JP5371780B2

JP5371780B2 - Ｃｘｃｒ３に対するヒト化抗体

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Publication number: JP5371780B2
Application number: JP2009548398A
Authority: JP
Inventors: ロジャースミス; パラニサミーカナカラジ; ビクターロシケ
Original assignee: テババイオファーマシューティカルズユーエスエーインコーポレーティッド
Priority date: 2007-02-01
Filing date: 2008-01-29
Publication date: 2013-12-18
Anticipated expiration: 2028-01-29
Also published as: AU2008210589B2; WO2008094942A2; US20100047238A1; KR20100014869A; AU2008210589A1; CN101796073A; US20130274447A1; US8435522B2; IL199974A0; WO2008094942A8; JP2010517531A; WO2008094942A3; EP2115006A2; CN101796073B; CA2677163A1

Description

関連出願の相互参照
本願は、2007年2月1日出願の米国仮出願第60/898,709号に基づく優先権を主張し、その開示は、参照により完全に本明細書に組み入れられる。

背景
ケモカインとそれらの受容体との間の相互作用は、白血球遊走の制御における重要な段階である。ケモカインは、細胞関連サイトカイン応答の誘導および増強を含む、走化性とは無関係の多様な効果も媒介する。

ヒト細胞表面タンパク質CD183は、IP10（インターフェロン-gにより誘導可能な10kDaタンパク質）、Mig（インターフェロン-gにより誘導されるモノカイン）、およびI-TAC（インターフェロンにより誘導可能なT細胞a-化学誘引物質）を含む3種のケモカインに対する選択性を有するGタンパク質共役型受容体である。これらの3種のケモカインは、単一のアミノ酸残基が4個の高度に保存されたCys残基の最初の2個を分離している、「CXC」ケモカインの構造サブファミリーに属する。歴史的に、CD183は3番目に発見されたCXCケモカイン受容体であり、従って、CD183は「CXCR3」と一般的に名付けられている。CXCR3へのケモカインの結合は、白血球輸送に関与している細胞応答、最も顕著には、インテグリン活性化、細胞骨格変化、および走化性遊走を誘導する。CXCR3は、エフェクター／メモリーT細胞上、および／または多くの型の炎症組織に存在するT細胞（例えば、T-ヘルパー1細胞またはTh1細胞およびCD8⁺Tc1細胞）に発現されている。さらに、IP10、Mig、およびI-TACは、炎症巣の局所細胞により一般的に産生され、このことは、CXCR3およびそのケモカインが、炎症部位への白血球の動員に参与することを示唆している。従って、CXCR3は、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患、乾癬、1型糖尿病、および移植片拒絶のような多様な炎症性および免疫性の疾患および障害の処置および診断において使用され得る抗体およびアンタゴニストの開発のための標的である。CXCR3は、B細胞リンパ腫のサブセットに発現されているため、CXCR3は、リンパ腫および白血病の処置および診断のための標的ともなり得る。

概要
ケモカイン受容体CXCR3（GenBank gi：4504099参照）に特異的に結合する抗原結合ポリペプチド分子が開示される。ポリペプチドは、ヒト化重鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域を含む。例えば、ポリペプチドは、親モノクローナル抗体の抗原結合特異性を実質的に保持しつつ、ヒト抗体の軽鎖および重鎖の可変領域のフレームワーク（FR）領域を含み得る。ヒト化重鎖可変領域および／またはヒト化軽鎖可変領域は、CDRを除き、少なくとも約90％ヒト化（好ましくは少なくとも約95％ヒト化、より好ましくは少なくとも約98％ヒト化、さらに好ましくは少なくとも約100％ヒト化）されている。抗原結合ポリペプチド分子は、モノクローナル抗体ドナー（例えば、マウスモノクローナル抗体ドナー）に由来し得、モノクローナル抗体に由来するCDR（例えば、マウスモノクローナルCDR）を含み得る。ポリペプチドは、CXCR3受容体のアンタゴニストとして機能し得る。

いくつかの態様において、抗原結合ポリペプチドは、CXCR3に特異的に結合し、かつ
（a）
（1）

のアミノ酸配列を含むCDR-H1；
（2）

のアミノ酸配列を含むCDR-H2；および
（3）

のアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含むヒト化抗体重鎖可変領域と、
（b）
（1）

のアミノ酸配列を含むCDR-L1；
（2）

のアミノ酸配列を含むCDR-L2；および
（3）

のアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含むヒト化抗体軽鎖可変領域と
を含む。ポリペプチドは、

のアミノ酸配列を含むCDR-H3を含み得る。

いくつかの態様において、
（1）CDR-H1は

のアミノ酸配列からなり；
（2）CDR-H2は

のアミノ酸配列からなり；
（3）CDR-H3は

のアミノ酸配列からなり；
（4）CDR-L1は

のアミノ酸配列からなり；
（5）CDR-L2は

のアミノ酸配列からなり；かつ
（6）CDR-L3は

のアミノ酸配列からなる。例えば、CDR-H3は

のアミノ酸配列からなり得る。

いくつかの態様において、ポリペプチドは、

のヒト化抗体重鎖可変領域を含む。例えば、ポリペプチドは、

のヒト化抗体重鎖可変領域を含み得る。いくつかの態様において、ポリペプチドは、

のヒト化抗体軽鎖可変領域を含む。例えば、ポリペプチドは、

のヒト化抗体軽鎖可変領域を含み得る。

ヒト化抗体重鎖可変領域も開示される。ヒト化抗体重鎖領域は、
（1）

のアミノ酸配列を含むCDR-H1；
（2）

のアミノ酸配列を含むCDR-H2；および
（3）

のアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含み得る。例えば、ヒト化抗体重鎖可変領域は

のアミノ酸配列を含み得る。

別の例において、ヒト化抗体重鎖可変領域は、
（1）

のアミノ酸配列を含むCDR-H1；
（2）

のアミノ酸配列を含むCDR-H2；および
（3）

のアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含む。例えば、ヒト化抗体重鎖可変領域は

のアミノ酸配列を含み得る。

別の例において、ヒト化抗体重鎖可変領域は、
（1）

のアミノ酸配列を含むCDR-H1；
（2）

のアミノ酸配列を含むCDR-H2；および
（3）

のアミノ酸配列を含み得る。

別の例において、ヒト化抗体重鎖可変領域は、
（1）

のアミノ酸配列を含むCDR-H1；
（2）

のアミノ酸配列を含むCDR-H2；および
（3）

のアミノ酸配列を含み得る。

別の例において、ヒト化抗体重鎖可変領域は、
（1）

のアミノ酸配列を含むCDR-H1；
（2）

のアミノ酸配列を含むCDR-H2；および
（3）

のアミノ酸配列を含み得る。

別の例において、ヒト化抗体重鎖可変領域は、
（1）

のアミノ酸配列を含むCDR-H1；
（2）

のアミノ酸配列を含むCDR-H2；および
（3）

のアミノ酸配列を含み得る。

ヒト化抗体軽鎖可変領域も開示される。ヒト化抗体軽鎖領域は、
（1）

のアミノ酸配列を含むCDR-L1；
（2）

のアミノ酸配列を含むCDR-L2；および
（3）

のアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含み得る。例えば、ヒト化抗体軽鎖可変領域は

のアミノ酸配列を含み得る。

別の例において、ヒト化抗体軽鎖可変領域は、
（1）

のアミノ酸配列を含むCDR-L1；
（2）

のアミノ酸配列を含むCDR-L2；および
（3）

のアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含む。例えば、ヒト化抗体軽鎖可変領域は

のアミノ酸配列を含み得る。

別の例において、ヒト化抗体軽鎖可変領域は、
（1）

のアミノ酸配列を含むCDR-L1；
（2）

のアミノ酸配列を含むCDR-L2；および
（3）

のアミノ酸配列を含み得る。

別の例において、ヒト化抗体軽鎖可変領域は、
（1）

のアミノ酸配列を含むCDR-L1；
（2）

のアミノ酸配列を含むCDR-L2；および
（3）

のアミノ酸配列を含み得る。

別の例において、ヒト化抗体軽鎖可変領域は、
（1）

のアミノ酸配列を含むCDR-L1；
（2）

のアミノ酸配列を含むCDR-L2；および
（3）

のアミノ酸配列を含み得る。

別の例において、ヒト化抗体軽鎖可変領域は、
（1）

のアミノ酸配列を含むCDR-L1；
（2）

のアミノ酸配列を含むCDR-L2；および
（3）

のアミノ酸配列を含み得る。

別の例において、ヒト化抗体軽鎖可変領域は、
（1）

のアミノ酸配列を含むCDR-L1；
（2）

のアミノ酸配列を含むCDR-L2；および
（3）

のアミノ酸配列を含み得る。

別の例において、ヒト化抗体軽鎖可変領域は、
（1）

のアミノ酸配列を含むCDR-L1；
（2）

のアミノ酸配列を含むCDR-L2；および
（3）

のアミノ酸配列を含み得る。

上記のヒト化重鎖およびヒト化軽鎖は、CXCR3に特異的に結合する抗原結合ポリペプチドに存在し得る。

抗原結合ポリペプチドは、抗体分子、Fab断片、Fab'断片、F(ab')₂断片、およびscFv分子からなる群より選択され得る。いくつかの態様において、ポリペプチドは抗体分子である。抗体分子は、ヒト重鎖定常領域とヒト軽鎖定常領域とを含むキメラ抗体であり得る。例えば、抗体分子は、ポリペプチドがIgG分子の重鎖および軽鎖の定常ドメインを含む、IgG分子（例えば、IgG1分子またはIgG4分子）であり得る。ポリペプチドはscFv分子であり得る。例えば、scFvは、NH₂-L-VH-X-VK-COOHおよびNH₂-L-VK-X-VH-COOHからなる群より選択される式を有し得、式中、Lはリーダー配列であり；VHはヒト化抗体重鎖可変領域であり；Xは連結ポリペプチドであり；かつVKはヒト化抗体軽鎖可変領域である。

抗原結合ポリペプチドは、さらに、治療剤または診断剤と結合または融合していてもよい。例えば、治療剤は、細胞障害剤、放射性標識、免疫調節剤、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光活性治療剤、またはそれらの組み合わせからなる群より選択され得る。診断剤の例には、放射性標識、光活性診断剤、超音波増強剤、または非放射性標識が含まれ得る。

抗原結合ポリペプチドは、CXCR3のアンタゴニストであり得る。典型的には、ポリペプチドはCXCR3のアゴニストではない。

抗原結合ポリペプチドは、特異性および高い親和性でCXCR3受容体に結合する。典型的には、ポリペプチドは、少なくとも約10⁶M^-1（好ましくは少なくとも約10⁷M^-1、より好ましくは少なくとも約10⁸M^-1、さらに好ましくは少なくとも約10⁹M^-1）の親和性定数でCXCR3に結合する。

上記抗原結合ポリペプチドと担体（例えば、希釈剤または賦形剤）とを含む薬学的組成物も開示される。薬剤は、本明細書に開示されるような付加的な治療剤または診断剤をさらに含んでいてもよい。

開示された薬学的組成物をその必要がある患者に投与する段階を含む、疾患または状態を処置または診断する方法も開示される。例えば、薬学的組成物は、炎症性、免疫性、および／または悪性の疾患または状態を処置または診断するために投与され得る。疾患または状態の例には、自己免疫疾患（例えば、狼瘡）、炎症性腸疾患（IBD）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、関節炎（例えば、関節リウマチ）、多発性硬化症、移植片拒絶、中枢神経系損傷、クローン病、乾癬、1型糖尿病、および白血病またはリンパ腫（例えば、慢性リンパ球性白血病（CLL））が含まれ得る。

上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも開示される。ポリヌクレオチドは、コードポリペプチドを適当な宿主細胞において発現させるために、プロモーターと機能的に連結され得る。従って、組換えポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを作製する方法は、（a）組換えポリヌクレオチドにより形質転換された細胞を培養して、コードポリペプチドを発現させる段階；および（b）そのように発現されたポリペプチドを回収する段階を含み得る。
[請求項101]
(a)
(1)

のアミノ酸配列を含むCDR-H1;
(2)

のアミノ酸配列を含むCDR-H2;および
(3)

のアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含むヒト化抗体重鎖可変領域と、
(b)
(1)

のアミノ酸配列を含むCDR-L1;
(2)

のアミノ酸配列を含むCDR-L2;および
(3)

のアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含むヒト化抗体軽鎖可変領域と
を含む、CXCR3に特異的に結合する抗原結合ポリペプチド。
[請求項102]
CDR-H3が、

のアミノ酸配列を含む、請求項101記載のポリペプチド。
[請求項103]
CDR-H3が、

のアミノ酸配列を含む、請求項101または102記載のポリペプチド。
[請求項104]
(1)CDR-H1が

のアミノ酸配列からなり;
(2)CDR-H2が

のアミノ酸配列からなり;
(3)CDR-H3が

のアミノ酸配列からなり;
(4)CDR-L1が

のアミノ酸配列からなり;
(5)CDR-L2が

のアミノ酸配列からなり;かつ
(6)CDR-L3が

のアミノ酸配列からなる、
請求項101〜103のいずれか一項記載のポリペプチド。
[請求項105]
CDR-H3が

のアミノ酸配列からなる、請求項101〜104のいずれか一項記載のポリペプチド。
[請求項106]
ヒト化抗体重鎖可変領域が

のアミノ酸配列を含む、請求項101〜105のいずれか一項記載のポリペプチド。
[請求項107]
ヒト化抗体重鎖可変領域が

のアミノ酸配列を含む、請求項106記載のポリペプチド。
[請求項108]
ヒト化抗体軽鎖可変領域が

のアミノ酸配列を含む、請求項101〜107のいずれか一項記載のポリペプチド。
[請求項109]
ヒト化抗体軽鎖可変領域が

のアミノ酸配列を含む、請求項108記載のポリペプチド。
[請求項110]
ヒト化抗体軽鎖可変領域が

のアミノ酸配列を含む、請求項108記載のポリペプチド。
[請求項111]
抗体分子、Fab断片、Fab'断片、F(ab') ₂ 断片、およびscFv分子からなる群より選択される、請求項101〜110のいずれか一項記載のポリペプチド。
[請求項112]
分子が抗体分子である、請求項111記載のポリペプチド。
[請求項113]
抗体が、ヒト重鎖定常領域とヒト軽鎖定常領域とを含むキメラ抗体である、請求項112記載のポリペプチド。
[請求項114]
抗体が、IgG分子(例えば、IgG1分子またはIgG4分子)である、請求項112または113記載のポリペプチド。
[請求項115]
scFv分子である、請求項101記載のポリペプチド。
[請求項116]
scFvがNH ₂ -L-VH-X-VK-COOHおよびNH ₂ -L-VK-X-VH-COOHからなる群より選択される式を有し、式中、Lはリーダー配列であり;VHはヒト化抗体重鎖可変領域であり;Xは連結ポリペプチドであり;かつVKはヒト化抗体軽鎖可変領域である、請求項115記載のポリペプチド。
[請求項117]
治療剤または診断剤と結合している、請求項101〜116のいずれか一項記載のポリペプチド。
[請求項118]
治療剤が、細胞障害剤、放射性標識、免疫調節剤、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光活性治療剤、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項117記載のポリペプチド。
[請求項119]
診断剤が、放射性標識、光活性診断剤、超音波増強剤、または非放射性標識からなる群より選択される、請求項117記載のポリペプチド。
[請求項120]
CXCR3のアンタゴニストである、請求項101〜119のいずれか一項記載のポリペプチド。
[請求項121]
CXCR3のアゴニストではない、請求項101〜120のいずれか一項記載のポリペプチド。
[請求項122]
少なくとも約10 ⁶ M ^-1 (好ましくは少なくとも約10 ⁷ M ^-1 、より好ましくは少なくとも約10 ⁸ M ^-1 、さらに好ましくは少なくとも約10 ⁹ M ^-1 )の親和性定数でCXCR3に結合する、請求項101〜121のいずれか一項記載のポリペプチド。
[請求項123]
請求項101〜122のいずれか一項記載のポリペプチドと担体とを含む、薬学的組成物。
[請求項124]
付加的な治療剤または診断剤をさらに含む、請求項123記載の薬学的組成物。
[請求項125]
請求項123または124記載の組成物をその必要がある患者に投与する段階を含む、炎症性の疾患または状態を処置または診断する方法。
[請求項126]
請求項123または124記載の組成物をその必要がある患者に投与する段階を含む、免疫性の疾患または状態を処置または診断する方法。
[請求項127]
請求項123または124記載の組成物をその必要がある患者に投与する段階を含む、悪性の疾患または状態を処置または診断する方法。
[請求項128]
疾患または状態が、自己免疫疾患(例えば、狼瘡)、炎症性腸疾患(IBD)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、関節炎(例えば、関節リウマチ)、多発性硬化症、移植片拒絶、中枢神経系損傷、クローン病、乾癬、および白血病またはリンパ腫(例えば、慢性リンパ球性白血病(CLL))からなる群より選択される、請求項125〜127のいずれか一項記載の方法。
[請求項129]
請求項101〜122のいずれか一項記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
[請求項130]
(1)

のアミノ酸配列を含むCDR-H1;
(2)

のアミノ酸配列を含むCDR-H2;および
(3)

のアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含むヒト化抗体重鎖可変領域を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
[請求項131]
ヒト化抗体重鎖可変領域が

のアミノ酸配列を含む、請求項130記載のポリヌクレオチド。
[請求項132]
ヒト化抗体重鎖可変領域が

のアミノ酸配列を含む、請求項131記載のポリヌクレオチド。
[請求項133]
(1)

のアミノ酸配列を含むCDR-L1;
(2)

のアミノ酸配列を含むCDR-L2;および
(3)

のアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含むヒト化抗体軽鎖可変領域を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
[請求項134]
ヒト化抗体軽鎖可変領域が

のアミノ酸配列を含む、請求項133記載のポリヌクレオチド。
[請求項135]
ヒト化抗体軽鎖可変領域が

のアミノ酸配列を含む、請求項134記載のポリヌクレオチド。
[請求項136]
ヒト化抗体軽鎖可変領域が

のアミノ酸配列を含む、請求項134記載のポリヌクレオチド。
[請求項137]
請求項129〜136のいずれか一項記載のポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーター配列を含む、組換えポリヌクレオチド。
[請求項138]
請求項137記載のポリヌクレオチドにより形質転換された、単離された細胞。
[請求項139]
以下の段階を含む、請求項137記載の組換えポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを作製する方法:
(a)組換えポリヌクレオチドにより形質転換された細胞を培養して、コードポリペプチドを発現させる段階;および
(b)そのように発現されたポリペプチドを回収する段階。
[請求項140]
(1)

のアミノ酸配列を含むCDR-H1;
(2)

のアミノ酸配列を含むCDR-H2;および
(3)

のアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含む、ヒト化抗体重鎖可変領域。
[請求項141]

のアミノ酸配列を含む、請求項140記載のヒト化抗体重鎖可変領域。
[請求項142]
(1)

のアミノ酸配列を含むCDR-H1;
(2)

のアミノ酸配列を含むCDR-H2;および
(3)

のアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含む、ヒト化抗体重鎖可変領域。
[請求項143]

のアミノ酸配列を含む、請求項142記載のヒト化抗体重鎖可変領域。
[請求項144]
(1)

のアミノ酸配列を含むCDR-H1;
(2)

のアミノ酸配列を含むCDR-H2;および
(3)

のアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含む、ヒト化抗体重鎖可変領域。
[請求項145]

のアミノ酸配列を含む、請求項144記載のヒト化抗体重鎖可変領域。
[請求項146]
(1)

のアミノ酸配列を含むCDR-H1;
(2)

のアミノ酸配列を含むCDR-H2;および
(3)

のアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含む、ヒト化抗体重鎖可変領域。
[請求項147]

のアミノ酸配列を含む、請求項146記載のヒト化抗体重鎖可変領域。
[請求項148]
(1)

のアミノ酸配列を含むCDR-H1;
(2)

のアミノ酸配列を含むCDR-H2;および
(3)

のアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含む、ヒト化抗体重鎖可変領域。
[請求項149]

のアミノ酸配列を含む、請求項148記載のヒト化抗体重鎖可変領域。
[請求項150]
(1)

のアミノ酸配列を含むCDR-H1;
(2)

のアミノ酸配列を含むCDR-H2;および
(3)

のアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含む、ヒト化抗体重鎖可変領域。
[請求項151]

のアミノ酸配列を含む、請求項150記載のヒト化抗体重鎖可変領域。
[請求項152]
(1)

のアミノ酸配列を含むCDR-L1;
(2)

のアミノ酸配列を含むCDR-L2;および
(3)

のアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含む、ヒト化抗体軽鎖可変領域。
[請求項153]

のアミノ酸配列を含む、請求項152記載のヒト化抗体軽鎖可変領域。
[請求項154]
(1)

のアミノ酸配列を含むCDR-L1;
(2)

のアミノ酸配列を含むCDR-L2;および
(3)

のアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含む、ヒト化抗体軽鎖可変領域。
[請求項155]

のアミノ酸配列を含む、請求項154記載のヒト化抗体軽鎖可変領域。
[請求項156]
(1)

のアミノ酸配列を含むCDR-L1;
(2)

のアミノ酸配列を含むCDR-L2;および
(3)

のアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含む、ヒト化抗体軽鎖可変領域。
[請求項157]

のアミノ酸配列を含む、請求項156記載のヒト化抗体軽鎖可変領域。
[請求項158]
(1)

のアミノ酸配列を含むCDR-L1;
(2)

のアミノ酸配列を含むCDR-L2;および
(3)

のアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含む、ヒト化抗体軽鎖可変領域。
[請求項159]

のアミノ酸配列を含む、請求項158記載のヒト化抗体軽鎖可変領域。
[請求項160]
(1)

のアミノ酸配列を含むCDR-L1;
(2)

のアミノ酸配列を含むCDR-L2;および
(3)

のアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含む、ヒト化抗体軽鎖可変領域。
[請求項161]

のアミノ酸配列を含む、請求項160記載のヒト化抗体軽鎖可変領域。
[請求項162]
(1)

のアミノ酸配列を含むCDR-L1;
(2)

のアミノ酸配列を含むCDR-L2;および
(3)

のアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含む、ヒト化抗体軽鎖可変領域。
[請求項163]

のアミノ酸配列を含む、請求項162記載のヒト化抗体軽鎖可変領域。
[請求項164]
(1)

のアミノ酸配列を含むCDR-L1;
(2)

のアミノ酸配列を含むCDR-L2;および
(3)

のアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含む、ヒト化抗体軽鎖可変領域。
[請求項165]

のアミノ酸配列を含む、請求項164記載のヒト化抗体軽鎖可変領域。
[請求項166]
(1)

のアミノ酸配列を含むCDR-L1;
(2)

のアミノ酸配列を含むCDR-L2;および
(3)

のアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含む、ヒト化抗体軽鎖可変領域。
[請求項167]

のアミノ酸配列を含む、請求項166記載のヒト化抗体軽鎖可変領域。
[請求項168]
請求項140〜151のいずれか一項記載のヒト化重鎖および請求項152〜167のいずれか一項記載のヒト化軽鎖を含む、CXCR3に特異的に結合する抗原結合ポリペプチド。
[請求項169]
請求項148または149記載のヒト化重鎖および請求項164または165記載のヒト化軽鎖を含む、請求項168記載のポリペプチド。
[請求項170]
請求項148または149記載のヒト化重鎖および請求項164または165記載のヒト化軽鎖を含む、請求項68記載のポリペプチド。
[請求項171]
請求項148または149記載のヒト化重鎖および請求項154または155記載のヒト化軽鎖を含む、請求項168記載のポリペプチド。
[請求項172]
請求項148または149記載のヒト化重鎖および請求項156または157記載のヒト化軽鎖を含む、請求項168記載のポリペプチド。
[請求項173]
請求項148または149記載のヒト化重鎖および請求項158または159記載のヒト化軽鎖を含む、請求項168記載のポリペプチド。
[請求項174]
請求項148または149記載のヒト化重鎖および請求項160または161記載のヒト化軽鎖を含む、請求項168記載のポリペプチド。
[請求項175]
抗体分子、Fab断片、Fab'断片、F(ab') ₂ 断片、およびscFv分子からなる群より選択される、請求項168〜174のいずれか一項記載のポリペプチド。
[請求項176]
分子が抗体分子である、請求項175記載のポリペプチド。
[請求項177]
抗体が、ヒト重鎖定常領域とヒト軽鎖定常領域とを含むキメラ抗体である、請求項176記載のポリペプチド。
[請求項178]
抗体が、IgG分子(例えば、IgG1分子またはIgG4分子)である、請求項176または177記載のポリペプチド。
[請求項179]
分子がscFv分子である、請求項175記載のポリペプチド。
[請求項180]
scFvがNH ₂ -L-VH-X-VK-COOHおよびNH ₂ -L-VK-X-VH-COOHからなる群より選択される式を有し、式中、Lはリーダー配列であり;VHはヒト化抗体重鎖可変領域であり;Xは連結ポリペプチドであり;かつVKはヒト化抗体軽鎖可変領域である、請求項179記載のポリペプチド。
[請求項181]
治療剤または診断剤と結合している、請求項168〜180のいずれか一項記載のポリペプチド。
[請求項182]
治療剤が、細胞障害剤、放射性標識、免疫調節剤、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光活性治療剤、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項181記載のポリペプチド。
[請求項183]
診断剤が、放射性標識、光活性診断剤、超音波増強剤、または非放射性標識からなる群より選択される、請求項181記載のポリペプチド。
[請求項184]
CXCR3のアンタゴニストである、請求項168〜183のいずれか一項記載のポリペプチド。
[請求項185]
CXCR3のアゴニストではない、請求項168〜184のいずれか一項記載のポリペプチド。
[請求項186]
少なくとも約10 ⁶ M ^-1 (好ましくは少なくとも約10 ⁷ M ^-1 、より好ましくは少なくとも約10 ⁸ M ^-1 、さらに好ましくは少なくとも約10 ⁹ M ^-1 )の親和性定数でCXCR3に結合する、請求項168〜185のいずれか一項記載のポリペプチド。
[請求項187]
請求項168〜186のいずれか一項記載のポリペプチドと担体とを含む、薬学的組成物。
[請求項188]
付加的な治療剤または診断剤をさらに含む、請求項187記載の薬学的組成物。
[請求項189]
請求項187または188記載の組成物をその必要がある患者に投与する段階を含む、炎症性の疾患または状態を処置または診断する方法。
[請求項190]
請求項187または188記載の組成物をその必要がある患者に投与する段階を含む、免疫性の疾患または状態を処置または診断する方法。
[請求項191]
請求項187または188記載の組成物をその必要がある患者に投与する段階を含む、悪性の疾患または状態を処置または診断する方法。
[請求項192]
疾患または状態が、自己免疫疾患(例えば、狼瘡)、炎症性腸疾患(IBD)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、関節炎(例えば、関節リウマチ)、多発性硬化症、移植片拒絶、中枢神経系損傷、クローン病、乾癬、および白血病またはリンパ腫(例えば、慢性リンパ球性白血病(CLL))からなる群より選択される、請求項189〜191のいずれか一項記載の方法。
[請求項193]
請求項140〜151のいずれか一項記載のヒト化重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド。
[請求項194]
請求項152〜167のいずれか一項記載のヒト化軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド。
[請求項195]
請求項168〜186のいずれか一項記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
[請求項196]
請求項193〜195のいずれか一項記載のポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーター配列を含む、組換えポリヌクレオチド。
[請求項197]
請求項196記載のポリヌクレオチドにより形質転換された、単離された細胞。
[請求項198]
以下の段階を含む、請求項196記載の組換えポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを作製する方法:
(a)組換えポリヌクレオチドにより形質転換された細胞を培養して、コードポリペプチドを発現させる段階;および
(b)そのように発現されたポリペプチドを回収する段階。

Th1細胞への125I-IP-10の結合の、マウス抗CXCR3 mAbによる阻害を示す図である。Ab#1-5D4A；Ab#2-8A5A；Ab#3-19G2；Ab#4-V36E5A；Ab#5-V44D7A；Ab#6-37B5A；Ab#7-21A4A；Ab#8-V15F4A；Ab#9-V3G6A；Ab#10-23E12A；Ab#11-35C4；Ab#12-39E10。 IP-10により誘導されるTh1細胞遊走の、マウス抗CXCR3 mAbによる阻害を示す図である。Ab#1-5D4A；Ab#2-8A5A；Ab#3-19G2；Ab#4-V36E5A；Ab#5-V44D7A；Ab#6-37B5A；Ab#7-21A4A；Ab#8-V15F4A；Ab#9-V3G6A；Ab#10-23E12A。 Th1細胞（上パネル）、CXCR3+/NSO細胞（中央パネル）、およびCXCR-/NSO細胞（下パネル）へのマウス抗CXCR3 mAbの結合のFACs分析を示す図である。 CXCR3へのケモカインの結合の、マウス抗CXCR3 mAbおよびヒト化抗CXCR3 mAbによる阻害を示す図である。ケモカインにより媒介される走化性の、マウス抗CXCR3 mAbおよびヒト化抗CXCR3 mAbによる阻害を示す図である。 5つの抗CXCR3クローンのVHドメインのアラインメントを示す図である。 5つの抗CXCR3クローンのVKドメインのアラインメントを示す図である。抗CXCR3クローンV44D7のVHドメインの、最も近い発現されたヒトIgGおよび生殖系列VHとのアラインメントを示す図である。抗CXCR3クローンV44D7のVHドメインの完全なヒト化のために必要とされるアミノ酸変化のリスク評価を示す図である。必要とされるアミノ酸変化は、主配列の下に示され、ヒトVH3-23とのアラインメントから導出された。生殖系列遺伝子および発現された抗体はGenBankアクセッション番号AAD53829に記載される。抗CXCR3クローンV44D7のVHドメインの完全なヒト化のために必要とされるアミノ酸変化のリスク評価を示す図である。必要とされるアミノ酸変化は、主配列の下に示され、ヒトVH3-23とのアラインメントから導出された。生殖系列遺伝子および発現された抗体はGenBankアクセッション番号AAD53829に記載される。抗CXCR3クローンV3G6のVKドメインの、最も近い発現されたヒトIgGおよび生殖系列VKとのアラインメントを示す図である。抗CXCR3クローンV3G6のVKドメインの完全なヒト化のために必要とされるアミノ酸変化のリスク評価を示す図である。 CXCR3⁺NSO細胞へのマウスCXCR3mAbの結合の、市販のCXCR3mAbによる阻害を示す図である。およそ0.5nM Eu-CXCR3mAbが、様々な濃度の未標識の市販のCXCRmAbの存在下で、CXCR3トランスフェクトNSO細胞と共にインキュベートされた。CXCR3⁺NSO細胞へのEu-CXCR3mAbの結合の用量依存性の阻害が観察された。 Th1細胞上のCXCR3の発現を示す図である。Th1細胞およびTh2細胞が臍帯血から作成され、CXCR3およびCCR4の発現がFACSにより決定された。CXCR3はTh1細胞にのみ存在した。 ¹²⁵I-CXCL10結合アッセイを示す図である。Th1細胞が、様々な濃度のCXCRmAbの非存在下または存在下で、¹²⁵I-CXCL10と共に96穴プレートにおいてインキュベートされた。細胞と結合した¹²⁵I-CXCL10がオイルカラムにより遊離放射能から分離され、ガンマ計数管を使用して計数された。IC₅₀値はPrizmソフトウェアを使用して計算された。リード候補は緑で強調された。 ¹²⁵I-CXCL11結合アッセイを示す図である。Th1細胞が、様々な濃度のCXCRmAbの非存在下または存在下で、¹²⁵I-CXCL11と共に96穴プレートにおいてインキュベートされた。細胞と結合した¹²⁵I-CXCL11がオイルカラムにより遊離放射能から分離され、ガンマ計数管を使用して計数された。IC₅₀値はPrizmソフトウェアを使用して計算された。リード候補は緑で強調された。 Th1細胞へのEu-CXCR3mAbの結合を示す図である。Th1細胞が、10倍過剰の未標識CXCR3mAbの非存在下または存在下で、増加する濃度のEu-CXCR3mAbと共にインキュベートされた。インキュベーション（RTで1hr）の後、3回洗浄することにより細胞と結合したEu-CXCR3mAbが遊離ユウロピウムから分離され、プレートがVctor2蛍光光度計を使用して読み取られた。 Th1への¹²⁵I-CXCL11の結合の、CXCR3mAbハイブリドーマ上清による阻害を示す図である。Th1細胞が、RTで1hr、様々なCXCRmAbハイブリドーマ上清の非存在下または存在下で、¹²⁵I-CXCL11と共に96穴プレートにおいてインキュベートされた。細胞と結合した¹²⁵Iリガンドがオイルカラムにより遊離放射能から分離され、ガンマ計数管を使用して計数された。Th1細胞へのCXCL11の結合を阻害した7つのハイブリドーマ上清が、さらなる開発のために選択された。 Th1への¹²⁵I-CXCL10の結合の、CXCR3mAbハイブリドーマ上清による阻害を示す図である。Th1細胞は、RTで1hr、様々なCXCRmAbハイブリドーマ上清の非存在下または存在下で、¹²⁵I-CXCL10と共に96穴プレートにおいてインキュベートされた。細胞と結合した¹²⁵Iリガンドがオイルカラムにより遊離放射能から分離され、ガンマ計数管を使用して計数された。Th1細胞へのCXCL10の結合を阻害した7つのハイブリドーマ上清が、さらなる開発のために選択された。マウスCXCR3mAbがラットTh1細胞と交差反応しないことを示す図である。マウスCXCR3mAbの偏向ラットTh1細胞に対する反応性を決定するために、FACS分析が実施された。ウサギ抗マウスCXCR3AbのみがラットTh1細胞と結合した。マウス抗ヒトCXCR3AbはラットTh1細胞と結合しなかった。対照として、マウス抗CXCR3mAbのヒトTh1細胞への結合も示される（下パネル）。ヒト化CXCR3AbによるEu-CXCR3mAbの阻害を示す図である。Th1細胞が、様々な濃度のヒト化CXCRmAbの非存在下または存在下で、Eu-CXCR3mAbと共に96穴プレートにおいてインキュベートされた。インキュベーション（RTで1hr）の後、3回洗浄することにより、細胞と結合したEu-CXCR3mAbが遊離ユウロピウムから分離され、プレートがVctor2蛍光光度計を使用して読み取られた。IC₅₀値はPrizmソフトウェアを使用して計算された。Ab1は、IgG1骨格内にヒト化抗CXCR3 V44D7 VHリード#5アミノ酸の重鎖配列およびヒト化抗CXCR3 V44D7 VKリード#1の軽鎖配列（非公式の配列表を参照のこと）を有する。Ab2は、IgG1骨格内にヒト化抗CXCR3 V44D7 VHリード#5の重鎖配列およびヒト化抗CXCR3 V44D7 VKリード#7の軽鎖配列（非公式の配列表を参照のこと）を有する。ヒト化Ab（IgG4）は、IgG4骨格内にヒト化抗CXCR3 V44D7 VHリード#5の重鎖配列および最初のマウス抗CXCR3 V44D7 VKの軽鎖配列を有する。ヒト化CXCR3AbによるEu-CXC10の阻害を示す図である。Th1細胞が、様々な濃度のヒト化CXCRmAbの非存在下または存在下で、Eu-CXCL10と共に96穴プレートにおいてインキュベートされた。インキュベーション（RTで1hr）の後、3回洗浄することにより、細胞と結合したEu-CXCL10が遊離ユウロピウムから分離され、プレートがVctor2蛍光光度計を使用して読み取られた。IC₅₀値はPrizmソフトウェアを使用して計算された。ヒト化CXCR3Abによる、CXCL10により誘導されるTh1細胞走化性の阻害を示す図である。走化性アッセイは、ChemoTx 96穴プレート（Neuro Probe, Inc）において実施された。およそ29μLのCXCL10または緩衝液対照が下ウェルに添加された。様々な濃度のヒト化抗体の非存在下または存在下で、25μLのTh1細胞懸濁物が、フィルターのウェルに直接添加された。37℃で2hrのインキュベーションの後、下ウェルに遊走した細胞がcell titer glo法（Promega）により決定された。 Th1細胞におけるCa⁺⁺流入の分析をを示す図である。Th1細胞にFluo-4,AM（Molecular Probes）が負荷され、示されるような様々なマウスCXCR3mAb抗体により刺激された。細胞内Ca⁺⁺の増加はFLIPRにより決定された。

好ましい態様の詳細な説明
定義
抗体とは、本明細書に記載されるように、全長の（即ち、天然に存在する、もしくは正常な免疫グロブリン遺伝子断片組み換え（recombinatorial）過程により形成される）免疫グロブリン分子（例えば、IgG抗体）、または抗体断片のような免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な（即ち特異的に結合する）部分をさす。

抗体断片とは、F(ab')₂、F(ab)₂、Fab'、Fab、Fv、scFv等のような抗体の一部分である。構造に関わらず、抗体断片は、完全な抗体により認識されるのと同じ抗原と結合する。「抗体断片」という用語には、特異的な抗原と結合し、複合体を形成することにより、抗体と同様に作用する、合成のまたは遺伝学的に操作されたタンパク質も含まれる。例えば、抗体断片には、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Fv」断片のような、可変領域からなる単離された断片、軽鎖および重鎖の可変領域がペプチドリンカーにより接続されている組換え単鎖ポリペプチド分子（「scFvタンパク質」）、ならびに超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位が含まれる。

ヒト化抗体とは、ある種に由来する抗体、例えば、げっ歯動物抗体からのCDRが、げっ歯動物抗体の重鎖および軽鎖の可変領域から、ヒトの重鎖および軽鎖の可変ドメイン、または（「ヒト化率」により表されるような）ヒトの重鎖および軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列の少なくとも一部を含むよう変異させられた重鎖および軽鎖の可変ドメインへと移された組換えタンパク質である。抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体のものに由来し得る。

本明細書において使用される「ヒト化率」とは、ヒト化ドメインと生殖系列ドメインとの間のフレームワークアミノ酸の相違（即ち、非CDRの相違）の数を決定し、アミノ酸の総数からその数を差し引き、次いでアミノ酸の総数によりそれを割り、100を掛けることにより計算される。

本明細書において使用される「CDR」とは、抗体重鎖の可変ドメイン（VH）または抗体軽鎖の可変ドメイン（VLまたはVK）に存在する「相補性決定領域」を意味する。各可変ドメインは、3個のCDRを含んでおり、それらは、重鎖可変ドメインに存在するものについてはCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3と呼ばれ、軽鎖可変ドメインに存在するものについてはCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3と呼ばれる。Kabatの番号付けシステムが本明細書において使用される。従って、CDR-H1は、およそアミノ酸31（即ち、最初のシステイン残基のおよそ9残基後）で開始し、およそ5〜7アミノ酸を含み、次のチロシン残基で終了する。CDR-H2は、CDR-H1の末端の後の15番目の残基で開始し、およそ16〜19アミノ酸を含み、次のアルギニンまたはリジン残基で終了する。CDR-H3は、CDR-H2の末端の後のおよそ33番目のアミノ酸残基で開始し；3〜25アミノ酸を含み；配列W-G-X-G（Xは任意のアミノ酸である）で終了する。CDR-L1は、およそ残基24（即ち、システイン残基の後）で開始し；10〜17残基を含み；次のチロシン残基で終了する。CDR-L2は、CDR-L1の末端の後のおよそ16番目の残基で開始し、およそ7残基を含む。CDR-L3は、CDR-L2の末端の後のおよそ33番目の残基で開始し；およそ7〜11残基を含み、配列F-G-X-G（Xは任意のアミノ酸である）で終了する。

本明細書に開示された抗原結合ポリペプチドは、放射性標識、免疫調節剤、ホルモン、光活性治療剤、薬物または毒素であり得る細胞障害剤、およびそれらの組み合わせを含み得る治療剤と結合または融合し得る。薬物には、有糸分裂抑制剤、抗キナーゼ剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、アルカロイド、抗血管形成剤、アポトーシス剤、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、薬学的特性を保有している薬物が含まれ得る。より具体的には、これらの薬物は、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸アナログ、COX-2阻害剤、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、抗生物質、酵素、エピポドフィロトキシン、白金配位錯体、ビンカアルカロイド、置換型尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、アンタゴニスト、エンドスタチン、タキソール、カンプトテシン、アントラサイクリン、タキサン、ならびにそれらのアナログおよび組み合わせからなる群より選択される。本発明に包含される毒素は、リシン、アブリン、アルファ毒素、サポリン、リボヌクレアーゼ（RNase）、例えば、オンコナーゼ（onconase）、DNase I、ブドウ球菌腸毒素A、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素からなる群より選択され得る。

免疫調節剤は、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（CSF）、インターフェロン（IFN）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択され得る。特に有用であるのは、腫瘍壊死因子（TNF）のようなリンホトキシン、インターロイキン（IL）のような造血因子、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）のようなコロニー刺激因子、インターフェロンα、インターフェロンβ、またはインターフェロンγのようなインターフェロン、および「S1因子」と呼ばれるもののような幹細胞増殖因子である。より具体的には、免疫調節剤には、IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、インターフェロンγ、TNF-α、またはそれらの組み合わせが含まれ得る。

本明細書に開示された抗原結合ポリペプチドは、診断剤と結合または融合し得る。診断剤には、光活性診断剤、または60〜4,000keVのエネルギーを有する放射標識、または非放射性標識が含まれ得る。放射性標識は、好ましくは、ガンマ線放射型同位体、ベータ線放射型同位体、および陽電子放射型同位体であり、¹²⁵I、¹³¹I、¹²³I、¹²⁴I、⁸⁶Y、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁶²Cu、⁶⁴Cu、¹¹¹In、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、^99mTc、^94mTc、¹⁸F、¹¹C、¹³N、¹⁵O、⁷⁶Br、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。診断剤には、例えば、マンガン、鉄、またはガドリニウムのような造影剤が含まれ得る。

実施例
ハイブリドーマ技術を使用したマウスIgG₁,k CXCR-3結合抗体の単離
BALB/cマウスを、CXCR-3発現NSO細胞により免疫感作した。典型的な手法で、50ulのRIBIアジュバント（Sigma）中の5×10⁶細胞を後足蹠に注射した（1足蹠当たり25ul）。RIBIアジュバントでの注射を、さらに2回、2週間間隔で与え、続いてPBSでの最終追加刺激を行った。3日後、マウスを屠殺し、膝窩リンパ節を採集し、融合のためにリンパ球を単離した。融合剤としてPEG/DMSO（Sigma）を使用して、5：1比で、リンパ球をP3X63Ag8.653形質細胞腫細胞と融合させた。融合細胞を選択HAT培地に再懸濁させた後、96穴プレートに1ウェル当たり10⁶細胞で播種した。HAT選択で生存したハイブリドーマからの上清を、マウスIgGの存在についてELISAによりスクリーニングした。IgG産生ハイブリドーマを同定し、それらの上清を、さらに、CXCR3発現NSO細胞（CXCR3⁺NSO）と結合する抗体についてFACS分析によりスクリーニングした。次いで、CXCR3⁺NSO細胞結合陽性と同定されたハイブリドーマを、CXCR3特異的クローンを同定するため、CXCR3⁺NSO細胞およびPC-NSO（ベクター対照）細胞との差次的な結合についてスクリーニングした。CXCR3特異的ハイブリドーマを、限界希釈により2回サブクローニングした。ハイブリドーマサブクローンを無血清培地で増幅し、抗体をプロテイン-Aカラムで精製し、リード候補を選出するためにさらに特徴決定した。

ヒト化戦略
抗CXCR3抗体のヒト化における一つの目標は、最初の結合親和性および特異性の90〜100％を保持している60〜80％ヒト化されたVHドメインおよびVKドメインを入手することであった。結合親和性および特異性を維持しつつ、抗体をさらにヒト化するため、VHおよびVKにおける個々の高リスク位置の部位特異的変異誘発を使用した。

ヒト化は、CDRグラフティングおよび構造に基づく分析および可変領域リサーフェイシング（resurfacing）により実施された。（Jones et al., NATURE (1986) May 29-Jun. 4; 321(6069):522-5；Roguska et al., PROTEIN ENGINEERING, 1996, 9(10):895-904；およびXoma, Humanizing Mouse Antibody Frameworks While Preserving 3-D Structure. PROTEIN ENGINEERING, 1994, Vol.7, pg 805を参照のこと）。結合親和性および特異性を維持するために必要とされる重要なフレームワーク残基を同定するために、一次抗体配列および3D構造のデータを利用した。9個の異なるFab分子およびIgG分子の3D構造を分析した（リガンドを含む、またはリガンドを含まない、ヒトおよびマウス）。マウス抗CXCR3 V44 VHおよびVKを、最も近いヒト生殖系列遺伝子と整列化した後、全ての位置におけるアミノ酸を、結合および免疫原性に対する可能性のある影響について評価した。この情報を使用して、各位置の変異について低リスク値、中リスク値、または高リスク値を割り当てた。一般に、高リスクの位置を回避して、低リスクおよび中リスクの位置のみを変異させた。

重鎖は、この過程の後、（CDRを除き）マウス重鎖に比べて98％ヒト化された。次いで、平均で2倍の親和性の増加を与える、Y115D置換を含むCDR3内の各位置へのペアのチロシンの組み入れにより、親和性成熟戦略を実施した。2個のリード候補において使用された重鎖は、CDRを除きそれを100％ヒトにする2個のさらなる変異を97位および98位に含んでいた。軽鎖についての同一の戦略の後、VKを、A14生殖系列遺伝子と整列化し、低リスクおよび中リスクの位置を変異させた。この生殖系列遺伝子が正常なヒトにおいて稀に発現されるらしいことが決定された後、L6生殖系列を鋳型として使用して過程を繰り返した。

研究において使用されたマウスVH領域およびVK領域と最も近いマッチを同定するため、NCBIにより後援された「Blast for Ig sequences」ウェブサイトを使用した。MRCのV-baseウェブサイトを、ヒト生殖系列配列を確認するために使用した。

ヒト生殖系列VH遺伝子およびVK遺伝子を、マウス配列のVH配列およびVK配列と最適なマッチとして選んだ。マウスVH配列については、（V-baseで名付けられたような）ヒト生殖系列配列VH3-23が、最適なマッチとして同定された：
VH3-23生殖系列

。マウスVK配列については、（V-baseで名付けられたような）ヒト生殖系列配列A14およびL6が、最適なマッチとして同定された：
L6生殖系列

；および
A14生殖系列

。

ハイブリドーマ細胞株からのマウス抗CXCR3のVHドメインおよびVKドメインのクローニングおよび配列決定
ハイブリドーマ細胞をペレット化し、PBSで3回洗浄し、製造業者のプロトコルに従いTrizol試薬（Invitrogen, Cat. No. 15596-026）を使用してRNAを抽出した。全RNAを、製造業者のプロトコルに従い、5'RACEキット（Rapid Amplification of cDNA Ends, Invitrogen, Cat. No. 18374-058）を使用して、cDNAに変換した。簡単に説明すると、RNAをランダムヘキサマープライマー、ランダムN6にライゲートさせ、superscript II RNAaseH陰性逆転写酵素を使用して第1鎖cDNAを作成した。cDNAを、キットと共に提供されたGlassMaxスピンカートリッジを使用して精製し、次いで、cDNAの5'末端にC塩基対を添付するためにdCTPの存在下でTdT（ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）と反応させた。dCテールを有するcDNAを、dCテールに特異的なアンカープライマー、ならびにVHについてはマウス定常重鎖1（CH1）およびVKについては定常κ（CK）における高度に保存されたDNA配列にハイブリダイズする遺伝子特異的プライマーを使用してPCR増幅した。得られたPCR産物を、完全なVHドメインまたはVKドメインに対応する正確なサイズについてゲル電気泳動により分析し、次いで精製し、製造業者のプロトコルに従いTopo TAベクター（Invitrogen Cat. No. 45-0071）にライゲートさせた。細菌への形質転換の後、正確なサイズのインサートを含有しているクローンからDNAを調製し、製造業者のプロトコルに従い、Big Dyeターミネーター配列決定反応ミックス（Applied Biosystems, Part No. 4336699）および3700 ABI/Prism DNA分析機を使用してDNA配列を決定した。

マウス抗CXCR3抗体のヒト化
まず、単一のリードマウス抗CXCR3抗体V44D7を、前記のようにして作成された結合データおよび配列データに基づき同定した。この抗体からのVHドメインおよびVKドメインのアミノ酸配列を、現在入手可能な公的データベース（即ち、NCBIのBlast for IgGおよびMRCのV-base）を使用して、全ての公知のヒト生殖系列VHドメインおよびVKドメインと整列化した。フレームワーク領域内のアラインメントに焦点を当てることにより、高度に相同なヒト生殖系列VHドメイン、VH3-23、および2個の異なるヒト生殖系列VKドメイン、A14およびL6が同定された。マウス配列がヒト生殖系列と異なっているフレームワーク内の位置においては、対応するヒト生殖系列フレームワークとマッチするよう、マウスフレームワークを変換するかまたは変異させるために反復過程を使用した。さらに、フレームワーク残基変化による親和性の損失の補償を可能性として補助するために、VHおよびVKの両方のCDR3におけるある種の残基を、チロシンとの交換により変異させた（即ち、親和性熟成させた）。親和性成熟されヒト化されたマウスVHドメインおよびVKドメインを、重複する合成DNAオリゴヌクレオチドのパネルを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応過程により作成した。合成遺伝子設計過程の一部として、コドン最適化戦略を使用した。即ち、遺伝子発現のため哺乳動物細胞により優先的に利用される各アミノ酸のトリプレットコードを、各位置に組み入れた。完全にヒトのIgG1、G4、またはκ抗体骨格の情況において、対応するドメインが発現されることを可能にする、専門の哺乳動物発現ベクターに、合成のVHドメインおよびVKドメインをクローニングした。ヒト化抗体の小規模作製は、製造業者のプロトコルに従いリポフェクタミン（Invitrogen）を用いた、293F細胞へのIgG1またはG4構築物のκ構築物とのコトランスフェクションにより達成された。一過性トランスフェクションからの上清を、プロテインAまたはG樹脂に通し、細胞に基づくアッセイでの試験のため均質になるまでIgGを精製した。

エピトープ競合研究
様々な市販のCXR3mAbを、ユウロピウム（Eu）で標識されたマウスCXCR3mAbを使用した競合結合アッセイにおいて試験した。様々な販売元からのCXCR3mAbが、CXCR3へのEu-CXCR3mAbの結合を阻害した。このデータは、マウスCXCR3mAb抗体および市販の抗体が、CXCR3上の重複するエピトープと結合することを示した（図13）。

抗体親和性
マウスCXCR3mAbおよびヒト化CXCR3mAbの結合親和性および活性は、¹²⁵IおよびEuで標識されたケモカイン、ならびにEuで標識されたCXCR3mAbを使用した様々な競合結合アッセイ、ならびに以下のものを含むTh1走化性アッセイにより決定された：¹²⁵I-CXCL10結合アッセイ；¹²⁵I-CXCL11結合アッセイ；Eu-CXCL10結合アッセイ；Th1走化性アッセイ；およびEu-マウスCXCR3mAb結合アッセイ。

Th1細胞
臍帯血から作成された初代Th1細胞を、全ての結合アッセイに使用した。文献に記載されるように、CXCR3発現は、FACS分析により決定されるように、Th1細胞にのみ観察され、Th2細胞には観察されなかった（図14）。Th2細胞はCCR4を特異的に発現した。

¹²⁵I-CXCL10および¹²⁵I-CXCL11結合アッセイ
マウスCXCR3mAb抗体の結合親和性は、放射標識されたCXCL10およびCXCL11とTh1細胞との結合を阻害する能力に基づき決定された（図15、16、18、および19、ならびに表1）。これらの結合研究および走化性アッセイに基づき、3つのマウスCXCRmAbがさらなる研究のために選択された。

（表１）抗CXCR3 mAbの特徴決定

Ab#1-5D4A；Ab#2-8A5A；Ab#3-19G2；Ab#4-V36E5A；Ab#5-V44D7A；Ab#6-37B5A；Ab#7-21A4A；Ab#8-V15F4A；Ab#9-V3G6A；Ab#10-23E12A；Ab#11-35C4；Ab#12-39E10。

Eu-CXCRmAb飽和結合アッセイ
CXCR3に対するマウスCXCR3抗体の結合親和性は、ユウロピウムで標識されたマウスCXCR3抗体を使用した直接飽和結合アッセイにより決定された。1つのマウスCXCR3mAbを使用したこのアッセイの一例が、図17に示される。この研究からのデータは、CXCR3へのEu-CXCR3mAbの結合が特異的であり、nM以下（0.47nM）のKdの結合親和性で飽和可能であることを示した。

抗体特異性
マウス抗体ハイブリドーマ（20000）を、Eu-二次抗体を使用して、CXCR3⁺およびCXCR3-NSO膜を用いた差次的スクリーニングアッセイ（DELFIA）によりスクリーニングした。CXCR3⁺膜と結合した抗体（〜2000）を、CXCR3⁺/CXCR3^- NSOおよびTh1細胞を使用したFACSによりさらに試験した。CXCR3発現細胞へのCXCR3mAbの特異的な結合についての一例は、図3に示される。

種交差反応性
親マウスCXCR3mAbを、FACSにより、偏向ラットTh1細胞との結合について試験した。ウサギ抗マウスCXCR3 Ab（陽性対照）のみがラットTh1細胞と結合した。マウス親CXCR3mAbは、図20に示されるように、ラットTh1細胞と結合しなかった。

生物学的活性
結合アッセイ：CXCR3mAbは、¹²⁵Iで標識されたIP-10およびI-Tacの、初代Th1細胞への結合を特異的に阻害した。標識されたMigが入手不可能であったため、それは結合アッセイにおいて試験されなかった。走化性アッセイ：CXCR3mAbは、CXCR3ケモカインにより媒介されるTh1細胞遊走を阻害した。

ヒト化抗体は結合アッセイおよび走化性アッセイにより試験された。Eu-CXCRmAb競合結合アッセイの結果は図21に示される。Eu-CXCL10結合アッセイの結果は図22に示される。Th1走化性アッセイの結果は図23に示される。

CXCR3受容体のアゴニズムについて試験されたマウス抗体
マウスCXCR3mAbを、Th1細胞におけるca動員の誘導におけるアゴニスト活性について試験した。図24に示されるように、いずれの抗体も、Ca⁺⁺流入の誘導におけるアゴニスト活性を示さなかった。

（表２）結合アッセイおよび走化性アッセイから決定された、異なるヒト化抗体のIC₅₀値

N.D.＝未決定

表2中、Ab1は、IgG1骨格内にヒト化抗CXCR3 V44D7 VHリード#5アミノ酸の重鎖配列およびヒト化抗CXCR3 V44D7 VKリード#1の軽鎖配列（非公式の配列表を参照のこと）を有する。Ab2は、IgG1骨格内にヒト化抗CXCR3 V44D7 VHリード#5の重鎖配列およびヒト化抗CXCR3 V44D7 VKリード#7の軽鎖配列（非公式の配列表を参照のこと）を有する。Ab3は、IgG1骨格内にヒト化抗CXCR3 V44D7 VHリード#5アミノ酸の重鎖配列およびヒト化抗CXCR3 V44D7 VKリード#2の軽鎖配列（非公式の配列表を参照のこと）を有する。Ab4は、IgG1骨格内にヒト化抗CXCR3 V44D7 VHリード#5の重鎖配列およびヒト化抗CXCR3 V44D7 VKリード#3の軽鎖配列（非公式の配列表を参照のこと）を有する。Ab5は、IgG1骨格内にヒト化抗CXCR3 V44D7 VHリード#5アミノ酸の重鎖配列およびヒト化抗CXCR3 V44D7 VKリード#4の軽鎖配列（非公式の配列表を参照のこと）を有する。Ab6は、IgG1骨格内にヒト化抗CXCR3 V44D7 VHリード#5の重鎖配列およびヒト化抗CXCR3 V44D7 VKリード#5の軽鎖配列（非公式の配列表を参照のこと）を有する。

非公式な配列表

オリジナルのマウス抗CXCR3 V44D7 VH ヌクレオチド

マウス抗CXCR3 V44D7 VH アミノ酸

マウス抗CXCR3 V44D7 VK ヌクレオチド

マウス抗CXCR3 V44D7 VK アミノ酸

ヒト化マウスVH配列

ヒト化抗CXCR3 V44D7 VH リード#1ヌクレオチド

ヒト化抗CXCR3 V44D7 VH リード#1アミノ酸

ヒト化抗CXCR3 V44D7 VH リード#2ヌクレオチド

ヒト化抗CXCR3 V44D7 VH リード#2アミノ酸

ヒト化抗CXCR3 V44D7 VH リード#3ヌクレオチド

ヒト化抗CXCR3 V44D7 VH リード#3アミノ酸

ヒト化抗CXCR3 V44D7 VH リード#4ヌクレオチド

ヒト化抗CXCR3 V44D7 VH リード#4アミノ酸

ヒト化抗CXCR3 V44D7 VH リード#5ヌクレオチド

ヒト化抗CXCR3 V44D7 VH リード#5アミノ酸

ヒト化抗CXCR3 V44D7 VH リード#6ヌクレオチド

ヒト化抗CXCR3 V44D7 VH リード#6アミノ酸

ヒト化マウスVK配列

ヒト化抗CXCR3 V44D7 VK リード#1ヌクレオチド

ヒト化抗CXCR3 V44D7 VK リード#1アミノ酸

ヒト化抗CXCR3 V44D7 VK リード#2ヌクレオチド

ヒト化抗CXCR3 V44D7 VK リード#2アミノ酸

ヒト化抗CXCR3 V44D7 VK リード#3ヌクレオチド

ヒト化抗CXCR3 V44D7 VK リード#3アミノ酸

ヒト化抗CXCR3 V44D7 VK リード#4ヌクレオチド

ヒト化抗CXCR3 V44D7 VK リード#4アミノ酸

ヒト化抗CXCR3 V44D7 VK リード#5ヌクレオチド

ヒト化抗CXCR3 V44D7 VK リード#5アミノ酸

ヒト化抗CXCR3 V44D7 VK リード#6ヌクレオチド

ヒト化抗CXCR3 V44D7 VK リード#6アミノ酸

ヒト化抗CXCR3 V44D7 VK リード#7ヌクレオチド

ヒト化抗CXCR3 V44D7 VK リード#7アミノ酸

ヒト化抗CXCR3 V44D7 VK リード#8ヌクレオチド

ヒト化抗CXCR3 V44D7 VK リード#8アミノ酸

Claims

（a）（1）(NYAMS)のアミノ酸配列を含むCDR-H1；
（2）(TISSGGGYTYYPDSLKG)のアミノ酸配列を含むCDR-H2；および
（3）(HGAPMTTVITYAPYYF{D,Y}Y)のアミノ酸配列を含むCDR-H3
を含み、且つ

のアミノ酸配列を含むヒト化抗体重鎖可変領域と、
（b）（1）(RASSSVKYMY)のアミノ酸配列を含むCDR-L1；
（2）(YTSNLAP)のアミノ酸配列を含むCDR-L2；および
（3）(QQFTTSPYT)のアミノ酸配列を含むCDR-L3
を含み、且つ

のアミノ酸配列を含むヒト化抗体軽鎖可変領域と
を含む、CXCR3に特異的に結合する抗原結合ポリペプチド。
（1）CDR-H1が(NYAMS)のアミノ酸配列からなり；
（2）CDR-H2が(TISSGGGYTYYPDSLKG)のアミノ酸配列からなり；
（3）CDR-H3が(HGAPMTTVITYAPYYF{D,Y}Y)のアミノ酸配列からなり；
（4）CDR-L1が(RASSSVKYMY)のアミノ酸配列からなり；
（5）CDR-L2が(YTSNLAP)のアミノ酸配列からなり；且つ
（6）CDR-L3が(QQFTTSPYT)のアミノ酸配列からなる、
請求項1記載のポリペプチド。
（a）ヒト化抗体重鎖可変領域が

のアミノ酸配列を含み、且つ
（b）ヒト化抗体軽鎖可変領域が
（i）

および
（ii）

からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、
請求項1または2記載のポリペプチド。
抗体分子、Fab断片、Fab'断片、F(ab')₂断片、およびscFv分子からなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか一項記載のポリペプチド。
（a）ヒト重鎖定常領域とヒト軽鎖定常領域とを含むキメラ抗体であるか、または
（b）scFv分子であり、該scFvがNH₂-L-VH-X-VK-COOHおよびNH₂-L-VK-X-VH-COOHからなる群より選択される式を有し、式中、Lがリーダー配列であり；VHがヒト化抗体重鎖可変領域であり；Xが連結ポリペプチドであり；かつVKがヒト化抗体軽鎖可変領域である、
請求項4記載のポリペプチド。
抗体が、IgG分子である、請求項4または5記載のポリペプチド。
抗体が、IgG1分子またはIgG4分子である、請求項6記載のポリペプチド。
治療剤または診断剤と結合している、請求項1〜7のいずれか一項記載のポリペプチド。
（a）治療剤が、細胞障害剤、放射性標識、免疫調節剤、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光活性治療剤、もしくはそれらの組み合わせからなる群より選択されるか、または
（b）診断剤が、放射性標識、光活性診断剤、超音波増強剤、もしくは非放射性標識からなる群より選択される、
請求項8記載のポリペプチド。
（a）CXCR3のアンタゴニストであるか、または
（b）CXCR3のアゴニストではない、
請求項1〜9のいずれか一項記載のポリペプチド。
請求項1〜10のいずれか一項記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
請求項11記載のポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーター配列を含む、組換えポリヌクレオチド。
請求項12記載のポリヌクレオチドにより形質転換された、単離された細胞。
以下の段階を含む、請求項12記載の組換えポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを作製する方法：
（a）該組換えポリヌクレオチドにより形質転換された細胞を培養して、コードポリペプチドを発現させる段階；および
（b）そのように発現されたポリペプチドを回収する段階。
（a）

のアミノ酸配列を含むヒト化重鎖、ならびに
（b）
(i)

(ii)

(iii)

(iv)

(v)

および
(vi)

からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むヒト化軽鎖
を含む、CXCR3に特異的に結合する抗原結合ポリペプチド。
抗体分子、Fab断片、Fab'断片、F(ab')₂断片、およびscFv分子からなる群より選択される、請求項15記載のポリペプチド。
（a）ヒト重鎖定常領域とヒト軽鎖定常領域とを含むキメラ抗体であるか、または
（b）scFv分子であり、該scFvがNH₂-L-VH-X-VK-COOHおよびNH₂-L-VK-X-VH-COOHからなる群より選択される式を有し、式中、Lがリーダー配列であり；VHがヒト化抗体重鎖可変領域であり；Xが連結ポリペプチドであり；かつVKがヒト化抗体軽鎖可変領域である、
請求項16記載のポリペプチド。
抗体が、IgG分子である、請求項16または17記載のポリペプチド。
抗体が、IgG1分子またはIgG4分子である、請求項18記載のポリペプチド。
治療剤または診断剤と結合している、請求項15〜19のいずれか一項記載のポリペプチド。
（a）治療剤が、細胞障害剤、放射性標識、免疫調節剤、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光活性治療剤、もしくはそれらの組み合わせからなる群より選択されるか、または
（b）診断剤が、放射性標識、光活性診断剤、超音波増強剤、もしくは非放射性標識からなる群より選択される、
請求項20記載のポリペプチド。
請求項1〜10ならびに15〜21のいずれか一項記載のポリペプチドと担体とを含む、薬学的組成物。
付加的な治療剤または診断剤をさらに含む、請求項22記載の薬学的組成物。
炎症性の疾患もしくは状態、免疫性の疾患もしくは状態、または悪性の疾患もしくは状態を処置または診断するための請求項22または23の薬学的組成物。
疾患または状態が、自己免疫疾患、炎症性腸疾患（IBD）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、関節炎、多発性硬化症、移植片拒絶、中枢神経系損傷、クローン病、乾癬、白血病およびリンパ腫からなる群より選択される、請求項24記載の薬学的組成物。
自己免疫疾患が、狼瘡である、請求項25記載の薬学的組成物。
関節炎が、関節リウマチである、請求項25記載の薬学的組成物。
リンパ腫が、慢性リンパ球性白血病（CLL）である、請求項25記載の薬学的組成物。
請求項15〜21のいずれか一項記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。