性等。以这种通用方式获得的抗体和抗原结合片段涵盖在本公开内。
本公开还包含全人抗PDGF-B单克隆抗体，其包括具有一个或多个保守取代的本文公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一个的变体。例如，本公开包含具有HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗PDGF-B抗体，相对于本文公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一个，所述HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列具有例如，10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等的保守氨基酸取代。
如本文所使用的，术语“人抗体”旨在包含具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本公开的人mAb可以包含并非由人种系免疫球蛋白序列，例如CDR中，并且具体地CDR3中的人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所使用的，术语“人抗体”不旨在包含其中源自另一种哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已经移植到人FR序列上的mAb。
术语“肺高压”(“PH”)是用于描述由任何原因引起的肺部中的高血压的术语。另一方面，术语“高血压(hypertension)”或“高血压(high blood pressure)”是指遍及全身的动脉中的高血压。
术语“肺动脉高压”(“PAH”)是指以肺动脉压的持续升高为特征的进行性肺部病症。这些患有PAH的患者的肺动脉压通常等于或大于25mm Hg，并且肺毛细血管或左心房压等于或小于15mm Hg。这些压通常在静息受试者中使用右心导管插入术测量。PAH如果不治疗，则将在被诊断后2.8年内导致死亡(平均)。
世界卫生组织(WHO)提供了五组的PAH的临床分类(Simonneau等人《美国心脏病学会杂志(J Am Coll Cardiol)》2013；62(25_S)，所述文献的全部内容通过引用并入本文)：
1.肺动脉高压(PAH)
1.1.特发性
1.2.可继承的
1.2.1.BMPR2
1.2.2.ALK1、ENG、SMAD9、CAV1、KCNK3
1.2.3.未知
1.3.药物和毒素诱发
1.4.与···相关：
1.4.1.结缔组织疾病
1.4.2.HIV感染
1.4.3.门静脉高压；
1.4.4.先天性心脏病
1.4.5.血吸虫病
1'.肺静脉闭塞性疾病(PVOD)和/或肺毛细血管瘤病(PCH)
1".新生儿持续性肺高压(PPHN)
2.由于左心疾病引起的肺高压
2.1.左心室收缩功能障碍
2.2.左心室舒张功能障碍
2.3.瓣膜病
2.4.先天性/获得性左心流入/流出道梗阻和先天性心肌病
3.由于肺部疾病和/或缺氧引起的肺高压
3.1.慢性阻塞性肺疾病
3.2.间质性肺部疾病
3.3.具有混合限制性和阻塞性模式的其它肺疾病
3.4.睡眠呼吸性障碍
3.5.肺泡换气不足障碍
3.6.长期暴露于高海拔
3.7.发育异常
4.慢性血栓栓塞性肺高压(CTEPH)
5.具有不明确多因素机制的肺高压
5.1.血液系统病症：慢性溶血性贫血、骨髓增生性病症、脾切除术
5.2.全身性病症：结节病、肺组织细胞增多症、淋巴管平滑肌瘤病
5.3.代谢紊乱：糖原贮积病、戈谢病(Gaucher disease)、甲状腺病症
5.4.其它：肿瘤梗阻、纤维化纵隔炎、透析时慢性肾功能衰竭、节段性PH。
在一个实施例中，将从本公开的方法中受益的受试者是具有I组(WHO)PAH的受试者。
基线处(例如，诊断时)的PAH可以是轻度、中度或重度，例如，通过WHO功能等级来衡量，这是患有PAH的患者的疾病严重程度的测量标准。WHO功能分类是纽约心脏协会(NYHA)系统的改编，并且通常用于定性评估活动耐量，例如，监测疾病进展和对治疗的反应(Rubin(2004)《胸部(Chest)126:7-10)。有四个WHO系统中所认可的功能类别：
I级：肺高压，未导致身体活动受限；
平常的身体活动不会引起过度呼吸困难或疲劳、胸痛或近乎晕厥；
II级：肺高压，导致身体活动轻微受限；
患者在休息时感觉舒适；平常的身体活动导致过度呼吸困难或疲劳、胸痛或近乎晕厥；
III级：肺高压，导致身体活动明显受限；患者在休息时感觉舒适；少于平常的活动导致过度呼吸困难或疲劳、胸痛或近乎晕厥；以及
IV级：肺高压，导致无法进行身体活动而无症状；患者表现出右心衰竭的体征；即使在休息时也可能存在呼吸困难和/或疲劳；任何身体活动都会增加不适感。
在一个实施例中，将从本公开的方法中受益的受试者是在基线处具有WHO I级的PAH(例如，第I组(WHO)PAH)的受试者。在另一个实施例中，将从本公开的方法中受益的受试者是在基线处具有WHO II级的PAH(例如，第I组(WHO)PAH)的受试者。在另一个实施例中，将从本公开的方法中受益的受试者是在基线处具有WHO III级的PAH(例如，第I组(WHO)PAH)的受试者。
如本文所使用的，“受试者”是动物，如哺乳动物，包含灵长类动物(如人、非人灵长类动物，例如猴和黑猩猩)、非灵长类动物(如牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔子、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、小鼠、马和鲸鱼)或鸟(例如，鸭子或鹅)。
在一个实施例中，如本文所述，受试者是人，如治疗或评估PAH，例如I组(WHO)PAH的人；处于PAH，例如I组(WHO)PAH的风险的人；患有PAH，例如I组(WHO)PAH的人；和/或治疗PAH，例如I组(WHO)PA)的人。
如本文所使用的，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指有益或期望的结果，包含但不限于减轻或改善与PAH，例如，I组(WHO)PAH相关的一种或多种症状。“治疗”也可能意味着减缓疾病的进程或减少疾病症状的发展、降低后期发展的疾病的严重程度，或与没有治疗的预期生存期相比延长生存期。例如，与此类疾病、病症或病状相关的症状发展减少(例如，在所述疾病或病症的临床接受的量表上减少至少约10％)，或延迟症状的表现(例如，几天、几周、几个月或几年)被认为是有效的处理。
术语“特异性结合”或“与···特异性结合”等意指抗体或其抗原结合片段与在生理条件下相对稳定的抗原形成复合物。特异性结合可以由至少约1x 10-6M或更小的平衡解离常数来表征(例如，更小的KD表示更紧密的结合)。用于确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域众所周知的，并且包含例如平衡透析、表面等离子体共振等。如本文所述，与PDGF-B特异性结合的抗体已通过表面等离子体共振，例如BIACORETM鉴定。此外，如本文所使用的，与PDGF-B中的一个结构域和一种或多种另外的抗原结合的多特异性抗体，或与PDGF-B的两个不同区结合的双特异性抗体仍然被认为是“特异性结合”的抗体。
术语“高亲和力”抗体是指与PDGF-B具有结合亲和力的那些mAb，以至少10-7M；优选地10-8M；更优选地10-9M，甚至更优选地10-10M，甚至更优选地10-11M的KD表示，如通过表面等离子体共振，例如，BIACORETM或溶液亲和ELISA所测量的。
术语“减慢速率”、“Koff”或“kd”是指从PDGF-B解离的抗体，其速率常数为1x 10- 3s-1或更小，优选地1x10-4s-1或更小，如通过表面等离子体共振，例如BIACORETM所确定的。
如本文所使用的，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包含任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或经基因工程化的特异性结合抗原以形成复合物的多肽或糖蛋白。如本文所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”或“抗体片段”是指保留与PDGF-B结合的能力的抗体的一个或多个片段。
在具体实施例中，本公开的抗体或抗体片段可以缀合到治疗部分(“免疫缀合物”)，如抗生素、第二抗PDGF-B抗体或抗体、缀合到如IL-1、IL-6或TGF-β等细胞因子，或可用于治疗肺动脉高压的任何其它治疗部分。
如本文所使用的，“分离的抗体”旨在指代基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体(Ab)的抗体(例如，特异性结合PDGF-B的分离的抗体或其片段基本上不含特异性结合除了PDGF-B之外的抗原的Ab)。
如本文所使用的，术语“表面等离子体共振”是指允许通过例如使用BIACORETM系统(瑞典乌普萨拉和新泽西州皮斯卡塔韦的法玛西亚生物传感器AB(Pharmacia BiosensorAB,Uppsala,Sweden and Piscataway,N.J.))检测生物传感器基质内的蛋白质浓度的变化来分析实时生物分子相互作用的光学现象。
如本文所使用的，术语“KD”旨在指代特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
术语“表位”是指与被称为互补位的抗体分子的可变区中的特异性抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单个抗原可以具有超过一个表位。因此，不同抗体可以与抗原上的不同区域结合并且可以具有不同的生物效应。术语“表位”还可以指B和/或T细胞对其应答的抗原上的位点。其还指由抗体结合的抗原的区。表位可以被定义为结构的或功能的。功能性表位通常是结构性表位的子集，并且具有直接有助于相互作用的亲和力的那些残基。表位也可以是构象的，即，由非线性氨基酸构成。在某些实施例中，表位可以包含作为如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基等分子的化学活性表面分组的决定簇，并且在某些实施例中，可以具有特定的三维结构特性和/或特定的电荷特性。
如以下所讨论的，当提及核酸或其片段时，术语“基本同一性”或“基本上相同”表示，当通过适当的核苷酸插入或缺失与另一个核酸(或其互补链)进行最佳比对时，核苷酸碱基具有至少约90％，并且更优选地至少约95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸序列同一性，如通过任何众所周知的序列同一性算法，如FASTA、BLAST或GAP所测量的。在某些情况下，与参考核酸分子具有基本同一性的核酸分子可以编码与通过参考核酸分子所编码的多肽具有相同或基本上类似的氨基酸序列的多肽。
当应用于多肽时，术语“基本类似性”或“基本上类似”意指当如通过程序GAP或BESTFIT，使用默认间隙权重进行最佳比对时，两个肽序列共享至少90％序列同一性，甚至更优选地至少95％、98％或99％序列同一性。优选地，不相同的残基位置因保守性氨基酸取代而不同。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有类似的化学特性(例如，电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一个氨基酸残基取代的氨基酸取代。通常，保守氨基酸取代不会实质上改变蛋白质的功能特性。在两个或更多个氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情况下，可以向上调整百分比或类似性的程度以校正取代的保守性质。用于作出此调整的方法是本领域技术人员众所周知的。参见例如Pearson,(1994)《分子生物学方法(MethodsMol.Biol.)》24:307-331，所述文献通过引用并入本文。具有类似化学特性的侧链的氨基酸基团的实例包含：1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；以及7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代基是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。可替代地，保守替代是在以下中公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何变化：Gonnet等人(1992)《科学(Science)》256:1443 45，通过引用并入本文。“适度保守”替代是PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何变化。
通常使用序列分析软件来测量多肽的序列类似性。蛋白质分析软件使用分配给各种取代、缺失和其它修饰(包含保守氨基酸取代)的类似性的度量来匹配类似的序列。例如，GCG软件含有如GAP和BESTFIT等程序，所述程序可以在默认参数下使用以测定紧密相关的多肽(如来自不同生物体物种的同源多肽)之间或野生型蛋白质与其突变体之间的序列同源性或序列同一性。参见例如，GCG 6.1版。多肽序列也可以使用具有默认或推荐参数的FASTA进行比较；GCG 6.1版中的程序。FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)提供了询问序列与搜索序列之间的最佳重叠区的比对和序列同一性百分比(Pearson(2000)同上)。当比较本公开的序列与含有大量来自不同生物的序列的数据库时，另一个优选的算法是使用默认参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。(参见例如，Altschul等人(1990)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》215:403-410和(1997)《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》25:3389-3402，所述文献中的每个文献通过引用并入本文。
在某些实施例中，用于本公开的方法的抗体或抗体片段可以是单特异性的、双特异性的或多特异性的。多特异性抗体可以对一种靶多肽的不同表位具有特异性，或者可以含有对多于一种靶多肽的表位具有特异性的抗原结合结构域。
如本文所使用的，短语“治疗有效量”旨在包含当向患有PAH，例如，I组(WHO)PAH的受试者施用时，足以影响疾病的治疗(例如，通过减少、改善或维持现有疾病或疾病的一种或多种症状)或处理所述疾病的抗PDGF-B抗体或其抗原结合片段的量。“治疗有效量”可能取决于抗PDGF-B抗体或其抗原结合片段、如何施用抗PDGF-B抗体或其抗原结合片段、疾病和其严重程度以及待治疗的患者的病史、年龄、体重、家族史、基因组成、PAH阶段、先前或伴随治疗的类型(如果有的话)以及其它个体特征而变化。
“治疗有效量”还旨在包含当向受试者施用时，足以改善疾病或疾病的一种或多种症状的抗PDGF-B抗体或其抗原结合片段的量。改善疾病包含减缓疾病的进程或降低后期发展的疾病的严重程度。
“治疗有效量”还包含以适用于任何治疗的合理收益/风险比产生一些期望的局部或全身性效果的抗PDGF-B抗体或其抗原结合片段的量。本公开的方法中采用的抗PDGF-B抗体或其抗原结合片段可以足以产生适用于此类治疗的合理收益/风险比的量施用。
一般性描述
血小板衍生生长因子(PDGF)是以五种不同二聚构型存在的有效丝裂原，所述五种不同二聚构型由四种不同同种型亚基构成：A、B、C和D。PDGF的五种二聚形式是AA、BB、AB、CC和DD，所述二聚形式通过对应单个PDGF单体的二硫连接而形成。PDGF配体通过与PDGF受体(PDGFR)的相互作用而发挥其生物效应。PDGFR是由α(a)受体链(PDGFR-α)和/或β(beta)受体链(PDGF-B)的异源二聚体或同源二聚体缔合构成的单程跨膜酪氨酸激酶受体。因此，活性PDGFR可以由αα、ββ或αβ受体链对组成。PDGFR共享共同的结构域结构，包含五个胞外免疫球蛋白(Ig)环、跨膜结构域和分裂的胞内酪氨酸激酶(TK)结构域。二聚PDGF配体与PDGFR之间的相互作用导致受体链二聚化、受体自磷酸化以及胞内信号转导。已证实在体外，ββ受体由PDGF-BB和-DD活化，而αβ受体由PDGF-BB、-CC、-DD和-AB活化，并且αα受体由PDGF-AA、-BB、-CC和-AB活化(参见Andrae等人(2008)《基因与发育》22(10):1276-1312)。
本文所述的抗体证实了与PDGF-B的特异性结合，并且在一些实施例中，可用于治疗患有肺动脉高压的患者。所述抗体可以单独使用或作为与本领域已知的用于治疗肺动脉高压的其它治疗部分或方式，如但不限于通过铁补充剂补充铁、改变饮食以促进血清铁和/或铁的静脉内递送、输血和铁促进药物的辅助疗法。所述抗体可以与对除PDGF-B以外的抗原具有特异性的另外的抗体结合使用，或者可以与其它类型的治疗结合。
在一些实施例中，本文所述的抗体可用于预防、治疗或管理肺动脉高压。
在某些实施例中，本公开的抗体获自用一级免疫原，如，原生全长人PDGF-B(SEQID NO:41)或PDGF-B片段进行免疫，随后用二级免疫原或用PDGF-B的免疫活性片段进行免疫的小鼠。
所述免疫原可以是PDGF-B的免疫原性片段或编码其片段的DNA。免疫原可以是偶联到组氨酸标记和/或到偶联抗体的Fc区的片段的PDGF-B。
全长人PDGF-B的氨基酸序列示为SEQ ID NO:41。
在某些实施例中，与PDGF-B特异性结合的抗体可以使用上述区的片段或从本文所述的区的N或C末端或两者延伸超出指定区约5至约20个氨基酸残基的肽来制备。在某些实施例中，上述区或其片段的任意组合可以用于制备PDGF-B特异性抗体。在某些实施例中，PDGF-B的上述区或其片段的中的任何一个或多个可以用于制备单特异性、双特异性或多特异性抗体。
抗体的抗原结合片段
如本文所使用的，除非另有特别说明，否则术语“抗体”应理解为涵盖包括两个免疫球蛋白重链和两个免疫球蛋白轻链的抗体分子(即“全抗体分子”)及其抗原结合片段。如本文所使用的，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包含任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或经基因工程化的特异性结合抗原以形成复合物的多肽或糖蛋白。如本文所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”或“抗体片段”是指保留与PDGF-B特异性结合能力的抗体的一个或多个片段。抗体片段可以包含Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、dAb片段、含有CDR的片段或分离的CDR。抗体的抗原结合片段可以例如使用任何合适的标准技术，如蛋白水解消化或重组基因工程化技术源自全抗体分子，所述重组基因工程化技术涉及编码抗体可变和(任选地)恒定结构域的DNA的操纵和表达。此类DNA是已知的和/或易于从例如商业来源、DNA文库(包含例如噬菌体-抗体文库)获得，或可以合成。DNA可以化学方式或通过使用分子生物学技术进行测序和操纵，例如，以将一个或多个可变和/或恒定结构域布置成合适的构型或引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或缺失氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包含：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；以及(vii)由模拟抗体的高变区(例如，分离的互补决定区(CDR)，如CDR3肽)或受约束的FR3-CDR3-FR4肽的氨基酸残基组成的最小识别单位。如本文所使用的，其它经工程化的分子，如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、二元抗体、三元抗体、四元抗体、微抗体、纳米抗体(例如一价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域也被涵盖在表达“抗原结合片段”中。
抗体的抗原结合片段通常将包括至少一个可变结构域。可变结构域可以具有任何大小或氨基酸组成，并且通常将包括至少一个与具有一个或多个框架序列的框架相邻或在所述框架内的CDR。在具有与VL结构域缔合的VH结构域的抗原结合片段中，VH和VL结构域可以任何适合的布置相对于彼此定位。例如，可变区可以是二聚体并且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。可替代地，抗体的抗原结合片段可以含有单体VH或VL结构域。
在某些实施例中，抗体的抗原结合片段可以含有至少一个共价连接到至少一个恒定结构域的可变结构域。可以在本公开的抗体的抗原结合片段内发现的可变和恒定结构域的非限制性示例性构型包含：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在可变和恒定结构域的任何构型，包含上面列出的任何示例性构型中，可变和恒定结构域可以彼此直接连接或者可以通过全长或部分铰链或接头区连接。铰链区可以由至少2个(例如，5个、10个、15个、20个、40个、60个或更多个)氨基酸组成，这导致单个多肽分子中的相邻可变和/或恒定结构域之间的柔性或半柔性连接。此外，本公开的抗体的抗原结合片段可以包括上文所列出的彼此和/或与一个或多个单体VH或VL结构域(例如，通过二硫键)非共价缔合的任何可变和恒定结构域构型的同二聚体或异二聚体(或其它多聚体)。
与全抗体分子一样，抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性的(例如，双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段通常将包括至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够与单独的抗原或与同一抗原上的不同表位特异性地结合。包含本文所公开的示例性双特异性抗体形式的任何多特异性抗体形式可以使用本领域可用的常规技术适用于本公开的抗体的抗原结合片段的上下文中。
本公开包含具有包含本文所示的氨基酸序列以及具有细胞和/或体外翻译后修饰的变体的免疫球蛋白链的抗PDGF-B抗体和抗原结合片段。例如，本公开包含与PDGF-B特异性结合的抗体以及其抗原结合片段，所述抗体以及其抗原结合片段包括本文所示的重链和/或轻链氨基酸序列(例如，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和/或CDR-L3)以及抗体和片段，其中一个或多个氨基酸残基被糖基化、一个或多个Asn残基被脱去酰胺基、一个或多个残基(例如，Met、Trp和/或His)被氧化、N末端Gln是焦谷氨酸(pyroE)和/或C末端赖氨酸缺失。
本公开包含用于制备抗PDGF-B抗体或其抗原结合片段或其免疫球蛋白链的重组方法，所述方法包括(i)引入一种或多种编码所述抗体或抗原结合片段的轻免疫球蛋白链和/或重免疫球蛋白链的多核苷酸(例如，重链或其VH或包括其HCDR1、HCDR2和HCDR3的免疫球蛋白和/或轻链或其VL或包括其LCDR1、LCDR2和LCDR3的免疫球蛋白)，例如，其中所述多核苷酸在载体中和/或可操作地与启动子连接；(ii)在有利于表达所述多核苷酸的条件下培养宿主细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或毕赤酵母属(Pichia)细胞或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞)；以及(iii)任选地从所述宿主细胞和/或所述宿主细胞生长的培养基中分离所述抗体或片段或链。当制备包括超过一条免疫球蛋白链的抗体或抗原结合片段，例如，包括两条重免疫球蛋白链和两条轻免疫球蛋白链的抗体时，如果分泌此类链，则单个宿主细胞中链的共表达导致链例如在细胞中或细胞表面上或细胞外的缔合，以便形成抗体或抗原结合片段分子。所述方法包含其中表达仅重免疫球蛋白链或仅轻免疫球蛋白链(例如，本文所讨论的包含其成熟片段和/或可变结构域的那些重免疫球蛋白链或轻免疫球蛋白链中的任何重免疫球蛋白链或轻免疫球蛋白链)的那些方法。例如，在表达包含此类链的抗体或抗原结合片段时，此类链可用作中间体。本公开包含这种表达方法的产物(例如，抗体、抗原结合片段、VH或VL)。
人抗体的制备
用于在转基因小鼠中生成人抗体的方法是本领域已知的。任何此类已知方法可以用于本公开的上下文中以制备与PDGF-B特异性结合的人抗体。
使用技术(参见，例如，US 6,596,541，再生元制药公司(Regeneron Pharmaceuticals)，/>)或用于生成单克隆抗体的任何其它已知方法，将具有人可变区和小鼠恒定区的PDGF-B的高亲和力嵌合抗体初步分离。技术涉及生成转基因小鼠，所述转基因小鼠具有包括与内源性小鼠恒定区基因座可操作地连接的人重链和轻链可变区的基因组，使得所述小鼠响应于抗原刺激产生包括人可变区和小鼠恒定区的抗体。将编码抗体的重链和轻链的可变区的DNA分离，并且将其与编码人重链和轻链恒定区的DNA可操作地连接。然后DNA在能够表达全人抗体的细胞中表达。
通常，用所关注的抗原攻击小鼠，并且从表达抗体的小鼠中回收淋巴细胞(如B细胞)。淋巴细胞可以与骨髓瘤细胞系融合以制备无限增殖杂交瘤细胞系，并且对此类杂交瘤细胞系进行筛选和选择以鉴别出产生对所关注的抗原具有特异性的抗体的杂交瘤细胞系。编码重链和轻链的可变区的DNA可以被分离并与所期望的重链和轻链的同种型恒定区连接。此类抗体蛋白可以在如CHO细胞等细胞中产生。可替代地，编码抗原特异性嵌合抗体或轻链和重链的可变结构域的DNA可以直接从抗原特异性淋巴细胞中分离。
首先，将具有人可变区和小鼠恒定区的高亲和力嵌合抗体分离。将抗体表征并且针对所期望的特征，包含亲和力、选择性、表位等进行选择。用所期望的人恒定区替代小鼠恒定区以生成本公开的全人抗体，例如野生型或经修饰的IgG1或IgG4。虽然所选择的恒定区可以根据具体用途而变化，但高亲和力抗原结合和靶特异性特性存在于可变区中。
通常，当通过与固定在固相上或溶液中的抗原的结合来测量时，本公开的抗体具有非常高的亲和力，通常具有约10-12至约10-7M的KD。用所期望的人恒定区替代小鼠恒定区以生成本公开的全人抗体。虽然所选择的恒定区可以根据具体用途而变化，但高亲和力抗原结合和靶特异性特性存在于可变区中。
生物等效物
本公开的抗PDGF-B抗体和抗体片段涵盖具有与所描述抗体的那些氨基酸序列不同的氨基酸序列，但保留结合PDGF-B的能力的蛋白质。当与亲本序列相比时，此类变体抗体和抗体片段包括氨基酸的一个或多个添加、缺失或取代，但表现出与所描述抗体的生物活性基本上等效的生物活性。同样，本公开的编码抗体的DNA序列涵盖当与所公开的序列相比时包括核苷酸的一个或多个添加、缺失或取代，但编码与本公开的抗体或抗体片段基本上生物等效的抗体或抗体片段的序列。
如果例如，两种抗原结合蛋白或抗体是吸收速率和吸收程度在类似的实验条件下以相同的摩尔剂量施用(单次剂量或多次剂量)时不显示显著差异的药物等效物或药物替代物，则其被认为是生物等效的。如果一些抗体在其吸收程度上等效但在其吸收速率上不等效，则认为所述抗体是等效物或药物替代物，并且仍可以认为所述抗体是生物等效的，因为吸收速率的此类差异是有意的并且反映在标记上，在例如长期使用时对于达到有效的身体药物浓度来说并非是必需的并且对于所研究的特定药物产品来说被认为是医学上无关紧要的。
在一个实施例中，如果两种抗原结合蛋白的安全性、纯度和效力不存在临床上有意义的差异，则所述两种抗原结合蛋白是生物等效的。
在一个实施例中，与不存在参考产品和生物产品之间的转换的持续疗法相比，如果患者可以在参考产品和生物产品之间转换一次或多次而没有预期的副作用风险增加(包含免疫原性的临床显著变化或有效性降低)，则两种抗原结合蛋白是生物等效的。
在一个实施例中，如果两种抗原结合蛋白均通过针对一个或多个使用条件的一种或多种共同作用机制起作用(只要这些机制是已知的)，则所述两种抗原结合蛋白是生物等效的。
生物等效性可以通过体内和/或体外方法来证明。生物等效性测量包含，例如，(a)在人或其它哺乳动物中的体内试验，其中在血液、血浆、血清或其它生物流体中测量抗体或其代谢物的浓度随时间的变化；(b)与人体内生物利用度数据相关并可合理预测人体内生物利用度数据的体外试验；(c)在人或其它哺乳动物中的体内试验，其中测量抗体(或其靶标)的适当急性药理作用随时间的变化；以及(d)在良好控制的临床试验中，确定抗体的安全性、功效或生物利用度或生物等效性。
可以通过例如对残基或序列进行各种取代或使非生物活性所需的末端或内部残基或序列缺失来构建本公开的抗体的生物等效变体。例如，可以使非生物活性所必需的半胱氨酸残基缺失或用其它氨基酸替代，以防止在复性时形成不必要的或不正确的分子内二硫桥。在其它上下文中，生物等效抗体可以包含抗体变体，所述抗体变体包括修饰抗体的糖基化特性的氨基酸变化，例如消除或去除糖基化的突变。
包括Fc变体的抗PDGF-B抗体
根据本公开的某些实施例，提供了包括Fc结构域的抗PDGF-B抗体，所述Fc结构域包括例如，如与中性pH相比在酸性pH下增强或减弱抗体与FcRn受体的结合的一个或多个突变。例如，本公开包含在Fc结构域的CH2区或CH3区中包括突变的抗PDGF-B抗体，其中突变增加Fc结构域在酸性环境中(例如，在pH范围为约5.5至约6.0的核内体中)对FcRn的亲和力。当施用于动物时，此类突变可以导致抗体的血清半衰期增加。
在本公开的范围内设想了前述Fc结构域突变的所有可能的组合和本文所公开的抗体可变结构域内的其它突变。
本公开还包含包括嵌合重链恒定(CH)区的抗PDGF-B抗体，其中所述嵌合CH区包括源自多于一种的免疫球蛋白同种型的CH区的区段。例如，本公开的抗体可以包括嵌合CH区，其包括源自人IgG1、人IgG2或人IgG4分子的CH2结构域的部分或全部，其与源自人IgG1、人IgG2或人IgG4分子的CH3结构域相结合。根据某些实施例，本公开的抗体包括具有嵌合铰链区的嵌合CH区。例如，嵌合铰链可以包括源自人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“上铰链”氨基酸序列(根据EU编号来自位置216至227的氨基酸残基)，其与源自人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“下铰链”序列(根据EU编号来自位置228至236的氨基酸残基)相结合。根据某些实施例，嵌合铰链区包括源自人IgG1或人IgG4上铰链的氨基酸残基和源自人IgG2下铰链的氨基酸残基。在某些实施例中，包括如本文所述的嵌合CH区的抗体可以表现出不会不利地影响抗体的治疗或药代动力学特性的经修饰的Fc效应子功能。(参见例如，2013年2月1日提交的美国临时申请第61/759,578号，所述美国临时申请的公开内容通过引用整体并入)。
抗体的生物特性
一般而言，本公开的抗体可以通过与PDGF-B结合而起作用。在一些实施例中，本公开的抗体可以与另一种抗原(交叉反应性抗体)结合。
在某些实施例中，本公开的抗体可以是双特异性抗体。本公开的双特异性抗体可以结合一个结构域中的一个表位，并且还可以结合PDGF-B的第二个结构域中的一个表位。在某些实施例中，本公开的双特异性抗体可以结合同一结构域中的两个不同的表位。
在一个实施例中，本公开提供了与PDGF-B结合的全人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段表现出以下特性中的一种或多种特性：(i)包括HCVR，所述HCVR具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2和22，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列；(ii)包括LCVR，所述LCVR具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:10和30，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列；(iii)包括HCDR3结构域，所述HCDR3结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:8和28，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列；以及LCDR3结构域，所述LCDR3结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:16和36，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列；(iv)包括HCDR1结构域，所述HCDR1结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:4和24，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列；HCDR2结构域，所述HCDR2结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6和26，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列；LCDR1结构域，所述LCDR1结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:12和32，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列；以及LCDR2结构域，所述LCDR2结构域具有选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:14和34，或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的基本相似的序列；以及(v)以等于或小于10-7的KD与PDGF-B结合。
本公开的某些抗PDGF-B抗体能够结合并中和PDGF-B的活性，如体外或体内测定所确定的。如本文所述，抗体结合和中和PDGF-B的活性的能力可以使用本领域技术人员已知的任何标准方法，包含结合测定或活性测定进行测量。
肽可以被修饰以包含添加或取代某些残基以标记或用于与载体分子(如KLH)缀合的目的。例如，可以在肽的N末端或C末端加入半胱氨酸，或者可以加入接头序列以制备肽以与例如KLH缀合以进行免疫。
PDGF-B特异性抗体可能不含另外的标记或部分，或者所述抗体可能包含N末端或C末端标记或部分。在一个实施例中，所述标记或部分是生物素。在结合测定中，标记物的位置(如果有的话)可以确定肽相对于肽结合的表面的方向。例如，如果表面涂有亲和素，则含有N末端生物素的肽将被定向，使得所述肽的C末端部分将在所述表面的远端。在一个实施例中，标记可以是放射性核素、荧光染料或MRI可检测的标记。在某些实施例中，这种标记的抗体可以用于诊断测定，包含成像测定。
表位作图和相关技术
本公开包含抗PDGF-B抗体，其与PDGF-B的一个或多个区内发现的一个或多个氨基酸相互作用。抗体结合的表位可以由位于PDGF-B分子的任何上述区域内的3个或更多个(例如，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)氨基酸的单个连续序列组成(例如结构域中的线性表位)。可替代地，表位可以由位于PDGF-B分子的上述区域中的一个或两个(例如构象表位)内的多个非连续氨基酸(或氨基酸序列)组成。
可以使用本领域的普通技术人员已知的各种技术来测定抗体是否在多肽或蛋白质内“与一个或多个氨基酸相互作用”。示例性技术包含，例如，常规交叉阻断测定，如抗体，Harlow和Lane(纽约冷泉港的冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring,NY))中所描述的。其它方法包含丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(Reineke(2004)《分子生物学方法》248:443-63)、肽切割分析、晶体学研究和NMR分析。另外，可以采用如表位切除、表位提取及抗原的化学修饰等方法(Tomer2000《蛋白质科学(Protein Science)》9:487-496)。可以用于鉴定与抗体相互作用的多肽内的氨基酸的另一种方法是通过质谱法检测的氢/氘交换。一般而言，氢/氘交换方法涉及对所关注的蛋白质进行氘标记，然后将抗体与经氘标记的蛋白质结合。接下来，将蛋白质/抗体复合物转移到水中，并且受抗体复合物保护的氨基酸内的可交换质子以比并非是界面的一部分的氨基酸内的可交换质子慢的速率经历氢-氘反交换。因此，形成蛋白质/抗体界面的一部分的氨基酸可以保留氘，并且因此表现出与并未包含在界面中的氨基酸相比相对较高的质量。在解离抗体后，对靶蛋白进行蛋白酶切割和质谱分析，由此揭示含有包含与抗体相互作用的特定氨基酸的经氘标记的残基的肽。参见例如，Ehring(1999)《分析生物化学(Analytical Biochemistry)》267(2):252-259；Engen和Smith(2001)《分析化学(Anal.Chem.)》73:256A-265A。
术语“表位”是指抗原上B细胞和/或T细胞所响应的位点。B细胞表位可以由连续氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸两者形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常包含处于独特的空间构象中的至少3个并且更通常至少5个或8-10个氨基酸。
修饰辅助分析(MAP)，也被称为基于抗原结构的抗体分析(ASAP)，是一种根据每种抗体与化学或酶促修饰的抗原表面的结合特征的类似性，对大量针对相同抗原的单克隆抗体(mAb)进行分类的方法(参见US2004/0101920，特此通过引用整体并入本文)。每个类别可以反映独特的表位，所述表位与另一个类别所代表的表位明显不同或部分重叠。此技术允许快速过滤基因相同的抗体，从而可以将表征集中在基因不同的抗体上。当应用于杂交瘤筛选时，MAP可能有助于鉴定产生具有所期望特性的mAb的稀有杂交瘤克隆。MAP可以用于将本公开的抗体分选成结合不同表位的抗体组。
在某些实施例中，抗PDGF-B抗体或其抗原结合片段结合人PDGF-B中例证的任何一个或多个区内的表位，如SEQ ID NO:41所例证的，或与其片段结合。
本公开包含与本文所述的任何特定示例性抗体，或具有本文所述的任何示例性抗体的CDR序列的抗体结合同一表位或所述表位的一部分的人抗PDGF-B抗体。同样，本公开还包含与本文所述的任何特定示例性抗体，或具有本文所述的任何示例性抗体的CDR序列的抗体竞争与PDGF-B或PDGF-B片段结合的抗PDGF-B抗体。
通过使用本领域已知的常规方法，可以容易地确定抗体是否与参考抗PDGF-B抗体结合同一表位或者与其竞争结合。例如，为了确定测试抗体是否与本公开的参考抗PDGF-B抗体结合同一表位，使参考抗体在饱和条件下与PDGF-B蛋白或肽结合。接下来，评估测试抗体与PDGF-B分子结合的能力。如果测试抗体能够在与参考抗PDGF-B抗体饱和结合后结合PDGF-B，则可以得出结论，测试抗体与参考抗PDGF-B抗体结合不同的表位。另一方面，如果测试抗体在与参考抗PDGF-B抗体饱和结合后不能与PDGF-B蛋白结合，则测试抗体可能与本公开的参考抗PDGF-B抗体结合的表位相同的表位结合。
为了确定抗体是否与参考抗PDGF-B抗体竞争结合，在两种朝向上进行上述结合方法：在第一朝向上，允许参考抗体在饱和条件下与PDGF-B蛋白结合，随后评估测试抗体与PDGF-B分子的结合。在第二朝向上，使测试抗体在饱和条件下与PDGF-B分子结合，随后评估参考抗体与PDGF-B分子的结合。如果在两个朝向上，只有第一个(饱和)抗体能够与PDGF-B分子结合，则得出结论，测试抗体和参考抗体竞争与PDGF-B结合。如本领域普通技术人员所理解的那样，与参考抗体竞争结合的抗体可能不一定与参考抗体结合相同的表位，但可以通过结合重叠或相邻的表位来在空间上阻断参考抗体的结合。
如果两种抗体各自竞争性地抑制(阻断)另一种抗体与抗原的结合，则所述两种抗体与相同或重叠的表位结合。换言之，一种抗体的1倍、5倍、10倍、20倍或100倍过量将另一种抗体的结合抑制至少50％，但优选地75％、90％或者甚至99％，如在竞争性结合测定中所测量的(参见例如，Junghans等人,《癌症研究(Cancer Res.)》1990 50:1495-1502)。可替代地，如果在抗原中减少或消除一种抗体的结合的基本上所有氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，则两种抗体具有同一表位。如果减少或消除一种抗体的结合的一些氨基酸突变减少或消除了另一种抗体的结合，则两种抗体具有重叠表位。
然后可以进行另外的常规实验(例如，肽突变和结合分析)，以确认所观察到的测试抗体的结合缺乏是否实际上是由于与参考抗体结合同一表位或者是否是空间阻断(或另一种现象)导致所观察到的结合缺乏。可以使用ELISA、RIA、表面等离子体共振、流式细胞术或本领域可用的任何其它定量或定性抗体结合测定执行这种分选的实验。
免疫缀合物
本公开涵盖与治疗部分(“免疫缀合物”)缀合的人抗PDGF-B单克隆抗体，如能够降低肺动脉高压的严重程度或改善至少一种与肺动脉高压相关的症状的药剂。如本文所使用的，术语“免疫缀合物”是指与放射性药剂、细胞因子、干扰素、靶标或报告部分、酶或治疗剂化学或生物连接的抗体。抗体可以沿分子能够结合其靶标的长度在任何位置处连接到放射性药剂、细胞因子、干扰素、靶标或报告基因部分、酶、毒素或治疗剂。免疫缀合物的实例是抗体药物缀合物。在一些实施例中，所述药剂可以是针对PDGF-B的第二种不同抗体，或针对细胞因子如IL-1、IL-6或趋化因子如TGF-β的抗体。可以与抗PDGF-B抗体缀合的治疗部分的类型将考虑待治疗的病状和要实现的所期望的治疗效果。用于形成免疫缀合物的合适的药剂的实例是本领域已知的，参见例如，WO 05/103081。免疫缀合物和免疫毒素的制备是本领域众所周知的(参见例如，美国专利第4340535号)。例如，在US 7250492、US 7420040和US7411046中详细描述了免疫缀合物，所述美国专利中的每一个美国专利均整体并入本文。
多特异性抗体
本公开的抗体可以是单特异性的、双特异性的或多特异性的。多特异性抗体可以对一个靶多肽的不同表位具有特异性，或者可以含有对多于一种靶多肽具有特异性的抗原结合结构域。参见例如，Tutt等人,1991,《免疫学期刊(J.Immunol.)》147:60-69；Kufer等人,2004,《生物科技趋势(Trends Biotechnol.)》22:238-244。本公开的抗体可以与另一种功能分子，例如，另一种肽或蛋白连接或共表达。例如，抗体或其片段可以与如另一种抗体或抗体片段等一个或多个其它分子实体(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或以其它方式)功能性地连接，以产生具有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗体。例如，本公开包含双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一个臂对于PDGF-B的N末端区或其片段具有特异性，并且所述免疫球蛋白的另一个臂对于PDGF-B的C末端区或第二治疗靶标具有特异性，或与治疗部分缀合。可以在本公开的上下文中使用的示例性双特异性抗体形式涉及第一免疫球蛋白(Ig)CH3结构域和第二Ig CH3结构域的使用，其中所述第一和第二Ig CH3结构域彼此相差至少一个氨基酸，并且其中至少一个氨基酸差异与缺乏氨基酸差异的双特异性抗体相比减少了双特异性抗体与PDGF-B的结合。在本公开的范围内设想了上文所述的双特异性抗体形式的变化。
可以在本公开的背景下使用的其它示例性双特异性形式包含但不限于例如，基于scFv的或双抗体双特异性形式、IgG-scFv融合、双可变结构域(DVD)-Ig、四杂交瘤(Quadroma)、结节入孔(knobs-into-holes)、共同轻链(例如，具有结节入孔的共同轻链等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)body、亮氨酸拉链、Duobody、IgG1/IgG2、双作用Fab(DAF)-IgG以及Mab2双特异性形式(参见例如Klein等人2012,mAbs 4:6,1-11，以及其中引用的参考文献，用于回顾前述形式)。还可以使用肽/核酸缀合构建双特异性抗体，例如，其中使用具有正交化学反应性的非天然氨基酸来产生位点特异性抗体-寡核苷酸缀合物，然后将其自组装成具有确定组成、价数和几何形状的多聚体复合物。(参见例如，Kazane等人,《美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)》[电子版:2012年12月4日])。
治疗剂施用和调配物
本公开提供了包括如本文所述的抗PDGF-B抗体或其抗原结合片段的治疗组合物。根据本公开的治疗组合物可以与合适的载体、赋形剂和并入到调配物中以提供改进的转移、递送、耐受性等的其它药剂一起施用。在所有药物化学家已知的处方集中可以找到许多适当的调配物：《雷明顿氏药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(Mack Publishing Company,Easton,PA)。这些调配物包含例如粉末、糊剂、软膏、凝胶、蜡、油、脂质、含有囊泡的脂质(阳离子或阴离子)(如)、DNA缀合物、无水吸收膏、水包油和油包水乳剂、碳蜡乳剂(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有碳蜡的半固体混合物。还参见Powell等人“用于肠胃外调配物的赋形剂的汇编(Compendium of excipients for parenteral formulations)”PDA(1998)《药物科学与技术杂志(J Pharm Sci Technol)》52:238-311。
抗体的剂量可以根据待施用的受试者的年龄和体型、目标疾病、病状、施用途径等而变化。当本公开的抗体出于预防或治疗肺动脉高压而使用时，有利的是，通常以约0.1至约100mg/kg体重、更优选地约5至约100、约10至约90或约20至约70mg/kg体重的单剂量静脉内施用本公开的抗体。视病状的严重程度而定，可以调整治疗的频率和持续时间。在某些实施例中，本公开的抗体或其抗原结合片段可以至少约0.1mg至约800mg、约1至约500mg、约5至约300mg、或约10至约200mg、至约100mg或至约50mg的初始剂量施用。在某些实施例中，在初始剂量之后可以可大约等于或小于初始剂量的量施用第二或多个后续剂量的抗体或其抗原结合片段，其中后续剂量间隔至少1天至3天；至少一周、至少2周；至少3周；至少4周；至少5周；至少6周；至少7周；至少8周；至少9周；至少10周；至少12周；或至少14周。
各种递送系统是已知的并且可以用于施用本公开的药物组合物，例如包封在脂质体、微颗粒、微胶囊、能够表达突变病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用中(参见例如，Wu等人(1987)《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》262:4429-4432)。引入的方法包含但不限于皮内、透皮、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。组合物可以通过任何方便的途径，例如通过输注或团注、通过经由上皮或皮肤粘膜内层(例如，口腔粘膜、直肠和肠道粘膜等)吸收来施用并且可以与其它生物活性剂一起施用。施用可以是全身性的或局部的。药物组合物也可以在囊泡(具体地说，脂质体)中递送(参见例如，Langer(1990)《科学》249:1527-1533)。
本文还设想了使用纳米颗粒来递送本公开的抗体。抗体缀合纳米颗粒可用于治疗和诊断应用。抗体缀合纳米颗粒及其制备和使用方法详细描述于Arruebo,M.等人2009(“用于生物医学应用的抗体缀合纳米颗粒”)《纳米材料学杂志(J.Nanomat)》2009卷,文章ID439389,24页,doi:10.1155/2009/439389)，所述文献通过引用并入本文。用于药物递送的纳米颗粒也已在例如US 8277812、US 8258256、US 8257740、US 8246995、US 8236330中描述，每个文献均整体并入本文。
在某些情况下，可以在控释系统中递送药物组合物。在一个实施例中，可以使用泵。在另一个实施例中，可以使用聚合材料。在又一个实施例中，可以将控释系统置于组合物的靶标附近，因此仅需要全身剂量的一部分。
可注射制剂可以包含用于静脉内、皮下、皮内和肌内注射、滴注等的剂型。这些可注射制剂可以通过公开已知方法制备。例如，可注射制剂可以例如通过将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在无菌水性介质或常规用于注射的油性介质中来制备。作为用于注射的水性介质，存在例如生理盐水、含有葡萄糖和其它助剂等的等渗溶液，其可以与适当的增溶剂组合使用，所述增溶剂如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如，聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等。作为油性介质，采用例如芝麻油、大豆油等，其可以与增溶剂，如苯甲酸苄酯、苯甲醇等组合使用。这样制备的注射剂可以装入适当的安瓿中。
可以用标准针头和注射器皮下或静脉内递送本公开的药物组合物。另外，关于皮下递送，笔递送装置易于应用于递送本公开的药物组合物。这种笔递送装置可以是可重复使用的或一次性的。可重复使用的笔递送装置通常利用含有药物组合物的可更换药筒。一旦已经施用了药筒内的全部药物组合物，并且药筒是空的，就可以轻易地丢弃空药筒，并且用含有药物组合物的新药筒更换。然后可以重复使用笔递送装置。在一次性笔递送装置中，没有可更换的药筒。相反，一次性笔递送装置预装有固持在装置内的贮存器中的药物组合物。一旦贮存器中的药物组合物被清空，就丢弃整个装置。
许多可重复使用的笔和自动注射器递送装置应用于皮下递送本公开的药物组合物。实例包含但当然不限于(英国伍德斯托克的欧曼福德公司(OwenMumford,Inc.,Woodstock,UK))、DISETRONICTM笔(瑞士波道夫的Disetronic医疗系统公司(Disetronic Medical Systems,Burghdorf,Switzerland))、HUMALOG MIX 75/25TM笔、笔、HUMALIN 70/30TM笔(印第安纳州印第安纳波利斯的礼来公司(EliLilly and Co.,Indianapolis,IN))、/>I、II和III(丹麦哥本哈根的诺和诺德公司(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark))、NOVOPEN JUNIORTM(丹麦哥本哈根的诺和诺德公司)、BDTM笔(新泽西州富兰克林湖的贝迪医疗(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ))、/>PRO、/>STARLET以及OPTICLIKTM(德国法兰克福市的赛诺菲公司(Sanofi-aventis,Frankfurt,Germany))，仅举几例。应用于皮下递送本公开的药物组合物的一次性笔递送装置的实例包含但当然不限于/>笔(赛诺菲公司)、/>(诺和诺德公司)以及/> 自动注射器、PENLET(德国斯图加特的Haselmeier公司(Haselmeier,Stuttgart,Germany))、/>以及/> 笔(伊利诺伊州雅培科技园的雅培实验室(Abbott Labs,Abbott Park IL))，仅举几例。
有利的是，将上述用于口服或肠胃外使用的药物组合物以适合于配合一定剂量的活性成分的单位剂量制备成剂型。单位剂量的此类剂型包含例如片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等。所含的上述抗体的量通常为每单位剂量剂型约5至约500mg；特别是在注射形式下，优选地上述抗体以约5至约100mg，并且对于其它剂型，以约10至约250mg包含。本公开包含注射装置(例如，预填充注射器或预填充自动注射器)或包括本公开的抗体或抗原结合片段或其包含药学上可接受的载体的药物组合物的小瓶(例如，玻璃或塑料小瓶)。
抗体的治疗用途
在本公开的某些实施例中，本发明的抗体可用于治疗肺动脉高压或至少一种与肺动脉高压相关的症状。本公开的抗体还考虑了用于处于发展肺动脉高压的风险下的患者中的预防性用途。这些患者包含老年人，或因疾病或免疫抑制疗法治疗而免疫功能低下的患者。经考虑，本公开的抗体可以单独使用，或与第二药剂或第三药剂联合使用以治疗肺动脉高压，或用于减轻至少一种与肺动脉高压相关的症状或并发症。第二或第三药剂可以与本公开的抗体同时递送，或者所述药剂可以在本公开的抗体之前或之后单独施用。可以接受本公开的抗体或抗原结合片段或其药物组合物的患者包含例如，如哺乳动物等动物，如人(例如，老年人，例如65岁或以上)、兔、小鼠、大鼠、牛、猪、狗、灵长类动物、马或绵羊。
在本公开的又一个实施例中，本发明的抗体用于制备用于治疗患有肺动脉高压的患者的药物组合物。
联合疗法
本公开包含包括本文所述的抗PDGF-B抗体中的任何一种与一种或多种另外的治疗活性组分组合的组合物和治疗调配物，以及包括向有需要的受试者施用此类组合的治疗方法。
本公开的抗PDGF-B抗体可以与以下共同调配和/或与之组合施用：例如VEGF拮抗剂(例如，“VEGF陷阱”，如US 7,087,41 1中所示的阿柏西普(aflibercept)或其它抑制VEGF的融合蛋白)、抗VEGF抗体或其抗原结合片段(例如，贝伐珠单抗(bevacizumab)、雷珠单抗(ranibizumab))、VEGF受体的小分子激酶抑制剂(例如，舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)或帕唑帕尼(pazopanib))，或抗VEGF受体抗体。抗PDGF-B抗体也可以与PDGF配体拮抗剂(例如，抗PDGF-BB抗体、抗PDGF-DD抗体、抗PDGF-CC抗体、抗PDGF-AB抗体或其它PDGF配体拮抗剂，如适配体[例如，抗PDGF-B适配体，如新泽西州普林斯顿爱眼科技公司的FovistaTM(FovistaTM,Ophthotech Corp.,Princeton,NJ)]、反义分子、核酶、siRNA、肽体、纳米抗体或针对PDGF配体的抗体片段)组合。在其它实施例中，本公开的抗PDGF-B抗体可以与以下共同调配和/或与之组合施用：EGFR拮抗剂(例如，抗EGFR抗体[例如，西妥昔单抗(cetuximab)或帕尼单抗(panitumumab)]或EGFR的小分子抑制剂[例如，吉非替尼(gefitinib)或厄洛替尼(erlotinib)])、另一个EGFR家族成员的拮抗剂，如Her2/ErbB2、ErbB3或ErbB4(例如，抗ErbB2、抗ErbB3或抗ErbB4抗体或ErbB2、ErbB3或ErbB4活性的小分子抑制剂)、EGFRvlll特异性拮抗剂(例如，特异性结合EGFRvlll的抗体)、cMET拮抗剂(例如抗cMET抗体)、IGF1 R拮抗剂(例如，抗IGF1 R抗体)或B-raf抑制剂(例如，维罗非尼(vemurafenib)、索拉非尼、GDC-0879、PLX-4720)。在某些情况下，本公开的抗PDGF-B抗体与以下组合、共同调配和/或与之组合施用：PDGFR-α抑制剂(例如，抗PDGFR-α抗体)、DLL4拮抗剂(例如，US2009/0142354中公开的抗DLL4抗体，如REGN421)、Ang2拮抗剂(例如，US2011/0027286中公开的抗Ang2抗体，如H1H685P)等。可以与本公开的抗PDGF-B抗体有益地组合施用的其它药剂包含细胞因子抑制剂，所述细胞因子抑制剂包含小分子细胞因子抑制剂和与如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18等细胞因子或与其相应受体结合的抗体。
本公开的抗PDGF-B抗体也可以与抗病毒药物、抗生素、镇痛药、皮质类固醇、类固醇、氧气、抗氧化剂、金属螯合剂、IFN-γ和/或NSAID组合施用和/或共同调配。本公开的抗PDGF-B抗体也可以作为治疗方案的一部分施用，所述方案还包含放射治疗和/或常规化疗(例如，在治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法的背景下)。
前述另外的治疗活性组分中的任何一种可以与本公开的抗PDGF-B抗体中的任何一种组合施用，用于治疗施用抗PDGFR-β抗体有益的任何疾病或病症，包含例如，本文提及的眼部疾病、纤维化疾病、血管疾病和/或癌症中的任何一种。例如，在治疗眼部疾病(例如，湿性AMD、糖尿病视网膜病变、CRVO或本文中描述的其它眼部疾病中的任何一种)的上下文中，本公开的抗PDGF-B抗体可以与以下共同调配和/或与之组合施用：VEGF拮抗剂(例如，“VEGF陷阱”，如US 7,087,41 1中所示的阿柏西普或其它抑制VEGF的融合蛋白)或抗VEGF抗体或其抗原结合片段(例如，贝伐珠单抗或雷珠单抗)。
在示例性实施例中，本公开的抗PDGF-B抗体与VEGF拮抗剂(例如，VEGF陷阱，如阿柏西普(aflibercept))组合施用，包含施用包括抗PDGF-B抗体和VEGF拮抗剂的共调配物，可以将单个组分向受试者施用和/或使用多种剂量组合共调配。例如，抗PDGF-B抗体可以选自由以下组成的组的量向受试者施用和/或包含在共调配物中：0.05mg、0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1.0mg、1.5mg、2.0mg、2.5mg、3.0mg、3.5mg、4.0mg、4.5mg、5.0mg和5.5mg；并且VEGF拮抗剂(例如，VEGF陷阱，如阿柏西普)可以选自由以下组成的组的量向所述受试者施用和/或包含在共调配物中：1.0mg、1.1mg、1.2mg、1.3mg、1.4mg、1.5mg、1.6mg、1.7mg、1.8mg、1.9mg、2.0mg、2.1mg、2.2mg、2.3mg、2.4mg、2.5mg、2.6mg、2.7mg、2.8mg、2.9mg和3.0mg。本公开的示例性抗PDGF-B抗体/阿柏西普剂量组合包含例如：(i)0.2mg抗PDGF-B抗体+2mg阿柏西普；(ii)0.5mg抗PDGF-B抗体+2mg阿柏西普；(iii)1mg抗PDGF-B抗体+2mg阿柏西普；(iv)3mg抗PDGF-B抗体+2mg阿柏西普；以及(v)4mg抗PDGFR-β抗体+2mg阿柏西普。组合/共调配物可以根据本文其它地方公开的任何施用方案向受试者施用，包含例如，每周一次、每2周一次、每3周一次、每月一次、每2个月一次、每3个月一次、每4个月一次、每5个月一次、每6个月一次等。
在施用本公开的抗PDGF-B抗体之前可以向受试者施用另外的治疗活性组分。例如，如果第一组分在施用第二组分1周前、72小时前、60小时前、48小时前、36小时前、24小时前、12小时前、6小时前、5小时前、4小时前、3小时前、2小时前、1小时前、30分钟前、15分钟前、10分钟前、5分钟前或少于1分钟前施用，则第一组分可被视为在第二组分“之前”施用。在其它实施例中，在施用本公开的抗PDGF-B抗体之后可以向受试者施用另外的治疗活性组分。例如，如果第一组分在施用第二组分1分钟后、5分钟后、10分钟后、15分钟后、30分钟后、1小时后、2小时后、3小时后、4小时后、5小时后、6小时后、12小时后、24小时后、36小时后、48小时后、60小时后、72小时后施用，则第一组分可被视为在第二组分“之后”施用。在又其它实施例中，在施用抗PDGF-B抗体的同时可以向受试者施用另外的治疗活性组分。
出于本公开的目的，“同时”施用包含例如以单一剂型(例如，共调配)或以在约30分钟或更少时间内向受试者施用的彼此单独的剂型向受试者施用抗PDGF-B抗体和另外的治疗活性组分。如果以单独的剂型施用，则每个剂型可以通过相同的途径施用(例如，抗PDGFR-β抗体和另外的治疗活性组分可以玻璃体内、皮下等施用)；可替代地，每种剂型可以通过不同的途径施用(例如，抗PDGF-B抗体可以玻璃体内施用，并且另外的治疗活性组分可以全身施用)。在任何情况下，出于本公开的目的，以单一剂型、通过相同途径以单独的剂型或通过不同途径以单独的剂型施用组分均被视为是“同时施用”。出于本公开的目的，在施用另外的治疗活性组分“之前”、“同时”或“之后”(如以上在本文中所定义的那些术语)施用抗PDGF-B抗体被视为是与另外的治疗活性组分“组合”施用抗PDGF-B抗体。
本公开包含药物组合物，其中本公开的抗PDGFR-β抗体与如本文其它地方所描述的另外的治疗活性组分中的一种或多种共调配。
本公开还包含包括PDGF拮抗剂和VEGF拮抗剂的组合的另外的治疗组合物。根据本公开的此方面的PDGF拮抗剂包含PDGF受体拮抗剂以及PDGF配体拮抗剂。同样，根据本公开的此方面的VEGF拮抗剂包含VEGF受体拮抗剂以及VEGF配体拮抗剂。
在施用本公开的抗PDGF-B抗体之前、同时或之后，可以施用另外的治疗活性组分。出于本公开的目的，此类施用方案被认为是抗PDGF-B抗体与一种或多种另外的治疗活性组分“组合”施用。
抗体的诊断用途
本公开的抗PDGF-B抗体也可用于检测和/或测量样品中的PDGF-B，例如用于诊断目的。PDGF-B的示例性诊断测定可以包括例如使从患者获得的样品与本公开的抗PDGF-B抗体接触，其中抗PDGF-B抗体用可检测标记或报告分子标记或用作捕获配体以选择性地从患者样品中分离出PDGF-B。可替代地，未标记的抗PDGF-B抗体可以与本身被可检测标记的二级抗体组合用于诊断应用。可检测标记或报告分子可以是放射性同位素，如3H、14C、32P、35S或125I；荧光或化学发光部分，如萤光素异硫氰酸酯或罗丹明；或酶，如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或萤光素酶。可用于检测或测量样品中的PDGF-B的具体示例性测定包含酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光活化细胞分选(FACS)。
可用于根据本公开的PDGF-B诊断测定中的样品包含可从患者获得的任何组织或流体样品，其在正常或病理条件下含有可检测量的PDGF-B或其片段。通常，将测量从健康患者(例如，未患有肺动脉高压的患者)获得的特定样品中的PDGF-B水平，以初步确定PDGF-B的基线或标准水平。然后可以将PDGF-B的此基线水平与从怀疑患有肺动脉高压相关病状或与此类病状相关的症状的个体获得的样品中测量的PDGF-B的水平进行比较。
PDGF-B特异性抗体可能不含另外的标记或部分，或者所述抗体可能包含N末端或C末端标记或部分。在一个实施例中，所述标记或部分是生物素。在结合测定中，标记物的位置(如果有的话)可以确定肽相对于肽结合的表面的方向。例如，如果表面涂有亲和素，则含有N末端生物素的肽将被定向，使得所述肽的C末端部分将在所述表面的远端。在一些实施例中，标记可以是可检测的标记，如放射性核素、荧光染料或MRI可检测的标记。可检测的标记可以与抗体连接，其中此类抗体可以用于成像测定。
治疗方法
本公开提供了用于治疗患有肺动脉高压的受试者的方法。所述方法通常包含向受试者施用治疗有效量的抗PDGF-B抗体或其抗原结合片段。
在一些方面，施用抗PDGF-B抗体或其抗原结合片段抑制受试者的肺动脉增厚，例如，从基线，例如，在诊断时抑制受试者的肺动脉的进一步增厚。肺动脉增厚可由例如胸部CT(如未增强的轴向10mm CT切片)确定，并用于计算主肺动脉直径(mPA)。正常受试者的主肺动脉直径为约2.4cm至约3.0cm。患有肺动脉高压的受试者的主肺动脉直径为约3.1cm至约3.8cm或更大。(参见例如，Edwards等人(1998)《英国放射学杂志(Br J Radiol)》71(850):1018-20。
在其它方面，施用抗PDGF-B抗体或其抗原结合片段增加受试者的每搏输出量和/或每搏输出量和与收缩末期容积比(“SV/ESV”)。“每搏输出量”(“SV”)是每次收缩从右心室或左心室泵出的血液量。每搏输出量可以使用来自超声心动图中的心室容积测量进行计算，并通过从心跳前的血液容积(称为“舒张末期容积”，“ESV”)中减去心跳结束时心室中的血液容积(称为“收缩末期容积”，“EDV”)来计算。每搏输出量也可以例如，如通过将右心导管插入术期间的热稀释除以心率或EDV减去ESV进行测量，并且以体表面积进行索引的心输出量进行计算。术语每搏输出量可适用于心脏的两个心室中的每一个。每个心室的每搏输出量通常相等，在健康受试者中均大约为70mL。健康受试者的SV/ESV为约0.9至约2.2，并且患有PAH的受试者的SV/ESV为约0.2至约0.9。参见例如，Brewis等人(2016)《美国心脏病学会杂志》218:206-211。
在又其它方面，施用抗PDGF-B抗体或其抗原结合片段增加受试者的右心室心输出量和/或心脏指数(CI)。“心输出量”(“CO”)定义为单位时间内心室泵出的血液量。“心脏指数”(“CI”)是血液动力学参数，所述血液动力学参数将一分钟内左心室的心输出量(CO)与“体表面积”(“BSA”)相关联，从而将心脏性能与个体的大小相关联。超声心动图技术和放射性核素成像技术可用于估计心室尺寸的实时变化，从而计算每搏输出量，当乘以心率时，给出心输出量，并且BSA可以使用本领域普通技术人员已知的任何一种形式来计算，包含例如杜波依斯氏公式(Du Bois formula)(Verbraecken,J等人(2006)《代谢-临床和实验(Metabolism-Clin Exper)》55(4):515–24)或莫斯特勒公式(Mosteller formula)(Mosteller(1987)《新英格兰医学杂志(N Engl J Med)》317:1098)。未患有PAH的受试者的心输出量的范围在约4.0-8.0升/分钟内，并且心脏指数为每平方米约2.6至约4.2升/分钟。患有PAH的受试者的心脏指数为每平方米约1.9至约2.3升/分钟(Ryan和Archer(2016)《循环研究(Circ Res)》115:176-188)。
在本公开的方法中，向患有PAH的受试者施用抗PDGF-B抗体或其抗原结合片段可以改善患有PAH的受试者中的其它血液动力学测量结果，如，右心房压、肺动脉压、存在呼气末压的情况下的肺毛细血管楔压、全身动脉压、心跳、肺血管阻力和/或全身血管阻力。用于测量右心房压、肺动脉压、存在呼气末压的情况下的肺毛细血管楔压、全身动脉压、心跳、肺血管阻力和/或全身血管阻力的方法和装置是本领域普通技术人员已知的。
未患有PAH的受试者的右心房压为约1mm Hg至约5mm Hg；患有PAH的受试者的右心房压为约11mm Hg至约13mm Hg。
未患有PAH的受试者的肺动脉压为约9mm Hg至约20mm Hg；患有PAH的受试者的肺动脉压为约57mm Hg至约61mm Hg。
未患有PAH的受试者在存在呼气末压的情况下的肺毛细血管楔压为约4mm Hg至约12mm Hg；患有PAH的受试者在存在呼气末压的情况下的肺毛细血管楔压为约9mm Hg至约11mm Hg。
未患有PAH的受试者的全身动脉压为约90mm Hg至约96mm Hg；患有PAH的受试者的全身动脉压为约87mm Hg至约91mm Hg。
未患有PAH的受试者的心跳为约每分钟60拍(bpm)至约90bpm；患有PAH的受试者的全身动脉压为约84bpm 88bpm。
未患有PAH的受试者的肺血管阻力为约20达因s/cm5至约130达因s/cm5(或约0.25至约1.625伍德单位)；患有PAH的受试者的肺血管阻力为约1200达因s/cm5至约1360达因s/cm5(或约15至约17伍德单位)。
未患有PAH的受试者的全身血管阻力为约700达因s/cm5至约1600达因s/cm5(或约9至约20伍德单位)；患有PAH的受试者的全身血管阻力为约1840达因s/cm5至约2000达因s/cm5(或约23至约25伍德单位)。
本公开的方法还可以改善被治疗的受试者中的其它临床参数，如肺功能。例如，在治疗期期间或之后，受试者的运动能力或活动可能增加，例如，如通过6分钟步行距离(6MWD)的测试或活动测量或降低Borg呼吸困难指数(BDI)所测量的。
本公开的方法还可以改善与基线相比的一个或多个生活质量参数，例如在健康调查功能量表中的至少一个的得分增加；与基线相比，病状的严重程度有所改善，例如通过转移到较低的WHO功能级别；和/或延长寿命。
任何合适的运动能力测量都可以用来确定受试者的运动能力或活动是否增加。一种合适的测量是6分钟步行测试(6MWT)，其测量受试者在6分钟内可以走多远，即6分钟步行距离(6MWD)。另一个合适的测量是Borg呼吸困难指数(BDI)，这是用于评估感知呼吸困难(呼吸不适)的数值量表。所述数值量表测量完成6分钟步行测试(6MWT)后的呼吸困难程度，其中BDI为0表示没有呼吸困难，并且10表示最大呼吸困难。在一个实施例中，本公开的方法向受试者提供了在6MWD中从基线增加了至少约10分钟，例如约10、15、20或约30分钟。在另一个实施例中，在6MWT之后，本公开的方法向受试者提供了比基线BDI低至少约0.5至约1.0个指数点。
可以使用任何合适的生活质量测量。例如，健康调查提供了自我报告多项目量表，所述量表测量八个健康参数：身体功能、由于身体健康问题而导致的角色限制、身体疼痛、一般健康、活力(能量和疲劳)、社会功能、由于情绪问题导致的角色限制以及心理健康(心理困扰和心理健康)。所述调查还提供了身体成分摘要和心理成分摘要。在一个实施例中，本公开的方法向受试者提供了SF-36身体健康相关参数(身体健康、角色-身体、身体疼痛和/或一般健康)中的至少一个和/或SF-36心理健康相关参数(活力、社会功能、角色-情感和/或心理健康)中的至少一个与基线相比的改善。这种改善可以采取在任何一个或多个参数的量表上增加至少1分，例如至少2分或至少3分的形式。
本公开的方法还可以改善被治疗的受试者的预后。例如，本公开的方法可以向受试者提供治疗期间临床恶化事件，和/或血清脑利钠肽(BNP)或NT前体BNP或其N末端激素原NT-pro-BNP浓度从基线降低的概率降低，其中，在基线时，从受试者首次诊断病状开始的时间不大于约2年。
在各个方面，从首次诊断开始的时间可以例如不大于约1.5年、不大于约1年、不大于约0.75年或不大于约0.5年。临床恶化事件(CWE)包含死亡、肺移植、PAH住院、房间隔造口术、另外的肺高压疗法的开始或其组合。PAH临床恶化的时间定义为从开始治疗到CWE首次发生的时间。
在一个实施例中，本公开的方法提供了BNP或NT-pro-BNP浓度从基线降低至少约15％，例如至少约25％、至少约50％或至少约75％。
在一个实施例中，本公开的方法提供了在治疗期间死亡、肺移植、肺动脉高压住院、房间隔造口术和/或另外的肺高压疗法的开始的概率降低至少约25％、例如至少约50％、至少约75％>或至少约80％。
本公开的方法还可以将患有PAH的受试者的寿命(延长生存时间)从开始治疗的时间开始延长例如至少约30天。
用于本公开的方法中的抗PDGF-B抗体或其抗原结合片段的治疗有效量可以是相应抗体的约0.05mg至约600mg；例如，约0.05mg、约0.1mg、约1.0mg、约1.5mg、约2.0mg、约10mg、约20mg、约30mg、约40mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约110mg、约120mg、约130mg、约140mg、约150mg、约160mg、约170mg、约180mg、约190mg、约200mg、约210mg、约220mg、约230mg、约240mg、约250mg、约260mg、约270mg、约280mg、约290mg、约300mg、约310mg、约320mg、约330mg、约340mg、约350mg、约360mg、约370mg、约380mg、约390mg、约400mg、约410mg、约420mg、约430mg、约440mg、约450mg、约460mg、约470mg、约480mg、约490mg、约500mg、约510mg、约520mg、约530mg、约540mg、约550mg、约560mg、约570mg、约580mg、约590mg、约600mg、约610mg、约620mg、约630mg、约640mg、约650mg、约660mg、约670mg、约680mg、约690mg、约700mg、约710mg、约720mg、约730mg、约740mg、约750mg、约760mg、约770mg、约780mg、约790mg、约800mg、约810mg、约820mg、约830mg、约840mg、约850mg、约860mg、约870mg、约880mg、约890mg、约900mg、约910mg、约920mg、约930mg、约940mg、约950mg、约960mg、约970mg、约980mg、约990mg或约1000mg。
单个剂量内含有的抗PDGF-B抗体或其抗原结合片段的量可以用每千克患者体重的抗体毫克(即mg/kg)来表示。例如，抗PDGF-B抗体或其抗原结合片段可以约0.0001至约50mg/kg的患者体重(例如，0.1mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、3.0mg/kg、3.5mg/kg、4.0mg/kg、4.5mg/kg、5.0mg/kg、5.5mg/kg、6.0mg/kg、6.5mg/kg、7.0mg/kg、7.5mg/kg、8.0mg/kg、8.5mg/kg、9.0mg/kg、9.5mg/kg、10.0mg/kg、10.5mg/kg、11.0mg/kg、11.5mg/kg、12.0mg/kg、12.5mg/kg、13.0mg/kg、13.5mg/kg、14.0mg/kg、14.5mg/kg、15.0mg/kg、15.5mg/kg、16.0mg/kg、16.5mg/kg、17.0mg/kg、17.5mg/kg、18.0mg/kg、18.5mg/kg、19.0mg/kg、19.5mg/kg、20.0mg/kg等)的剂量向患者施用。
可以在规定的时程内向受试者施用多剂量的抗PDGF-B抗体或其抗原结合片段，或包括抗PDGF-B抗体或其抗原结合片段的药物组合物。根据本公开的此方面的方法包括向受试者依次施用多剂量的本公开的活性成分。如本文所使用的，“依次施用”意指每个剂量的活性成分在不同时间点，例如，在隔开预定间隔(例如，数小时、数天、数周或数月)的不同日期向受试者施用。本公开包含方法，所述方法包括向患者依次施用单一初始剂量的活性成分，然后施用一个或多个第二剂量的活性成分，并且任选地随后施用一个或多个第三剂量的活性成分。
术语“初始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”是指施用抗PDGF-B抗体或其抗原结合片段或本公开的组合疗法的时间顺序。因此，“初始剂量”是在治疗方案开始时施用的剂量(也被称为“基线剂量”)；“第二剂量”是在初始剂量之后施用的剂量；并且“第三剂量”是在第二剂量之后施用的剂量。初始、第二和第三剂量可以全部含有相同量的抗PDGF-B抗体或其抗原结合片段，但是在施用频率方面可能彼此不同。然而，在某些实施例中，在治疗过程中初始、第二和/或第三剂量中含有的抗PDGF-B抗体或其抗原结合片段的量彼此不同(例如，适当地调高或降低)。在某些实施例中，在治疗方案开始时施用两个或更多个(例如，2个、3个、4个或5个)剂量作为“负荷剂量”，然后是在较不频繁的基础上施用后续剂量(例如，“维持剂量”)。
在本公开的某些示例性实施例中，紧接着前一剂量后1至26(例如，1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、15、151/2、16、161/2、17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/2、23、231/2、24、241/2、25、251/2、26、261/2或更多)周施用每个第二和/或第三剂量。如本文所使用的，短语“紧接着前一剂量”意指按照多次施用的顺序，在没有中间剂量的情况下在按顺序施用下一个剂量之前向患者施用的抗PDGF-B抗体或其抗原结合片段的剂量。
根据本公开的此方面的方法可以包括向患者施用任意数量的第二和/或第三剂量。举例来说，在某些实施例中，仅向患者施用单个第二剂量。在其它实施例中，向患者施用两个或更多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个)第二剂量。同样地，在某些实施例中，仅向患者施用单个第三剂量。在其它实施例中，向患者施用两个或更多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个)第三剂量。
在涉及多个第二剂量的实施例中，每个第二剂量可以与其它第二剂量相同的频率施用。例如，每个第二剂量可以紧接着前一剂量后1至2周或1至2个月向患者施用。类似地，在涉及多个第三剂量的实施例中，每个第三剂量可以与其它第三剂量相同的频率施用。例如，每个第三剂量可以紧接着前一剂量后2至12周向患者施用。在本公开的某些实施例中，在治疗方案的过程中，向患者施用的第二和/或第三剂量的频率可以变化。施用频率还可以在医生的治疗过程期间根据临床检查后个体患者的需要进行调节。
在一些实施例中，抗PDGF-B抗体或其抗原结合片段可以作为单一疗法(即，作为唯一的治疗剂)施用。在其它实施例中，抗PDGF-B抗体或其抗原结合片段可以或与一种或多种另外的治疗剂组合施用。
在包括向受试者施用抗PDGF-B抗体或其抗原结合片段以及至少一种另外的治疗剂的组合方法中，抗体和另外的治疗剂可以同时或基本上同时，例如，以单个治疗剂量，或以同时或彼此少于约5分钟内施用的两个单独剂量向受试者施用。可替代地，抗体和另外的治疗剂可以依次，例如，以单独的治疗剂量彼此间隔超过约5分钟向受试者施用。
因此，在一个实施例中，所述方法进一步包括施用治疗有效量的选自由以下组成的组的至少一种治疗剂：抗凝剂、利尿剂、强心苷、钙通道阻滞剂、血管扩张剂、前列环素类似物、内皮拮抗剂、磷酸二酯酶抑制剂、内肽酶抑制剂、降脂剂和血栓素抑制剂。在一个实施例中，本公开的方法进一步包括施用治疗有效量的至少一种或多种另外的一种或多种治疗性抗体或抗体，或其一种或多种抗原结合片段。在一个实施例中，一种或多种另外的一种或多种抗体选自由以下组成的组：一种或多种抗Grem 1抗体、一种或多种抗PDGFRβ抗体、一种或多种抗TLR4抗体、一种或多种抗TLR2抗体、一种或多种抗EDN1抗体和一种或多种抗ASIC1抗体。
合适的抗凝剂的实例包含但不限于例如，可用于治疗具有血栓形成和血栓栓塞风险增加的肺高压患者的华法林(warfarin)。
合适的钙通道阻滞剂的实例包含但不限于地尔硫卓(diltiazem)、非洛地平(felodipine)、氨氯地平(amlodipine)和硝苯地平(nifedipine)。
合适的血管扩张剂包含但不限于例如，前列环素、依前列醇(epoprostenol)、曲前列环素(treprostinil)和一氧化氮(NO)。
合适的示例性磷酸二酯酶抑制剂包含但不限于具体地磷酸二酯酶V抑制剂，如他达拉非(tadalafil)、西地那非(sildenafil)和伐地那非(vardenafil)。
合适的内皮素拮抗剂的实例包含但不限于例如波生坦(bosentan)和西他生坦(sitaxentan)。
合适的前列环素类似物包含但不限于例如伊洛美定(ilomedin)、曲前列环素和依前列醇。
合适的降脂剂包含但不限于例如，HMG CoA还原酶抑制剂，如辛伐他汀(simvastatin)、普伐他汀(pravastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、伊伐他汀(itavastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)、ZD-4522和色利伐他汀(cerivastatin)。
合适用于本公开的组合疗法的利尿剂包含但不限于例如，氯噻酮(chlorthalidon)、吲达帕胺(indapamid)、苄-氟甲噻嗪(bendro-flumethiazid)、美托拉宗(metolazon)、环戊氯噻嗪(cyclopenthiazid)、泊利噻嗪(polythiazid)、美夫西特(mefrusid)、西马匹特(ximapid)、氯噻嗪(chlorothiazid)和氢氯噻嗪(hydrochlorothiazid)。
其它治疗剂的实例包含但不限于例如，ACE抑制剂，如依那普利(enalapril)、雷米普利(ramipril)、卡托普利、西拉普利(cilazapril)、群多普利(trandolapril)、福辛普利(fosinopril)、喹那普利(quinapril)、莫西普利(moexipril)、赖诺普利(lisinopril)和培哚普利(perindopril)；或ATII抑制剂，如氯沙坦(losartan)、坎地沙坦(candesartan)、厄贝沙坦(irbesartan)、恩布沙坦(embusartan)、缬沙坦(valsartan)和替米沙坦(telmisartan)；或伊洛前列素(iloprost)、β前列素(betaprost)、L-精氨酸、奥马曲拉(omapatrilat)、氧和/或地高辛(digoxin)。
所述方法还可以包含组合使用激酶抑制剂(例如，BMS-354825、卡奈替尼(canertinib)、厄洛替尼、吉非替尼、伊马替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、来他替尼(lestaurtinib)、洛那法尼(lonafarnib)、哌加他尼(pegaptanib)、培利替尼(pelitinib)、司马沙尼(semaxanib)、坦度替尼(tandutinib)、替吡法尼(tipifarnib)、瓦他拉尼(vatalanib)、氯尼达明(lonidamine)、法舒地尔(fasudil)、来氟米特(leflunomide)、硼替佐米(bortezomib)、伊马替尼、厄洛替尼和格列卫(glivec))和/或弹性蛋白酶抑制剂。
另外的治疗活性组分可以在施用抗PDGF-B抗体之前向受试者施用。例如，如果第一组分在施用第二组分1周前、72小时前、60小时前、48小时前、36小时前、24小时前、12小时前、6小时前、5小时前、4小时前、3小时前、2小时前、1小时前、30分钟前、15分钟前、10分钟前、5分钟前或少于1分钟前施用，则第一组分可被视为在第二组分“之前”施用。在其它实施例中，另外的治疗活性组分可以在施用抗PDGF-B抗体或其抗原结合片段之后向受试者施用。例如，如果第一组分在施用第二组分1分钟后、5分钟后、10分钟后、15分钟后、30分钟后、1小时后、2小时后、3小时后、4小时后、5小时后、6小时后、12小时后、24小时后、36小时后、48小时后、60小时后、72小时后施用，则第一组分可被视为在第二组分“之后”施用。
在又其它实施例中，另外的治疗活性组分可以在施用本公开的抗PDGF-B抗体或其抗原结合片段的同时向受试者施用。出于本公开的目的，“同时”施用包含例如以单一剂型，或以在彼此约30分钟或更少时间内向受试者施用的单独的剂型向受试者施用抗PDGF-B抗体和另外的治疗活性组分。如果以单独的剂型施用，则每个剂型可以通过相同的途径施用(例如，抗PDGF-B抗体和另外的治疗活性组分可以静脉内、皮下、玻璃体内等施用)；可替代地，每种剂型可以通过不同的途径施用(例如，抗PDGF-B抗体可以局部(例如，玻璃体内)施用，并且另外的治疗活性组分可以全身施用)。在任何情况下，出于本公开的目的，以单一剂型、通过相同途径以单独的剂型或通过不同途径以单独的剂型施用组分均被视为是“同时施用”。出于本公开的目的，施用另外的治疗活性组分“之前”、“同时”或“之后”(如以上在本文中所定义的那些术语)施用抗PDGF-B抗体被视为是与另外的治疗活性组分“组合”施用抗PDGF-B抗体或其抗原结合片段。
实例
提出以下实例，以向本领域的普通技术人员提供关于如何制备和使用本发明的方法和组合物的完整公开和描述，并且不旨在限制发明人认为是其发明的范围。除非另外指明，否则份数是重量份数，分子量是平均分子量，温度是以摄氏度为单位计，并且压力是在大气压下或接近大气压。
术语REGN13335和H4H13145P在本文中可互换使用。进一步，术语REGN15171和H4H13132P在本文中可互换使用。
实例1：抗PDGF抗体的筛选和体外表征
利用Adam6/VI-3，ULC1633和ULC1635小鼠进行抗PDGF-B抗体的分离和初步筛选。考虑因素包含需要猴交叉器和小鼠交叉器，并要求阻断PDGF-BB和PDGF-AB信号传导。与DD的交叉被认为不太可能，并且预计不会与PDGF AA进一步交叉反应。AF-220-NA山羊非人PDGFBB多克隆中和抗体用作对照/比较抗体。
从12只小鼠中分离出了PES分选的B细胞。Adam6/VI-3、ULC1633和ULC1635小鼠被用于分选抗原生物素-hPDGFBB或mPDGFBB，并且收集了6387个B细胞。处理了十一个B细胞板(3614个B细胞)，并且仅扩增VH用于ULC小鼠。共有1056个PCR对被克隆到hIgG1 BST质粒中。Ag+样品的初步筛选由ELISA进行。共鉴定出854个Ag+(81％)样品(>1000MFI至hPDFGBB(派普泰克公司(Peprotech)))。通过使用阻断ELISA、阻断Luminex、Biacore和生物测定对Ag+样品进行二次筛选。通过使用小鼠Biacore和生物测定分析小鼠交叉器。下图1和表1总结了来自VI-3小鼠的单克隆抗体的筛选结果。
表1：来自VI-3小鼠的单克隆抗体的筛选结果。
使用实时表面等离子体共振(SPR)生物传感器仪器MASS-1确定了人和小鼠PDGF-B与本公开的纯化的抗PDGF-B单克隆抗体结合的平衡解离常数(KD值)。所有结合研究在25℃和37℃下在10mM HEPES、300mM NaCl、3mM EDTA、1μg/mL肝素和0.05％v/v表面活性剂Tween-20、pH为7.4的(HBS-T)运行缓冲液中进行(图2)。HCA传感器表面首先通过胺偶联将单克隆小鼠抗人Fc抗体(GE，#BR100839)衍生化，并分别捕获抗PDGF-B单克隆抗体。将在HBS-EHT运行缓冲液制备的不同浓度的人PDGF-B(hPDGF-B；50nM、12.5nM、3.125nM)或小鼠PDGF-B(mPDGF-B；50nM、12.5nM、3.125nM)以50微升/分钟的流速注入捕获的抗PDGF-B单克隆抗体持续4分钟，同时在HBS-T运行缓冲液中监测与捕获的抗PDGF-B单克隆抗体结合的PDGF-B试剂的解离持续10分钟。动力学缔合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)通过使用Scrubber 2.0c软件将实时结合传感图拟合到具有质量传输限制的1:1结合模型来确定。不同抗PDGF-B单克隆抗体的结合解离平衡常数(KD)和解离半衰期(t1/2)是根据动力学速率常数如下计算的：
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表2-4示出了在25℃和37℃下hPDGF-B或mPDGF-B与本公开的不同抗PDGF-B单克隆抗体结合的结合动力学参数。
表2：17种抗PDGF-B mAb的亲和力和t1/2–人与小鼠抗体之间的比较。
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NB；在当前实验条件下没有观察到结合。
表3：在25℃和37℃下人PDGF BB的结合动力学。
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NB；在当前实验条件下没有观察到结合。
表4：在25℃和37℃下小鼠PDGF BB的结合动力学。
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NB：在当前实验条件下没有观察到结合。
表5-6示出了在37℃下hPDGF-B或mPDGF-B与本公开的示例性抗PDGF-B单克隆抗体结合的结合动力学参数。
表5：在37℃下H4H13132P的Bia-core结合亲和力和t1/2。
表6：在37℃下H4H13145P的Bia-core结合亲和力和t1/2。
这些结合数据证实，抗PDGF-B-mAb(例如，H4H13132P和H4H13145P)可以在pM浓度下与人、食蟹猴、大鼠和小鼠PDGF-BB特异性结合。
实例2：重链和轻链可变区氨基酸序列
表7示出了PDGF-B特异性选定抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列对以及其对应的抗体标识符。抗体通常根据以下命名法在本文中提及：Fc前缀(例如“H4H”)，后跟数字标识符(例如“3132”，如表7中所示)，后跟“P”后缀。因此，根据此命名法，抗体可以被称为例如“H4H13132P”。本文中使用的抗体名称上的H4H前缀表示抗体的特定Fc区。例如，“H4H”抗体具有人IgG4 Fc。
表7
实例3：纯化的抗PDGF-BB单克隆抗体之间的交叉竞争
为了确定纯化的抗PDGF-BB单克隆抗体(mAb)之间的交叉竞争，通过将α-hFc涂覆的Octet生物传感器浸渍在含有50μg/mL的抗人PDGF-BB mAb的孔中持续3分钟，捕获了大约1.2–1.6nM的抗人PDGF-BB mAb(图3A)。H4H hFc(同种型对照)被用作阴性对照。将未占用的α-hFc Octet传感器通过浸入含有阻断mAb的溶液(200μg/mL的H4H人Fc(同种型对照)1)的孔中进行饱和持续4分钟，并将100nM的人PDGF-BB(R&D公司)与1uM的抗PDGF-BB mAb预温育持续至少2小时。将阻断mAb的饱和Octet生物传感器浸入含有抗PDGF-BB mAb和人PDGF-BB的预混液的孔中持续4分钟。在每个循环结束时，α-hFc Octet传感器在10mM HCl中再生。在分析过程中，从整个柱中减去由于mAb与捕获表面结合而产生的自背景结合信号。比较了mAb-1的结合反应，并基于其各自的mAb-1结合反应对竞争和非竞争mAb进行分箱。
交叉竞争研究使用HBST+0.1mg/mL BSA的运行缓冲液在25℃下在Octet HTX仪器上进行。传感器类型为反His，捕获流速/时间为1000rpm，持续3分钟，并且不同时间的样品注射流速/时间为1000rpm。图3B描绘了显示抗体交叉竞争测定的结合反应的结果的矩阵。纯化的抗体的亲和力范围为0.002nM至2nM。
实例4：通过使用ELISA表征抗PDGF-B抗体
抗PDGF-B抗体以两种阻断ELISA形式进行表征：阻断PDGF-BB和PDGF-AB与板捕获的PDGFR-B结合。为了进行这项研究，在4℃下将1ug/ml的人PDGFR-β-mmH(REGN 979批次号01-100326)涂覆在板上过夜。
预结合：来自100nM+100pM最终浓度biot-PDGF-AB(R&D公司，222-AB)或60pM最终浓度biot-PDGF-BB(R&D公司，220-BB)的Ab的12点3倍连续稀释。室温下1小时。检测：1:10,000SA-HRP。
如图4A-C所描绘的，鉴定出阻断了>70％的5种强抗PDGF-B抗体；3种抗PDGF-B抗体阻断了PDGF-BB和PDGF-AB两者，并且用于PDGF-BB的IC50值的范围为0.23-1.8nM；2种抗PDGF-B抗体仅阻断了PDGF-BB，并且IC50值的范围为0.55-0.64nM；6种中度抗PDGF-B抗体阻断了>45％；2种抗PDGF-B抗体阻断了PDGF-BB和PDGF-AB两者，并且用于PDGF-BB的IC50值的范围为2.8-13nM；4种抗PDGF-B抗体仅阻断了PDGF-BB，并且IC50值的范围为0.64-2.8nM；并且6种抗PDGF-B抗体为非阻断剂。
实例5：抗PDGF-B抗体抑制人PDGF-BB
为了确定抗PDGF-B抗体的活性，使用PDGF-BB进行生物测定。为了进行生物测定，将20,000个HEK293/SRE-Luc/hPDGFRβ单细胞分选细胞/孔接种在0.1％ FCS Optimem中过夜。确定人PDGF BB(派普泰克公司，目录号100-14B，批次号111004，源自大肠杆菌(E.coli))的剂量反应，从100nM开始进行1:3连续稀释。确定抗PDGF-B、抗PDGFRb(REGN2176，08-R120731)的抑制作用，并将纯化的抗体(从100nM开始的1:3连续稀释)加入到具有以500pM的人PDGF-BB的细胞中。将板在37℃下温育5.5小时，并使用One-Glo(普洛麦格公司(Promega))测量发光。
如图5A所描绘的，17种抗hPDGF-B抗体中有13种以88pM–7.2nM的IC50值和42–99％的最大抑制率抑制500pM的hPDGF BB。此外，如图5B中所描绘的，两种抗PDGF-B抗体被人PDGF-BB活化。图5C描绘了17种抗hPDGF-B抗体中有8种以99pM–>50nM的IC50值和32–99％的最大抑制率抑制5nM的人PDGF-AB。H4H13132P和H4H13145P以8.8和2.6nM的IC50值阻断到基线。最后，图5D描绘了17种抗hPDGF-B抗体中有10种以450pM–6.4nM的IC50值和39–98％的最大抑制率抑制600pM的小鼠PDGF-BB。这些结果证实，6种抗PDGF-B抗体以310pM-2nM的IC50值对人PDGF-BB表现出完全抑制。具体地，H4H13145P将所有3种配体，即hPDGF BB，hPDGF AB和mPDGF BB抑制到基线。下表8-9中总结了通过在HEK293/SRE-luc/hPDGFRβ细胞中使用示例性抗hPDGF-B抗体抑制PDGF-B活化的方法。
表8：通过在HEK293/SRE-luc/hPDGFRβ细胞中的H4H13132P抑制PDGF-B活化
H4H13132P以1.9–9.0nM的IC50值对hPDGF-BB、hPDGF-AB、mPDGF-BB和cynoPDGF-BB表现出大于87％的抑制率。
表9：通过在HEK293/SRE-luc/hPDGFRβ细胞中的H4H13145P抑制PDGF-B活化
H4H13145P以0.5-3nM的IC50值对hPDGF-BB、hPDGF-AB、mPDGF-BB和cynoPDGF-BB表现出完全抑制。
实例6：分析重组人PDGF-BB与抗PDGF-B单克隆抗体(mAb)之间形成的复合物
体积排阻色谱法与多角度激光散射(SEC-MALLS)相联合，用于评估重组人PDGF-BB(派普泰克公司)与若干抗PDGF先导mAb之间形成的复合物的相对尺寸分布。在1X PBS，pH7.4中制备五mM PDGF-BB+5mM mAb(等摩尔比)用于测试的每个抗PDGF-B mAb，并在由SEC-MALLS分馏总蛋白之前，使其在室温下温育3小时。在SEC-MALLS条件下，在1X PBS，pH 7.4(流动相)中将100mg(总蛋白)的每个样品一式两份注射到通用电气医疗公司(GEHealthcare)Superose 6 10/300GL柱中，每次注射运行时间为90分钟。
H4H13145P(峰1)与人PDGF-BB主要形成明显的复合物(峰2)，这与2:2mAb:人-PDGF-BB物种相一致(图6A)。此外，H4H13145P(峰1)与人PDGF-BB主要形成明显的复合物(峰2)，这与2:2mAb:人-PDGF-BB物种相一致(图6B)。图6C描绘了来自形成最明显的2:2mAb:人-PDGF-BB物种的样品的叠加色谱图，未观察到可检测到的高阶复合物。
一般而言，大多数抗PDGF mAb似乎与人PDGF-BB形成主要明显的复合物，这与2:2mAb:hPDGF-BB物种相一致，几乎没有观察到更高阶的复合物(“纸娃娃”)。在样品H4H13132P、H4H13145P和H4H13162P中观察到少量大于2:2mAb:hPDGF-BB物种的更高阶的复合物；然而，尚不清楚这些复合物是由于hPDGF-BB与抗体的单体形式或与在每个mAb样品中以不同的量存在的抗体多聚体(HMW物种)相互作用而形成的。可替代地，这些样品中的更高阶的复合物可能是由于单体抗体与少量的多聚hPDGF-BB的相互作用，这也被检测到。样品H4H13148P和H4H13169P似乎形成了最明显的2:2mAb:hPDGF-BB物种，不存在可检测到的更高阶的复合物。有趣的是，尽管由这两个样品形成的复合物具有相似的计算摩尔质量，但由H4H13148P形成的复合物洗脱明显晚于等效的H4H13169P复合物，这表明由H4H13148P形成的复合物的分子形状(流体动力学半径)在性质上更加致密。在H4H13155P样品中观察到复合物的广泛分布<2:2mAb:hPDGF-BB复合物的假定摩尔质量，这可以表明溶液中用hPDGF-BB形成的复合物在分馏过程中解离，或者样品在测试的实验条件下未达到平衡。
实例7：抗PDGF-B单克隆抗体-H4H13132P和H4H13145P的食蟹猴PDGF-BB蛋白生物测定验证
食蟹猴PDGF-BB获得自翠丰集团(KingFisher)和义翘神州公司(SinoBiological)作为Fc-融合。将HEK293/SRE-Luc/mfPDGFBB-ecto/hPDGFRb-cyto细胞p2接种到96孔板上，并在37℃，5％ CO2下将细胞以2.5x105细胞/ml(20,000个细胞/孔)的80ul/孔加入过夜。PDGF-BB的剂量反应从20nM开始以1至3倍稀释进行确定。为了确定抑制，分析了1:3连续稀释的Ab，从500nM开始，以500pM PDGF-BB作为恒量。将板在37℃、5％ CO2下温育5.5小时。将板从培养箱中取出并在室温(RT)下平衡大约30分钟。将100ul的One-glo底物(平衡至室温)加入到板的所有孔中，并在室温下在平板振荡器上混合10分钟。发光通过使用SpectraMaxi3X(PerkinElmerTM)进行测量。如图7所描绘的，在此测定系统中，H4H13145P被鉴定比H4H13132P对人和食蟹猴PDGF-BB蛋白两者更有效。
以下测定用于确定抗PDGF-B抗体阻断食蟹猴PDGF-BB诱导的细胞中表达猴PDGFRβ的细胞外结构域的信号传导的效力。
荧光素酶生物测定
经工程化的细胞系HEK293/SRE-Luc/mfPDGFRβ-ecto/hPDGFRb-cyto细胞(ACL7804)用于测定H4H13145P和H4H13132P中和由食蟹猴PDGF-BB驱动的荧光素酶表达的能力。使用测定培养基(含0.5％牛血清白蛋白，1％青霉素-链霉素-谷氨酰胺的DMEM培养基)和饥饿过夜的血清(37℃，5.0％CO2)将细胞接种到96孔板中。
生成剂量反应曲线
通过将在测定培养基中稀释的配体添加到浓度范围为3pM至20nM的HEK293/SRE-Luc/mfPDGFRβ-ecto/hPDGFRb-cyto细胞中来确定食蟹猴PDGF-BB的剂量反应曲线。一式两份测试每种浓度，并且未加入配体的孔作为阴性对照。加入食蟹猴PDGF-BB后，将细胞在37℃，5.0％ CO2下温育5.5小时，并且然后平衡至室温30分钟。向每个孔中加入等体积的ONE-Glo荧光素酶底物，并将板在室温下温育另外5分钟。在SpectraMaxi3X读板器上测量相对光单位(RLU)，并通过四参数逻辑方程在10点剂量反应曲线(GraphPad Prism)上分析值。
抑制曲线的生成
测试H4H13145P和H4H13132P抑制HEK293/SRE-Luc/mfPDGFRβ-ecto/hPDGFRb-cyto细胞系中的食蟹猴PDGF-BB介导的mfPDGFRβ信号传导。将H4H13145P、H4H13132P或阴性对照抗体(REGN1945)一式两份加入到浓度范围为228pM至500nM的细胞中，然后在500pM时加入食蟹猴PDGF-BB。将板在37℃，5.0％ CO2下温育5.5小时，并平衡至室温30分钟。将等量的ONE-Glo荧光素酶底物加入到每个孔并且将板在室温下温育另外5分钟。在SpectraMaxi3X读板器上测量相对光单位(RLU)，并通过四参数逻辑方程在10点剂量反应曲线(GraphPadPrism)上分析值。
结果
阻断配体介导的食蟹猴PDGF-BB介导的mfPDGFRβ信号传导
在HEK293/SRE-Luc/mfPDGFRβ-ecto/hPDGFRb-cyto细胞系中，刺激mfPDGFRβ信号传导至最大活性水平的50％(EC50)所需的义翘神州公司食蟹猴PDGF-BB Fc标记的浓度为167pM(图7)。在存在固定浓度的食蟹猴PDGF-BB的情况下，确定了H4H13132P、H4h13145P和同种型对照抗体REGN1945(针对猫Fel d 1升高的抗体，不与mfPDGFRβ结合)将PDGF-BB信号传导降低到最大活性的50％(IC50)所需的抗体的浓度。如图7所示，H4H13132P和H4H13145P分别以781pM和16pM的IC50值有效阻断了由固定浓度为500pM的食蟹猴PDGF-BB诱导的食蟹猴PDGF-BB信号传导。与之相反，IgG4同种型对照抗体REGN1945在阻断由食蟹猴PDGF-BB诱导的食蟹猴PDGF-BB信号传导上无效。
实例8：商业猴PDGF-BB试剂与抗PDGF-B单克隆抗体-H4H13132P和H4H13145P的Biacore结合验证
为了确定商业猴PDGF-BB(翠丰集团，义翘神州公司)与抗PDGF-BmAb H4H13132P和H4H13145P的结合动力学，在25℃下在用于MASS-2的抗hFc HCA芯片上用阴性对照(REGN1945)捕获大约250-350RU的抗PDGF-B mAb。制备90nM的人和猴PDGF-BB，并连续稀释3倍。将样品以25uL/分钟注射持续3分钟，并监测解离持续10分钟。通过使用具有质量传递限制的1:1结合模型拟合实时数据来评价动力学参数。如图8所描绘的，商业猴PDGF-BB显示出与抗PDGF-BmAb H4H13132P和H4H13145P的特异性结合。
实例9：PDGF-BB上mAb结合表位的蛋白质印迹检测
了解抗体的不同性能的关键是确定其识别的结合位点或表位。表位通常分为两类，线性表位和构象表位，在线性表位中一段连续氨基酸足以结合，并且在构象表位中关键氨基酸残基通过蛋白质折叠聚集在一起。线性表位可以是免疫测定，如蛋白质印迹(WB)前样品制备过程中蛋白质靶标完全或部分变性的应用的首选。因此，用H4H13145P和H4H13132P对PDGF-BB进行蛋白质印迹分析，以确定这些mAb是否与线性表位结合。
来自R&D系统公司1μg的人重组PDGF-BB二聚体蛋白(CF)在还原(R)和非还原(NR)条件下用SDS PAGE 5-20％梯度凝胶分解。以下步骤用于用PDGF-BB mAb H4H13145P和商用抗PDGF-BB ab(R&D公司抗人PDGF-BB ab:人PDGF-BB抗体AF-220-NA)检测在R和NR条件下的PDGF-BB带。对于非特异性阻断：将PVDF膜在室温下在5％ BSA中阻断1小时。对于初级Ab印迹：PVDF膜(1)PDGF-BB mAb H4H13145P或(2)在5％ BSA TBST中以1.0ug/ml稀释的R&D公司抗PDGF-BB mAb在4℃下过夜。将膜在室温下在TBST洗涤缓冲液中洗涤10分钟(三次)。二级抗体温育包括在室温下将膜在5％ BSA TBST中在HRP缀合的抗小鼠二级Ab中温育1小时。膜洗涤包括在室温下使用TBST缓冲液10分钟(三次)。所述信号是用PierceTM蛋白质印迹信号增强器开发的。
将一μg/道的重组人PDGF-BB在还原(R)和非还原(NR)条件下用SDS-PAGE分解，并通过银染色可视化，从而在13kDa和28kDa下分别示出了单条带。图9描绘了抗体结合表位的蛋白质印迹分析，所述分析证实了H4H13145P与人rPDGF-BB的线性表位结合。
实例10：H4H13145P的临床前实验PAH功效评估
通过先导mAb(H4H13145P)的PDGF-B阻断在PAH的多种模型(小鼠+大鼠)中提供了强大的治疗益处。这些效果比迄今为止包含SOC在内的任何治疗或基准都更令人瞩目。这些结果证实，抗PDGF-B抗体将提供有效的非血管扩张性PAH疗法。
为了评价抗PDGF-B抗体H4H13145P在肺动脉高压中的效果，使用慢性缺氧诱导的肺动脉高压小鼠模型和野百合碱大鼠模型进行了单独的研究。
下表10中总结了PAH模型。
表10：PAH临床前模型
以下材料和方法用于这些研究。
材料和方法
小鼠
肺动脉高压(PAH)的特征在于肺血管重塑，这导致血管阻力逐渐增加。肺压升高诱发代偿性右心室肥大并最终导致衰竭。血小板衍生生长因子-B(PDGF-B)是有效丝裂原，所述丝裂原是血小板衍生生长因子(PDGF)家族的成员。PDGF-B/PDGFRβ信号传导已示出是调节病理性肺动脉血管重塑的中枢信号传导通路。本研究是为了比较当治疗性给药时，抗PDGF-B和抗PDGFRβ抗体在缺氧/sugen PAH小鼠中的功效。
对于第一项研究，使用了14至16周大的雄性人源化PDGFRβhu-hu小鼠(MAID#1639)。将小鼠按重量分成处理组，使得不同组的起始体重相似。选择笼子以保持在约21％ O2(常压常氧)或放入10％ O2(常压缺氧)室(改进的6'半刚性隔离器单元，查尔斯河公司(Charles River))，所述缺氧室通过调节N2流以稳定吸入室内空气来保持低O2水平。缺氧室中的小鼠每周一次皮下给予20mg/kg的VEGF受体抑制剂Sugen5146持续6周。如表11所述，从第21天开始向小鼠施用抗体持续3周。到第6周结束时，通过右心导管插入术测量右心室收缩压(RVSP)，并通过富尔顿指数按RV与(LV+隔膜)的重量比计算RV肥大。
对于第二项研究(研究2)，使用12至14周大的雄性C57/BL小鼠(科尼克公司(Taconic))进行研究。将小鼠按重量分成处理组，使得不同组的起始体重相似。选择笼子以保持在约21％ O2(常压常氧)或放入10％ O2(常压缺氧)室(改进的6'半刚性隔离器单元，查尔斯河公司)，所述缺氧室通过调节N2流以稳定吸入室内空气来保持低O2水平。缺氧室中的小鼠每周一次皮下给予20mg/kg的VEGF受体抑制剂Sugen5146持续6周。如表12所述，从第21天开始向小鼠施用抗体持续3周。到第6周结束时，通过右心导管插入术测量右心室收缩压(RVSP)，并通过富尔顿指数按RV与(LV+隔膜)的重量比计算RV肥大。在第42天收集小鼠血清用于人抗体IgG评估。
右心导管插入术和右心室收缩压
将小鼠用异氟醚麻醉，并使用加热平台(加热硬垫1，布伦特里科学公司(Braintree Scientific))和循环加热水泵(T/Pump Classic，盖玛工业公司(GaymarIndustries))保持在大约37℃。每只小鼠的颈部区域通过在右颈总动脉和右颈静脉内脱毛来准备手术。形成切口，并且小心分离右颈静脉，以免损伤颈动脉和/或迷走神经。将一段5-0的丝线放置在分离的颈静脉下，以允许血管向颅骨回缩，然后使用30号针将孔引入颈静脉。将压力导管(微尖导管传感器SPR-1000，米拉尔仪器公司(Millar Instruments，Inc.))插入到颈静脉的开口中，并通过右心房推进到右心室中。将导管连接到压力/容量仪器(MPVS-300，米拉尔仪器公司)，所述仪器测量心率以及舒张和收缩右心室压两者。这些参数是使用数据采集系统(PowerLab 4/35，AD仪器公司(AD Instruments))进行数字采集的。LabChart Pro 7.0软件(AD仪器公司)用于分析右心室压。从压示踪的60秒间隔量化读数(在2分钟的记录期之后，以允许压稳定)。分析的参数是右心室收缩压(RVSP)、心率(HR)和右心室压上升的速率(dP/dt max)。
右心肥大评估
在体内血液动力学测量后，在麻醉下通过放血对动物实施安乐死，并且然后收获RV游离壁，左心室(LV)和隔膜组织并称重。RV肥大通过富尔顿指数按RV与(LV+隔膜)的重量比计算。然后，将RV组织冷冻保存(-80℃)用于生化分析。安乐死后立即获得每只小鼠的血比容。
血清人IgG评估
血清PDGF-B抗体人IgG通过在甘油中稀释的生物素化小鼠抗人IgG1/IgG4单克隆抗体(REGN2567)在Gyrolab BioaffyTM200CD上捕获，并通过在甘油中稀释的Alexa Fluor647缀合的小鼠抗人κ抗体进行检测。血清样品如下所述继续进行：1)在稀释缓冲液中将血清样品稀释1:50；使用用于共8点标准品的稀释缓冲液将标准品稀释到2μg/mL的起始浓度。2)在洗涤中将生物素化的小鼠抗人IgG1/IgG4稀释到100ug/mL。3)在洗涤缓冲液中将AlexaFluor 647缀合的小鼠抗人κ抗体稀释到10ug/mL。4)在15,000RCF下离心捕获和检测抗体持续5分钟。5)在检测缓冲液中将检测抗体(仅使用离心检测抗体的顶层)进一步稀释到0.5ug/mL的最终浓度。6)使用GYROS生成的板图，加载样品、标准品、洗涤缓冲液，并在96孔PCR板上捕获和检测抗体。
统计分析
定量数据以平均值±标准偏差表示。通过t检验分析两组之间进行的统计分析。通过双向方差分析(ANOVA)分析时程的比较。通过单向ANOVA分析多个药物处理组的治疗效果的比较。Prism软件用于所有统计分析。p-值<0.05被认为是统计学上显著的。
表11中提供了研究1的给药方案。
表11：慢性缺氧小鼠模型研究中各组的治疗性给药和治疗方案
表12中提供了研究2的给药方案。
表12：慢性缺氧小鼠模型研究中各组的治疗性给药和治疗方案
超声评估和分析
在每项研究的最后一天，使用高频超声系统(Vevo 2100，视觉索尼克公司(VisualSonics))评估每只小鼠的肺动脉大小和右心室功能和尺寸。为了进行评估，对小鼠进行麻醉(用1.5％异氟醚以1.0cc/mL医用级空气的速率)，并用直肠温度探针监测其体温，并用加热平台(MouseMonitorS，印第安仪器公司(Indus Instruments))和加热灯保持在大约37℃。使用亮度模式(B模式)和运动模式(M模式)成像两者。小鼠心脏横截面的B模式成像用于确定肺动脉瓣水平的肺动脉横截面积(PA CSA)。M模式成像用于确定脉冲波速度时间积分(VTI)，其源自通过肺动脉的代表性多普勒血流轨迹曲线下的面积。右心室每搏输出量(RV SV)由PA CSA和VTI的乘积计算。右心室心输出量(RV CO)由SV和心率(HR)的乘积计算。M模式成像用于确定舒张期和收缩期的右心室游离壁(RVFW)厚度。在评估右心室压之前，将动物送回其家笼。
右心室压评估
随后评估所有处理组的右心室压。将小鼠用异氟醚麻醉，并使用加热平台(加热硬垫1，布伦特里科学公司)和循环加热水泵(T/Pump Classic，盖玛工业公司)保持在大约37℃。每只小鼠的颈部区域通过在右颈总动脉和右颈静脉内脱毛来准备手术。形成切口，并且小心分离右颈静脉，以免损伤颈动脉和/或迷走神经。将一段5-0的丝线放置在分离的颈静脉下，以允许血管向颅骨回缩，然后使用30号针将孔引入颈静脉。将压力导管(微尖导管传感器SPR-1000，米拉尔仪器公司)插入到颈静脉的开口中，并通过右心房推进到右心室中。将导管连接到压力/容量仪器(MPVS-300，米拉尔仪器公司)，所述仪器测量心率以及舒张和收缩右心室压两者。这些参数是使用数据采集系统(PowerLab4/35，AD仪器公司)进行数字采集的。LabChart Pro 7.0软件(AD仪器公司)用于分析右心室压。从压示踪的60秒间隔量化读数(在2分钟的记录期之后，以允许压稳定)。分析的参数是右心室收缩压(RVSP)、心率(HR)和右心室压上升的速率(dP/dt max)。血清/组织采集和右心室肥大的评估
完成右心室压测量后，取出导管并处死每只动物。打开腹部并且从腔静脉抽血进行血比容评估和血清采集。然后打开胸腔，并且用5-0丝线结扎右肺中叶，切除，稍后放入RNA(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)，目录号R0901)，并且24小时后在-80℃下冷冻。从每只动物切除心脏，并且小心地从左心室和隔膜(LV+S)切开右心室(RV)。将两块心脏组织分别在微量天平(AJ000，梅特勒公司(Mettler))上称重，以计算RV肥大指数[RV/(LV+S)；富尔顿指数]。
每个处理组的一半动物用磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH 7.4)以20-25mmHg灌注肺，然后用10％中性缓冲福尔马林(NBF)固定。在组织处理和石蜡包埋之前，在放入70％乙醇中持续至少48小时之前，将肺在10％ NBF中保持24小时。对于未进行肺灌注固定的动物，在切除、称重并在液体N2中冷冻之前，用5-0丝线结扎右下叶。
大鼠
使用六到七周大的雄性斯普拉-道来大鼠。将大鼠分成处理组，使得不同组的体重相似。在研究1中，在注射野百合碱前一天，抗体处理组的大鼠每周2次以25mg/kg皮下施用抗PDGF-B抗体或同种型对照IgG持续28天。标准处理组以每天30mg/kg口服施用马西替坦持续28天。在第一天，大鼠皮下施用40mg/kg的野百合碱或5mL/kg的生理盐水。到第28天结束时，通过右心导管插入术测量右心室收缩压(RVSP)，并通过富尔顿指数按RV与(LV+隔膜)的重量比计算RV肥大。在研究2中，大鼠皮下施用60mg/kg的野百合碱或5mL/kg的生理盐水。从第14天开始，抗体处理组的大鼠每周2次以25mg/kg皮下施用抗PDGF-B抗体或同种型对照IgG持续21天。第0-35天的体重变化用于一般毒性评估，并在第35天计算动物死亡率。
表13中提供了研究1的给药方案。
表13：进行预防性药物治疗的4周野百合碱PAH大鼠
表14中提供了研究2的给药方案。
表14：进行治疗性药物治疗的5周野百合碱严重PAH大鼠存活率
右心导管插入术和右心室收缩压
将大鼠用异氟醚麻醉，并使用加热平台(加热硬垫1，布伦特里科学公司)和循环加热水泵(T/Pump Classic，盖玛工业公司)保持在大约37℃。每只大鼠的颈部区域通过在右颈总动脉和右颈静脉内脱毛来准备手术。形成切口，并且小心分离右颈静脉，以免损伤颈动脉和/或迷走神经。将一段5-0的丝线放置在分离的颈静脉下，以允许血管向颅骨回缩，然后使用23号针将孔引入颈静脉。将压力导管(微尖导管传感器SPR-1000，米拉尔仪器公司)插入到颈静脉的开口中，并通过右心房推进到右心室中。将导管连接到压力/容量仪器(MPVS-300，米拉尔仪器公司)，所述仪器测量心率以及舒张和收缩右心室压两者。这些参数是使用数据采集系统(PowerLab 4/35，AD仪器公司)进行数字采集的。LabChart Pro 7.0软件(AD仪器公司)用于分析右心室压。从压示踪的60秒间隔量化读数(在2分钟的记录期之后，以允许压稳定)。分析的参数是右心室收缩压(RVSP)、心率(HR)和右心室压上升的速率(dP/dtmax)。
右心肥大评估
在体内血液动力学测量后，在麻醉下通过放血对动物实施安乐死，并且然后收获RV游离壁，左心室(LV)和隔膜组织并称重。RV肥大通过富尔顿指数按RV与(LV+隔膜)的重量比计算。然后，将RV组织冷冻保存(-80℃)用于生化分析。
统计分析
定量数据以平均值±标准偏差表示。通过t检验分析两组之间进行的统计分析。通过双向方差分析(ANOVA)分析时程的比较。通过单向ANOVA分析多个药物处理组的治疗效果的比较。Prism软件用于所有统计分析。p-值<0.05被认为是统计学上显著的。
结果
当与抗PDGFRβ直接比较时，抗PDGF-B在PAH的两个临床相关终点中具有卓越的功 效
缺氧/Sugen小鼠的体重变化
与常氧下的动物相比，暴露于缺氧的小鼠在6周内表现出较慢的体重增长。与同种型对照hIgG4处理组相比，抗PDGF-B抗体处理显著减轻了体重减轻。抗PDGFRβ抗体处理对缺氧暴露引起的体重变化没有任何影响(图10)。仅在第42天的时间点，Hy/Su+同种型对照IgG与Hy/Su+抗PDGF-B(**p<0.01)之间被发现存在明显差异。
缺氧/sugen小鼠中诱导的右心室压升高
基于导管的心脏右心室压评估显示，在第6周，缺氧/sugen小鼠中的同种型抗体处理组的右心室收缩压明显升高。抗PDGF-B抗体处理明显降低了9mmHg的右心室收缩压升高，而抗PDGFRβ抗体也将右心室收缩压降低到了较低的程度(图10)。Hy/Su+同种型对照IgG与Hy/Su+抗PDGF-B(****p<0.0001)和Hy/Su+抗PDGFRβ(****p<0.0001)之间被发现存在明显差异。Hy/Su+PDGFRβ与Hy/Su+抗PDGF-B(*p<0.05)之间也存在明显差异。
缺氧/sugen小鼠中诱导的右心室肥大
对小鼠右心重量的验尸分析发现缺氧/sugen暴露小鼠的明显变化(图10)。右心室重量与左心室加间隔重量的比率提供了右心室肥大的指数(即富尔顿指数)，并且缺氧/sugen组在6周表现出相对于常氧动物更大的比率，从而表明存在右心室肥大。当与缺氧/sugen同种型对照处理的小鼠相比，抗PDGF-B抗体的治疗性治疗使右心室肥大减轻了约35％。使用抗PDGFRβ抗体未能减少缺氧/Sugen暴露动物的右心室肥大。Hy/Su+同种型对照IgG与Hy/Su+抗PDGF-B(****p<0.0001)和Hy/Su+抗PDGFRβ(*p<0.05)之间被发现存在明显差异。Hy/Su+PDGFRβ与Hy/Su+抗PDGF-B(*p<0.05)之间也存在明显差异。
总之，在缺氧/sugen小鼠模式下，与抗PDGFRβ直接相比，抗PDGF-B抗体在PAH的两个临床相关终点(右心室压和肥大)中具有卓越的功效。
抗PDGF-B的预防性治疗有效保护MCT大鼠中的动物，并且抗PDGF-B的治疗性治疗 提高高剂量MCT大鼠的存活率
野百合碱大鼠中诱导的右心室压升高
研究1中，基于导管的心脏右心室压评估显示，在第4周，野百合碱大鼠中的同种型抗体处理组的右心室收缩压明显升高。血管扩张剂马西替坦和抗PDGF-B抗体处理两者均显著降低了右心室收缩压升高。野百合碱+同种型对照IgG与野百合碱+马西替坦(***p<0.001)和野百合碱+抗PDGF-B(*p<0.05)之间被发现存在明显差异(图11)。
野百合碱大鼠中诱导的右心室肥大
对大鼠右心重量的验尸分析发现用同种型对照IgG进行处理的野百合碱大鼠的明显变化。右心室重量与左心室加间隔重量的比率提供了右心室肥大的指数(即富尔顿指数)，并且用野百合碱处理的大鼠组在4周表现出相对于用生理盐水进行处理的动物更大的比率，从而表明存在右心室肥大。预防性(与同种型对照处理大鼠的野百合碱相比，抗PDGF-B抗体的处理使右心室肥大减轻了约40％)(图11)。使用血管扩张剂马西替坦未能减少野百合碱大鼠的右心室肥大。野百合碱+同种型对照IgG与野百合碱+抗PDGF-B(*p<0.05)之间被发现存在明显差异。
野百合碱大鼠的动物存活率
在研究2中，注射60mg/kg野百合碱的大鼠出现重度肺高压症状和高死亡率。值得注意的是，同种型对照IgG处理组的野百合碱动物中有90％在第35天死亡。抗PDGF-B抗体处理在注射野百合碱后14开始，并且明显减弱了动物体重减轻。在第28天(*p<0.05)和第35天(***p<0.001)，野百合碱+同种型对照IgG与野百合碱+抗PDGF-B之间被发现存在明显差异。PDGF-B抗体处理直至第35天也挽救了58％的大鼠免于死亡。野百合碱+同种型对照IgG与野百合碱+抗PDGF-B(*p<0.05)之间被发现存在明显差异，并直至第35天挽救了58％的大鼠免于死亡(图12)。
总之，在野百合碱模型中，抗PDGF-B抗体的预防性治疗降低了血液动力学终点(右心室收缩压)和右心室肥大。抗PDGF-B抗体的治疗性治疗明显改善了野百合碱大鼠的重度PAH的动物存活率。
抗PDGF-B证实了在低剂量治疗性治疗中的功效
缺氧/sugen小鼠中诱导的右心室压升高
基于导管的心脏右心室压评估显示，到第6周，缺氧/sugen小鼠中的同种型抗体处理组的右心室收缩压明显升高。抗PDGF-B抗体处理以1、3、10和25mg/kg剂量显著降低了右心室收缩压升高。Hy/Su+同种型对照IgG与Hy/Su+抗PDGF-B组之间被发现存在明显差异：在1mg/kg(*p<0.05)、3mg/kg(*<0.01)；10mg/kg(****p<0.0001)和25mg/kg(****p<0.0001)。不同剂量的PDGF-B处理之间没有统计学上明显差异(图13A)。
缺氧/sugen小鼠中诱导的右心室肥大
对小鼠右心重量的验尸分析发现缺氧/sugen暴露小鼠的明显变化(图13A)。右心室重量与左心室加间隔重量的比率提供了右心室肥大的指数(即富尔顿指数)，并且缺氧/sugen组在6周表现出相对于常氧动物更大的比率，从而表明存在右心室肥大。与缺氧/sugen同种型对照处理小鼠相比，抗PDGF-B抗体的治疗性治疗没有改变右心室肥大。常氧组与所有Hy/Su组之间存在明显差异(####p<0.0001)。
缺氧/Sugen小鼠的血清PDGF-B蛋白和抗体水平
到第6周，收集血清用于循环PDGF-B蛋白和人抗体分析。PDGF-B的循环水平在缺氧/sugen小鼠组中明显升高(图13B)。小鼠血清中人IgG的测量证实，1-25mg/kg抗PDGF-B处理组中的抗体水平呈剂量依赖性增加。1-25mg/kg重复皮下给药达到了是循环PDGF-B的千倍的nM水平血清抗体水平(图13B)。
总之，循环PDGF-BB在Hy/Su PAH小鼠中升高。抗PDGF-B抗体在缺氧/sugen小鼠模式下将肺血液动力学(右心室压)改善低至1mg/kg剂量方面表现出功效。
下表15中总结了靶向PDGF-B信号传导的体内功效。
表15
通过先导mAb(H4H13145P)靶向PDGF-B已证实在啮齿动物模型中的临床相关PAH终点(右心室收缩压-RVSP；右心室肥大-RV)中的一致且强大的功效。这些效果比迄今为止的任何治疗或基准(包含标准护理药物、对照临床研究药物和内部PDGFRb阻断剂)更令人瞩目。PDGF-B阻断剂可以提供有效的非血管扩张剂PAH疗法。
实例11：PDGFR-β阻断的安全性评估
PDGF-B/PDGFRb信号传导参与周细胞增殖、迁移、存活和附着。发芽内皮细胞分泌PDGF-B，其与周细胞特异性受体PDGFRb结合，导致周细胞的募集和附着。PDGF-B/PDGFRb信号传导受损导致周细胞募集失败和微血管周细胞覆盖率降低，从而最终导致内皮增生、血管形态发生异常和微动脉瘤形成。消融内皮来源的PDGF-B的小鼠示出是正常周细胞密度的<52％，从而导致毛细血管和静脉直径变化，毛细血管分支退化。感光细胞中PDGF-B的特异性过度表达导致周细胞还有星形胶质细胞和内皮细胞增殖增加。PDGF-B与PDGF-Rb拮抗剂的长期处理可能会导致人的周细胞丢失/血管损伤以及随后的水肿和出血。此外，抗PDGFRβ聚乙二醇化di-Fab(细胞技术公司/津莫吉尼蒂克斯公司(Celltech/Zymogenics))已报道对人类具有全身毒性(癌症患者的外周水肿)，并且长期抗PDGF-B疗法的安全性尚不清楚。
本发明人假设，特异性PDGF-B配体阻断将允许通过剩余的PDGF配体持续进行受体信号传导，并且对周细胞稳态产生较小的负面影响。已发现，以皮下3mg/kg的抗PDGF-B ab进行全身施用未引起新生小鼠中的视网膜血管周细胞损失，而抗PDGFRb ab则完全耗尽视网膜血管周细胞。观察到成年啮齿动物对高剂量抗PDGF-B和抗PDGFRb处理具有耐受性。此外，对成年小鼠进行8个月高剂量的抗PDGFRb处理并没有引起任何血管损伤、出血或明显水肿。
在分析抗PDGF-B抗体对P2野生型小鼠视网膜脉管系统的影响时，在以3mg/kg剂量的抗PDGF BB处理的视网膜中，没有观察到对周细胞覆盖的影响。虽然抗PDGF-Rβ抗体(2C5，REGN764)的全身递送有效地耗尽周细胞，但抗PDGF-BB抗体(H4H13132P和H4H13145P)在以3mg/kg的视网膜血管发育(RVD)模型中没有明显效果(图14)。
为了确定抗PDGF-B抗体对P2 WT小鼠的视网膜脉管系统的影响，在P2时注射抗PDGF-B抗体；并在P5时收集组织。所有视网膜均用抗NG2抗体温育以检测血管周细胞。观察到较高剂量的抗PDGF-B抗体(H4H13145P)对RVD模型中的周细胞耗竭表现出中等影响(图15)。
因此，本研究证实，相对于使用抗PDGFR-β抗体，使用抗PDGF-B抗体提供了更好的安全特征，并且特异性PDGF-B配体阻断将允许通过剩余PDGF配体持续进行受体信号传导，以维持周细胞功能。
实例12：抗PDGF-B抗体的药代动力学特征
在以三种不同剂量的C57BL/6WT小鼠中确定了抗PDGF-B抗体的药代动力学(PK)曲线。本研究中使用的两种抗PDGF-B单克隆抗体在37℃下以亚纳摩尔亲和力与小鼠PDGF-BB交叉。对二十六周大的雌性小鼠(总计＝36只小鼠；100％ C57BL/6背景上的WT)施用0.1、1或10mg/kg的单次皮下剂量，并在6小时、第1天、第2天、第3天、第4天、第7天、第10天、第15天、第22天和第30天的出血时间点进行分析。通过Gyros测定总人IgG：小鼠抗人κ轻链恒定(REGN654*生物素)mAb捕获/小鼠抗人IgG1/IgG4(REGN2567*Alexa647)mAb检测。通过Gyros确定功能性结合：小鼠PDGF-BB*生物素捕获/小鼠抗人IgG1/IgG4(REGN2567*Alexa647)mAb检测。
表16中描述了药代动力学研究中使用的抗PDGF-B抗体和hIgG4同种型对照的剂量。
表16
总体而言，在H4H13145P与H4H13132P之间观察到差异(图16)。H4H13145P以1mg/kg和0.1mg/kg表现出比同种型对照更快的清除率；并且以10mg/kg的PK曲线与同种型对照类似。H4H13132P在所有剂量下均表现出与同种型对照类似的PK曲线。当与H4H13145P相比，在以1mg/kg和0.1mg/kg时观察到药物暴露(AUClast)的最大差异。所有测试的单克隆抗体在每个相应剂量下均达到类似的Cmax。然而，以0.1mg/kg给药的所有三种单克隆抗体均观察到低于预期的Cmax。
用以1mg/kg和0.1mg/kg的H4H13145P观察到的清除率表明靶标介导的清除率可能是由mPDGF-BB的亚皮摩尔亲和力驱动的。值得注意的是，每个分子对hPDGF-BB的亲和力非常类似，而分子对mPDGF-BB的亲和力之间则存在差异。
可以进行功能性(小鼠PDGF-BB)结合测定来检查未结合的抗体浓度与总hIgG浓度的比较。
在食蟹猴中进行了类似的研究，以评估抗PDGF抗体的PK曲线。对食蟹猴(总计＝27)施用0.1、1或10mg/kg的单次皮下剂量，并在6小时、第1天、第2天、第3天、第4天、第7天、第10天、第15天、第22天和第30天的出血时间点进行分析。收集血浆用于PK分析，以确定抗体的目标水平(总结合和未结合PDGF-B)、hFc水平(总计)和游离目标水平(游离PDGF-B)的终点。
实例13：抗PDGF-B抗体的血管通透性研究
与血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂疗法(卡托普利)相关的血管性水肿的病理生物学机制被认为与激肽释放酶激肽血浆效应系统有关(参见Craig等人,2014《过敏和免疫学国际资料库(Int Arch Allergy Immunol.)》2014；165(2):119-27；所述文献通过引用整体附入本文)。由于缓激肽(BK)降解不充分，可能会发生血管性水肿。BK的半衰期非常短，为17秒，因为其被各种金属蛋白酶(如ACE)快速代谢。ACE抑制剂卡托普利通过阻断缓激肽的分解，增加缓激肽水平并且导致血管舒张和血管通透性增加。
进行研究以评估用高剂量的PDGF-BB抗体对健康C57成年小鼠进行长期处理是否对胃肠道(GI)、肺或脑血管通透性过高产生任何附加的影响。向11-16周大的TaconicC57BL雄性小鼠每周两次施用25mg/kg皮下剂量的对照IgG、抗PDGF-B和抗PDGFRβ抗体持续4周，如图17所述。伊文思蓝(EB)测定用于评估抗PDGF-B和PDGFRβ抗体处理4周对基线和ACEII抑制剂诱导的GI血管通透性的影响。伊文思蓝(EB)染料以中等亲和力可逆地与血清白蛋白结合，并且具有长的血液半衰期。EB与白蛋白的结合已被用来量化蛋白质渗漏，作为血管通透性增加的指标。在生理条件下，内皮对白蛋白是不可渗透的，因此结合伊文思蓝的白蛋白仍然限制于血管内。在促进血管通透性增加的病理条件下，内皮细胞部分失去其紧密接触，并且内皮变得可渗透小蛋白质，如白蛋白。与具有完整内皮的器官相比，渗透性增加的器官将显示出明显增加的蓝色。血管通透性水平可以通过简单的可视化或通过定量测量每毫克组织中掺入的染料来评估。
图18证实抗PDGF-B和抗PDGFRβ抗体的给药没有明显干扰动物体重增加。此外，没有观察到动物行为发生变化。
此外，如图19所证实的，在健康小鼠中用同种型对照IgG、抗PDGF-B和抗PDGFRβ抗体处理后，小肠GI体液潴留/水肿没有明显变化。卡托普利引起小肠湿重的轻微且统计学上不明显的增加。同种型对照IgG、抗PDGF-B和抗PDGFRβ抗体的处理没有明显改变卡托普利引起的小肠组织水肿。类似地，图20证实了通过在小鼠中用抗PDGF-B和抗PDGFRβ抗体处理，小肠中的血管通透性没有明显变化。抗PDGF-B和抗PDGFRβ抗体的处理没有恶化卡托普利引起的小肠急性血管通透性过高。
此外，如图21所证实的，在健康和卡托普利处理的小鼠中，通过抗PDGF-B和抗PDGFRβ抗体的处理，胃中GI体液潴留/水肿没有明显变化。卡托普利没有引起胃中湿重的统计学显著增加。同样地，图22示出了通过在小鼠中抗PDGF-B和抗PDGFRβ抗体的处理，胃中的血管通透性没有明显变化。抗PDGF-B和抗PDGFRβ抗体的处理没有恶化卡托普利引起的胃中急性血管通透性过高。
图23呈递了证实通过在健康和用卡托普利处理的小鼠中抗PDGF-B和抗PDGFRβ抗体的处理，肺中的GI体液潴留/水肿没有明显变化的结果。卡托普利没有引起肺部体重的显著增加。同样地，如图24所证实的，通过在健康和用卡托普利处理的小鼠中抗PDGF-B和抗PDGFRβ抗体的处理，肺中的血管通透性没有明显变化。卡托普利急性处理没有引起肺血管通透性过高。
此外，图25呈递了证实通过在健康和用卡托普利处理的小鼠中抗PDGF-B和抗PDGFRβ抗体的处理，脑中的GI体液潴留/水肿没有明显变化的结果。卡托普利没有引起脑体重的显著增加。同样地，如图26所证实的，通过在健康和用卡托普利处理的小鼠中抗PDGF-B和抗PDGFRβ抗体的处理，脑中的血管通透性没有明显变化。卡托普利急性处理没有引起脑血管通透性过高。
总体而言，抗PDGF-B和抗PDGFRβ抗体的处理没有引起小鼠中的任何明显的组织水肿和GI血管通透性变化。因此，PDGF-B和PDGFRβ中和抗体对成年小鼠GI血管通透性没有负面影响。此外，这项研究表明，PDGF-B信号在维持小鼠脉管系统周细胞完整性方面可能是可有可无的。
实例14：在25℃下PDGF-BB单克隆抗体与人PDGF-BB、猴PDGF-BB和大鼠PDGF-BB结合的Biacore结合动力学
使用Biacore T200或MASS-2仪器使用实时表面等离子体共振生物传感器确定PDGF-BB与不同PDGF-BB单克隆抗体(mAb)结合的平衡解离常数(KD)。所有结合研究均在25℃下在10mM HEPES、300mM NaCl和0.05％v/v表面活性剂Tween-20，pH 7.4(HBS-P)运行缓冲液中进行。传感器芯片表面首先通过人Fc特异性小鼠mAb(REGN2567)的胺偶联进行衍生，以捕获不同的PDGF-BB mAb。将HBS-P运行缓冲液中制备的人PDGF-BB、猴(食蟹猴(Macacafascicularis))PDGF-BB或大鼠PDGF-BB的不同浓度(90-1.11nM，3倍连续稀释)以25-50微升/分钟的流速在抗PDGF-BB mAb捕获的表面上注射持续1-3分钟，并监测其在HBS-P运行缓冲液中的解离持续5-10分钟。在每个循环结束时，PDGF-BB mAb捕获的表面使用20mM磷酸的10-12秒注射再生。
缔合率(ka)和解离率(kd)通过使用Scrubber 2.0c曲线拟合软件将实时结合传感图拟合到具有质量传输限制的1:1结合模型来确定。结合解离平衡常数(KD)和解离半衰期(t1/2)是根据动力学速率如下计算的：
并且/>
表17-19中描述了在25℃下PDGF-BB与本发明的不同PDGF-BB mAb结合的结合动力学参数。
结果
表17：不同PDGF-BB单克隆抗体的结合动力学参数
在25℃下(mAb)与人PDGF-BB结合。
*表明在当前实验条件下没有观察到抗PDGD-BB mAb的解离，并且kd的值固定在1.00E-05。
表18：在25℃下不同PDGF-BB单克隆抗体(mAb)与猴PDGF-BB结合的结合动力学参数。
表19：在25℃下不同PDGF-BB单克隆抗体(mAb)与大鼠PDGF-BB结合的结合动力学参数。
实例15使用FLIPR用原代人肺动脉平滑肌细胞和原代人肺成纤维细胞测试人PDGF-BB、PDGF-AB或PDGF-BB/AB诱导的钙通量的组合的抗体抑制。
对于钙通量测定，将原代人肺平滑肌细胞(龙沙公司(Lonza)，目录号CC-2581)和人肺成纤维细胞(龙沙公司，目录号2512)以10k/孔的细胞密度接种到96孔测定板上。平滑肌细胞在供应商推荐的平滑肌培养基(龙沙公司，CC-3182)中培养，并且成纤维细胞在37℃下在5％CO2中在加湿培养箱中的DMEM-10％FBS-1x青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺中培养。
在孔中达到100％汇合度后，按照制造商的方案，通过FLIPR四联系统(分子装置公司(Molecular Devices))上的钙5测定试剂盒(分子装置公司，目录号R8185)评估PDGF驱动的钙通量。简而言之，用50μL测定培养基(DMEM-0.1％ BSA-1x青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺)替换完整培养基。然后将钙5染料在丙磺舒(probenecid)(赛默飞世尔公司(Thermofisher)，目录号P36400)的存在下在所提供的缓冲液中重构。然后将50μL的重构钙5染料加入到细胞中，并且在放入FLIPR四联系统之前，在37℃下在5％ CO2中温育1小时。人PDGF-BB(R&D系统公司，目录号220-GMP)、人PDGF-AB(R&D系统公司，目录号222-AB)和PDGF-AB/PDGF-BB以3:1的比率用于生成单独的给药板。选择1nM浓度的PDGF-AB、PDGF-BB和组合处理PDGF-AB/BB作为恒量来评估抗体抑制。在存在1nM PDGF蛋白H4H13145P或H4H13132P的情况下，在500nM至0.06nM(1:6连续稀释)的范围内进行测试。在通过FLIPR四联系统添加到细胞上之前，将抗体用PDGF蛋白预温育30分钟。在60秒和5分钟的全时过程两者中评估钙通量痕迹。使用SoftMax Pro软件(分子装置公司)分析了这些钙痕迹的最大最小值。
如表20所示，两种抗体H4H13145P和H4H13132P在记录人肺平滑肌细胞上的钙通量持续60秒时，均显示出对1nM PDGF-BB、PDGF-AB和PDGF-AB/BB(3:1)的完全抑制。两种抗体均显示出对1nM PDGF处理的抑制，并且IC50值范围为0.18nM至4.5nM。H4H13145P显示出高于H4H13132P的对PDGF-BB的效力，并且IC50分别为0.18nM和0.64nM。这些抗体是PDGF-BB单独比PDGF-AB和PDGF-AB/BB(3:1)组合更有效的抑制剂。
当在5分钟的全时过程中记录钙通量时，与H4H13132P相比，H4H13145P显示出更大的中和PDGF-BB和防止PDGF驱动的钙通量的能力。H4H13145P对所有PDGF处理均保持强抑制，对PDGF-BB抑制的IC50为0.36nM，对PDGF-AB抑制为16nM，对PDGF-AB/BB组合(3:1)为5.7nM。同种型对照抗体显示出对PDGF介导的钙通量没有抑制作用。
表20：在原代基于细胞的测定(肺动脉平滑肌细胞)中抗PDGF-BB抗体抑制PDGF-BB、AB或AB/BB活化
PASM-人肺动脉平滑肌细胞
当在人肺成纤维细胞中测试时，在记录钙通量超过60秒时，H4H13145P和H4H13132P显示出对所有PDGF处理的完全抑制。两种抗体均显示出对1nM PDGF处理的抑制作用，并且IC50值范围为0.59nM至1.6nM。与H4H13132P相比，H4H13145P在中和PDGF-BB方面显示出略高的效力，并且IC50分别为0.59nM和0.99nM。H4H13145P在中和PDGF-AB/BB处理的组合方面也比H4H13132P更有效，并且IC50值分别为0.16nM和0.54nM。这些抗体是PDGF-BB单独比PDGF-AB和组合PDGF-AB/BB处理更有效的抑制剂。
当在5分钟的全时过程中记录钙通量时，与H4H13132P相比，H4H13145P显示出显著更高的中和PDGF-BB、PDGF-AB和组合处理PDGF-AB/BB的能力。H4H13132P在所有PDGF处理中显示出最大抑制1nM恒量的较低能力。与H4H13132P相比，H4H13145P在抑制PDGF-BB驱动的钙通量方面表现出更大的效力，并且IC50分别为0.63nM和3.8nM。同种型对照抗体未显示出对人肺成纤维细胞中PDGF介导的钙通量的抑制。
表21：抗PDGF-BB抗体抑制原代基于细胞的测定(成纤维细胞)中的PDGF-BB、AB或AB/BB活化
实例16：通过低温电子显微镜(Cryo-EM)的抗体-PDGF-BB复合物的结构分析
方法
Fab片段制备
按照制造商的标准方案，使用制造者酶(吉诺维斯公司(Genovis))将H4H13145P、H4H13132P和H4H13127P IgG切割成F(ab')2和Fc片段。使用2-巯基乙胺(2-MEA，赛默飞世尔公司)将F(ab')2还原成Fab，然后使用CaptureSelect IgG-Fc(ms)亲和树脂(赛默飞世尔公司)去除Fc片段。将Fab片段通过注射到连接到AKTA Avant 25色谱系统(通用电气医疗公司)、含有50mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaCl的运行缓冲液的体积排阻色谱(SEC)柱(Superdex 200增加15/300GL，通用电气医疗公司)进行进一步纯化。将峰级分汇集并浓缩在30kDa截止离心过滤器(密理博西格玛公司(Millipore Sigma))中，随后用于复合物制备。
复合物制备
将重组人PDGF-BB蛋白(R&D公司)与H4H13145P Fab或H4H13132P Fab以1:2.2摩尔比混合。向两个样品进一步加入过量的非竞争性H4H13127P Fab，以增加两个复合物的尺寸，从而使其为EM表征的更适合靶标。这种另外的Fab还能够改善EM网格上复合颗粒的方向分布。在30kDa截止离心过滤器(密理博西格玛公司)中浓缩到使用纳米滴仪器(赛默飞世尔公司)测量的浓度为2.5mg/mL之前，将样品在4℃下温育30分钟。
Cryo-EM样品制备和数据收集
将新鲜制备的PDGFBB–H4H13145P Fab–H4H13127 Fab复合物或PDGFBB–H4H13132PFab–H4H13127 Fab复合物与约0.15％ Amphipol PMAL-C8(安娜塔斯公司(Anatrace))混合，紧接着将3.5μL的混合物移液到UltrAufoil R1.2/1.3，300网格(康德福伊尔公司(Quantifoil))上。使用滤纸吸走多余的液体，并使用在4℃和100％湿度下操作的VitrobotMark IV(赛默飞世尔公司)将网格开始冷冻到液氮冷却的液态乙烷中。然后将网格加载到配备有K3相机(嘎坦公司(Gatan))的Titan Krios G3i显微镜(赛默飞世尔公司)中。用EPU软件(赛默飞世尔公司)以105,000倍(像素大小)的标称放大倍率在计数模式下收集两个复合物的约7,000个短片。每个短片在2秒曝光内包含46个剂量级分，并且每个/>的总获得剂量为约40个电子。
Cryo-EM数据处理和图谱生成
Cryo-EM数据使用Cryosparc v2.14.2进行处理。通过贴片运动校正对短片进行运动校正，并且通过贴片CTF估计估计CTF参数。最初使用Blob选取器拾取颗粒，以生成2D类平均值，以用作后续模板拾取的模板。在多轮2D分类以去除垃圾颗粒之后，分别留下了249,832和429,948个颗粒用于PDGFBB–H4H13145P Fab–H4H13127 Fab复合物和PDGFBB–H4H13132P Fab–H4H13127 Fab复合物。通过从头重构、均质细化和异质精炼，鉴定出对应于PDGFBB–H4H13145P Fab–H4H13127Fab复合物的110,261个颗粒，以及对应于PDGFBB–H4H13132P Fab–H4H13127 Fab复合物的159,372个颗粒。使用非均匀细化，这些颗粒分别被进一步细化为和/>分辨率重构用于两种复合物。
模型构建和细化
使用Coot 0.8.9版进行手动模型构建，并且在Phenix 1.17版中完成实际空间细化。人PDGF-BB(PDB：1PDG)的晶体结构使用UCSF Chimer图谱适配对接到PDGFBB–H4H13145PFab–H4H13127 Fab复合物和PDGFBB–H4H13132P Fab–H4H13127 Fab复合物的cryo-EM密度图中。H4H13145P、H4H13132P和H4H13127P的Fab片段的同源模型由先前确定的REGN Fab结构制成。Fab模型与其各自密度的明确对接得益于与其不同CDR序列相对应的清晰可解释的侧链密度。对接后，在Coot中手动调整模型，然后对费尼克斯公司(Phenix)中的整个PDGFBB–H4H13145P Fab–H4H13127 Fab复合物或PDGFBB–H4H13132P Fab–H4H13127 Fab复合物进行实际空间细化。
结果
PDGFBB配体是包含由三个链间环(L1由残基25-38形成，L2由残基53-58形成，并且L3由残基78-81形成)形成的两个钳位区，随后是C末端区段的同源二聚体。
根据cryo-EM研究，每个PDGFBB同源二聚体与两个H4H13145P或H4H13132P Fab分子以及两个H4H13127P Fab分子结合。两种复合物都具有2倍对称性，并且两个H4H13127PFab分子与β片区的外边缘结合。H4H13145P Fab和H4H13132P Fab都与三个链间环结合，这三个链间环也与PDGFBB-PDGFRβ信号传导复合物(PDB：3MJG)中的PDGFRβ接合，具有相似的结合位点。数据表明，H4H13145P和H4H13132P抗体在PDGFBB二聚体的末端结合，并且单个Fab与二聚体中的两种单体接触，即抗体通过二聚体界面结合。
H4H13145P：H4H13145P的重链和轻链两者都在三个链间环处与PDGFBB二聚体相互作用。
抗体与二聚体相互作用：重链中的CDR H1、H2和H3(残基A31、Y32、W50、Y54、N57、W100)参与与PDGFBB同源二聚体的两个链的相互作用。轻链中的CDR L3(残基Y91、Y92、N93、L94和F96)参与与PDGFBB二聚体的链1的相互作用。
二聚体与抗体相互作用：PDGFBB的链1(残基F37、W40、R73、K80、K81、P82、F84和K86)与H4H13145P的两个链相互作用。PDGFBB的链2中的残基I13和R56参与与H4H13145P的重链的相互作用。链1中的环1和环3在相互作用中起着重要作用。
H4H13132P：H4H13132P的重链和轻链两者都在三个链间环处与PDGFBB二聚体相互作用。
抗体与二聚体相互作用：重链中的CDR H1、H2和H3(残基S31、A33、I52、I54、F55、D103、Y104、Y105)参与与PDGFBB二聚体的两条链的相互作用。轻链中的CDR L1和L3(残基Y31、T97和W99)参与与PDGFBB二聚体的链1的相互作用。
二聚体与抗体相互作用：PDGFBB的链1(残基L38、W40、R73、I75、K80、K81、P82、I83、F84和K86)与H4H13132P的两个链相互作用。PDGFBB的链2中的残基R56参与和H4H13132P的重链的相互作用。链1中的环1和环3在相互作用中起着重要作用
讨论
Cryo-EM数据显示，两种抗体H4H13145P和H4H13132P在PDGFBB二聚体上具有几乎相同的结合位点。PDGFBB的链1内的多个残基与两种抗体(W40、R73、K80、K81、P82、F84和K86)相互作用。PDGFBB的链2与抗体之间的相互作用较少(H4H13145P为两个，并且H4H13132P为一个)，但两种相互作用都共同具有R56残基。
实例17：使用FLIPR或原代人肺动脉平滑肌细胞中的细胞增殖测试人PDGF-BB、PDGF-AA或PDGF-DD诱导的钙通量的抗体或小分子抑制。
试剂
用于使用FLIPR或原代人肺动脉平滑肌细胞中的细胞增殖测试人PDGF-BB、PDGF-AA或PDGF-DD诱导的钙通量的抗体或小分子抑制的试剂包含：人肺动脉平滑肌细胞(PASMC)，龙沙公司目录号CC-2581批次号0000559495；平滑肌细胞培养基，龙沙公司，CC-3182；DMEM培养基，赛默飞世尔公司，目录号11965092；牛血清白蛋白溶液，密理博西格玛公司，目录号A9576；PDGF-BB，R&D系统公司，目录号220-GMP；PDGF-AA，R&D系统公司，目录号221-AA；PDGF-DD，R&D系统公司，目录号1159-SB；钙5测定试剂盒，分子装置公司，目录号R8185；丙磺舒，赛默飞世尔公司，目录号P36400；塞拉鲁替尼(Seralutinib)(GB002)，医药快报公司(MedChemExpress)，目录号HY-109190；以及甲磺酸伊马替尼(ImatinibMesylate)，医药快报公司，目录号HY-50946。
实验程序
对于钙通量和增殖测定，将原代人肺平滑肌细胞分别以10,000/孔和2,000/孔的细胞密度接种到96孔测定板上。将平滑肌细胞在37℃下于5％ CO2中在加湿培养箱中在供应商推荐的平滑肌培养基中培养。
在每个孔中达到100％汇合度后，按照制造商的方案，通过FLIPR四联系统(分子装置公司)上的钙5测定试剂盒评估PDGF驱动的钙通量。简而言之，用50μL测定培养基(DMEM-0.1％ BSA-1x青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺)替换完整培养基。然后将钙5染料在丙磺舒的存在下在所提供的缓冲液中复溶。然后将50μL的重构钙5染料加入到细胞中，并且在放入FLIPR四联系统之前，在37℃下在5％ CO2中温育1小时。在单独的给药板上生成人PDGF-AA、PDGF-BB和PDGF-DD连续稀释和抑制恒量。选择0.5nM浓度的PDGF-BB、1nM浓度的PDGF-DD和3nM浓度的PDGF-AA作为恒量来评估抗体和小分子抑制。在PDGF恒量的存在下测试H4H13145P(抗PDGFb)和H4H1238N(同种型对照)(250nM至0.2nM，1:6稀释)的连续稀释。在通过FLIPR四联系统添加到细胞上之前，将抗体用PDGF蛋白预温育30分钟。将小分子塞拉鲁替尼和伊马替尼用测定培养基中的细胞和钙染料以10,000nM至8nM(1:6连续稀释)的浓度范围预温育30分钟。使用SoftMax Pro软件(分子装置公司)分析了这些钙痕迹的最大最小值。
通过IncuCyte活细胞成像系统(艾森生物科技公司(Essen BioScience))评估增殖。电镀过夜后，用补充有0.1％ BSA的无血清平滑肌培养基替换完整培养基。将抗体与PDGF恒量一起预温育30分钟，同时在加入PDGF之前用小分子化合物伊马替尼和塞拉鲁替尼预处理细胞。在7天的过程内每3小时对板进行成像，并通过由IncuCyte碱基分析软件(赛多利斯公司(Sartorius))在第6天测量孔中的细胞汇合度来确定增殖。
结果
PDGF生长因子家族是一组对肺动脉高压有所关注的有效丝裂原。多种疗法，包含名为塞拉鲁替尼和伊马替尼的小分子受体激酶抑制剂，靶向PDGF/PDGFR信号传导通路。在本研究中，在两种体外细胞测定中抗PDGF-BB分子H4H13145P直接与这些小分子PDGFR抑制剂进行比较。
塞拉鲁替尼和伊马替尼两者都完全抑制PDGF-AA、PDGF-DD和PDFD-BB驱动的钙通量和增殖。PDGF-AA信号通过PDGFRa，PDGF-DD信号通过PDGFRb，并且PDGF-BB信号通过两个二聚受体。如表22所示，在这种基于细胞的测定中，与伊马替尼相比，塞拉鲁替尼更有效，并且IC50值范围为6-27nM。伊马替尼能够完全抑制PDGF信号传导，并且IC50值范围为110-650nM。H4H13145P能够完全抑制PDGF-BB驱动的钙通量和增殖，并且IC50分别为0.11nM和0.14nM。当与小分子PDGFR抑制剂塞拉鲁替尼和伊马替尼相比时，H4H13145P对PDGF-BB更有效(表22和图27-28)。
表22：体外测定中总结的IC50。
实例18：测试原代人肺动脉平滑肌细胞和原代人肺成纤维细胞中受体介导的抗体内化。
试剂
用于检测原代人肺动脉平滑肌细胞和原代人肺成纤维细胞中受体介导的抗体内化的试剂包含：人肺动脉平滑肌细胞(PASMC)，龙沙公司目录号CC-2581批次号0000559495；正常人肺成纤维细胞(NHLF)龙沙公司目录号CC-2512批次号0000494609；DMEM培养基，赛默飞世尔公司，目录号11965092；牛血清白蛋白溶液，密理博西格玛公司，目录号A9576；平滑肌细胞培养基，龙沙公司，CC-3182；pHrodoTMDeep红色抗体标记试剂盒目录号P35355赛默飞世尔公司；CellTrkrTM紫细胞增殖试剂盒目录号C34571赛默飞世尔公司；PDGF-BB-R&D系统公司，目录号220-GMP；PDGF-AB-R&D系统公司，目录号222-AB；钙5测定试剂盒，分子装置公司，目录号R8185；丙磺舒，赛默飞世尔公司，目录号P36400；PDGFRa-APC，艾博抗公司(Abcam)，目录号AB119838；PDGFRb-APC，R&D系统公司，目录号FAB1263A；同种型抗体-APC，艾博抗公司，目录号AB37391；DAPI活性染料，赛默飞世尔公司，目录号62248；以及TrypLETM表达酶，赛默飞世尔公司，目录号12604013。
实验程序
抗体标记：pHrodo深红抗体标记按照英杰公司(Invitrogen)pHrodoTM深红抗体标记试剂盒(货号P35355和P35356)提供的用户指南完成。抗体内化测定使用以下程序进行：
抗体内化测定1：(1)在96孔板的每孔中板20,000PASMC，并将细胞在37℃，5％ CO2下在完整培养基中温育过夜；(2)取出完整的培养基，用PBS洗涤一次，然后用CellTrkr紫染料标记细胞15分钟；(3)取出CellTrkr溶液；(4)在细胞处理前，在室温下将标记的(pHrodo)抗PDGF-B mAb与PDGF-BB或PDGF-AB预结合30分钟；(5)将抗体-配体溶液加入到细胞中。未预结合作为对照；(6)在Opera Phenix成像系统上每小时采集活细胞成像持续至多21小时；以及(7)用Harmony 4.9软件分析数据。
抗体内化测定2(受体阻断)：(1)在96孔板的每孔中板20,000PASMC，并将细胞在37℃，5％ CO2下在完整培养基中温育过夜；(2)取出完整的培养基，用PBS洗涤一次，然后用CellTrkr紫染料标记细胞15分钟；(3)取出CellTrkr溶液；(4)将抗PDGFRα(REGN1574)、抗PDGFRβ(REGN764)以各自500nM或组合添加到细胞中持续30分钟；(5)在细胞处理前，在室温下将标记的(pHrodo)抗PDGF-B mAb与PDGF-BB或PDGF-AB预结合30分钟；(6)将抗体-配体溶液加入到细胞中；(7)在Opera Phenix成像系统上每小时采集活细胞成像持续至多72小时；以及(8)用Harmony 4.9软件分析数据。
FLIPR(荧光成像读板器)抗体内化测定：(1)在96孔板的每孔中板10,000PASMC，并将细胞在37℃，5％ CO2下在完整培养基中温育过夜；(2)在测定培养基(DMEM-0.1％ BSA-1x青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺)中将抗体与PDGF-BB的混合物以10-1nM的比率预温育10分钟；(3)用10-1nM比率的REGN1945和H4H13145P与PDGF-BB替换完整的培养基；(4)用抗体-配体混合物处理细胞3、24和48小时；(5)用PBS洗涤细胞单层3倍；(6)加入50uL的测定培养基和50uL的钙5染料；(7)在通过FLIPR Tetra成像仪读取板之前，将板在加入染料后温育1小时；(8)组装并具有插入FLIPR系统中的处理板，以用连续稀释的PDGF-BB(25-0.04nM，1:6稀释)处理细胞；以及(9)使用SoftMax Pro软件(分子装置公司)分析这些钙痕迹的最大最小值
流式细胞术抗体内化测定：(1)在6孔板的每孔中板300,000PASMC，并将细胞在37℃，5％ CO2下在完整培养基中温育过夜；(2)在测定培养基(DMEM-0.1％ BSA-1x青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺)中将抗体与PDGF-BB的混合物以10-1nM的比率预温育10分钟；(3)用10-1nM比率的抗体与PDGF-BB替换完全培养基；(4)用抗体-配体混合物处理细胞持续24小时；(5)用PBS洗涤细胞单层3倍；(6)使用TrypLETM表达酶从6孔板中解离细胞；(7)旋转减慢并重悬于细胞染色缓冲液(10％ DMEM，5％ FBS)；(8)按照制造商的方案，用针对PDGFRa和PDGFRb的APC缀合抗体在冰上染色细胞持续1小时；(9)旋转和洗涤细胞3次；(10)在插入CytoFlex流式细胞仪之前，将DAPI活力染料以1μg/mL的终浓度加入到细胞中；(11)在CytoFlex流式细胞仪上记录10,000个细胞，并针对活单细胞进行门控；以及(12)在FlowJo软件(BD生物科学公司(BD Biosciences))上分析流式细胞仪数据。
结果
在多个单独的测定中，显示出H4H13145P可以通过PDGF受体以配体依赖性方式内化到各种细胞系中。
抗体内化：用pHrodo深红标记抗PDGF-B抗体允许评估人原发性PASMC测定中的抗体内化。pHrodo深红以在晚期内体或溶酶体中遇到的pH水平发射光。在正常pH值下，不发射光。这允许使用共聚焦成像评估时间依赖性内化。如表23-24所示，在PASMC和NHLF两者中，与标记的同种型对照REGN1945相比，标记的H4H13145P-PDGFBB共处理的荧光信号具有108-127x的变化倍数增加。在较低幅度的PDGF-AB下观察到了类似的趋势。这种荧光信号的增加仅在标记的抗体内化到细胞中后被发射，当细胞已被抑制PDGFRa和PDGFRb受体两者的两种抗体预处理时减弱。此数据表明H4H13145P通过PDGF受体以配体依赖性方式内化到细胞中。
FLIPR数据：在此测定中，PDGF-BB与PDGF受体结合并导致细胞对随后的PDGF-BB处理的快速受体内化和脱敏。如表25和图29所示，用REGN1945-PDGFBB(10:1nM)预处理的PASMC对随后的PDGF-BB诱导的钙通量脱敏。H4H13145P能够中和PDGF-BB并限制观察到的对PDGF-BB响应性的损失。与培养基对照相比，H4H13145P组不能完全防止PDGF-BB脱敏。H4H13145P-PDGFBB处理在以5nM的PDGF-BB进行处理时效力略有右移，并且最大最小钙通量响应略有下降。这可以解释为抗体-配体复合物与PDGFR受体结合并引起受体内化，尽管其速率和幅度明显慢于未结合的PDGF-BB。
流式细胞术：PASMC表示PDGFRa和PDGFRb两者。在REGN1945配体处理组中未检测到PDGFRa和PDGFRb两者的荧光信号。这一发现证实了响应PDGF-BB的受体的快速配体依赖性内化。H4H13145P阻止了观察到的PDGFRb荧光信号丢失。与指示受体内化的培养基对照相比，H4H13145P处理组的PDGFR细胞表面表达略有变化和丧失，尽管与未结合的PDGF-BB相比速率和幅度降低。
表23：PASMC中的荧光抗体标记内化
表24：NHLF中的荧光抗体标记内化
在每次测定的第10小时选择汇总表中的数据
*变化倍数＝(pHrodo-A647荧光强度/同种型对照Ab REGN1945的pHrodo-A647荧光强度)
表25：PASMC中的FLIPR受体内化测定
实例19：评价肺动脉高压的大鼠野百合碱模型中两种抑制性抗PDGF-B抗体的效果。
试剂
用于评价肺动脉高压的大鼠野百合碱模型中两种抑制性抗PDGF-B抗体的效果的试剂包含：野百合碱(野百合碱(Crotaline))西格玛目录号PHL89251-CAS编号：315-22-0，MDL：MFCD00084656，式：C16H23NO6，分子量：325.36g/mol，存储温度：2-8℃，纯度：98％；马西替坦医药快报公司目录号HY-14184-口服活性内皮素受体拮抗剂，CAS编号：441798-33-0，式：C19H20Br2N6O4S，分子量：588.27g/mol，批次号：10673，储存温度：-20℃持续3年，纯度：98％；以及PEG-400(以50:50v/v，昂飞公司(Affymetrix Inc.)，#19957)。
实验程序
为了评价肺动脉高压的大鼠野百合碱模型中两种抑制性抗PDGF-B抗体的效果，进行了2项研究：对进行预防性药物处理的4周的野百合碱PAH大鼠进行1号研究；并且对进行治疗性药物处理的5周野百合碱重度PAH大鼠存活率进行2号研究(表26-27)。
使用六到七周大的雄性斯普拉-道来大鼠。将大鼠分成处理组，使得不同组的体重相似。在1号研究中，在注射野百合碱前一天，抗体处理组的大鼠以每周2次的速率以10mg/kg连续给药进行皮下施用抗PDGF-B抗体或同种型对照IgG持续28天。在第一天，大鼠皮下施用40mg/kg的野百合碱或5mL/kg或生理盐水对照。在第28天，通过右心导管插入术测量右心室收缩压(RVSP)，并通过富尔顿指数按RV与(LV+隔膜)的重量比计算RV肥大。在2号研究中，大鼠皮下施用60mg/kg的野百合碱或5mL/kg的生理盐水。从第14天开始，抗体处理组的大鼠每周2次以25mg/kg皮下施用抗PDGF-B抗体或同种型对照IgG。小分子组以每天30mg/kg口服施用马西替坦。第0-35天的体重变化用于一般毒性评估，并在第35天计算动物死亡率和中位存活时间。
表26：1号研究-进行预防性药物处理的4周野百合碱PAH大鼠
表27：2号研究-进行治疗性药物处理的5周野百合碱严重PAH大鼠存活率
右心导管插入术和右心室收缩压:将大鼠用异氟醚麻醉，并使用加热平台(加热硬垫1，布伦特里科学公司)和循环加热水泵(T/Pump Classic，盖玛工业公司)保持在大约37℃。每只大鼠的颈部区域通过在右颈总动脉和右颈静脉内脱毛来准备手术。形成切口，并且小心分离右颈静脉，以免损伤颈动脉和/或迷走神经。将一段5-0的丝线放置在分离的颈静脉下，以允许血管向颅骨回缩，然后使用23号针将孔引入颈静脉。将压力导管(微尖导管传感器SPR-1000，米拉尔仪器公司)插入到颈静脉的开口中，并通过右心房推进到右心室中。将导管连接到压力/容量仪器(MPVS-300，米拉尔仪器公司)，所述仪器测量心率以及舒张和收缩右心室压两者。这些参数是使用数据采集系统(PowerLab 4/35，AD仪器公司)进行数字采集的。LabChart Pro 7.0软件(AD仪器公司)用于分析右心室压。从压示踪的60秒间隔量化读数(在2-分钟的记录期之后，以允许压稳定)。分析的参数是右心室收缩压(RVSP)和心率(HR)。
右心肥大评估：在体内血液动力学测量后，在麻醉下通过放血对动物实施安乐死，并且然后收获RV游离壁，左心室(LV)和隔膜组织并称重。RV肥大通过富尔顿指数按RV与(LV+隔膜)的重量比计算。
结果
野百合碱大鼠中诱导的右心室压升高：在1号研究中，在用野百合碱进行处理的大鼠中，基于导管的心脏右心室压评估显示，在第4周，同种型抗体处理组的右心室收缩压明显升高。两种抗PDGF-B抗体处理显著降低了右心室收缩压(图30和表28)。
野百合碱大鼠中诱导的右心室肥大：在同种型对照IgG处理组中观察到野百合碱大鼠的右心室心脏重量增加。右心室重量与左心室加间隔重量的比率提供了右心室肥大的指数(即富尔顿指数)。相对于用生理盐水进行处理的对照，在用野百合碱进行处理的大鼠中，观察到富尔顿指数增加，从而表明存在右心室肥大。当与同种型对照处理的大鼠相比时，用抗PDGF-B抗体H4H13145P和H4H13132P以10mg/kg进行预防性处理将右心室肥大分别减少了36％和30％(图31和表28)。
野百合碱大鼠的动物存活率：在2号研究中，注射60mg/kg野百合碱的大鼠出现重度肺高压症状和高死亡率。值得注意的是，同种型对照IgG处理组的16只野百合碱大鼠中有15只在第35天死亡。抗PDGF-B抗体H4H13145P在注射野百合碱后14天开始，显著延长了生存时间并且改善了死亡率。标准护理药物，内皮素受体拮抗剂马西替坦未能延长生存期。与抗PDGF-B抗体的单一疗法相比，马西替坦与抗PDGF-B处理的组合没有显示出另外的存活益处(图32和表29)。
总之，在PAH的野百合碱大鼠模型中，用再生元抗PDGF-B抗体进行预防性处理降低了血液动力学终点(右心室收缩压)和右心室肥大。在重度野百合碱大鼠PAH模型中，再生元抗PDGF-B抗体的治疗性治疗显示出优于血管舒张药物内皮素受体拮抗剂马西替坦的存活益处。抗PDGF-B抗体H4H13145P显著挽救了动物死亡率并延长了生存时间。
表28
*p<0.00001与生理盐水对照，##p<0.01与MCT+同种型对照IgG，#p<0.05与MCT+同种型对照IgG
表29
*p<0.00001与生理盐水对照，#p<0.05与MCT+同种型对照IgG，Δp<0.01与MCT+马西替坦
等效形式
本领域技术人员会认识到或能够使用不超过例行实验确定本文描述的具体实施例和方法的许多等效形式。此类等效形式旨在被涵盖在以下权利要求书的范围内。
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Claims (22)

1.一种分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段，所述分离的人单克隆抗体或其抗原结合片段与人血小板衍生生长因子亚基B(PDGF-B)特异性结合，其中所述抗体或抗原结合片段表现出一种或多种选自由以下组成的组的特性：
(a)在37℃下以小于约1.84pM的结合解离平衡常数(KD)与人PDGF亚基B同源二聚体(PDGF-BB)结合，如通过表面等离子体共振所测量的；
(b)在37℃下以小于约1.36pM的KD与人PDGF-BB结合，如通过表面等离子体共振所测量的；
(c)在37℃下以大于或等于约1155分钟的t1/2与人PDGF-BB结合，如通过表面等离子体共振所测量的；
(d)在25℃下以小于约2.79pM的KD与人PDGF-BB结合，如通过表面等离子体共振所测量的；
(e)在25℃下以大于或等于约1155分钟的t1/2与人PDGF-BB结合，如通过表面等离子体共振所测量的；
(f)在25℃下以小于约1.9nM的IC50抑制PDGF-B对人PDGF-BB的活化，如在竞争ELISA测定中所测量的；
(g)在25℃下以小于约8.8nM的IC50抑制PDGF-B对人PDGF亚基A和亚基B异源二聚体(PDGF-AB)的活化，如在竞争ELISA测定中所测量的；以及
(h)阻断人PDGF-BB与人PDGFR-αα、PDGFR-αβ和PDGFR-ββ中的一种或多种之间的相互作用。
2.一种分离的人抗体或其抗原结合片段，所述分离的人抗体或其抗原结合片段与人PDGF-B特异性结合，其中所述抗体或抗原结合片段包括：在选自由以下组成的组的重链可变区(HCVR)序列中的任一个内包含的三个重链互补决定区(CDR)(HCDR1、HCDR2和HCDR3)：SEQ ID NO:2和22；以及在选自由以下组成的组的轻链可变区(LCVR)序列中的任一个内包含的三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)：SEQ ID NO:10和30。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的分离的人抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包括HCVR，所述HCVR包括与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:22的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的人抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包括LCVR，所述LCVR包括与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:30的序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的人抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包括：(a)HCVR，所述HCVR包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO:2和22；以及(b)LCVR，所述LCVR包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:10和30。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的分离的人抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包括：
(a)HCDR1结构域，所述HCDR1结构域包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO:4和24；
(b)HCDR2结构域，所述HCDR2结构域包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO:6和26；
(c)HCDR3结构域，所述HCDR3结构域包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO:8和28；
(d)LCDR1结构域，所述LCDR1结构域包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO:12和32；
(e)LCDR2结构域，所述LCDR2结构域包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO:14和34；和/或
(f)LCDR3结构域，所述LCDR3结构域包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ IDNO:16和36。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的分离的人抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包括选自由以下组成的组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO:2/10和22/30。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的分离的人抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包括：
(i)包括SEQ ID NO:20中所示的氨基酸序列的轻链免疫球蛋白，以及
包括SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列的重链免疫球蛋白；和/或
(ii)包括SEQ ID NO:40中所示的氨基酸序列的轻链免疫球蛋白，以及
包括SEQ ID NO:38中所示的氨基酸序列的重链免疫球蛋白。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是Fab片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、单链Fv(scFv)分子或dAb片段。
10.一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段与根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或抗原结合片段结合人PDGF-B上的同一表位。
11.一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述分离的抗体或其抗原结合片段与根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或抗原结合片段竞争与人PDGF-B结合。
12.一种用于制备根据权利要求1至11中任一项所述的抗体或抗原结合片段的方法，所述方法包括：
(i)将一个或多个编码所述抗体或片段的轻免疫球蛋白链和所述抗体或片段的重免疫球蛋白链的多核苷酸引入到宿主细胞中；
(ii)在有利于表达所述多核苷酸的条件下在生长培养基中培养所述宿主细胞；以及
(iii)任选地从所述宿主细胞和/或所述宿主细胞生长的培养基中分离所述抗体或片段。
13.一种抗体或抗原结合片段，其通过根据权利要求12所述的方法产生。
14.一种注射装置或容器，其包括根据权利要求1至11和13中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
15.一种药物组合物，其包括：与人PDGF-B结合的根据权利要求1至11和13中任一项所述的分离的人抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体或稀释剂；以及任选地一种或多种另外的治疗剂。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述一种或多种另外的治疗剂包括铁补充剂。
17.一种用于预防或治疗有需要的患者的肺动脉高压(PAH)的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的根据权利要求1至11和13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段；或根据权利要求15至16中任一项所述的药物组合物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段皮下、静脉内、皮内、口服或肌内施用。
19.根据权利要求17至18中任一项所述的方法，其中所述PAH产生选自由以下组成的组的病状：受试者的肺动脉增厚；受试者的每搏输出量减少；受试者的右心室心输出量减少；以及受试者的生存时间减少；
并且所述抗体或抗原结合片段的施用治疗所述病状或减轻所述病状的一种或多种症状的严重程度。
20.根据权利要求1至11和13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其用于治疗患有PAH的患者。
21.一种用于治疗PAH的组合物，所述组合物包括一种或多种根据权利要求1至11和13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
22.根据权利要求1至11和13中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗患有PAH的患者的药物中的用途。
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