RU2803096C2 - Способы модификации поверхностного заряда для получения биспецифических антител - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу снижения изоэлектрической точки антитела при сохранении его функциональной активности. Изобретение позволяет эффективно снижать изоэлектрическую точку антитела. 4 з.п. ф-лы, 24 ил., 10 табл., 4 пр.

Description

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0001] Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, представленных по сети EFS-Web, все содержание которого полностью включено в настоящий документ путем ссылки. Текстовый файл ASCII, созданный 16 мая 2018 г., назван JBI5100WOPCTSEQLIST.TXT и имеет размер 18 килобайт.

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Данное описание относится к способам модификации поверхностного заряда для повышения продуцирования биспецифических антител.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0003] Терапевтические средства на основе антител успешно применяются для лечения разнообразных заболеваний, включая рак и аутоиммунные/воспалительные заболевания. Тем не менее, все еще необходимы улучшения данного класса лекарственных средств, особенно в отношении повышения их клинической эффективности. Один из исследуемых в настоящее время способов представляет собой конструирование дополнительных и новых антигенсвязывающих сайтов в лекарственных средствах на основе антител таким образом, чтобы одна молекула иммуноглобулина взаимодействовала с двумя разными антигенами. Такие альтернативные форматы антител, которые взаимодействуют с двумя разными антигенами, часто называют биспецифическими антителами.

[0004] Благодаря уникальным механизмам действия биспецифических антител, им уделяется все больше внимания в качестве кандидатов в биотерапевтические средства. Традиционно получение биспецифических антител типа IgG включало введение четырех молекул нуклеиновых кислот в клетки, например, молекул нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды тяжелой и легкой цепей первого антитела, специфического к данному антигену, и молекул нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды тяжелой и легкой цепей второго антитела, специфического к другому антигену. В данной системе экспрессия молекул нуклеиновых кислот, кодирующих две тяжелые цепи и две легкие цепи, и, как правило, случайная ассоциация между двумя различными тяжелыми цепями и тяжелой и легкой цепями приводят к тому, что небольшая часть полученных антител имеет необходимое сочетание тяжелых и легких цепей. Только одно из десяти антител, полученных таким способом, обеспечивает правильное спаривание HC и LC для генерации представляющего интерес биспецифического антитела. Для решения этой проблемы были разработаны стратегии конструирования, которые способствуют гетеродимеризации двух различных HC и надлежащему спариванию HC с их партнером LC с образованием желаемых биспецифических антител. Подобные стратегии предусматривали мутации, которые не благоприятствовали нежелательному спариванию в результате введения заряда, гидрофобности, стерического несоответствия или их комбинации. Хотя эти типы подходов существенно увеличили долю биспецифических антител, оставались другие виды нежелательных антител. Поскольку эти нежелательные примеси тесно связаны с желаемым продуктом, их может быть трудно удалить.

[0005] 16 марта 2006 года Huang et al. (международная патентная публикация № WO 2006/028936) предположили, что для облегчения очистки нужного гетеромультимера антитела может быть желательно варьировать разницей в изоэлектрических точках (pI) между первой парой полипептидов и второй парой полипептидов путем проведения селективных замен в CDR или каркасных областях одного или более антител. В последующей работе Igawa et al. (публикации патентных заявок США №№ 20090263392 и 20110076275) раскрыты способы увеличения удаления нежелательных моноспецифических гомодимерных побочных продуктов, образующихся в ходе получения биспецифических антител, которые включают конструирование одного или обоих из полуантител, содержащих биспецифическое, для получения другой pI. Изменение pI модифицируют посредством введения одной или более конкретных аминокислотных замен в константную и/или вариабельную области антитела. В результате изменения pI одного или обеих из полуантител, желаемое биспецифическое антитело может быть более легко очищено от исходных моноспецифических гомодимерных антител с использованием катионного обмена. Аналогично, патентная публикация США № 20140294823, выданная Moore et al., описывает подобный подход, при котором специфические аминокислотные замены в константной области тяжелой цепи одного из исходных антител создают гетеродимерное антитело, в котором две тяжелые цепи имеют разные изоэлектрические точки (pI).

[0006] Несмотря на эти усилия, все еще необходимы дополнительные способы очистки биспецифических антител.

ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0007] Один аспект описания относится к способу модификации изоэлектрической точки антитела. Способ включает обеспечение антитела, содержащего первый полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, и второй полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, и замещение в по меньшей мере одном из первого и второго полипептидов антитела одного или более аминокислотных остатков вариабельной области тяжелой цепи (V_H) в положениях 7, 9, 11, 14, 41, 70, 74, 82a, 84, 113, и в соответствии с системой нумерации по Кабату, причем замещение увеличивает или уменьшает изоэлектрическую точку антитела.

[0008] Второй аспект описания относится к антителу, имеющему модифицированную изоэлектрическую точку, полученную с помощью способов, описанных в данном документе.

[0009] Третий аспект описания относится к способу увеличения степени разделения биспецифического антитела от двух его исходных антител. Данный способ включает обеспечение первого и второго исходных антител, причем каждое исходное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, и замещение в по меньшей мере одном из первого и второго исходных антител одного или более аминокислотных остатков в вариабельной области тяжелой цепи (VH) в положениях 7, 9, 11, 14, 41, 70, 74, 82a, 84 и 113 в соответствии с системой нумерации по Кабату, при этом замещение увеличивает или уменьшает изоэлектрическую точку первого исходного антитела относительно второго исходного антитела. Данный способ дополнительно включает получение биспецифического антитела из двух исходных антител после замещения и отделения полученного биспецифического антитела от его двух исходных антител, причем степень разделение биспецифического антитела увеличивается в результате замен.

[0010] Четвертый аспект описания относится к мультиспецифическому антителу, которое содержит первый полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, и второй полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, причем изоэлектрическая точка первого полипептида меньше, чем изоэлектрическая точка второго полипептида. В соответствии с данным аспектом один или более аминокислотных остатков в положениях 9, 70, 74, 82a и 84 (нумерация по Кабату) вариабельной области тяжелой цепи первого полипептида содержат нейтрально или отрицательно заряженный аминокислотный остаток, и один или более аминокислотных остатков в соответствующих положениях вариабельной области тяжелой цепи второго полипептида содержат аминокислотный остаток с отличающимся зарядом по сравнению с первым полипептидом.

[0011] Пятый аспект описания относится к мультиспецифическому антителу, которое содержит первый полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, и второй полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, причем изоэлектрическая точка первого полипептида выше, чем изоэлектрическая точка второго полипептида. В соответствии с данным аспектом один или более аминокислотных остатков в положениях 7, 9, 11, 14, 41, 74, 84, и 113 (нумерация по Кабату) вариабельной области тяжелой цепи первого полипептида содержат нейтрально или положительно заряженный аминокислотный остаток, и один или более аминокислотных остатков в соответствующих положениях вариабельной области тяжелой цепи второго полипептида содержат аминокислотный остаток с отличающимся зарядом по сравнению с первым полипептидом.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0012] На Фиг. 1A-1C представлены графики ИФА связывания ФНО-α человека с вариантами CNTO148 с одиночной заменой. На Фиг. 1A показано связывание ФНО-α с вариантами антитела S75D и N84D по сравнению с диким типом (148 ДТ и CNTO148). На Фиг. 1B показано связывание ФНО-α с вариантом антитела A88D по сравнению с диким типом. На Фиг. 1C показано связывание ФНО-α с вариантами антитела G9E и S71E по сравнению с диким типом. Связывание антитела CNTO95 с ФНО-α показано в качестве отрицательного контроля.

[0013] На Фиг. 2A-2C показаны результаты анализа вариантов CNTO148 с одиночной заменой при помощи аналитической эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (эксклюзионной ВЭЖХ). В частности, на Фиг. 2A представлен профиль эксклюзионной ВЭЖХ антитела CNTO148 дикого типа, на Фиг. 2B представлен профиль эксклюзионной ВЭЖХ варианта N84D, а на Фиг. 2C представлен профиль эксклюзионной ВЭЖХ варианта S75D.

[0014] На Фиг. 3A-3B показаны результаты анализа CNTO148 дикого типа и варианта A88D при помощи аналитический эксклюзионной ВЭЖХ. В частности, на Фиг. 3A представлен профиль эксклюзионной ВЭЖХ антитела CNTO148 дикого типа, а на Фиг. 2B представлен профиль эксклюзионной ВЭЖХ варианта A88D.

[0015] На Фиг. 4A-4C показаны результаты анализа вариантов CNTO148 дикого типа, G9E и S71E при помощи аналитической эксклюзионной ВЭЖХ. В частности, на Фиг. 4A представлен профиль эксклюзионной ВЭЖХ антитела CNTO148 дикого типа, на Фиг. 4B представлен профиль эксклюзионной ВЭЖХ варианта G9E, на Фиг. 4C представлен профиль эксклюзионной ВЭЖХ для варианта S71E.

[0016] На Фиг. 5A-5C представлены графики, демонстрирующие результаты анализа начала агрегации (коллоидной стабильности) вариантов CNTO148 с одиночной заменой. На Фиг. 5A показано начало агрегации для CNTO148 дикого типа, наблюдаемое при 63,9°C, на Фиг. 5B показано начало агрегации для варианта антитела S75D, наблюдаемое при 66,8°C, и на Фиг. 5C показано начало агрегации для варианта N84D, наблюдаемое при 65,8°C.

[0017] На Фиг. 6A и 6B представлены графики, демонстрирующие результаты анализа начала агрегации (коллоидной стабильности) CNTO148 дикого типа и варианта A88D. На Фиг. 6A показано, что начало агрегации для дикого типа происходит при 67,6°C, а на Фиг. 6B показано начало агрегации для варианта A88D при 66,9°C.

[0018] На Фиг. 7A-7C представлены графики, демонстрирующие результаты анализа начала агрегации (коллоидной стабильности) CNTO148 дикого типа, вариантов G9E и S71E. На Фиг. 7A показано, что начало агрегации для дикого типа происходит при 68,6°C, на Фиг. 7B показано, что начало агрегации для варианта G9E происходит при 65,7°C, а на Фиг. 7C показано начало агрегации для варианта S71E при 69,5°C.

[0019] На Фиг. 8A-8C представлены графики, демонстрирующие результаты анализа температуры разворачивания (конформационной стабильности) вариантов CNTO148 с одиночной заменой. На Фиг. 8A показана температура разворачивания для дикого типа, наблюдаемая при 63,9°C, на Фиг. 8B показана температура разворачивания для варианта S75D, наблюдаемая при 67,3°C, а на Фиг. 8C показана температура разворачивания для варианта N84D, наблюдаемая при 65,3°C.

[0020] На Фиг. 9A и 9B представлены графики, демонстрирующие результаты анализа температуры разворачивания (конформационной стабильности) CNTO148 дикого типа и варианта A88D. На Фиг. 9A показана температура разворачивания для дикого типа, наблюдаемая при 67,3°C, и на Фиг. 9B показана температура разворачивания для варианта A88D, наблюдаемая при 66,9°C.

[0021] На Фиг. 10A-10C представлены графики, демонстрирующие результаты анализа температуры разворачивания (конформационной стабильности) CNTO148 дикого типа, вариантов G9E и S71E. На Фиг. 10A показана температура разворачивания для дикого типа, наблюдаемая при 68,8°C, на Фиг. 10B показана температура разворачивания для варианта G9E, наблюдаемая при 65,8°C, а на Фиг. 10C показана температура разворачивания для варианта S71E, наблюдаемая при 69,5°C.

[0022] На Фиг. 11 представлен график ИФА связывания человеческого αVβ3 с вариантами антитела CNTO95 с одиночной заменой. На Фиг. 11 показано связывание αVβ3 с антителами S7R, G9R, V11R, P14R, P41R, S71K, A88R и S119R по сравнению с CNTO95 дикого типа. Связывание антитела CNTO148 с αVβ3 показано в качестве отрицательного контроля.

[0023] На Фиг. 12A-12I показаны результаты анализа вариантов CNTO95 с одиночной заменой при помощи аналитической эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (эксклюзионной ВЭЖХ). В частности, на Фиг. 12А показан профиль эксклюзионной ВЭЖХ антитела CNTO95 дикого типа, на Фиг. 12B показан профиль эксклюзионной ВЭЖХ варианта S7R, на Фиг. 12C показан профиль эксклюзионной ВЭЖХ варианта G9R, на Фиг. 12D показан профиль эксклюзионной ВЭЖХ варианта V11R, на Фиг. 12E показан профиль эксклюзионной ВЭЖХ варианта P14R, на Фиг. 12F показан профиль эксклюзионной ВЭЖХ варианта P41R, на Фиг. 12G показан профиль эксклюзионной ВЭЖХ варианта S71K, на Фиг. 12H показан профиль эксклюзионной ВЭЖХ варианта A88R, и на Фиг. 12I показан профиль эксклюзионной ВЭЖХ варианта S119R.

[0024] На Фиг. 13A-13I представлены графики, демонстрирующие результаты анализа начала агрегации (коллоидной стабильности) вариантов CNTO95 с одиночной заменой. На Фиг. 13A показано начало агрегации для CNTO95 дикого типа, наблюдаемое при 68,2°C, на Фиг. 13B показано начало агрегации для варианта антитела S7R, наблюдаемое при 67,2°C, на Фиг. 13C показано начало агрегации для варианта G9R, наблюдаемое при 57,9°C, на Фиг. 13D показано начало агрегации для варианта V11R, наблюдаемое при 63,9°C, на Фиг. 13E показано начало агрегации для варианта P14R, наблюдаемое при 63,5°C, на Фиг. 13F показано начало агрегации для варианта P41R, наблюдаемое при 66,4°C, на Фиг. 13G показано начало агрегации для варианта S71K, наблюдаемое при 64,9°C, на Фиг. 13H показано начало агрегации для варианта A88R, наблюдаемое при 67,6°C, и на Фиг. 13I показано начало агрегации для варианта S119R, наблюдаемое при 66,7°C.

[0025] На Фиг. 14A-14I представлены графики, демонстрирующие результаты анализа температуры разворачивания (конформационной стабильности) вариантов CNTO95 с одиночной заменой. На Фиг. 14А показана температура разворачивания для дикого типа, наблюдаемая при 68,8°C, на Фиг. 14B показана температура разворачивания для варианта S7R, наблюдаемая при 67,9°C, на Фиг. 14C показана температура разворачивания для варианта G9R, наблюдаемая при 59,4°C, на Фиг. 14D показана температура разворачивания для варианта V11R, наблюдаемая при 64,8°C, на Фиг. 14E показана температура разворачивания для варианта P14R, наблюдаемая 64,3°C, на Фиг. 14F показана температура разворачивания для варианта P41R, наблюдаемая при 66,8°C, на Фиг. 14G показана температура разворачивания для варианта S71K, наблюдаемая при 65,8°C, на Фиг. 14H показана температура разворачивания для варианта A88R, наблюдаемая при 68,0°C, и на Фиг. 14I показана температура разворачивания для варианта S119R, наблюдаемая при 67,6°C.

[0026] На Фиг. 15 показан ИФА связывания TIM3 человека с вариантами антитела к TIM3 с одиночной заменой.

[0027] На Фиг. 16A-16D показаны результаты анализа вариантов антитела к TIM3 с одиночной заменой при помощи эксклюзионной ВЭЖХ. На Фиг. 16A показан профиль эксклюзионной ВЭЖХ варианта вариант антитела S75D к TIM3, на Фиг. 16B показан профиль эксклюзионной ВЭЖХ антитела дикого типа к TIM3, на Фиг. 16C показан профиль эксклюзионной ВЭЖХ варианта антитела N84D к TIM3, и на Фиг. 16D показан профиль эксклюзионной ВЭЖХ варианта антитела A88D к TIM3.

[0028] На Фиг. 17А-17D показаны результаты анализа начала агрегации (коллоидной стабильности) вариантов антитела к TIM3 с одиночной заменой. На Фиг. 17A показано начало агрегации для варианта S75D, наблюдаемое при 67,5°C, на Фиг. 17B показано начало агрегации для варианта N84D, наблюдаемое при 68,2°C, на Фиг. 17C показано начало агрегации для варианта A88D, наблюдаемое при 66,7°C, на Фиг. 17D показано начало агрегации для дикого типа, наблюдаемое при 68,5°C.

[0029] На Фиг. 18 показана кинетика связывания PD1 для вариантов анти-PD1 антител с одиночной заменой как определено методом ППР.

[0030] На Фиг. 19A-19D показаны результаты анализа вариантов анти-PD1 антитела с одиночной заменой при помощи аналитический эксклюзионной ВЭЖХ. На Фиг. 19A показан профиль эксклюзионной ВЭЖХ варианта антитела S75D к PD1, на Фиг. 19B показан профиль эксклюзионной ВЭЖХ антитела дикого типа к PD1, на Фиг. 19C показан профиль эксклюзионной ВЭЖХ варианта антитела S84D к PD1, и на Фиг. 19D показан профиль эксклюзионной ВЭЖХ варианта антитела S88D к PD1.

[0031] На Фиг. 20A-20D показаны результаты анализа начала агрегации (коллоидной стабильности) вариантов анти-PD1 с одиночной заменой. На Фиг. 20A показано начало агрегации для варианта S75D, наблюдаемое при 66,6°C, на Фиг. 20B показано начало агрегации для варианта S84D, наблюдаемое при 66,1°C, на Фиг. 20C показано начало агрегации для варианта S88D, наблюдаемое при 66,5°C, на Фиг. 20D показано начало агрегации для дикого типа, наблюдаемое при 65,7°C.

[0032] На Фиг. 21 показан ИФА связывания человеческого ФНО с вариантами антител CNTO148 с комбинацией замен.

[0033] На Фиг. 22A-22E показаны результаты анализа комбинированных вариантов CNTO148 при помощи аналитической эксклюзионной хроматографии. На Фиг. 22A представлен профиль эксклюзионной ВЭЖХ CNTO148 дикого типа, на Фиг. 22B представлен профиль эксклюзионной ВЭЖХ варианта CNTO148 N84D/A88D, на Фиг. 22C представлен профиль эксклюзионной ВЭЖХ варианта CNTO148 S75D/A88D, на Фиг. 22D представлен вариант эксклюзионной ВЭЖХ варианта CNTO148 N75D/N84D/A88D, на Фиг. 22E представлен профиль эксклюзионной ВЭЖХ варианта CNTO148 S75D/N84D.

[0034] На Фиг. 23A-23E показаны результаты анализа начала агрегации (коллоидной стабильности) комбинированных вариантов CNTO148. На Фиг. 23A показано начало агрегации для варианта CNTO148 N84D/A88D, наблюдаемое при 66,8°C, на Фиг. 23B показано начало агрегации для варианта CNTO148 S75D/A88D, наблюдаемое при 66,8°C, на Фиг. 23C показано начало агрегации для варианта S75D/N84D/A88D, наблюдаемое при 67,2°C, на Фиг. 23D показано начало агрегации для варианта S75D/N84D, наблюдаемое при 67,1°C. На Фиг. 23E показано начало агрегации для дикого типа, наблюдаемое при 66,5°C.

[0035] На Фиг. 24A-24E представлены графики, демонстрирующие результаты анализа температуры разворачивания (конформационной стабильности) вариантов CNTO148 с множеством замен. На Фиг. 24A показана температура разворачивания для дикого типа, наблюдаемая при 66,4°C, на Фиг. 24B показана температура разворачивания для варианта N84D/A88D, наблюдаемая при 67,1°C, на Фиг. 24C показана температура разворачивания для варианта S75D/A88D, наблюдаемая при 66,8°C, на Фиг. 24D показана температура разворачивания для варианта S75D/N84D/A88D, наблюдаемая при 66,9°C, и на Фиг. 24E показана температура разворачивания для варианта S75D/N84D, наблюдаемая 67,3°C.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0036] Данное описание в целом относится к способам модификации поверхностного заряда для повышения продукции и очистки мультиспецифического антитела.

[0037] Данное описание также относится к антителам, полученным с использованием способов согласно изобретению. Данное описание также относится к антителам к PD1 и антителам к TIM3 и биспецифическим антителам к PD-1xTIM3, получаемым в данном описании, а также к способам их получения и применения. Созданные антитела к PD-1, антитела к TIM3 и биспецифические антитела к PD-1xTIM3 используются в качестве диагностических и терапевтических средств.

[0038] Соответственно, один аспект согласно данному изобретению относится к способу модификации изоэлектрической точки антитела. Данный способ включает обеспечение антитела, содержащего первый полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, и второй полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи. Способ дополнительно включает замещение в по меньшей мере одном из первого и второго полипептидов антитела одного или более аминокислотных остатков вариабельной области тяжелой цепи (V_H) в положениях 7, 9, 11, 14, 41, 70, 74, 82a, 84 и 113 в соответствии с системой нумерации по Кабату, причем замещение увеличивает или уменьшает изоэлектрическую точку антитела.

[0039] Термин «антитело» используется в самом широком смысле и, как правило, охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела и полученные из них молекулы меньшего размера) и поликлональные антитела. Термин «антитело» также включает моновалентные и мультивалентные антитела, например, бивалентные антитела, антитела, трехвалентные и четырехвалентные антитела. Термин «антитело» также охватывает моноспецифические и мультиспецифичные антитела, например, биспецифические антитела, триспецифические антитела, тетраспецифические антитела. Мультиспецифическое антитело представляет собой антитело, способное связываться с двумя или более различными антигенами или с двумя различными эпитопами одного и того же антигена. Соответственно, способ модификации изоэлектрической точки антитела, как описано в данном документе, применим к широкому спектру антител

[0040] В одном варианте осуществления антитело, модифицированное в соответствии со способом, описанным в данном документе, представляет собой молекулу иммуноглобулина (Ig) и содержит по меньшей мере две полипептидные цепи, т. е., две тяжелые (H) цепи. Известны пять типов тяжелых цепей Ig млекопитающих: α, δ, ε, γ и μ, причем тип тяжелой цепи определяет класс (изотип) антитела. Антитела согласно описанию могут быть любого класса (например, IgG, IgE, IgM, IgD и IgA) и подкласса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2). Тяжелая цепь может содержать только вариабельную область (V_H) или вариабельную область и константную область (C_H).

[0041] Антитело, модифицированное в соответствии со способом, описанным в данном документе, может дополнительно содержать две легкие (L) цепи. Как и тяжелая цепь, легкая цепь (т.е. легкие цепи лямбда (λ) и каппа (κ)) может содержать только вариабельную область (V_L) или вариабельную область и константную область (C_L).

[0042] В другом варианте осуществления антитело содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепей, слитые вместе с образованием одноцепочечного вариабельного фрагмента антитела (scFv) или одноцепочечного вариабельного домена с Fc-областью (т.е. scFv-Fc, например, миниантитело). В другом варианте осуществления фрагмент антитела представляет собой бивалентный или двухвалентный одноцепочечный вариабельный фрагмент, сконструированный путем связывания двух scFv вместе или в тандеме (то есть в тандемный scFv), или так, что они димеризуются с образованием диантител. В еще одном варианте осуществления антитело представляет собой трехвалентный одноцепочечный вариабельный фрагмент, сконструированный путем связывания трех scFv друг с другом или в тандеме, или в форме тримера с образованием триантител. В другом варианте осуществления антитело представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмента тетраантитела. В другом варианте осуществления изобретения антитело представляет собой «линейное антитело», который представляет собой антитело, содержащее пару тандемных Fd-фрагментов (V_H-C_H1-V_H-C_H1), которые образуют пару антигенсвязывающих областей (см. Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)), который включен в данный документ посредством ссылки во всей ее полноте).

[0043] Описанный в данном документе способ также подходит для модификации изоэлектрической точки химерных антител (т.е. антитела, в котором одна часть аминокислотной последовательности каждой из тяжелой и легкой цепей гомологична соответствующим последовательностям в антителе, полученном из определенного вида, или принадлежащие к определенному классу, в то время как оставшийся сегмент каждой цепи гомологичен соответствующим последовательностям другого вида или класса), антител с привитой CDR (т. е., антитела, которые содержат последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи одного вида, причем одна или более из областей CDR заменена областями CDR другого вида) и гуманизированных антител.

[0044] Антитела, пригодные для модификации в соответствии с описанными в данном документе способами, представляют собой предпочтительно человеческие антитела или гуманизированные антитела (полностью или частично гуманизированные), как описано выше. Альтернативно, антитела могут представлять собой антитела животных, такими как, но не ограничиваясь этим, антитело птицы, антитело акулы, антитело кита или млекопитающего, включая антитело млекопитающего, отличного от приматов, (например, коровы, свиньи, верблюда, ламы, лошади, козы, кролика, овцы, хомяка, морской свинки, кошки, собаки, крысы, мыши и т.д.) или антитело примата, отличного от человека (например, обезьяны, шимпанзе и т.д.).

[0045] Способы, описанные в данном документе, включают модификацию изоэлектрической точки антитела. Изоэлектрическая точка (pI) антитела представляет собой pH, при котором антитела не несут суммарного электрического заряда. Изоэлектрическую точку антитела или любого полипептида определяют по его аминокислотному составу. Например, полипептид, имеющий большое число основных аминокислотных остатков, будет иметь высокое значение pI, тогда как полипептид, имеющий большое число кислых аминокислотных остатков, будет иметь низкое значение pI. Соответственно, способы согласно данному изобретению включают модификацию аминокислотного состава антитела для изменения его pI. Более конкретно, способы, описанные в данном документе, включают модификацию одного или более аминокислотных остатков в по меньшей мере одной вариабельной области тяжелой цепи антитела для модификации pI антитела.

[0046] Аминокислотный состав вариабельной области тяжелой цепи антитела может быть модифицирован путем вставки, делеции или замещения аминокислоты. Аминокислотная «замена» включает замещение аминокислотного остатка в определенном положении в полипептидной последовательности другой аминокислотой. В одном варианте осуществления замена включает замещение аминокислотного остатка, который естественным образом не встречается в конкретном положении, или естественным образом не встречается в указанном организме, или в любом организме. Альтернативно, одна или более замен могут представлять собой аминокислотные остатки, которые часто встречаются в последовательностях сходных родственных полипептидов в одном и том же организме, например консервативные аминокислотные остатки, которые часто встречаются в последовательностях из других антител того же вида. Замены консервативными остатками из встречающихся в природе последовательностей из одного и того же вида, например, из человеческих последовательностей, могут снизить шансы повышенной антигенности для полипептидов, имеющих одну или более замен. Кроме того, при выборе аминокислотных остатков для замены также учитывается сохранение заряда (например, относительно более высокая частота того же положительно заряженного, отрицательно заряженного или незаряженного вида) по сравнению с последовательностями из родственных полипептидов в одном и том же организме. Эти особенности заряда, которые необходимо учитывать, могут оказывать влияние на поддержание структуры и/или стабильности антитела, которое содержит одну или более аминокислотных замен. Для целей модификации pI антитела аминокислотные замены включают замещение аминокислотного остатка, имеющего положительный или отрицательный заряд, на аминокислотный остаток, имеющий нейтральный заряд, и наоборот. Иллюстративные замены включают, но не ограничиваются ими: (1) замену нейтрально заряженной аминокислоты на положительно заряженную аминокислоту для увеличения pI; (2) замену отрицательно заряженной аминокислоты на нейтрально или положительно заряженную аминокислоту для увеличения pI; (3) замену нейтрально заряженной аминокислоты на отрицательно заряженную аминокислоту для снижения pI; и (4) замену положительно заряженной аминокислоты нейтрально или отрицательно заряженной аминокислоты для уменьшения pI.

[0047] Аминокислотное «делеция» включает удаление одного или более аминокислотных остатков для модификации изоэлектрической точки антитела, тогда как аминокислотная «вставка» включает добавление одного или более аминокислотных остатков для модификации изоэлектрической точки антитела. Примеры делеций включают, но не ограничиваются ими, делецию отрицательно заряженного аминокислотного остатка для увеличения pI или удаления положительно заряженного аминокислотного остатка для уменьшения pI. Подходящие добавления аминокислот включают, но не ограничиваются ими, добавление положительного аминокислотного остатка для увеличения pI антитела или добавление отрицательного аминокислотного остатка для уменьшения pI антитела.

[0048] Известные в данной области техники аминокислотные остатки, имеющие положительный заряд, включают, без ограничений, остатки, имеющие основную боковую цепь, например, лизин (K), аргинин (R) и гистидин (H). Известные в данной области техники аминокислотные остатки, имеющие отрицательный заряд, включают, без ограничений, остатки, имеющие кислую боковую цепь, например, глутаминовую кислоту (E) и аспарагиновую кислоту (D). Аминокислотные остатки, имеющие незаряженные боковые цепи, считаются нейтральными, например, серин, треонин, аспарагин, глутамин, цистеин, глицин, пролин, аланин, валин, изолейцин, лейцин, метионин, фенилаланин, тирозин и триптофан.

[0049] Такие замены, вставки или делеции часто включают манипуляцию с генами или мутагенез, которые изменяют исходную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, для модификации путем вставки, удаления или замены по меньшей мере одного нуклеотида с получением кодона, который кодирует представляющий интерес аминокислотный остаток. Более конкретно, кодон, кодирующий исходный аминокислотный остаток, заменяют на кодон, кодирующий аминокислотный остаток, который должен быть введен путем модификации. Такие модификации нуклеиновой кислоты могут быть выполнены специалистами в данной области техники с использованием хорошо известных способов, таких как сайт-направленный мутагенез или ПЦР-мутагенез.

[0050] В соответствии со описанными в данном документе способами замены, вставки или делеции аминокислот вводят в один или более полипептидов тяжелой цепи представляющего интерес антитела. В частности, аминокислотные замены, вставки или делеции вводят в вариабельную область тяжелой цепи представляющего интерес антитела. Вариабельная область тяжелой цепи разделена на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR). Три CDR в вариабельных областях тяжелой цепи обозначены как CDR1, CDR2 и CDR3 для каждой из вариабельных областей. CDR перемежаются с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Эти FR-области специфичны для размещения в надлежащей пространственной конфигурации контактных аминокислотных остатков CDR, которые отвечают за большую часть связывающей способности антитела. Каждая V_H состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от N-конца до C-конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Точные границы этих CDR были определены по-разному согласно разным системам. Система, описанная Кабатом (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) и (1991), которая полностью включена в данный документ посредством ссылки), которая используется в данном документе при ссылке на остатки вариабельной области тяжелой цепи, не только обеспечивает определенную систему нумерации остатков, применимую к любой вариабельной области антитела, но также обеспечивает точные границы остатков, определяющие три CDR. Эти CDR называются как CDR по Кабату.

[0051] В соответствии с описанными в данном документе способами изоэлектрическую точку антитела модифицируют путем замены по меньшей мере в одной из вариабельных областей тяжелой цепи антитела по меньшей мере одного аминокислотного остатка, причем аминокислотный остаток находится в положении 7, 9, 11, 14, 41, 70, 74, 82a, 84, и/или 113 по нумерации согласно Кабату в вариабельной области тяжелой цепи. Количество аминокислотных остатков, которые подвергаются модификации, не имеет конкретных ограничений. Например, в одном варианте осуществления одна аминокислотная замена в достаточной степени изменяет изоэлектрическую точку антитела. В другом варианте осуществления две аминокислотные замены достаточно изменяют изоэлектрическую точку антитела. В другом варианте осуществления для достаточного изменения изоэлектрической точки антитела требуются три, или четыре, или пять, или шесть, или семь, или восемь, или девять, или десять аминокислотных замен.

[0052] В одном варианте осуществления один или более аминокислотных остатков V_H в положениях 7, 9, 11, 14, 41, 74, 84 и/или 113 (нумерация по Кабату) представляют собой нейтрально заряженные аминокислотные остатки, а стадия замещения включает замену одного или более нейтрально заряженных аминокислотных остатков на один или более положительно заряженных аминокислотных остатков. Эта замена увеличит изоэлектрическую точку антитела по сравнению с антителом в его немодифицированном состоянии (т. е., исходным антителом или антителом дикого типа).

[0053] В другом варианте осуществления один или более аминокислотных остатков V_H в положениях 7, 9, 11, 14, 41, 74, 84 и/или 113 (нумерация по Кабату) представляют собой отрицательно заряженные аминокислотные остатки, а стадия замещения включает замену указанного одного или более отрицательно заряженных аминокислотных остатков на один или более нейтрально или положительно заряженных аминокислотных остатков. Данная замена также увеличит изоэлектрическую точку антитела по отношению к изоэлектрической точке антитела в его немодифицированном состоянии.

[0054] В дополнительном варианте осуществления один или более аминокислотных остатков V_H в положениях 9, 70, 74, 82a, и 84 (нумерация по Кабату) представляют собой нейтрально заряженные аминокислотные остатки, а стадия замещения включает замену указанного одного или более нейтрально заряженных аминокислотных остатков на один или более отрицательно заряженных аминокислотных остатков. Эта замена приведет к уменьшению изоэлектрической точки антитела по отношению к изоэлектрической точке немодифицированного исходного антитела.

[0055] В еще одном варианте осуществления один или более аминокислотных остатков V_H в положениях 9, 70, 74, 82a и 84 (нумерация по Кабату) представляют собой положительно заряженные аминокислотные остатки, и замещение включает замену указанного одного или более положительно заряженных аминокислотных остатков на один или более нейтрально или отрицательно заряженных аминокислотных остатков. Эта замена приведет к уменьшению изоэлектрической точки антитела по отношению к изоэлектрической точке немодифицированного исходного антитела.

[0056] Нет необходимости в обмене всех аминокислотных остатков, описанных выше. Как указано выше, аминокислотные замены можно вводить в положениях 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9 или 10 идентифицированных остатков в вариабельной области тяжелой цепи. Количество введенных аминокислотных замен зависит от желаемой величины изменения или разницы в изоэлектрической точке, то есть изменение на 0,1 единицы рН, изменение на 0,2 единицы рН, изменение на 0,3 единицы рН, изменение на 0,4 единицы рН, изменение на 0,5 единицы рН, изменение на 0,6 единицы рН, изменение на 0,7 единицы рН, изменение на 0,8 единицы рН, изменение на 0,9 единицы рН, изменение на более чем 1,0 единицу рН. Изменение или различие в изоэлектрической точке модифицированного антитела можно наблюдать с использованием изоэлектрического фокусирования. Изоэлектрическое фокусирование представляет собой метод электрофореза, который разделяет белки по их изоэлектрической точки. Белки можно наносить на полиакриламидный гель (IEF-гели) или полоски с иммобилизованным градиентом pH (IPG), содержащие фиксированный градиент pH. Применяют электрическое поле, и белок перемещается через градиент pH, становясь иммобилизованным в градиенте рН по мере приближения к его специфической pI. В альтернативном варианте осуществления теоретическая изоэлектрическая точка может быть определена с помощью программного обеспечения для анализа генов и аминокислотной последовательности (GENETYX и т.п.). Это полезно, когда необходима значительная модификация изоэлектрической точки, например, для достаточного разделения биспецифических антител от исходных антител.

[0057] В одном варианте осуществления замена включает обмен аминокислотного остатка V_H в положении 74 (нумерация по Кабату) в по меньшей мере одном из первого или второго полипептидов тяжелой цепи антитела на отрицательно заряженный аминокислотный остаток.

[0058] В другом варианте осуществления замена включает обмен аминокислотного остатка V_H в положении 82a (нумерация по Кабату) в по меньшей мере одном из первого или второго полипептидов тяжелой цепи антитела на отрицательно заряженный аминокислотный остаток.

[0059] В дополнительном варианте осуществления замена включает обмен аминокислотного остатка V_H в положении 84 (нумерация по Кабату) в по меньшей мере одном из первого или второго полипептидов тяжелой цепи антитела на отрицательно заряженный аминокислотный остаток.

[0060] В еще одном варианте осуществления замена включает обмен аминокислотного остатка V_H по меньшей мере в двух положениях, выбранных из положений 74, 82a и 84 (нумерация по Кабату), в по меньшей мере одном из первого или второго полипептидов тяжелой цепи антитела на отрицательно заряженный аминокислотный остаток.

[0061] В другом варианте осуществления замена содержит обмен аминокислотного остатка V_H в трех положениях 74, 82a, и 84 (нумерация по Кабату) в по меньшей мере одном из первого или второго полипептидов тяжелой цепи антитела с отрицательно заряженным аминокислотным остатком.

[0062] При выполнении способов, описанных в данном документе, аминокислотные замены, внесенные в антитело для модификации его изоэлектрической точки, не изменяют его антигенсвязывающий потенциал, т. е., модифицированное антитело сохраняет антигенсвязывающую активность немодифицированного антитела дикого типа или исходного антитела. В данном документе термин «сохраняет антигенсвязывающую активность» означает, что антитело поддерживает по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80% или более, 85% или более, 90% или более, 95% или более, т. е., 96%, 97%, 98%, 99% или 100% антигенсвязывающей активности антитела перед модификацией. До тех пор, пока может сохраняться достаточная активность связывания для связывания с антигеном, чтобы антитело могло выполнять свою функцию, аффинность, определяемая при 37°С в физиологических условиях, может составлять, например, 100 нМ или менее, предпочтительно 50 нМ или менее, более предпочтительно 10 нМ или менее и еще более предпочтительно 1 нМ или менее. Сохраняет ли полипептид, содержащий вариабельную область антитела с модифицированной изоэлектрической точкой, полученной способами, описанными в данном документе, антигенсвязывающую активность, можно определить с помощью способов, которые хорошо известны специалистам в данной области техники, таких как, но не ограничиваясь этим, Biacore (анализ межмолекулярных взаимодействий), анализ пролиферации клеток, ИФА (твердофазный иммуноферментный анализ), EIA (иммуноферментный анализ), РИА (радиоиммуноанализ) и флуоресцентный иммуноанализ.

[0063] При выполнении способов, описанных в данном документе, аминокислотные замены, внесенные в антитело для модификации его изоэлектрической точки, не изменяют стабильность антитела, например, его конформационную стабильность. Иными словами, модифицированное антитело демонстрирует по существу такую же стабильность, как и немодифицированное антитело дикого типа или исходное антитело. Используемый в данном документе термин «по существу ту же стабильность» означает, что модифицированный белок имеет менее чем 25% изменение в стабильности, менее чем 20% изменение в стабильности, менее чем 15% изменение в стабильности, менее чем 10% изменение в стабильности, менее чем 5%, 4%, 3%, 2% или 1% изменение в стабильности. Параметры, которые могут быть измерены как индикаторы стабильности антитела, включают, но не ограничиваются ими, температуру конформационного перехода с разворачиванием, температуру начала агрегации и скорости агрегации. Другие параметры стабильности антитела, которые могут быть измерены, включают стабильность в сыворотке in vitro, уровни деградации, биологическую активность, pH, цвет, прозрачность, химическую стабильность и физическую стабильность.

[0064] В одном варианте осуществления антитело, имеющее модифицированную изоэлектрическую точку, представляет собой моноспецифическое антитело. В соответствии с данным вариантом осуществления первый и второй полипептиды, каждый из которых содержит вариабельную область тяжелой цепи исходного моноспецифического антитела, являются одинаковыми, и одинаковые замены в одном или более идентифицированных положениях аминокислотных остатков (т. е., остатков 7, 9, 11, 14, 41, 70, 74, 82a, 84, и/или 113) выполняются как в первом, так и во втором полипептидах тяжелой цепи для получения варианта антитела, имеющего изоэлектрическую точку, которая отличается от изоэлектрической точки исходного антитела.

[0065] Способы, описанные в данном документе, можно использовать для изменения изоэлектрической точки практически любого моноспецифического антитела, ранее известного в данной области техники, или для разработки. Только в качестве примера моноспецифическое антитело, которое было модифицировано с применением способов, описанных в данном документе, представляет собой моноклональное антитело, которое связывается с ФНО-α, известное как CNTO148. Как описано в данном документе, вариабельная область тяжелой цепи антитела CNTO148 модифицирована по остаткам 74, 82a и 84 по Кабату, которые соответствуют остаткам 75, 84 и 88 соответственно SEQ ID NO: 1 (показан ниже), для уменьшения его изоэлектрической точки.

Вариабельная область тяжелой цепи CNTO148 (C14F1) - SEQ ID NO: 1

qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgfifssyamhwvrqapgnglewvafmsydgsnkkyadsvkgrftisrdn[s/d]kntlylqm[n/d]slr[a/d]edtavyycardrgiaaggnyyyygmdvwgqgttvtvss

[0066] В частности, остаток серина в положении 75 SEQ ID NO: 1 был замещен на остаток аспарагиновой кислоты (S75D), остаток аспарагина в положении 84 SEQ ID NO: 1 был замещен на остаток аспарагиновой кислоты (N84D), и остаток аланина в положении 88 SEQ ID NO: 1 был замещен на остаток аспарагиновой кислоты (A88D) для уменьшения изоэлектрической точки антитела CNTO148. Эти замены аминокислот не оказывали влияния на антигенсвязывающие способности антитела CNTO148 (см. Фиг. 1A, 1B и 1C).

[0067] Другое моноспецифическое антитело, которое было модифицировано с применением способов, описанных в данном документе, представляет собой моноклональное антитело, которое связывается с TIM3 (CD366), известное как TIMB337. Как описано в данном документе, вариабельная область тяжелой цепи антитела TIMB337 (HC TM3H24) модифицирована по остаткам 74, 82a и 84 по Кабату, которые соответствуют остаткам 75, 84 и 88 соответственно SEQ ID NO: 2 (показан ниже), для уменьшения его изоэлектрической точки. TIMB337 содержит вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 5.

Вариабельная область тяжелой цепи TIMB377 (TM3H24) - SEQ ID NO: 2

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGS GGSTYYADSVKGRFTISRDN[s/d]KNTLYLQM[n/d]SLR[a/d]EDTAVYYCAKSPYAPLD YWGQGTLVTVSS;

Вариабельная область легкой цепи TIMB377 - SEQ ID NO: 5

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVNDYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQGGHAPITFGQGTKVEIK

[0068] В частности, остаток серина в положении 75 SEQ ID NO: 2 был замещен на остаток аспарагиновой кислоты (S75D), остаток аспарагина в положении 84 SEQ ID NO: 2 был замещен на остаток аспарагиновой кислоты (N84D), и остаток аланина в положении 88 SEQ ID NO: 2 был замещен на остаток аспарагиновой кислоты (A88D) для уменьшения изоэлектрической точки антитела TIMB337. Эти аминокислотные замены не оказывали влияния на антигенсвязывающие способности антитела TIMB337 (см. Фиг. 15). Аминокислотные последовательности вариантов VH TIMB337 приведены ниже.

SEQ ID NO: 6 варианта S75D VH TM3B337

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNdKNTLYLQMnSLRaEDTAVYYCAKSPYAPLDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO: 7 варианта N84D VH TM3B337

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMDSLRaEDTAVYYCAKSPYAPLDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO: 8 варианта A88D VH TM3B337

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRDEDTAVYYCAKSPYAPLDYWGQGTLVTVSS

[0069] Другое моноспецифическое антитело, которое было модифицировано с применением способов, описанных в данном документе, представляет собой моноклональное антитело, которое связывается с PD-1 (CD279), известное как PD1B244. Как описано в данном документе, вариабельная область тяжелой цепи антитела PD1B244 (HC PD1H170) модифицирована по остаткам 74, 82a и 84 по Кабату, которые соответствуют остаткам 75, 84 и 88 соответственно SEQ ID NO: 3 (показан ниже), для уменьшения его изоэлектрической точки. PD1B2244 содержит вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 9.

Вариабельная область тяжелой цепи PD1B244 PD1H170 - SEQ ID NO: 3

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIF DTANYAQKFQGRVTITADE[s/d]TSTAYMEL[S/d]SLR[S/D]EDTAVYYCARPGLAAAYD TGSLDYWGQGTLVTVSS

Вариабельная область легкой цепи PD1B244 - SEQ ID NO: 9

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRNYWPLTFGQGTKVEIK

[0070] В частности, остаток серина в положении 75 SEQ ID NO: 3 был замещен на остаток аспарагиновой кислоты (S75D), остаток серина в положении 84 SEQ ID NO: 3 был замещен на остаток аспарагиновой кислоты (S84D), и остаток серина в положении 88 SEQ ID NO: 3 был замещен на остаток аспарагиновой кислоты (S88D) для уменьшения изоэлектрической точки антитела PD1B244. Эти аминокислотные замены не оказывали влияния на антигенсвязывающие свойства антитела PD1B244 (см. Фиг. 18). Аминокислотные последовательности вариантов VH PD1B244 приведены ниже.

SEQ ID NO: 10 варианта S75D VH PD1B244

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDTANYAQKFQGRVTITADEdTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGSLDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO: 11 варианта S84D VH PD1B244

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELdSLRSEDTAVYYCARPGLAAAYDTGSLDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO: 12 варианта S88D VH PD1B244

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDTANYAQKFQGRVTITADEsTSTAYMELSSLRDEDTAVYYCARPGLAAAYDTGSLDYWGQGTLVTVSS

[0071] В другом варианте осуществления антитело, имеющее модифицированную изоэлектрическую точку, представляет собой мультиспецифическое антитело, например, биспецифическое антитело. В соответствии с данным вариантом осуществления первый и второй полипептиды, содержащие вариабельную область тяжелой цепи мультиспецифического антитела, отличаются. В соответствии с данным вариантом осуществления аминокислотные замены, описанные в данном документе, могут присутствовать только в одной из вариабельных областей тяжелой цепи. В альтернативном варианте осуществления в вариабельных областях обеих тяжелых цепей могут быть выполнены аминокислотные замены, и эти замены могут быть одинаковыми или разными в зависимости от цели модификации. Например, если изоэлектрическая модификация выполнена для изменения периода полувыведения/скорость клиренса мультиспецифического антитела, то могут быть выполнены аналогичные замены в обеих вариабельных областях тяжелой цепи для увеличения или уменьшения pI антитела. В альтернативном варианте осуществления в вариабельных областях обеих тяжелых цепей могут быть выполнены различные аминокислотные замены для увеличения или уменьшения pI антитела.

[0072] В другом варианте осуществления аминокислотные замены присутствуют только в одной вариабельной области тяжелой цепи мультиспецифического антитела, например, биспецифического антитела. Такой подход желателен, если биспецифическое антитело получают из двух исходных антител, имеющих сходные pI. При использовании двух исходных антител с одинаковыми или аналогичными изоэлектрическими точками для создания биспецифического антитела, разделение и очистка полученного из него биспецифического антитела с использованием стандартных методов рекомбинации и экспрессии клеток сильно затруднены. Соответственно, модификация исходных антител для увеличения разности в pI между ними приведет к получению биспецифического антитела, которое можно более легко отделить и отличить от исходных антител, тем самым увеличивая выход и чистоту биспецифического антитела.

[0073] Соответственно, другой аспект данного описания относится к способу увеличения степени разделения биспецифического антитела от двух его исходных антител. Данный способ включает обеспечение первого и второго исходных антител, причем каждое исходное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи. Способ дополнительно включает замещение в по меньшей мере одном из первого и второго исходных антител одного или более аминокислотных остатков в вариабельной области тяжелой цепи (VH) в положениях 7, 9, 11, 14, 41, 70, 74, 82a, 84 и 113, в соответствии с системой нумерации по Кабату, при этом замещение увеличивает или уменьшает изоэлектрическую точку первого исходного антитела относительно второго исходного антитела. Способ дополнительно включает получение биспецифических антител из двух исходных антител после указанного замещения, и отделения биспецифического антитела, полученного из двух исходных антител, причем степень разделения биспецифического антитела от двух исходных антител увеличивается в результате указанного замещения.

[0074] В соответствии с этим аспектом, когда один или более аминокислотных остатков в области V_H в положениях 7, 9, 11, 14, 41, 74, 84 и 113 (нумерация по Кабату) первого исходного антитела представляют собой нейтрально заряженные аминокислотные остатки, один или более из этих аминокислотных остатков может быть замещен на один или более положительно заряженных аминокислотных остатков. Эта замена приведет к увеличению изоэлектрической точки антитела по отношению к изоэлектрической точке второго исходного антитела. В альтернативном варианте осуществления, когда один или более аминокислотных остатков области V_H в положениях 7, 9, 11, 14, 41, 74, 84 и 113 (нумерация по Кабату) первого исходного антитела представляют собой отрицательно заряженные аминокислотные остатки, аминокислотные остатки могут быть замещены путем замены одного или более отрицательно заряженных аминокислотных остатков на один или более нейтрально или положительно заряженных аминокислотных остатков. Эта замена также увеличит изоэлектрическую точку первого исходного антитела по отношению ко второму исходному антителу.

[0075] В другом варианте осуществления, когда один или более аминокислотных остатков области V_H в положениях 9, 70, 74, 82a и 84 (нумерация по Кабату) первого исходного антитела представляют собой нейтрально заряженные аминокислотные остатки, один или более из этих аминокислотных остатков могут быть замещены путем замены указанных одного или более нейтрально заряженных аминокислотных остатков на один или более отрицательно заряженных аминокислотных остатков. Эта замена приведет к уменьшению изоэлектрической точки первого исходного антитела относительно второго исходного антитела. В дополнительном варианте осуществления, когда один или более аминокислотных остатков области V_H в положениях 9, 70, 74, 82a и 84 (нумерация по Кабату) первого исходного антитела представляют собой положительно заряженные аминокислотные остатки, один или более из них аминокислотные остатки могут быть замещены путем замены указанных одного или более положительно заряженных аминокислотных остатков на один или более нейтрально или отрицательно заряженных аминокислотных остатков. Эта замена также уменьшит изоэлектрическую точку первого исходного антитела по отношению ко второму исходному антителу.

[0076] Как описано выше, количество аминокислотных остатков, которые модифицированы или замещены в первом или втором исходном антителе, не ограничено. В одном варианте осуществления выполняют замены, которые изменяют на 0,1 единицы рН, 0,2 единицы рН, 0,3 единицы рН, 0,4 единицы рН или на 0,5 единицы рН, 0,6 единицы рН, 0,7 единицы рН, 0,8 единицы рН, 0,9 единицы рН и на 1,0 единицы рН в изоэлектрической точке первого исходного антитела. В другом варианте осуществления выполняют замену, которая изменяет на 1,0 единицу pH в изоэлектрической точке первого исходного антитела по отношению ко второму исходному антителу. Эти изменения можно получить с помощью 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных замен. Замены аминокислотных остатков, описанные выше, могут выполняться в области V_H либо одного из первого или второго исходного антитела, либо альтернативно как первого, так и второго исходных антител. Когда аминокислотные замены выполняются как для первого, так и для второго исходных антител, одна или более аминокислотных замен в области V_H первого исходного антитела будут снижать изоэлектрическую точку первого исходного антитела, тогда как одна или более аминокислотных замен в области V_H второго исходного антитела будет увеличивать изоэлектрическую точку второго исходного антитела. Аминокислотные замены, сделанные как в первом, так и во втором исходном антителе, могут быть сделаны в одном и том же положении аминокислотного остатка (хотя и могут быть разными заменами) или могут быть выполнены в разных положениях аминокислотных остатков.

[0077] В одном варианте осуществления аминокислотный остаток V_H в положении 74 (нумерация по Кабату) в первом исходном антителе заменяют на отрицательно заряженный аминокислотный остаток для уменьшения изоэлектрической точки первого исходного антитела относительно второго исходного антитела.

[0078] В другом варианте осуществления аминокислотный остаток V_H в положении 82a (нумерация по Кабату) в первом исходном антителе заменяют на отрицательно заряженный аминокислотный остаток для уменьшения изоэлектрической точки первого исходного антитела относительно второго исходного антитела.

[0079] В другом варианте осуществления аминокислотный остаток V_H в положении 84 (нумерация по Кабату) в первом исходном антителе заменяют на отрицательно заряженный аминокислотный остаток для уменьшения изоэлектрической точки первого исходного антитела относительно второго исходного антитела.

[0080] В дополнительном варианте осуществления аминокислотный остаток V_H по меньшей мере в двух положениях, выбранных из положений 74, 82a и 84 (нумерация по Кабату) в первом исходном антителе, заменяют на отрицательно заряженный аминокислотный остаток для уменьшения изоэлектрической точки первого исходного антитела относительно второго исходного антитела.

[0081] В еще одном варианте осуществления аминокислотный остаток V_H во всех трех положениях 74, 82a, и 84 (нумерация по Кабату) в первом исходном антителе заменяют на отрицательно заряженный аминокислотный остаток для уменьшения изоэлектрической точки первого исходного антитела по сравнению со вторым исходным антителом.

[0082] Как описано выше, модификация изоэлектрических точек первого и второго исходных антител приводит к получению биспецифического антитела, имеющего изоэлектрическую точку, которая отличается от каждого из исходных антител. Следовательно, при помощи способов ионообменной хроматографии значительно увеличивается разделение и, в конечном счете, восстановление представляющего интерес биспецифического антитела.

[0083] Способы получения биспецифических антител известны в данной области техники, и способ согласно данному описанию по существу можно включить в любой из этих известных способов для увеличения степени разделения и очистки биспецифических антител. Традиционное получение полноразмерных биспецифических антител основано на совместной экспрессии двух пар тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина, причем две цепи имеют различную специфичность (Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983), которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме). В результате случайного распределения и рекомбинации тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов эти гибридомы (квадромы) образуют смесь из 10 различных возможных молекул антител, причем только одна из них имеет правильную биспецифичную структуру. Использование способов, описанных в данном документе, для увеличения разности в изоэлектрических точках исходных антител будет в значительной степени способствовать отделению и очистке желаемого биспецифического антитела от исходных антител и других побочных продуктов.

[0084] Другие способы получения биспецифических антител включают, без ограничений, метод «выступы-во-впадины», который включает аминокислотное конструирование, которое создает стерические влияния, способствующие образованию гетеродимеров и не способствующие образованию гомодимеров, как описано в патенте США № 8216805, выданный Carter, см. также Ridgway et al., Protein Engineering 9(7):617 (1996); и Atwell et al., J. Mol. Biol. 1997 270:26, содержание каждого из которых полностью включено в данный документ путем ссылки. Кроме того, как описано в Merchant et al., Nature Biotech. 16:677 (1998), который полностью включен в данный документ посредством ссылки, эти мутации типа «выступы-во-впадины» могут быть комбинированы с дисульфидными связями для смещения образования в сторону гетеродимеризации.

[0085] Дополнительный метод, используемый для получения биспецифических антител, часто называют методом «электростатического взаимодействия» или «заряженных пар», как описано в Gunasekaran et al., J. Biol. Chem. 285(25):19637 (2010), который полностью включен в данный документ посредством ссылки. В данном способе для смещения образования в сторону желаемой гетеродимеризации используют электростатику.

[0086] Отделение биспецифического антитела от исходных антител выполняют с использованием стандартных методик разделения, известных в данной области техники. Например, ионообменную хроматографию обычно применяют для отделения биспецифического антитела от его исходных антител. Вкратце, смесь исходных и биспецифических антител связана с катионообменным материалом (или, альтернативно, анионообменным материалом) с использованием загрузочного буфера, причем загрузочный буфер имеет первую удельную проводимость и pH. Катионообменный материал промывают промежуточным буфером со второй удельной проводимостью и/или pH, который больше, чем у загрузочного буфера, чтобы элюировать контаминант (то есть, исходные антитела) из ионообменного материала. Катионообменный материал промывают промывочным буфером, который имеет третью удельную проводимость и/или pH, который меньше, чем у промежуточного буфера, а затем промывают элюирующим буфером с четвертой удельной проводимостью и/или pH, который больше, чем у промежуточного буфера, чтобы элюировать желаемое биспецифическое антитело из ионообменного материала.

[0087] Разделение и очистку биспецифических антител можно также выполнить с использованием других хроматографических методов, таких как хроматография гидрофобного взаимодействия, аффинная хроматография, эксклюзионная/гель-фильтрационная хроматография и обращенно-фазовая хроматография, проводимая при атмосферном давлении или при высоком давлении с использованием таких систем, как FPLC (жидкостная экспресс-хроматография белков) и ВЭЖХ. Методы очистки также включают электрофоретические методики, изоэлектрическое фокусирование, иммунологические методики, методики осаждения, диализа и хроматофокусирования. Применимы также методики ультрафильтрации и диафильтрации в сочетании с концентрированием белков. Для получения общего руководства по подходящим методикам очистки, см., например, Robert Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Ed (Springer-Verlag 1994), которая полностью включена в данный документ посредством ссылки.

[0088] Описанные в данном документе антитела, содержащие одну или более аминокислотных замен, подходящих для увеличения или уменьшения pI антитела, могут дополнительно содержать одну или более дополнительных аминокислотных замен, ранее выявленных как пригодные для модификации поверхностного заряда и pI антитела, включая, без ограничений, аминокислотные замены, рассмотренные в публикации заявки на патент США № 20140294823, выданной Moore, и публикации заявки на патент США № 20090263392, выданном Igawa et al., которые полностью включены в данный документ посредством ссылки. Аналогично, антитела, описанные в данном документе, могут дополнительно содержать дополнительные аминокислотные замены в области Fc, которые, как известно, изменяют ряд дополнительных функциональных характеристик, таких как связывание FcγR и/или связывание FcRn. Оптимизированные варианты Fc известны в данной области техники, см., например, патент США № 8188 231, выданный Lazar, патент США № 9040041, выданный Desjarlais et al., и патент США № 8802820, выданный Chamberlain et al., все из которых полностью включены в данный документ посредством ссылки.

[0089] Как описано выше, антитела, описанные в данном документе, могут быть получены с использованием любой из различных методик с использованием выделенных полинуклеотидов, векторов и клеток-хозяев. Как правило, антитела могут быть получены способами культуры клеток, включая получение моноклональных антител с помощью стандартных способов, или трансфекции генов антител, тяжелых цепей и/или легких цепей в подходящие клетки бактерий или клетки млекопитающих, чтобы обеспечить выработку антител, причем антитела могут быть рекомбинантными. Для получения рекомбинантного вектора экспрессии, трансфекции клеток-хозяев, отбора трансформантов, культивирования клеток-хозяев и выделения антитела из культуральной среды применяют стандартные методы молекулярной биологии. Трансфицирование клетки-хозяина можно проводить с использованием различных методик, обычно применяемых для введения экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяин, например, путем электропорации, осаждения фосфатом кальция, диэтиламиноэтилдекстран-опосредованную трансфекцию и т. п. Хотя можно экспрессировать антитела, описанные в данном документе, или в прокариотических, или в эукариотических клетках-хозяевах, экспрессия антител в эукариотических клетках иногда является предпочтительной, а иногда предпочтительной в клетках-хозяевах млекопитающих, поскольку такие эукариотические клетки (и в частности клетки млекопитающих) с большей вероятностью, чем прокариотические клетки, собирают и секретируют правильно сложенное и иммунологически активное антитело.

[0090] Иллюстративные клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител согласно изобретению включают клетки яичника китайского хомяка (клетки CHO) (включая DHFR-клетки CHO, описанные в Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216-4220 (1980), которая полностью включена в данный документ посредством ссылки). Другие подходящие клетки - хозяева млекопитающего включают, помимо прочего, клетки миеломы NS0, клетки COS и клетки SP2. При введении рекомбинантных векторов экспрессии, кодирующих гены антитела, в клетки-хозяева млекопитающего, антитела получают путем культивирования клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для экспрессии антитела в клетках-хозяевах или, более предпочтительно, секреции антитела в культуральную среду, в которой выращивают клетки-хозяев.

[0091] Данное описание также относится к антителу, имеющему модифицированную изоэлектрическую точку, полученную с помощью способов, описанных в данном документе. Как описано выше, изоэлектрическая точка практически любого антитела может быть модифицирована с использованием способов, описанных в данном документе, при условии, что указанное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи.

[0092] Четвертый аспект описания относится к мультиспецифическому антителу, которое содержит первый полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, и второй полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, причем изоэлектрическая точка первого полипептида меньше, чем изоэлектрическая точка второго полипептида из-за того, что один или более аминокислотных остатков в положениях 9, 70, 74, 82a и 84 (нумерация по Кабату) вариабельной области тяжелой цепи первого полипептида содержат нейтрально или отрицательно заряженный аминокислотный остаток, и один или более аминокислотных остатков в соответствующих положениях вариабельной области тяжелой цепи второго полипептида содержат аминокислотный остаток с отличающимся зарядом по сравнению с первым полипептидом.

[0093] Способы получения антител, а также способы внесения аминокислотных замен описаны выше. В одном варианте осуществления нейтрально или отрицательно заряженные аминокислотные остатки в положениях 9, 70, 74, 82a и 84 первого полипептида вводят в первый полипептид путем аминокислотной замены.

[0094] В соответствии с данным аспектом раскрытия иллюстративное биспецифическое антитело, описанное в данном документе, представляет собой антитело, которое связывает ФНО-α и αVβ3. Данное антитело имеет первый полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, которая вместе с его легкой цепью связывает ФНО-α (CNTO148). Изоэлектрическая точка данного первого полипептида тяжелой цепи меньше, чем изоэлектрическая точка второго полипептида тяжелой цепи антитела, которая вместе с его легкой цепью связывает αVβ3.

[0095] В одном варианте осуществления вариабельная область тяжелой цепи первого полипептида содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в которой остаток в положении 75 (соответствует остатку 74 согласно Кабату) представляет собой отрицательно заряженный аминокислотный остаток, такой как остаток аспарагиновой кислоты (S75D CNTO148). В альтернативном варианте осуществления вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в которой аминокислотный остаток в положении 84 (соответствует остатку 82а согласно Кабату) представляет собой отрицательно заряженный аминокислотный остаток, такой как остаток аспарагиновой кислоты (N84D CNTO148). В еще одном варианте осуществления вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в которой аминокислотный остаток в положении 88 (соответствует остатку 84 согласно Кабату) представляет собой отрицательно заряженный аминокислотный остаток, такой как остаток аспарагиновой кислоты (A88D CNTO148).

[0096] В еще одном варианте осуществления вариабельная область тяжелой цепи содержит более одной аминокислотной замены, которая снижает pI биспецифического антитела. В частности, в одном варианте осуществления вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в которой аминокислотные остатки в положениях 84 и 88 (соответствующие остаткам 82a и 84 согласно Кабату) представляют собой отрицательно заряженные аминокислотные остатки, такие как остатки аспарагиновой кислоты (N84D и A88D CNTO148). В одном варианте осуществления вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в которой аминокислотные остатки в положениях 75 и 88 (соответствующие остаткам 74 и 84 согласно Кабату) представляют собой отрицательно заряженные аминокислотные остатки, такие как остатки аспарагиновой кислоты (S75D и A88D CNTO148). В одном варианте осуществления вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в которой аминокислотные остатки в положениях 75 и 84 (соответствующие остаткам 74 и 82a согласно Кабату) представляют собой отрицательно заряженные аминокислотные остатки, такие как остатки аспарагиновой кислоты (S75D и N84D CNTO148). В еще одном варианте осуществления вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, в которой аминокислотные остатки в положениях 75, 84 и 88 (соответствующие остаткам 74, 82a и 84 согласно Кабату) представляют собой отрицательно заряженные аминокислотные остатки, такие как остатки аспарагиновой кислоты (S75D, N84D, и A88D CNTO148).

[0097] Как было указано выше, это иллюстративное биспецифическое антитело имеет второй полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, которая вместе с его легкой цепью связывает αVβ3. Этот второй полипептид содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела CNTO95, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (показана ниже). В одном варианте осуществления один или более аминокислотных остатков в положениях 7, 9, 11, 14, 41, 74, 84 и 113 данной вариабельной области тяжелой цепи замещены на нейтрально или положительно заряженный аминокислотный остаток.

Вариабельная область тяжелой цепи CNTO95 (C95H22) - SEQ ID NO: 4

QVQLVESGGGVVQPGRSRRLSCAASGFTFSRYTMHWVRQAPGKGLEWVAVISFDGSNKYYVDSVKGRFTISRDNSENTLYLQVNILRAEDTAVYYCAREARGSYAFDIWGQGTMVTVSS

[0098] Другое иллюстративное биспецифическое антитело, описанное в данном документе, представляет собой антитело, которое связывает TIM3 (CD366) и PD-1 (CD279). Это антитело имеет первый полипептид, содержащий тяжелую цепь (TM3H24), имеющую вариабельную область, которая вместе с его легкой цепью связывает TIM3. В одном варианте осуществления изоэлектрическая точка данного первого полипептида тяжелой цепи меньше, чем изоэлектрическая точка второго полипептида тяжелой цепи антитела, которая вместе с его легкой цепью связывает PD-1. В соответствии с данным вариантом осуществления эта вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, в которой остаток в положении 75 (соответствует остатку 74 согласно Кабату) представляет собой отрицательно заряженный аминокислотный остаток, такой как остаток аспарагиновой кислоты (S75D TM3H24). В альтернативном варианте осуществления вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, в которой аминокислотный остаток в положении 84 (соответствует остатку 82а согласно Кабату) представляет собой отрицательно заряженный аминокислотный остаток, такой как остаток аспарагиновой кислоты (N84D TM3H24). В еще одном варианте осуществления вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, в которой аминокислотный остаток в положении 88 (соответствует остатку 84 согласно Кабату) представляет собой отрицательно заряженный аминокислотный остаток, такой как остаток аспарагиновой кислоты (A88D TM3H24).

[0099] В альтернативном варианте осуществления второй полипептид, содержащий тяжелую цепь, имеющую вариабельную область (PD1H170), которая вместе с его легкой цепью связывается с PD-1, модифицируют для снижения его pI относительно pI тяжелой цепи TM3H24 и более высокого pI биспецифического антитела. В соответствии с данным вариантом осуществления вариабельная область тяжелой цепи PD1H170 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, в которой остаток в положении 75 (соответствует остатку 74 согласно Кабату) представляет собой отрицательно заряженный аминокислотный остаток, такой как остаток аспарагиновой кислоты (S75D PD1H170). В альтернативном варианте осуществления вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, в которой аминокислотный остаток в положении 84 (соответствует остатку 82а согласно Кабату) представляет собой отрицательно заряженный аминокислотный остаток, такой как остаток аспарагиновой кислоты (S84D PD1H170). В еще одном варианте осуществления вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, в которой аминокислотный остаток в положении 88 (соответствует остатку 84 согласно Кабату) представляет собой отрицательно заряженный аминокислотный остаток, такой как остаток аспарагиновой кислоты (S88D PD1H170).

[0100] Другой аспект данного раскрытия относится к мультиспецифическому антителу, которое содержит первый полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, и второй полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, причем изоэлектрическая точка первого полипептида выше, чем изоэлектрическая точка второго полипептида из-за того, что один или более аминокислотных остатков в положениях 7, 9, 11, 14, 41, 74, 84 и 113 (нумерация по Кабату) вариабельной области тяжелой цепи первого полипептида содержат нейтрально или положительно заряженный аминокислотный остаток, и один или более аминокислотных остатков в соответствующих положениях вариабельной области тяжелой цепи второго полипептида содержат аминокислотный остаток с отличающимся зарядом (то есть отрицательно или нейтрально заряженный аминокислотный остаток, соответственно) по сравнению с первым полипептидом.

[0101] В одном варианте осуществления один или более аминокислотных остатков в положениях 9, 70, 74, 82a и 84 (нумерация по Кабату) вариабельной области тяжелой цепи второго полипептида содержат нейтрально или отрицательно заряженный аминокислотный остаток, и один или более аминокислотных остатков в соответствующих положениях вариабельной области тяжелой цепи первого полипептида содержат аминокислотный остаток с отличающимся зарядом (т. е., отрицательно или нейтрально заряженный остаток, соответственно) по сравнению с первым полипептидом.

[0102] В одном варианте осуществления нейтрально или положительно заряженные аминокислотные остатки в одном или более положениях 7, 9, 11, 14, 41, 74, 84 и 113 первого полипептида тяжелой цепи вводят в первый полипептид путем аминокислотной замены. Аналогичным образом, один или более нейтрально или отрицательно заряженных аминокислотных остатков во втором полипептиде тяжелой цепи вводят во второй полипептид путем аминокислотной замены.

[0103] Изобретение также обеспечивает антитело к TIM3, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO: 6, 7 или 8 и вариабельную область легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 5. Изобретение также обеспечивает антитело к TIM3, содержащее VH SEQ ID NO: 6 и VL SEQ ID NO: 5. Изобретение также обеспечивает антитело к TIM3, содержащее VH SEQ ID NO: 7 и VL SEQ ID NO: 5. Изобретение также обеспечивает антитело к TIM3, содержащее VH SEQ ID NO: 8 и VL SEQ ID NO: 5.

[0104] Изобретение также обеспечивает антитело к PD-1, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO: 10, 11 или 12 и вариабельную область легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 9. Изобретение также обеспечивает антитело к PD-1, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO: 10 и вариабельную область легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 9. Изобретение также обеспечивает антитело к PD-1, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO: 11 и вариабельную область легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 9. Изобретение также обеспечивает антитело к PD-1, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO: 12 и вариабельную область легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 9.

[0105] Изобретение также обеспечивает биспецифическое антитело к PD1xTIM3, содержащее первый домен, который связывает PD-1, и второй домен, который связывает TIM3, в котором первый домен содержит VH SEQ ID NO: 10, 11 или 12 и VL SEQ ID NO: 9, и второй домен содержит VH SEQ ID NO: 6, 7 или 8 и VL SEQ ID NO: 5.

[0106] В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1, антитело к TIM3 и биспецифические антитела к PD-1xTIM3 представляют собой изотип IgG1. В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1, антитело к TIM3 или биспецифические антитела к PD-1xTIM3 представляют собой изотип IgG2. В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1, антитело к TIM3 или биспецифические антитела к PD-1xTIM3 представляют собой изотип IgG3. В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1, антитело к TIM3 или биспецифические антитела к PD-1xTIM3 представляют собой изотип IgG4.

[0107] В некоторых вариантах осуществления антитело, предложенное в данном документе, содержит по меньшей мере одну мутацию в Fc антитела, которая модулирует связывание антитела с Fc-рецептором (FcR). В некоторых вариантах осуществления FcR представляет собой FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIII или FcRn. В некоторых вариантах осуществления антитело, предложенное в данном документе, содержит мутацию S228P.

[0108] Иллюстративный константный домен IgG4 приведен в SEQ ID NO: 13 (IgG4 с мутацией S228P).

SEQ ID NO: 13

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

[0109] Биспецифические антитела к PD-1/TIM3 можно создавать in vitro в бесклеточной среде, вводя асимметричные мутации в области CH3 двух моноспецифических гомодимерных антител и образуя биспецифическое гетеродимерное антитело из двух исходных моноспецифических гомодимерных антител в восстановительных условиях для обеспечения изомеризации дисульфидной связи, в соответствии со способами, описанными в международной патентной публикации № WO 2011/131746. В этих способах первое моноспецифическое двухвалентное антитело и второе моноспецифическое двухвалентное антитело конструируют с возможностью обладания определенными заменами в домене CH3, способствующими стабильности гетеродимера; антитела инкубируют вместе в восстановительных условиях, достаточных для обеспечения подверженности цистеинов в шарнирной области изомеризации дисульфидной связи; получая таким образом биспецифическое антитело в результате обмена плечами Fab. Замены, которые могут быть использованы, представляют собой F405L в одной тяжелой цепи и K409R в другой тяжелой цепи в антителах IgG1. В антителах IgG4 можно использовать одну тяжелую цепь дикого типа и мутацию F405L/R409K в другой тяжелой цепи. Условия инкубации можно оптимально возвращать к невосстанавливающим. Иллюстративные восстанавливающие агенты, которые могут применяться, представляют собой 2-меркаптоэтиламин (2-MEA), дитиотреитол (DTT), дитиоэритритол (DTE), глутатион, трис(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP), L-цистеин и бета-меркаптоэтанол. Например, можно применять инкубацию в течение по меньшей мере 90 мин при температуре по меньшей мере 20°C в присутствии по меньшей мере 25 мМ 2-MEA или в присутствии по меньшей мере 0,5 мМ дитиотреитола при pH от 5 до 8, например, при pH 7,0 или при pH 7,4.

В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1, антитело к TIM3 и биспецифические антитела к PD-1xTIM3 представляют собой антагонистические антитела. Иллюстративная биологическая активность, индуцированная антагонистическими антителами, предложенными в данном документе, представляет собой активацию антигенспецифических CD4⁺ или CD8⁺ T-клеток. Для оценки антагонического характера антител, предложенных в данном документе, можно использовать различные показатели, такие как повышенная пролиферация или повышенная продукция интерферона -γ (ИФН -γ), ИЛ-17, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-22, ИЛ-23 или ГМ-КСФ с помощью антигенспецифических CD4⁺ или CD8⁺ T-клеток. В иллюстративном анализе используют воздействие антител на Т-клетки нормального донора, которые стимулируются аллогенными дендритными клетками или специфическими антигенами, такими как столбнячный анатоксин или ЦМВ. В таких условиях изменения функции T-клеток при обработке антителом можно обнаруживать посредством измерения уровней цитокина в супернатанте либо по активации маркеров T-клеток. В иллюстративном анализе МКПК, определенные как реактивные к антигенам ЦМВ, используют в качестве источника антигенспецифических CD4⁺ или CD8⁺ T-клеток. 1,5×10⁶ клеток/мл или 2×10⁶ ЦМВ-реактивных МКПК высевают на чашки для культивирования и 0,1 -0,2 мкг/мл пептидов ЦМВ добавляют к культурам. Пептиды ЦМВ можно приобрести, например, у компании JPT Technologies. Тестируемые антитела добавляют в однократной дозе 10 мкг/мл, планшеты инкубируют в течение 6 суток и оценивают пролиферацию клеток путем добавления 1 мкКи/лунка метил-3Н-тимидина (PerkinElmer) в течение 6 часов, и измеряют радиоактивность в каждом образце. В альтернативном варианте осуществления продукцию цитокинов клетками измеряют с помощью ИФА или известных мультиплексных анализов. Термин «антагонист» или «антагонистическое» относится к антителу, которое при связывании с PD-1, TIM-3 или обеими подавляет по меньшей мере одну биологическую активность, опосредованную лигандом PD-1 и/или TIM-3. Антитело является антагонистом, если происходит подавление биологической активности на по меньшей мере около 20%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, или 100% больше, чем в отсутствие антагониста (например, отрицательный контроль), или если подавление является статистически значимым по сравнению с подавлением в отсутствие антагониста. Иллюстративный лиганд TIM-3 представляет собой галектин-9. PD-L1 представляет собой лиганд для PD-1.

[0110] Изобретение также обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую антитела к PD-1, антитела к TIM3 и биспецифические антитела к PD-1xTIM3 согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Для терапевтического применения возможна подготовка антител по изобретению в виде фармацевтических композиций, содержащих эффективное количество антител в качестве активного ингредиента в фармацевтически приемлемом носителе. Термин «носитель» относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или несущей среде, с которыми вводят антитело настоящего изобретения. Такие несущие среды могут представлять собой жидкости, такие как вода и масла, включая масла минерального, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т. п. Например, можно применять 0,4%-й солевой раствор и 0,3%-й раствор глицина. Эти растворы стерильны и по существу не содержат твердых частиц. Их можно стерилизовать с применением хорошо известных стандартных методик стерилизации (например, фильтрации). Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для приближения к физиологическим условиям, такие как регулирующие pH и буферные агенты, стабилизирующие, загущающие, увлажняющие и окрашивающие агенты и т. д. Концентрация антител или их антигенсвязывающих фрагментов согласно изобретению в таком фармацевтическом составе может варьировать от менее около 0,5%, обычно по меньшей мере около 1% и до 15 или 20% вес., и может выбираться преимущественно на основании необходимой дозы, объемов текучей среды, значений вязкости и т. д. в соответствии с конкретным выбранным способом введения. Приемлемые несущие среды и составы, включающие другие человеческие белки, например сывороточный альбумин человека, описаны, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21^st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092, см., в особенности pp. 958-989.

[0111] Антитела по изобретению применяют в диагностике in vitro и in vivo, а также в качестве средств лечения и профилактики. Например, антитела по изобретению можно вводить в клетки в культуре in vitro или ex vivo или субъекту для лечения, профилактики и/или диагностики разнообразных расстройств, таких как онкологические и инфекционные заболевания.

[0112] Изобретение обеспечивает способ усиления иммунного ответа у субъекта, включающий введение субъекту антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно изобретению в течение времени, достаточного для модификации иммунного ответа.

[0113] «Иммунный ответ» включает иммунный ответ, опосредованный Т-клетками и/или опосредованный В-клетками. Иллюстративные иммунные ответы включают Т-клеточные иммунные ответы, например, выработку цитокинов и клеточную цитотоксичность. Кроме того, термин «иммунный ответ» включает иммунные ответы, на которые косвенно влияет Т-клеточная активация, например, выработка антител (гуморальные ответы) и активация чувствительных к цитокинам клеток, например, макрофагов.

[0114] Термин «усиливать» или «усиление», или «модулировать на более высокий уровень», или «модуляция на более высокий уровень» относится к обнаруживаемому увеличению уровня иммунного ответа у субъекта по сравнению с уровнем ответа у субъекта в отсутствие лечения или соединения, и/или по сравнению с уровнем ответа у идентичного, но неполучавшего лечение.

[0115] В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой пациента-человека.

[0116] Антитела согласно изобретению приемлемы для лечения субъекта, имеющего заболевание, которое можно лечить посредством усиления иммунных ответов, таких как иммунные ответы, опосредованные T-клетками.

[0117] В некоторых вариантах осуществления субъект имеет рак или вирусную инфекцию.

[0118] Изобретение также обеспечивает способ лечения рака, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества выделенного антитела или антигенсвязывающего фрагмента, предложенного в данном документе, в течение времени, достаточного для лечения рака.

[0119] Термины «лечить» или «лечение» обозначают как терапевтическое лечение, так и профилактические или превентивные меры, причем целью является предотвращение или замедление (уменьшение) нежелательного физиологического изменения или расстройства. Преимущественные или желательные клинические результаты включают в себя ослабление симптомов, уменьшение степени заболевания, стабилизацию (т. е., отсутствие ухудшения) течения заболевания, задержку или замедление прогрессирования заболевания, облегчение или временное улучшение болезненного состояния и ремиссию (частичную или полную), как обнаруживаемые, так и не обнаруживаемые. Термин «лечение» может также означать продление времени жизни по сравнению с ожидаемым в отсутствие лечения субъекта. Требующие лечения субъекты включают тех, которые уже имеют патологическое состояние или расстройство, а также тех, которые имеют предрасположенность к развитию патологического состояния или расстройства, или тех, у которых такое состояние или расстройство необходимо предотвратить.

[0120] Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество может изменяться в зависимости от таких факторов, как течение заболевания, возраст, пол и масса тела субъекта, а также от способности терапевтического средства или комбинации терапевтических средств вызывать у индивидуума желаемый ответ. Иллюстративные показатели эффективного терапевтического средства или комбинации терапевтических средств, которые включают, например, улучшенное самочувствие пациента.

[0121] Рак может представлять собой гиперпролиферативное состояние или расстройство, солидную опухоль, гематологическую злокачественную опухоль, опухоль мягкой ткани или метастатическое поражение.

[0122] Предполагается, что термин «рак» включает в себя все типы раковых разрастаний или онкогенных процессов, метастазирования в тканях или злокачественной трансформации клеток, тканей или органов независимо от типа гистопатологии или стадии инвазивности. Примеры рака включают в себя солидные опухоли, гематологические злокачественные опухоли, опухоли мягких тканей и метастатические поражения. Примеры солидных опухолей включают в себя злокачественные образования, например, саркомы, и карциномы (включая аденокарциномы и плоскоклеточные карциномы) в различных системах органов, такие как поражения печени, легкого, молочной железы, лимфатической системы, желудочно-кишечного (например, толстая кишка) и мочеполового трактов (например, почки, уротелиальные клетки), предстательной железы и глотки. Аденокарциномы включают в себя злокачественные образования, такие как многие виды рака толстой кишки, рак прямой кишки, почечно-клеточная карцинома, рак печени, немелкоклеточная карцинома легкого, рак тонкого кишечника и рак пищевода. Плоскоклеточные карциномы включают в себя злокачественные образования, например, в легком, пищеводе, коже, в области головы и шеи, ротовой полости, анусе и шейке матки.

[0123] В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой меланому.

[0124] Метастатические поражения онкологических заболеваний можно также лечить или предотвращать с помощью способов и антител согласно изобретению, описанных в данном документе.

[0125] Примеры видов рака, рост которых можно ингибировать или уменьшать с помощью антител по изобретению, включают в себя виды рака, которые отвечают на иммунотерапию. Примеры такого рака включают в себя меланому, рак почки, рак предстательной железы, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак желудочно-кишечного тракта, рак желудка, рак пищевода, рак легкого, метастазирующую злокачественную меланому, светлоклеточную карциному, устойчивую к гормонам аденокарциному предстательной железы, немелкоклеточный рак легкого или рак головы и шеи. Устойчивые или рецидивирующие злокачественные образования можно лечить с помощью антител по изобретению, описанных в настоящем документе.

[0126] Примерами других видов рака, которые можно лечить антителами по изобретению, являются рак ануса, базально-клеточная карцинома, рак желчевыводящих путей, рак мочевого пузыря, рак костей, рак мозга и ЦНС, карцинома фаллопиевых труб, карцинома влагалища, карцинома вульвы, злокачественная меланома кожи или глаза, aстроклеточный рак пищевода, рак яичка, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак прямой кишки, рак матки, первичная лимфома ЦНС; опухоль центральной нервной системы (ЦНС), рак шейки матки, хориокарцинома, рак прямой кишки, рак соединительной ткани, рак пищеварительной системы, рак эндометрия, рак глаза; внутриэпителиальное новообразование, рак почки, рак гортани, рак печени; мелкоклеточный рак легкого, нейробластома, рак ротовой полости (например, губы, языка, рта и глотки), рак носоглотки, ретинобластома, рабдомиосаркома, рак дыхательной системы, саркома, рак щитовидной железы, рак мочевой системы, гепатокарцинома, рак анальной области, карцинома фаллопиевых труб, карцинома влагалища, карцинома вульвы, рак тонкого кишечника, рак эндокринной системы, рак паращитовидной железы, рак надпочечника, саркома мягкой ткани, рак уретры, рак пениса, солидные опухоли у детей, опухолевый ангиогенез, рак спинного мозга, глиома мозгового ствола, аденома гипофиза, саркома Капоши, рак меркелевых клеток, эпидермоидный рак, плоскоклеточный рак, вида рака, индуцированного окружающей средой, включая рак, индуцированный асбестом, и другие карциномы и саркомы, а также комбинации указанных видов рака.

[0127] Примеры гематологических злокачественных опухолей, которые можно лечить антителами по изобретению, включают в себя лейкозы, лимфомы и миелому, такие как лимфобластный лейкоз/лимфома предшественников В-клеток и неходжкинская лимфома В-клеток, острый промиелоцитный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ), хронический лимфоцитарный лейкоз B-клеток (ХЛЛ)/малая лимфоцитарная лимфома (МЛЛ), острый лимфоцитарный лейкоз B-клеток, пролимфоцитарный лейкоз B-клеток, лимфоплазмоцитарная лимфома, лимфома мантийных клеток (MCL), фолликулярная лимфома (FL), включая низкодифференцированную, среднедифференцированную и высокодифференцированную FL, кожную фолликулярную центральную лимфому, лимфому B-клеток краевой зоны (типов MALT, узелкового и селезеночного), лейкоз ворсистых клеток, диффузную лимфому крупных B-клеток (DLBCL), лимфому Беркитта (BL), плазмоцитому, множественную миелому (MM), плазмоцитарный лейкоз, посттрансплантационное лимфопролиферативное расстройство, макроглобулинемию Вальденстрема, нарушения функции плазмоцитов, анапластическая крупноклеточная лимфома (ALCL), острый лимфоцитарный лейкоз T-клеток, первичный системный амилоидоз (например, амилоидоз легких цепей), пролимфоцитарный/миелоцитарный лейкоз, острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ), крупногранулярный лимфоцитарный лейкоз (LGL), лейкоз NK-клеток и ходжкинскую лимфому.

[0128] Термин «нарушение функции плазмоцитов» относится к расстройствам, которые характеризуются клональными плазмоцитами и включают в себя множественную миелому, амилоидоз легких цепей и макроглобулинемию Вальденстрема. Амилоидоз легких цепей и макроглобулинемия Вальденстрема могут возникать независимо от множественной миеломы. Они также могут проявляться одновременно со множественной миеломой и развиваться либо до, либо после развития множественной миеломы.

[0129] Примеры В-клеточных неходжкинских лимфом представляют собой лимфогранулематоз, первичную выпотную лимфому, внутрисосудистую В-крупноклеточную лимфому, средостенную В-крупноклеточную лимфому, заболевания тяжелых цепей (включая γ-, μ- и a-цепи), лимфомы, индуцированные терапией иммуносупрессорными агентами, такие как лимфома, вызванная циклоспорином, и лимфома, вызванная метотрексатом.

[0130] Пациентов, имеющих рак, включая метастатический рак, который экспрессирует PD-L1, можно лечить антителами по изобретению. Рак может представлять собой меланому, почечно-клеточную карциному, плоскоклеточный немелкоклеточный рак легких (NSCLC), неплоскоклеточный NSCLC, колоректальный рак, устойчивый к кастрации рак предстательной железы, рак яичника, рак желудка, аденокарциному (ACA), плоскоклеточную карциному (SCC), гепатоцеллюлярную карциному (HCC), карциному поджелудочной железы, плоскоклеточную карциному головы и шеи, карциномы пищевода, желудочно-кишечного тракта и молочной железы.

[0131] В некоторых вариантах осуществления субъект имеет опухоль, которая экспрессирует PD-L1.

[0132] В некоторых вариантах осуществления субъект является рефрактерным и/или рецидивирующим после лечения антителом к PD-L1. В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-L1 представляет собой авелумаб, дурвалумаб или атезолизумаб. Различные качественные и/или количественные способы могут применяться для определения рецидивирующих или рефрактерных форм заболевания. Симптомами, которые могут быть связаны с рецидивом или устойчивостью заболевания, являются, например, ухудшение или отсутствие улучшения состояния пациента или возврат или ухудшение различных симптомов, связанных с солидными опухолями, и/или распространение раковых клеток в организме из одного места в другие органы, ткани или клетки.

[0133] Изобретение также обеспечивает способ лечения вирусной инфекции, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества выделенного антитела или антигенсвязывающего фрагмента, предложенного в данном документе, в течение времени, достаточного для лечения вирусной инфекции.

[0134] Иллюстративные вирусные инфекции, которые можно лечить антителами согласно изобретению, включают ВИЧ, гепатит (A, B, C), вирус герпеса (например, ВЗВ, ВПГ-1, ВГA-6, ВПГ-II, ЦМВ, вирус Эпштейна - Барр), аденовирус, вирус гриппа, флавивирусы, эховирус, риновирус, вирус коксаки, коронавирус, респираторно-синцитиальный вирус, вирус паротита, ротавирус, вирус кори, вирус краснухи, парвовирус, вирус коровьей оспы, Т-лимфотропный вирус человека, вирус Денге, вирус папилломы, вирус контагиозного моллюска, полиовирус, вирус бешенства, вирус Джона Каннингема, вирус арбовирусного энцефалита.

[0135] Дополнительные варианты осуществления изобретения

[0136] Ниже представлены определенные дополнительные варианты осуществления изобретения в соответствии с раскрытиями, представленными в других разделах настоящего документа. Элементы из вариантов осуществления изобретения, изложенных выше, описанные как связанные с изобретением, раскрытым в настоящем документе, также относятся ко всем и каждому из этих дополнительно пронумерованных вариантов осуществления.

[0137] Вариант осуществления 1. Антитело к TIM3, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO: 6, 7 или 8 и вариабельную область легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 5.

[0138] Вариант осуществления 2. Антитело к TIM3, содержащее VH SEQ ID NO: 6 и VL SEQ ID NO: 5.

[0139] Вариант осуществления 3. Антитело к TIM3, содержащее VH SEQ ID NO: 7 и VL SEQ ID NO: 5.

[0140] Вариант осуществления 4. Антитело к TIM3, содержащее VH SEQ ID NO: 8 и VL SEQ ID NO: 5.

[0141] Вариант осуществления 5. Антитело к PD-1, содержащее VH SEQ ID NO: 10, 11 или 12 и VL SEQ ID NO: 9.

[0142] Вариант осуществления 6. Антитело к PD-1, содержащее VH SEQ ID NO: 10 и VL SEQ ID NO: 9.

[0143] Вариант осуществления 9. Антитело к PD-1, содержащее VH SEQ ID NO: 11 и VL SEQ ID NO: 9.

[0144] Вариант осуществления 10. Антитело к PD-1, содержащее VH SEQ ID NO: 12 и VL SEQ ID NO: 9.

[0145] Вариант осуществления 11. Биспецифическое антитело к PD-1xTIM3, содержащее первый домен, который связывает PD-1, и второй домен, который связывает TIM3, причем первый домен содержит VH SEQ ID NO: 10, 11 или 12 и VL SEQ ID NO: 9, и второй домен содержит VH SEQ ID NO: 6, 7 или 8 и VL SEQ ID NO: 5.

[0146] Вариант осуществления 12. Биспецифическое антитело к PD-1xTIM3 согласно варианту осуществления 11, отличающееся тем, что первый домен содержит VH SEQ ID NO:10 и VL SEQ ID NO: 9, и второй домен содержит VH SEQ ID NO: 6 и VL SEQ ID NO: 5.

[0147] Вариант осуществления 13. Биспецифическое антитело к PD-1xTIM3 согласно варианту осуществления 11, отличающееся тем, что первый домен содержит VH SEQ ID NO:11 и VL SEQ ID NO: 9, и второй домен содержит VH SEQ ID NO: 6 и VL SEQ ID NO: 5.

[0148] Вариант осуществления 14. Биспецифическое антитело к PD-1xTIM3 согласно варианту осуществления 11, отличающееся тем, что первый домен содержит VH SEQ ID NO:12 и VL SEQ ID NO: 9, и второй домен содержит VH SEQ ID NO: 6 и VL SEQ ID NO: 5.

[0149] Вариант осуществления 15. Биспецифическое антитело к PD-1xTIM3 согласно варианту осуществления 11, отличающееся тем, что первый домен содержит VH SEQ ID NO:10 и VL SEQ ID NO: 9, и второй домен содержит VH SEQ ID NO: 7 и VL SEQ ID NO: 5.

[0150] Вариант осуществления 16. Биспецифическое антитело к PD-1xTIM3 согласно варианту осуществления 11, отличающееся тем, что первый домен содержит VH SEQ ID NO:11 и VL SEQ ID NO: 9, и второй домен содержит VH SEQ ID NO: 7 и VL SEQ ID NO: 5.

[0151] Вариант осуществления 17. Биспецифическое антитело к PD-1xTIM3 согласно варианту осуществления 11, отличающееся тем, что первый домен содержит VH SEQ ID NO:12 и VL SEQ ID NO: 9, и второй домен содержит VH SEQ ID NO: 7 и VL SEQ ID NO: 5.

[0152] Вариант осуществления 18. Биспецифическое антитело к PD-1xTIM3 согласно варианту осуществления 11, отличающееся тем, что первый домен содержит VH SEQ ID NO:10 и VL SEQ ID NO: 9, и второй домен содержит VH SEQ ID NO: 8 и VL SEQ ID NO: 5.

[0153] Вариант осуществления 19. Биспецифическое антитело к PD-1xTIM3 согласно варианту осуществления 11, отличающееся тем, что первый домен содержит VH SEQ ID NO:11 и VL SEQ ID NO: 9, и второй домен содержит VH SEQ ID NO: 8 и VL SEQ ID NO: 5.

[0154] Вариант осуществления 20. Биспецифическое антитело к PD-1xTIM3 согласно варианту осуществления 11, отличающееся тем, что первый домен содержит VH SEQ ID NO:12 и VL SEQ ID NO: 9, и второй домен содержит VH SEQ ID NO: 8 и VL SEQ ID NO: 5.

[0155] Вариант осуществления 21. Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-20, отличающееся тем, что антитело представляет собой изотип IgG4.

[0156] Вариант осуществления 22. Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-21, содержащего мутацию S228P по сравнению с IgG4 дикого типа SEQ ID NO: 13.

[0157] Вариант осуществления 23. Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-22, отличающееся тем, что антитело представляет собой антагонистическое антитело.

[0158] Вариант осуществления 24. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по одному из вариантов осуществления 1-23.

[0159] Вариант осуществления 25. Антитело по любому из вариантов осуществления 1-23 или фармацевтическая композиция по варианту осуществления 24 для применения в терапии.

[0160] Вариант осуществления 24. Антитело по любому одному из вариантов осуществления 1-23 или фармацевтическая композиция по варианту осуществления 24 для применения в лечении субъекта, имеющего рак.

[0161] Вариант осуществления 25. Антитело или фармацевтическая композиция для применения в соответствии с вариантом осуществления 24, отличающиеся тем, что рак представляет собой солидную опухоль или гемобластоз.

ПРИМЕРЫ

[0162] Следующие примеры приведены для иллюстрации вариантов осуществления данного изобретения, но никоим образом не предназначены для ограничения его объема.

Пример 1 - Модификация изоэлектрической точки моноклональных и биспецифических антител к ФНО-α

[0163] Для идентификации аминокислотных остатков на поверхности вариабельной области, которые можно было бы заменить для увеличения или уменьшения поверхностного заряда, использовали антитело CNTO148. CNTO148 представляет собой моноклональное антитело, которое связывает ФНО-α. Доступны кристаллические структуры антител. Изоэлектрическая точка антитела CNTO148 составляет ~9. Аминокислотные замены в вариабельной тяжелой области в положениях 9, 70, 74, 82a и 84 (нумерация по Кабату) (соответствует аминокислотным положениям 9, 71, 75, 84 и 88 SEQ ID NO: 1) были протестированы первоначально для определения их способности уменьшать изоэлектрическую точку (pI) антитела CNTO148. Эти замены вводили или по отдельности, или в комбинации (см. Пример 4) посредством модификации молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи. Варианты были экспрессированы с использованием клеток Expi293.

Таблица 1. Варианты антител CNTO148

Положение по Кабату	Мутация	Поверхность воздействия (%)	Местоположение	Комментарий по структуре
9	G9E	29	Напротив паратопа	На поверхности
70	S71E	22	Поверхность вне паратопа	На поверхности
74	S75D	76	Поверхность вне паратопа	На поверхности
82a	N84D	31	Напротив паратопа	На поверхности
84	A88D	29	Напротив паратопа	Выступает в углубление

[0164] Варианты были охарактеризованы с использованием капиллярного изоэлектрического фокусирования (cIEF), капиллярного электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (cSDS) или электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ-электрофореза) и эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (эксклюзионной ВЭЖХ). cIEF выполняли с использованием анализатора iCE3 от Protein Simple в соответствии с протоколом производителя с pH 5-8 или pH 3-10 в сочетании с амфолитами с pH 8-10,5. cSDS выполняли с помощью Lab Chip GXII от Caliper, используя чип Protein Express и набор реагентов HT Protein Express. ДСН-ПААГ-электрофорез проводили с использованием 1-12% бис-трис геля Novex NuPAGE, предварительно окрашенного стандарта Invitrogen SeeBlue Plus2 (1X) и подвижного буфера 1X MES. Эксклюзионную ВЭЖХ проводили на Waters Alliance с использованием колонки TOSOH Bioscience Bioassist G35W с внутренним диаметром 7,8 мм, длиной 30 см.

[0165] Варианты были также охарактеризованы на предмет изменений в связывании антигена. Связывание антигена измеряли с использованием планшетов Maxisorp (Nunc), покрытых F(ab')2-фрагментом ослиного антитела против человеческого Fc от Jackson Immunoresearch, и блокированных с использованием Superblock (Pierce). Затем в планшет добавляли последовательные разведения вариантов и позволяли связываться с ними. Для измерения связывания CNTO148 с ФНО добавляли биотинилированный человеческий ФНО, затем стрептавидин ПХ (Jackson Immunoresearch), и определяли связанный ФНО с помощью субстрата TMB (Fitzgerald).

[0166] Температуру разворачивания (T_m) и температуру начала агрегации (T_agg) образцов также анализировали с использованием или Activa Optim 2, или с использованием обновленного инструмента UNCLE. Эти инструменты измеряют собственную флуоресценцию при увеличении температуры в качестве показателя разворачивания белка и рассеяние света при увеличении температуры в качестве показателя начала агрегации. Температура, при которой белок начинает разворачиваться или агрегировать, может указывать на его структурную стабильность. Для этого анализа были использованы температурные шаги от 20°C до 85°C со скоростью 0,3°C в минуту.

Результаты

[0167] Характеристика вариантов CNTO148 представлены в Таблице 2 ниже. Экспериментально измеренные значения pI вариантов CNTO148 S75D и N84D составили 8,9 и 9,0, соответственно, по сравнению с диким типом (ДТ) с pI, равной 9,1. В отдельном эксперименте значение pI варианта CNTO148 A88D составило 9,1 по сравнению с ДТ с pI, равной 9,2. В еще одном эксперименте pI вариантов CNTO148 G9E и S71E составляли 8,7 и 8,7, соответственно, по сравнению с ДТ с pI, равной 8,9. Различия в pI ДТ CNTO148 между экспериментами, вероятно, были связаны с нормальной суточной вариабельностью и незначительными изменениями состава электролитов. Варианты S75D, N84D, A88D, G9E и S71E связаны с ФНО-α по меньшей мере так же как и контроль ДТ. На Фиг. 1A показано связывание вариантов S75D и N84D по сравнению с диким типом (148 ДТ и CNTO148), на Фиг. 1B сравниваются вариант A88D с CNTO148 дикого типа, а на Фиг. 1C сравнивается связывание вариантов G9E и S71E с CNTO148 ДТ. CNTO95 использовали в качестве отрицательного контроля. Варианты также давали профиль эксклюзионной ВЭЖХ, который был очень похож на профиль ДТ. На Фиг. 2A-2C представлены профили эксклюзионной ВЭЖХ для CNTO148 дикого типа (Фиг. 2A), N84D (Фиг. 2B) и S75D (Фиг. 2C), и на Фиг. 3A-3B представлено сравнение профилей эксклюзионной ВЭЖХ для CNTO148 дикого типа (Фиг. 3A) и варианта A88D (Фиг. 3B). На Фиг. 4A-4C представлено сравнение профилей эксклюзионной ВЭЖХ для CNTO148 дикого типа (Фиг. 4A), G9E (Фиг. 4B) и S71E (Фиг. 4C).

Таблица 2. Сводная характеристика вариантов CNTO148

Положение по Кабату	Мутация	Профиль разделения	% мономера	Профиль заряда cIEF	Связывание Аг	Устойчивость (Tm и Tagg)
9	G9E	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	Снижена
70	S71E	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ
74	S75D	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ
82a	N84D	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ
84	A88D	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ

[0168] Температуру в начале агрегации измеряли как показатель коллоидной стабильности. Начало агрегации (Tagg) для вариантов S75D и N84D наблюдали при 66,8°C и 65,8°C (см. Фиг. 5B и 5C, соответственно), что было сходным, если не несколько более высоким, чем начало агрегации для CNTO148 дикого типа, которое наблюдали при 63,9°С (см. Фиг. 5А) в этом эксперименте. В отдельном эксперименте было обнаружено, что начало агрегации для варианта A88D происходило при 66,9°C (Фиг. 6B), что было аналогично конструкту дикого типа при 67,6°C (Фиг. 6A). В другом эксперименте было обнаружено, что начало агрегации вариантов G9E и S71E происходит при 65,7°C (Фиг. 7B) и 69,5°C (Фиг. 7C), соответственно, по сравнению с CNTO148 дикого типа при 68,6°C (Фиг. 7A).

[0169] Температуру разворачивания измеряли как показатель конформационной стабильности. Температуру разворачивания (T_m) вариантов S75D и N84D наблюдали при 67,3°C (Фиг. 8B) и 65,3°C (Фиг. 8C), соответственно, что было аналогично температуре разворачивания CNTO148 дикого типа, которую наблюдали при 63,9°C (Фиг. 8А). В отдельном эксперименте температуру разворачивания для варианта A88D наблюдали при 66,9°C (Фиг. 9B), что было аналогично конструкту дикого типа в эксперименте, которую наблюдали при 67,3°C (Фиг. 9A). В еще одном эксперименте было обнаружено, что температуру разворачивания для вариантов G9E и S71E наблюдают при 65,8°C (Фиг. 10B) и 69,6°C (Фиг. 10C), соответственно, по сравнению с CNTO148 дикого типа в этом эксперименте, которую наблюдали при 68,8°C (Фиг. 10А). Варианты, которые продемонстрировали снижение T_m и T_agg более чем на 2°C, рассматривались как имеющие пониженную стабильность. Из этих вариантов только вариант G9E продемонстрировал сниженное связывание по сравнению с ДТ; он имел более низкую Tm на 3°C и более низкое начало агрегации на 2,9°C.

Пример 2 - Модификация изоэлектрической точки моноклональных и биспецифических антител к αVβ3

[0170] Для идентификации аминокислотных остатков на поверхности вариабельной области, которые можно было бы заменить для увеличения или уменьшения поверхностного заряда, использовали антитело CNTO95. CNTO95 представляет собой моноклональное антитело, которое связывает αVβ3. Доступны кристаллические структуры. Изоэлектрическая точка антитела CNTO95 составляет ~9. Аминокислотные замены в вариабельной тяжелой области в положениях 7, 9, 11, 14, 41, 74, 84, и 113 (нумерация по Кабату) (соответствует аминокислотным положениям 7, 9, 11, 14, 41, 71, 88, и 119 SEQ ID NO: 4) были протестированы первоначально для определения их способности уменьшать изоэлектрическую точку (pI) антитела CNTO95. Эти замены вводили или по отдельности, или в комбинации посредством модификации молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи. Варианты были экспрессированы с использованием Expi293.

Таблица 3. Варианты антител CNTO95

Положение по Кабату	Мутация	Поверхность воздействия (%)	Местоположение	Комментарий по структуре
7	S7R	42	Поверхность вне паратопа	На поверхности
9	G9R	41	Поверхность вне паратопа	На поверхности
11	V11R	30	Обращена к CH1	На поверхности
14	P14R	29	В нижней части	На поверхности
41	P41R	48	Обращена к CH1	На поверхности
74	S71K	29	Поверхность вне паратопа	На поверхности
84	A88R	52	Обращена к CH1	На поверхности
113	S119R	58	Часть изгиба V-CH1	На поверхности

[0171] Варианты были охарактеризованы с использованием капиллярного изоэлектрического фокусирования (cIEF), электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ-электрофореза) и эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (эксклюзионной ВЭЖХ). cIEF выполняли с использованием анализатора iCE3 от Protein Simple в соответствии с протоколом производителя с амфолитами pH 3-10 и pH 8-10,5. ДСН-ПААГ-электрофорез проводили с использованием 1-12% бис-трис геля Novex NuPAGE, предварительно окрашенного стандарта Invitrogen SeeBlue Plus2 (1X) и подвижного буфера 1X MES. Эксклюзионную ВЭЖХ проводили на Waters Alliance с использованием колонки TOSOH Bioscience Bioassist G35W с внутренним диаметром 7,8 мм, длиной 30 см.

[0172] Варианты были также охарактеризованы на предмет изменений в связывании антигена. Связывание антигена измеряли с использованием планшетов Maxisorp (Nunc), покрытых F(ab')2-фрагментом ослиного антитела против человеческого Fc от Jackson Immunoresearch, и блокированных с использованием Superblock (Pierce). Затем в планшет добавляли последовательные разведения вариантов и позволяли связываться с ними. Для измерения связывания CNTO95 с αVβ3 добавляли биотинилированный человеческий αVβ3, затем стрептавидин ПХ (Jackson Immunoresearch), и определяли связанный αVβ3 с помощью субстрата TMB (Fitzgerald).

[0173] Образцы также анализировали с использованием обновленного прибора Uncle. Этот инструмент измеряет собственную флуоресценцию при увеличении температуры в качестве показателя разворачивания белка и рассеяние света при увеличении температуры в качестве показателя начала агрегации. Температура, при которой белок начинает разворачиваться или агрегировать, может указывать на его структурную стабильность. Для этого анализа были использованы температурные шаги от 20°C до 85°C со скоростью 0,3°C в минуту.

Результаты

[0174] Характеристика вариантов CNTO95 представлена в Таблице 4 ниже. Значения pI для вариантов CNTO95 S7R, G9R, V11R, P14R, P41R, S71K, A88R и S119R составляли 9,2, 9,2, 9,2, 9,2, 9,2, 9,1, 9,2, и 9,2, соответственно, по сравнению с CNTO95 дикого типа с pI, равной 9,05. Все варианты связывают αVβ3 по меньшей мере так же, как и контроль ДТ. На Фиг. 11 показано связывание вышеуказанных вариантов в сравнении с диким типом (CNTO95). CNTO148 использовали в качестве отрицательного контроля. Варианты также давали профиль эксклюзионной ВЭЖХ, который был очень похож на профиль ДТ. На Фиг. 12A-12I представлены профили эксклюзионной ВЭЖХ для CNTO95 дикого типа (Фиг. 12A), S7R (Фиг. 12B), G9R (Фиг. 12C), V11R (Фиг. 12D), P14R (Фиг. 12E), P41R (Фиг. 12F), S71K (Фиг. 12G), A88R (Фиг. 12H) и S119R (Фиг. 12I).

Таблица 4. Сводная характеристика вариантов CNTO95

Положение по Кабату	Мутация	Профиль разделения	% мономера	Профиль заряда cIEF	Связывание Аг	Устойчивость (Tm и Tagg)
7	S7R	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ
9	G9R	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	Сильно снижена
11	V11R	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	Снижена
14	P14R	аналогично ДТ	Незначительная агрегация	аналогично ДТ	аналогично ДТ	Снижена
41	P41R	аналогично ДТ	Незначительная агрегация	аналогично ДТ	аналогично ДТ	Снижена
74	S71K	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	Снижена
84	A88R	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ
113	S119R	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ

[0175] Начало агрегации (T_agg) для вариантов S7R, G9R, V11R, P14R, P41R, S71K, A88R и S119R наблюдали при 67,2°C (Фиг. 13B), 57,9°C (Фиг. 13C), 63,9°C (Фиг. 13D), 63,5°C (Фиг. 13E), 66,4°C (Фиг. 13F), 64,9°C (Фиг. 13G), 67,6°C (Фиг. 13H) и 66,7°C (Фиг. 13I) по сравнению с началом агрегации для CNTO95 дикого типа, которое наблюдали при 68,2°С (см. Фиг. 13А).

[0176] Температуру разворачивания (T_m) для вариантов S7R, G9R, V11R, P14R, P41R, S71K, A88R и S119R наблюдали при 67,9°C (Фиг. 14B), 59,4°C (Фиг. 14C), 64,8°C (Фиг. 14D) 64,3°C (Фиг. 14E), 66,8°C (Фиг. 14F), 65,8°C (Фиг. 14G), 68,0°C (Фиг. 14H) и 67,6°C (Фиг. 14I), соответственно, по сравнению с температурой разворачивания для CNTO95 дикого типа, которое наблюдали при 68,8°С (Фиг. 14А). Варианты, которые продемонстрировали снижение T_m и T_agg более чем на 2°C, рассматривали как имеющие сниженную стабильность, а варианты, которые продемонстрировали снижение более чем на 5°C, рассматривали как имеющие значительно сниженную стабильность. Из этих вариантов только вариант G9R продемонстрировал значительно сниженную стабильность; он имел более низкую T_m на 9,4°C и более низкое начало агрегации на 10,3 °C. Варианты V11R, P14R, P41R и S71K продемонстрировали сниженную стабильность. У них была более низкая T_m на 4°C, 4,5°C, 2°C и 3°C, соответственно, и более низкая T_agg на 4,3°C, 4,7°C, 1,8°C и 3,2°C, соответственно.

Пример 3 - Модификация изоэлектрической точки моноклональных и биспецифических антител к TIM3 и к PD1

[0177] Для дальнейшего изучения возможности использования аминокислотных замен в положениях 74, 82a и 84 по Кабату в вариабельной области тяжелой цепи для модификации изоэлектрической точки были протестированы варианты двух дополнительных антител, антител к TIM3 и к PD1. TIMB337 представляет собой моноклональное антитело, которое связывает TIM3 (CD366), а PD1B244 представляет собой моноклональное антитело, которое связывает PD-1 (CD279). pI TIMB337 и PD1B244 составляют 7,26 и 7,06 (для версии IgG4); таким образом, различие в pI между этими двумя гомодимерами и биспецифическим соединением, образованным путем объединения двух, составляет менее 0,1 единицы. Это было отражено на колонке для CEX (катионообменной хроматографии), где наблюдали разрешающую способность, равную 0,1.

[0100] Аминокислотные замены в вариабельных областях тяжелой цепи TIM337 и PD1B244 в положениях 74, 82a и 84 (нумерация по Кабату) (соответствует аминокислотным положениям 75, 84 и 88 SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, соответственно) были протестированы первоначально для определения их способности уменьшать изоэлектрическую точку (pI) этих антител (см. Таблицы 5 и 6). Эти замены вводили или по отдельности, или в комбинации посредством модификации молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область тяжелой цепи. Варианты были экспрессированы с использованием клеток Expi293 в 24-луночных планшетах.

Таблица 5. Варианты антител TIMB337

Положение по Кабату	Мутация	Поверхность воздействия (%)	Местоположение	Комментарий по структуре
74	S75D	86	Рядом с CDR	выступает
82a	N84D	33	Рядом с нижней петлей	На поверхности
84	A88D	45	Нижняя петля	На поверхности

Таблица 6. Варианты антител PD1B244

Положение по Кабату	Мутация	Поверхность воздействия (%)	Местоположение	Комментарий по структуре
74	S75D	78	Рядом с CDR	Наибольшее воздействие
82a	S84D	27	Рядом с нижней петлей	Воздействовали только на гидроксил
84	S88D	33	Нижняя петля	На поверхности

[0101] Варианты TIMB377 и PD1B244 экспрессировали в 24-луночных планшетах и очищали. Та же панель методов, которая использовалась для характеристики вариантов CNTO148, была использована для анализа вариантов TIMB377 и PD1B244, включая cSDS, эксклюзионную ВЭЖХ, cIEF. В этом случае cIEF выполняли с амфолитами с рН 3-10 и рН 5-8. Стабильность измеряли с помощью Activa Optim2, как описано выше. Связывание антигена также измеряли для каждого из антител на месте. Для измерения связывания TIM3 использовали ИФА. Вкратце, планшеты Maxisorp (Nunc) покрывали стрептавидином, а затем блокировали PBS с 0,4% BSA. Затем связывали биотинилированный человеческий слитый белок TIM3-Fc от R&D Systems в концентрации 1 мкг/мл в PBS, 0,4% BSA. Затем добавляли последовательные разведения вариантов и позволяли им связываться. Затем добавляли конъюгированное козье антитело против человеческой каппа (Southern Biotech) в разведении 1:5000 в PBS, добавляли 0,4% BSA (анти-FC не использовали для предотвращения связывания слитого белка TIM3-Fc). Наконец, для обнаружения использовали субстрат TMB (Fitzgerald).

[0102] Для измерения связывания заряженных вариантов с PD1 использовали инструмент Proteon SPR. Для этого был подготовлен сенсорный чип типа GLC путем ковалентной иммобилизации козьего антитела против Fc человека/мыши (в ацетате натрия, pH 4,5) на проточные ячейки всех 6 каналов (~5000 RU). Затем мкАт к PD1 разводили до 0,001 мг/мл в PBSTE и захватывали по всем каналам с лигандами (~ 180 RU). Наконец, человеческий антиген PD1 (100 нМ - 0,4 нМ при 4 - кратных разбавлениях в PBSTE) вводили через каналы с захваченными мкАт к PD1, и отслеживали профили ассоциации/диссоциации в течение 4 и 30 минут, соответственно. Регенерацию выполняли в конце каждого цикла титрования с использованием 0,85% H₃PO₄. Данные анализировали для проверки на захват и связывающие взаимодействия.

Результаты

[0103] Анализ вариантов TIMB377 продемонстрировал, что все они проявляли себя так же, как дикий тип (см. Таблицу 7). pI все трех вариантов S75D N84D и A88D составлял 8,5 по сравнению с ДТ с pI, равной 8,7. Все три варианта связывали TIM3 по меньшей мере так же, как и ДТ (Фиг. 15), и каждый из них давал профиль эксклюзионной ВЭЖХ, который был очень похож на профиль ДТ (Фиг. 16A-16D). Кроме того, начало агрегации для вариантов S75D, N84D и A88D при 67,5°C, 68,2°C и 66,7°C было аналогично началу агрегации для ДТ при 68,5°C (Фиг. 17A-17D).

Таблица 7. Характеристика вариантов TIMB377 с заменой

Положение по Кабату	Мутация	Профиль разделения cSDS	% мономера	Профиль заряда cIEF	Связы-вание Аг	Устойчи-вость (Optim2)
74	S75D	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ
82a	N84D	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ
84	A88D	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ

[0104] Результаты характеристики для вариантов PD1B244 с одиночной заменой приведены в Таблице 8 ниже. В данных экспериментах антитело дикого типа к PD1 продемонстрировало тенденцию к агрегации, о чем свидетельствует эксклюзионная ВЭЖХ, что затрудняет определение того, оказывают ли замены влияние на агрегацию. Чистота дикого типа по данным эксклюзионной ВЭЖХ составляла 78% мономера, в то время как одиночные мутанты находились в диапазоне от 51% до 95% мономерности. В предыдущих экспериментах, характеризующих антитело к PD-1, было показано, что агрегация данного антитела чувствительна к температуре и pH, поэтому вариабельность в пропорции мономера можно объяснить различиями в экспериментальных условиях при обработке образцов. По этой причине изменяемая доля мономера, наблюдаемая в некоторых вариантах, не рассматривалась как достаточная причина из-за которой следует исключить эти замены из дополнительной оценки, и % мономера не был включен в итоговый анализ мутантов антител к PD-1. Следует отметить, однако, что дальнейшие исследования показали, что с помощью оптимизации процесса такая агрегация может быть значительно минимизирована, и описанные в данном время эксперименты проводились в PBS без такой оптимизации.

[0105] pI вариантов S75D, S84D и S88D составляла 8,6, 8,6 и 8,7 по сравнению с ДТ с pI, равной 8,9. Все три варианта связывались с человеческим PD1 с KD, которая была аналогична ДТ (Фиг. 18). Они также давали профиль эксклюзионной ВЭЖХ, который был очень похож на профиль ДТ. В этом случае профиль эксклюзионной ВЭЖХ для антитела дикого типа к анти-PD1 включал несколько полос, которые элюировались раньше предположительного пика мономера. На количество и внешний вид этих пиков не влияли замены заряда (Фиг. 19A-19D). Кроме того, начало агрегации для вариантов S75D, S84D и S88D при 66,6°C, 66,1°C и 66,5°C было аналогично началу агрегации для ДТ при 65,7°C (Фиг. 20A-20D). Помимо вариабельных результатов эксклюзионной ВЭЖХ для % мономера, все остальные данные демонстрируют для всех 3 проверенных одиночных мутаций были подобны ДТ.

Таблица 8. Характеристика вариантов PD1B244 с заменой

Положение по Кабату	Мутация	Профиль разделения cSDS	Профиль эксклюзионной ВЭЖХ	Профиль заряда cIEF	Связывание Аг	Устойчивость (Optim2)
74	S75D	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ
82a	S84D	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ
84	S88D	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ	аналогично ДТ

Пример 4 - Характеристика вариантов CNTO148 с множеством замен

[0106] pI четырех вариантов CNTO148 с множеством замен, состоящих из S75D, N84D или A88D, приведены в Таблице 9 ниже. Для антитела CNTO148 комбинирование двух замен дало снижение pI от 0,25 до 0,31 единицы рН. Объединение всех трех привело к снижению рН на 0,45 единицы.

[0107] Как показано на Фиг. 21, все варианты комбинаций связывались с ФНО аналогично CNTO148 дикого типа. Они также давали профиль эксклюзионной ВЭЖХ, который был очень похож на профиль ДТ (Фиг. 22A-22E). Кроме того, конформационная и коллоидная стабильность вариантов была сходна с ДТ (Таблица 10 ниже, Фигуры 23A-23E и Фиг. 24A-24E). Конформационная стабильность вариантов (Tm) находилась в пределах 0,5°C от ДТ, и коллоидная стабильность (начало агрегации) находилась в пределах 0,7°C от ДТ.

Таблица 10. Стабильность белка комбинированных вариантов CNTO148

	Конформационная стабильность	Коллоидная стабильность
WT	66,8°C	66,5°C
N84D A88D	67,1°C	66,8°C
S75D A88D	66,8°C	66,8°C
S75D N84D	67,3°C	67,1°C
S75D N84D A88D	66,9°C	67,2°C

[0108] Хотя предпочтительные варианты осуществления изображены и описаны подробно в данном документе, специалистам в соответствующей области техники будет очевидно, что различные модификации, дополнения, замены и тому подобное могут быть сделаны без отклонения от сущности изобретения, и поэтому считается, что они входят в объем изобретения, как определено в следующей формуле изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Janssen Biotech, Inc.

Nesspor, Thomas

<120> Способы модификации поверхностного заряда для получения биспецифических антител

<130> JBI5100WOPCT

<140> Для заполнения

<141> 04.06.2018

<160> 13

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 126

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Варианты VH CNTO148

<220>

<221> ПРОЧИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ

<222> (75)..(75)

<223> Xaa представляет собой Ser или Asp

<220>

<221> ПРОЧИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ

<222> (84)..(84)

<223> Xaa представляет собой Asn или Asp

<220>

<221> ПРОЧИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ

<222> (88)..(88)

<223> Xaa представляет собой Ala или Asp

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Phe Met Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Lys Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Xaa Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Xaa Ser Leu Arg Xaa Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Gly Ile Ala Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly

100 105 110

Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 2

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи TIMB377 (TM3H24)

<220>

<221> ПРОЧИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ

<222> (75)..(75)

<223> Xaa представляет собой Ser или Asp

<220>

<221> ПРОЧИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ

<222> (84)..(84)

<223> Xaa представляет собой Ser Asn или Asp

<220>

<221> ПРОЧИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ

<222> (88)..(88)

<223> Xaa представляет собой Ser Ala или Asp

<400> 2

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Xaa Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Xaa Ser Leu Arg Xaa Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ser Pro Tyr Ala Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 3

<211> 123

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи варианта PD1B244 PD1H170

<220>

<221> ПРОЧИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ

<222> (75)..(75)

<223> Xaa представляет собой Ser или Asp

<220>

<221> ПРОЧИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ

<222> (84)..(84)

<223> Xaa представляет собой Ser или Asp

<220>

<221> ПРОЧИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ

<222> (88)..(88)

<223> Xaa представляет собой Ser или Asp

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Xaa Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Xaa Ser Leu Arg Xaa Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Pro Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Asp Thr Gly Ser Leu Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 4

<211> 119

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи CNTO95 (C95H22)

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Arg Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Phe Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Val Asn Ile Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ala Arg Gly Ser Tyr Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 5

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL TIMB377

<400> 5

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Asp Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gly His Ala Pro Ile

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 6

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ВАРИАНТ S75D VH TM3B337

<400> 6

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ser Pro Tyr Ala Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант N84D VH TM3B337

<400> 7

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ser Pro Tyr Ala Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант A88D VH TM3B337

<400> 8

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ser Pro Tyr Ala Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> VL PD1B244

<400> 9

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Asn Tyr Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 10

<211> 123

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант S75D VH PD1B244

<400> 10

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Asp Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Pro Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Asp Thr Gly Ser Leu Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 11

<211> 123

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант S84D VH PD1B244

<400> 11

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Pro Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Asp Thr Gly Ser Leu Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 12

<211> 123

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариант S88D VH PD1B244

<400> 12

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Pro Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Asp Thr Gly Ser Leu Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 13

<211> 327

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IgG4 с мутацией S228P

<400> 13

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<---

Claims (9)

1. Способ снижения изоэлектрической точки антитела при сохранении его функциональной активности, причем указанный способ включает:

обеспечение антитела, при этом указанное антитело содержит:

первый полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, и

второй полипептид, содержащий вариабельную область тяжелой цепи; и

замены в первом и/или втором полипептидах антитела аминокислотного остатка вариабельной области тяжелой цепи (V_H) в положении 82a в соответствии с системой нумерации по Кабату и обмен аминокислотных остатков VH по меньшей мере в двух положениях, выбранных из положений 74, 82а и 84 в соответствии с системой нумерации по Кабату, по меньшей мере в одном первом или втором полипептидах на отрицательно заряженные аминокислотные остатки.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что антитело представляет собой моноспецифическое или биспецифическое антитело, а первый и второй полипептиды содержат разные вариабельные области тяжелой цепи.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что (а) указанные замены выполняют только в одном первом или втором полипептидах, (б) указанные замены выполняют в обоих первом и втором полипептидах.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что замены аминокислотных остатков первого полипептида отличаются от замен аминокислотных остатков второго полипептида.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что антитело представляет собой антитело IgG, химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело.