KR100901090B1

KR100901090B1 - 항-ｏｘ40ｌ 항체

Info

Publication number: KR100901090B1
Application number: KR1020077006191A
Authority: KR
Inventors: 요제프 엔들; 엘시 유구이; 마리아 푸엔테스; 이보 그라우스; 아란 라브린; 마틴 란첸되르퍼; 파울 파렌; 프랑크 레버스; 랄프 슈마허; 슈테판 제버; 데 빙켈 얀 반; 부크트 마티네 반
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2004-09-17
Filing date: 2005-09-16
Publication date: 2009-06-08
Also published as: KR100895597B1; KR20080059471A; WO2006029879A2; EP1791869B1; HK1108000A1; US20110070239A1; TW200621805A; CA2580140C; TWI309240B; NZ553333A; JP2010280673A; US7868141B2; WO2006029879A3; MX2007002905A; ES2433916T3; US20100166740A1; JP2008512995A; TWI380996B; CA2580140A1; AR051925A1

Abstract

본 발명은 항-OX40L 항체, 특히 인간 기원 유래의 Fc 부분을 함유하고 보체 인자 C1q 에 결합하지 않는 항-OX40L 항체 및 그의 변이체에 관한 것이다. 상기 항체는 염증 질환으로 고통받는 환자에게 유익함을 가져다주는 신규의 진보적인 특성을 갖는다.

항-OX40L 항체

Description

항-ＯＸ40Ｌ 항체 {ANTI-OX40L ANTIBODIES}

본 발명은 일반적으로 항-OX40L 항체 및, 특히 보체 인자 C1q 에 결합하지 않는 항-OX40L 항체, 그의 약학적 조성물 및 용도에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 항체는 인간의 또는 인간화된 항체이다.

인간 OX40L (gp34, SwissProt P23510) 는 CD40/CD40L 결합 시 활성화된 B 세포 및 수지상 세포 상, 및 염증 조직 내 내피 세포 상에서 발현된다 (Review: Weinberg, A.D., Trends Immunol. 23 (2002) 102 - 109). 처음에 HTLV-I 감염된 인간 백혈구 세포에서 인간 OX40L 를 단리하였다 (OX40 이 있는 자가분비 고리의 생성에 의한 상기 T-세포의 불멸화). OX40L 및 그에 대한 항체는 예를 들어, [WO 95/12673 ; WO 95/21915 ; WO 99/15200 ; Baum, P.R., 등, EMBO J. 13 (1994) 3992 - 4001 ; Imura, A., 등, Blood 89 (1997) 2951 - 2958 ; Imura, A., 등, J. Exp. Med. 183 (1996) 2185 - 2195 ; Kjaergaard, J., 등, J. Immunol. 167 (2001) 6669 - 6677 ; Lane, P., J. Exp. Med. 191 (2000) 201 - 206 ; Mallett, S., and Barclay, A.N., Immunol. Today 12 (1991) 220 - 223 ; Mallett, S., 등, EMBO J. 9 (1990) 1063 - 1068 ; Ndhlovu, L.C., 등, J. Immunol. 167 (2001) 2991 - 2999 ; Ohshima, Y., 등, J. Immunol. 159 (1997) 3838 - 3848 ; Rogers, P.R., 등, Immunity 15 (2001) 445 - 455 ; Stueber, E., and Strober, W., J. Exp. Med. 183 (1996) 979 - 989 ; Stueber, E., 등, Gastroenterology 115 (1998) 1205 - 1215 ; Takahashi, Y., 등, J. Virol. 75 (2001) 6748 - 6757 ; Takasawa, N., 등, Jpn. J. Cancer Res. 92 (2001) 377 - 382 ; Taylor, L., and Schwarz, H., J. Immunol. Meth. 255 (2001) 67 - 72 ; Weinberg, A.D., 등, Nature Medicine 2 (1996) 183 - 189 ; Weinberg, A.D., 등, Semin. Immunol. 10 (1998) 471 - 480 ; Weinberg, A.D., Trends Immunol. 23 (2002) 102 - 109 ; Wu, T., 등, Transplant. Proc. 33 (2001 ) 217 - 218 ; Higgins, L.M., 등, J. Immunol. 162 (1999) 486 - 493 ; and Yoshioka, T., 등, Eur. J. Immunol. 30 (2000) 2815 - 2823] 에 기술되어 있다. 인간 OX40L 은 활성화된 CD4+ T 세포 상에서 일시적으로 발현되는 인간 OX40 (CD134) 에 대한 리간드이다. 그의 리간드에 의한 OX40 의 참여는 T 세포 활성화를 위한 공동자극 신호를 초래한다. OX40/OX40L 상호작용은 양방향 신호를 생성하는 것으로 기술되어 있다 (Matsumura, Y., 등, J. Immunol. 163 (1999) 3007 - 3011 ; Kotani, A., 등, Immunol. Lett. 84 (2002) 1 - 7). 추가의 OX40/OX40L 상호작용은 활성화된 T-세포가 염증 조직 내의 내피 세포에 결합하는 것을 매개한다. OX40L 가 단지 활성화된 B 세포, DC 및 내피 세포 상에서 일시적으로 발현되기 때문에, OX40L 에 대한 항체는 염증 반응 동안에 T 세포 활성화 및 내피 세포 결합을 선택적으로 방지하고, 비활성화된, 말초 T 세포는 감염되지 않은 상태로 있게 해야 할 것이다. Yoshioka, A. 등 (Eur. J. Immunol. 30 (2000) 2815 - 2823) 은 류마티스 관절염 마우스 모델에서 항-mOX40L mAb 를 중화 시키는 치료 잠재성을 기술하였다. 항-mOX40L mAb 를 투여하면 질환의 심각성을 현저히 저하시켰다. 상기 항체는 예를 들어, 염증성 피부 질환, 실험적 자가면역 질환 (EAE), GVHD, 요도 염증성 장 질환과 같은 기타 관련 질환 모델에서 유사한 활성을 나타내었다 (Yoshioka, A., 등, Eur. J. Immunol 30 (1999) 2815 - 2823 ; Salek-Ardakani, S., 등, J. Exp. Med. 198 (2003) 315 - 324 ; Burgess, J.K., 등, J. Allergy Clin. Immunol. 113 (2004) 683 - 689 ; Hoshino, A., 등, Eur. J. Immunol. 33 (2003) 861 - 869 ; Arestides, R.S., 등, Eur. J Immunol. 32 (2002) 2874 - 2880 ; Nohara, C, 등, J. Immunol. 166 (2001) 2108 - 2115 ; Weinberg, A.D., 등, J. Immunol. 162 (1999) 1818 - 1826 ; Higgins, L.M., 등, J. Immunol. 162 (1999) 486 - 493 ; Humphreys, I.R., 등, J. Exp. Med. 198 (2003) 1237 - 1242 ; Akiba, H., 등, J. Exp. Med. 191 (2000) 375 - 380 ; Ishii, N., 등, Eur. J. Immunol. 33 (2003) 2372 - 2381 ; Blazar, B.R., 등, Blood 101 (2003) 3741 - 3748 ; Tsukada, N., 등, Blood 95 (2000) 2434 - 2439 ; Akiba, H., 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 251 (1998) 131 - 136).

OX40L 에 대한 항체는 다양한 질환 모델에서 그의 항-염증 효과에 대해 연구되었다 (Sugamura, K., 등, Nat. Rev. Immunol. 4 (2004) 420 - 431).

[Tanaka, Y., 등, Int. J. Cancer 36, (1985) 549 - 555 ; Tozawa, H., 등, Int. J. Cancer 41 (1988) 231 - 238 ; 및 Miura, S., 등, Mol. Cell. Biol. 11 (1991) 1313 - 1325] 는 인간 T-세포 백혈구 바이러스 유형-I (HTLV-I) 을 갖고 있는 인간 림프구 세포주 (line) 의 표면 항원과 반응하는 TARM-34 및 TAC-34 라고 하는 마우스 단일클론 항체에 대해 설명하고 있다. TAC-34 항체는 MBL International Corporation 에서 시판된다. TAC-34 는 또한 OX40L 에 결합한다.

발명의 개요

본 발명은, OX40L 에 결합하고, 인간 기원의 Fc 부분을 함유하고, 인간 보체 인자 C1q 및/또는 NK 세포 상의 인간 Fcγ 수용체에 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 항체, 바람직하게는 단일클론 항체에 관한 것이다.

본 발명은 추가로, 인간 기원의 Fc 부분을 함유하고, 1OO ng 의 항체 농도에서 OX40L 및 변성된 OX40L (웨스턴 블랏에서) 에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체, 바람직하게는 단일클론 항체에 관한 것이다. 상기 항체는 단일클론 항체 LC.001 이 결합하는 에피토프와 동일한 OX40L 폴리펩티드 에피토프에 결합한다. 상기 항체는 예를 들어, LC.001, LC.033 및 LC.060 이다. 상기 항체는 바람직하게는 인간 IgG1 유형 (야생형) 이거나, 또는 인간 보체 인자 C1q 및/또는 NK 세포 상의 인간 Fcγ 수용체에 결합하지 않는다.

본 발명은 추가로 가변 경쇄 및 가변 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, OX40L 에 결합하는 항체에 관한 것으로, 상기 가변 중쇄는 CDR1, CDR2 및 CDR3 을 포함하는 것을 특징으로 하며, CDR3 은 SEQ ID NO : 33 - 38 로부터 선택되는 것을 특징으로 한다. CDR1 이 SEQ ID NO: 21 - 25 로부터 선택되고, CDR2 가 SEQ ID NO: 26 - 32 로부터 선택되고, CDR3 이 SEQ ID NO: 33 - 38 로부터 선택되는 것이 특히 바람직하다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 가변 경쇄 및 가변 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하고, 상기 가변 경쇄는 CDR1, CDR2 및 CDR3 을 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 CDR3 이 SEQ ID NO : 51 - 57 로부터 선택되는 것을 특징으로 한다. CDR1 이 SEQ ID NO : 39 - 44 로부터 선택되고, CDR2 가 SEQ ID NO : 45 - 50 으로부터 선택되고, CDR3 이 SEQ ID NO : 51 - 57 로부터 선택되는 것이 특히 바람직하다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하고, 상기 가변 중쇄는 CDR1, CDR2 및 CDR3 을 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 중쇄의 CDR3 이 SEQ ID NO : 33 - 38 으로부터 선택되고, 상기 경쇄의 CDR3 이 SEQ ID NO : 51 - 57 로부터 선택되는 것을 특징으로 한다. 가변 중쇄가 SEQ ID NO: 21 - 25 로부터 선택되는 CDR1, SEQ ID NO: 26-32 로부터 선택되는 CDR2 및 SEQ ID NO: 33-38 로부터 선택되는 CDR3 을 포함하고, 상기 가변 경쇄가 SEQ ID NO : 39 - 44 로부터 선택되는 CDR1, SEQ ID NO : 45-50 으로부터 선택되는 CDR2 및 SEQ ID NO : 51 - 57 로부터 선택되는 CDR3 을 포함하는 것이 특히 바람직하다.

모든 CDR 은 서로 독립적으로 선택되나, 당연히 이같이 항체는 OX40L 에 결합한다. 따라서, 동일한 LC 항체의 경쇄 및 중쇄의 CDR 이 조합되거나 또는 LC.001 의 경쇄 CDR 과 LC.001, LC.059 또는 LC.063 의 중쇄 CDR 이 조합될 수 있다. 각각의 사슬 상의 CDR 은 골격 아미노산에 의해 분리된다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는, 항체가 하기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 CDR 또는 그의 OX40L-결합 골격을 포함하는 것을 특징으로 한다 :

a) 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 의 경쇄 (V_L) 가변 CDR 및 SEQ ID NO:2 의 중쇄 (V_H) 가변 CDR ;

b) 아미노산 서열 SEQ ID NO:3 의 경쇄 가변 CDR 및 SEQ ID NO:4 의 중쇄 가변 CDR ;

c) 아미노산 서열 SEQ ID NO:5 의 경쇄 가변 CDR 및 SEQ ID NO:6 의 중쇄 가변 CDR ;

d) 아미노산 서열 SEQ ID NO:7 의 경쇄 가변 CDR 및 SEQ ID NO:8 의 중쇄 가변 CDR ;

e) 아미노산 서열 SEQ ID NO:9 의 경쇄 가변 CDR 및 SEQ ID NO: 10 의 중쇄 가변 CDR ;

f) 아미노산 서열 SEQ ID NO:11 또는 16 의 경쇄 가변 CDR 및 SEQ ID NO: 12 의 중쇄 가변 CDR ;

g) 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 에 의해 한정되는 경쇄 (V_L) 가변 도메인 및 SEQ ID NO: 17 에 의해 한정되는 중쇄 (V_H) 가변 도메인 ;

h) 아미노산 서열 SEQ ID NO:18 에 의해 한정되는 경쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO: 19 에 의해 한정되는 중쇄 가변 도메인 ;

i) 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 에 의해 한정되는 경쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:20 에 의해 한정되는 중쇄 가변 도메인.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는, 상기 항체가 하기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 가변 영역 또는 그의 OX40L-결합 골격을 포함하는 것을 특징으로 한다 :

a) 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 에 의해 한정되는 경쇄 (VL) 가변 도메인 및 SEQ ID NO:2 에 의해 한정되는 중쇄 (VH) 가변 도메인 ;

b) 아미노산 서열 SEQ ID NO:3 에 의해 한정되는 경쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:4 에 의해 한정되는 중쇄 가변 도메인 ;

c) 아미노산 서열 SEQ ID NO:5 에 의해 한정되는 경쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:6 에 의해 한정되는 중쇄 가변 도메인 ;

d) 아미노산 서열 SEQ ID N0:7 에 의해 한정되는 경쇄 가변 도메인 및 SEQ ID N0:8 에 의해 한정되는 중쇄 가변 도메인 ;

e) 아미노산 서열 SEQ ID NO:9 에 의해 한정되는 경쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO: 10 에 의해 한정되는 중쇄 가변 도메인 ;

f) 아미노산 서열 SEQ ID NO: 11 또는 16 에 의해 한정되는 경쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO: 12 에 의해 한정되는 중쇄 가변 도메인 ;

h) 아미노산 서열 SEQ ID NO: 18 에 의해 한정되는 경쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO: 19 에 의해 한정되는 중쇄 가변 도메인 ;

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는, 인간 경쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 16 및 18 로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는, 인간 중쇄 가변 영역이 SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 17, 19 및 20 으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

중쇄 및 경쇄의 CDR 영역은 SEQ ID NO : 21 - 38 및 39 - 57 에 나타나 있다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는, 항체가 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 에 의해 한정되는 경쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:2, 17 또는 20 에 의해 한정되는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는, 인간 중쇄 불변 영역이 SEQ ID NO:14 및 15 또는 SEQ ID NO:58 의 중쇄 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는, 항체가 SEQ ID NO: 13 의 κ-경쇄 불변 영역 또는 SEQ ID NO:61, 65 또는 69 의 경쇄 불변 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 항체는 OX40L 에 결합하고, 인간 IgG1 부류 (야생형) 이고, γ 중쇄로서 SEQ ID NO: 58, 62 또는 66 을 포함하는 것을 특징으로 한다. 하기를 포함하는 항체가 특히 바람직하다 :

a) γ 중쇄로서 SEQ ID NO:58 및 카파 경쇄로서 SEQ ID NO:61,

b) γ 중쇄로서 SEQ ID NO:62 및 카파 경쇄로서 SEQ ID NO:65 또는

c) γ 중쇄로서 SEQ ID NO:66 및 카파 경쇄로서 SEQ ID NO:69.

본 발명의 추가의 구현예는 OX40L 에 결합하는 항체로서, 이는 세포주 hu-Mab<hOX40L>LC.001, hu-Mab<hOX40L>LC.005, hu-Mab<hOX40L>LC.010, hu-Mab<hOX40L>LC.019, hu-Mab<hOX40L>LC.029 또는 hu-Mab<hOX40L>LC.033 에 의해 생성되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 키메라성, 인간의 또는 인간화된 항체이다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 BIAcore 어세이에서 10^-8 M 미만 (10^-12 내지 10^-8 M) 의 K_D 값, 더욱 바람직하게는 10^-12 내지 10^-9 M 의 K_D 범위로 OX40L 에 결합하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 4 nM 이하의 IC50 값으로 0.5 μg/ml 의 코팅 농도에서 고정된 OX40L (바람직하게는 스트렙타비딘 표면 상에 고정시킨 바이오틴화된 OX40L) 를 사용한 ELISA 에서 OX40L 와 OX40 과의 상호작용을 억제시킨다. 더욱 바람직하게는 IC50 값은 1 내지 4 nM 의 범위이다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는, 보체 인자 C1q 에의 항체의 비-결합이 ELISA 어세이 측정을 말하는 것을 특징으로 하는데, 여기서 10 μg/ml 의 농도에서 항체의 C1q 에의 최대 결합 (Bmax) 이 항체 LC.001 의 Bmax 와 비교해 30% 이하, 바람직하게는 20% 이하이다.

바람직하게는 본 항체는 인간 FcγRⅠ, FcγRⅡA 및/또는 FcγRⅢA 에 결합하지 않는다. 특히 바람직하게는, 상기 항체는 NK 효과기 세포 상의 인간 Fcγ 수용체에 결합하지 않는다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는, NK 세포 상의 Fcγ 수용체에 상기 항체가 결합하지 않는 것이, 20 μg/ml 의 농도에서 상기 항체의 NK 세포에의 최대 결합 (Bmax) 이 항체 LC.001 의 Bmax 와 비교해 20% 이하, 바람직하게는 10% 이하인 어세이를 말하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 FcγRⅠ 에 결합하지 않는 것을 특징으로 한다. 이는, 상기 항체가, 0.078 - 10 μg/ml 범위의 농도에서, FcγRⅡA 및 FcγⅡB 는 없으나 재조합 FcγRⅠ 을 발현하는 B-세포 림프종 세포에 항체가 결합하는 것을 테스트하는 어세이에서 측정된 경우, EC50 값이 LC.001 의 EC50 값과 비교해 5 배 이상, 바람직하게는 7 배 이상, 8 배 이상과 같은 것을 특징으로 함을 의미한다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는, 바람직하게는 인간 Fc 부분에서 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 IgG4 항체 또는 IgG1 항체이어서, 보체 인자 C1q 에의 비-결합 및/또는 NK 세포 상의 인간 Fcγ 수용체에의 비-결합을 야기하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 보체 인자 C3 을 활성화시키지 않는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는, 인간 하위부류 IgG4 인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 추가의 바람직한 구현예에서, 항체는 E233, L234, L235, G236, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 및/또는 P329 (EU 지침에 따라 넘버링) 에 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 임의의 IgG 부류, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 인 것을 특징으로 한다. IgG1 돌연변이 PVA236, L234A/L235A 및/또는 GLPSS331 뿐만 아니라 IgG4 돌연변이 L235E 가 특히 바람직하다. IgG4 하위부류의 항체가 돌연변이 S228P 또는 돌연변이 S228P 및 L235E 를 함유하는 것이 더욱 바람직하다 (Angal, S., 등, Mol. Immunol. 30 (1993) 105-108).

따라서, 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 PVA236, GLPSS331 및/또는 L234A/L235A (EU 지침에 따라 넘버링) 로부터의 하나 이상의 돌연변이(들) 를 함유하는 인간 하위부류 IgG1 의 항체이다.

바람직하게는 본 발명에 따른 항체는 OX40L 에 결합하고, 돌연변이 L234A/L235A 를 함유하는 IgG1 부류인 것을 특징으로 하며, γ 중쇄로서 SEQ ID NO: 59, 63 또는 67 을 포함한다.

하기를 포함하는 항체가 특히 바람직하다 :

a) γ 중쇄로서 SEQ ID NO:59 및 카파 경쇄로서 SEQ ID NO:61,

b) γ 중쇄로서 SEQ ID NO:63 및 카파 경쇄로서 SEQ ID NO:65 또는

c) γ 중쇄로서 SEQ ID NO:67 및 카파 경쇄로서 SEQ ID NO:69.

바람직하게는 본 발명에 따른 항체는 돌연변이 S228P 를 함유하는 IgG4 부류인 것을 특징으로 하고, γ 중쇄로서 SEQ ID NO: 60, 64 또는 68 을 포함한다.

하기를 포함하는 항체가 특히 바람직하다 :

a) γ 중쇄로서 SEQ ID NO:60 및 카파 경쇄로서 SEQ ID NO:61,

b) γ 중쇄로서 SEQ ID NO:64 및 카파 경쇄로서 SEQ ID NO:65 또는

c) γ 중쇄로서 SEQ ID NO:68 및 카파 경쇄로서 SEQ ID NO:69.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 보체-의존성 세포독성 (CDC) 을 유도하지 않는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 을 유도하지 않는 것을 특징으로 한다.

따라서, 본 발명은 CDR, 가변 영역, 완전 아미노산 서열 또는 하이브리도마를 특징으로 하고 Fc 부분이 없거나 또는 임의의 유형의 Fc 부분, 바람직하게는 인간 기원으로부터 비개질되어 있거나 또는 상기 언급된 돌연변이에 의해 개질되어 있는, 인간 IgG1 Fc 또는 인간 IgG4 Fc 를 포함하는 것을 특징으로 하는 항-OX40L 항체 또는 단일 중쇄 또는 경쇄를 포함한다.

따라서, 본 발명은 또한, 항체가 OX40L 에 결합하고, 인간 기원의 Fc 부분을 함유하고, 인간 보체 인자 C1q 및/또는 NK 세포 상의 인간 Fcγ 수용체에 결합하지 않으며, 인간 IgG4 유형, 또는 상기 언급된 돌연변이에 의해 둘 다 개질된 인간 IgG4 유형 또는 IgG1 인 것을 특징으로 하는 항체, 바람직하게는 단일클론 항체를 포함한다.

따라서, 본 발명은 항체가 1OO ng 의 항체 농도에서 OX40L 및, 변성 OX40L (웨스턴 블랏에서) 에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체, 바람직하게는 단일클론 항체를 포함한다. 상기 항체는 단일클론 항체 LC.001 이 결합하는 에피토프와 동일한 OX40L 폴리펩티드 에피토프에 결합한다. 상기 항체는 Fc 부분을 포함하지 않거나 또는 임의의 유형의 Fc 부분, 바람직하게는 야생형 또는 상기 언급된 돌연변이에 의해 개질된 인간 IgG1 또는 인간 IgG4 를 포함한다.

본 발명에 따른 항체는 OX40L 에 대한 항체로 치료받을 필요가 있는 환자, 특히 염증성 장애, 특히 류마티스 관절염, 알레르기성 천식, 및 이식 시 GvHD 로 고통받는 환자에게 이득을 주는 신규 및 진보적인 특성을 갖고 있다 ([Sugamura, K., 등, Nat. Rev. Immunol. 4 (2004) 420 - 431] 또한 참조).

본 발명의 추가의 구현예는 본 발명에 따른 항체 분자, 그의 가변 쇄 또는 CDR 도메인을 인코딩하는 핵산 분자이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 항체는 Fab, F(ab')₂ 또는 단일-쇄 절편이다.

본 발명의 추가의 구현예는 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터이다.

본 발명의 추가의 구현예는 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.

본 발명의 추가의 구현예는 항체 분자를 합성시킬 수 있는 조건 하에 본 발명에 따른 숙주 세포를 배양하고, 상기 배양물로부터 상기 항체 분자를 회수하는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 항체의 제조 방법이다.

본 발명의 추가의 구현예는 조성물, 바람직하게는 본 발명에 따른 항체의 약학 또는 진단 조성물이다.

본 발명의 추가의 구현예는 본 발명에 따른 항체 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물이다.

본 발명의 추가의 구현예는 본 발명에 따른 치료적 유효량의 항체를 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는, 치료가 필요한 환자의 치료 방법이다.

본 발명의 추가의 구현예는 치료, 바람직하게는 염증성 질환의 치료, 특히 류마티스 관절염, 천식 및 GvHD (이식 숙주 편대 질환) 의 치료 및/또는 예방을 위한 본 발명에 따른 항체의 용도이다.

본 발명의 추가의 구현예는 염증성 장애의 예방 및/또는 치료, 바람직하게는 류마티스 관절염, 천식 및 GvHD 의 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도이다.

본 발명의 추가의 구현예는 본 발명에 따른 항체, 본 발명에 따른 핵산 분자, 본 발명에 따른 벡터 또는 본 발명에 따른 숙주 세포를 포함하는 진단 키트이다.

발명의 상세한 설명

용어 "OX40L" 는 TNF-리간드 과에 속하는 유형 Ⅱ 막 단백질을 말한다. 다른 이름들로는 ACT-4 수용체, CD134L, gp34 또는 TNF4_-인간이 있다. 분자량은 34 KDa 이고, 수납 번호 P23510 으로 SwissProt 에 보관되어 있다.

용어 "OX40" 은 OX40L 에 결합하는 수용체를 말한다. 이것은 TNF 수용체 과에 속하는 유형 I 막 단백질이다. 다른 이름들로는 ACT-4, OX40L 수용체, CD134 항원, ACT35 항원, TNR4_-인간이 있다. 분자량은 50 kDa 이고, 수납 번호 P43489 로 SwissProt 에 보관되어 있다.

용어 "항체" 는 본 발명에 따른 특성이 유지되는 한, 다양한 형태의 항체를 포함하며, 바람직하게는 전체 항체, 항체 절편, 인간 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체 및 유전적으로 조작된 항체 (변이체 또는 돌연변이 항체) 를 포함하나 이에 제한되지 않는 단일클론 항체를 포함한다. 인간 또는 인간화된 단일클론 항체, 특히 재조합 인간 항체가 특히 바람직하다.

본원에서 사용된 용어 "단일클론 항체" 또는 "단일클론 항체 조성물" 은 단일 아미노산 조성물의 항체 분자의 제조물을 말한다.

용어 "키메라 항체" 는 보통 재조합 DNA 기술에 의해 제조되는, 하나의 기원 또는 종으로부터의 가변 영역, 즉 결합 영역, 및 상이한 기원 또는 종으로부터 유래된 불변 영역의 일부 이상을 포함하는 단일클론 항체를 말한다. 쥣과 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메라 항체가 바람직하다. 본 발명에 포함되는 "키메라 항체" 의 다른 바람직한 형태는, 본 발명에 따른 특성, 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체 (FcR) 결합에 관한 특성을 발생시키도록 불변 영역이 개질되어 있거나 또는 원래 항체의 것에서 변한 것들이다. 상기 키메라 항체를 또한 "부류-교환된 항체" 라고도 한다. 키메라 항체는 면역글로불린 가변 영역을 인코딩하는 DNA 단편 및 면역글로불린 불변 영역을 인코딩하는 DNA 단편을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 생성물이다. 키메라 항체의 생성 방법은 통상의 재조합 DNA 를 포함하고, 유전자 트랜스펙션 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, [Morrison, S.L., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855 ; 미국 특허 제 5,202,238 호 및 제 5,204,244 호] 를 참조한다.

용어 "인간화된 항체" 는, 골격 또는 "상보성 결정 영역" (CDR) 이 모 면역글로불린의 것과 비교해 상이한 특이성을 갖는 면역글로불린의 CDR 을 포함하도록 개질된 항체를 말한다. 바람직한 구현예에서, 쥣과 CDR 을 인간 항체의 골격 영역에 이식하여, "인간화된 항체" 를 만든다. 예를 들어, [Riechmann, L, 등, Nature 332 (1988) 323 - 327 ; 및 Neuberger, M.S., 등, Nature 314 (1985) 268 - 270] 를 참조한다. 특히 바람직한 CDR 은 키메라성 및 이작용성 항체에 대해 상기 언급된 항원을 인지하는 서열을 나타내는 CDR 에 상응한다. 본 발명에 포함되는 다른 형태의 "인간화된 항체" 는, 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체 (FcR)결합에 관해 본 발명에 따른 특성이 발생되도록 불변 영역이 추가로 개질되거나 또는 원래 항체의 불변 영역에서 변화된 항체이다.

본원에 사용된 용어 "인간 항체" 는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것이다. 인간 항체는 당업계에 잘 알려져 있다 (van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368 - 374). 인간 항체는 또한 면역 시, 내생 면역글로불린 생성의 부재 하에 인간 항체의 완전한 레퍼토리 또는 선택물을 생성할 수 있는 유전자 도입 동물 (예를 들어, 마우스) 에서 생성될 수 있다. 상기 생식-계열 돌연변이 마우스에서 인간 생식-계열 면역글로불린 유전자 어레이의 이전은, 항원 공격 시 인간 항체의 생성을 초래할 것이다 (예를 들어, [Jakobovits, A., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551 - 2555 ; Jakobovits, A., 등, Nature 362 (1993) 255 - 258 ; Bruggemann, M., 등, Year Immunol. 7 (1993) 33 - 40 참조). 인간 항체는 또한 상 디스플레이 라이브러리에서도 생성될 수 있다 (Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381 - 388 ; Marks, J.D., 등, J. Mol. Biol. 222 (1991) 581 - 597). Cole 등 및 Boerner 등의 기술은 또한 인간 단일클론 항체의 제조에도 사용가능하다 (Cole 등, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) ; 및 Boerner, P., 등, J. Immunol. 147 (1991) 86 - 95). 본 발명에 따른 키메라성 및 인간화된 항체에 대해 이미 언급한 바와 같이, 본원에 사용된 용어 "인간 항체" 는 또한, 특히 예를 들어 "부류 교환" 즉, Fc 부분의 변화 또는 돌연변이 (예를 들어 IgG1 에서 IgG4 로, 및/또는 IgG1/IgG4) 에 의해, C1q 결합 및/또는 FcR 결합에 관한 본 발명에 따른 특성이 생성되도록 불변 영역이 개질된 항체를 포함한다. 또한, 본 발명은 C1q 및/또는 FcR 에 결합하는 OX40L 에 대한 단일클론 인간 항체를 포함한다. 상기 인간 항체는 인간 OX40L 대 마우스 OX40L (인간 OX40L 에 대해서보다 마우스 OX40L 에 대한 결합이 > 30 배 더 낮음) 에 대해 높은 선택성을 가지는 것을 특징으로 하고, 500 nM 이하의 농도의 TNFα 또는 CD40L 에 대한 비특이적 결합을 나타내지 않는다. 상기 항체는 C1q 및/또는 FcR 에 결합하지 않는 항체의 생성에 유용하다.

본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체" 는 NSO 또는 CHO 세포와 같은 숙주 세포 또는 인간 면역글로불린 유전자를 위해 유전자 도입된 동물 (예를 들어 마우스) 로부터 단리된 항체, 또는 숙주 세포에 트랜스펙션된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체와 같은, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체를 포함하는 것이다. 상기 재조합 인간 항체는 재배열된 형태에서 가변 및 불변 영역을 갖는다. 본 발명에 따른 재조합 인간 항체는 생체 내에서 체세포 과돌연변이를 받았다. 따라서, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식-계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 그것과 관련된 한편, 생체 내에서 인간 항체 생식-계열 레퍼토리 내에서 자연적으로 존재할 수는 없는 서열이다.

본원에 사용된 "가변 영역" (경쇄의 가변 영역 (VL), 중쇄의 가변 영역 (VH)) 은 항원에 항체가 결합하는 것에 직접적으로 관련하는 경쇄 및 중쇄의 쌍의 각각을 말한다. 가변 인간 경쇄 및 중쇄의 도메인은 동일한 일반 구조를 갖고, 각각의 도메인은, 서열이 광범위하게 보전되어 있으면서 3 개의 "과가변 영역" (또는 상보성 결정 영역, CDR) 에 의해 연결되는 4 개의 골격 (FR) 영역을 포함한다. 골격 영역은 β-시트 구조를 갖고, CDR 은 β-시트 구조를 연결하는 루프를 형성할 수 있다. 각각의 쇄에 있는 CDR 은 골격 영역에 의해 3 차원 구조로 유지되어 있고, 다른 쇄에 있는 CDR 과 함께 항원 결합 부위를 형성한다. 항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역은 본 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화성에서 특별히 중요한 역할을 하고, 따라서 본 발명의 추가의 목적을 제공한다.

본원에 사용될 때, 용어 "과가변 영역" 또는 "항체의 항원-결합 부위" 는 항원-결합을 책임지는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 과가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "골격" 또는 "FR" 영역은 본원에 정의된 과가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 영역이다. 따라서, 항체의 경쇄 및 중쇄는 N- 내지 C-말단 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4 를 포함한다. 각 사슬 상의 CDR 은 상기 골격 아미노산에 의해 분리된다. 특히, 중쇄의 CDR3 은 항원 결합에 가장 기여하는 영역이다. CDR 및 FR 영역은 [Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] 의 표준 정의에 따라 결정된다.

본원에 사용된 용어 "핵산 또는 핵산 분자" 는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것이다. 핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있으나, 바람직하게는 이중-가닥 DNA 이다.

핵산은 또다른 핵산 서열과 기능적 연관을 갖도록 위치될 때 "조작적으로 연결된" 다. 예를 들어, 전서열 또는 분비 리더 (secretory leader) 를 위한 DNA 는, 그것이 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현된다면 폴리펩티드를 위한 DNA 에 조작적으로 연결되거나 ; 프로모터 또는 인핸서는, 그것이 서열의 전사에 영향을 미친다면 코딩 서열에 조작적으로 연결되거나 ; 또는 리보솜 결합 부위는, 그것이 번역을 할 수 있도록 하기 위해 위치된다면 코딩 서열에 조작적으로 연결된다. 일반적으로, "조작적으로 연결된" 은, 연결되는 DNA 서열이 인접하고, 분비 리더의 경우 인접하면서 해독 프레임 내에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접되어 있을 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결합됨으로써 이루어진다. 상기 부위가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상의 실행에 따라 사용된다.

본원에 사용된 바와 같이, 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물" 은 상호교환적으로 사용되고, 모든 상기 정의는 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포" 는 원래의 주체 세포, 및 이전의 수에 상관없이 그로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한, 계획적이거나 또는 우연한 돌연변이로 인해, 모든 자손의 DNA 함량이 정확하게 동일할 수는 없다고 이해한다. 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물 활성을 가진 변이체 자손이 포함된다. 명확하게 지정되기를 원하는 경우에는, 내용상 명확해질 것이다.

"불변 도메인" 은 항체의 항원 결합에는 직접 관여하지 않으나, 다양한 효과기 작용을 나타낸다. 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 항체 또는 면역글로불린은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 의 부류로 나눠지고, 이의 다수는 추가로 하위부류 (아이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4, IgA1 및 IgA2 로 나누어질 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 상응하는 중쇄 불변 영역을 각각 α, ε, γ, 및 μ 라고 한다. 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 IgG 유형이다.

본 발명에 따른 항체는 Fc 부분으로서, 바람직하게는 인간 기원 유래의 Fc 부분 및 바람직하게는 인간 불변 영역의 모든 다른 부분을 함유한다. 항체의 Fc 부분은 보체 활성화, C1q 결합, C3 활성화 및 Fc 수용체 결합에 직접 관여한다. 보체 시스템에 대한 항체의 효과가 특정 조건에 의존하는 한편, C1q 에의 결합은 Fc 부분에 있는 한정된 결합 부위에 의해 야기된다. 상기 결합 부위는 당업계에 알려져 있고, 예를 들어 [Lukas, TJ., 등, J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., and Cebra, J.J., MoI. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., 등, Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., 등, Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., 등, J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., 등, J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., 등, Immunology 86 (1995) 319-324; 및 EP 0 307 434] 에 기술되어 있다. 상기 결합 부위는 예를 들어 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329 (Kabat 의 EU 지침에 따라 넘버링, 하기 참조) 이다. 하위부류 IgG1, IgG2 및 IgG3 의 항체는 보통 보체 활성화, C1q 결합 및 C3 활성화를 나타내며, 반면 IgG4 는 보체 시스템을 활성화시키지 않고, C1q 에 결합하지 않고, C3 를 활성화시키지 않는다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간 기원이며 NK 세포 상에서 인간 보체 인자 C1q 및/또는 인간 Fc□ 수용체에 결합하지 않는 Fc 부분" 은, 하기에 정의된 바와 같이 C1q 결합, C3 활성화 및/또는 FcR 결합이 검출될 수 없는 방식으로 개질된, 하위부류 IgG4 의 인간 항체의 Fc 부분 또는 하위부류 IgG1, IgG2 또는 IgG3 의 인간 항체의 Fc 부분인 Fc 부분을 말한다. "항체의 Fc 부분" 은 당업자에게 잘 알려져 있으며 항체의 파파인 분할을 바탕으로 한정된다. 바람직하게는 Fc 부분은 인간 Fc 부분이고, 바람직하게는 힌지 (hinge) 영역에서 돌연변이된 인간 IgG4 하위부류 (예를 들어 S228P 및/또는 L235E) 또는 인간 IgG1 하위부류의 돌연변이된 Fc 부분이 특히 바람직하다. SEQ ID NO: 14 및 15 에 나타나 있거나 또는 SEQ ID NO:58, 59, 60, 돌연변이 L234A 및 L235A 가 있는 SEQ ID NO: 14 또는 돌연변이 S228P 또는 돌연변이 S228P 및 L235E 가 있는 SEQ ID NO: 15 에 포함된 영역으로부터 선택되는 중쇄 불변 영역을 포함하는 Fc 부분이 가장 바람직하다.

본 발명은 OX40L 에는 결합하고 보체 인자 C1q, 및/또는 Fc 수용체에는 결합하지 않는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 항체는 보체 의존성 세포독성 (CDC) 및/또는 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 을 유도하지 않는다. 바람직하게는, 상기 항체는 OX40L 에 결합하고, 인간 기원 유래의 Fc 부분을 함유하고, 보체 인자 C1q 에 결합하지 않는 것을 특징으로 한다. 더욱 바람직하게는, 상기 항체는 인간 또는 인간화된 단일클론 항체이다.

항체 Fc 영역의 Fc 부분에 의해 매개되는 효과기 기능은 항체의 항원 결합 후에 작동하는 효과기 기능 (이러한 기능은 Fc 수용체에 의한 보체 캐스캐이드의 활성화 및/또는 세포 활성화를 포함함) 을 말한다.

보체 캐스캐이드의 기능은 CH50 어세이에 의해 평가될 수 있다. 항-적혈구 항체 (EA) 로 민감화시킨 양의 적혈구를 테스트 혈청에 첨가하여, 용혈 반응을 일으키는 전형적인 경로를 활성화시킨다. 적혈구 50% 를 용해시키는데 필요한 혈청의 부피는 CH50 유닛을 결정한다. AP-CH50 은 대안적이고 종착적인 경로를 측정한다. 과정은 토끼 적혈구가 사용되는 것을 제외하고는 유사하다. 대안 경로는 테스트 혈청의 첨가 시 활성화된다.

C1q 및 2 개의 세린 프로테아제, C1r 및 C1s 는 보체 의존성 세포독성 (CDC) 경로의 제 1 성분인 복합체 C1 을 형성한다. 보체 캐스캐이드를 활성화시키기 위해, C1q 가 항원 표적에 결합된 2 개 이상의 IgG1 분자 또는 하나의 IgM 분자에 결합한다 (Ward, E.S., and Ghetie, V., Ther. Immunol. 2 (1995) 77-94). Burton, D.R. (Mol. Immunol. 22 (1985) 161- 206) 은 아미노산 잔기 318 내지 337 을 포함하는 중쇄 영역이 보체 고정화에 관여한다고 기술하였다. 부위 직접적 돌연변이 생성을 이용하여, Duncan, A.R., 및 Winter, G. (Nature 332 (1988) 738-740) 는, Glu318, Lys320 및 Lys322 가 C1q 에의 결합 부위를 형성한다고 보고하였다. Glu318, Lys320 및 Lys 322 잔기를 함유하는 짧은 합성 펩티드가 보체 매개 용해를 억제시키는 능력에 의해, C1q 의 결합에 있어서 상기 잔기의 능력을 확인하였다.

용어 "보체-의존성 세포독성 (CDC)" 은 보체의 존재 하에 본 발명에 따른 항체에 의한 OX40L 발현 인간 내피 세포의 파괴를 말한다. CDC 는 바람직하게는 보체의 존재 하에 본 발명에 따른 항체를 OX40L 발현 인간 내피 세포에 처리함으로써 측정된다. 상기 세포는 바람직하게는 칼세인으로 표지된다. 항체가 30 μg/ml 의 농도에서 표적 세포 20% 이상의 파괴를 유도한다면, CDC 가 있는 것이다. 본 발명자들은, 본 발명에 따른 항체의 특성을 알아보기 위해서는 ELISA 어세이에서 보체 인자 C1q 에 대한 결합이 감소되는 것이 필요함을 발견하였다. 상기 어세이에서, 원래 ELISA 플레이트는 농도 범위의 항체로 코팅되고, 거기에 정제된 인간 C1q 또는 인간 혈청이 첨가된다. C1q 결합은 C1q 에 대해 직접적인 항체 및 이어서 퍼록시다제-표지된 콘쥬게이트에 의해 검출된다. 결합 (최대 결합 Bmax) 의 검출은 퍼록시다제 기질 ABTS® (2,2'-아지노-디-[3-에틸벤즈티아졸린-6-술포네이트 (6)] 을 위해서는 광학 밀도로서 405 nm (OD405) 에서 측정된다. 따라서, 본 발명은, 보체 인자 C1q 에의 항체 결합이 10 μg/ml 의 항체 농도에서 본 발명에 따른 항체에 대한 C1q 의 최대 결합이 항체 LC.001 로 관찰된 Bmax 의 20% 이하, 바람직하게는 10% 이하인 상기 ELISA 어세이 측정을 말하는 것을 특징으로 하는 항체에 관한 것이다.

ELISA 어세이에서 본 발명에 따른 항체가 보체 인자 C3 의 감소된 활성화를 나타낸 것이 더욱 바람직하다. 상기 어세이는 C1q 어세이와 동일한 방식으로 수행된다. 상기 어세이에서, 원칙적으로 ELISA 플레이트는 농도 범위의 항체로 코팅되고, 거기에 인간 혈청이 첨가된다. C3 결합은 C3 에 대해 직접적인 항체 및 이어서 퍼록시다제-표지된 콘쥬게이트에 의해 검출된다. 결합 (최대 결합 Bmax) 의 검출은 퍼록시다제 기질 ABTS® 에 대해 405 nm 의 광학 밀도 (OD405) 에서 측정된다. 따라서, 본 발명은, 보체 인자 C3 에 항체가 비-결합되었다고 하는 것이 10 μg/ml 의 항체 농도에서 C3 의 항체에의 최대 결합 (Bmax) 이 항체 LC.001 의 Bmax 의 10%, 이 바람직하게는 5% 이하인 상기 ELISA 어세이 측정을 말하는 것을 특징으로 하는 항체를 말한다.

용어 "항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)" 은 Fc 수용체 결합에 의해 매개되는 기능이고, 효과기 세포의 존재 하에 본 발명에 따른 항체에 의한 OX40L 발현 표적 세포의 파괴를 말한다. ADCC 는 바람직하게는, 갓 단리된 PBMC (말초 혈액 단핵구 세포) 또는 단핵세포 또는 NK (자연 살해세포) 와 같이 연막으로부터 정제된 효과기 세포와 같은 효과기 세포의 존재 하에 OX40L 발현 적혈구계 세포 (예를 들어 재조합 인간 OX40L 를 발현하는 K562 세포) 의 제조물을 본 발명에 따른 항체로 처리함으로써 측정된다. 표적 세포를 ⁵¹Cr 으로 표지하고, 이어서 항체와 함께 인큐베이션시킨다. 표지된 세포를 효과기 세포와 함께 인큐베이션시키고, 방출된 ⁵¹Cr 에 대해 상청액을 분석한다. 대조군은 항체 없이 효과기 세포와 표적 내피 세포를 인큐베이션시킨 것을 포함한다. ADCC 를 매개하는 초기 단계를 유도하는 항체의 능력을, 재조합적으로 FcγRⅠ 및/또는 FcγRⅡA 를 발현하는 세포 또는 NK 세포 (원래 FcγRⅢA 를 발현함) 와 같이 Fcγ 수용체 발현 세포에 상기 항체가 결합하는 정도를 측정함으로써 알아보았다. 바람직하게는 NK 세포 상의 FcγR 에의 결합을 측정한다.

Fc 수용체 결합 효과기 기능은 항체의 Fc 영역과 조혈모세포 상의 특수화된 세포 표면 수용체인 Fc 수용체 (FcR) 와의 상호작용에 의해 매개될 수 있다. Fc 수용체는 면역글로불린 상과 (superfamily) 에 속하고, 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 을 통해, 면역 복합체의 식균작용에 의한 항체-코팅된 병원균의 제거, 및 상응하는 항체로 코팅된 적혈구 및 다양한 기타 세포 표적 (예를 들어 종양 세포) 의 파괴 둘 다를 매개하는 것으로 보인다 (Van de Winkel, J.G., and Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524). FcR 는 면역글로불린 아이소타입에 대한 그의 특이성에 의해 정의되고 ; IgG 항체에 대한 Fc 수용체를 FcγR 라고 하고, IgE 에 대해서는 FcεR 로, IgA 에 대해서는 FcαR 등이라고 한다. Fc 수용체 결합은 예를 들어 [Ravetch, J.V., and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel, PJ., 등, Immunomethods 4 (1994) 25-34; de Haas, M., 등, J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341; and Gessner, J.E., 등, Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248] 에 기술되어 있다.

IgG 항체의 Fc 도메인에 대한 수용체 (FcγR) 의 교차-결합은 식균 작용, 항체-의존성 세포성 세포독성, 및 염증 매개자의 방출, 뿐만 아니라 면역 복합체 제거 및 항체 생성의 조절을 포함한 광범위하게 다양한 효과기 기능을 이끈다. 인간에서는, 3 가지 부류의 FcγR 가 특징화되어 있으며, 이는 하기이다 :

- FcγRⅠ (CD64) 은 단량체성 IgG 에 높은 친화성을 가지고 결합하고, 대식세포, 단핵세포, 중성구 및 호중구 상에서 발현된다. 하나 이상의 E233-G236, P238, D265, N297, A327 및 P329 의 IgG 에서의 개질은 FcγRⅠ 에의 결합을 감소시킨다. IgG1 및 IgG4 로 치환된, 위치 233-236 에 있는 IgG2 잔기는 FcγRⅠ 에의 결합을 10³-배 감소시켰고, 인간 단핵세포의 항체-민감화된 적혈구 세포에의 반응을 제거하였다 (Armour, K.L., et al.. Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624).

- FcγRⅡ (CD32) 는 낮은 친화성을 가지고 배지와 함께 복합체화된 IgG 에 결합하고, 광범위하게 발현된다. 상기 수용체는 2 가지 중요 유형인 FcγRⅡA 및 FcγRⅡB 로 구분될 수 있다. FcγRⅡA 는 세포살해와 관련된 많은 세포 (예를 들어 대식세포, 단핵세포, 중성구) 상에서 발견되고, 세포살해 과정을 활성화시킬 수 있는 것으로 보인다. FcγRⅡB 는 억제 작용에 있어 역할을 하는 것으로 보이고, B-세포, 대식세포 및 거대세포 및 호중구 상에서 발견된다. B-세포 상에서, FcγRⅡB 는 추가로 면역글로불린 생성 및 IgE 부류와 같은 아이소타입 스위칭을 억제하는 기능이 있는 것으로 보인다. 대식 세포 상에서, FcγRⅡB 는 FcγRⅡA 를 통해 매개되는 식균작용을 억제시키는 작용을 한다. 호중구 및 거대 세포 상에서, b 형태는 그의 분리된 수용체에의 IgE 결합을 통해 상기 세포의 활성화를 억제시키는 것을 도울 수 있다. FcγRⅡA 에 대한 감소된 결합은 예를 들어 하나 이상의 E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, R292 및 K414 의 IgG 돌연변이에서 발견된다.

FcγRⅢ (CD 16) 는 낮은 친화성을 가지고 IgG 에 결합하고, 2 가지 유형으로서 존재한다. FcγRⅢA 는 NK 세포, 대식세포, 호중구 및 일부 단핵세포 및 T 세포 상에 존재하고, ADCC 를 매개한다. FcγRⅢB 는 중성구 상에서 많이 발현된다. FcγRⅢA 에의 감소된 결합은 예를 들어 E233, G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, S239, E269, E293, Y296, V303, A327, K338 및 D376 중 하나 이상에서의 돌연변이에서 발견된다.

Fc 수용체에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위의 맵핑, 상기 언급된 돌연변이 위치 및 FcγRⅠ 및 FcγRⅡA 에의 결합의 측정 방법은 [Shields, R.L., et al. JBC 276 (2001) 6591 - 6604] 에 기술되어 있다.

본원에 사용될 때 용어 "Fc 수용체" 는 수용체와 관련된 세포질 ITAM 서열이 있음을 특징으로 하는 활성화 수용체를 말한다 (예를 들어 [Ravetch, J.V., and Bolland, S., Annu. Rev. Immunol. 19 (2001) 275-290] 참조). 상기 수용체는FcγRⅠ, FcγRⅡA 및 FcγRⅢA 이다. 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 Fcγ 수용체, 바람직하게는 FcγⅢA 에의 결합이 감소되어 나타나 있다. 바람직하게는 용어 "FcγR 의 결합이 없음" 은 본 발명에 따른 항체의 NK 세포에의 결합이 항체 농도 1Oμg/ml 에서 항체 LC.001 에 대한 결합의 10% 이하임을 의미한다.

IgG4 가 감소된 FcR 결합을 나타내는 한편, 기타 IgG 하위부류의 항체는 강한 결합을 나타낸다. 그러나, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (Fc 탄수화물이 없음), Pro329 및 234, 235, 236 및 237 Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434, 및 His435 는 변경된다면 FcR 결합을 또한 감소시키는 잔기이다 (Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001 ) 6591-6604; Lund, J., et al. FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., 등, Immunology 86 (1995) 319-324; and EP 0 307 434). 바람직하게는 IgG1 또는 IgG2 하위부류의 본 발명에 따른 항체는 돌연변이 PVA236, GLPSS331 및/또는 L234A/L235A 를 포함한다. IgG4 하위부류의 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 돌연변이 L235E 를 포함한다. 더욱 바람직한 IgG4 돌연변이는 S228P 또는 L235E 및 S228P 이다 (비교 : 표 1).

본원에 사용된 용어 "OX40L 에의 결합" 은 BIAcore 어세이 (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden) 에서 인간 OX40L 에 항체가 결합한 것을 의미한다. 더욱 확실히 하기 위해, OX40L 에의 결합은 또한 정제된 OX40L 가 마이크로타이터 플레이트에 코팅된 ELISA, 또는 직접 또는 간접 표지된 항체가 OX40L 를 발현하는 K562 세포에 결합되는 FACS-어세이에서 측정될 수 있다.

BIAcore 어세이에서, 항체는 표면에 결합하고, OX40L 의 결합은 표면 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 에 의해 측정된다. 결합의 친화성은 용어 ka (항체의 항원과의 결합에 대한 속도 상수), kd (해리에 대한 속도 상수), 및 K_D (kd/ka) 로 정의된다. 본 발명에 따른 항체는 10^-8 M 이하, 바람직하게는 약 10^-12 내지 10^-9 M 의 K_D 를 나타낸다 (실시예 참조). 따라서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 항체를 말하며, 여기서 이 항체는 BIAcore 어세이에서 10^-8 M 미만의 K_D 값을 가지고 OX40L 에 결합하며, 바람직하게는 K_D 범위는 10^-12 내지 10^-9 M 이다.

OX40L-특이적 결합 ELISA 에서, OX40L 를 마이크로타이터 플레이트에 코팅하고, OX40L 에의 항체 결합을 HRP-공액 항-인간 IgG 및 통상의 ELISA 의 단계를 사용해 검출한다. 상기 어세이에서 EC₅₀ 값은 바람직하게는 3 nM 내지 8 nM 의 범위이다.

본원에서 사용된 용어 "OX40 의 OX40L 에의 결합의 억제" 는 본 발명에서 기술된 항체가 인간 OX40L 에 결합하고, 그럼으로써 OX40/OX40L 상호작용을 억제시키고, 그리하여 OX40L 에 의해 유도되는 신호 전달을 억제시키는 것을 말한다.

본 발명의 항체는 바람직하게는 하기에서 hOX40L/OX40 상호작용을 억제시킨다 :

i) IC50 값의 범위가 1 nM - 4 nM 인 바이오틴화 OX40L 의 (고체상) 코팅 농도 0.5 μg/ml 에서, 바이오틴화, 고정화된 OX40L 와 용해성 OX40 의 상호작용을 항체에 의해 차단함으로써 ELISA 어세이에 의해 나타난 시험관 내 농도에서,

ii) IC50 값의 범위가 1 nM - 10 nM 인 항체 농도 0.78 - 100 nM 에서, 고정화된 OX40 과 용해성 OX40L (10 nM, 바람직하게는 hOX40L-His 로서) 의 상호작용을 항체에 의해 차단함으로써 Biocore 어세이에 의해 나타난 시험관 내 농도에서,

iii) 2 x 1O⁵ 세포/샘플 농도에서 OX40L (K562_-OX40L) 를 발현하는 K562 세포와 IC50 값의 범위가 4 - 20 nM 인 OX40 과의 상호작용을 항체가 차단하는, FACS-어세이에 의해 나타난 세포 농도에서,

iv) OX40 을 발현하는 3 x 1O⁴ HeLa-세포/샘플에의, K562_-OX40L 에 의해 유도되는 OX40 신호 전달을 항체가 차단하고, 그 결과 IC50 값의 범위 1 - 5 nM 에서 NFκB 활성화를 차단하는 OX40-신호 전달 어세이에 의해,

v) 1.5 x 1O⁵ 세포/샘플의 농도 및 0.75 μg/ml 의 PHA 농도에서 K562_OX40L 에 의한 OX40L-유도 T-세포 활성화를 1C50 값의 범위 1 nM 내지 10 nM 로 항체가 차단하는 T-세포 활성화 어세이에 의해, 및/또는

vi) 활성화된 B 세포 또는 수지상 세포 (Tetanus 어세이) 에 의한 OX40L 유도 T 세포 활성화를 항체 농도 10 μg/ml 에서 항체가 차단하고, 40% - 60% 가 억제되는, T-세포 활성화 어세이에 의해.

OX40L 의 코팅 농도 0.5 μg/ml 에서 고정화된 OX40L 와 용해성 OX40 의 상호작용을 차단함으로써 억제를 나타내는, IC50 값의 범위 1 nM - 4 nM 인 항체가 바람직하다.

따라서, 본 발명의 추가의 바람직한 구현예는 OX40/OX40L 상호작용을 억제시킴으로써 OX40L 유도 신호 전달을 억제시키는 것을 특징으로 하는 항체에 관한 것이다.

본 발명에 따른 항체가 500 nM 이하의 TNF알파 또는 CD40L 농도에서 TNF알파 또는 CD40L 에 대한 비특이적 결합을 나타내지 않는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에 따른 항체가 인간 OX40L 에 비해 마우스 OX40L 에 30 배 이상 더 낮은 결합을 보이는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에 따른 항체가 10 μg/ml 농도에서는 HUVEC 세포 상에서의 OX40L 의 발현을 하향조절하지 않는 것이 더욱 바람직하다.

추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 하위 조합으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 가변 도메인 조합을 포함하는 것을 특징으로 한다 :

a) 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 로 정의된 항체 LC.001 의 경쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:2 로 정의된 항체 LC.001 의 중쇄 가변 도메인 ;

b) 아미노산 서열 SEQ ID NO:3 으로 정의된 항체 LC.005 의 경쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:4 로 정의된 항체 LC.OO5 의 중쇄 가변 도메인 ;

c) 아미노산 서열 SEQ ID NO:5 로 정의된 항체 LC.010 의 경쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:6 으로 정의된 항체 LC.010 의 중쇄 가변 도메인 ;

d) 아미노산 서열 SEQ ID NO:7 로 정의된 항체 LC.029 의 경쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:8 로 정의된 항체 LC.029 의 중쇄 가변 도메인 ;

e) 아미노산 서열 SEQ ID NO:9 로 정의된 항체 LC.O19 의 경쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:10 으로 정의된 항체 LC.019 의 중쇄 가변 도메인 ;

f) 아미노산 서열 SEQ ID NO:11 또는 16 으로 정의된 항체 LC.033 의 경쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO: 12 로 정의된 항체 LC.033 의 중쇄 가변 도메인 ;

g) 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 로 정의된 경쇄 (V_L) 가변 도메인 및 SEQ ID NO:17 로 정의된 중쇄 (V_H) 가변 도메인 ;

h) 아미노산 서열 SEQ ID NO:18 로 정의된 경쇄 (V_L) 가변 도메인 및 SEQ ID NO:19 로 정의된 중쇄 (V_H) 가변 도메인 ;

i) 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 로 정의된 경쇄 (V_L) 가변 도메인 및 SEQ ID NO:20 으로 정의된 중쇄 (V_H) 가변 도메인.

추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 항체는 하기로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 불변 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다 :

k) 서열 SEQ ID NO:13 에 의해 정의되는 경/카파쇄 ;

l) L234A 및 L235A, PVA236 또는 GLPSS331 로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이가 있는 IgG1 아이소타입 SEQ ID NO: 14 의 중/감마쇄 ;

m) IgG4 아이소타입 SEQ ID NO: 15 의 중/감마쇄 ;

n) 돌연변이 S228P 또는 돌연변이 S228P 및 L235E 가 있는 IgG4 아이소타입 SEQ ID NO: 15 의 중/감마쇄 ;

o) SEQ ID NO:61, 65 또는 69 에 포함된 경 (light) 불변 사슬 ;

p) SEQ ID NO:58, 59, 60, 62, 63, 64, 66, 67 또는 68 에 포함된 중 (heavy) 불변 사슬.

각각의 가변 항체 도메인 조합 a) - i) 와 감마 사슬 l), m), n) 또는 p) 및 바람직하게는 카파 사슬 k) 또는 o) 와의 모든 조합이 더욱 바람직하다. 서열 SEQ ID NO:13 에 의해 정의되는 카파 사슬과 함께 항체 LC.001, LC.005, LC.O1O, LC.019, LC.029, LC.033, LC.059, LC.060 또는 LC.063 의 가변 사슬 각각, 또는 SEQ ID NO:61, 65 또는 69 에 포함되는 경 불변 사슬 및 돌연변이 L234A 및 L235A 가 있는 IgG1 아이소타입 SEQ ID NO:14 의 중/감마 사슬, 또는 SEQ ID NO:59, 63 또는 67 에 포함되는 중 (heavy) 불변 사슬을 포함하는 항체 ; 서열 SEQ ID NO:13 으로 정의되는 카파 사슬과 함께 항체 LC.001, LC.005, LC.O1O, LC.O19, LC.029, LC.033, LC.059, LC.060 또는 LC.063 의 가변 사슬 각각, 또는 SEQ ID NO:59, 63 또는 67 에 포함되는 중 불변 사슬 및 IgG4 아이소타입 SEQ ID NO:15 의 중/감마 사슬, 또는 3 가지 모두 S228P 돌연변이가 없는 SEQ ID NO:60, 64 또는 68 에 포함되는 중 불변 사슬을 포함하는 항체 ; 서열 SEQ ID NO: 13 으로 정의되는 카파 사슬과 함께 항체 LC.001, LC.005, LC.O1O, LC.019, LC.029, LC.033, LC.059, LC.060 또는 LC.063 의 가변 사슬 각각, 또는 SEQ ID NO:61, 65 또는 69 에 포함되는 경 불변 사슬 및 돌연변이 S228P 이 있는 IgG4 아이소타입 SEQ ID NO: 15 의 중/감마 사슬 또는 SEQ ID NO:60, 64 또는 68 에 포함되는 중 불변 사슬을 포함하는 항체가 특히 바람직하다.

바람직하게는, 본 항체는 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 의 경쇄 가변 CDR 및 SEQ ID NO:2, 17 또는 20 의 중쇄 가변 CDR 또는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 18 의 경쇄 가변 CDR 및 SEQ ID NO: 19 의 중쇄 가변 CDR 을 포함한다.

바람직한 항체는, 항체가 보체 인자 C1q 에의 비-결합 및/또는 FCR 결합의 상실을 야기하는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는, 인간 IgG4 하위부류 또는 또다른 인간 하위부류 (바람직하게는 IgG1) 의 것임을 특징으로 한다. 상기 바람직한 변이체 항체는 예를 들어 돌연변이 L234A 및 L235A 가 있는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 14 또는 돌연변이 S228P 가 있거나 또는 없는 SEQ ID NO: 15 를 포함한다.

본 발명에 따른 바람직한 항체는 IgG1v1 (PVA-236 ; E233P 로서 명시된 GLPSS331 ; L234V ; L235A ; 델타 G236 ; A327G ; A330S ; P331S), IgG1v2 (L234A ; L235A) 및 IgG4v1 (S228P ; L235E) 및 IgG4x (S228P) 로서 정의되는 항체이다.

본 발명에 따른 하이브리도마 세포주 hu-Mab<hOX40L>LC.001 를, 특허 과정을 목적으로 미생물 기탁의 국제 인증에 대한 부다페스트 조약 하에, 2004 년 7 월 27 일, 독일 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) 에 기탁 번호 DSM ACC 2672 로 기탁하였다.

본 발명에 따른 하이브리도마 세포주 hu-Mab<hOX40L>LC.005 (DSM ACC 2685), hu-Mab<hOX40L>LC.010 (DSM ACC 2686), hu-Mab<hOX40L>LC.019, hu- Mab<hOX40L>LC.029 (DSM ACC 2688) 및 hu-Mab<hOX40L>LC.033 (DSM ACC 2689) 을, 특허 과정을 목적으로 미생물 기탁의 국제 인증에 대한 부다페스트 조약 하에, 2004 년 9 월 2 일, 독일 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) 에 기탁하였다.

상기 세포주로부터 수득가능한 항체는 본 발명의 바람직한 구현예이고, 결합 보체 인자 C1q 에 결합하지 않고/않거나 또는 인간 Fcγ 수용체에 결합하지 않는 본 발명에 따른 항체의 생성을 위한 중간 물질로서 특히 유용하다.

본 발명의 추가의 바람직한 구현예는 OX40L 에 결합하고, 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성되는 단일클론 항체 LC.005, LC.O1O 또는 LC.029 가 결합하기도 하는 동일한 OX40L-에피토프에 결합하는 단리된 항-OX40L 항체이다.

본 발명의 추가의 구현예는 인간 보체 인자 C1q 및/또는 인간 Fcγ 수용체에 결합하지 않는 OX40L 에 대한 항체의 제조 방법으로서, 10^-8 M 미만의 KD 값으로 OX40L 에 결합하는 항체의 중쇄를 인코딩하는 핵산의 서열을 개질하는데, 상기 개질된 항체가 보체 인자 C1q 및/또는 NK 세포 상의 인간 Fcγ 수용체에는 결합하지 않도록 개질하고, 상기 개질된 핵산 및 상기 항체의 경쇄를 인코딩하는 핵산을 발현 벡터 내로 삽입하고, 상기 벡터를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 삽입하고, 인코딩되는 단백질을 숙주 세포 또는 상청액으로부터 발현 및 회수하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 추가의 구현예는 보체 인자 C1q 에 결합하지 않고/않거나 또는 인간 Fcγ 수용체에 결합하지 않는 본 발명에 따른 항체의 제조 방법이고, 상기 세포주 중 하나로부터 수득된 항체를 "부류 스위칭", 즉, Fc 부분 (예를 들어 IgG1 에서 IgG4 로, 및/또는 IgG1/IgG4 돌연변이), 바람직하게는 IgG1v1 (PVA-236; E233P 로서 특정된 GLPSS331; L234V; L235A; 델타 G236; A327G; A330S; P331S), IgG1v2 (L234A; L235A) 및 IgG4v1 (S228P; L235E) 및 IgG4x (S228P) 로서 정의된 Fc 부분의 변경 또는 돌연변이에 의해 개질하는 것을 특징으로 한다.

추가의 바람직한 구현예에서, 상기 항체는 또한 Fab, F(ab')₂ 및 단일-쇄 절편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 절편을 포함한다.

따라서, 본원에서 "변이체" 항-OX40L 항체는 모 항체 서열에 있는 하나 이상의 아미노산 잔기(들) 의 첨가, 소실 및/또는 치환으로 인해 "모" 항-OX40L 항체 아미노산 서열과 아미노산 서열이 상이한 분자를 말한다. 바람직한 구현예에서, 변이체는 모 항체의 하나 이상의 불변 또는 가변 영역(들), 바람직하게는 불변 영역에서 하나 이상의 아미노산 치환체(들) 를 포함한다. 예를 들어, 변이체는 모 항체의 하나 이상의 가변 영역에서 하나 이상의, 예를 들어 약 1 내지 약 10, 및 바람직하게는 약 2 내지 약 5 개의 치환체를 포함할 수 있다. 통상, 변이체는 모 항체 불변 및/또는 가변 도메인 서열과 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 및 가장 바람직하게는 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 것이다.

본 발명은 SEQ ID NO:21-38 로 이루어진 군으로부터 선택되는 모 항체 중쇄 CDR 및/또는 SEQ ID NO : 39-57 로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 경쇄 CDR 의 처음의 아미노산 서열을 개질시키는 방법을 포함하며, 이 방법은 상기 처음의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 제공하고, 하나의 아미노산이 중쇄 CDR1 에서 개질되고, 1 - 2 개의 아미노산이 중쇄 CDR2 에서 개질되고, 1 - 2 개의 아미노산이 중쇄 CDR3 에서 개질되고, 1 - 3 개의 아미노산이 경쇄 CDR1 에서 개질되고, 1 - 3 개의 아미노산이 경쇄 CDR2 에서 개질되고/되거나 또는 1 - 3 개의 아미노산이 경쇄 CDR3 에서 개질되도록 상기 핵산을 개질하고, 상기 개질된 CDR 아미노산 서열을 항체 구조에서 발현시키고, 상기 항체가 10^-8 M 미만의 K_D 로 OX40L 에 결합하는지 측정하고, 항체가 10^-8 M 미만의 K_D 로 OX40L 에 결합한다면 상기 개질된 CDR 을 선택하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 상기 개질은 보존성 서열 개질화이다.

서열에 대한 동일성 또는 상동성은 본원에서, 최대 % 서열 동일성을 달성하기 위해 필요하다면, 서열을 배열하고, 갭을 도입시킨 후, 모 항체 잔기와 동일한 아미노산 잔기의 후보 서열 내에서의 % 로서 정의된다. N-말단, C-말단, 또는 내부 신장, 소실, 또는 항체 서열로의 삽입 중 어느 것도 서열 동일성 또는 상동성에 영향을 미치는 것으로 여겨져서는 안 될 것이다. 변이체는 인간 OX40L 게 결합하는 능력을 유지하고, 바람직하게는 모 항체의 것보다 더 우수한 특성을 갖는다. 예를 들어, 변이체는 OX40L 가 B-세포, 수지상 세포 및 대식 세포뿐만 아니라, 내피 세포 (Kotani, A., 등, Immunol. Lett. 84 (2002) 1-7), 기도 평활근 세포 (= ASM) (Burgess, J.K., J. Allergy Clin. Immunol 113 (2004) 683-689) 및 미세아교세포 (Weinberg, A.D., 등, J. Immunol. 162 (1999) 1818-1826) 상에서 일시적으로 발현되기 때문에 류마티스 관절염 및 천식 치료 동안의 부작용을 감소시킬 수 있다. OX40L 에 대한 항체가 내피 세포, ASM 및 미세아교세포에 결합하는 것은 혈관 누수를 초래하는 내피 세포, 폐 파괴를 초래하는 ASM 세포, 및 아교세포의 손상을 초래하는 미세아교세포의 세포 손상을 초래할 수 있다.

본원에서 "모" 항체는 변이체의 제조에 사용되는 아미노산 서열에 의해 인코딩되는 것이다. 바람직하게는, 모 항체는 인간 골격 영역을 갖고, 만약 존재한다면 인간 항체 불변 영역(들) 을 갖는다. 예를 들어, 모 항체는 바람직하게는 IgG1 유형의 인간화된 또는 인간 항체일 수 있다.

본 발명에 따른 항체는 또한 본 발명에 따른 항체의 상기-언급된 특징에 영향을 주거나 또는 변경시키지 않는 "보존적 서열 개질화" 를 갖는 항체, 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 개질화를 포함한다. 개질화는 위치-직접적 돌연변이 및 PCR-매개 돌연변이와 같은 당업계에 공지된 표준 기술에 의해 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환체에는 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것들이 포함된다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 과 (family) 는 당업계에 정의되어 있다. 상기 과에는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비전하 극성 측쇄 (예를 들어 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소루신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘) 가 있는 아미노산이 포함된다. 따라서, 인간 항-OX40L 항체 내 예정된 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 과의 또다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있다.

아미노산 치환체는 [Riechmann, L., 등, Nature 332 (1988) 323-327 및 Queen, C, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033] 에 의해 기술된 분자 모델링을 바탕으로 한 돌연변이에 의해 수행될 수 있다.

본 발명은 추가로 항체의 제조 방법을 포함하는데, 이 방법은 KD 값 10^-8 M 미만으로 OX40L 에 결합하는 항체의 중쇄를 인코딩하는 첫번째 핵산의 서열을, 항체가 보체 인자 C1q 및/또는 NK 세포 상의 인간 Fcγ 수용체에 결합하지 않도록 개질시키고, 상기 개질된 첫번째 핵산 및 상기 항체의 경쇄를 인코딩하는 두번째 핵산을 발현 벡터 내로 삽입하고, 상기 벡터를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 삽입하고, 상기 숙주 세포를 상기 항체를 합성시킬 수 있는 조건 하에 배양하고, 상기 배양물로부터 상기 항체를 회수하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 추가로 인간 기원 유래의 Fc 부분을 포함하는 본 발명에 따른 항체의 제조 방법을 포함하는데, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다 ;

a) 본 발명에 따른 모 인간 항체의 경쇄를 인코딩하는 첫번째 핵산 서열 및 상기 모 인간 항체의 중쇄를 인코딩하는 두번째 DNA 서열로 숙주 세포를 형질전환시킴 (여기서, Fc 부분은 이 Fc 부분이 보체 인자 C1q 및/또는 Fc 수용체에 결합하지 않도록 개질됨) ;

b) 상기 항체 중쇄 및 경쇄를 생성하기 위해 상기 첫번째 및 두번째 DNA 서열을 발현시킴 ; 및

c) 숙주 세포 또는 숙주 세포 배양물로부터 상기 항체를 회수함.

본 발명은 또한 상기 언급된 항체를 인코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산을 포함하는 상응하는 벡터 및 상기 벡터에 대한 상응하는 숙주 세포를 포함한다. 본 발명은 예를 들어 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 중쇄를 인코딩하는 핵산 및 경쇄를 인코딩하는 핵산을 발현시키고, 상기 세포로부터 상기 폴리펩티드를 회수하는 것과 같이, 항체 분자를 합성시킬 수 있는 조건 하에 상응하는 숙주 세포를 배양하고, 상기 배양물로부터 상기 항체를 회수하는 것을 포함하는, 항체의 제조 방법을 포함한다.

항체의 진단 및 치료 용도를 생각해 본다. 한 진단 적용에서, 본 발명은 OX40L 를 함유하는 것으로 생각되는 샘플을 항-OX40L 항체에 노출시키고, 그 항체의 샘플에의 결합을 측정하는 것을 포함하는, OX40L 단백질의 존재를 측정하는 방법을 제공한다. OX40L 단백질은 그의 막관통 도메인에 의해 OX40L-발현 세포의 세포막 내로 삽입될 수 있거나, 또는 쉐딩 또는 단백질용해성 방출과 같은 기작에 의해 체액 내에서 용해성 세포외 도메인으로서 발생할 수 있다. 상기 용도를 위해, 본 발명은 상기 항체를 포함하는 키트 및 OX40L 단백질의 검출을 위해 상기 항체를 사용하는 지침서를 제공한다.

본 발명의 항체는 염증성 질환이 있거나 또는 그것으로 인해 고통받는 포유류, 바람직하게는 환자에서 염증성 질환을 예방 및/또는 치료하는데 유용하다. 상기 질환에는 천식과 같은 알레르기 반응이 포함된다. 기타 적용은 류마티스 관절염을 포함한 자가면역 질환의 치료이다.

본 발명은 추가로 상기 언급된 염증성 장애, 특히 천식 및 류마티스 관절염으로부터 고통받는 포유류를 치료하는 방법을 제공한다.

바람직하게는 본 발명의 항체는 흡입 코르티코스테로이드로 적절하게 조절되지 않는 증후를 가진 환자에서 중증의 지속성 천식의 치료에 사용될 수 있다. 환자군에는 부적절하게 조절되는 중중의 지속성 천식을 가진 성인 및 젊은이 (12 살 이상) 가 포함된다. 항체는 바람직하게는 1 달에 1 또는 2 회 피하로 전달될 것이다. 종료점은 바람직하게는 급성 악화를 감소시킬 것이다. 기타 종료점에는 피크 유동, 낮동안의 천식 증후군, 야간에 깨어있음, 삶의 질, 응급실 방문, 천식 없는 날, 베타-2 아고니스트 사용, 스테로이드 감소 또는 체감, 및 과-반응성에 대한 효과가 포함된다.

급성 활성형 류마티스 관절염에 대해 온건한 성인의 치료를 위해 단독치료법 또는 메토트렉세이트 또는 기타 DMARD (Disease Modifying Anti-Rheumatic Drugs, 항-류마티스 제제) 와의 병용해서 본 발명에 따른 항체를 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 항체는 매 2 또는 4 주에 피하 주사하여 투여될 것이다. 하나 이상의 DMARD 로의 치료에 실패한 환자에서는 만성적인 치료가 될 것이다. 종료점에는, 활성 류마티스 관절염이 있는 성인 환자에서 증상 및 증후의 감소 및 구조적 손상의 진행의 억제가 포함될 것이다. ACR 범주 (ACR20 > 60%, ACR50 > 35%, ACR70 > 15% ; American College of Rheumatology 로부터의 지침 ; www.rheumatology.com) 에 의해 불안정성의 예방, 증상 및 증후의 향상을 측정한다.

본 발명의 추가의 구현예는 상기 질환의 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 항체의 용도이다.

본 발명은 또한 약학적 조성물의 제조를 위해 상기 언급된 항체를 사용하는 것에 관한 것이고, 약학적 유효량의 본 발명에 따른 항체 및 임의로 약학적 목적을 위해 항체의 제형에 유용한 완충액 및/또는 아쥬반트를 함께 함유하는 조성물을 포함한다.

본 발명은 추가로 약학적으로 허용가능한 담체 내에서 상기 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 한 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 제조 물품 또는 키트에 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 재조합 수단에 의해 생성된다. 상기 방법은 당업계에 널리 알려져 있고, 원핵 및 진핵 세포에서 단백질을 발현시키고, 이어서 항체 폴리펩티드를 단리하고, 통상 약학적으로 허용가능한 순도로 정제하는 것을 포함한다. 단백질 발현을 위해, 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 핵산 및 그의 절편을 표준 방법에 의해 발현 벡터 내에 삽입한다. CHO 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, 효모, 또는 E.coli 세포와 같은 적절한 원핵 및 진핵 세포에서 발현시키고, 항체를 세포 (세포파괴 후의 상청액 또는 세포) 로부터 회수한다.

항체의 재조합 생성은 당업계에 널리 알려져 있으며, 예를 들어 [Makrides, S. C, Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202 ; Geisse, S., 등, Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282 ; Kaufman, RJ., MoI. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., 등, Arzneimittelforschung 48 (1998) 870-880] 의 리뷰 기사에 기술되어 있다.

항체는 전체 세포, 세포 파쇄물, 또는 부분적으로 정제되거나 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 기타 세포성 핵산 또는 단백질과 같은 기타 세포 성분 또는 기타 오염물질을 제거하기 위해 알칼리/SDS 처리, 칼럼 크로마토그래피 및 기타 당업계에 잘 알려진 기술을 포함한 표준 기술에 의해 정제를 한다. [Ausubel, F., 등, ed., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)] 를 참조한다.

NSO 세포에서의 발현은 예를 들어, [Barnes, LM. , 등, Cytotechnology 32 (2000) 109-123; and Barnes, L.M., 등, Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270] 에 기술되어 있다. 일시적인 발현은 예를 들어, [Durocher, Y., 등, Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9] 에 기술되어 있다. 가변 도메인의 클로닝은 [Orlandi, R., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837 ; Carter, P., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289 ; 및 Norderhaug, L., 등, J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87] 에 기술되어 있다. 바람직한 일시적 발현 시스템 (HEK 293) 은 [Schlaeger, E.-J., and Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83 and by Schlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199] 에 기술되어 있다.

원핵 세포에 적합한 조절 서열은 예를 들어, 프로모터, 임의로 작동 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 인핸서 및 폴리아데닐화 신호를 사용하는 것으로 알려져 있다.

핵산은 그것이 또다른 핵산 서열과 기능적으로 관계를 갖도록 위치되어 있을 때, "조작적으로 연결되어 있다". 예를 들어, 전서열 또는 분비 리더를 위한 DNA 는, 그것이 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현된다면 폴리펩티드를 위한 DNA 에 조작적으로 연결되고 ; 프로모터 또는 인핸서는, 그것이 서열의 전사에 영향을 미친다면 코딩 서열에 조작적으로 연결되고 ; 또는 리보솜 결합 부위는, 그것이 번역을 할 수 있게 하도록 위치된다면 코딩 서열에 조작적으로 연결된다. 일반적으로, "조작적으로 연결된" 은, 연결되는 DNA 서열이 인접되어 있고, 분비 리더의 경우, 인접되어 있으면서 해독 프레임 내에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접되어 있을 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결합에 의해 이루어진다. 상기 부위가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상 수행방법에 따라 사용된다.

단일클론 항체는 단백질 A-세파로스, 히드록실아파티트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상의 면역글로불린 정제 과정에 의해 배양 배지로부터 적합하게 분리된다. 단일클론 항체를 인코딩하는 DNA 및 RNA 는 통상의 과정을 이용해 쉽게 단리 및 서열화된다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA 및 RNA 의 원천으로서 사용될 수 있다. 일단 단리되면, DNA 는 발현 벡터 내로 삽입되고, 그런 다음 다른 방법으로 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 HEK 293 세포, CHO 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포에 트랜스펙션되어, 숙주 세포 내에서 재조합 단일클론 항체가 합성될 수 있다.

인간 OX40L 항체의 아미노산 서열 변이체 (또는 돌연변이체) 는 항체 DNA 로의 적절한 뉴클레오티드 도입, 또는 뉴클레오티드 합성에 의해 제조된다. 그러나, 상기 개질화는 예를 들어, 상기 기술된 바와 같이, 매우 제한된 범위 내에서만 수행될 수 있다. 예를 들어, 개질화는 IgG 아이소타입 및 에피토프 결합과 같은 상기 언급된 항체 특징을 변경하지 않으나, 재조합 생성의 수율, 단백질 안정성을 향상시키거나 또는 정제를 유용하게 할 수 있다.

항-OX40L 항체의 적절한 구조를 유지하는데 관련이 없는 임의의 시스테인 잔기가 또한 일반적으로 세린으로 치환되어, 분자의 산화 안정성을 향상시키고, 비정상적인 교차연결을 방지할 수 있다. 반대로 말해서, 시스테인 결합(들) 이 항체에 첨가되어, 그의 안정성을 향상시킬 수 있다 (특히, 항체가 Fv 절편과 같은 항체 절편인 경우).

항-OX40L 항체의 아미노산 서열 변이체를 인코딩하는 핵산 분자를 당업계에 공지된 다양한 방법으로 제조한다. 상기 방법에는, 천연 원천으로부터의 단리 (자연 발생적 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 위치-직접적) 돌연변이에 의한 제조, PCR 돌연변이, 및 인간화된 항-OX40L 항체의 더 빨리 제조된 변이체 또는 비-변이체 버전의 카세트 돌연변이가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한 화학치료제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 균류, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 절편), 방사성 동위원소 (즉, 방사선콘쥬게이트) 와 같은 세포독성제에 공액된 본 발명에 따른 항체를 포함하는 면역콘쥬게이트에 관한 것이다. 항체 및 세포독성제의 콘쥬게이트는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체 ; (디메틸 아디피미데이트 HCL 과 같은), 활성 에스테르 (디숙신이미딜 수베레이트와 같은), 알데하이드 (글루타르알데하이드와 같은), 비스-아지도 화합물 (비스(p-아지도벤조일)헥산디아민과 같은), 비스-디아조늄 유도체 (비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아트닌과 같은), 디이소시아네이트 (톨리엔 2,6-디이소시아네이트와 같은), 및 비스-활성 불소 화합물 (1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠과 같은) 과 같은 이작용성 단백질 커플링제를 사용하여 제조된다. 예를 들어, 리신 면역독소를 [Vitetta, E.S., 등, Science 238 (1987) 1098-1104)] 에서 기술된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA) 은 방사성뉴클레오티드의 항체에의 공액을 위한 실례의 킬레이트화제이다. WO 94/11026 을 참조한다.

항체의 공유 개질의 또다른 유형은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌과 같은 다양한 비단백질성 중합체 중 하나에 상기 항체를 미국 특허 제 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 또는 4,179,337 호에 나타낸 방식으로 연결하는 것을 포함한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 인간 항-OX40L 항체 (예를 들어 본 발명에 따른 항체를 생성하는 하이브리도마 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포주에 의해 생성되는 모 항체) 를 발현하는 유전자 도입 마우스와 같은 유전자 도입 비-인간 동물로부터 단리된 B-세포를 제공한다. 바람직하게는, 단리된 B 세포를 OX40L 항원 및/또는 OX40L 를 발현하는 세포의 정제 또는 재조합 형태로 면역시킨 유전자 도입 마우스와 같은 유전자 도입 비-인간 동물로부터 수득한다. 바람직하게는, 유전자 도입 마우스와 같은 유전자 도입 비-인간 동물은 본 발명의 항체의 전부 또는 일부를 인코딩하는 인간 중쇄 형질전환 유전자 및 인간 경쇄 형질전환 유전자를 포함하는 게놈을 갖는다. 다음, 단리된 B-세포를 불멸화시켜, 인간 항-OX40L 항체의 원천 (예를 들어, 하이브리도마) 을 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 인간 단일클론 항체를 생성할 수 있는 하이브리도마를 제공한다. 한 구현예에서, 하이브리도마는 본 발명의 항체의 전부 또는 일부를 인코딩하는 인간 중쇄 형질전환 유전자 및 인간 경쇄 형질전환 유전자를 포함하는 게놈을 갖는, 불멸화된 세포에 융합된 유전자 도입 비-인간 동물, 예를 들어, 유전자 도입 마우스로부터 수득된 B 세포를 포함한다.

특별한 구현예에서, 유전자 도입 비-인간 동물은 본 발명의 항체의 전부 또는 일부를 인코딩하는 인간 중쇄 형질전환 유전자 및 인간 경쇄 형질전환 유전자를 포함하는 게놈을 갖는 유전자 도입 마우스이다. 유전자 도입 비-인간 동물을, OX40L 항원 및/또는 OX40L 를 발현하는 세포의 정제된 또는 풍부한 제조물로 면역시킬 수 있다. 바람직하게는, 유전자 도입 비-인간 동물, 예를 들어 유전자 도입 마우스는 OX40L 에 대한 인간 단일클론 항체의 아이소타입을 생성할 수 있다.

본 발명에 따른 인간 단일클론 항체는, 본 발명의 항체의 전부 또는 일부를 인코딩하는 인간 중쇄 형질전환 유전자 및 인간 경쇄 형질전환 유전자를 포함하는 게놈을 갖는 유전자 도입 비-인간 동물, 예를 들어 유전자 도입 마우스를 OX40L 항원 및/또는 OX40L 를 발현하는 세포의 정제된 또는 풍부한 제조물로 면역시킴으로써 제조될 수 있다. 다음, 동물의 B 세포 (예를 들어 비장 B 세포) 를 수득하고, 골수종 세포와 융합시켜, OX40L 에 대한 인간 단일클론 항체를 분비하는 불멸의 하이브리도마 세포를 형성한다.

바람직한 구현예에서, OX40L 에 대해 직접적인 인간 단일클론 항체를 마우스 시스템이 아닌 인간 면역 시스템 부분을 갖는 유전자 도입 마우스를 사용하여 생성시킬 수 있다. 상기 유전자 도입 마우스를 본원에서는 "HuMAb" 마우스라고 하는데, 이것은 내생 μ 및 κ 쇄 유전자 좌를 불활성시키는 표적화된 돌연변이와 함께, 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ 경쇄 (불변 영역 유전자) 를 포함하는 비재배열된 인간 면역글로불린 유전자를 인코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 최소유전자 좌를 함유한다 (Lonberg, N., 등, Nature 368 (1994) 856-859). 따라서, 마우스는 마우스 IgM 또는 K 의 발현이 감소되어 나타나고, 면역화에 반응하여, 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 형질전환 유전자는 높은 친화성 인간 IgG 단일클론 항체를 생성하기 위해 부류 스위칭 및 체세포 돌연변이를 수행한다 (Lonberg, N., 등, Nature 368 (1994) 856-859 ; reviewed in Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113 (1994) 49- 101 ; Lonberg, N., and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. 25 (1995) 65-93 ; and Harding, F., and Lonberg, N., Ann. N. Acad. Sci. 764 (1995) 536-546). HuMAb 마우스의 제조는 본원에서 그 내용 전체가 참조로써 삽입된 [Taylor, L., 등, Nucleic Acids Res. 20 (1992) 6287-6295; Chen, , 등, Int. Immunol. 5 (1993) 647-656 ; Tuaillon, N., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 3720-3724 ; Choi, T.K., 등, Nat. Genet. 4 (1993) 117-123 ; Chen, J., 등, EMBO J. 12 (1993) 821-830 ; Tuaillon, N., 등, J. Immunol. 152 (1994) 2912-2920 ; Lonberg, N., 등, Nature 368 (1994) 856-859 ; Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113 (1994) 49-101 ; Taylor, L., 등, Int. Immunol. 6 (1994) 579-591 ; Lonberg, N., and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. 25 (1995) 65-93 ; Harding, F., and Lonberg, N., Ann. N. Acad. Sci. 764 (1995) 536-546 ; Fishwild, D.M., 등, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851] 에 기술되어 있다. 추가로, 미국 특허 제 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 5,545,807; 5,770,429; WO 98/24884; WO 94/25585; WO 93/1227; WO 92/22645; 및 WO 92/03918 호를 참조한다.

OX40L 에 대한 완전한 인간 단일클론 항체를 생성하기 위해, HuMAb 마우스를, [Lonberg, N., 등, Nature 368 (1994) 856-859; Fishwild, D.M., 등, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851 및 WO 98/24884] 에 기술된 바와 같은 일반적인 방법에 따라 OX40L 항원 및/또는 OX40L 를 발현하는 세포의 정제된 또는 풍부한 제조물로 면역시킬 수 있다. 바람직하게는, 마우스는 첫 면역 시 6 - 16 주령일 것이다. 예를 들어, KLH 에 커플링되거나 또는 PBS 중의 용해성 OX40L 항원 (예를 들어 OX40L-발현 세포로부터 정제된 항원) 의 순수한 또는 풍부한 제조물을 HuMAb 마우스에 복강 내 면역주사하는데 사용할 수 있다. OX40L 를 발현하는 세포, 예를 들어, 종양 세포주와 함께 단리된 OX40L 단백질로 대안적인 면역화를 병행하여, 면역 반응을 증진시킬 수 있다. 다양한 항원을 사용한 축적된 경험은, HuMAb 유전자 도입 마우스가, 처음에 완전 프로인트 (Freund's) 아쥬반트 중 항원으로 복강 내 (i.p.) 면역되고, 이어서 불완전 프로인트 아쥬반트 중 항원으로 격주로 복강 내 면역 (예를 들어, 총 6 회까지) 된 경우, 가장 잘 반응함을 나타내었다. 안와후 출혈에 의해 수득된 혈장 샘플로 면역 프로토콜의 과정을 거쳐 면역 반응을 모니터링할 수 있다. 혈장을 ELISA 에 의해 스크리닝할 수 있고, 항-OX40L 인간 면역글로불린의 충분한 타이터를 가진 마우스를 상응하는 B 세포의 불멸화에 사용할 수 있다. 죽여서 비장 및 림프절을 제거하기 3- 4 일 전에 항원을 정맥 내 주사하여 마우스를 증진 (boosting) 시킬 수 있다. 다수의 마우스가 각 항원에 대해 면역될 것이다. 예를 들어, HCo7 및 HCo12 계통의 총 12 마리의 HuMAb 마우스를 면역시킬 수 있다.

HCo7 마우스는 그의 내생 경쇄 (카파) 유전자에서의 JKD 분열 ([Chen, J., 등, EMBO J. 12 (1993) 821-830] 에서 기술된 바와 같음), 그의 내생 중쇄 유전자 (WO 01/14424 의 실시예 1 에서 기술된 바와 같음), KCo5 인간 카파 경쇄 형질전환 유전자 ([Fishwild, D.M., 등, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851] 에 기술된 바와 같음), 및 HCo7 인간 중쇄 형질전환 유전자 (미국 특허 제 5,770,429 호에 기술된 바와 같음) 에서의 CMD 분열을 갖는다.

HCo12 마우스는 그의 내생 경쇄 (카파) 유전자에서의 JKD 분열 ([Chen, J., 등, EMBO J. 12 (1993) 821-830] 에서 기술된 바와 같은), 그의 내생 중쇄 유전자 (WO 01/14424 의 실시예 1 에서 기술된 바와 같은), KCo5 인간 카파 경쇄 형질전환 유전자 ([Fishwild, D.M., 등, Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851] 에서 기술된 바와 같은), 및 HCo12 인간 중쇄 형질전환 유전자 (WO 01/14424 의 실시예 2 에서 기술된 바와 같은) 에서의 CMD 혼란을 갖는다. 마우스 림프구를 단리하고, 하이브리도마를 생성하는 표준 프로토콜을 바탕으로 한 PEG 를 사용하여 마우스 골수종 세포주와 융합시킬 수 있다. 다음, 생성 하이브리도마를 항원-특이적 항체의 생성을 위해 스크리닝한다. 예를 들어, 면역시킨 마우스의 비장 및 림프절-유래 림프구의 단일 세포 현탁액을 1/6 수의 SP 2/0 비분비 마우스 골수종 세포 (ATCC, CRL 1581) 에 50% PEG 와 함께 융합시킨다. 세포를 편평 바닥 마이크로타이터 플레이트에 대략 2 x 10⁵ 으로 심고, 이어서 선택 배지 중에서 약 2 주 동안 인큐베이션시킨다.

다음, 개별 웰을 인간 항-OX40L 단일클론 IgM 및 IgG 항체에 대한 ELISA 에 의해 스크리닝한다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장이 일어나면, 통상 10 - 14 일 후에 배지를 분석한다. 하이브리도마를 분비하는 항체를 다시 깔고, 다시 스크리닝하고, 여전히 인간 IgG 에 대해 포지티브하다면, 항-OX40L 단일클론 항체를 제한 희석하여 2 회 이상 서브클로닝시킬 수 있다. 다음, 안정한 서브클론을 시험관 내에서 배양하여, 특징화를 위한 조직 배양 배지 중에서 항체를 제조한다.

어세이 가계는 원칙적으로 IgG 에 대한 비특이적 어세이 ("IgG-ELISA") 와 이어서, 정제된 OX40L 단백질 또는 OX40L-발현 세포 중 어느 하나에의 항원 결합을 측정하기 위한 특이적 ELISA 및 식별가능한 FACS 어세이로 구성된다. 다음 단계는, 예를 들어 정제된 OX40L 또는 세포 상에 발현된 OX40L 중 어느 하나에 대한 용해성, 정제된 OX40 과 같은 그의 자연 상호작용 파트너와 항 OX40L 항체와의 경합을, 예를 들어 경합 ELISA 또는 FACS 로 측정하는 기능적 어세이를 포함한다. 다음 단계는, 항-OX40L 항체의 OX40-신호 전달을 차단하는 능력을 예를 들어 NFκB-활성화 (= "NFκB-어세이") 로 측정하는 기능적 어세이를 포함한다. 다음 단계는, T-세포 활성화에 관한 항-OX40L 항체의 차단 능력을 측정하는 기능적 어세이 ("T-세포 활성화 어세이" 및 "TT-어세이") 를 포함한다 .

CDR 서열이 항체-항원 상호작용을 책임지기 때문에, 상이한 인간 항체의 골격 서열에 본 발명에 따른 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 구축함으로써 본 발명에 따른 재조합 항체를 발현시킬 수 있다 (예를 들어, [Riechmann, L., 등, Nature 332 (1998) 323-327; Jones, P., 등, Nature 321 (1986) 522-525; 및 Queen, C, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029- 10033] 참조). 생식-계열 인간 항체 유전자 서열을 포함하는 공공의 DNA 데이타베이스로부터 상기 골격 서열을 수득할 수 있다. 상기 생식-계열 서열은 성숙한 항체 유전자 서열과 상이할 것인데, 그 이유는 상기 생식-계열 서열이 B 세포 성숙 동안에 끼여드는 V(D)J 에 의해 형성되는 완전히 어셈블리된 가변 유전자를 포함하지 않을 것이기 때문이다. 생식-계열 유전자 서열은 또한 개별의 고르게 가로지르는 가변 영역에서 높은 친화성의 2 차 레퍼토리 항체의 서열과도 상이할 것이다.

본 발명은 추가로, 바람직하게는 OX40L (수용성 또는 막-결합성) 샘플 및 본 발명에 따른 항체 사이의 결합을 측정하는 면역학적 어세이에 의해 시험관 내에서 OX40L 를 진단하기 위한 본 발명에 따른 항체의 용도를 포함한다.

또다른 측면에서, 본 발명은 조성물, 예를 들어 본 발명의 인간 단일클론 항체, 또는 그의 항원-결합 부분 중 하나 또는 병용물을 함유하고 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제형되는 약학적 조성물을 제공한다. 더욱 구체적으로는, 본 조성물은 약학 또는 진단 조성물이고, 더욱 더 구체적으로는 약학적 조성물은 상기 정의된 항체 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 상기 조성물은 멸균되어야 하고, 조성물이 주사기에 의해 전달가능한 정도로 유체이어야 한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 담체" 에는 생리학적으로 상용성인 임의의 그리고 모든 용매, 분산액 배지, 코팅제, 항박테리아제 및 항균제, 등장성 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 바람직하게는, 상기 담체는 정맥 내, 근육 내, 피하 내, 비경구, 척수 또는 경피 투여 (예를 들어 주사 또는 주입) 에 적합하다. 바람직하게는 상기 담체는 수성 pH 완충액 (예를 들어, 아세테이트, 시트레이트, 포스페이트 또는 히스티딘), 바람직하게는 등장성의, 바람직하게는 또한 무기염, 당, 폴리올 및/또는 계면활성제를 함유하는 완충액이다. 약학적으로 허용가능한 담체는 또한 [Remington's Pharmaceutical Sciences, ¹⁶th edition, Osol, A. Ed. (1980)] 에 기술되어 있다.

항체 농도는 바람직하게는 0.1 mg/ml 내지 50 mg/ml 이다. 바람직하게는 완충액의 pH 값은 1 mM 내지 20O mM 의 완충액 농도에서 4.0 내지 8.0 의 범위이다. 바람직한 염은 1 mM 내지 200 mM 범위의 염화나트륨 및/또는 인산나트륨이다. 바람직한 당은 1% 내지 15% (w/v) 범위의 수크로스 및/또는 트레할로스이다. 바람직한 폴리올은 1% 내지 15% (w/v) 의 범위로 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등이다. 계면활성제는 바람직하게는 0.001% 내지 0.5% (w/v) 의 범위로 폴리소르베이트 (예를 들어 폴리소르베이트 20 또는 80) 및/또는 폴록사메르이다. 바람직한 약학적 조성물은 0.1 mg/ml 내지 50 mg/ml 의 항체 및 pH 4.0 내지 8.0 의 1 mM 내지 20O mM 인산염 완충 식염수를 함유한다.

본 발명의 조성물을 당업계에 알려진 광범위한 방법으로 그것을 필요로 하는 환자에 투여할 수 있다. 당업자가 잘 알다시피, 투여 경로 및/또는 형태는 원하는 결과에 따라 다양할 것이다.

약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체에는 멸균 주사용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 또는 멸균 분말이 포함된다. 약학적 활성 성분을 위한 상기 매질 및 제제의 사용은 당업계에 알려져 있다.

본원에서 사용되는 구 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여되는" 은 장내 및 국소 투여 이외의 투여 형태, 통상적으로 주사에 의한 투여를 의미하고, 제한 없이, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 수막강 내, 관절낭 내, 안와 내, 심장 내, 경피 내, 복강 내, 경기관, 피하, 큐티클하, 관절 내, 관절낭 하, 거미막 하, 척수 내, 경막 외, 및 흉골 내 주사 및 주입이 포함된다.

본 발명의 약학적 조성물 내 활성 성분의 실제 투여 농도는 다양해서, 환자에 독성을 주지 않으면서 특정 환자, 조성물, 및 투여 형태에 대해 원하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 수득할 수 있다. 선택되는 투여 농도는, 사용되는 본 발명의 특정 조성물, 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 분비 속도, 치료 기간, 사용되는 특정 조성물과 병용해서 사용되는 기타 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적 건강상태, 및 이전의 병력, 및 의료계에 잘 알려진 기타 요소를 포함한 다양한 약동학적 요소에 의존할 것이다. 전형적인 주간 투여량은 상기 언급된 요소에 따라, 약 0.1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg 이상의 범위일 것이다.

하기 실시예, 참조예, 서열 목록 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된 것이고, 실제 청구영역은 첨부된 청구항에 나타나 있다. 본 발명의 취지를 벗어나지 않으면서 개질이 과정 중에 이루어질 수 있음을 이해한다.

도 1a 는 TAC-34, LC.001, LC.005, LC.O1O, LC.019, LC.029, LC.033 에 대한 "결합 ELISA" 을 나타낸다.

도 1b 는 TAC-34, LC.001, LC.005, LC.O1O, LC.019, LC.029, LC.033 에 대한 "차단 ELISA" + IC50 데이타를 나타낸다.

도 2 는 TAC-34, LC.001, LC.005 에 대한 "차단 FACS" 를 나타낸다.

도 3 은 TAC-34, LC.001, LC.019 및 LC.024 (비결합 항체) 에 대한 "NFκB-어세이" 를 나타낸다.

도 4 및 5 는 TAC-34, LC.001 및 LC.005 (도 4 : IL-2 방출, 도 5 : 억제) 에 대한 "T-세포 활성화 어세이" 및 IC50-값을 나타낸다.

도 6 은 TAC-34, LC.001 및 LC.033 에 대한 "TT-어세이" 데이타를 나타낸다.

도 7 은 본 발명의 항체와 마우스 OX40L 와의 교차-반응성을 나타낸다.

A) 트랜스펙션된 세포 및 WT 세포 상에서의 hOX40L 발현의 조절,

B) 항체의 hOX40L 발현 K562 세포에의 결합,

C) 트랜스펙션된 세포 및 WT 세포 상에서의 mOX40L 발현의 조절,

D) 항체의 mOX40L 발현 K562 세포에의 결합, 및

E) 항체의 WT K562 세포에의 결합 (n = 3).

도 8 은 본 발명의 항체의 C1q 에의 결합 능력을 나타낸다 (n = 3).

도 9 는 본 발명의 항체의 C3c 를 활성화시키는 능력을 나타낸다 (n = 3).

도 10 은 본 발명의 항체의 FcγRⅠ (n = 4), FcγRⅡA (n = 4) 및 FcγRⅡb (n = 4) 에의 결합 능력을 나타낸다.

도 11 은 본 발명의 항체의 NK 세포 상의 FcγRⅢa (CD16) 에의 결합 능력을 나타낸다 (6 공여체의 평균 ± SEM).

도 12 는 웨스턴 블랏을 나타낸다 ; 레인 1, 4, 7 : 마커 ; 레인 2, 5, 8 : 100 ng OX40L ; 레인 3, 6, 9 : 40 ng OX40L.

서열 목록의 설명

SEQ ID NO:1 LC.001의 카파 경쇄, 가변 영역

SEQ ID NO:2 LC.001 의 γ 중쇄 가변 영역

SEQ ID NO:3 LC.005 의 카파 경쇄, 가변 영역

SEQ ID NO:4 LC.005 의 γ 중쇄 가변 영역

SEQ ID NO:5 LC.O1O 의 카파 경쇄, 가변 영역

SEQ ID NO:6 LC.O1O 의 γ 중쇄 가변 영역

SEQ ID NO:7 LC.029 의 카파 경쇄, 가변 영역

SEQ ID NO:8 LC.029 의 γ 중쇄 가변 영역

SEQ ID NO:9 LC.O19 의 카파 경쇄, 가변 영역

SEQ ID NO:10 LC.O19 의 γ 중쇄 가변 영역

SEQ ID NO:11 LC.033 의 카파 경쇄, 가변 영역

SEQ ID NO:12 LC.033 의 γ 중쇄 가변 영역

SEQ ID NO:13 카파 경쇄 불변 영역

SEQ ID NO:14 γ1 중쇄 불변 영역

SEQ ID NO:15 γ4 중쇄 불변 영역

SEQ ID NO:16 LC.033 의 카파 경쇄, 돌연변이 가변 영역

SEQ ID NO:1 LC.059 의 카파 경쇄, 가변 영역

SEQ ID NO:17 LC.059 의 γ 중쇄 가변 영역

SEQ ID NO:18 LC.060 의 카파 경쇄, 가변 영역

SEQ ID NO:19 LC.060 의 γ 중쇄 가변 영역

SEQ ID NO:1 LC.063 의 카파 경쇄, 가변 영역

SEQ ID NO:20 LC.063 의 γ 중쇄 가변 영역

SEQ ID NO:21-57 CDR 서열

SEQ ID NO:58 LC.001 (인간 IgG1 유형) 의 γ 중쇄

SEQ ID NO:59 LC.001 (L234A, L235A 인간 IgG1 돌연변이) 의 γ 중쇄

SEQ ID NO:60 LC.001 (S228P 인간 IgG4 돌연변이) 의 γ 중쇄

SEQ ID NO:61 LC.001 의 카파 경쇄

SEQ ID NO:62 LC.005 (인간 IgG 1 유형) 의 γ 중쇄

SEQ ID NO:63 LC.005 (L234A, L235A 인간 IgG1 돌연변이) 의 γ 중쇄

SEQ ID NO:64 LC.005 (S228P 인간 IgG4 돌연변이)의 γ 중쇄

SEQ ID NO:65 LC.005 의 카파 경쇄

SEQ ID NO:66 LC.060 (인간 IgG1 유형) 의 γ 중쇄

SEQ ID NO:67 LC.060 (L234A, L235A 인간 IgG1 돌연변이) 의 γ 중쇄

SEQ ID NO:68 LC.060 (S228P 인간 IgG4 돌연변이) 의 γ 중쇄

SEQ ID NO:69 LC.060 의 카파 경쇄

약어 :

아미노산을 3 글자 (Leu) 또는 1 글자 형태 (L) 로 약술한다.

S228P 는 IgG4 중쇄의 위치 228 에서의 세린에서 프롤린으로의 교환을 의미한다.

L234 는 EU 넘버링 (Kabat) 에 따라 위치 234 에서의 아미노산 루신을 의미한다.

L234A 는 위치 234 에서 아미노산 루신이 알라닌으로 변경되는 것을 의미한다.

L235A 는 위치 235 에서 아미노산 루신이 알라닌으로 변경되는 것을 의미한다.

PVA236 은 236 영역에서 IgG1 의 ELLG 또는 IgG4 의 EFLG 가 PVA 에서 보정되는 것을 의미한다.

GLPSS331 은 331 영역에서 IgG1 의 ALPAP 또는 IgG2 의 GLPAP 가 GLPSS 로 변경되는 것을 의미한다.

델타 G236 은 위치 236 에 있는 아미노산이 결실되는 것을 의미한다.

IgG4x 는 IgG4 에서의 돌연변이 S228P 를 의미한다.

LC2010-001 는 LC.001 과 상동어이다.

Fcg 는 Fc 감마 (Fcγ) 와 상동어이다.

항체의 기타 서열 보정은 유사하게 지정된다.

히스티딘 태그에 융합된 재조합 용해성 인간 OX40L hOX40L-His

히스티딘 태그에 융합된 재조합 용해성 쥣과 OX40L mOX40L-His

플래그 (Flag) 태그에 융합된 재조합 용해성 인간 OX40L hOX40L-Flag

플래그 태그에 융합된 재조합 용해성 쥣과 OX40L mOX40L-Flag

인간 Fcγ 에 융합된 재조합 용해성 인간 OX40 hOX40-hFc

토끼 항-쥣과 Fcγ 단일클론 항체 항-mFc

염소 항-인간 Fcγ 단일클론 항체 항-hFc

쥣과 항-히스티딘 단일클론 항체 항-His

쥣과 Fcγ 에 융합된 재조합 용해성 인간 OX40 hOX40-mFc

쥣과 항-TNFα 단일클론 항체 항-TNFα

쥣과 항-CD40L 단일클론 항체 항-CD40L

종양 괴사 인자 알파 TNFα

CD40 리간드 CD40L

래트 항-인간 OX40L 단일클론 항체 TAG34 항체

인간 항-인간 OX40L LC.001, LC.005,

단일클론 항체 LC.O1O, LC.019,

LC.029, LC.033,

LC.059, LC.060,

LC.063

피토헤마글루티닌 PHA

실시예 1

항- OX40L 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주의 발생

하이브리도마 배양

HuMab 하이브리도마를 37℃, 5% CO₂ 에서 IMDM (Cambrex), 태아 클론 1 소 혈청 (Perbio Science), 원래 하이브리도마 클로닝 인자 (Igen), 나트륨 피루베이트, 페니실린/스트렙토마이신, 2-메르캅토에탄올, HAT (Sigma-Aldrich) 및 카나마이신 (Invitrogen) 중에서 배양하였다.

유전자 도입 마우스의 면역 과정

LC2010-001 : 계통 GG2201 (Medarex, San Jose, CA, USA) 의 6 마리의 HCo7 (2 마리의 수컷 및 4 마리의 암컷), 및 계통 GG2198 (Medarex, San Jose, CA, USA) 의 4 마리의 HCol2 (4 마리의 수컷) 를 인간 OX40L (hOX40L) 에 대한 발현 벡터및 hOX40L의 용해성 세포외 도메인 20 μg 으로 일시적으로 트랜스펙션시킨 1 x 10⁶ HEK293 세포로 교대로 면역시켰다. 총 8 번의 면역주사를 수행하였고, 이 중 4 번은 hOX40L 발현 세포로 복강 내 (i.p.) 주사하고, 4 번은 재조합 단백질로 꼬리 바닥에서 피하 (s.c.) 면역주사하였다. 첫번째 면역주사 시, 1 x 10⁶ HEK293-hOX40L 세포 100 μl 를 완전 프로인트 아쥬반트 (CFA ; Difco Laboratories, Detroit, USA) 100 μl 와 혼합하였다. 모든 나머지 면역주사에서는, PBS 에 든 세포 100 μl 를 사용하거나, 또는 재조합 단백질을 불완전 프로인트 아쥬반트 (ICFA; Difco) 100 μl 와 혼합하였다.

항-hOX40L 의 혈청 적정 농도가 충분한 것으로 나타난 경우, 융합 전 4 일 및 3 일째에 200 μl PBS 중 15 μg hOX40L 세포외 도메인을 정맥 내 (i.v.) 주사하여 마우스를 추가로 2 회 증진 (boosting) 시켰다.

LC2010-001, LC.059, LC.060 및 LC.063 를 HCol2 마우스로부터 유도하였다.

LC2010-005, -010, -019, -029 및 -033 : 계통 GG2201 (Medarex, San Jose, CA, USA) 의 5 마리의 HCo7 (4 마리의 수컷 및 1 마리의 암컷) 을 hOX40L 의 용해성 세포외 도메인 20 μg 으로 면역시켰다. 총 7 번의 면역주사를 수행하였고, 4 번은 복강 내 (i.p.), 그리고 3 번은 꼬리 바닥에서 피하 (s.c.) 면역주사하였다. 첫번째 면역주사를 위해서, 재조합 단백질 100 μl 를 완전 프로인트 아쥬반트 (CFA ; Difco Laboratories, Detroit, USA) 100 μl 와 혼합하였다. 모든 나머지 면역주사를 위해서는, 재조합 단백질 100 μl 를 불완전 프로인트 아쥬반트 (ICFA ; Difco) 100 μl 와 혼합하였다.

항-hOX40L 의 혈청 적정 농도가 충분한 것으로 나타난 경우, 융합 전 4 일 및 3 일째에 200 μl PBS 중의 15 μg hOX40L 세포외 도메인을 정맥 내 (i.v.) 주 사하여 마우스를 추가로 2 회 증진 시켰다.

하이브리도마 생성

마우스를 죽이고, 비장 및 복부 대동맥 및 대정맥 옆의 림프절을 수합하였다. 비장세포 및 림프절 세포와, 융합 파트너 SP 2.0 세포와의 융합을 표준 조작 과정에 따라 수행하였다.

항원 특이적 ELISA

면역주사한 마우스 혈청 중의 항-OX40L 의 적정 농도를 항원 특이적 ELISA 에 의해 측정하였다. 플레이트 (96 편평 바닥 ELISA 플레이트, Greiner) 를 PBS 중에 용해시킨 0.1 μg/ml 정제 OX40L 로 코팅시키고, 실온에서 밤새 코팅시켰다. 그런 후, 웰을 PBSTC (0.05% Tween 20 (Sigma-Aldrich Chemie BV) 및 2% 닭 혈청 (Gibco) 을 함유하는 PBS) 로 실온에서 1 시간 동안 차단시켰다.

PBSTC 중에서 1 : 50 으로 희석시킨 테스트 혈청 탭 (tap) 을 웰에 첨가하였다. 면역시키기 전의 마우스에서 수득한 혈청을 PBSTC 중에서 1 : 100 으로 용해시키고, 네거티브 대조군으로 사용하였다. 인간 OX40L 에 대해 직접적인 마우스 항체를 PBSTC 중에서 1 : 50 으로 용해시키고, 포지티브 대조군으로 사용하였다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 플레이트를 PBST (0.05% Tween 20 함유 PBS) 를 사용해 2 회 세척하였다. Gt-α -huIgG-HRP (Jackson) 를 PBSTC 중에서 1 : 5000 으로 희석시키고, 테스트 탭 및 네거티브 대조군을 함유하는 각 웰에 첨가하였다. Rb-α-mIgG (Jackson) 를 PBSTC 중에서 1 : 3000 으로 희석시키고, 포지티브 대조군을 함유하는 웰에 첨가하 였다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 마지막으로, 플레이트를 PBST 를 사용하여 3 회 세척하고, 갓 만들어낸 ABTS

용액 (1 mg/ml) (ABTS : 2,2'-아지노 비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-술폰산) 을 사용해 어두운 데서 실온 (RT) 에서 30 분 동안 발색시켰다. 흡광도를 405 nm 에서 측정하였다.

카파 - ELISA

융합으로 생성된 하이브리도마가 인간 항체를 생성하는지 알아보기 위해, 카파-ELISA 를 수행하였다. ELISA 플레이트를 PBS 중에서 1/10000 로 희석시킨 래트 항-인간 IgG 카파-경쇄 항체 (DAKO) 로 코팅시키고, 4℃ 에서 밤새 인큐베이션시켰다. 웰의 내용물을 버리고, 플레이트를 PBSTC (0.05% Tween-20 (PBSTC) 가 보충된 PBSC) 로 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션시켜서 차단시켰다. 그런 후, 웰을 PBSTC 중에서 1/2 로 희석시킨 하이브리도마 배양 상청액과 함께 인큐베이션시켰다. PBSTC 중에서 1/2 로 희석시킨 배양 배지를 네거티브 대조군으로 사용하고, PBSTC 중에서 1/100 으로 희석시킨 카파-경쇄 포지티브 마우스 혈청을 포지티브 대조군으로서 사용하였다. 이어서, 웰을 3 회 세척하고, PBSTC 중에서 1/2000 로 희석시킨 HRP-공액 래트 항-인간 IgG F(ab')₂ (DAKO) 와 함께 37℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 웰을 3 회 세척하고, 어세이를 갓 만들어낸 ABTS

용액 (1 mg/ml) 을 사용해 어두운 데서 실온 (RT) 에서 30 분 동안 발색시켰다. 흡광도를 ELISA 플레이트 판독기에서 405 nm 에서 측정하였다.

실시예 2

항- OX40L HuMab 가변 도메인의 클로닝 및 서열 분석

( 카파 - 경쇄 및 γ1- 중쇄 )

OX40L HuMab 의 경쇄 가변 영역 V_L 및 중쇄 가변 영역 V_H 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 표준 cDNA 합성/PCR 과정에 의해 단리하였다.

총 RNA 를 GeneRacer™ Kit (Invitrogen) 를 사용해 1 x 1O⁶ - 1 x 1O⁷ 하이브리도마 세포로부터 제조하였다. 하이브리도마 유래 RNA 를 GeneRacer™ Oligo-dT 프라이머의 제 1 가닥 cDNA 합성 및 결합을 위한 템플레이트로서 사용하였다. 제 2 가닥 cDNA 합성 및 추가의 V_L 및 V_H 인코딩 cDNA 절편의 PCR 증폭을 카파-경쇄 및 γ1-중쇄 불변 영역의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 역상 경쇄 및 중쇄 프라이머 및 5'-특이적 GeneRacer™ 프라이머 각각을 사용해 수행하였다. Invitrogen™ Life Technologies 의 TOPO™ TA 클로닝 키트 및 클로닝 벡터로서 pCR4-TOPO™ 을 사용하여 PCR 생성물을 클로닝하였다. 클로닝된 PCR 생성물을 분해용 EcoRI 를 사용하여 적절한 플라스미드의 제한 맵핑에 의해 규명하고, DNA 절편 크기를 V_L 및 V_H 에 대해 각각 약 740 및 790 bp 로 예상/계산하였다.

클로닝한 PCR 절편의 DNA 서열을 이중 가닥 서열화에 의해 결정하였다.

GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) 소프트웨어 패키지 버전 10.2 및 벡터-NTI 8 (InforMax, Inc) 를 일반적인 데이타 프로세싱에 사용하였다. DNA 및 단백질 서열을 GCG modul CLUSTALW 을 사용하여 배열하였다. 서열 배열을 프로그램 GENEDOC (버전 2.1) 를 사용하여 하였다.

실시예 3

항- OX40L IgG1 HuMab 를 위한 발현 플라스미드 구축

항-OX40L HuMab 경쇄 및 중쇄 인코딩 유전자를 포유류 세포 발현 벡터에서 따로 어셈블리하였다.

그로 인해, 항-OX40L HuMab 경쇄 가변 영역 (V_L) 및 인간 카파-경쇄 불변 영역 (C_L, SEQ ID NO:13, 또는 SEQ ID NO:61, 65 또는 69 중에서) 을 인코딩하는 유전자 단편을 연결하고, 항-OX40L HuMab 중쇄 가변 영역 (V_H) 및 인간 γ1-중쇄 불변 영역 (C_H1-Hinge-C_H2-C_H3, SEQ ID NO: 14, 또는 SEQ ID NO:58, 62 또는 66 중에서) 에 대한 유전자 단편들도 마찬가지로 하였다.

코돈 사용을 추론할 수 있는 인간 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반적인 정보가 [Kabat, E.A., 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, fifth ed., NIH Publication No. 91- 3242 (1991)] 에 나타나 있다.

항-OX40L HuMab 카파-경쇄의 전사 단위는 하기 구성원으로 구성된다 :

- 인간 거대세포바이러스 (HCMV) 로부터의 즉각적인 초기 인핸서 및 프로모터,

- Kozak 서열을 포함한 합성 5'-UT,

- 신호 서열 인트론을 포함한 쥣과 면역글로불린 중쇄 신호 서열,

- 5' 말단에 있는 독특한 BsmI 제한 부위 및 접합 공여체 부위 및 3' 말단에 있는 독특한 NotI 제한 부위가 배열된 클로닝된 항-OX40L HuMab 가변 경쇄 cDNA,

- 인트론 2 마우스 Ig-카파 인핸서를 포함하는 게놈 인간 카파-유전자 불변 영역 [Picard, D., and Schaffner, W., Nature 307 (1984) 80-82], 및

- 인간 면역글로불린 카파-폴리아데닐화 ("폴리 A") 신호 서열.

항-OX40L HuMab γ1-중쇄의 전사 단위는 하기 구성원으로 구성되어 있다 :

- 인간 거대세포바이러스 (HCMV) 의 즉각적인 초기 인핸서 및 프로모터,

- Kozak 서열을 포함한 합성 5'-UT,

- 신호 서열 인트론을 포함한 개질된 쥣과 면역글로불린 중쇄 신호 서열,

- 5' 에 있는 독특한 BsmI 제한 부위 및 접합 공여체 부위 및 3' 말단에 있는 독특한 NotI 제한 부위가 배열된 클로닝된 항-OX40L HuMab 가변 중쇄 cDNA,

- 마우스 Ig μ-인핸서를 포함한 게놈 인간 γ1-중쇄 유전자 불변 영역 (Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378),

- 인간 γ1-면역글로불린 폴리아데닐화 ("폴리 A") 신호 서열.

항-OX40L HuMab 카파-경쇄 및 γ1-중쇄 발현 플라스미드의 기능 구성원 : 항-OX40L HuMab 카파-경쇄 또는 γ1-중쇄 발현 카세트 외에도 상기 플라스미드는 하기를 함유한다 :

- 하이그로마이신 내성 유전자

- 엡스타인-바르 바이러스 (Epstein-Barr virus, EBV) 의 복제 기원, oriP

- E. coli 내에서 상기 플라스미드를 복제할 수 있는 벡터 pUC18 로부터의 복제 기원, 및

- E. coli 에 암피실린 내성을 부여하는 β-락타마제 유전자.

실시예 4

항- OX40L IgG4 HuMab 를 위한 발현 플라스미드의 구축

인간 게놈 γ1-불변 영역 및 γ1-면역글로불린 폴리아데닐화 ("폴리 A") 신호 서열을 인간 게놈 γ4-불변 영역 (SEQ ID NO:15 또는 SEQ ID NO:60, 64 나 68 중의 비돌연변이 γ4-불변 영역 중에서) 및 γ4-면역글로불린 폴리아데닐화-신호 서열로 대체함으로써 항-OX40L γ1-중쇄 발현 플라스미드로부터 항-OX40L γ4-중쇄 원형 발현 플라스미드를 유도하였다.

항-OX40L HuMab 카파-경쇄의 발현을 위해, 동일한 발현 플라스미드를 IgG1 에 대해 기술된 바와 같이 사용하였다 (상기 참조).

실시예 5

LC .001 기재 돌연변이 ( 변이체 ) 항- OX40L IgG1 및 IgG4 를 위한 발현 플라스미드의 구축

돌연변이 항-OX40L γ1- 및 γ4-중쇄를 인코딩하는 발현 플라스미드를, QuickChange™ 부위-직접적 돌연변이 키트 (Stratagene) 를 사용하여 야생형 발현 플라스미드를 사용한 부위-직접적 돌연변이에 의해 제조하였다. 아미노산을 EU 넘버링에 따라 넘버링하였다 (Edelman, G. M., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85 ; Kabat, E.A., 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH Publication No. 91 - 3242, Bethesda, MD (1991)).

아이소타입	약어	돌연변이	설명
IgG1	IgG1v1	PVA-236; E233P 에 의해 명시된 바와 같은 GLPSS331; L234V; L235A; 델타 G236; A327G; A330S; P331S	인간 γ1-중쇄의 아미노산 서열 Glu₂₃₃Leu₂₃₄Leu₂₃₅Gly₂₃₆ 은 인간 γ2-중쇄의 아미노산 서열 Pro₂₃₃Val₂₃₄Ala₂₃₅ 에 의해 대체됨. 인간 γ1-중쇄의 아미노산 서열 Ala₃₂₇Leu₃₂₈Pro₃₂₉Ala₃₃₀Pro₃₃₁ 은 인간 γ4-중쇄의 아미노산 서열 Gly₃₂₇Leu₃₂₈Pro₃₂₉Ser₃₃₀Ser₃₃₁ 에 의해 대체됨.
IgG1	IgG1v2	L234A; L235A	인간 γ1-중쇄의 아미노산 서열 Leu₂₃₄Leu₂₃₅ 는 아미노산 서열 Ala₂₃₄Ala₂₃₅ 에 의해 대체됨.
IgG4	IgG4v1	S228P; L235E	인간 γ4-중쇄의 Ser₂₂₈ 은 Pro₂₂₈ 에 의해 대체되고, 인간 γ4-중쇄의 Leu₂₃₅ 는 Glu₂₃₅ 에 의해 대체됨.
IgG4	IgG4x	S228P	인간 γ4-중쇄의 Ser₂₂₈ 은 Pro₂₂₈ 에 의해 대체됨.

실시예 6

재조합 항 OX40L HuMab 의 제조

10% 초-저 IgG FCS (Gibco), 2mM 글루타민 (Gibco), 1% v/v 비필수 아미노산 (Gibco) 및 250 μg/ml G418 (Roche) 이 보충된 DMEM (Gibco) 중에서 배양된 부착성 HEK293-EBNA 세포 (ATTC CRL-10852) 의 일시적인 트랜스펙션에 의해 재조합 HuMab 를 생성하였다. 트랜스펙션을 위해, Fugene™ 6 (Roche) 트랜스펙션 시약을 시약 (μl) 대 DNA (μg) 의 비율을 3 : 1 내지 6 : 1 의 범위로 사용하였다. 면역글로불린 경쇄 및 중쇄를, 경쇄 및 중쇄를 각각 인코딩하는 플라스미드들을 1 : 2 내지 2 : 1 (경쇄 : 중쇄) 로 사용하여 2 가지 상이한 플라스미드로부터 발현시켰다. HuMab 함유 세포 배양 상청액을 트랜스펙션시킨 후 4 내지 11 일 째에 수합하였다. 정제할 때까지 상청액을 -20℃ 에 보관하였다.

예를 들어 HEK293 내의 인간 항체의 재조합 발현에 관한 일반적인 정보는 [Meissner, P., 등, Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203] 에 나타나 있다.

실시예 7

항체 TAG34 , LC .001, LC .005, LC .010, LC .019, LC .029, LC . 033 의 친화성 분석

장비 : Biacore 3000, 진행 및 반응 완충액 : HBS-P (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005% Tween 20, ph 7.4), 25℃. 0.78 nM 내지 100 nM 사이의 7 가지 농도에서 3 분 동안 분석물을 주입하고, HBS-P 로 5 분 동안 세척하였다. 표면 (카르복시메틸화된 덱스트란 표면, CM) 의 재발생을, 10 mM 글리신 pH 2.0 을 각각 1 분 동안 2 회 주입하여 수행하였다. 주입 칩, 어세이 포맷과 순서 및 속도 데이타는 하기 표에 기술된 것에 상응하였다. 속도 데이타를 1 : 1 Langmuir 결합 모델에 속도 데이타를 맞춤으로써 계산하였다.

칩	캡처링	리간드	분석물	ka (1/Ms)	kd (1/s)	K_D (M)
CM5	항-mFcg	TAG34	hOX40L-His	8.84 x 10⁴	3.32 x 10^-5	3.75 x 10^-10
CM5	항-hFcg	LC.001	hOX40L-His	9.01 x 10⁴	7.16 x 10^-9	< 1.1 x 10^-11
CM5	항-hFcg	LC.005	hOX40L-His	6.84 x 10⁴	2.02 x 10^-7	< 1.5 x 10^-11
CM5	항-hFcg	LC.010	hOX40L-His	6.25 x 10⁴	2.5 x 10^-5	3.99 x 10^-10
CM5	항-hFcg	LC.019	hOX40L-His	7.89 x 10⁴	7.53 x 10^-8	< 1.2 x 10^-11
CM5	항-hFcg	LC.029	hOX40L-His	1.41 x 10⁵	2.4 x 10^-8	< 7.1 x 10^-12
CM5	항-hFcg	LC.033	hOX40L-His	7.01 x 10⁴	2.09 x 10^-7	< 1.4 x 10^-11

TAG34 및 mOX40L 간의 상호 작용은 측정할 수 없었다.

모든 Biacore 어세이에 대한 데이타 평가 및 데이타 분해

전신 내인성 기준선 이동 보정 및 잡신호 감소를 위해 샘플 커브에서 네거티브 대조군 데이타 (예를 들어 완충액 커브) 를 감하였다. BiaEvaluation 버전 4.01 을 센소그램 (sensorgram) 분석 및 친화성 데이타 계산에 사용하였다.

실시예 8

hOX40L 와 고정된 hOX40 과의 상호작용을 억제시키는 항- hOX40L 항체의 억제 경합 어세이

장비 : Biacore 3000, 진행 및 반응 완충액 : HBS-P (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005% Tween 20, ph 7.4), 25℃. 주입 전에, 분석물 (10 nM) 및 경합체 (0.78 nM 내지 100 nM 사이의 8 가지 농도) 를 22℃ 에서 20 분 이상 예비인큐베이션시켰다. 분석물 +/- 경합체를 3 분 동안 주입하고, HBS-P 로 3 분 동안 세척하였다. 10 mM 글리신 pH 2.0 을 각각 1 분 동안 2 회 주입하여, 표면의 재발생을 수행하였다. 주입 칩, 어세이 포맷과 순서 및 속도 데이타는 하기 표 3 에 기술된 것에 상응하였다.

칩	리간드	분석물	경합체	IC50 (M)
CM5	OX40-hFc	hOX40L-His	TAG34	7 x 10^-9
CM5	OX40-hFc	hOX40L-His	LC.001	4 x 10^-9
CM5	OX40-hFc	hOX40L-His	LC.005	3 x 10^-9

모든 항체는 용액 중에서 OX40L 의 OX40 에의 결합을 억제시킨다 (용액 친화성). LC.001 및 LC.005 는 TAG34 보다 더 낮은 IC50-값을 나타낸다.

실시예 9

항- OX40L 항체 TAG34 , LC .001, LC .005, LC . O10 , LC .019, LC .029, LC .033, LC.060 의 에피토프 특징화

장비 : Biacore 3000, 진행 및 반응 완충액 : HBS-P (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005% Tween 20, ph 7.4), 25℃. 에피토프 군을 열거된 항체 사이의 교차 경합에 의해 결정하였다. 주입 전에 분석물 (50 nM) 및 경합체 (100 nM) 를 22℃ 에서 20 분 이상 예비인큐베이션시켰다. 분석물 +/- 경합체를 2 분 동안 주입하고, HBS-P 로 3 분 동안 세척하였다. 10 mM 글리신 pH 2.0 을 각각 1 분 동안 2 회 주입하여, 표면의 재발생을 수행하였다. 주입 칩, 어세이 포맷과 순서 및 속도 데이타는 하기 표 4 에 기술된 것에 상응하였다.

칩	캡처링	리간드	분석물	경합체	에피토프
CM5	항-hFcg	항-hOX40L (A,B,C)	hOX40L-His	TAG34	A
CM5	항-hFcg	항-hOX40L (A,B,C)	hOX40L-His	LC.001	A
CM5	항-hFcg	항-hOX40L (A,B,C)	hOX40L-His	LC.005	B
CM5	항-hFcg	항-hOX40L (A,B,C)	hOX40L-His	LC.010	B
CM5	항-hFcg	항-hOX40L (A,B,C)	hOX40L-His	LC.019	A/B
CM5	항-hFcg	항-hOX40L (A,B,C)	hOX40L-His	LC.029	B
CM5	항-hFcg	항-hOX40L (A,B,C)	hOX40L-His	LC.033	A
CM5	항-hFcg	항-hOX40L (A,B,C)	hOX40L-His	LC.060	A

TAG34 에 의해 인지되는 OX40L 에피토프를 에피토프 A 로 정의하였다. 그러나, TAG34 는 100 ng 의 항체 농도에서 변성 OX40L (웨스턴 블랏에서) 에 결합하지 않는다. 하나의 에피토프 군 (A 또는 B) 내의 항체는 교차 억제 활성을 나타내고, 한편 상이한 군의 항체는 부가적인 결합 신호를 나타내었다. LC.019 는 군 A 뿐만 아니라 군 B 의 기타 항체를 중화시킨다.

실시예 10

TAG34 , LC .001 및 LC . 005 의 CD40L 및 TNF α 에의 결합 특이성

장비 : Biacore 3000, 진행 및 반응 완충액 : HBS-P (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005% Tween 20, ph 7.4), 25℃. 분석물을 100 nM 및 500 nM 에서 3 분 동 주입하고, HBS-P 로 2 분 동안 세척하였다. 100 mM HCl 을 각각 1 분 동안 2 회 주입하여, 표면의 재발생을 수행하였다. 주입 칩, 어세이 포맷과 순서 및 속도 데이타는 하기 표 5 에 기술된 것에 상응하였다.

칩	캡처링	리간드	분석물
CM5	항-mFcg 항-hFcg	TAG34 LC.001 LC.005 항-TNFα 항-CD40L	TNFα CD40L OX40L

상기 어세이에서, CD40L 는 모든 항체 또는 칩 표면에의 일부 비특이적 결합을 나타내었으나, 배경 신호를 감하고 난 후, 상기 어세이는 TNFα 및 CD40L (500 nM 이하) 가 고정된 항체 TAG34, LC.001 및 LC.005 에 비특이적으로 결합하지 않음을 나타내었다.

실시예 11

항체 LC . 001 - IgG1 및 LC .001- IgG4x 의 친화성 분석

장비 : Biacore 3000, 진행 및 반응 완충액 : HBS-P (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005% Tween 20, ph 7.4), 25℃. 0.78 nM - 100 nM 의 8 가지 농도에서 분석물을 3 분 동안 주입하고, HBS-P 로 5 분 동안 세척하였다. 100 mM HCl 을 각각 1 분 동안 주입하여 표면 재발생을 수행하였다. 주입 칩, 어세이 포맷과 순서 및 속도 데이타는 하기 표에 기술된 것에 상응하였다. 1 : 1 Langmuir 결합 모델에 속도 데이타를 맞추어서 속도 데이타를 계산하였다.

칩	캡처링	리간드	분석물	ka (1/MS)	kd (1/s)	K_D (M)
CM5	항-mFcg	LC.001	hOX40L-His	4.27 x 10⁴	3.46 x 10^-8	< 2.3 x 10^-11
CM5	항-mFcg	LC.001-IgG4x	hOX40L-His	4.85 x 10⁴	7.72 x 10^-8	< 2.06 x 10^-11

LC.001 및 LC.001 -IgG4x 는 hOX40L-His 에 대해 동일한 친화성을 나타내었다.

실시예 12

항체의 OX40L 에의 결합을 검출하기 위한 ELISA 어세이

SA-코팅된 플레이트 (96 편평 바닥 ELISA 플레이트, Microcoat) 를 인큐베이션 완충액 (IB = 0.1% Tween 20 (Serva) 및 1% 차단 단백질을 함유하는 PBS) 중에 용해시킨 0.5 μg/ml 바이오틴화 OX40L 로 실온에서 1 시간 동안 코팅시켰다. 다음, 플레이트를 세척 완충액 (WB = 0.1% Tween 20 함유 식염수) 으로 2 회 세척하였다.

샘플 (세포 배양 상청액 또는 정제된 항체)을 IB 중에서 단계 희석시키고, 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 플레이트를 WB 를 사용해 2 회 세척하였다. 이어서, 인간 IgG 에 대한 염소 항체 및 POD (Dianova) 의 컨쥬게이트를 IB 중에서 50 ng/ml 로 희석시키고, 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 마지막으로, 플레이트를 WB 를 사용해 2 회 세척하고, 즉석 ABTS

용액 (Roche) 으로 어두운 데서 실온 (RT) 에서 발색시켰다. 가장 높은 농도의 흡광도가 충분한 OD (도 1a) 에 도달한 후, 흡광도를 405 nm 에서 측정하였다. EC50 값을 3 nM - 8 nM 의 범위에서 수득하였다.

실시예 13

인간 OX40 /인간 OX40L 의 상호작용을 억제시키는 항체를 검출하기 위한 ELISA 어세이

SA-코팅된 플레이트 (96 편평 바닥 ELISA 플레이트, Microcoat, Germany) 를 IB 중에 용해시킨 0.5 μg/ml 바이오틴화 OX40L 로 실온에서 1 시간 동안 코팅시켰다. 다음, 플레이트를 WB (PBS 완충액, 0.1%(w/v) Tween™ 20) 를 사용해 2 회 세척하였다.

샘플을 1 μg/ml 의 농도로 IB 중에 희석시키고, 단계 희석액 내에서 각 웰에 첨가하였다. OX40 의 OX40L 에의 최대 결합을 이루기 위해, 일부 웰에는 단지 IB 만을 첨가하였다. 다음, Digoxigenin (Roche Diagnostics GmbH, DE) 과 공액된 인간 OX40 의 용액을 0.2 μg/ml 의 농도로 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 플레이트를 WB 로 2 회 세척하였다. 양<Digoxigenin>-POD (Roche) 를 IB 중에서 50 mU/ml 로 희석시키고, 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 마지막으로, 플레이트를 WB 로 2 회 세척하고, 즉석 ABTS

용액 (Roche) 으로 어두운 데서 실온 (RT) 에서 발색시켰다. 10 내지 20 분 후에 흡광도를 405 nm 에서 측정하였다 (도 1b). 1 nM 내지 4 nM 의 범위에서 IC50 값을 수득하였다.

실시예 14

K562 세포 상에 발현된 인간 OX40L ( K562 _ OX40L 세포) 와 인간 OX40 과의 상호 작용을 억제시키는 HuMab 를 검출하기 위한 FACS - 어세이 .

목적 : Dig-표지된 hOX40:hFc 융합 단백질과 hOX40L 발현 세포주 K562_hOX40L 와의 상호작용을 차단하는 HuMab hOX40L 의 특성을 결정하기 위한 어세이.

과정 : "어세이 시약" 으로서 Dig 표지된 hOX40:hFc, 및 "경합체" 로서 HuMab hOX40L 를 사용하여 어세이하였다.

어세이 시약 : 저장물질 0.5 μg/μl (PBS 중에 1 : 10 으로 희석시킨 것), 100 μl 항 디곡시게닌-FLUOS - PBS/0.5% BSA/1% 차단 시약 (Roche Diagnostics GmbH, DE) 중에 1 : 25 로 희석시킨 것.

2 x 1O⁵ K562_OX40L 세포 (ISF-0 에서 성장시킴) 를 2 ml PBS 에서 세척하고, 1OO μl PBS 중에 재현탁시켰다. 이어서, PBS 중의 경합체 (경합체/시약 비율이 0:1 / 1:1 / 1.5:1 / 2:1 / 2.5:2 / 5:1) 를 첨가하였다. 이어서, 밝은 곳, RT 에서 30 분 동안 인큐베이션시켰다. 다음, 시약 (PBS 중) 을 첨가하고 ; 밝은 곳, RT 에서 30 분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 2 ml PBS 로 세척하고, 원심분리에 의해 펠렛으로 만들었다. 염색용 2 차 항체 (항-디곡시게닌-형광, Fab-절편 (Roche, 1207741)) 를 첨가하고, 암실, 4℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 2 ml PBS 로 세척하고, 원심분리에 의해 펠렛으로 만들었다. 그런 후, 세포를 0.5 ml PBS 중에 재현탁시켰다. 샘플을 FACS-Scan 에서 측정하였다 (도 2).

실시예 15

hOX40 / hOX40L 신호전달에 대한 항체의 억제 능력을 측정하기 위한 기능적 어세이 (" NF κB- 어세이 ")

HeLa 야생형 (wt) 및 인간 OX40 발현 HeLa 세포 (HeLa_OX40) 를 Minimal Essential Medium (MEM), 1 x Na-피루베이트, 1 x 비필수 아미노산 (Gibco), 10% FCS, 및 재조합 세포의 경우 + 600 μg/ml G418 중에서 배양하였다. K562 및 OX40L 발현 K562 를 ISF-O 배지 중에서 배양하고, 재조합 세포의 경우 200 μg/ml G418 을 첨가하였다.

HeLa_wt 또는 HeLa_OX40 세포를 96-웰 플레이트 w/o G418 내에 3 x 1O⁴ 세포/100 μl 의 세포 밀도로 심고, CO₂-인큐베이터 내에서 밤새 인큐베이션시켰다. K562_wt 또는 K562_OX40L 세포를 1 : 1 의 세포-대-세포 비율로 첨가하였다. OX40L 를 발현하는 포르말린-고정 또는 비포르말린-고정 K562 세포 (-70℃ 에서 냉동시킨 것) 를 해동시키고, MEM/10%FCS 중에서 1 : 10 으로 희석하고 ; K562_OX40L 세포를 OX40L 에 대한 항체로 RT 에서 30 분 동안 예비인큐베이션시켰다. K562_OX40L 세포로의 자극 시간은 30 분 내지 150 분이었다. 세포 핵으로부터의 단백질 추출을 Active Motif 사의 NE-Kit 를 사용해 공급업자의 지시에 따라 수행하였다. Active Motif 사의 TransAM NFκB-ELISA (어세이를 공급업자의 지시에 따라 수행하였음) 를 사용해, NFκB 활성화를 초래하는 OX40-신호전달을 측정하였다. Tecan MTP-판독기에서 파장 450/620 nm 흡광도에서 측정하였다 (도 3). 0.6 내지 5 nM 의 범위에서 모든 LC 항체에 대한 IC50 값을 수득하였다.

실시예 16

T-세포 활성화 어세이

어세이 원칙 :

인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBL) 를 하위-최적 농도의 T-세포 미토겐 피토헤마글루티닌 (PHA) 으로 활성화시키고, OX40L 를 과발현하는 K562 세포로 공동-자극시켰다. 상기 어세이 조건 하에, 활성화된 T-세포를 37℃ 에서 24 시간 동안 인큐베이션시켜서, IL-2 를 생성하였다. ELISA 어세이를 사용해 상청액 중에서 사이토카인을 측정하였다. Mab 의 차단 효과를 측정하기 위해, PBL 과의 공동-배양 전에 K562_OX40L 세포를 적절한 항체 희석액과 함께 1 시간 동안 예비인큐베이션시켰다.

과정 :

인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBL) 를 Histopaque®-1077 (Sigma) 에서 밀도 구배 원심분리에 의해 헤파린처리한 전혈에서 분리하였다. Hanks 로 세척한 후, Turk's 용액을 사용해 세포의 수를 세고, 페니실린, 스트렙토마이신 및 글루타민 (Gibco 10378-016), 및 10% FBS 를 보충한 RPMI 1640 (Gibco) 중에서 10⁶/ml 의 농도로 세포를 재현탁시켰다. K562 대조군 세포 (야생형) 를 기술된 바와 동일한 RPMI 배지에서 유지시켰다. OX40L 로 트랜스펙션시킨 K562 세포를 50 mg/ml 의 최종 농도로 지네시틴 (G418, Gibco) 이 보충된 동일 배지에서 유지시켰다. K562 세포 (야생형 또는 OX40L+) 를 1.5 x 1O⁵ 세포/ ml 로 동일 배지에서 희석시키고, 96 웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 50 μl/웰 (0.75 x 10⁴/웰) 로 주입시켰다. Mab 의 적절한 희석액을 20 μl/웰의 부피로 세포에 첨가하고, 37℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 각 희석액을 2 벌의 웰에서 테스트하였다. PBL 을 100 μl/웰 (10⁵ 세포/웰) 의 부피로 첨가하였다. PBL 대 K562 세포의 최종 농도는 ~13 : 1 이었다. PHA (10 X) (Sigma L-9132) 를 20 μl/웰 (최종 농도 0.75μg/ml) 로 첨가하였다. 웰 당 총 부피는 RPMI/10% FCS 200 μl 로 완성되었다. 플레이트를 37℃, 5% CO₂-습도화된 인큐베이터에서 24 시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 원심분리한 후, 상청액을 수합하고, 제조업자의 특별지시에 따라 ELISA (BD, San Diego, CA, Cat No2627KI) 에 의해 IL-2 를 테스트하였다 (도 4). IC₅₀ (OX40L-자극받은 PBL 에 의한 IL-2 방출을 50% 차단시키는 Mab 농도) 을 계산하기 위해, K562 x OX40L+ 세포로 자극받은 PBL 에 의해 생성된 총 IL-2 에서 대조군 배양 (PBL+PHA+K562WT) 에서 생성된 배경 IL-2 농도를 감하였다 (도 5). IC₅₀ TAG34: 0.07μM ; LC.001: 2 nM ; LC.005: 10 nM. IC₅₀ 값은 2 내지 10 nM 의 범위였다.

실시예 17

Tetanus 어세이 (' TT - 어세이 ') 테타누스 독소에 의해 자극받은 말초 혈액 림프구에 대한 항체의 억제 효과의 시험

말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 를 Ficoll Hypaque 에 의해 헤파린처리한 혈액으로부터 단리하였다. 대부분의 경우, 갓 단리한 PBMC 를 상기 어세이에 사용하였다. 또한 일부 경우, 저온 보존한 PBMC 를 사용하였다. 상기 어세이용 배지는 10% 인간 남성 AB 혈청 (Sigma-Aldrich) ; 2 mM 글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신 (항생 페니실린 및 스트렙토마이신 (Roche Diagnostics GmbH DE) 의 즉석 혼합물 ; 20 ml 에서 재구성한 동결건조물 ; 배지 1000 ml 당 2 ml 사용) 을 함유하는 RPMI 였다.

플라스틱에 부착시키기 위해, 웰 당 300.000 개의 PBMC 를 96 웰 편평 바닥 플레이트에서 밤새 예비인큐베이션시켰다.

다음 날, 테타누스독소 (TT) (Chiron Behring) 를 2 내지 5 μg/ml 의 최종 농도로 웰에 첨가하였다. 포지티브 대조군 웰 (최대 증식/자극) 만이 TT 를 함유하였고, 모든 나머지 웰에는 항체 (정제된 IgG 로서) 를 10 μg/ml 의 최종 농도로 첨가하였다. 쥣과 Mab TAG34 를 어세이 (최종 농도 10 μg/ml) 에 포함하였다. 비자극 배경 대조군으로서, 배지만을 사용하였다. 모든 어세이를 3 벌로 세팅하였다.

추가의 인큐베이션 (37℃, 5% CO₂, 95% 습도) 을 한 지 6 일 후에, ³H-사이미딘을 1 μCurie/ml 의 최종 농도로 첨가하고, 16 시간 동안의 추가의 인큐베이션 후에, 플레이트를 수합하고, 혼입된 ³H-사이미딘을 베타-계수기에서 측정하였다 (도 6).

실시예 18

OX40L 항체와 마우스 OX40L 와의 교차-반응성

본 발명의 항체의 쥣과 OX40L 와의 교차-반응성을 측정하기 위해, 단계 희석시킨 항체 및 대조군 항체를, 안정하게 mOX40L 를 발현하는 K562-mOX40L 세포와 함께 인큐베이션시켰다. K562 WT 세포 및 hOX40L 를 안정하게 발현하는 K562-hOX40L 세포에의 결합을 또한 평가하였다. 네거티브 대조군으로서, Keyhole Limpet Hemocyanin (알파-KLH) 에 대해 직접적인 HuMab 항체를 사용하였다. 항체 RM134L, 래트 항-mOX40L (eBioscience, San Diego, CA) 를 mOX40L 발현에 대한 포지티브 대조군으로서 포함하였다. 항체 TAC-34, 마우스 항-hOX40L (MBL, Nagoya, Japan) 를 hOX40L 발현에 대한 포지티브 대조군으로서 포함하였다. 결합된 인간 항체의 검출을 위해, 형광 (FITC)-공액된 염소 항-인간 IgG 항체를 사용하였다. 결합된 RM134L 의 검출을 위해, 바이오틴화 토끼 항-래트 IgG 항체 (DAKO, Glostrup, Denmark) 를 피코에리트린 (PE) (DAKO) 과 공액된 스트렙타비딘과 병용하여 사용하였다. 결합된 TAG34 의 검출을 위해, FITC-공액 토끼 항-마우스 IgG 항체를 사용하였다. HuMab 의 20 μg/ml (Bmax) 에서의 EC50 값 또는 최대 결합에 관한 계산을 Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 비-선형 회귀 (가변 경사를 가진 S 자 모양의 투여량-반응) 를 사용하여 측정하였다.

결과 :

5.16±2.93 μg/ml 의 EC50 값 및 385.22 의 Bmax (MFI) 값이 지시한 바와 같이, 본 발명에 따른 LC.001 은 hOX40L 에 결합할 수 있었으나, 각각 11.41 및 9.67 의 Bmax (MFI) 값이 나타낸 바와 같이 mOX40L 또는 WT 세포에는 결합할 수 없었다. 더욱이, 본 발명에 따른 LC.001 (IgG4) 은 또한 8.19 ± 1.05 μg/ml 의 EC50 값 및 311.30 의 Bmax (MFI) 값으로 나타난 바와 같이 hOX40L 에는 효율적으로 결합할 수 있었으나, 각각 13.47 및 9.58 의 Bmax (MFI) 값이 나타낸 바와 같이 mOX40L 또는 WT 세포에는 결합할 수 없었다. 기대한 바와 같이, 네거티브 대조군 알파-KLH 는 어떤 세포에도 결합하지 않았다 (도 7). 따라서, 본 발명에 따른 OX40L 항체는 인간 OX40L 와 비교해 마우스 OX40L 에 30 배 이상 더 낮게 결합하는 것으로 나타났다.

실시예 19

보체 시스템을 활성화시키는 OX40L HuMab 의 잠재성

C1q 및 C3c 결합 ELISA

C1q 결합 및 C3 활성화를 유도하는 본 발명의 항체의 능력을 측정하기 위해, ELISA 플레이트를 단계 희석시킨 항체 및 대조군 항체로 코팅시켰다. 네거티브 대조군으로서, C1q 에 매우 약하게 결합하는 인간 IgG4 (The Binding Site, Birmingham, England) 를 사용하였다. 인간 IgG1 (The Binding Site) 및 알파-KLH (IgG1) 를 포지티브 대조군으로서 포함하였다. 이어서, 코팅된 항체를 C3 의 원천으로서 재조합 C1q 또는 인간의 풀링된 (pooled) 혈청과 함께 인큐베이션시켰다. 결합된 C1q 의 검출을 위해, 양고추냉이 퍼록시다제 (HRP) (DAKO) 와 공액된 돼지 항-토끼 IgG 항체와 병용하여 C1q (DAKO) 에 대해 직접적인 토끼 항체를 사용하였다. 활성화된 C3c (C3 의 활성화를 통해 발생된 것) 를 검출하기 위해, HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) 와 공액된 토끼 항-마우스 IgG 항체와 병용하여 마우스 항-인간 C3c 항체 (DAKO) 를 사용하였다. 코팅 효율의 차이를 평가하기 위해, 코팅된 항체를 HRP 가 공액된 염소 항-인간 IgG 항체로 시각화하였다. 10 μg/ml (Bmax) 에서의 HuMab 의 EC50 값 또는 최대 결합에 관한 계산을 Graphpad Prism 소프트웨어를 사용해 비-선형 회귀 (가변 경사가 있는 S 자형 투여량-반응) 를 사용해 측정하였다.

결과 :

본 발명에 따른 LC.001 은 2.19±0.42 μg/ml 의 EC50 값 및 3.089의 Bmax (OD405) 로 나타난 바와 같이 C1q 에 효율적으로 결합할 수 있었다. 더욱이, 포지티브 대조군 인간 IgG1 및 항-KLH 둘 다 각각 4.17±1.08 μg/ml 및 2.57±1.51 μg/ml 의 EC50 값, 및 각각 2.685 및 3.306 의 Bmax (OD405) 값으로 나타난 바와 같이, C1q 에 효율적으로 결합할 수 있었다. 예상한 바와 같이, 네거티브 대조군 인간 IgG4 는 0.353 의 OD405 Bmax 값으로 나타난 바와 같이, C1q 에 결합하지 않았다. 더욱이, 본 발명에 따른 LC.001IgG4x 는 0.357 의 OD405 Bmax 값이 나타낸 바와 같이, C1q 에 결합하는 능력이 상실되었다.

C1q 결합 능력이 있는 주 (line) 에서, LC.001 에 의한 C3c 침착은, 2.67+0.16 μg/ml 의 EC50 값 및 2.614 의 Bmax (OD405) 값으로, 항체-농도 의존적 방식으로 발생하였다.. 더욱이, 포지티브 대조군 인간 IgG1 및 항-KLH 둘 다 각각 5.45±0.36 μg/ml 및 2.16±0.26 μg/ml 의 EC50 값, 및 각각 2.543 및 2.633 의 Bmax (OD405) 값이 나타낸 바와 같이, C3c 를 효율적으로 침착시킬 수 있었다. 예상한 바와 같이, 네거티브 대조군 인간 IgG4 는 0.095 의 OD405 Bmax 값이 나타낸 바와 같이, C3c 를 침착시키지 않았다. 더욱이, 본 발명에 따른 LC.001IgG4x 는 0.090 의 OD405 Bmax 값이 나타낸 바와 같이, C3c 를 침착시키는 능력을 상실하였다 (도 8 및 9).

실시예 20

Fc γ 수용체 I, Ⅱa 및 Ⅱb 에 결합하는 OX40L HuMab 의 잠재성

IgG-유도성 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 은 효과기 세포 상의 Fcγ 수용체 (FcγR) 에 의해 매개된다. 본 발명의 항체가 FcγR 에 결합하는 능력을 측정하기 위해, 인간 FcγRⅠ, FcγRⅡa, FcγRⅡb 로 안정하게 트랜스펙션시킨 ⅡA1.6 세포 (ⅡA1 세포로부터 한정 희석에 의해 유래됨 ; Jones, B., 등, J. Immunol. 136 (1986) 348-356) 및 야생형 세포를 단계 희석시킨 항체 및 대조군 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 네거티브 대조군으로서, FcγRⅠ 에 결합하지 않는 인간 IgG2 (The Binding Site Ltd., UK), 및 FcγRⅡ 에 결합하지 않는 인간 IgG4 (The Binding Site) 를 사용하였다. 인간 IgG1 (The Binding Site) 를 FcγRⅠ 결합을 위한 포지티브 대조군으로서 포함하고, IgG3 (The Binding Site) 을FcγRⅡ 결합을 위한 포지티브 대조군으로서 포함하였다. 피코에리트린 (PE) 과 공액된 인간 IgG 에 대해 직접적인 항체를 사용해 FACS 분석하여 결합된 항체를 검출하였다. 테스트되는 HuMab 10 μg/ml (Bmax) 에서의 EC50 값 또는 최대 결합에 관한 계산을 Graphpad Prism 소프트웨어를 사용해 비선형 회귀 커브 조정 (가변 경사) 을 사용해 측정하였다.

LC.001 은 0.11±0.03 μg/ml 의 EC50 값 및 8041.54 의 Bmax (MFI) 값으로 나타난 바와 같이, FcγRⅠ 에 효율적으로 (대조군 IgG1 항체에 필적함) 결합할 수 있었으나, 각각 25.06 및 21.18 의 Bmax (MFI) 값이 나타낸 바와 같이, FcγRⅡa 및 FcγRⅡb 에는 결합할 수 없었다.

LC.001IgG4x 는 0.86±0.12 μg/ml 의 EC50 값 및 6030.07 의 Bmax (MFI) 값을 가졌는데, 이는 LCOO1 과 비교해 FcγRⅠ 에의 결합이 덜 효율적이었고, 대조군 IgG4 항체에 필적하였다. LC.001 IgG4x 의 FcγRⅡa 및 FcγRⅡb 에의 결합을 관찰할 수 없었고 (각각 21.40 및 19.27 의 Bmax (MFI) 값), 반면 대조군 IgG3 항체는 결합할 수 있었다 (각각 536.65 및 418.59 의 Bmax (MFI) 값) (도 10). 따라서, FcγRⅠ 에의 결합에 대한 EC50 값은 항체 LC.001 의 EC50 값에 비해 LC001IgG4x 에 대해서는 8 배였다.

실시예 21

NK 세포 상의 Fc γRⅢa 에 결합하는 OX40L HuMab 의 잠재성

자연살해 (NK) 세포 상의 FcγRⅢA (CD16) 에 결합하는 본 발명 항체의 능력을 측정하기 위해, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs) 를 단리하고, FcγRⅢa (항-CD16, 클론 3G8, RDI, Flanders, NJ) 에 대한 차단 마우스 항체 20 μg/ml 의 존재 또는 부재 하에 HuMab 항체 및 대조군 항체 20 μg/ml 와 함께 인큐베이션시켜, FcγRⅢa 를 통한 결합을 증명하였다. 네거티브 대조군으로서, FcγRⅢa 에 결합하지 않는 인간 IgG2 및 IgG4 (The Binding Site) 를 사용하였다. 인간 IgG1 및 IgG3 (The Binding Site) 를 FcγRⅢa 결합에 대한 포지티브 대조군으로서 포함하였다. FITC-표지 염소 F(ab)₂ 항-인간 IgG (Fc) 항체 (Protos immunoresearch, Burlingame, CA) 와 병용하여 PE-표지 마우스 항-인간 CD56 (NK-세포 표면 마커) 항체 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) 를 사용하여 FACS 분석해, NK 세포 상에 결합된 항체를 검출하였다. 테스트된 HuMab 20 μg/ml (Bmax) 에서의 최대 결합을 측정하였다.

LC.001 은 641.37 의 Bmax (MFI) 값으로 나타난 바와 같이, FcγRⅢa 에 효율적으로 결합할 수 있었다 (대조군 IgG1 항체에 필적함). FcγRⅢa 에 대한 차단 항체를 첨가하면, NK 세포 (145.38 의 배경 염색과 비교해 194.61 의 Bmax (MFI) 값) 에의 LC.001 의 결합을 없앴다. LC.001 IgG4x 는 FcγRⅢa 에 결합하지 않았고, 170.52 의 Bmax (MFI) 값을 가지고 대조군 IgG4 항체에 필적하게 거동하여, LC.001 의 Bmax 의 단지 약 10% 인 LC.001 IgG4x 의 Bmax 를 초래하였다. FcγRⅢa 에 대한 차단 항체를 첨가하면, LC.001 IgG4x 결합 (Bmax (MFI) 값 174.26) 에 대해 아무런 영향을 주지 않았다 (도 11).

실시예 22

HUVEC (원래의 인간 제대 정맥 내피 세포/ Promocell ) 에의 hMab _ hOX40L 및 Mab TAC-34 의 결합 효과

내피 세포는 hOX40L 를 발현하는 것으로 기술되어 있었다 (Kotani, A., 등, Immunol. Lett. 84 (2002) 1-7). 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC) 는 hOX40L 를 자연 발현하고, 따라서 "내피 세포 모델" 로서 사용할 수 있었다. 상기 어세이의 목적은 항체 TAG-34 및 LC.001 에 결합한 후 HUVEC 세포 상에서의 hOX40L 의 운명을 알아보는 것이었다.

HUVEC 을 해동시키고, T175-플라스크 (Sarstedt) 내에서 ECG-M 배지 + 2% FCS 에서 4 일 동안 증식시켰다. 세포를 24-웰 플레이트에 플레이팅하였다 (10.000 세포/웰).

3 일 후에, 배지를 ECG-M + 0.5 % FCS 로 교환하였다. 항체 (하위-조정을 유도하기 위한 <KLH> (Keyhole Limpet Hemocyanin 에 대한 항체), TAG-34 또는 LC.001) 를 10 μg/ml 에서 2.5 h 또는 24 h 동안 인큐베이션시켰다. TAG-34 또는 LC.001 로 HUVEC 세포를 재염색하였다. 각각 10 μg/ml 로 Alexa488 (=<m>) 로 표지된 쥣과 IgG 에 대한 2 차 항체 또는 Alexa488 (= <h>) 로 표지된 인간 IgG 에 대한 2 차 항체로 FACS-염색을 하였다. FACS-scan (Becton Dickinson) 에서 FACS-측정을 하고, 평균 형광 밀도 (MFI) 를 계산하였다.

<KLH> 항체를 비특이적, 네거티브 대조군으로서 사용하였다.

표 7 은, LC.001 의 첨가가 2.5 시간 또는 24 시간 후에 HUVEC 세포 상에서의 OX40L 발현의 하위-조정을 초래하지 않음을 보여준다 (라인 4 를 라인 5 및 라인 6 과 비교). 그러나, 태그 34 의 첨가는 2.5 시간 후의 웰에서뿐만 아니라 24 시간 후의 웰에서 (라인 10 을 라인 11 및 라인 12 와 비교) HUVEC 세포 상의 hOX40L 의 강한 (약 3-배) 하향-조정을 나타내었다.

본 발명에 따른 항체는 10 μg/ml 의 농도에서는 HUVEC 세포 상의 OX40L 발현을 하향조정하는 것을 유도하지 않았다.

하향조정에 사용되는 Mab	염색에 사용되는 Mab	FACS 를 위한 2 차 Mab	MFI 2.5 시간	MFI 24 시간
1. 배지 대조군	-	<h>	5.17	5.39
2. 배지 대조군	LC.001	<h>	28.52	24.99
3. <KLH>	-	<h>	4.76	4.74
4. <KLH>	LC.001	<h>	31.44	23.07
5. LC.001	-	<h>	36.52	30.78
6. LC.001	LC.001	<h>	38.58	38.69
7. 배지-대조군	-	<m>	3.66	3.18
8. 배지-대조군	TAG-34	<m>	31.81	25.32
9. <KLH>	-	<m>	3.68	3.43
10. <KLH>	TAG-34	<m>	30.79	31.58
11. TAG-34	-	<m>	9.44	7.39
12. TAG-34	TAG-34	<m>	8.97	14.89

실시예 23

TAG34 , LC .001 및 LC . 005 의 웨스턴 블롯 분석

40 및 100 ng hOx40L-His (R&D Systems, 이론적 크기가 28 - 34 kDa) 및 분자량 마커 Magik Mark XP (Invitrogen ; 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120, 220 kDa) 를 젤-전기영동을 위해 제조하였다. 따라서, x μl 단백질, 2.5 μl NuPage LDS (도데실 술페이트의 리튬염) 샘플 완충액 (4 x), 1 μl NuPage 환원제 (1Ox), 및 10 μl 이 되게 하는 H₂O 를 함께 넣고, 70℃ 에서 10 분 동안 변성시켰다. 그런 후, 샘플을 NuPage 젤 (Novex; 10% Bis-Tris) 상에 로딩하고, 1 x MOPS 진행 완충액 (Novex) 중에서 150V 에서 1 시간 동안 진행시켰다.

PVDF 막 (Millipore ; 메탄올에서 5 분 인큐베이션, 및 1 x 이동 완충액에서 10 분 동안 인큐베이션시켜서 막을 활성화시킴) 에 Semi-Dry-Blot 에 의해 1 x NuPage 이동 완충액 (1 x 완충액, 0.1% Antioxidance, 10% 메탄올) 을 사용해 반건조 챔버 내에서 1 시간/50 mA 동안 젤을 블랏시켰다. 1 x PBS/5% 밀크/0.5% Tween 에서 RT 에서 1 시간 동안 흔들어서 막을 차단시켰다. 1 차 항체 (pAB) 를 1 x PBS/1% 밀크/0.5 % Tween 중에 희석시키고, 첨가하고, 4℃ 에서 밤새 인큐베이션시켰다.

LC.001 : 총 4 ml 의 부피에서 1.9 μl ( 1.6 μg)

LC.005 : 1.1 μl (1.6 μg)/4 ml

TAG34 : 1.6 μl (1.6 μg)/4 ml

막을 1 x PBS/0.5% Tween 중에서 10 분 동안 3 회 세척하였다. 2 차 항체 (sAB) 를 1 x PBS/1% 밀크/0.5 % Tween 중에서 희석시키고, 첨가하고, RT 에서 1.5 시간 동안 인큐베이션시켰다. LC.001 및 LC.005 에 대해, 1 : 10000 희석액 중의 인간 IgG (Pierce) 에 대한 다중클론 항체를 sAB 로서 사용하고 ; 1 : 400 희석액 중의 Lumi-Light Western Blotting Kit (Roche) 사의 마우스 IgG 에 대한 TAG34 다중클론 항체를 sAB 로서 사용하였다. 막을 1 x PBS/0.5 % Tween 으로 30 분 동안 2 회 세척하였다. 검출을 위해 제조업자의 지시에 따라 Lumi-Light Western Blotting Kit (Roche) 를 사용하였다. 웨스턴 블랏의 결과를 도 12 에 나타내었다. LC.001 은 (도데실 술페이트) 변성 OX40L 를 검출할 수 있는 반면, LC.005 및 TAG34 는 변성 OX40L 에 결합하지 않는다.

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Ser Ser Trp Tyr Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 65 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain of LC.005 <400> 65 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 66 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain of LC.060 (human IgG1 type) <400> 66 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Leu Ile Ser Gly Ser Gly Gly Leu Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Arg Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Ile Leu Val Thr Gly Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 67 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain LC.060 (L234A, L235A human IgG1 mutant) <400> 67 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Leu Ile Ser Gly Ser Gly Gly Leu Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Arg Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Ile Leu Val Thr Gly Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 68 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain of LC.060 (S228P human IgG4 mutant) <400> 68 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Leu Ile Ser Gly Ser Gly Gly Leu Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Arg Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Ile Leu Val Thr Gly Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 69 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain of LC.060 <400> 69 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Val Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Trp Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims

인간 OX40L 에 결합하고, 인간 기원 유래의 Fc 부분을 함유하고, 보체 인자 C1q 에 결합하지 않으며, 하기의 가변 영역 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체:

a) 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 에 의해 한정되는 경쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:2 에 의해 한정되는 중쇄 가변 도메인 ; 또는

b) 아미노산 서열 SEQ ID NO:3 에 의해 한정되는 경쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:4 에 의해 한정되는 중쇄 가변 도메인 ; 또는

c) 아미노산 서열 SEQ ID NO:5 에 의해 한정되는 경쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:6 에 의해 한정되는 중쇄 가변 도메인 ; 또는

d) 아미노산 서열 SEQ ID NO:7 에 의해 한정되는 경쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:8 에 의해 한정되는 중쇄 가변 도메인 ; 또는

e) 아미노산 서열 SEQ ID NO:9 에 의해 한정되는 경쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO: 10 에 의해 한정되는 중쇄 가변 도메인 ; 또는

f) 아미노산 서열 SEQ ID NO:11 또는 16 에 의해 한정되는 경쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO: 12 에 의해 한정되는 중쇄 가변 도메인 ; 또는

g) 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 에 의해 한정되는 경쇄 (V_L) 가변 도메인 및 SEQ ID NO: 17 에 의해 한정되는 중쇄 (V_H) 가변 도메인 ; 또는

h) 아미노산 서열 SEQ ID NO:18 에 의해 한정되는 경쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO: 19 에 의해 한정되는 중쇄 가변 도메인 ; 또는

i) 아미노산 서열 SEQ ID NO:1 에 의해 한정되는 경쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:20 에 의해 한정되는 중쇄 가변 도메인.
제 1 항에 있어서, NK 세포 상의 인간 Fcγ 수용체에 결합하지 않는 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 인간 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 키메라성 또는 인간화된 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 10^-8 M 미만의 K_D 값으로 OX40L 에 결합하는 항체.
제 5 항에 있어서, K_D 범위가 10^-12 내지 10^-9 M 인 항체.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, PVA236, GLPSS331 및/또는 L234A/L235A (EU 지침에 따라 넘버링) 로부터의 하나 이상의 돌연변이(들) 를 함유하는 인간 하위부류 IgG1 의 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 인간 하위부류 IgG4 의 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
제 8 항에 있어서, 돌연변이 S228P 를 함유하는 것을 특징으로 하는 항체.
제 8 항에 있어서, 돌연변이 L235E 를 함유하는 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 보체 인자 C3 을 활성화시키지 않는 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 보체-의존성 세포독성 (CDC) 을 유도하지 않는 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 을 유도하지 않는 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 0.5 μg/ml OX40L 의 코팅 농도에서 고정된 OX40L 와 용해성 OX40 과의 상호작용을 1 nM - 4 nM 범위의 IC50 값으로 차단함으로써 ELISA 어세이 억제를 나타내는 것을 특징으로 하는 항체.
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제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 보체 인자 C1q 에의 비-결합을 야기하는, Fc 부분에서의 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, SEQ ID NO: 13 에 의해 한정되는 카파 경쇄 불변 영역 또는 SEQ ID NO: 61, 65 또는 69 의 경쇄 불변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, SEQ ID NO: 14 또는 SEQ ID NO: 15 에 의해 한정되는 중쇄 불변 영역 또는 SEQ ID NO:58 의 중쇄 불변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
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제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, Fab, F(ab')₂ 또는 단일-사슬 절편인 것을 특징으로 하는 항체.
10^-8 M 미만의 K_D 값으로 OX40L 에 결합하는 항체의 중쇄를 인코딩하는 첫번째 핵산의 서열을, 상기 항체가 보체 인자 C1q 및/또는 NK 세포 상의 인간 Fcγ 수용체에 결합하지 않도록 개질하고, 상기 첫번째 핵산 및 상기 항체의 경쇄를 인코딩하는 두번째 핵산을 발현 벡터에 삽입하고, 상기 벡터를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 삽입하고, 상기 숙주 세포를 상기 항체를 합성할 수 있는 조건 하에 배양하고, 상기 항체를 상기 배양액으로부터 회수하는 것을 특징으로 하는, 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 항체의 제조 방법.
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제 1 항 또는 제 2 항의 항체 분자를 인코딩하는 핵산 분자.
제 28 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
제 29 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제 1 항 또는 제 2 항의 항체 분자의 제조 방법으로서, 상기 항체 분자를 합성할 수 있는 조건 하에 상기 항체 분자를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 상기 배양액으로부터 상기 항체 분자를 회수하는 것을 포함하는 방법.
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제 1 항 또는 제 2 항에서 정의된 항체를 포함하는 염증성 장애의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에서 정의된 항체를 염증성 장애의 예방 및 치료용 약제를 제조하는데 사용하는 방법.
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OX40L 에 결합하고, 인간 IgG1 부류이며, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 :

a) γ 중쇄로서 SEQ ID NO: 58 및 카파 경쇄로서 SEQ ID NO: 61,

b) γ 중쇄로서 SEQ ID NO: 62 및 카파 경쇄로서 SEQ ID NO: 65, 또는

c) γ 중쇄로서 SEQ ID NO: 66 및 카파 경쇄로서 SEQ ID NO: 69.
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