KR102667021B1 - Aplnr 길항제 및 vegf 저해제를 이용한, 안 장애의 치료 방법 - Google Patents

Aplnr 길항제 및 vegf 저해제를 이용한, 안 장애의 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 안 질환을 치료하거나, 예방하거나, 이의 중증도를 감소시키는 방법을 제공한다. 본 개시내용의 방법은 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 길항제(예를 들어, 애플리버셉트)와 조합하여, 항-APLNR 항체와 같은 APLNR 길항제를 포함하는 치료 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

Description

APLNR 길항제 및 VEGF 저해제를 이용한, 안 장애의 치료 방법
서열 목록
본 출원은 2018년 5월 4일에 생성되고 16,843 바이트를 포함하는 파일 10354WO01-서열.txt로서 컴퓨터 판독 가능한 형태로 제출된 서열 목록을 참조로 포함한다.
기술분야
본 개시내용은, 특히 아펠린(apelin) 수용체 길항제 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 길항제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써, 혈관 안 질환(vascular eye disease)을 치료하는 방법에 관한 것이다.
혈관 안 질환은 오늘날 노화 인구 중 시력 상실의 주된 원인이다. 이들 질환은 망막 내로 성장하는 비정상적인 '누출(leaky)' 혈관을 특징으로 할 수 있다. 이러한 대상체 집단에 대한 가장 큰 기여자 중 2가지는 당뇨병성 망막병증 및 삼출성 나이-관련 황반 변성(exudative age-related macular degeneration)이다.
당뇨병성 망막병증(DR)은 미국에서 시력 장애(visual impairment)의 주원인이다(문헌[Klein et al., 1984, Ophthalmology 91:1464-1474; Moss et al., 1998, Ophthalmology 105:998-1003]). 당뇨병성 망막병증은 기저막 비후(thickening)로 시작하는 미세혈관 보상 해제(decompensation)로 인한 것이고(문헌[Ruggiero et al., 1997, Diabetes Metab. 23:30-42]), 결국 혈관 폐색 및 신혈관 형성을 초래한다(문헌[Porta et al., 2002, Diabetologia 45:1617-1634]). 당뇨병을 가진 40세 이상의 대상체 중 약 28%가 DR을 갖고, 4.4%가 시력을 위협하는 DR을 갖고 있는 것으로 추정된다(문헌[Zhang et al., 2010, JAMA 304: 649-656]). 당뇨 황반 부종(DME; diabetic macular edema)은 DR의 표명(manifestation)이고, 청년 및 중년 성인에서 실명의 가장 흔한 원인이다(문헌[Klein et al., 1984, Ophthalmology 91:1464-1474; Moss et al., 1998, Ophthalmology 105:998-1003]).
나이-관련 황반 변성(AMD)은 선진국에서 50세 이상 연령의 사람들에서 중증 시력 상실의 주된 원인이다. 최근, 항-혈관신생제의 도입으로 AMD의 치료에서 주된 진전이 있어 왔으며, 이는 신혈관 AMD를 갖는 대상체에게 유의한 시력 회복의 희망을 제공한다(문헌[Keane et al., 2012, Surv Ophthalmol. 57: 389-414]).
프리프로아펠린(preproapelin)은 인간 CNS 및 주변 조직, 예를 들어 폐, 심장 및 유선에서 발현되는 77개 아미노산 단백질이다. 다양한 크기의 아펠린 펩타이드를 포함하는 C-말단 단편을 포함하는 펩타이드는 G 단백질-커플링된 수용체, APJ 수용체(현재 APLNR로서 공지됨)(문헌[Habata, et al., 1999, Biochem Biophys Acta 1452:25-35; Hosoya, et al., 2000, JBC, 275(28):21061-67; Lee, et al., 2000, J Neurochem 74:34-41; Medhurst, et al., 2003, J Neurochem 84:1162-1172])를 활성화시키는 것으로 나타났다. 많은 연구들이, 아펠린 펩타이드 및 유사체가 이들과 APJ 수용체(APLNR)의 상호작용, 예컨대 내피-의존적 혈관확장을 통해 심장혈관 및 혈관신생 작용을 운반한다고 가리킨다(문헌[Tatemoto et al., 2001, Regul Pept 99:87-92]).
아펠린 시스템은 병리생리학적 혈관신생에서 역할을 하는 것으로 보인다. 연구는, 아펠린이 저산소증-유도 망막 혈관신생에 관여할 수 있음을 가리켰다(문헌[Kasai et al., 2010, Arterioscler Thromb Vasc Bioi 30:2182-2187]). 일부 보고에서, 소정의 조성물은 아펠린/APJ 경로를 차단함으로써(예를 들어, 미국 특허 7,736,646), 예컨대 병리학적 혈관신생을 차단시킬 수 있으며 따라서 망막에서 혈관형성을 저해하는 데 유용한 APLNR 저해제에 의해 혈관신생을 저해할 수 있다(문헌[Kojima, Y. and Quertermous, T., 2008, Arterioscler Thromb Vasc Biol 28:1687-1688]). 이와 같이, 아펠린-매개 신호전달의 간섭은 또한, 증식성 당뇨병성 망막병증의 조기 예방에 유익할 수 있다(문헌[Tao et al., 2010, Invest Opthamol Visual Science 51:4237-4242; Du, JH et al., Int J Ophthalmol. 2014 Dec 18;7(6):968-73; Lu, Q. et al., 2013, PLoS One 8(7):e69703]). 보다 최근, 아펠린은 미숙아 망막병증(retinopathy of prematurity)의 기전에 연루되어 왔다(문헌[Ali YF et al., Clin Ophthalmol. 2017 Feb 21;11:387-392]).
항-혈관 내피 성장 인자(VEGF) 치료법(예를 들어, 애플리버셉트(aflibercept))은 신혈관 AMD 및 DME를 위한 치유 치료의 표준이다. 이들 대상체 집단에서 애플리버셉트의 효능 및 안전성은 잘-특징화되어 있다(문헌[Dixon et al., 2009; Expert Opin. Investig. Drugs 18: 1573-80]). 그러나, AMD에서, 대상체 중 대략 95%가 이들의 시력을 유지하였으며, 단지 대략 30%의 대상체만 1년째에 최대 교정 시력(BCVA)에서 15개 이상의 글자의 향상을 달성하였다. DME에서, 치료 결과를 향상시킬 가능성이 또한 존재한다. 애플리버셉트 및 라니비주맙(ranibizumab)에서 관찰된 바와 같이, DME로 인한 시력 상실 대상체 중 50% 미만이 1년 내지 2년에 걸쳐 15개 이상의 글자의 향상을 달성한다. 또한, 라니비주맙을 이용한 연구에서, 증식성 망막병증의 임상 증거는, 라니비주맙의 매달(monthly) 치료를 3년간 받은 대상체의 7.2% 이하에서만 나타났고, 3.2% 이하의 대상체가 잠재적으로 시각적 불능화 치료 양상(potentially visually disabling treatment modality)인 범망막 광응고술(panretinal photocoagulation)을 필요로 하였다(문헌[Brown et al., 2013 Ophthalmology 10: 2013-22]).
아펠린/APLNR과 VEGF 둘 모두가 혈관신생 및 혈관 발달에 기여하는 것으로 공지되어 있긴 하지만, 2가지 신호전달 경로가 혈관신생의 촉진에서 상호작용하는 기전은 불안전하게 이해된 채로 남아 있다. 특히, 이들 경로는 망막 혈관의 형성에 관여하는 것으로 공지되어 있고, 다양한 연구는, 아펠린 및 VEGF가 양성 및 음성 피드백 효과를 갖고 있으며, 이러한 효과에서 하나의 증가된 발현은 다른 것의 발현에 기여할 수 있거나 또는 하나의 길항작용은 다른 것의 발현을 억제시킨다고 보고하였다(문헌[Lu et al., 2014, Molecular Vision, 20:1122-1131]).
라니비주맙 및 애플리버셉트와 같은 항-VEGF 치료법의 유리체내(IVT; intravitreal) 전달은 맥락망막 질환에 대해 효능 및 안전성을 실증하였다. 그러나, 혈관 투과성, 신혈관 형성 및 다른 혈관 기능장애에 기여하는 많은 추가의 인자들이 존재한다.
일 양태에서, 본 발명은 대상체에서 혈관 안 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상 또는 적응증(indication)을 치료하거나, 예방하거나 개선하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 치료적 유효량의, APLNR 길항제를 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 소정의 실시형태에서, APLNR 길항제는 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 길항제와 조합되어, 예를 들어 치료적 유효량의, VEGF 길항제를 포함하는 약제학적 조성물의 투여에 의해 투여된다.
소정의 실시형태에서, 안 질환 또는 장애는 당뇨병성 망막병증, 당뇨 황반 부종, 나이-관련 황반 변성, 망막 신혈관 형성, 중심 망막 정맥 폐색, 분지 망막 정맥 폐색, 결절 맥락막 혈관병증(polypoidal choroidal vasculopathy), 맥락막 신혈관 형성(CNV; choroidal neovascularization), 퇴행성 근시(근시성 CNV), 신혈관 녹내장, 및 미숙아 망막병증으로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 망막 혈관신생을 저해하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 치료적 유효량의, VEGF 길항제와 조합하여, APLNR 길항제를 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 망막 혈관신생은 혈관 안 질환 또는 장애와 연관이 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (예를 들어, 혈관신생과 연관된 안 질환 또는 장애를 갖고 있는 대상체에서) 망막 신혈관 형성을 저해하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 치료적 유효량의, VEGF 길항제와 조합하여, APLNR 길항제를 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 맥락막 신혈관 형성을 저해하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 치료적 유효량의, VEGF 길항제와 조합하여, APLNR 길항제를 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 혈관 재성장을 향상시키고 비정상적인 신혈관 형성을 저하시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 치료적 유효량의, VEGF 길항제와 조합하여, APLNR 길항제를 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 망막의 재혈관혈성을 이를 필요로 하는 대상체에서 촉진하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 치료적 유효량의 APLNR 길항제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하고; 치료적 유효량의 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 길항제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 망막 혈관의 균일한 재성장을 이를 필요로 하는 대상체에서 촉진하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 치료적 유효량의 APLNR 길항제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하고; 치료적 유효량의 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 길항제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 망막에서의 혈관 외성장(outgrowth)을 이를 필요로 하는 대상체에서 향상시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 치료적 유효량의 APLNR 길항제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하고; 치료적 유효량의 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 길항제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 망막에서의 균일한 혈관 성장을 이를 필요로 하는 대상체에서 촉진하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 치료적 유효량의 APLNR 길항제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하고; 치료적 유효량의 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 길항제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 망막의 혈관 구조화를 이를 필요로 하는 대상체에서 향상시키는 방법을 제공한다. 상기 방법은 치료적 유효량의 APLNR 길항제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하고; 치료적 유효량의 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 길항제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
상기 또는 본원에서 고찰된 임의의 방법에서, 대상체는 안 질환 또는 장애를 진단받은 대상체일 수 있다. 일부 경우, 안 질환 또는 장애는 당뇨병성 망막병증, 증식성 당뇨병성 망막병증, 당뇨 황반 부종, 나이-관련 황반 변성, 망막 신혈관 형성, 중심 망막 정맥 폐색, 분지 망막 정맥 폐색, 결절 맥락막 혈관병증, 맥락막 신혈관 형성(CNV), 퇴행성 근시(근시성 CNV), 신혈관 녹내장, 및 미숙아 망막병증으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 경우, 안 질환 또는 장애는 나이-관련 황반 변성이다. 일부 경우, 안 질환 또는 장애는 당뇨 황반 부종이다. 일부 경우, 안 질환 또는 장애는 미숙아 망막병증이다. 일부 경우, 안 질환 또는 장애는 증식성 당뇨병성 망막병증이다.
본 개시내용의 방법 또는 조성물의 맥락에서 사용될 수 있는 예시적인 APLNR 길항제는 APLNR의 저분자 화학적 저해제, 또는 APLNR을 표적화하는 생물학적 작용제, 예컨대 펩타이드, 펩타이드 모방체 및 항체를 포함한다. 소정의 실시형태에서, APLNR 길항제는 APLNR과 아펠린의 상호작용을 차단한다.
소정의 실시형태에 따르면, APLNR 길항제는, APLNR 길항제에 결합하고 APLNR 신호전달을 저해하는 항체 또는 항원-결합 단백질이다. 소정의 실시형태에서, 항-APLNR 항체 또는 항원-결합 단백질은 서열번호: 2 또는 13의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR)의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 및 서열번호: 7 또는 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함한다.소정의 실시형태에서, 항-APLNR 항체 또는 항원-결합 단백질은 H2aM9232N(또는 H4H9232N) 및 H1M9207N으로 구성된 군으로부터 선택되는 항-APLNR 항체의 중쇄 가변 영역(HCVR)의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
상기 또는 본원에 고찰된 임의의 방법 또는 조성물에서, APLNR 길항제는 항-APLNR 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있으며, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 APLNR에 특이적으로 결합한다. 일부 경우, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 2/7 및 13/18로 구성된 군으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 서열 쌍을 포함하는 기준 항체와 인간 아펠린 수용체(APLNR)에의 결합에 대해 경쟁하며, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 APLNR에 특이적으로 결합한다. 일부 경우, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 2/7 및 13/18로 구성된 군으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 서열 쌍을 포함하는 기준 항체와 동일한 APLNR 상의 에피토프에 결합하며, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 APLNR에 특이적으로 결합한다. 일부 경우, 항체 또는 항원-결합 단편은: (a) 서열번호: 2 및 13으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR)의 상보성 결정 영역(CDR); 및 (b) 서열번호: 7 및 18로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR)의 CDR을 포함한다. 일부 경우, 항체 또는 항원-결합 단편은: 서열번호: 3-4-5-8-9-10 및 14-15-16-19-20-21로 구성된 군으로부터 선택되는 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 도메인을 각각 포함한다. 일부 경우, 항체 또는 항원-결합 단편은: (a) 서열번호: 2 및 13으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR); 및 (b) 서열번호: 7 및 18로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함한다. 일부 경우, 항체 또는 항원-결합 단편은: 서열번호: 2/7 및 13/18로 구성된 군으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍의 중쇄 및 경쇄 CDR을 포함한다. 일부 경우, 항체 또는 항원-결합 단편은: 서열번호: 2/7 및 13/18로 구성된 군으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함한다.
상기 또는 본원에 고찰된 임의의 하나의 방법 또는 조성물의 일 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 2/7의 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함한다.
상기 또는 본원에 고찰된 임의의 하나의 방법 또는 조성물의 일 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 13/18의 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함한다.
상기 또는 본원에 고찰된 임의의 하나의 방법 또는 조성물에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 IgG1 또는 IgG4 중쇄 불변 영역을 갖는 인간 항체일 수 있다. 일 실시형태에서, 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1이다. 일 실시형태에서, 중쇄 불변 영역은 인간 IgG4이다.
상기 또는 본원에 고찰된 임의의 하나의 방법 또는 조성물의 다양한 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 APLNR과 아펠린의 상호작용을 차단한다. 일부 경우, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 APLNR과 아펠린의 상호작용을 차단하여, 경쟁 결합 검정법에서 적어도 50%의 결합 저해를 나타낸다. 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 APLNR과 아펠린의 상호작용을 차단하지 않거나, 단지 부분적으로 차단한다.
본 개시내용의 조성물 및 방법에서 APLNR 길항제와 조합되어 사용될 수 있는 VEGF 길항제는 항-VEGF 항체(예를 들어, 라니비주맙), 저분자 VEGF 저해제(예를 들어, 수네티닙(sunetinib)), 및 VEGF-저해 융합 단백질("VEGF 트랩")을 포함한다. 본 개시내용의 치료 방법에서 APLNR 길항제와 조합되어 사용될 수 있는 VEGF 길항제의 일례는 VEGF-저해 융합 단백질인 애플리버셉트이다(예를 들어, US 7,087,411 참조).
상기 또는 본원에 고찰된 임의의 하나의 방법 또는 조성물에서, VEGF 길항제는 VEGF 수용체-기반 키메라 분자(VEGF 트랩)를 포함한다. 일부 경우, VEGF 트랩은 VEGFR1의 하나 이상의 면역글로불린(Ig)-유사 도메인, VEGFR2의 하나 이상의 Ig-유사 도메인, 및 다량체화 도메인을 포함한다. 일부 경우, VEGF 트랩은 VEGFR1의 Ig-유사 도메인 2, VEGFR2의 Ig-유사 도메인 3, 및 다량체화 도메인을 포함한다. 일부 경우, VEGF 트랩은 애플리버셉트 또는 이의 생물유사 분자이다. 일부 경우, VEGF 길항제는 서열번호: 23의 아미노산 27 내지 457로 구성된 2개의 폴리펩타이드의 이량체로 구성된다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 치료적 유효량의 APLNR 길항제 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 조성물은 VEGF 길항제를 추가로 포함한다.
다양한 실시형태에서, 본 개시내용은 인간을 포함한 대상체에서 안 질환 또는 장애를 치료하기 위한, 또는 상기 또는 본원에 고찰된 임의의 방법의 다른 목적을 수행하기 위한 약제의 제조에서 VEGF 길항제와 조합된 APLNR 길항제의 용도를 제공한다. 상기 또는 본원에 고찰된 모든 방법은 안 질환 또는 장애의 치료 또는 언급된 방법의 다른 목적을 위한 APLNR 길항제 및 VEGF 길항제의 용도 또는 용도들로서 구현될 수 있다. 다른 실시형태는 상기 또는 본원에 고찰된 방법에 사용하기 위한 APLNR 길항제 및 VEGF 길항제를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 혈관 안 질환 또는 장애를 치료하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 치료적 유효량의 APLNR 길항제, 치료적 유효량의 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 길항제, 및 적합한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함한다. 조성물의 다양한 실시형태에서, APLNR 길항제 또는 VEGF 길항제는 상기 또는 본원에 고찰된 바와 같을 수 있다.
다른 실시형태들은 하기의 상세한 설명의 검토로부터 명백해질 것이다.
도 1a 및 1b는 P2 내지 P5에서 전신적으로(IP) 치료받은 마우스 망막의 대표적인 현미경 사진 및 계산된 혈관 면적의 그래프이다. 잔여 혈관 면적은 비치료된 망막과 비교하여 α아펠린R(항-APLNR 항체 H2aM9232N) 치료된(25 mg/kg에서 23%, p < 0.05) 망막에서 유의하게 더 작았다. 망막 내피 세포를 GS 렉틴 I로 염색하였다. 이미지를 20x(정량화를 위해) 및 40x에서 촬영하였다. 통계학적 분석을 스튜던트 T-검정을 이용하여 수행하였다. 전신 주사를 통한 아펠린R의 선택적 저해는 P5 새끼(pup)에서 발달중인 망막에서 정상적인 혈관 외성장을 지연시켰다. 25 mg/kg 용량에서, 아펠린R의 차단은 혈관 외성장을 약간 저해한다.
도 2a 및 2b는 P2 내지 P5에서 전신적으로(IP) 치료받은 마우스 망막의 대표적인 현미경 사진 및 계산된 혈관 면적의 그래프이다. 잔여 혈관 면적은 비치료된 망막과 비교하여 α아펠린R 치료된(50 mg/kg에서 35%, p < 0.005) 망막에서 유의하게 더 작았다. 망막 내피 세포를 GS 렉틴 I로 염색하였다. 이미지를 20x(정량화를 위해) 및 40x에서 촬영하였다. 통계학적 분석을 스튜던트 T-검정을 이용하여 수행하였다. 전신 주사를 통한 아펠린R의 선택적 저해는 P5 새끼에서 발달중인 망막에서 정상적인 혈관 외성장을 지연시켰다. 용량을 50 mg/kg 용량까지 증가시킴으로써, 아펠린R의 표적화는 망막 혈관 외성장을 더 지연시켰다.
도 3a 및 3b는 P2 내지 P5에서 전신적으로(IP) 치료받은 마우스 망막의 대표적인 현미경 사진 및 계산된 혈관 면적의 그래프이다. 이러한 마스킹된 연구에서, 50 mg/kg α아펠린R은 Fc 치료 대조군과 비교하여 혈관 성장을 29.8%(p < 0.0001)만큼 저하시켰다. 망막 내피 세포를 GS 렉틴 I로 염색하였다. 이미지를 20x(정량화를 위해) 및 40x에서 촬영하였다. 통계학적 분석을 스튜던트 T-검정을 이용하여 수행하였다. 전신 주사를 통한 아펠린R의 선택적 저해는 P5 새끼에서 발달중인 망막에서 정상적인 혈관 외성장을 지연시켰다.
도 4a 및 4b는 P2 내지 P5에서 전신적으로(IP) 치료받은 마우스 망막의 대표적인 현미경 사진 및 계산된 혈관 면적의 그래프이다. 잔여 혈관 면적은 단일 시약, α아펠린R(50 mg/kg에서 31%, p < 0.001) 또는 애플리버셉트(50 mg/kg에서 43%, p < 0.005) 단독과 비교하여, 조합(α아펠린R + 애플리버셉트)(50 mg/kg에서 62%, p < 0.0001)에서 유의하게 더 작았다. 망막 내피 세포를 GS 렉틴 I로 염색하였다. 용량 및 상관적인 혈관화된 면적에 미치는 효과를 주목한다. 이미지를 20x(정량화를 위해) 및 40x에서 촬영하였다. 통계학적 분석을 1측 ANOVA(one-way ANOVA)와 사후 터키 검정(post-hoc Tukey test)을 이용하여 수행하였다. 전신 투여와 유리체내 투여 둘 모두에서(도 5a 및 5b 참조), α아펠린R, 및 애플리버셉트 병용 치료법은 정상적인 발달중의 망막 혈관구조의 퇴화를 초래하였다. 전신 주사를 통한 아펠린R와 VEGFA 둘 모두의 차단은 아펠린R 또는 VEGFA 단독을 차단하는 것과 비교하여 혈관 외성장을 방해하는 데 더 효과적이다. 이 모델에서, 병용 치료는 혈관 면적을 α아펠린R와 비교하여 46%만큼(p < 0.0005) 및 애플리버셉트와 비교하여 32%만큼(p < 0.001) 더 저하시켰다.
도 5a 및 5b는 P4 내지 P6에서 유리체내(IVT) 주사로 치료받은 마우스 망막의 대표적인 현미경 사진 및 계산된 혈관 면적의 그래프이다. 잔여 혈관 면적은 단일 시약, α아펠린R(5 μg에서 43%, p < 0.0001) 또는 애플리버셉트(5 μg에서 65%, p < 0.0001) 단독과 비교하여, 조합(α아펠린R + 애플리버셉트)(5 μg에서 68%, p < 0.0001)에서 유의하게 더 작았다. 망막 내피 세포를 GS 렉틴 I로 염색하였다. 용량 및 상관적인 혈관화된 면적에 미치는 효과를 주목한다. 이미지를 20x(정량화를 위해) 및 40x에서 촬영하였다. 통계학적 분석을 1측 ANOVA와 사후 터키 검정을 이용하여 수행하였다. 전신 투여와 유리체내 투여 둘 모두에서, α아펠린R, 및 애플리버셉트 병용 치료법은 정상적인 발달중의 망막 혈관구조의 퇴화를 초래한다. 유리체내 주사를 통한 아펠린R와 VEGFA 둘 모두의 차단은 아펠린R 또는 VEGFA 단독을 차단하는 것과 비교하여 혈관 외성장을 방해하는 데 훨씬 더 효과적이다. IVT 병용 치료는 혈관 면적을 α아펠린R와 비교하여 50%만큼(p < 0.0005) 및 애플리버셉트와 비교하여 34%만큼(p < 0.001) 더 저하시켰다.
도 6a 및 6b는 P12 내지 P16에서 전신적으로(IP) 치료받은 OIR 마우스 망막의 대표적인 현미경 사진 및 계산된 무혈관 면적의 그래프이다. 잔여 무혈관 면적은 Fc(대조군) 망막과 비교하여 α아펠린R(29%, p < 0.05) 및 애플리버셉트(27.5%, p <0.01) 망막에서 유의하게 더 작았다. Fc와 비교하여 α아펠린R(67%, p <0.0001) 및 애플리버셉트(94%, p <0.0005) 치료받은 시료에서 신혈관 다발(tuft)에서 유의한 저하를 주목한다. 망막 내피 세포를 GS 렉틴 I로 염색하였다. 이미지를 20x(무혈관 면적 정량화) 및 40x(비정상적인 신혈관 면적 정량화)에서 촬영하였다. 통계학적 분석을 스튜던트 T-검정을 이용하여 수행하였다. 전신 주사를 통한 아펠린R 및 VEGFA 저해 둘 모두는 망막 혈관 재성장을 촉진시키고, 비정상적인 신혈관 형성을 감소시킨다.
도 7a 및 7b는 P12 내지 P16에서 유리체내 치료받은 산소 유도 망막병증 (OIR) 마우스 망막의 대표적인 현미경 사진 및 계산된 무혈관 면적의 그래프이다. 잔여 무혈관 면적은 Fc 대조군과 비교하여 α아펠린R(27.5%, p < 0.05)에서 유의하게 저하되었고, 애플리버셉트(32%, p <0.0001)에서 증가되었다. α아펠린R(60%, p <0.0001)에서 신혈관 다발의 유의한 저하 및 애플리버셉트 시료에서 다발의 완전한 소실(disappearance)을 주목한다. 망막 내피 세포를 GS 렉틴 I로 염색하였다. 용량 및 상관적인 혈관화된 면적에 미치는 효과를 주목한다. 이미지를 20x(무혈관 면적 정량화) 및 40x(비정상적인 신혈관 면적 정량화)에서 촬영하였다. 통계학적 분석을 1측 ANOVA와 사후 터키 검정을 이용하여 수행하였다. 전신 투여(도 6a 및 6b 참조)와 유리체내 투여 둘 모두에서, 아펠린R의 선택적 저해는 OIR 마우스에서 망막 혈관 재성장을 촉진시키고, 신혈관 형성을 감소시킨다. 유리체내 주사를 통한 아펠린R 저해는 혈관 재성장을 향상시키고 비정상적인 신혈관 형성을 저하하는 한편, VEGFA 저해는 혈관 재성장을 억제시키고 임의의 신혈관 형성을 완전히 중단시킨다.
도 8a 및 8b는 P12 내지 P16에서 전신적으로 치료받은 OIR 마우스 망막의 대표적인 현미경 사진(20x) 및 계산된 무혈관 면적의 그래프이다. 병용 치료를 이용한 경우 재성장 속도는 각각의 작용제 단독과 유사하며, 혈관 재성장은 hFc-치료 대조군 망막과 비교하여 향상되고, 치료군 사이에서 무혈관 면적에 유의한 변화가 있었다(p <0.0005).
도 9a 및 9b는 P12 내지 P16에서 전신적으로 치료받은 OIR 마우스 망막의 대표적인 현미경 사진(40x) 및 계산된 비정상적인 혈관 면적의 그래프이다. 병용 치료는 애플리버셉트와 비교하여 더 적은 프룬드(pruned) 혈관, 및 항-APLNR 및 Fc 대조군과 비교하여 더 적은 비정상적인 신혈관 형성을 보여준다(도 9a). 도 9b는 치료군 사이에서 비정상적인 혈관 면적에 유의한 변화가 있었음을 보여준다(p <0.0005). 비정상적인 혈관 면적은 Fc 대조군과 비교하여 항-APLNR(***, p <0.0005), 애플리버셉트(*** p <0.005) 및 조합(***, p <0.0005)을 이용한 경우 유의하게 저하되었고, 비정상적인 혈관 면적 또한, 항-APLNR 치료군과 비교하여 병용 치료군(*, p <0.05)에서 유의하게 저하되었다.
도 10은 실시예 7에서 혈관 면적 및 혈관 길이를 계산하는 데 사용된 이미지 가공 및 측정 기술을 나타낸다. "원래 이미지"는 도 9a에 제시된 40x 현미경 사진이다.
도 11a 및 11b는 P12 내지 P16에서 전신적으로 치료받은 OIR 마우스 망막의 현미경 사진(40x)으로부터 혈관의 구조화 및 균일성을 보여주는 대표적인 가공된 이미지 및 계산된 혈관 면적의 그래프이다. 도 11a에 제시된 바와 같이, 항-APLNR 항체와 애플리버셉트의 조합은, 항-APLNR 단독과 비교하여 더 구조화되고 균일하며 애플리버셉트 단독과 비교하여 덜 산재해 있는(sparse)(더 적은 프룬드 혈관을 가짐) 망막 혈관을 생성하였다. 도 11b는 치료군 사이에서 혈관 면적에 유의한 변화가 있었음을 보여준다(p <0.0005). 혈관 면적은 Fc 대조군과 비교하여 항-APLNR(***, p <0.0005)을 이용한 경우 유의하게 증가되었고, 애플리버셉트(***, p <0.005) 및 병용 치료(*, p <0.05)를 이용한 경우 저하되었다. 혈관 면적은 항-APLNR과 비교하여 애플리버셉트(####, p <0.0005) 및 조합(####, p <0.0005)을 이용한 경우 저하되었다. 대조적으로, 혈관 면적은 애플리버셉트와 비교하여 병용 치료(&&&, p<0.005)를 이용한 경우 유의하게 증가되었다.
도 12a 및 12b는 P12 내지 P16에서 전신적으로 치료받은 OIR 마우스 망막의 현미경 사진(40x)으로부터 혈관의 밀도를 보여주는 대표적인 가공된 이미지 및 계산된 혈관 길이의 그래프이다. 도 12a에 제시된 바와 같이, 항-APLNR 항체와 애플리버셉트의 조합은 항-APLNR(더 큰 밀도) 또는 애플리버셉트(더 작은 밀도) 단독과 비교하여 중간 밀도의 망막 혈관을 생성하였다. 도 12b는 치료군 사이에서 혈관 길이에 유의한 변화가 있었음을 보여준다(p <0.0005). 혈관 길이는 항-APLNR과 비교하여 애플리버셉트(####, p <0.0005) 및 조합(####, p <0.0005)을 이용한 경우 유의하게 저하되었다. 대조적으로, 혈관 길이는 애플리버셉트와 비교하여 병용 치료(&&&, p <0.005)를 이용한 경우 유의하게 증가되었다.
본 개시내용이 기재되기 전에, 본 개시내용은 기재된 특정 방법 및 실험 조건으로 제한되지 않으며, 이러한 방법 및 조건이 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 특정 실시형태를 설명하기 위한 것일 뿐이며, 본 개시내용의 범위가 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이므로, 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 특정 열거된 수치에 관하여 사용될 때, 그 값이 열거된 값과 1% 이하만큼 다를 수 있음을 의미한다. 예를 들어 본원에 사용된 바와 같이, 표현 "약 100"은 99 및 101 및 그 사이의 모든 값(예를 들어, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등)을 포함한다.
본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 개시내용의 실행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 이제 설명된다. 본 명세서에 언급된 모든 특허, 출원 및 비-특허 공개는 그 전문이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명 및 개시내용은 부분적으로는, APLNR 길항제와 VEGF 길항제(예를 들어, 항-APLNR 항체와 VEGF 트랩)의 조합이, APLNR 길항제 또는 VEGF 길항제 단독에서 관찰된 것보다 대상체의 망막에서 중간 밀도(더 적은 프룬드 혈관)의 보다 구조화되고 정돈된(ordered) 재혈관형성을 생성할 수 있다는 놀라운 발견을 기초로 한다.
정의
본원에 사용된 바와 같이, 표현 "아펠린 수용체," "APLNR," "아펠린R," "APJ 수용체" 등은: MEEGGDFDNYYGADNQSECEYTDWKSSGALIPAIYMLVFLLGTTGNGLVLWTVFRSSREKRRSADIFIASLAVADLTFVVTLPLWATYTYRDYDWPFGTFFCKLSSYLIFVNMYASVFCLTGLSFDRYLAIVRPVANARLRLRVSGAVATAVLWVLAALLAMPVMVLRTTGDLENTTKVQCYMDYSMVATVSSEWAWEVGLGVSSTTVGFVVPFTIMLTCYFFIAQTIAGHFRKERIEGLRKRRRLLSIIVVLVVTFALCWMPYHLVKTLYMLGSLLHWPCDFDLFLMNIFPYCTCISYVNSCLNPFLYAFFDPRFRQACTSMLCCGQSRCAGTSHSSSGEKSASYSSGHSQGPGPNMGKGGEQMHEKSIPYSQETLVVD(서열번호: 22)로 제시된 아미노산 서열, 또는 서열번호: 22와 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 인간 APLNR 단백질을 지칭한다. 본원에서 단백질, 폴리펩타이드 및 단백질 단편에 대한 모든 지칭은 비-인간 종(예를 들어, "마우스 APLNR", "원숭이 APLNR" 등)으로부터의 것으로 분명하게 명시되지 않는 한, 각각의 단백질, 폴리펩타이드 또는 단백질 단편의 인간 버전을 지칭하고자 한다.
본원에 사용된 바와 같이, "APLNR에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편" 또는 "항-APLNR 항체"는 APLNR 단백질의 단편에 결합하는 면역글로불린 분자, 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다. APLNR 분자는 천연 APLNR 단백질뿐만 아니라 재조합 APLNR 단백질 변이체, 예를 들어 단량체성 및 이량체성 APLNR 구축물을 포함한다. 실시형태에서, APLNR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 APLNR 길항제이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "길항제"는 부분적으로는, 효능제(agonist)(예를 들어, 내인성 리간드)와 동일한 부위에서 또는 동일한 부위 근처에서 수용체에 결합하지만, 상기 수용체의 활성 형태에 의해 전형적으로 개시되는 세포내 반응을 활성화시키지 않고, 이로써 효능제 또는 부분 효능제에 의한 세포내 반응을 저해하거나 중화시키는 모이어티를 지칭한다. 용어 길항제는 또한, 부분적으로는, 수용체 효능제에 결합하여, 이로써 이의 동족(cognate) 수용체와의 상호작용으로부터 효능제를 격리시키는 모이어티를 지칭할 수 있다. 효능제에 결합하는 길항제의 일례는 리간드 트랩, 예컨대 VEGF 트랩이다. 일부 경우, 길항제는 효능제 또는 부분 효능제의 부재 하에 기준선 세포내 반응을 약화시키지 않는다. 길항제는 본질적으로 경쟁적 결합 저해제로서 작용해야 할 필요는 없으나, 효능제를 격리시키거나 다운스트림 효과를 간접적으로 조정함으로써 작용할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 APLNR 길항제는 효능제(예를 들어, 아펠린)와 동일한 부위에서 또는 동일한 부위 근처에서 APLNR 수용체에 결합하지만, 상기 수용체의 활성 형태에 의해 전형적으로 개시되는 세포내 반응을 활성화시키지 않고, 이로써 APLNR의 세포내 반응을 저해하거나 중화시키는 모이어티를 지칭할 수 있다. 실시형태에서, APLNR 길항제는 APLNR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. APLNR 길항제의 예는 2015년 5월 28일에 공개된 국제 특허 공개 WO2015077491에서 확인할 수 있으며, 이는 그 전문이 원용에 의해 본 명세서에 구체적으로 포함된다. 다른 APLNR 길항제는 저분자 및 다른 생물학적 엔터티, 예컨대 펩타이드를 포함할 수 있다.
용어 "면역글로불린"(Ig)은 폴리펩타이드 사슬의 2개 쌍, 즉, 1쌍의 경쇄(L) 및 1쌍의 중쇄(H)로 구성된 구조적으로 관련된 당단백질 부류를 지칭하며, 이들 사슬은 모두 이황화 결합에 의해 서로 연결될 수 있다. 면역글로불린의 구조는 양호하게 특징화되었다. 예를 들어 문헌[Fundamental Immunology Ch. 7(Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N. Y. (1989))]을 참조한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 특정 항원(예를 들어, APLNR)에 특이적으로 결합하거나 이와 상호작용하는 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 임의의 항원-결합 분자 또는 분자 복합체를 의미한다. 용어 "항체"는 본원에 기재된 바와 같이, 4개의 폴리펩타이드 사슬, 즉, 이황화 결합에 의해 서로 연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 면역글로불린 분자, 뿐만 아니라 이의 다량체(예를 들어, IgM), 뿐만 아니라 하나 이상의 중쇄의 단편 또는 하나 이상의 경쇄의 단편을 포함하는 면역글로불린 분자(예를 들어, Fab, F(ab')2 또는 scFv 단편)를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인(CL1)을 포함한다. VH 및 VL 영역은, 프레임워크 영역(FR)이라고 명명되는 보다 보존된 영역이 개재된(interspersed) 상보성 결정 영역(CDR)이라고 명명되는 초가변 영역으로 더 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단부터 카르복시-말단까지 하기의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 본 개시내용의 상이한 실시형태에서, 항-APLNR 항체(또는 이의 항원-결합 부분)의 FR은 인간 생식계열 서열과 동일할 수 있거나, 또는 천연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 아미노산 공통 서열은 2개 이상의 CDR의 병렬 분석을 기초로 정의될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 또한, 완전(full) 항체 분자의 항원-결합 단편을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 항체의 "항원-결합 부분", 항체의 "항원-결합 단편" 등은 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 천연적으로 발생하거나, 효소적으로 수득 가능하거나, 합성적이거나, 유전적으로 조작된 임의의 폴리펩타이드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은 예를 들어, 단백분해 절단(proteolytic digestion)과 같은 임의의 적합한 표준 기술, 또는 항체 가변 및 선택적으로 불변 도메인을 인코딩하는 DNA의 조작 및 발현을 수반하는 재조합 유전공학적 기술을 사용하여 완전 항체 분자로부터 유래될 수 있다. 이러한 DNA는 공지되어 있고/있거나, 예를 들어 상업적인 출처인 DNA 라이브러리(예를 들어, 파지-항체 라이브러리 포함)로부터 쉽게 입수 가능하거나, 합성될 수 있다. DNA는, 예를 들어, 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적합한 입체배치로 배열시키기 위해, 또는 코돈을 도입하기 위해, 시스테인 잔기를 생성하기 위해, 아미노산을 변형, 첨가 또는 결실시키는 등을 수행하기 위해 화학적으로 또는 분자생물학 기술을 이용함으로써 시퀀싱되고, 조작될 수 있다. 이러한 기술은 또한, 완전 항체 분자로부터 유래된 항원-결합 단편을 함유하는 임의의 항체-융합 분자를 합성하는 데 이용될 수 있다.
항원-결합 단편의 비제한적인 예는: (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단쇄 Fv(scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체의 초가변 영역을 모방하는 아미노산 잔기로 구성된 최소 인지 단위(unit)(예를 들어, CDR3 펩타이드와 같은 단리된 상보성 결정 영역(CDR)) 또는 구속형(constrained) FR3-CDR3-FR4 펩타이드를 포함한다. 도메인-특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-결실 항체, 키메라 항체, CDR-이식 항체, 이중체, 삼중체, 사중체, 미니체, 나노체(예를 들어, 1가 나노체, 2가 나노체 등), 소모듈형 면역약제(SMIP) 및 상어 가변 IgNAR 도메인과 같은 다른 조작된 분자 또한, 본원에 사용된 바와 같이 표현 "항원-결합 단편" 내에 포괄된다.
항체의 항원-결합 단편은 전형적으로 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 것이다. 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성을 가질 수 있고, 일반적으로 하나 이상의 프레임워크 서열에 인접하거나 이와 프레임을 맞춘 적어도 하나의 CDR을 포함할 것이다. VL 도메인과 연관된 VH 도메인을 갖는 항원-결합 단편에서, VH 및 VL 도메인은 임의의 적합한 배열에서 서로에 비하여 위치할 수 있다. 예를 들어, 가변 영역은 이량체일 수 있고 VH-VH, VH-VL 또는 VL-VL 이량체를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체의 항원-결합 단편은 단량체성 VH 또는 VL 도메인을 함유할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 항체의 항원-결합 단편은 적어도 하나의 불변 도메인에 공유 연결된 적어도 하나의 가변 도메인을 함유할 수 있다. 본 개시내용의 항체의 항원-결합 단편 내에서 확인될 수 있는 가변 및 불변 도메인의 비제한적인 예시적인 입체구조는: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; 및 (xiv) VL-CL을 포함한다. 상기 나열된 임의의 예시적인 입체배치를 포함하여 가변 및 불변 도메인의 임의의 입체배치에서, 가변 및 불변 도메인은 서로 직접적으로 연결될 수 있거나, 완전 또는 부분 힌지 또는 링커 영역에 의해 연결될 수 있다. 힌지 영역은 단일 폴리펩타이드 분자에서 인접한 가변 및/또는 불변 도메인 사이의 가요성 또는 반-가요성 연결을 초래하는, 적어도 2개(예를 들어, 5, 10, 15, 20, 40 또는 60개 이상)의 아미노산으로 구성될 수 있다. 더욱이, 본 개시내용의 항체의 항원-결합 단편은 상기에 나열된 임의의 가변 및 불변 도메인 입체배치의 동종-이량체 또는 이종-이량체(또는 다른 다량체)를 서로간 및/또는 하나 이상의 단량체성 VH 또는 VL 도메인의 비-공유 결합으로(예를 들어, 이황화 결합(들)에 의해) 포함할 수 있다.
완전 항체 분자와 마찬가지로, 항원-결합 단편은 단일특이적 또는 다중특이적(예컨대, 이중특이적)일 수 있다. 항체의 다중특이적 항원-결합 단편은 전형적으로, 적어도 2개의 상이한 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서, 각각의 가변 도메인은 개별 항원에, 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 본원에 개시된 예시적인 이중특이적 항체 포맷을 포함하는 임의의 다중특이적 항체 포맷은 당업계에서 이용 가능한 일상적인 기술을 사용하여 본 개시내용의 항체의 항원-결합 단편의 맥락에서 사용하기 위해 적합화될 수 있다.
어구 "항체-융합 단백질"은 본원에 기재된 바와 같이 항체 또는 항원-결합 단편을 함유하도록 조작된 본 개시내용의 항체로부터 유래된 재조합 폴리펩타이드 및 단백질을 포함한다. 펩타이드 구성성분은 항체 경쇄 또는 중쇄의 N-말단 또는 C-말단에서 항-APLNR 항체 또는 항원-결합 단편에 펩타이드 링커와 함께 또는 이러한 링커 없이 융합될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 어구 "~에 융합된"은, 1개 초과의 서열을 조합함으로써, 전형적으로 1개의 유전자를 제2 유전자와 함께 프레임 내에서 발현 벡터 내로 클로닝하여 2개의 유전자가 1개의 연속 폴리펩타이드를 인코딩하도록 제조된 키메라 유전자의 발현에 의해 형성된 폴리펩타이드를 의미한다(그러나 이로 한정되지 않음). 재조합 클로닝 기술, 예컨대 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및 제한효소 엔도뉴클레아제 클로닝은 당업계에 잘 공지되어 있다. 재조합 기술에 의해 제조되는 것 외에도, 폴리펩타이드의 부분은 화학 반응, 또는 커스텀 폴리펩타이드의 제조를 위해 당업계에 공지된 다른 수단에 의해 서로 "융합"될 수 있다.
일부 실시형태에서, 항체-융합 단백질의 구성성분 또는 아미노산은 링커(또는 "스페이서") 펩타이드에 의해 분리된다. 이러한 펩타이드 링커는 당업계에 잘 공지되어 있고(예를 들어, 폴리글리신 또는 Gly-Ser 링커), 전형적으로 항체-융합 단백질의 구성성분 중 하나 또는 둘 모두의 적절한 접힘을 허용한다. 상기 링커는 융합 단백질의 구성성분의 가요성 연접 영역을 제공하여, 분자의 2개의 말단이 독립적으로 움직이도록 허용하고, 2개의 모이어티의 적절한 기능을 각각 보유하는 데 있어서 중요한 역할을 할 수 있다. 따라서, 연접 영역은 일부 경우 2개의 부분을 함께 조합하는 링커로서 작용하기도 하고, 2개의 부분이 각각 그 자체의 생물학적 구조를 형성하고 다른 부분을 간섭하지 않도록 허용하는 스페이서로서 작용하기도 한다. 뿐만 아니라, 연접 영역은 대상체의 면역계에 의해 외래물질로서 인지되지 않을, 즉, 면역원성으로 여겨지지 않을 에피토프를 생성해야 한다. 링커 선택은 또한, 융합 단백질의 결합 친화성, 따라서, 대생물활성(bioactivity)에 효과를 가질 수 있다. (문헌[Huston, et al, 1988, PNAS, 85:16:5879-83; Robinson & Bates, 1998, PNAS 95(11):5929-34; 및 Arai, et al. 2001, PEDS, 14(8):529-32; Chen, X. et al., 2013, Advanced Drug Delivery Reviews 65:1357-1369] 참조) 일 실시형태에서, 아펠린 펩타이드는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 경쇄 또는 중쇄의 C-말단 또는 N-말단에 하나 이상의 펩타이드 링커를 통해 연결된다.
본 개시내용의 항체는 보체-의존성 세포 독성(CDC) 또는 항체 의존성 세포-매개 세포 독성(ADCC)을 통해 작용할 수 있다. "보체-의존성 세포 독성"(CDC)은 보체의 존재 하에 본 개시내용의 항체에 의한 항원-발현 세포의 용해를 말한다. "항체-의존적 세포-매개 세포독성"(ADCC)은 Fc 수용체(FcR)를 발현시키는 비특이적 세포독성 세포(예를 들어, 자연 살해(Natural Killer: NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인지하고, 이로써 표적 세포의 용해를 야기하는 세포-매개 반응을 지칭한다. CDC 및 ADCC는 잘 공지되어 있고, 당업계에서 이용 가능한 분석을 이용하여 측정될 수 있다. (예를 들어 미국 특허 5,500,362 및 5,821,337, 및 문헌[Clynes et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656] 참조). 항체의 불변 영역은 보체를 고정시키고, 세포-의존적 세포독성을 매개하는 항체의 능력에 있어서 중요하다. 따라서, 항체의 이소타입(isotype)은 세포독성을 매개하기 위해 그것이 항체에 대해 바람직한지의 여부에 기초하여 선택될 수 있다.
또 다른 양태에서, 항체는 이러한 항체의 요망되는 약물동력학적 특성에 영향을 주지 않으면서, 정상적인 Fc 효과기 기능 모두 또는 일부를 활성화시키거나 어느 것도 활성화시키지 않도록 이의 Fc 도메인에서 조작될 수 있다. 따라서, 변경된 Fc 수용체 결합을 갖는 조작된 Fc 도메인을 갖는 항체는 감소된 부작용을 가질 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 단백질은 키메라 또는 그렇지 않으면 변형된 Fc 도메인을 포함한다. 키메라 Fc 도메인의 일례에 대해, 2014년 8월 7일에 공개된 국제 공개 WO 2014/121087 A1을 참조하며, 이 문헌은 그 전문이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "EC50" 또는 "EC50"은 1/2 최대 유효 농도를 지칭하며, 이러한 농도는 명시된 노출 시간 후 기준선과 최대 사이의 1/2에서 반응, 예를 들어 세포 반응을 유도하는 리간드의 농도를 포함한다. EC50은 본질적으로 이의 최대 효과의 50%가 관찰되는 리간드의 농도를 나타낸다. 따라서, 세포 신호전달과 관련하여, 증가된 수용체 활성은 저하된 EC50 값, 즉, 1/2 최대 유효 농도 값으로 관찰된다(더 큰 반응을 생성하는 데 있어서 더 적은 리간드가 필요함).
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "IC50" 또는 "IC50"은 세포 반응의 1/2 최대 저해 농도를 지칭한다. 다시 말해, 생물학적 또는 생화학적 수용체 기능을 저해하는 데 있어서 특정 모이어티(예를 들어, 단백질, 화합물 또는 분자)의 효과성의 측정이며, 여기서, 검정법은 주어진 생물학적 과정을 저해하는 데 필요한 이러한 모이어티의 양을 정량화한다. 따라서, 세포 신호전달과 관련하여, 더 큰 저해 활성은 저하된 IC50 값으로 관찰된다.
혈관 안 질환 또는 장애를 치료하거나 개선하는 방법
본 개시내용은 대상체에서 혈관 안 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상 또는 적응증을 치료하거나, 예방하거나 개선하는 방법을 포함한다. 본 개시내용의 이러한 양태에 따른 방법은 치료적 유효량의, APLNR 길항제를 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, APLNR 길항제는 피하, 정맥내 또는 유리체내 투여된다. 실시형태에서, APLNR 길항제는 VEGF 길항제와 조합되어 투여된다. 일부 실시형태에서, APLNR 길항제는 VEGF 길항제와 조합되어 유리체내 투여된다. 일부 실시형태에서, APLNR 길항제는 VEGF 길항제와 함께 단일 조합된 투약 제제로서 투여된다. 일부 실시형태에서, APLNR 길항제는 VEGF 길항제와 조합되어 투여되며, 여기서, APLNR 길항제는 정맥내 투여되고, VEGF 길항제는 유리체내 투여된다. VEGF 길항제는 APLNR 길항제 전에, 후에 또는 동시에 투여될 수 있다.
본 발명은 부분적으로는, VEGF와 아펠린/APLNR 경로 둘 모두에 대한 길항 작용의 조합이 유리하게는, 눈의 원치 않는 병리학적 혈관형성에 영향을 줄 수 있다는 출원인의 발견을 기초로 한다. 특히, 출원인은, 이러한 조합이 증식성 당뇨병성 망막병증, 미숙아 망막병증 및 나이-관련 황반 변성을 포함하여 당뇨병성 망막병증과 같은 병태를 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있음을 발견하였다. APLNR의 길항제의 첨가는 VEGF 길항작용의 항-혈관신생 효과를 향상시킬 수 있으며, 여기서, VEGF 경로의 길항작용은 포화되었다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하다", "치료하는" 등은 신혈관 안 질환 또는 장애의 증상을 경감시키거나, 일시적 또는 영구적 기준으로 증상의 원인을 없애거나, 증상의 출현을 예방하거나 늦추는 것을 의미한다. 소정의 실시형태에서, 본 방법은 비제한적으로, 망막 혈관신생, 신혈관 형성, 혈관 누출, 중심와(center of fovea)의 500 μm 이내에서의 망막 비후, 인접한 망막 비후와 함께 중심와의 500 μm 이내에서의 단단한 황색 삼출물, 및 중심와의 1 원판 직경 이내의 임의의 부분인 적어도 1 원판 면적(disc area)의 망막 비후, 흐릿한 시력, 부유물, 대조시 상실(loss of contrast), 복시(double vision), 및 시력의 궁극적인 상실을 포함하는 적어도 하나의 증상 또는 적응증을 치료하거나 개선하는 데 유용하다. AMD 또는 DME와 같은 혈관 안 질환을 치료하는 방법의 맥락에서, 상기 용어는, 치료의 개시로부터, 대상체가 조기 치료 당뇨병성 망막병증 연구(EDTRS) 시력 차트 상에서 하나 이상의(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의) 글자의 이득(gain)을 나타내는 것을 의미한다. 소정의 실시형태에서, 상기 용어는, 치료의 개시로부터 15개 이상의 글자의 시력 상실이 대상체에서 예방되는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "예방하다", "예방하는" 등은 혈관 안 질환의 증상, 적응증 또는 합병증의 발병을 예방하는 것을 의미한다. AMD 또는 DME와 같은 혈관 안 질환을 치료하는 방법의 맥락에서, 상기 용어는, 치료의 개시로부터 중등도 또는 중증 시력 상실이 대상체에서 예방되는 것을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "혈관 안 질환 또는 장애"는 눈에서 혈관에 영향을 주는 안 질환 또는 장애를 지칭한다. 상기 질환은 비정상적인 혈관신생(새로운 혈관의 형성) 또는 혈관의 폐색이나 차단으로 인해 유발될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어는 혈관신생과 연관된 안 질환 또는 장애를 포함한다. 상기 용어는 당뇨병성 망막병증(증식성 당뇨병성 망막병증 포함), 당뇨 황반 부종, 나이-관련 황반 변성, 망막 신혈관 형성, 중심 망막 정맥 폐색, 분지 망막 정맥 폐색, 결절 맥락막 혈관병증, 맥락막 신혈관 형성(CNV), 퇴행성 근시(근시성 CNV), 신혈관 녹내장, 및 미숙아 망막병증으로 구성된 군으로부터 선택되는 안 질환 또는 장애를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 소정의 실시형태에서, 용어 "신혈관 안 질환 또는 장애"는 용어 "혈관신생과 연관된 안 질환 또는 장애"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 대상체에서 혈관신생과 연관된 안 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상 또는 적응증을 치료하거나, 예방하거나 개선하는 방법을 포함하며, 여기서, 상기 질환 또는 장애는 병리학적 신혈관 형성, 당뇨병성 망막병증(증식성 당뇨병성 망막병증 포함), 당뇨 황반 부종, 나이-관련 황반 변성, 망막 신혈관 형성, 결절 맥락막 혈관병증, 맥락막 신혈관 형성(CNV), 퇴행성 근시(근시성 CNV), 신혈관 녹내장, 및 미숙아 망막병증으로 구성된 군으로부터 선택된다. 소정의 실시형태에서, APLNR 길항제의 투여가 또한, 예를 들어 산소 유도 망막병증(OIR)에서 망막의 정상적인 재-혈관형성을 촉진한다.
본원에 사용된 바와 같이, "당뇨 황반 부종"(DME)은 당뇨병(1형 또는 2형)을 가진 사람에게 영향을 주는 중증의 안 병태(eye condition)를 지칭한다. 황반 부종은, 망막 내 혈관이 황반 내로 누출되고, 유체 및 단백질 침착물이 눈의 황반(망막의 황색 중심 영역) 위에서 또는 아래에서 수합되어, 황반을 비후화시키고 팽윤시킬 때(부종) 발생한다. 황반이 안구의 뒤에서 망막의 중심 근처에 있기 때문에, 팽윤은 사람의 중심시(central vision)를 왜곡시킬 수 있다. DME의 1차 증상은 흐릿한 시력, 부유물, 대조시 상실, 복시, 및 시력의 궁극적인 상실을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. DME의 병적 측면은, 보통 망막 내에서 물 이동을 방지하여 따라서 유체가 망막 조직 내에 축적되게 하는 혈액-망막 장벽의 와해, 및 망막 비후의 존재를 특징으로 한다. DME는 현재, 사람이 표준화된 차트 상에서 읽을 수 있는 최소 글자를 결정하는 시력 검사, 질환의 징후를 체크하는 확장된 안구 검사(dilated eye exam), 빛간섭 단층 촬영(OCT; optical coherence tomography) 또는 형광 안저촬영(FA; fluorescein angiography)과 같은 이미지 검사(imaging test), 및 눈 내부의 압력을 측정하는 장비인 토노메트리(tonometry)로 구성된 눈 검사(eye examination) 동안에 진단된다. 하기 연구를 또한 수행하여, 치료를 결정한다: 빛간섭 단층 촬영(OCT), 형광 안저촬영 및 컬러 스테레오 안저 촬영(color stereo fundus photography). DME는 광범위하게는 2개의 주요 범주 - 국소성(Focal) 및 미만성(Diffuse)으로 특징화될 수 있다. 국소성 DME는 충분한 황반 혈액 유동과 함께 황반에서 개별적이며 별개의 누출의 특이적인 영역을 특징으로 한다. 미만성 DME는 눈의 내부 혈액-망막 장벽의 와해로 인해 황반 주변의 전체 모세혈관상(capillary bed)의 누출로 인한 것이다. 국소성 및 미만성 외에도, DME는 또한, 임상 검사 확인을 기초로, 임상적으로 유의한 황반 부종 (CSME), 비-CSME, 및 중심와를 수반하는 중심 관여 CSME(CSME-CI)로 분류된다. 본 개시내용은 상기 언급된 범주의 DME를 치료하는 방법을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 나이-관련 황반 변성(AMD)은 황반으로 공지된 망막의 작은 중심부가 악화될 때의 중증 안 병태를 지칭한다. 습식 형태(wet form)의 AMD는 황반 아래의 맥락막으로부터 비정상적인 혈관의 성장을 특징으로 한다. 이를 맥락막 신혈관 형성(CNV)이라고 한다. 이들 혈관은 혈액 및 유체를 망막 내로 누출시켜, 직선을 물결 모양으로 보이게 하는 시력의 왜곡, 뿐만 아니라 맹점(blind spot), 및 중심시의 상실을 유발한다. 이들 비정상적인 혈관은 결국 반흔(scar)을 남겨, 중심시의 영구적 상실을 야기한다. AMD의 증상은 시력의 중심에서 어둡고 흐릿한 영역; 및 약화되거나 변화된 색 지각(color perception)을 포함한다. AMD는 일상적인 시력 검사에서 검출될 수 있다. 황반 변성의 가장 보편적인 조기 징후 중 하나는 드루젠(drusen) - 망막 아래의 아주 작은 황색 침착물 - 또는 색소 응괴(pigment clumping)의 존재이다.
본원에 사용된 바와 같이, 수정체후부 섬유증식증(retrolental fibroplasia) 및 테리 증후군(Terry syndrome)으로도 공지된 "미숙아 망막병증"(ROP)은 저체중 출생의 미숙아 및 어린 임신 연령(young gestational age)에 영향을 주는 병태를 지칭한다. 미숙아 망막병증은, 정상적인 망막 혈관이 전체 임신 기간 전의 출생에 의해 간섭을 받아, 망막 혈관의 비정상적인 발달을 초래할 때 발생한다. 병태가 진행된다면, 반흔 조직의 성장은 망막 박리 및 시력 손상 또는 시력 상실을 야기할 수 있다. ROP의 발병은 2개의 별개의 기(phase): 혈관 소멸기(vasoobliterative phase) 및 혈관 증식기(vasoproliferative phase)를 수반한다. 정상적인 망막 혈관 성장은 제1 기에서 고산소(hyperoxic) 환경에 노출된 결과 지연되는 반면, 제2 기는 신혈관 형성의 급속한 증가, 뒤이어 망막 박리를 포함한다. 한랭치료법 또는 레이저 광응고화에 의한 무혈관 망막의 절제는 ROP에 대한 1차 치료로서 간주되어 왔으며, 항-VEGF 치료법(예를 들어, 항-VEGF 항체)은 연구 중에 있다. 이들 치료 선택에도 불구하고, 병태는 평생 시력 장애의 주된 원인으로 남아 있으며, 발생률은 20년 초과 동안 상대적으로 일정하게 유지되었다.
본원에 사용된 바와 같이, 당뇨병성 망막병증(DR)은 연장된 고혈당증과 연관된 망막 미세혈관구조의 만성 진행성 질환이다. DR은 당뇨병의 가장 보편적인 미세혈관 합병증이고, 진성 당뇨병의 유병률(prevalence)이 세계적으로 계속 증가하고 있어서 급증하는 세계적 문제이다. 본원에 사용된 바와 같이, 증식성 DR(PDR)은 DR의 시력-위협 합병증이고, 눈의 망막, 시신경 유두(optic nerve head) 또는 전안부(anterior segment)에서 비정상적인 새로운 혈관의 발달을 특징으로 한다. PDR은 DR의 진행된 단계이며, 이 단계는 예비망막 공간 내로 돌출되는 망막 내의 새로운 혈관의 일탈적인(aberrant) 형성을 자극하는 저산소증 및 프로혈관신생(proangiogenesis) 성장 인자의 발현에 의해 구동된다. 망막 신혈관 형성은 이것이 유리체 출혈 또는 견인성 망막 박리를 야기할 때 중증 시력 상실을 초래할 수 있다. 레이저 광응고화는 오랫 동안 PDR의 치료 표준이 되어 왔으며, 보다 최근의 치료법은 항-VEGF(예를 들어, 항-VEGF 항체)와 스테로이드 작용제를 이용한 안내(intraocular) 치료 및 유리체망막 수술을 포함한다. 이들 치료 진전에도 불구하고, 충족되지 않은 치료 요구(need), 특히 비침습적, 비파괴적 및 더 장기간의 치료 옵션은 남아 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 표현 "이를 필요로 하는 대상체"는 혈관신생과 연관된 안 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상 또는 적응증을 나타내고/나타내거나 상기 안 질환 또는 장애를 진단받은 인간 또는 비-인간 포유류를 의미한다. 용어 "이를 필요로 하는 대상체"는 또한, 예를 들어 치료 전에, 예를 들어 망막 혈관신생, 신혈관 형성, 혈관 누출, 중심와의 500 μm 이내에서의 망막 비후, 인접한 망막 비후와 함께 중심와의 500 μm 이내에서의 단단한 황색 삼출물, 및 중심와의 1 원판 직경 이내의 임의의 부분인 적어도 1 원판 면적의 망막 비후, 흐릿한 시력, 부유물, 대조시 상실, 복시, 및 시력의 궁극적인 상실과 같은 신혈관 안 질환의 하나 이상의 적응증을 나타내는(또는 나타낸) 대상체를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 맥락에서, "이를 필요로 하는 대상체"는 또한, 당뇨병성 망막병증(증식성 당뇨병성 망막병증 포함), 당뇨 황반 부종, 나이-관련 황반 변성, 망막 신혈관 형성, 중심 망막 정맥 폐색, 분지 망막 정맥 폐색, 결절 맥락막 혈관병증, 맥락막 신혈관 형성(CNV), 퇴행성 근시(근시성 CNV), 신혈관 녹내장, 및 미숙아 망막병증으로 구성된 군으로부터 선택되는 혈관 안 질환 또는 장애를 가진 인간 또는 비-인간 포유류를 포함한다.
본 개시내용의 맥락에서, "이를 필요로 하는 대상체"는 DME 또는 AMD에 더 취약하거나, DME-연관 또는 AMD-연관 바이오마커, 또는 ROP 또는 PDR과 연관된 바이오마커를 상승된 수준으로 보여줄 수 있는 집단의 부분집합을 포함할 수 있다. 예를 들어, "이를 필요로 하는 대상체"는 10년 초과 동안 당뇨병을 앓고 있는 대상체, 또는 빈번한 고 혈중 당 수준(high blood sugar level) 또는 고 공복 혈당(blood glucose) 수준을 갖는 대상체를 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 용어 "이를 필요로 하는 대상체"는 APLNR 길항제 및/또는 VEGF 길항제의 투여 전에 또는 투여 시, 당뇨병을 진단받았거나 진단받는 대상체를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 용어 "이를 필요로 하는 대상체"는 APLNR 길항제 및/또는 VEGF 길항제의 투여 전에 또는 투여 시, 50세 초과인 대상체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 용어 "이를 필요로 하는 대상체"는 흡연자인 대상체, 또는 고혈압 또는 고 콜레스테롤을 갖는 대상체를 포함한다.
본 개시내용은 혈관 안 질환을 치료하거나, 예방하거나, 이의 중증도(severity)를 감소시키는 방법을 포함하며, 상기 방법은 치료적 유효량의, VEGF 길항제와 조합하여, APLNR 길항제를 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 약제학적 조성물은 다수의 용량으로, 예를 들어 특이적인 치료 투약 요법(dosing regimen)의 일부로서 대상체에게 투여된다. 예를 들어, 치료적 투약 요법은 다수의 용량의 약제학적 조성물을 대상체에게 약 1일 1회, 2일마다 1회, 3일마다 1회, 4일마다 1회, 5일마다 1회, 6일마다 1회, 1주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 1개월에 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회, 4개월마다 1회의 빈도로, 또는 덜 빈번하게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 치료적 투약 요법은 다수의 용량의 약제학적 조성물을 대상체에게 1일 1회 또는 1일 2회 이상의 빈도로 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한, 대상체에서 혈관 누출을 저해하거나, 감소시키거나 억제시키는 방법을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 개시내용의 이러한 양태에 따른 방법은 하나 이상의 용량의, VEGF 길항제와 조합하여, APLNR 길항제를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하여, 상기 대상체의 눈에서 혈관 누출을 감소시키거나 저해하는 단계를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 혈관 누출은 VEGF 길항제 단독을 투여받은 대상체와 비교하여, 3주 초과, 4주 초과, 8주 초과, 또는 10주 초과 동안 저해된다.
소정의 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 방법은 치료적 유효량의, VEGF 길항제와 조합하여, APLNR 길항제를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 소정의 실시형태에서, APLNR 길항제는 황반 내로의 누출을 중단시키기 위해 레이저 치료를 포함한 치료법과 조합되어 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 어구 "~과 조합하여"는, APLNR 길항제를 포함하는 약제학적 조성물이 VEGF 길항제의 투여와 동시에, 투여 직전에, 또는 투여 직후에 대상체에게 투여되는 것을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 어구 "~과 조합하여"는, APLNR 길항제를 포함하는 약제학적 조성물이 VEGF 길항제의 투여와 동시에, 투여 직전에, 또는 투여 직후에 대상체에게 투여되는 것을 의미한다. 소정의 실시형태에서, VEGF 길항제는 APLNR 길항제와 공동-제제로서 투여된다. 관련된 실시형태에서, 본 개시내용은 치료적 유효량의, APLNR 길항제를 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하여, VEGF 길항제 단독의 투여와 비교하여, 더 큰 치료 효과 또는 상승 효과를 제공하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 대상체는 유리체내 투여되는 VEGF 길항제의 치료적 요법 상에 있을 수 있다. 일부 실시형태에서, APLNR 길항제가 이러한 치료적 요법에 추가되며, 여기서, VEGF 길항제의 하나 이상의 유리체내 주사가 감소될 수 있거나, 연속적인 유리체내 주사 사이의 기간이 증가될 수 있다.
본 개시내용의 방법은 혈관 안 장애(eye disorder)를 진단받았거나 이를 앓을 위험에 있는 대상체에서 혈관 안 장애를 치료하거나 예방하는 데 유용하다. 일반적으로, 본 개시내용의 방법은 치료 요법(초기 용량은 "제0주"에 투여됨)의 개시의 36주 이내에, 예를 들어 제6주 말까지, 제12주 말까지, 제18주 말까지, 제24주 말까지 효능을 실증한다. AMD 및 DME와 같은 혈관신생 안 장애를 치료하는 방법의 맥락에서, "효능"은, 치료의 개시로부터 대상체는 조기 치료 당뇨병성 망막병증 연구(ETDRS) 시력 차트 상에서 10개 이하의 글자의 상실을 나타내는 것을 의미한다. 소정의 실시형태에서, "효능"은 치료의 개시 시점으로부터 ETDRS 차트 상에서 하나 이상의(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11개 이상의) 글자의 이득을 의미한다.
예를 들어, 치료적 투약 요법은 다수의 용량의 약제학적 조성물을 대상체에게 약 1일 1회, 2일마다 1회, 3일마다 1회, 4일마다 1회, 5일마다 1회, 6일마다 1회, 1주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 1개월에 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회, 4개월마다 1회의 빈도로, 또는 덜 빈번하게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 치료적 투약 요법은 다수의 용량의 약제학적 조성물을 대상체에게 1일 1회 또는 1일 2회 이상의 빈도로 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
APLNR 길항제
본 개시내용은 대상체에서 혈관 안 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상 또는 적응증을 치료하거나, 예방하거나, 개선하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 치료적 유효량의, APLNR 길항제를 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. APLNR 길항제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 아펠린 수용체 신호전달 경로의 저분자 저해제, 및 아펠린 수용체 신호전달 경로의 펩타이드 저해제를 포함한다. APLNR의 예시적인 저분자 저해제 또는 길항제는 미국 특허 공개 US2014000518과 US20150125459 및 국제 특허 공개 WO2004081198과 WO2015140296에서 확인할 수 있다. APLNR의 예시적인 펩타이드 저해제 또는 길항제는 미국 특허 9,593,153과 7,736,646 및 국제 특허 공개 WO2004081198에서 확인할 수 있다. 다른 APLNR 길항제는 MM54, MM07, N-알파-아세틸-노나-D-아르기닌 아미드 아세테이트(ALX40-4C), ML221, 돌연변이체 아펠린-13(F13A), 4-옥소-6-((피리미딘- 2-일티오) 메틸)-4H-피란-3-일-4-니트로벤조에이트(Ml221) 및 E339-3D6을 포함한다.
APLNR 길항제는 2015년 5월 5일에 공개된 국제 특허 공개 WO 2015077491 및 미국 특허 9,493,554에서 개시된 항체의 군으로부터 선택되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하고, 상기 특허 공개는 그 전문이 본 명세서에 구체적으로 포함된다. 일부 실시형태에서, 항체는 H2aM9232N, H4H9232N 또는 H1M9207N이다. 일 실시형태에서, 항-APLNR 항체는 H4H9232N이다.
APLNR 길항제는 서열번호: 2 및 13으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR)을 포함하는 군으로부터 선택되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
APLNR 길항제는 서열번호: 7 및 18로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
소정의 실시형태에 따르면, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호: 1 및 6(예를 들어, H1M9207N), 및 서열번호: 12 및 17(예를 들어, H2aM9232N 또는 H4H9232N)의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 포함한다.
본 개시내용의 소정의 비제한적인 예시적 항체 및 항원-결합 단편은 서열번호: 3-4-5-8-9-10(예를 들어, H1M9207N); 및 서열번호: 14-15-16-19-20-21(예를 들어, H2aM9232N 또는 H4H9232N)로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3 도메인을 각각 포함한다. H2aM9232N 및 H4H9232N으로 지정된 항체는 동일한 인간 가변 영역(HCVR 및 LCVR)을 공유한다. H2aM9232N은 뮤린 IgG2a 중쇄 불변 영역을 포함하는 한편, H4H9232N은 인간 IgG4 중쇄 불변 영역을 포함한다.
APLNR 길항제는 서열번호: 2/7 및 13/18로 구성된 군으로부터 선택되는 HCVR 및 LCVR 서열 쌍(HCVR/LCVR)을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
APLNR 길항제는 서열번호: 5 및 16으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR3(HCDR3) 도메인; 및 서열번호: 10 및 21로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR3(LCDR3) 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
소정의 실시형태에서, APLNR 길항제는 서열번호: 5/10 및 16/21로 구성된 군으로부터 선택되는 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
APLNR 길항제는 서열번호: 3 및 14로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR1(HCDR1) 도메인; 서열번호: 4 및 15로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄 CDR2(HCDR2) 도메인; 서열번호: 8 및 19로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR1(LCDR1) 도메인; 및 서열번호: 9 및 20으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄 CDR2(LCDR2) 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
소정의 비제한적인 예시적 항-APLNR 항체는 APLNR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 포함하며, 여기서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 서열번호: 2/7 및 13/18로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 및 경쇄 가변 영역(HCVR/LCVR) 서열 내에 함유된 중쇄 및 경쇄 CDR 도메인을 포함한다.
HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 내의 CDR을 식별하기 위한 방법 및 기술은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 본원에서 개시된 명시된 HCVR 및/또는 LCVR 아미노산 서열 내의 CDR을 식별하는 데 사용될 수 있다. CDR의 경계를 식별하는 데 사용될 수 있는 대표적인 통례는, 예컨대 Kabat 정의, Chothia 정의 및 AbM 정의를 포함한다. 일반적으로, Kabat 정의는 서열 가변성을 기초로 하고, Chothia 정의는 구조적 루프 영역의 위치를 기초로 하며, AbM 정의는 Kabat 접근법과 Chothia 접근법 사이의 절충안이다. 예를 들어 문헌[Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol. 273:927-948; 및 Martin et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272]를 참조한다. 항체 내의 CDR 서열을 식별하기 위한 공개 데이터베이스 또한, 이용 가능하다.
본 개시내용은 서열번호: 2 및 13으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 중쇄(HCVR)를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 개시내용은 또한, 서열번호: 7 및 18로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 갖는 경쇄(LCVR)를 포함하는 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 개시내용은 또한, HC 및 LC 아미노산 서열 쌍(HC/LC)을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
소정의 실시형태에 따르면, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체 H1M9207N, 또는 H2aM9232N(또는 H4H9232N)의 핵산 서열에 의해 인코딩되는 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 포함한다.
본 개시내용은 변형된 글리코실화 패턴을 갖는 항-APLNR 항체를 포함한다. 소정의 적용에서, 바람직하지 않은 글리코실화 부위를 제거하기 위한 변형이 유용할 수 있거나, 예를 들어, 항체 의존적 세포의 세포독성(ADCC) 기능을 증가시키기 위해 올리고당 사슬 상에 존재하는 푸코스 모이어티가 결여된 항체가 유용할 수 있다(문헌[Shield et al., 2002, JBC 277:26733] 참조). 다른 적용에서, 보체 의존적 세포독성(CDC)을 변형시키기 위해 갈락토실화의 변형이 이루어질 수 있다.
예를 들어, 본 개시내용은 인간 APLNR을 발현하는 세포에서 아펠린-매개 신호전달을 차단하거나 저해하는 이의 APLNR 길항제를, 세포-기초 차단 또는 저해 생물검정법에서, 예를 들어 WO2015/077491의 실시예 5, 8, 9 또는 11에서 정의된 바와 같은 검정법 포맷 또는 실질적으로 유사한 검정법을 사용하여 측정된 바와 같이 약 20 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 2 nM 미만, 약 1 nM 미만, 약 900 pM 미만, 약 800 pM 미만, 약 700 pM 미만, 약 600 pM 미만, 약 500 pM 미만, 약 400 pM 미만, 약 350 pM 미만, 약 300 pM 미만, 약 250 pM 미만, 약 200 pM 미만, 약 150 pM 미만, 약 100 pM 미만, 약 90 pM 미만, 약 80 pM 미만, 약 70 pM 미만, 약 60 pM 미만, 약 50 pM 미만, 약 40 pM 미만, 약 30 pM 미만, 약 20 pM 미만 또는 약 10 pM 미만의 IC50으로 포함한다.
본 개시내용은 아펠린의 존재 하에 pERK의 APLNR-매개 비(ratio)를 저해하는 APLNR 길항제를, APLNR-유도 pERK 검정법에서 측정된 바와 같이 약 50 nM 미만, 약 25 nM 미만, 약 20 nM 미만, 약 15 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 1 nM 미만, 약 900 pM 미만, 약 800 pM 미만, 약 700 pM 미만, 약 600 pM 미만, 약 500 pM 미만, 약 400 pM 미만 또는 약 300 pM 미만의 IC50으로 포함한다.
그러나 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 소정의 APLNR 길항제는 APLNR-매개 신호전달을 저해하거나 약화시키는 능력을 갖고 있음에도 불구하고, APLNR과 아펠린의 상호작용을 차단하지 않거나 부분적으로만 차단한다. 이러한 항체 및 이의 항원-결합 단편은 본원에서 "간접 차단제"로 지칭될 수 있다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 본 개시내용의 간접 차단제는, APLNR의 N-말단 리간드 결합 도메인과 중첩되지 않거나 부분적으로만 중첩되지만 그럼에도 불구하고 APLNR/아펠린 상호작용을 직접적으로 차단하지 않으면서 APLNR-매개 신호전달을 간섭하는 에피토프에서 APLNR에 결합함으로써 작용하는 것으로 여겨진다.
본 개시내용은 가용성 APLNR 분자에 높은 친화성 및/또는 특이성으로 결합하는 APLNR 길항제를 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용은 형광 활성화된 세포 소팅(FACS; fluorescent activated cell sorting) 검정법에 의해, 예를 들어 WO2015/077491의 실시예 4에 정의된 바와 같은 검정법 포맷을 사용하여 측정된 바와 같이 약 20 초과의 결합비로 APLNR에 결합하는 항체 및 항체의 항원-결합 단편을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 개시내용의 항체 또는 항원-결합 단편은 예를 들어 FACS 또는 실질적으로 유사한 검정법에 의해 측정된 바와 같이, 약 15 초과, 약 20 초과, 약 100 초과, 약 200 초과, 약 300 초과, 약 400 초과, 약 500 초과, 약 1000 초과, 약 1500 초과 또는 약 2000 초과의 결합비로 APLNR에 결합한다.
본 개시내용은 또한, 25℃ 또는 37℃에서 표면 플라즈몬 공명에 의해, 예를 들어 잘 공지된 BIAcore™ 검정법 포맷 또는 실질적으로 유사한 검정법을 사용하여 측정된 바와 같이 약 10분 초과의 해리 반감기(dissociative half-life)(t½)로 APLNR에 특이적으로 결합하는 항-APLNR 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
본 개시내용의 항체는 상기 언급된 생물학적 특징 중 하나 이상 또는 이들의 임의의 조합을 소유할 수 있다. 본 개시내용의 항체의 다른 생물학적 특징은 본원의 작업예를 포함하는 본 개시내용의 검토로부터 당업자에게 명백해질 것이다.
항-APLNR 항체는, 상기 항체가 유래된 상응하는 생식계열 서열과 비교하여, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 프레임워크 및/또는 CDR 영역에 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 이러한 돌연변이는, 예를 들어, 본원에 개시된 아미노산 서열을 공개적인 항체 서열 데이터베이스로부터 입수 가능한 생식계열 서열과 비교함으로써 쉽게 확인될 수 있다. 본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 아미노산 서열로부터 유래된 항체 및 이의 항원-결합 단편을 포함하며, 여기서, 하나 이상의 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산은, 항체가 유래된 생식계열 서열의 상응하는 잔기(들)로, 또 다른 인간 생식계열 서열의 상응하는 잔기(들)로, 또는 상응하는 생식계열 잔기(들)의 보존적 아미노산 치환으로 돌연변이화된다(이러한 서열 변화는 본원에서 종합적으로 "생식계열 돌연변이"로 지칭됨). 당업자는 본원에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열로 출발하여, 하나 이상의 개별적인 생식계열 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함하는 수많은 항체 및 항원-결합 단편을 쉽게 생성할 수 있다. 소정의 실시형태에서, VH 및/또는 VL 도메인 내의 모든 프레임워크 및/또는 CDR 잔기는, 항체가 유래된 원래의 생식계열 서열에서 확인되는 잔기로 역돌연변이화된다. 다른 실시형태에서, 단지 소정의 잔기만, 예를 들어 FR1의 처음 8개 아미노산 내에서 또는 FR4의 마지막 8개 아미노산 내에서 확인된 돌연변이화된 잔기, 또는 CDR1, CDR2 또는 CDR3 내에서 확인된 돌연변이화된 잔기만 원래의 생식계열 서열로 역돌연변이화된다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 프레임워크 및/또는 CDR 잔기(들)는 상이한 생식계열 서열(즉, 항체가 원래 유래된 생식계열 서열과 상이한 생식계열 서열)의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이화된다. 더욱이, 본 개시내용의 항체는 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내에 2개 이상의 생식계열 돌연변이의 임의의 조합을 포함할 수 있으며, 예를 들어 여기서, 소정의 개별적인 잔기는 특정 생식계열 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이화되는 한편, 원래의 생식계열 서열과 상이한 소정의 다른 잔기는 유지되거나, 상이한 생식계열 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이화된다. 하나 이상의 생식계열 돌연변이를 함유하는 항체 및 항원-결합 단편이 일단 수득되면, 이들은 향상된 결합 특이성, 증가된 결합 친화성, 향상되거나 증강된 길항적 또는 효능적 생물학적 특성(경우에 따라), 감소된 면역원성 등과 같은 하나 이상의 요망되는 특성에 대해 쉽게 시험될 수 있다. 이러한 일반적인 방식으로 수득된 항체 및 항원-결합 단편은 본 개시내용 내에 포괄된다.
본 개시내용은 또한, 하나 이상의 보존적 치환을 갖는 본원에 개시된 임의의 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열의 변이체를 포함하는 항-APLNR 항체를 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열에 비해 예를 들어 10개 이하, 8개 이하, 6개 이하 또는 4개 이하 등의 보존적 아미노산 치환을 갖는 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열을 갖는 항-APLNR 항체를 포함한다.
용어 "에피토프"는, 파라토프(paratope)로도 공지된 항체 분자의 가변 영역 내의 특이적인 항원-결합 부위와 상호작용하는 항원 결정기를 지칭한다. 단일 항원은 1개 초과의 에피토프를 가질 수 있다. 따라서, 상이한 항체는 하나의 항원 상의 상이한 영역에 결합할 수 있고, 상이한 생물학적 효과를 가질 수 있다. 에피토프는 구조적(conformational) 또는 선형일 수 있다. 구조적 에피토프는 선형 폴리펩타이드 사슬의 상이한 분절(segment)로부터 공간적으로 병치된 아미노산에 의해 생성된다. 선형 에피토프는 폴리펩타이드 사슬에서 인접한 아미노산 잔기에 의해 생성된 에피토프이다. 소정의 환경에서, 에피토프는 항원 상에 당류, 포스포릴기 또는 설포닐기의 모이어티를 포함할 수 있다.
핵산 또는 이의 단편을 지칭할 때 용어 "실질적인 동일성" 또는 "실질적으로 동일한"은, 적절한 뉴클레오타이드 삽입 또는 결실을 동반하여 또 다른 핵산(또는 이의 상보적 가닥)과 최적으로 정렬될 때, 하기에 고찰된 바와 같이 FASTA, BLAST 또는 Gap과 같은 임의의 잘 공지된 서열 동일성 알고리즘에 의해 측정된 바와 같이, 뉴클레오타이드 염기의 적어도 약 95%, 보다 바람직하게 적어도 약 96%, 97%, 98% 또는 99%에서 뉴클레오타이드 서열 동일성이 존재함을 가리킨다. 기준 핵산 분자와 실질적인 동일성을 갖는 핵산 분자는 소정의 경우에, 기준 핵산 분자에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드와 동일하거나 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다.
폴리펩타이드에 적용된 바와 같이, 용어 "실질적인 유사성" 또는 "실질적으로 유사한"은, 2개의 펩타이드 서열이, 예컨대 디폴트 갭 중량을 사용하여 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬될 때, 적어도 95%의 서열 동일성, 보다 더 바람직하게 적어도 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 달라진다. "보존적 아미노산 치환"은, 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄(R기)를 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 특성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 달라지는 경우, 서열 동일성의 백분율 또는 유사성의 정도는 치환의 보존적 성질을 보정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 이러한 조정을 수행하기 위한 수단은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에 참조로서 포함된 문헌[Pearson, 1994, Methods Mol. Biol. 24: 307-331]을 참조한다. 유사한 화학적 특성을 갖는 측쇄를 가진 아미노산 그룹의 예는, (1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; (2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; (3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; (4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; (5) 염기성 측쇄: 라이신, 아르기닌 및 히스티딘; (6) 산성 측쇄: 아스파테이트 및 글루타메이트, 및 (7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌을 포함한다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 그룹은: 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 라이신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파테이트 및 아스파라긴-글루타민이다. 대안적으로, 보존적 대체는 본원에 참조로서 포함된 문헌[Gonnet et al., 1992, Science 256: 1443-1445]에 개시된 PAM250 로그-유사 행렬에서 양성 값을 갖는 임의의 변화이다. "적당한 보존적" 대체는 PAM250 로그-유사 행렬에서 비음성 값을 갖는 임의의 변화이다.
서열 동일성으로도 지칭되는 폴리펩타이드에 대한 서열 유사성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정된다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존적 아미노산 치환을 포함한 다양한 치환, 결실 및 다른 변형에 할당된 유사성 측정값을 사용하여 유사한 서열을 매칭시킨다. 예를 들어, GCG 소프트웨어는 상이한 유기체 종으로부터의 상동성 폴리펩타이드와 같은 밀접하게 관련된 폴리펩타이드 사이의, 또는 야생형 단백질과 이의 뮤테인(mutein) 사이의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 결정하기 위해 디폴트 매개변수와 함께 사용될 수 있는 Gap 및 Bestfit과 같은 프로그램을 포함한다. 예를 들어, GCG 버전 6.1을 참조한다. 폴리펩타이드 서열은 또한, 디폴트 또는 권장된 매개변수를 사용하는, GCG 버전 6.1의 프로그램인 FASTA를 사용하여 비교될 수 있다. FASTA(예를 들어, FASTA2 및 FASTA3)는 쿼리 및 서치 서열(상기 Pearson, 1994) 사이의 최적의 중첩 영역의 정렬 및 서열 동일성 백분율을 제공한다. 본 개시내용의 서열을 상이한 유기체로부터의 다수의 서열을 포함하는 데이터베이스와 비교할 때 또 다른 바람직한 알고리즘은 디폴트 매개변수를 사용하는 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 BLASTP 또는 TBLASTN이다. 예를 들어, 각각 원용에 의해 본 명세서에 포함된 문헌[Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410 및 Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-402]을 참조한다.
나아가, 본 개시내용은 본원에 기재된 임의의 특이적인 예시적 항체(예를 들어, H1M9207N, H2aM9232N 및 H4H9232N)와 동일한 에피토프에 결합하는 항-APLNR 항체를 포함한다. 마찬가지로, 본 개시내용은 또한, 본원에 기재된 임의의 특이적인 예시적 항체(예를 들어, H1M9207N, H2aM9232N 및 H4H9232N)와 APLNR에의 결합에 대해 경쟁하는 항-APLNR 항체를 포함한다.
당업자는, 항체가 기준 항-APLNR 항체와 동일한 에피토프에 결합하거나 상기 기준 항체와 결합에 대해 경쟁하는지의 여부를, 당업계에 공지되고 본원에 예시된 일상적인 방법을 사용하여 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들어, 시험 항체가 본 개시내용의 기준 항-APLNR 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 결정하기 위해, 기준 항체는 APLNR 단백질에 결합하도록 허용된다. 다음, APLNR 분자에 결합하는 시험 항체의 능력이 평가된다. 시험 항체가 기준 항-APLNR 항체와의 포화 결합 이후에 APLNR에 결합할 수 있다면, 시험 항체는 기준 항-APLNR 항체와 상이한 에피토프에 결합하는 것으로 결론내릴 수 있다. 한편, 시험 항체가 기준 항-APLNR 항체와의 포화 결합 이후에 APLNR 분자에 결합할 수 없다면, 시험 항체는 본 개시내용의 기준 항-APLNR에 의해 결합된 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 그 후에, 추가의 일상적인 실험(예를 들어, 펩타이드 돌연변이 및 결합 분석)이 수행되어, 시험 항체의 관찰된 결합 결여가 사실상 기준 항체와 동일한 에피토프에의 결합 때문인지의 여부 또는 입체적 차단(또는 또 다른 현상)이 관찰된 결합 결여에 책임이 있는지의 여부를 검증할 수 있다. 이러한 부류의 실험은 ELISA, RIA, BIAcore™, 유세포분석 또는 당업계에서 이용 가능한 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체-결합 분석을 이용하여 수행될 수 있다. 본 개시내용의 소정의 실시형태에 따르면, 2개의 항체는, 예를 들어 1-배, 5-배, 10-배, 20-배 또는 100-배 과량의 하나의 항체가 경쟁 결합 검정법에서 측정된 바와 같이 다른 항체의 결합을 적어도 50%만큼, 그러나 바람직하게는 75%, 90% 또는 심지어 99%만큼 저해한다면, 동일한(또는 중첩되는) 에피토프에 결합한다(예를 들어 문헌[Junghans et al., 1990, Cancer Res. 50:1495-1502] 참조). 대안적으로, 2개의 항체는, 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 없애는 항원 내의 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합을 감소시키거나 없앤다면, 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 여겨진다. 2개의 항체는, 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 없애는 아미노산 돌연변이의 부분집합만이 다른 항체의 결합을 감소시키거나 없앤다면, "중첩되는 에피토프"를 갖는 것으로 여겨진다.
항체가 기준 항-APLNR 항체와 결합에 대해 경쟁하는지(또는 결합에 대해 교차-경쟁하는지) 결정하기 위해, 상기 기재된 결합 방법이 2개 배향에서 수행된다: 제1 배향에서, 기준 항체가 포화 조건 하에 APLNR 단백질에 결합하도록 허용한 다음, APLNR 분자에의 시험 항체의 결합을 평가한다. 제2 배향에서, 시험 항체가 포화 조건 하에 APLNR 분자에 결합하도록 허용한 다음, APLNR 분자에의 기준 항체의 결합을 평가한다. 두 배향 모두에서, 단지 제1(포화) 항체만 APLNR 분자에 결합할 수 있다면, 시험 항체 및 기준 항체는 APLNR에의 결합에 대해 경쟁하는 것으로 결론내려진다. 당업자가 이해할 바와 같이, 결합에 대해 기준 항체와 경쟁하는 항체는 기준 항체와 동일한 에피토프에 필수적으로 결합하는 것은 아닐 수 있지만, 중첩하거나 인접한 에피토프에 결합함으로써 기준 항체의 결합을 입체적으로 차단할 수 있다.
본 개시내용의 소정의 실시형태에서, 본 개시내용의 항-APLNR 항체는 인간 항체이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하고자 한다. 본 개시내용의 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이생성 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 예를 들어 CDR, 특히 CDR3에 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유류 종, 예컨대 마우스의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 이식되어 있는 항체는 포함하지 않고자 한다. 다양한 실시형태에서, 본원에서 고찰된 항체는 IgG 중쇄 불변 영역을 갖는 인간 항체이다. 일부 경우, 항체는 인간 IgG1 또는 IgG4 이소타입의 중쇄 불변 영역을 가진다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 항체는 재조합 인간 항체일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 인간 항체"는, 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체(하기에 추가로 기재됨), 재조합, 조합적 항체 라이브러리로부터 단리된 항체(하기에 추가로 기재됨), 인간 면역글로불린 유전자에 대해 형질전환(transgenic)인 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체(예를 들어, 문헌[Taylor et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20:6287-6295] 참조) 또는 다른 DNA 서열로의 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체와 같이, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 이의 모든 인간 항체를 포함하고자 한다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나 소정의 실시형태에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이생성(또는 인간 IG 서열에 대한 형질전환 동물이 사용되는 경우, 생체내 체세포 돌연변이생성)을 받고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련이 있는 한편 생체내에서 인간 항체 생식계열 레파토리 내에서 천연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
인간 항체는 힌지 이종성(heterogeneity)과 연관된 2가지 형태로 존재할 수 있다. 제1 형태에서, 면역글로불린 분자는 약 150 내지 160 kDa의 안정한 4개 사슬 구축물을 포함하며, 이러한 구축물 내에서 이량체는 사슬간 중쇄 이황화 결합에 의해 함께 고정된다. 제2 형태에서, 이량체는 사슬간 이황화 결합을 통해 연결되지 않고, 공유 결합된 경쇄 및 중쇄로 이루어진 약 75 내지 80 kDa의 분자(반(half)-항체)가 형성된다. 이들 형태는 친화성 정제 후에도 분리하기가 극히 어려웠다.
다양한 온전한 IgG 이소타입에서 제2 형태의 출현 빈도는 항체의 힌지 영역 이소타입과 연관된 구조적 차이로 인한 것이지만 이로 한정되는 것은 아니다. 인간 IgG4 힌지의 힌지 영역에서의 단일 아미노산 치환은 제2 형태(문헌[Angal et al., 1993, Molecular Immunology 30:105])의 출현을, 인간 IgG1 힌지를 사용하여 전형적으로 관찰되는 수준까지 유의하게 감소시킬 수 있다. 본 개시내용은 요망되는 항체 형태의 수율을 향상시키기 위해 예를 들어 생성 시에 바람직할 수 있는 하나 이상의 돌연변이를 힌지, CH2 또는 CH3 영역에 갖는 항체를 포괄한다.
본 개시내용의 항체는 단리된 항체일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "단리된 항체"는 이의 천연 환경의 적어도 하나의 구성성분으로부터 식별되고 분리 및/또는 회수된 항체를 의미한다. 예를 들어, 유기체의 적어도 하나의 구성성분으로부터, 또는 항체가 천연적으로 존재하거나 천연적으로 생성되는 조직 또는 세포로부터 분리되거나 제거된 항체는 본 개시내용의 목적을 위한 "단리된 항체"이다. 단리된 항체는 또한, 재조합 세포 내에서 인시츄(in situ) 항체를 포함한다. 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 또는 단리 단계를 받은 항체이다. 소정의 실시형태에 따르면, 단리된 항체에는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
본 개시내용은 중화형 및/또는 차단형 항-APLNR 항체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "중화형" 또는 "차단형" 항체는, APLNR에의 결합이: (i) APLNR 또는 APLNR 단편과 APLNR 수용체 구성성분(예를 들어, 아펠린 펩타이드 등) 사이의 상호작용을 간섭하며; 및/또는 (ii) APLNR의 적어도 하나의 생물학적 기능의 저해를 초래하는 항체를 지칭하고자 한다. APLNR 중화형 또는 차단형 항체에 의해 유발되는 저해는, 이러한 저해가 적절한 검정법을 사용하여 검출 가능한 한, 완전할 필요는 없다.
VEGF 길항제
본원에 사용된 바와 같이, "VEGF 길항제"는 VEGF에 결합하거나 이와 상호작용하며, VEGF와 이의 수용체(VEGFR1 및 VEGFR2)의 결합을 저해하며, 및/또는 VEGF의 생물학적 신호전달 및 활성을 저해하는 임의의 작용제이다. VEGF 길항제는, VEGF와 천연 VEGF 수용체 사이의 상호작용을 간섭하는 분자, 예를 들어 VEGF 또는 VEGF 수용체에 결합하고 VEGF와 VEGF 수용체 사이의 상호작용을 방지하거나 그렇지 않다면 방해하는 분자를 포함한다. 구체적인 예시적 VEGF 길항제는 항-VEGF 항체(예를 들어, 라니비주맙 [LUCENTIS®]), 항-VEGF 수용체 항체(예를 들어, 항-VEGFR1 항체, 항-VEGFR2 항체 등), VEGF의 저분자 저해제(예를 들어, 수니티닙(sunitinib)), 및 VEGF 수용체-기반 키메라 분자 또는 VEGF-저해 융합 단백질(본원에서 "VEGF-트랩"으로도 지칭됨), 예컨대 애플리버셉트 및 ziv-애플리버셉트를 포함한다. VEGF-트랩의 다른 예는 ALT-L9, M710, FYB203 및 CHS-2020이다. VEGF-트랩의 추가의 예는 미국 특허 7,070,959, 7,306,799, 7,374,757, 7,374,758, 7,531,173, 7,608,261, 5,952,199, 6,100,071, 6,383,486, 6,897,294 및 7,771,721에서 확인될 수 있으며, 이들은 원용에 의해 본 명세서에 구체적으로 포함된다. 추가의 VEGF 저해제 및/또는 길항제는 저분자 저해제: 파조파닙(pazopanib), 소라페닙(sorafenib), 악시티닙(axitinib), 포나티닙(ponatinib), 레고라페닙(regorafenib), 카보잔티닙(cabozantinib), 반데타닙(vandetanib), 카보잔티닙 및 렌바티닙(lenvatinib); 및 VEGF 저해 항체: 베바시주맙(bevacizumab) 및 라무시루맙(ramucirumab), 또는 이들의 생물유사 분자를 포함한다.
VEGF 수용체-기반 키메라 분자는 VEGF 수용체, 예컨대 VEGFR1(Flt1로도 지칭됨) 및/또는 VEGFR2(Flk1 또는 KDR로도 지칭됨)의 2개 이상의 면역글로불린(Ig)-유사 도메인을 포함하고 다량체화 도메인(예를 들어, 2개 이상의 키메라 폴리펩타이드의 다량체화[예를 들어 이량체화]를 용이하게 하는 Fc 도메인)을 함유할 수 있는 키메라 폴리펩타이드를 포함한다. 예시적인 VEGF 수용체-기반 키메라 분자는 VEGFR1R2-FcC1(a)(애플리버셉트로도 공지됨; 제품명 EYLEA® 하에 판매됨)로 지칭되는 분자이다. 소정의 실시형태에서, 애플리버셉트는 MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호:23)로서 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 약제학적 제제 내에 함유된 VEGF 길항제의 양은 제제의 요망되는 특이적인 특성, 뿐만 아니라 제제가 사용되고자 하는 특정 상황 및 목적에 따라 달라질 수 있다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 제제는 5±0.75 mg/mL 내지 150±22.5 mg/mL의 VEGF 길항제; 10±1.5 mg/mL 내지 100±15.0 mg/mL의 VEGF 길항제; 20±3 mg/mL 내지 80±12 mg/mL의 VEGF 길항제; 30±4.5 mg/mL 내지 70±10.5 mg/mL의 VEGF 길항제 또는 40±6.0 mg/mL의 VEGF 길항제를 함유할 수 있는 액체 제제이다. 예를 들어, 본 개시내용의 제제는 약 20 mg/mL; 약 30 mg/mL; 약 40 mg/mL; 약 50 mg/mL; 또는 약 60 mg/mL의 VEGF 길항제를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 방법은 VEGF 길항제를 포함하는 치료 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
치료 제제 및 투여
본 개시내용은 적어도 하나의 APLNR 길항제, 예컨대 인간 APLMR에 특이적으로 결합하는 항-APLNR 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약제학적 제제를 제공한다. 소정의 다른 실시형태에 따르면, 본 개시내용은 추가의 치료제를 포함하는 약제학적 제제를 제공한다. 나아가, 본 개시내용은 예를 들어, 적어도 하나의 APLNR 길항제를 포함하는 약제학적 제조와 함께 사용하기 위한 적어도 하나의 VEGF 길항제를 포함하는 약제학적 제제를 제공한다.
본 개시내용의 약제학적 조성물은 향상된 이전(transfer), 전달, 관용성 등을 제공하는 적합한 담체, 부형제 및 다른 작용제와 함께 제제화된다. 다수의 적절한 제제는 모든 제약 화학자에게 공지된 처방집인 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA]에서 확인할 수 있다. 이들 제제는 예를 들어, 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 소포를 함유한 지질(양이온성 또는 음이온성)(예를 들어, LIPOFECTIN™, Life Technologies, 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재), DNA 공액체, 무수 흡수성 페이스트, 수-중-유 및 우-중-수 에멀젼, 에멀젼 카보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반-고체 겔, 및 카보왁스를 함유한 반-고체 혼합물을 포함한다. 또한, 문헌[Powell et al. "Compendium of expicients for parenteral formulations" PDA, 1998, J Pharm Sci Technol 52:238-311]을 참조한다.
대상체에게 투여되는 APLNR 길항제, 예컨대 인간 APLNR에 특이적으로 결합하는 항-APLNR 항체, 또는 이의 항원-결합 단편의 용량은 대상체의 연령 및 체격, 표적 질환, 병태, 투여 경로 등에 따라 달라질 수 있다. 바람직한 용량은 전형적으로 체중 또는 체표면적에 따라 계산된다. APLNR 길항제가 병태 또는 질환을 치료하는 데 사용되는 경우, 본 개시내용의 항체를 통상 약 0.01 내지 약 50 mg/kg 체중의 단일 용량으로 정맥내 투여하는 것이 유리할 수 있다. 다른 경우, APLNR 길항제를 예를 들어 약 0.01 내지 약 50 mg/kg 체중의 농도로 유리체내 투여하는 것이 유리할 수 있다. 병태의 중증도에 따라, 치료의 빈도 및 기간이 조정될 수 있다. APLNR 길항제, 예컨대 항-APLNR 항체를 투여하는 데 효과적인 투약량 및 스케쥴은 경험적으로 결정될 수 있으며; 예를 들어, 대상체의 진행이 주기적인 평가에 의해 모니터링될 수 있고, 이에 따라 용량이 조정될 수 있다. 더욱이, 당업계에 잘 공지된 방법(예를 들어, 문헌[Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351])을 사용하여 투약량의 종간(interspecies) 스케일링을 수행할 수 있다.
VEGF 길항제의 용량은 대상체의 연령 및 체격, 표적 질환, 병태, 투여 경로 등에 따라 달라질 수 있다. 바람직한 용량은 전형적으로 체중 또는 체표면적에 따라 계산된다. VEGF 길항제가 병태 또는 질환을 치료하는 데 사용되는 경우, 본 개시내용의 항체를 통상 약 0.01 내지 약 50 mg/kg 체중의 단일 용량으로 정맥내 투여하는 것이 유리할 수 있다. 다른 경우, VEGF 길항제를 예를 들어 약 0.01 내지 약 50 mg/kg 체중의 농도로 유리체내 투여하는 것이 유리할 수 있다. 병태의 중증도에 따라, 치료의 빈도 및 기간이 조정될 수 있다. VEGF 길항제를 투여하는 데 효과적인 투약량 및 스케쥴은 경험적으로 결정될 수 있으며; 예를 들어, 대상체의 진행이 주기적인 평가에 의해 모니터링될 수 있고, 이에 따라 용량이 조정될 수 있다. 다양한 전달 시스템, 예를 들어 리포좀, 미세입자, 미세캡슐 내에서의 캡슐화, 돌연변이체 바이러스를 발현시킬 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개 엔도사이토시스가 공지되어 있고, 본 개시내용의 약제학적 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Wu et al. 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432] 참조). 도입 방법은 피내(intradermal), 근육내, 복강내, 정맥내, 유리체내, 피하, 비내, 경막외 및 경구 경로를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 상기 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어, 주입 또는 볼루스(bolus) 주사에 의해, 상피 또는 점막 피부층(예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성 작용제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신적 또는 국소적일 수 있다.
본 개시내용은 APLNR 길항제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함하고, 여기서, APLNR 길항제는 약제학적 조성물 내에 함유된다. 소정의 실시형태에서, 상기 약제학적 조성물은 VEGF 길항제를 추가로 포함한다. 대안적인 실시형태에서, APLNR 길항제 및 VEGF 길항제는 각각 그 자체의 개별적인 약제학적 투약 제제에 존재할 수 있다. 본 개시내용의 약제학적 조성물은 적합한 이전, 전달, 관용성 등을 제공하는 적합한 담체, 부형제 및 다른 작용제와 함께 제제화될 수 있다. 다수의 적절한 제제는 모든 제약 화학자에게 공지된 처방집인 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa]에서 확인할 수 있다. 이들 제제는 예를 들어 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 소포(LIPOFECTIN™과 같음)를 포함한 지질(양이온성 또는 음이온성), DNA 공액체, 무수 흡수성 페이스트, 수-중-유 및 유-중-수 에멀전, 에멀전 카보왁스(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반-고체 겔, 및 카보왁스를 함유한 반-고체 혼합물을 포함한다. 또한, 문헌[Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA(1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311]을 참조한다.
본원에 사용된 바와 같이, 표현 "약제학적 제제"는, 활성 성분 또는 하나 이상의 추가의 비활성 성분과 조합된 경우 인간 또는 비-인간 동물에게 치료적 투여하기에 적합한, 적어도 하나의 활성 성분(예를 들어, 인간 또는 비-인간 동물에서 생물학적 효과를 발휘할 수 있는 저분자, 거대분자, 화합물 등)과 적어도 하나의 비활성 성분의 조합을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "제제"는 구체적으로 다르게 지시되지 않는 한, "약제학적 제제"를 의미한다.
본 개시내용의 약제학적 제제 내에 함유된 APLNR 길항제, 예컨대 항-APLNR 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 양은 제제의 요망되는 특이적인 특성, 뿐만 아니라 제제가 사용되고자 하는 특정 상황 및 목적에 따라 다를 수 있다. 소정의 실시형태에서, 약제학적 제제는 5±0.75 mg/mL 내지 150±22.5 mg/mL의 항체; 7.5±1.125 mg/mL 내지 140±21 mg/mL의 항체; 10±1.5 mg/mL 내지 130±19.5 mg/mL의 항체; 10±1.5 mg/mL의 항체; 20±3 mg/mL의 항체; 60±9 mg/mL의 항체; 또는 120±18 mg/mL의 항체를 함유할 수 있는 액체 제제이다. 예를 들어, 본 개시내용의 제제는 약 10 mg/mL; 약 20 mg/mL; 약 40 mg/mL; 약 60 mg/mL; 약 80 mg/mL; 약 100 mg/mL; 약 120 mg/mL; 또는 약 140 mg/mL의, 인간 APLNR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 약제학적 제제는 5±0.75 mg/mL 내지 100±15 mg/mL의 VEGF 길항제를 함유할 수 있는 액체 제제이다. 예를 들어, 본 개시내용의 제제는 약 5 mg/mL; 약 10 mg/mL; 약 15 mg/mL; 약 20 mg/mL; 약 25 mg/mL; 약 30 mg/mL; 약 35 mg/mL; 약 40 mg/mL; 약 50 mg/mL; 약 60 mg/mL; 약 70 mg/mL; 약 80 mg/mL; 약 90 mg/mL; 또는 약 100 mg/mL의 VEGF 길항제, 예컨대 애플리버셉트를 포함할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 약제학적 제제는 약 5 mg/mL 내지 약 150 mg/mL의 APLNR 길항제 및 약 5 mg/mL 내지 100 mg/mL의 VEGF 길항제를 포함하는 안정한 액체 공동-제제이다.
본 개시내용의 약제학적 제제는 하나 이상의 부형제를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "부형제"는 요망되는 콘시스턴시(consistency), 점도 또는 안정화 효과를 제공하기 위해 제제에 첨가되는 임의의 비-치료제를 의미한다.
본 개시내용의 맥락에서 사용될 수 있는 VEGF 길항제를 포함하는 예시적인 제제는 예를 들어 미국 특허 7,531,173 및 7,608,261에 개시되어 있다. 본 개시내용의 맥락에서 사용될 수 있는 APLNR 길항제를 포함하는 예시적인 약제학적 조성물은 예를 들어 미국 특허 출원 공개 20130186797에 개시되어 있다. 본 개시내용의 맥락에서 사용될 수 있는 APLNR 길항제를 포함하는 예시적인 약제학적 조성물은 예를 들어 국제 특허 공개 WO2016085750 및 미국 특허 출원 공개 US20110027286에 개시되어 있다.
병용 치료법
소정의 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 방법은 VEGF 길항제와 조합하여, APLNR 길항제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 표현 "~와 조합하여"는, VEGF 길항제가 APLNR 길항제를 포함하는 약제학적 조성물 전에, 후에 또는 동시에 투여되는 것을 의미한다. 용어 "~와 조합하여"는 또한, APLNR 길항제 및 VEGF 길항제의 순차적인 또는 동시적인 투여를 포함한다. 예를 들어, "~ 전에" 투여되는 경우, APLNR 길항제를 포함하는 약제학적 조성물은 VEGF 길항제를 포함하는 약제학적 조성물의 투여 전, 72시간 초과, 약 72시간, 약 60시간, 약 48시간, 약 36시간, 약 24시간, 약 12시간, 약 10시간, 약 8시간, 약 6시간, 약 4시간, 약 2시간, 약 1시간, 약 30분, 약 15분 또는 약 10분째에 투여될 수 있다. "~ 후에" 투여되는 경우, APLNR 길항제를 포함하는 약제학적 조성물은 VEGF 길항제를 포함하는 약제학적 조성물의 투여 후, 약 10분, 약 15분, 약 30분, 약 1시간, 약 2시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 8시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 24시간, 약 36시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 72시간, 또는 72시간 초과째에 투여될 수 있다. APLNR 길항제를 포함하는 약제학적 조성물과 "동시에" 투여는, VEGF 길항제가 APLNR 길항제를 포함하는 약제학적 조성물의 투여의 5분 미만 이내에(투여 전, 후, 또는 동일한 시점에) 개별적인 투약 형태로 대상체에게 투여되거나, APLNR 길항제와 VEGF 길항제를 포함하는 단일의 조합된 투약 제제로서 대상체에게 투여되는 것을 의미한다.
병용 치료법은 APLNR 길항제 및 VEGF 길항제(예를 들어, 애플리버셉트, VEGF-트랩, 예를 들어 미국 특허 7,087,411 참조(본원에서 "VEGF-저해 융합 단백질"로도 지칭됨), 항-VEGF 항체(예를 들어, 라니비주맙 등), VEGF 수용체의 저분자 키나제 저해제(예를 들어, 수니티닙, 소라페닙 또는 파조파닙) 등을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 방법은 당뇨병성 망막병증(증식성 당뇨병성 망막병증 포함), 당뇨 황반 부종, 나이-관련 황반 변성, 망막 신혈관 형성, 중심 망막 정맥 폐색, 분지 망막 정맥 폐색, 결절 맥락막 혈관병증, 맥락막 신혈관 형성(CNV), 퇴행성 근시(근시성 CNV), 신혈관 녹내장, 및 미숙아 망막병증으로 구성된 군으로부터 선택되는 안 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상 또는 적응증을 치료하거나 개선하기 위한 첨가적 또는 상승적 활성을 위해 VEGF 길항제와 조합하여, APLNR 길항제를 투여하는 단계를 포함한다.
투여 용기 및 방법
다양한 전달 시스템, 예를 들어 리포좀, 미세입자, 미세캡슐 내에서의 캡슐화, 돌연변이체 바이러스를 발현시킬 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개 엔도사이토시스가 공지되어 있고, 본 개시내용의 약제학적 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Wu et al. 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432] 참조). 투여 방법은 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 유리체내, 피하, 비내, 경막외 및 경구 경로를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 상기 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어, 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막 피부층(예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성 작용제와 함께 투여될 수 있다.
안 장애의 치료를 위해, 본 개시내용의 약제학적 제제는 예를 들어, 점안액, 결막하(subconjunctival) 주사, 결막하 이식, 유리체내 주사, 유리체내 이식, 서브-테논(sub-Tenon) 주사 또는 서브-테논 이식에 의해 투여될 수 있다.
본 개시내용의 약제학적 조성물은 표준 바늘 및 주사기를 이용하여 피하로 또는 정맥내로 전달될 수 있다. 또한, 피하 전달과 관련하여, 펜 전달 장치는 본 개시내용의 약제학적 조성물을 전달하는 데 바로 적용된다. 이러한 펜 전달 장치는 재사용 가능하거나 일회용일 수 있다. 재사용 가능한 펜 전달 장치는 일반적으로, 약제학적 조성물을 함유하는 교체 가능한 카트리지를 이용한다. 일단 카트리지 내의 모든 약제학적 조성물이 투여되고 카트리지가 비워지면, 빈 카트리지는 바로 폐기되고, 약제학적 조성물을 함유하는 새로운 카트리지로 대체될 수 있다. 그 후에, 펜 전달 장치는 재사용될 수 있다. 일회용 펜 전달 장치에는 교체 가능한 카트리지가 없다. 그보다는, 일회용 펜 전달 장치는 장치 내의 저장조에 보유된 약제학적 조성물로 사전충전된다. 일단 저장조가 약제학적 조성물을 비우면, 전체 장치는 폐기된다.
소정의 상황에서, 약제약적 조성물은 조절 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 일 실시형태에서, 펌프가 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 중합체 물질이 사용될 수 있으며; 문헌[Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Fla]를 참조한다. 더 다른 실시형태에서, 조절 방출 시스템은 조성물의 표적 근처에 배치될 수 있으며, 따라서 전신 용량의 일부만을 필요로 한다(예를 들어, 문헌[Goodson, 1984, Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138] 참조). 다른 조절 방출 시스템은 문헌[Langer, 1990, Science 249:1527-1533]에 의한 검토에서 고찰된다.
주사 가능한 조제물은 정맥내, 피하, 피부내 및 근육내 주사, 드립 주입 등을 위한 투약 형태를 포함할 수 있다. 이들 주사 가능한 조제물은 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사 가능한 조제물은 예를 들어 상기 기재된 항체 또는 이의 염을 통상적으로 주사에 사용되는 멸균 수용성 매질 또는 유성 매질에 용해하거나, 현탁하거나, 에멀전화함으로써 제조될 수 있다. 주사용 수성 매질로는 예를 들어, 생리식염수, 포도당 및 다른 보조제를 함유하는 등장액 등이 있으며, 이는 알코올(예를 들어, 에탄올), 폴리알코올(예를 들어, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온성 계면활성제[예를 들어, 폴리소르베이트 80, HCO-50(수소화된 피마자유의 폴리옥시에틸렌(50 몰) 부가물)] 등과 같은 적절한 가용화제와 조합되어 사용될 수 있다. 유성 매질로는, 예를 들어 참기름, 대두유 등이 이용되고, 이러한 유성 매질은 벤질 벤조에이트, 벤질 알코올 등과 같은 가용화제와 조합되어 사용될 수 있다. 이렇게 해서 제조된 주사제는 바람직하게는 적절한 앰플에 충전된다.
유리하게는, 상기 기재된 경구 또는 비경구 용도를 위한 약제학적 조성물은 활성 성분의 용량에 맞춰진 단위 용량 투약 형태 내에 제조된다. 이러한 단위 용량 투약 형태는 예를 들어, 정제, 환제, 캡슐제, 주사제(앰플), 좌제 등을 포함한다.
본 개시내용의 약제학적 제제는 의약 및 다른 치료 조성물의 저장 또는 투여에 적합한 임의의 용기 내에 함유될 수 있다. 예를 들어, 약제학적 제제는 정의된 부피를 갖는 밀봉되고 멸균된 플라스틱 또는 유리 용기, 예컨대 바이얼, 앰플, 주사기, 카트리지, 병 또는 IV 백 내에 함유될 수 있다. 예를 들어 투명한 및 불투명한(예를 들어, 호박색) 유리 또는 플라스틱 바이얼을 포함하여 상이한 유형의 바이얼이 본 개시내용의 제제를 함유하는 데 사용될 수 있다. 마찬가지로, 임의의 유형의 주사기가 본 개시내용의 약제학적 제제를 함유하거나 투여하는 데 사용될 수 있다.
본 개시내용의 약제학적 제제는 "정상 텅스텐" 주사기 또는 "저(low) 텅스텐" 주사기 내에 함유될 수 있다. 당업자가 이해하게 될 바와 같이, 유리 주사기를 제조하는 과정은 일반적으로, 유리를 관통시켜 구멍을 만드는 작용을 하는 고온 텅스텐 막대의 사용을 수반하고, 상기 구멍으로부터 액체가 주사기로부터 인출 및 배출될 수 있다. 이러한 과정은 주사기의 내부 표면 상에서 미량의 텅스텐의 침착을 초래한다. 후속적인 세척 및 다른 가공 단계가 사용되어, 주사기 내의 텅스텐의 양을 감소시킬 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "정상 텅스텐"은, 주사기가 500 십억분율(ppb; parts per billion) 이상의 텅스텐을 함유함을 의미한다. 용어 "저 텅스텐"은 주사기가 500 ppb 미만의 텅스텐을 함유함을 의미한다. 예를 들어, 본 개시내용에 따른 저 텅스텐 주사기는 약 490, 480, 470, 460, 450, 440, 430, 420, 410, 390, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 ppb 미만 또는 그보다 적은 양의 텅스텐을 함유할 수 있다.
주사기에 사용되는 고무 플런저, 및 바이얼의 개구부(opening)를 닫는 데 사용되는 고무 마개는 상기 주사기 또는 바이얼의 의학적 내용물의 오염을 예방하거나 이들 내용물의 안정성을 보존하기 위해 코팅될 수 있다. 따라서, 소정의 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 약제학적 제제는 코팅된 플런저를 포함하는 주사기 내에, 또는 코팅된 고무 마개로 밀봉된 바이얼 내에 함유될 수 있다. 예를 들어, 플런저 또는 마개는 플루오로카본 필름으로 코팅될 수 있다. 본 개시내용의 약제학적 제제를 함유하는 바이얼 및 주사기와 함께 사용하기에 적합한 코팅된 마개 또는 플런저의 예는 예를 들어 미국 특허 4,997,423; 5,908,686; 6,286,699; 6,645,635; 및 7,226,554에 언급되어 있고, 이들의 내용은 그 전문이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본 개시내용의 맥락에서 사용될 수 있는 특정한 예시적인 코팅된 고무 마개 및 플런저는 West Pharmaceutical Services, Inc.(미국 펜실베니아주 리온빌 소재)로부터 입수 가능한 상표명 "FluroTec®" 하에 상업적으로 입수 가능하다. FluroTec®은 약물 생성물이 고무 표면에 부착되는 것을 최소화하거나 방지하는 데 사용되는 플루오로카본 코팅의 일례이다.
본 개시내용의 소정의 실시형태에 따르면, 약제학적 제제는 플루오로카본-코팅된 플런저를 포함하는 저 텅스텐 주사기 내에 함유될 수 있다.
약제학적 제제는 대상체에게 비경구 경로, 예컨대 주사(예를 들어, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내 등) 또는 경피, 점막, 비내, 폐 또는 경구 투여에 의해 투여될 수 있다. 수많은 재사용 가능한 펜 또는 자기 주사기 전달 장치가 본 개시내용의 약제학적 제제를 피하 전달하는 데 사용될 수 있다. 그 예는 AUTOPEN™(Owen Mumford, Inc., 영국 우드스톡 소재), DISETRONIC™ 펜(Disetronic Medical Systems, 스위스 베르그도프 소재), HUMALOG MIX 75/25™ 펜, HUMALOG™ 펜, HUMALIN 70/30™ 펜(Eli Lilly and Co., 미국 인디애나주 인디애나폴리스 소재), NOVOPEN™ I, II 및 III(Novo Nordisk, 덴마크 코펜하겐 소재), NOVOPEN JUNIOR™(Novo Nordisk, 덴마크 코펜하겐 소재), BD™ 펜(Becton Dickinson, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™, 및 OPTICLIK™(sanofi-aventis, 독일 프랑크푸르트 소재)를 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본 개시내용의 약제학적 조성물의 피하 전달에 적용되는 일회용 펜 또는 자기 주사기 전달 장치의 예는 SOLOSTAR™ 펜(sanofi-aventis), FLEXPEN™(Novo Nordisk), 및 KWIKPEN™(Eli Lilly), SURECLICK™ 자기 주사기(Amgen, 미국 캘리포니아주 사우전드오크스 소재), PENLET™(Haselmeier, 독일 슈투트가르트 소재), EPIPEN(Dey, L.P.), 및 HUMIRA™ 펜(Abbott Labs, 미국 일리노이주 애봇 파크 소재)을 포함하지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 개시내용의 약제학적 제제를 전달하기 위한 미량주입기(microinfusor)의 사용이 또한, 본원에 고려된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "미량주입기"는 다량의(예를 들어, 약 2.5 mL 이상까지의) 치료 제제를 연장된 시간 기간(예를 들어, 약 10, 15, 20, 25, 30분 이상)에 걸쳐 서서히 투여하도록 설계된 피하 전달 장치를 의미한다. 예를 들어 미국 특허 6,629,949; 미국 특허 6,659,982; 및 문헌[Meehan et al., J. Controlled Release 46:107-116 (1996)]을 참조한다. 미량주입기는 특히, 고농도(예를 들어, 약 100, 125, 150, 175, 200 mg/mL 이상) 또는 점성 용액 내에 함유된 큰 용량의 치료 단백질의 전달에 유용하다.
일 실시형태에서, 약제학적 제제는 IV 점적을 통해 투여되며, 따라서 제제는 생리학적으로 허용 가능한 용액을 함유하는 IV 백에서 희석된다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 정맥내 주입 백 내의 화합된 멸균 조제물이며, 따라서 단일 용량의 약물 생성물이 100 mL, 250 mL(또는 정맥내 점적 전달에 적합한 다른 유사한 양)의 생리학적 완충제(예를 들어, 0.9% 식염수) 내로 희석된다. 일부 실시형태에서, 주입 백은 폴리비닐 클로라이드(예를 들어, VIAFLEX, Baxter, 미국 일리노이주 데어필드 소재)로 제조된다. 일부 실시형태에서, 주입 백은 폴리올레핀(EXCEL IV 백, Braun Medical Inc., 미국 펜실베니아주 베들레햄 소재)으로 제조된다.
투여 요법
본 개시내용은 APLNR 길항제, 예컨대 항-APLNR 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 대상체에게 약 1주 4회, 1주 2회, 1주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 5주마다 1회, 6주마다 1회, 8주마다 1회, 12주마다 1회의 투약 빈도로, 또는 치료 반응이 달성되는 한 그보다 덜 빈번하게 투여하는 단계를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 상기 방법은 APLNR 길항제, 예컨대 항-APLNR 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 VEGF 길항제를 포함하는 약제학적 조성물을 1주 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회, 4주마다 1회, 5주마다 1회, 6주마다 1회, 8주마다 1회, 9주마다 1회, 12주마다 1회의 투약 빈도로, 또는 치료 반응이 달성되는 한 그보다 덜 빈번하게 투여하는 단계를 수반한다.
본 개시내용의 소정의 실시형태에 따르면, 다수의 용량의 APLNR 길항제, 예컨대 항-APLNR 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 VEGF 길항제가 대상체에게 정의된 시간 경로에 걸쳐 투여될 수 있다. 본 개시내용의 이러한 양태에 따른 방법은 다수의 용량의 APLNR 길항제, 예컨대 항-APLNR 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 VEGF 길항제를 대상체에게 순차적으로 투여하는 단계를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "순차적으로 투여하는"은, 각각의 용량의 APLNR 길항제, 예컨대 항-APLNR 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 VEGF 길항제를 대상체에게 상이한 시점에서, 예를 들어 예정된 간격(예를 들어, 시간, 일, 주(week) 또는 달(month))에 의해 분리된 상이한 일자(day)에 투여하는 것을 의미한다. 본 개시내용은 단일 초기 용량의 APLNR 길항제, 예컨대 항-APLNR 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 VEGF 길항제, 뒤이어 하나 이상의 2차 용량의 APLNR 길항제, 예컨대 항-APLNR 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 VEGF 길항제, 및 선택적으로 뒤이어 하나 이상의 3차 용량의 APLNR 길항제, 예컨대 항-APLNR 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 VEGF 길항제를 대상체에게 순차적으로 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
본 개시내용의 소정의 실시형태에 따르면, 다수의 용량의, APLNR 길항제, 예컨대 항-APLNR 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 VEGF 길항제를 포함하는 공동-제제가 대상체에게 정의된 시간 경로에 걸쳐 투여될 수 있다. 본 개시내용의 이러한 양태에 따른 방법은 다수의 용량의, APLNR 길항제, 예컨대 항-APLNR 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 VEGF 길항제를 포함하는 공동-제제를 대상체에게 순차적으로 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "순차적으로 투여하는"은, 각각의 용량의, VEGF 길항제와 조합하여, APLNR 길항제를 대상체에게 상이한 시점에서, 예를 들어 예정된 간격(예를 들어, 시간, 일, 주 또는 달)에 의해 분리된 상이한 일자에 투여하는 것을 의미한다. 본 개시내용은 단일 초기 용량의, APLNR 길항제와 VEGF 길항제를 포함하는 공동-제제, 뒤이어 하나 이상의 2차 용량의 공동-제제화된 APLNR 길항제와 VEGF 길항제, 및 선택적으로 뒤이어 하나 이상의 3차 용량의 공동-제제화된 APLNR 길항제와 VEGF 길항제를 대상체에게 순차적으로 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.
용어 "초기 용량," "2차 용량" 및 "3차 용량"은 투여의 시간적 순서를 지칭한다. 따라서, "초기 용량"은 치료 요법의 시작 시 투여되는 용량("기준선 용량"이라고도 지칭됨)이며; "2차 용량"은 초기 용량 후 투여되는 용량이고; "3차 용량"은 2차 용량 후 투여되는 용량이다. 초기, 2차 및 3차 용량은 모두, 동일한 양의 APLNR 길항제(또는 APLNR 길항제와 VEGF 길항제를 포함하는 공동-제제)를 함유할 수 있으나, 일반적으로 투여 빈도의 측면에서 서로 상이할 수 있다. 그러나, 소정의 실시형태에서, 초기, 2차 및/또는 3차 용량에 함유되는 양은 치료 경로 동안 서로 다르다(예를 들어, 적절하게 상향 조정되거나 하향 조정됨). 소정의 실시형태에서, 하나 이상의(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개의) 용량이 치료 요법의 시작 시에 "로딩(loading) 용량"으로서 투여되고, 뒤이어 덜 빈번한 기준으로 투여되는 후속 용량(예를 들어, "유지 용량")이 투여된다. 예를 들어, APLNR 길항제(또는 APLNR 길항제와 VEGF 길항제를 포함하는 공동-제제)가 안 질환 또는 장애를 갖는 대상체에게 약 6 mg의 로딩 용량, 뒤이어 하나 이상의 유지 용량으로 투여될 수 있다.
본 개시내용의 일 예시적인 실시형태에서, 각각의 2차 및/또는 3차 용량은 바로 이전의 용량 이후에 1 내지 14주째에(예를 들어, 1, 1½, 2, 2½, 3, 3½, 4, 4½, 5, 5½, 6, 6½, 7, 7½, 8, 8½, 9, 9½, 10, 10½, 11, 11½, 12, 12½, 13, 13½, 14, 14½주 이상째에) 투여된다. 본원에 사용된 바와 같이, 어구 "바로 이전의 용량"은, 다수의 투여 순서에서, 어떠한 개입 용량도 없는 순서에서 바로 다음의 용량의 투여 전에 대상체에게 투여되는 APLNR 길항제(또는 APLNR 길항제와 VEGF 길항제를 포함하는 공동-제제)의 용량을 의미한다.
본 개시내용의 이러한 양태에 따른 방법은 임의의 수의 2차 및/또는 3차 용량의 항-APLNR 길항제(또는 APLNR 길항제와 VEGF 길항제를 포함하는 공동-제제)를 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어 소정의 실시형태에서, 단지 1회의 2차 용량만이 대상체에게 투여된다. 다른 실시형태에서, 2회 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8회 이상)의 2차 용량이 대상체에게 투여된다. 마찬가지로, 소정의 실시형태에서, 단지 1회의 3차 용량만이 대상체에게 투여된다. 다른 실시형태에서, 2회 이상(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8회 이상)의 3차 용량이 대상체에게 투여된다.
다수의 2차 용량을 수반하는 실시형태에서, 각각의 2차 용량은 다른 2차 용량과 동일한 빈도로 투여될 수 있다. 예를 들어, 각각의 2차 용량은 바로 이전의 용량 후 1 내지 2주째에 대상체에게 투여될 수 있다. 유사하게는, 다수의 3차 용량을 수반하는 실시형태에서, 각각의 3차 용량은 다른 3차 용량과 동일한 빈도로 투여될 수 있다. 예를 들어, 각각의 3차 용량은 바로 이전의 용량 후 2 내지 4주째에 대상체에게 투여될 수 있다. 대안적으로, 2차 및/또는 3차 용량이 대상체에게 투여되는 빈도는 치료 요법 경로에 걸쳐 다를 수 있다. 투여 빈도는 또한, 임상 검사 후 개별 대상체의 필요에 따라 치료 과정 동안 의사에 의해 조정될 수 있다.
본 개시내용은 DME, AMD, ROP 또는 PDR을 치료하기 위해 APLNR 길항제 및 VEGF 길항제를 대상체에게 순차적으로 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 하나 이상의 용량의 APLNR 길항제, 뒤이어 하나 이상의 용량의 VEGF 길항제를 투여하는 단계를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 방법은 단일 용량의 VEGF 길항제, 뒤이어 하나 이상의 용량의 APLNR 길항제를 투여하는 단계를 포함한다.
실시예
하기 실시예는 당업자에게 본 개시내용의 방법 및 조성물을 제조하고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시내용 및 설명을 제공하기 위해 제시되고, 본 발명자가 그들의 개시내용으로 간주하는 범위를 제한하려는 것은 아니다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)의 측면에서 정확성을 보장하려고 노력하였지만, 일부 실험적 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 다르게 지시되지 않는 한, 부(part)는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨도이고, 압력은 대기압에 또는 대기압 근처이다.
실시예 1
본 개시내용의 선택된 항-APLNR 항체의 생체내 특징을 평가하기 위해, 눈 혈관구조에서 APLNR-매개 혈관신생을 차단하는 이들 항체의 능력을 측정하였다.
망막 혈관 발달(RVD) 모델을 사용하여, 잡종(75% C57BL6 및 25% Sv129)이며 마우스 APLNR 대신에 인간 APLNR의 발현에 대해 동형접합성인 마우스 새끼(인간화 APLNR 마우스)의 정상적인 발달중의 망막에서 혈관 외성장에 미치는 길항적 항-APLNR 항체의 효과를 평가하였다.
인간화(Hu) 아펠린R 마우스에게 생후 2일째(P)2에 25 mg/kg 및 50 mg/kg 항-아펠린 수용체 항체(αAR; H2aM9232N)를 전신(IP) 주사하였다. 실험자의 편견을 방지하기 위해, 시약을 은폐하고(mask), 용액 A 및 용액 B로 표지하였다. 생후 5일째에, 조직 시료를 수합하고, 그 후에 4% 파라포름알데하이드를 함유하는 PBS에서 고정하였다. 고정된 조직 시료(망막 내피 세포)를 PBS로 세척하고, 후속적으로 0.25% Triton-X 100 중 1% BSA를 함유하는 1x PBS에서 1:200으로 희석된 GS 렉틴 I(Vector Laboratories, #FL-1101)로 25℃에서 밤새 염색하여, 망막 혈관구조를 시각화하였다. 이튿날, 염색된 시료를 PBS로 여러 번 세척하고, 슬라이드 상에 플랫-마운트(flat-mount)하고, 후속적으로 커버슬립을 Prolong Gold(Invitrogen, #P36930)를 사용하여 마운트하였다. 이미지를 에피-플루리슨트 현미경(epi-fluorescent microscope)(Nikon Eclipse 80)을 사용하여 20배 배율에서 촬영하였다. 망막 내 혈관화된 면적을, 이러한 검정법으로부터 획득된 이미지로부터 Adobe Photoshop CS6 익스텐디드(extended)를 사용하여 측정하였다. 망막 혈관구조 면적 측정 및 통계학적 분석을 완료한 후에만, 시료 정제를 드러내었다.
도 1a 및 1b는 P2 내지 P5에서 전신적으로 치료받은 마우스 망막의 대표적인 현미경 사진 및 계산된 혈관 면적의 그래프(20x에서의 이미지, 및 정량화를 위해 40x; 통계학적 분석을 스튜던트 T-검정을 이용하여 수행하였음)이다.
잔여 혈관 면적은 비치료된 망막과 비교하여 α아펠린R(25 mg/kg에서 23%, p < 0.05) 망막에서 유의하게 더 작았다. 전신 주사를 통한 아펠린R의 선택적 저해는 P5 새끼에서 발달중인 망막에서 정상적인 혈관 외성장을 지연시켰다. 25 mg/kg 용량에서, 아펠린R의 차단은 혈관 외성장을 약간 저해한다.
실시예 2
RVD 모델에서 후속 실험을 최고 용량에서 실시예 1과 유사하게 수행하고, 은폐된 그레이더(grader)에 의해 분석하였다. 간략하게는, 새끼에게 50 mg/kg의 Fc(대조군) 또는 αAR을 IP 주사하였다. 도 2a 및 2b는 P2 내지 P5에서 전신적으로 치료받은 마우스 망막의 대표적인 현미경 사진 및 계산된 혈관 면적의 그래프이다. 잔여 혈관 면적은 비치료된 망막과 비교하여 α아펠린R(50 mg/kg에서 35%, p < 0.005) 망막에서 유의하게 더 작았다. 망막 내피 세포를 GS 렉틴 I로 염색하였다. 이미지를 20x(정량화를 위해) 및 40x에서 촬영하였다. 통계학적 분석을 스튜던트 T-검정을 이용하여 수행하였다. 전신 주사를 통한 아펠린R의 선택적 저해는 P5 새끼에서 발달중인 망막에서 정상적인 혈관 외성장을 지연시켰다. 용량을 50 mg/kg 용량까지 증가시킴으로써, 아펠린R의 표적화는 망막 혈관 외성장을 더 지연시켰다.
실시예 3
RVD 모델에서의 후속 실험(실시예 1과 유사하게 수행됨)에서, P2 Hu 새끼에게 50 mg/kg의 Fc, αAR 또는 애플리버셉트 또는 조합(αAR과 애플리버셉트)을 IP 주사하고, P5에서 수합하였다. 도 3a 및 3b는 P2 내지 P5에서 전신적으로 치료받은 마우스 망막의 대표적인 현미경 사진 및 계산된 혈관 면적의 그래프이다. 이러한 마스킹된 연구에서, 50 mg/kg α아펠린R은 Fc 치료 대조군과 비교하여 혈관 성장을 29.8%(p < 0.0001)만큼 저하시켰다. 망막 내피 세포를 GS 렉틴 I로 염색하였다. 이미지를 20x(정량화를 위해) 및 40x에서 촬영하였다. 통계학적 분석을 스튜던트 T-검정을 이용하여 수행하였다. 전신 주사를 통한 아펠린R의 선택적 저해는 P5 새끼에서 발달중인 망막에서 정상적인 혈관 외성장을 지연시켰다.
실시예 4
RVD 모델에서의 또 다른 실험(실시예 1과 유사하게 수행됨)에서, P4 Hu 새끼에게 5 μg의 Fc, αAR 또는 애플리버셉트 또는 조합(αAR과 애플리버셉트)을 유리체내(IVT) 주사하고, P6에서 수합하였다. 도 4a 및 4b는 P2 내지 P5에서 전신적으로 치료받은 마우스 망막의 대표적인 현미경 사진 및 계산된 혈관 면적의 그래프이다. 잔여 혈관 면적은 단일 시약, α아펠린R(50 mg/kg에서 31%, p < 0.001) 또는 애플리버셉트(50 mg/kg에서 43%, p < 0.005) 단독과 비교하여, 조합(α아펠린R + 애플리버셉트)(50 mg/kg에서 62%, p < 0.0001)에서 유의하게 더 작았다. 망막 내피 세포를 GS 렉틴 I로 염색하였다. 용량 및 상관적인 혈관화된 면적에 미치는 효과를 주목한다. 이미지를 20x(정량화를 위해) 및 40x에서 촬영하였다. 통계학적 분석을 1측 ANOVA와 사후 터키 검정을 이용하여 수행하였다. 전신 투여와 유리체내 투여 둘 모두에서(하기 실시예 5 참조), α아펠린R, 및 애플리버셉트 병용 치료법은 정상적인 발달중의 망막 혈관구조의 퇴화를 초래하였다. 전신 주사를 통한 아펠린R와 VEGFA 둘 모두의 차단은 아펠린R 단독 또는 VEGFA 단독을 차단하는 것과 비교하여 혈관 외성장을 방해하는 데 더 효과적이다.
P2에서 αAR을 주사함으로써, P5에서 혈관 외성장을 25 mg/kg에서 23%만큼(n= 6 눈(eye)/그룹, p < 0.05) 50 mg/kg에서 35%만큼(n= 6 눈/그룹, p < 0.005) 감소시켰다. 본 발명자들의 은폐 연구에서, Fc 대조군과 비교하여 혈관 외성장에서 29%(n= 5 눈/그룹, p <0.0001) 저하와 함께 본 발명자들의 관찰을 확증할 수 있었다.
IP 및 IVT 주사 후, 아펠린R과 VEGFA의 조합된 저해는 혈관 외성장을 50 mg/kg에서 62%만큼(n= 4 눈/그룹, p < 0.0001) 및 5 μg에서 68%만큼(n= 4 눈/그룹, p <0.0001) 유의하게 제한하였다. 애플리버셉트 단독은 혈관 외성장에서 50 mg/kg에서 43% 감소(n=4 눈/그룹, p < 0.001) 및 5 μg에서 65% 감소(n=3 눈/그룹, p <0.005)를 생성하였다. 또한, αAR 단독은 혈관 외성장에서 50 mg/kg에서 31% 감소(n= 4 눈/그룹 p < 0.001) 및 5 μg에서 43% 감소(n= 4 눈/그룹, p < 0.005)를 생성하였다.
실시예 5
또 다른 RVD 실험에서, 마우스에게 α아펠린R(H2aM9232N)(5 μg), 애플리버셉트(5 μg), 또는 α아펠린R와 애플리버셉트의 조합(혼합물)을 IVT 치료하였다. 도 5a 및 5b는 P4 내지 P6에서 유리체내 주사로 치료받은 마우스 망막의 대표적인 현미경 사진 및 계산된 혈관 면적의 그래프이다. 잔여 혈관 면적은 단일 시약, α아펠린R(5 μg에서 43%, p < 0.0001) 또는 애플리버셉트(5 μg에서 65%, p < 0.0001) 단독과 비교하여, 조합(α아펠린R + 애플리버셉트)(5 μg에서 68%, p < 0.0001)에서 유의하게 더 작았다. 용량 및 상관적인 혈관화된 면적에 미치는 효과를 주목한다. 이미지를 20x(정량화를 위해) 및 40x에서 촬영하였다. 통계학적 분석을 1측 ANOVA와 사후 터키 검정을 이용하여 수행하였다. 전신 투여와 유리체내 투여 둘 모두에서, α아펠린R, 및 애플리버셉트 병용 치료법은 정상적인 발달중의 망막 혈관구조의 퇴화를 초래한다. 유리체내 주사를 통한 아펠린R와 VEGFA 둘 모두의 차단은 아펠린R 또는 VEGFA 단독을 차단하는 것과 비교하여 혈관 외성장을 방해하는 데 훨씬 더 효과적이다.
실시예 6
산소-유도 허혈성 망막병증(OIR)의 뮤린 모델은 필수적인 프로-혈관신생 인자, VEGF의 상승된 발현과 연관된 병리학적 신혈관 형성(문헌[Smith et al. 1994 Invest Ophthalmol Vis Sci 35:101-111; Neely et al. 1998 Am J. Pathol 153:665-670; Saint-Geniez et al. 2004 Int J Dev Biol 48:1045-1058]), 및 따라서 다양한 질환 병태와 연관된 병리학적 혈관신생과 관련된(문헌[Ferrarra et al. 2005 Nature 438:967-974]) 잘 특징화된 모델이다.
산소-유도 허혈성 망막병증(OIR)에서 망막 혈관의 성장, 혈관 비정상의 형성 및 망막 관류에 미치는 항-APLNR 항체의 효과를 결정하기 위해 조사를 수행하였다.
아펠린/APLNR 신호전달이 병리학적 혈관신생, 뿐만 아니라 정상적인 발달 동안 역할을 하는지 결정하기 위해, OIR 모델을 이용하였다. OIR 모델에서, P6에서 저산소증에의 마우스 새끼의 노출은 중심 망막에서 모세혈관의 신속한 소멸을 초래한다. P11에서 실내로 돌려 보낸 후, 무혈관 구역은 심각하게 저산소성으로 되고, 이는 다시, 유리체 내로의 혈관의 이소성 성장(ectopic growth)(망막전(epiretinal) 혈관 '다발') 및 비정상적인 동정맥 단락(arteriovenous shunt)의 형성을 특징으로 하는 광범위한 비정상적인 신혈관 형성을 이끌어 내고; 망막의 중심부는 연장된 기간 동안 대체로 무혈관으로 남아 있다.
C57/Bl6 마우스(Taconic)를 사용하여, OIR에서 망막 신혈관 형성에 미치는 VEGF 트랩 또는 중화형 APLNR 항체의 효과를 연구하였다. OIR을 1994년에 Smith 등(상기)에 의해 개발된 방법에 따라 생성하였다. 간략하게는, 인간화 마우스 새끼를 P6에서 고산소 환경(75% O2)에 놓고, P11에서 실내로 되돌려 보냈다. 고산소증에의 노출은 중심 망막에서 신속한 혈관소멸(vasoobliteration)을 유도한다. 마우스를 실내로 되돌려 보낼 때(P11), 중심 망막으로부터의 혈관의 상실은 중증 저산소증/허혈증을 초래하고, 이는 다시 병리학적 혈관 변화를 자극한다. 새끼에게 P12에서 50 mg/kg의 Fc(대조군), α아펠린R 또는 애플리버셉트를 전신 주사하고, P16에서 수합하였다. 망막 내피 세포를 GS 렉틴 I로 염색하였다.
도 6a 및 6b는 P12 내지 P16에서 전신적으로 치료받은 OIR 마우스 망막의 대표적인 현미경 사진 및 계산된 무혈관 면적의 그래프이다. 잔여 무혈관 면적은 Fc(대조군) 망막과 비교하여 α아펠린R(29%, p < 0.05) 및 애플리버셉트(27.5%, p <0.01) 망막에서 유의하게 더 작았다. Fc와 비교하여 α아펠린R(67%, p <0.0001) 및 애플리버셉트(94%, p <0.0005) 치료받은 시료에서 신혈관 다발에서 유의한 저하를 주목한다. 망막 내피 세포를 GS 렉틴 I로 염색하였다. 이미지를 20x(무혈관 면적 정량화) 및 40x(비정상적인 신혈관 면적 정량화)에서 촬영하였다. 통계학적 분석을 1측 ANOVA와 사후 터키 검정을 이용하여 수행하였다. 전신 투여와 유리체내 투여 둘 모두에서, 아펠린R의 선택적 저해는 OIR 마우스에서 망막 혈관 재성장을 촉진시키고, 신혈관 형성을 감소시킨다. 전신 주사를 통한 아펠린R 및 VEGFA 저해 둘 모두는 망막 혈관 재성장을 촉진시키고, 비정상적인 신혈관 형성을 감소시킨다.
OIR 마우스를, 상기 OIR 마우스에게 P12에서 5 μg의 Fc, αAR 또는 애플리버셉트를 IVT 주사하고 P16에서 수합하는 점을 제외하고는, 상기 조사와 유사하게 치료하였다. 도 7a 및 7b는 P12 내지 P16에서 유리체내 치료받은 OIR 마우스 망막의 대표적인 현미경 사진 및 계산된 무혈관 면적의 그래프이다. 무혈관 면적은 Fc 대조군과 비교하여 α아펠린R(27.5%, p < 0.05)에서 유의하게 저하되었고, 애플리버셉트(32%, p <0.0001) 조건에서 증가되었다. α아펠린R(60%, p <0.0001)에서 신혈관 다발의 유의한 저하 및 애플리버셉트 시료에서 다발의 완전한 소실을 주목한다. 망막 내피 세포를 GS 렉틴 I로 염색하였다. 이미지를 20x(무혈관 면적 정량화) 및 40x(비정상적인 신혈관 면적 정량화)에서 촬영하였다. 통계학적 분석을 1측 ANOVA와 사후 터키 검정을 이용하여 수행하였다. 전신 투여와 유리체내 투여 둘 모두에서, 아펠린R의 선택적 저해는 OIR 마우스에서 망막 혈관 재성장을 촉진시키고, 신혈관 형성을 감소시킨다. 유리체내 주사를 통한 아펠린R 저해는 혈관 재성장을 향상시키고 비정상적인 신혈관 형성을 저하하는 한편, VEGFA 저해는 혈관 재성장을 억제시키고 임의의 신혈관 형성을 완전히 중단시킨다.
OIR 모델에서, αAR 및 애플리버셉트는 혈관 재성장을 촉진시킬 수 있었다. 새끼에게 OIR P12에서 IP 주사하였을 때, αAR 및 애플리버셉트는 P16에서 무혈관 면적을 29% 및 27%만큼(n= 6 눈/그룹, p < 0.05), 및 신혈관 형성을 69% 및 94%만큼(n= 6 눈/그룹, p < 0.0001) 각각 유의하게 감소시켰다. IVT 투여에 의해, 애플리버셉트가 혈관 재성장을 30%만큼(n= 4 눈/그룹, p < 0.0001) 감소시키고 모든 신혈관 형성을 없앤 한편, αAR은 혈관 재성장을 30%만큼(n= 4 눈/그룹, p < 0.05) 촉진시키고 신혈관 형성을 60%만큼(n= 4 눈/그룹, p < 0.0001) 감소시킬 수 있었다.
APLNR 길항제와 VEGF 트랩, 예를 들어 애플리버셉트의 조합 또한, 실시예 7에 고찰된 바와 같이 OIR 모델에서 병리학적 혈관신생을 퇴화시키고, 정상적인 혈관 재성장을 촉진시켰다. 따라서, 이러한 조합은 미숙아 망막병증을 포함하여 다양한 안 질환에서 관찰된 바와 같이 병리학적 혈관신생을 치료하는 것으로 기대된다.
실시예 7
추가의 생체내 실험에서, 실시예 6에서 상기 고찰된 바와 같이 OIR 모델을 사용하여, 재혈관형성의 구조화 및 밀도를 평가하였다. 간략하게는, 인간화 마우스 새끼를 P6에서 고산소 환경(75% O2)에 놓고, P11에서 실내로 되돌려 보냈다. 고산소증에의 노출은 중심 망막에서 신속한 혈관소멸을 유도한다. 마우스를 실내로 되돌려 보낼 때(P11), 중심 망막으로부터의 혈관의 상실은 중증 저산소증/허혈증을 초래하고, 이는 다시 병리학적 혈관 변화를 자극한다. 새끼에게 P12에서 50 mg/kg의 Fc(대조군), αAPLNR(H4H9232N) 또는 애플리버셉트(VEGF-트랩), 또는 25 mg/kg의 αAPLNR과 애플리버셉트의 조합을 전신 주사하고, P16에서 수합하였다. 망막 내피 세포를 GS 렉틴 I로 염색하였다.
도 8a 및 8b는 P12 내지 P16에서 전신적으로 치료받은 OIR 마우스 망막의 대표적인 현미경 사진(20x) 및 계산된 무혈관 면적의 그래프이다. 병용 치료를 이용한 경우 재성장 속도는 각각의 작용제 단독과 유사하며, 이를 위해, 혈관 재성장은 모든 치료 조건에서 hFc-치료 대조군 망막과 비교하여 향상되고, 병용 치료는 약간 더 저하된 평균 무혈관 면적을 보여준다. 도 8b는, 치료군 사이에서 무혈관 면적에 유의한 변화가 있었음을 보여준다(p <0.0005). 혈관 면적은 Fc 대조군과 비교하여, 항-APLNR 항체(**, p <0.05), VEGF 트랩 (***, p <0.005), 및 조합(***, p <0.05)에서 유의하게 저하되었다. 통계학적 분석을 1측 ANOVA와 사후 터키 검정을 이용하여 수행하였다.
도 9a 및 9b는 P12 내지 P16에서 전신적으로 치료받은 OIR 마우스 망막의 대표적인 현미경 사진(40x) 및 계산된 비정상적인 혈관 면적의 그래프이다. 병용 치료는 VEGF 트랩과 비교하여 더 적은 프룬드 혈관, 및 항-APLNR 및 Fc 대조군과 비교하여 더 적은 비정상적인 신혈관 형성을 보여준다(도 9a). 도 9b는 치료군 사이에서 비정상적인 혈관 면적에 유의한 변화가 있었음을 보여준다(p <0.0005). 비정상적인 혈관 면적은 Fc 대조군과 비교하여 항-APLNR(***, p <0.0005), VEGF 트랩(*** p <0.005) 및 조합(***, p <0.0005)을 이용한 경우 유의하게 저하되었다. 비정상적인 혈관 면적 또한, 항-APLNR 치료군과 비교하여 병용 치료군(*, p <0.05)에서 유의하게 저하되었다. 통계학적 분석을 1측 ANOVA와 사후 터키 검정을 이용하여 수행하였다.
도 10은 혈관 면적 및 혈관 길이를 계산하는 데 사용된 이미지 가공 및 측정 기술을 나타낸다. "원래 이미지"는 도 9a에 제시된 40x 현미경 사진이다. "역치 이미지(threshold image)" 및 "바이너리 이미지(binary image)"는 하기 도 11a, 11b, 12a 및 12b와 관련되어 보다 구체적으로 고찰된다.
도 11a 및 11b는 P12 내지 P16에서 전신적으로 치료받은 OIR 마우스 망막의 현미경 사진(40x)으로부터 혈관의 구조화 및 균일성을 보여주는 대표적인 가공된 이미지 및 계산된 혈관 면적의 그래프이다. 도 11a에 제시된 바와 같이, 항-APLNR 항체와 VEGF 트랩의 조합은, 항-APLNR 단독과 비교하여 더 구조화되고 균일하며 VEGF 트랩 단독과 비교하여 덜 산재해 있는(더 적은 프룬드 혈관을 가짐) 망막 혈관을 생성하였다. 도 11b는 치료군 사이에서 혈관 면적에 유의한 변화가 있었음을 보여준다(p <0.0005). 혈관 면적은 Fc 대조군과 비교하여 항-APLNR(***, p <0.0005)을 이용한 경우 유의하게 증가되었고, VEGF 트랩(***, p <0.005) 및 병용 치료(*, p <0.05)를 이용한 경우 저하되었다. 혈관 면적은 항-APLNR과 비교하여 VEGF 트랩(####, p <0.0005) 및 조합(####, p <0.0005)을 이용한 경우 저하되었다. 대조적으로, 혈관 면적은 VEGF 트랩과 비교하여 병용 치료(&&&, p<0.005)를 이용한 경우 유의하게 증가되었다. 통계학적 분석을 1측 ANOVA와 사후 터키 검정을 이용하여 수행하였다.
도 12a 및 12b는 P12 내지 P16에서 전신적으로 치료받은 OIR 마우스 망막의 현미경 사진(40x)으로부터 혈관의 밀도를 보여주는 대표적인 가공된 이미지 및 계산된 혈관 길이의 그래프이다. 도 12a에 제시된 바와 같이, 항-APLNR 항체와 VEGF 트랩의 조합은 항-APLNR(더 큰 밀도) 또는 VEGF 트랩(더 작은 밀도) 단독과 비교하여 중간 밀도의 망막 혈관을 생성하였다. 도 12b는 치료군 사이에서 혈관 길이에 유의한 변화가 있었음을 보여준다(p <0.0005). 혈관 길이는 항-APLNR과 비교하여 VEGF 트랩(####, p <0.0005) 및 조합(####, p <0.0005)을 이용한 경우 유의하게 저하되었다. 대조적으로, 혈관 길이는 VEGF 트랩과 비교하여 병용 치료(&&&, p <0.005)를 이용한 경우 유의하게 증가되었다. 통계학적 분석을 1측 ANOVA와 사후 터키 검정을 이용하여 수행하였다.
도 8a 내지 12b에 제시되고 상기 고찰된 바와 같이, 항-APLNR 항체와 VEGF 트랩의 조합은 재혈관형성을 촉진하여, Fc 대조군과 비교하여 무혈관 면적의 저하를 초래한다. 또한, 병용 치료는 항-APLNR 항체 또는 VEGF 트랩 치료 단독과 비교하여, 병리학적 신혈관 형성을 저해하고, 혈관 면적과 혈관 길이에 미치는 중간 효과를 발휘한다. 특히, 병용 치료는 VEGF 트랩 치료와 비교하여 주요 혈관들 사이에서 미세혈관 성장을 촉진하고, 항-APLNR 항체 치료와 비교하여 혈관 구조화 및 균일성을 향상시킨다.
본 개시내용은 그 범위가 본원에 기재된 구체적인 실시형태에 의해 제한되지 않는다. 사실상, 본원에 기재된 것 이외의 본 개시내용의 다양한 변형은 상기 상세한 설명 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명확해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
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Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Leu Glu Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Leu Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Gly Leu Leu Arg Phe Leu Glu Pro Gly Arg Arg Tyr Tyr 100 105 110 Ser Gly Met Asn Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 3 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 4 Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys 1 5 <210> 5 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 5 Ala Arg Pro Gly Leu Leu Arg Phe Leu Glu Pro Gly Arg Arg Tyr Tyr 1 5 10 15 Ser Gly Met Asn Val 20 <210> 6 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 6 gacatccagt tgacccagtc tccatccttc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgct gggccagtca gggcattcgc agttatttag cctggtatca gcaaaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccactt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca caatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt acccgtggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 7 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 7 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Trp Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 8 Gln Gly Ile Arg Ser Tyr 1 5 <210> 9 <211> 3 <212> PRT <213> 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Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Val Val Arg Gly Val Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110 Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 14 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Val 1 5 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 15 Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys 1 5 <210> 16 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 16 Ala Arg Asp Arg Val Val Arg Gly Val Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 1 5 10 15 Leu Asp Val <210> 17 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 17 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttaga agcaacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatcctcca gggccactgg tatcccagcc 180 aggttcagtg gcactgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240 gacgattttg cagtttatta ctgtcagcaa tataataagt ggcctcggac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa g 321 <210> 18 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 18 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Thr Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Lys Trp Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> 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Pro Val Ala Asn Ala Arg Leu Arg Leu Arg Val 130 135 140 Ser Gly Ala Val Ala Thr Ala Val Leu Trp Val Leu Ala Ala Leu Leu 145 150 155 160 Ala Met Pro Val Met Val Leu Arg Thr Thr Gly Asp Leu Glu Asn Thr 165 170 175 Thr Lys Val Gln Cys Tyr Met Asp Tyr Ser Met Val Ala Thr Val Ser 180 185 190 Ser Glu Trp Ala Trp Glu Val Gly Leu Gly Val Ser Ser Thr Thr Val 195 200 205 Gly Phe Val Val Pro Phe Thr Ile Met Leu Thr Cys Tyr Phe Phe Ile 210 215 220 Ala Gln Thr Ile Ala Gly His Phe Arg Lys Glu Arg Ile Glu Gly Leu 225 230 235 240 Arg Lys Arg Arg Arg Leu Leu Ser Ile Ile Val Val Leu Val Val Thr 245 250 255 Phe Ala Leu Cys Trp Met Pro Tyr His Leu Val Lys Thr Leu Tyr Met 260 265 270 Leu Gly Ser Leu Leu His Trp Pro Cys Asp Phe Asp Leu Phe Leu Met 275 280 285 Asn Ile Phe Pro Tyr Cys Thr Cys Ile Ser Tyr Val Asn Ser Cys Leu 290 295 300 Asn Pro Phe Leu Tyr Ala Phe Phe Asp Pro Arg Phe Arg Gln Ala Cys 305 310 315 320 Thr Ser Met Leu Cys Cys Gly Gln Ser Arg Cys Ala Gly Thr Ser His 325 330 335 Ser Ser Ser Gly Glu Lys Ser Ala Ser Tyr Ser Ser Gly His Ser Gln 340 345 350 Gly Pro Gly Pro Asn Met Gly Lys Gly Gly Glu Gln Met His Glu Lys 355 360 365 Ser Ile Pro Tyr Ser Gln Glu Thr Leu Val Val Asp 370 375 380 <210> 23 <211> 458 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro 20 25 30 Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu 35 40 45 Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr 50 55 60 Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys 65 70 75 80 Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr 85 90 95 Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His 100 105 110 Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile 115 120 125 Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu 130 135 140 Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile 145 150 155 160 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Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 370 375 380 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 385 390 395 400 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 405 410 415 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 420 425 430 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 435 440 445 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455

Claims (53)

  1. 치료적 유효량의 APLNR 길항제를 포함하는, 병리학적 망막 혈관신생(pathological retinal angiogenesis)으로 특징지어지는 혈관성 안 질환 또는 장애(vascular eye disease or disorder)를 치료하는 방법에 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 APLNR 길항제가 치료적 유효량의 혈관 내피 성장 인자 (vascular endothelial growth factor: VEGF) 길항제와 조합하여 투여되고, 상기 APLNR 길항제가 각각 서열번호 14, 15, 16, 19, 20 및 21의 아미노산 서열로 구성되는 6개의 상보성 결정 영역, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고 인간 APLNR에 특이적으로 결합하는 항-APLNR 항체 또는 이의 항원-결합 단편이며, 상기 VEGF 길항제가 애플리버셉트(aflibercept)인, 약제학적 조성물.
  2. 치료적 유효량의 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 길항제를 포함하는, 병리학적 망막 혈관신생으로 특징지어지는 혈관성 안 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 VEGF 길항제가 치료적 유효량의 APLNR 길항제와 조합하여 투여되고, 상기 APLNR 길항제가 각각 서열번호 14, 15, 16, 19, 20 및 21의 아미노산 서열로 구성되는 6개의 상보성 결정 영역, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고 인간 APLNR에 특이적으로 결합하는 항-APLNR 항체 또는 이의 항원-결합 단편이며, 상기 VEGF 길항제가 애플리버셉트(aflibercept)인, 약제학적 조성물.
  3. 병리학적 망막 혈관신생으로 특징지어지는 혈관성 안 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 조성물이
    치료적 유효량의 APLNR 길항제;
    치료적 유효량의 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 길항제; 및
    적합한 담체, 부형제 또는 희석제
    를 포함하고,
    상기 APLNR 길항제가 각각 서열번호 14, 15, 16, 19, 20 및 21의 아미노산 서열로 구성되는 6개의 상보성 결정 영역, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고 인간 APLNR에 특이적으로 결합하는 항-APLNR 항체 또는 이의 항원-결합 단편이며, 상기 VEGF 길항제가 애플리버셉트(aflibercept)인, 약제학적 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 안 질환 또는 장애가 당뇨병성 망막병증, 증식성 당뇨병성 망막병증, 나이-관련 황반 변성, 망막 신혈관 형성(retinal neovascularization), 중심 망막 정맥 폐색, 분지 망막 정맥 폐색, 및 미숙아 망막병증(retinopathy of prematurity)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안 질환 또는 장애가 나이-관련 황반 변성인, 약제학적 조성물.
  6. 삭제
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 서열번호 13의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 18의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 약제학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항체가 IgG1 또는 IgG4 중쇄 불변 영역을 갖는 인간 항체인, 약제학적 조성물.
  9. 제4항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 서열번호 13의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 18의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 약제학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 항체가 IgG1 또는 IgG4 중쇄 불변 영역을 갖는 인간 항체인, 약제학적 조성물.
  11. 제5항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 서열번호 13의 아미노산 서열로 구성되는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 18의 아미노산 서열로 구성되는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 약제학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 항체가 IgG1 또는 IgG4 중쇄 불변 영역을 갖는 인간 항체인, 약제학적 조성물.
  13. 삭제
  14. 삭제
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