KR20240056666A - 이중특이성 항체 생성을 위한 표면 전하 조작 방법 - Google Patents

이중특이성 항체 생성을 위한 표면 전하 조작 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항체의 등전점(isoelectric point)을 변형시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 중쇄 가변 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 항체를 제공하는 단계; 및 상기 항체의 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드 중 적어도 하나에서, 카바트 넘버링 체계(Kabat numbering system)에 따라 위치 7, 9, 11, 14, 41, 70, 74, 82a, 84, 및 113에 있는 중쇄 가변 영역(VH)의 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환하는 단계로서, 상기 치환은 상기 항체의 등전점을 증가 또는 감소시키는, 단계를 포함한다.

Description

이중특이성 항체 생성을 위한 표면 전하 조작 방법{METHODS OF ENGINEERING SURFACE CHARGE FOR BISPECIFIC ANTIBODY PRODUCTION}
서열 목록
본 출원은 EFS-웹을 통해 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전체 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 2018년 5월 16일자로 생성된 ASCII 텍스트 파일은 JBI5100WOPCTSEQLIST.TXT로 명명되고 크기가 18 킬로바이트이다.
기술분야
본 발명은 이중특이성 항체 생성을 향상시키기 위해 표면 전하를 조작하는 방법에 관한 것이다.
항체-기반 치료제는 암 및 자가면역/염증성 장애를 포함한 다양한 질병을 치료하는 데 성공적으로 사용되어 왔다. 아직까지도 이러한 부류의 약물에 대한 개선이 여전히 필요한데, 이는 특히 그들의 임상 효능을 향상시키는 것과 관련하여 그러하다. 탐구되고 있는 한 가지 방법은 추가의 그리고 신규한 항원 결합 부위를 항체-기반 약물 내로 조작하여 단일 면역글로불린 분자가 2개의 상이한 항원과 동시결합(co-engage)하도록 하는 것이다. 2개의 상이한 항원과 결합하는 그러한 대안적인 항체 포맷은 종종 이중특이성 항체로 지칭된다.
특유의 작용 기전으로 인해, 이중특이성 항체는 생물치료제 후보로서 더욱 더 주목을 받아 왔다. 역사적으로, IgG 유형 이중특이성 항체의 생성은 세포 내로의 4개의 핵산 분자의 도입을 수반하였는데, 4개의 핵산 분자는, 예를 들어 주어진 항원에 특이적인 제1 항체의 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자, 및 상이한 항원에 특이적인 제2 항체의 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자이다. 이러한 시스템에서는, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 인코딩하는 핵산 분자의 발현, 및 2개의 상이한 중쇄 사이 및 중쇄와 경쇄 사이의 대체로 랜덤한 회합으로 인해, 생성된 항체의 작은 비율이 중쇄와 경쇄의 원하는 조합을 가져왔다. 이러한 방식으로 생성된 10개의 항체 중 단지 1개만이 관심 이중특이성 항체를 생성하기에 적절한 HC와 LC의 쌍형성을 달성한다. 이러한 문제를 해결하기 위하여, 2개의 상이한 HC의 이종이량체화 및 그들의 LC 파트너와의 HC의 적절한 쌍형성을 촉진하여 원하는 이중특이체를 형성하는 조작 전략이 착상가능하였다. 그러한 전략은 전하, 소수성, 입체 장애(steric hindrance), 또는 이들의 조합을 도입한 결과로서 원치 않는 쌍형성을 불리하게 하는 돌연변이를 도입하였다. 이들 유형의 접근법은 이중특이성 항체의 비율을 크게 증가시켰지만, 다른 원치 않는 항체종이 남아 있었다. 이러한 원치 않는 불순물은 원하는 생성물에 근연되어 있기 때문에, 이들은 제거하기가 어려울 수 있다.
2006년 3월 16일, Huang et al.(국제 특허 출원 공개 WO 2006/028936호)은 원하는 항체 이종이량체의 정제를 용이하게 하기 위하여, 하나 이상의 항체의 CDR 또는 프레임워크에서 선택적 치환을 형성함으로써 제1 폴리펩티드 쌍과 제2 폴리펩티드 쌍 사이의 등전점(isoelectric point, pI)의 차이를 조작하는 것이 바람직할 수 있음을 시사하였다. Igawa et al.(미국 특허 출원 공개 제20090263392호 및 제20110076275호)에 의한 후속 연구는 상이한 pl를 갖도록 이중특이체를 포함하는 절반-항체(half-antibody)들 중 하나 또는 둘 모두를 조작하는 것을 수반하는 이중특이성 항체 생성 과정 동안 형성된 원치 않는 단일특이성 동종이량체성 부산물의 제거를 향상시키기 위한 방법을 개시하였다. pI의 변화는 항체의 불변 영역 및/또는 가변 영역에서의 하나 이상의 특정 아미노산 치환의 도입에 의해 조작된다. 절반 항체들 중 하나 또는 둘 모두의 pI의 변화의 결과로서, 원하는 이중특이성 항체는 양이온 교환을 사용하여 모 단일특이성 동종이량체성 항체로부터 더욱 용이하게 정제될 수 있다. 마찬가지로, Moore et al.에게 허여된 미국 특허 출원 공개 제20140294823호는 모 항체들 중 하나의 중쇄 불변 영역에서의 특정 아미노산 치환이 이종이량체성 항체를 생성하는 유사한 접근법을 기재하는데, 여기서는 2개의 중쇄가 상이한 등전점(pI)을 갖는다.
이러한 노력에도 불구하고, 이중특이성 항체의 정제를 위한 추가의 방법이 여전히 필요하다.
본 발명의 일 태양은 항체의 등전점을 변형시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 중쇄 가변 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 항체를 제공하는 단계; 및 상기 항체의 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드 중 적어도 하나에서, 카바트 넘버링 체계(Kabat numbering system)에 따라 위치 7, 9, 11, 14, 41, 70, 74, 82a, 84, 및 113에 있는 중쇄 가변 영역(VH)의 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환하는 단계로서, 상기 치환은 상기 항체의 등전점을 증가 또는 감소시키는, 단계를 포함한다.
본 발명의 제2 태양은 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성되는 변형된 등전점을 갖는 항체에 관한 것이다.
본 발명의 제3 태양은 2개의 모 항체로부터의 이중특이성 항체의 분리를 향상시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은, 제1 모 항체 및 제2 모 항체를 제공하는 단계로서, 각각의 모 항체는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 단계; 및 상기 제1 모 항체 및 상기 제2 모 항체 중 적어도 하나에서, 카바트 넘버링 체계에 따라 위치 7, 9, 11, 14, 41, 70, 74, 82a, 84, 및 113에 있는 중쇄 가변 영역(VH) 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환하는 단계로서, 상기 치환은 상기 제2 모 항체와 대비하여 상기 제1 모 항체의 등전점을 증가 또는 감소시키는, 단계를 포함한다. 상기 방법은 상기 치환 후에 상기 2개의 모 항체로부터 상기 이중특이성 항체를 생성하는 단계, 및 상기 2개의 모 항체로부터 생성된 이중특이성 항체를 분리하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 이중특이성 항체의 분리는 상기 치환의 결과로서 향상된다.
본 발명의 제4 태양은 다중특이성 항체에 관한 것으로, 상기 다중특이성 항체는 중쇄 가변 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하며, 상기 제1 폴리펩티드의 등전점은 상기 제2 폴리펩티드의 등전점보다 더 낮다. 상기 태양에 따르면, 상기 제1 폴리펩티드의 중쇄 가변 영역의 위치 9, 70, 74, 82a, 및 84(카바트 넘버링)에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기는 중성으로 또는 음으로 하전된 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드의 중쇄 가변 영역의 상응하는 위치에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기는 상기 제1 폴리펩티드와 대비하여 차별적으로 하전된 아미노산 잔기를 포함한다.
본 발명의 제5 태양은 다중특이성 항체에 관한 것으로, 상기 다중특이성 항체는 중쇄 가변 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하며, 상기 제1 폴리펩티드의 등전점은 상기 제2 폴리펩티드의 등전점보다 더 높다. 상기 태양에 따르면, 상기 제1 폴리펩티드의 중쇄 가변 영역의 위치 7, 9, 11, 14, 41, 74, 84, 및 113(카바트 넘버링)에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기는 중성으로 또는 양으로 하전된 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드의 중쇄 가변 영역의 상응하는 위치에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기는 상기 제1 폴리펩티드와 대비하여 차별적으로 하전된 아미노산 잔기를 포함한다.
도 1a 내지 도 1c는 CNTO148 항체 단일 치환 변이체의 인간 TNFα 결합 ELISA의 그래프이다. 도 1a는 야생형과 대비하여 S75D 및 N84D 항체 변이체의 TNFα 결합을 나타낸다(148 WT와 CNTO148). 도 1b는 야생형과 대비하여 A88D 항체 변이체의 TNFα 결합을 나타낸다. 도 1c는 야생형과 대비하여 G9E 및 S71E 항체 변이체의 TNFα 결합을 나타낸다. TNFα에 대한 CNTO95 항체 결합은 음성 대조군으로서 제시되어 있다.
도 2a 내지 도 2c는 CNTO148 단일 치환 변이체의 분석용 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SE-HPLC) 분석을 나타낸다. 상세하게는, 도 2a는 CNTO148 야생형 항체의 SE-HPLC 프로파일을 나타내고, 도 2b는 N84D 변이체의 SE-HPLC 프로파일을 나타내고, 도 2c는 S75D 변이체의 SE-HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 3a 및 도 3b는 CNTO148 야생형 및 A88D 변이체의 분석용 SE-HPLC 분석을 나타낸다. 상세하게는, 도 3a는 CNTO148 야생형 항체의 SE-HPLC 프로파일을 나타내고, 도 2b는 A88D 변이체의 SE-HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 4a 내지 도 4c는 CNTO148 야생형, G9E, 및 S71E 변이체의 분석용 SE-HPLC 분석을 나타낸다. 상세하게는, 도 4a는 CNTO148 야생형 항체의 SE-HPLC 프로파일을 나타내고, 도 4b는 G9E 변이체의 SE-HPLC 프로파일을 나타내고, 도 4c는 S71E 변이체에 대한 SE-HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 5a 내지 도 5c는 CNTO148 단일 치환 변이체의 응집 개시(콜로이드 안정성) 분석을 나타낸 그래프이다. 도 5a는 CNTO148 야생형에 대한 응집 개시가 63.9℃에서 발생함을 나타내고, 도 5b는 S75D 변이 항체에 대한 응집 개시가 66.8℃에서 발생함을 나타내고, 도 5c는 N84D 변이체에 대한 응집 개시가 65.8℃에서 발생함을 나타낸다.
도 6a 및 도 6b는 CNTO148 야생형 및 A88D 변이체의 응집 개시(콜로이드 안정성) 분석을 나타낸 그래프이다. 도 6a는 야생형에 대한 응집 개시가 67.6℃에서 발생함을 나타내고, 도 6b는 A88D 변이체에 대한 응집 개시가 66.9℃에서 발생함을 나타낸다.
도 7a 내지 도 7c는 CNTO148 야생형, G9E, 및 S71E 변이체의 응집 개시(콜로이드 안정성) 분석을 나타낸 그래프이다. 도 7a는 야생형에 대한 응집 개시가 68.6℃에서 발생함을 나타내고, 도 7b는 G9E 변이체에 대한 응집 개시가 65.7℃에서 발생함을 나타내고, 도 7c는 S71E 변이체에 대한 응집 개시가 69.5℃에서 발생함을 나타낸다.
도 8a 내지 도 8c는 CNTO148 단일 치환 변이체의 풀림 온도(입체구조 안정성) 분석을 나타낸 그래프이다. 도 8a는 야생형에 대한 풀림 온도가 63.9℃에서 발생함을 나타내고, 도 8b는 S75D 변이체에 대한 풀림 온도가 67.3℃에서 발생함을 나타내고, 도 8c는 N84D 변이체에 대한 풀림 온도가 65.3℃에서 발생함을 나타낸다.
도 9a 및 도 9b는 CNTO148 야생형 및 A88D 변이체의 풀림 온도(입체구조 안정성) 분석을 나타낸 그래프이다. 도 9a는 야생형에 대한 풀림 온도가 67.3℃에서 발생함을 나타내고, 도 9b는 A88D 변이체에 대한 풀림 온도가 66.9℃에서 발생함을 나타낸다.
도 10a 내지 도 10c는 CNTO148 야생형, G9E, 및 S71E 변이체의 풀림 온도(입체구조 안정성) 분석을 나타낸 그래프이다. 도 10a는 야생형에 대한 풀림 온도가 68.8℃에서 발생함을 나타내고, 도 10b는 G9E 변이체에 대한 풀림 온도가 65.8℃에서 발생함을 나타내고, 도 10c는 S71E 변이체에 대한 풀림 온도가 69.5℃에서 발생함을 나타낸다.
도 11은 CNTO95 항체 단일 치환 변이체의 인간 αVβ3 결합 ELISA의 그래프이다. 도 11은 CNTO95 야생형과 대비하여 S7R, G9R, V11R, P14R, P41R, S71K, A88R, 및 S119R 항체 변이체의 αVβ3 결합을 나타낸다. αVβ3에 대한 CNTO148 항체 결합은 음성 대조군으로서 제시되어 있다.
도 12a 내지 도 12i는 CNTO95 단일 치환 변이체의 분석용 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SE-HPLC) 분석을 나타낸다. 상세하게는, 도 12a는 CNTO95 야생형 항체의 SE-HPLC 프로파일을 나타내고, 도 12b는 S7R 변이체의 SE-HPLC 프로파일을 나타내고, 도 12c는 G9R 변이체의 SE-HPLC 프로파일을 나타내고, 도 12d는 V11R 변이체의 SE-HPLC 프로파일을 나타내고, 도 12e는 P14R 변이체의 SE-HPLC 프로파일을 나타내고, 도 12f는 P41R 변이체의 SE-HPLC 프로파일을 나타내고, 도 12g는 S71K 변이체의 SE-HPLC 프로파일을 나타내고, 도 12h는 A88R 변이체의 SE-HPLC 프로파일을 나타내고, 도 12i는 S119R 변이체의 SE-HPLC 변이체를 나타낸다.
도 13a 내지 도 13i는 CNTO95 단일 치환 변이체의 응집 개시(콜로이드 안정성) 분석을 나타낸 그래프이다. 도 13a는 CNTO95 야생형에 대한 응집 개시가 68.2℃에서 발생함을 나타내고, 도 13b는 S7R 변이 항체에 대한 응집 개시가 67.2℃에서 발생함을 나타내고, 도 13c는 G9R 변이체에 대한 응집 개시가 57.9℃에서 발생함을 나타내고, 도 13d는 V11R 변이체에 대한 응집 개시가 63.9℃에서 발생함을 나타내고, 도 13e는 P14R 변이체에 대한 응집 개시가 63.5℃에서 발생함을 나타내고, 도 13f는 P41R 변이체에 대한 응집 개시가 66.4℃에서 발생함을 나타내고, 도 13g는 S71K 변이체에 대한 응집 개시가 64.9℃에서 발생함을 나타내고, 도 13h는 A88R 변이체에 대한 응집 개시가 67.6℃에서 발생함을 나타내고, 도 13i는 S119R 변이체에 대한 응집 개시가 66.7℃에서 발생함을 나타낸다.
도 14a 내지 도 14i는 CNTO95 단일 치환 변이체의 풀림 온도(입체구조 안정성) 분석을 나타낸 그래프이다. 도 14a는 야생형에 대한 풀림 온도가 68.8℃에서 발생함을 나타내고, 도 14b는 S7R 변이체에 대한 풀림 온도가 67.9℃에서 발생함을 나타내고, 도 14c는 G9R 변이체에 대한 풀림 온도가 59.4℃에서 발생함을 나타내고, 도 14d는 V11R 변이체에 대한 풀림 온도가 64.8℃에서 발생함을 나타내고, 도 14e는 P14R 변이체에 대한 풀림 온도가 64.3℃에서 발생함을 나타내고, 도 14f는 P41R 변이체에 대한 풀림 온도가 66.8℃에서 발생함을 나타내고, 도 14g는 S71K 변이체에 대한 풀림 온도가 65.8℃에서 발생함을 나타내고, 도 14h는 A88R 변이체에 대한 풀림 온도가 68.0℃에서 발생함을 나타내고, 도 14i는 S119R 변이체에 대한 풀림 온도가 67.6℃에서 발생함을 나타낸다.
도 15는 항-TIM3 항체 단일 치환 변이체의 인간 TIM3 결합 ELISA를 나타낸다.
도 16a 내지 도 16d는 항-TIM3 단일 치환 변이체의 분석용 SE-HPLC 분석을 나타낸다. 도 16a는 TIM3 S75D 변이체의 SE-HPLC 프로파일을 나타내고, 도 16b는 TIM3 야생형의 SE-HPLC 프로파일을 나타내고, 도 16c는 TIM3 N84D 변이체의 SE-HPLC 프로파일을 나타내고, 도 16d는 TIM3 A88D 변이체의 SE-HPLC 변이체를 나타낸다.
도 17a 내지 도 17d는 항-TIM3 단일 치환 변이체의 응집 개시(콜로이드 안정성) 분석을 나타낸다. 도 17a는 S75D 변이체에 대한 응집 개시가 67.5℃에서 발생함을 나타내고, 도 17b는 N84D 변이체에 대한 응집 개시가 68.2℃에서 발생함을 나타내고, 도 17c는 A88D 변이체에 대한 응집 개시가 66.7℃에서 발생함을 나타내고, 도 17d는 야생형에 대한 응집 개시가 68.5℃에서 발생함을 나타낸다.
도 18은 SPR에 의해 결정된 바와 같은 항-PD1 단일 치환 변이체에 대한 PD1 결합 속도론을 나타낸다.
도 19a 내지 도 19d는 항-PD1 항체 단일 치환 변이체의 분석용 SE-HPLC 분석을 나타낸다. 도 19a는 PD1 S75D 변이체의 SE-HPLC 프로파일을 나타내고, 도 19b는 PD1 야생형의 SE-HPLC 프로파일을 나타내고, 도 19c는 PD1 S84D 변이체의 SE-HPLC 프로파일을 나타내고, 도 19d는 PD1 S88D 변이체의 SE-HPLC 변이체를 나타낸다.
도 20a 내지 도 20d는 항-PD1 단일 치환 변이체의 응집 개시(콜로이드 안정성) 분석을 나타낸다. 도 20a는 S75D 변이체에 대한 응집 개시가 66.6℃에서 발생함을 나타내고, 도 20b는 S84D 변이체에 대한 응집 개시가 66.1℃에서 발생함을 나타내고, 도 20c는 S88D 변이체에 대한 응집 개시가 66.5℃에서 발생함을 나타내고, 도 20d는 야생형에 대한 응집 개시가 65.7℃에서 발생함을 나타낸다.
도 21은 CNTO148 항체 치환 조합 변이체의 인간 TNF 결합 ELISA를 나타낸다.
도 22a 내지 도 22e는 CNTO148 조합 변이체의 분석용 크기 배제 크로마토그래피 분석을 나타낸다. 도 22a는 CNTO148 야생형의 SE-HPLC 프로파일을 나타내고, 도 22b는 CNTO148 N84D/A88D 변이체의 SE-HPLC 프로파일을 나타내고, 도 22c는 CNTO148 S75D/A88D 변이체의 SE-HPLC 프로파일을 나타내고, 도 22d는 CNTO148 N75D/N84D/A88D 변이체의 SE-HPLC 변이체를 나타내고, 도 22e는 CNTO148 S75D/N84D 변이체의 SE-HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 23a 내지 도 23e는 CNTO148 조합 변이체의 응집 개시(콜로이드 안정성) 분석을 나타낸다. 도 23a는 CNTO148 N84D/A88D 변이체에 대한 응집 개시가 66.8℃에서 발생함을 나타내고, 도 23b는 CNTO148 S75D/A88D 변이체에 대한 응집 개시가 66.8℃에서 발생함을 나타내고, 도 23c는 S75D/N84D/A88D 변이체에 대한 응집 개시가 67.2℃에서 발생함을 나타내고, 도 23d는 S75D/N84D 변이체에 대한 응집 개시가 67.1℃에서 발생함을 나타낸다. 도 23e는 야생형에 대한 응집 개시가 66.5℃에서 발생함을 나타낸다.
도 24a 내지 도 24e는 CNTO148 다중 치환 변이체의 풀림 온도(입체구조 안정성) 분석을 나타낸 그래프이다. 도 24a는 야생형에 대한 풀림 온도가 66.4℃에서 발생함을 나타내고, 도 24b는 N84D/A88D 변이체에 대한 풀림 온도가 67.1℃에서 발생함을 나타내고, 도 24c는 S75D/A88D 변이체에 대한 풀림 온도가 66.8℃에서 발생함을 나타내고, 도 24d는 S75D/N84D/A88D 변이체에 대한 풀림 온도가 66.9℃에서 발생함을 나타내고, 도 24e는 S75D/N84D 변이체에 대한 풀림 온도가 67.3℃에서 발생함을 나타낸다.
대체로, 본 발명은 다중특이성 항체의 생성 및 정제를 향상시키기 위해 표면 전하를 조작하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법을 사용하여 생성된 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명에서 생성된 항-PD1 및 항-TIM3 항체 및 이중특이성 PD-1xTIM3 항체, 및 이들의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 생성된 항-PD-1, 항-TIM3 및 이중특이성 PD-1xTIM3 항체는 진단제 및 치료제로서 유용하다.
따라서, 본 발명의 일 태양은 항체의 등전점을 변형시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 중쇄 가변 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 항체를 제공하는 단계를 포함한다. 상기 방법은, 항체의 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드 중 적어도 하나에서, 카바트 넘버링 체계에 따라 위치 7, 9, 11, 14, 41, 70, 74, 82a, 84, 및 113에 있는 중쇄 가변 영역(VH)의 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환하는 단계를 추가로 포함하며, 치환은 항체의 등전점을 증가 또는 감소시킨다.
용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는 단일클론 항체(전장 단일클론 항체 및 그로부터 유래된 더 작은 분자를 포함함) 및 다중클론 항체를 포함한다. 용어 "항체"는 또한 1가 및 다가 항체, 예를 들어 2가 항체, 3가 항체, 및 4가 항체를 포함한다. 용어 "항체"는 또한 단일특이성 및 다중특이성 항체, 예를 들어 이중특이성 항체, 삼중특이성 항체, 사중특이성 항체를 포함한다. 다중특이성 항체는 2개 이상의 상이한 항원 또는 동일한 항원의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 항체이다. 따라서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체의 등전점을 변형시키는 방법은 매우 다양한 항체에 적용가능하다.
일 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 변형된 항체는 면역글로불린(Ig) 분자이며, 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬, 즉 2개의 중쇄(H 사슬)를 포함한다. 5가지 유형의 포유류 Ig 중쇄, α, δ, ε, γ, 및 μ가 알려져 있으며, 중쇄의 유형은 항체의 클래스(동종형)를 정의한다. 본 발명의 항체는 임의의 클래스(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, 및 IgA), 및 하위클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)의 것일 수 있다. 중쇄는 가변 영역(VH)만을 포함하거나, 또는 가변 영역 및 불변 영역(CH)을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법에 따라 변형된 항체는 2개의 경쇄(L 사슬)를 추가로 포함할 수 있다. 중쇄와 마찬가지로, 경쇄(즉, 람다(λ) 및 카파(κ) 경쇄)는 가변 영역(VL)만을 포함하거나, 또는 가변 영역 및 불변 영역(CL)을 포함할 수 있다.
다른 실시 형태에서, 항체는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역이 함께 융합되어 형성된 단일쇄 가변 도메인 항체(scFv) 또는 Fc 부분을 갖는 단일쇄 가변 도메인(즉, scFv-Fc, 예를 들어 미니항체)을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 항체 단편은 이가 또는 2가 단일쇄 가변 단편인데, 이는 2개의 scFv를, 탠덤(tandem)으로(즉, 탠덤 scFv) 또는 이들이 이량체화되어 다이아바디(diabody)를 형성하도록, 함께 연결시킴으로써 조작된 것이다. 또 다른 실시 형태에서, 항체는 3가 단일쇄 가변 단편인데, 이는 3개의 scFv를, 탠덤으로 또는 삼량체 형성으로 트라이아바디(triabody)를 형성하도록, 함께 연결시킴으로써 조작된 것이다. 다른 실시 형태에서, 항체는 테트라바디(tetrabody) 단일쇄 가변 단편이다. 다른 실시 형태에서, 항체는 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fd 세그먼트(VH-CH1-VH-CH1)를 포함하는 항체인 "선형 항체"이다(문헌[Zapata et al. Protein Eng. 8(10): 1057-1062 (1995)] 참조, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨).
본 명세서에 기재된 방법은 또한 키메라 항체(즉, 중쇄 및 경쇄 각각의 아미노산 서열의 일부분이 특정 종으로부터 유래되거나 특정 클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 상동성이며, 한편 각각의 사슬의 나머지 세그먼트는 다른 종 또는 클래스 내의 상응하는 서열과 상동성인 항체), CDR-그래프팅된 항체(즉, 하나의 종의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하며, CDR 영역들 중 하나 이상이 다른 종의 CDR 영역으로 대체된 항체), 및 인간화 항체의 등전점을 변형시키는 데 적합하다.
본 명세서에 개시된 방법에 따른 변형에 적합한 항체는 바람직하게는 상기에 기재된 바와 같은 인간 항체 또는 인간화 항체(완전 또는 부분 인간화)이다. 대안적으로, 항체는 동물 항체, 예컨대 제한 없이, 조류 항체, 상어 항체, 고래 항체, 또는 포유동물 항체일 수 있으며, 이때 포유동물 항체에는 비영장류 항체(예를 들어, 소, 돼지, 낙타, 라마, 말, 염소, 토끼, 양, 햄스터, 기니 피그, 고양이, 개, 래트, 마우스 등) 또는 비인간 영장류 항체(예를 들어, 원숭이, 침팬지 등)이 포함된다.
본 명세서에 기재된 방법은 항체의 등전점을 변형시키는 단계를 포함한다. 항체의 등전점(pI)은 항체가 순전하(net electrical charge)를 갖지 않는 pH이다. 항체 또는 임의의 폴리펩티드의 등전점은 그의 아미노산 조성에 의해 결정된다. 예를 들어, 다수의 염기성 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩티드는 높은 pI를 갖는 반면, 다수의 산성 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩티드는 낮은 pI를 가질 것이다. 따라서, 본 발명의 방법은 항체의 아미노산 조성을 변형시켜 그의 pI를 변형시키는 단계를 포함한다. 더 구체적으로는, 본 명세서에 기재된 방법은 항체의 적어도 하나의 중쇄 가변 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변형시켜 항체의 pI를 변형시키는 단계를 포함한다.
항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 조성은 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환에 의해 변형될 수 있다. 아미노산 "치환"은 폴리펩티드 서열 내의 특정 위치에 있는 아미노산 잔기를 상이한 아미노산으로 대체하는 것을 포함한다. 일 실시 형태에서, 치환은, 해당 유기체 내에서 또는 어떠한 유기체에서도 천연적으로 발생하지 않는, 특정 위치에서 천연적으로 발생하지 않는 아미노산 잔기의 치환을 포함한다. 대안적으로, 하나 이상의 치환은 동일한 유기체 내의 유사한 관련 폴리펩티드의 서열에서 빈번하게 발생하는 잔기인 아미노산 잔기, 예를 들어 동일한 종으로부터의 다른 항체로부터의 서열에서 빈번하게 발생하는 보존된 아미노산 잔기일 수 있다. 동일한 종으로부터의 천연 발생 서열, 예를 들어 인간 서열로부터의 보존된 잔기로의 치환은 하나 이상의 치환을 갖는 폴리펩티드에 대한 증가된 항원성의 가능성을 감소시킬 수 있다. 게다가, 동일한 유기체 내의 관련 폴리펩티드로부터의 서열과 대비하여 전하의 보존(예를 들어, 비교적 더 높은 빈도의 동일한 양으로 하전된, 음으로 하전된, 또는 비하전된 종)이 또한 치환을 위한 아미노산 잔기 선택을 행하는 데 있어서 고려된다. 전하에 대한 이러한 고려는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 항체의 구조 및/또는 안정성을 유지하는 데 영향을 미칠 수 있다. 항체의 pI를 변형시킬 목적으로, 아미노산 치환은 양전하 또는 음전하를 갖는 아미노산 잔기를 중성 전하를 갖는 아미노산 잔기로 치환하는 것을 포함하거나 또는 그 반대의 경우도 포함한다. 예시적인 치환은 하기를 포함하지만 이로 한정되지 않는다: (1) pl를 증가시키기 위하여, 양으로 하전된 아미노산의 중성으로 하전된 아미노산으로의 치환; (2) pl를 증가시키기 위하여, 중성으로 또는 양으로 하전된 아미노산의 음으로 하전된 아미노산으로의 치환; (3) pl를 감소시키기 위하여, 음으로 하전된 아미노산의 중성으로 하전된 아미노산으로의 치환; 및 (4) pl를 감소시키기 위하여, 양으로 하전된 아미노산의 중성으로 또는 음으로 하전된 아미노산으로의 치환.
아미노산 "결실"은 항체의 등전점을 변형시키기 위하여 하나 이상의 아미노산 잔기를 제거하는 것을 포함하는 반면, 아미노산 "삽입"은 항체의 등전점을 변형시키기 위하여 하나 이상의 아미노산 잔기를 부가하는 것을 포함한다. 예시적인 결실은 pI를 증가시키기 위하여 음으로 하전된 아미노산 잔기를 결실시키는 것 또는 pI를 감소시키기 위하여 양전하 아미노산 잔기를 결실시키는 것을 포함한다. 적합한 아미노산 부가는 항체의 pI를 증가시키기 위하여 양성 아미노산 잔기를 부가하는 것 또는 항체의 pI를 감소시키기 위하여 음성 아미노산 잔기를 부가하는 것을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.
양전하를 갖는 것으로 당업계에 알려진 아미노산 잔기는, 제한 없이, 염기성 측쇄, 예를 들어 라이신(K), 아르기닌(R), 및 히스티딘(H)을 갖는 것들을 포함한다. 음전하를 갖는 것으로 당업계에 알려진 아미노산 잔기는, 제한 없이, 산성 측쇄, 예를 들어 글루탐산(E) 및 아스파르트산(D)을 갖는 것들을 포함한다. 비하전된 측쇄를 갖는 아미노산 잔기는 중성인 것으로 여겨지며, 예를 들어 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 글리신, 프롤린, 알라닌, 발린, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판이다.
그러한 치환, 삽입, 또는 결실은 적어도 하나의 뉴클레오티드를 삽입, 결실, 또는 치환함으로써 변형시키고자 하는 폴리펩티드를 인코딩하는 원래의 핵산 분자를 변형시켜, 관심 아미노산 잔기를 인코딩하는 코돈을 생성하는 유전자 조작 또는 돌연변이생성을 종종 포함한다. 더 구체적으로는, 원래의 아미노산 잔기를 인코딩하는 코돈이 변형에 의해 도입시키고자 하는 아미노산 잔기를 인코딩하는 코돈으로 대체된다. 그러한 핵산 변형은 부위-지향적 돌연변이생성 또는 PCR 돌연변이생성과 같은 잘 알려진 기법을 사용하여 당업자에 의해 수행될 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법에 따르면, 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실은 관심 항체의 중쇄 폴리펩티드들 중 하나 이상에 도입된다. 특히, 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실은 관심 항체의 중쇄 가변 영역에 도입된다. 중쇄의 가변 영역은 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변성 영역으로 세분된다. 중쇄의 가변 영역 내의 3개의 CDR은 가변 영역 각각에 대해 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지정된다. 이들 CDR에는 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 더 보존된 영역들이 산재되어 있다. 이들 FR 영역은 항체의 결합능의 대부분을 담당하는 CDR의 접촉 아미노산 잔기를 적절한 공간 구조로 배치하는 데 있어서 특유하다. 각각의 VH는 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 아미노-말단부터 카르복시-말단까지 하기의 순서대로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 이들 CDR의 정확한 경계는 상이한 체계에 따라 상이하게 정의되어 있다. 중쇄 가변 영역의 잔기를 언급할 때 본 명세서에서 사용되는 카바트에 의해 기재된 체계(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991)], 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨)는 항체의 임의의 가변 영역에 적용가능한 명료한 잔기 넘버링 체계를 제공할 뿐만 아니라, 3개의 CDR을 규정하는 정확한 잔기 경계를 제공한다. 이들 CDR은 카바트 CDR로 지칭된다.
본 명세서에 기재된 방법에 따르면, 항체의 등전점은 항체의 중쇄 가변 영역들 중 적어도 하나에서, 중쇄 가변 영역 내의 위치 7, 9, 11, 14, 41, 70, 74, 82a, 84, 및/또는 113(카바트 넘버링)에 있는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 치환함으로써 변형된다. 변형을 겪는 아미노산 잔기의 수는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 일 실시 형태에서, 하나의 아미노산 치환이 항체의 등전점을 충분히 변형시킨다. 다른 실시 형태에서, 2개의 아미노산 치환이 항체의 등전점을 충분히 변형시킨다. 다른 실시 형태에서, 항체의 등전점을 충분히 변형시키는 데 3개, 또는 4개, 또는 5개, 또는 6개, 또는 7개, 또는 8개, 또는 9개, 또는 10개의 아미노산 치환이 필요하다.
일 실시 형태에서, 위치 7, 9, 11, 14, 41, 74, 84, 및/또는 113(카바트 넘버링)에 있는 VH의 하나 이상의 아미노산 잔기는 중성으로 하전된 아미노산 잔기이며, 치환 단계는 하나 이상의 중성으로 하전된 아미노산 잔기를 하나 이상의 양으로 하전된 아미노산 잔기로 교환하는 것을 포함한다. 이러한 치환은 항체의 등전점을 그의 비변형된 상태의 항체(즉, 모 항체 또는 야생형 항체)와 대비하여 증가시킬 것이다.
다른 실시 형태에서, 위치 7, 9, 11, 14, 41, 74, 84, 및/또는 113(카바트 넘버링)에 있는 VH의 하나 이상의 아미노산 잔기는 음으로 하전된 아미노산 잔기이며, 치환 단계는 상기 하나 이상의 음으로 하전된 아미노산 잔기를 하나 이상의 중성으로 또는 양으로 하전된 아미노산 잔기로 교환하는 것을 포함한다. 이러한 치환은 또한 항체의 등전점을 그의 비변형된 상태의 항체의 등전점과 대비하여 증가시킬 것이다.
추가의 실시 형태에서, 위치 9, 70, 74, 82a, 및 84(카바트 넘버링)에 있는 VH의 하나 이상의 아미노산 잔기는 중성으로 하전된 아미노산 잔기이며, 치환 단계는 상기 하나 이상의 중성으로 하전된 아미노산 잔기를 하나 이상의 음으로 하전된 아미노산 잔기로 교환하는 것을 포함한다. 이러한 치환은 항체의 등전점을 비변형된 모 항체의 등전점과 대비하여 감소시킬 것이다.
또 다른 실시 형태에서, 위치 9, 70, 74, 82a, 및 84(카바트 넘버링)에 있는 VH의 하나 이상의 아미노산 잔기는 양으로 하전된 아미노산 잔기이며, 치환 단계는 상기 하나 이상의 양으로 하전된 아미노산 잔기를 하나 이상의 중성으로 또는 음으로 하전된 아미노산 잔기로 교환하는 것을 포함한다. 이러한 치환은 항체의 등전점을 비변형된 모 항체의 등전점과 대비하여 감소시킬 것이다.
전술된 모든 아미노산 잔기를 반드시 교환할 필요는 없다. 상기 언급된 바와 같이, 아미노산 치환은 중쇄 가변 영역 내의 확인된 잔기들 중 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 또는 10개에 도입될 수 있다. 도입되는 아미노산 치환의 수는 요구되는 등전점의 변화 또는 차이의 크기, 즉 0.1 pH 단위 변화, 0.2 pH 단위 변화, 0.3 pH 단위 변화, 0.4 pH 단위 변화, 0.5 pH 단위 변화, 0.6 pH 단위 변화, 0.7 pH 단위 변화, 0.8 pH 단위 변화, 0.9 pH 단위 변화, 1.0 pH 단위 변화, 또는 1.0 pH 단위 변화 초과에 좌우된다. 변형된 항체의 등전점의 변화 또는 차이는 등전 집속(isoelectric focusing)을 사용하여 관찰될 수 있다. 등전 집속은 단백질들을 그들의 등전점에 의해 분리시키는 전기영동 기법이다. 단백질들이 고정된 pH 구배를 함유하는 고정화된 pH 구배(IPG) 스트립 또는 폴리아크릴아미드 겔(IEF 겔)에 적용될 수 있다. 전기장이 인가되고, 단백질이 pH 구배를 통해 이동하여, 그들이 그들의 특정 pI에 접근함에 따라 pH 구배로 고정화되게 된다. 대안적으로, 유전자 및 아미노산 서열 분석 소프트웨어(GENETYX 등)를 사용하여 이론적 등전점이 결정될 수 있다. 이는, 예를 들어, 모 항체로부터의 이중특이성 항체의 충분한 분리를 위해 등전점의 상당한 변형이 필요할 때 유용하다.
일 실시 형태에서, 치환은 항체의 제1 중쇄 폴리펩티드 또는 제2 중쇄 폴리펩티드 중 적어도 하나에서 위치 74(카바트 넘버링)에 있는 VH 아미노산 잔기를 음으로 하전된 아미노산 잔기로 교환하는 것을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 치환은 항체의 제1 중쇄 폴리펩티드 또는 제2 중쇄 폴리펩티드 중 적어도 하나에서 위치 82a(카바트 넘버링)에 있는 VH 아미노산 잔기를 음으로 하전된 아미노산 잔기로 교환하는 것을 포함한다.
추가의 실시 형태에서, 치환은 항체의 제1 중쇄 폴리펩티드 또는 제2 중쇄 폴리펩티드 중 적어도 하나에서 위치 84(카바트 넘버링)에 있는 VH 아미노산 잔기를 음으로 하전된 아미노산 잔기로 교환하는 것을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 치환은 항체의 제1 중쇄 폴리펩티드 또는 제2 중쇄 폴리펩티드 중 적어도 하나에서 위치 74, 82a, 및 84(카바트 넘버링)로부터 선택되는 위치들 중 적어도 2개의 위치에 있는 VH 아미노산 잔기를 음으로 하전된 아미노산 잔기로 교환하는 것을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 치환은 항체의 제1 중쇄 폴리펩티드 또는 제2 중쇄 폴리펩티드 중 적어도 하나에서 3개의 모든 위치 74, 82a, 및 84(카바트 넘버링)에 있는 VH 아미노산 잔기를 음으로 하전된 아미노산 잔기로 교환하는 것을 포함한다.
본 명세서에 기재된 방법을 수행함에 있어서, 등전점을 변형시키기 위해 항체에 대해 행해진 아미노산 치환은 그의 항원 결합능을 변경시키지 않으며, 즉 변형된 항체는 비변형된 야생형 또는 모 항체의 항원-결합 활성을 보유한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "항원-결합 활성을 보유하는"은 항체가 변형 전의 항체의 항원 결합 활성의 적어도 75%, 적어도 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 즉 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%를 유지하는 것을 의미한다. 항원에 결합하기에 충분한 결합 활성이 항체가 그의 기능을 발휘하도록 보유될 수 있는 한, 생리학적 조건 하에서 37℃에서 결정된 친화도는, 예를 들어 100 nM 이하, 바람직하게는 50 nM 이하, 더 바람직하게는 10 nM 이하, 그리고 더욱 더 바람직하게는 1 nM 이하일 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법에 의해 획득되는 변형된 등전점을 갖는 항체 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드가 항원-결합 활성을 보유하는지의 여부는 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 시험될 수 있는데, 이러한 방법에는 Biacore(분자간 상호작용 분석), 세포 증식 검정, ELISA(효소-결합 면역흡착 검정), EIA(효소 면역검정), RIA(방사면역검정), 및 형광 면역검정과 같은 것이 있지만 이로 한정되지 않는다.
본 명세서에 기재된 방법을 수행함에 있어서, 등전점을 변형시키기 위한 항체에 대해 행해진 아미노산 치환은 항체의 안정성, 예를 들어 그의 입체구조 안정성을 변경시키지 않는다. 다시 말하면, 변형된 항체는 비변형된 야생형 또는 모 항체와 실질적으로 동일한 안정성을 나타낸다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "실질적으로 동일한 안정성"은 변형된 단백질이 25% 미만의 안정성 변화, 20% 미만의 안정성 변화, 15% 미만의 안정성 변화, 10% 미만의 안정성 변화, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만의 안정성 변화를 갖는다는 것을 의미한다. 항체 안정성의 지표로서 측정될 수 있는 파라미터는 풀림(unfolding) 전이 온도, 응집 개시 온도, 및 응집 속도를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 측정될 수 있는 항체 안정성의 다른 파라미터는 시험관내(in vitro) 혈청 안정성, 분해 수준, 생물학적 활성, pH, 색, 투명도, 화학적 안정성, 및 물리적 안정성을 포함한다.
일 실시 형태에서, 변형된 등전점을 갖는 항체는 단일특이성 항체이다. 이러한 실시 형태에 따르면, 각각 모 단일특이성 항체의 중쇄 가변 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 동일하며, 하나 이상의 확인된 아미노산 잔기 위치(즉, 잔기 7, 9, 11, 14, 41, 70, 74, 82a, 84, 및/또는 113)에 대한 동일한 치환이 제1 중쇄 폴리펩티드 및 제2 중쇄 폴리펩티드 둘 모두에서 행해져서 모 항체의 등전점과 상이한 등전점을 갖는 변이 항체를 생성한다.
본 명세서에 기재된 방법은 당업계에 이전에 알려져 있거나 개발될 사실상 임의의 단일특이성 항체의 등전점을 변형시키는 데 이용될 수 있다. 단지 예로서, 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 변형된 단일특이성 항체는 CNTO148로 알려진 TNFα에 결합하는 단일클론 항체이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, CNTO148 항체의 중쇄 가변 영역을 카바트 잔기 74, 82a, 및 84 - 이들은 서열 번호 1(하기에 제시됨)의 잔기 75, 84, 및 88에 각각 상응함 - 에서 변형시켜 그의 등전점을 감소시켰다.
CNTO148 중쇄 가변 영역(C14F1) - 서열 번호 1
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIFSSYAMHWVRQAPGNGLEWVAFMSYDGSNKKYADSVKGRFTISRDN
[S/D]KNTLYLQM[N/D]SLR[A/D]EDTAVYYCARDRGIAAGGNYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
상세하게는, 서열 번호 1의 위치 75에 있는 세린 잔기는 아스파르트산 잔기로 치환하고(S75D), 서열 번호 1의 위치 84에 있는 아스파라긴 잔기는 아스파르트산 잔기로 치환하고(N84D), 서열 번호 1의 위치 88에 있는 알라닌 잔기는 아스파르트산 잔기로 치환하여(A88D) CNTO148 항체의 등전점을 감소시켰다. 이들 아미노산 치환은 CNTO148 항체의 항원 결합 능력에 영향을 미치지 않았다(도 1a, 도 1b 및 도 1c 참조).
본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 변형된 다른 단일특이성 항체는 TIMB337로 알려진 TIM3(CD366)에 결합하는 단일클론 항체이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, TIMB337 항체의 중쇄 가변 영역(TM3H24 HC)을 카바트 잔기 74, 82a, 및 84 - 이들은 서열 번호 2(하기에 제시됨)의 잔기 75, 84, 및 88에 각각 상응함 - 에서 변형시켜 그의 등전점을 감소시켰다. TIMB337은 서열 번호 5의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
TIMB377 중쇄 가변 영역(TM3H24) - 서열 번호 2
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDN[S/D]KNTLYLQM[N/D]SLR[A/D]EDTAVYYCAKSPYAPLDYWGQGTLVTVSS;
TIMB377 경쇄 가변 영역 - 서열 번호 5
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVNDYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQGGHAPITFGQGTKVEIK
상세하게는, 서열 번호 2의 위치 75에 있는 세린 잔기는 아스파르트산 잔기로 치환하고(S75D), 서열 번호 2의 위치 84에 있는 아스파라긴 잔기는 아스파르트산 잔기로 치환하고(N84D), 서열 번호 2의 위치 88에 있는 알라닌 잔기는 아스파르트산 잔기로 치환하여(A88D) TIMB337 항체의 등전점을 감소시켰다. 이들 아미노산 치환은 TIMB337 항체의 항원 결합 능력에 영향을 미치지 않았다(도 15 참조). TIMB337 VH 변이체의 아미노산 서열은 하기에 제시되어 있다.
서열 번호 6: TM3B337 VH의 S75D 변이체
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNDKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSPYAPLDYWGQGTLVTVSS
서열 번호 7: TM3B337 VH의 N84D 변이체
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMDSLRAEDTAVYYCAKSPYAPLDYWGQGTLVTVSS
서열 번호 8: TM3B337 VH의 A88D 변이체
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCAKSPYAPLDYWGQGTLVTVSS
본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 변형된 다른 단일특이성 항체는 PD1B244로 알려진 PD-1(CD279)에 결합하는 단일클론 항체이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, PD1B244 항체의 중쇄 가변 영역(PD1H170 HC)을 카바트 잔기 74, 82a, 및 84 - 이들은 서열 번호 3(하기에 제시됨)의 잔기 75, 84, 및 88에 각각 상응함 - 에서 변형시켜 그의 등전점을 감소시켰다. PD1B2244는 서열 번호 9의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
PD1B244 중쇄 가변 영역 PD1H170 - 서열 번호 3
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDTANYAQKFQGRVTITADE[S/D]TSTAYMEL[S/D]SLR[S/D]EDTAVYYCARPGLAAAYDTGSLDYWGQGTLVTVSS
PD1B244 경쇄 가변 영역 - 서열 번호 9
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRNYWPLTFGQGTKVEIK
상세하게는, 서열 번호 3의 위치 75에 있는 세린 잔기는 아스파르트산 잔기로 치환하고(S75D), 서열 번호 3의 위치 84에 있는 세린 잔기는 아스파르트산 잔기로 치환하고(S84D), 서열 번호 3의 위치 88에 있는 세린 잔기는 아스파르트산 잔기로 치환하여(S88D) PD1B244 항체의 등전점을 감소시켰다. 이들 아미노산 치환은 PD1B244 항체의 항원 결합 능력에 영향을 미치지 않았다(도 18 참조). PD1B244 VH 변이체의 아미노산 서열은 하기에 제시되어 있다.
서열 번호 10: PD1B244 VH의 S75D 변이체
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDTANYAQKFQGRVTITADEDTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGSLDYWGQGTLVTVSS
서열 번호 11: PD1B244 VH의 S84D 변이체
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELDSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGSLDYWGQGTLVTVSS
서열 번호 12: PD1B244 VH의 S88D 변이체
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRDEDTAVYYCARPGLAAAYDTGSLDYWGQGTLVTVSS
다른 실시 형태에서, 변형된 등전점을 갖는 항체는 다중특이성 항체, 예를 들어 이중특이성 항체이다. 이 실시 형태에 따르면, 다중특이성 항체의 중쇄 가변 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 상이하다. 이러한 실시 형태에 따르면, 본 명세서에 개시된 아미노산 치환은 중쇄 가변 영역들 중 단 하나에만 존재할 수 있다. 대안적으로, 아미노산 치환은 중쇄 가변 영역 둘 모두에서 행해질 수 있으며, 이들 치환은 변형 목적에 따라 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 다중특이성 항체의 반감기/제거율(clearance rate)을 변경시키기 위해 등전점 변형이 행해진다면, 항체의 pI를 증가 또는 감소시키기 위해 두 중쇄 가변 영역 모두에서 유사한 치환이 행해질 수 있다. 대안적으로, 항체의 pI를 증가 또는 감소시키기 위해 두 중쇄 가변 영역 모두에서 상이한 아미노산 치환이 행해질 수 있다.
다른 실시 형태에서, 아미노산 치환은 다중특이성 항체, 예를 들어 이중특이성 항체의 단 하나의 중쇄 가변 영역에만 존재한다. 이러한 접근법은 이중특이성 항체가 유사한 pI를 갖는 2개의 모 항체로부터 생성될 때 요구된다. 이중특이성 항체를 생성하기 위해 동일하거나 유사한 등전점을 갖는 2개의 모 항체가 이용되는 경우, 그로부터 생성된 이중특이성 항체를 표준 세포 재조합 및 발현 기법을 사용하여 분리 및 정제하는 것은 심각하게 방해된다. 따라서, 이들 사이의 pI의 차이를 증가시키기 위한 모 항체의 변형은 모 항체로부터 더 용이하게 분리되고 구별될 수 있는 이중특이성 항체의 생성을 가져오며, 그럼으로써 이중특이성 항체 생성의 수율 및 순도를 증가시킬 것이다.
따라서, 본 발명의 다른 태양은 2개의 모 항체로부터의 이중특이성 항체의 분리를 향상시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 제1 모 항체 및 제2 모 항체를 제공하는 단계를 포함하며, 각각의 모 항체는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 상기 방법은, 제1 모 항체 및 제2 모 항체 중 적어도 하나에서, 카바트 넘버링 체계에 따라 위치 7, 9, 11, 14, 41, 70, 74, 82a, 84, 및 113에 있는 중쇄 가변 영역(VH) 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환하는 단계를 추가로 포함하며, 치환은 제2 모 항체와 대비하여 제1 모 항체의 등전점을 증가 또는 감소시킨다. 상기 방법은 상기 치환 후에 2개의 모 항체로부터 이중특이성 항체를 생성하는 단계, 및 2개의 모 항체로부터 생성된 이중특이성 항체를 분리하는 단계를 추가로 포함하며, 2개의 모 항체로부터의 이중특이성 항체의 분리는 상기 치환의 결과로서 향상된다.
이러한 태양에 따르면, 제1 모 항체의 위치 7, 9, 11, 14, 41, 74, 84, 및 113(카바트 넘버링)에 있는 VH 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기가 중성으로 하전된 아미노산 잔기일 때, 이들 아미노산 잔기 중 하나 이상은 하나 이상의 양으로 하전된 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 이러한 치환은 제2 모 항체의 등전점과 대비하여 제1 모 항체의 등전점을 증가시킬 것이다. 대안적으로, 제1 모 항체의 위치 7, 9, 11, 14, 41, 74, 84, 및 113(카바트 넘버링)에 있는 VH 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기가 음으로 하전된 아미노산 잔기인 경우, 아미노산 잔기는 하나 이상의 음으로 하전된 아미노산 잔기를 하나 이상의 중성으로 또는 양으로 하전된 아미노산 잔기로 교환함으로써 치환될 수 있다. 이러한 치환은 또한 제2 모 항체와 대비하여 제1 모 항체의 등전점을 증가시킬 것이다.
다른 실시 형태에서, 제1 모 항체의 위치 9, 70, 74, 82a, 및 84(카바트 넘버링)에 있는 VH 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기가 중성으로 하전된 아미노산 잔기인 경우, 이들 아미노산 잔기 중 하나 이상은 상기 하나 이상의 중성으로 하전된 아미노산 잔기를 하나 이상의 음으로 하전된 아미노산 잔기로 교환함으로써 치환될 수 있다. 이러한 치환은 제2 모 항체와 대비하여 제1 모 항체의 등전점을 감소시킬 것이다. 추가의 실시 형태에서, 제1 모 항체의 위치 9, 70, 74, 82a, 및 84(카바트 넘버링)에 있는 VH 영역의 하나 이상의 아미노산 잔기가 양으로 하전된 아미노산 잔기인 경우, 이들 아미노산 잔기 중 하나 이상은 상기 하나 이상의 양으로 하전된 아미노산 잔기를 하나 이상의 중성으로 또는 음으로 하전된 아미노산 잔기로 교환함으로써 치환될 수 있다. 이러한 치환은 또한 제2 모 항체와 대비하여 제1 모 항체의 등전점을 감소시킬 것이다.
전술된 바와 같이, 제1 모 항체 또는 제2 모 항체에서 변형 또는 치환된 아미노산 잔기의 수는 제한되지 않는다. 일 실시 형태에서, 제2 모 항체와 대비하여 제1 모 항체의 등전점에 있어서 0.1 pH 단위, 0.2 pH 단위, 0.3 pH 단위, 0.4 pH 단위, 또는 0.5 pH 단위, 0.6 pH 단위, 0.7 pH 단위, 0.8 pH 단위, 0.9 pH 단위, 1.0 단위 변화를 야기하는 치환이 행해진다. 다른 실시 형태에서, 제2 모 항체와 대비하여 제1 모 항체의 등전점에 있어서 1.0 pH 단위 변화 초과를 야기하는 치환이 행해진다. 이들 변화는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 치환으로 달성될 수 있다. 전술된 아미노산 잔기 치환은 제1 모 항체 또는 제2 모 항체 중 어느 하나의 VH 영역에서, 또는 대안적으로 제1 모 항체 또는 제2 모 항체 둘 모두에서 수행될 수 있다. 아미노산 치환이 제1 모 항체 및 제2 모 항체 둘 모두에 대해 행해질 때, 제1 모 항체의 VH 영역 내의 하나 이상의 아미노산 치환은 제1 모 항체의 등전점을 감소시킬 것인 반면, 제2 모 항체의 VH 영역 내의 하나 이상의 아미노산 치환은 제2 모 항체의 등전점을 증가시킬 것이다. 제1 모 항체 및 제2 모 항체 둘 모두에 대해 행해지는 아미노산 치환은 동일한 아미노산 잔기 위치에서 행해질 수 있거나(비록 상이한 치환일 수 있을지라도) 상이한 아미노산 잔기 위치에서 행해질 수 있다.
일 실시 형태에서, 제1 모 항체에서 위치 74(카바트 넘버링)에 있는 VH 아미노산 잔기는 음으로 하전된 아미노산 잔기로 교환되어 제2 모 항체와 대비하여 제1 모 항체의 등전점을 감소시킨다.
다른 실시 형태에서, 제1 모 항체에서 위치 82a(카바트 넘버링)에 있는 VH 아미노산 잔기는 음으로 하전된 아미노산 잔기로 교환되어 제2 모 항체와 대비하여 제1 모 항체의 등전점을 감소시킨다.
다른 실시 형태에서, 제1 모 항체에서 위치 84(카바트 넘버링)에 있는 VH 아미노산 잔기는 음으로 하전된 아미노산 잔기로 교환되어 제2 모 항체와 대비하여 제1 모 항체의 등전점을 감소시킨다.
추가의 실시 형태에서, 제1 모 항체에서 위치 74, 82a, 및 84(카바트 넘버링)로부터 선택되는 위치들 중 적어도 2개의 위치에 있는 VH 아미노산 잔기는 음으로 하전된 아미노산 잔기로 교환되어 제2 모 항체와 대비하여 제1 모 항체의 등전점을 감소시킨다.
다른 실시 형태에서, 제1 모 항체에서 3개의 모든 위치 74, 82a, 및 84(카바트 넘버링)에 있는 VH 아미노산 잔기는 음으로 하전된 아미노산 잔기로 교환되어 제2 모 항체와 대비하여 제1 모 항체의 등전점을 감소시킨다.
전술된 바와 같이, 제1 모 항체 및 제2 모 항체의 등전점의 변형은 각각의 모 항체와 상이한 등전점을 갖는 이중특이성 항체의 생성을 가져온다. 따라서, 관심 이중특이성 항체의 분리 및 궁극적으로 회수는 이온 교환 크로마토그래피 방법을 사용하여 유의하게 향상된다.
이중특이성 항체의 제조 방법은 당업계에 알려져 있으며, 본 발명의 방법은 이중특이성 항체의 분리 및 정제를 향상시키기 위해 일반적으로 임의의 이들 알려진 방법에 도입될 수 있다. 전장 이중특이성 항체의 전통적인 생성은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시발현에 기초하며, 여기서 2개의 사슬은 상이한 특이성을 갖는다(문헌[Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983)], 이것은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨). 면역글로불린 중쇄와 경쇄의 무작위 분류 및 재조합의 결과로서, 이들 하이브리도마(쿼드로마(quadroma))는 10개의 상이한 항체 분자들의 잠재적 혼합물을 생성하며, 이들 중 단 하나만이 정확한 이중특이성 구조를 갖는다. 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 모 항체의 등전점의 차이를 증가시킴으로써, 모 항체 및 다른 부산물로부터의 원하는 이중특이성 항체의 분리 및 정제를 유의하게 향상시킬 것이다.
이중특이성 항체를 제조하기 위한 다른 방법은, 제한 없이, "노브(knob) 및 홀(hole)" 기법을 포함하는데, 이 기법은 이종이량체 형성을 유리하게 하고 동종이량체 형성을 불리하게 하는 입체적 영향을 야기하는 아미노산 조작을 포함하는 것으로, 이는, 미국 특허 제8,216,805호(Carter)에 기재된 바와 같으며, 또한 문헌[Ridgway et al., Protein Engineering 9(7): 617 (1996)]; 및 문헌[Atwell et al., J. Mol. Biol. 1997 270:26]을 참조하며, 이들 모두는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 게다가, 문헌[Merchant et al., Nature Biotech. 16:677 (1998)](이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 이들 "노브 및 홀" 돌연변이는 이황화물 결합과 조합되어 이종이량체화를 향해 형성을 편향(skew)시킬 수 있다.
이중특이성 항체를 생성하는 데 사용되는 추가의 기법은 종종 "정전기 스티어링(electrostatic steering)" 또는 "전하쌍"으로 지칭되는 것으로, 이는 문헌[Gunasekaran et al., J. Biol. Chem. 285(25):19637 (2010)]에 기재된 바와 같으며, 이 문헌은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 상기 방법에서, 정전기는 원하는 이종이량체화를 향해 형성을 편향시키는 데 사용된다.
모 항체로부터 이중특이성 항체를 분리하는 것은 당업계에 알려진 표준 분리 기법을 사용하여 행해진다. 예를 들어, 이온-교환 크로마토그래피가 모 항체로부터 이중특이성 항체를 분리하는 데 일반적으로 사용된다. 간략하게 말하면, 모 항체 및 이중특이성 항체의 혼합물이 로딩 완충액을 사용하여 양이온 교환 물질(또는, 대안적으로, 음이온 교환 물질)에 결합되며, 이때 로딩 완충액은 제1 전도도 및 pH에 있다. 양이온 교환 물질을 로딩 완충액보다 더 큰 제2 전도도 및/또는 pH의 중간 완충액으로 세척하여, 이온 교환 물질로부터 오염물(즉, 모 항체)을 용리시키도록 한다. 양이온 교환 물질을 중간 완충액보다 더 작은 제3 전도도 및/또는 pH에 있는 세척 완충액으로 세척하고, 이어서 중간 완충액보다 더 큰 제4 전도도 및/또는 pH에 있는 용리 완충액으로 세척하여, 이온 교환 물질로부터 원하는 이중특이성 항체를 용리시키도록 한다.
이중특이성 항체의 분리 및 정제는 또한 FPLC 및 HPLC와 같은 시스템을 사용하여 대기압에서 또는 고압에서 수행되는 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제/겔 여과 크로마토그래피, 및 역상 크로마토그래피와 같은 다른 크로마토그래피 기법을 사용하여 달성될 수 있다. 정제 방법은 또한 전기영동, 등전 집속, 면역학적, 침전, 투석 및 크로마토그래피 기법을 포함한다. 단백질 농도와 함께 한외여과 및 투석여과 기법이 또한 유용하다. 적합한 정제 기법에서의 일반적인 지침을 위하여, 예를 들어 문헌[Robert Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Ed (Springer-Verlag 1994)]을 참조하며, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
항체의 pI를 증가 또는 감소시키는 데 적합한 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하는 본 명세서에 기재된 항체는 항체의 표면 전하 및 pI를 변형시키는 데 유용한 것으로 이전에 확인된 하나 이상의 추가의 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있는데, 이러한 추가의 아미노산 치환에는 Moore에게 허여된 미국 특허 출원 공개 제20140294823호 및 Igawa et al.에게 허여된 미국 특허 출원 공개 제20090263392호에서 확인된 아미노산 치환이 포함되지만 이로 한정되지 않으며, 이들은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 마찬가지로, 본 명세서에 기재된 항체는 FcγR 결합 및/또는 FcRn 결합과 같은 다양한 추가의 기능성을 변경시키는 것으로 알려진 Fc 영역 내의 추가의 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 최적화된 Fc 변이체는 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 Lazar에게 허여된 미국 특허 제8,188, 231호, Desjarlais et al.에게 허여된 미국 특허 제9,040,041호, 및 Chamberlain et al.에게 허여된 미국 특허 제8,802,820호를 참조하며, 이들 모두는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
전술된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 항체는 단리된 폴리뉴클레오티드, 벡터, 및 숙주 세포를 사용하여 임의의 다양한 기법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 항체는 세포 배양 기법에 의해 생성될 수 있는데, 이러한 기법에는 통상적인 기법을 통해, 또는 항체의 생성을 가능하게 하기 위하여, 적합한 세균 또는 포유류 세포 숙주 내로 항체 유전자, 중쇄 및/또는 경쇄를 형질감염시킴으로써 단일클론 항체를 생성하는 것이 포함되는데, 여기서 항체는 재조합될 수 있다. 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질감염시키고, 형질전환체를 선택하고, 숙주 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 항체를 회수하기 위하여 표준 분자 생물학 기법이 사용된다. 숙주 세포의 형질감염은 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포 내로의 외인성 DNA의 도입을 위해 일반적으로 사용되는 다양한 기법을 사용하여, 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등에 의해 수행될 수 있다. 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포 어느 것에서도 본 명세서에 기재된 항체를 발현시키는 것이 가능하지만, 진핵 세포에서의 항체의 발현이 때때로 바람직하며, 포유류 숙주 세포에서 때때로 바람직한데, 그 이유는, 그러한 진핵 세포(및 특히, 포유류 세포)가 원핵 세포보다 적절하게 접히고 면역학적으로 활성인 항체를 조립하고 분비할 가능성이 더 높기 때문이다.
본 발명의 재조합 항체를 발현시키기 위한 예시적인 포유류 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO 세포)(dhfr-CHO 세포를 포함하며, 이는 문헌[Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216-4220 (1980)]에 기재되어 있으며, 이 문헌은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨)를 포함한다. 다른 적합한 포유류 숙주 세포는, 제한 없이, NS0 골수종 세포, COS 세포, 및 SP2 세포를 포함한다. 항체 유전자를 인코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주 세포 내로 도입될 때, 항체는 숙주 세포에서의 항체의 발현 또는, 더 바람직하게는, 숙주 세포가 성장되는 배양 배지 내로의 항체의 분비를 가능하게 하기에 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생성된다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생성되는 변형된 등전점을 갖는 항체에 관한 것이다. 전술된 바와 같이, 사실상 임의의 항체의 등전점은, 항체가 가변 중쇄 영역을 함유하는 한, 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 변형될 수 있다.
본 발명의 제4 태양은 중쇄 가변 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 다중특이성 항체에 관한 것이며, 제1 폴리펩티드의 등전점은 제1 폴리펩티드의 중쇄 가변 영역의 위치 9, 70, 74, 82a, 및 84(카바트 넘버링)에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기가 중성으로 또는 음으로 하전된 아미노산 잔기를 포함하고, 제2 폴리펩티드의 중쇄 가변 영역의 상응하는 위치에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기가 제1 폴리펩티드와 대비하여 차별적으로 하전된 아미노산 잔기를 포함한 것의 결과로서 제2 폴리펩티드의 등전점보다 더 낮다.
항체의 생성 방법뿐만 아니라 아미노산 치환을 행하는 방식이 전술되어 있다. 일 실시 형태에서, 제1 폴리펩티드의 위치 9, 70, 74, 82a 및 84에 있는 중성으로 또는 음으로 하전된 아미노산 잔기는 아미노산 치환에 의해 제1 폴리펩티드 내로 도입된다.
본 발명의 이러한 태양에 따르면, 본 명세서에 개시된 예시적인 이중특이성 항체는 TNFα 및 αVβ3에 결합하는 항체이다. 본 항체는 그의 경쇄와 함께 TNFα에 결합하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드를 갖는다(CNTO148). 이러한 제1 중쇄 폴리펩티드의 등전점은 항체의 제2 중쇄 폴리펩티드의 등전점보다 더 낮은데, 이때 제2 중쇄 폴리펩티드는 그의 경쇄와 함께 αVβ3에 결합한다.
일 실시 형태에서, 제1 폴리펩티드 중쇄 가변 영역은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하며, (카바트 잔기 74에 상응하는) 위치 75에 있는 잔기는 음으로 하전된 아미노산 잔기, 예컨대 아스파르트산 잔기이다(CNTO148 S75D). 대안적으로, 중쇄 가변 영역은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하며, (카바트 잔기 82a에 상응하는) 위치 84에 있는 아미노산 잔기는 음으로 하전된 아미노산 잔기, 예컨대 아스파르트산 잔기이다(CNTO148 N84D). 또 다른 실시 형태에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하며, (카바트 잔기 84에 상응하는) 위치 88에 있는 아미노산 잔기는 음으로 하전된 아미노산 잔기, 예컨대 아스파르트산 잔기이다(CNTO148 A88D).
또 다른 실시 형태에서, 중쇄 가변 영역은 이중특이성 항체의 pI를 감소시키는 하나 초과의 아미노산 치환을 포함한다. 특히, 일 실시 형태에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하며, (카바트 잔기 82a 및 84에 상응하는) 위치 84 및 88에 있는 아미노산 잔기는 음으로 하전된 아미노산 잔기, 예컨대 아스파르트산 잔기이다(CNTO148 N84D 및 A88D). 다른 실시 형태에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하며, (카바트 잔기 74 및 84에 상응하는) 위치 75 및 88에 있는 아미노산 잔기는 음으로 하전된 아미노산 잔기, 예컨대 아스파르트산 잔기이다(CNTO148 S75D 및 A88D). 다른 실시 형태에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하며, (카바트 잔기 74 및 82a에 상응하는) 위치 75 및 84에 있는 아미노산 잔기는 음으로 하전된 아미노산 잔기, 예컨대 아스파르트산 잔기이다(CNTO148 S75D 및 N84D). 또 다른 실시 형태에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하며, (카바트 잔기 74, 82a, 및 84에 상응하는) 위치 75, 84, 및 88에 있는 아미노산 잔기는 음으로 하전된 아미노산 잔기, 예컨대 아스파르트산 잔기이다(CNTO148 S75D, N84D, 및 A88D).
상기에 나타낸 바와 같이, 이러한 예시적인 이중특이성 항체는 그의 경쇄와 함께 αVβ3에 결합하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 갖는다. 이러한 제2 폴리펩티드는 서열 번호 4(하기에 제시됨)의 아미노산 서열을 갖는, CNTO95 항체의 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일 실시 형태에서, 이러한 중쇄 가변 영역의 위치 7, 9, 11, 14, 41, 74, 84, 및 113에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기는 중성으로 또는 양으로 하전된 아미노산 잔기를 포함하도록 치환된다.
CNTO95 중쇄 가변 영역(C95H22) - 서열 번호 4
QVQLVESGGGVVQPGRSRRLSCAASGFTFSRYTMHWVRQAPGKGLEWVAVISFDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSENTLYLQVNILRAEDTAVYYCAREARGSYAFDIWGQGTMVTVSS
본 명세서에 개시된 다른 예시적인 이중특이성 항체는 TIM3(CD366) 및 PD-1(CD279)에 결합하는 항체이다. 본 항체는 그의 경쇄와 함께 TIM3에 결합하는 가변 영역을 갖는 중쇄(TM3H24)를 포함하는 제1 폴리펩티드를 갖는다. 일 실시 형태에서, 이러한 제1 중쇄 폴리펩티드의 등전점은 항체의 제2 중쇄 폴리펩티드의 등전점보다 더 낮은데, 이때 제2 중쇄 폴리펩티드는 그의 경쇄와 함께 PD-1에 결합한다. 이러한 실시 형태에 따르면, 이러한 중쇄 가변 영역은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하며, (카바트 잔기 74에 상응하는) 위치 75에 있는 잔기는 음으로 하전된 아미노산 잔기, 예컨대 아스파르트산 잔기이다(TM3H24 S75D). 대안적으로, 중쇄 가변 영역은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하며, (카바트 잔기 82a에 상응하는) 위치 84에 있는 아미노산 잔기는 음으로 하전된 아미노산 잔기, 예컨대 아스파르트산 잔기이다(TM3H24 N84D). 또 다른 실시 형태에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하며, (카바트 잔기 84에 상응하는) 위치 88에 있는 아미노산 잔기는 음으로 하전된 아미노산 잔기, 예컨대 아스파르트산 잔기이다(TM3H24 A88D).
대안적으로, 경쇄와 함께 PD-1에 결합하는 가변 영역을 갖는 중쇄(PD1H170)를 포함하는 제2 폴리펩티드는 TM3H24 중쇄의 pI와 대비하여, 그리고 이중특이성 항체의 pI에 비하여 그의 pI를 낮추도록 변형된다. 이러한 실시 형태에 따르면, 이러한 PD1H170 중쇄 가변 영역은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하며, (카바트 잔기 74에 상응하는) 위치 75에 있는 잔기는 음으로 하전된 아미노산 잔기, 예컨대 아스파르트산 잔기이다(PD1H170 S75D). 대안적으로, 중쇄 가변 영역은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하며, (카바트 잔기 82a에 상응하는) 위치 84에 있는 아미노산 잔기는 음으로 하전된 아미노산 잔기, 예컨대 아스파르트산 잔기이다(PD1H170 S84D). 또 다른 실시 형태에서, 중쇄 가변 영역은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하며, (카바트 잔기 84에 상응하는) 위치 88에 있는 아미노산 잔기는 음으로 하전된 아미노산 잔기, 예컨대 아스파르트산 잔기이다(PD1H170 S88D).
본 발명의 다른 태양은 중쇄 가변 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 다중특이성 항체에 관한 것이며, 제1 폴리펩티드의 등전점은 제1 폴리펩티드의 중쇄 가변 영역의 위치 7, 9, 11, 14, 41, 74, 84, 및 113(카바트 넘버링)에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기가 중성으로 또는 양으로 하전된 아미노산 잔기를 포함하고, 제2 폴리펩티드의 중쇄 가변 영역의 상응하는 위치에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기가 제1 폴리펩티드와 대비하여 차별적으로 하전된 아미노산 잔기(즉, 각각 음으로 또는 중성으로 하전된 아미노산 잔기)를 포함한 것의 결과로서 제2 폴리펩티드의 등전점보다 더 높다.
일 실시 형태에서, 제2 폴리펩티드의 중쇄 가변 영역의 위치 9, 70, 74, 82a, 및 84(카바트 넘버링)에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기는 중성으로 또는 음으로 하전된 아미노산 잔기를 포함하고, 제1 폴리펩티드의 중쇄 가변 영역의 상응하는 위치에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기는 제1 폴리펩티드와 대비하여 차별적으로 하전된 아미노산 잔기(즉, 각각 음으로 또는 중성으로 하전된 잔기)를 포함한다.
일 실시 형태에서, 제1 중쇄 폴리펩티드의 위치 7, 9, 11, 14, 41, 74, 84, 및 113 중 하나 이상의 위치에 있는 중성으로 또는 양으로 하전된 아미노산 잔기는 아미노산 치환에 의해 제1 폴리펩티드 내로 도입된다. 마찬가지로, 제2 중쇄 폴리펩티드 내의 하나 이상의 중성으로 또는 음으로 하전된 아미노산 잔기는 아미노산 치환에 의해 제2 폴리펩티드 내로 도입된다.
본 발명은 또한 서열 번호 6, 7 또는 8의 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 5의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항-TIM3 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 서열 번호 6의 VH 및 서열 번호 5의 VL을 포함하는 항-TIM3 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 서열 번호 7의 VH 및 서열 번호 5의 VL을 포함하는 항-TIM3 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 서열 번호 8의 VH 및 서열 번호 5의 VL을 포함하는 항-TIM3 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 서열 번호 10, 11 또는 12의 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 9의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항-PD-1 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 서열 번호 10의 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 9의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항-PD-1 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 서열 번호 11의 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 9의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항-PD-1 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 서열 번호 12의 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 9의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항-PD-1 항체를 제공한다.
본 발명은 또한 이중특이성 PD1xTIM3 항체를 제공하며, 상기 이중특이성 PD1xTIM3 항체는 PD-1에 결합하는 제1 도메인 및 TIM3에 결합하는 제2 도메인을 포함하며, 제1 도메인은 서열 번호 10, 11 또는 12의 VH 및 서열 번호 9의 VL을 포함하고, 제2 도메인은 서열 번호 6, 7 또는 8의 VH 및 서열 번호 5의 VL을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 항-PD-1, 항-TIM3 또는 이중특이성 PD-1xTIM3 항체는 IgG1 동종형이다. 일부 실시 형태에서, 항-PD-1, 항-TIM3 또는 이중특이성 PD-1xTIM3 항체는 IgG2 동종형이다. 일부 실시 형태에서, 항-PD-1, 항-TIM3 또는 이중특이성 PD-1xTIM3 항체는 IgG3 동종형이다. 일부 실시 형태에서, 항-PD-1, 항-TIM3 또는 이중특이성 PD-1xTIM3 항체는 IgG4 동종형이다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 항체 Fc 내에, Fc 수용체(FcR)에 대한 항체 결합을 조절하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시 형태에서, FcR은 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIII 또는 FcRn이다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 S228P 돌연변이를 포함한다.
예시적인 IgG4 불변 도메인이 서열 번호 13(S228P 돌연변이를 갖는 IgG4)에 제시되어 있다.
서열 번호 13
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
이중특이성 PD-1/TIM3 항체는, 2개의 단일특이성 동종이량체성 항체의 CH3 영역 내에 비대칭 돌연변이를 도입시키고, 이황화물 결합 이성질화를 가능하게 하는 환원성 조건에서 2개의 모 단일특이성 동종이량체성 항체로부터 이중특이성 이종이량체성 항체를 형성함으로써 무세포 환경에서 시험관내에서 생성될 수 있는데, 이는 국제 특허 출원 공개 WO2011/131746호에 기재된 방법에 따른 것이다. 이들 방법에서, 제1 단일특이성 2가 항체 및 제2 단일특이성 2가 항체는 CH3 도메인에서 이종이량체 안정성을 촉진하는 소정의 치환을 갖도록 조작되며; 이들 항체는 힌지 영역 내의 시스테인이 이황화물 결합 이성질화를 거칠 수 있게 하기에 충분한 환원성 조건 하에서 함께 인큐베이션되고; 그럼으로써 Fab 아암 교환에 의해 이중특이성 항체를 생성한다. 사용될 수 있는 치환은 IgG1 항체에서 하나의 중쇄 내의 F405L 및 다른 하나의 중쇄 내의 K409R이다. IgG4 항체에서는, 하나의 야생형 중쇄 및 다른 하나의 중쇄 내의 F405L/R409K 돌연변이가 사용될 수 있다. 인큐베이션 조건은 비환원성 상태로 최적으로 회복될 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 환원제는 2-메르캅토에틸아민(2-MEA), 다이티오트레이톨(DTT), 다이티오에리트리톨(DTE), 글루타티온, 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP), L-시스테인 및 베타-메르캅토에탄올이다. 예를 들어, pH 5 내지 8에서, 예를 들어 pH 7.0에서 또는 pH 7.4에서 적어도 25 mM 2-MEA의 존재 하에서 또는 적어도 0.5 mM 다이티오트레이톨의 존재 하에서 20℃ 이상의 온도에서 90분 이상 동안의 인큐베이션이 사용될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 항-PD-1, 항-TIM3 및 이중특이성 PD-1xTIM3 항체는 길항적 항체이다. 본 명세서에 제공된 길항적 항체에 의해 유도된 전형적인 생물학적 활성은 항원-특이적 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 활성화이다. 본 명세서에 제공된 항체의 길항적 성질, 예컨대 항원-특이적 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 의한 인터페론-γ(IFN-γ), IL-17 IL-2, IL-6, IL-22, IL-23 또는 GM-CSF의 향상된 증식 또는 향상된 생성을 평가하기 위해 다양한 판독치가 사용될 수 있다. 예시적인 검정에서는, 동종이계 수지상 세포 또는 특이적 항원, 예컨대 파상풍 톡소이드 또는 CMV에 의해 자극된, 정상 공여자로부터의 T 세포에 대한 항체의 효과가 사용된다. 이러한 설정에서, 항체 처리에 의한 T 세포 작용의 변화는 상층액 사이토카인 수준 또는 T 세포 활성화의 마커를 측정함으로써 검출할 수 있다. 예시적인 검정에서는, CMV 항원에 반응성인 것으로 결정된 PBMC가 항원-특이적 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 공급원으로서 사용된다. 1.5 × 106개의 세포/ml 또는 2 × 106개의 세포/ml의 CMV-반응성 PBMC를 배양 플레이트 상에 플레이팅하고, 0.1 내지 0.2 ㎍/ml의 CMV 펩티드를 배양물에 첨가한다. CMV 펩티드는, 예를 들어 JPT Technologies로부터 구매될 수 있다. 시험 항체를 10 ㎍/ml의 단회 용량으로 첨가하고, 플레이트를 6일 동안 인큐베이션하고, 1 μCi/웰 메틸-3H-티미딘(PerkinElmer)을 6시간 동안 첨가함으로써 세포 증식을 평가하고, 각각의 샘플에서 방사능을 측정한다. 대안적으로, 세포에 의한 사이토카인 생성이 ELISA 또는 알려진 멀티플렉스 검정을 사용하여 측정된다. "길항제" 또는 "길항적"은 PD-1, TIM-3 또는 둘 모두에 결합 시에 PD-1 및/또는 TIM-3 리간드에 의해 매개되는 적어도 하나의 생물학적 활성을 억제하는 항체를 지칭한다. 항체는, 적어도 하나의 생물학적 활성이, 길항제의 부재 하에서보다(예를 들어, 음성 대조군)보다 적어도 약 20%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 초과로 억제될 때, 또는 그러한 억제가 길항제의 부재 하에서의 억제에 비하여 통계학적으로 유의할 때, 길항제이다. 예시적인 TIM-3 리간드는 갈렉틴-9 이다. PD-L1은 PD-1에 대한 리간드이다.
본 발명은 또한 본 발명의 항-PD-1, 항-TIM3 및 이중특이성 PD-1xTIM3 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 치료적 용도를 위하여, 본 발명의 항체는 약제학적으로 허용되는 담체 중에 활성 성분으로서 항체의 유효량을 함유하는 약제학적 조성물로서 제조될 수 있다. "담체"는 본 발명의 항체와 함께 투여되는 희석제, 애쥬번트(adjuvant), 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 그러한 비히클은 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 낙화생유, 대두유, 광유, 참기름 등을 포함하는, 물 및 오일과 같은 액체일 수 있다. 예를 들어, 0.4% 염수 및 0.3% 글리신이 사용될 수 있다. 이들 용액은 무균성이고 일반적으로 미립자 물질이 없다. 이들은 통상적인 잘 알려진 멸균 기법(예를 들어, 여과)에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 pH 조정제 및 완충제, 안정제, 증점제, 윤활제 및 착색제 등과 같은 생리학적 조건에 근접시키기 위하여 필요한 약제학적으로 허용되는 보조 물질을 함유할 수 있다. 그러한 약제학적 제형에서 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 농도는 약 0.5 중량% 미만부터, 통상 적어도 약 1 중량%까지, 많게는 15 또는 20 중량%까지 변동될 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식에 따라, 필요 용량, 유체 부피, 점도 등에 기초하여 주로 선택될 수 있다. 다른 인간 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민을 포함하는 적합한 비히클 및 제형이, 예를 들어 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092, 특히 pp. 958-989 참조]에 기재되어 있다.
본 발명의 항체는 시험관내 및 생체내(in vivo) 진단적 유용성뿐만 아니라, 치료적 및 예방적 유용성을 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 다양한 장애, 예컨대 암 및 염증성 장애를 치료, 예방, 및/또는 진단하기 위해 대상체에게 투여되거나, 또는 시험관내 또는 생체외(ex vivo)에서 배양 중인 세포에 투여될 수 있다.
본 발명은 대상체에서 면역 반응을 향상시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 면역 반응을 변형시키기에 충분한 시간 동안 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
"면역 반응"은 T 세포 매개 및/또는 B 세포 매개 면역 반응을 포함한다. 예시적인 면역 반응은 T 세포 반응, 예를 들어 사이토카인 생성 및 세포성 세포독성을 포함한다. 게다가, 용어 면역 반응은 T 세포 활성화에 의해 간접적으로 영향을 받는 면역 반응, 예를 들어 항체 생성(체액성 반응) 및 사이토카인 반응성 세포, 예를 들어 대식세포의 활성화를 포함한다.
"향상시키다" 또는 "향상시키는" 또는 "상향조절하다" 또는 "상향조절하는"은 치료 또는 화합물의 부재 하에서의 대상체에서의 반응의 수준과 비교하여, 그리고/또는 달리 동일하지만 처리되지 않은 대상체에서 반응의 수준과 비교하여 대상체에서의 면역 반응의 수준의 검출가능한 증가를 지칭한다.
일부 실시 형태에서, 대상체는 인간 환자이다.
본 발명의 항체는 면역 반응, 예컨대 T-세포 매개 면역 반응을 증강시킴으로써 치료될 수 있는 장애를 갖는 대상체를 치료하기에 적합하다.
일부 실시 형태에서, 대상체는 암 또는 바이러스성 감염을 가진다.
본 발명은 또한 암을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 암을 치료하기에 충분한 시간 동안 본 명세서에 제공된 단리된 항체 또는 항원-결합 단편의 치료적 유효량을 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
"치료하다" 또는 "치료"는 치료적 치료 및 예방학적 또는 예방적 조치 둘 모두를 지칭하며, 여기서 목적은 원치 않는 생리학적 변화 또는 장애를 예방 또는 둔화(감퇴)시키는 것이다. 유익하거나 원하는 임상 결과는, 검출가능하든 검출 불가능하든 어느 것이든 간에, 증상의 경감, 질병 정도의 저하, 안정화된(즉, 악화되지 않는) 질병 상태, 질병 진행의 지연 또는 감속, 질병 상태의 개선 또는 고식, 및 관해(부분 또는 전체 어느 것이든)를 포함한다. "치료"는 또한 대상체가 치료를 받지 않고 있을 경우에 예상되는 생존과 비교할 때 연장되는 생존을 의미할 수 있다. 치료가 필요한 자들은 이미 질환 또는 장애를 가진 자들뿐만 아니라 질환 또는 장애를 갖기 쉬운 자들 또는 질환 또는 장애가 예방되어야 하는 자들을 포함한다.
"치료적 유효량"은 필요한 투여량에서 그리고 필요한 시간 동안 원하는 치료 결과를 달성하는 데 유효한 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 개체의 질병 상태, 연령, 성별, 및 체중, 그리고 치료제 또는 치료제들의 병용물이 개체에서 원하는 반응을 유도하는 능력과 같은 인자들에 따라 변동될 수 있다. 효과적인 치료제 또는 치료제들의 병용물의 예시적인 지표는, 예를 들어 환자의 개선된 웰빙(well-being)을 포함한다.
암은 과증식성 질환 또는 장애, 고형 종양, 혈액학적 악성종양, 연조직 종양, 또는 전이성 병변일 수 있다.
"암"은 조직병리학적 유형 또는 침습성의 병기와 무관하게 모든 유형의 암성 성장 또는 발암성 과정, 전이성 조직 또는 악성종양으로 변환된 세포, 조직, 또는 기관을 포함하는 것으로 의미된다. 암의 예에는 고형 종양, 혈액학적 악성종양, 연조직 종양, 및 전이성 병변이 포함된다. 예시적인 고형 종양은 다양한 기관계(organ system)의 악성종양, 예를 들어 육종, 및 암종(선암종 및 편평 세포 암종을 포함함), 예컨대 간, 폐, 유방, 림프계, 위장(예를 들어, 결장), 비뇨생식관(예를 들어, 신세포, 요로 세포), 전립선 및 인두를 침범한 것들을 포함한다. 선암종은 악성종양, 예컨대 대부분의 결장암, 직장암, 신세포 암종, 간암, 폐의 비소세포 암종, 소장의 암, 및 식도의 암을 포함한다. 편평 세포 암종은, 예를 들어 폐, 식도, 피부, 두경부 영역, 구강, 항문, 및 자궁경부 내의 악성종양을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 암은 흑색종이다.
암의 전이성 병변이 또한 본 명세서에 기재된 본 발명의 방법 및 항체를 사용하여 치료 또는 예방될 수 있다.
본 발명의 항체를 사용하여 성장이 억제 또는 감소될 수 있는 예시적인 암은 면역요법에 반응성일 수 있는 암을 포함한다. 그러한 예시적인 암은 흑색종, 신장암, 전립선암, 유방암, 결장암, 위장암, 위암, 식도암, 폐암, 전이성 악성 흑색종, 투명 세포 암종, 호르몬 불응성 전립선 선암종, 비소세포 폐암 또는 두경부의 암을 포함한다. 본 명세서에 기재된 본 발명의 항체를 사용하여 불응성 또는 재발성 악성종양이 치료될 수 있다.
본 발명의 항체로 치료될 수 있는 예시적인 다른 암은 항문암, 기저 세포 암종, 담도암, 방광암, 골암, 뇌 및 CNS 암, 나팔관의 암종, 질의 암종, 외음부의 암종, 피부 또는 안내(intraocular)의 악성 흑색종, 위-식도암, 고환암, 난소암, 췌장암, 직장암, 자궁암, 원발성 CNS 림프종; 중추신경계(CNS)의 신생물, 자궁경부암, 융모막암종, 결장암, 결합조직암, 소화계의 암, 자궁내막암, 안암; 상피내 신생물, 콩팥암, 후두암, 간암; 소세포 폐암, 신경모세포종, 구강암(예를 들어, 입술, 혀, 입, 및 인두), 비인두암, 망막모세포종, 횡문근육종, 호흡계의 암, 육종, 갑상선암, 비뇨계의 암, 간암종, 항문 영역의 암, 나팔관의 암종, 질의 암종, 음문의 암종, 소장의 암, 내분비계의 암, 부갑상선의 암, 부신의 암, 연조직의 육종, 요도의 암, 음경의 암, 유년기의 고형 종양, 종양 혈관신생, 척추 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 머켈 세포암, 유표피암, 편평 세포암, 석면에 의해 유도되는 것들을 포함한 환경적으로 유도된 암뿐만 아니라 다른 암종 및 육종, 및 상기 암의 조합이다.
본 발명의 항체로 치료될 수 있는 예시적인 혈액학적 악성종양은 백혈병, 림프종, 및 골수종, 예컨대 전구체 B-세포 림프아구성 백혈병/림프종 및 B-세포 비호지킨 림프종, 급성 전골수구성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병(ALL), B-세포 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소림프구성 림프종(SLL), B-세포 급성 림프구성 백혈병, B-세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 외투 세포 림프종(MCL), 저분화도, 중간 분화도, 및 고분화도 여포성 림프종(FL)을 포함한 여포성 림프종, 피부 여포 중심 림프종, 변연부 B-세포 림프종(MALT 유형, 림프절 및 비장 유형), 털세포 백혈병, 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL), 버킷 림프종(BL), 형질세포종, 다발성 골수종(MM), 형질 세포 백혈병, 이식후 림프증식성 장애, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 형질 세포 장애, 역형성 대세포 림프종(ALCL), T-세포 급성 림프구성 백혈병, 원발성 전신성 아밀로이드증(예를 들어 경쇄 아밀로이드증), 전림프구성/골수구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 대과립 림프구성(LGL) 백혈병, NK-세포 백혈병, 및 호지킨 림프종을 포함한다.
"형질 세포 장애"는 클론성 형질 세포를 특징으로 하는 장애를 지칭하고, 다발성 골수종, 경쇄 아밀로이드증 및 발덴스트롬 거대글로불린혈증을 포함한다. 경쇄 아밀로이드증 및 발덴스트롬 거대글로불린혈증은 독립적으로 다발성 골수종으로부터 야기될 수 있다. 이들은 또한 다발성 골수종과 동시에 존재할 수 있고, 다발성 골수종의 발생 전이나 후에 발생될 수 있다.
예시적인 B-세포 비호지킨 림프종은 림프종양 육아종증, 원발성 삼출액 림프종, 혈관내 대 B-세포 림프종, 종격 대 B-세포 림프종, 중쇄 질병(γ, μ, 및 a 질병을 포함함), 면역억제제를 사용하는 요법에 의해 유도된 림프종, 예컨대 사이클로스포린-유도 림프종, 및 메토트렉세이트-유도 림프종이다.
PD-L1을 발현시키는 전이성 암을 포함한 암을 가진 환자를 본 발명의 항체로 치료할 수 있다. 암은 흑색종, 신세포 암종, 편평 비소세포 폐암(NSCLC), 비편평 NSCLC, 결직장암, 거세-저항성 전립선암, 난소암, 위장암, 선암종(ACA), 편평 세포 암종(SCC), 간세포 암종(HCC), 췌장 암종, 두경부의 편평 세포 암종, 식도, 위장관, 및 유방의 암종일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 대상체는 PD-L1을 발현시키는 종양을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 대상체는 PD-L1 항체에 의한 치료 후에 불응성 및/또는 재발성이다. 일부 실시 형태에서, PD-L1 항체는 아벨루맙, 두르발루맙 또는 아테졸리주맙이다. 이 질병의 재발 또는 불응성 성질을 결정하기 위하여 다양한 정성적 및/또는 정략적 방법이 사용될 수 있다. 재발 또는 저항성과 관련될 수 있는 증상은, 예를 들어 환자의 웰빙의 감소 또는 정체, 또는 고형 종양과 관련된 다양한 증상의 재확립 또는 악화, 및/또는 체내에서 한 위치로부터 다른 기관, 조직 또는 세포로의 암성 세포의 확산이다.
본 발명은 또한 바이러스성 감염을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 바이러스성 감염을 치료하기에 충분한 시간 동안 본 명세서에 제공된 단리된 항체 또는 항원-결합 단편의 치료적 유효량을 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 항체에 의해 치료가능할 수 있는 예시적인 바이러스성 감염체는 HIV, 간염(A형, B형, 또는 C형), 헤르페스 바이러스(예를 들어, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II, 및 CMV, 엡스타인-바르 바이러스), 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키 바이러스, 코르노바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 이하선염 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 루벨라 바이러스, 파보바이러스, 백시니아 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅기 바이러스, 유두종 바이러스, 연속종 바이러스, 폴리오바이러스, 공수병 바이러스, JC 바이러스, 및 아르보바이러스 뇌염 바이러스를 포함한다.
본 발명의 추가의 실시 형태
본 명세서의 어딘가 다른 곳에 있는 본 개시내용에 따른 본 발명의 특정의 추가 실시 형태들이 하기에 나열되어 있다. 본 명세서에 개시된 본 발명과 관련된 것으로서 기재된 상기에 나열된 본 발명의 실시 형태들로부터의 특징은 또한 이들 추가의 넘버링된 실시 형태들 각각 하나하나와 관련된다.
실시 형태 1. 서열 번호 6, 7 또는 8의 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 5의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는, 항-TIM3 항체.
실시 형태 2. 서열 번호 6의 VH 및 서열 번호 5의 VL을 포함하는, 항-TIM3 항체.
실시 형태 3. 서열 번호 7의 VH 및 서열 번호 5의 VL을 포함하는, 항-TIM3 항체.
실시 형태 4. 서열 번호 8의 VH 및 서열 번호 5의 VL을 포함하는, 항-TIM3 항체.
실시 형태 5. 서열 번호 10, 11 또는 12의 VH 및 서열 번호 9의 VL을 포함하는, 항-PD-1 항체.
실시 형태 6. 서열 번호 10의 VH 및 서열 번호 9의 VL을 포함하는, 항-PD-1 항체.
실시 형태 9. 서열 번호 11의 VH 및 서열 번호 9의 VL을 포함하는, 항-PD-1 항체.
실시 형태 10. 서열 번호 12의 VH 및 서열 번호 9의 VL을 포함하는, 항-PD-1 항체.
실시 형태 11. PD-1에 결합하는 제1 도메인 및 TIM3에 결합하는 제2 도메인을 포함하며, 상기 제1 도메인은 서열 번호 10, 11 또는 12의 VH 및 서열 번호 9의 VL을 포함하고, 상기 제2 도메인은 서열 번호 6, 7 또는 8의 VH 및 서열 번호 5의 VL을 포함하는, 이중특이성 PD-1xTIM3 항체.
실시 형태 12. 실시 형태 11에 있어서, 상기 제1 도메인은 서열 번호 10의 VH 및 서열 번호 9의 VL을 포함하고, 상기 제2 도메인은 서열 번호 6의 VH 및 서열 번호 5의 VL을 포함하는, 이중특이성 PD-1xTIM3 항체.
실시 형태 13. 실시 형태 11에 있어서, 상기 제1 도메인은 서열 번호 11의 VH 및 서열 번호 9의 VL을 포함하고, 상기 제2 도메인은 서열 번호 6의 VH 및 서열 번호 5의 VL을 포함하는, 이중특이성 PD-1xTIM3 항체.
실시 형태 14. 실시 형태 11에 있어서, 상기 제1 도메인은 서열 번호 12의 VH 및 서열 번호 9의 VL을 포함하고, 상기 제2 도메인은 서열 번호 6의 VH 및 서열 번호 5의 VL을 포함하는, 이중특이성 PD-1xTIM3 항체.
실시 형태 15. 실시 형태 11에 있어서, 상기 제1 도메인은 서열 번호 10의 VH 및 서열 번호 9의 VL을 포함하고, 상기 제2 도메인은 서열 번호 7의 VH 및 서열 번호 5의 VL을 포함하는, 이중특이성 PD-1xTIM3 항체.
실시 형태 16. 실시 형태 11에 있어서, 상기 제1 도메인은 서열 번호 11의 VH 및 서열 번호 9의 VL을 포함하고, 상기 제2 도메인은 서열 번호 7의 VH 및 서열 번호 5의 VL을 포함하는, 이중특이성 PD-1xTIM3 항체.
실시 형태 17. 실시 형태 11에 있어서, 상기 제1 도메인은 서열 번호 12의 VH 및 서열 번호 9의 VL을 포함하고, 상기 제2 도메인은 서열 번호 7의 VH 및 서열 번호 5의 VL을 포함하는, 이중특이성 PD-1xTIM3 항체.
실시 형태 18. 실시 형태 11에 있어서, 상기 제1 도메인은 서열 번호 10의 VH 및 서열 번호 9의 VL을 포함하고, 상기 제2 도메인은 서열 번호 8의 VH 및 서열 번호 5의 VL을 포함하는, 이중특이성 PD-1xTIM3 항체.
실시 형태 19. 실시 형태 11에 있어서, 상기 제1 도메인은 서열 번호 11의 VH 및 서열 번호 9의 VL을 포함하고, 상기 제2 도메인은 서열 번호 8의 VH 및 서열 번호 5의 VL을 포함하는, 이중특이성 PD-1xTIM3 항체.
실시 형태 20. 실시 형태 11에 있어서, 상기 제1 도메인은 서열 번호 12의 VH 및 서열 번호 9의 VL을 포함하고, 상기 제2 도메인은 서열 번호 8의 VH 및 서열 번호 5의 VL을 포함하는, 이중특이성 PD-1xTIM3 항체.
실시 형태 21. 실시 형태 1 내지 실시 형태 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 IgG4 동종형인, 항체.
실시 형태 22. 실시 형태 1 내지 실시 형태 21 중 어느 하나에 있어서, 서열 번호 13의 야생형 IgG4와 대비하여 S228P 돌연변이를 포함하는, 항체.
실시 형태 23. 실시 형태 1 내지 실시 형태 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 길항적 항체인, 항체.
실시 형태 24. 실시 형태 1 내지 실시 형태 23 중 어느 하나의 항체를 포함하는, 약제학적 조성물.
실시 형태 25. 실시 형태 1 내지 실시 형태 23 중 어느 하나에 있어서 또는 실시 형태 24에 있어서, 요법에 사용하기 위한, 실시 형태 1 내지 실시 형태 23 중 어느 하나의 항체 또는 실시 형태 24의 약제학적 조성물.
실시 형태 24. 실시 형태 1 내지 실시 형태 23 중 어느 하나에 있어서 또는 실시 형태 24에 있어서, 암을 가진 대상체를 치료하는 데 사용하기 위한, 실시 형태 1 내지 실시 형태 23 중 어느 하나의 항체 또는 실시 형태 24의 약제학적 조성물.
실시 형태 25. 실시 형태 24에 있어서, 암이 고형 종양 또는 혈액학적 악성종양인, 상기에 따라 사용하기 위한, 항체 또는 약제학적 조성물.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 실시 형태를 예시하기 위해 제공되지만 결코 그의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1 - 단일클론 및 이중특이성 항-TNFα 항체의 등전점 변형
표면 전하를 증가 또는 감소시키도록 치환될 수 있는 가변 영역의 표면 내에 있는 아미노산 잔기를 확인하기 위하여, CNTO148 항체를 사용하였다. CNTO148은 TNFα에 결합하는 단일클론 항체이다. 항체 결정 구조는 입수가능하다. CNTO148 항체의 등전점은 약 9이다. (서열 번호 1의 아미노산 위치 9, 71, 75, 84, 및 88에 상응하는) 위치 9, 70, 74, 82a, 및 84(카바트 넘버링)에서의 가변 중쇄 영역 내의 아미노산 치환을 먼저 시험하여, 이들 치환이 CNTO148 항체의 등전점(pI)을 감소시키는 능력이 있는지를 결정하였다. 이들 치환을 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 분자의 변형을 통해 단독으로 또는 조합하여 도입하였다(실시예 4 참조). 변이체를 Expi293 세포를 사용하여 발현시켰다.
[표 1]
모세관 등전 집속(capillary isoelectric focusing, cIEF), 모세관 소듐 도데실 설페이트 전기영동(cSDS) 또는 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE), 및 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SE-HPLC)를 사용하여 변이체를 특성화하였다. cIEF는, pH 8 내지 10.5와 조합된, pH 5 내지 8 또는 pH 3 내지 10 중 어느 하나의 양쪽성 전해질을 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 Protein Simple로부터의 iCE3 분석기를 사용하여 행하였다. cSDS는, Protein Express 칩 및 HT Protein Express 시약 키트를 사용하여, Caliper로부터의 Lab Chip GXII를 사용하여 행하였다. SDS-PAGE는, Novex NuPAGE 1 내지 12% 비스-트리스 겔(Bis-Tris Gel), Invitrogen SeeBlue Plus2 사전염색된 표준물(Prestained Standard)(1X), 및 1X MES 전개 완충액(Running Buffer)을 사용하여 행하였다. SE-HPLC는, TOSOH Bioscience Bioassist G35W, 7.8 mm ID, 30 cm 직경을 사용하여Waters Alliance 상에서 행하였다.
변이체를 또한 항원 결합의 변화에 대해 특성화하였다. 항원 결합은, Jackson Immunoresearch로부터의 F(ab')2 단편 당나귀 항-인간 Fc로 코팅되고 Superblock(Pierce)으로 차단된 Maxisorp 플레이트(Nunc)를 사용하여 측정하였다. 이어서, 변이체의 연속 희석물을 플레이트에 첨가하고 결합되게 하였다. TNF에 대한 CNTO148 결합을 측정하기 위하여, 비오티닐화 인간 TNF를 첨가한 후, 스트렙타비딘-HRP(Jackson Immunoresearch)를 첨가하고, 결합된 TNF를 TMB 기질(Fitzgerald)을 사용하여 검출하였다.
샘플의 풀림 온도(Tm) 및 응집 개시 온도(Tagg)를 또한 Activa Optim 2, 또는 업데이트된 UNCLE 기기를 사용하여 분석하였다. 이들 기기는, 단백질 풀림의 지표로서 증가하는 온도에 따른 고유 형광을 측정하고, 응집 개시의 지표로서 증가하는 온도에 따른 광 산란을 측정한다. 단백질이 풀리거나 응집되기 시작하는 온도는 그의 구조적 안정성을 나타낼 수 있다. 이러한 분석을 위하여, 분당 0.3℃로 20℃부터 85℃까지의 온도 단계를 사용하였다.
결과
CNTO148 변이체의 특성화가 하기 표 2에 요약되어 있다. CNTO148 S75D 및 N84D 변이체의 실험적으로 측정된 pI는 각각 8.9 및 9.0이었는데, 이는 야생형(WT)의 pl가 9.1인 것과 대비되었다. 별도의 실험에서, CNTO148 A88D 변이체의 pI는 9.1이었는데, 이는 WT의 pl가 9.2인 것과 대비되었다. 또 다른 실험에서, CNTO148 G9E 및 S71E 변이체의 pI는 각각 8.7 및 8.7이었는데, 이는 WT의 pl가 8.9인 것과 대비되었다. 실험간의 WT CNTO148의 pI의 차이는 통상적인 매일매일의 변동성 및 전해질 조성의 미소한 변화에 기인될 가능성이 높았다. S75D, N84D, A88D, G9E, 및 S71E 변이체뿐만 아니라 WT 대조군은 적어도 TNFα에 결합하였다. 도 1a는 야생형과 대비하여 S75D 및 N84D 변이체의 결합을 나타내고(148 WT와 CNTO148), 도 1b는 야생형 CNTO148과 대비하여 A88D 변이체를 나타내고, 도 1c는 WT CNTO148과 대비하여 G9E 및 S71E 변이체의 결합을 나타낸다. CNTO95를 음성 대조군으로 사용하였다. 변이체는 또한 WT와 매우 유사한 SE-HPLC 프로파일을 제공하였다. 도 2a 내지 도 2c는 CNTO148 야생형(도 2a), N84D(도 2b), 및 S75D(도 2c)에 대한 SE-HPLC 프로파일을 나타내고, 도 3a 및 도 3b는 CNTO148 야생형(도 3a)과 A88D 변이체(도 3b)에 대한 SE-HPLC 프로파일의 비교를 나타낸다. 도 4a 내지 도 4c는 CNTO148 야생형(도 4a)과 G9E(도 4b)와 S71E(도 4c)에 대한 SE-HPLC 프로파일의 비교를 나타낸다.
[표 2]
콜로이드 안정성의 지표로서 응집 개시 시점에서의 온도를 측정하였다. S75D 및 N84D 변이체에 대한 응집 개시(Tagg)는 66.8℃ 및 65.8℃(각각 도 5b 및 도 5c 참조)에서 발생하였으며, 이는, 야생형 CNTO148에 대한 응집 개시와 유사하거나 그렇지 않으면 다소 더 높았는데, 이때 야생형 CNTO148은 이 실험에서 63.9℃(도 5a 참조)에서 발생하였다. 별도의 실험에서, A88D 변이체에 대한 응집 개시는 66.9℃(도 6b)에서 발생하는 것으로 밝혀졌는데, 이는 67.6℃(도 6a)에서 발생한 야생형 작제물과 유사하였다. 다른 실험에서, G9E 및 S71E 변이체에 대한 응집 개시는 각각 65.7℃(도 7b) 및 69.5℃(도 7c)에서 발생하는 것으로 밝혀졌는데, 이는 68.6℃(도 7a)에서 발생한 야생형 CNTO148과 대비되었다.
입체구조 안정성의 지표로서 풀림 온도를 측정하였다. S75D 및 N84D 변이체의 풀림 온도(Tm)는 각각 67.3℃(도 8b) 및 65.3℃(도 8c)에서 발생하였는데, 이는 63.9℃(도 8a)에서 발생한 야생형 CNTO148의 풀림 온도와 유사하였다. 별도의 실험에서, A88D 변이체에 대한 풀림 온도는 66.9℃(도 9b)에서 발생하였는데, 이는 이 실험에서 67.3℃(도 9a)에서 발생한 야생형 작제물과 유사하였다. 또 다른 실험에서, G9E 및 S71E 변이체에 대한 풀림 온도는 각각 65.8℃(도 10b) 및 69.6℃(도 10c)에서 발생하는 것으로 밝혀졌는데, 이는 이 실험에서 68.8℃(도 10a)에서 발생한 야생형 CNTO148과 대비되었다. Tm 및 Tagg의 감소가 2℃를 초과하는 것으로 나타난 변이체를 감소된 안정성을 갖는 것으로 간주하였다. 이들 변이체 중, 단지 G9E 변이체만이 WT와 대비하여 감소된 결합을 보여주었는데; 그것은 3℃만큼 더 낮은 Tm을 가졌고 2.9℃만큼 더 낮은 응집 개시를 가졌다.
실시예 2 - 단일클론 및 이중특이성 항-αVβ3 항체의 등전점 변형
표면 전하를 증가 또는 감소시키도록 치환될 수 있는 가변 영역의 표면 내에 있는 아미노산 잔기를 확인하기 위하여, CNTO95 항체를 사용하였다. CNTO95는 αVβ3에 결합하는 단일클론 항체이다. 결정 구조는 입수가능하다. CNTO95 항체의 등전점은 약 9이다. (서열 번호 4의 아미노산 위치 7, 9, 11, 14, 41, 71, 88, 및 119에 상응하는) 위치 7, 9, 11, 14, 41, 74, 84, 및 1134(카바트 넘버링)에서의 가변 중쇄 영역 내의 아미노산 치환을 먼저 시험하여, 이들 치환이 CNTO95 항체의 등전점(pI)을 감소시키는 능력이 있는지를 결정하였다. 이들 치환을 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 분자의 변형을 통해 단독으로 또는 조합하여 도입하였다. 변이체를 Expi293를 사용하여 발현시켰다.
[표 3]
모세관 등전 집속(cIEF), 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE), 및 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SE-HPLC)를 사용하여 변이체를 특성화하였다. cIEF는, pH 3 내지 10 및 pH 8 내지 10.5의 양쪽성 전해질을 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 Protein Simple로부터의 iCE3 분석기를 사용하여 행하였다. SDS-PAGE는, Novex NuPAGE 1 내지 12% 비스-트리스 겔, Invitrogen SeeBlue Plus2 사전염색된 표준물(1X), 및 1X MES 전개 완충액을 사용하여 행하였다. SE-HPLC는, TOSOH Bioscience Bioassist G35W, 7.8 mm ID, 30 cm 직경을 사용하여Waters Alliance 상에서 행하였다.
변이체를 또한 항원 결합의 변화에 대해 특성화하였다. 항원 결합은, Jackson Immunoresearch로부터의 F(ab')2 단편 당나귀 항-인간 Fc로 코팅되고 Superblock(Pierce)으로 차단된 Maxisorp 플레이트(Nunc)를 사용하여 측정하였다. 이어서, 변이체의 연속 희석물을 플레이트에 첨가하고 결합되게 하였다. αVβ3에 대한 CNTO95 결합을 측정하기 위하여, 비오티닐화 인간 αVβ3를 첨가한 후, 스트렙타비딘-HRP(Jackson Immunoresearch)를 첨가하고, 결합된 αVβ3를 TMB 기질(Fitzgerald)을 사용하여 검출하였다.
샘플을 또한 업데이트된 UNCLE 기기를 사용하여 분석하였다. 이 기기는, 단백질 풀림의 지표로서 증가하는 온도에 따른 고유 형광을 측정하고, 응집 개시의 지표로서 증가하는 온도에 따른 광 산란을 측정한다. 단백질이 풀리거나 응집되기 시작하는 온도는 그의 구조적 안정성을 나타낼 수 있다. 이러한 분석을 위하여, 분당 0.3℃로 20℃부터 85℃까지의 온도 단계를 사용하였다.
결과
CNTO95 변이체의 특성화가 하기 표 4에 요약되어 있다. CNTO95 S7R, G9R, V11R, P14R, P41R, S71K, A88R, 및 S119R 변이체의 pI는 각각 9.2, 9.2, 9.2, 9.2, 9.2, 9.1, 9.2, 및 9.2였는데, 이는 CNTO95 야생형의 pI가 9.05인 것과 대비되었다. 모든 변이체뿐만 아니라 WT 대조군은 적어도 αVβ3에 결합하였다. 도 11은 야생형(CNTO95)과 대비하여 상기 변이체의 결합을 보여준다. CNTO148을 음성 대조군으로 사용하였다. 변이체는 또한 WT와 매우 유사한 SE-HPLC 프로파일을 제공하였다. 도 12a 내지 도 12i는 CNTO95 야생형(도 12a), S7R(도 12b), G9R(도 12c), V11R(도 12d), P14R(도 12e), P41R(도 12f), S71K(도 12g), A88R(도 12h) 및 S119R(도 12i)에 대한 SE-HPLC 프로파일을 나타낸다.
[표 4]
S7R, G9R, V11R, P14R, P41R, S71K, A88R, 및 S119R 변이체에 대한 응집 개시(Tagg)는 67.2℃(도 13b), 57.9℃(도 13c), 63.9℃(도 13d), 63.5℃(도 13e), 66.4℃(도 13f), 64.9℃(도 13g), 67.6℃(도 13h), 및 66.7℃(도 13i)에서 발생하였는데, 이는 68.2℃(도 13a 참조)에서 발생한 야생형 CNTO95에 대한 응집 개시와 대비되었다.
S7R, G9R, V11R, P14R, P41R, S71K, A88R, 및 S119R 변이체의 풀림 온도(Tm)는 각각 67.9℃(도 14b), 59.4℃(도 14c), 64.8℃(도 14d), 64.3℃(도 14e), 66.8℃(도 14f), 65.8℃(도 14g), 68.0℃(도 14h), 및 67.6℃(도 14i)에서 발생하였는데, 이는 68.8℃(도 14a)에서 발생한 야생형 CNTO95의 풀림 온도와 대비되었다. Tm 및 Tagg의 감소가 2℃를 초과하는 것으로 나타난 변이체를 감소된 안정성을 갖는 것으로 간주하였으며, 5℃ 초과의 감소를 보여준 변이체는 크게 감소된 안정성을 갖는 것으로 간주되었다. 이들 변이체 중, 단지 G9R 변이체만이 크게 감소된 안정성을 보여주었는데; 그것은 9.4℃만큼 더 낮은 Tm을 가졌고 10.3℃만큼 더 낮은 응집 개시를 가졌다. V11R, P14R, P41R, 및 S71K 변이체는 감소된 안정성을 보여주었다. 이들은 각각 4℃, 4.5℃, 2℃, 및 3℃만큼 더 낮은 Tm을 가졌고, 각각 4.3℃, 4.7℃, 1.8℃, 및 3.2℃만큼 더 낮은 Tagg를 가졌다.
실시예 3 - 단일클론 및 이중특이성 항-TIM3 및 항-PD1 항체의 등전점 변형
등전점을 변형시키기 위한 중쇄 가변 영역 내의 카바트 위치 74, 82a, 및 84에서의 아미노산 치환의 유용성을 추가로 조사하기 위하여, 2개의 추가의 항체, 항-TIM3 및 항-PD1 항체의 변이체를 시험하였다. TIMB337은 TIM3(CD366)에 결합하는 단일클론 항체이고, PD1B244는 PD-1(CD279)에 결합하는 단일클론 항체이다. TIMB337 및 PD1B244의 pI는 (IgG4 버전에 대해) 7.26 및 7.06이며; 이에 따라, 이들 2개의 동종이량체와 이들 2개를 조합함으로써 형성된 이중특이체 사이의 pI의 차이는 0.1 단위 미만이다. 이것은 CEX 컬럼 상에 반영되었는데, 여기서는 분해능이 0.1인 것으로 관찰되었다.
(각각 서열 번호 2 및 서열 번호 3의 아미노산 위치 75, 84, 및 88에 상응하는) 위치 74, 82a, 및 84(카바트 넘버링)에서의 TIM337 및 PD1B244의 중쇄 가변 영역 내의 아미노산 치환을 먼저 시험하여, 이들 치환이 이들 항체의 등전점(pI)을 감소시키는 능력이 있는지를 결정하였다(표 5 및 표 6 참조). 이들 치환을 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 핵산 분자의 변형을 통해 단독으로 또는 조합하여 도입하였다. 변이체를 24웰 플레이트 내에서 Expi293 세포를 사용하여 발현시켰다.
[표 5]
[표 6]
TIMB377 및 PD1B244 변이체를 24웰 플레이트 내에서 발현시키고 정제하였다. cSDS, SE-HPLC, cIEF를 포함한 CNTO148 변이체의 특성화에 사용된 방법들의 동일한 패널을 사용하여 TIMB377 및 PD1B244 변이체를 분석하였다. 이 경우에, cIEF를 pH 3 내지 10 및 pH 5 내지 8의 양쪽성 전해질로 행하였다. 안정성은 앞에서와 같이 Activa Optim2를 사용하여 측정하였다. 각각의 POC 항체에 대해 항원 결합을 또한 측정하였다. ELISA를 사용하여 TIM3 결합을 측정하였다. 간략하게 말하면, Maxisorp 플레이트(Nunc)를 스트렙타비딘으로 코팅하고, 이어서 0.4% BSA를 함유하는 PBS로 블로킹하였다. 이어서, PBS(0.4% BSA) 중 1 ug/mL 농도의 R&D Systems로부터의 비오티닐화 인간 TIM3-Fc 융합체를 결합시켰다. 이어서, 변이체의 연속 희석물을 첨가하고 결합되게 하였다. 다음으로, PBS(0.4% BSA) 중 1:5000 희석률의 퍼옥시다아제 접합된 염소 항-인간 카파(Southern Biotech)를 첨가하였다(TIM3-Fc 융합체의 결합을 피하기 위하여 항-FC는 사용하지 않았다). 마지막으로, TMB 기질(Fitzgerald)을 검출을 위해 사용하였다.
PD1에 대한 전하 변이체의 결합을 측정하기 위하여, Proteon SPR 기기를 사용하였다. 이를 위하여, 모두 6개의 채널의 유세포에 걸쳐 염소 항-인간/항-마우스 Fc 항체(Na 아세테이트(pH 4.5) 중)를 공유적으로 고정화함으로써(약 5000 RU) GLC 형 센서 칩을 제조하였다. 다음으로, 항-PD1 mAb를 PBSTE 중에 0.001 mg/ml로 희석시키고, 모든 리간드 채널에 걸쳐 포획하였다(약 180 RU). 마지막으로, 인간 PD1 항원(PBSTE 중 4배 희석물로 100 nM 내지 0.4 nM)을 항-PD1 mAb 포획된 채널에 걸쳐 주입하고, 회합/해리 프로파일을 각각 4분 및 30분 동안 모니터링하였다. 0.85% H3PO4를 사용하여 매 적정 사이클마다 종료 시점에서 재생을 수행하였다. 데이터를 분석하여 포획 및 결합 상호작용에 대해 확인하였다.
결과
TIMB377 변이체의 분석은 이들이 모두 야생형과 유사하게 거동함을 보여주었다(표 7 참조). 3개의 모든 S75D N84D 및 A88D 변이체의 pI는 8.5였는데, 이는 WT의 pI가 8.7인 것과 대비되었다. 3개의 모든 변이체뿐만 아니라 WT는 적어도 TIM3에 결합하였으며(도 15), 이들 각각은 WT와 매우 유사한 SE-HPLC 프로파일을 제공하였다(도 16a 내지 도 16d). 게다가, 67.5℃, 68.2℃ 및 66.7℃에서의 S75D, N84D 및 A88D 변이체에 대한 응집 개시는 68.5℃에서의 WT 개시와 유사하였다(도 17a 내지 도 17d).
[표 7]
PD1B244 단일-치환 변이체의 특성화 결과가 하기 표 8에 나타나 있다. 이들 실험에서, 야생형 항-PD1은 SE-HPLC에 의해 입증된 바와 같이 응집되는 경향을 나타내었는데, 이는, 치환이 응집에 영향을 주는지를 결정하는 것을 어렵게 하였다. SE-HPLC에 의한 야생형 순도는 78% 단량체인 반면, 단일 돌연변이체는 51% 내지 95% 단량체의 범위였다. PD-1 항체를 특성화하는 이전 실험은 이 항체의 응집이 온도 및 pH에 민감함을 보여주었으며, 이에 따라, 단량체 비율의 변동성은 샘플의 처리 동안 실험 조건의 차이에 기인할 수 있었다. 이러한 이유로, 변이체들 중 일부에서 관찰되는 변동가능한 단량체 비율은 추가의 평가로부터 이들 치환을 배제하는 데 유효한 근거인 것으로 간주되지 않았으며, % 단량체는 PD-1 항체 돌연변이체의 최종 분석에 포함되지 않았다. 그러나, 추가의 연구는 공정 최적화를 통해 그러한 응집이 유의하게 최소화될 수 있음을 입증하였으며, 현재 기술된 실험은 그러한 최적화 없이 PBS 중에서 수행되었음에 유의해야 한다.
S75D, S84D, 및 S88D 변이체의 pI는 8.6, 8.6 및 8.7이었는데, 이는 WT의 pl가 8.9인 것과 대비되었다. 3개의 모든 변이체는 WT와 유사한 KD로 인간 PD1에 결합하였다(도 18). 이들은 또한 WT와 매우 유사한 SE-HPLC 프로파일을 제공하였다. 이 경우에, WT 항-PD1 항체의 SE-HPLC 프로파일은 추정상의 단량체 피크보다 더 조기에 용리되는 몇몇 밴드를 포함하였다. 이들 피크의 수 및 출현은 전하 치환에 의해 영향을 받지 않았다(도 19a 내지 도 19d). 게다가, 66.6℃, 66.1℃ 및 66.5℃에서의 S75D, S84D 및 S88D 변이체에 대한 응집 개시는 65.7℃에서의 WT 개시와 유사하였다(도 20a 내지 도 20d). % 단량체에 대한 변동가능한 SE-HPLC 결과를 제외하면, 모든 다른 데이터는 시험된 3개의 단일 돌연변이가 모두 WT-유사이었음을 입증한다.
[표 8]
실시예 4 - CNTO148 다중 치환 변이체의 특성화
S75D, N84D 또는 A88D로 구성된 4개의 다중 치환 CNTO148 변이체의 pI가 하기 표 9에 나타나 있다. CNTO148 항체의 경우, 2개의 치환의 조합은 0.25 내지 0.31 pH 단위의 pI의 감소를 제공하였다. 3개의 모든 조합은 0.45 pH 단위의 감소를 가져왔다.
[표 9]
도 21에 나타낸 바와 같이, 모든 조합 변이체는 야생형 CNTO148과 유사하게 TNF에 결합하였다. 이들은 또한 WT와 매우 유사한 SE-HPLC 프로파일을 제공하였다(도 22a 내지 도 22e). 게다가, 변이체의 입체구조 안정성 및 콜로이드 안정성 둘 모두가 WT와 유사하였다(하기 표 10, 도 23a 내지 도 23e 및 도 24a 내지 도 24e). 변이체의 입체구조 안정성(Tm)은 WT의 0.5℃ 이내이고, 콜로이드 안정성(응집 개시)은 WT의 0.7℃ 이내였다.
[표 10]
바람직한 실시 형태가 본 명세서에 상세히 묘사되고 기술되어 있지만, 다양한 변형, 첨가, 치환 등이 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않고서 이루어질 수 있으며, 이에 따라 이들은 하기의 청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 여겨짐이 당업자에게 명백할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Janssen Biotech, Inc. Nesspor, Thomas <120> Methods of engineering surface charge for bispecific antibody production <130> JBI5100WOPCT <140> To be assigned <141> 2018-06-04 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CNTO148 VH variants <220> <221> MISC_FEATURE <222> (75)..(75) <223> Xaa is Ser or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (84)..(84) <223> Xaa is Asn or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (88)..(88) <223> Xaa is Ala or Asp <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Met Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Lys Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Xaa Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Xaa Ser Leu Arg Xaa Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg Gly Ile Ala Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110 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Thr Ile Thr Ala Asp Glu Asp Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Asp Thr Gly Ser Leu Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S84D variant of PD1B244 VH <400> 11 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Asp Thr Gly Ser Leu Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 12 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S88D variant of PD1B244 VH <400> 12 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Pro Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Asp Thr Gly Ser Leu Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 13 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 with S228P mutation <400> 13 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325

Claims (17)

  1. 2개의 모 항체로부터의 이중특이성 항체의 분리를 향상시키는 방법으로서, 상기 방법은,
    제1 모 항체 및 제2 모 항체를 제공하는 단계로서, 각각의 모 항체는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 단계;
    상기 제1 모 항체 및 상기 제2 모 항체 중 적어도 하나에서, 카바트 넘버링 체계에 따라 위치 7, 9, 11, 14, 41, 70, 74, 82a, 84, 및 113에 있는 중쇄 가변 영역(VH) 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환하는 단계로서, 상기 치환은 상기 제2 모 항체와 대비하여 상기 제1 모 항체의 등전점을 증가 또는 감소시키는, 단계;
    상기 치환 후에 상기 2개의 모 항체로부터 상기 이중특이성 항체를 생성하는 단계; 및
    상기 생성된 이중특이성 항체를 그의 2개의 모 항체로부터 분리하는 단계로서, 상기 분리는 상기 치환의 결과로서 향상되는 것인, 단계;를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 모 항체의 위치 7, 9, 11, 14, 41, 74, 84, 및 113(카바트 넘버링)에 있는 상기 VH의 하나 이상의 아미노산 잔기가 중성으로 하전된 아미노산 잔기이고,
    상기 치환은, 상기 하나 이상의 중성으로 하전된 아미노산 잔기를 하나 이상의 양으로 하전된 아미노산 잔기로 교환하여 상기 항체의 등전점을 증가시키는 것을 포함하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1 모 항체의 위치 7, 9, 11, 14, 41, 74, 84, 및 113(카바트 넘버링)에 있는 상기 VH의 하나 이상의 아미노산 잔기가 음으로 하전된 아미노산 잔기이고,
    상기 치환은, 상기 하나 이상의 음으로 하전된 아미노산 잔기를 하나 이상의 중성으로 또는 양으로 하전된 아미노산 잔기로 교환하여 상기 항체의 등전점을 증가시키는 것을 포함하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제1 모 항체의 위치 9, 70, 74, 82a, 및 84(카바트 넘버링)에 있는 상기 VH의 하나 이상의 아미노산 잔기가 중성으로 하전된 아미노산 잔기이고, 상기 치환은
    상기 하나 이상의 중성으로 하전된 아미노산 잔기를 하나 이상의 음으로 하전된 아미노산 잔기로 교환하여 상기 항체의 등전점을 감소시키는 것을 포함하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제1 모 항체의 위치 9, 70, 74, 82a, 및 84(카바트 넘버링)에 있는 상기 VH의 하나 이상의 아미노산 잔기가 양으로 하전된 아미노산 잔기이고,
    상기 치환은, 상기 하나 이상의 양으로 하전된 아미노산 잔기를 하나 이상의 중성으로 또는 음으로 하전된 아미노산 잔기로 교환하여 상기 항체의 등전점을 감소시키는 것을 포함하는, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 치환은
    상기 제1 모 항체에서 위치 74(카바트 넘버링)에 있는 VH 아미노산 잔기를 음으로 하전된 아미노산 잔기로 교환하는 것을 포함하는, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 치환은
    상기 제1 모 항체에서 위치 82a(카바트 넘버링)에 있는 VH 아미노산 잔기를 음으로 하전된 아미노산 잔기로 교환하는 것을 포함하는, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 치환은
    상기 제1 모 항체에서 위치 84(카바트 넘버링)에 있는 VH 아미노산 잔기를 음으로 하전된 아미노산 잔기로 교환하는 것을 포함하는, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 치환은
    상기 제1 모 항체에서 위치 74, 82a, 및 84(카바트 넘버링)로부터 선택되는 위치들 중 적어도 2개의 위치에 있는 VH 아미노산 잔기를 음으로 하전된 아미노산 잔기로 교환하는 것을 포함하는, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 치환은
    상기 제1 모 항체에서 3개의 모든 위치 74, 82a, 및 84(카바트 넘버링)에 있는 VH 아미노산 잔기를 음으로 하전된 아미노산 잔기로 교환하는 것을 포함하는, 방법.
  11. 다중특이성 항체로서,
    중쇄 가변 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 및
    중쇄 가변 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하며,
    상기 제1 폴리펩티드의 등전점은 상기 제2 폴리펩티드의 등전점보다 더 낮고, 상기 제1 폴리펩티드의 중쇄 가변 영역의 위치 9, 70, 74, 82a, 및 84(카바트 넘버링)에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기는 중성으로 또는 음으로 하전된 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드의 중쇄 가변 영역의 상응하는 위치에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기는 상기 제1 폴리펩티드와 대비하여 차별적으로 하전된 아미노산 잔기를 포함하는, 다중특이성 항체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제2 폴리펩티드의 중쇄 가변 영역의 위치 7, 9, 11, 14, 41, 74, 84, 및 113에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기는 중성으로 또는 양으로 하전된 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 제1 폴리펩티드의 중쇄 가변 영역의 상응하는 위치에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기는 상기 제2 폴리펩티드와 대비하여 차별적으로 하전된 아미노산 잔기를 포함하는, 다중특이성 항체.
  13. 제11항에 있어서, 하나 이상의 위치 9, 70, 74, 82a, 및 84(카바트 넘버링)에 있는 상기 중성으로 또는 음으로 하전된 아미노산 잔기는 아미노산 치환인, 다중특이성 항체.
  14. 다중특이성 항체로서,
    중쇄 가변 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 및
    중쇄 가변 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하며,
    상기 제1 폴리펩티드의 등전점은 상기 제2 폴리펩티드의 등전점보다 더 높고, 상기 제1 폴리펩티드의 중쇄 가변 영역의 위치 7, 9, 11, 14, 41, 74, 84, 및 113(카바트 넘버링)에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기는 중성으로 또는 양으로 하전된 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드의 중쇄 가변 영역의 상응하는 위치에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기는 상기 제1 폴리펩티드와 대비하여 차별적으로 하전된 아미노산 잔기를 포함하는, 다중특이성 항체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 제2 폴리펩티드의 중쇄 가변 영역의 위치 9, 70, 74, 82a, 및 84(카바트 넘버링)에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기는 중성으로 또는 음으로 하전된 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 제1 폴리펩티드의 중쇄 가변 영역의 상응하는 위치에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기는 상기 제2 폴리펩티드와 대비하여 차별적으로 하전된 아미노산 잔기를 포함하는, 다중특이성 항체.
  16. 제14항에 있어서, 하나 이상의 위치 7, 9, 11, 14, 41, 74, 84, 및 113(카바트 넘버링)에 있는 상기 중성으로 또는 양으로 하전된 아미노산 잔기는 아미노산 치환인, 다중특이성 항체.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이성 항체인, 다중특이성 항체.
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